JP7082371B2 - 細胞培養容器、観察用試料セル及び細胞培養方法 - Google Patents
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Description
共焦点レーザー顕微鏡では、対物レンズによりレーザービームの焦点を細胞に結び、その焦点における細胞に標識された蛍光物質の自家蛍光を検出することができる。このため、複数の焦点面(xy平面)の二次元画像をz方向に重ね合わせることにより細胞の三次元画像を作成することができる。
また、細胞の多面観察する場合、通常、それぞれの画像中で同一細胞と考えられる特徴のある細胞を見つけ出し、その細胞を利用して異なる方向からの観察画像の位置合わせを行い、細胞の三次元構造を把握する。この方法では、異なる方向からの観察画像の位置合わせに時間がかかる。また、正確な位置あわせを行うことが難しい。また、比較的特徴の少ない細胞を多面観察する場合、異なる方向からの観察画像の位置合わせを行うことが困難である。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、細胞又は細胞組織を立体培養することができ、かつ、多面観察により培養した細胞又は細胞組織の三次元構造を容易に把握することが可能である細胞培養容器/観察用試料セルを提供する。
本発明の細胞培養容器/観察用試料セルは栄養成分透過性を有する窓部を有するため、細胞培養容器/観察用試料セルを液体培地中に浸漬することにより、液体培地中の栄養素、タンパク質、酸素などを窓部及び培養ゲルを介して細胞又は細胞組織に供給することができる。
本発明の細胞培養容器/観察用試料セルは枠部と前記枠部で囲まれた少なくとも1つの窓部とを有するため、細胞培養容器/観察用試料セルの強度を大きくすることができ、細胞培養容器/観察用試料セルの取り扱いが容易になる。また、窓部が傷つくことを抑制することができる。さらに細胞培養容器/観察用試料セルを容易に回転させることができる。
本発明の細胞培養容器/観察用試料セルは枠部から細胞培養容器/観察用試料セルの内部側に突出した少なくとも1つの凸部を有する。このため、細胞培養容器/観察用試料セルの内部に凸部の先端部分を配置することができる。
前記凸部は、細胞又は細胞組織と共に前記窓部から観察できる位置に配置された特徴点を有する。このため、細胞又は細胞組織を窓部から多面観察した際に、異なる方向からの観察画像に特徴点を入れることができる。この特徴点を参照点として利用して、異なる方向からの観察画像を、細胞組織の形状に依存することなく高精度に位置合わせすることができ、観察対象である細胞又は細胞組織の三次元構造を把握することができる。
窓部が複数の場合、各窓部から取得した複数の観察画像を位置合わせできる。また窓部が1つの場合でも、その窓部を通して互いに異なる角度から取得した複数の観察画像を位置合わせすることができる。
本発明の細胞培養容器/観察用試料セルに含まれる枠部は、立方体又は直方体であり、各面に窓部を設けるための開口を有することが好ましい。このことにより、細胞培養容器の内部空間における空間座標のx軸方向、y軸方向、z軸方向からそれぞれ細胞組織を観察することができ、細胞組織の三次元構造を容易に把握することができる。
本発明の細胞培養容器/観察用試料セルは、複数の凸部を有することが好ましく、各凸部は特徴点を有することが好ましい。このことにより、細胞組織の観察画像に複数の特徴点を入れることができ、異なる方向からの観察画像を位置合わせする際に複数の特徴点を参照点として利用して観察画像の回転などを補正することができる。このため、異なる方向からの観察画像をより高精度に位置合わせすることができる。
本発明の細胞培養容器/観察用試料セルに含まれる凸部は少なくとも特徴点が自家蛍光を発する材料からなるように設けられることが好ましい。このことにより、共焦点レーザー顕微鏡などで細胞組織を蛍光観察する際に、特徴点を発光させることができ、蛍光観察においても凸部の特徴点を参照点として利用して、異なる方向からの蛍光観察画像を高精度に位置合わせすることができる。
また、本発明は、細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを収容する細胞培養容器用の枠であって、前記枠は、窓部を設けるための少なくとも1つの開口を有し、かつ、枠の内部側に突出した少なくとも1つの凸部を有し、前記窓部は、透光性であり、かつ、栄養成分透過性を有し、かつ、前記細胞又は前記細胞組織を多面観察できるように設けられ、前記凸部は、前記細胞又は前記細胞組織と共に前記窓部から観察できる位置に配置された特徴点を有することを特徴とする細胞培養容器用の枠も提供する。
