CZ200754A3 - Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy - Google Patents

Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy Download PDF

Info

Publication number
CZ200754A3
CZ200754A3 CZ20070054A CZ200754A CZ200754A3 CZ 200754 A3 CZ200754 A3 CZ 200754A3 CZ 20070054 A CZ20070054 A CZ 20070054A CZ 200754 A CZ200754 A CZ 200754A CZ 200754 A3 CZ200754 A3 CZ 200754A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cells
group
layer
copolymer
derived
Prior art date
Application number
CZ20070054A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ300805B6 (cs
Inventor
Lesný@Petr
Syková@Eva
Michálek@Jirí
Prádný@Martin
Jirsák@Oldrich
Martinová@Lenka
Original Assignee
Ústav experimentální medicíny AV CR
Ústav makromolekulární chemie AV CR
Technická univerzita v Liberci
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav experimentální medicíny AV CR, Ústav makromolekulární chemie AV CR, Technická univerzita v Liberci filed Critical Ústav experimentální medicíny AV CR
Priority to CZ20070054A priority Critical patent/CZ300805B6/cs
Priority to PCT/CZ2008/000005 priority patent/WO2008089708A1/en
Publication of CZ200754A3 publication Critical patent/CZ200754A3/cs
Publication of CZ300805B6 publication Critical patent/CZ300805B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01D—MECHANICAL METHODS OR APPARATUS IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS
    • D01D5/00—Formation of filaments, threads, or the like
    • D01D5/0007—Electro-spinning
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/12—Nanosized materials, e.g. nanofibres, nanoparticles, nanowires, nanotubes; Nanostructured surfaces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

Je popsán biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev sestávajícího alespon z jedné nanovlákenné vrstvy a živých bunek pevne spojených s touto nanovlákennou vrstvou, pricemž nanovlákenná vrstva je tvorena syntetickými polymery nebo kopolymery monomeruvybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny methakrylové, polyurethany, polyvinylalkohol a polymery odvozené od kyseliny mlécné a jejích derivátu, dále je popsán zpusob jeho prípravy.

