KR101684698B1 - 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 나노구조체의 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 나노구조체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체의 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 후코이단을 균일하게 함유하고 수용액에서 방출되지 않아 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체에 관한 것이다.
본 발명에 의한 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체의 제조 방법은 빙초산을 용매로 하여 후코이단을 용해시킨 후 폴리카플로락톤을 혼합한 용액을 전기방사법에 의해 나노구조체로 제조함으로써 본 발명에 의하여 제조된 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체에는 후코이단이 균일하게 분포하여 나노섬유로부터 방출이 되지 않는 특성을 나타내고, 이로 인하여 여러 종류의 세포 부착이 용이하여 부착된 세포를 배양하면서 세포활성을 조절할 수 있는 효과를 나타낸다.

Description

후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 나노구조체의 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 나노구조체{MANUFACTURING METHOD OF NANOFIBER STRUCTURE COMPRIGING FUCOIDAN WITH ENHANCED CELL ADHESION AND NANOFIBER STRUCTURE COMPRIGING FUCOIDAN MADE BY THE SAME}

본 발명은 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체의 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 후코이단을 균일하게 함유하고 수용액에서 방출되지 않아 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체에 관한 것이다.

2차원적 세포배양에서의 문제를 해결하기 위해서는 3차원적 세포 배양 방법이 매우 중요한 의의를 가진다. 생체조직 모사 세포배양 환경을 조성하기 위해 시도된 간단한 방법의 하나로서 세포를 나노섬유 재료로 제조되는 다공성 생체적합성 스캐폴드(porous biocompatible scaffold)를 이용하여 배양하는 것이다.

나노섬유는 적은 공간에 넓은 표면적을 지니고 있으며, 내구성이 강하고, 다루기가 매우 간편하며 다양한 형태로 제작이 가능하다. 합성고분자의 특성에 따라서 나노섬유의 공극이나 섬유 직경의 차이가 나는 특성을 보인다. 나노섬유 재료로 흔히 사용되는 합성 고분자로서는 polyglycolic acid (PGA), polycaprolactone (PCL), 및 polylactic acid (PLA)가 있으며 천연 고분자로서는 키토산(chitosan) 및 콜라겐(collagen) 등이 있다.

나노섬유 구조체는 다양한 물질을 화학적으로 결합시키는 것이 용이하다는 특징이 있을 뿐만 아니라 생체 적합성 소재를 이용하여 제작 가능하기 때문에 의료 분야에 활용하기 적합하다. 나노섬유 구조체의 또 다른 장점으로는 3차원 세포배양에서 세포의 활성이나 이동 등을 유도하거나 조절할 수 있는 약물을 함유하고 이들 약물을 서서히 방출할 수 있는 조건을 만들 수가 있다는 점이다. 이러한 환경은 3차원 세포배양에서 약물 투여를 하지 않고 면역세포와 피부세포의 활성이나 상호작용을 측정하거나 이식용 나노섬유 매트로 제작될 수 있는 기초 기술이 된다. 활성물질을 적재한 나노섬유 구조체는 세포의 부착, 증식, 분화 및 이동 조절에 활용될 수 있다. 따라서 세포에 대한 부착, 생존, 증식, 분화 등의 성능을 가지는 생활성지지체의 개발이 매우 중요한 의의를 갖는다.

PCL은 전기방사법으로 나노섬유 구조체를 제작하는 물질로 흔히 사용되는 고분자이지만 PCL 나노섬유는 소수성의 성질로 인하여 세포부착능이 낮은 단점을 가지고 있다. PCL 용액으로 사용되는 용매로는 chloroform, acetone, methylene chloride, hexafluoropropanol 및 dimethylformamide 등이 있다. Ferreira 등은(Ferreira et al., J Appl Polym Sci. 2014;131(22):41068) 초산 용액을 사용하여 PCL 나노섬유 매트를 제작하게 되었다. 따라서 친수성 물질을 균일하게 소수성인 PCL 나노섬유에 적재하는 제작기술이 필요하다.

