JP5861419B2 - 機能性フィルム付き細胞培養容器およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、機能性フィルムが底面に配置された機能性フィルム付き細胞培養容器とその製造方法に関する。

表面に細胞培養される親水性ポリマー（温度応答性ポリマー)の層を被覆した細胞培養支持体（シャーレなどの細胞培養容器）が特許文献１に記載されている。この細胞培養支持体を用いることにより、温度を変化させるだけで培養・増殖後の細胞を破壊することなく細胞支持体から容易に剥離して回収することができる。しかし、特許文献１に記載のように、シャーレなどの細胞培養容器に、別個にバッチ処理により表面処理をして機能性化合物層を設けることは、多くの手間を必要としており、作業性の観点からはなお改善する余地がある。

特開平２−２１１８６５号公報

特許文献１に記載される細胞培養支持体の持つバッチ処理による不都合を解消する手法として、機能性化合物層の多数個を帯状の剥離フィルム上に配列した原反を予め作っておき、ラベリングの手法を使って、原反から機能性化合物層を連続的に剥離させるとともに、各剥離した機能性化合物層を、従来からシート材などの搬送手段として用いられている負圧吸着ヘッドを用いて、細胞培養容器まで移送した後、負圧を開放して、機能性化合物層を細胞培養容器の底部に配置する手法が考えられる。

一方、細胞培養容器の底面に機能性フィルムを配置して細胞の培養・増殖を行う場合、細胞培養容器の底面と機能性フィルムの裏面との間に気泡が存在しない状態で、両者が密着していることが求められる。

本発明者らは、図６に示すような従来から用いられている負圧吸着ヘッド４０を用い、負圧吸着ヘッド４０の吸着面４１に機能性フィルムを吸着した状態で細胞培養容器の上まで移送し、そこで負圧を開放して機能性フィルムを細胞培養容器の底面に落下させる処理を多く行っているが、図７（ａ）に示すように、細胞培養容器５０の底面５１の形状に一致した大きさの機能性フィルム１０を用いる場合、底面５１にぴったり位置合わせして機能性フィルム１０を落下させるのは容易でなく、負圧吸着ヘッド４０と細胞培養容器５０との位置合わせに多くの時間を要する場合があった。

図７（ｂ）に示すように、細胞培養容器５０の底面面積よりも小さい面積の機能性フィルム１０を用いる場合には、位置合わせは比較的容易となるが、細胞培養容器５０の機能性フィルム１０が存在しない底面領域ｓに、培養時に、培養しようとする細胞が落下してしまい、無駄な細胞が生じるとともに、顕微鏡での観察時に機能性フィルム１０の周縁エッジ部１０ｅが見えてしまい、細胞培養容器としての見栄えが低下するのを避けられなかった。

また、細胞培養容器５０の底面５１に機能性フィルム１０を配置するときに、底面５１と機能性フィルム１０の裏面との間に気泡１（図７（ａ）参照）が形成されがちであり、形成された気泡を排除するために、０．４ＭＰａ程度の圧力環境下にあるオートクレーブ内に細胞培養容器５０を収容して、気泡を排除することが行われるが、細胞培養容器５０の底面形状に一致した大きさの機能性フィルム１０を用いる場合、図７（ａ）に示すよう、機能性フィルム１０の周縁エッジ部１０ｅが細胞培養容器５０の周側壁５２に衝接した状態となり、その結果、オートクレーブ内で圧をかけても、衝接部が逃げ道を塞ぐようになって、気泡の排除が困難となるのも経験した。より高い圧をかけることで気泡の排除は可能となるが、機能性フィルムの有効面（細胞培養面）に傷を付ける恐れがあり、現実的な解決策とはならなかった。

なお、図６に示す負圧吸着ヘッド４０は、前記したように従来知られたものであり、図６（ａ）の断面図に示すように、実質的に平坦面である吸着面４１と該吸着面４１の裏面側の空気室４２とを有し、前記空気室４２は、例えばエアーシリンダ３１の空気路３６と接続している。また、前記空気路３６は適宜の図示しない空気吸引および排気手段に接続している。図６（ｂ）に示すように、この例において、前記吸着面４１の形状は平面視で円形であり、該吸着面４１の全面に多数の負圧吸引孔４４が形成されている。

