EA024121B1 - Композиции эндорибонуклеаз и способы их использования - Google Patents

Композиции эндорибонуклеаз и способы их использования Download PDF

Info

Publication number
EA024121B1
EA024121B1 EA201291024A EA201291024A EA024121B1 EA 024121 B1 EA024121 B1 EA 024121B1 EA 201291024 A EA201291024 A EA 201291024A EA 201291024 A EA201291024 A EA 201291024A EA 024121 B1 EA024121 B1 EA 024121B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
zeg
ley
rna
azr
rgo
Prior art date
Application number
EA201291024A
Other languages
English (en)
Other versions
EA024121B9 (ru
EA201291024A1 (ru
Inventor
Рейчел Э. Хорвитц
Дженнифер А. Даудна
Блейк Виденхефт
Мартин Инек
Original Assignee
Дзе Реджентс Ов Дзе Юниверсити Ов Калифорния
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дзе Реджентс Ов Дзе Юниверсити Ов Калифорния filed Critical Дзе Реджентс Ов Дзе Юниверсити Ов Калифорния
Publication of EA201291024A1 publication Critical patent/EA201291024A1/ru
Publication of EA024121B1 publication Critical patent/EA024121B1/ru
Publication of EA024121B9 publication Critical patent/EA024121B9/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
    • C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение описывает вариант Csy4 эндорибонуклеазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант Csy4 эндорибонуклеазы, и клетки-носители, генетически модифицированные нуклеиновыми кислотами. Вариант Csy4 эндорибонуклеазы находит разные применения, которые также описаны. Настоящее изобретение также описывает способы детекции специфической последовательности в целевом полирибонуклеотиде и способы регуляции производства РНК-мишени в эукариотической клетке.

Description

Это изобретение было сделано при поддержке правительственного финансирования, грант № Т32 СМ07232, предоставленный Ναΐίοηαΐ 1п8Й1и1е οί НеаИЪ, а также грант № МСВ-0950971, предоставленный Ναΐίοηαΐ 8с1епсе Роипйайоп. Правительство обладает некоторыми правами на изобретение.
Уровень техники
ДНК-рестриктазы преобразовали молекулярную биологию в 1970-х гг., т.к. способны расщеплять определенные ДНК последовательности по своему усмотрению. Секвенсинг молекул РНК одновременно способствует синтезированию из РНК ДНК-нити, после чего секвенция происходит традиционными способами. Этот принцип, также известный как ΡΝΛ^ς. трудоемок, и считывание происходит с миллионов последовательностей. Тем не менее, синтез комплементарной ДНК представлен отклонениями от нормы, ввиду того, что результативность каждого считывания зависит от последовательности. Литература Саг1е е! а1. (2008) Сепек Эеу. 22:3489; и.8. Ра!еп! РиЬйсайоп Νο. 2010/0093026.
Настоящее изобретение обеспечивает различные Ску4 эндорибонуклеазы; нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант Ску4 эндорибонуклеазы; клетки-носители, генетически модифицированные нуклеиновыми кислотами. Вариант Ску4 эндонуклеазы находит разные применения, которые также обеспечены. Настоящее изобретение также обеспечивает способы определения специфической последовательности в искомом полирибонуклеотиде и способы регуляции производства целевой РНК в эукариотической клетке.
Краткое описание фигур
Фиг. 1А-С изображают специфическое распознавание субстрата пре-трансактивирующей РНК (ргесгРЛА) Ра14Ску4. Изображенная нуклеотидная последовательность - 5'-СииСАСиССССиАиАСССАССИААСААА-3' (8ЕО ГО N0:1).
Фиг. 2А-С изображают кристаллические структуры Ску4, связанные с РНК субстратом.
Фиг. 3А и 3В изображают детальный обзор каталитического центра Ску4 (фиг. 3А) и разделение активности Ску4 дикого типа и мутантных (фиг. 3В).
Фиг. 4 изображает инвариантные аминокислоты среди 12 последовательностей Ску4. Ра (8ЕО ГО N0:8); Υρ (8ЕО ГО N0:34); Ес89 (8ЕО ГО N0:39); Оп (8ЕО ГО N0:79); АЬ (8ЕО ГО N0:84); МР1 (8ЕО ГО N0:2); МР01 (8ЕО ГО N0:3); 8\Υ (8ЕО ГО N0:4); Рт (8ЕО ГО N0:85); 1% (8ЕО ГО N0: 13) и Эй (8ЕО ГО N0:10).
Фиг. 5А-5ВЭ представляют ряд аминокислотной последовательности различных Ску4 полипептидов, также как и нуклеотидные последовательности РНК распознаются каждым Ску4 полипептидом.
Фиг. 6 изображает примеры аминокислотных последовательностей ферментативно неактивных сайт-специфических эндорибонуклеаз.
Фиг. 7 изображает пример способа для определения специфической последовательности в целевом полирибонуклеотиде.
Фиг. 8 изображает активирующий эффект имидазола на различные варианты ферментативно неактивных Ску4.
Фиг. 9 изображает примерный способ изоляции искомой РНК. Показана целевая Ску4 стволовая петля (8ЕО ГО N0:103).
Фиг. 10 изображает примерный способ регуляции экспрессии целевой РНК в эукариотической клетке. Показана последовательность (8Е0 ГО N0:103) РНК субстрата Ску4.
Определения
Используемый здесь термин полирибонуклеотид означает полимерную форму рибонуклеотидов и включает РНК, РНК-содержащие дезоксирибунуклеотид(ы) и ДНК-содержащие рибонуклеотид(ы). Полирибонуклеотид в некоторых случаях может включать один или более модифицированных нуклеотидов (например, дезоксиинозин, дезоксиуридин или гидроксиметилдезоксиуридин). В некоторых случаях полирибонуклеотид состоит только из рибонуклеотидов (т.е., не включает какие-либо дезоксирибонуклеотиды). В некоторых случаях полирибонуклеотид содержит рибонуклеотиды, и один или более модифицированных рибонуклеотидов, и не содержит дезоксирибонуклеотидов. В других случаях, полирибонуклеотид содержит рибонуклеотиды, и может содержать один или более модифицированных рибонуклеотидов, и один или более дезоксирибонуклеотидов (включая модифицированные дезоксирибонуклеотиды). В некоторых случаях, когда полирибонуклеотид содержит один или более дезоксирибонуклеотидов, дезоксирибонуклеотиды содержат от около 50 до примерно 40%, от около 40 до примерно 30%, от около 30 до примерно 20%, от около 20 до примерно 10%, от около 10 до примерно 1% или менее 1% от общего количества нуклеотидов в полирибонуклеотиде.
Термины нуклеиновая кислота и полинуклеотид взаимозаменяемы и означают полимерную форму нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотидов, либо рибонуклеотидов, или же их аналогов. Неограниченные варианты полинуклеотидов включают линейные и кольцевые нуклеиновые ки- 1 024121 слоты, мессенджер РНК (мРНК), кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, векторы, зонды и праймеры.
Биологический образец охватывает разнообразие типов образцов, полученных из клетки, внеклеточного матрикса, ткани или многоклеточного организма. Определение охватывает кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, твердые тканевые образцы, такие как образцы биопсии или тканевой культуры, или клетки, полученные из культуры и их предшественники. Определение также включает образцы, над которыми уже производились действия после их получения, такие как обработка реактивами, погружение в растворы или добавления компонентов, таких как полинуклеотиды. Термин биологический образец охватывает клинические образцы, а также включает клетки в культуре, клетки из надосадочной жидкости, клеточный лизат, сыворотку, плазму, биологическую жидкость (например, цереброспинальная жидкость, жидкость бронхоальвеолярных выделений, моча, кровь, фракции крови (например, плазма, сыворотка), слюна и подобные) и образцы тканей. В некоторых случаях биологический образец включает клетки, в некоторых - нет.
Термин функционально связанный означает функциональную связь между молекулами для обеспечения необходимой функции. Например, термин функционально связанные, в контексте нуклеиновых кислот означает функциональную связь между нуклеиновыми кислотами для обеспечения необходимых функций, таких как транскрипция, трансляция и подобных, например функциональная связь между последовательностью (такой как промотор, сигнальная последовательность или порядок сайтов связывания фактора транскрипции), контролирующей экспрессию нуклеиновой кислоты и вторым полинуклеотидом, когда последовательность, контролирующая экспрессию влияет на транскрипцию и/или трансляцию второго полинуклеотида. Термин функционально связанный в контексте полипептида означает функциональную связь аминокислотных последовательностей (например, из разных доменов) для обеспечения описанного действия полипептида.
Термин изолированный означает протеин или нуклеиновую кислоту, которые, если образуются естественным путем, находятся в среде, отличной от той, в которой они могли образоваться естественным путем. Изолированный, значит содержащий протеины или нуклеиновые кислоты, находящиеся в образцах, которые в значительной степени включают интересующий протеин или нуклеиновую кислоту, и/или в которых интересующий протеин или нуклеиновая кислота частично или в значительной степени химически чисты. Там, где протеин или нуклеиновая кислота возникают неестественным путем, термин изолированный обозначает протеин или нуклеиновую кислоту, которые отделены от среды, в которой возникли синтетическими или рекомбинантными путями.
Термин практически чистый означает, что объект (например, полипептид или нуклеиновая кислота) составляет более чем 50% общего состава композиции (например, общего белка композиции) и обычно более чем 60% от общего содержания белка. В некоторых вариантах воплощения практически чистый относится к композициям, в которых по меньшей мере 75%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или более от общего состава является объектом интереса (например, 95% от общего белка). В некоторых вариантах воплощения белок или нуклеиновая кислота, представляющие интерес, будут составлять больше чем примерно 90%, больше чем примерно 95%, больше чем примерно 98% или больше чем примерно 99% общего белка или нуклеиновой кислоты в композиции.
Перед дальнейшим описанием изобретения следует отметить, что это изобретение не ограничивается описанием частных случаев, которые конечно могут быть разными. Также следует понять, что используемая терминология подходит только для описания конкретных вариантов воплощения, и не является предметом ограничений, поскольку масштаб настоящего изобретения ограничен только представленной формулой изобретения.
В тех местах, где представлен диапазон значений, очевидно, что каждое промежуточное значение, вплоть до десятых долей единицы нижнего предела, если в тексте не указывается обратное, между верхним и нижним пределом диапазона или другим указанным или промежуточным значением в указанном диапазоне, находится в рамках изобретения. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут независимо включаться в меньшие диапазоны, также находиться в рамках изобретения, и могут быть исключены из указанного диапазона. Там, где указанный диапазон включает один или два предела, диапазон, исключающий любой из двух или оба этих включенных предела, также включен в изобретение.
Если не указано обратное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, что и используемые в области, к которой принадлежит изобретение. Хотя некоторые способы и материалы, похожие или эквивалентные описанным здесь, могут быть использованы на практике или тестировании настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны в данной работе. Все публикации, упомянутые здесь, объединены описанием для раскрытия и характеристики способов и/или материалов, в связи с которыми и приводятся эти публикации.
Следует отметить, что используемые здесь и в представленных формулах изобретения артикли в единственном числе используются и во множественном, если в тексте не указано обратное. Т.е., например, использование термина сайт-специфичная эндорибонуклеаза указывает и на множественное число таких сайт-специфичных эндорибонуклеаз, а использование термина целевой полирибонуклеотид указывает на один или более целевых полирибонуклеотидов или их эквивалентов, известных специалистам в этой области и так далее. Также отмечено, что формула изобретения может быть разработана для ис- 2 024121 ключения других дополнительных элементов. Т.е., это утверждение может быть основой для использования такой исключающей терминологии как исключительно, только и подобных в связи с перечислением элементов формулы изобретения или для использования отрицательных ограничений.
Материалы, представленные здесь, опубликованы исключительно до подачи настоящей заявки. Ничто здесь не должно быть истолковано как признание того, что данное изобретение не имеет права задним числом на такие публикации до вступления в силу предшествующего изобретения. В дальнейшем, представленные даты публикации могут отличаться от даты реальной публикации, которая может быть подтверждена независимо.
Детальное описание изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает вариант С§у4 эндорибонуклеазы, нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант С§у4 эндорибонуклеазы и содержащие их клетки, генетически модифицированные нуклеиновыми кислотами. Вариант С§у4 эндорибонуклеазы находи т разные применения, которые также обеспечены. Настоящее изобретение также обеспечивает способы определения специфических последовательностей в искомых полирибонуклеотидах и способы регуляции производства целевой РНК в эукариотической клетке.
Методы определения последовательности в целевом полирибонуклеотиде
Настоящее изобретение описывает способ определения последовательности в целевом полирибонуклеотиде. Способы полезны для определения наличия определенной последовательности в полирибонуклеотиде и, как следствие, могут быть использованы для определения полирибонуклеотида, содержащего определенную последовательность. Например, способ может быть использован для определения наличия полирибонуклеотида патогена в образце (например, в биологическом образце).
Этим способом можно определить только около 100 копий, вплоть до определения каждой копии искомого полирибонуклеотида. Таким образом, к примеру, этот способ позволяет определить от около 1 до примерно 5, от около 5 до примерно 10, от около 10 до примерно 50, от около 50 до примерно 100, или более чем 100 копий искомого полирибонуклеотида в образце (например, в одиночной клетке, одиночном эмбрионе или другом биологическом образце). Таким образом, этот метод применим в различных судебных, исследовательских, диагностических целях.
В некоторых вариантах воплощения способ определения специфической последовательности в полирибонуклеотиде включает: а) взаимодействие целевого полирибонуклеотида с олигонуклеотидным зондом, содержащим специфическую последовательность и ферментативно активную сайтспецифическую С§у4 эндорибонуклеазу, в условиях, способствующих образованию дуплекса между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом, где дуплекс расщепляется С§у4 эндорибонуклеазой; и Ь) определение специфического связывания между олигонуклеотидным зондом и искомым полирибонуклеотидом, где определение образования дуплекса между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом указывает на присутствие специфической последовательности в целевом полирибонуклеотиде.
В некоторых случаях олигонуклеотидный зонд связан с пептидом, и пептид высвобождается при расщеплении дуплекса С§у4 эндорибонуклеазой; в этих случаях на этапе определения детектируется и высвободившийся пептид. Например, высвободившийся пептид определен связыванием с антителом, специфичным для пептида, например, когда антитело иммобилизированно. В некоторых вариантах воплощения, полирибонуклеотид иммобилизирован на твердом носителе. Искомые полирибонуклеотиды включают вариант полинуклеотиды, например, искомый полирибонуклеотид может быть полирибонуклеотидом патогена.
Как сказано выше, в некоторых вариантах воплощения, антитело или искомый полинуклеотид иммобилизированы на твердом носителе (нерастворимый носитель). Подходящие нерастворимые носители включают, но не ограничиваются этим, агарозные шарики, магнитные шарики, тестовые полоски, многолуночные планшеты и им подобные. Нерастворимый носитель может включать различные вещества (стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, натуральную и модифицированную целлюлозу, полиакриламиды, агарозы и магнетит) и может быть представлен в различных формах, включая, например, агарозные шарики, полистирольные шарики, латексные шарики, магнитные шарики, коллоидные металлические частицы, стеклянные и/или кремниевые пластинки и поверхности, нитроцеллюлозные полоски, нейлоновые мембраны, листы, лунки реакционных лотков (например, мультилуночные планшеты), пластиковые трубки и т.д.
В некоторых вариантах воплощения, в общем, способ включает:
a) взаимодействие искомого полирибонуклеотида с сайт-специфической эндорибонуклеазой и
b) определение продуктов расщепления в результате сайт-специфической реакции расщепления целевого полирибонуклеотида, когда выход продуктов расщепления, ожидаемых в реакции расщепления специфической последовательности в полирибонуклеотиде, указывает на присутствие специфической последовательности.
В других вариантах воплощения способ определения последовательности в искомом полирибонуклеотиде включает:
а) взаимодействие искомого полирибонуклеотида с: ί) сайт-специфической эндорибонуклеазой и ίί)
- 3 024121 олигонуклеотидным зондом, содержащим связанную определяемую функциональную группу, когда олигонуклеотидный зонд содержит специфическую известную нуклеотидную последовательность; в то время как образец олигонуклеотида формирует дуплекс с комплементарной последовательностью искомого полирибонуклеотида, основанный на связывании известной нуклеотидной последовательности, присутствующей в олигонуклеотидном зонде, с комплементарной последовательностью в искомом полирибонуклеотиде, и где сайт-специфическая эндорибонуклеаза расщепляет дуплекс путем, специфическим для последовательности, таким образом высвобождая определяемую функциональную группу из олигонуклеотидного зонда; и
Ь) определение высвободившейся определяемой функциональной группы, в то время как высвобождение определяемой функциональной последовательности указывает на присутствие специфической последовательности. В некоторых вариантах воплощения используются два или более разных олигонуклеотидных зонда, каждый из которых содержит разную специфическую известную нуклеотидную последовательность.
В некоторых вариантах воплощения определяемая функциональная группа является полипептидом. Полипептид может быть определен с использованием иммунологического теста (например, тест на фермент-связанный иммуносорбент (ЕЬ1§А); радиоиммунотест (ΚΙΑ) и т.д.), использование антитела, специфичного для определения функциональной группы полипептида. Антитело, специфичное для определения полипептидной функциональной группы может включать определяемый маркер. Иммуннотест может быть выполнен с использованием тестовой полоски (например, в проточном тесте) или другой подходящей среде, такой как мультилуночный планшет.
В некоторых вариантах воплощения, определяемая функциональная группа - флуоресцирующие белки, описание которых включено в документ. В других вариантах воплощения определяемая функциональная группа - люциферин или другой субстрат для люциферазы. Подходящие люциферины или другие люциферазные вещества включают, например, люциферин (например, люциферин светлячка), аминолюциферин; коэлентирозин; модифицированный коэлентирозин, описанный в патенте США № 7537912: аналог коэлентирозина, описанный в патенте США № 2009/0081129 (например, мембранпроникающий аналог коэлентирозина, описанный в патенте США № 2009/0081129, например, одна из структур II, III, IV, V и VI патента США № 2009/0081129); аминолюциферин; дигидролюциферин; люциферин 6' метилэфир; или люциферин 6' хлорэтилэфир. См., например, Вгапсшц В.К. е! а1. Апа1. ВюсНет. 2010, 396, 290-296 и Ме//апо11е Ь. е!. а1., Ση νίνο Ью1итте8сепсе ипадшд о£ тигше хеподгай сапсег тобек \\ί11ι а геб-кЫйеб (НегтоЧаЫе Шсйегазе. Мо1. Ппадшд Βίο! (2009, Νον. 9, опйпе; РиЬМеб ГО: 19937390).
Неограничивающий пример использования способа определения схематически представлен на фиг. 7. В примере, изображенном на фиг. 7, небольшие олигонуклеотиды, которые связывают дискретные области искомого полинуклеотида (например, вирусная РНК), контактируют с искомым полинуклеотидом, тогда как олигонуклеотиды включают определяемые функциональные группы (например, лиганды; пептиды и т.д.). Также приведена последовательность ферментативно активной сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции (РКЕ), которая помечает комплекс олигонуклеотид/вирусная РНК. Фермент расщепляет комплекс олигонуклеотид/вирусная РНК и лиганды становятся доступны для определения. Фермент расщепляет последующие дуплексы, таким образом, усиливая сигнал. Высвобожденные лиганды определяются проточным (например, тестовыми полосками) или иммунологическим методом (например, ЕЫ§А).
Необходимая сайт-специфическая эндорибонуклеаза ферментативно активна. Эндорибонуклеазы, пригодные для использования в данном способе определения, включают эндорибонуклеазы, которые связываются с субстратом полирибонуклеотида и расщепляют его в зависимости от последовательности, включая ферментативно активные полипептиды, которые имеют по меньшей мере на около 85%, по меньшей мере на около 90%, по меньшей мере на около 95%, по меньшей мере на около 98%, по меньшей мере на около 99%, или на 100% идентичную последовательность в наборе аминокислот, изображенных на фиг. 4 (С§у4 аминокислотная последовательность).
Эндорибонуклеазы, которые подходят для использования в данном способе определения, включают эндорибонуклеазы, которые связываются с и расщепляют субстрат полирибонуклеотида, в зависимости от последовательности, включая ферментативно активные полипептиды, которые имеют по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или на 100% идентичную последовательность в наборе аминокислот, изображенных на фиг. 5 (С§у4 аминокислотная последовательность). На фиг. 5 изображена последовательность, специфически связанная различными эндорибонуклеазами. В некоторых случаях подходящая сайт-специфическая ферментативно активная С§у4 эндорибонуклеаза может включать аминокислотную последовательность С§у4 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5.
Эндорибонуклеазы, которые подходят для использования в данном способе определения, включают эндорибонуклеазы, которые связываются с и расщепляют субстрат полирибонуклеотида, в зависимости от последовательности, включая ферментативно активные полипептиды, которые отличаются от аминокислотной последовательности в одной из фиг. 4 или 5 на от 1 до 20 (например, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19 или 20) замещенных аминокислот, и/либо дополнительно включенных,
- 4 024121 и/либо отсутствующих.
Целевой полирибонуклеотид для определения может присутствовать в образце, например биологическом образце, таком как кровь, компонент крови (например, плазма), моча, цереброспинальная жидкость, жидкость бронхоальвеолярного секрета, слюна, ткань, клетки и т.д. Целевой полирибонуклеотид может быть изолирован или очищен. Целевой полирибонуклеотид может быть мессенджером РНК (мРНК), вирусной РНК, бактериальной РНК, паразитной РНК или другим типом РНК. Вирусные РНК включают, но не ограничиваются этим, любой компонент флавивирида, например, вирус гепатита С, вирус лихорадки Денге, вирус желтой лихорадки, вирус западного Нила и т.д.; любой компонент Ретровирида; вирус иммунодефицита (например, вирус иммунодефицита человека) и т.д.
Целевой полирибонуклеотид для определения может присутствовать в клетке многоклеточного организма (или может быть получен из клетки многоклеточного организма).