후코이단은 fucose와 sulfate로 구성된 음이온을 띄는 다당류이다. 이 물질은 세포에 대한 독성이 적고 세포에 여러 가지 작용을 나타낸다. 후코이단은 헤파린 결합 단백질인 fibroblast growth factor (FGF)-1이나 FGF-2에 결합하고 이들의 활성도 증가시켜서 혈관내피세포로 구성된 혈관과 같은 튜브 형성을 증가시킨다. 섬유아세포나 근세포의 배양에서 후코이단을 처리할 경우 섬유성 콜라겐의 생성이 증가되며 피부에 대한 안정성이 우수하며 부분적으로 가수분해된 후코이단은 E. coli, S. aureus , 및 C. albicans에 대하여 세균증식 억제 효능이 있다. 후코이단은 백혈구, 혈소판 및 혈관내피세포의 세포막 수용체인 셀렉틴(selectin)에 결합하는 능력이 우수하여 혈관내피세포와 백혈구의 결합을 억제하기도 한다.

후코이단은 다시마 및 미역과 같은 해조류에 함유된 성분으로서 분자량이 약 200 kDa 이상의 고분자로서 해조류에서 물질을 분리한 경우 후코이단 등 여러 가지 거대분자의 복합다당류가 섞어져 있다. 실제 판매되는 후코이단은 순수 성분이 아니라 여러 추출 물질 혼합물이며 이에 함유된 후코이단의 농도가 명확하지 않다는 단점을 가지고 있다.

후코이단을 함유한 나노섬유를 제작한 시도가 있었으나 제작된 나노섬유에서 추출물이 수 시간의 배양액에 담군 뒤 방출되는 것으로 나타났는데 이를 해결하기 위해 고분자 용액과의 블렌딩 등 다양한 방법으로 제어물질을 적재하기 위한 기술들이 개발되고 있다. Lee 등은(Lee et al., Carbohydr Polym. 2012;90(1):181-8) PCL과 후코이단 파우더를 methylene chloride/dimethylformamide 혼합용액(8:2)에 녹인 후 전기방사를 통하여 후코이단 함유 나노섬유를 제작하였다. Jung 등은(Jung et al., In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2012;48(10):633-40) Fucoidan을 포함하는 해양추출물을 tetrahydrofuran과 dimethylformamide(7:3)에 PCL과 함께 파우더 형태로 녹인 용액에 혼합하여 PCL 나노섬유를 제작하여 성상교세포(astrocyte)의 활성에 영향을 준다고 발표하였다.

그러나 친수성인 후코이단은 소수성인 PCL과 실질적으로 나노섬유에 균질의 혼합 형태로 섞이지 못하고 나노섬유 표면에 과립 형태로 검출되는 문제점이 있었다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 후코이단이 균일하게 용해되어 나노섬유 구조체에 균일하게 혼합될 수 있는 새로운 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 후코이단을 함유하는 세포 배양을 위한 나노섬유 구조체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여

후코이단을 증류수에 용해시키고, 빙초산 용액과 혼합하는 단계;

상기 후코이단-빙초산 용액에 폴리카플로락톤을 용해시키는 단계;

상기 용액을 35 ℃ 내지 40 ℃의 온도로 12시간 동안 교반시키는 단계; 및

전기방사법에 의하여 상기 용액으로 나노구조체를 제조하는 단계; 를 포함하는 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체의 제조 방법은 후코이단을 먼저 증류수에 용해시켜 용액 상태로 제조한 후 빙초산 용액과 혼합하여 후코이단을 완전 용해시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의한 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체의 제조 방법에 있어서, 상기 폴리카플로락톤을 후코이단- 빙초산 용액에 용해시키는 단계에서 상기 후코이단의 농도가 0.5 내지 1 mg/ml 가 되도록 후코이단- 빙초산 용액에 용해시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체의 제조 방법에 있어서, 상기 전기방사법에 의하여 상기 용액으로 나노구조체를 제작하는 단계에서는 8-10 KV의 전압, 8 ㎕/min - 10 ㎕/min의 방사속도로 나노구조체를 제조하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체를 제공한다.