本発明は、上記のような事情に鑑みてなされたものであり、従来から行っている０．４ＭＰａ程度の圧力環境下にあるオートクレーブ内での加圧処理によって、容器底面と機能性フィルムの裏面との間に存在する気泡を確実に排除することができるようにした機能性フィルム付き細胞培養容器とその製造方法を提供することを課題とする。また、機能性フィルムを配置するときの位置決め作業を容易化できる機能性フィルム付き細胞培養容器とその製造方法を提供することを課題とする。

上記の課題を解決すべく、本発明者らは多くの実験を行うことにより、機能性フィルムの大きさを、それを配置しようとする細胞培養容器の底面の大きさよりも少し大きくしておき、それを細胞培養容器の底面に向けて落下させて容器底面に配置した場合、機能性フィルムは容器底面に加えて、周側壁の底面に近接した領域をも覆う状態で配置されるようになるが、その状態の細胞培養容器をオートクレーブ内に収容して０．４ＭＰａ程度の圧力環境下に置くと、容器底面と機能性フィルムの裏面との間に気泡が存在する場合、その気泡は確実にその間から外部に排除されることを知見した。その理由は、機能性フィルムの容器底面に位置する部分と周側壁を覆っている部分とは丸みを帯びた領域で接続しており、端面（エッジ部）が周側壁と衝接した状態とはならないので、加圧されたときに気泡は上方に逃げやすくなるためと考えられる。

本発明は、上記の実験を通して得た知見に基づくものであり、本発明による機能性フィルム付き細胞培養容器は、底面と該底面から立ち上がる周側壁とを備え前記底面には機能性フィルムが配置されている機能性フィルム付き細胞培養容器であって、前記機能性フィルムは前記底面に加え前記周側壁の底面に近接した領域をも覆う状態で配置されていることを特徴とする。

また、本発明による細胞培養容器の製造方法は、底面と該底面から立ち上がる周側壁とを備えた容器の前記底面側に機能性フィルムが配置されてなる細胞培養容器の製造方法であって、前記機能性フィルムとして前記容器の底面よりも広い面積を持つ機能性フィルムを用い、当該機能性フィルムを負圧吸引により前記容器の上まで移送し、落下後に前記機能性フィルムが前記容器の底面に加え前記周側壁の底面に近接した領域をも覆うことができる位置において、負圧を開放して機能性フィルムを前記容器の底面に向けて落下させ、落下した機能性フィルムを前記底面に加え前記周側壁の底面に近接した領域をも覆う状態で容器底面側に固定することを特徴とする。

本発明による機能性フィルム付き細胞培養容器では、容器底面に機能性フィルムを配置させた後、０．４ＭＰａ程度の圧力環境下に置くことで、容器底面と機能性フィルムの裏面との間に気泡が存在する場合に、その気泡を確実に外部に排除することができる。結果として、本発明による機能性フィルム付き細胞培養容器は、従来と同じオートクレーブ内での処理を行うことで、容器底面と機能性フィルムの裏面との間に気泡が存在しない細胞培養容器とすることができ、機能性フィルムの有効面（細胞培養面）に損傷のない細胞培養容器が得やすくなる。

また、製造に当たり、細胞培養容器の底面と機能性フィルムとの位置合わせも容易化であり、さらに、容器の底面領域全面が機能性フィルムで覆われることで、培養時に、細胞の無駄が生じることもない。そのために、製造コストの低減ももたらされる。さらに、顕微鏡での観察時に機能性フィルムの周縁エッジ部が見えてしまうこともなく、細胞培養容器としての見栄えも向上する。

本発明による機能性フィルム付き細胞培養容器において、前記機能性フィルムが容器底面から立ち上がっている距離、すなわち周側壁を覆っている高さに特に制限はないが、機能性フィルムはほぼ２〜１０ｍｍの高さまでの周側壁を覆っていることは好適な態様である。２ｍｍよりも低い場合には、位置決めに精緻な制御が必要となり、制御が十分でないと、位置ずれによって容器底面の一部に機能性フィルムで覆われない露出した領域が形成されたり、機能性フィルムの端面が顕微鏡での観察時に視野内に入ってしまうことが起こり得る。１０ｍｍよりも長い場合には、位置決め制御は容易となるが、オーバースペックとなってコストの高騰を招く。