Целевой полирибонуклеотид для определения может присутствовать в или быть получен из клетки организма любого из 6 царств, например бактерии (например, эубактерии); архебактерии; одноклеточные; грибы; растения и животные. Подходящий источник целевого полирибонуклеотида включает растениеподобных представителей из царства одноклеточных, включая, но не ограничиваясь этим, водоросли (например, зеленые водоросли, красные водоросли, глаукофитовые водоросли, цианобактерии); грибоподобных представителей одноклеточных, например, слизевиков, оомицетов и т.д.; животноподобных представителей одноклеточных, например, жгутиконосцы (например, эвглена), саркодовые (например, амеба), апикомплексы (например, апикомплекса, миксозоа, микроспоридия) и инфузории (например, парамеция). Подходящий источник искомых полирибонуклеотидов включает представителей царства грибы, включающих, но не ограничивающихся этим, представителей групп: базидиомицеты (клавароидные грибы: например, представители агариковых, аманитовых, болетовых, лисичковых и т.д.); аскомицеты (сумчатые грибы, включая, например, сахаромицеты); микофитофиты (лишайники); зигомицеты и дейтеромицеты. Подходящий источник для целевых полирибонуклеотидов включает представителей царства растения, включая, но не ограничиваясь этим, представителей любых из следующих таксонов: бриофиты (например, мхи), антоцеротофиты (например, антоцеротовидные), гепатикофиты (например, печеночные мхи), ликофиты (например, плауновидные), сфенофиты (например, хвощи), псилофиты (например, риниофиты), офиоглоссофиты, птерофиты (например, папоротниковидные), цикадофиты, гинкгофиты, пинофиты, гнетофиты и магнолиевые (например, цветковые растения). Подходящий источник для целевых полирибонуклеотидов включает представителей царства животные, включая, но не ограничиваясь этим, представителей любых из следующих таксонов: порифера (губки), пластинчатые, ортонектиды (паразиты морских беспозвоночных); дициемиды, стрекающие (кораллы, актинии, медузы, морское перо, морские анютины глазки, кубомедуза), ктенофора (гребневики); платегельминты (плоские черви); немертины (ленточные черви); гнатостомулиды; гастротрихии, коловратки, приапулиды, киноринхии, лорициферы, скребни, внутрипорошициевые; нематоды; волосатики; циклиофоры, моллюски; сипункулиды; аннелиды (кольчатые черви); тихоходки (водяные медведи); онихофоры (бархатные черви); членистоногие (включая таксоны низшего порядка: хелицеровые, многоножки, шестиногие и ракообразные, при этом хелицеровые включают, например, паукообразные, меростоматовые, морские пауки, при этом многоножки включают, например, губоногие (сороконожки), двупарноногие(многоножки), параподии и симфилы, при этом шестиногие включают насекомых, ракообразные включают креветок, криль, усоногих и т.д.; форониды; мшанки; плеченогие; иглокожие (например, морская звезда, ксилоплакса, морские лилии, морские ежи, морские огурцы, офиуры, эуриалины и т.д.); щетинкочелюстные (морские стрелки); хемихордаты (полухордовые черви); и хордовые. Подходящие представители хордовых включают любых представителей следующих низших таксонов: оболочники (включая асцидий, сальп и аппендикулярий); головохордовые (ланцетники); миксины; и позвоночные, включая представителей, например, петромизантиды (миноги), хондрихтии (хрящевые рыбы), актиноптеригии (лучеперстные рыбы), актинисты (целакантообразные), двоякодышащие, рептилии (например, змеи, аллигаторы, крокодилы, ящерицы и т.д.), птицы и млекопитающие. подходящие растения включают любых представителей однодольных или двудольных.
Таким образом, например, целевой полирибонуклеотид может присутствовать или быть получен из клеток организма, который включает, но не ограничивается этим, простейшее, растение, гриб, клетку водоросли, дрожжи, рептилию, амфибию, млекопитающее, морской микроорганизм, морское беспозвоночное, членистоногое, равноногое, насекомое, паукообразное, архебактерию и эубактерию.
Целевой полирибонуклеотид может присутствовать или быть получен из нечеловеческого эмбриона, например эмбриона дрозофилы, эмбриона данио-рерио, мышиного эмбриона и т.д.
Целевой полирибонуклеотид может присутствовать или быть получен из стволовой клетки, например стволовой клетки ίη νίΐτο, нечеловеческой стволовой клетки и т.д. Подходящие стволовые клетки включают стволовые клетки эмбриона, стволовые клетки взрослого и стимулированные плюрипотентные клетки (ίΡδ).
В некоторых вариантах воплощения целевой полирибонуклеотид будет изолирован от ткани организма; от конкретной клетки или группы клеток, изолированных от организма и т.д. Например, если организм - растение, искомый полирибонуклеотид будет в некоторых вариантах воплощения изолирован из
- 5 024121 ксилемы, лубяной ткани, камбия, листьев, корней и т.д. Если организм - животное, искомый полирибонуклеотид будет в некоторых вариантах воплощения изолирован из конкретной ткани (например, легкого, печени, сердца, почки, головного мозга, селезенки, кожи, фетальной ткани и т.д.) или конкретного типа клеток (например, нейронов, эпителиальных клеток, эндотелиальных клеток, астроцитов, макрофагов, клеток глии, островковых клеток, Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и т.д.).
Способы регуляции производства целевой РНК
Представленное изобретение описывает способ регуляции производства целевой РНК в клетке. В общем, способ включает в себя взаимодействие генетически модифицированной клетки-носителя с реагентом, который активирует индуцируемый промотор, в то время как генетически модифицированная клетка-носитель генетически модифицирована рекомбинантным вектором экспрессии, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую фермент, который катализирует расщепление в сайте расщепления определенной последовательности субстрата полирибонуклеотида, в то время как ферменткодирующая нуклеотидная последовательность активно связана с индуцируемым промотором, и при этом, в результате активации индуцируемого промотора, фермент продуцируется в клетке и расщепляет оговоренную целевую РНК из РНК-предшественника.
Фиг. 10 схематически изображает примерный способ регуляции производства целевой РНК. На фиг. 10 эндогенная целевая РНК модифицирована и включает С§у4 РНК субстрат (например, СииСАСиССССиАИАСССАС (НЕС) ГО N0: 103); или 8ЕЦ ГО N0:1) в 3' нетранслируемой зоне (3' ИТЕ). Экспрессия С§у4 в клетке-носителе ведет к связыванию и расщеплению РНК субстрата. В этот момент расщепленная РНК теряет свой полиА хвост и распадается.
Например, в некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение описывает способ регуляции производства целевой РНК в эукариотической клетке, в то время как способ включает взаимодействие генетически модифицированных клеток-носителей с реагентом, который активирует индуцированный промотор, в то время как генетически модифицированная клетка-носитель генетически модифицирована рекомбинантным вектором экспрессии, включающим нуклеотидную последовательность, кодирующую ферментативно активную сайт-специфическую С§у4 эндорибонуклеазу, которая катализирует расщепление сайта расщепления в определенной последовательности субстрата полинуклеотида, тогда как фермент-кодирующая нуклеотидная последовательность активно связана с индуцируемым промотором, и при этом, в результате активации индуцируемого промотора, фермент продуцируется в клетке и расщепляет оговоренную целевую РНК из РНК-предшественника. В некоторых случаях вид искомой РНК - регуляторная РНК. В некоторых случаях расщепление указанной целевой РНК из РНК-предшественника инактивирует РНК-предшественник.
Подходящая сайт-специфическая эндорибонуклеаза ферментативно активна.
Эндорибонуклеазы, которые подходят для использования способом регуляции производства целевой РНК, включают эндорибонуклеазы, которые связываются с и расщепляют субстрат полирибонуклеотида в сайт-специфической манере, включая ферментативно активные полипептиды, имеющие по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 или 100% аминокислотную последовательность, идентичную набору аминокислот на фиг. 4 (С§у4 аминокислотная последовательность).
Эндорибонуклеазы, которые подходят для использования в способе регуляции производства целевой РНК, включают эндорибонуклеазы, которые связываются с и расщепляют субстрат полирибонуклеотида, в сайт-специфической манере, включая ферментативно активные полипептиды, которые содержат по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 или 100% аминокислотную последовательность идентичную аминокислотной последовательности на фиг. 5 (С§у4 аминокислотную последовательность). Фиг. 5 предлагает сайт-специфические последовательности, связанные различными эндорибонуклеазами.
Эндорибонуклеазы, которые подходят для использования в способе регуляции производства целевой РНК, включают эндорибонуклеазы, которые связываются с и расщепляют субстрат сайтспецифического полирибонуклеотида, включая ферментативно активные полипептиды, которые отличаются от аминокислотной последовательности на любой из фиг. 4 или 5 на от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16,17, 18,19 или 20) замещенных аминокислот и/или дополнительно включенных, и/или отсутствующих.
Подходящий индуцированный промотор может включать промотор, который функционирует в эукариотической клетке. Подходящий индуцированный промотор известен в данной области техники. Например, подходящий индуцированный промотор включает, но не ограничивается, САЕ1 промотор, САЬ10 промотор, АЭН2 промотор, РНО5 промотор, СИР1 промотор, САЬ7 промотор, МЕТ25 промотор, МЕТ3 промотор, СУС1 промотор, Н183 промотор, АЭН1 промотор, РСК промотор, САРЭН промотор, АЭС1 промотор, ТЕР1 промотор, ИЕА3 промотор, ЬЕШ промотор, ΕΝΟ промотор, ТР1 промотор и АОХ1. Подходящие индуцированные промоторы включают тетрациклин-индуцированные промоторы; металлотионеиновый промотор; тетрациклин-индуцированные промоторы, метионин-индуцированные промоторы; галактоза-индуцированные промоторы, которые хорошо известны в данной области техники. Другие подходящие промоторы включают промотор АЭН2 алкогольдегидрогеназу (инактивированный в
- 6 024121 глюкозе, индуцированный в условиях, когда этанола образуется больше, чем имеется глюкозы) и промотор СиР1 металлотионеиновый (индуцированный в присутствии Си2+, Ζη2+).
Реагенты, которые индуцируют любой имеющийся индуцированный промотор, известны в данной области техники. Например, тетрациклин-регулируемые промоторы могут регулироваться тетрациклином или доксициклином; углеводы могут быть использованы для индукции углевод-индуцируемых промоторов (например, галактоза для галактоза-индуцируемого промотора); метионин может быть использован для индукции метионин-индуцируемого промотора; металлы могут быть использованы для индукции металлотионеинового промотора.
Целевая РНК может быть регуляторной РНК. Регуляторные РНК хорошо известны в данной области техники и включают, например, микро-РНК, РНК, образующие шпильки (δΙιΡΝΑ), и подобные.
В некоторых вариантах воплощения отщепление целевой РНК от предшественника РНК инактивирует предшественника РНК.
Генетически модифицированная клетка-носитель может быть клеткой ίη νίίτο, например прокариотическая клетка или эукариотическая клетка (например, клетка млекопитающего, включая исходные клетки, трансформированные клеточные линии и подобные). Генетически модифицированная клетканоситель может быть клеткой ίη νίνο. В некоторых случаях клетка ίη νίνο является нечеловеческой клеткой.
Генетически модифицированная клетка-носитель может быть клеткой многоклеточного организма (или может быть получена из клетки многоклеточного организма).
Генетически модифицированная клетка-носитель может быть клеткой, полученной от или присутствующей в организме любого из 6 царств, например, бактерии (например, эубактерии); архебактерии; одноклеточные; грибы; растения и животные. подходящие организмы включают растениеподобных представителей из царства одноклеточных, включая, но не ограничиваясь этим, водоросли (например, зеленые водоросли, красные водоросли, глаукофитовые водоросли, цианобактерии); грибоподобных представителей одноклеточных, например, слизевиков, оомицетов и т.д.; животноподобных представителей одноклеточных, например, жгутиконосцы (например, эвглена), саркодовые (например, амеба), апикомплексы (например, апикомплекса, миксозоа, микроспоридия) и инфузории (например, парамеция). Подходящие организмы включают представителей царства грибы, включающих, но не ограничивающихся этим, представителей групп: базидиомицеты (клавароидные грибы: например, представители агариковых, аманитовых, болетовых, лисичковых и т.д.); аскомицеты (сумчатые грибы, включая, например, сахаромицеты); микофитофиты (лишайники); зигомицеты и дейтеромицеты. подходящие организмы включают представителей царства растения, включая, но не ограничиваясь этим, представителей любых из следующих таксонов: бриофиты (например, мхи), антоцеротофиты (например, антоцеротовидные), гепатикофиты (например, печеночные мхи), ликофиты (например, плауновидные), сфенофиты (например, хвощи), псилофиты (например, риниофиты), офиоглоссофиты, птерофиты (например, папоротниковидные), цикадофиты, гинкгофиты, пинофиты, гнетофиты и магнолиевые (например, цветковые растения). подходящие организмы включают представителей царства животные, включая, но не ограничиваясь этим, представителей любых из следующих таксонов: порифера (губки), пластинчатые, ортонектиды (паразиты морских беспозвоночных); дициемиды, стрекающие (кораллы, актинии, медузы, морское перо, морские анютины глазки, кубомедуза), ктенофора (гребневики); платегельминты (плоские черви); немертины (ленточные черви); гнатостомулиды; гастротрихии, коловратки, приапулиды, киноринхии, лорициферы, скребни, внутрипорошициевые; нематоды; волосатики; циклиофоры, моллюски; сипункулиды; аннелиды (кольчатые черви); тихоходки (водяные медведи); онихофоры (бархатные черви); членистоногие (включая таксоны низшего порядка: хелицеровые, многоножки, шестиногие и ракообразные, при этом хелицеровые включают, например паукообразные, меростоматовые, морские пауки, при этом многоножки включают, например, губоногие (сороконожки), двупарноногие (многоножки), параподии и симфилы, при этом шестиногие включают насекомых, ракообразные включают креветок, криль, усоногих и т.д.; форониды; мшанки; плеченогие; иглокожие (например, морская звезда, ксилоплакса, морские лилии, морские ежи, морские огурцы, офиуры, эуриалины и т.д.); щетинкочелюстные (морские стрелки); хемихордаты (полухордовые черви); и хордовые. Подходящие представители хордовых включают любых представителей следующих низших таксонов: оболочники (включая асцидий, сальп и аппендикулярий); головохордовые (ланцетники); миксины; и позвоночные, включая представителей, например, петромизантиды (миноги), хондрихтии (хрящевые рыбы), актиноптеригии (лучеперстные рыбы), актинисты (целакантообразные), двоякодышащие, рептилии (например, змеи, аллигаторы, крокодилы, ящерицы и т.д.), птицы и млекопитающие. Подходящие растения включают любых представителей однодольных или двудольных.
Таким образом, например, генетически модифицированная клетка-носитель может быть клеткой, полученной из или существующей в простейшем, растении, грибе, клетке водоросли, дрожжах, рептилии, амфибии, млекопитающем, морском микроорганизме, морском беспозвоночном, членистоногом, равноногом, насекомом, паукообразном, архебактерии и эубактерии.
Подходящие клетки млекопитающего включают исходные клетки и иммортализованные клеточные линии. Подходящие клеточные линии млекопитающих включают человеческие клеточные линии, нече- 7 024121 ловеческие клеточные линии приматов, клеточные линии грызунов (например, мышь, крыса) и подобные. Подходящие клеточные линии млекопитающих включают, но не ограничиваются этим, клетки НеЬа (например Атепсап Туре СиЙиге Со11есйоп (АТСС) № ССЬ-2), СНО клетки (например, АТСС Νοδ. СКЬ9618, ССЬ61, СКЬ9096), 293 клетки (например, АТСС № СКЬ-1573), Уего клетки, ΝΙΗ 3Т3 клетки (например, АТСС № СКЬ-1658), Ний-7 клетки, ВНК клетки (например, АТСС№ ССЬ10), РС12 клетки (АТСС № СРЙ1721). СО8 клетки, СО8-7 клетки (АТСС № СРЙ1651). КАТ1 клетки, мышиные Ь клетки (АТСС № ССЫ3), клетки почки эмбриона человека (НЕК) (АТСС № СКЬ1573), НЬНерО2 клетки и подобные.
Генетически модифицированная клетка-носитель может быть клеткой, полученной из или присутствующей в нечеловеческом эмбрионе, например, эмбрионе дрозофилы; эмбрионе данио-рерио; мышином эмбрионе и т.д.
Генетически модифицированная клетка-носитель может быть стволовой клеткой, например стволовой клеткой ίη νίίτο; нечеловеческой стволовой клеткой и т.д. Подходящие стволовые клетки включают стволовые клетки эмбриона, стволовые клетки взрослого организма и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (тР8).
Способы изолирования целевой нуклеиновой кислоты
Настоящее изобретение представляет способы изолирования искомой нуклеиновой кислоты из смеси нуклеиновых кислот. В общем, способы включают:
а) взаимодействие смеси нуклеиновых кислот с иммобилизированной сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазой, в которой смесь нуклеиновых кислот включает целевую нуклеиновую кислоту, содержащую меченую (или распознаваемую) нуклеотидную последовательность, которая специфически связана иммобилизированной сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазой, так что целевая нуклеиновая кислота, содержащая меченую нуклеотидную последовательность (узнаваемая целевая нуклеиновая кислота), связывается с иммобилизированной сайтспецифической ферментативно неактивной эндорибонуклеазой, формируя комплекс узнаваемая целевая нуклеиновая кислота/иммобилизированная сайт-специфическая ферментативно активная эндорибонуклеаза, в котором этапы взаимодействия протекают в жидком растворе (связывающий раствор); и
й) посредством добавления имидазола к жидкому раствору в завершающей концентрации от около 100 до около 500 мМ (например, от около 100 мМ до около 150 мМ, от около 150 мМ до около 200 мМ, от около 200 мМ до около 250 мМ, от около 250 мМ до около 300 мМ, от около 300 мМ до около 350 мМ, от около 350 мМ до около 400 мМ, от около 400 мМ до около 450 мМ, от около 450 мМ до около 500 мМ), таким образом, формируя активационный раствор, который ферментативно возобновляет ферментно неактивную эндорибонуклеазу так, что эндорибонуклеаза становится ферментативно активной и отщепляет целевую нуклеиновую кислоту от меченой нуклеотидной последовательности, таким образом высвобождая целевую нуклеиновую кислоту. Фиг. 9 схематически изображает примерный способ изолирования целевой РНК.
Способ в дальнейшем может включать один или два очищающих этапа.
Например, после этапа (а) и перед этапом (й), иммобилизированная сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза, которая содержит связанную целевую нуклеиновую кислоту, содержащую меченую нуклеотидную последовательность, может быть дополнительно очищена один или два раза связывающим раствором, так что целевая нуклеиновая кислота остается связанной с сайтспецифической ферментативно неактивной эндорибонуклеазой и любые несвязанные нуклеиновые кислоты вымываются.
Смесь нуклеиновых кислот может включать РНК и ДНК. Целевая нуклеиновая кислота - это РНК, которая содержит меченую или распознаваемую нуклеотидную последовательность, которая связана сайт-специфической эндорибонуклеазой. В своем ферментативно неактивном состоянии (неиндуцированное состояние), эндорибонуклеаза может связать, но не расщепить, узнаваемую целевую РНК. В своем ферментативно активном состоянии (индуцированное состояние) (например, в присутствии имидазола в концентрации от около 100 мМ до около 500 мМ), эндорибонуклеаза может как связывать, так и расщеплять распознаваемую нуклеотидную последовательность в узнаваемой целевой нуклеиновой кислоте, таким образом, высвобождая целевую нуклеиновую кислоту.
Связывающий раствор может включать буфер и соль; остальное - имидазол.
Реактивационный раствор может включать имидазол в конечной концентрации от около 100 до около 500 мМ, например, от около 100 до около 150 мМ, от около 150 до около 200 мМ, от около 250 до около 350 мМ, от около 350 до около 400 мМ, или от около 400 до около 500 мМ. Наличие имидазола восстанавливает активность сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазы, так что эндорибонуклеаза становится ферментативно активной, например, эндорибонуклеаза демонстрирует по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95% или более 95% сайтспецифической эндорибонуклеазы дикого типа (например, аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 5 (например, 8ЕЦ ГО N0:6, 8 или 9)). Как один неограничивающий пример, сайтспецифическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза - это мутант Н29А из С'5у4 (как описано
- 8 024121 ниже; и изображено на фиг. 6); содержащая мутант Ску4(Н29А) с имидазолом, как описано выше, реактивирует эндорибонуклеазу так, что она способна расщеплять сайт-специфическим образом распознаваемую последовательность в целевой рибонуклеиновой кислоте. Также подходит для использования Н29А, двойная мутантная 850С из Ску4 (как описано ниже). В некоторых вариантах воплощения, меченая последовательность включает нуклеотидную последовательность 5'-СииСАСиССССиАиЛСССЛССиЛЛСЛАА-3' (8НС) ΙΌ N0:1).
Меченая или распознаваемая нуклеотидная последовательность может быть представлена в нуклеиновой кислоте с использованием стандартных рекомбинантных способов. Таким образом, узнаваемая целевая нуклеиновая кислота будет включать распознаваемый элемент, который ферментативно расщеплен, таким образом, высвобождая искомую нуклеиновую кислоту.
В некоторых вариантах воплощения узнаваемая целевая нуклеиновая кислота (РНК) будет иметь один или более полипептидов, связанных с ней. Узнаваемая целевая РНК, которая имеет один или более полипептидов, связанных с ней, означает протеиновый комплекс РНК. Таким образом, в некоторых вариантах воплощения целевая РНК, которая изолирована описанным способом, это РНК протеиновый комплекс. В некоторых вариантах воплощения описанный способ может включать в дальнейшем анализирование полипептида (ов), связанного (х) с изолированной целевой РНК.
Описанный способ используется для изоляции целевой РНК (или РНК протеинового комплекса). В некоторых вариантах воплощения способ используется для очистки целевой РНК (или РНК протеинового комплекса), так чтобы целевая РНК (или РНК протеиновый комплекс) была очищена, по меньшей мере около 50% чистоты, по меньшей мере около 60% чистоты, по меньшей мере около 70% чистоты, по меньшей мере около 80% чистоты, по меньшей мере около 90% чистоты, по меньшей мере около 95% чистоты, по меньшей мере около 98% чистоты или более чем на 98% чистоты.
В некоторых вариантах воплощения протеин, связанный с целевой РНК в целевом РНК/протеин комплексе может быть извлечен из РНК/протеин комплекса. Извлеченный протеин может быть подвергнут дальнейшему анализу, например секвенированию, ферментативному расщеплению, функциональному химическому анализу и т.д.
Смесь нуклеиновых кислот может присутствовать в клеточном лизате.
Например, вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую узнаваемую целевую РНК, представлен в клетке (например, ίη νίίτο или ίη νίνο), так что клетка синтезирует узнаваемую целевую РНК. Лизат готовится из клетки и лизат (опционально разделение на один или более этапов для обогащения нуклеиновыми кислотами) используется с иммобилизированной сайтспецифическойной ферментативно неактивной эндорибонуклеазой.
Сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза может быть иммобилизирована на всевозможных нерастворимых носителях. Подходящие нерастворимые носители включают, но не ограничиваются этим, агарозные шарики, магнитные шарики, тестовые полоски, многолуночные планшеты и подобное. Нерастворимый носитель может включать различные вещества (стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, натуральную и модифицированную целлюлозу, полиакриламиды, агарозы и магнетит) и может быть представлен в различных формах, включая, например, агарозные шарики, полистирольные шарики, латексные шарики, магнитные шарики, коллоидные металлические частицы, стекло и/или силиконовые пластинки и покрытия, нитроцеллюлозные полоски, нейлоновые мембраны, листы, лунки в реакционных кюветах (например, многолуночные планшеты), пластиковые трубки и т.д.