본 발명에 의한 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체의 제조 방법은 빙초산을 용매로 하여 후코이단을 용해시킨 후 전기방사법에 의해 나노구조체로 제조하는 것을 특징으로 하며, 이와 같은 본 발명에 의하여 제조된 후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체에는 후코이단이 균일하게 분포하여 나노섬유로부터 방출이 되지 않는 특성을 나타내고, 이로 인하여 여러 종류의 세포 부착이 용이하여 부착된 세포를 배양하면서 세포활성을 조절할 수 있는 효과를 나타낸다.

도 1은 전기 방사한 PCL 나노섬유의 형태학적 구조나 변화를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 Fucoidan/PCL 나노섬유와 비교예로서 PCL 나노섬유에 혈관내피세포의 부착되는 정도에 차이가 있는가를 실험한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 Fucoidan/PCL 나노섬유와 비교예로서 PCL 나노섬유에 호중구가 시간에 따라 두 종류의 나노섬유에 부착하는 정도를 실험한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 Fucoidan/PCL 나노섬유와 비교예로서 PCL 나노섬유에 대식세포가 시간에 따라 두 종류의 나노섬유에 부착하는 정도를 실험한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예에 의하여 후코이단으로 제조된 Fucoidan/PCL 나노섬유와 비교예로서 클로로포름에 녹인 폴리카플로락톤 나노섬유를 albician blue로 처리하고 세척한 후의 나노섬유 매트의 염색 정도를 관찰한 사진이다.
도 6은 농도가 다른 후코이단 용액의 메틸렌 블루 (methylene blue) 염색에 의한 염색 정도를 나타낸 도면이며(도면 A), 메틸렌 블루의 농도를 측정하기 위하여 분광광도계(spectrophotometer)에서 메틸렌 블루의 흡광도를 나타낸 도면이며(도면 B), 도6A에서 점적한 후코이단에 염색된 메틸렌 블루를 추출하고 측정한 흡광도의 표준곡선(standard curve)를 도시한 도면이다(도면 C).
도 7은 메틸렌 블루 염색법을 사용하여 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 Fucoidan/PCL 나노섬유 내에 후코이단이 함유된 것을 나타낸 도면이다.
도 8은 Fucoidan/PCL 나노섬유와 후코이단을 점적한 여과지를 메틸렌 블루로 염색하고, 추출액으로 처리한 후 이차적으로 다시 염색하였을 때 Fucoidan/PCL 나노섬유 만이 염색되는 것을 나타낸 도면이다.
도 9는 2D 배양상태, PCL 나노섬유 및 Fucoidan/PCL 나노섬유 매트에서 혈관내피세포와 대식세포를 배양하면서 생성되는 nitric oxide (NO)의 생성 양을 측정하여 비교한 결과를 나타낸 것이다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> Fucoidan / PCL 전기 방사 용액 제조

Polycaprolactone (PCL, Mw=80,000, Sigma)과 후코이단(Fucose vesiculosus fucoidan, Mw=68.6K, sulfate 26.6% Sigma)를 사용하였고, 용매는 빙초산(Glacial acetic acid, Sigma)을 사용하였다.

후코이단을 증류수에 50 mg/ml(w/v) 혹은 25 mg/ml으로 녹인 용액 (100 ㎕)을 빙초산(5 ml)에 혼합하고 PCL을 15% (w/v) 비율로 첨가하고 37℃에서 12시간 동안 용해하였다.

비교예로서 용매로서 클로로포름(chloroform, Sigma)을 사용하여 PCL을 15%로 희석한 후, 후코이단을 1 mg/ml(w/v)의 농도로 용해시켰다. .