Description

Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a způsob jeho přípravy
Oblast techniky
Vynález se týká biomateriálu na bázi nanovlákenných vrstev a způsobu jeho přípravy.
Dosavadní stav techniky
Příprava různých forem pevných látek vyznačujících se přítomností pórů, respektive měrného povrchu odpovídajícího rozměrům strukturních jednotek systému v řádu několika nanometrů až stovek nanometrů je v současné době v popředí zájmu materiálového inženýrství. Prakticky všechny důležité vlastnosti takových systémů se odvozují právě od mimořádně velkého měrného povrchu. Zatímco porézní materiály na bázi polymerů a nanomatcriály připravované cestou organizovaných nadmolekulárních struktur jsou dlouhodobě zevrubně studovány, vláknům o průměru řádově v desítkách až stovkách nanometrů se věnuje zvýšená pozornost teprve v posledních pěti letech. Z těchto vláken lze přitom vytvářet vlákenné vrstvy dobrých mechanických vlastností přímo v průběhu procesu zvláknění, Mechanické vlastnosti i morfologie jsou příznivě ovlivněny anizotropickým charakterem vlákenné vrstvy. Póry v takových vrstvách mají specifickou geometrii, díky níž jsou povrchy vláken dobře přístupné.
Nanovlákna jsou obecně popisována jako vlákna, jejichž průměr se pohybuje v submikronovc oblasti, tedy v rozsahu do 1000 nm. Mají řadu výjimečných vlastností, jako je například velký měrný povrch vláken, velká pórovitost vlákenné vrstvy a malý průměr pórů. Z hlediska buněčných kultur se struktura nanovlákenných vrstev přibližuje struktuře extraeelulární matrix. Tomu odpovídají opakovaná pozorování vyšší adheze buněk k nanovláknům než k mikrovláknům nebo vrstvám identických polymerů [Schindler M, Ahmed 1. Kamal J, Nur ΕΚΛ, Grafe TH, Young Chung H, et al, A synthctic nanofíhrillar matrix promotes in vivo-likc organization and morphogenesis for cells in culture. Biomaterials. 2005 Oct;26(28):5624-31.; Rho KS, Jeong L, Lee G, Seo BM, Park YJ, Hong SD, et al. Electrospinning of collagen nanofibers: effects on the behavior of normál human keratinocytes and early-stagc wound hcaling. Biomaterials. 2006 Mar:27(8).T452-6E: Min BM, Lee G, Kim SH. Nam YS, Lee TS, Park WH. Electrospinning of silk fibroin nanofibers and its effeet on the adhesion and spreading of normál human keratinocytes and fíbroblasts in vitro. Biomaterials. 2004 MarApr;25(7-8); 1289-97].
• · · · · • · * · · «·«« · · 1 · «· ·
Využití míkrovláken k vytvoření porézních trojrozměrných tkáňových náhrad obsahujících buňky je známo již od roku 1993; tato technologie sloužila nejprve k experimentální přípravě náhrad kloubních chrupavek [Robinson D, Efrat M, Mendes DG, Halperin N, Něvo Z. Implants composed of carbon liber mesh and bone-marrow-derived, chondrocyte-enrichcd cultures for joint surface reconstruction. Bull Hosp Jt Dis. 1993 Spring;53( 1):75-82.]. Toto využití míkrovláken je chráněno patentem [US 5 759 830, US 5 770 417], Prostorová síť míkrovláken zde zajišťuje mechanickou pevnost materiálu, udržuje jeho trojrozměrný tvar a vzájemné prostorové uspořádání buněk. Tato metoda však není aplikovatelná na netkané nanovlákenné textilie, protože při dosažení porozity potřebné pro vmezeření buněk mezi vlákna (póry v řádech jednotek až desítek mikrometrů) by materiál vlastní vahou kolaboval.
Standardním postupem pro udržování kultur tkáňových i kmenových buněk je kultivace vmonolayeru (růst v ploše); pro tuto kultivaci se využívá speciálně povrchově upravených materiálů, ke kterým buňky adherují (tkáňový plastik, sklo povrchově upravené laminincm. polylysinem, tkáňový plastik porostlý inaktivovanými íibroblasty apod.). Alternativní metody kultivace zahrnují kultivací v suspenzi nebo v materiálech na bázi řídkých gelů, např. MatriGel®. Všechny popsané metody kultivace mají své nevýhody. Růst buněk v kultuře v monolayeru je podmíněn jejich adhezí k materiálu, na němž jsou kultivovány; médium má přístup pouze k apikální (od kultivačního povrchu odvrácené) vrstvy; vlastnosti bunčk se mění po dosažení souvislé (konfluenlní) vrstvy; látky produkované buňkami se uvolňují do média a nezůstávají v okolí buněk. Výhodou kultivace v monolayeru je - kromě toho, že jde o velmi dobře standardizovaný postup - také možnost sledovat v mikroskopu jednotlivé buňky (obr. 1).
Při kultivaci buněk na vláknech, nebo v makroporéznícb materiálech, jejichž velikost pórů se pohybuje v řádu desítek mikrometrů, se buňky chovají podobně jako v monolayeru - porůstají rovné plochy materiálu (obr. 2),
Vrstvy z netkané nanovlákenné textilie připravené metodou elektrospinningu je možné využít ke kultivaci buněk v monolayeru podobně jako například tkáňový plastik; první experimenty s buněčnými kulturami na nanovlákenných textiliích byly publikovány v roce 2002 [Li WJ, Laurencin CL, Caterson EJ, Tuan RS. Ko FK. Elcctrospun nanofibrous structure: a novel seafťold for tissue engineering. J Biomed Mater Rcs. 2002 Jun 15:60(4):613-21.]. Systém pro kultivaci buněk na nanovlákenných vrstvách je chráněn patentem [US 6 790 455], Očekávané • · · * · *····· · · · ···* »» ·· ··· ·· · 'V prospěšné využití nanovlákenných vrstev v biomedicíně vedlo k podání souhrnné patentové přihlášky [PCT/US2004/029765], ve které však použití nanovláken pro konstrukci tkáňových náhrad není zmiňováno.
Řada autorů se pokoušela o vytvoření trojrozměrné tkáňové náhrady s využitím nanovláken. Patentováno bylo využití nanovlákenné vrstvy jako základu, na kterém jsou kultivovány buňky hladké svalovány a na nich jsou poté vytvářeny další buněčné vrstvy oddělované biomateriálem (například na bázi polymeru) [US 6 428 802J. Zveřejněna byla i možnost vytvoření tkáňové náhrady pomocí kultivace buněk na rovnoběžných vrstvách ze sítě nanovláken a podkladové vrstvy (nosiče, v originále substráte). Tyto vrstvy dále mohou být od sebe odděleny libovolným biomateriálem [WO 2005/047493]. Ani zde však není popsán vznik homogenní tkáně vzájemným propojením vrstev obsahujících buňky.
Biomateriály na základě kopolymeru 2-hydroxyethvlmethakrylátu (HEMA)již byly opakovaně připraveny. Tyto kopolymery jsou vysoce biokompatibilní a adhezc buněk k jejich povrchům závisí na jejich elektrickém náboji [Lesný P, Pradny M, Jendelova P, Michalek J, Vacik J. Sykova E. Macroporous hydrogels based on 2-hydroxyethyl metliacrylate. Part 4: Growth of rat bone marrow stromal cells in three-dimensional hydrogels with positive and negative surface charges and in polyelectrolyte complexes. Journal of materials science. 2006 Sep;17(9):829-33.].
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev, jehož podstata spočívá v tom, že sestává alespoň z jedná nanovlákenné vrstvy a živých buněk pevně spojených s touto nanovlákennou vrstvou, přičemž nanovlákenná vrstva je tvořena syntetickými polymery nebo kopolymery monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny methakrylové, polyurethany, polyvinylalkohol a polymery odvozené od kyseliny mléčné a jejích derivátů.