Настоящее изобретение также описывает способ изолирования полипептида, который связывает целевую РНК, при этом способ включает:
a) взаимодействие иммобилизированного комплекса с жидким раствором, содержащим полипептид, который связывает целевую РНК, при этом иммобилизированный комплекс включает вариант Ску4 эндорибонуклеазы и узнаваемую целевую РНК, содержащую нуклеотидную последовательность, которая специфически связана различными Ску4 эндорибонуклеазами, при этом результаты взаимодействия при связывании полипептида с искомой РНК, при котором взаимодействие выполняется в связывающем растворе без имидазола; и
b) извлечение связанного полипептида.
Эндорибонуклеазы
Настоящее изобретение описывает сайт-специфические эндорибонуклеазы.
В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение описывает сайт-специфические эндорибонуклеазы, которые связывают распознаваемую последовательность в целевом полирибонуклеотиде, но не расщепляют целевой полирибонуклеотид, например, сайт-специфическая эндорибонуклеаза является ферментативно неактивной при гидролизе целевого полирибонуклеотида. В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение описывает сайт-специфические эндорибонуклеазы, которые связываются с распознаваемой последовательностью в целевом полирибонуклеотиде, и расщепляют целевой полирибонуклеотид в или рядом с распознаваемой последовательностью, например сайт-специфическая эндорибонуклеаза является ферментативно активной при гидролизе целевого полирибонуклеотида.
В некоторых вариантах воплощения описанная сайт-специфическая эндорибонуклеаза иммобили- 9 024121 зирована на нерастворимом субстрате. Подходящие нерастворимые субстраты включают, но не ограничиваются этим, агарозные шарики, магнитные шарики, тестовые полоски, многолуночные планшеты и подобное. Нерастворимый субстрат может включать различные вещества (стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, натуральную и модифицированную целлюлозу, полиакриламиды, агарозы и магнетит) и может быть представлен в различных формах, включая, например, агарозные шарики, полистирольные шарики, латексные шарики, магнитные шарики, коллоидные металлические частицы, стекло и/или силиконовые пластинки и покрытия, нитроцеллюлозные полоски, нейлоновые мембраны, листы, лунки в реакционных кюветах (например, многолуночные планшеты), пластиковые трубки и т.д.
Ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза
Настоящее изобретение описывает ферментативно неактивную сайт-специфическую эндорибонуклеазу, где ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза связывается с искомой последовательностью в полирибонуклеотиде сайт-специфическим способом. Описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза связывается с искомым полирибонуклеотидом сайтспецифическим образом, но не расщепляет искомый полирибонуклеотид. Описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза пригодна для изолирования целевой РНК из смеси нуклеиновых кислот, как описано выше.
В некоторых вариантах воплощения, описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза включает один или более аминокислотных остатков, замещенных на естественно образовавшиеся ферментативно активные Сзу4, СазЕ или Сазб полипептиды.
В некоторых вариантах воплощения, ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза включает аминокислотный остаток в Шз-29 Сзу4 полипептида или в эквивалентной позиции в СазЕ или Сазб полипептида. В некоторых вариантах воплощения, ферментативно неактивная сайтспецифическая эндорибонуклеаза включает аминокислотный остаток в §ег-148 Сзу4 полипептида или в эквивалентной позиции в СазЕ или Сазб полипептида.
Фиг. б изображает неограничивающий пример подходящей ферментативно неактивной сайтспецифической эндорибонуклеазы аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах воплощения описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 или 100% аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. б, при этом аминокислотная последовательность включает заместитель в Шз-29, §ет-50 или оба Шз-29 и §ет-50. Например, вариант Сзу4 эндорибонуклеазы может включать Н29А (от Шз-29 до А1а-29) заместитель, 850С (от §ет-50 до Суз-50) заместитель или оба Н29А и 850С заместители.
В некоторых вариантах воплощения ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза является разновидностью Сзу4 эндорибонуклеазы. В некоторых случаях вариант варианты Сзу4 эндорибонуклеазы включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 95% аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. б, где эндорибонуклеаза включает аминокислотный заместитель в Шз-29, где разновидность Сзу4 эндорибонуклеазы ферментативно неактивна в отсутствии имидазола, и где разновидность Сзу4 эндорибонуклеазы активируется в присутствии имидазола. В некоторых случаях аминокислотный заместитель - это заместители от Шз29 до А1а29. В некоторых случаях, разновидность Сзу4 эндорибонуклеазы также включает §ет-50 заместитель. В некоторых случаях, описанная разновидность Сзу4 эндорибонуклеазы связывает РНК субстрат, который включает нуклеотидную последовательность 5'ОииСАСиОССОиАиАООСАОСиААОААА-3' (5ЕО ΙΌ N0:1).
Описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза условно ферментативно неактивна, например, описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, различные варианты Сзу4 эндорибонуклеазы), ферментативно неактивна в отсутствии имидазола; и ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, различные варианты Сзу4 эндорибонуклеазы) активируемая имидазолом. Например, ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, различные варианты Сзу4 эндорибонуклеазы) могут быть ферментативно активированы взаимодействием эндорибонуклеазы с имидазолом в концентрации от около 100 до около 500 мМ.
Присутствие имидазола (например, в концентрации от около 100 мМ до около 500 мМ) восстанавливает сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу, так что эндорибонуклеаза становится ферментативно активной, например эндорибонуклеаза демонстрирует по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около б0%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95% или более чем 95% сайт-специфической эндорибонуклеазы дикого типа (например, аминокислотная последовательность, изображенная на фиг. 5 (например, 5>ЕО ΙΌ ΝΟ:6, 8 или 9)).
В некоторых вариантах воплощения описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эн- 10 024121 дорибонуклеаза (например, различные варианты Ску4 эндорибонуклеазы) содержит определяемый фрагмент, включающий функциональную группу, которая создает определяемый сигнал. Подходящий определяемый фрагмент и/или функциональная группа, которая создает определяемый сигнал, включает, но не ограничивается этим, фермент, радиоизотоп, компонент РВЕТ пары, компонент специфично связанной пары, флюорофор; флюоресцентный белок; квантовую точку и подобное.
РКЕТ пары (донор/акцептор), подходящие для использования, включают, но не ограничиваются ΕΌΑΝδ/флюоресцеин, ΙΑΕΌΑΝδ/флюоресцеин, флюоресцеин/тетраметилродамин, флюоресцеин/Су 5, ΙΕΟΑΝδ/ΟΑΒίΎΕ флюоресцеин/О5У-7. флюоресцеин/ЬС Кеб 640, флюоресцеин/Су 5.5 и флюоресцеин/ЬС Кеб 705. Дополнительно может использоваться флюорофор/квантовая точка пара донор/акцептор.
Подходящие флюорофоры (флюоресцентные метки) включают любую молекулу, которая может быть определена посредством присущих ей флюоресцентных свойств, которые включают флюоресцентное определение возбужденной молекулы. Подходящие флюоресцентные метки включают, но не ограничиваются этим, флюоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин, метилкумарины, пирен, малахитовый зеленый, стилбен, ЬисИет Уейоте, Саксабе В1ие™, Техак Кеб, ΙΑΕΌΑΝδ, ΕΌΑΝδ, ΒΟΌΙΡΥ РЬ, ЬС Кеб 640, Су 5, Су 5.5, ЬС Кеб 705 и Огедоп дгееп. Подходящие оптические красители описаны в 2002 Мо1еси1аг РгоЬек НапбЬоок, 91Ь Еб., Ьу ВюЬатб Ρ. Наид1апб, включенной здесь в виде ссылки.
Подходящий фермент включает, но не ограничивается этим, пероксидазу хрена, люциферазу, βгалактозидазу и подобные.
Подходящие флюоресцентные белки включают, но не ограничиваются этим, зеленый флюоресцентный белок (СРР), например СРР из Ледиот1а УШопа или мутантный, или производный от него, например, как описано в патентах США № 6066476; 6020192; 5985577; 5976796; 5968750; 5968738; 5958713; 5919445; 5874304; красный флюоресцентный белок; желтый флюоресцентный белок; любой из возможных флюоресцентных и цветных белков из видов корраловых полипов, как описано, например, в Ма1/ е! а1. (1999) №Циге Вю1есЬпо1. 17:969-973, и подобные.
Подходящие наночастицы включают, например, квантовые точки (ΡΌ% флюоресцентные или люминесцентные наночастицы и магнитные наночастицы. Любые оптические или магнитные свойства или параметры наночастиц могут быть определены.
Р0к и способы их синтеза хорошо известны в данной области техники (см., например, патенты США № 6322901; 6576291 и 6815064). рЭк могут быть водорастворимыми благодаря применению покрывающих слоев, включающих различные материалы (смотри, например, патенты США № 6423551; 6251303; 6319426; 6426513; 6444143 и 6649138). Например, Р0к могут быть растворены с использованием амфифильных полимеров. Примерные полимеры, которые используются, включают октиламинмодифицированную низкомолекулярную полиакриловую кислоту, полиэтиленгликоль (РЕС)производные фосфолипидов, полиангидриды, блоковые кополимеры и т.д. Р0к могут быть соединены с полипептидом через любое количество разных функциональных групп или связывающих агентов, которые могут быть напрямую или не напрямую связаны с покрывающим слоем (смотри, например патенты США № 5990479; 6207392; 6251303; 6306610;6325144 и 6423551).
Р0к с широким спектром абсорбции и эмиссии с коммерческой точки зрения доступны, например, от Риайиш Эо1 Согр. (Нау\\агб С’аЬГ.; сейчас собственником является 1пуйтодеп) или от ЕЛбеШ ТесЬпо1од1ек (Тгоу, Ν.Υ.). Например, рЭк, имеющие пик длины волны возбуждения приблизительно 525, 535, 545, 565, 585, 605, 655, 705 и 800 нм доступны. Таким образом, Р0к могут иметь диапазон различных цветов в видимой части спектра, а в некоторых случаях и за его пределами.
Подходящие радиоизотопы включают, но не ограничиваются этим, С, Н, Р, Р, δ, I и I. Использование изотопов в качестве меток хорошо известно в данной области техники.
В некоторых вариантах воплощения описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, различные варианты Ску4 эндорибонуклеазы) иммобилизирована на нерастворимом субстрате. Подходящие нерастворимые субстраты включают, но не ограничиваются этим, агарозные шарики, магнитные шарики, тестовые полоски, многолуночные планшеты и им подобные. Нерастворимый субстрат может включать различные вещества (стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, натуральную и модифицированную целлюлозу, полиакриламиды, агарозы и магнетит) и может быть представлен в различных формах, включая, например, агарозные шарики, полистирольные шарики, латексные шарики, магнитные шарики, коллоидные металлические частицы, стеклянные и/или кремниевые пластинки и поверхности, нитроцеллюлозные полоски, нейлоновые мембраны, листы, лунки реакционных кювет (например, мультилуночные планшеты), пластиковые трубки и т.д.
В некоторых вариантах воплощения описанная ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, различные варианты Ску4 эндорибонуклеазы) химически чистая, например, по меньшей мере на 80% чистоты, по меньшей мере 85% чистоты, по меньшей мере 90% чистоты, по меньшей мере 95% чистоты, по меньшей мере 98% чистоты, по меньшей мере 99% чистоты или более чем на 99% чистоты.
- 11 024121
Композиции
Настоящее изобретение описывает композиции, включающие сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу. Композиция может включать в дополнении к сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазе одно или более следующих веществ: соль, например ЫаС1, МдС1, КС1, Мд§04 и т.д.; буферный агент, например Тп5-буфер. Ы-(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-(2этансульфоновую кислоту) (ΗΕΡΕδ), 2-(Ы-морфолино)этансульфоновую кислоту (ΜΕδ), 2-(Νморфолино)этансульфоновую кислоту натриевую соль (ΜΕδ), 3-^-морфолино)пропансульфоновую кислоту (Μ0Ρδ), ^трис[гидроксиметил]метил-3-аминопропансульфоновую кислоту (ΤΑΡδ) и т.д.; растворяющий агент; детергент, например неионный детергент, такой как Тгееи-20, и т.д..; ингибитор протеазы и подобные.
Ферментативно активная сайт-специфическая эндорибонуклеаза
В некоторых вариантах воплощения ферментативно активная сайт-специфическая эндорибонуклеаза включает функциональную группу, которая обеспечивает детектирование. Например, описанная ферментативно активная сайт-специфическая эндорибонуклеаза может включать ковалентно или нековалентно связанную функциональную группу, которая обеспечивает детектирование.
Подходящие метки детекции включают любую композицию, детектируемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими методами. Функциональные группы, которые обеспечивают детектирование, включают, но не ограничиваются этим, флюоресцентную молекулу, квантовую точку, фермент (отличный от эндорибонуклеазы), при этом фермент катализирует переход субстрата в детектируемый продукт, при этом продукт непосредственно определяемый; наночастицу; и подобные.
Подходящие флюоресцентные белки, которые могут быть связаны с ферментативно активной сайтспецифической эндорибонуклеазой, включают, но не ограничиваются этим, зеленый флюоресцентный белок (СЕР), например, СЕР из Аесцюпа νίαΙΟΓία или мутантный, или производный от него, например, как описан в патентах США № 6066476; 6020192; 5985577; 5976796; 5968750; 5968738; 5958713; 5919445;5874304; красный флюоресцентный белок; желтый флюоресцентный белок; любой из возможный флюоресцентных и цветных белков из видов коралловых полипов, как описаны, например, в Маи е1 а1. (1999) №Циге Вю1есЬио1. 17:969-973, и подобные.
Подходящие наночастицы включают, например, квантовые точки (φΌδ), флюоресцентные или люминесцентные наночастицы и магнитные наночастицы. Любые оптические или магнитные свойства и параметры наночастиц могут быть определены.
φΌδ и способы их синтеза хорошо известны (смотри, например, патенты США № 6322901; 6576291 и 6815064). φΌδ могут быть водорастворимыми благодаря применению покрывающих слоев, включающих различные материалы (см., например, патенты США № 6423551; 6251303; 6319426; 6426513; 6444143 и 6649138). Например, φΌδ могут быть растворены с использованием амфифильных полимеров. Примерные полимеры, которые используются, включают октиламин-модифицированную низкомолекулярную полиакриловую кислоту, полиэтиленгликоль (РЕО)-производные фосфолипидов, полиангидриды, блоковые кополимеры и т.д. φΌδ могут быть соединены с полипептидом через любое количество разных функциональных групп или связывающих агентов, которые могут быть напрямую или не напрямую связаны с покрывающим слоем (см., например патенты США № 5990479; 6207392; 6251303; 6306610; 6325144 и 6423551).
φΌδ с широким спектром абсорбции и эмиссии с коммерческой точки зрения доступны, например, от фиайит Όοΐ Согр. (Науссагб СаПГ.; сейчас собственником является 1пуйгодеи) или от Буйей Тесйηο1ο^δ (Тгоу, Ν.Υ.). Например, φΌδ, имеющие пик длины волны возбуждения приблизительно 525, 535, 545, 565, 585, 605, 655, 705 и 800 нм доступны. Таким образом, φΌδ могут иметь диапазон различных цветов в видимой части спектра, а в некоторых случаях и за его пределами.
В некоторых вариантах воплощения описанная ферментативно активная сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, различные варианты Сδу4 эндорибонуклеазы) химически чистая, например, на, по меньшей мере 80% чистоты, по меньшей мере 85% чистоты, по меньшей мере 90% чистоты, по меньшей мере 95% чистоты, по меньшей мере 98% чистоты, по меньшей мере 99% чистоты или более чем на 99% чистоты.
Композиции
Настоящее изобретение описывает композиции, включающие сайт-специфическую ферментативно активную эндорибонуклеазу. Композиция может включать в дополнение к описанной сайтспецифической ферментативно активной эндорибонуклеазе одно или более следующих веществ: соль, например, №С1, МдС1, КС1, Μ§δ04 и т.д.; буферный агент, например, ТШ буфер, N-(2гидроксиэтил)пиперазин-№-(2-этансульфоновую кислоту) (ΗΕΡΕδ), 2-^-морфолино)этансульфоновую кислоту (ΜΕδ), 2-^-морфолино)этансульфоновую кислоту натриевую соль (ΜΕδ), 3-(Νморфолино)пропансульфоновую кислоту ^0Ρδ), ^трис[гидроксиметил]метил-3-аминопропансульфоновую кислоту ^ΑΡδ) и т.д.; растворяющий агент; детергент, например неионный детергент, такой как Тгееи-20 и т.д.; ингибитор протеазы и подобные.
Настоящее изобретение описывает композиции, включающие сайт-специфическую ферментативно
- 12 024121 неактивную эндорибонуклеазу (например, различные варианты Ску4 эндорибонуклеазы). Композиция может включать в дополнение к описанной сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазе одно или более следующих веществ: соль, например, ЫаС1, МдС1, КС1, Мд§04 и т.д.; буферный агент, например Тгй буфер, Ы-(2-гидроэтил)пиперазин-№-(2-этансульфоновую кислоту) (ΗΕΡΕδ), 2-(Νморфолино)этансульфоновую кислоту (ΜΕδ), 2-^-морфолино)этансульфоновую кислоту натриевую соль (ΜΕδ), 3-^-морфолино)пропансульфоновую кислоту (Μ0Ρδ), ^трис[гидроксиметил]метил-3аминопропансульфоновую кислоту (ΤΑΡδ) и т.д.; растворяющий агент; детергент, например неионный детергент, такой как Т\уссп-20. и т.д.; ингибитор протеазы и подобные.
В некоторых вариантах воплощения композиция не содержит имидазол. В некоторых вариантах воплощения композиция включает имидазол в концентрации от около 100 до около 500 мМ.
Способы получения сайт-специфической эндорибонуклеазы
Сайт-специфическая эндорибонуклеаза (например, сайт-специфическая ферментативно активная эндорибонуклеаза; сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза) может быть получена любым известным способом, например традиционными синтетическими способами для белкового синтеза; способами рекомбинирования ДНК и т.д.
Там, где сайт-специфическая эндорибонуклеаза химически синтезирована, синтез может проходить через жидкую фазу или твердую фазу. Твердая фаза полипептидного синтеза (δΡΡδ), в которой Стерминальная аминокислота последовательности соединяется с нерастворимым субстратом за последующим присоединением оставшихся аминокислот в последовательности, - это пример подходящего способа для химического синтеза сайт-специфической эндорибонуклеазы. Различные варианты δΡΡδ, такие как Ртос и Вос, доступны для синтеза описанной сайт-специфической эндорибонуклеазы. Методики для твердофазного синтеза описана Вагапу апб Метйе1б, δο1ί6-Ρ1ι;·ΐ50 ΡορΙί6ο δγπΐΐ^δίδ; рр. 3-284 ίη ТЬе Ρеρί^бе5: Апа1у515, δуηΐЬе5^5, Вю1оду. Уо1. 2: δρес^а1 МеШобк ίη Нер11бе δуηΐЬе5^5, Ρητί А., Мегпйе1б, е! а1. 1. Ат. СЬет. δοс, 85: 2149-2156 (1963); δ^\ν;·ιΠ е! а1., δο1^б ΡЬа5е НерНбе δуηΐЬе5^5, 2пб еб. к!егсе СЬет. Со., КоскРогб, 111. (1984); и Сапекап А. 2006 М1т Кеу. Меб СЬет. 6:3-10 и Сатагего 1А е! а1. 2005 Ρ^οΐе^η Ρеρΐ Ьей. 12:723-8.
Стандартные рекомбинантные способы могут быть использованы для получения сайтспецифической эндорибонуклеазы. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие сайт-специфическую эндорибонуклеазу, вставлены в векторы экспрессии. ДНК сегменты, кодирующие сайт-специфическую эндорибонуклеазу активно связаны с контролирующими последовательностями в векторе/-ах экспрессии, который/-ые обеспечивают экспрессию кодирующих полипептидов. Последовательности контроля экспрессии включают, но не ограничиваются этим, промоторы (например, естественно-связанные или разнородные промоторы), сигнальные последовательности, элементы усиления и последовательности прерывания транскрипции. Последовательности контроля экспрессии могут быть системами эукариотических промоторов в векторах, способных к трансформации или трансфекции эукариотических клетокносителей (например, С0δ или СНО клетки). Как только вектор стал частью подходящего носителя, носитель сохраняется в условиях высокоуровневой экспрессии нуклеотидных последовательностей, и в условиях сборки и очищения эндорибонуклеазы.
Нуклеиновые кислоты и клетки-носители
Настоящее изобретение описывает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт-специфическую эндорибонуклеазу (например, сайт-специфическая ферментативно активная эндорибонуклеаза; сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза). В некоторых вариантах воплощения нуклеиновая кислота - это вектор экспрессии, при этом вектор экспрессии способствует получению сайт-специфической эндорибонуклеазы, например, в клетке.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт-специфическую эндорибонуклеазу (например, сайт-специфическая ферментативно активная эндорибонуклеаза; сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза) может быть активно связана с одним или более регуляторными элементами, такими как промотор или усилитель, что способствует экспрессии нуклеотидной последовательности в определенных клетках-мишенях (например, клетка, которая генетически модифицирована чтобы синтезировать кодируемую эндорибонуклеазу).
В некоторых вариантах воплощения нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, имеющий по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 или 100% с аминокислотной последовательностью, изображенной на фиг. 4 или 5. В некоторых вариантах воплощения нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую различные Ску4 полипептиды, как описано выше.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт-специфическую эндорибонуклеазу (например, сайт-специфическая ферментативно активная эндорибонуклеаза; сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза) может быть активно связана с элементом контроля транскрипции (например, промотором, усилителем и т.д.). Подходящие промоторные и усилительные элементы хорошо известны в данной области техники. Для экспрессии в бактериальной клетке подходящие промоторы включают, но не ограничиваются этим, 1ас1, 1ас2, Т3, Т7, §ρΐ, 1атЬба Р и 1гс. Для экспрессии в эукариоти- 13 024121 ческой клетке подходящие промоторы включают, но не ограничиваются этим, цитомегаловируса медиаторный ранний промотор, промотор тимидинкиназы простого вируса герпеса; ранний и поздний 8У40 промоторы; промотор, присутствующий в длинных терминальных повторениях ретровируса; мышиный металлотионеин-Ι промотор и различные известные в данной области техники тканевые специфические промоторы.
В некоторых вариантах воплощения , например, для экспрессии в дрожжевых клетках, подходящий промотор является конститутивным промотором, таким как ΆΌΗ1 промотор, РСК1 промотор, ΕΝΟ промотор, ΡΥΚ1 промотор и подобные; или регулирующий промотор, такой как СЛЬ1 промотор, ОЛЬ 10 промотор, ΛΌΗ2 промотор, РНО5 промотор, СИР1 промотор, ОЛЬ7 промотор, МЕТ25 промотор, МЕТ3 промотор, СУС1 промотор, ΗΙ8 3 промотор, ΛΌΗ1 промотор, РОК промотор, ΟΑΡΌΗ промотор, ЛЭС1 промотор, ТРР1 промотор, ИРЛЗ промотор, ЬЕИ2 промотор, ΕΝΟ промотор, ТР1 промотор, и АОХ1 (например, для использования в Рю1йа). Выбор подходящего вектора и промотора обуславливается навыками специалиста в определенной области техники.