本発明による機能性フィルム付き細胞培養容器において、前記底面と前記周側壁は湾曲部を介して連続している態様は、より好ましい態様である。この態様では、機能性フィルムは容器の形状に沿った形状で容器底面および周側壁に沿って配置されるようになり、オートクレーブ内での加圧処理時などに、機能性フィルムにしわや損傷が生じるのを確実に回避することができる。

本発明による機能性フィルム付き細胞培養容器において、前記周側面の全周が前記機能性フィルムによって覆われている態様はより好ましいが、細胞培養容器の底面形状によっては、周側面の全周を機能性フィルムによって覆うことが困難な場合が起こり得る。そのような場合でも、機能性フィルムが少なくとも周側壁の全周における少なくとも５０％以上を覆っていれば、実用上支障のない程度に所期の目的を達成することができる。周側壁が機能性フィルムで覆われない領域では、容器底面への細胞の落下や顕微鏡での観察時に機能性フィルムの周縁エッジ部が見えてしまうなどの不都合が起こる場合があるが、それは５０％未満の領域であり、実用上の大きな支障とはならない。

本発明によれば、容易にかつ低コストで、機能性フィルムの裏面と細胞培養容器の底面との間に気泡が存在しない機能性フィルム付き細胞培養容器を得ることができる。

図１（ａ）（ｂ）は本発明による機能性フィルム付き細胞培養容器をその製造過程とともに示す断面図であり、図１（ｃ）は他の形態の本発明による機能性フィルム付き細胞培養容器を示す断面図である。 機能性フィルムの一例を説明する模式図であり、図３のａ−ａ線に沿う断面で示している。 多数個の機能性フィルムを帯状の剥離フィルムに仮接着した原反を説明する模式図。 機能性フィルムを原反から細胞培養容器へ移し替える装置の一例を説明する模式図。 機能性フィルムを配置した細胞培養容器の例であるフラスコ型細胞培養容器を示す図。 負圧吸着ヘッドの従来例を示す図。 細胞培養容器の底面に機能性フィルムを配置したときの２つの図。

以下、本発明を実施の形態に基づき説明する。
図１（ａ）（ｂ）は、本発明による機能性フィルム付き細胞培養容器をその製造過程とともに示している。図において、仮想線で示す負圧吸着ヘッド４０は、図６を参照して説明した従来知られた負圧吸着ヘッド４０と同じものであり、図１では省略するが、図６に示すように、実質的に平坦面でありかつ平面視で円形である吸着面４１を有し、該吸着面４１の全面には多数の負圧吸引孔４４が形成されている。５０は、図７に示したと同様な細胞培養容器であり、有底の円筒形状であって、底面５１と円筒状の周側壁５２を備える。底面５１は平坦面であり、周側壁５２の内径は負圧吸着ヘッド４０の外径よりも２ｍｍ程度だけ大きくされている。

１０は、機能性フィルムであり、該機能性フィルム１０は平面視で円形であり、その直径は、細胞培養容器５０の周側壁５２の内径よりも２〜５ｍｍ程度だけ大きくされている。なお、本発明において、機能性フィルム１０とは、可撓性を有しており、かつ表面に細胞培養に適した所望の機能が付与された、粘着剤層を備えたフィルムであることが好ましい。より好ましい実施形態では、図２に示す機能性フィルム１０のように、フィルム基材層１１の一方の面に機能性化合物層１２が積層され、他方の面に粘着剤層１３が積層されている。なお、図２において、１４は後記する帯状をなす剥離フィルムである。また、機能性フィルム１０を構成する各素材については、後に詳述する。

