JP5926242B2 - エンドリボヌクレアーゼ組成物およびその使用方法 - Google Patents

エンドリボヌクレアーゼ組成物およびその使用方法 Download PDF

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Description

相互参照
本出願は、出願のそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年５月１０出願の米国仮特許出願第６１／３３３，１６３号、２０１０年７月１９日出願の米国仮特許出願第６１／３６５，６２７号および２０１０年１１月１２日出願の米国仮特許出願第６１／４１３，２８７号の利益を請求している。
連邦政府による資金援助による研究または開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所により付与される助成番号第Ｔ３２ ＧＭ０７２３２および全米科学財団により付与される助成番号ＭＣＢ−０９５０９７１のもと、米国政府の支援を受けてなされた。米国政府が本発明には一定の権利を有する。
ＤＮＡ制限酵素は、特定のＤＮＡ配列を随意に開裂することを可能にしたことにより、１９７０年代の分子生物学を一変させた。ＲＮＡ分子の配列決定は、現在、ＲＮＡをＤＮＡストランドにコピーし、その後、従来の方法により配列を決定することを伴う。ＲＮＡＳｅｑとしても知られるこのアプロ−チは、ロバストであり、数百万の配列読み込みが可能である。しかし、ｃＤＮＡを生成する必要があるため、個々のステップの配列に依存する効率が原因で固有バイアスが導入される。
文献
Ｃａｒｔｅら（２００８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２２：３４８９；米国特許公開第２０１０／００９３０２６。
本発明の開示は、変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ、該変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼをコードする核酸および該核酸で遺伝子組み換えした宿主細胞を提供する。変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼは、多種多様な用途での使い道があり、それらについても提供する。本開示はまた、標的ポリリボヌクレオチドにおける特定の配列を検出する方法；および真核細胞において標的ＲＮＡの産生を調節する方法を提供する。
Ｐａ１４Ｃｓｙ４によるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ基質の特異的認識を示す図である。示されているヌクレオチド配列は５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：１）である。 ＲＮＡ基質に結合したＣｓｙ４の結晶構造を示す図である。 Ｃｓｙ４の触媒中心の詳細図（図３Ａ）；およびＣｓｙ４野生型（ＷＴ）および変異体の開裂活性（図３Ｂ）である。 １２個のＣｓｙ４配列間で不変なアミノ酸を示す図である。Ｐａ（配列ＩＤ番号：８）；Ｙｐ配列ＩＤ番号：３４）；Ｅｃ８９（配列ＩＤ番号：３９）；Ｄｎ（配列ＩＤ番号：７９）；Ａｂ（配列ＩＤ番号：８４）；ＭＰ１（配列ＩＤ番号：２）；ＭＰ０１（配列ＩＤ番号：３）；ＳＷ（配列ＩＤ番号：４）；Ｐｍ（配列ＩＤ番号：８５）；Ｐｗ（配列ＩＤ番号：１３）；およびＤｄ（配列ＩＤ番号：１０）。 多様なＣｓｙ４ポリペプチドのアミノ酸配列配置、ならびに各々のＣｓｙ４ポリペプチドにより認識されるＲＮＡ配列のヌクレオチド配列を示す。 酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼのアミノ酸配列の例を示す図である。 標的ポリリボヌクレオチドにおける特定の配列を検出するための方法の例を示す図である。 多種多様な酵素的に不活性なＣｓｙ４変異型の活性に対するイミダゾールの効果を示す図である。 標的ＲＮＡを単離する代表的な方法を示す図である。Ｃｓｙ４標的ステムル−プ（配列ＩＤ番号：１０３）が示されている。 真核細胞における標的ＲＮＡの発現を制限する代表的な方法を示す図である。Ｃｓｙ４ ＲＮＡ基質配列（配列ＩＤ番号：１０３）が示されている。
定義
本明細書で用いられる場合、「ポリリボヌクレオチド」はリボヌクレオチドの重合形態を指し、ＲＮＡ、ＲＮＡを含有するデオキシリボヌクレオチド、ＤＮＡを含有するリボヌクレオチドを含む。ポリリボヌクレオチドは、場合によっては、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド（例えば、デオキシノシン、デオキシウリジンまたはヒドロキシメチルデオキシウリジン）を含む。場合によっては、ポリリボヌクレオチドはリボヌクレオチドのみから成る（すなわち、デオキシリボヌクレオチドを含まない）。場合によっては、ポリリボヌクレオチドは、リボヌクレオチドおよび１つまたは複数の修飾リボヌクレオチドを含むが、 デオキシリボヌクレオチドは含まない。その他の場合には、ポリリボヌクレオチドはリボヌクレオチドを含み、１つまたは複数の修飾リボヌクレオチドおよび１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド（修飾デオキシリボヌクレオチドも含む）を含んでもよい。場合によっては、ポリリボヌクレオチドが１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドを含むとき、そのポリリボヌクレオチドにおいて、デオキシリボヌクレオチドは全部で約５０％から約４０％、約４０％から約３０％、約３０％から約２０％、約２０％から約１０％、約１０％から約１％または１％未満のヌクレオチドを含む。
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は同義的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体である任意長のヌクレオチドの重合体を指す。ポリヌクレオチドの例としては、以下に限定されないが、線形または環状の核酸、メッセンジャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブおよびプライマーが挙げられる。
「生物学的試料」は細胞、細胞外物質、組織または多細胞生物から得た多種多様な試料タイプを包含する。この定義は、生体起源の血液およびその他の液体試料、生検標本もしくは組織培地またはこれらに由来する細胞などの固体組織試料およびこれらの子孫を含有する。この定義は、調達後、試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドなどの特定成分の濃縮などにより、何らかの方法で操作された試料も含む。「生物学的試料」という用語は臨床試料を包含し、さらに、培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液 （例えば、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、尿、血液、血液分画（例えば、血漿；血清）、痰など）および組織試料も含む。場合によっては、生物学的試料は細胞を包含する。その他の場合は、生物学的試料は細胞を含まない。
「操作可能な形で結合された」という用語は、所望の機能を提供するための分子間の機能的結合を指す。例えば、核酸の文脈での「操作可能な形で結合された」は、転写、翻訳などの所望の機能を提供するための核酸間の機能的結合、例えば、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、シグナル配列または転写因子結合部位のアレイ）と第２のポリヌクレオチドとの機能的結合を指し、ここでこの発現制御配列は、第２のポリニクレオチドの転写および／または翻訳に影響を与える。ポリペプチドの文脈での「操作可能な形で結合された」は、ポリペプチドの所望の活性を提供するための（例えば、異なる領域の）アミノ酸配列間の機能的結合を指す。
「単離された」は、タンパク質または核酸が天然に発生したものである場合、天然で発生し得る環境から異なる環境にあるタンパク質または核酸を指す。「単離された」は、関心対象のタンパク質または核酸について実質的に濃縮されているおよび／または関心対象のタンパク質または核酸が部分的にまたは実質的に精製されている試料中のタンパク質または核酸を含むものとする。タンパク質または核酸が天然に生じたものでない場合、「単離された」はタンパク質または核酸が合成または組換え手法のいずれかによって作成された環境から分離されたことを意味する。
「実質的に純粋な」は、ある物質（entity）（例えば、ポリペプチドまたは核酸）が組成物の全含有量（例えば、組成物中の全タンパク質量）の約５０％より多く、一般的には、合計タンパク質含有量の約６０％より多くを占めることを意味する。一部の実施形態においては、「実質的に純粋な」は、組成物全体の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはそれ以上が関心対象物質である組成物を指す（例えば、全タンパク質の９５％）。一部の実施形態においては、関心対象のタンパク質または核酸が組成物中の全タンパク質または確信に占める割合は、約９０％を超える、約９５％を超える、約９８％を超えるまたは約９９％を超える。
本発明をさらに記述する前に、本発明は、記述される特定の実施形態に限定されず、したがって当然ながら変化してもよいことが理解されるべきである。さらに、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を記述する目的のためだけであり、限定を意図するものでなないことも理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。
ある範囲の値が示されている場合、各々の間に存在する値は、文脈が明確に他を示すのでない限り下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間、そしてその言及される範囲における任意の他の言及される値または間に存在する値が本発明に包含されることが理解される。これらのさらに小さい範囲の上限および下限は、独立して、さらに小さい範囲に含まれてもよく、そしてまた、言及される範囲における任意の特に包含される限界を条件として、本発明の範囲内に包含される。言及される範囲がその限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除く範囲も本発明に含まれる。
特に他に定義されているのでない限り、本明細書で用いられる技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する分野の専門家により共通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または等価な任意の方法および材料も本発明の実践または試験に使用することが可能であるが、好ましい方法および材料がここでは記述されている。本明細書で言及される刊行物はすべて、その刊行物が引用されている内容に関連する方法および／または材料を開示および記述する目的で、参照により本明細書に組み込まれている。
本明細書および添付された特許請求の範囲内で使用される際には、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の指示対象も包含することに注意すべきである。それゆえ、例えば、「部位特異的エンドリボヌクレアーゼ」と言及されている場合には、複数のそのような部位特異的エンドリボヌクレアーゼも包含し、「標的ポリリボヌクレオチド」と言及されている場合には、１つまたは複数の標的ポリリボヌクレオチドおよび当業者に既知のこれらの相当品なども包含する。特許請求の範囲は任意の要素をすべて除外するように起草されている可能性もあることにさらに注意すべきである。したがって、この声明は、「のみ」「だけ」などの排他的な用語を請求要素の列挙と関連して使用する場合、または「否定的な」制約を使用する場合の先の記載としての役割を果たすことを意図している。
本明細書で論じられる文献は、本発明の出願日に先立つ、それらの開示に関してのみ示される。本明細書のいかなる記述も、先行発明という理由で、かかる文献よりも本発明が先行しているとする権利はないことの容認であるとはみなすべきでない。さらに、示されている文献の日付は実際の発行日付とは異なる可能性もあり、独立して確認する必要があり得る。
詳細な説明 本開示は、変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ、変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼをコードする核酸およびその核酸によって遺伝子修飾された宿主細胞を提供する。変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼは、多種多様な用途に使い道があり、それらについても提供される。本開示は、さらに標的ポリリボヌクレオチドにおける特定の配列を検出する方法；および真核細胞における標的ＲＮＡの産生を調節するための方法も提供する。
標的ポリリボヌクレオチドにおける配列の検出方法
本開示は、標的ポリリボヌクレオチドにおいて配列を検出する方法を提供する。本方法は、ポリリボヌクレオチドにおいて特定の配列の存在を検出する目的に有用であり、したがって、特定の配列を含むポリリボヌクレオチドを検出する目的に利用することができる。例えば、本方法は、試料中（例えば、生物学的試料中）の病原体のポリリボヌクレオチドの有無を検出する目的に利用することができる。
主題方法は、標的ポリリボヌクレオチドのコピーをわずか１００、最小は１つまで検出することができる。したがって、例えば、主題方法は試料中（例えば、単一の細胞中、単一の胚中またはその他の生物学的試料）にある標的ポリリボヌクレオチドの１から約５、約５から約１０、約１０から約５０、約５０から約１００または１００を超える数のコピーを検出することができる。したがって主題方法は多種多様な法医学的、研究および診断の用途に有用である。
一部の実施形態においては、標的ポリリボヌクレオチドにおける特定の配列を検出する主題方法は、ａ）オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの間の二本鎖形成に有利な条件下で、標的ポリリボヌクレオチドを特定の配列および酵素的に活性な配列特異的Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼを含むオリゴヌクレオチドプローブに接触させ、二本鎖がＣｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによって開裂されるようにすること；およびｂ）オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの特異的結合を検出すること（ここでオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの間の二本鎖形成の検出は、標的ポリリボヌクレオチドにおいて特定の配列が存在することを表す）を含む。
場合によっては, オリゴヌクレオチドプローブはペプチドに結合され、結合されたペプチドはＣｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによる二本鎖の開裂と同時に放出される；このような場合、検出ステップは放出されたペプチドの検出を伴う。例えば、放出されたペプチドは、そのペプチドに対して特異的な抗体に結合し、例えば、その抗体が固定化することにより検出される。一部の実施形態においては、標的ポリリボヌクレオチドは固体支持体上に固定化される。標的ポリリボヌクレオチドには、多種多様なポリヌクレオチドのいずれもが含まれ、例えば、標的ポリリボヌクレオチドは病原体のポリリボヌクレオチドとすることができる。
上述のとおり、一部の実施形態においては、抗体または標的ポリヌクレオチドは固体支持体（不溶性支持体）上に固定化される。適切な不溶性支持体としては、以下に限定されないが、 アガロースビーズ、磁気ビーズ、テストストリップ、マルチウェルディッシュなどが挙げられる。不溶性支持体は多種多様な物質（ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱）を含むことができ、例えば、アガロースビーズ、 ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンのチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン被膜、シーツ、反応トレイのウェル（例えば、マルチウェルプレート）、プラスチックチューブなどを含む、多種多様な形態で提供され得る。
一部の実施形態において、本方法は、一般に、ａ）標的ポリリボヌクレオチドを配列特異的なエンドリボヌクレアーゼに接触させること；およびｂ）標的ポリリボヌクレオチドの部位特異的開裂により産生された開裂フラグメントを検出すること（ここでポリリボヌクレオチドにおいて特定の配列での開裂時に予期される開裂フラグメントの産生は、特定の配列が存在することを意味する）を含む。
他の実施形態において、標的ポリリボヌクレオチドにおけるある配列を検出する主題方法は以下を伴う：ａ）標的ポリリボヌクレオチドをｉ）配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ；およびｉｉ）結合された検出部分を含むオリゴヌクレオチドプローブに接触させること（ただし、該オリゴヌクレオチドプローブは特定の既知のヌクレオチド配列を含み、オリゴヌクレオチドプローブに存在する既知のヌクレオチド配列を標的ポリリボヌクレオチド内の相補配列に結合させることに基づき、オリゴヌクレオチドプローブは標的ポリリボヌクレオチド内の相補配列との間に二本鎖を形成し、配列特異的エンドリボヌクレアーゼは配列に特異的な形でその二本鎖を開裂し、それにより、オリゴヌクレオチドプローブから検出部分を放出させる）およびｂ）検出部分の放出は特定配列の存在を意味する状況において、放出された検出部分を検出すること。一部の実施形態においては、各々が異なる特定の既知のヌクレオチド配列を含む、２つまたはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドプローブが使用される。
一部の実施形態において、検出部分はポリペプチドである。該ポリペプチドは免疫アッセイ （例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）； 放射免疫測定 （ＲＩＡ）；など）を使用して、ポリペプチド検出部分に特異的な抗体を使用することで、検出することができる。ポリペプチド検出部分に特異的な抗体は、検出可能な標識を含むことができる。免疫アッセイは、テストストリップ（例えば、側方流動測定において）またはマルチウェルプレートなどのその他の適切な媒体上で実施することができる。
一部の実施形態においては、検出部分は蛍光タンパク質であり、適切な蛍光タンパク質は本明細書の記述に従う。他の実施形態においては、検出部分はルシフェリンまたはその他の発光酵素物質である。適切なルシフェリンまたはその他の発酵酵素物質としては、例えば、ルシフェリン（例えば、蛍ルシフェリン）；アミノルシフェリン；セレンテラジン；米国特許第７，５３７，９１２号に記載の修飾セレンテラジン；米国特許公開第２００９／００８１１２９号に記載のセレンテラジン類似体（例えば、米国特許公開第２００９／００８１１２９号に記載の膜透過セレンテラジン類似体、例えば、米国特許公開第２００９／００８１１２９号の構造体ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩのどれか）；アミノルシフェリン；デヒドロルシフェリン；ルシフェリン６’メチルエーテル；またはルシフェリン６’クロロエチルエーテルが挙げられる。例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ， Ｂ．Ｒ．ら， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１０，３９６，２９０−２９６；およびＭｅｚｚａｎｏｔｔｅ．Ｌ．ら，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｍｕｒｉｎ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｅｄ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ． Ｍｏｌ． Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ．（２００９年１１月９日、オンライン；ＰｕｂＭｅｄ ＩＤ：１９９３７３９０）を参照されたい。
主題の検出方法の非制限的な例を、図７に模式的に示してある。図７に示した例では、 標的ポリヌクレオチドの不連続領域（例えば、ウイルスＲＮＡ）を結合する小オリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドと接触させるが、ここで該オリゴヌクレオチドには検出可能部分（例えば、リガンド、ペプチドなど）が含まれている。オリゴヌクレオチド／ウイルスＲＮＡの二本鎖を標的とする酵素的に活性で配列特異的制限エンドヌクリアーゼ （ＲＲＥ）が添加される。 酵素はオリゴヌクレオチド／ウイルスＲＮＡの二本鎖を開裂し、リガンドが検出のために放出される。酵素はさらに二本鎖を開裂し、それによりシグナルを増幅する。放出されたリガンドは、 側方流動、例えば、テストストリップ）または免疫学的測定（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使って検出される。
適切な配列特異的なエンドリボヌクレアーゼは、酵素的に活性な配列特異的なエンドリボヌクレアーゼである。主題の検出方法において使用するのに適したエンドリボヌクレアーゼとしては、配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合および開裂し、酵素的に活性なポリペプチドを含有し、図４に規定されたアミノ酸配列（Ｃｓｙ４アミノ酸配列）に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するエンドリボヌクレアーゼが挙げられる。
主題の検出方法で使用するのに適したエンドリボヌクレアーゼとしては、配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂し、酵素的に活性なポリペプチドを含み、図５に規定されたアミノ酸配列 （Ｃｓｙ４アミノ酸配列）に対して少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するエンドリボヌクレアーゼが挙げられる。図５ に、多種多様なエンドリボヌクレアーゼにより特異的に結合される配列を示す。場合によっては、適切な酵素的に活性な配列特異的Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼは、図５に示されているＣｓｙ４アミノ酸配列のアミノ酸配列を含むことができる。
主題の検出方法で使用するのに適したエンドリボヌクレアーゼとしては、配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂し、酵素的に活性なポリペプチドを含み、１から２０（すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）のアミノ酸置換および／または挿入および／または欠失により、図４または図５のいずれか１つにより規定されたアミノ酸配列から異なるエンドリボヌクレアーゼが挙げられる。
検出の対象となる標的ポリリボヌクレオチドは、試料中、例えば、血液、血液製剤（例えば、血漿）、尿、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、唾液、組織、細胞など生物学的試料中に存在することができる。標的ポリリボヌクレオチドは単離または精製することができる。標的ポリリボヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）、ウイルスＲＮＡ、またはその他のＲＮＡ種とすることができる。ウイルスＲＮＡとしては、以下に限定されないが、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、デングウイルス、黄熱病ウイルス、ウエスト・ナイル・ウイルスなど；レトロウイルス科に属す任意のメンバー；免疫不全ウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス）；など、フラビ・ウイルス科の任意のメンバーが挙げられる。
検出の対象となる標的ポリリボヌクレオチドは、多細胞生物の細胞に存在することができる（または多細胞生物の細胞から得ることができる）。