Подходящие промоторы для использования в прокариотических клетках-носителях включают, но не ограничиваются этим, бактериофаг Т7 РНК полимеразный промотор; !гр промотор; 1ас опероновый промотор; двойной промотор, например, 1ас/!ас двойной промотор, 1ас/1гс двойной промотор, 1гр/1ас промотор, Т7/1ас промотор; 1гс промотор, 1ас промотор и подобные; агаВЛЭ промотор; промоторы, регулируемые ίη νίνο, такие как ззаО промотор или родственный промотор (см., например патент США № 20040131637),радС промотор (Ри1ккшеп апб МШсг. ί. Вас!етю1, 1991: 173(1): 86-93; А1рисЬе-Агапба е! а1, ΡΝΑδ, 1992; 89(21): 10079-83), пиВ промотор (Ш^оте е! а1. (1992) Мо1. Мюго. 6:2805-2813), и подобные (см., например, Эипз!ап е! а1. (1999) 1п1сс1. 1ттип. 67:5133-5141; МсКеМе е! а1. (2004) Уассше 22:32433255; и СЬабге1б е! а1. (1992) Вю1есЬпо1. 10:888-892); З1дта70 промотор, например консенсусный З1дта70 промотор (см., например, ОепВапк Ассеззюп Νοδ. АХ798980, АХ798961 и АХ798183); стационарный фазовый промотор, например, брз промотор, δρν промотор и подобные; промотор, выделенный из патогенетического островка 8Р1-2 (см., например, УО 96/17951); ас!А промотор (см., например, 8Ье!гоп-Рата е! а1. (2002) 1пГес1. 1ттип. 70:1087-1096); грзМ промотор (см., например, Уа1бМа апб Ра1коте (1996). Мо1. МютоЪю1. 22:367); !е! промотор (см., например, ИШенУ. апб У13зтапп,А. (1989) 1п 8аепдег,У. апб Иететапци. (ебз), Торюз ш Мо1еси1аг апб 81гис!ига1 Вю1оду, РюШм-ШсШс Ааб 1п!етас!юп. МастШап, Ьопбоп, ЦК, Уо1. 10, рр. 143-162); 8Р6 промотор (см., например, Ме1!оп е! а1. (1984) №с1. Аабз Рез. 12:7035) и подобные. Подходящие сильные промоторы для использования в прокариотических клетках, таких как ЕзсЬеЕЫа сой включают, но не ограничиваются этим, Тгс, Тас, Т5, Т7 и РьатЪба. Неограничивающий пример операторов для использования в бактериальных клетках-носителях включают лактозный оператор промотора (Ьас1 репрессорный протеин изменяет конформацию при контакте с лактозой, таким образом предохраняя Ьас1 репрессорный протеин от связывания с оператором), триптофановый оператор промотора (при связывании с триптофаном, ТгрР репрессорный протеин имеет конформацию, которая связывается с оператором; при отсутствии триптофана, ТгрР репрессорный протеин имеет конформацию, которая не связывается с оператором) и 1ас оператор промотора (см., например, беВоег е! а1. (1983) Ргос. N311. Асаб. 8οΐ. И.8.А. 80:21-25).
Нуклеотидная последовательность, кодирующая сайт-специфическую эндорибонуклеазу (например, сайт-специфическую ферментативно активную эндорибонуклеазу; сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу) может быть представлена в векторе экспрессии и/или векторе клонирования. Вектор экспрессии может включать в себя селективный маркер начала репликации и другие функции, которые обеспечивают репликацию и/или поддержание вектора.
Большое количество подходящих векторов и промоторов известно специалистам в данной области техники, многие из них являются коммерчески доступными для генерации описанной рекомбинантной конструкции. Следующие векторы предоставляются в качестве примера. Бактериальные: рВз, рЬадезспр!, Р81Х174, рВЬезспр! 8К, рВз К8, рNΗ8а, рNΗ16а, рNΗ18а, рNΗ46а (8!га!адепе, Ьа бо11а, СаПЕ и8А); рТгс99А, рКК223-3, рКК233-3, рЭР540 и рР1Т5 (РЬаттааа, Иррза1а, 8\уебеп). Эукариотические: рУЬпео, р8У2са!, рОО44, РХР1, р8о (81та1адепе), р8УК3, рВРУ, рМ8о и р8УЪ (РЬаттааа).
Векторы экспрессии, как правило, имеют удобные сайты рестрикции, которые располагаются рядом с промоторной последовательностью для обеспечения введения нуклеиновых кислот, кодирующих гетерологичные белки. Выборочный маркер оперативный в экспрессии носителя может присутствовать. Подходящие векторы экспрессии включают, но не ограничиваются ими, вирусные векторы (например, вирусные векторы на основе вируса коровьей оспы, вируса полиомиелита, аденовирусы (см., например, Ь1 е! а1., ΙΐΉΌδΙ Ор!Ьа1то1 У1з 8а 35:2543 2549, 1994; Воггаз е! а1., Оепе ТЬег 6:515 524, 1999; Ь1 апб Эау1бзоп, Р^8 92:7700 7704,1995; 8акато!о е! а1., Η Оепе ТЬег 5:1088 1097,1999; УО 94/12649, УО 93/03769; УО 93/19191; УО 94/28938; УО 95/11984 и УО 95/00655); адено-связанный вирус (см., например, АП е! а1., Иит Оепе ТЬег 9:81 86, 1998, Иаппегу е! а1., ΡNΑ8 94:6916 6921,1997; Веппе!! е! а1., 1пуез1 Ор!Ьа1то1 У18 8а 38:2857 2863,1997; Ютагу е! а1., Оепе ТЬег 4:683 690,1997, РоШпд е! а1., Иит Оепе ТЬег 10:641 648, 1999; АН е! а1., Пит Мо1 Оепе! 5:591 594,1996; 8гказ!ауа в УО 93/09239, 8ати1зк1 е! а1., 1. Ук. (1989) 63:3822-3828; Мепбе1зоп е! а1., Уио1. (1988) 166:154-165; и Р1о!!е е! а1, Р^8 (1993) 90:10613-10617); 8У40; вируса простого герпеса, вируса иммунодефицита человека (см., например, М1уозЬ е! а1., ΡNΑ8
- 14 024121
94:10319 23, 1997; Такайа8Ы е( а1., 1 νίτοί 73:7812 7816, 1999); ретровирусных векторов (например, Митте Ьеикеш1а νίπΐ8, вируса некроза селезенки, и векторы, полученные из ретровирусов, таких как Кои8 8агсота νίπΐ8, Натуеу 8агсота νίπΐ8, вирус птичьего лейкоза, вирус иммунодефицита человека, миелопролиферативный вирус саркомы и вирус опухоли молочной железы); и тому подобное.
Настоящее изобретение обеспечивает изолированные генетически модифицированные клеткиносители (например, ίη νίίτο клетки), которые являются генетически модифицированными нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах воплощения, изолированная генетически модифицированная клетканоситель может производить сайт-специфическую эндорибонуклеазу (например, сайт-специфическую ферментативно активную эндорибонуклеазу; сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу).
Подходящие клетки-носители включают эукариотические клетки-носители, такие как клетки млекопитающих, клетки-носители насекомых, дрожжевые клетки, и прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки. Введение нуклеиновой кислоты в клетку-носитель может быть осуществлено, например, путем осаждения фосфата кальция, ΌΕΆΕ декстран опосредованной трансфекции, липосомоопосредованной трансфекции, электропорации, или других известных способов.
Подходящие клетки млекопитающих включают первичные клетки и иммортализованные клеточные линии. Подходящие клеточные линии млекопитающих включают в себя человеческие клеточные линии, нечеловеческие клеточные линии приматов, клеточные линии грызунов (например, мыши, крысы), и тому подобное. Подходящие клеточные линии млекопитающих включают, но не ограничиваются этим, НеЬа клетки (например, Американской коллекции типовых культур (АТСС) № ССЬ-2), клетки СНО (например, АТСС № СКЬ9618, ССЬ61, СКЬ9096), 293 клетки (например, АТСС № СКЬ-1573), Vе^ο клетки, ΝΙΗ 3Т3клетки (например, АТСС № СКЬ-1658), Ний-7 клетки, ВНК клетки (например, АТСС № ССЬ10), РС12 клетки (АТСС № СКЬ1721), СО8 клетки, СО8-7 клетки (АТСС № СКЬ1651), КАТ1 клетки, Ь клетки мыши (АТСС № ССЫ3), эмбриональные клетки человеческих почек (НЕК) (АТСС № СКЬ1573), НЬНерС2 клетки и тому подобное.
Подходящие клетки дрожжей включают, но не ограничиваются ими, РюЫа ра81оп8, РюЫа Гпйапбюа, РюЫа 1геНа1орННа, РюЫа кос1атае, РюЫа тетЪгапаеГаает, РюЫа орипйае, РюЫа 1йегто1о1егап8, РюЫа 8а1ю1апа, РюЫа диегсиит, РюЫа рурел, РюЫа 8ЙрЙ8, РюЫа тейапойса, РюЫа 8р., 8ассйаготусе8 сеге\а81ае, 8ассйаготусе8 8р., Нап8епи1а ро1утогрйа, Κ1иуνе^οтусе8 8р., К1иу\'еготусе8 1ас118, Сапйба а1Ъюап8, А8регдй1и8 пЫи1ап8, А8регдй1и8 тдег, А8регдй1и8 огу/ае, Тлсйобетта тее8ец СЫу8о8ролит 1искпо\уеп8е, Ризалит 8р., Ризалит дгаттеит, Ри8алит νеηеηаΐит, №иго8рога сга88а, СЫатуботопа8 гешНагбШАЕ подобные.
Подходящие прокариотические клетки включают, но не ограничиваются ими, любые из множества лабораторных штаммов кишечной палочки, Е8сйелсЫа сой, Ьас1оЪасШи8 8р., 8а1топе11а 8р., 8Ыде11а 8р., и тому подобные. См., например, Сатлет е( а1. (1992) 1. 1ттипо1. 148:1176-1181, патент США № 6447784; 81/етоге е! а1. (1995) 8Ыепсе 270:299-302. Примеры штаммов сальмонелл, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, 8а1топе11а 1урЫ и 8. (урЫтигшт. Подходящие штаммы 8Ыде11а включают, но не ограничиваются ими, 8Ыде11а йехпел, 8Ыде11а 8оппе1 и 8Ыде11а Й8еЫелае. Как правило, лабораторный штамм не является патогенным. Не ограничивающие примеры других подходящих бактерий включают, но не ограничиваются ими, Васй1и8 8ΐΛ01ί8, Р8еиботопа8 рибйа, Р8еиботопа8 аегидто8а, Р8еиботопа8 те\'а1опЫ КйобоЪаЫег 8рНаегоЫе8, КйобойаЫег сар8и1а(и8, Кйобо8рш11ит гиЪгит, Кйобососси8 8р., и тому подобные. В некоторых вариантах воплощения клеткой-носителем является Е8сйелсЫа сой.
Наборы
Настоящее изобретение также предоставляет наборы для определения нуклеотидной последовательности целевого полирибонуклеотида. Настоящее изобретение предоставляет наборы для проведения сайт-специфического расщепления субстрата полирибонуклеотида. Настоящее изобретение предоставляет наборы для проведения обнаружения последовательности РНК в целевом полирибонуклеотиде. Настоящее изобретение предоставляет наборы для проведения изоляции РНК-мишени. Настоящее изобретение предоставляет наборы для проведения изоляции полипептида, который связывается с РНКмишенью.
Наборы для проведения прямого секвенирования полирибонуклеотида Комплект для проведения прямого секвенирования полирибонуклеотида включает в себя, по меньшей мере, сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу, где сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза очищена. В некоторых вариантах воплощения, сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза связана с молекулой акцептором или молекулой донором, для РКЕТ детекции.
Комплект для проведения прямого секвенирования полирибонуклеотида включает в себя, по меньшей мере, сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу, а также может включать в себя один или более дополнительных компонентов, в которых один или более дополнительных компонентов могут быть:
1) буфером;
- 15 024121
2) олигонуклеотидным зондом, содержащим определенную последовательность;
3) олигонуклеотидный зондом, содержащим определенную последовательность, в которой олигонуклеотидный зонд связан с молекулой акцептором или молекулой донором, для РКЕТ детекции;
4) нерастворимой подложкой, для соединения с целевым полирибонуклеотидом;
5) положительным контрольным полирибонуклеотидом, где положительный контрольный полирибонуклеотид содержит известную последовательность нуклеотидов;
6) положительным контрольным олигонуклеотидным зондом, который связывает и образует дуплекс с известной последовательностью положительного контрольного полирибонуклеотида.
В дополнение к вышеупомянутым компонентам комплект может дополнительно включать в себя инструкции по использованию компонентов набора в практике способов. Инструкции для практикующих способов, как правило, отражаются на соответствующем носителе. Например, инструкции могут быть напечатаны на подложке, такой как бумага или пластик и т.д. Таким образом, инструкции могут быть представлены в комплектах как листок-вкладыш, в маркировке контейнера набора или его компонентов (например, связанного с упаковкой или субупаковкой) и т.д. В других вариантах воплощения инструкции присутствуют в виде электронного файла хранения данных, присутствующих на подходящих машиночитаемых носителях, например, СИ-КОМ, дискетах и т.д. В других вариантах воплощения, фактические инструкции не присутствуют в комплекте, что означает, что получение инструкций обеспечено от удаленного источника, например, через Интернет. Примером этого варианта воплощения является комплект, который включает в себя веб-адрес, где команды могут быть просмотрены и / или из которого команды могут быть загружены. Как и с инструкциями, это средство для получения инструкций, записанных на подходящий носитель.
Наборы для проведения сайт-специфического расщепления субстрата полирибонуклеотида
Комплект для проведения сайт-специфического расщепления субстрата полирибонуклеотида включает в себя, по меньшей мере, очищенную сайт-специфическую эндорибонуклеазу и/или нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт-специфическую последовательность конкретной эндорибонуклеазы. Комплект для проведения сайт-специфического расщепления субстрата полирибонуклеотида может включать в себя, в дополнение к очищенной сайт-специфической эндорибонуклеазе (и/или нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность конкретной эндорибонуклеазы), один или более дополнительных компонентов. Подходящие дополнительные компоненты включают в себя, например, буфер; полирибонуклеотидный субстрат, который служит в качестве положительного контроля; полирибонуклеотид стандартных размеров; субстрат отрицательного контроля; и тому подобное. Компоненты могут быть помещены каждый в отдельную емкость. Комплект может дополнительно включать в себя один или несколько положительных и отрицательных контролей.
В дополнение к вышеупомянутым компонентам комплект может дополнительно включать в себя инструкции по использованию компонентов набора в практике способов. Инструкции для практикующих способов, как правило, отражаются на соответствующем носителе. Например, инструкции могут быть напечатаны на подложке, такой как бумага или пластик и т.д. Таким образом, инструкции могут быть представлены в комплектах как листок-вкладыш, в маркировке контейнера набора или его компонентов (например, связанного с упаковкой или субупаковкой) и т.д. В других вариантах воплощения инструкции присутствуют в виде файлов электронного хранения данных, присутствующих на подходящих машиночитаемых носителях, например, СИ-КОМ, дискетах и т.д. В других вариантах воплощения, фактические инструкции не присутствуют в комплекте, что означает, что получение инструкций обеспечено от удаленного источника, например, через Интернет. Примером этого варианта воплощения является комплект, который включает в себя веб-адрес, где команды могут быть просмотрены и / или из которого команды могут быть загружены. Как и с инструкциями, это средство для получения инструкций, записанных на подходящий носитель.
Наборы для проведения обнаружения последовательности в целевом полирибонуклеотиде
Комплект для проведения детектирования последовательности в целевом полирибонуклеотиде (например, для проведения детектирования полирибонуклеотида) может включать в себя олигонуклеотидный зонд, содержащий известную последовательность. В некоторых вариантах воплощения, комплект будет включать в себя олигонуклеотидный зонд, содержащий известную последовательность и содержащий функциональную группу детектирования, например, полипептида, который может быть обнаружен с помощью иммунологического анализа; флуоресцентный белок; люциферин и т.д. Комплект может дополнительно включать в себя положительный контрольный полирибонуклеотид, который содержит последовательность нуклеотидов, способных образовывать дуплекс с олигонуклеотидным зондом. Комплект может дополнительно включать ферментативно активную специфическую последовательность эндорибонуклеазы, которая специфично выявляет и расщепляет дуплекс, образованный олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом. Комплект может дополнительно включать в себя один или несколько буферов; компоненты для обнаружения детектируемой функциональной группы; тестполоски и тому подобное. Комплект может дополнительно включать в себя один или несколько положительных и отрицательных контролей.
- 16 024121
В дополнение к вышеупомянутым компонентам комплект может дополнительно включать в себя инструкции по использованию компонентов набора в практике способов. Инструкции для практикующих способов, как правило, отражаются на соответствующем носителе. Например, инструкции могут быть напечатаны на подложке, такой как бумага или пластик и т.д. Таким образом, инструкции могут быть представлены в комплектах как листок-вкладыш, в маркировке контейнера набора или его компонентов (например, связанного с упаковкой или субупаковкой) и т.д. В других вариантах воплощения инструкции присутствуют в виде файлов электронного хранения данных, присутствующих на подходящих машиночитаемых носителях, например СЭ-Р0М, дискетах и т.д. В других вариантах воплощения фактические инструкции не присутствуют в комплекте, что означает, что получение инструкций обеспечено от удаленного источника, например через Интернет. Примером этого варианта воплощения является комплект, который включает в себя веб-адрес, где команды могут быть просмотрены и/или из которого команды могут быть загружены. Как и с инструкциями это средство для получения инструкций, записанных на подходящий носитель.
Наборы для проведения изоляции РНК-мишени
Комплект для проведения изоляции (например, очистки) РНК-мишени может включать в себя один или более из:
1) сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу;
2) экспрессирующую конструкцию, содержащую меченую нуклеотидную последовательность, то есть нуклеотидную последовательность, которая специфически связана сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазой, где нуклеотидная последовательность, кодирующая РНК-мишень выбора может быть вставлена 3' меченой нуклеотидной последовательности; и
3) имидазола.
Сайт-специфическая ферментативно неактивная эндорибонуклеаза может быть иммобилизована на нерастворимую подложку. Комплект может дополнительно включать в себя жидкую композицию для контакта смешанной популяции нуклеиновых кислот с иммобилизованой сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазой. Комплект может дополнительно включать в себя промывочный буфер. Комплект может дополнительно включать в себя один или несколько положительных и отрицательных контролей. Положительный контроль может включать вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую отмеченную РНК-мишень, где метка специально связана посредством сайт-специфической ферментативно неактивной эндорибонуклеазы. Компоненты могут быть помещены каждый в отдельные емкости.
Например, комплект может включать в себя сайт-специфическую ферментативно неактивную эндорибонуклеазу. Комплект может дополнительно включать в себя рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий в порядке от 5' до 3' и в функциональной связи:
а) нуклеотидную последовательность, кодирующую РНК субстрат, который специфически связывается различными Ску4 эндорибонуклеазами; и
б) несколько сайтов клонирования, подходящих для вставки нуклеиновой кислоты, кодирующей РНК-мишень. Нуклеотидная последовательность, кодирующая РНК субстрат, может быть функционально связана с промотором. В некоторых случаях промотор является индуцируемым промотором. РНК субстрат может содержать последовательность нуклеотидов 5'-СииСАСиССССИАиАСССАССИААСААА-3' (8Е0 ГО N0: 1). В некоторых случаях, рекомбинантный вектор экспрессии включает в себя вставленную в сайт множественного клонирования нуклеотидную последовательность, кодирующую РНК-мишень. Комплект может дополнительно включать в себя буфер, не содержащий имидазол. Комплект может дополнительно включать имидазол или раствор имидазола. Комплект может дополнительно включать в себя один или более буферов отмывки. В некоторых случаях комплект будет включать в себя положительный контрольный вектор экспрессии. Вариант Ску4 эндорибонуклеазы может быть иммобилизованными на нерастворимую подложку, где подходящие нерастворимые носители включают, но не ограничиваются этим, агарозные шарики, магнитные шарики, тест-полоски, мультилуночные планшеты, и тому подобное. Нерастворимая подложка может включать в себя различные вещества (стекло, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиэтилен, поликарбонат, декстран, нейлон, амилозу, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозу и магнетит) и может быть представлена в полистироле, шариками из латекса, магнитными шариками, коллоидными частицами металла, стекла и/или кремниевых пластин и поверхностей, нитроцеллюлозными полосками, нейлоновыми мембранами, листами, луночными реакционными кюветами (например, мультилуночными планшетами), пластиковыми трубками и т.д. В дополнение к вышеупомянутым компонентам, комплект может дополнительно включать в себя инструкции по использованию компонентов набора в практике способов. Инструкции для практикующих способов, как правило, отражаются на соответствующем носителе. Например, инструкции могут быть напечатаны на подложке, такой как бумага или пластик и т.д. Таким образом, инструкции могут быть представлены в комплектах как листок-вкладыш, в маркировке контейнера набора или его компонентов (например, связанного с упаковкой или субупаковкой) и т.д. В других вариантах воплощения инструкции присутствуют в виде файлов электронного хранения данных, присутствующих на подходящих машиночитаемых носителях, например, СЭ-Р0М, дискетах и т.д. В
- 17 024121 других вариантах воплощения, фактические инструкции не присутствуют в комплекте, что означает, что получение инструкций обеспечено от удаленного источника, например, через Интернет. Примером этого варианта воплощения является комплект, который включает в себя веб-адрес, где команды могут быть просмотрены и/или из которого команды могут быть загружены. Как и с инструкциями это средство для получения инструкций, записанных на подходящий носитель.
Способы непосредственного секвенирования целевого полирибонуклеотида
Настоящее изобретение обеспечивает способ прямого определения нуклеотидной последовательности целевого полирибонуклеотида. Так, например, способ не требует синтеза полидезоксирибонуклеотидного дубликата целевого полирибонуклеотида в целях определения нуклеотидной последовательности целевого полирибонуклеотида.
Вирусная диагностика, персонализированная медицина, одноклеточный транскрипционный анализ и трансляционное профилирование - все области, в которых прямое определение РНК и последовательности находит применение. Метод секвенирования полирибонуклеотида и метод обнаружения определенной последовательности в полирибонуклеотиде находят применение в таких различных областях.
Метод секвенирования полирибонуклеотида обычно включает в себя:
a) контакт целевого полирибонуклеотида с олигонуклеотидным зондом, содержащим определенную известную последовательность, и ферментативно неактивной сайт-специфической эндорибонуклеазой в условиях, которые способствуют формированию дуплекса между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом, где ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза связывает определенную последовательность в дуплекс; и
b) выявление специфического связывания между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом, где специфическое связывание ферментативно неактивной сайт-специфической эндорибонуклеазой в дуплекс указывает на наличие определенной последовательности в целевом полирибонуклеотиде.