機能性フィルム付き細胞培養容器Ａを製造するに際し、適所に置かれた機能性フィルム１０を負圧吸着ヘッド４０により中心合わせした状態で負圧吸着する。図１（ａ）に示すように、寸法の関係から、吸着されている機能性フィルム１０の周縁領域は、負圧吸着ヘッド４０の吸着面４１からはみ出た状態となる。その状態で、負圧吸着ヘッド４０を細胞培養容器５０の上方位置まで移動して位置合わせをし、その後、図１（ｂ）に示すように、負圧吸着ヘッド４０を細胞培養容器５０の底面５１に０．１ｍｍ〜１０ｍｍ程度に近接した位置まで下降させる。下降の過程で、機能性フィルム１０の周縁部１０ｂは、細胞培養容器５０の周側壁５２の内周面に接した状態で下降することとなり、結果として、機能性フィルム１０の周縁エッジ部１０ｅは上に向いた姿勢となる。

負圧吸着ヘッド４０の吸着面４１と細胞培養容器５０の底面５１とが所定の距離となった時点で、負圧吸引孔４４に作用している負圧を開放する。それにより、機能性フィルム１０は、周縁部１０ｂを細胞培養容器５０の周側壁５２の内周面に接触した状態で、かつ周縁エッジ部１０ｅが上に向いた状態で、細胞培養容器５０の底面５１まで落下していき、図１（ｂ）に示すように、細胞培養容器５０の底面５１に固定される。すなわち、機能性フィルム１０は、細胞培養容器５０の底面５１に加え、その周縁部１０ｂで細胞培養容器５０の周側壁５２の底面５１に近接した高さほぼ２〜１０ｍｍの領域をも覆う状態で、細胞培養容器５０の底面５１に固定された状態となる。その際に、細胞培養容器５０の底面５１と機能性フィルム１０との間に気泡１が抱き込まれた状態となるのは避けられない。

上記のようにして機能性フィルム１０が底面に配置された機能性フィルム付き細胞培養容器Ａを、気泡除去の目的でオートクレーブ内にセットし、０．４ＭＰａ程度の圧力環境下に置く。機能性フィルム１０の上面側に作用する圧力により、前記した気泡１は次第に周側壁５２側に移動していき、周側壁５２の内周面とそこを覆っている機能性フィルム１０の周縁部１０ｂとの間から、確実に外部に抜け出ていく。

上記した形態の本発明による機能性フィルム付き細胞培養容器Ａでは、機能性フィルム１０の大きさは、それを配置しようとする細胞培養容器５０の底面５１、すなわち開放側の面よりやや大きくなっており、負圧吸着ヘッド４０と細胞培養容器５０との位置合わせは比較的に容易である。また、細胞培養容器５０の底面全面は機能性フィルム１０で覆われており、細胞培養時に、培養しようとする細胞が機能性フィルム１０のない領域に落下して無駄になるようなこともない。さらに、顕微鏡での観察時に機能性フィルム１０の周縁エッジ部１０ｅが見えてしまい、細胞培養容器としての見栄えが低下することもない。

図１（ｃ）は本発明による機能性フィルム付き細胞培養容器Ａの他の形態を示す、図１（ｂ）に相当する図である。この機能性フィルム付き細胞培養容器Ａ１は、細胞培養容器５０の底面５１と周側壁５２とが、垂直な接合部ではなく、湾曲部５３を介して連続している点で、図１（ｂ）に示す細胞培養容器５０と相違している。他の構成は同じであってよく、同じ符号を付して説明は省略する。

図１（ｃ）に示す機能性フィルム付き細胞培養容器Ａ１は、機能性フィルム１０は、細胞培養容器５０の丸みを持つ湾曲部５３の形状に沿って容器底面５１から周側壁５３にわたって配置されるようになり、オートクレーブ内での加圧処理時などに、機能性フィルムにしわや損傷が生じるのを確実に回避することができる。また、気泡１の抜けも促進される。

上記した機能性フィルム１０は、任意の方法で作ることができるが、一つの例として、多数個の機能性フィルムを帯状の剥離フィルムに仮接着した原反２２を用いる方法と、その原反２２から剥離した機能性フィルム１０を細胞培養容器５０を移送するための装置の一例について、図２〜図４を参照して、以下に説明する。