本実施形態の細胞培養容器/観察用試料セル10は、細胞又は細胞組織7を包埋する培養ゲル6を収容するための細胞培養容器/観察用試料セル10であって、細胞培養容器/観察用試料セル10は、枠部5と、枠部5で囲まれた少なくとも1つの窓部4と、枠部5から細胞培養容器/観察用試料セル10の内部側に突出した少なくとも1つの凸部2とを有し、少なくとも1つの窓部4は、透光性であり、かつ、栄養成分透過性を有し、かつ、細胞又は細胞組織7を多面観察できるように設けられ、凸部2は、細胞又は細胞組織7と共に窓部4から観察できる位置に配置された特徴点3を有することを特徴とする。
以下、本実施形態の細胞培養容器/観察用試料セル10について説明する。
本実施形態の細胞培養容器10は、細胞又は細胞組織7を包埋する培養ゲル6を内部に収容している状態であってもよい。この場合、細胞培養容器10は、例えば、図3、4に示したような構造を有することができる。
細胞又は細胞組織7を培養ゲル6に包埋することにより、培養ゲル6を介して細胞7又は細胞組織7に栄養、刺激因子などを供給することができる。また、培養ゲル6が細胞組織7の足場になることができ、細胞組織7が三次元的に成長することができ立体培養することができる。
培養ゲル6は、細胞培養容器10に内包され、外部の液体培地9に直接接触しないため、培養ゲル6が液体培地9を吸収し膨潤することにより細胞組織7の相対位置がずれることを抑制することができる。
また、細胞培養容器10が枠部5を有することにより、細胞培養容器10の強度を大きくすることができ、細胞培養容器10の取り扱いが容易になる。また、細胞培養容器10を容易に回転させることが可能になる。また、窓部4が傷つくことを抑制することができる。枠部5は、少なくとも1つの開口を有する立体形状とすることができ、この開口を塞ぐように窓部4を設けることができる。また、枠部5は、複数の開口を有する立体形状とすることができ、複数の開口をそれぞれ塞ぐように複数の窓部4を設けることができる。
枠部5の材料は、生体適合性を有する樹脂とすることができる。また、枠部5の材料は、例えば、ポリカーボネートとすることができる。
ハイドロゲルとは、水中の分散質が繋がってネットワークを形成し系全体として固体状になったものである。また、窓部4は、細胞組織7にタンパク質を供給するために十分なタンパク質透過性を有するように設けることができる。
多孔質体とは、多数の細かい孔を有する部材である。多孔質体は、例えば、多孔質材料シート、メッシュ、エッチングシート、不織布、織布などである。また、多孔質体はシート形状を有することができる。また、多孔質体は、生体適合性を有することが好ましい。多孔質体は、ポリカーボネートなどの樹脂であってもよく、金などの金属であってもよく、ガラスなどの無機化合物であってもよい。
例えば、図5に示したように、細胞培養容器10を液体培地9中に浸漬することにより、液体培地9に含まれる栄養素、タンパク質、化学物質、酸素などを窓部4及び培養ゲル6を介して細胞組織7に供給することができる。また、細胞培養容器10を液体培地9が流れる流路中に配置してもよい。
窓部4は、透光性を有する。このため、窓部4を介して細胞培養容器10の内部の細胞組織7を観察することができる。培養中の細胞組織7を窓部4を介して観察してもよく、培養が終わった後の細胞組織7を窓部4を介して観察してもよい。また、色素染色した細胞組織7を窓部4を介して蛍光観察してもよい。
また、窓部4は、枠部5の開口を塞ぐように設けることができる。また、窓部4の形状は、膜状又はシート状とすることができる。また、窓部4の厚さは薄いほうが好ましい。このことにより、窓部4のタンパク質透過性や透光性を向上させることができる。
ネットワークを形成する分散質の濃度が高いほど窓部4の強度が高くなる。窓部4の強度としては50g/cm2以上のゲル強度を有することが好ましい。このことにより、細胞培養容器10の内部の培養ゲル6の重さにより窓部4が変形することを抑制することができる。
一方、窓部4の分散質の濃度が高すぎると、タンパク質透過性が低下するので、タンパク質透過性を確保する上で、窓部4の強度が10000g/cm2以下となるように分散質の濃度に抑えることが好ましい。
従って、窓部4の強度としては50g/cm2以上10000g/cm2以下が好ましい。なお、このようなゲル強度を得るための分散質の適切な濃度は、分散質の種類により異なる。