В некоторых случаях ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза является связанной (ковалентно или нековалентно) с эмиссионной меткой. Под эмиссионной меткой подразумевается любая молекула, которая может быть обнаружена с помощью своих неотъемлемых свойств излучения, которые включают в себя эмиссию, обнаруживаемую при возбуждении. Подходящие эмиссионных метки включают, но не ограничиваются этим, флюоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин, метилкумарины, пирен, малахитовый зеленый, стильбен, Ьисбёг Ус11о^. Саксабе В1ие™, Техак Кеб, ΙΛΕΌΛΝδ, ΕΌΆΝδ, ΒΟΌΙΡΥ ЕЬ, ЬС Кеб 640, Су 5, Су 5.5, ЬС Кеб 705 и Огедоп дгееп. Подходящие оптические красители описаны в 2002 году КюЬатб Ρ. Наид1апб в Мо1еси1аг РгоЬек НапбЬоок, 9Ηι Еб.
В некоторых случаях олигонуклеотидный зонд, используемый в способе секвенирования полирибонуклеотида, связан с молекулой донором, ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза связана с акцепторной молекулой, и обнаружение образования дуплекса происходит посредством резонансного переноса энергии флуоресценции (также известного как Форстер резонансный перенос энергии или ЕКЕТ).
Форстер резонансный перенос энергии (ЕКЕТ) - явление, известное в данной области техники, при котором возбуждение одного эмиссионного красителя переносится на другой без испускания фотона. ЕКЕТ пара состоит из хромофора донора и хромофора акцептора (где акцепторный хромофор может быть гасителем люминесценции молекулы). Спектр излучения донора и спектр поглощения акцептора должны перекрываться, и две молекулы должны находиться в непосредственной близости. Расстояние между донором и акцептором, при котором 50% доноров деактивированы (передача энергии на акцептор) определяется радиусом Форстера, который, как правило, составляет 10-100 ангстрем. Изменения в спектре излучения содержащих ЕКЕТ пар могут быть обнаружены, что указывает на изменения в количестве пар, которые находятся в непосредственной близости (т.е. на расстоянии 100 ангстрем друг от друга). Это, как правило, происходит в результате связывания и диссоциации двух молекул, одна из которых помечена ЕКЕТ донором и другая из которых помечена ЕКЕТ акцептором, в котором такое связывание приводит к ЕКЕТ паре в непосредственной близости.
Связывание таких молекул может привести к увеличению эмиссии акцептора и/или гашению флуоресцентного излучения донора. ЕКЕТ пары (донор/акцептор), пригодные для использования, включают, но не ограничиваются этим, ΕΌΛΝδ/флюоресцеин, ΙΛΕΌΆΝδ/флюоресцеин, флюоресцеин/тетраметилродамин, флюоресцеин/Су 5, IΕ^ΑNδ/^ΑΒСΥ^, флюоресцеин/^δΥ-7, флюоресцеин/ЬС Кеб 640, флюоресцеин/Су 5.5 и флюоресцеин/ЬС Кеб 705. Кроме того, пара флуорофор/квантовая точка донор/акцептор может быть использована. ΕΌΆΝδ представляет собой (5-((2-аминоэтил)амино)нафталин-1-сульфокислота); ΙΛΕΌΛΝδ представляет собой 5-({2-[(йодацетил)амино]этил}амино)нафталин-1-сульфокислота); ΌΛΒί'ΎΕ представляет собой 4-(4-диметиламинофенил)диазенилбензойная кислота.
Су3, Су5, Су 5.5 и тому подобные являются цианинами. Например, Су3 и Су5 являются реакционноспособными растворимыми в воде флуоресцентными красителями цианинового семейства красителей. Су3 красители - красные (ок.550 нм возбуждение, ок.570 нм излучения и, следовательно, проявляются
- 18 024121 зелеными), в то время как Су5 является флуоресцентным в красной области (ок.650/670 нм), но поглощает в оранжевой области (ок.649 нм). А1еха Ииог красители, ОуЫдЫ, ГО1§ красители, §е!а красители, §еТаи красители, §Кйиог красители и Здиаге красители также могут быть использованы.
В другом аспекте РКЕТ эмиссионная молекула донор и неэмиссионная молекула акцептор (гаситель) могут быть использованы. В этом приложении излучение донора будет возрастать по мере гашения люминесценции при смещении ближе к донору, и излучение будет уменьшаться, когда гашение люминесценции приводит к непосредственной близости к донору. Используемые гасители люминесценции, включают, но не ограничиваются этим, ОАВСУЬ. 08У 7 и 08Υ 33. Используемые пары флуоресцентные доноры/гасители люминесценции включают, но не ограничиваются этим, ЕОА^/ОАВСУЬ, Техак Кеб/ОАВСУЕ, ΒО^IРΥ/^ΑΒСΥ^, ЬисКег уе11ο№/^ΑΒСΥ^, кумарин/^ΑΒСΥ^ и флюоресцеин/ρδΥ 7 краситель.
В некоторых случаях ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза является связанной (ковалентно или нековалентно) с ферментом меткой. Фермент метка означает фермент, который может вступать в реакцию в присутствии субстрата метки фермента, который производит обнаруживаемый продукт. Подходящие ферменты метки также включают оптически детектируемые метки (например, в случае с пероксидазой хрена (НКР)). Подходящие ферменты метки включают, но не ограничиваются этим, НКР, щелочную фосфатазу, люциферазу, β-галактозидазу и глюкозооксидазу. Способы использования таких субстратов хорошо известны в данной области техники. Наличие фермента метки, как правило, раскрывается через катализ ферментом реакции с субстратом фермента метки, производимым идентифицируемым продуктом. Такие продукты могут быть непрозрачными, такими как при реакции пероксидазы хрена с тетраметилбензидином и могут иметь различные цвета. Другие субстраты для фермента метки, которые производят флуоресцентные продукты реакции, такие как Ьитто1 (доступен от Р1егсе СЬетюа1 Со.), были разработаны. Способы определения ферментов меток с субстратами ферментов меток хорошо известны в данной области техники и многие коммерческие наборы доступны. Примеры и способы использования различных ферментов меток описаны в §аνаде е! а1., Ргсузсуук 247:6-9 (1998), Υοиηд, б. νΐΐΌΐ. МеШобк 24:227-236 (1989).
В некоторых случаях ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза включает в себя радиоизотоп. Радиоизотоп означает любые радиоактивные молекулы. Подходящие радиоизотопы для использования в данном изобретении, включают, но не ограничиваются этим, 14С, 3Н, 2Р, Р, 5§, 0 и 131Е Использование радиоизотопов в качестве меток хорошо известно в данной области техники.
В некоторых случаях ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза является связанной (ковалентно или нековалентно) с членами пар специфического связывания (партнер связанная пара). Партнер связанная пара или член связанная пара означает одну пару из первой и второй функциональной группы, где первая и вторая функциональная группа имеют специфическое сродство друг к другу. Подходящие связанные пары включают, но не ограничиваются этим, антиген/антитело (например, дигоксигенин/антидигоксигенин, динитрофенил (П№)/анти-Э№, дансил/антидансил, флюоресцеин/антифлюоресцеин, люцифер желтый/антилюцифер желтый и родамин/антиродамин), биотин/авидин (или биотин/стрептавидин) и кальмодулин-связывающий белок (СВР)/кальмодулин.
В некоторых вариантах воплощения олигонуклеотидный зонд содержит изменения, которые обеспечивают повышенную устойчивость к неспецифическому гидролизу. Такие модификации хорошо известны в данной области техники и включают, например, нуклеазоустойчивые межнуклеозидные связи, изменение основного скелета, базовые модификации, замены оснований, модификации сахара и тому подобное.
Подходящее изменение олигонуклеотидного скелета, содержащего атом фосфора, включает, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил и другие алкилфосфонаты, в том числе 3'-алкиленфосфонаты, 5'алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, в том числе 3'аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидат, фосфородиамидаты, тионофосфоамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры, селенофосфаты и боранофосфаты с нормальными 3'5'связями, 2'-5' связанные их аналоги, и тех, у которых инвертирована полярность за счет одной или нескольких межнуклеотидных связей, являющихся 3'-3', 5'-5' или 2'-2' связями. Подходящие олигонуклеотиды, имеющие обратную полярность, имеют одну 3'-3' связь с 3'- межнуклеотидной связью, т.е. один инвертированный нуклеозидный остаток, который может быть основным (нуклеооснование отсутствует или имеет гидроксильные группы на их месте). Различные соли (такие как, например, калия или натрия), смешанные соли и формы свободных кислот также включены.
Модифицированный олигонуклеотид может содержать одну или более фосфоротиоатных и/или гетероатомных межнуклеозидных связей, в частности -СН2-кН-О-СН2-, -СН2-ЖСН3)-О-СН2- (известный как метилен (метилимино) или ММI скелет), -СН2-О-ЖСН2)-СН2-, -СН2-ЖСН3,)-ЖСН3,)-СН2- и -ОЖСН3,)-СН2-СН2- (где нативное межнуклеотидное фосфодиэфирное связывание представлено как -ОР(=О)(ОН)-О-СН2-). ММI тип межнуклеозидного связывания раскрыт в вышеупомянутых патентах США № 5489677. Подходящее межнуклеозидное амидное связывание раскрыто в патенте США № 5602240.
Модифицированный олигонуклеотид может содержать одну или более морфолиновую скелетную
- 19 024121 структуру, как описано, например, в патенте США № 5034506. Например, в некоторых вариантах воплощения модифицированный олигонуклеотид включает в себя 6-членное морфолиновое кольцо в месте кольца рибозы. В некоторых из этих вариантов воплощения фофсородиамидат или другая нефосфодиэфирная межнуклеозидная связь заменена фосфодиэфирной связью. Морфолинонуклеиновые кислоты (тотрйо1то8) включают в себя основания, связанные с морфолиновым кольцом вместо кольца дезоксирибозы; кроме того, фосфатный скелет может включать в себя нефосфатную группу, например, фосфородиамидатную группу вместо фосфата. ЗиттсПон (1999) ВюсЫт. ВюрЬуз. Ас1а 1489:141; Неазтаη (2002) Эеу. ΒίοΙ. 243:209; διιιηιικΠοη амб ^е11ег (1997) АлИкете & №с1. Ааб Эгид Эеу. 7:187; Ниб/1ак е1 а1. (1996) Αηΐ^зеηзе & №с1. Ааб Эгид Эеу. 6:267; Ратйтбде е1 а1. (1996) АмОкенке & №с1. Ааб Эгид Эеу. 6:169; АтаШага е1 а1. (2007) Βΐο^η). СЬет. 18:1325; Μοκοκ е1 а1. (2008) ВюТесЬтдиез 45:616.
Модифицированный олигонуклеотид может включать в себя измененный скелет. Модифицированные полинуклеотидные скелеты, которые не включают атом фосфора в свой скелет, образуются короткими алкильными цепями или циклоалкил межнуклеозидными связями, смешанными гетероатом и алкил или циклоалкил межнуклеозидными связями, или одной или более короткой гетероатомной цепью или гетероциклической межнуклеозидной связью. К ним относятся те, которые имеют морфолиновую связь (образована в части из сахарного фрагмента нуклеозида); силоксановый скелет; сульфид, сульфоксид и сульфоновый скелет; формацетил и тиоформацетил скелет; метиленформацетил и тиоформацетил скелет; рибоацетил скелет; алкенсодержащий скелет; сульфамат скелет; метиленимино и метиленгидразино скелет; сульфонат и сульфонамид скелет; амид скелет, а также другие, имеющие смешанные Ν, О, δ и СН2 компонентные части.
Модифицированный олигонуклеотид может содержать один или более замещенных остатков сахара. Подходящие олигонуклеотиды составляют группу заместителей сахара, выбранных из ОН, Р, О-, δили Ν-алкил; О-, δ- или Ν-алкенил, О-, δ- или Ν-алкинил, или О-алкил-О-алкил, где алкил, алкенил и алкинил может быть замещенным или незамещенным С1-С1о алкилом или С2-С10 алкенилом и алкинилом. Также подходящими являются Ο^ΗΧ,Ο^^,,Ο^ΗΧΟ^,,Ο^ΗΧ,ΝΗ, О(С1 ΜΑΊ к Ο^Χ,ΟΝΗ и О(СН2)пО^(СН2)пСН3)2, где η и т от 1 до 10. Другие подходящие олигонуклеотиды составляют группу заместителей сахара, выбранных из С1-С10 низший алкил, замещенный низший алкил, алкенил, алкинил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, ЗН, ЗСН3, ОСИ С1, Вг, ΟΝ, СР3, ОСР3, ЗОСН3, ЗО2СН3, ΟΝΟ2, ΝΟ2, Ν3, ΝΉ2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, РНК расщепляющие группы, репортерные группы, интеркаляторы и тому подобное. Соответствующие модификации включают в себя 2'-метоксиэтокси (2'-О-СН2 СН2ОСН3, также известную как 2'-О-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Мабш е1 а1., Нек. С1йт. Ас1а, 1995, 78, 486-504), т.е. алкоксиалкоксигруппу. Еще соответствующие модификации включают в себя 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е. О(СН2)2О^СН3)2 группу, также известную как 2'-ЭМАОЕ, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известную в данной области техники как 2'-О-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-ЭМАЕОЕ), т. е. 2'-О-СН2-ОСН2-ЖСН3)2.
Модифицированный олигонуклеотид может содержать одну или более нуклеооснований (часто называют в науке просто как основание) модификаций или замен. Как здесь используется, неизмененное или естественное нуклеооснование включает пуриновые основания аденин (А) и гуанин (С), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (И). Модифицированные нуклеооснования включают в себя другие синтетические и природные нуклеиновые основания, такие как 5-метилцитозин (5-те-С), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил и цитозин, 5-пропинил (-С = С-СН3) урацил и цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8замещенные аденина и гуанина, 5-гало особенно 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацила и цитозина, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-Р-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-диазагуанин и 7-диазааденин и 3-диазагуанин и 3-диазааденин. Дальнейшее изменение нуклеиновых оснований включает трициклические пиримидины, такие как феноксазина цитидин (1Н-пиримидо (5,4-Ь) (1, 4) бензоксазин-2 (3Н)-он), фенотиазина цитидин (1Н-пиримидо (5,4-Ь) (1,4) бензотиазин-2 (3Н)-он), С-зажимы, такие как замещенные феноксазина цитидин (например, 9-(2-аминоэтокси)-Н-пиримидо (5,4(Ь) (1, 4) бензоксазин -2(3Н)-он), карбазол цитидин (2Н-пиримидо (4,5-Ь) индол-2-он), пиридоиндол цитидин (Н-пиридо (3',2': 4,5) пирроло (2,3-б) пиримидин-2-он).
Остатки гетероциклических оснований могут также включать те, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменяется другим гетероциклом, например, 7-диазааденином, 7-диазагуанозином, 2-аминопиридином и 2-пиридоном.
Подходящие ферментативно неактивные сайт-специфические эндорибонуклеазы включают в себя ферментативно неактивные сайт-специфические эндорибонуклеазы описанные ниже. Например, могут быть использованы ферментативно неактивные сайт-специфические эндорибонуклеазы, как показано на фиг. 6.
В некоторых вариантах воплощения целевой полирибонуклеотид связан (ковалентно или некова- 20 024121 лентно) на твердом носителе (на нерастворимом носителе). Подходящие нерастворимые носители включают, но не ограничиваются этим, шарики, планшеты (например, мультилуночные планшеты), полосы и т.д., где нерастворимый носитель может включать в себя различные материалы, включая, но не ограничиваясь этим, полистирол, полипропилен, агарозу и тому подобные.
Олигонуклеотидные зонды (олигонуклеотид обнаружения ) могут быть РНК, ДНК, или любой химически модифицированной версией РНК или ДНК, например пептидными нуклеиновыми кислотами (ΡNЛ5), заблокированными нуклеиновыми кислотами (ΕΝΆκ). и тому подобное.
Метод секвенирования полирибонуклеотида может включать в себя одну или несколько промывок, например, для удаления неспецифических родственных связанных компонентов, таких как неспецифически связанных олигонуклеотидных зондов, любых неспецифически связанных обнаруженных фрагментов и тому подобное.
Неограничивающий пример того, как осуществлять способ секвенирования полирибонуклеотида заключается в следующем. Целевой полирибонуклеотид связан с твердой подложкой. Целевой полирибонуклеотид имеет неизвестную последовательность и является РНК-последовательностью. Четыре олигонуклеотидных зонда из четырех различных известных нуклеотидных последовательностей каждая включают различные флуорофоры (флуорофоры 1-4). Флуорофоры являются членами РКЕТ пар. Соответствующие члены РКЕТ пар являются квантовыми точками. Квантовая точка связана с ферментативно неактивной сайт-специфической эндорибонуклеазой. Ферментативно неактивная сайт-специфическая эндорибонуклеаза связывает, но не расщепляет, дуплекс, образующийся между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом. Только один из четырех олигонуклеотидных зондов связывает и образует дуплекс с целевым полирибонуклеотидом. Промывка удаляет любые несвязанные олигонуклеотидные зонды. Связывание олигонуклеотидного зонда-флуорофор2 приводит к формированию дуплекса с целевым полирибонуклеотидом. Флуорофор2, таким образом, находится в непосредственной близости от квантовой точки, связанной с ферментативно неактивной сайт-специфической эндорибонуклеазой, и флуоресценция гасится.
Способы расщепления полирибонуклеотида
Настоящее изобретение обеспечивает способ расщепления полирибонуклеотида сайтспецифическим образом. Способ обычно включает в себя взаимодействие субстрата полирибонуклеотида с ферментативно активной сайт-специфической эндорибонуклеазой (например, Ску4 эндорибонуклеазой) в условиях, которые способствуют сайт-специфическому расщеплению полирибонуклеотидного субстрата. Способ расщепления полирибонуклеотида сайт-специфическим образом может быть использован для: 1) снятия аффинной метки с подложки полирибонуклеотида; 2) для получения популяции полирибонуклеотидных продуктов, имеющих однородность на 5' конце, например, когда субстраты полирибонуклеотидов являются ίη νίίτο транскрибируемыми мРНК; и 3) для регулирования экспрессии генов в клетке ίη νίίτο или ίη νίνο.
Субстрат полирибонуклеотидов
Термин субстрат полирибонуклеотида и целевой полирибонуклеотид являются используемыми здесь взаимозаменяемо для обозначения полирибонуклеотида, который связан сайт-специфической эндорибонуклеазой сайт-специфическим образом. Субстрат полирибонуклеотида может быть одноцепочечным. В некоторых случаях субстрат полирибонуклеотида двухцепочечный.
Эндорибонуклеаза связывает и расщепляет субстрат полирибонуклеотида сайт-специфическим образом. Так, например, эндорибонуклеаза связывает и расщепляет субстрат полирибонуклеотида в определенной последовательности, называемые здесь последовательность узнавания или сайт узнавания.
Последовательность узнавания может быть тетрануклеотидной последовательностью, пентануклеотидной последовательностью, гексануклеотидной последовательностью, гептануклеотидной последовательностью, октануклеотидной последовательностью, или больше, чем октануклеотидной. Например, в некоторых вариантах воплощения последовательность узнавания составляет 9 рибонуклеотидов, 10 рибонуклеотидов, 11 рибонуклеотидов, 12 рибонуклеотидов, 13 рибонуклеотидов, 14 рибонуклеотидов, 15 рибонуклеотидов, 16 рибонуклеотидов, 17 рибонуклеотидов, 18 рибонуклеотидов, 19 рибонуклеотидов или 20 рибонуклеотидов в длину. В некоторых вариантах воплощения сайт-специфическая эндорибонуклеаза расщепляет сразу 5' последовательность узнавания. В некоторых вариантах воплощения сайтспецифическая эндорибонуклеаза расщепляет сразу 3' последовательность узнавания. В некоторых вариантах воплощения сайт-специфическая эндорибонуклеаза расщепляет внутри последовательность узнавания. В некоторых случаях последовательность узнавания является сразу 5' вторичной структурой. В некоторых случаях последовательность узнавания находится в 5' вторичной структуре и имеет внутри 1 нуклеотид (ηί), 2 ηί, 3 ηί, 4 ηί, 5 ηί, или от 5 ηί до 10 ηί вторичной структуры. В некоторых случаях последовательность узнавания является сразу 3' вторичной структурой. В некоторых случаях последовательность узнавания находится в 3' вторичной структуре и имеет внутри 1 нуклеотид (ηί), 2 ηί, 3 ηί, 4 ηί, 5 ηί, или от 5 ηί до 10 ηί вторичной структуры.
В некоторых вариантах воплощения субстрат полирибонуклеотида включает в себя структуру ΧχΧ2Χ3Χ4Χ5Χ6Χ7Χ8Χ9Χι0ΧιιΧι2Χι3Χι4Χι5, где нуклеотиды Х1-Х5 пары оснований с Х11-Х15 также, как X] и Х15 образуют основания стволовой структуры, и такие, как Х^, Х7, Х8, Х9, и Х10 образуют замкнутый
- 21 024121 контур (петлю); структура является регулярной А-образной спиральной структурой.
В некоторых вариантах воплощения субстрат полирибонуклеотида включает в себя аффинную метку; и способ предусматривает удаление аффинной метки с субстрата полирибонуклеотида.
Сайт-специфические эндорибонуклеазы
Эндорибонуклеазы, которые связывают и расщепляют субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом, включают ферментативно активные полипептиды, которые расщепляют (гидролизуют) субстрат полирибонуклеотида в ион металла независимым способом.
Структурные особенности эндорибонуклеазы, которая связывает и расщепляет субстрат полирибонуклеотида сайт-специфическим и ион металла независимым образом, может включать в себя одну или несколько из следующих особенностей: 1) высокую основную альфа-спираль для сайт-неспецифического распознавания фосфатного скелета РНК по РНК основным бороздам, например, Е114, Е115, Е118, Е119, или их эквиваленты; 2) Е102 и / или 0104. или их эквиваленты, создающие водородные связи при контакте с большой бороздкой РНК ствола; 3) и одного или более Н1829, 8ет148 и Туг176, или их эквивалентов, участвующих в катализе; и 4) Р155 или их эквивалент.
Эндорибонуклеазы, которые связывают и расщепляют субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом, включают ферментативно активные полипептиды, которые имеют по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99% или на 100%, идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной на фиг. 4 (Ску4 аминокислотной последовательностью).
Эндорибонуклеазы, которые связывают и расщепляют субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом, включают ферментативно активные полипептиды, которые имеют по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 % или на 100%, идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной на фиг. 5 (Ску4 аминокислотной последовательностью).
Эндорибонуклеазы, которые связывают и расщепляют субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом, включают ферментативно активные полипептиды, которые имеют по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 % или на 100%, идентичность аминокислотной последовательности с Сак6 аминокислотной последовательностью.
Эндорибонуклеазы, которые связывают и расщепляют субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом, включают ферментативно активные полипептиды, которые имеют по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90%, по меньшей мере около 95%, по меньшей мере около 98%, по меньшей мере около 99 % или на 100%, идентичность аминокислотной последовательности с СакЕ аминокислотной последовательностью.