図２に示すように、最初に帯状をなす剥離フィルム１４を用意し、その全面に粘着剤層１３を塗布し、その上に、同じ幅であるやはり帯状のフィルム基材層１１と機能性層としての機能性化合物層１２を積層する。それにより、図に示すように、剥離フィルム１４と粘着剤層１３とフィルム基材層１１と機能性化合物層１２の４層構造からなる、長尺物２０（図３参照）が形成される。ここで、粘着剤層１３とフィルム基材層１１と機能性化合物層１２の３層が、機能性フィルム１０を構成することとなるが、それらを構成する素材については後に詳述する。なお、剥離フィルム１４には、必要な強度や柔軟性を有する限り特に限定されないが、例えば、ポリエチレンテレフタレート等の樹脂からなるフィルムまたはそれらの発泡フィルムに、シリコーン系剥離剤等の剥離剤で剥離処理したものを挙げることができる。

長尺物２０の前記剥離フィルム１４とは反対の面から、得ようとする機能性フィルム１０の外郭形状を持つ型枠（不図示）を、剥離フィルム１４の表面にまで達するように押下する。それにより、機能性化合物層１２とフィルム基材層１１と粘着剤層１３には、機能性フィルム１０の外郭形状をなす切り込み線２１が形成される。その型押し作業を所定の間隔をおいて連続的に長尺物２０に対して行うことにより、図３に示すような、複数個の切り込み線２１の入った長尺物２０が得られる。そして、前記長尺物２０は、機能性フィルム１０（機能性化合物層１２）側が内側となるようにしてロール状に巻き込まれて原反２２（図７参照）とされ、保管される。

機能性フィルム１０の平面視での形状には制限はなく任意の形状を取ることができ、それに応じた型枠が用いられる。図２，３に示した例では、円形の細胞培養容器５０の底面５１に配置することを予定する機能性フィルム１０を得ようとするものであり、切り込み線２１は、細胞培養容器５０の底面５１の内周輪郭の形状とほぼ同じ、円形形状とされている。

図４は、前記原反２２から機能性フィルム１０を分離し、分離後の機能性フィルム１０を、前記のようにして細胞培養容器５０の底面５１に移し替える装置の一例を示している。図示の移し替え装置３０は、従来知られた３次元ロボットアーム（不図示）に取り付けられたエアーシリンダ３１を備え、該エアーシリンダ３１の下方先端に、図６で説明した形態の従来知られた負圧吸着ヘッド４０が着脱可能に装着されている。エアーシリンダ３１は、３次元ロボットアームの制御装置（不図示）により、面方向であるＸ−Ｙ軸方向および垂直方向であるＺ軸方向に移動可能とされている。

エアーシリンダ３１の近傍には、水平方向またはわずかに下方に傾斜した方向に延在する案内台３２が位置しており、前記原反２２から巻き出される長尺物２０は、ガイドロール３３・・によって案内されることで、前記案内台３２の上面に沿って移動し、先端でＵターンした後、巻き取りロール３４によって巻き取られる。長尺物２０が案内台３２の先端でＵターンするときに、前記切り込み線２１によって区画された内側の領域は剥離フィルム１４から剥離し、案内台３２の上面の延長線方向に送り出される。すなわち、機能性化合物層１２とフィルム基材層１１と粘着剤層１３の３層構造からなる円形状の機能性フィルム１０が、粘着剤層１３側を下面側とした姿勢で連続的に剥離フィルム１４から剥離し、水平方向またはわずかに下方に傾斜した方向に送り出される。

移し替え装置３０は、さらに、細胞培養容器５０を水平姿勢に載置した状態で間欠的に移動と停止を繰り返すことのできる搬送コンベア３５を備えている。また、好ましくは、前記案内台３２の先端近傍であって送り出される機能性フィルム１０の下方位置には、機能性フィルム１０の横幅にほぼ等しい横幅を持つエアノズル３７が空気噴出方向を斜め上方に向けた姿勢で取り付けられる。エアノズル３７からの噴出空気を下方から受けることにより、剥離フィルム１４から剥離して送り出される機能性フィルム１０は、その後もほぼ水平な姿勢を維持することができる。

負圧吸着ヘッド４０は、前記したように、実質的に平坦面である吸着面４１と該吸着面４１の裏面側の空気室４２とを有しており、前記空気室４２は前記エアーシリンダ３１の空気路３６と接続している。