Význakem biomateriálu podle předloženého vynálezu je, že nanovlákenná vrstva je netkaná.
S výhodou jsou monomery vybrány ze skupiny zahrnující 2-hydroxyethyImelhakrylát, 2ethoxyethylmethakrylát a 2-hydroxypropyImethakrylamid.
Význakem vynálezu je, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové. buňky parenchymatózních orgánů a mczenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně. S výhodou jsou buňky vybrány ze skupiny zahrnující chondrocyty, fibroblasty, hepatocyly a mezenchytnální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
Biomateriál podle předloženého vynálezu je určen ke konstrukci dvoj- i trojrozměrných struktur, využitelných ve tkáňovém inženýrství.
Význakem předloženého vynálezu je biomateriál podle předloženého vynálezu, sestávající alespoň ze dvou nanovlákenných vrstev porostlých na obou stranách souvisle živými buňkami, přičemž tyto vrstvy jsou vzájemně propojeny prorůstáním buněk.
Význakem dalšího provedení předloženého vynálezu je biomateriál podle předloženého vynálezu, sestávající z jedné nanovlákennc vrstvy porostlé na jedné straně živými buňkami, kde buňky jsou funkčně polarizované.
Schopnost polymeru formovat se do vláken, tedy zvlákňovat se,je ovlivněna řadou procesních a materiálových parametrů, jako je například intenzita elektrického pole, elektrická vodivost, viskozita. molární hmotnost, povrchové napětí, koncentrace polymeru, rozpouštědlo, dielcktrické vlastnosti polymemího roztoku, hydroíi Inost/hydrolobnost. polymerizační stupeň a stupeň větvení polymeru nebo uspořádání experimentu, Vlastnosti zvlákněného materiálu ovlivňuje nejen chemické složení polymeru, ale i parametry zvlákňování. Změnou uvedených parametrů lze ovlivnit nejen proces zvlákňování, ale v určitých mezích i strukturu výsledné vrstvy a jemnost vláken. Pro každý polymemí roztok zvlákňovaný metodou elektrostatického zvlákňování je však třeba zvlášť hledat optimální procesní a systémové parametry, protože nalezené parametry jsou přenositelné jen ve velmi omezené míře.
Způsobem přípravy nanovláken syntetického polymeru nebo kopolymerů podle předloženého vynálezu může být metoda elektrostatického zvlákňování ..Nanospider1'. při které jsou vlákna formována účinkem elektrostatického pole z tenké vrstvy polymemího roztoku, vynášené brodícím válečkem, který je zároveň kladnou elektrodou, a jsou ukládána na kolektor, který je zároveň protielektrodou [CZ 294274 (B6), WO 2005/024101], » · ·· ·
Kontakt s molekulami extracelulární matrix a adheze k nim jsou pro většinu buněk velmi důležité faktory, které podmiňují jejich adhezi a růst v organismu. Kultivace buněk ve dvojrozměrných kultivačních systémech neodráží přirozené prostředí v organismu. Struktura nanovlákenné vrstvy je přirovnávána ke struktuře bazální membrány.
Buňky výrazně adherují na nanovlákenné vrstvy biomateriálu podle předloženého vynálezu tvořené polymery s nanovlákennou strukturou, a to i tehdy, když nejeví afinitu k vlastním polymerům bez nanovlákenné struktury. Po naočkování buněk na vrstvu nanovláken dojde v době dnů až týdnů (v závislosti na koncentraci buněk) ktomu, že buňky vrstvu nanovláken hustě porostou a jejich výběžky vrostou i mezi vlákna. Je-li vrstva nanovláken dostatečně tenká (jednotky až desítky mikrometrů), přesahuje růst buněk až na opačnou stranu vrstvy; od tloušťky vrstvy cca 100 mikrometrů již buňky na druhou stranu vrstvy nepřesahují.
Kultivace buněk na vrstvách nanovláken má řadu předností před jejich kultivací v monolayeru, v suspenzi nebo v gelu. Při kultivaci na nanovláknech má - na rozdíl od kultivace v monolayeru médium přístup k apikální (od vrstvy nanovláken odvrácené) i bazální (k nanovláknům přivrácené) straně buněk. Pokud se při kultivaci nanovlákenná textilie umístí na rozhraní dvou prostředí odlišujících se buď fyzikálními (teplota) nebo chemickými (koncentrace růstových faktorů, složení média) vlastnostmi tak, že jedno prostředí je v kontaktu s apikální stranou buněk, a druhé prostředí je v kontaktu s bazální stranou buněk, může rozdíl těchto vlastností na apikální a bazální straně buňky vyvolat její funkční polarizaci (zejména odlišnou koncentraci receptoru na membráně apikální a bazální části buňky). Funkční polarizace buněk může být dále využívána, například při konstrukci detoxikacních bioreaktoru obsahujících hepatocyty, vc kterých je simulováno fyziologické umístění hcpatocytu mezi kapilární a biliární řečiště [Ostrovidov S, Jiang J, Sakai Y, Fujii T. Membrane-bascd PDMS nhcrobioreactor for perfused 3D primary rat hepatocyte cultures. Biomed Microdevices, 2004 Dec;6(4):279-87.j. Další předností buněčných kultur na nanovlákcnných vrstvách jc možnost oboustranného růstu buněk na nanovlákenné vrstvě. Buňky rostoucí na nanovlákenné vrstvě si současně zachovávají schopnost růstu v prostoru, která se projevuje tak, že při přiblížení dvou nanovlákcnných vrstev, obsahujících buňky, k sobě dojde ke srůstu těchto vrstev.
Předmětem předloženého vynálezu je způsob přípravy biomateriálu podle předloženého vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se připraví syntetický polymer nebo kopolymer ·«* monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové. amidy kyseliny methakrylové, polyurethany, polyvinylalkohol a polymery odvozené od kyseliny mléčné a jejích derivátů, připravený syntetický polymer nebo kopolymer se zvlákní metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu), následně se na metodou elektrostatického zvlákňování připravenou zvlákněnou vrstvu syntetického polymeru nebo kopolymeru vysejí buňky a kultivují se za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur do dosažení souvislé (konfluentní) vrstvy buněk.
Standardní podmínky pro pěstování tkáňových kultur zahrnují použití kombinace média vhodného pro daný typ buněk, fetálního telecího séra nebo jeho náhrady, antibiotik, případně růstových faktorů, a kultivace probíhá v inkubátorech při 37 °C a 5 % CO?, kultivační médium je měněno každé 2-3 dny.
S výhodou jsou monomery vybrány ze skupiny zahrnující 2-hydraxyethylniethakrylát, 2elhoxycthylmethakrylát a 2-hydroxypropylmethakrylamid.
Význakem způsobu podle vynálezu je, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové, buňky parenchymatózních orgánů a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně. S výhodou jsou buňky vybrány ze skupiny zahrnující chondrocyty. fibroblasty, hepatocyty a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