Эндорибонуклеазы, которые связывают и расщепляют субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом, включают ферментативно активные полипептиды, которые отличаются от аминокислотной последовательности, изложенной в любой одной из фиг. 4 или 5 на от 1 до 20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) аминокислотных замен и/или вставок и/или удалений.
Условия реакции
Сайт-специфическая эндорибонуклеаза может гидролизовать субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом при температуре в диапазоне от примерно 15 до примерно 100°С, например, в диапазоне от примерно 15 до примерно 17°С, от примерно 17 до примерно 20°С, от примерно 20 до примерно 25°С, от примерно 25 до примерно 30°С, от примерно 30 до примерно 40°С, от примерно 40 до примерно 50°С, от примерно 50 до примерно 60°С, от примерно 60 до примерно 70°С, от примерно 70 до примерно 80°С, от примерно 80 до примерно 90°С, или от примерно 90 до примерно 100°С.
Сайт-специфическая эндорибонуклеаза может гидролизовать субстрат полирибонуклеотида сайтспецифическим образом в диапазоне рН от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,0, например, приблизительно от рН 4,0 до примерно 4,5, примерно от рН 4,5 до примерно 5,0, примерно от рН 5,0 до примерно 5,5, примерно от рН 5,5 до примерно 6,0, примерно от рН 6,0 до примерно 6,5, примерно от рН 6,5 до примерно 7,0, примерно от рН 7,0 до примерно 7,5, примерно от рН 6,5 до примерно 7,5, примерно от рН 7,5 до примерно 8,0, примерно от рН 6,5 до примерно 8,0 или примерно от рН 5,5 до примерно 7,5.
Примеры
Следующие примеры предложены так, чтобы обеспечить специалистам в этой области техники полное раскрытие и описание того, как создавать и использовать настоящее изобретение, и не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели считают своим изобретением, и они не предназначены для представления о том, что эксперименты ниже являются всеми или единственными экспериментами, которые выполнены. Были предприняты усилия, чтобы обеспечить точность по отношению к используемым числам, (например, количество, температура и т.д.), но некоторые экспериментальные ошибки и отклонения должны быть учтены. Если не указано иначе, части являются частями по весу, мо- 22 024121 лекулярная масса составляет среднюю молекулярную массу, температура представлена в градусах Цельсия, а давление находится на уровне или близком к атмосферному. Стандартные сокращения могут быть использованы, например, йр, пара(ы) оснований; кй, килобаза(ы); пкл, пиколитр(ы); с или сек, секунда(ы); мин, минута(ы); ч или час, час(ы); аа, аминокислота(ы); кй, килобаза(ы); йр, пара(ы) оснований; ηί, нуклеотид(ы); 1.т., внутримышечно (ые); 1.р., внутрибрюшинно(ые); 8.с, подкожно(ые), и тому подобное.
Пример 1. Прямое обнаружение РНК и последовательность использования белков семейства Ску4 Материалы и способы
Ску4 дикого типа, точечные мутанты и селенометионин (8еМер-замещенные Ску4 были экспрессированы в Рокейа 2 (ΌΕ3) клетках, либо как Н186-мальтоза связывающий гибридный белок (МВР) или Н|к6 гибридный белок и очищали с помощью Νί-аффинной хроматографии с последующим протеолитическим удалением Н1к(МВР) метки, с дальнейшим шагом Νί-сродства и гель-фильтрации. р^е-с^РNА8 были транскрибированы ίη νίίΐΌ с полимеразой Т7 и очищены на денатурирующем геле. Комплекс был сформирован путем инкубации РНК с Ску4 в соотношении 2:1 в течение 30 мин при температуре 30°С с последующей гель-фильтрацией. Комплекс был кристаллизован с использованием висячего капельного способа в 200 мМ цитрата натрия, рН 5,0, 100 мМ хлорида магния, 20% (вес/об.) поли(этиленгликоля) (РЕС)-4000 (дикого типа (ЮТ) комплекс) или 150 мМ ацетата натрия рН 4,6,17% РЕС4000 или 160 мМ ацетата натрия, рН 4,6, 18% РЕС4000 (822С содержащий комплекс). Структура ЮТ Ску4-РНК комплекса определяется способом многоволновой аномальной дисперсии (МАО) с использованием 8еМе1замещенных кристаллов. Структура Ску4 (822С)-РНК комплекса была определена посредством молекулярной замены.
Геномное аннотирование (картирование), клонирование, экспрессия и очистка белков
Сравнительный анализ последовательности Ску4 генов у разных видов определенной консервативной области 20 кодонов вверх от аннотированного стартового кодона в РА14 геноме. Ьее, еί а1. Сепоте Вю1 7, Р90 (2006). Консервативная Ску4 (РА 14_33300) последовательность была ПЦР-амплифицирована из Ркеийотоиак аегидшока ИСВРР-РА14 геномной ДНК с использованием Ра14С5у4_Г\\й: сасса1ддассас(ассЮдасаПсд и Ра14Ску4_геу: даассадддаасдааасс&с. Продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР) клонировали с использованием Са1е\уау 8у8ίет в рЕЭТР/ТЕУ/О-ТОРО входного вектора (1пу11годеп), после чего посредством сайт-специфической рекомбинации в вектор экспрессии рНСЮА или рНМСЮА. Викко, еί а1. Апа1уйса1 ВюсНепикйу 343, 313-321, (2005). Точечные мутации были введены в Ску4 с помощью ЦшкСйапде 8Не-01гес1еН Ми1адепек1к К11 (81га1ацепе). Ра14Ску4 экспрессия плазмиды была трансформирована в Е.соН Рокейа 2 (ОЕ3) (Шуадеп) или совместно трансформирована с рМК вектором экспрессии СР18РР РНК, синтезированным Сепеай (Редепкйигд, Сегтапу). Рокейа 2 (ОЕ3) выращивали в Йипа Вго1й (ЬВ) с добавлением ампициллина и хлорамфеникола. Экспрессию белка индуцировали 0,5 мМ изопропил Р-О-1-тиогалактопиранозида (1РТС) (АГГутейтх) при плотности клеток ок.0,5 ОЭ с последующим встряхиванием при 18°С в течение 16 ч. Клетки осаждали и ресуспендировали в буфере для лизиса (15,5 мМ динатрийгидрофосфат, 4,5 мМ дигидрофосфат натрия, 500 мМ хлорида натрия, 10 мМ имидазола, ингибиторы протеаз, 5% глицерина, 0,01% Тритон Х-100, 100 мкМ / мл О№ке1, 1 мМ Трис [2-карбоксиэтил] фосфин гидрохлорид (ТСЕР), 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида, рН 7,4) и обрабатывали ультразвуком на льду в течение двух минут, очередями по 10 с. Лизат осветляли центрифугированием (24000 х §, 30 мин) и инкубировали с никель-нитрилотриуксусной кислотой (Νί-ΝΊΆ) в аффинной смоле в пакете (Ц1адеп). Связанный белок элюировали высокоимидазольным буфером (15,5 мМ динатрийгидрофосфат, 4,5 мМ дигидрофосфат натрия, 500 мМ хлорида натрия, 300 мМ имидазола, 1 мМ ТСЕР, 5% глицерина, рН 7,4) и диализовали в течение ночи в диализном буфере (буфер элюирования только с 20 мМ имидазола) в присутствии вируса табачной мозаики (ТЕУ) для расщепления Н|к6 или Н1к6МВР метки. Белок был сконцентрирован (Атюоп) и очищен на никель аффинной колонке (СЕ), а затем на тандеме 8ир75 (16/60) колонок в буфере для гель-фильтрации (100 мМ НЕРЕ8 рН 7,5, 500 мМ КС1, 5% глицерина, 1 мМ ТСЕР). Затем образец диализовали против буфера гель-фильтрации, содержащего только 150 мМ хлорида калия. Аналогичный протокол был использован для подготовки селенометионина (8еМеЦ-производного белка и единственным заметным отличием стала среда экспрессии. Коротко, ВЬ21 (ОЕ3) клетки трансформировали с Ску4 (рНСЮА) вектором экспрессии и были выращены в М9 минимальной среде с ампициллином, как описано выше Ю1ейепйей, еί а1. 8йисй1ге 17, 904-912 (2009).
Анализы нуклеазной активности пикомоль дикого типа или мутантного Ску4 инкубировали с 5 пикомоль ш У11го транскрипционной РАН р^е-с^РNА (полученной, как описано; ЮейепйеП (2009) см. выше) в 10 мкл реакционной среды, содержащей 20 мМ НЕРЕ8 рН 7,5, 100 мМ калия хлоридного буфера при 25°С в течение 5 мин. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл кислоты фенол-хлороформ (Атйюп). 10 мкл дополнительного буфера реакции было добавлено и образцы центрифугировали (16000 х д 30 мин) и 16 мкл водного образца было отобрано, смешано 1:1с 2Х заполняющего буфера с формамидом и разделено на 15% денатурирующем полиакриламидном геле. РНК визуализированы с 8УВР Со1д красителем (1пуйгодеп).
- 23 024121
Кристаллизация
Все эксперименты кристаллизации проводились при температуре 18°С с использованием способа висячей капли диффузии водяного пара путем смешивания равных объемов (1 мкл + 1 мкл) комплекса и запасных растворов. Пластинчатые кристаллы дикого типа С8у4-РНК комплексов выращивали в 200 мМ цитрата натрия рН 5,0, 100 мМ хлорида магния, 20% (вес/об.) поли(этиленгликоля) -4000 (РЕС4000). Эти кристаллы принадлежали к пространственной группе С2, содержащей в одном экземпляре комплекс в асимметричной единице и дифрагированной с разрешением до 2,3 ангстрем на синхротронном рентгеновском источнике. При использовании воссоздания комплекса с Сзу4§22С точечным мутантом две дополнительные формы кристаллов были получены в 150 мМ ацетата натрия рН 4,6, 17% (вес/об.) РЕС4000 и 160 мМ ацетата натрия, рН 4,6,18% РЕС4000. Первоначально гексагональные кристаллы появились в течение 24 ч. Эти кристаллы дифрагировали до разрешения 2,6 ангстрем, принадлежали к пространственной группе Ρ6ι и содержали одну копию комплекса в асимметричной единице. 48 ч спустя те же условия кристаллизации дали игольчатые кристаллы, которые принадлежали к пространственной группе Ρ212121 и содержали в двух экземплярах комплекс и дифрагировали до разрешения 1,8 ангстрем. Для сбора данных все кристаллические формы были подвергнуты криозащите путем замачивания в своих маточных растворах с добавлением 30% глицерина до мгновенного охлаждения в жидком азоте.
Определение структуры
Все дифракционные данные были собраны при 100 К на каналах синхротронного излучения 8.2.2 и 8.3.1 АДуапсеД §оитсе (Ьа^тепсе Вегке1еу Ναΐίοηαΐ ЬаЪотайгу). Данные были обработаны с помощью ΧΌδ. КаЪзск, Лс1а Сту81а11одт Ό Вю1 Сту81а11одт 66,125-132 (2010). Экспериментальные фазы были определены из трех длин волн в эксперименте с многоволновой аномальной дисперсией (МАО) (максимум, перегиб и удаленные наборы данных) с использованием моноклинных С8у4-РНК кристаллов, содержащих селенометионин-замещенную С8у4 дикого типа. Два участка селена были локализованы с использованием НуЪпД 8иЪ81гис1иге §еатск (Ну§§) модуля пакета РЬешх. Сго88е-Кип811еуе. апД АДат8. Ас1а Сту81а11одт Ό Вю1 Сгу81а11одг 59, 1966-1973 (2003). Субструктурные уточнения, фазирование и модификация плотности проводились с использованием Аи1о8НАКР. Уопгкеит е1 а1. Ме1коД8 Мо1 Вю1 364, 215-230 (2007). Полученная карта плотности электронов показала ясно слои плотности, связанные с белком и РНК, чередующиеся вдоль оси с, при этом слой РНК состоит из двух коаксиально соединенных спиралей РНК, участвующих в целующейся петле взаимодействия. Начальная атомная модель для С8у4 белка была получена автоматическим построением с помощью модуля РЬешх АШоВиПД. ТетМШдет, е1 а1, Ас1а Сту81а11одт Ό Вю1 Сту81а11одт 64, 61-69, (2008). Комплексная модель была завершена путем итерационных циклов ручного построения в СООТ (Ет81еу, апД СоМап, Ас1а Сгу81а11одг Ό Вю1 Сту81а11одт 60, 21262132 (2004)) и уточнения с использованием Ркешх.текте36 (АДат8, е1 а1. Ас1а Сгу81а11одг Ό Вю1 Сгу81а11одг 66,213-221 (2010)) против нативного набора данных при разрешении 2,33 ангстрем, что дало окончательную модель с кристаллографическим Кток фактором 21,4% и К£гее фактором 26,4% (табл. 1).
Таблица 1. Сбор данных, фазирование и уточнение статистики
Нативная Нативная Нативная ТУТ
ТУГ 522С 322С ЗеММТУТ
Сбор данных
Пространственная группа С2 Р2,2,2, Рб, С2
Размеры клетки
- 24 024121
62 37, 7277, 40 1,78 9 39 25, 39 25. 62 33, 4723.
вгЬ,с(А) 8662 1459 29737 87 26
900
1082. 90 0,90 0. 90 0. 90 0. 90 0,
а.Ич( ) 900 900 1200 108 3,90 0
Пик Перегиб Удаленный
Длина волны
(А) 111159 0 99992 111588 0 97949 097971 0 97204
Разрешение 1963-2 33 694-1 80 22 38-260 8286-2 80 82 86-2 80 82 86-2 80
(А) (2 50-2 33) (1 90-1 80) (270-2 60) (2 90-280) (2 90-2 80} (2 90-2 80)
58(44 6) 7 0(52 8) 3 3(31 1) 94(38 3) 8 9(38 5) 9 0(381)
1АР 18 9(3 35) 31 1 (31) 29 8 (3 3) 17 0(4 4} 14 5(3 7) 14 5(3 6)
Полнота
(%)· 96 6(98 3) 98 7(91 0) 994(985) 99 6 (96 7) 99 5 (99 3) 993(964)
Избыточность* 44(44) 19 8(6 5) 61 (54) 57(53) 38(3 7) 38(37}
Уточнение
Разрешение (А) 1970-2 33 69 4-1 80 1960-260
Νο отражений 9974 43284 7798
0 214/ 0 255/
Рмгк/П 0265 0187/0220 0279
Νο атомов
Белок 1273 2975 1364
РНК 313 642 321
Вода/лиганды 41 386 5
6-фэкгоры
Белок 47 7 291 101 5
РНК 1093 353 1030
Вода/лиганды 449 335 745
Кгле отклонения Длина связей (А) 0007 ООН 0002
Углы связей (°) 1 0 1 5 07
• Значения в скобках обозначают высокое разрешение оболочки
Модель включает в себя РНК нуклеотиды С1-О15 и фосфатные группы нуклеотидных остатков С1б и остатков белка 1-104,109-120 и 139-187. Благодаря слоистому расположению белка и РНК в кристаллической решетке и отсутствию бокового контакта кристаллов в слое РНК, РНК демонстрирует значительные нарушения функциональности, о чем свидетельствуют резко повышенные температурные факторы (> 100 А2) и отсутствие интерпретации плотности для нуклеотидного основания И9. Нарушение проявляется также в остатках белка 109-120, соответствующих аргинин-богатой спирали, вставленной в паз основной РНК, на которых нужный полипептидный скелет может быть построен (за исключением остатков Агд 115 и Агд 118). Структуры Сзу4 (§22С)-РНК комплекса в гексагональной и орторомбической кристаллической формах были определены посредством молекулярной замены в РЬазет (МсСоу, е1 а1. 1 Арр1 Стуз1а11одт 40, б58-б74 (2007)), используя Сзу4 белок (не хватает аргинин-богатой спирали) и РНК моделей моноклинной кристаллической формы в виде отдельных поисковых ансамблей. В обоих кристаллических формах, электронная плотность на аргинин-богатой спирали и линкерном регионе, включающем Сзу4 остатки 105-108 было сразу заметно в 2Ро-Рс картах, полученных от молекулярных растворов замещения. Структура Сзу4 (§22С)-РНК комплекса в гексагональной форме была уточнена до К„огк фактора на 25,5% и К£гее на 27,9 при разрешении 2,б ангстрем. Окончательная модель включает в себя Сзу4 остатки 1-120 и 139-187 и РНК нуклеотиды С1-О15 плюс фосфатную группу нуклеотида С1б. Орторомбическая кристаллическая форма Сзу4 (§22С)-РНК комплекса была показана на уровне разрешения 1,8 ангстрем и уточнена до К„огк фактора на 18,7% и К£гее на 22,0%, с отличной стереохимией. Из двух комплексов в асимметричном блоке, комплекс 1 (цепи А и С) содержит Сзу4 остатки 1-187 и РНК нуклеотиды С1015 плюс фосфатную группу нуклеотида С1б, в то время как менее упорядоченный комплекс 2 (цепи В и Ό) включает в себя Сзу4 остатки 1-187, за исключением остатков 13-15 и 135-138, которые показывают неупорядоченную электронную плотность, и РНК нуклеотиды С1-015 и фосфатная группа нуклеотида С1б. Два экземпляра Сзу4 дают суперпозицию с гтзб 1,15 ангстрем на 179 атомах Са, наибольшие различия исходя из несколько иной позиции аргинин-богатой спирали. Эти две молекулы РНК в асимметричной совмещенной единице с гтзб 1,49 ангстрем, дают наибольшее отклонение, что связано с выпячиванием нуклеотида И9, который предполагает различные конформации в двух РНК. Наши обсуждения и иллюстрации через всю рукопись основаны на комплексе 1 орторомбической кристаллической формы. Все структурные иллюстрации были получены с использованием Руто1 1П1р:/Лу\у\у(бо1)руто1(бо1)огд).
- 25 024121
Результаты
СК1ЗРК-медиированный иммунитет, как полагают, происходит из примерно90% простейших и 40% бактериальных геномов на основе наличия СК1ЗРК локусов в последовательности геномов. Ногуа1й апб Ваггапдои, Заепсе 327, 167-170 (2010); йткеп, е1 а1. Мо1еси1аг МюгоЬю1оду 43, 1565-1575 (2002); Зогек, е1 а1. №1 Кеу МюгоЬю1 6, 181-186 (2008); МаггаГйш, апб ЗоШНеппег, ΝηΙ Кеу Сепе1 11,181-190 (2010). СК18РК ассоциированные (Сак) белки, принадлежащие к восьми известным СК1ЗРК/Сак подтипам весьма расходятся на уровне первичной последовательности, скрывая идентификацию функциональных гомологов. Най, е1 а1. РЬоЗ Сотри! Вю1 1, е60 (2005); Макагоуа, е1 а1. Вю1оду Эпес! 1, 1-26 (2006). Ркеиботопак аегидшока ИСВРР-РА14 (далее Ра14), грамотрицательный оппортунистический патоген, укрывает СК1ЗРК/Сак систему подтипа Уегаша. содержит шесть Сак генов в окружении двух элементов СК18РК (фиг. 1А). Хотя Сак1 находится универсально среди СК18РК содержащих организмов, и Сак3 очевидно, находится в большинстве подтипов, Ску1-4 являются уникальными для подтипа Уегкнйа. Оба СК18РК элемента содержат характерные расположения 28-нуклеотидных повторов, идентичных в обоих СК18РК (за исключением одного нуклеотида) и перемежаются с ~32-нуклеотидными уникальными спейсерами, некоторые из этих совместимых последовательностей найдены в бактериофагах или плазмидах. Спкка, е1 а1. ВМС ВютГогтайск 8, 172 (2007). Во многих организмах было показано, что СК18РК локусы транскрибируются как длинные отдельные единицы и пост-транскрипционно обрабатываются для получения сгКИАк, каждый из которых содержит одну уникальную последовательность в окружении последовательностей, полученных из повторяющихся элементов. Вгоипк е1 а1. Заепсе 321, 960-964 (2008); Сапе, е1 а1. Оепек апб Иеуе1ортеп1 22, 3489-3496 (2008); Тапд, е! а1. Ргос. ЫаЙ. Асаб. Зск ИЗА 99, 7536-7541 (2002); ЫПекЮк е! а1. Агсйаеа 2, 59-72 (2006); Ы11ек1о1, е! а1. Мо1 МюгоЬю1 72,259-272 (2009); Тапд, е! а1. Мо1еси1аг М1сгоЬю1оду 55,469-481 (2005).
Для определения белка (ов), ответственного (ых) за производство сгКЫАк от длинных СК1ЗРК транскриптов (рге-сгКЫАк) в подтипе Уегкйна, каждый из шести белков Сак из Ра14 был рекомбинантно экспрессирован, и рекомбинантно экспрессированные белки были протестированы на эндорибонуклеолитическую функцию, используя ш уйго транскрибированную рге-сгКЫА. На основе сайтспецифической рге-сгКИА обработки активности, было установлено, что эта Ску4 эндорибонуклеаза ответственна за биогенез сгКЫА. Как было отмечено для αΡΝΛ обработки при изучении двух других СК1ЗРК/Сак подтипов (Вгоипк е1 а1. (2008) выше; Сапе е1 а1. (2008) выше), СК1ЗРК транскрипционное расщепление является быстрой, ион металла независимой реакцией. Ску4 расщепляет рге-αΡΝΛ в повторных элементах на базе предсказываемой структуры стволовой петли, создавая ок.60 нуклеотидных сгКИАк, состоящих из 32-нуклеотидных уникальных (фаг-производных) боковых последовательностей на 5' и 3' концах на восемь и 20 нуклеотидов, соответственно, повторяющейся последовательности (фиг. 1А).
Для Ску4 чтобы быть эффективной, было высказано предположение, что ее механизм РНК распознавания должен быть очень специфичным, чтобы быть предназначенным только для СК1ЗРКпроизводных транскриптов, а не других клеточных РНК, содержащих шпильки и/или родственные последовательности. Чтобы проверить это, Ску4 была экспрессирована в Е. сой самостоятельно или совместно экспрессирована с Ра14 СК1ЗРК РНК. Несмотря на высокую изоэлектрическую точку (Р1 = 10,2), Ску4 не ассоциируется с клеточными нуклеиновыми кислотами, однако, когда коэкспрессируется с СК1ЗРК Ра14 белком, связанным с сгКЯА (фиг. 1В, С). Эти наблюдения подчеркивают специфику Ску4 распознавания, приводя нас к изучению белок / РНК взаимодействия, необходимого для распознавания Ску4 субстрата и расщепления. Ску4 анализы строения и активности проводили ш уйго с использованием РНК олигонуклеотидов, соответствующих различным регионам 28-нуклеотидной Ра14 СК1ЗРК повторяющейся последовательности. Используя этот подход, минимальный фрагмент РНК, распознаваемый Ску4, состоящий из повторяющихся производных стволовых петель и одного опускающегося нуклеотида был идентифицирован. Анализ расщепления с использованием этой минимальной РНК в качестве субстрата показал, что Ску4 активность требует 2'ОН на рибозе непосредственно перед сайтом расщепления. 2'-дезоксирибоза в этом положении полностью отменяет расщепление, но не нарушает Ску4 фиксацию.