検出の対象となる標的ポリリボヌクレオチドは、以下に限定されないが、任意の６つの界、例えば、細菌（例えば、真正細菌）；古細菌；原生動物；真菌；植物界；および動物界の細胞または生物体が挙げられる。標的ポリリボヌクレオチドの適切な供給源としては、以下に限定されないが、藻類（例えば、緑藻、紅藻、灰色藻）、藍藻）を含む、原生動物界の植物様のメンバー；原生動物の真菌様メンバー、例えば、粘菌、水生菌類など；原生動物の動物様メンバー、例えば、鞭毛虫（例えば、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ））、アメーバ類（例えば、アメーバ）、胞子虫類（例えば、アピーコンプレクサ（Apicomplexａ）、ミクソゾア （Ｍｙｘｏｚｏａ）、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ））、および繊毛虫（例えば、ゾウリムシ属（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ））が挙げられる。標的ポリリボヌクレオチドの適切な供給源としては、真菌界のメンバーが挙げられ、これには限定はしないが任意の門のメンバー：担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）（ホウキタケ；例えば、ハラタケ属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、テングタケ属（Ａｍａｎｉｔａ）、ヤドリタケ属（Ｂｏｌｅｔｕｓ）、カンテレラス（Ｃａｎｔｈｅｒｅｌｌｕｓ）など）；子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）（子嚢菌、例えば、酵母属菌を含む）；ミコフィコフィタ （Ｍｙｃｏｐｈｙｃｏｐｈｙｔａ）（地衣類）；接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（接合真菌類）；および不完全菌門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ）が挙げられる。標的ポリリボヌクレオチドの適切な供給源としては、植物界のメンバーが挙げられ、これには限定はしないが、任意の以下の門のメンバーが挙げられる：コケ植物門（Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ）（例えば、コケ類）、ツノゴケ門（Ａｎｔｈｏｃｅｒｏｔｏｐｈｙｔａ）（例えば、マツモ類）、ヘパティコフィタ（Ｈｅｐａｔｉｃｏｐｈｙｔａ）（例えば、ゼニゴケ類）、リコフィタ（Ｌｙｃｏｐｈｙｔａ）（例えば、ヒカゲノカズラ類）、スフェノフィタ（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｙｔａ）（例えば、トクサ類）、プシロフィタ（Ｐｓｉｌｏｐｈｙｔａ）（例えば、マツバラン（ｗｈｉｓｋ ｆｅｒｎｓ））、シダ植物門（Ｏｐｈｉｏｇｌｏｓｓｏｐｈｙｔａ）、シダ門（Ｐｔｅｒｏｐｈｙｔａ）（例えば、シダ）、ソテツ植物（ＣＹＣａｄｏｐｈｙｔａ）、イチョウ門（Ｇｉｎｇｋｏｐｈｙｔａ）、マツ植物門（Ｐｉｎｏｐｈｙｔａ）、マオウ門（Ｇｎｅｔｏｐｈｙｔａ）および被子植物門（Ｍａｇｎｏｌｉｏｐｈｙｔａ）（例えば、顕花植物）。標的ポリリボヌクレオチドの適切な供給源としては、動物界のメンバーが挙げられ、これには限定はしないが、以下の任意の門のメンバーが挙げられる：海綿動物門（海面動物）；板形動物門（Ｐｌａｃｏｚｏａ）；直遊動物門（海洋無脊椎動物の寄生生物）；菱型動物門 （Ｒｈｏｍｂｏｚｏａ）；刺胞動物門（Ｃｎｉｄａｒｉａ）（サンゴ、アネモネ、クラゲ、シーペン、ウミシータケ、有毒クラゲ（ｓｅａ ｗａｓｐｓ）；有櫛動物門（クシクラゲ）；扁形動物門（Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）（扁形動物）；紐形動物門（Nemertinａ）（紐形動物）；Ｎガソストムリダ（Ｎｇａｔｈｏｓｔｏｍｕｌｉｄａ）（ジャウドワーム（ｊａｗｅｄ ｗｏｒｍｓ））腹毛動物；輪形動物門（Ｒｏｔｉｆｅｒａ）；鰓曳動物門（Ｐｒｉａｐｕｌｉｄａ）；動吻動物門（Ｋｉｎｏｒｈｙｎｃｈａ）；胴甲動物門 （Ｌｏｒｉｃｉｆｅｒａ）；鉤頭動物門（Ａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌａ）；内肛動物門（Ｅｎｔｏｐｒｏｃｔａ）；線形動物門（Ｎｅｍｏｔｏｄａ）；類線形 動物門（Ｎｅｍａｔｏｍｏｒｐｈａ）；有輪動物門（ＣＹＣｌｉｏｐｈｏｒａ）；軟体動物門（Ｍｏｌｌｕｓｃａ）（軟体動物）；星口動物門（Ｓｉｐｕｎｃｕｌａ）（ピーナッツ・ワーム（peanut worms）；環形動物門（Ａｎｎｅｌｉｄａ）（環形動物）；緩歩動物門（Ｔａｒｄｉｇｒａｄａ）（クマムシ）；有爪動物門（Ｏｎｙｃｈｏｐｈｏｒａ）（カギムシ類（ｖｅｌｖｅｔ ｗｏｒｍｓ）；節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）（以下の亜門を含む。鋏角亜門（Ｃｈｅｌｉｃｅｒａｔａ）、多足亜門（Ｍｙｒｉａｐｏｄａ）、六脚亜門（Ｈｅｘａｐｏｄａ）および甲殻亜門（Ｃｒｕｓｔａｃｅａ）、ここで鋏角亜門は例えば、クモ綱、節口綱（Ｍｅｒｏｓｔｏｍａｔａ）、およびウミグモ綱を含み、多足亜門は、例えば、唇脚綱（ムカデ類）、倍脚綱（ヤスデ類）、エダヒゲムシ綱（Ｐａｒｏｐｏｄａ）およびコムカデ綱（Ｓｙｍｐｈｙｌａ）を含み、六脚亜門は、昆虫を含み、そして甲殻亜門は、エビ、オキアミ、フジツボ（エボシガイ）などを含む；箒虫動物門（Ｐｈｏｒｏｎｉｄａ）；外肛動物門 （Ｅｃｔｏｐｒｏｃｔａ）（コケムシ類（ｍｏｓｓ ａｎｉｍａｌｓ））；腕足動物門（Ｂｒａｃｈｉｏｐｏｄａ）；棘皮動物（Ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍａｔａ）（例えば、ヒトデ、シャリンヒトデ（ｓｅａ ｄａｉｓｉｅｓ）、ウミシダ、ウニ、ナマコ、クモヒトデ、ブリトル・バスケット（ｂｒｉｔｔｌｅ ｂａｓｋｅｔｓ）など）；毛顎動物門（ヤムシ）；半索動物（ギボシムシ）；および脊索動物門（Ｃｈｏｒｄａｔａ）。脊索動物門の適切なメンバーとしては、 以下：尾索動物亜門（ホヤ類；これにはホヤ綱（Ａｓｃｉｄｉａｃｅａ）、サルバ綱（Ｔｈａｌｉａｃｅａ）およびオタマボヤ綱（Ｌａｒｖａｃｅａ）が挙げら れる）；頭索動物亜門（Ｃｅｐｈａｌｏｃｈｏｒｄａｔａ）（ナメクジウオ）；メクラウナギ綱（Ｍｙｘｉｎｉ）（メクラウナギ（ｈａｇｆｉｓｈ））；および脊椎動物亜門（Ｖｅｒｔｅｂｒａｔａ）の亜門の任意のメンバーが挙げられ、脊椎動物亜門のメンバーとしては、例えば、ヤツメウナギ目のメンバー（ヤツメウナギ）、軟骨魚綱（Ｃｈｏｎｄｒｉｃｈｔｈｙｃｅｓ）（軟骨魚類）、条鰭亜綱（Ａｃｔｉｎｏｐｔｅｒｙｇｉｉ）（条鰭類）、シーラカンス（Ａｃｔｉｎｉｓｔａ）、肺魚亜綱（Ｄｉｐｎｏｉ）（肺魚）、爬虫綱（Ｒｅｐｔｉｌｉａ）（爬虫類、例えば、ヘビ、アリゲ−タ、クロコダイル、トカゲなど）、鳥類（トリ類）；および哺乳綱（哺乳動物）が挙げられる。適切な植物としては、任意の単子葉植物および任意の双子葉植物が挙げられる。
例えば、標的ポリリボヌクレオチドは、以下に限定されないが、原生動物、植物、真菌、藻細胞、酵母、爬虫類、両生類、哺乳類、海洋微生物、海生無脊椎動物、節足動物、等脚類、昆虫、クモ形類動物、古細菌および真正細菌を含む有機体の細胞に存在するか、または有機体の細胞から得ることができる。
標的ポリリボヌクレオチドはヒト以外の胚、例えば、ショウジョウバエ胚；ゼブラフィッシュ胚；マウス胚；などに存在するか、ヒト以外の胚から得ることができる。
標的ポリリボヌクレオチドは、幹細胞、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ幹細胞；ヒト以外の幹細胞；などに存在するか、幹細胞から得ることができる。 適切な幹細胞としては、胚幹細胞、成人幹細胞および人工多能性幹（ｉＰＳ）の細胞が挙げられる。
例えば、生物体が植物である場合、一部の実施形態において、標的ポリリボヌクレオチドは木質部、師部、形成層、葉、根などから単離される。生物体が動物である場合、標的ポリリボヌクレオチドは、一部の実施形態において、特定の組織（例えば、肺、肝臓、心臓、腎臓、脳、脾臓、皮膚、胎児組織など）から、または特定の細胞タイプ（例えば、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、星状細胞、マクロファージ、グリア細胞、島細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球など）から単離される。
標的ＲＮＡの産生を調節する方法
本開示は、細胞における標的ＲＮＡの産生を調節する方法を提供する。本方法は、一般には、遺伝子修飾された宿主細胞を誘導プロモーターを活性化する薬剤と接触させることを伴うが、ここで、その遺伝子修飾された宿主細胞は、一般に、基質ポリリボヌクレオチドにおいて配列特異的な開裂部位で開裂を触媒する酵素をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターによって遺伝子修飾され、酵素をコードするヌクレオチド配列は、誘導プロモーターに操作可能な形で結合され、誘導プロモーターが活性化すると、酵素が細胞で産生され、前駆体ＲＮＡから前記標的ＲＮＡを開裂する。
図１０は標的ＲＮＡの産生を調節する代表的な方法の概略図を示している。図１０では、内因性標的ＲＮＡは、Ｃｓｙ４ ＲＮＡ基質（例えば、ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧ（配列ＩＤ番号：１０３）；または配列ＩＤ番号：１）を３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に含むように修飾される。宿主細胞でのＣｙｓ４発現は、ＲＮＡ基質の結合および開裂に通じる。開裂されたＲＮＡは、そのｐｏｌｙＡ尾部を失い、分解される。
例えば、一部の実施形態においては、 本開示は、真核細胞における標的ＲＮＡの産生を調節する方法を提供し、該方法は遺伝子修飾された宿主細胞を、誘導プロモーターを活性化する薬剤に接触させることを伴うが、ここでこの遺伝子修飾された宿主細胞は、基質ポリリボヌクレオチドにおいて配列特異的な開裂部位で開裂を触媒する酵素的に活性な配列特異的Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターによって遺伝子修飾され、この酵素をコードするヌクレオチド配列は、誘導プロモーターに操作可能な形で結合され、誘導プロモーターが活性化すると、酵素が細胞内で産生され、前駆体ＲＮＡから前記標的ＲＮＡを開裂する。場合によっては、標的ＲＮＡの種類は調節ＲＮＡである。場合によっては、前駆体ＲＮＡからの前記標的ＲＮＡの開裂は前駆体ＲＮＡを不活性化する。
適切な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、酵素液に活性で、配列特異的なエンドリボヌクレアーゼである。標的ＲＮＡの産生を調節する主題方法で使用するのに適したエンドリボヌクレアーゼには、配列に特異的な形で、基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂し、酵素的に活性なポリペプチドを含み、図４に規定されたアミノ酸配列 （Ｃｓｙ４アミノ酸配列）に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する.エンドリボヌクレアーゼが含まれる。
標的ＲＮＡの産生を調節する主題方法で使用するのに適したエンドリボヌクレアーゼ としては、配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂し、酵素的に活性なポリペプチドを含み、図５に規定されたアミノ酸配列 （Ｃｓｙ４アミノ酸配列）に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するエンドリボヌクレアーゼが挙げられる。図５に多様なエンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合される配列を示す。
標的ＲＮＡの産生を調節する主題方法で使用するのに適したエンドリボヌクレアーゼ には、配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂し、酵素的に活性なポリペプチドを含み、図４または５のいずれか一方で規定されたアミノ酸配列とは１から２０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）個のアミノ酸置換および／または挿入および／または欠失により異なるエンドリボヌクレアーゼが含まれる。
適切な誘導プロモーターには、真核細胞において機能できるプロモーターが含まれる。適切な誘導プロモーターは当分野で公知である。例えば、適切な誘導プロモーターとしては、以下に限定されないが、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、 ＭＥＴ３プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＣ１プロモーター、ＴＲＰ１プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＴＰ１プロモーターおよびＡＯＸ１が挙げられる。適切な誘導プロモーターとしては、テトラサイクリン誘導プロモーター；メタロチオネインプロモーター；テトラサイクリン誘導プロモーター、メチオニン誘導プロモーター；およびガラクトース誘導プロモーターが挙げられ、これらのプロモーターはすべて当業で公知である。その他の適切なプロモーターには、ＡＤＨ２アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（グルコース中では抑制され、グルコースが消耗され、エタノ−ルが作られると誘導される）およびＣＵＰ１メタロチオネインプロモーター（Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋の存在下で誘導される）が含まれる。
任意の所定の誘導プロモーターを誘導する薬剤は当分野で公知である。例えば、テトラサイクリン調節可能プロモーターはテトラサイクリンまたはドキシーサイクリンによって調節することができる；炭水化物は、炭水化物誘導プロモーターを誘導するのに使用することができる（例えば、ガラクトース誘導プロモーターの場合はガラクトース）；メチオニンは、メチオニン誘導プロモーターを誘導するのに使用することができる；金属は、メタロチオネインプロモーターを誘導するのに使用することができる。
標的ＲＮＡは調節ＲＮＡとすることができる。調節ＲＮＡは当業では公知であり、例えば、マイクロＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などが挙げられる。
一部の実施形態においては、前駆体ＲＮＡからの標的ＲＮＡの開裂は、前駆体ＲＮＡを不活性化する。
遺伝子修飾された宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞とすることができ、例えば、原核細胞または真核細胞（例えば、初代細胞、形質転換された細胞株などを含む哺乳類細胞）である。遺伝子修飾された宿主細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞とすることができる。一部の実施形態においては、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞はヒト以外の細胞である。
遺伝子修飾された宿主細胞は、多細胞生物の細胞とすることができる（または多細胞生物の細胞から得ることができる）。
遺伝子修飾された宿主細胞は、任意の６つの界、例えば、細菌（例えば、真正細菌）；古細菌；原生動物；真菌；植物界；および動物界の生物体から得るまたはこれらの生物体に存在することができる。適切な生物体としては、以下に限定されないが、藻類（例えば、緑藻、紅藻、灰色藻）、藍藻）を含む、原生動物界の植物様のメンバー；原生動物の真菌様メンバー、例えば、粘菌、水生菌類など；原生動物の動物様メンバー、例えば、鞭毛虫（例えば、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ））、アメーバ類（例えば、アメーバ）、胞子虫類（例えば、アピーコンプレクサ（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）、ミクソゾア（Ｍｙｘｏｚｏａ）、微胞子虫（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ））、および繊毛虫（例えば、ゾウリムシ属（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ））が挙げられる。標的ポリリボヌクレオチドの適切な供給源としては、真菌界のメンバーが挙げられ、これには限定はしないが任意の門のメンバー：担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）（ホウキタケ；例えば、ハラタケ属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、テングタケ属（Ａｍａｎｉｔａ）、ヤドリタケ属（Ｂｏｌｅｔｕｓ）、カンテレラス （Ｃａｎｔｈｅｒｅｌｌｕｓ）など）；子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）（子嚢菌、例えば、酵母属菌を含む）；ミコフィコフィタ （Ｍｙｃｏｐｈｙｃｏｐｈｙｔａ）（地衣類）；接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（接合真菌類）；および不完全菌門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ）が挙げられる。適切な生物体としては、植物界のメンバーが挙げられ、これに限定はしないが、任意の以下の門のメンバーが挙げられる：コケ植物門（Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ）（例えば、コケ類）、ツノゴケ門（Ａｎｔｈｏｃｅｒｏｔｏｐｈｙｔａ）（例えば、マツモ類）、ヘパティコフィタ（Ｈｅｐａｔｉｃｏｐｈｙｔａ）（例えば、ゼニゴケ類）、リコフィタ（Ｌｙｃｏｐｈｙｔａ）（例えば、ヒカゲノカズラ類）、スフェノフィタ （Ｓｐｈｅｎｏｐｈｙｔａ）（例えば、トクサ類）、プシロフィタ（Ｐｓｉｌｏｐｈｙｔａ）（例えば、マツバラン（ｗｈｉｓｋ ｆｅｒｎｓ））、シダ植物門（Ｏｐｈｉｏｇｌｏｓｓｏｐｈｙｔａ）、シダ門（Ｐｔｅｒｏｐｈｙｔａ）（例えば、シダ）、ソテツ植物（ＣＹＣａｄｏｐｈｙｔａ）、イチョウ門（Ｇｉｎｇｋｏｐｈｙｔａ）、マツ植物門（Ｐｉｎｏｐｈｙｔａ）、マオウ門（Ｇｎｅｔｏｐｈｙｔａ）および被子植物門（Ｍａｇｎｏｌｉｏｐｈｙｔａ）（例えば、顕花植物）。適切な生物体としては、動物界のメンバーが挙げられ、これには限定はしないが、以下の任意の門のメンバーが挙げられる：海綿動物門（海面動物）；板形動物門（Ｐｌａｃｏｚｏａ）；直遊動物門（海洋無脊椎動物の寄生生物）；菱型動物門 （Ｒｈｏｍｂｏｚｏａ）；刺胞動物門（Ｃｎｉｄａｒｉａ）（サンゴ、アネモネ、クラゲ、シーペン、ウミシータケ、有毒クラゲ（ｓｅａ ｗａｓｐｓ）；有櫛動物門（クシクラゲ）；扁形動物門（Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）（扁形動物）；紐形動物門（Nemertinａ）（紐形動物）；Ｎガソストムリダ（Ｎｇａｔｈｏｓｔｏｍｕｌｉｄａ）（ジャウドワーム（ｊａｗｅｄ ｗｏｒｍｓ））腹毛動物；輪形動物門（Ｒｏｔｉｆｅｒａ）；鰓曳動物門（Ｐｒｉａｐｕｌｉｄａ）；動吻動物門（Ｋｉｎｏｒｈｙｎｃｈａ）；胴甲動物門 （Ｌｏｒｉｃｉｆｅｒａ）；鉤頭動物門（Ａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌａ）；内肛動物門（Ｅｎｔｏｐｒｏｃｔａ）；線形動物門（Ｎｅｍｏｔｏｄａ）；類線形 動物門（Ｎｅｍａｔｏｍｏｒｐｈａ）；有輪動物門（ＣＹＣｌｉｏｐｈｏｒａ）；軟体動物門（Ｍｏｌｌｕｓｃａ）（軟体動物）；星口動物門 （Ｓｉｐｕｎｃｕｌａ）（ピーナッツ・ワーム（peanut worms）；環形動物門（Ａｎｎｅｌｉｄａ）（環形動物）；緩歩動物門（Ｔａｒｄｉｇｒａｄａ）（クマムシ）；有爪動物門（Ｏｎｙｃｈｏｐｈｏｒａ）（カギムシ類（ｖｅｌｖｅｔ ｗｏｒｍｓ）；節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）（以下の亜門を含む。鋏角亜門（Ｃｈｅｌｉｃｅｒａｔａ）、多足亜門（Ｍｙｒｉａｐｏｄａ）、六脚亜門 （Ｈｅｘａｐｏｄａ）および甲殻亜門（Ｃｒｕｓｔａｃｅａ）、ここで鋏角亜門は例えば、クモ綱、節口綱（Ｍｅｒｏｓｔｏｍａｔａ）、およびウミグモ綱を含み、多足亜門は、例えば、唇脚綱（ムカデ類）、倍脚綱（ヤスデ類）、エダヒゲムシ綱（Ｐａｒｏｐｏｄａ）およびコムカデ綱（Ｓｙｍｐｈｙｌａ）を含み、六脚亜門は、昆虫を含み、そして甲殻亜門は、エビ、オキアミ、フジツボ（エボシガイ）などを含む；箒虫動物門（Ｐｈｏｒｏｎｉｄａ）；外肛動物門 （Ｅｃｔｏｐｒｏｃｔａ）（コケムシ類（ｍｏｓｓ ａｎｉｍａｌｓ））；腕足動物門（Ｂｒａｃｈｉｏｐｏｄａ）；棘皮動物（Ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍａｔａ）（例えば、ヒトデ、シャリンヒトデ（ｓｅａ ｄａｉｓｉｅｓ）、ウミシダ、ウニ、ナマコ、クモヒトデ、ブリトル・バスケット（ｂｒｉｔｔｌｅ ｂａｓｋｅｔｓ）など）；毛顎動物門（ヤムシー）；半索動物（ギボシムシ）；および脊索動物門（Ｃｈｏｒｄａｔａ）。脊索動物門の適切なメンバーとしては、 以下：尾索動物亜門（ホヤ類；これにはホヤ綱（Ａｓｃｉｄｉａｃｅａ）、サルバ綱（Ｔｈａｌｉａｃｅａ）およびオタマボヤ綱（Ｌａｒｖａｃｅａ）が挙げられる）；頭索動物亜門（Ｃｅｐｈａｌｏｃｈｏｒｄａｔａ）（ナメクジウオ）；メクラウナギ綱（Ｍｙｘｉｎｉ）（メクラウナギ（ｈａｇｆｉｓｈ））；および脊椎動物亜門（Ｖｅｒｔｅｂｒａｔａ）の亜門の任意のメンバーが挙げられ、脊椎動物亜門のメンバーとしては、例えば、ヤツメウナギ目のメンバー（ヤツメウナギ）、軟骨魚綱（Ｃｈｏｎｄｒｉｃｈｔｈｙｃｅｓ）（軟骨魚類）、条鰭亜綱（Ａｃｔｉｎｏｐｔｅｒｙｇｉｉ）（条鰭類）、シーラカンス（Ａｃｔｉｎｉｓｔａ）、肺魚亜綱（Ｄｉｐｎｏｉ）（肺魚）、爬虫綱（Ｒｅｐｔｉｌｉａ）（爬虫類、例えば、ヘビ、アリゲ−タ、クロコダイル、トカゲなど）、鳥類（トリ類）；および哺乳綱（哺乳動物）が挙げられる。適切な植物としては、任意の単子葉植物および任意の双子葉植物が挙げられる。
したがって、例えば、遺伝子修飾された宿主細胞は、原生動物、植物、真菌、藻細胞、 酵母、爬虫類、両生類、哺乳類、海洋微生物、海生無脊椎動物、節足動物、等脚類、昆虫、 クモ形類動物、古細菌および真正細菌から入手した細胞またはこれらに存在する細胞とすることができる。
適切な哺乳類細胞としては、初代細胞および不死化細胞株が挙げられる。適切哺乳類細胞株としては、ヒト細胞株、ヒト以外の霊長類の細胞株、齧歯動物（例えば、マウス、ラット）の細胞株などが挙げられる。適切な哺乳類細胞株は、以下に限定されないが、ＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞 （例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞 （例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ベロ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞 （例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞 （例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞 （ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴＩ細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞 （ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞などが挙げられる。
遺伝子修飾された宿主細胞は、ヒト以外の胚、例えば、ショウジョウバエ胚；ゼブラフィッシュ胚；マウス胚などから得たまたはそれらの胚に存在する細胞とすることができる。
遺伝子修飾された宿主細胞は、幹細胞、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ幹細胞；ヒト以外の幹細胞などとすることができる。適切な幹細胞としては、胚幹細胞、成人幹細胞および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。
標的核酸の単離方法
本開示は、核酸の混合ポピュレーションから標的核酸を単離する方法を提供する。本方法は一般に以下のステップを伴う：ａ）核酸の混合ポピュレーションを固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼと接触させるステップであって、ここで、核酸の混合ポピュレーションは、固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合される「タグ」（または「認識」）ヌクレオチド配列を含む標的核酸を含んでいるため、タグヌクレオチド配列 （「タグ付けされた標的核酸」）を含む標的核酸は、固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼに結合し、タグ付けされた標的核酸／固定化された配列特異的な、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ複合体を形成し、接触ステップは溶液（「結合溶液」）中で進行するステップ；およびｂ）溶液に最終濃度が約１００ｍＭから約５００ｍＭ （例えば、約１００ｍＭから約１５０ｍＭ、約１５０ｍＭから約２００ｍＭ、約２００ｍＭから約２５０ｍＭ、 約２５０ｍＭから約３００ｍＭ、約３００ｍＭから約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭから約４００ｍＭ、約４００ｍＭから約４５０ｍＭまたは約４５０ｍＭから約５００ｍＭ）になるようにイミダゾールを添加し、それにより、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを酵素的に再活性化し、 エンドリボヌクレアーゼが酵素的に活性となって、 「タグ」ヌクレオチド配列から標的核酸を開裂し、それにより標的核酸が放出されるようにする反応溶液を形成するステップ。図９は標的ＲＮＡを単離するための主題方法の代表的な実施形態の概略図である。
本方法はさらに、１つまたは複数の洗浄ステップを含むこともできる。例えば、ステップ（ａ）の後で、ステップ（ｂ）の前に、「タグ」 ヌクレオチド配列を含む結合した標的核酸を含んでいる固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを、結合溶液で１回または複数回洗浄し、標的核酸は配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼに結合したままの状態で留まり、結合していない核酸はすべて洗い流されるようにすることができる。
