KR102176892B1 - 세포특이적 부착능을 증강시키는 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법 - Google Patents

세포특이적 부착능을 증강시키는 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 특이적 부착 조절 물질을 함유하는 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법에 관한 것으로, 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol)에, 폴리아크릴산(polyacrylic acid) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 가교제를 포함하는 수용성 용액과 세포부착성을 증강시키거나 조절할 수 있는 물질을 포함하여 이를 전기 방사하는 단계, 염산 증기 및 디메틸포름알데히드 용매처리 후 수산화나트륨으로 처리하는 단계를 거쳐서 세포부착성을 조절함으로써, 세포활성과 성장 등의 세포기능을 유지할 수 있는 나노섬유 멤브레인을 제조하는 방법이다.

Description

세포특이적 부착능을 증강시키는 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법{Method for manufacturing polyvinyl alcohol nanofiber membrane enhancing cell specific adhesion}
본 발명은 세포의 종류에 따른 특이적인 부착능을 증강시킬 수 있는 물질을 함유하는 세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 나노섬유의 구조특성과 세포부착성의 특성을 가지는 세포외기질 및 조직미세환경 유사 세포 배양용 폴리비닐알콜 나노섬유 멤브레인 제조 방법에 관한 것이다.
통상의 세포배양 방법은 2차원적이며 폴리스티렌(polystyrene) 배양디쉬에서 세포의 부착성을 유지하면서 세포를 배양하는 것을 기반으로 하고 있다. 생체조직 내에서 세포는 세포외기질(Extracellular matrix, ECM)에 의하여 3차원적인 환경 하에서 성장 또는 분화함으로써 2차원 배양은 생체조직과는 다른 세포외 환경을 가지고 있다. 이러한 2차원 세포배양의 한계를 극복하기 위하여 생체모방적이고 세포배양 효율을 향상시킬 수 있는 3차원 세포배양법이 개발되고 있다. 최근 3차원 세포 배양 지지체로서 나노섬유의 중요성이 부각되고 있으며 전기방사법으로 제작된 나노섬유는 구조적으로 자연 세포외기질과 유사하여 조직 공학 응용을 위한 유망한 지지체로 사용될 수 있다.
폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA)은 생체적합성을 가지는 폴리머로서 생체재료로 개발될 수 있지만, 높은 친수성으로 인하여 세포부착성이 매우 낮아서 세포배양용 소재로 이용되는데 한계가 있다. 전기방사로 제조된 나노섬유는 세포외기질과 유사한 형태를 가지고 있으나, PVA로 만들어진 나노섬유의 내수성을 증가시키기 위해서 PVA를 가교(cross-linkage) 시키기도 하는데, 가교의 대표적인 방법으로는 가교제를 이용하는 화학적 가교법이 있다. 전기방사를 위해 생리활성 물질은 전기방사용액에 균일하게 녹아야 한다는 점에서 수용성 폴리머인 PVA를 단백질이나 펩타이드 등 수용성 생리활성물질을 함유하는 지지체로 제조하기에는 가장 적절하다. 그러나 PVA는 물에 대한 용해도가 높고 단백질 친화성이 낮아서 세포부착성이 좋지 않은 단점이 있다. 이러한 이유로, 세포배양 분야에서는 물에 녹지 않으면서 투명한 PVA 나노섬유 지지체로서 PVA 재료 자체의 친수성은 그대로 유지하면서 세포활성을 조직에서와 유사하게 유지할 수 있는 기능성 PVA 나노섬유 멤브레인을 제조하는 기술이 필요하다.
세포외기질은 세포와 세포 사이의 틈을 메워주는 물리적 역할 뿐만 아니라 생리·화학적 역할을 하는데 세포외 환경을 조성하는 생체고분자의 집합체로 이루어져 있다. 세포외기질의 주요 구성 성분은 콜라겐(Collagen)이며 피브로넥틴(Fibronectin)과 라미닌(Laminin) 등의 세포부착성 단백질에 의하여 콜라겐 섬유와 세포간 연결이 이루어져 있다. Arg-Gly-Asp (RGD) 펩타이드는 주로 피브로넥틴에서 발견되는 펩타이드 배열로서 세포결합에 중요한 부위에 해당되는데, 그 외 비트로넥틴(vitronectin), 피브리노겐(fibrinogen) 및 오스테오폰틴(osteopontin)과 같은 세포외기질 단백질 내에 존재하는 주요 인테그린 결합 도메인이다. 라미닌은 기저막(basement membrane)에서 상피세포가 부착하는 기저판(basal lamina)의 주요 구성 성분으로서 세포부착성을 부여한다. 라미닌의 대표적인 세포결합부위는 B1사슬의 Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg 배열(펩타이드 YIGSR)이 있으며, 라미닌 단백질에서 RGD 배열 또한 세포결합부위에 해당한다. 이러한 세포부착성 단백질이나 펩타이드들을 함유하는 나노섬유는 인체와 유사한 세포외기질의 환경을 제공할 수 있다.
단백질은 나노섬유 제작 과정에서 첨가하는 화학적 가교제인 글루타르알데히드(Glutaraldhyde) 등에 의하여 단백질의 변성이나 활성의 소실이 일어날 수 있다. 대부분의 경우에서 세포부착 단백질이나 펩타이드는 나노섬유나 배양 플레이트에 코팅하여 세포부착성을 증강시키는 방법을 사용하고 있다. 가교제를 사용하지 않고 플루오로알콜(fluoroalcohol)에 녹인 폴리카프로락톤(ε-polycaprolacotone) 폴리머에 라미닌을 함유하여 전기방사로 제작한 기술 등이 소개되어 있다. 케라틴(keratin) 성분인 케라토즈(keartose)나 키토산(chitosan)과 같은 고분자 폴리머들은 PVA와 같이 전기방사하여 쉽게 혼합된 나노섬유로서 제작이 가능하다고 알려져 있다. 가교제를 섞지 않고 펩타이드-PVA 폴리머 용액의 전기방사에 의하여 제작된 나노섬유는 펩타이드의 분비가 서서히 증가되는 현상을 이용하여 약물분비 지지체로 활용하기도 한다. 이와 같은 기술과 비교하여 PVA 폴리머 용액에 약물을 첨가하고 전기방사 후 나노섬유를 글루타르알데히드 증기로 처리하여 가교도를 높이고 약물의 분비가 없도록 하는 방법을 사용하기도 한다. 가교제를 첨가하거나 첨가하지 않은 PVA 나노섬유에서 혼합한 펩타이드가 방출되는 것은 PVA의 친수성인 화학적 성질이나 물에 녹는 물리적 성질에 의하여 발생 될 수 있다고 추측할 수 있다. 따라서 생리활성 물질은 친수성이 강한 PVA 나노섬유에서 방출되는 문제점을 가지고 있어서 이러한 기술적인 제한점을 극복할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
한국등록특허 제10-1665918호(2016.10.06 등록)
본 발명의 목적은 폴리비닐 알코올 나노섬유의 투명성, 내수성, 및 친수성의 특성은 확보하면서도 세포의 부착성과 기능을 조절할 수 있는 물질을 함유하는 세포부착능이 증진된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법, 상기 방법에 따라 제조된 여러 종류의 세포에 대하여 특이적으로 부착능이 증진된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 및 상기 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인을 이용한 세포부착능이 증진된 3차원 세포 배양 방법을 제공하는 데에 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리아크릴산(polyacrylic acid; PAA) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde; GA)를 포함하는 전기방사 용액에 세포부착성 물질을 첨가하고, 전기방사하여 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인을 제조하는 단계; (2) 상기 제조된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인에 대해서 염산(HCl) 증기 처리하여 가교시킨 후, 디메틸포름아마이드(dimethylformamide; DMF) 용매 처리하여 결정화시키는 단계; 및 (3) 상기 결정화된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인을 수산화나트륨으로 처리하는 단계를 포함하는 세포부착능이 증진된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 따라 제조된 세포부착능이 증진된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인에서 세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는 세포부착능이 증진된 3차원 세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 세포 특이적 부착성을 조절하는 물질을 함유하는 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 나노섬유의 친수성은 확보하면서도 세포 고유의 부착성을 유지할 수 있는 기능성의 나노섬유 구조체를 제조할 수 있다. 특히, 이러한 방법을 통해서 제조된 나노섬유 구조체는 다양한 종류의 세포부착 조절물질을 코팅하는 단순한 기술의 범위가 아니라 나노섬유 내 블렌딩시켜 부착성 물질을 분비시키거나 세포 표면의 수용체에만 작용하면서 배양할 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 3개의 아미노산 아르기닌(Arginine), 글리신(Glycine), 및 아스파르트산(Aspartate)으로 구성된 펩타이드 Arg-Gly-Asp (RGD) 함유 나노섬유 멤브레인을 전기방사로 제작하고 나노섬유의 형태와 공극의 정도를 확인한 전자현미경 이미지이고,