Для того чтобы получить структурный взгляд на сгКЫА распознавание и расщепление, Ску4 была совместно кристаллизована в комплексе с минимальным субстратом РНК. Для создания стабильного комплекса для структурного анализа, Ску4 была связана с нерасщепляемым 16-нуклеотидным минимальным субстратом РНК, как описано выше, в котором нуклеотидом, предшествующим сайту расщепления, является 2'-дезоксинуклеотид. Кристаллы комплекса были получены в трех уникальных пространственных группах, демонстрируя различные упаковки кристалла, один содержащий Ску4 дикого типа и два содержащих Ску4 с точечными мутациями. Кристаллическая структура Ску4-РНК комплекса была определена с разрешением 1,8 ангстрем (фиг. 2А, табл. 1), выявлен непредвиденный механизм, с помощью которого СК1ЗРК РНК распознается и обрабатывается для использования СК1ЗРК-опосредованным комплексом сайленсинга. Ску4 делает сайт-специфические контакты в большой бороздке ствола-петли СК1ЗРК повторяющейся последовательности и дополнительной последовательности неспецифических контактов со скелетом из стволовых РНК. Большинство характерных белок/РНК взаимодействий опо- 26 024121 средуются малой бороздкой спирали РНК; распознавание РНК большой бороздки Ску4 является весьма необычным механизмом белок/РНК взаимодействия.
На уровне первичной последовательности Ску4 сильно отличаются от других известных эндорибонуклеаз, участвующих в αΗΝΑ биогенезе (СакЕ от ТЬегтик !ЬетторЫ1ек (ЕЫЬага е! а1. Рго!ет δα 15, 1494-1499 (2006)) и Сак6 от Ругососсик Гипокик Сапе е! а1. (2008) см. выше), делясь только ок. 10% идентичностью. Кристаллические структуры в обоих СакЕ и Сак6 показывают, что эти белки принимают участие в тандеме ферродоксин-подобных складок. Примечательно, что Ску4 участвует в этой складке с этими ферментами; Ску4-РНК комплекс, Ν-концевой домен (остатки 1-94) из Ску4 действительно принимает ферредоксин-подобную складку. Однако, несмотря на то, что С-концевой домен (остатки 95-187) разделяет то же вторичное подключение структуры, как и ферредоксин-подобная складка, но его конформация заметно отличается. Поразительно, аргинин-богатая спираль (остатки 108-120) от предполагаемого С-концевого домена ферредоксин вставляет в большие бороздки шпильки РНК. Структурные суперпозиции с помощью ΌΑΣΙ сервера (Но1т, апб δίπ^τ, ί Мо1 Вю1 233,123-138 (1993)) показывают, что Ску4 в своей РНК-связывающей конформации образует суперпозицию с СакЕ и Сак6 со среднеквадратичным отклонением (гткб) в 3,8 А (более 111 атомов Са) и 3,9 А (более 104 атомов Са), соответственно. Ску4, СакЕ и Сак6 могли быть потомками одной родовой эндорибонуклеазы, которые расходились заметно на уровне последовательности, совместно эволюционировали с повтора последовательности локуса СККРК, сохраняя при этом аналогичную складку белка.
Субстрат с^КNЛ образует структуру шпильки, как и предсказывают для этого подкласса αΒΝΑ повторы (Китп, е! а1. Сепоте Вю1 8, К61 (2007)), с нуклеотидами 1-5 и 11-15 парные основания дают регулярную А-форму винтового ствола. ΟυΑυΑ пентапетля содержит рассеченную Ο6-Α10 пару оснований и выступающий нуклеотид υ9, его структура напоминает ΟΝΡ(Ν)Α пентапетлю, найденную в дрожжах и6 малых ядерных РНК внутримолекулярной ствол-петли (Нирр1ег, е! а1. ΝπΙ δΙπκ:1 Вю1 9, 431-435 (2002)) и бактериофага лямбда ВохВ РНК (Ьедаи1!, е! а1. Се11 93, 289-299 (1998)). В Ску4-РНК комплексе, РНК стволовая петля охватывает Р-шпильку, образованную нитями β 7- β 8 из Ску4, с С1-С15 парами оснований, непосредственно соединенных на ароматической боковой цепи РЬе155 (фиг. 2В). Это якорь РНК ствола и ориентирует его на нужный угол, чтобы позволить сайт-специфические взаимодействия в большой бороздке.
Два остатка в линкерном сегменте, соединяющем тело Ску4 с аргинин-богатой спиралью, Α^102 и С1п104, образовали взаимодействия через водородные связи в большой бороздке РНК ствола, сайтспецифически распознавая С15 и А14, соответственно (фиг. 2В). Сκу4-с^ΡNЛ взаимодействие в дальнейшем стабилизировалось путем введения аргинин-богатой спирали в большую бороздку шпильки РНК в непосредственной близости от выпячивания нуклеотида и9 (фиг. 2С). Боковые цепи 114, 115,
118 и 119 контактируют с фосфатными группами нуклеотидов 2-6. Кроме того, в боковой цепи из 115 входит в зацепление с основанием С6, как только проявляется сайт-специфическое взаимодействие между богатой аргинином спиралью и шпилькой РНК. Интересно, что это взаимодействие очень напоминает, как некоторые вирусные белки взаимодействуют с большой бороздкой молекул бкРНК, например Та!/Таг взаимодействия в вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекции)23 и 1атЬба-МЬохВ комплексе в ламбдоидных фагах (Сат е! а1. №-Ииге δ1πκ:1ιιπι1 Вю1оду 5, 203-212 (1998)). В обоих случаях, высокоосновная α-спираль используется для сайт-неспецифического распознавания фосфатного остова РНК по РНК большой бороздке.
Ску4 распознает элемент шпильки СЮБРК повторяющейся последовательности и прикрепляется непосредственно после него. Структура, описанная в этом примере, содержит субстрат-мимическую РНК, которая не является компетентной для расщепления. В активном центре, плотность наблюдается только на фосфатной группе 3' предпоследнего нуклеотида, но не плотность для терминального сахара или основания, предположительно, из-за гибкости этого нуклеотида (фиг. 3А). Расщепляющийся фосфат связывается в карман, расположенный между β-поворотом β7-β8 шпильки на одной стороне и α1 спирали и богатой глицином петли, ранее выявленных в Сак6 и СакЕ, на другой. Три остатка проксимальнее, что фосфатные группы, скорее всего, участвуют в катализе, Н1к29, δе^148 и Туг176. Эти остатки - инвариантны среди 12 Ску4 последовательностей, которые были определены с использованием Β^ЛδТ поиска (Αί8θΗϋ1, е! а1. №с1ею Лс^бκ КекеагсЬ 25, 3389-3402 (1997)) в сочетании с ручной проверкой вблизи СК^РК локуса (Спкка, е! а1. ВМС ВютГогтаПск 8, 172 (2007)) (фиг. 4). Структура предполагает, что несколько остатков в Ску4 важны для медиирования субстрата распознавания/связывания и катализа. Точечные мутанты каждого из этих остатков были генерированы, их активность в реакциях расщепления была протестирована биохимически (фиг. 3В). Мутация предполагаемого каталитического сайта остатков Н1к29 или δе^148 отменяет активность расщепления. Тем не менее, мутация Туг176 на фенилаланине не нарушает активность, указывая, что Туг 176 может играть важную роль в ориентировании Шк29, хотя он непосредственно не участвует в катализе. Мутация Α^ 102 на аланине отменяет накопление с^ΡNЛκ. в то время как мутация С1п 104 на аланине несущественно нарушает активность, предполагая, что Α^102, в котором распознается пара терминального основания, имеет важное значение для правильной ориентации субстрата РНК, но С1п 104 не требуется ш уйго активности. РЬе155, по-видимому, играет
- 27 024121 большую роль в надлежащей ориентации РНК субстрата, тогда как аланин мутация в этом остатке значительно ограничивает сгКУЛ биогенез.
Идентификация серина, участвующего в медиированном расщеплении РНК, является неожиданной. Хотя мутации Шк29 на аланине приводит к каталитически неактивной Ску4, мутация лизина частично восстанавливает активность, что сильно свидетельствует, что Ηίδ29 выступает в качестве донора протонов, а не инициирует расщепление через нуклеофильную атаку.
СК18РК являются генетической памятью на основе нуклеиновых кислот иммунной системы, которая опирается на небольшие СК18РК-производные РНК для направления иммунной системы родственных последовательностей, связанных с вторжением генетических элементов. Филогенетический анализ СК18РК повторяющихся последовательностей определил различные категории СК18РК (Китп е! а1. Сепоте ΒίοΙ 8, К61 (2007)), которые коррелируют с определенным набором генов Сак. Совместное изменение генов Сак с определенными типами СК18РК повторяющихся последовательностей предполагает, что СК18РК повторы совместно эволюционировали с генами Сак, которые отвечают за адаптацию СК18РК, генерацию сгКЯАк и подавление вторжения генетических элементов. Структура, описанная здесь, детализирует необычный механизм распознавания того, что дискриминирует сгКЯА субстраты на основе сайт- и структурной специфичности, обеспечивая отличное понимание возможностей Ску4 и ее гомологов, чтобы легко отличить субстрат РНК от всех клеточных РНК.
Фиг. 1А-С.
Ра14Ску4 специфически распознает только ее субстрат рге-сгКЯА. а, Схема СК18РК/Сак локуса в Ра14. Шесть Сак генов прикрепляются по бокам с обеих сторон СК18РК локусов. Расширение схематически показывает предсказанную ствол-петлю из 28-нуклеотидных прямых повторов (черного цвета), разделенных 32-нуклеотидной спейсерной последовательностью (синий). Красные стрелки отмечают связь, которую расщепляет Ску4. Ь,с Сравнение белка (Ь) и РНК (с) после Ра14Ску4 экспрессии в Е.соП с (+) и без (-) плазмиды, содержащей Ра14 СК18РК локус. Очищенная Ску4 от обоих приготовлений была разделена на два пула. Половину из них разделяли на 8Э8-РАСЕ и визуализировали с окрашиванием кумасси синим, половину из них экстрагировали кислотой в фенол-хлороформе, разделяли на ИКЕА- РАСЕ и визуализировали с 8ΥΒΚ Сой (1пуйгодеп).
Фиг. 2А-С.
Кристаллическая структура Ску4 связана с субстратом РНК.
a) Фронтальный и задний вид комплекса. Ску4 окрашена в синий и скелет РНК окрашен в оранжевый;
b) Подробное взаимодействие между остатками К102 и 0104 и нуклеотидами А14 и С15. Водородная связь изображена пунктирными линиями;
c) Подробное взаимодействие между богатой аргинином альфа-спиралью и скелетом РНК и С6.
Фиг. 3А и 3В. Предполагаемый активный центр
a) Подробный обзор каталитического центра.
b) Активность расщепления Ску4. Дикого типа (^Т) Ску4 и серия одиночных точечных мутантов инкубировали ш уПго транскрибированной рге-сгКЯА в течение 5 мин при температуре 25°С. Продукты были экстрагированы кислотой в фенол-хлороформе и разделены на иКЕА-РАСЕ и визуализированы окрашиванием Сой 8ΥΒΚ.
Пример 2. Прямое секвенирование РНК
РНК может быть секвенирована на одномолекулярном уровне с использованием Форстер Резонансного Переноса Энергии (РКЕТ). РНК-последовательность будет прикреплена к твердой поверхности через ее 3 'рибозу. РНК должна быть расположена достаточно далеко от соседних молекул РНК на поверхности, чтобы позволить детекцию на одномолекулярном уровне. Расстояние продиктовано дифракционно-ограничивающими способами, в зависимости от длины волны излучаемого света. Альтернативно, РНК расположение может быть меньше, чем дифракционный предел, если используются методы визуализации с суперразрешением. На первом этапе обнаружения последовательности, белок семейства Ску4 с известным специфическим связыванием нуклеиновых кислот добавляют к РНК, последовательность которой определяют, наряду с пулом детектируемых олигонуклеотидов. Ску4 белок только тогда связывается с секвенируемой РНК, если один из детектируемых олигонуклеотидов может образовать 4 пары оснований двойной спирали с секвенируемой РНК. Кроме того, детектируемый нуклеотид должен иметь пару оснований с дополнительным 3 нуклеотидом 3' из 4-х пар оснований распознавания последовательности секвенируемой РНК, для того, чтобы Ску4 белок связался стабильно. Детектируемые олигонуклеотиды будут содержать расширение из 3 нуклеотидов 3' 4-нуклеотидных последовательностей распознавания. В пуле детектируемых олигонуклеотидов, 3-нуклеотидное расширение будет иметь определенный 5' нуклеотид в сопровождении двух случайных нуклеотидных позиций; или случайный нуклеотид в 5' положении, который следует за определенным нуклеотидом и случайным нуклеотидом; или 2 случайных нуклеотида на 5' конце, а затем определенные нуклеотиды. В любом из этих пулов определенные нуклеотиды известны на основании прикрепленных флуоресцентных молекул, излучение или возбуждения спектра которых определяется нуклеотидом. Ску4 белок будет прикреплен к квантовой точке, спектр возбуждения которой перекрывается со спектром излучения флуоресцентных молекул, прикрепленных к
- 28 024121 детектируемому олигонуклеотиду. После связывания детектируемых олигонуклеотидов и Сδу4 избыток реагентов будет смыт. Положительное событие связывания детектируется только в том случае, когда детектируемый нуклеотид образует 7-нуклеотидные двойных спиралей с секвенируемой РНК. Если связывание происходит, в результате тройной комплекс секвенируемой РНК, детектируемого олигонуклеотида и Сδу4 белка может быть обнаружен ЕКБТ по флуоресцентным молекулам, которые прикреплены к детектируемому олигонуклеотиду с квантовыми точками, прикрепленными к Сδу4 белку. После каждого цикла связывания Сδу4 белок и детектируемые олигонуклеотиды будут удалены из образца с использованием химической и/или тепловой денатурации и отмывки. На последующих шагах секвенирования другие Сδу4 белки различной сайт-специфичности и соответствующие детектируемые олигонуклеотиды будут инкубированы с секвенируемой РНК в подобной манере. Другие варианты 3-нуклеотидных расширений на детектируемом олигонуклеотиде могут быть предусмотрены, такие как расширение разной длины, либо на 5' конце или на 3' конце детектируемого олигонуклеотида. Детектируемый олигонуклеотид может быть РНК, ДНК или любой химически модифицированной версией этих полимеров, такой как ΡΝΑδ или ΕΝΑδ.
Пример 3. Индуцибельная сайт-специфическая эндорибонуклеаза
Посредством биохимических и структурных методик были созданы точечные мутанты Сδу4 с отсутствием активности расщепления при сохранении активности при связывании субстрата. Примером является описанный выше Сδу4 (Η29Α) мутант. В противном случае каталитически неактивный Сδу4 (Η29Α) мутант может быть реактивирован в присутствии экзогенного имидазола. Добавление между 150 мМ и 300 мМ имидазола в буфере для реакции достаточно, чтобы стимулировать активность расщепления почти дикого типа. Результаты представлены на фиг. 8. На фиг. 8 показан анализ активности расщепления, изображающий восстанавливающее действие имидазола. Сδу4Η29Α является каталитически неактивным мутантом Сδу4, который сохраняет способность связывать свой субстрат с кд <1 нМ.
Детали реакции:
Каждые 10 мкл реакционной смеси содержат 5 пикомоль ίη νίίΐΌ транскрибируемого субстрата рге^ΚΝΑ, 100 пикомоль Сδу4 (^Т или Н29А, как показано на фиг. 8), 20 мМ ΗΕΡΕδ рН 7,5,100 мМ КС1 и 150-300 мМ имидазола, как указано. Реакцию проводили в течение 30 минут при 25°С. Продукты были извлечены кислотой в фенол-хлороформе, разделены на 15% денатурирующем геле и визуализированы с Со1П δΥΒΚ. Биохимическая характеристика Сδу4 (Η29Α) показывает, что она связывается с ее субстратом РНК с <1 нМ аффинностью.
Сδу4 (Η29Α) является полезной для обоих ίη νί\Ό и ίη νίΙΐΌ приложений, для которых не существует альтернативного подхода.
Сδу4 (Η29Α) (также называемая здесь индуцибельной Сδу4), полезна для очистки частичного РНК/белкового комплекса (ΚΝΡ) из сложной смеси РНК и ΚΝΡδ (РНК/белок комплексы). Например, исследователи могут быть заинтересованы в понимании того, какие белки связываются с конкретной транскрибируемой РНК. Используя эту систему, исследователи смогли спроектировать конструкцию экспрессии РНК для их выбора, который будет включать метку 5', состоящую из стволовой петли Сδу4 целевой последовательности. Исследователи тогда трансфецируют эту конструкцию экспрессии на их выбор типа клеток, ведущих к получению многих РНК и ΚΝΡδ. Клетки затем будет лизированы и лизат будет наноситься на колонку, которая содержит индуцибельную Сδу4, иммобилизованную на гранулах агарозы. РНК или ΚΝΡδ, которые имеют Сδу4 последовательности-мишени будут связываться. Следующий отмывочный шаг удалит неспецифически связанные РНК. Отмывка с имидазолом (~300 мМ) будет активировать индуцибельную Сδу4, которая будет расщеплять последовательности-мишени и освободит связанные РНК/ΚΝΡ. Этот метод схематически показан на фиг. 9.
Аналогичный метод может быть полезен для сборки ΚΝΡδ ίη νίΙΐΌ.
Например, РНК выбора может быть транскрибирована ίη νίΐΐΌ с помощью построения экспрессии аналогичной плазмиды, предназначенной для эксперимента выше. (Конструкция должна ввести Сδу4 ствол-петля целевую последовательность в 5' конец транскрибируемой РНК.) Этот ίη νίΐΐΌ продукт транскрипции может быть затем инкубирован с белками по известным или предполагаемым связям конкретного транскрипта. Колонка, содержащая индуцибельную Сδу4, может быть использована для очистки ίη νίΙΐΌ образуемых ΚΝΡδ от свободного белка.
Пример 4.
Механизм специфического распознавания субстрата эндорибонуклеазой СаδΕ является важным компонентом ί’ΚΙδΡΚ иммунной системы у большинства бактерий и архей (νηη Пег Οοδΐ е1 а1, Тгем^ ВюсНет δα. 34, 401-7 (2009)), что было определено. С использованием структурных и биохимических методов было выявлено, что минимальная последовательность РНК, необходимая для оптимального расщепления субстрата, - 20 нуклеотидная последовательность (5-24 ΟΚΙδΡΚ повторяющаяся последовательность), которая включает в себя семь пар оснований ствол-петля, следующих за двумя неспаренными нуклеотидами. В структуре этой РНК связаны СаδΕ из ТНегтш (НегторЫПю, что было показано на разрешении в 2, 0 ангстрем с помощью рентгеновской кристаллографии. Эта структура раскрывает многочисленные последовательности конкретных контактов между белком и РНК, в том числе несколько
- 29 024121 взаимодействий в большой бороздке РНК. Терминальная пара оснований в стволовой петле разрушена, А22 перевернут наружу спирали и сочлененный основанием с И23. Эта конформация частично стабилизирована взаимодействием δ34 и Е38, которые также являются сайт-специфичными для субстрата распознавания. Дальнейшая стабилизация А22 и И23 конформации достигается за счет расположения терминального нуклеотида, С24, который переворачивает обратно в регистр ствол-петлю, но находится значительно ниже спирали в привязке кармана, который состоит из остатков Ό18, Е24 и К31, с К27, содержащих скелет между И23 и С24.
Позиционирование А22 удлиняет скелет РНК на расщепляющийся фосфат, располагая его между двумя активными остатками сайта, Υ23 и Н26. Основываясь на этом наблюдении и очевидной стабилизации этой конформации РНК за счет связывания С24, было высказано предположение, что С24 может потребоваться для позиционирования РНК в каталитическую конформацию. В соответствии с этой гипотезой удаление или мутации С24 существенно снижает активность расщепления, равно как и мутации остатков белка, участвующих в С24 связывании. Чтобы подтвердить роль С24 в стимулировании каталитической конформации РНК, структуру Са5Ε связали с 19-нуклеотидной РНК, которая не имела определяемого терминального С24 остатка. Этот комплекс кристаллизуется в двух различных формах, которые выявили две различные конформации РНК в активном центре белка. В одной кристаллической форме (Р21). 2,5 ангстрем структура содержит 8 молекул в асимметричной единице. Все 8 молекул показали, что А22 основание соединено с С21 для поддержания А-формы геометрии с остальной частью ствола-петли. В дополнение к изменениям в структуре РНК, структура белка также отличается от каталитической конформации, что наблюдалось в 2,0 ангстрем структуре. В этой структуре петля, содержащая К58 и К160 сочетается с активным сайтом, что предполагает, что эти остатки могут играть определенную роль в катализе или в стабилизации переходного состояния интермедиата. В 2,5 ангстрем структуре эта петля является дистальной от активного центра и частично неупорядоченной, предполагая, что позиционирование петли является гибким. Интересно, что эта петля также разупорядочена в случае апо структуры Са5Ε (ЕЫЬага е! а1, ΡιόΕπ δα. 15,1494-9 (2006)), что предполагает, что правильная конформация РНК необходима для стабилизации этой петли.
Вторая кристаллическая форма (Ρ212121), полученная для Са5Ε/19-нуклеотидного РНК комплекса, была использована для определения 1,5 ангстрем структуры, которая показала РНК связывание в каталитической конформации с А22 и И23, перевернутыми наружу спирали. Тем не менее, петля, содержащая К158 и К160 остается неупорядоченной в этой структуре, предполагая, что С24 связывание обязательно также может быть необходимым для стабилизации этой структуры белка. Наблюдение двух различных конформации РНК для того же комплекса позволяет предположить, что РНК может принимать несколько структурных состояний и что она может потребовать С24, чтобы зафиксировать ее в каталитически компетентную конформацию.
Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные варианты его воплощения, оно должно быть понятно специалистам в данной области техники и что различные изменения могут быть сделаны и эквиваленты могут быть заменены без отступления от сущности и объема изобретения. Кроме того, многие модификации могут быть сделаны, чтобы адаптироваться к конкретной ситуации, материалу, веществу, процессу, продвигаясь шаг за шагом к цели, сущности и объему настоящего изобретения. Все такие модификации предназначены для рамок прилагаемой формулы изобретения.
- 30 024121
ЛИСТИНГ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Дзе Реджентс ов дае Юниверсити ов Калифорния Хорвитц, Рейчел Э.
Даудна, Дженнифер А.