< 실시예 2> 전기방사법에 의한 fucoidan / PCL 나노섬유의 제작

전기방사법을 이용하여 전기방사기의 조건을 조절함으로써 나노섬유를 제작하였는데 10%-15%의 PCL 농도, 8-10 KV의 전압, 8 μl/min - 10 μl/min의 방사속도의 여러 조건에서 전기방사를 실행하여 최적의 조건으로 15% PCL 용액(5 ml)을 8 ㎕/min의 방사속도로 20 cm의 방사거리를 두고 25G 금속주사기를 사용하여 10 KV 상태에서 전기방사하였다.

<실험예> SEM 측정

나노섬유를 백금코팅한 후 주사전자현미경(scanning electron microscopy, SEM)(JSM-6700F, Japan)을 사용하여 전기 방사한 PCL 나노섬유의 형태학적 구조나 변화를 관찰하고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 나노섬유의 두께나 공극은 이미지 분석 프로그램(ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)을 사용하여 측정하였다.

도 1에서 보는 바와 같이 1 mg/ml 농도로 후코이단을 사용한 경우에서 0.5 mg/ml 후코이단이 보다 일정한 나노섬유의 형태를 보였다. 후코이단은 1.5 mg/ml 이상의 농도에서는 PCL이 들어 있는 빙초산 용액에서 녹지 않고 결정화되는 것으로 나타남으로써 전기방사에 의하여 균질의 후코이단을 포함하는 나노섬유는 제작되지 못하였다.

PCL 용액을 전기방사하여 제작한 나노섬유 매트는 비교예로서 후코이단이 포함되지 않은 경우보다 두께가 더욱 일정하고 공극이 있는 것으로 나타났다.

<실험예> Fucoidan/PCL 나노섬유에서 혈관내피세포의 부착 및 배양

본 발명의 실시예에 의하여 제조된 Fucoidan/PCL 나노섬유와 비교예로서 PCL 나노섬유에 혈관내피세포의 부착되는 정도에 차이가 있는가를 조사하였다.

혈관내피세포는 사람의 제대정맥세포 유래의 EA.hy926 세포(ATCC CRL- 922)를 사용하였다. 혈관내피세포는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배지에 10% FBS 100 IU/mL penicillin 및 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 배양액에서 5% CO₂를 유지하는 세포배양기에서 배양하였다.

상기 실시예 및 비교예에서 제조된 나노섬유는 8 well 슬라이드에 고정시키고 1 × 10⁵ 개의 세포를 상기 배양액에서 배양하였다. 배양 후 5분부터 24시간 까지 나노섬유에 부착하지 않은 세포를 포함하는 배양액을 제거하고 배양액으로 2회 세척한 후 DAPI와 phalloidin으로 형광염색하여 부착된 세포의 수를 확인하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 비교예인 PCL 나노섬유와 비교하여 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 Fucoidan/PCL 나노섬유 전체에 혈관내피세포들은 배양 1시간부터 현저히 많은 수가 부착하는 것으로 나타났다.

<실험예> Fucoidan/PCL 나노섬유에서 대식세포 및 호중구 부착 및 배양

본 발명의 실시예에 의하여 제조된 Fucoidan/PCL 나노섬유와 비교예로서 PCL 나노섬유에 대식세포(macrophage) 및 호중구와 같은 면역세포가 부착되는 정도에 차이가 있는가를 조사하였다.

대식세포 및 호중구는 마우스 복강유래 세포를 사용하였다. 마우스 복강에 3% thioglycollate를 2 ml 주입하고 호중구는 5시간 후에 대식세포는 3일 후에 복강액에 들어 있는 세포를 분리하여 96 well 배양 플레이트에서 1 × 10⁵ 개의 세포를 200㎕ RPMI-1640 배양액(10% FBS, 100 IU/mL penicillin 및 100 ㎍/mL streptomycin)에서 배양하였다. 대식세포는 배양 2일 후 플레이트에 부착된 세포를 나노섬유에 얹고 일정 시간이 지난 후 부착되지 않은 세포를 제거하고 배양액으로 2회 세척한 후 DAPI와 phalloidin으로 형광염색하여 부착된 세포의 수를 확인하고 그 결과를 도 3 및 도 4 에 나타내었다.