도 2는 본 발명에 따른 RGD 함유 나노섬유 멤브레인에 형광으로 염색한 세포들을 배양한 후 배양액으로 세척하기 전과 후에 부착하고 있는 세포들을 미분간섭(Differential interference contrast, DIC) 현미경과 공초점형광현미경으로 관찰하고 형광염색된 세포 수를 측정한 결과이고,
도 3은 형광물질인 플루오레신염(fluorescence sodium salt)이 들어 있는 나노섬유를 증류수나 1 몰 수산화나트륨 용액에 담군 후 시간 별로 용액으로 녹아 나온 형광을 측정한 결과와 나노섬유에 잔존하고 있는 형광을 공초점형광현미경으로 관찰한 결과이고,
도 4는 본 발명에 따른 PVA 나노섬유, RGD 함유 나노섬유(Untreated) 및 수산화나트륨으로 처리한 RGD 함유 나노섬유(NaOH-treated) 멤브레인들에 형광으로 염색한 세포들을 48시간 동안 배양하면서 부착하는 정도와 세포 성장 형태를 측정한 공초점현미경과 미분간섭현미경의 이미지를 조합한 사진을 나타낸 것이고,
도 5는 수산화나트륨으로 처리한 RGD-PVA 멤브레인에서 배양한 두 종류의 세포가 부착하는 정도를 비교하기 위하여 세포를 세척하기 전(Before)과, 세척하고 난 후(After) 남아 있는 세포를 공초점현미경으로 관찰하고 세포의 수를 측정한 결과이고,
도 6은 다양한 농도의 RGD를 함유하는 RGD-PVA 멤브레인을 수산화나트륨으로 처리한 후 다른 농도의 RGD를 함유하는 멤브레인에 분주한 세포가 배양액으로 세척을 한 후에 부착되어 있는 세포 수를 측정한 결과이고,
도 7은 수산화나트륨으로 처리한 RGD-PVA 멤브레인에서 배양한 세포의 부착 형태 및 특성을 설명하기 위하여 공초점현미경으로 측정한 미분간섭 사진들을 도시한 도면(도 7A)과 형광염색한 세포들의 성장 및 부착형태를 형광현미경으로 관찰한 결과이고(도 7B),
도 8은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 RGD 함유 나노섬유 멤브레인(PVA membrane)에서 배양한 세포의 부착성 증가가 배양액에 첨가한 RGD (RGD solution)에 의하여 억제되는가를 2차원 배양디쉬(2D culture dish) 상태와 비교하여 길항적 저해를 측정한 공초점현미경 결과이고,
도 9는 수산화나트륨으로 처리한 RGD 함유 PVA 멤브레인에서 배양한 MLE-12 기도상피세포의 부착형태와 세포연접의 정도를 공초점현미경 결과로 나타낸 것이고,
도 10은 RGD 펩타이드를 함유한 PVA 멤브레인과 비교하여 펩타이드 KGRGDS 및 펩타이드 GGPEILDVPST를 함유하는 PVA 멤브레인을 제작하고 수산화나트륨으로 처리한 후 이들 멤브레인에서 배양한 세포의 부착성과 세포연접의 정도를 측정한 공초점현미경 결과이고,
도 11은 배양디쉬 및 PVA 멤브레인에서 세포 부착 및 성장에 대한 천식유발 알러젠(Der P)의 영향을 액틴과 ZO-1 단백질에 대한 항체로 염색한 후 공초점현미경으로 조사한 결과이고,
도 12는 PVA 멤브레인과 수산화나트륨으로 처리한 RGD-PVA 멤브레인에서 배양한 면역세포인 CD11c+ 수지상세포와 F4/80+ 대식세포의 활성화 정도를 유세포분석기(flow cytometry)로 이들 세포표면에 CD86이 발현되는 정도로서 측정한 결과이고,
도 13은 PVA 멤브레인과 수산화나트륨으로 처리한 RGD-PVA 멤브레인에서 배양한 수지상세포(BMDC) 및 대식세포(Macrophage)의 활성화 정도를 ELISA법으로 TNF-α 분비 농도를 측정하여 비교한 결과를 나타낸 것이고,
도 14는 PVA 멤브레인과 수산화나트륨으로 처리한 RGD-PVA 멤브레인에서 배양한 면역세포의 활성화를 검증하기 위하여 세포 부착 형태를 주사전자현미경으로 확인한 결과이고,
도 15는 펩타이드 KGRGDS 및 펩타이드 GGPEILDVPST를 함유하는 PVA 멤브레인을 수산화나트륨으로 처리한 후 이들 멤브레인에서 배양한 수지상세포의 CD86 발현을 유세포분석기로 분석하여 활성정도를 측정한 결과이고,
도 16은 라미닌 단백질의 세포부착 도메인의 펩타이드인 YIGSR을 함유하는 PVA 멤브레인을 수산화나트륨으로 처리한 후 이들 멤브레인에서 배양한 기도상피세포의 부착되는 정도를 RGD-PVA 멤브레인과 비교측정한 결과이고,
도 17은 라미닌 단백질의 세포부착 도메인의 펩타이드인 YIGSR을 함유하는 PVA 멤브레인을 수산화나트륨으로 처리한 후 이들 멤브레인에서 배양한 기도상피세포의 형태를 관찰한 공초점현미경 이미지이고,
도 18은 펩타이드 YIGSR을 함유하는 PVA 멤브레인에서 수산화나트륨으로 처리한 후 이들 멤브레인에서 배양한 혈관내막세포의 증식 상태 및 세포연접을 공초점현미경으로 관찰한 이미지이고,
도 19는 수산화나트륨으로 처리하거나 처리하지 않은 PVA 및 RGD-PVA 멤브레인에서 7일 동안 배양한 초대간세포의 알부민과 액틴의 발현의 정도와 세포 성장 양상을 공초점현미경으로 측정한 결과이고,
도 20은 수산화나트륨으로 처리하거나 처리하지 않은 PVA 및 RGD-PVA 멤브레인에서 21일 동안 배양한 초대간세포의 미분간섭현미경 관찰(도 20A)과 전자현미경으로 관찰한 세포 형태를 나타낸 결과(도 20B)이고,
도 21은 펩타이드 KGRGDS 및 펩타이드 GGPEILDVPST를 함유하는 PVA 멤브레인을 수산화나트륨으로 처리한 후 이들 멤브레인에서 배양한 초대간세포의 비멘틴과 E-카드헤린 발현을 공초점현미경으로 측정한 이미지 결과이고,
도 22는 PVA 나노섬유에 고분자 입자인 후코이단을 함유하는 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 나노섬유를 전기방사로 제작하고 나노섬유의 형태와 공극의 정도를 확인한 전자현미경 이미지이고,
도 23은 후코이단을 함유하는 PVA 나노섬유 멤브레인(Fucoidan-PVA)에 포함되어 있는 후코이단을 검출하기 위한 메틸렌블루(methylene blue) 염색 이미지이고,
도 24는 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에 함유된 후코이단이 수산화나트륨으로 멤브레인을 처리한 후에 나노섬유에서 방출되고 남아 있는 양을 측정하기 위하여 후코이단을 구성하는 황(sulfur) 원소 농도를 파장 분산 X선 형광(Wavelength Dispersive X-ray Fluorescence)로 측정한 결과이고,
도 25는 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에서 배양한 혈관내막세포의 부착성이 증가 되는가를 미분간섭 현미경 관찰한 이미지와 세포수를 측정한 결과이고,
도 26는 수산화나트륨으로 처리하지 않은 PVA 및 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에서 7일간 배양한 초대 간세포의 스페로이드 형성, 알부민 발현, 및 액틴의 발현과 분포를 측정한 공초점현미경 결과이고,
도 27은 수산화나트륨으로 처리한 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에서 5일 동안 배양한 초대간세포의 부착성과 분포를 조사하기 위한 공초점현미경 이미지이고,
도 28은 배양조건이 다른 환경인 배양 디쉬 및 PVA 멤브레인에서 방사선 조사를 받은 세포의 부착성 및 성장 변화가 있는가를 측정한 공초점현미경 이미지이다.
이에, 본 발명자들은 PVA 나노섬유를 화학적 가교제를 첨가하여 제조하더라도 세포부착성이 저하하는 문제를 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 세포 결합 특이적 펩타이드나 리간드를 함유하는 PVA 나노섬유 지지체를 제작하고 나노섬유에 약하게 결합하고 있어서 수용액으로 방출되는 물질을 완전히 방출시키는 방법을 고안하여 나노섬유에 부착되어 있는 리간드에 의하여 배양한 세포의 결합능이 증가된 배양 환경을 제공할 수 있는 생체 미세환경과 유사한 세포외기질을 모사하는 기술을 완성하였다.
즉, 본 발명자들은 PVA 나노섬유 멤브레인의 투명성을 유지할 수 있는 화학적 가교제 조합을 사용하고 펩타이드 등의 생리활성 조절 물질을 함유하는 나노섬유를 제작하였는데, 이는 공정이 간단하여 제조가 용이하고, 다량의 세포 배양이 가능하며 배양비용을 크게 줄일 수 있다. 또한, 다양한 종류의 세포활성물질을 블렌딩하여 제작된 나노섬유는 배양하고자 하는 세포에 따라 적합한 3차원적인 세포외기질 환경을 제공할 수 있다. 특히, 본 발명은 세포부착성이 떨어지는 상피세포의 배양에 효능이 우수하고 상피세포의 부착성으로 인한 상피중간엽전이(epithelial-msenchymal transition) 등을 유발하지 않고 배양된 세포의 기능을 유지할 수 있는 3차원 배양이 가능한 지지체를 제공할 수 있다.