核酸の混合ポピュレーションはＲＮＡおよびＤＮＡを含むことができる。標的核酸は、配列特異的エンドリボヌクレアーゼにより特異的に結合される「タグ」または「認識」ヌクレオチド配列を含むＲＮＡである。その酵素的に不活性な状態（「非誘導」状態）では、エンドリボヌクレアーゼはタグ付けされた標的ＲＮＡを結合することはできるが、開裂することはできない。その酵素的に活性な状態（「誘導」状態）（例えば、約１００ｍＭから約５００ｍＭの濃度のイミダゾールの存在下）では、エンドリボヌクレアーゼは、タグ付けされた標的核酸内の認識ヌクレオチド配列の結合と開裂の両方を行うことができ、その結果、タグから標的核酸が放出される。
結合溶液は、緩衝剤および塩を含むことができ；イミダゾールは含んでいない。再活性化溶液は、約１００ｍＭから約５００ｍＭ、例えば、約１００ｍＭから約１５０ｍＭ、約１５０ｍＭから約２００ｍＭ、約２５０ｍＭから約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭから約４００ｍＭまたは約４００ｍＭから約５００ｍＭの最終濃度でイミダゾールを含有することができる。イミダゾールが存在すると、 配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼは再活性化され、エンドリボヌクレアーゼは酵素的に活性となり、例えば、エンドリボヌクレアーゼは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または９５％より多い野生型配列特異的エンドリボヌクレアーゼ（例えば、図５（例えば、配列ＩＤ番号：６、８または９）に示されているアミノ酸配列）を示す。１つの非限定的な例としては、配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼは（以下に記述し、図６に示される）Ｃｓｙ４のＨ２９Ａ変異体である； Ｃｓｙ４（Ｈ２９Ａ）変異体をイミダゾールと接触させると、上述したように、エンドリボヌクレアーゼは再活性化され、配列に特異的な形で、標的リボ核酸内の認識配列を開裂することが可能になる。（後述する）Ｃｓｙ４の二重変異体、Ｈ２９Ａ、Ｓ５０Ｃも使用に適している。一部の実施形態においては、「タグ」、すなわち、認識配列はヌクレオチド配列の５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：１）を含む。
「タグ」または「認識」ヌクレオチド配列は、標準的な組換え方法を使って核酸に導入することができる。したがって、タグ付けされた標的核酸には、酵素的に開裂され、その結果、標的核酸が放出されるタグが含まれる。
一部の実施形態においては、タグ付けされた標的核酸 （ＲＮＡ）はそれに結合された１つまたは複数のポリペプチドを有する。１つまたは複数のポリペプチドが結合されているタグ付けされたＲＮＡは、本明細書では、ＲＮＡタンパク質複合体と称する。したがって、一部の実施形態においては、主題方法を使用して単離される標的ＲＮＡは、ＲＮＡタンパク質複合体である。一部の実施形態においては、主題方法はさらに、単離された標的ＲＮＡに結合されたポリペプチドを分析することも含むことができる。
主題方法は標的ＲＮＡ（またはＲＮＡタンパク質複合体）の単離を提供する。一部の実施形態においては、主題方法は、標的ＲＮＡ（またはＲＮＡタンパク質複合体）が少なくとも純度約５０％、少なくとも純度約６０％、少なくとも純度約７０％、少なくとも純度約８０％、少なくとも純度約９０％、少なくとも純度約９５％、少なくとも純度約９８％または純度９８％を超えるように、標的ＲＮＡ（またはＲＮＡタンパク質複合体）の精製を提供する。
一部の実施形態においては、標的ＲＮＡタンパク質複合体内の標的ＲＮＡに結合したタンパク質をＲＮＡタンパク質複合体から溶出することができる。溶出されたタンパク質は、例えば配列決定、酵素消化、機能解析などにより、さらに特徴を明らかにすることができる。
核酸の混合ポピュレーションは細胞溶解物中に存在することができる。例えば、タグ付けされたＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは細胞に（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで）導入され、細胞がタグ付けされたＲＮＡを合成できるようにする。溶解物は細胞から作られ、作られた溶解物は（任意で核酸の濃縮のための１つまたは複数のステップにかけられ）固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼに加えられる。
配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼは、多種多様な不溶性支持体のいずれかの上に固定することができる。適切な不溶性支持体としては、以下に限定されないが、アガロースビーズ、磁気ビーズ、テストストリップ、マルチウェルディッシュなどが挙げられる。不溶性支持体は多種多様な物質（ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースならびに磁鉄鉱）を含むことができ、例えば、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンのチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン被膜、シート、反応トレイのウェル（例えば、マルチウェルプレート）、プラスチックチューブなどを含む、多種多様な形態で提供され得る。
本開示は、さらに、標的ＲＮＡに結合するポリペプチドを単離する方法も提供し、ここで、本方法は以下のステップを含む：ａ）固定化された複合体を標的ＲＮＡを結合するポリペプチドを含む溶液に接触させるステップであって、ここで、固定化された複合体は、変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合される認識ヌクレオチド配列を含んでいる変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼおよびタグ付けされたＲＮＡを含み、前記接触により、ポリペプチドが標的ＲＮＡに結合され、前記接触はイミダゾールを含んでいない結合溶液で実施されるステップ；およびｂ）結合したポリペプチドを溶出するステップ。
エンドリボヌクレアーゼ
本開示は、配列特異的エンドリボヌクレアーゼを提供する。一部の実施形態において、 本開示は、標的ポリリボヌクレオチド内の認識配列に結合するが、該標的ポリリボヌクレオチドを開裂しない配列特異的エンドリボヌクレアーゼを提供する。すなわち、この配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、標的ポリリボヌクレオチドの加水分解において酵素的に不活性である。一部の実施形態において、本開示は、標的ポリリボヌクレオチド内の認識配列に結合し、該認識配列内または付近にある標的ポリリボヌクレオチドを開裂する配列特異的エンドリボヌクレアーゼを提供する。すなわち、この配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、標的ポリリボヌクレオチドの加水分解において酵素的に活性である。.
一部の実施形態において、主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、不溶性基質上に固定化される。適切な不溶性基質としては、以下に限定されないが、アガロースビーズ、 磁気ビーズ、テストストリップ、マルチウェルディッシュなどが挙げられる。不溶性基質は、多種多様な物質（ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱）を含有することができ、例えば、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンのチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン被膜、シーツ、反応トレイのウェル（例えば、マルチウェルプレート）、プラスチックチューブなどを含む、多種多様な形態で提供されることがあり得る。
酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ
本開示は、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼを提供し、ここで、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、配列に特異的な形でポリリボヌクレオチド内の標的配列に結合する。主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、配列に特異的な形で標的ポリリボヌクレオチドに結合するが、該標的ポリリボヌクレオチドを開裂しない。主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ は、前述したように、標的ＲＮＡを核酸の混合ポピュレーションから単離するのに有用である。
一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、天然に発生する酵素的に活性なＣｓｙ４、ＣａｓＥまたはＣａｓ６のポリペプチドに比較して、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ は、Ｃｓｙ４ ポリペプチドのＨｉｓ−２９の位置またはＣａｓＥもしくはＣａｓ６ポリペプチドの相当する位置にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、Ｃｓｙ４ポリペプチドのＳｅｒ−１４８の位置またはＣａｓＥもしくはＣａｓ６ポリペプチドの相当する位置にアミノ酸置換を含む。
図６は、適切な酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼのアミノ酸配列の非制限的な例を示している。一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、図６に示されたアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該アミノ酸配列は、Ｈｉｓ−２９、Ｓｅｒ−５０またはＨｉｓ−２９およびＳｅｒ− ５０の両方の位置に置換を含む。例えば、変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼは、Ｈ２９Ａ （Ｈｉｓ−２９からＡｌａ−２９への）置換、Ｓ５０Ｃ （Ｓｅｒ−５０からＣｙｓ−５０への）置換、またはＨ２９ＡおよびＳ５０Ｃ置換の両方を含むことができる。
一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な、配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼである。場合によっては、主題の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼは、図６に規定したアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、エンドリボヌクレアーゼは、Ｈｉｓ−２９の位置にアミノ酸置換を含み、変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼは、イミダゾールが存在しないときには酵素的に不活性であり、イミダゾールの存在下で活性化可能になる。場合によっては、アミノ酸置換は、Ｈｉｓ２９からＡｌａ２９への置換である。場合によっては、変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼは、Ｓｅｒ−５０置換も含む。場合によっては、主題の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼは、ヌクレオチド配列 ５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：１）を含むＲＮＡ基質に結合する。
主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、「条件付きで」酵素的に不活性であり、例えば、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ（例えば、主題の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ）は、イミダゾールが存在しないときには酵素的に不活性である；そして、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ（例えば、主題の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ）は、イミダゾールによって活性化可能になる。例えば、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ（例えば、主題の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ）は、約１００ｍＭから約５００ｍＭの濃度のイミダゾールにエンドリボヌクレアーゼを接触させることにより、酵素的に活性化することができる。
（例えば、約１００ｍＭから約５００ｍＭの濃度範囲での）イミダゾールの存在は、配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼを再活性化し、エンドリボヌクレアーゼは、酵素的に活性となり、例えば、エンドリボヌクレアーゼは、少なくとも約５０％, 少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または９５％より多い野生型配列特異的エンドリボヌクレアーゼ （例えば、図５に示されたアミノ酸配列（例えば、配列ＩＤ番号：６、８または９））を示す。
一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ（例えば、主題の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ）は、検出可能なシグナルを提供する部分も含め、検出可能な標識を含む。適切な検出可能な標識および／または検出可能なシグナルを提供する部分としては、以下に限定されないが、酵素、放射性同位体, ＦＲＥＴ対のメンバー、特定の結合対のメンバー；フルオロフォア；蛍光タンパク質；量子ドットなどが挙げられる。
使用するのに適したＦＲＥＴ対（ドナー／アクセプター）としては、以下に限定されないが、ＥＤＡＮＳ／フルオレセイン, ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、フルオレセイン／Ｃｙ５、ＩＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／ＱＳＹ−７、フルオレセイン／ＬＣＲｅｄ ６４０、フルオレセイン／Ｃｙ５．５およびフルオレセイン／ＬＣ Ｒｅｄ７０５が挙げられる。さらに、フルオロフォア／量子ドットのドナー／アクセプターの対を使用することもできる。
適切なフルオロフォア（「蛍光標識」）には、その内在する蛍光特性を通じて検出され得る任意の分子を含むことができ、励起時に検出可能な蛍光発光を含む。適切な蛍光標識は、以下に限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラサイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー（商標）、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、 ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ７０５およびオレゴングリーンが挙げられる。適切な光色素は、参照により本明細書に明確に組み込まれるＲｉｃｈａｒｄ Ｐ． Ｈａｕｇｌａｎｄによる２００２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第９版に記載されている。
適切な酵素としては、以下に限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。
適切な蛍光タンパク質としては、以下に限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、 例えば、オワンクラゲに由来するＧＦＰもしくはその変異体またはこれらの誘導体、例えば、米国特許第６，０６６，４７６号；第６，０２０，１９２号；第５，９８５，５７７号；第５，９７６，７９６号；第５，９６８，７５０号；第５，９６８，７３８号；第５，９５８，７１３号；第５，９１９，４４５号；第５，８７４，３０４号に記載のもの；赤色蛍光タンパク質；黄色蛍光タンパク質；花虫類に由来する多種多様な蛍光有色タンパク質の任意のいずれか、例えば、Ｍａｔｚら （１９９９）、 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：９６９−９７３に記載されているもの；など.が挙げられる。
適切なナノ粒子としては、例えば、量子ドット（ＱＤ）、蛍光性または発光性ナノ粒子および磁性ナノ粒子が挙げられる。ナノ粒子の光学特性または磁性 または特性はいずれも検出されることができる。
各種ＱＤおよびそれらの合成の方法は、当業では公知である（例えば、米国特許第６，３２２，９０１号；第６，５７６，２９１号；および第６，８１５，０６４号を参照されたい）。ＱＤは、多種多様な異なる材料（例えば、米国特許第６，４２３，５５１号；第６，２５１，３０３号；６，３１９，４２６号；第６，４２６，５１３号；第６，４４４，１４３号；および第６，６４９，１３８号を参照されたい）から成るコーティング層を塗布することにより、水溶性にすることができる。例えば、ＱＤは、両親媒性高分子を使用して可溶化することができる。使用されてきた例示的な高分子としては、オクチルアミン修飾された低分子量ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体化されたリン脂質、ポリ無水物、ブロック共重合体などが挙げられる。ＱＤは、コーティング層に直接的または間接的にリンクすることのできる多数の異なる官能基または結合剤のいずれかを通じてポリペプチドに共役させることができる（例えば、米国特許第５，９９０，４７９号；第６，２０７，３９２号；第６，２５１，３０３号；第６，３０６，６１０号；第６，３２５，１４４号；および第６，４２３，５５１号を参照されたい）。
多様な吸収および発光スペクトルを有するＱＤが、例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐ．（カリフォルニア州Ｈａｙｗａｒｄ；Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎが現在所有）またはＥｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ニューヨーク州Ｔｒｏｙ）から市販されている。例えば、およそ５２５、 ５３５、５４５、５６５、５８５、６０５、６５５、７０５および８００ｎｍのピーク発光波長を有するＱＤが入手可能である。したがって、ＱＤは、スペクトルの可視部全域および場合によっては、可視部を越えて、様々な異なる色を有することができる。
適切な放射性同位体としては、以下に限定されないが、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、 １２５Ｉおよび１３１Ｉが挙げられる。放射性同位体の標識としての使用は当業で公知である。
一部の実施形態において、主題の酵素的に不活性な、配列特異的エンドリボヌクレアーゼ （例えば、主題の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ）は、不溶性基質上に固定化される。適切な不溶性基質としては、以下に限定されないが、アガロースビーズ、磁気ビーズ、テストストリップ、マルチウェルディッシュなどが挙げられる。不溶性基質は、多種多様な物質（ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾セルロース、 ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱）を含有することができ、例えば、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンのチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン被膜、シーツ、反応トレイのウェル（例えば、マルチウェルプレート）、プラスチックチューブなどを含め、多種多様な形態で提供され得る。
一部の実施形態においては、主題の酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ（例えば、主題の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ）は精製され、例えば、少なくとも純度８０％、少なくとも純度８５％、少なくとも純度９０％、少なくとも純度９５％、 少なくとも純度９８％、少なくとも純度９９％、または純度９９％を超える。
組成物
本開示は、主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを含む組成物を提供する。主題の組成物は、主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ以外に、１つまたは複数の：塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンＮ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸 （ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸 （ＴＡＰＳ）など；可溶化剤；洗浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性洗浄剤；プロテアーゼ阻害剤；などを含むことができる。
酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ
一部の実施形態においては、主題の酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、検出を可能にする部分を含む。例えば、主題の酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、検出を可能にする共有または非共有結合された部分を含むことができる。
適切な検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的方法によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。検出を可能にする部分としては、以下に限定されないが、蛍光性分子；量子ドット；酵素が基質の検出可能な産生物への変換を触媒し、産生物は直接検出可能であるものとする、酵素（エンドリボヌクレアーゼ以外）；ナノ粒子などが挙げられる。
適切な蛍光タンパク質としては、以下に限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、 例えば、オワンクラゲに由来するＧＦＰもしくはその変異体またはこれらの誘導体、例えば、米国特許第６，０６６，４７６号；第６，０２０，１９２号；第５，９８５，５７７号；第５，９７６，７９６号；第５，９６８，７５０号；第５，９６８，７３８号；第５，９５８，７１３号；第５，９１９，４４５号；第５，８７４，３０４号に記載のもの；赤色蛍光タンパク質；黄色蛍光タンパク質；花虫類に由来する多種多様な蛍光有色タンパク質の任意のいずれか、例えば、Ｍａｔｚら （１９９９）、 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７：９６９−９７３に記載されているもの；など.が挙げられる。
適切なナノ粒子としては、例えば、量子ドット（ＱＤ）、蛍光性または発光性ナノ粒子および磁性ナノ粒子が挙げられる。ナノ粒子の光学特性または磁性または特性はいずれも検出されることができる。
各種ＱＤおよびそれらの合成の方法は、当業では公知である（例えば、米国特許第６，３２２，９０１号；第６，５７６，２９１号；および第６，８１５，０６４号を参照されたい）。ＱＤは、多種多様な異なる材料（例えば、米国特許第６，４２３，５５１号；第６，２５１，３０３号；６，３１９，４２６号；第６，４２６，５１３号；第６，４４４，１４３号；および第６，６４９，１３８号を参照されたい）から成るコーティング層を塗布することにより、水溶性にすることができる。例えば、ＱＤは、両親媒性高分子を使用して可溶化することができる。使用されてきた例示的な高分子としては、オクチルアミン修飾された低分子量ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体化されたリン脂質、ポリ無水物、ブロック共重合体などが挙げられる。ＱＤは、コーティング層に直接的または間接的にリンクすることのできる多数の異なる官能基または結合剤のいずれかを通じてポリペプチドに共役させることができる（例えば、米国特許第５，９９０，４７９号；第６，２０７，３９２号；第６，２５１，３０３号；第６，３０６，６１０号；第６，３２５，１４４号；および第６，４２３，５５１号を参照されたい）。