Význakem předloženého vynálezu je způsob přípravy biomateriálu podle předloženého vynálezu, sestávajícího alespoň ze dvou nanovlákenných vrstev navzájem propojených prorůstáním buněk, jehož podstata spočívá v lom, že se připraví syntetický polymer nebo kopolymer monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny methakrylové, polyurethany, polyvinylalkohol a polymery odvozené od kyseliny mléčné a jejích derivátů, připravený syntetický polymer nebo kopolymer se zvlákní metodou elektrostatického zvlákňování, následně se na metodou elektrostatického zvlákňování připravenou zvlákněnou vrstvu syntetického polymeru nebo kopolymeru vysejí buňky a kultivují sc za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur do dosažení souvislého pokrytí nanovlákennc vrstvy, a poté se alespoň dvě vrstvy zvláknčného syntetického polymeru nebo kopolymeru, porostlé buňkami, manuálně nebo automaticky naskládají na sebe a tato soustava vrstev se zatíží tlakem 5 až 20 g/cm3 a kultivuje se za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur po dobu I až 4 týdnů.
S výhodou jsou monomery vybrány ze skupiny zahrnující 2-hydroxycthylmethakrylát, 2ethoxyethylmethakrylát a 2-hydroxypropylmethakrylamid.
Význakem tohoto provedení vynálezu je, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové, buňky parenchymatózních orgánů a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně. S výhodou jsou buňky vybrány ze skupiny zahrnující chondrocyly, fíbroblasly, hcpatoeyty a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
Význakem předloženého vynálezu je také způsob přípravy biomatcriálu podle předloženého vynálezu, obsahujícího funkčně polarizované buňky, jehož podstata spočívá vtom, ž.e se připraví syntetický polymer nebo kopolymer monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny methakrylové, polyurethany, polyvinylalkohol a polymery odvozené od kyseliny mléčné ajejich derivátů, připravený syntetický polymer nebo kopolymer se zvlákrrí metodou elektrostatického zvlákňování, následně se na metodou elektrostatického zvlákňování připravenou zvlákněnoti vrstvu syntetického polymeru nebo kopolymeru vysejí buňky a kultivují se za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur, přičemž se vrstva zvlákněného syntetického polymeru nebo kopolymeru v průběhu kultivace buněk umístí na rozhraní dvou prostředí odlišujících se fyzikálními nebo chemickými vlastnostmi. S výhodou jsou monomery vybrány ze skupiny zahrnující 2hydroxyethylmethakrylát, 2-ethoxyethylmcthakrylát a 2-hydroxypropylmethakrylamid.
Význakem tohoto provedení vynálezu je. že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové, buňky parenchymatózních orgánů a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně. S výhodou jsou buňky vybrány ze skupiny zahrnující chondrocyty, fibroblasíy. hepatocyty a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
Celý postup podle vynálezu tedy spočívá v neoddělitelných procesech zahrnujících přípravu a charakterizaci polymeru, proces zvláknění, osídlení nanovláken vhodnou buněčnou kulturou, • * ζ · • · · « · *♦#· ·· ·· kultivaci buněk na vrstvě nanovláken a zformování výsledného materiálu do podoby vhodné k vyhrané aplikaci v tkáňovém inženýrství nebo konvenčním léčebném procesu.
Biomcdicinální aplikace
V oblasti biomedicinálních aplikací je nutné brát zřetel na kvalitu použitého materiálu l několika úhlů pohledu. První hledisko jsou výsledné užitné fyzikálně-chemické vlastnosti, jako jsou mechanické (pevnost, tvrdost, houževnatost, elasticita), botnací (rovnovážný obsah vody), transportní (permeabilita), optické (index lomu) a povrchové (drsnost, smáěivost, kontaktní úhel) vlastnosti. Dalšími podstatnými hledisky jsou pak fyzikální a chemická struktura materiálu, které významně ovlivňují biotoleranci materiálu v aplikacích v daném prostředí. Jedná se o požadovanou interakci materiálu s živou tkání, tedy buněčnou kulturou, dále o jeho chemickou stabilitu, respektive řízenou biodegradaei. Požadavky kladené na vlastnosti biomateriálů jsou často protichůdné a je nutno hledat kompromis mezi nimi. Proto také pro řadu aplikací existuje pouze úzký výběr vhodných chemických struktur.
Dalším problémem bioaplikací jsou nutné dlouhodobé testy vlastních účinků a zejména možných nežádoucích účinků použitých látek. Ze všech uvedených důvodů rezultuje přirozená snaha testovat v nových aplikacích již zavedené a tedy dlouhodobě užívané vyzkoušené materiály, které mají dobrý předpoklad vyhovět v testech toxicity respektive snášenlivosti.
V oblasti hydrogelů je takovým materiálem síťovaný poly(2-hydroxycthylmethakrylát) a některé jeho kopolymery nebo poly(2-hydroxypropylmethakrylaniid).
Biomatcriál podle předloženého vynálezu jc ve tkáňovém inženýrství možné využít například jako plošný nosič buněk, produkujících růstové faktory; je-li vrstva nanovláken připravena z nedegradovalelného materiálu a porostlá z jedné strany buňkami, uvolňují tyto buňky růstové faktory, které mohou prostupovat vrstvou nanovláken. Přiloží-li se takto připravený materiál na cílové místo, dosáhne se působení růstových faktorů, aniž by bylo cílové místo v přímém kontaktu s buňkami. Příklad použití; kožní kryly porostlé alogenními fibroblasty, které po přiložení na ránu uvolňují faktory napomáhající hojení.
Biomateriál podle předloženého vynálezu lze využít i jako nosič polarizovaných buněčných kultur; necháme-li vrstvu nanovláken porůst z jedné strany buňkami a umístíme-li ji na rozhraní dvou prostředí s odlišným složením média, vznikne polarizovaná buněčná kultura, ve ·»»· 99
9 9 9 9 9 •· *·· ·· * které mají buňky na straně odvrácené od nanovláken i na straně přivrácené k nanovláknům odlišné povrchové vlastnosti. Příklad použití: hepatální bioreaktor,
Dalším využitím biomateriálu podle předloženého vynálezu může být konstrukce trojrozměrných orgánových náhrad: seskládáním nanovlákenných vrstev porostlých buňkami a jejich rovnoměrným zatížením je možné vytvořit trojrozměrné implantáty. Vhodnou kombinací parametrů - zatížení, tloušťka vrstvy, procento plochy porostlé buňkami, počet vrstev a typy buněk v jednotlivých vrstvách - můžeme dosáhnout i vzniku relativně komplexních tkání. Příklad: kombinací vrstev porostlých hcpatocyty a vrstev s buňkami endotelu lze vytvořit tkáňovou náhradu s podobným zastoupením buněk,jakéjc v jaterní tkáni.
Přehled obrázků
Obr. 1 znázorňuje lidské stromální buňky kostní dřeně rostoucí v monolayeru na plastiku pro tkáňové kultury. Černá úsečka znázorňuje měřítko - 100 pm.
Obr. 2 znázorňuje lidské chondrocyty (šipka) rostoucí na povrchu polylaktidového vlákna o tloušťce 50 mikrometrů. Černá úsečka znázorňuje měřítko = 50 pm,
Obr. 3 ukazuje schéma přístroje pro elektrospinning. Použité vztahové značky: 1 - kovový válec, kladná elektroda, 2 - zvlákňovaná vrstva polymerního roztoku, 3 - rezervoár polymerního roztoku, 4 - textilní substrát (podpůrný materiál), 5 - směr vzniku nanovláken. 6 - záporná uzemněná elektroda, 7 - odsávání vzduchu a par.
Obr. 4 ukazuje strukturu nanovlákenné vrstvy zobrazenou elektronovým mikroskopem AQUASF.M.