図1~4、図6(a)、(b)のように、細胞培養容器10の形状が多面体である場合、枠部5は多面体形状を有することができ、多面体形状の各面に窓部4を形成するための開口を有することができる。また、図6(c)のように、細胞培養容器10の形状が円柱である場合、枠部5は円柱形状を有することができ、円柱形状の上面、下面、側面に窓部4を形成するための開口を有することができる。
細胞培養容器10に培養ゲル6を入れる前に、枠部5の上面の開口14以外の開口に窓部4を形成することができる。また、枠部5の上面の開口14から細胞培養容器10の内部に培養ゲル6及び細胞組織7を入れた後に、枠部5の上面の開口14に窓部4を形成することができる。
窓部4が多孔質体からなる場合、窓部4は、多孔質体のシートを枠部5に接着することにより形成することができる。
図1~4、図6のように、立体形状の枠部5の開口に窓部4を設けることにより、細胞培養容器10の内部の細胞組織7を異なる方向から観察することが可能となり、細胞組織7を多面観察することができる。
また、細胞培養容器10を多面体形状とすることにより、多面体形状の各面から細胞組織7を観察できるように細胞培養容器10を回転させることができ、顕微鏡により異なる面からの細胞組織7の観察画像を得ることができる。
凸部2は、枠部5から容器の中央部に向かって突出するように設けることができる。このように凸部2を設けることにより細胞組織7の成長の妨げになりにくい。また、図1、2、6の例では、凸部2が、枠部5の中でも枠の突合せ部分の内側から突出させている。即ち細胞培養容器10が多面体形状である場合は、枠部5の角部の内側に凸部2を設けている。この場合特に、凸部2は容器の中央から離れた位置に存在するので、細胞組織7の成長の妨げにならない。
図1~3の例では、各凸部2a~2fが枠部5の角部から容器内側に突出しているので、各角部に存在する1つの凸部2を、それに隣接する3つの窓部4から観察することができる。従って、この3つの窓部4から観察する画像を高精度に位置合わせすることができる。
図1~3、6の例では各凸部2の形状においても先細り形状であり、その先端部が特徴点3となっているので、特徴点3の周囲は光が通過することができる。すなわち、各凸部2は、異なる方向から特徴点3を観察しやすい形状となっている。
ただし、凸部2の形状は、図示したものには限られず、例えば凸部2を角部を有する形状(多面体など)とし、その角部を特徴点3とすることができる。また、例えば凸部2に球状部分を設けて、その球状部分の中心や先端などを特徴点3とすることもできる。
複数の凸部2は、それぞれの凸部2の長さ及び突出角度が異なるように設けることができる。このことにより、細胞培養容器10の内部の様々な箇所に特徴点3を配置することができ、観察する細胞組織7に応じて特徴点3を使い分けることができる。例えば、観察する細胞組織7が広範囲にわたる場合、各部分ごとに、細胞培養容器10の内部に配置された複数の特徴点3の中から最適な特徴点3を参照点として選択することができる。
複数の凸部2は、異なる形状を有することができる。このことにより、細胞組織7の観察画像に含まれる凸部2を容易に特定することができる。
凸部2は、少なくとも特徴点3が自家蛍光を発する材料からなるように設けることができる。このことにより、共焦点レーザー顕微鏡などで細胞組織7を蛍光観察する際に、特徴点3を発光させることができる。凸部2が自家蛍光を発する材料からなってもよく、特徴点3を設けた部分だけが自家蛍光を発する材料からなってもよい。また、自家蛍光を発する材料で形成された凸部2の特徴点3は、細胞組織7の明視野観察においても利用することができる。
凸部2は例えば、生体適合性のフォトレジスト(例えば、SU-8など)により三角で板状の部材を作製し、この部材を枠部5に貼り付けることにより形成することができる。凸部を枠部5に貼り付ける接着剤及びフォトレジストには、生体適合性を有するものを用いることができる。
本実施形態の細胞培養方法は、細胞又は細胞組織7を包埋する培養ゲル6を収容した細胞培養容器10中において細胞又は細胞組織7を培養するステップと、細胞培養容器10中の培養した細胞又は細胞組織7を観察するステップとを含む。
本実施形態の細胞培養方法では、細胞又は細胞組織7を培養するステップの前に、細胞又は細胞組織7と共に窓部4から観察できる位置に配置された特徴点3を有する参照物体2を細胞培養容器10中に設けている。
参照物体2は、上述の凸部2であってもよい。