ロボットアームの制御装置は、送り出されてくる機能性フィルム１０を負圧吸着ヘッド４０によって負圧吸引することのできる位置に、前記エアーシリンダ３１を位置させる。そして、吸引手段によって空気室４２内の空気を吸引することで、吸着面４１に負圧を発生させ、それにより、機能性フィルム１０を負圧吸引する。

その状態で制御装置はロボットアームを操作して、エアーシリンダ３１を前記搬送コンベア３５で搬送されてくる細胞培養容器５０の直上位置に移動させる。移動後、細胞培養容器５０の底面と機能性フィルム１０との距離が０．１ｍｍ〜１０ｍｍ程度となるまでエアーシリンダ３１を下降させ、下降位置で負圧を開放する。負圧の開放より、機能性フィルム１０は自重により細胞培養容器５０の底面に向けて落下していき、図１（ｂ）に基づき説明したような姿勢で、機能性フィルム１０は細胞培養容器５０の底面に固定される。

上記では、負圧吸着ヘッド４０として平面視で円形のものを説明したが、負圧吸着ヘッド４０の形状は、円形に限らず、吸着した機能性フィルム１０を移送する細胞培養容器５０の底面５１の形状に依存して定められる。一例として、図５に示すようなフラスコ型容器５０Ａも挙げることができる。

フラスコ型細胞培養容器５０Ａは、矩形状の平板の一方端側が狭くなった形状の底板５１Ａと、底板５１Ａの周縁部から立ち上がる側壁部２０１と、側壁部２０１の上面を閉鎖する天面２０２とを備える。この形状のフラスコ型細胞培養容器５０Ａの場合には、図示しないが、負圧吸着ヘッド４０として底板５１Ａの外郭形状に沿った吸着面を持つ負圧吸着ヘッドが用いられる。また、機能性フィルム１０にも底板５１Ａの外郭形状に沿った外郭形状である機能性フィルム１０Ａが用いられる。

ただし、この場合でも、負圧吸着ヘッド４０の外形寸法は前記側壁部２０１の内寸よりも少し小さいものとされ、機能性フィルム１０Ａの外形寸法は側壁部２０１の内寸よりも少し大きなものとされる。その状態で、図１に基づき説明したと同様にして、機能性フィルム１０Ａを底板５１Ａの上に落下させると、図５に示すように、機能性フィルム１０Ａの周縁部１０ｂが側壁部２０１の底板５１Ａに近接した領域を覆った状態となって、機能性フィルム１０Ａは底板５１Ａに固定される。

機能性フィルム１０Ａを底面に固定し上面を開放した状態のフラスコ型細胞培養容器５０Ａを、０．４ＭＰａ程度の圧力環境下にあるオートクレーブ内に収容して、所要の気泡排除処理を行った後、天面２０２を側壁部２０１の開放端側に融着することで、フラスコ型細胞培養容器５０Ａが形成される。

なお、特に、図５に示すような矩形状の平板の一方端側が狭くなった形状のように、複雑な形状の底板を備えた細胞培養容器に対して、機能性フィルム１０を底面に加え周側壁の底面に近接した領域をも覆う状態で配置することが、困難な場合も起こり得る。そのような場合でも、機能性フィルム１０が少なくとも周側壁の全周における少なくとも５０％以上を覆うようにすれば、実用上支障のない程度に本発明の作用効果を奏することのできる機能性フィルム付き細胞培養容器とすることができる。
次に、本発明において用いる機能性フィルム１０を構成する材料を説明する。

＜フィルム基材層１１＞
限定されないが、フィルム基材層１１は、一方の表面に前記機能性化合物層１２を形成することが可能な材料を含むものであればよく、材料の種類は特に限定されない。典型的には、フィルム基材層１１の材料として、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリル等が挙げられる。

フィルム基材層１１の、機能性化合物層１２が形成される側の表面は、易接着処理された表面であることができる。「易接着処理」とは、例えば、ポリエステル、アクリル酸エステル、ポリウレタン、ポリエチレンイミン、シランカップリング剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）等の易接着剤による処理を指す。