Obr. 5 znázorňuje růst lidských chondroeylů obarvených pomocí imunofluoresccnce CFDA-SE (karboxyfluorescein diacetát, sukcinimidy 1 ester) na vrstvě nanovláken; (A) z horní strany jsou viditelné celé buňky (šipka), (B) ze spodní strany jsou viditelné pouze jejich výběžky. Bílá úsečka znázorňuje měřítko = 100 pm.
Obr. 6 znázorňuje vznik tkáně v nanovlákenném implantátu připraveného stočením nanovlákem do ruličky v míše laboratorního potkana, a jejím vložením v podélné ose míchy ( Α,Ο,Ε,Ο,Ι) nebo kolmo na podélnou osu míchy (B,D,F,H,J,K.,L).
A,B - přehledné barvení hematoxylincm-eosinem, obdélníky označují výřezy s vysokou a s nízkou denzitou buněk které jsou dále zobrazeny ve větším měřítku. Měřítko = 5()0pm.
C.D - detaily vrůstání tkáně s vysokou denzitou buněk, barvení hematoxylinem-eosínem. Měřítko - lOOpm.
·*«* ·♦ • · · « ·· · · · · ·
ÍO
E,F - detaily vrůstání tkáně s nízkou denzitou buněk, barvení hematoxylinem-eosinem; Měřítko - lOOpm.
G.H - přehledné imunohistochemické barvení protilátkou proti NF160; obdélníky označují výřezy, které jsou dále zobrazeny ve větším měřítku. Měřítko = 500pm.
I - NFI60 u implantátu vloženého kolmo na podélnou osu míchy rostou pozitivní výběžky nervových buněk podél okraje implantátu, Měřítko = lOOpm.
J,K - NF160 pozitivní výběžky nervových buněk vrůstající do implantátu vloženého v podélné ose míchy. Měřítko = lOOpm.
L - NF160 pozitivní výběžky nervových buněk vrůstající do implantátu vloženého v podélné ose míchy. Měřítko _ 50pm.
Obr. 7 znázorňuje růst potkaních stromálních buněk kostní dřeně barvených imunofluorescencně phalloidinem (cytoskelet buněk) a DAPI (jádra buněk) na vrstvě nanovláken v různém zvětšení.
Obr. 8 znázorňuje biomatcriál vzniklý růstem lidských chondrocytů na vrstvách nanovláken, které byly k sobě přiblíženy a rovnoměrně zatíženy; barveno hematoxylinem-cosinem.
A - přehledný obrázek, B - detail z obrázku A, na kterém je vidět homogenita tkáně; měřítko 500 pm.
Obr. 9 znázorňuje lidské stromální buňky kostní dřeně barvené phalloidinem (cytoskelet buněk) a DAPI (jádra buněk) rostoucí mezi dvěma vrstvami nanovlákenné textilie.
Obr. 10 ukazuje růst potkaních stromálních buněk kostní dřeně na vrstvě nanovláken rekonstrukce zobrazení v konfokálnínt mikroskopu, pořízená pomocí software Amira®. Cytoskelet buněk byl barven phalloidinem. A - střed nanovlákenné vrstvy s konfluentnč rostoucími buňkami, B - pohled z boku s vyznačením pozice nanovlákenné vrstvy (světle) a prorůstajících výběžkůbuněk (tmavě), C - místo, kde byla nanovlákenná vrstva zvlněná: buňky kopírují tvar vrstvy, D - okraj nanovlákenné vrstvy, kde buňky rostly izolovaně.
Obr. 11 Růst potkaních mezenchymálnich buněk derivovaných z. tukové tkáně na vrstvě nanovláken, barveno phalloidinem. A - přehledné zobrazení, měřítko = 500 pm. B - detail, měřítko = 100 pm.
Obr. 12. znázorňuje růst lidských chondrocytů v zatížené a nezatížené části téhož vzorku. A při růstu v zatížené části vzorku docházelo k propojování jednotlivých nanovlákenných vrstev růstembuněk; dochází zde i k usazování extracelulární matrix. Barvení na kolagen typu II, Měřítko - 100 pm. B - při růstu na vrstvách nanovláken v nezatížené části vzorku nedochází ke spojování vrstev ani k ukládání extracelulární matrix. Barveno hematoxylinem-eosinem. Měřítko = 100 pm.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Kopolymer 2-hydroxyethylmelhakrylátu (25,5 g) s 2-ethoxyethylmethakrylátcm (60 g) byl připraven oxidačně redukční radikálovou polymerací monomerů účinkem persíranu amonného (0,5 g) a pyrosiřicitanu sodného (0,5 g) ve vodné ethanolickém roztoku (380 g ethanolu, 170 g vody) při 23 °C po dobu 7 dnů. Poté byl vzniklý kopolymer vysrážen do vody (3 I), vysušen a rozpuštěn v ethanolu na koncentraci 16,6 %. Molámí hmotnost kopolymerů byla 6,78 . 10’ g/mol, vnitřní viskozita 27.1.
Příklad 2
Polymer 2-ethoxyethylmethakrylátu (85.5 g) byl připraven oxidačně redukční radikálovou polymerací monomeru účinkem persíranu amonného (0,5 g) a pyrosiřicitanu sodného (0.5 g) ve vodné - ethanolickém roztoku (380 g ethanolu, 170 g vody) při 23 °C po dobu 7 dnů. Poté byl vzniklý polymer vysrážen do vody (3 1), vysušen a rozpuštěn v absolutním ethanolu na koncentraci 16.1 % . Molámí hmotnost kopolymerů byla 6.78 . 10? g/mol, vnitřní viskozita 26,9.
Příklad 3
Poly(2-hydroxypropylmethakrylamid) byl připraven srážecí polymerací 10 g monomeru účinkem 0,1 g azobis(isobutyronilrilu) při 60 °C po dobu 8 hod. v 40 g acetonu, následným promytím polymeru acetonem a vysušením. Molární hmotnost polymeru byla 8,2 . 10\
Příklad 4
Roztok kopolymerů podle příkladu 1 byl zvlákněn metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospidcr. Schéma přístroje je znázorněno na obr. 3 a podrobně bylo popsáno již dříve [CZ 294274 (B6), WO 2005024101]. Zvláknění probíhalo při napětí 25 kV.
Příklad 5
Polyuretan o molární hmotnosti 2000 (lineární polykarbonátový diol a alifatický ísophorondiizokyanát) (Larithane LSI086 od firmy Novotcx. ítálie) byl zvlákněn z 15% hmot, roztoku dimethyl formám idu s 1% hmot. tetracthylamoniumbromídu (vztaženo na polyuretan) metodou «·»« ·· elektrostatického zvláknování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Zvláknění probíhalo při 25 kV.
Příklad 6
Polyvinylalkohol se stupněm hydrolýzy 80+8 % (Sloviol R - Chemické závody Nováky, Slovensko) byl /vlákněn z 12 % hmot. vodného roztoku spolu sglyoxalem (3% hmot.) a kyselinou trihydrogenfosforečnou (4,5 % hmot) metodou elektrostatického zvláknování (clcktrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Zvláknění probíhalo při 25 kV.
Následně byla vlákenná vrstva zaltřáta na 140°C po dobu 3 minut, při čemž došlo k zesíťění a tím stabilizaci vláken proti rozpouštění ve vodě.
Příklad 7
Kopolymer kyseliny mléčné a glykolové - (typ 7525DL 11IGH IV od firmy Lakeshore Biomaterials Birmingham,AL) by] zvíákněn z 15% hmot. roztoku v dichlormethanu a acetonu (4:1) metodou elektrostatického zvláknování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Zvláknění probíhalo při 25 kV.
Příklad 8
16.6 % ethanolický roztok polymeru podle příkladu 1, jehož vodivost byla upravena přídavkem nasyceného roztoku chloridu sodného na 260 pS/cm, byl zvíákněn metodou elektrostatického zvláknování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Povrchové napětí polymerního roztoku bylo 27.07 niN/m, napětí při zvláknění 30 kV. Vzniklá nanovlákcnná struktura je dokumentována na obr. 4 (fotografie z mikroskopu AQUASEM ve velkém zvětšení).
Příklad 9
16,1 % vodné - ethanolický roztok (66,3 % ethanolu) polymeru podle příkladu 2. jehož vodivost hýla upravena přídavkem nasyceného roztoku chloridu sodného na 260 pS/cin, byl zvíákněn metodou elektrostatického zvláknování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Povrchové napětí polymerního roztoku bylo 26,9 mN/rn. napětí při zvláknění 34 kV.
Příklad 10 • · * ·