多様な吸収および発光スペクトルを有するＱＤが、例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐ．（カリフォルニア州Ｈａｙｗａｒｄ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎが現在所有）またはＥｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ニューヨーク州Ｔｒｏｙ）から市販されている。例えば、およそ５２５、 ５３５、５４５、５６５、５８５、６０５、６５５、７０５および８００ｎｍのピーク発光波長を有するＱＤが入手可能である。したがって、ＱＤは、スペクトルの可視部全域および場合によっては、可視部を越えて、様々な異なる色を有することができる。
一部の実施形態においては、主題の酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは精製され、例えば、少なくとも純度８０％、少なくとも純度８５％、少なくとも純度９０％、少なくとも純度９５％、 少なくとも純度９８％、少なくとも純度９９％、または純度９９％を超える。
組成物
本開示は、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼを含む組成物を提供する。主題の組成物は、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ以外に、１つまたは複数の：塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンＮ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸 （ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸 （ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸 （ＴＡＰＳ）など；可溶化剤；洗浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性洗浄剤；プロテアーゼ阻害剤；などを含むことができる。
本開示は、主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ （例えば、主題の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ）を含む組成物を提供する。主題の組成物 は、主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ（例えば、主題の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ）以外に、１つまたは複数の：塩、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４など；緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンＮ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸 （ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸 （ＴＡＰＳ）など；可溶化剤；洗浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性洗浄剤；プロテアーゼ阻害剤；などを含むことができる。一部の実施形態においては、組成物はイミダゾールを含まない。一部の実施形態においては、組成物は約１００ｍＭから約５００ｍＭの濃度でイミダゾールを含む。
主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼの産生方法
主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼ（例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ；主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）は、任意の既知の方法、例えば、タンパク質合成のための従来の合成方法；組換えＤＮＡ方法；などによって産生することができる。
主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼが化学的に合成される場合、合成は液相または固相で進めることができる。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、不溶性の支持体に配列のＣ末端アミノ酸を付着させた後、配列中の残りのアミノ酸を順次付着させていくもので、主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼの化学合成のための適切な方法の例の１つである。ＦｍｏｃおよびＢｏｃなどの様々な形態のＳＰＰＳが、主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼの合成に利用可能である。固相ペプチド合成法は、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄら Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ．第２巻「Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」パ−トＡ、３−２８４ペ−ジ：Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、J． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９−２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版. Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ． Ｃｏ．， イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ（１９８４）；ならびにＧａｎｅｓａｎ Ａ． ２００６ Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ． Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ６：３−１０およびＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡら、２００５ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８によって記述されている。
標準的な組換え法を主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼの産生に用いることができる。例えば、主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードする核酸が発現ベクターに挿入される。主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするＤＮＡセグメントは、コードされたポリペプチドが確実に発現するようにする発現ベクター中の制御配列に操作可能な形で結合される。発現制御配列としては、以下に限定されないが、プロモーター（例えば、天然で対応しているプロモーターまたは異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサー要素および転写終結配列が挙げられる。発現制御配列は、真核宿主細胞（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクトすることのできるベクター内の真核プロモーター系とすることができる。ひとたびベクターが適切な宿主に組み込まれたら、宿主はヌクレオチド配列の高度な発現、ならびにエンドリボヌクレアーゼの回収および精製に適した条件下で維持される。
核酸および宿主細胞
本開示は、主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列 （例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ；主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）を含む核酸を提供する。一部の実施形態において、核酸は発現ベクターであり、該発現ベクターは、配列特異的エンドリボヌクレアーゼの、例えば、細胞内での産生をもたらす。
主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列（例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ；主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）は、意図した標的細胞（例えば、コードされたエンドリボヌクレアーゼを合成するように遺伝子修飾された細胞）においてヌクレオチド配列の発現を可能にする、プロモーターおよびエンハンサーなどの１つまたは複数の調節要素に操作可能な形で結合され得る。
一部の実施形態において、主題の核酸は、図４または図５に規定されたアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、主題の核酸は、上述の変異型Ｃｓｙ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列（例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ；主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）は、転写制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）に操作可能な形で結合され得る。適切なプロモーターおよびエンハンサー要素は、当業で公知である。細菌性細胞での発現の場合、適切なプロモーターとしては、以下に限定されないが、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ｌａｍｂｄａ Ｐおよびｔｒｃが挙げられる。真核細胞での発現の場合、適切なプロモーターとしては、以下に限定されないが、サイトメガロウイルス前初期プロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナ−ゼプロモーター；前記および後期ＳＶ４０プロモーター；レトロウイルス由来の長い末端反復に存在するプロモーター；マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター；および多種多様な当業で公知の組織特異的プロモーターが挙げられる。
一部の実施形態において、例えば、酵母細胞での発現のためには、 適切なプロモーターは、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＰＹＫ１プロモーターなどの構成的プロモーター；ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＭＥＴ３プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＣ１プロモーター、 ＴＲＰ１プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＴＰ１プロモーターおよびＡＯＸ１（例えば、Ｐｉｃｈｉａでの使用向け）などの調節可能プロモーターである。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベルの十分に範囲内である。
原核宿主細胞での使用に適したプロモーターは、以下に限定されないが、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ｔｒｐプロモーター；ｌａｃオペロンプロモーター；ハイブリッドプロモーター、例えば、ｌａｃ／ｔａｃハイブリッドプロモーター、ｔａｃ／ｔｒｃハイブリッドプロモーター、ｔｒｐ／ｌａｃプロモーター、Ｔ７／ｌａｃプロモーター；ｔｒｃプロモーター；ｔａｃプロモーターなど；ａｒａＢＡＤプロモーター； ｉｎ ｖｉｖｏで調節されたプロモーター、例えば、ｓｓａＧプロモーターまたは関連するプロモーターなど （例えば、米国特許公開第２００４０１３１６３７号を参照されたい）、ｐａｇＣプロモーター（ＰｕｌｋｋｉｎｅｎおよびＭｉｌｌｅｒ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９１：１７３（１）：８６−９３；Ａｌｐｕｃｈｅ−Ａｒａｎｄａら、ＰＮＡＳ、１９９２；８９（２１）：１００７９−８３）、ｎｉｒＢプロモーター（Ｈａｒｂｏｒｎｅら（１９９２）Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏ． ６：２８０５−２８１３）など（例えば、 Ｄｕｎｓｔａｎら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５１３３−５１４１；ＭｃＫｅｌｖｉｅら（２００４） Ｖａｃｃｉｎｅ ２２：３２４３−３２５５； およびＣｈａｔｆｉｅｌｄら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：８８８−８９２を参照されたい）；ｓｉｇｍａ７０ プロモーター、例えば、コンセンサスｓｉｇｍａ７０プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７９８９８０、 ＡＸ７９８９６１およびＡＸ７９８１８３を参照されたい）；静止期プロモーター、例えば、ｄｐｓプロモーター、ｓｐｖプロモーターなど；病原性アイランドＳＰＩ−２由来プロモーター （例えば、W０９６／１７９５１号を参照されたい）；ａｃｔＡプロモーター（例えば、Ｓｈｅｔｒｏｎ−Ｒａｍａら（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：１０８７−１０９６を参照されたい）；ｒｐｓＭプロモーター（例えば、ＶａｌｄｉｖｉａおよびＦａｌｋｏｗ（１９９６）、Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：３６７を参照されたい）；ｔｅｔプロモーター（例えば、Ｈｉｌｌｅｎ，Ｗ．およびＷｉｓｓｍａｎｎ，Ａ．（１９８９）Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｗおよび Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ， Ｕ．（編集）、Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，タンパク質−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ 相互作用． Ｍａｃｍｉｌｌａｎ、英国ロンドン、第１０巻、１４３−１６２頁を参照されたい）；ＳＰ６プロモーター（例えば、Ｍｅｌｔｏｎら（１９８４）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７０３５を参照されたい）；などが挙げられる。大腸菌などの原核細胞で使用するのに適切な強いプロモーターは、以下に限定されないが、 Ｔｒｃ、Ｔａｃ、Ｔ５、Ｔ７およびＰＬａｍｂｄａ.が挙げられる。細菌性宿主細胞で使用するためのオペレーターの非限定的な例としては、ラクトースプロモーターオペレーター（ＬａｃＩリプレッサータンパク質は、ラクトースと接触すると、立体構造を変化させて、これによってＬａｃＩリプレッサータンパク質がオペレーターと結合するのを防ぐ）、トリプトファンプロモーターオペレーター （トリプトファンと複合体を形成するとき、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質はオペレーターに結合する立体構造を有する；トリプトファンの非存在下では、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質は、オペレーターに結合しない立体構造を有する）およびｔａｃプロモーターオペレーター（例えば、ｄｅＢｏｅｒら（１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．８０：２１−２５を参照されたい）が挙げられる。
主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列（例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ；主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）は、発現ベクターおよび／またはクローニングベクターに存在することができる。発現ベクターは、選択可能なマーカー、複製の起点ならびにベクターの複製および／または維持を提供するその他の機能を含み得る。
多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には知られており、多くが主題の組換え構築体の生成のために市販されている。以下のベクターは、例示として記載される：細菌性細胞：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ Ｋｓ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）； ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェ−デンＵｐｐｓａｌａ）。真核細胞：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、 ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
発現ベクターは、一般に異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を可能にするようにプロモーター配列の近くに位置した好都合な制限部位を有する。発現宿主中で作用する選択マーカーが存在してもよい。適切な発現ベクターは、以下に限定されないが、ウイルスベクター（例えば、種痘ウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３−２５４９，１９９４；Ｂｏｒｒａｓら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５〜５２４，１９９９；ＬｉおよびＤａｖｉｄｓｏｎ、ＰＮＡＳ ９２：７７００−７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８−１０９７，１９９９、国際公開第９４／１２６４９号、国際公開第９３／０３７６９号、国際公開第９３／１９１９１号、国際公開第９４／２８９３８号、国際公開第９５／１１９８４号、および国際公開第９５／００６５５号を参照されたい）、アデノ随伴ウイルス （例えば、Ａｌｉら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１−８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙら、ＰＮＡＳ ９４：６９１６−６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７−２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３−６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１−６４８，１９９９、Ａｌｉら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１−５９４，１９９６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａの国際公開第９３／０９２３９号、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ． Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５、およびＦｌｏｔｔｅら、 ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照されたい）、ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉら、ＰＮＡＳ ９４：１０３１９−２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２−７８１６，１９９９を参照されたい）；およびレトロウイルスベクター（例えば、ネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハ−ベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスなどのレトロウイルスから得られるベクター）などが挙げられる。
本開示は、主題の核酸によって遺伝子修飾された、単離された遺伝的修飾を加えた宿主細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞）を提供する。一部の実施形態において、主題の単離された、遺伝的修飾を加えた宿主細胞は、主題の配列特異的エンドリボヌクレアーゼ （例えば、主題の配列特異的で、酵素的に活性なエンドリボヌクレアーゼ；主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）を産生することができる。
適切な宿主細胞としては、哺乳類細胞、昆虫宿主細胞、 酵母細胞などの真核宿主細胞；および細菌性細胞などの原核細胞が挙げられる。主題の核酸の宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストランが仲介するトランスフェクション、リポソ−ムが仲介するトランスフェクション、エレクトロポレーションまたはその他の既知の方法によって実施することができる。
適切な哺乳類細胞としては、初代細胞および不死化細胞株が挙げられる。適切哺乳類細胞株としては、ヒト細胞株、ヒト以外の霊長類の細胞株、齧歯動物（例えば、マウス、ラット）の細胞株などが挙げられる。適切な哺乳類細胞株は、以下に限定されないが、ＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞 （例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞 （例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ベロ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞 （例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞 （例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞 （ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ1細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞 （ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞などが挙げられる。
適切な酵母細胞としては、以下に限定されないが、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシーエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチピーチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニジューランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、緑藻クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）などが挙げられる。
適切な原核細胞は、以下に限定されないが、大腸菌、乳酸菌属種、サルモネラ属種、赤痢菌属種などの任意の多種多様な実験室株が挙げられる。例えば、Ｃａｒｒｉｅｒら（１９９２）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１７６−１１８１；米国特許第６，４４７，７８４号；およびＳｉｚｅｍｏｒｅら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：２９９−３０２を参照されたい。本発明で使用することができるサルモネラ株の例は、以下に限定されないが、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ）およびネズミチフス菌（Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）が挙げられる。適切な赤痢菌株としては、以下に限定されないが、シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ），シゲラ・ソンネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、およびシゲラ・ディセンテリアエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｉｓｅｎｔｅｒｉａｅ）が挙げられる。典型的には、実験室株は、非病原性の株である。他の適切な細菌の非制限的な例としては、以下に限定されないが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス・プディタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｔａ）、シュードモナス・アエルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・メバロニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）、ロドバクター・スファエロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドバクター・カプスラトゥス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドスポリリウム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ロドコッカス属種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）などが挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。