본 발명은 (1) 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리아크릴산(polyacrylic acid; PAA) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde; GA)를 포함하는 전기방사 용액에 세포부착성 물질을 첨가하고, 전기방사하여 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인을 제조하는 단계; (2) 상기 제조된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인에 대해서 염산(HCl) 증기 처리하여 가교시킨 후, 디메틸포름아마이드(dimethylformamide; DMF) 용매 처리하여 결정화시키는 단계; 및 (3) 상기 결정화된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인을 수산화나트륨으로 처리하는 단계를 포함하는 세포부착능이 증진된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 세포결합성 물질은 세포결합성 펩타이드 또는 후코이단일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 상기 세포결합성 펩타이드는 RGD 펩타이드, KGRGDS 펩타이드, GGPEILDVPST 펩타이드 또는 YIGSR 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 세포는 상피세포, 혈관내막세포, 암세포, 섬유아세포, 간세포, 면역세포 또는 기질세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 세포결합성 펩타이드는 10 내지 300 ㎍/mL 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 후코이단은 1 내지 20 mg/mL 농도로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 세포부착성 물질 함유 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인은 세포부착능을 증강시키는 역할을 가질 수 있으나, 세포 기능 조절은 생존능, 분화, 활성 등 다양한 세포 기능을 포함한다.
상기 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인에 세포의 부착성을 향상시키기 위하여 세포부착인자, 특히 펩타이드를 혼합할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며 세포부착능에 관여하는 다양한 종류의 단백질이나 펩타이드를 포함할 수 있으며, 세포의 종류에 따라서 세포부착능이나 더 나아가 활성조절을 위하여 특이적인 리간드를 혼합하여 제작할 수 있다.
한편, 본 발명의 세포 특이적 부착능이 증진된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인의 제조 방법은 상기 결정화된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인에서 펩타이드 등 세포활성 조절 물질이 수산화나트륨의 처리에 의하여 급속히 방출되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 세포부착능 조절 물질 방출 단계 이후에, 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인에 방출되지 않고 남은 세포부착성 조절 물질을 포함하는 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인에서 세포를 배양시킬 수도 있다.
또한, 펩타이드 등의 세포부착 조절물질의 블렌딩을 통해 제조된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인의 표면에는 상기 세포부착 조절물질이 나노섬유 표면에 노출되어 세포면의 수용체와 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 세포부착성 물질을 함유하는 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인은 수산화나트륨으로 처리하지 않은 상태에서 세포를 배양할 경우, 세포결합능이 오히려 억제될 수 있으며 분비된 물질에 의하여 세포활성이 영향을 받을 수 있는 조건이 될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 따라 제조된 세포부착능이 증진된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인에서 세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는 세포부착능이 증진된 3차원 세포 배양 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 세포는 상피세포, 혈관내막세포, 암세포, 섬유아세포, 간세포, 면역세포 또는 기질세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포부착성 물질을 함유하는 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인을 사용하여 초대 간세포를 배양하는 경우, 초대간세포의 부착성을 조절함으로써 장기간 배양한 간세포는 스페로이드 형태나 단일세포층의 형태로 배양할 수 있는 조건을 제공한다.
본 발명의 세포부착성 물질을 함유하는 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인을 사용하여 면역세포를 배양하는 경우, 배양한 면역세포에서는 부착성에 의하여 세포활성이 다른 조건을 제공할 수 있다.
본 발명의 세포부착성 물질을 함유하는 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인을 사용한 3차원 세포 배양시스템을 이용하면, 세포부착성에 대한 약물이나 방사선 조사의 영향 등을 측정할 수 있는 분석방법을 제공할 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
< 참조예 1> 3차원 세포배양용 PVA 나노섬유의 제조
한국등록특허 제1665918호의 방법에 따라 3차원 세포 배양용 PVA 나노섬유를 제조하였다. 이러한 PVA 나노섬유는 물에 안정하고 투명하며 세포의 종류에 따라 다양한 정도의 세포부착성을 가지는 나노섬유로서 100-200 nm 평균 직경을 나타내었다.
전기방사 용액은 용매를 증류수로 하여 폴리비닐알코올(PVA, Mw=89,000 - 98,000, Sigma)과 폴리아크릴산(polyacrylic acid, PAA, Mw=2000, Sigma)을 10%(w/v)과 0.2%(w/v)의 농도로 하여 가열 자석 교반기를 이용하여 85℃에서 24시간 동안 용해하였다. 용해된 PVA 용액은 실온에서 완전히 식힌 후 글루타르알데하이드(glutaraldehyde, GA)를 2%(v/v) 첨가하여 30분 동안 섞어 전기방사 용액을 만들었다. 전기방사 용액 4 mL을 8 μl/분의 속도로 10 cm의 거리를 두고 27 G 금속 주사기 두 개를 사용하여 10 kV 상태로 전기방사를 하였다. 전기방사로 제조된 PVA/PAA/GA 나노섬유를 60℃에서 1분간 열처리하였다. 나노섬유를 가교화시키기 위하여 진공 데시케이터에 나노섬유와 염산(HCl)을 넣고 진공 상태로 60초간 염산증기로 처리하였다. 염산증기로 처리된 나노섬유를 디메틸포름아마이드(dimethylformamide, DMF) 용액으로 1분간 처리한 후 완전히 건조시키고 3차 증류수에 12시간 동안 담근 후 자외선에 12시간 동안 노출시켜 멸균하였다. 이렇게 제작된 나노섬유 멤브레인은 증류수에 처리하여도 겔화되지 않는 특성을 나타내고, 동시에 투명성도 유지하게 된다.
< 실시예 1> 세포활성 물질이 블렌딩된 PVA 나노섬유 제조
전기방사 용액으로 PVA/PAA/GA 용액에 RGD를 첨가하는 것을 제외하고는 나노섬유 멤브레인을 제조하는 방법과는 실질적으로 동일하게 전기방사 공정, 염산증기 처리 및 용매 처리를 수행하여 RGD-PVA 나노섬유 멤브레인을 제조하였다. 증류수에 PVA와 PAA를 첨가하고 펩타이드, 플루오레세인염(fluorescein sodium salt), 후코이단 등 세포활성 조절 물질을 혼합하고 가열 자석 교반기를 이용하여 85℃에서 24시간 동안 용해한 후 글루타르알데하이드를 첨가하여 조제된 용액을 전기방사하여 나노섬유를 제조하였다. 나노섬유 멤브레인은 그 두께가 50-60 μm가 되도록 제조하였다. PVA와 PAA를 녹이는 과정에서 장기간의 열을 가하게 되므로 열에 약한 단백질 등은 PVA/PAA 용액을 식힌 후 글루타르알데히드와 함께 첨가할 수 있다. 전기방사 이후 염산증기 및 디메틸포름아마이드 처리는 참조예 1과 동일하게 실시하였다.
참조예 1과 실시예 1에서 제조된 PVA 나노섬유 지지체와 펩타이드가 블렌딩된 PVA 나노섬유 지지체의 표면 구조는 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM)을 이용하여 확인하였다. 전자현미경을 이용한 관찰을 위해서, 나노섬유를 백금코팅한 후 주사전자현미경으로 SNE-4500M (Sec 사, Korea)를 사용하였다. 도 1을 참조하면, 전자현미경 이미지들을 통해서 확인할 수 있듯이 전기방사 공정을 통해서 50 μg/mL이나 250 μg/mL의 RGD 펩타이드를 함유하는 PVA 나노섬유 지지체를 구성하는 섬유는 비드가 생성되지 않고 직경은 180-300 나노미터(220 ± 60 nm)로서 일정한 것으로 확인할 수 있다.
< 실시예 2> RGD - PVA 멤브레인에서 세포부착성 평가
나노섬유 멤브레인을 8웰 배양 플레이트에 부착시킨 후 나노섬유 멤브레인에 세포를 파종하였다. 그러나 멤브레인의 부착은 8웰에 한정되지 않고 다양한 크기의 플레이트나 트랜스웰(transwell) 등을 사용할 수 있다. 멤브레인이 부착된 플레이트는 70% 에탄올(1 mL)을 채워서 자외선 상자에서 18시간 이상 멸균시켜 주었다. 에탄올을 제거한 뒤 세포배양 배지(1 mL)을 채우고 37℃ 조건 하에서 이산화탄소 세포 배양기에 넣어서 12시간 이상 적신 후 사용하였다.
CT-26 대장암세포, NIH3T3 섬유아세포, EA.hy926 혈관내막세포(ATCC, Manassas, VA, USA)는 FBS (10%), 페니실린(penicillin; 100 IU/mL), 및 스트렙토마이신(streptomycin; 100 μg/mL)을 첨가한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 배지에서 배양하였으며 마우스 기도상피세포인 MLE-12 세포는 ATCC로부터 구입하여 FBS(10%), 페니실린(penicillin; 100 IU/mL)을 첨가한 DMEM/F-12 고농도 글루코스(high glucose) 배양액을 사용하여 37℃ 하에서 5% CO2 농도가 유지되는 배양기에서 세포를 배양시켰다. CT-26, NIH3T3, EA.hy926, 및 MLE-12 세포는 PKH26 적색형광(Sigma사)으로 염색한 후 나노섬유 멤브레인에서 웰당 3×104 개/700 μL/1 cm2으로 상기 배양액을 사용하여 배양하였다.