도 3 및 도 4 에서 대식세포 및 호중구의 부착은 top-seeding 후 비교예의 PCL 나노섬유보다는 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 fucoidan/PCL 나노섬유의 전체 표면에 빠른 시간에 더욱 더 잘 부착하는 것으로 나타났다.

< 실험예 >: Fucoidan / PCL 나노섬유 내 후코이단의 검출

Fucoidan/PCL에 후코이단이 함유되어 있는가를 검출하기 위하여 나노섬유를 메틸렌 블루로 처리하여 후코이단이 반응하여 나노섬유 매트가 염색이 되는가를 조사하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이 본 발명의 비교예에 의하여 클로로포름에 녹인 PCL에 섞은 후코이단을 전기방사한 나노섬유 매트에서는 후코이단이 완전히 녹지 않아서 도5A와 같이 나노섬유 매트에 과립형의 덩어리가 나오는 것으로 나타났다.

또한, 상기 비교예의 나노섬유를 alcian blue로 염색하였을 때 도5B에 나타낸 바와 같이 나노섬유는 부분적으로 염색이 되고, 증류수로 세척 후에는 과립형 덩어리 부위만 염색이 지속되며 다른 부위의 나노섬유는 탈색이 되는 것을 알 수 있다.

< 실험예 >: 메틸렌 블루에 의한 Fucoidan 의 정량 및 정성적 검출

110 mm 여과지에 1 × 1cm 칸을 그리고, 각각의 칸에 농도별로 fucoidan 용액을 2 μl 씩 떨어뜨려 건조 오븐에서 말렸다. 건조된 여과지를 메탄올, 아세톤 및 증류수 용액(6:4:15, V/V)에 50 mM HCl과 0.1% 메틸렌 블루를 섞은 시약으로 상온에서 10분 동안 염색하였다. 염색된 필터 페이퍼를 증류수로 3회 세척하고 후코이단에 결합하지 않은 염색액을 제거하기 위하여 필터 페이퍼는 탈색 시약(5% 아세트산, 6% 메탄올, 4% 아세톤)을 사용하여 상온에서 20분 동안 반응시켜서 탈색하였다. 도6A에서와 같이 일정양의 후코이단 용액을 점적한 여과지는 메틸렌 블루에 의하여 염색되는 것으로 나타났다.

이들 염색된 정도가 후코이단의 농도와 비례하는가를 측정하기 위하여 염색된 메틸렌 블루를 추출하여 얻은 용액의 흡광도를 측정하였다. 도6B에서와 같이 메틸렌 블루는 663 nm에서 특징적인 흡광도를 나타내었다.

메틸렌 블루로 염색된 여과지를 추출용액(70% 에탄올, 2% sodium dodecyl sulfate)에 넣고 50℃ 항온수조에서 15분 동안 추출한 후 그 용액은 Nanodrop spectrophotometer를 사용하여 663 nm에서 흡광도를 측정하였다. 도6C에 나타낸 바와 같이 후코이단을 점적하여 염색된 부분을 추출한 메틸렌 블루의 흡광도는 점적 농도와 비례하여 나타남으로써 후코이단의 검출에 메틸렌 블루 염색법을 적용할 수 있다.

<실험예>: Fucoidan/PCL 나노섬유로부터 후코이단 방출 여부 검출

Fucoidan/PCL 나노섬유 내 후코이단이 메틸렌 블루 추출용액에 의하여 방출되는 가를 측정하기 위하여 70% 에탄올 및 2% sodium dodecyl sulfate로 조성된 추출 용액에 나노섬유 매트를 넣고 50℃ 항온수조에서 일정시간 반응시킨 다음 메틸렌 블루로 다시 염색하고 탈색을 이차적으로 시행하였다.