キット
本開示は、標的ポリリボヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのキットも提供する。本開示は、基質ポリリボヌクレオチドの配列特異的開裂を実施するためのキットを提供する。本開示は、標的ポリリボヌクレオチドにおけるＲＮＡ配列の検出を実施するためのキットを提供する。本開示は、標的ＲＮＡの単離を実施するためのキットを提供する。本開示は、 標的ＲＮＡに結合するポリペプチドの単離を実施するためのキットを提供する。
ポリリボヌクレオチドの直接配列決定を実施するためのキット
ポリリボヌクレオチドの直接配列決定を実施するための主題のキットには、少なくとも主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼが含まれ、該配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼは精製されている。一部の実施形態において、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、ＦＲＥＴ検出のためにアクセプター分子またはドナー分子に結合される。
ポリリボヌクレオチドの直接的な配列決定を実施するための主題のキットには、少なくとも主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼが含まれ；そして、１つまたは複数の追加成分を含むことができ、該１つまたは複数の追加成分は以下とすることができる：１）緩衝剤；２）所定の配列を含むプローブオリゴヌクレオチド；３）所定の配列を含むプローブオリゴヌクレオチドであり、ＦＲＥＴ検出のためにアクセプター分子またはドナー分子に結合されているプローブオリゴヌクレオチド；４）標的ポリリボヌクレオチドに結合するための不溶性支持体；５）ポジティブコントロールのポリリボヌクレオチドであって、既知のヌクレオチド配列を含むポジティブコントロールのポリリボヌクレオチド；６）該ポジティブコントロールのポリリボヌクレオチドの既知の配列に結合し、二本鎖を形成するポジティブコントロールのプローブオリゴヌクレオチド。
上記の成分に加えて、主題のキットは、 主題の方法を実践するためのキットの成分の使用に関する指示をさらに含むことができる。主題の方法を実践するための指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は紙またはプラスチックなどの媒体に印刷してもよい。そのような場合、指示はキットにおいて、添付文書として、キットもしくはその成分の容器の標識（すなわち包装または副次的な包装（subpackaging）と関連付けて）などの形で提示してもよい。他の実施形態において、指示はコンピューターで判読可能な適切な記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭディスクなどとして提示される。さらに他の実施形態では、実際の指示はキットでは提示されないが、例えば、インタ−ネットを介して、リモートソースから指示を入手するための方法が提供される。この実施形態の例は、指示の確認および／または指示のダウンロードが行えるウェブアドレスを含むキットである。指示の場合と同様、指示を入手するための方法も、適切な媒体に記録される。
基質ポリリボヌクレオチドの配列特異的開裂を実施するためのキット
基質ポリリボヌクレオチドの配列特異的開裂を実施するための主題のキットには、少なくとも精製された配列特異的エンドリボヌクレアーゼおよび／または配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が含まれる。基質ポリリボヌクレオチドの配列特異的開裂を実施するための主題のキットには、精製された配列特異的エンドリボヌクレアーゼ（および／または配列特異的エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）に加えて、１つまたは複数の追加成分を含むことができる。適切な追加成分としては、例えば、緩衝剤；ポジティブコントロールとしての役割を果たすポリリボヌクレオチド基質；ポリリボヌクレオチドのサイズ標準；ネガティブコントロールの基質；などが挙げられる。成分はそれぞれ別の容器に入れることができる。キットは１つまたは複数のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールをさらに含むことができる。
上記の成分に加えて、主題のキットは、 主題の方法を実践するためのキットの成分の使用に関する指示をさらに含むことができる。主題の方法を実践するための指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は紙またはプラスチックなどの媒体に印刷してもよい。そのような場合、指示はキットにおいて、添付文書として、キットもしくはその成分の容器の標識（すなわち包装または副次的な包装（subpackaging）と関連付けて）などの形で提示してもよい。他の実施形態において、指示はコンピューターで判読可能な適切な記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭディスクなどとして提示される。さらに他の実施形態では、実際の指示はキットでは提示されないが、例えば、インタ−ネットを介して、リモートソースから指示を入手するための方法が提供される。この実施形態の例は、指示の確認および／または指示のダウンロードが行えるウェブアドレスを含むキットである。指示の場合と同様、指示を入手するための方法も、適切な媒体に記録される。
標的ポリリボヌクレオチドにおける配列の検出を実施するためのキット
標的ポリリボヌクレオチドにおける配列の検出を実施するための（例えば、ポリリボヌクレオチドの検出を実施するための）主題のキットには、既知の配列を含むオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。一部の実施形態において、キットには、既知の配列を含み、検出可能部分、例えば、免疫アッセイ；蛍光タンパク質；ルシフェリン；などを使って検出可能なポリペプチド、を含むオリゴヌクレオチドプローブが含まれる。キットは、オリゴヌクレオチドプローブと二本鎖を形成することが可能なヌクレオチド配列を含むポジティブコントロールのポリリボヌクレオチドをさらに含むことができる。キットは、オリゴヌクレオチドプローブおよび標的ポリリボヌクレオチドによって形成された二本鎖を特異的に検出して開裂する酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼをさらに含むことができる。キットは、１つまたは複数の緩衝剤；検出可能部分を検出するための成分；テストストリップ；などをさらに含むことができる。キットは、１つまたは複数のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールをさらに含むことができる。
上記の成分に加えて、主題のキットは、 主題の方法を実践するためのキットの成分の使用に関する指示をさらに含むことができる。主題の方法を実践するための指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は紙またはプラスチックなどの媒体に印刷してもよい。そのような場合、指示はキットにおいて、添付文書として、キットもしくはその成分の容器の標識（すなわち包装または副次的な包装（subpackaging）と関連付けて）などの形で提示してもよい。他の実施形態において、指示はコンピューターで判読可能な適切な記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭディスクなどとして提示される。さらに他の実施形態では、実際の指示はキットでは提示されないが、例えば、インタ−ネットを介して、リモートソースから指示を入手するための方法が提供される。この実施形態の例は、指示の確認および／または指示のダウンロードが行えるウェブアドレスを含むキットである。指示の場合と同様、指示を入手するための方法も、適切な媒体に記録される。
標的ＲＮＡの単離を実施するためのキット
標的ＲＮＡの単離（例えば、精製）を実施するための主題のキットは、以下を１つまたは複数含むことができる：１）主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ；２）「タグ」ヌクレオチド配列、すなわち配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼにより特異的に結合されるヌクレオチド配列を含む発現構築体（ここで選択した標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、「タグ」 ヌクレオチド配列挿入された３’とすることができる）；および ３）イミダゾール。配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼは、不溶性支持体上に固定化することができる。キットは、固定化された配列特異的な、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼと核酸の混合ポピュレーションを接触させるための液体組成物をさらに含むことができる。キットは、洗浄緩衝剤をさらに含むことができる。キットは、１つまたは複数のポジティブコントロールおよびネガティブコントロールをさらに含むことができる。ポジティブコントロールは、タグ付けされたＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含むことができ、タグは、配列特異的で、酵素不活性なエンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合される。成分はそれぞれ別の容器に入れることができる。
例えば、主題のキットは、主題の配列特異的で、酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼを含むことができる。主題のキットは、５’から３’の順で、操作可能な結合で、以下を含む組換え発現ベクターをさらに含むことができる：ａ）主題の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合されるＲＮＡ基質をコードするヌクレオチド配列；およびｂ）標的ＲＮＡをコードする核酸の挿入に適した多重クローニングサイト。ＲＮＡ基質をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに操作可能な形で結合され得る。場合によっては、プロモーターは、誘導プロモーターである。ＲＮＡ基質は、ヌクレオチド配列の５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：１）を含むことができる。場合によっては、組換え発現ベクターは、多重クローニングサイトに挿入され、標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。キットは、イミダゾールを含んでいない緩衝剤をさらに含むことができる。キットは、イミダゾールまたはイミダゾール溶液をさらに含むことができる。キットは、１つまたは複数の洗浄緩衝剤をさらに含むことができる。場合によっては、キットはポジティブコントロール発現ベクターを含む。変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼは、不溶性支持体上に固定化することができ、ここで適切な不溶性支持体としては、以下に限定されないが、 アガロースビーズ、磁気ビーズ、テストストリップ、マルチウェルディッシュなどが挙げられる。不溶性支持体は、多種多様な物質（ガラス、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリプロピレン、 ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱）を含有することができ、例えば、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび／またはシリコンのチップおよび表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン被膜、シート、反応トレイのウェル（例えば、マルチウェルプレート）、プラスチックチューブなどを含め、多種多様な形態で提供され得る。
上記の成分に加えて、主題のキットは、 主題の方法を実践するためのキットの成分の使用に関する指示をさらに含むことができる。主題の方法を実践するための指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は紙またはプラスチックなどの媒体に印刷してもよい。そのような場合、指示はキットにおいて、添付文書として、キットもしくはその成分の容器の標識（すなわち包装または副次的な包装（subpackaging）と関連付けて）などの形で提示してもよい。他の実施形態において、指示はコンピューターで判読可能な適切な記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭディスクなどとして提示される。さらに他の実施形態では、実際の指示はキットでは提示されないが、例えば、インタ−ネットを介して、リモートソースから指示を入手するための方法が提供される。この実施形態の例は、指示の確認および／または指示のダウンロードが行えるウェブアドレスを含むキットである。指示の場合と同様、指示を入手するための方法も、適切な媒体に記録される。
標的ポリリボヌクレオチドの配列を直接決定する方法
本開示は、標的ポリリボヌクレオチドのヌクレオチド配列を直接決定するための方法を提供する。したがって、例えば、本方法は標的ポリリボヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するために、標的ポリリボヌクレオチドのポリデオキシリボヌクレオチドの相補対の合成を必要としない。
ウイルス診断、オーダーメイド医療、単一細胞転写解析、翻訳プロファイリングは、すべて直接的なＲＮＡ検出および配列決定の用途がある分野である。主題のポリリボヌクレオチド配列決定方法、およびポリリボヌクレオチドにおける特定配列を検出する主題方法は、これらの多種多様な分野で用途がある。
主題のポリリボヌクレオチド配列決定方法は、一般に以下を伴う：ａ）オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの間の二本鎖形成に有利な条件下で、特定の既知の配列および酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼを含むオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドを接触させ、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼを二本鎖中で特定の配列と結合させる；およびｂ）オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの特異的結合を検出すること（ここで、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼが二本鎖に特異的に結合することは、標的ポリリボヌクレオチドにおいて特定の配列が存在することを意味する）。
場合によっては、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、放射性標識に（共有または非共有）結合される。「放射性標識」は、その内在する発光特性を通じて検出される任意の分子を意味し、励起時に検出可能な発光も含む。適切な放射性標識としては、以下に限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、マラサイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー（商標）、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、 ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ７０５およびオレゴングリーンが挙げられる。適切な光色素は、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ． Ｈａｕｇｌａｎｄによる２００２ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第９版に記載されている。
場合によっては、 主題のポリリボヌクレオチド配列決定方法で使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、ドナー分子に結合され、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、アクセプター分子に結合され、二本鎖形成の検出は、蛍光共鳴エネルギー移動（または「フェルスター共鳴エネルギー移動」もしくは「ＦＲＥＴ」とも呼ばれる）による。
フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、１つの蛍光色素の励起が、光子の発光を伴わずに別の蛍光色素に移動する、当業で公知の現象である。ＦＲＥＴ対は、ドナー発色団およびアクセプター発色団 （アクセプター発色団はクエンチャー分子であってもよい）から成る。ドナーの発光スペクトルおよびアクセプターの吸収スペクトルはオーバーラップしなければならず、２つの分子は引接していなければならない。ドナーの５０％が不活性化される（エネルギーをアクセプターに移動する）ドナーとアクセプターとの距離は、フェルスター半径によって定義され、通常は、１０〜１００オングストロームである。ＦＲＥＴ対を含む発光スペクトルの変化は、検出することができ、近接位置（すなわち、互いの１００オングストローム以内）にあるＦＲＥＴ対の数の変化を表す。これは、通常、２つの分子の結合または解離の結果として起こり、２つの分子の一方はＦＲＥＴドナーと標識され、他方はＦＲＥＴアクセプターと標識され、かかる分子の結合によって、ＦＲＥＴ対は近接に位置するようになる。
かかる分子の結合によって、アクセプターの発光および／またはドナーの蛍光発光のクエンチングが増加する。使用するのに適したＦＲＥＴ対（ドナー／アクセプター）は、以下に限定されないが、ＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、フルオレセイン／Ｃｙ５、ＩＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／ＱＳＹ−７、フルオレセイン／ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、フルオレセイン／Ｃｙ５．５およびフルオレセイン／ＬＣ Ｒｅｄ ７０５が挙げられる。加えて、フルオロフォア／量子ドットのドナー／アクセプターの対も使用することができる。ＥＤＡＮＳは、（５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）であり；ＩＡＥＤＡＮＳは、５−（｛２−［（ヨ−ドアセチル）アミノ］エチル｝ナフタレン−１−スルホン酸）であり；ＤＡＢＣＹＬは、４−（４−ジメチルアミノフェニル）ジアゼニル安息香酸である。
Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５などは、シアニンである。例えば、Ｃｙ３およびＣｙ５は、シアニン染料ファミリ−の反応性のある、水溶性蛍光染料である。Ｃｙ３染料は赤色（〜５５０ｎｍ励起、〜５７０ｎｍ発光であるため、緑に見える）であり、Ｃｙ５は赤色領域（〜６５０／６７０ｎｍ）で蛍光するが、 オレンジの領域（〜６４９ｎｍ）で吸収する。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｄｙｌｉｇｈｔ色素、ＩＲＩＳ色素、Ｓｅｔａ色素、ＳｅＴａｕ色素、ＳＲｆｌｕｏｒ色素およびＳｑｕａｒｅ色素も使用することができる。
ＦＲＥＴのもう１つの態様では、発光ドナー分子および非発光アクセプター分子（「クエンチャー」）が使用され得る。この用途では、ドナーの発光は、クエンチャーがドナーの近接位置から離れた位置にあるときに増加シー、クエンチャーがドナーの近接位置に近づくと、発光は減少する。有用なクエンチャーとしては、以下に限定されないが、 ＤＡＢＣＹＬ、ＱＳＹ７およびＱＳＹ３３が挙げられる。有用な蛍光ドナー／クエンチャーの対としては、以下に限定されないが、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、テキサスレッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬおよびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が挙げられる。
場合によっては、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、標識酵素に（共有的または非共有的に）結合される。「標識酵素」とは、検出可能産生物を産生する標識酵素の基質の存在下で、反応し得る酵素を指す。適切な標識酵素には、光学的に検出可能な標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の場合）も含まれる。適切な標識酵素としては、以下に限定されないが、ＨＲＰ、アルカリ性ホスファタ−ゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼが挙げられる。かかる基質を使用するための方法は、当業で公知である。標識酵素の存在は、一般に、標識酵素の基質との反応の酵素による触媒作用を通じて明らかになり、識別可能な産生物が産生される。この種の産生物は、テトラメチルベンジジンとの西洋ワサビペルオキシダーゼの反応などのように、不透明であることがあり得、多種多様な色を有することがあり得る。Ｌｕｍｉｎｏｌ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手可能）など、蛍光反応産生物を産生する他の標識酵素の基質が開発された。標識酵素の基質を使って標識酵素を同定するための方法は、当業では公知であり、商用キットが数多く市販されている。多種多様な標識酵素の使用例および使用方法は、Ｓａｖａｇｅら、Ｐｒｅｖｉｅｗｓ ２４７：６−９（１９９８）、Ｙｏｕｎｇ，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２２７−２３６（１９８９）に記述されている。
場合によっては、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、放射性同位体を含む。「放射性同位体」とは、任意の放射性分子を意味する。本発明で使用するのに適した放射性同位体としては、以下に限定されないが、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉが挙げられる。標識としての放射性同位体の使用は、当業では公知である。
場合によっては、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、特定の結合対のメンバー（「結合対の相手」）に（共有的または非共有的に）結合される。「結合対の相手」または「結合対のメンバー」とは、第１および第２の部分のどちらか一方を指し、ここで第１および第２の部分は互いに対して特異的な結合親和性を有する。適切な結合対としては、以下に限定されないが、抗原／抗体（例えば、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ、ダンシル／抗ダンシル、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ルシファーイエロー／抗ルシファーイエロー、およびローダミン／抗ローダミン）、ビオチン／アビジン（またはビオチン／ストレプトアビジン）、およびカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリンが挙げられる。
一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチドプローブは、非特異的な加水分解に対する抵抗性の増加を提供する修飾を含む。かかる修飾は、当業で公知であり、例えば、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合、修飾された骨格、塩基修飾、塩基置換、糖修飾などが含まれる。
そこにリン原子を含む適切な修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミダイトおよびアミノアルキルホスホラミダイトを含むホスホラミダイト、ホスホロジアミダイト、チオノホスホラミダイト、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常３’−５’結合を有するセレノリン酸およびボラノリン酸、これらの２’−５’結合類似体、および逆位極性を有するそれらを含み、ここにおいて１もしくは複数のヌクレオチド間結合は３’−３’、５’−５’、または２’−２’結合である。逆位極性を有する適切なオリゴヌクレオチドは、最も３’側のヌクレオチド間結合、すなわち脱塩していてもよい単一の逆位ヌクレオシド残基において単一の３’−３’結合を有することができる（核酸塩基が欠損またはその場所にヒドロキシル基を有する）。様々な塩類（例えば、カリウムまたはナトリウム）、混合塩類、および遊離酸形態も含まれる。