본 발명의 실시예 1에 따라 나노섬유 방사용액에 RGD (50 μg/mL)을 함유한 RGD-PVA와 RGD가 들어 있지 않은 PVA 멤브레인을 제조하고 부착성이 다른 세포들을 이들 멤브레인에 파종하고 4시간 후 표면에 부착한 세포의 수를 측정하였다. 도 2에 도시된 바와 같이 파종 후 단시간에 나노섬유 멤브레인에 대장암세포의 부착능이 다소 컸으며 상피세포의 부착능은 떨어지는 것으로 나타났다. RGD를 함유하는 PVA 나노섬유에서의 세포부착능은 PVA 멤브레인에서와 비교하여 크게 증가하지는 않았다. PVA 및 RGD-PVA 나노섬유 멤브레인에 세포를 파종하고, 4시간 후 교반기(shaker)에서 50×rpm의 속도로 45분간 흔든 다음 떨어져 나오게 하는 세척과정으로 세포를 제거한 후 나노섬유에 부착한 세포의 수를 확인하였다. “Before”는 세포가 부착된 나노섬유 멤브레인을 세척하기 전의 공초점현미경과 미분간섭현미경의 혼합 이미지들이고, “After”는 세척한 후의 혼합 이미지들이다. 세척 후 모든 종류의 세포에서 현저하게 세포가 떨어져 나가는 현상을 보였으며 MLE-12 세포의 부착성이 가장 낮았다. 또한, RGD-PVA 멤브레인에서 세척한 후 CT26이나 NIH3T3와 같이 비교적 잘 부착하는 세포들이 부착한 수는 PVA 멤브레인에서 보다는 많은 것으로 나타났으나 RGD-PVA에서도 많은 수의 세포가 세척되어 떨어지는 것으로 나타났다.
< 실시예 3> 형광나트륨염을 함유한 PVA 나노섬유에서 형광 유출현상 측정
PVA 용액에 혼합된 물질이 분비되는 정도를 측정하기 위하여 형광물질을 섞어서 제작한 형광-PVA 나노섬유를 제작하였다. 용해된 PVA 용액은 실온에서 완전히 식힌 후, 녹색형광염(fluorescence sodium salt, Sigma)을 100 μg/mL의 농도로 혼합하여 자석 교반기를 이용하여 24시간 동안 섞어주었다. 글루타르알데하이드를 2% (v/v) 첨가하여 30분 동안 섞어 전기방사용 용액을 만들고, 이 용액을 전기방사하여 형광을 띄는 나노섬유 멤브레인을 제작하였다. 이후 처리과정은 PVA 나노섬유 제작 방법과 동일하게 진행하였다.
형광물질이 유출되는 정도를 알기 위하여 멤브레인을 증류수에 담구고 나노섬유에 함유되어 있는 형광물질이 증류수에 녹아 나오는 형광의 농도를 측정하였다. 도 3은 형광이 들어 있는 나노섬유를 물이나 1 M 수산화나트륨 용액에 담군 후 용액으로 녹아 나온 형광을 490 nm에서 측정한 결과이다. 도 3A는 증류수에 담군 나노섬유에서 유출되어 수용액에 들어 있는 형광의 정도는 측정되는 양이 미약하였으며 서서히 지속적으로 증가하는 것으로 나타났으나 여러 농도의 수산화나트륨 용액에 담군 나노섬유의 경우 매우 짧은 시간에서 높은 정도의 형광이 측정되는 것을 확인하였다. 이러한 결과와 비교하여 1M 염화나트륨(NaCl)의 염이나, 1M 염산(HCl)과 같은 강산에 의해서는 나노섬유에 들어 있는 물질의 유출은 수산화나트륨과 비교하여 매우 낮았다. 수산화나트륨 용액에서 형광이 유출되는 형광의 농도는 반응 1시간 이후부터 더 이상의 증가는 없었다. 증류수에 담구어 두었을 경우 형광물질은 48시간 까지 지속적으로 유출되는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과들은 친수성이 강한 PVA 나노섬유에 약하게 결합하고 있는 수용성 화합물은 물에 녹는 화합물로서 유출될 수 있으며 수산화나트륨과 같은 알카리 처리에 의하여 유출이 급속히 일어나는 것을 제시한다. 도 3B에서 나타낸 바와 같이 수산화나트륨의 농도가 증가함에 따라 전기방사용액에 들어 있는 형광염은 나노섬유로 부터 많은 양이 방출되었다.
도 3C는 수산화나트륨으로 처리한 PVA 나노섬유에서 방출된 형광물질 이외 PVA 나노섬유에 형광물질이 잔존하고 있는가를 확인한 결과이다. 형광염을 함유하는 PVA 나노섬유를 수산화나트륨과 증류수로 24시간 동안 처리하고 건조시킨 후 공초점현미경으로 관찰하였을 때 나노섬유 멤브레인은 형광을 띄는 것으로 나타났으며 수산화나트륨으로 처리한 경우에서 더욱 낮은 정도의 형광을 나타내었다. 따라서 수산화나트륨 처리에 의하여 나노섬유에 약하게 결합되어 있는 물질은 모두 유출되며 나노섬유에 결합한 형광은 더 이상의 처리에 의하여 잔존하는 것으로 확인됨으로써 수산화나트륨의 처리에 의하여 나노섬유에 첨가된 물질이 안정적으로 부착한 상태로 유지될 수 있는 멤브레인을 제작하는 방법을 제시하고 있다.
< 실시예 4> 수산화나트륨으로 처리하거나 처리하지 않은 RGD 함유 PVA 멤브레인에서 세포의 부착성 및 성장 비교 측정
수산화나트륨으로 처리한 RGD-PVA 멤브레인에 잔존하고 있는 나노섬유 결합형 RGD에 세포가 반응하여 세포의 부착성이 증가하는가를 측정하였다. NIH3T3 섬유아세포, CT-26 대장암세포, HepG2 간암세포, EA.hy926 혈관내막세포, 및 MLE-12 기도상피세포를 적색형광물인 PKH26으로 염색한 후 PVA 멤브레인, 수산화나트륨을 처리하지 않은 RGD-PVA 멤브레인과 1M 수산화나트륨으로 1시간 동안 처리한 후 세척한 RGD-PVA (이하 RGD-NaOH-PVA) 멤브레인에 상기 세포들을 3×104으로 분주하였다. 배양 4시간, 24시간, 48시간 후에 세포의 성장 형태를 공초점현미경으로 측정한 결과를 도 4에 나타내었다. PVA 멤브레인과 비교하여 수산화나트륨을 처리하지 않은 RGD-PVA에서 배양한 세포의 응집이 더욱 증가하는 것으로 나타났으며 특히 HepG2 세포 배양에서 가장 증가한 응집현상이 나타났다. 이에 비교하여 수산화나트륨으로 처리한 RGD-PVA 멤브레인에서 배양한 세포들은 응집현상을 보이지 않고 세포들은 균일하게 분포하는 것으로 나타났다.
RGD를 함유하는 PVA 나노섬유에서의 세포부착능은 PVA 멤브레인에서와 비교하여 크게 증가하지 않고 세척한 후 나노섬유에 부착한 세포의 수도 크게 증가하지는 않았다. 도 5에 나타낸 바와 같이 표면 부착성이 다른 CT-26 암세포와 MLE-12 상피세포를 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에 파종하고 배양액으로 세척한 후에도 부착하고 있는 세포 수는 PVA 멤브레인에서 보다는 많은 것으로 나타났으며 특히 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 상피세포보다는 암세포의 부착성이 더욱 높은 것으로 나타났다. 도 6에 나타낸 바와 같이 PVA 나노섬유에 함유된 RGD의 농도가 증가함에 따라 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 파종 후 세척한 NIH3T3와 MLE-12세포의 부착성은 증가하는 것으로 나타났다.
PVA 멤브레인의 특성은 투명성을 가지기 때문에 일반 배양디쉬에서 배양한 세포의 형태를 관찰하는 것과 같이 세포가 자라는 것을 관찰할 수 있다. 도 7에 나타낸 바와 같이 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에 배양한 세포들 중에서 CT-26 대장암세포나 NIH3T3 섬유아세포는 PVA 멤브레인에서 배양한 세포와 비교하여 부착성의 증가로 인하여 세포가 보다 뻗어나가는 모양으로 자라는 것으로 나타났으며 MLE-12 기도상피세포는 RGD-NaOH-PVA에서도 세포가 응집되어 성장하는 것으로 보아 세포의 부착 특성이 잘 나타나는 것을 보여주고 있다. 이러한 양상은 PKH26으로 염색한 세포들을 배양한 후 공초점현미경으로 측정하였을 때도 유사하게 나타났다.
다음으로 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 배양한 세포의 부착성이 증가하는 것이 RGD에 의한 것인지를 측정하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이 배양 세포액에 RGD (250 ng/ml)을 첨가하고 24시간 후 세포부착성을 관찰하였다. 일반적으로 사용하는 배양디쉬에서 배양한 세포는 부착성이 감소하여 세포수가 현저히 감소하였으며 부착된 세포도 형태가 원형으로 나타났다. PVA 멤브레인에서 배양한 MLE-12 세포는 RGD 처리에 의하여 세포 수가 감소하는 한편 세포 응집이 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과로 보아 상피세포는 기저막(basement membrane)에 부착하는 데는 주로 라미닌(laminin)이 관여하나 이들 세포의 부착에 피브로넥틴(fibronectin)의 세포 결합도 관여한다는 것을 제시하고 있다.