16,8 % vodný roztok polymeru podle příkladu 3, jehož vodivost byla upravena přídavkem nasyceného roztoku chloridu sodného na 270 pS/cm, byl zvláknčn metodou elektrostatického zvlákňování (elektrospinningu) na laboratorním modelu zařízení pro technologii Nanospider. Povrchové napětí polymerního roztoku bylo 26,2 mN/m, napětí při zvláknění 31 kV.
Příklad 11
Vrstva nanovláken podle příkladů 1 a 4 o ploše 5mm2 a tloušťce 50 pm byla na jednu hodinu ponořena do suspenze chondrocytů, označených plazmatickým barvivém CTDA, o koncentraci 1 xlO6 buněk/ml a kultivována po dobu 2 dní vc standardních podmínkách pro pěstování tkáňových kultur (médium DMEM/F12 1:1, 10% FC'S, pěnicilin+strcptomycin, inkubátor s 5 % CO;>, 37 °C). Po uplynutí této doby byla vrstva nanovláken hustě porostlá z obou stran chondrocyly. Na obr. 5 je ukázán růst buněk z horní (A) a ze spodní (B) strany nanovlákenné
Příklad 12
Na vrstvu nanovláken o ploše 5mm2 a tloušťce 50 pm připravenou podle příkladů 1 a 4 byly vysety potkaní buňky olfaktorické glie (OEG); vrstva byla stočena do roličky o tloušťce 1,5 mm a délce 1 mm a vložena do míchy laboratorního potkana. Po uplynutí 2 týdnů buňky pojivové tkáně a cévy masivně prorostly do implantované nanovlákenné roličky. V okolní tkáni nedošlo k zánčtlivé infiltraci. Z proximálního i distálního okolí implantátu (roličky) prorůstala u implantátů, jejichž osa byla totožná s osou míchy, i vlákna nervových buněk; u implantátů, ktcrc byly kolmé na osu míchy vlákna nervových buněk prorůstala jen minimálně (obr. 6).
Příklad 13
Na vrstvu nanovláken připravenou podle příkladů 1 a 4 o ploše 5mm2 a tloušťce 50 pm byly vysety potkani stromální buňky kostní dřeně v koncentraci 1Ί04 / cm’. Buňky byly obarveny phalloidinem (Červeně) a jádra dobarvena DAPI (modře). Za sedm dní porostly obě buněčné kultury (srovnatelně navzájem) nanovlákcnnou vrstvou srovnatelně jako při růstu na standardním polystyrenu upraveném pro růst tkáňových kultur (obr. 7),
Přiklad 14 p
Pět jednotlivých vrstev nanovláken připravených podle příkladu 1 a 4 o ploše 5mm‘ a tloušťce 50 pm bylo ponořeno na 1 h do suspenze lidských chondrocytů o koncentraci 1x 106 buněk/ml T ' · · · « « » » · , t · ♦«« * * * ···· 1· ·· ··· ·* * a kultivováno po dobu 2 dní ve standardních podmínkách pro pěstování tkáňových kultur (médium 0MEM/F12 1:1, 10% FCS, penicilín + streptomycin; inkubátor 5 % CO? a 37 °C) tak, aby chondrocvty porostly obě strany každé vrstvy netkané nanovlákcnné textilie. Vrstvy byly poté naskládány na sebe. rovnoměrně zatíženy (10 g/cm2) a kultivovány po následující tři týdny opět za stejných standardních podmínek jako předchozí kultivace. Po této době v materiálu vznikla řídká mezenchymální tkáň prorostlá všemi vrstvami nanovláken (obr. 8).
Přiklad 15 •J
Pět jednotlivých vrstev nanovláken připravených podle příkladů 1 a 4 o ploše 5mm” a tloušťce 50 pm bylo ponořeno na 1 h do suspenze lidských stromální buněk kostní dřeně o koncentraci MCE buněk/ml a kultivováno po dobu 2 dní ve standardních podmínkách pro pěstování tkáňových kultur (médium DMEM/F12 1:1, 10% FCS, penicilín + streptomycin; inkubátor 5 % CO? a 37 °C) tak, aby buňky porostly obě strany každé vrstvy netkané nanovlákenné textilie. Vrstvy byly poté naskládány na sebe. rovnoměrně zatíženy (10 g/cm2) a kultivovány po následující dva týdny za stejných standardních podmínek jako předchozí kultivace. Po této době buňky propojily jednotlivé vrstvy nanovlákenné textilie (obr. 9).
Příklad 16
Na vrstvu nanovláken připravenou podle příkladů 1 a 4 o ploše lem“ a tloušťce 50 pm byly vysety stromální buňky kostní dřeně a mezenchymální buňky derivované z tukové tkáně v koncentraci INCE / cm’. Po 3 dnech kultivace ve standardních podmínkách pro pěstování tkáňových kultur buňky porostly celou vrstvu nanovláken; zobrazení v konlbkálním mikroskopu po obarvení phalloidincm ukázalo, že buňky porůstají souvisle (konfluentně) vrstvu nanovláken (obr. 10A) a vysílají výběžky do vrstvy nanovláken (obr. 10B). V místech, kde byla nanovlákenná vrstva zvlněná, porůstaly buňky její povrch (obr. 10C); buňky rostly i na okraji nanovlákenné vrstvy, kde byla koncentrace buněk nejnižší (obr. 1 OD).
Příklad 17
Stejný experiment jako v příkladu 16 byl zopakován s vrstvou nanovláken připravenou podle příkladů 3 a 10 o ploše lem2 a tloušťce 50 pm. 3D zobrazení v konfokálním mikroskopu po obarvení buněk phalloidinem prokázalo obdobný růst, jako v předchozím případě (obr. 10E), v místech na okrajích rostly na povrchu vrstvy izolované buňky (obr. 10F).
Příklad 18
Na vrstvách nanovláken připravených podle příkladů 2 a 9 (obr, 11 A) a 3 a 10 (obr.l 1B) byly kultivovány za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur mezenchymální buňky derivované z tukové tkáně laboratorního potkana po dobu 4 dnů. Poté byly buňky obarvené phalloidincm. Buňky porostly konfluentně vrstvu nanovláken.
Příklad 19 jednotlivých vrstev nanovláken připravených podle příkladů 1 a 4 o ploše lOmm a tloušťce 50 pm bylo ponořeno na 1 h do suspenze lidských chondrocytů o koncentraci 1 * 106 buněk/ml a kultivováno po dobu 2 dní ve standardních podmínkách pro pěstování tkáňových kultur (médium DMEM/P12 1:1, 10% FCS, penicilín + slreptomycin; inkubátor 5 % CO2 a 37 °C) tak, aby chondrocyty porostly obě strany každé vrstvy netkané nanovlákenné textilie. Vrstvy byly poté naskládány na sebe, nerovnoměrně zatíženy (0-20 g/cm2) a kultivovány po následující tři týdny opět za stejných standardních podmínek jako předchozí kultivace.
Po této době v části materiálu, která byla zatížena vyšším tlakem než 5g/cm . vznikla řídká mezenchymální tkáň prorostlá všemi vrstvami nanovláken a došlo k ukládání extracclulární matrix (obr. 12A); v nezatížené částí materiálu nedošlo k propojení vrstev (obr. 12B).
Příklad 20
Na vrstvu nanovláken podle příkladů 1 a 4 o ploše 1 cm byly vysety buňky primokulturv olfaktorické glie laboratorního potkana. Tato vrstva byla umístěna do poloviny výšky zkumavky zcela naplněné kultivačním roztokem (médium DMEM/F12 1:1, 10% PCS. penicilin+streptomycin). Zkumavka byla umístěna do inkubátoru (37 °C, 5% CO?). Po dvou hodinách byl na hladinu přidán útržek filtračního papíru, který obsahoval 2 pg faktoru NT3 a 2 pg barviva (fenolová červeň). Po dobu 4 hodin byla zkumavka ponechána na místě a nebylo s ní manipulováno. Po této době byi ve zkumavce viditelný gradient barviva s maximem při hladině a minimem při dně zkumavky. Vrstva nanovláken obsahující buňky byla fixována, obarvena fluorescenčními protilátkami proti receptoru p75 a byla vyhodnocena intenzita obarvení buněčných membrán na straně přivrácené ke zdroji faktoru NT3 a na opačné straně. Pomocí obrazové analýzy byl poměr intenzity fluorescence buněčných membrán roven 2,3 : 1, což ukazuje funkční polarizaci - odlišnou distribuci p75 reecptorů na buněčné membráně přivrácené a odvrácené ke zdroji růstového faktoru NT3.