修飾されたオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエートおよび／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合、特に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ− ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ここで、天然のホスホジエステルヌクレオチド間結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−として表現されている）を含むことができる。ＭＭＩタイプのヌクレオシド間結合は、上で参照した米国特許第５，４８９，６７７号に開示されている。適切なアミドヌクレオシド間結合は、米国特許第５，６０２，２４０号に開示されている。
修飾されたオリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許第５，０３４，５０６号に記述されているように、１つまたは複数のモルホリノ骨格を含むことができる。例えば, 一部の実施形態において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、リボース環の代わりに、６員モルホリノ環を含む。これらの実施形態の一部では、ホスホロジアミダイトまたはその他のホスホジエステル以外のヌクレオシド間結合が、ホスホジエステル結合に取って代わる。モルホリノ 核酸 （「モルホリノ」）は、 デオキシリボース環の代わりに、モルホリン環に結合された塩基を含む；加えて、リン酸骨格は、リン酸の代わりに、リン酸基以外の基、例えば、ホスホロジアミダイト基を含むことができる。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４８９：１４１；Ｈｅａｓｍａｎ（２００２）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４３：２０９；ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ（１９９７） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７：１８７；Ｈｕｄｚｉａｋら（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．６：２６７；Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．６：１６９；Ａｍａｎｔａｎａら（２００７）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１８：１３２５；Ｍｏｒｃｏｓら（２００８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４５：６１６。
修飾されたオリゴヌクレオチドは、修飾骨格を含むことができる。リン原子を含まない修飾ポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子アルキルもしくは混合へテロ原子シクロアルキルのヌクレオシド間結合、１個もしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環のヌクレオシド間結合により形成された骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分形成される）を有する骨格；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格； メチレンイミノおよびメチレンヒドラジン骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成成分部分を有するその他のものが含まれる。
修飾されたオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の置換された糖部分を含むことができる。適切なオリゴヌクレオチドは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；〇−、Ｓ−、Ｎ−もしくはＮ−アルケニル；〇−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；または〇−アルキル−〇−アルキルから選択される糖置換基を含み、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルとすることができる。Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３ 、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３ 、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２も適切であり、ここでｎおよびｍは１から約１０である。他の適切なオリゴヌクレオチドは、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル, アラアルキル、Ｏ−アルカリルまたは Ｏ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、Ｓ〇２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ脱離基、レポーター基、挿入剤などから選択される糖置換基を含む。適切な修飾の１つは、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３ 、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。もう１つの適切な修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２―Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
修飾されたオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の核酸塩基（しばしば当業では単に「塩基」と称される）の修飾または置換を含むことができる。本明細書で用いられる場合、「非修飾」または「天然」の核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、およびアデニンおよびグアニンのその他のアルキル誘導体、２−プロピルおよびアデニンおよびグアニンのその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基のその他のアルキニル誘導体, ６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよびその他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然の核酸塩基を含む。さらなる修飾された核酸塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）− オン）、フェノチアジンシチジン （１Ｈ−ピリミド（５,４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環系ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５,４−（ｂ）（１，４）ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’、２’：４、５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）などのＧ−クランプ（G-clamps）を含む。
複素環塩基部分は、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンによって置換されたものも含んでよい。
適切な酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼには、本明細書で以下に記述する酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼが含まれる。例えば、図６に示す酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼを使用することができる。
一部の実施形態においては、標的ポリリボヌクレオチドは、固体支持体（不溶性支持体）に（共有または非共有）結合される。適切な不溶性支持体としては、以下に限定されないが、ビーズ、プレート（例えば、マルチウェルプレート）、ストリップなどが挙げられ、不溶性支持体は、これに限定されないが、ポリスチレン、ポリプロピレン、アガロースなどを含む多種多様な物質を含有することができる。
オリゴヌクレオチドプローブ（「検出ヌクレオチド」）は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは任意のＲＮＡまたはＤＮＡの化学修飾されたもの、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）などとすることができる。
主題のポリリボヌクレオチド配列決定方法は、１つまたは複数の洗浄ステップ、例えば、非特異的に結合されたオリゴヌクレオチドプローブ、任意の非特異的に結合された検出可能部分などの非特異的に結合された構成成分の除去を含むことができる。
主題のポリリボヌクレオチド配列決定方法の実施方法の非限定的な例は以下の通りである。標的ポリリボヌクレオチドが固体支持体に結合される。標的ポリリボヌクレオチドは未知の配列から成り、「配列決定の対象となるＲＮＡ」である。４種類の異なる既知のヌクレオチド配列の４本のオリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、異なるフルオロフォア （フルオロフォア１〜４）を含む。これらのフルオロフォアは、ＦＲＥＴ対のメンバーである。ＦＲＥＴ対の相手となるメンバーは、量子ドットである。量子ドットは、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼに結合される。酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの間に形成された二本鎖に結合するが、開裂はしない。４本のオリゴヌクレオチドプローブのうち１本だけが、標的ポリリボヌクレオチドに結合して、標的ポリリボヌクレオチドとの間に二本鎖を形成する。洗浄ステップは、結合していないオリゴヌクレオチドプローブをすべて除去する。オリゴヌクレオチドプローブ−フルオロフォア２の結合の結果、 標的ポリリボヌクレオチドとの間に二本鎖が形成される。フルオロフォア２は、したがって、酵素的に不活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼに結合された量子ドットに近接する位置に引っ張られ、蛍光はクエンチされる。
ポリリボヌクレオチドの開裂方法
本開示は、ポリリボヌクレオチドを配列に特異的な形で開裂する方法を提供する。本方法は、一般に、ポリリボヌクレオチド基質の配列特異的な開裂に有利な条件下で、酵素的に活性な配列特異的エンドリボヌクレアーゼ （例えば、Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ）と基質ポリリボヌクレオチドを接触させることを伴う。ポリリボヌクレオチドを配列に特異的な形で開裂する主題方法は、１）基質ポリリボヌクレオチドから親和性タグを欠失する；２）５’端、例えば、基質ポリリボヌクレオチドがｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡに転写された位置に均一性を有する産生ポリリボヌクレオチドのポピュレーションを生成する；および３）ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞の遺伝子発現を調節する目的に利用することができる。
基質ポリリボヌクレオチド
「基質ポリリボヌクレオチド」および「標的ポリリボヌクレオチド」という用語は、本明細書では同義的に用いられ、配列特異的エンドリボヌクレアーゼによって、配列に特異的な形で結合されるポリリボヌクレオチドを指す。基質ポリリボヌクレオチドは、一本鎖とすることができる。場合によっては、基質ポリリボヌクレオチドは二本鎖である。
エンドリボヌクレアーゼは、配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂を行う。したがって、例えば、エンドリボヌクレアーゼは、本明細書で「認識配列」または「認識部位」と呼称する特定の配列で、基質ポリリボヌクレオチドを結合および開裂する。
認識配列は、テトラヌクレオチド配列、ペンタヌクレオチド配列、ヘキサヌクレオチド配列、ヘプタヌクレオチド配列、オクタヌクレオチド配列またはオクタヌクレオチドより長くすることができる。例えば、一部の実施形態においては、認識配列は配列長が９のリボヌクレオチド、１０のリボヌクレオチド、１１のリボヌクレオチド、１２のリボヌクレオチド、１３のリボヌクレオチド、１４のリボヌクレオチド、１５のリボヌクレオチド、１６のリボヌクレオチド、１７のリボヌクレオチド、１８のリボヌクレオチド、１９のリボヌクレオチドまたは２０のリボヌクレオチドである。一部の実施形態において、配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、認識配列の５’の直近から開裂する。一部の実施形態においては、配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、認識配列の３’の直近から開裂する。一部の実施形態において、配列特異的エンドリボヌクレアーゼは認識配列内を開裂する。場合によっては、認識配列は二次的構造体の５’の直近である。場合によっては、認識配列は二次構造体の５’であり、その二次構造体から１ヌクレオチド （ｎｔ）、２ ｎｔ、３ ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔまたは５ｎｔ〜１０ｎｔ以内に位置する。場合によっては、認識配列は二次構造体の３’の直近である。場合によっては、認識配列は、二次構造体の３’であり、その二次構造体から１ヌクレオチド （ｎｔ）、２ ｎｔ、３ ｎｔ、４ ｎｔ、５ｎｔまたは５ｎｔ〜１０ｎｔ以内に位置する。
一部の実施形態において、基質ポリリボヌクレオチドは、ＸｘＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５の構造体を含み、ここで、ヌクレオチドＸ１−Ｘ５は Ｘ１１−Ｘ１５と塩基対を組み、Ｘ１およびＸ１５ は、ステム構造のベースを形成し、Ｘ６、 Ｘ７、Ｘ８、 Ｘ９およびＸ１０はループを形成し；構造は、例えば、通常のＡ型の螺旋構造である。
一部の実施形態において、基質ポリリボヌクレオチドは親和性タグを含み；主題方法は、基質ポリリボヌクレオチドからの親和性タグの欠失を可能にする。
配列特異的エンドリボヌクレアーゼ
配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼとしては、金属イオンに依存しない形で基質ポリリボヌクレオチドを開裂（加水分解）する酵素的に活性なポリペプチドが挙げられる。
配列特異的かつ金属イオンに依存しない形で、基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼの構造的特徴には、以下の１つまたは複数を含むことができる：１）ＲＮＡのメジャーグルーブを通じた、ＲＮＡのリン酸骨格の配列非特異的認識のための塩基性の高いαヘリックス、例えば、Ｒ１１４、Ｒ１１５、Ｒ１１８、Ｒ１１９またはこれらに相当するもの；２）ＲＮＡステムのメジャーグルーブと水素結合接触をする、Ｒ１０２および／もしくはＱ１０４、またはこれらに相当するもの；３）触媒作用に関与するＨｉｓ２９、Ｓｅｒｌ４８およびＴｙｒｌ７６またはこれらに相当するものの１つまたは複数；および４）Ｆ１５５またはこれに相当するもの。
配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼには、 図４に規定されたアミノ酸配列（Ｃｓｙ４アミノ酸配列）に対して、少なくとも約７５％、 少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する、酵素的に活性なポリペプチドが含まれる。
配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼには、図５に規定されたアミノ酸配列（Ｃｓｙ４アミノ酸配列）に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、 少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する、酵素的に活性なポリペプチドが含まれる。
配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼには、Ｃａｓ６アミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する酵素的に活性なポリペプチドが含まれる。
配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼには、ＣａｓＥアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有する酵素的に活性なポリペプチドが含まれる。
配列に特異的な形で基質ポリリボヌクレオチドに結合し、開裂するエンドリボヌクレアーゼには、１ 〜２０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）のアミノ酸置換および／または挿入および／または欠失によって、図４または５のいずれか一方で規定されたアミノ酸配列とは異なる酵素的に活性なポリペプチドが含まれる。
反応条件
配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、約１５℃から約１００℃の範囲、例えば、約１５℃〜約１７℃、約１７℃〜約２０℃、約２０℃〜 約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約４０℃、約４０℃〜約５０℃、約５０℃〜約６０℃、約６０℃〜約７０℃、約７０℃〜約８０℃、約８０℃〜約９０℃、約９０℃〜約１００℃の範囲の温度で、配列に特異的な形で、基質ポリリボヌクレオチドを加水分解することができる。
配列特異的エンドリボヌクレアーゼは、約４．０から約８．０のｐＨ範囲、例えば、ｐＨ約４．０〜約４.５、ｐＨ約４．５〜約５．０、ｐＨ約５．０〜約５．５、ｐＨ約５．５〜約６．０、ｐＨ約６．０〜約６．５、ｐＨ約６．５〜約７．０、ｐＨ約７．０〜約７．５、ｐＨ約６．５〜約７．５、ｐＨ約７．５〜約８．０、ｐＨ約６．５〜約８．０またはｐＨ約５．５〜約７．５のｐＨ範囲で、配列に特異的な形で、基質ポリリボヌクレオチドを加水分解することができる。
以下の実施例は、本発明を実施および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示されるものであり、本発明者らがその発明とみなす範囲を限定する意図はなく、以下の実験が行なわれる実験の全てまたは唯一のものであるということを示すことも意図していない。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関する正確性を保証する努力が払われているが、ある程度の実験誤差および逸脱は考慮されるべきである。別段の表記がない限り、割合は重量による割合であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏の温度であり、圧力は大気圧であるかその近辺である。標準的な略語、例えば、ｂｐ、塩基対（単数または複数）；ｋｂ、キロベース（単数または複数）；ｐｌ、ピコリットル（単数または複数）；ｓまたはｓｅｃ、秒（単数または複数）；ｍｉｎ、分（単数または複数）、ｈまたはｈｒ、時間（単数または複数）；ａａ、アミノ酸（単数または複数）；ｋｂ、キロベース（単数または複数）；ｂｐ、塩基対（単数または複数）；ｎｔ、ヌクレオチド（単数または複数）；ｉ．ｍ．、筋肉内（に）；ｉ．ｐ．、腹腔内（に）；ｓ．ｃ．、皮下（に）；などが用いられていることもある。
実施例１：Ｃｓｙ４ファミリーのタンパク質を使用した直接ＲＮＡ検出および配列決定
材料および方法
野生型Ｃｓｙ４、点変異体およびセレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）置換Ｃｓｙ４を、 Ｒｏｓｅｔｔａ ２（ＤＥ３）細胞で、Ｈｉｓ６−マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合タンパク質または Ｈｉｓ６融合タンパク質のいずれかとして発現させ、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィーにより精製した後、Ｈｉｓ（ＭＢＰ）タグのタンパク質分解による除去を行い、さらなるＮｉ−アフィニティーステップを実施し、サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｔ７ポリメラ−ゼを使って転写し、変性ゲル上で精製した。３０℃で３０分間、ＲＮＡをＣｓｙ４と一緒に２：１の割合でインキュベートした後、サイズ排除クロマトグラフィーにかけて複合体を形成した。複合体をハンギングドロップ法を使って、２００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、２０％（ｗ／ｖ）ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−４０００（野生型（ＷＴ）複合体）または１５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、１７％ＰＥＧ４０００または１６０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、１８％ＰＥＧ４０００（Ｓ２２Ｃ含有複合体）で結晶化した。ＳｅＭｅｔ置換結晶を使って、ＷＴ Ｃｓｙ４−ＲＮＡ複合体の構造を、多波長異常分散（ＭＡＤ）法により決定した。Ｃｓｙ４（Ｓ２２Ｃ）−ＲＮＡ複合体の構造を、分子置換により決定した。
遺伝子注釈、クローニング、タンパク質の発現および精製。複数種間のＣｓｙ４遺伝子の比較配列解析は、ＰＡ１４ゲノム中の注釈付き開始コドンの上流２０コドンに保存領域があることを明らかにした。Ｌｅｅら、 Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ７， Ｒ９０ （２００６）。 保存Ｃｓｙ４（ＰＡ１４＿３３３００）配列を、Ｐａ１４Ｃｓｙ４＿ｆｗｄ：ｃａｃｃａｔｇｇａｃｃａｃｔａｃｃｔｃｇａｃａｔｔｃｇおよびＰａ１４Ｃｓｙ４＿ｒｅｖ：ｇａａｃｃａｇｇｇａａｃｇａａａｃｃｔｃｃを使って、シュードモナス・アエルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＵＣＢＰＰ−ＰＡ１４ゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ増幅した。 ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産生物をＧａｔｅｗａｙシステムを使って、 ｐＥＮＴＲ／ＴＥＶ／Ｄ−ＴＯＰＯ エントリーベクター（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングした後、部位特異的組換えにより、発現ベクターｐＨＧＷＡまたはｐＨＭＧＷＡを得た。Ｂｕｓｓｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４３， ３１３−３２１（２００５）。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使って、Ｃｓｙ４に点変異を導入した。Ｐａ１４Ｃｓｙ４ 発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｒｏｓｅｔｔａ ２ （ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に形質転換するか、またはＧｅｎｅａｒｔ（ドイツ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）を使って合成されたＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを発現するｐＭＫベクターと同時形質転換した。Ｒｏｓｅｔｔａ ２ （ＤＥ３）細胞を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを補給したＬ培地 （ＬＢ）で培養した。タンパク質発現を、〜０.５ＯＤの細胞密度で、０.５ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を使って誘導した後、１８℃で１６時間振とうした。細胞をペレットし、溶解緩衝液（１５．５ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４.５ｍＭリン酸二水素ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭイミダゾール、プロテアーゼ阻害剤、５％グリセロール、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、 １００μ／ｍｌＤＮａｓｅＩ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィン塩酸塩 （ＴＣＥＰ）、０.５ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル、ｐＨ７．４）で再懸濁し、１０秒のバーストで２分間、氷上で超音波分解した。溶解物を遠心分離（２４，０００ｘｇ、３０分）して清澄化し、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）アフィニティー樹脂でインキュベートし、バッチ（Ｑｉａｇｅｎ社）に結合した。結合したタンパク質を高イミダゾール緩衝液（１５.５ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４．５ｍＭリン酸二水素ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、３００ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、ｐＨ７.４）を使って溶出し、透析緩衝液（イミダゾールをわずか２０ｍＭ含む溶出緩衝液）中でタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）の存在下で一夜透析し、Ｈｉｓ６ またはＨｉｓ６ＭＢＰタグを開裂した。タンパク質を濃縮し（Ａｍｉｃｏｎ社）、ニッケルアフィニティーカラム（ＧＥ）で精製した後、ゲル濾過緩衝液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＫＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ ＴＣＥＰ）中でタンデムＳｕｐ７５（１６／６０）カラムにかけた。 続いて試料を１５０ｍＭ塩化カリウムのみを含むゲル濾過緩衝液に対して透析した。セレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）誘導体化タンパク質の調製にも同様のプロトコルを使用したが、 唯一留意すべき違いは発現培地であった。簡単に説明すると、ＷｉｅｄｅｎｈｅｆｔらのＳｔｒｕｃｔｕｒｅ １７，９０４−９１２（２００９）で既に記述されていたように、Ｃｓｙ４（ｐＨＧＷＡ）発現ベクターを使って形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をアンピシリンを補充したＭ９最小培地で培養した。