< 실시예 5> RGD -NaOH- PVA 멤브레인에서 배양한 MLE -12 상피세포의 면역 형광 염색 측정
MLE-12 기도상피세포는 2차원 배양상태에서 세포간 연접(tight junction)의 형성이 잘 이루어진다. RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 배양한 MLE-12 기도상피세포의 부착형태와 세포연접의 정도를 공초점현미경 하에서 비교분석하였다. 각각의 다른 조건에서 MLE-12 세포(3×104/700 μL/cm2)를 분주하고 37℃에서 5% CO2 농도가 유지되는 배양기에서 1, 3, 5일간 배양 후 실온에서 4% PFA로 10분간 고정하였다. PBS로 5분간 세 번 세척 후 5% 염소 혈청(goat serum)이 첨가된 PBST (0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS)로 1시간 처리하였고 1차 항체로 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 세포간 연접을 확인하기 위한 항체인 Zona occludens-1 (ZO-1)을 1:100의 비율로 희석하고 Phalloidin을 1:200의 비율로 희석하여 24시간 동안 반응시킨 후 PBS로 10분간 3번 세척하였다. 2차 항체로 Alexa Fluor® 488과 Alexa Fluor® 594를 각각 1:200의 비율로 희석하여 시료에 첨가하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 시료를 PBS로 5분간 세척한 후 DAPI를 1:1000의 비율로 희석하여 10분간 반응시켰다. 시료는 Mounting gel을 사용하여 봉입한 후 공초점현미경을 사용하여 관찰하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이 PVA 멤브레인에 배양한 세포는 배양디쉬에서와 같이 세포부착이 강하게 일어나지는 않는다. 세포를 PVA 멤브레인에 분주하고 24시간 동안 배양하였을 때 MLE-12 세포들은 부착성이 떨어져서 세포간 응집이 되었으며 배양 후 3일까지는 세포연접에 관여하는 단백질인 ZO-1의 발현은 뚜렷하지 않았으나 배양 5일 후 세포응집이 일어나면서 세포 표면에 ZO-1의 발현이 현저히 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 현상은 수산화나트륨으로 처리하지 않은 RGD-PVA에서도 유사하게 일어났으나 세포응집의 정도는 PVA 멤브레인에서 배양한 세포보다는 크지 않고 소규모의 응집체로 나타났다. 이에 비교하여 RGD-NaOH-PVA에서 배양한 MLE-12세포는 세포응집은 크게 증가하지 않으면서 세포간의 연접은 이루어지는 것으로 나타났다. 대조군으로 배양디쉬에서 배양한 MLE-12 세포는 높은 증식도와 배양디쉬의 표면에 대한 강한 부착성으로 인하여 세포간의 결합이 매우 높은 형태를 보였다.
< 실시예 6> RGD 이외 세포부착 부위 펩타이드를 함유한 PVA 멤브레인에서 배양한 세포의 부착특성 측정
RGD 펩타이드를 함유한 PVA 멤브레인 뿐만 아니라 피브로넥틴(fibronectin)의 세포결합 부위인 RGD를 포함하는 펩타이드 KGRGDS 및 또 다른 세포결합 부위인 LDV를 포함하는 펩타이드 GGPEILDVPST를 50 μg/mL의 농도로 PVA 용액에 넣고 전기방사법으로 제작한 펩타이드 함유 PVA 멤브레인을 수산화나트륨으로 처리하고 난 다음 이들 멤브레인에서 기도상피세포를 배양하고 5일 후 부착능 정도와 세포연접을 비교분석하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이 세포의 응집도는 피브로넥틴 펩타이드를 첨가하지 않은 PVA 멤브레인에서 가장 높고 RGD-PVA와 마찬가지로 KGRGDS 펩타이드나 GGPEILDVPST 펩타이드를 함유하는 PVA 멤브레인에서 배양한 세포들은 응집 현상을 나타내지 않았다. 따라서 RGD 뿐만 아니라 피브로넥틴의 세포 결합 도메인에 해당하는 다른 종류의 펩타이드를 함유하는 PVA 멤브레인에서도 세포부착 증강 효과를 얻을 수 있었다.
PVA 멤브레인에서 배양한 상피세포는 세포응집에 의한 세포간 접촉 부위에서 세포연접 단백질의 발현이 증가하였으나 세포 증식도가 매우 낮아서 배양한 세포가 나노섬유에 균일하게 분포하지는 않는 문제점이 있음을 확인하고 이러한 문제점을 세포부착성을 증강시키는 펩타이드 함유 나노섬유로서 해결할 수 있는 소재로 활용할 수 있음을 보여준다.
< 실시예 7> 수산화나트륨으로 처리한 RGD-PVA 멤브레인에서 기도상피세포 부착성에 대한 알러겐 영향 평가
천식을 유발하는 알러겐인 집먼지진드기의 성분인 Der P가 기도상피세포에 어떠한 영향이 있는가를 2차원 및 3차원 배양상태에서 비교하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이 2차원 배양디쉬에서 Der P로 5일간 처리한 세포는 세포연접이 소실되고 세포의 부착성을 유지하기 위하여 액틴 발현이 현저히 증가하는 것으로 보였으나 PVA 멤브레인에서 Der P를 첨가하고 5일간 배양한 기도상피세포는 세포형태를 유지하면서 세포연접을 이루는 ZO-1의 발현만이 소실되나 액틴의 발현은 크게 증가하지 않는 것으로 나타났다. 이에 비교하여 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 배양한 세포는 2차원 배양디쉬에서와 같이 세포연접의 소실 뿐만 아니라 액틴의 발현이 현저히 증가함으로써 Der P는 배양한 세포의 부착성에 큰 영향을 주는 것으로 보이며 이러한 현상은 배양 상태에 따라 다르다는 것을 제시하고 있다.
< 실시예 8> PVA 멤브레인에서 면역세포의 부착성 및 활성 평가
골수유래 수지상세포(bone marrow-derived DC, BMDC)를 배양 디쉬나 폴리카프로락톤 나노섬유에서 배양한 경우 자극을 받지 않은 세포는 활성화되지 않으며 활성화 물질을 첨가하면 충분히 활성화를 일으킨다. 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 나노섬유 멤브레인에 대해서, 자극을 받지 않은 면역세포를 배양한 후 세포활성화가 일어나는가를 조사하였다.
< 실시예 8-1> 골수유래 수지상세포 및 복강유래 대식구의 제작
수지상세포는 골수세포를 사이토카인으로 분화시켜 사용하였다. 5~6 주령의 C57BL/6 마우스의 대퇴부 및 종아리에서 골수세포를 분리하였다. 분리된 골수세포(1×106 개/mL)는 소태아혈청(10%)과 페니실린(100 U/ml) 그리고 스트렙토마이신(100 μg/ml)이 들어있는 HEPES/RPMI-1640 배지를 이용하여 10%의 CO2가 공급되는 37℃ 조건의 배양기에서 배양하였으며, 수지상세포로 분화유도를 위하여 20 ng/mL 과립구 대식세포 집락자극인자(GM-CSF)와 20 ng/mL의 인터루킨-4(IL-4)를 7일 동안 함께 배양하였다. 분화된 수지상세포는 이들 세포의 특이적 단백질 표면 인자인 CD11c에 대한 항체가 결합된 마이크로비드를 이용하여 분리하였다.
대식세포는 마우스 복강유래 세포를 사용하였다. 마우스 복강에 3% thioglycollate를 2 mL 주입하고 3일 후에 복강액에 들어 있는 세포를 분리하여 96웰 배양 플레이트에서 1×105 개의 세포를 200 μL RPMI-1640 배양액(10% FBS, 100 IU/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신)에서 배양하였다. 대식세포는 배양 1일 후 F4/80 항체가 결합된 마이크로비드를 이용하여 분리하고 배양액으로 2회 세척한 후 사용하였다.
< 실시예 8-2> 수지상세포 및 대식구의 배양 및 활성화 측정
PVA와 RGD-NaOH-PVA에서 24시간 동안 배양한 수지상세포와 대식세포의 활성화 정도는 이들 세포의 표면에서 CD86이 발현되는 세포수를 측정하였다. 배양한 수지상세포는 알로피코시아닌(allophycocyanin; APC)가 결합된 CD11c 항체와 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate; FITC)가 결합된 CD86 항체로 반응시키고 복강액 유래 대식세포는 피코에리트린(Phycoerythrin; PE)가 결합된 F4/80 항체와 FITC가 결합된 CD86 항체로 반응시킨 다음 유세포분석기(flow cytometry, 모델 MACSQuant, Mltenyi Biotec, 미국)를 이용하여 측정하였다. 활성화 세포는 전체 반응 세포 중 CD86을 발현하는 세포의 %로 표시하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이 본 발명에서 개발한 PVA 멤브레인에 CD11c+ 수지상 세포를 배양하였을 때는 활성화 지표인 CD86이 발현되는 세포는 50%로 현저히 증가하는 것으로 나타나고 LPS 자극에 의하여 CD86-양성인 세포 수는 55%로서 더 이상의 CD86 발현의 증가는 보이지 않음으로써 자극받지 않은 상태로 배양된 수지상세포는 자가활성이 일어남을 알 수 있다. RGD-NaOH-PVA에서 배양한 수지상세포는 CD86의 발현은 10% 정도로 매우 낮았으며 LPS로 자극하였을 때 75% 정도로 증가하는 것으로 나타남으로써 자극받지 않고 배양한 수지상세포는 비활성형이며 자극에 의하여 충분히 활성화된다는 것을 보여주고 있다. 또한 F4/80+ 대식세포를 PVA 멤브레인에서 배양한 경우에도 CD86 양성인 세포의 비율은 30%로 보여 수지상세포에서와 비교하여 다소 낮았으나 활성화가 일어났다. RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 배양한 대식세포는 활성화가 일어나지 않으며 LPS의 자극에 의하여 활성화되는 결과를 보여주고 있다.