複数の参照物体2を培養ゲル6中に埋め込んでもよい。また、複数の特徴点3を有する参照物体2を培養ゲル6中に埋め込んでもよい。
参照物体2は、例えば、立方体、星型形状、四面体、球体であってもよい。
細胞又は細胞組織7を観察するステップでは、液体培地9中から取り出した細胞培養容器10(試料観察用セル10)を顕微鏡にセットすることにより細胞又は細胞組織7を観察することができる。細胞組織7は、明視野観察又は蛍光観察により観察することができる。細胞組織7を蛍光観察する場合、細胞培養容器10中の細胞組織7を色素で染色した後に蛍光観察を行うことができる。
また、細胞培養容器10(試料観察用セル10)をガラス容器に入れた後に顕微鏡で細胞組織7を観察してもよい。このことにより、顕微鏡に液体培地9が付着することを防止することができる。
Claims (11)
- 細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを収容するための細胞培養容器であって、
前記細胞培養容器は、枠部と、前記枠部で囲まれた少なくとも1つの窓部と、前記枠部から前記細胞培養容器の内部側に突出した少なくとも1つの凸部とを有し、
少なくとも1つの窓部は、透光性であり、かつ、栄養成分透過性を有し、かつ、前記細胞又は前記細胞組織を多面観察できるように設けられ、
前記凸部は、前記細胞又は前記細胞組織と共に前記窓部から観察できる位置に配置された特徴点を有し、
前記特徴点は、多面観察における異なる方向からの観察画像の位置合わせにおいて参照点として利用されることを特徴とする細胞培養容器。 - 少なくとも1つの窓部は、ハイドロゲル又は多孔質体であり、
前記多孔質体は、多孔質材料シート、メッシュ、エッチングシート、不織布、織布のうち少なくとも1つを含む請求項1に記載の細胞培養容器。 - 前記枠部は、立方体又は直方体であり、各面に前記窓部を設けるための開口を有する請求項1又は2に記載の細胞培養容器。
- 前記細胞培養容器は、複数の前記凸部を有し、
各凸部は、前記特徴点を有する請求項1~3のいずれか1つに記載の細胞培養容器。 - 前記凸部は、複数の特徴点を有する請求項1~4のいずれか1つに記載の細胞培養容器。
- 前記凸部は、先端部が先細りした形状を有する請求項1~5のいずれか1つに記載の細胞培養容器。
- 前記細胞培養容器は、複数の窓部を有し、
前記凸部は、少なくとも2つの窓部から観察できる位置に配置された特徴点を有する請求項1~6のいずれか1つに記載の細胞培養容器。 - 前記凸部は、少なくとも前記特徴点が自家蛍光を発する材料からなるように設けられた請求項1~7のいずれか1つに記載の細胞培養容器。
- 前記窓部は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸ナトリウム又はコラーゲンゲルを含む請求項1~8のいずれか1つに記載の細胞培養容器。
- 細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを収容するための観察用試料セルであって、
前記観察用試料セルは、枠部と、前記枠部で囲まれた少なくとも1つの窓部と、前記枠部から前記観察用試料セルの内部側に突出した少なくとも1つの凸部とを有し、
少なくとも1つの窓部は、透光性であり、かつ、栄養成分透過性を有し、かつ、前記細胞又は前記細胞組織を多面観察できるように設けられ、
前記凸部は、前記細胞又は前記細胞組織と共に前記窓部から観察できる位置に配置された特徴点を有し、
前記特徴点は、多面観察における異なる方向からの観察画像の位置合わせにおいて参照点として利用されることを特徴とする観察用試料セル。 - 細胞又は細胞組織を包埋する培養ゲルを収容した細胞培養容器中において細胞又は細胞組織を培養するステップと、
前記細胞培養容器中の培養した細胞又は細胞組織を観察するステップとを含み、
前記細胞培養容器は、少なくとも1つの窓部を有し、
少なくとも1つの窓部は、透光性であり、かつ、栄養成分透過性を有し、かつ、前記細胞又は前記細胞組織を多面観察できるように設けられ、
細胞又は細胞組織を培養するステップの前に、前記細胞又は前記細胞組織と共に前記窓部から観察できる位置に配置された特徴点を有する参照物体を前記細胞培養容器中に設けており、
前記特徴点は、多面観察における異なる方向からの観察画像の位置合わせにおいて参照点として利用されることを特徴とする細胞培養方法。
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