フィルム基材層１１の厚さ（フィルム基材層１１が基材の層に加えて易接着層を備える場合は、易接着層を含むフィルム基材層の全体の厚さを指す）は、特に制限は無いが可撓性を付与する厚さであることが好ましく、例えば５μｍ〜４００μｍ、好ましくは５０μｍ〜２５０μｍである。

＜機能性化合物層１２＞
機能性化合物層１２を構成する機能性化合物としては、有機化合物または無機化合物が挙げられ、より好ましくは、所定の刺激によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な表面を有する刺激応答性ポリマーや、１つ以上のエチレングリコール単位（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）からなるエチレングリコール鎖等の親水性化合物が挙げられる。

機能性化合物層の膜厚は、例えば、０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内とするのがよく、なかでも１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることが好ましい。

以下「刺激応答性ポリマー層」および「親水性化合物層」の好適な実施形態について説明する。

＜刺激応答性ポリマー層＞
機能性有機化合物層は、刺激応答性ポリマー層であることが特に好ましい。刺激応答性ポリマー層とは、所定の刺激によって表面の細胞の接着度合いが変化するポリマーを含む層である。刺激応答性ポリマーとしては、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマーなどを挙げることができる。なかでも温度応答性ポリマーが、刺激の付与が容易であることから好ましい。

温度応答性ポリマーとして、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートの剥離する時の温度では細胞非接着性を示すものを用いるとよい。例えば、温度応答性ポリマーは、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものを用いるとよい。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Ｔが０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いるとよい。Ｔが０℃〜８０℃であると、細胞を安定的に培養できるからである。

好適な温度応答性ポリマーとしては、アクリル系ポリマーまたはメタクリル系ポリマーが挙げられる。具体的に好適な温度応答性ポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド(Ｔ＝２１℃)、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド(Ｔ＝３２℃)、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド(Ｔ＝約３５℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(Ｔ＝約２８℃)、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、およびポリ−Ｎ,Ｎ−ジエチルアクリルアミド(Ｔ＝３２℃)等が挙げられる。

ｐＨ応答性ポリマーおよびイオン応答性ポリマーは作製しようとする細胞シートに適したものを適宜選択することができる。

刺激応答性ポリマー層は、重合して目的の刺激応答性ポリマーを形成するモノマーと、該モノマーを溶解しうる有機溶媒と含む塗布用組成物を調製し、これを慣用の塗布方法に従って、フィルム基材の表面に塗布して塗膜を形成し、次に、該塗膜に放射線照射等の適当な手段により塗膜中のモノマーを重合してポリマーを形成するとともに、フィルム基材の表面とポリマーとの間にグラフト化反応を生じさせることにより形成することができる。

＜親水性化合物層＞
機能性有機化合物層の他の実施形態として、１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖（複数のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖は、「ポリエチレングリコール鎖」ということができる）等の親水性化合物の層が挙げられる。

エチレングリコール鎖の末端は水酸基により封鎖された形態であってもよいし、エチレングリコール鎖の末端に生体関連物質等の他の物質が共有結合により連結された形態であってもよい。

末端が水酸基により封鎖されたエチレングリコール鎖を含む層は、細胞が接着し難い親水性の表面を提供することができる。

エチレングリコール鎖の末端に共有結合されうる生体関連物質としては、抗原、抗体、DNA、RNA、ペプチド、ホルモン、酵素、サイトカイン、糖鎖、脂質、補酵素、酵素阻害剤、細胞、その他の機能を有するタンパク質が含まれる。更に、このような生体関連物質と親和性を有する低分子化合物、および高分子化合物も生体関連物質の範囲に含まれる。

エチレングリコール鎖等の親水性化合物の層を、樹脂製のフィルム基材層の表面に固定化するためには、予め、フィルム基材層の表面に、物理的に吸着可能であって、エチレングリコール鎖の末端の水酸基と反応して共有結合を形成可能な官能基を側鎖に含むポリシロキサンを含むプライマー層を設ける。ポリシロキサンの側鎖上の官能基としては、グリシジル基またはエポキシ基が好ましい。プライマー層は、フィルム基材層の表面に、所望の側鎖を有するシラノール化合物を適用し、該表面上で縮合重合してポリシロキサンに変換することにより形成することができる。