PVA 및 RGD-NaOH-PVA에서 수지상세포와 대식세포를 24시간 동안 배양한 상태에서 배양액으로 분비되는 tumor necrosis factor (TNF)-α의 양을 측정하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이 수지상세포를 배양한 24시간 후의 배양액 내 분비되는 TNF-α의 양은 700 pg/mL 정도로 증가하는 것으로 나타났으며 LPS를 첨가한 경우 분비양은 증가하지 않은 결과를 보여주고 있다. 이와 비교하여 RGD-NaOH-PVA에서 수지상세포를 배양할 경우 분비되는 TNF-α의 양은 100 pg/mL 이하로 측정되었으며 LPS로 자극하였을 경우 500 pg/mL 까지 증가하는 결과를 보였다. 이와 같은 TNF-α의 분비 현상은 복강 유래 대식세포를 PVA와 RGD-NaOH-PVA에서 배양하였을 때도 유사하게 나타났다. 따라서 PVA 나노섬유에서 배양하였을 때 면역세포가 활성화되는 것은 RGD 함유 나노섬유 제조법으로 극복할 수 있다.
< 실시예 8-3> PVA 및 RGD - PVA에 배양한 면역세포의 주사전자현미경 형태 관찰
PVA 멤브레인에 배양한 수지상세포와 대식세포가 부착되어 있는 형태를 주사전자현미경으로 확인하였다. 배양된 대식세포를 3% 글루타르알데히드가 들어간 0.1 M 인산완충액으로 4℃에서 24시간 동안 1차 고정하였다. 상기 인산완충액으로 3번 세척한 후 1% 사산화오스뮴으로 1시간 동안 2차 고정하였다. 에탄올으로 탈수과정을 거친 후 8웰 플레이트에서 나노섬유를 분리하여 카본 테이프에 붙이고 이온 스퍼터 코터를 이용하여 금으로 코팅하였다. 금으로 코팅된 나노섬유를 주사전자현미경 안에 넣고 진공압을 걸어 이미지를 분석하였다.
도 14을 참조하면, PVA 멤브레인에 부착된 수지상세포와 대식세포의 모양은 길고 가지를 뻗는 것으로 나타났으며 LPS로 자극하였을 때에는 이들 세포의 형태는 큰 차이를 보이자 않았다. RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 배양한 상기 두 종류의 세포는 주로 둥근형으로 나타났으며 LPS로 자극한 경우에서만 세포의 모양이 길고 가지를 뻗는 모양을 나타내었다. 이와 같은 결과로서 수지상세포와 대식세포는 PVA 멤브레인에서 활성화가 된다는 것을 암시하며 RGD를 포함하는 PVA 멤브레인은 세포안정화를 제공하는 지지체임을 알 수 있다.
< 실시예 8-4> RGD 이외 세포부착 부위 펩타이드 함유 멤브레인에서 배양한 면역세포의 활성 측정
RGD 펩타이드를 함유한 PVA 멤브레인 뿐만 아니라 펩타이드 KGRGDS 및 펩타이드 GGPEILDVPST를 함유하는 PVA 멤브레인에서 배양한 수지상세포가 활성화되는가를 측정하였다. 도 16을 참조하면, 수지상세포는 자극을 받지 않은 상태에서는 활성화를 보이지 않았으며, LPS에 의하여 CD86 발현이 현저히 증가하여 세포막의 인테그린과 결합하는 피브로넥틴의 펩타이드 부분을 함유하는 PVA 멤브레인에서 면역세포를 비활성형으로 배양이 가능하다는 것을 보였다.
< 실시예 9> 수산화나트륨으로 처리한 YIGSR-PVA 멤브레인에서 배양한 세포의 부착성 평가
기저막의 단백질인 라미닌 서열에서 세포부착에 관여하는 펩타이드 서열로는 YIGSR이 알려져 있다(Grant et al., Ann N Y Acad Sci. 1990;588:61-72). PVA에 YIGSR 펩타이드(50 μg/mL)를 함유하는 YIGSR-PVA 멤브레인이 세포의 결합능이 증가된 지지체로 사용할 수 있는가를 조사하였다. 기도상피세포는 조직에서 라미닌을 함유하는 기저막에 부착하여 기도상피조직을 구성한다. 펩타이드 YIGSR을 함유하는 PVA 멤브레인을 전기방사법으로 제작하고 수산화나트륨으로 처리한 다음(이하, YIGSR-NaOH-PVA 멤브레인) 기도상피세포를 배양하면서 세포의 부착정도와 세포형태를 공초점현미경으로 관찰하였다. 도 16을 참조하면 YIGSR-NaOH-PVA 멤브레인에서 배양한 MLE-12 기도상피세포를 배양액으로 세척한 후 부착한 세포의 수를 측정하였을 때 PVA 멤브레인에서 배양한 경우보다 큰 증가를 보였으며 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 배양한 세포와 거의 유사한 정도의 세포 수를 보였다. 도 17에 나타낸 바와 같이 PVA 멤브레인에서 배양한 기도상피세포는 세포간 응집이 증가하며 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서도 응집 정도는 다소 떨어지나 응집성의 패턴은 보였다. 이와 비교하여 YIGSR-NaOH-PVA 멤브레인에서 배양한 기도상피세포는 세포응집 현상은 거의 일어나지 않으며 멤브레인에서 세포들은 균일한 분포로 부착하였으며 확대한 이미지를 참조하면 세포가 응집이 일어나지는 않지만 세포간의 접촉이 있는 곳에서는 세포연접이 잘 일어나는 것으로 나타났다.
혈관내막세포도 조직에서 라미닌을 함유하는 기저막에 부착한다. 도 18은 펩타이드 YIGSR을 함유하는 YIGSR-NaOH-PVA 멤브레인에서 혈관내막세포인 bEND.3 세포의 배양 상태를 관찰한 결과이다. bEND.3 세포는 뇌조직의 혈관내막세포로서 ATCC(ATCC® CRL-2299™)로부터 구입하여 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배양액을 사용하여 배양하였다. PVA 멤브레인에서 배양한 세포와 비교하여 RGD-PVA 멤브레인에서 배양한 세포는 더욱 퍼져서 결합하는 현상을 보였다. 이와 비교하여 YIGSR-NaOH-PVA 멤브레인에서 배양한 혈관내막세포주인 bEND.3 세포는 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 배양한 세포보다는 세포의 크기가 작으면서 연접이 뚜렷하며 특징적으로 혈관유사형성(tube formation)의 양상을 보였다.
< 실시예 10> RGD 함유 PVA 멤브레인에서 초대 간세포(Primary hepatocytes )의 3차원 배양 특성 측정
간조직의 상피세포로서 간의 고유 기능을 수행하는 간세포는 세포표면에 발현되어 있는 인테그린 α5β1이 간조직의 디세강(space of disse)에 분포되어 있는 콜라겐과는 콜라겐에 붙어 있는 피브로넥틴을 통하여 결합하고 있다. 2차원 배양상태에서 초대 간세포는 배양 후 1~2일 이내 세포사멸하여 간세포 배양법으로서 한계를 가지므로 변형된 2차원 배양방법으로서 콜라겐이 코팅된 배양 디쉬에서 세포를 파종하고 다시 세포 위에 매트리젤(matrigel)을 얹어서 배양하는 샌드위치(sandwich) 방법이 현재까지 가장 일반적으로 사용하고 있다. 샌드위치법으로 배양을 하더라도 William’s E medium과 같은 특수 배지, 덱사메타손, 인슐린 등을 포함시킨 배지 조성물에서 배양해야 하며 간세포가 생존하더라도 생체 본래의 생리활성 및 세포 접착성이 현저하게 저하되며 장기간 배양은 불가능한 단점을 가지고 있다.
이러한 간세포의 2차원적 배양의 단점을 극복하기 위한 하이드로겔(hydrogel)을 이용한 3차원 배양(대한민국공개특허, 제2017-0010857호)법이 있으나, 하이드로겔에서 배양한 간세포들은 스페로이드를 형성함으로써 간조직에서 나타나는 상피세포의 단일층(monolayer) 형태는 이루지 못하고 있다. 따라서 이러한 간세포 배양 기술을 극복하기 위한 지지체로서 PVA 멤브레인, RGD를 함유하는 RGD-PVA 멤브레인, 및 NaOH로 처리한 RGD-NaOH-PVA 멤브레인을 사용할 경우 3차원적인 초대간세포의 단일층 배양이 가능한가를 평가하였다.