Claims (19)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Biomaleriál na bázi nanovlákenných vrstev, vyznačený tím, že sestává alespoň z jedné nanovlákenné vrstvy a živých buněk pevné spojených s touto nanovlákennou vrstvou, přičemž nanovlákenná vrstva je tvořena syntetickými polymery nebo kopolymery monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny methakrylové, polyurethany, polyvinylalkohol a polymery odvozené od kyseliny mléčné a jejích derivátů.
  2. 2. Biomateriál podle nároku 1, vyznačený tím, že nanovlákenná vrstva je netkaná.
  3. 3. Biomateriál podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že monomery jsou vybrány ze skupiny zahrnující 2-hydroxyethylmethakrylát, 2-ethoxyethylmethakrylát a 2-hydroxypropylmelhakrylamid.
  4. 4. Biomateriál podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačený tím. že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové, buňky parenchymatózních orgánů a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně,
  5. 5. Biomateriál podle nároku 4, vyznačený tím, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující chondrocyty, íibroblasty, hepatocyty a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
  6. 6. Biomateriál podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačený tím, že sestává alespoň ze dvou nanovlákenných vrstev porostlých na obou stranách souvisle živými buňkami, přičemž vrstvy jsou vzájemně propojeny prorůstáním buněk.
  7. 7. Biomaleriál podle kteréhokoliv /.nároků 1 až 5. vyznačený tím. že sestává z jedné nanovlákenné vrstvy porostlé na jedné straně živými buňkami, kde buňky jsou funkčně polarizované.
  8. 8. Způsob přípravy biomateriálu podle nároku 1, vyznačený tím, že se připraví syntetický polymer nebo kopolymer monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny methakrylové, polyurethany. polyvinylalkohol a polymery odvozené od kyseliny mléčné a jejích derivátů, připravený syntetický polymer nebo kopolymer
    4 · • *
    4 · · · se zvlákní metodou elektrostatického zvlákňování, následně se na metodou elektrostatického zvlákňování připravenou zvlákněnou vrstvu syntetického polymeru nebo kopolymeru vysejí buňky a kultivují se za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur do dosažení souvislé vrstvy buněk.
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že monomery jsou vybrány ze skupiny zahrnující 2hydroxyethylmethakrylát. 2-ethoxyethylmcthakrylát a 2-hydroxypropylmelhakrylamid.
  10. 10. Způsob podle nároku 8 nebo 9, vyznačený tím. že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové, buňky parenchymatózních orgánů a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
  11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující chondrocyty, fibroblasty, hepatocyty a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
  12. 12. Způsob přípravy biomateriálu podle nároku 6, vyznačený tím. že se připraví syntetický polymer nebo kopolymer monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny methakrylové, polyurethany, polyvinylalkohol a polymery odvozené od kyseliny mléčné a jejích derivátů, připravený syntetický polymer nebo kopolymer se zvlákní metodou elektrostatického zvlákňování, následně se na metodou elektrostatického zvlákňování připravenou zvlákněnou vrstvu syntetického polymeru nebo kopolymeru vysejí buňky a kultivují se za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur do dosažení souvislého pokrytí nanovlákcnné vrstvy buňkami, a poté se alespoň dvě vrstvy zvlákněného syntetického polymeru nebo kopolymeru, porostlé buňkami, manuálně nebo automaticky naskládají na sebe a tato soustava vrstev se zatíží tlakem 5 až 20 g/cm'1 a kultivuje se za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur po dobu I až 4 týdnů.
  13. 13. Způsob podle nároku 12. vyznačený tím, že monomery jsou vybrány ze skupiny zahrnující
    2-hydroxyethylmelhakrylát, 2-ethoxycthylmethakrylát a 2-hydroxypropylmcthakrylamid.
  14. 14. Způsob podle nároku 12 nebo 13, vyznačený tím, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové, buňky parenchymatózních orgánů a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
    • ·
  15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačený lim, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující chondrocyty. ííbroblasty, hepatocyty a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
  16. 16. Způsob přípravy biomatcrialu podle nároku 7, vyznačený tím, že se připraví syntetický polymer nebo kopolymer monomerů vybraných ze skupiny zahrnující estery kyseliny methakrylové, amidy kyseliny methakrylové, polyurethany, polyvinylalkohol a polymery odvozené od kyseliny mléčné a jejích derivátů, připravený syntetický polymer nebo kopolymer se zvlákní metodou elektrostatického zvlákňování, následně se na metodou elektrostatického zvláknování připravenou zvlákněnou vrstvu syntetického polymeru nebo kopolymeru vysejí buňky a kultivují se za standardních podmínek pro pěstování tkáňových kultur, přičemž se vrstva zvlákněného syntetického polymeru nebo kopolymeru v průběhu kultivace buněk umístí na rozhraní dvou prostředí odlišujících se fyzikálními nebo chemickými vlastnostmi.
  17. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačený tím, že monomery jsou vybrány ze skupiny zahrnující
    2-hydroxyethylmethakrylát, 2-ethoxyethylmethakrylát a 2-hydroxypropylmethakrylamid.
  18. 18. Způsob podle nároku 16 nebo 17, vyznačený tím. že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující buňky pojivové tkáně, buňky epitelové, buňky parenchymatózníeh orgánů a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
  19. 19. Způsob podle nároku 18, vyznačený tím, že buňky jsou vybrány ze skupiny zahrnující chondrocyty, ftbroblasty, hepatocyty a mezenchymální kmenové buňky derivované z kostní dřeně nebo tukové tkáně.
CZ20070054A 2007-01-23 2007-01-23 Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy CZ300805B6 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20070054A CZ300805B6 (cs) 2007-01-23 2007-01-23 Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy
PCT/CZ2008/000005 WO2008089708A1 (en) 2007-01-23 2008-01-09 Biomaterial based on nanofibrillar layers and method of preparation thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20070054A CZ300805B6 (cs) 2007-01-23 2007-01-23 Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ200754A3 true CZ200754A3 (cs) 2008-10-29
CZ300805B6 CZ300805B6 (cs) 2009-08-12