ヌクレアーゼ活性アッセイ。７５ｐｍｏｌの野生型または変異型Ｃｓｙ４を、５ｐｍｏｌのｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＰａ１４ ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ （上記のＷｉｅｄｅｎｈｅｆｔ（２００９）の文献の記述に従って調製した）と一緒に２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ塩化カリウム緩衝液を含有する１０μｌ反応液で５分間、２５℃でインキュベートした。５０μｌ酸性フェノールクロロホルム （Ａｍｂｉｏｎ社）を添加して、反応をクエンチした。１０μｌの追加反応緩衝液を添加し、試料を遠心分離し（１６,０００ ｘｇ、３０分）、１６μｌ水性試料を除去し、２Ｘホルムアミドローディング緩衝液と１：１で混合し、１５％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でＲＮＡを可視化した。
結晶化。結晶化実験は全て等量（１μｌ＋１μｌ）の複合体とリザーバー溶液を混合することにより、ハンギングドロップ蒸気拡散法を使って、１８℃で実施した。野生型Ｃｓｙ４−ＲＮＡ複合体の円盤状の結晶を、２００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ ５．０）、１００ｍＭ塩化マグネシウム、２０％（ｗ／ｖ）ポリ（エチレングリコール）−４０００（ＰＥＧ４０００）中で培養した。これらの結晶は、空間群Ｃ２に属し、非対称単位中に複合体１個を含み、 シンクロトロンＸ線源において、分解能２.３Åの回折を示した。Ｃｓｙ４Ｓ２２Ｃ 点変異体を用いて再構成した複合体を使って、 １５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.６）、１７％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００および１６０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、１８％ＰＥＧ４０００中でさらに２つの結晶形を得た。最初に、六角形の結晶が２４時間以内に現れた。これらの結晶は、分解能２．６Åの回折を示し、空間群Ｐ６１に属し、非対称単位中に複合体１個を含んでいた。４８時間後に、同一の結晶化条件から、空間群Ｐ２１２１２１に属し、複合体を２個含み、分解能最大１．８Åの回折を示す針状の結晶が生じた。データ収集のために、全ての結晶形を、液体窒素でフラッシュ冷却する前に、３０％グリセロールを補充したそれぞれの母液に浸漬することにより、凍結保護した。
構造決定。我々は全ての回折データをＡｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のビームライン８．２．２および８．３．１で１００Ｋで収集した。データはＸＤＳを使って処理した。Ｋａｂｓｃｈ， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，１２５−１３２（２０１０）。実験フェーズはセレノメチオニン置換野生型Ｃｓｙ４を含む単斜晶系Ｃｓｙ４−ＲＮＡ結晶を使って、３波長多波長異常分散（ＭＡＤ）実験（ピーク、屈曲およびリモートデータセット）から確定した。ＰｈｅｎｉｘパッケージのＨｙｂｒｉｄ Ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｓｅａｒｃｈ（ＨｙＳＳ）モジュールを使って、２つのセレン部位を特定した。Ｇｒｏｓｓｅ−ＫｕｎｓｔｌｅｖｅおよびＡｄａｍｓ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５９，１９６６−１９７３ （２００３）。 下部構造の精密化、フェージングおよび密度修正は、ＡｕｔｏＳＨＡＲＰを使って実行した。 Ｖｏｎｒｈｅｉｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３６４， ２１５−２３０（２００７）。出来上がった電子密度マップは、ｃ軸上で交互に現れるタンパク質とＲＮＡとに拠る明確な密度の層を示し、ＲＮＡ層は、「キッシング・ループ（kissing loop）」相互作用に関与している２つの同軸にスタックしたＲＮＡ螺旋で構成されている。Ｃｓｙ４タンパク質の初期の原子モデルは、Ｐｈｅｎｉｘ ＡｕｔｏＢｕｉｌｄモジュールを使って自動作成により得た。Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６４、６１−６９（２００８）。複合体モデルは、ＣＯＯＴで手動作成の反復サイクルによって完成され（ＥｍｓｌｅｙおよびＣｏｗｔａｎ， Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６０， ２１２６−２１３２ （２００４））、精密化は、ネイティブ２．３３Å分解能データセットに対照して、Ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ３６ （Ａｄａｍｓら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６６，２１３−２２１ （２０１０））を使って行い、結晶学的Ｒｗｏｒｋ因子が２１．４％およびＲｆｒｅｅ因子が２６．４％の最終モデルを得た（表１）。
このモデルには、ＲＮＡヌクレオチドＣ１〜Ｇ１５およびヌクレオチドＣ１６のリン酸基およびタンパク質残基１〜１０４、１０９〜１２０および１３９〜１８７が含まれる。結晶格子におけるタンパク質およびＲＮＡの階層化された配列ならびにＲＮＡ層内での横方向結晶接触の欠如が原因で、著しく上昇した温度因子（>１００Å２）およびＵ９のヌクレオチド塩基に対する解釈可能な密度の欠如により証拠づけられているように、ＲＮＡの無秩序さは顕著である。この無秩序さは、ＲＮＡのメジャーグルーブに挿入されたアルギニンの豊富な螺旋に対応している、タンパク質残基１０９〜１２０でも明白であり、ここに対してはポリペプチド骨格のみを作成することができた（残基Ａｒｇ１１５およびＡｒｇ１１８を除く）。
六角形および斜方晶系の結晶形におけるＣｓｙ４（Ｓ２２Ｃ）−ＲＮＡ複合体の構造を、（アルギニン豊富な螺旋を有さない）Ｃｓｙ４タンパク質および単斜晶系結晶形からのＲＮＡモデルを別個の検索アンサンブルとして使い、Ｐｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙら、Ｊ Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ４０，６５８−６７４ （２００７））で、分子置換によって確定した。どちらの結晶形でも、アルギニン豊富な螺旋およびＣｓｙ４残基１０５〜１０８から成るリンカー領域の電子密度は、分子置換解から得た２Ｆｏ−Ｆｃ マップソリューションでも即座に認識できた。六角形のＣｓｙ４（Ｓ２２Ｃ）−ＲＮＡ複合体の構造は、２．６Åの分解能にてＲｗｏｒｋ 因子２５．５％およびＲｆｒｅｅ２７．９に精密化した。最終モデルには、Ｃｓｙ４残基１〜１２０および１３９〜１８７ならびにＲＮＡヌクレオチドＣ１〜Ｇ１５、これらに加えて、ヌクレオチドＣ１６のリン酸基が含まれる。優れた立体化学により、Ｃｓｙ４（Ｓ２２Ｃ）−ＲＮＡ複合体の斜方晶系の結晶形を１.８Å分解能で解明し、Ｒｗｏｒｋ 因子１８.７％およびＲｆｒｅｅ ２２.０％に精密化した。非対称単位内の２つの複合体のうち、複合体 １（鎖ＡおよびＣ）には、Ｃｓｙ４残基１〜１８７およびＲＮＡヌクレオチドＣ１〜Ｇ１５、これらに加えてヌクレオチドＣ１６のリン酸基が含まれるのに対し、より無秩序な複合体２（鎖ＢおよびＤ）は、残基１３〜１５および１３５〜１３８（これらは秩序だった電子密度を示さない）を除き、Ｃｓｙ４残基１〜１８７、およびＲＮＡヌクレオチドＣ１〜Ｇ１５およびヌクレオチドＣ１６のリン酸基を含む。２個のＣｓｙ４は、１７９のＣα原子の上で１．１５Åのｒｍｓｄと重なるが、最大の違いはアルギニン豊富な螺旋のわずかに異なる位置から生じている。 非対称単位内の２つのＲＮＡ分子は、１．４９Åのｒｍｓｄと重なるが、最大偏差は突き出したヌクレオチドＵ９が原因であり、これは２つのＲＮＡで異なる配座を取る。この原稿全体を通して、構造の説明は斜方晶系の複合体１に基づいている。全てＰｙｍｏｌ（http://www（ドット）pymol（ドット）org）を使って生成した。
結果
ＣＲＩＳＰＲが媒介する免疫は、配列決定されたゲノムにおいてＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が存在することから、古細菌ゲノムの約９０％および細菌ゲノムの約４０％で発生すると考えられている。ＨｏｒｖａｔｈおよびＢａｒｒａｎｇｏｕ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７，１６７−１７０（２０１０）；Ｊａｎｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４３， １５６５−１５７５ （２００２）；Ｓｏｒｅｋら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６， １８１− １８６ （２００８）；ＭａｒｒａｆｆｉｎｉおよびＳｏｎｔｈｅｉｍｅｒ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １１，１８１−１９０ （２０１０）。既知の８種のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプに属すＣＲＩＳＰＲ系（Ｃａｓ）タンパク質は、１次配列レベルで非常に相違しているため、機能的相同体を識別しにくくしている。Ｈａｆｔら，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １， ｅ６０（２００５）；Ｍａｋａｒｏｖａら， Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｉｒｅｃｔ １， １−２６ （２００６）。シュードモナス・アエルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＵＣＢＰＰ−ＰＡ１４（以降、Ｐａ１４）は、エルシニア属のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が潜んでいるグラム陰性日和見病原体であり、２個のＣＲＩＳＰＲ要素が両側に位置する６個の遺伝子を含む（図１Ａ）。Ｃａｓ１は、ＣＲＩＳＰＲ含有生物体の間で普遍的に見出せ、Ｃａｓ３は、ほとんどのサブタイプで顕著であるが、Ｃｓｙ１〜４は、エルシニア属に特有である。どちらのＣＲＩＳＰＲ要素も、〜３２のヌクレオチド固有のスペーサー（その一部は、バクテリオファ−ジまたはプラスミドに見られる配列と一致する） が間に挿入されている、どちらのＣＲＩＳＰＲ内でも（１個のヌクレオチドを除き）同一の２８ヌクレオチド反復の特徴的な配列を含む。Ｇｒｉｓｓａら，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８， １７２（２００７）。多くの生物体では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、長い単一単位として転写され、転写後に処理されて、各々が反復要素から派生した配列が両側を占める１つの固有配列を含むｃｒＲＮＡを作り出していることが明らかにされた。Ｂｒｏｕｎｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１， ９６０−９６４（２００８）；Ｃａｒｔｅら，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２２，３４８９−３４９６（２００８）；Ｔａｎｇら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９， ７５３６− ７５４１（２００２）；Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌら，Ａｒｃｈａｅａ ２，５９−７２（２００６）；Ｌｉｌｌｅｓｔｏｌら， Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７２， ２５９−２７２（２００９）； Ｔａｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５５，４６９−４８１（２００５）。
エルシニア属における長いＣＲＩＳＰＲ転写産物（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）由来のｃｒＲＮＡの産生に関与するタンパク質を同定するために、Ｐａ１４由来の６種類のＣａｓタンパク質の各々を組換えにより発現させ、組換えで発現したタンパク質を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを使って、エンドリボ核酸分解機能の有無についてテストした。配列特異的ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ処理活性に基き、Ｃｓｙ４は、ｃｒＲＮＡ反復発生に関与するエンドリボヌクレアーゼであることが明らかになった。２つの他のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプ内でのｃｒＲＮＡ処理について洞察されているように（上記のＢｒｏｕｎｓら（２００８）；上記のＣａｒｔｅら（２００８））、ＣＲＩＳＰＲ転写産物の開裂は急速で金属イオンに依存しない反応である。Ｃｓｙ４は、５’端および３’端で両側を反復配列のそれぞれ８個または２０個のヌクレオチドが占める３２ヌクレオチドの固有（ファージ誘導）配列から成る〜６０ヌクレオチドのｃｒＲＮＡを生成する予測されたステムループ構造のベースとなる反復要素内でｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを開裂する（図１Ａ）。
Ｃｓｙ４が効果的であるためには、そのＲＮＡ認識機構はＣＲＩＳＰＲ誘導転写産物だけを標的とし、ヘアピンおよび／または関連配列を含むその他の細胞ＲＮＡは標的としないように、高度に特異的でなければならないという仮説が立てられた。これを試験するために、Ｃｓｙ４を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のみで発現させるか、またはＰａ１４ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと共発現させた。高い等電点（ＰＩ＝１０.２）にも関わらず、Ｃｓｙ４は細胞核酸には結合しない；しかし、ＰＡ１４ ＣＲＩＳＰＲ共発現させると、このタンパク質は、ｃｒＲＮＡと結合する （図１Ｂ、Ｃ）。このような洞察は、Ｃｓｙ４認識の特異性を強調するものだったので、我々はＣｓｙ４ 基質の認識および開裂に必要とされるタンパク質／ＲＮＡ相互作用を探求することにした。Ｃｓｙ４の結合および活性アッセイを、２８ヌクレオチドＰＡ１４ ＣＲＩＳＰＲ反復配列の異なる領域に対応するＲＮＡオリゴヌクレオチドを使って、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実行した。このアプローチを使って、反復誘導ステムループおよび１個の下流ヌクレオチドから成る、Ｃｓｙ４により認識される最小ＲＮＡフラグメントを同定した。この最小ＲＮＡを基質として活用する開裂アッセイでは、Ｃｓｙ４活性には、開裂部位のすぐ上流のリボースに２’ＯＨを必要とすることが明らかになった。この位置にある２’デオキシリボースは、開裂を完全に無効にするが、Ｃｓｙ４の結合を分断することはない。
ｃｒＲＮＡの認識および開裂について構造的な識見を得るために、Ｃｓｙ４を最小ＲＮＡ基質と複合して共結晶化した。構造解析のための安定した複合体を生成するために、開裂部位の直前のヌクレオチドが２’デオキシヌクレオチドである、上述の開裂できない１６ヌクレオチドの最小ＲＮＡ基質にＣｓｙ４を結合させた。複合体の結晶を、それぞれが異なる結晶充填を示す３つの固有の空間群として得た；１つには、野生型Ｃｓｙ４が含まれ、２つにはＣｓｙ４点変異体が含まれた。Ｃｓｙ４−ＲＮＡ複合体の結晶構造を、１．８Åの分解能まで解明し（図２Ａ、表１）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ がＣＲＩＳＰＲが媒介するサイレンシング・マシナリーにより認識され、使用に備えて処理される予想外の機構を明らかにした。Ｃｓｙ４は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列のステムループのメジャーグルーブで配列特異的接触を行い、ＲＮＡステムのリン酸骨格と追加の配列非特異的接触を行う。特徴付けられたタンパク質／ＲＮＡ相互作用の大半は、ＲＮＡ螺旋のマイナーグルーブを介して媒介される；Ｃｓｙ４によるＲＮＡメジャーグルーブの認識は、タンパク質／ＲＮＡ相互作用の極めて異例な機構である。
１次配列レベルにおいて、Ｃｓｙ４は、ｃｒＲＮＡ生合成に関与するほかの既知のエンドリボヌクレアーゼ（サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）由来のＣａｓＥ（Ｅｂｉｈａｒａら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １５， １４９４−１４９９（２００６））およびピュロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のＣａｓ６（Ｃａｒｔｅら（２００８）前記参照））とは非常に異なっており、わずか〜１０％しか同一性を共有していない。ＣａｓＥおよびＣａｓ６のどちらの結晶構造も、これらのタンパク質がタンデムなフェレドキシン様フォールドを採用していることを示している。特筆すべきことに、Ｃｓｙ４は、これらの酵素とこのフォールドを共用している；Ｃｓｙ４−ＲＮＡ複合体では、Ｃｓｙ４のＮ末端ドメイン（残基１〜９４） は、実際に、 フェレドキシン様フォールドを採用している。しかし、Ｃ末端ドメイン （残基９５〜１８７）は、フェレドキシン様フォールドと同一の二次構造結合性を共有しているが、その配座は著しく異なっている。際立っているのは、推定上のＣ端末フェレドキシンドメインからのアルギニン豊富な螺旋（残基１０８〜１２０）がヘアピンＲＮＡのメジャーグルーブに挿入される。ＤＡＬＩサーバーを使った構造の重ね合わせ（ＨｏｌｍおよびＳａｎｄｅｒ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３３， １２３−１３８ （１９９３））は、そのＲＮＡ座位でのＣｓｙ４は、ＣａｓＥおよびＣａｓ６と、それぞれ（Ｃａ原子１１１個に渡って）３．８Åの標準偏差（ｒｍｓｄ）と（Ｃａ原子１０４個に渡って）３．９Å の標準偏差で重なり合うことを示している。Ｃｓｙ４、ＣａｓＥおよびＣａｓ６は、類似のタンパク質フォールドを維持しながら、ＣＲＩＳＰＲ座位の反復配列と共進化したので、配列レベルで著しく分岐した単一の先祖エンドリボヌクレアーゼの子孫かもしれない。
ｃｒＲＮＡ基質は、このサブクラスのｃｒＲＮＡ反復に対して予測されていた（Ｋｕｎｉｎら， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ８，Ｒ６１（２００７））ように、ヌクレオチド１〜５および１１〜１５の塩基対によって正規のＡ型螺旋ステムを作り出し、ヘアピン構造を形成する。ＧＵＡＵＡペンタループは、せん断されたＧ６−Ａ１０塩基対および突出したヌクレオチドＵ９を含んでおり、その構造は酵母Ｕ６核内低分子ＲＮＡ分子内ステムループ（Ｈｕｐｐｌｅｒら， Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９， ４３１−４３５ （２００２））内およびバクテリオファ−ジラムダＢｏｘＢ ＲＮＡ（Ｌｅｇａｕｌｔら，Ｃｅｌｌ ９３，２８９−２９９（１９９８））に見られるＧＮＲ（Ｎ）Ａペンタループを連想させる。Ｃｓｙ４− ＲＮＡ複合体では、ＲＮＡステムループは、Ｃｓｙ４のβ７〜β８のストランドによって形成されたβヘアピンをまたがっており、Ｃ１−Ｇ１５塩基対は、 Ｐｈｅｌ５５の芳香族側鎖に直接スタックしている（図２Ｂ）。これはＲＮＡステムを固定し、適切な角度に方向付けて、メジャーグルーブでの配列特異的相互作用を可能にする。.
Ｃｓｙ４の本体をアルギニン豊富な螺旋、Ａｒｇ１０２およびＧｌｎ１０４に連結するリンカーセグメント内の２つの残基は、ＲＮＡステムのメジャーグループ内で水素結合接触し、配列特異的にそれぞれＧ１５およびＡ１４を認識する（図２Ｂ）。Ｃｓｙ４−ｃｒＲＮＡ相互作用は、突出したヌクレオチドＵ９の近接位置で、アルギニン豊富な螺旋がＲＮＡヘアピンのメジャーグルーブに挿入されることにより、さらに安定化される（図２Ｃ）。Ａｒｇ１１４、Ａｒｇ１１５、Ａｒｇ１１８およびＡｒｇ１１９の側鎖はヌクレオチド２〜６のリン酸基に接触する。さらに、Ａｒｇ１１５の側鎖は、アルギニン豊富な螺旋とＲＮＡヘアピンとの間の唯一の配列特異的相互作用として、Ｇ６塩基と会合する。興味深いことに、この相互作用は、特定のウイルスタンパク質が、ｄｓＲＮＡ分子のメジャーグルーブと相互作用する方法、例えば the in ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）２３におけるＴａｔ／Ｔａｒ相互作用およびラムドイドファージにおけるラムダ−Ｎ／ｂｏｘＡ複合体などを、非常に連想させる（Ｃａｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，２０３−２１２ （１９９８））。どちらのＣａｓＥも、塩基性の高いα螺旋が、ＲＮＡのメジャーグルーブを通して、ＲＮＡのリン酸骨格による配列非特異的認識に使われている。
Ｃｓｙ４は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列のヘアピン要素を認識し、そのすぐ下流を開裂する。この実施例に記述した構造には、基質擬態ＲＮＡが含まれており、これは開裂には不適である。活性部位において、最後から２番目のヌクレオチドのリン酸基３’についてのみ、密度が観察されたが、恐らくはこのヌクレオチドの柔軟性が原因で、末端の糖または塩基には密度は観察されなかった（図３Ａ）。解離しやすいリン酸塩は、一方の側のβ７− β８ヘアピンのβターンと、もう一方の側の以前にＣａｓ６ およびＣａｓＥで識別されていた螺旋α１とグリセリン豊富なループとの間に位置するポケットに結合する。そのリン酸基に近接する３つの残基、Ｈｉｓ２９、Ｓｅｒ１４８およびＴｙｒ１７６は、触媒作用に参加する可能性が高い。これらの残基は、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５， ３３８９−３４０２（１９９７））を使い、近傍のＣＲＩＳＰＲ座位の手動による検証（Ｇｒｉｓｓａら，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８，１７２（２００７））を併用して同定した１２のＣｓｙ４配列間で不変である（図４）。
構造は、Ｃｓｙ４内の複数の残基が、基質の認識／結合および触媒作用の媒介に重要であることを示唆している。これらの残基の各々の点変異体を生成し、それらの開裂活性を生化学的に試験した（図３Ｂ）。推定上の触媒部位の残基Ｈｉｓ２９またはＳｅｒ１４８の変異は、開裂活性を無効化する。ただし、Ｔｙｒ１７６がフェニルアラニンに変異しても、活性は中断しない。これはＴｙｒ１７６が、触媒作用には直接関与しないが、Ｈｉｓ２９の方向付けに重要な役割を担っている可能性を示唆している。 Ａｒｇ１０２がアラニンに変異すると、ｃｒＲＮＡの蓄積が止まるが、Ｇｌｎ１０４がアラニンに変異しても活性はほとんど中断されない。これはＡｒｇ１０２が末端の塩基対を認識し、ＲＮＡ基質の適切な方向付けに重要であるが、Ｇｌｎ１０４はｉｎ ｖｉｔｒｏ活性に必要とされていないことを示唆している。Ｐｈｅ１５５は、ＲＮＡ基質の適切な方向付けに大きな役割を担っているように見える。この残基でのアラニンの変異はｃｒＲＮＡ生合成を大きく阻害するからだ。