< 실시예 10-1> 초대 간세포(Primary hepatocytes )의 분리 및 배양 방법
초대 간세포는 C57BL/6 마우스의 간조직으로부터 분리하여 사용하였다. 에테르(ether)로 마우스를 마취한 후 70% 에탄올(ethanol)로 복부와 가슴 부위를 깨끗이 세척하고 하복부를 수직으로 절개하였다. 간문맥에 24 G 정맥카테터를 삽입한 후 주사기에 채워둔 Hank’s balanced salt solution (HBSS, 0.5 mM EDTA, 25 mM HEPES) 용액 60 mL를 실린지 펌프를 이용하여 1분당 3 mL의 양으로 흘려주었다. 간이 부풀어 오르는 것을 확인하고 하대정맥을 자르고 펌프의 속도를 1분당 7-9 mL으로 증가시켰다. HBSS를 모두 흘려준 후 DMEM-저농도 글루코스(low glucose)에 15 mM HEPES, 페니실린 (penicillin), 4형 콜라겐분해효소(collagenase type IV, 100 CDU/mL)이 함유된 소화완충액(digestion buffer, 50 mL)을 7-9 mL/분으로 흘려주었다. 주사기와 정맥카테터를 조심스럽게 제거한 후 집게를 사용하여 간을 분리하고 소화완충액에 넣고 핀셋으로 간조직을 분해하여 간세포를 수득하였다. 수득한 간세포를 스트레이너(strainer)로 걸러주어 통과된 간세포를 DMEM 고농도 글루코스(high glucose)와 DMEM F-12 (1 : 1)로 조성된 분리완충액을 30 mL 채워준 후 원심 분리기를 사용하여 4℃에서 50×g의 속도로 2분간 원심분리하였다. 이 과정을 3회 반복하고 간세포를 분리완충액에 희석하여 분주하여 37℃에서 5% CO2 농도가 유지되는 배양기에서 세포를 배양시켰다. 2시간 후 분리 완충액을 제거하고 10% 소태아혈청, 1% 페니실린이 함유된 DMEM-고농도 글루코스(high glucose) 배양액을 첨가하였다.
< 실시예 10-2> 수산화나트륨으로 처리한 피브로넥틴 펩타이드 함유 PVA 멤브레인에서 간세포의 장기간 배양과 형태 측정
PVA 멤브레인, RGD를 함유하는 RGD-PVA 멤브레인, 및 수산화나트륨으로 처리한 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 7일 동안 배양한 초대간세포의 형태와 스페로이드(spheroid) 형성 유무를 공초점현미경으로 측정하였다. 도 19에 도시된 바와 같이, 수산화나트륨으로 처리하지 않은 PVA 멤브레인과 RGD-PVA 멤브레인에 초대간세포를 7일간 배양하였을 때 두 조건 모두에서 간세포들은 서로 응집하였으며 유사한 크기의 스페로이드의 형태로서 나타났다. 또한 이들 경우에서는 세포응집이 나타나는 스페로이드에 세포외 액틴의 발현이 강하게 나타났다. 수산화나트륨으로 처리한 PVA 멤브레인에서 간세포의 스페로이드 형성이 여전히 나타났으나 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 배양한 간세포는 세포응집이 일어나지 않은 상태로 각각의 세포들이 균일한 분포로 부착되어 있으며 팔로이딘 염색에 의한 액틴의 분포를 측정하였을 때도 스페로이드에서 나타나는 세포외 액틴은 발현되지 않았다. 7일간 배양한 초대 간세포에서 알부민 발현 정도는 스페로이드를 형성하거나 균일하게 분포되어 있는 세포 내에서나 모두 충분히 검출되었다. E-카드헤린으로 형광염색을 하였을 경우 세포간 접촉이 있는 부위에서 발현이 검출되었으며 세포의 다른 부위에서는 거의 발현되지 않음으로써 초대간세포가 장기간 배양에서 기능을 유지하면서 이상적인 단일층의 3차원 배양이 가능하다는 것을 보여주고 있다.
RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 21일 동안 배양한 후에도 초대간세포는 높은 생존율, 일정한 분포와 부착성을 유지하고 있는가를 조사하였다. 도 20A에 도시된 미분간섭현미경 이미지를 참조하면 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 21일 까지 배양한 초대간세포는 PVA 멤브레인에서 나타나는 간세포의 응집현상이 현저히 줄어들면서 배양 1일 이후의 세포와 같이 배양표면에 각각의 세포들이 균일하게 분포하는 것으로 나타났으며 세포부착성은 증가되는 현상을 보였다. PVA 멤브레인에서 배양한 초대간세포에 혈청을 첨가하지 않을 경우 세포의 수가 감소하면서 스페로이드 형성은 줄어드는 경향을 보였으나 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 배양한 초대 간세포는 혈청을 첨가한 경우에는 첨가하지 않은 경우보다 세포의 수는 증가하나 스페로이드 형성은 이루어지지 않았다. 특히, 도 18B에 도시된 전자현미경 이미지에서와 같이 RGD-NaOH-PVA 멤브레인에서 배양한 대부분의 세포들은 수산화나트륨을 처리하지 않은 멤브레인에서 보이는 세포응집 현상과는 달리 단독으로 흩어져 분포하고 있으며 규칙적인 크기와 세포 형태를 보인다는 것을 관찰할 수 있다.
도 21을 참조하면 KGRGDS와 GGPEILDVPST를 함유하는 PVA 멤브레인에서 초대간세포를 7일간 배양하면서 초대간세포의 형태를 RGD-NaOH-PVA 멤브레인과 비교하였을 때 세포의 부착성이나 분포는 더욱 향상됨을 보였다. 특히 이들 펩타이드가 함유된 멤브레인에서 배양한 경우 세포응집이 거의 일어나지 않으며 팔로이딘 염색이 세포 전체에 균일하게 나타났다. 이들 펩타이드가 함유된 멤브레인에서 배양한 초대간세포에서 E-카드헤린의 발현은 검출되었으며 간엽성유래 세포에서 발현되는 비멘틴(vimentin)을 염색하였을 때 비멘틴 발현의 증가는 없는 것으로서 상피-간엽성 전이는 일어나지 않는 것으로 나타는 것을 알 수 있다.
< 실시예 11> 후코이단 함유 PVA 나노섬유에서 세포 배양과 특성 측정
후코이단(fucoidan)은 세포외기질에 존재하는 프로테오글리칸(proteoglycan)과 유사한 구조를 가지며 세포표면에서 발현되는 셀렉틴(selectin)과 결합하는 것으로 알려져 있으며(Cumashi et al., Glycobiology. 2007;17(5):541-52.) 친수성인 후코이단을 소수성인 폴리카프로락톤 나노섬유에 균일하게 함유하게 제작할 경우 세포부착능이 증강된다는 보고가 있다. 친수성인 후코이단은 소수성인 PCL 등과 같은 폴리머와 실질적으로 나노섬유에 균질의 혼합 형태로 섞이지 못하거나 균일하게 제작하는 제조법이 어려운 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 후코이단 함유 나노섬유 멤브레인이 세포 배양과 부착성이 개선된 PVA 멤브레인으로 제공될 수 있는가를 조사하였다.
< 실시예 11-1> 후코이단 함유 나노섬유의 제작과 후코이단 검출 방법
PVA에 세포결합능을 증강시키는 펩타이드 뿐만 아니라 분자량이 110 kDa 정도인 고분자 입자인 후코이단을 함유하는 PVA 멤브레인(이하, 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인)을 전기방사법으로 제작하고 균일한 구조의 나노섬유로 제작되었는가를 측정하였다. 도 22에 나타낸 주사전자현미경 이미지에 나타낸 바와 같이 PVA 나노섬유에서와 같이 후코이단을 함유하더라도 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 나노섬유는 직경이 균일하고 공극도 균일하게 나타났는데 후코이단의 농도가 10 mg/ml인 경우 나노섬유의 직경은 다소 증가하지만 균일한 직경과 공극은 유지할 수 있는 것으로 나타났다.
후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에 후코이단이 함유되어 있는가를 검출하기 위하여 나노섬유를 메틸렌 블루로 처리하여 후코이단이 반응하여 멤브레인이 염색이 되는가를 조사하였다. 도 23은 1 mg/mL 농도의 후코이단을 함유하는 Fucoidan-PVA 멤브레인에 포함되어 있는 후코이단을 검출하기 위한 메틸렌 블루(methylene blue) 염색 결과이다. 나노섬유 멤브레인을 0.1% 메틸렌 블루(methylene blue)가 들어 있는 용매(50 mM HCl/MetOH:Acetone:H2O (6:4:15))에 담구어 상온에서 10분 동안 염색하고 증류수로 5분간 3회 세척하여 나노섬유에 묻어 있는 메틸렌 블루를 씻어낸 경우 PVA 나노섬유는 청색을 나타내지 않았으나 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA)는 청색으로 진하게 염색되는 것을 보였다. 후코이단에 결합된 메틸렌 블루를 탈색하기 위하여 탈색시약(5% acetic acid, 6% MetOH, 4% Acetone)으로 상온에서 20분 동안 탈염색 후 말린 다음 메틸렌 블루로 다시 염색을 하였을 때 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 나노섬유는 탈염색에 의하여 청색이 소멸되고 다시 염색을 한 경우에도 청색으로 염색되는 것으로 보아 전기방사로 제작된 후코이단을 함유하는 PVA 나노섬유에 있는 후코이단은 지속적으로 결합되어 있는 것으로 나타났다.