Family

ID=39431239

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20070054A CZ300805B6 (cs) 2007-01-23 2007-01-23 Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ300805B6 (cs)
WO (1) WO2008089708A1 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10639377B2 (en) 2009-09-30 2020-05-05 Thiomatrix Forschungs-Und Beratungs Gmbh Mucoadhesive polymers having vitamin B partial structures

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ302901B6 (cs) 2011-06-01 2012-01-11 Technická univerzita v Liberci Zpusob vytvárení funkcní nanovlákenné vrstvy a zarízení k provádení zpusobu
GB201202138D0 (en) * 2012-02-07 2012-03-21 Electrospinning Company The Ltd Multi-well plate

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340581C (en) * 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
US6428802B1 (en) * 1999-12-29 2002-08-06 Children's Medical Center Corp. Preparing artificial organs by forming polylayers of different cell populations on a substrate
US6790455B2 (en) * 2001-09-14 2004-09-14 The Research Foundation At State University Of New York Cell delivery system comprising a fibrous matrix and cells
US7704740B2 (en) * 2003-11-05 2010-04-27 Michigan State University Nanofibrillar structure and applications including cell and tissue culture
US20090202616A1 (en) * 2004-09-29 2009-08-13 National University Of Singapore Composite, Method of Producing the Composite and Uses of the Same
US20060128012A1 (en) * 2004-12-03 2006-06-15 Treena Arinzeh Substrate recognition by differentiable human mesenchymal stem cells
CA2599946A1 (en) * 2005-03-07 2006-09-14 Georgia Tech Research Corporation Nanofilament scaffold for tissue regeneration
US8048446B2 (en) * 2005-05-10 2011-11-01 Drexel University Electrospun blends of natural and synthetic polymer fibers as tissue engineering scaffolds

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10639377B2 (en) 2009-09-30 2020-05-05 Thiomatrix Forschungs-Und Beratungs Gmbh Mucoadhesive polymers having vitamin B partial structures

Also Published As

Publication number Publication date
CZ300805B6 (cs) 2009-08-12
WO2008089708A1 (en) 2008-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Fabrication and in vitro evaluation of PCL/gelatin hierarchical scaffolds based on melt electrospinning writing and solution electrospinning for bone regeneration
Ahmadi et al. Preparation and characterization of polyurethane/chitosan/CNT nanofibrous scaffold for cardiac tissue engineering
Srouji et al. 3-D Nanofibrous electrospun multilayered construct is an alternative ECM mimicking scaffold
Chen et al. A three-dimensional dual-layer nano/microfibrous structure of electrospun chitosan/poly (d, l-lactide) membrane for the improvement of cytocompatibility
CN101253259A (zh) 聚合物涂覆的纳米原纤结构和用于细胞维持和分化的方法
US8343742B2 (en) Encapsulation of cells in biologic compatible scaffolds by coacervation of charged polymers
Kim et al. 3D tissue formation by stacking detachable cell sheets formed on nanofiber mesh
Kitsara et al. Fabrication of cardiac patch by using electrospun collagen fibers
US20120128739A1 (en) Three-dimensional nanostructured hybrid scaffold and manufacture thereof
Yang et al. Coaxial bioelectrospinning of P34HB/PVA microfibers biomimetic scaffolds with simultaneity cell-laden for improving bone regeneration
Kriebel et al. Three‐dimensional configuration of orientated fibers as guidance structures for cell migration and axonal growth
KR102119514B1 (ko) 세포배양용 또는 조직공학용 지지체
WO2007012050A2 (en) Polymer coated nanofibrillar structures and methods for cell maintenance and differentiation
Niu et al. HA-coated collagen nanofibers for urethral regeneration via in situ polarization of M2 macrophages
JP2002536011A (ja) 繊 維
Wang et al. Nanofibres and their influence on cells for tissue regeneration
Cui et al. Vascularization of LBL structured nanofibrous matrices with endothelial cells for tissue regeneration
Unnithan et al. Strategic design and fabrication of biomimetic 3d scaffolds: unique architectures of extracellular matrices for enhanced adipogenesis and soft tissue reconstruction
Wang et al. Bacterial cellulose nanofiber reinforced poly (glycerol-sebacate) biomimetic matrix for 3D cell culture
EP2291556A2 (en) Nonwoven structure and method of fabricating the same
Ameer et al. Fabrication of co-cultured tissue constructs using a dual cell seeding compatible cell culture insert with a clip-on scaffold for potential regenerative medicine and toxicological screening applications
Qiao et al. An ordered electrospun polycaprolactone–collagen–silk fibroin scaffold for hepatocyte culture
KR102176892B1 (ko) 세포특이적 부착능을 증강시키는 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법
Ao et al. Biofunctionalized bacterial cellulose grafted with bacitracin for wound healing
CZ200754A3 (cs) Biomateriál na bázi nanovlákenných vrstev a zpusob jeho prípravy

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20180123