次いで、プライマー層の官能基と、エチレングリコールまたはエチレングリコール単位が２以上繰り返されたポリエチレングリコールの水酸基とを反応させて共有結合を形成し、エチレングリコール鎖を固定化する。このとき、触媒量の濃硫酸を含むエチレングリコールまたはポリエチレングリコールをプライマー層に接触させる。

末端が水酸基により封鎖されたエチレングリコール鎖を含む層はこのようにして形成される。

更に、必要に応じて、エチレングリコール鎖の一端に、他の物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基を直接的または間接的に連結させる。官能基の導入方法は特に限定されない。

＜粘着剤層１３＞
粘着剤層１３を構成する粘着剤としてはポリエステル樹脂、アクリル酸エステル樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリエチレンイミン樹脂、シランカップリング剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）等を挙げることができ、なかでもアクリル酸エステル樹脂、ポリウレタン樹脂等を好ましく用いることができる。

粘着剤層の厚さは特に限定されないが、１０μｍ〜３００μｍであることが好ましく、２０μｍ〜２００μｍであることがより好ましい。

また、本発明において、各細胞培養容器を構成する材料は特に限定されず、細胞培養において一般的に用いられる材料を用いることができる。例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等の樹脂材料、表面親水化処理を施した上記の少なくとも１種を含む樹脂材料、およびガラスや石英等の無機材料であることができるが、好ましくは樹脂材料である。樹脂材料としては、ポリスチレン樹脂又はポリエチレンテレフタレート樹脂であることが好ましい。

Ａ、Ａ１…機能性フィルム付き細胞培養容器、
１…気泡、
１０…機能性フィルム、
１０ｂ…機能性フィルムの周縁部、
１０ｅ…機能性フィルムの周縁エッジ部、
１１…フィルム基材層、
１２…機能性化合物層、
１３…粘着剤層、
１４…帯状をなす剥離フィルム、
２０…４層構造からなる長尺物、
２１…機能性フィルムの外郭形状をなす切り込み線、
２２…ロール状の原反、
３０…移し替え装置、
３１…エアーシリンダ、
３２…案内台、
３３…ガイドロール、
３４…巻き取りロール、
３５…細胞培養容器の搬送コンベア、
３６…空気路、
４０…負圧吸着ヘッド、
４１…吸着面、
４２…空気室、
４４…負圧吸引孔、
５０…細胞培養容器、
５１…底面、
５２…周側壁。

Claims (5)

1. 底面と該底面から立ち上がる周側壁とを備えた容器と該容器の底面に該容器とは別個に用意された機能性フィルムが配置されている細胞培養容器であって、
   前記機能性フィルムは前記底面に加え前記周側壁の底面に近接した領域をも覆う状態で配置されていることを特徴とする機能性フィルム付き細胞培養容器。
2. 前記機能性フィルムは底面から２〜１０ｍｍの高さまでの前記周側壁を覆っていることを特徴とする請求項１に記載の機能性フィルム付き細胞培養容器。
3. 前記底面と前記周側壁は湾曲部を介して連続していることを特徴とする請求項１または２に記載の機能性フィルム付き細胞培養容器。
4. 前記機能性フィルムは前記周側壁の全周における少なくとも５０％以上を覆っていることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の機能性フィルム付き細胞培養容器。
5. 底面と該底面から立ち上がる周側壁とを備えた容器の前記底面側に機能性フィルムが配置されてなる細胞培養容器の製造方法であって、前記機能性フィルムとして前記容器の底面よりも広い面積を持つ機能性フィルムを用い、当該機能性フィルムを負圧吸引により前記容器の上まで移送し、落下後に前記機能性フィルムが前記容器の底面に加え前記周側壁の底面に近接した領域をも覆うことができる位置において負圧を開放して機能性フィルムを前記容器の底面に向けて落下させ、落下した機能性フィルムを前記底面に加え前記周側壁の底面に近接した領域をも覆う状態で容器底面側に固定することを特徴とする機能性フィルム付き細胞培養容器の製造方法。

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