먼저 도7 에 나타낸 바와 같이 여과지에 후코이단을 점적하고 염색한 다음 추출액을 처리하였을 때 이차 염색이 잘 되지 않았으나 후코이단 함유 나노섬유는 추출액 처리를 하고 이차 염색을 하였을 때도 일차 염색을 하였을 경우와 같은 정도로 염색되는 것으로 나타남으로써 나노섬유에 적재한 후코이단은 추출되지 않고 나노섬유에 결합되어 있다는 것을 알 수 있다.

< 실험예 > Fucoidan / PCL 나노섬유에서 배양한 세포에서 nitric oxide(NO)의 생성 측정

후코이단을 처리한 세포는 활성화가 일어나는데 세포 활성화 기전으로서 세포에 결합한 후코이단이 특이 수용체를 거치거나 비특이적으로 세포 내로 들어가서 일어나는가는 아직 명확히 밝혀져 있지 않다. 따라서 배양된 세포에 후코이단을 처리한 경우와 나노섬유에 결합되어 세포에 영향을 주는 후코이단의 영향을 nitric oxide 생성 정도를 측정하여 비교하였다.

Nitric oxide의 생성은 Griess 시약(G4410, Sigma)을 사용하여 발색되는 정도를 흡광도 540 nm에서 spectrophotometer(UVT 06856, Molecular Devices Co.)를 사용하여 측정하였다. 혈관내피세포 및 대식세포(1 × 10⁵)을 8 well plate에 분주하고 2D 배양 상태인 경우 100 ㎍/ml의 후코이단이나 1 ㎍/ml LPS을 처리하고 2일 동안 배양하였다. 이들 세포(1 × 10⁵)는 PCL 및 Fucoidan/PCL 나노섬유 매트에 분주하고 LPS를 처리하고 2일간 배양하였다. 세포배양 후 분리한 배양액에 1× Griess 시약을 1:1로 첨가하고 15분간 반응시킨 다음 흡광도를 측정하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이 나노구조체를 사용하지 않고 2D 배양 상태에서는 혈관내피세포나 대식세포를 LPS나 후코이단을 처리하였을 때 nitric oxide의 생성이 증가하였으나, 이들 두 시약을 동시에 처리하였을 때는 상승 작용은 나타나지 않았다.

이에 비하여 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 Fucoidan/PCL 나노섬유 매트에서 배양한 세포들은 LPS만을 첨가하여도 nitric oxide의 생성이 크게 증가하였다. Fucoidan/PCL에 배양한 세포와는 다르게 PCL 나노섬유 매트에서 배양한 세포들에서는 LPS의 처리 후에도 nitric oxide의 생성은 크게 증가하지 않았다. 따라서 나노섬유에 함유된 후코이단은 세포에 결합함으로써 다른 경로를 통한 세포활성에 크게 영향을 미친다는 것을 시사한다.

Claims (4)

1. 후코이단을 증류수에 용해시키고, 빙초산 용액과 혼합하는 단계;
   상기 후코이단-빙초산 용액에 폴리카플로락톤을 용해시키는 단계;
   상기 용액을 35 ℃ 내지 40 ℃의 온도로 12시간 동안 교반시키는 단계; 및
   전기방사법에 의하여 상기 용액으로 나노구조체를 제조하는 단계; 를 포함하는
   후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체의 제조 방법
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 빙초산 용액에 후코이단을 용해시키는 단계에서 상기 후코이단의 농도가 0.5 내지 1 mg/ml 가 되도록 용해시키는 것인
   후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체의 제조 방법
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 전기방사법에 의하여 상기 용액으로 나노구조체를 단계에서는
   8-10 KV의 전압, 8 μl/min - 10 μl/min의 방사속도로 전기방사법에 의하여 상기 용액으로 나노구조체를 제조하는 것을 특징으로 하는
   후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체의 제조 방법
   
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 제조 방법에 의하여 제조된
   후코이단을 함유하는 세포 부착능이 개선된 폴리카플로락톤 나노구조체
   
   

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