후코이단은 특이적인 성분으로 fucose-sulfate를 함유하고 있으므로 제작된 나노섬유에 이들 성분을 정량 분석함으로써 후코이단 함유량을 유추할 수 있을 것이다. 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에 함유된 후코이단이 나노섬유 멤브레인을 수산화나트륨으로 처리한 후에 방출되고 나서 나노섬유에 남아 있는 황의 원소 농도가 어느 정도인가를 파장 분산 X선 형광법(Wavelength Dispersive X-ray Fluorescence, WD-XRF)으로 측정하여 전체 폴리머 중에서 황의 농도를 %로 나타내었다. 도 24의 결과를 참조하면 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에서는 대조군 PVA 멤브레인에 비교하여 황의 원소농도가 현저히 증가되어 있고 수산화나트륨으로 멤브레인을 처리한 후에는 그 농도가 현저히 떨어지나 수산화나트륨으로 처리한 PVA 보다는 높게 측정되어 나노섬유에 후코이단이 잔존한다는 것을 알 수 있다.
< 실시예 11-2> 후코이단 - PVA ( Fucoidan - PVA ) 멤브레인에서 배양하는 세포의 부착능 측정
PVA 멤브레인과 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인을 염산증기와 디메틸포름아마이드로 처리하고 다시 1M 수산화나트륨으로 12시간 처리한 다음 세포배양에 사용하였을 때 이들 멤브레인에서 세포 부착의 차이가 있는가를 조사하여 후코이단을 함유하는 세포 부착에 영향이 있는가를 조사하였다. 도 25를 참조하면, PVA 멤브레인이나 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에서 염산증기만 처리한 경우 보다 디메틸포름아마이드를 추가하여 처리하였을 때 bEND.3 혈관내막세포의 부착수는 배양액으로 세척한 후에 더 많은 것으로 나타났다. 특징적으로 염산증기만 처리하거나 염산증기와 DMF를 둘 다 처리를 한 경우에서 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에서 배양한 세포의 부착능은 PVA 멤브레인에서 보다 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 세포부착능이 개선된 후코이단을 함유하는 PVA 나노섬유 멤브레인을 제작할 수 있다.
< 실시예 11-3> 후코이단 함유 PVA 멤브레인에서 초대간세포의 장기간 배양
후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인은 수산화나트륨의 처리 여부에 따라서 배양액에는 방출된 후코이단이 세포부착이나 성장 등에 영향을 미칠 수 있을 것이다. 따라서 수산화나트륨으로 처리하지 않거나 혹은 처리한 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에서 초대간세포를 장기간 배양하면서 이들 세포의 부착형태와 성장 등을 비교하였다. 도 26은 후코이단을 함유하는 나노섬유를 제작하고 수산화나트륨으로 처리하지 않은 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에서 7일간 배양한 초대 간세포의 스페로이드 형성 정도를 측정한 결과이다. 후코이단을 함유하는 PVA 나노섬유에서 후코이단이 방출되어 멤브레인에 세포의 부착을 오히려 방지함으로써 초대간세포의 응집을 더욱 유도하여 스페로이드 형성이 억제되기보다는 더욱 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 스페로이드를 형성하는 간세포에서 알부민의 발현은 지속적으로 유지되는 것으로 보아서 멤브레인에 세포부착성은 떨어지면서 세포간 부착성이 증가하며 세포기능은 유지된다는 것을 알 수 있다.
수산화나트륨으로 처리한 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인을 사용하여 초대간세포를 5일간 배양하면서 세포성장 형태를 공초점현미경으로 관찰한 도 27의 이미지를 참조하면, RGD-NaOH-PVA에서 배양한 간세포들이 멤브레인 표면에 균일하게 분포하면서 부착하는 현상과 유사하게 수산화나트륨으로 처리한 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에서 배양한 초대간세포는 부착성이 증가하여 단일세포가 부착하는 양상을 보이며 세포응집으로 인한 스페로이드 형성은 일어나지 않는 것으로 나타났다. 따라서 초대간세포의 단일층 배양의 지지체로서 세포부착성 펩타이드 뿐만 아니라 천연물인 후코이단 함유 PVA 멤브레인을 제작하여 사용할 수 있다.
< 실시예 12> PVA 멤브레인에서 배양한 세포부착성에 대한 방사선의 영향 평가
현재까지 암세포의 성장에 대한 항암제나 방사선의 효능은 주로 2차원 배양 조건에서 이루어지고 있는데 특히 세포부착성이 이들 세포의 약물효능에 영향을 줄 수 있으나 이러한 영향 인자를 배제할 수 있는 배양조건의 확립이 되지 못한 것은 적절한 지지체 개발의 한계도 이유가 될 수 있다. 따라서 배양디쉬 및 PVA 멤브레인에서 배양한 세포의 부착과 성장에 대한 방사선의 영향을 비교하였다.
도 28의 이미지는 CT26 대장암세포(3×104/700 μL/cm2)를 배양디쉬 및 PVA 멤브레인에서 분주하고 이틀간 배양한 후 4 Gy 및 8 Gy의 방사선을 조사한 후 다시 2일간 세포를 배양하면서 세포의 형태를 관찰한 결과이다. 배양디쉬에서 배양한 CT26 암세포는 방사선 조사에 의하여 세포부착이 큰 영향을 받지 않는 것으로 나타났으나 PVA 멤브레인에서 배양한 암세포는 4 Gy 처리에 의하여 세포부착성이 저하되면서 세포간 부착으로 인하여 ZO-1의 발현이 세포 주위로 증가하는 양상을 보였으며 8 Gy 처리 후에는 세포의 모양이 더욱 둥근형으로 나타나며 세포간 인접현상이 두드러졌다. 세포부착성을 증강시킨 후코이단을 넣은 PVA 멤브레인인 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에 CT26 세포를 배양하고 4 Gy 방사선을 조사하였을 때 PVA 멤브레인에 배양한 세포와 비교하여 세포의 부착성은 유지하면서 세포간의 연접은 어느 정도 일어나는 것으로 나타남으로써 세포부착성의 증강효과가 있는 것으로 보였다. 그러나 8 Gy의 높은 방사선량으로 조사하였을 경우 배양한 세포의 수가 현저히 감소하는 것으로 나타났는데 이는 후코이단에 결합한 암세포가 부착성이 떨어져서 소실되는지 세포의 사멸이 일어나는가는 확실치 않다.
위의 실험과 유사하게 HepG2 간암세포를 이틀간 배양한 후 4 Gy 및 8 Gy의 방사선을 조사하고 다시 2일간 세포를 배양하면서 세포의 형태를 관찰하였다. 배양디쉬에서 배양한 HepG2 세포는 표면에 붙어서 생존하지만 세포간 응집이 특징적으로 일어난다. 방사선을 조사하였을 때 세포부착이나 세포간 응집에는 어떠한 영향이 없었으며 세포연접에 관여하는 ZO-1의 발현 양상에도 큰 변화는 일어나지 않았다. PVA 멤브레인에서 배양한 간암세포는 4 Gy의 방사선을 조사한 2일 후 세포의 수는 현격히 감소함으로써 세포사멸이나 세포부착성의 결손이 일어남을 알 수 있다. 후코이단-PVA(Fucoidan-PVA) 멤브레인에 HepG2 간암세포를 배양하고 4 Gy 방사선을 조사하였을 때 방사선처리를 하지 않은 세포와 비교하여 부착된 세포의 수가 현저히 적게 나타났으나 PVA 멤브레인에 배양한 세포와 비교하여서는 부착된 세포의 수가 현저히 증가함을 나타내었다. 이러한 현상은 8 Gy의 방사선을 조사하였을 때도 세포의 수는 4 Gy 조사하였을 때 보다는 세포의 수는 감소하였으나 PVA 멤브레인에서 배양한 세포에 비교하여 현저히 많은 수의 세포가 관찰되었다. 특히 세포연접에 관여하는 ZO-1의 발현은 방사선조사에 의하여 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 암세포에 대한 방사선의 영향을 비교분석할 수 있는 3차원 배양 지지체로서 PVA 멤브레인 및 세포부착인자 함유 PVA 멤브레인을 제작하여 사용할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. (1) 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA), 폴리아크릴산(polyacrylic acid; PAA) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde; GA)를 포함하는 전기방사 용액에 세포부착성 물질인 세포결합성 펩타이드 또는 후코이단을 첨가하고, 전기방사하여 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인을 제조하는 단계;
    (2) 상기 제조된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인에 대해서 염산(HCl) 증기 처리하여 가교시킨 후, 디메틸포름아마이드(dimethylformamide; DMF) 용매 처리하여 결정화시키는 단계; 및
    (3) 상기 결정화된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인을 수산화나트륨으로 처리하는 단계를 포함하는 세포부착능이 증진된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포결합성 펩타이드는 RGD 펩타이드, KGRGDS 펩타이드, GGPEILDVPST 펩타이드 및 YIGSR 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 펩타이드인 것을 특징으로 하는 세포부착능이 증진된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포는 상피세포, 혈관내막세포, 암세포, 섬유아세포, 간세포, 면역세포 또는 기질세포인 것을 특징으로 하는 세포부착능이 증진된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포결합성 펩타이드는 10 내지 300 ㎍/mL 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 세포부착능이 증진된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 후코이단은 1 내지 20 mg/mL 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 세포부착능이 증진된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인 제조 방법.
  7. 제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 제조 방법에 따라 제조된 세포부착능이 증진된 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인.
  8. 제7항에 따른 폴리비닐 알코올 나노섬유 멤브레인에서 세포를 3차원 배양하는 단계를 포함하는 세포부착능이 증진된 3차원 세포 배양 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포는 상피세포, 혈관내막세포, 암세포, 섬유아세포, 간세포, 면역세포 또는 기질세포인 것을 특징으로 하는 세포부착능이 증진된 3차원 세포 배양 방법.
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