ＲＮＡ開裂の媒介に関与しているセリンの同定は、予測外である。Ｈｉｓ２９がアラニンに変異すると、 Ｃｓｙ４は触媒活性が不活性になるが、リジンに変異すると、活性は部分的に回復する。これはＨｉｓ２９が、求核攻撃によって開裂を開始するのではなく、プロトンドナーとして動作していることを強く示唆している。
ＣＲＩＳＰＲは、侵入してくる遺伝的要素に対応する同種の配列に免疫系を誘導することを低分子ＣＲＩＳＰＲ誘導ＲＮＡに依存している核酸を基礎とする免疫系の遺伝記憶である。ＣＲＩＳＰＲ反復配列の系統発生解析によって、Ｃａｓ遺伝子の特定のセットと相関する明確なＣＲＩＳＰＲカテゴリーが識別された（Ｋｕｎｉｎら， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ８， Ｒ６１（２００７））。特定のＣＲＩＳＰＲ反復配列タイプと一緒にＣａｓ遺伝子が変動することは、ＣＲＩＳＰＲ反復は、ＣＲＩＳＰＲの適合、ｃｒＲＮＡの生成および侵入遺伝要素のサイレンシングに関与するＣａｓ遺伝子と共進化したことを示唆している。ここに記述した構造は、配列特異性および構造特異性の両方に基いて、ｃｒＲＮＡ基質を区別する異例な認識機構の詳細を示し、Ｃｓｙ４およびその同位種が全ての細胞ＲＮＡの中で基質ＲＮＡを容易に区別できる能力について大きな洞察を与えてくれる。
図１Ａ〜Ｃ。Ｐａ１４Ｃｓｙ４は、そのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ基質のみを特異的に認識する。ａ Ｐａ１４におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ座位の概略図。６個のＣａｓ遺伝子は両側をＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によって占められている。拡大図は３２ヌクレオチドスペーサー配列（青）によって分離された２８ヌクレオチド直接反復（黒い文字）の予測ステムループを示す概略図である。赤い矢印は、Ｃｓｙ４により開裂された結合を指している。ｂ，ｃ ＰＡ１４ ＣＲＩＳＰＲ座位を含むプラスミドのある（＋）場合とない（−）場合での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＰａ１４Ｃｓｙ４発現後のタンパク質 （ｂ）およびＲＮＡの内容（ｃ）の比較。どちらの調製物からも精製したＣｓｙ４を２つのプールに分割した。 半分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分解し、クマシー・ブルー染色で可視化した；半分は酸性フェノールクロロホルム抽出し、ＵＲＥＡ−ＰＡＧＥ上で分解し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使って可視化した。
図２Ａ〜２Ｃ。ＲＮＡ基質に結合したＣｓｙ４の結晶構造。ａ 複合体の前面図および背面図。Ｃｓｙ４を青色で示し、ＲＮＡ骨格をオレンジ色で示してある。ｂ 残基Ｒ１０２とＱ１０４およびヌクレオチドＡ１４とＧ１５との間の詳細相互作用。水素結合を点線で示してある。ｃ アルギニン豊富なαヘリックスとＲＮＡ骨格とＧ６との間の詳細相互作用。
図３Ａおよび３Ｂ。推定の活性部位。ａ 触媒中心の詳細図。ｂ Ｃｓｙ４の開裂活性。野生型（ＷＴ）Ｃｓｙ４および一連の単一点変異体をｉｎ ｖｉｔｒｏ で転写したｐｒｅ−ｃｒＲＮＡと一緒に、２５℃で５分間、インキュベートした。Ｃ 産生物を酸性フェノールクロロホルム抽出し、ＵＲＥＡ−ｐａｇｅ上で分解し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色により可視化した。
実施例２：直接ＲＮＡ配列決定
フェルスター共鳴エネルギー移動 （ＦＲＥＴ）を使って、単一分子レベルでＲＮＡの配列を決定することができる。配列決定の対象ＲＮＡは、その３’リボースを通じて、固体表面に付着される。ＲＮＡは、単一分子レベルでの検出を可能にするのに十分なだけの間隔を、表面上で、近隣のＲＮＡ分子から取られなければならない。間隔は、放射光の波長に応じて、回折を制限する方法により決定される。あるいは、超分解能イメージング法を使用する場合、ＲＮＡ間隔は、回折の限界よりも接近させることができる。第１の配列検出ステップでは、既知の核酸結合特異性のＣｓｙ４ファミリータンパク質を、検出ヌクレオチドのプールと一緒に配列決定の対象ＲＮＡに添加する。検出ヌクレオチドの１つが、配列決定の対象ＲＮＡとの間に４塩基対の二重螺旋を形成できる場合、Ｃｓｙ４タンパク質は、配列決定の対象ＲＮＡにのみ結合する。さらに、検出ヌクレオチドは、Ｃｓｙ４タンパク質が安定して結合するためには、配列決定の対象ＲＮＡ中の４塩基対認識配列の追加の３ヌクレオチド３’と塩基対を形成しなければならない。検出ヌクレオチドには、４ヌクレオチド認識配列の３ヌクレオチドの３’の拡張子が含まれる。検出ヌクレオチドのプールでは、３ヌクレオチド拡張子は、定義された５’ヌクレオチドを有し、その後ろに２つのランダムなヌクレオチド配列部位が続く；または５’の配列部位にランダムなヌクレオチドを有し、その後ろに定義されたヌクレオチドおよびランダムなヌクレオチドが続く；または５’末端に２つのランダムなヌクレオチドを有し、その後に定義されたヌクレオチドが続く。これらのプールのいずれにおいても、定義されたヌクレオチドは、付着した蛍光性分子（その発光または励起スペクトルはヌクレオチドによって定義されている）に基いて既知である。 Ｃｓｙ４タンパク質を、検出ヌクレオチドに付着した蛍光性分子の発光スペクトルとオーバーラップする励起スペクトルを有する量子ドットに付着させる。検出ヌクレオチドとＣｓｙ４が結合した後、過剰な試薬を洗い流す。検出ヌクレオチドが配列決定の対象ＲＮＡとの間に７ヌクレオチドの二重螺旋を形成した場合に限り、陽性結合事象が検出される。結合が発生した場合、配列決定の対象ＲＮＡ、検出ヌクレオチドおよびＣｓｙ４タンパク質の３要素から成る複合体を、検出ヌクレオチドに付着させた蛍光分子からＣｓｙ４タンパク質に付着させた量子ドットへのＦＲＥＴにより検出することができる。結合のサイクルが終わるごとに、Ｃｓｙ４タンパク質および検出ヌクレオチドを、化学変性および／または熱変性ならびに洗浄を使って試料から除去する。以降の配列決定ステップでは、異なる配列特異性の他のＣｓｙ４ タンパク質およびそれらに対応する検出ヌクレオチドを同様の方法で配列決定の対象ＲＮＡと一緒にインキュベートする。検出ヌクレオチド上での３ヌクレオチド拡張子の差異は、検出ヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかでの異なる長さの拡張子など、想定することができる。検出ヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはこれらのポリマーの化学修飾型、例えば、ＰＮＡまたはＬＮＡであってもよい。
実施例３：誘導配列特異的エンドリボヌクレアーゼ
生化学的および構造的技法を通じて、基質結合活性は維持しながら、開裂活性を欠くＣｓｙ４の点変異体を生成した。１つの例は上述したＣｓｙ４（Ｈ２９Ａ）変異体である。そのままでは触媒的に不活性な異性体Ｃｓｙ４（Ｈ２９Ａ）変異体を外因性イミダゾールの存在下では、再活性化させることができる。１５０ｍＭ から３００ｍＭの間でイミダゾールを反応緩衝液に添加するだけで、野生型に近い開裂活性を刺激するのに十分である。結果を図８に示す。図８は、イミダゾールによる救済を示す開裂活性アッセイである。Ｃｓｙ４Ｈ２９Ａは、ｋｄが１ｎM未満で、ＲＮＡ基質に対する結合能は維持しているＣｓｙ４の酵素的に不活性な変異体である。
反応の詳細：各１０μｌの反応液は、５ｐｍｏｌのｉｎ ｖｉｔｒｏで転写したｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ基質、１００ｐｍｏｌのＣｓｙ４ （図８に示されているように、ＷＴまたはＨ２９Ａ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍM ＫＣｌおよび前記のように、１５０〜３００ｍＭイミダゾールを含有する。反応は２５℃で３０分間実施した。産生物を酸性フェノールクロロホルム抽出し、 １５％変性ゲルで分離し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを使って可視化した。Ｃｓｙ４（Ｈ２９Ａ）の生化学的特性は、１ｎＭ未満の親和性でそのＲＮＡ基質と結合することを示している。
Ｃｓｙ４（Ｈ２９Ａ）は、現在、代わりになるアプローチが存在していないｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ のどちらの用途にも、有用である。
Ｃｓｙ４（Ｈ２９Ａ）（本明細書では「誘導」Ｃｓｙ４とも称する）は、ＲＮＡおよびＲＮＰの複合混合物（ＲＮＡタンパク質複合体）由来の特定のＲＮＡタンパク質複合体（ＲＮＰ）を精製する場合に有用である。例えば、研究者はどのタンパク質がある特定のＲＮＡ転写産物に結合するのか理解することに関心を持っているかもしれない。この系を使用すれば、研究者はステムループＣｓｙ４標的配列から成る５’タグを含む、選択したＲＮＡのための発現構築体を操作することができる。続いて、研究者がこの発現構築体を選んだ細胞種別に導入すれば、多くのＲＮＡおよびＲＮＰが生成される。続いて細胞を溶解し、溶解物をアガロースビーズビースに固定化された誘導Ｃｓｙ４を含むカラムに注入する。. Ｃｓｙ４標的配列を有するＲＮＡまたはＲＮＰが結合する。以降の洗浄ステップでは、非特異的に結合したＲＮＡを洗浄する。イミダゾール（〜３００mM）で洗浄すると、誘導Ｃｓｙ４が活性化し、標的配列を開裂し、結合したＲＮＡ／ＲＮＰが解放される。この方法は図９に概略が示されている。
同様の方法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＰを組み立てる場合にも有用になり得る。例えば、上記の実験のために設計した発現プラスミドと類似の構築体を使って、選択したＲＮＰをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写することもできる。（構築体は転写したＲＮＡの５’末端にてＣｓｙ４ステムループ標的配列を導入しなければならない）。続いて、このｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した産生物を既知のタンパク質と一緒にインキュベートするか、または懸濁して、特定の転写産物と結合させることができる。誘導Ｃｓｙ４含有カラムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成されたＲＮＰを遊離タンパク質から除去する目的にも使用することができる。.
実施例４
大半の細菌および古細菌に存在するＣＲＩＳＰＲ免疫系の必須成分（ｖａｎ ｄｅｒ Ｏｏｓｔら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ． ３４， ４０１−７（２００９））、エンドリボヌクレアーゼＣａｓＥによる特異的基質認識のための機構を確定した。構造的および生化学的方法を使って、最適な基質開裂のために必要とされる最小ＲＮＡ配列、７個の塩基対ステムループの後に２つの不対ヌクレオチドが続く２０ヌクレオチド配列 （５〜２４のＣＲＩＳＰＲ反復配列）を同定した。サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓＥに結合したこのＲＮＡ の構造をＸ線結晶学を使って、２．０Åの分解能で解明した。この構造は、ＲＮＡのメジャーグルーブにおける複数の相互作用も含めて、タンパク質とＲＮＡとの間の数多くの配列特異的接触を明らかにした。ステムループの末端塩基対は分断され、Ａ２２は螺旋から飛び出し、Ｕ２３によって塩基がスタックしている。この座位は、 Ｓ３４およびＥ３８との相互作用により部分的に安定化され、基質認識のための配列特異性も与えている。 末端ヌクレオチド、Ｇ２４を配置して、元に戻るように反転させ、ステムループと一致するが、残基Ｄ１８、Ｅ２４およびＫ３１で構成される結合ポケット内の螺旋のずっと下に常駐し、Ｒ２７がＵ２３とＧ２４との間にある骨格に接触するようにすることで、 cＡ２２およびＵ２３座位はさらなる安定化する。
Ａ２２を配置すると、解離しやすいリン酸塩の位置でＲＮＡの骨格が伸張し、２つの活性部位残基、Ｙ２３とＨ２６との間で広がる。この洞察およびＧ２４結合によりこのＲＮＡ座位が安定化したように見えることから、触媒座位にＲＮＡを配置するためには、Ｇ２４が必要とされる可能性があるという仮説を立てた。Ｇ２４結合に関与するタンパク質残基が変異した場合と同様、Ｇ２４が欠失または変異すると、開裂活性が著しく低下することは、この仮説と一致している。Ｇ２４の触媒ＲＮＡ座位を誘導する際のＧ２４の役割を確認するために、端末Ｇ２４残基を持たない１９ヌクレオチドＲＮＡに結合したＣａｓＥの構造を確定した。この複合体は２種類の異なる形に結晶化し、２つの異なるＲＮＡ座位タンパク質の活性部位を示した。１つの結晶形（Ｐ２１）において、２．５ Å 構造には、非対称単位に８分子が含まれた。８分子の全てにおいて、ステムループの残りと一緒にＡ型形状を維持しながら、Ａ２２塩基はＧ２１によってスタックしていることが明らかになった。ＲＮＡ構造の変化に加えて、タンパク質構造も２．０Å構造で観察された触媒座位から異なっている。この構造では、Ｒ１５８およびＫ１６０を含むループは、活性部位と並置しており、これらの残基が触媒作用においてまたは遷移状態中間の安定化において役割を果たしている可能性を示唆している。２．５ Å構造では、このループは活性部位から遠位にあり、部分的に無秩序化している。これはループの配置に柔軟性があることを示唆している。興味深いことに、このループは、ＣａｓＥのアポ構造でも無秩序であり （Ｅｂｉｈａｒａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． １５，１４９４−９ （２００６））、このループの安定化のためには、正確なＲＮＡ座位が必要であることを示唆している。
ＣａｓＥ／１９ヌクレオチドＲＮＡ複合体に対して得た第２の結晶形 （Ｐ２１２１２１）を使って、１．５ Å構造を確定した。これはＡ２２およびＵ２３が螺旋から飛び出した触媒配座でＲＮＡが結合していることを明らかにした。しかし、Ｒ１５８およびＫ１６０を含むループは、この構造中に無秩序状態で留まった。これは、このタンパク質構造の安定化に、Ｇ２４の結合も必要である可能性を示唆している。同一の複合体に対する２つの異なるＲＮＡ配座の洞察は、ＲＮＡが複数の構造状態をサンプリングする可能性およびＧ２４が触媒的に適切な座位にロックされることを必要とする可能性を示唆している。
本発明はその特定の実施形態に関して記載されているが、種々の変化を加えることが可能であり、そして等価物が本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく置き換えられ得ることが当業者によって理解されるべきである。さらに、本発明の目的、精神および範囲に対して、特定の状況、物質、組成物、プロセス、工程段階または工程に多くの改変を適合させることが可能である。このような改変の全てが本明細書に添付される特許請求の範囲内であるものとする。

Claims (35)

  1. 図６に規定したアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１０１又は配列ＩＤ番号：１０２）に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼであって、Ｈｉｓ−２９の位置にアミノ酸置換を含み、イミダゾールの非存在時には酵素的に不活性であり、イミダゾールの存在時には活性化可能である、変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
  2. アミノ酸置換がＨｉｓ２９からＡｌａ２９への置換である、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
  3. 検出可能なシグナルを提供する部分を含む、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
  4. 検出可能なシグナルを提供する部分が、フルオロフォア、量子ドット、エンドリボヌクレアーゼ以外の酵素、またはナノ粒子から選択される、請求項３に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
  5. 不溶性支持体上に固定化されてている、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
  6. 不溶性支持体がビーズである、請求項５に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
  7. ヌクレオチド配列５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：１）を含むＲＮＡ基質に結合する、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
  8. ヘアピン構造を有するＲＮＡ基質に結合し、ここでヘアピン構造のヌクレオチド１〜５および１１〜１５が塩基対形成して正規のＡ型螺旋ステムを形成する、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
  9. 請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  10. 請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
  11. 変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに操作可能な形で結合されている、請求項１０に記載の組換え発現ベクター。
  12. プロモーターが誘導プロモーターである、請求項１１に記載の組換え発現ベクター。
  13. 請求項１０に記載の組換え発現ベクターを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子修飾された宿主細胞。
  14. 核酸の混合ポピュレーション中に存在する標的ＲＮＡを精製するためのキットであり、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼを含むキット。
  15. 変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼが不溶性支持体上に固定化されている 請求項１４に記載のキット。
  16. ５’から３’の順番で、操作可能な結合で：
    ａ）請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合されるＲＮＡ基質をコードするヌクレオチド配列；
    ｂ）標的ＲＮＡをコードする核酸の挿入に適した多重クローニングサイト
    を含む組換え発現ベクターをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
  17. ＲＮＡ基質をコードするヌクレオチド配列がプロモーターに操作可能な形で結合されている、請求項１６に記載のキット。
  18. プロモーターが誘導プロモーターである、請求項１７に記載のキット。
  19. ＲＮＡ基質がヌクレオチド配列５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：１）を含む、請求項１６に記載のキット。
  20. 変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼがヘアピン構造を有するＲＮＡ基質に結合し、ここでヘアピン構造のヌクレオチド１〜５および１１〜１５が塩基対形成して正規のＡ型螺旋ステムを形成する、請求項１４に記載のキット。
  21. 組換え発現ベクターが、多重クローニングサイトに挿入された、標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載のキット。
  22. ａ）イミダゾール；
    ｂ）１つまたは複数の洗浄緩衝剤；及び
    ｃ）ポジティブコントロール発現ベクター
    の１つまたは複数をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
  23. 核酸の混合ポピュレーション中に存在する標的ＲＮＡを単離する方法であって、
    ａ）核酸の混合ポピュレーションを、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼに接触させ、タグ付けされた標的ＲＮＡ−固定化された変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ複合体を形成すること、ここで、変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼは不溶性支持体上に固定化されていて、核酸の混合ポピュレーションは、固定化された変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼにより特異的に結合される認識ヌクレオチド配列を含む、タグ付けされた標的ＲＮＡを含んでおり、前記接触はイミダゾールを含まない結合溶液中で実行される；
    ｂ）結合溶液に最終濃度が１００ｍＭから５００ｍＭになるようにイミダゾールを添加し、それにより、固定化した変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼを酵素的に再活性化する再活性化溶液を形成し、再活性化され、固定化された変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによりタグから標的ＲＮＡを開裂すること；および
    ｃ）放出された標的ＲＮＡを回収すること
    を含む方法。
  24. ステップ（ａ）の後で、かつステップ（ｂ）の前に実行される洗浄ステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 標的ＲＮＡに結合するポリペプチドを単離する方法であって、
    ａ）固定化された複合体を標的ＲＮＡに結合するポリペプチドを含む溶液に接触させること、ここで、前記固定化された複合体は、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼと、当該変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼが特異的に結合する認識ヌクレオチド配列を含むタグ付けされた標的ＲＮＡとを含み、前記接触によってポリペプチドが標的ＲＮＡに結合し、前記接触がイミダゾールを含まない結合溶液で実施されるものとする；および
    ｂ）結合したポリペプチドを溶出すること
    を含む方法。
  26. 真核細胞における標的ＲＮＡの産生を調節する方法であって、遺伝子修飾された宿主細胞と誘導プロモーターを活性化する薬剤とを接触させることを含み、ここで、
    前記遺伝子修飾された宿主細胞は、基質ポリリボヌクレオチドにおける配列特異的な開裂部位での開裂を触媒する酵素的に活性な配列特異的Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターで遺伝子修飾されており、
    前記酵素をコードするヌクレオチド配列は誘導プロモーターに操作可能な形で結合されており、誘導プロモーターの活性化により、酵素が細胞内で産生され、前記標的ＲＮＡが前駆体ＲＮＡから開裂される、方法。
  27. 標的ＲＮＡの種類が調節ＲＮＡである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前駆体ＲＮＡからの前記標的ＲＮＡの開裂により、前駆体ＲＮＡが不活性化される、請求項２６に記載の方法。
  29. 標的ポリリボヌクレオチドにおける特定配列を検出する方法であって、
    ａ）オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの二本鎖形成に有利な条件下において、標的ポリリボヌクレオチドを、前記特定配列を含むオリゴヌクレオチドプローブおよび酵素的に活性な配列特異的Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼに接触させること、ただし、ここで前記二本鎖はＣｓｙ４エンドリボヌクレアーゼにより開裂される；および
    ｂ）オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの特異的結合を検出すること、ただし、ここでオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの間の二本鎖形成の検出が、標的ポリリボヌクレオチドにおいて特定配列が存在することを表す；
    を含む方法。
  30. 標的ポリリボヌクレオチドが固体支持体上に固定化されている、請求項２９に記載の方法。
  31. オリゴヌクレオチドプローブがペプチドに結合され、前記ペプチドがＣｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによる二本鎖の開裂時に放出され、検出ステップが放出されたペプチドの検出を含む、請求項２９に記載の方法。
  32. 放出されたペプチドがそのペプチドに対して特異的な抗体への結合によって検出される、請求項２９に記載の方法。
  33. 抗体が固定化されている、請求項３２に記載の方法。
  34. 標的ポリリボヌクレオチドが病原体のポリリボヌクレオチドである、請求項２９に記載の方法。
  35. 酵素的に活性なＣｓｙ４エンドリボヌクレアーゼが、配列ＩＤ番号：６、８または９のいずれか一つに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。
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