Виденхефт, Блейк Инек, Мартин < 120> КОМПОЗИЦИИ ЭНДОРИБОНУКЛЕАЗ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ <130> ВЕКК-118АУО <150> ЦБ 61/413,287 <151> 2010-11-12 <150> Ы5 61/365,627 <151> 2010-07-19 <150> из 61/333,163 <151> 2010-05-10 <160> 103 < 170> РажКЕр ίοτ νν'ίηύονβ Уегзюп 4.0 <2Ι0> 1 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 1 £иисаси§сс £иаиа§@са£ сиаа^ааа 28 <210> 2 <211> 204 <212> РКТ <213> Моп!е11а зр. РЕ36 <400> 2
Ме! Ьеи Азп Аг§ РЬе Туг РЬе Туг Пе Ьуз РЬе Пе Рго ΟΙη Ηίκ ТЬг
10 15
Азр Азп А1а РЬе Ьеи Пе О1у Аг§ Суз Пе Ьуз Уа1 Зег Ηί$ А1а РЬе 20 25 30
РЬе А1а Ьуз Ηίί 8ег Пе ТЬг О1у Уа101у Уа1 Зег РЬе Рго Суз Тгр 35 40 45
Зег С1и О1п Азр Пе <31у Азп А1а Ьеи А!а РЬе Уа1 Зег ТЬг Азр Ме!
55 60
О1и А1а Ьеи СНи О1п Ьеи Ьуз А1а О1п Рго Ьеи РЬе Зег Уа1 Ме! А1а
70 75 80
Азр С1и Ьеи Пе РЬе С1и Пе Зег Азр Уа1 Ьеи Зег Пе Рго Азр Ьуз 85 90 95
- 31 024121
Ьеи 01и 01и 01и Аг§ РЬе ТЬг Ьеи Азп Туг А1а Пе Аг« Ьуз Зег РЬе 100 105 110
А1а С1у Азр Ьуз Ьуз Аг§ Аг§ Ьеи Ьуз Аг§ А1а Ьуз Ьуз Аг§ А1а С1и 115 120 125
А1а Аг§ С1у С1и ТЬг Туг Ьуз Рго Уа1 Ьеи Шз Пе Азп ТЬг О1и Ьуз ВО 135 140
Ату Уа1 РЬе Азп Шз Туг Шз ТЬг Пе Рго Ме! Азп Зег Ьуз С1и Ьуз 145 150 155 160
Рго Азр С1у РЬе ТЬг Ьеи Шз Уа1 С1п Ьуз Азп Рго Суз Уа1 С1и С1п 165 170 175
Туг А1а А1а Азр РЬе Ьеи Азр Туг С1у РЬе А1а ТЬг Азп С1и С1п Шз 180 185 190
Агу О1у ТЬг Уа1 Рго Ьуз Ьеи Зег Зег Ьеи Ме1 Ьуз 195 200 <210> 3 <211> 192 <212> РКТ <213> МогЬеИазр. РЕ36 <400> 3
Ме1 Азр Уа1 РЬе Ьеи Ьеи Зег О1у Агу Суз А1а Ьуз А1а Ьеи Шз Азп 15 10 15
РЬе О1и РЬе Ьуз Ьуз Агу Ьуз Шз Азп Ие О1у Пе А1а Ьеи Рго Суз 20 25 30
Тгр Зег С1и Азп Зег Уа101у Азр Ме( Пе А1а РЬе \'а1 Зег О1и Азр 35 40 45
Ьуз Азп С1п Ьеи Ьеи Ьуз РЬе Шз О1п Азр Зег Туг РЬе С1п Ме1 Ме1 50 55 60
А1а Зег Азр О1и Пе РЬе Пе Пе Зег Азр Пе ТЬг А1а Уа1 Азп Зег 65 70 75 80
О1и Ьеи Рго О1и Уа] О1п РЬе Суз Агу Азп Азп ТЬг Ие Зег Ьуз Ме1 85 90 95
РЬе Пе Ьуз Азр ТЬг С1п Ьуз Агу Ьеи Агу Агу ТЬг С1п Ьуз Агу А1а 100 105 ПО
С1и А1а Аг» О1у Азр А1а РЬе Ьуз Рго А1а Ьеи Шз О1и Азп Зег Ьуз 115 120 125
Ьуз Агу Уа1 РЬе О1и Азп РЬе Шз Зег Ьеи Рго Не Азр Зег Тут <51у 130 135 140
ТЬг О!и О1и Азр РЬе Ме1 Ьеи Шз Пе О1п Ьуз Шз Азп Азр Уа1 А1а 145 150 155 160
Ьеи Зег Азр Суз Туг ТЬг Зег Туг О1у РЬе А1а ТЬг Азп Азп Азр Азп 165 170 175
- 32 024121
Агд 01у ТЬг Уа1 Рго Азр Ме! Зег Пе Ьеи РЬе Азп С1п Ме! ТЬг Ьуз 180 185 190 <210> 4 <211> 224 <212> РКТ <213> 5Ье\уапе11а зр. М/3-18-1 <400> 4
Ме! Ьуз Туг Туг Ьеи Азр Пе ТЬг Ьеи Ьеи Рго Азр А1а О1и А1а Азп 15 10 15
Ьеи <31у РЬе Ьеи Тгр Н1з Ьуз Уа1 Туг О!п О1п Пе Ηίκ Ьеи Ме! Ьеи 20 25 30
Уа1 С1и Шз Ьуз Уа1 Зег Уа1 О1и Азп Зег А1а Пе О1у Ьеи Зег РЬе 35 40 45
Рго Ьуз Туг Азр А1а Ьуз Зег РЬе Зег Азр Азп ТЬг Ьуз РЬе Рго Ьеи 50 55 60
С1у Азр Ьуз Ьеи Агд Ьеи РЬе А1а С1у ТЬг О1и <31п О1п Ьеи А1а Азр 65 70 75 80
Ьеи Ьуз Уа1 А1а С1п Тгр Ьеи А1а Агд Ьеи А1а Азр Туг Уа1 Шз Пе 85 90 95
Ьуз А1а Не Ьуз А1а Уа1 Рго Азр Азп Уа! Зег О1и Туг А1а Туг РЬе 100 105 ПО
Ьуз Агд Агд Шз РЬе Ьуз Зег Рго Азр Ьуз Ьеи Агд Агд Азп Пе Азр 115 120 125
А1а Агд А1а Пе Уа1 Не А1а О1п Ьуз Азп С1у РЬе А1а Пе Азп О1и ВО 135 140
Уа1 Ьуз ТЬг Агд Ьеи Ьеи А1а Зег Пе Азр Азп Ьеи Азр ТЬг Ьуз Зег 145 150 155 160
Ьуз Ьеи Рго РЬе Пе Азп Ьеи Агд Зег Ьеи Зег ТЬг <31и Ьуз Азр Уа1 165 170 175
Зег Рго А1а Азр Агд Агд Ьуз РЬе Ьеи Ьеи РЬе Пе О1и Суз С1и Ьуз 180 185 190
Уа1 ТНг Ьуз Рго Зег С1п Азп Азп С1у Ьеи РЬе Азп Суз Туг О1у Ьеи 195 200 205
Зег Агд Агд А1а О1п ТЬг О1и О1п А1а А1а Уа1 Рго Тгр РЬе О1и О1у 210 215 220 <210> 5 <211> 167 <212> РКТ <213> Рзеиботопаз аегидтоза <400> 5
- 33 024121
Ме1 Зег Уа1 Ьеи РЬе <31у Ьуз Ьеи Шз Οίη А1а Ьеи Уа1 А1а ΟΙη О1у 15 10 15
О1у Азр Аг£ Не О1у Уа1 Зег РЬе Рго Азр Ьеи Азр О1и Зег Лг§ Зег 20 25 30
Аг£ Ьеи О1у О1и Аге Ьеи Аг§ Пе Шз А1а Зег А1а Азр Азр Ьеи Аг§ 35 40 45
А1а Ьеи Ьеи А1а Аг§ Рго Тгр Ьеи О1и 01у Ьеи Аг§ Азр Шз Ьеи О1п 50 55 60
РЬе О1у О1и Рго А1а Уа1 Уа1 Рго Шз Рго ТЬг Рго Туг Аг§ О1п Уа1 65 70 75 80
Зег Аг§ \'а1 О1п А1а Ьуз Зег Азп Рго О1и Аг§ Ьеи Аг§ Аг§ Аг§ Ьеи 85 90 95
Ме( Лгё Лг§ Шз Азр Ьеи Зег О1и О1и О1и А1а Аге Ьуз Аге Не Рго 100 105 110
Азр ТЬг Уа1 А1а Аге А1а Ьеи Азр Ьеи Рго РЬе Уа1 ТЬг Ьеи Аге Зег 115 120 125
О1п Зег ТЬг О1у О1п Шз РЬе Аг§ Ьеи РЬе Пе Аг§ Шз О1у Рго Ьеи 130 135 140
О1п Уа1 ТЬг А1а О1и О1и О1у О1у РЬе ТЬг Суз Туг О1у Ьеи Зег Ьуз 145 150 155 160
С1у О1у РЬе Уа1 Рго Тгр РЬе 165 <210> 6 <211> 187 <212> РКТ <213> Рзеийошопаз аегиегпоза <400> 6
Ме1 Азр Шз Туг Ьеи Азр Не Аг§ Ьеи Аг§ Рго Азр Рго О1и РЬе Рго 15 10 15
Рго А1а О1п Ьеи Ме1 Зег Уа1 Ьеи РЬе О1у Ьуз Ьеи Шз О1п А1а Ьеи 20 25 30
Уа1 А1а С1п О1у О!у Азр Аг® Пе О1у Уа! Зег РЬе Рго Азр Ьеи Азр 35 40 45
О1и Зег Аг§ Зег Аг® Ьеи С1у О1и Аг« Ьеи Аге Не Шз А1а Зег А1а 50 55 60
Азр Азр Ьеи Аге А1а Ьеи Ьеи А1а Аге Рго Тгр Ьеи С1и О1у Ьеи Аг§ 65 70 75 80
Азр Шз Ьеи О1п РЬе О1у О1и Рго А1а Уа! Уа] Рго Н1з Рго ТЬг Рго 85 90 95
Туг Лг® О1п Уа1 Зег Аге Уа1 О1п Уа1 Ьуз Зег Азп Рго О1и Аге Ьеи 100 105 НО
- 34 024121
Аг® Агд Агд Ьеи Ме( Агд Агд Шз Азр Ьеи Зег С1и 01и 01и А1а Агд 115 120 125
Ьуз Агд Пе Рго Азр ТКг Уа1 А1а Агд А1а Ьеи Азр Ьеи Рго РЬе Уа1 130 135 140
ТКг Ьеи Агд Зег С1п Зег ТЬг <31у О1п Шз РЬе Агд Ьеи РЬе Пе Агд 145 150 155 160
Шз О1у Рго Ьеи С1п Уа1 ТЬг А1а О1и О1и О1у С1у РЬе ТЬг Суз Туг 165 170 175
О1у Ьеи Зег Ьуз СНу С1у РЬе Уа1 Рго Тгр РЬе 180 185 <210> 7 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 7 диисасидсс дидиаддсад еиаадааа 28 <210> 8 <211> 187 <212> РКТ <213> Рзеидотопаз аеги£1поза <400> 8
Ме! Азр Шз Туг Ьеи Азр Пе Агд Ьеи Агд Рго Азр Рго С1и РЬе Рго 15 10 15
Рго А1а О1п Ьеи Ме! Зег Уа1 Ьеи РЬе О1у Ьуз Ьеи Шз 61п А1а Ьеи 20 25 30
Уа1 А1а С1п С!у С1у Азр Агд Пе О1у Уа1 Зег РЬе Рго Азр Ьеи Азр 35 40 45
О1и Зег Агд Зег Агд Ьеи О1у СПи Агд Ьеи Агд Пе Шз А1а Зег А1а 50 55 60
Азр Азр Ьеи Агд А1а Ьеи Ьеи А1а Агд Рго Тгр Ьеи О1и 01у Ьеи Агд
70 75 80
Азр Шз Ьеи О1п РЬе С1у С1и Рго А1а Уа! Уа1 Рго Шз Рго ТЬг Рго
90 95
Туг Агд О1п Уа1 Зег Агд Уа1 О1п А1а Ьуз Зег Азп Рго С1и Агд Ьеи 100 105 ПО
Агд Агд Агд Ьеи Ме! Агд Агд Шз Азр Ьеи Зег С1и О1и О1и А1а Агд 115 120 125
Ьуз Агд Пе Рго Азр ТЬг Уа1 А1а Агд ТЬг Ьеи Азр Ьеи Рго РЬе Уа1 130 135 140
- 35 024121
ТЬг Ьеи Аг§ 8ег 01п Зег ТЬг С1у С1п Шз РЬе Аг§ Ьеи РЬе Не Аг§ 145 150 155 160
Шз О1у Рго Ьеи О1п А1а ТЬг А1а О1и О1и О1у О1у РЬе ТЬг Суз Туг 165 170 175
О1у Ьеи Зег Ьуз О1у О1у РЬе Уа1 Рго Тгр РЬе 180 185 <2Ю> 9 <211> 187 <212=- РКТ <213=- Рзеиботопаз аепцрпоза <400> 9
Ме( Азр Шз Туг Ьеи Азр Не Аге Ьеи Аге Рго Азр Рго О1и РЬе Рго 15 10 15
Рго А1а С1п Ьеи Ме( Зег Уа1 Ьеи РЬе О1у Ьуз Ьеи Шз ΟΙη А1а Ьеи 20 25 30
Уа1 А1а О1п О1у О1у Азр Аге Не О1у Зег РЬе Рго Азр Ьеи Азр 35 40 45
О1и Зег Аг§ Зег Аге Ьеи О1у О1и Аг« Ьеи Аг§ Пе Н1з А1а Зег А1а 50 55 60
Азр Азр Ьеи ЬНз А1а Ьеи Ьеи А!а Аге Рго Тгр Ьеи О1и О1у Ьеи Аге 65 70 75 80
Азр Шз Ьеи О1п РЬе О1у О1и А1а А1а Уа1 Уа1 Рго Шз Рго ТЬг Рго 85 90 95
Туг Аге С1п Уа1 Зег Аг§ Уа1 ΟΙη А1а Ьуз Зег Азп Рго О1и Аг§ Ьеи 100 105 110
Аге Аге Аге Ьеи Ме( Аге Аг§ Шз Азр Ьеи Зег О1и О1и О1и А1а Аге 115 120 125
Ьуз Аг§ Пе Рго Азр ТЬг Уа1 А1а Аге ТЬг Ьеи Авр Ьеи Рго РЬе Уа1 130 135 140
ТЬг Ьеи Аге Зег О1п Зег ТЬг О1у О1п Шз РЬе Аге Ней Р'1е Не Аг§ 145 150 155 160
ΗΪ5 О1у Рго Ьеи О1п А1а ТЬг А1а О1и О1и О1у 01у РЬе ТЬг Суз Туг 165 170 175
О1у Ьеи Зег Ьуз О1у О1у РЬе Уа! Рго Тгр РЬе 180 185 <210=- 10 <211> 184 <212> РКТ <213> Оккеуа с1ас1ап1п <400> 10
Ме1 Азр Шз Туг Не С1и Пе Аге Уа1 Ьеи Рго Азр Ьеи О1и РЬе Зег
- 36 024121
10 15
А1а Уа! ΟΙη Ьеи Ьеи Зег А1а Ьеи РЬе А1а Ьуз Ьеи Шз Аг§ А1а Ьеи 20 25 30
СНу О1п Аг§ А1а ТЬг СНу А1а Не С1у Уа1 Зег РЬе Рго Азр Уа1 Азр 35 40 45
Ьуз ТЬг Ьеи 01у С1и Аг§ Ьеи Аг£ Ьеи Шз 01у Зег Уа1 ΟΙη С1и Ьеи 50 55 60
А1а А1а Ьеи О1и СНп ТЬг СНу Тгр Ьеи Ьуз СНу Ьеи Аг§ Азр Туг ТЬг 65 70 75 80
А1а Пе ТЬг СНи Рго Ьеи Рго Уа1 Рго ΑΙа СНу А 1а Ьуз Шз Аг§ ТЬг 85 90 95
Уа1 Аг§ Аг§ Уа1 СНп Уа1 Ьуз Зег Зег А1а СНи Аг§ Ьеи Аг§ Аг§ Аг§ 100 105 НО
А1а Уа1 Зег Ьуз СНу Аг§ Ме1 ТЬг О1и Азр СНи А1а А1а ТЬг Аг§ Не 115 120 125
Рго Туг А1а Уа1 О1и Ьуз Аг§ Зег Зег Ьеи Рго Туг Ьеи Рго Ьеи Аг§ 130 135 140
Зег Ьеи Зег Зег СНу С1п ТЬг РЬе Ьеи Ьеи РЬе Уа1 СНи Шз СНу Рго 145 150 155 160
Ьеи О1п Азр Ьуз Рго Уа1 А1а СНу А1а РЬе Зег Зег Туг СНу Ьеи Зег 165 170 175
А1а ТЬг ТЬг ТЬг Пе Рго Тгр РЬе 180 <210> II <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> II §иисаси§сс §с§иа§8са§ сииадааа 28 <210> 12 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 12 циисасидсс §а§и১са§ сииадааа 28 <210> 13 <211> 184 <212> РКТ
- 37 024121 <213> РесГоЬасГепит ’Л'а.чаЫае <400> 13
МеГ Азр Н«з Туг Не Азр Не Аг§ Уа1 С1п Рго Азр Рго 01ц РЬе ТЬг 15 10 15
А1а Рго О1п Ьеи Ьеи Азп А1а Ьеи РЬе А1а Ьуз Ьеи Шз Аг§ А1а Ьеи 20 25 30
О1у О1п Ьеи А1а Азр О1у Ьуз Пе СНу Пе Зег РЬе Рго О1и Уа101у 35 40 45
Ьуз ТЬг Ьеи О1у О1и Суз Ьеи Аг§ Ьеи Шз О1у ТЬг А1а Азр А1а Ьеи 50 55 60
Зег ТЬг Ьеи О1и Ьуз ТЬг Зег Тгр Ьеи Ьуз О1у Ьеи Аг§ Азр Туг ТЬг 65 70 75 80
О1п Уа1 Зег О1и Суз Ьуз А1а Уа! Рго Азп Азп Уа1 Ьуз РЬе Лг£ ТЬг 85 90 95
Уа1 Аг§ Аг§ Уа1 О1п Ьеи Ьуз ТЬг Зег А1а СНи Аг@ Ьеи Аг§ Аг§ Аг§ 100 105 НО
Зег Уа1 Азп Ьуз О1у Тгр Ьеи ТЬг С1и А1а О1и А1а А1а А1а Аг§ Ие 115 120 125
Рго Азр А1а Уа1 О1и Ьуз Лг» Зег ТЬг Ьеи Рго РЬе Уа101п Ие Ьуз 130 135 140
Зег Ьеи Зег Азп О1у О1п МеГ РЬе РЬе Уа1 РЬе Уа! СНи Шз СНу Рго 145 150 155 160
Ьеи О1п Азп А1а Рго А1а ТЬг СНу Ага: РЬе Зег Зег Туг С1у Ьеи Зег 165 170 175
А1а СНи А1а ТЬг Уа1 Рго Тгр РЬе 180 <210> 14 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 14 §иисаеи§се £иаи১еа£ сииадааа 28 <210> 15 <211> 184 <212> РКТ <213> РЬогогЬаЬНиз азушЫоГюа <400> 15
МеГ Азр Туг Туг РЬе С1и Пе Ьеи Уа1 Ьеи Рго Азр Рго С1и РЬе Зег 15 10 15
- 38 024121
Ьуз Οίη Зег Ьеи Ме( О1и А1а Ьеи РЬе А1а Ьук Ьеи Шз Агц А1а Ьеи 20 25 30
О1у С1п Уа101у Азп О1у Аг§ Не С1у Уа1 Зег РЬе Рго Суз А1а Аг§
40 45
Ьуз ТЬг Ьеи О1у Азр Ьуз Ьеи Аг§ Пе Шз О1у А1а Зег О1и А1а Ьеи 50 55 60
Азп Азр Ьеи О1п А1а Ьеи Рго Тгр Ьеи Ьуз О1у Ьеи Аг§ Азр Туг ТЬг 65 70 75 80
О1и Пе Ме1 Азр Не О1п Рго Уа1 Рго О1п Азр ТЬг О1п Туг Аг§ Агд 85 90 95
Уа1 Зег Аг§ Уа| О1п Уа1 Ьуз Зег Зег А1а О1и Аге Ьеи Аге Аге Аге 100 105 ПО
Зег Пе Ьуз Ьуз О1у Тгр Ьеи ТЬг О1и О1и О1п А1а Агд О1п Агд Пе 115 120 125
Рго Пе Зег Ьуз О1и О1п Аг§ ТЬг Шз Ьеи Рго РЬе Ьеи Ьеи Уа1 Ьуз 130 135 140
Зег Ьеи Зег Зег Агд О1п ТЬг РЬе Рго Ьеи РНе Пе О1и О1п С1у Рго 145 150 155 160
Не О1и Азр Ьуз Рго ТЬг Рго О1у Уа1 РЬе Зег Зег Туг О1у Ьеи Зег 165 170 175
А1а Зег А1а ТЬг Пе Рго Тгр РКе 180 <210> 16 <211> 29 <2Ι2> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 16 диисасидис диасаддсад сииадаааа 29 <210> 17 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 17 дидсасидсс диасаддсад сииадааа 28 <210> 18 <211> 24 <212> К\Л <213> Искусственная последовательность
- 39 024121 <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400 18 асиуссуиас ауусауиииа уааа 24 <210> 19 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 19 уиисасиусс усасауусау сииауааа 28 <210> 20 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 20 уиуиасиусс уиасауусау сииауааа 28 <210> 21 <211> 28 <212'- ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 21 уиисасиусс уиасауусау сииауааа 28 <210> 22 <211> 184 <212> РКТ <213> Оккеуа сЫапСп <400> 22
Ме1 Азр Н1з Туг Пе 01и Ие Агу Уа1 Ьеи Рго Азр Рго 01и РНе Зег 15 10 15
С1у Уа1 С1п Ьеи Ьеи Зег А1а Ьеи РЬе А1а Ьуз Ьеи Шз Агу А1а Ьеи 20 25 30
О1у О1п Агу А1а ТЬг О1у А1а Не О1у Уа1 Зег РЬе Рго Азр А1а О1у 35 40 45
Ьуз ТЬг Ьеи О1у О1и Агу Ьеи Агу Ьеи Ηί3 С1у Зег Уа1 О1п О1и Ьеи 50 55 60
А1а А1а Ьеи О1и О1п ТЬг С1у Тгр Ьеи Агу С1у Ьеи Агу Азр Туг ТЬг 65 70 75 80
- 40 024121
А1а Не ТЬг О1и Рго Ьеи Рго Уа1 Рго А1а О1у Уа1 Ьуз Шз Агд ТЬг 85 90 95
Уа1 Агд Агд Уа1 О1п Уа1 Ьуз Зег Зег А1а О1и Агд Ьеи Агд Агд Агд 100 105 ПО
А1а Уа1 Азп Ьуз С1у Агд МеС ТЬг Уа1 Азр С1и А1а Азр А1а Агд Пе 115 120 125
Рго Туг ТЬг Уа1 О1и Ьуз Агд ТЬг Зег Ьеи Рго Туг Ьеи Рго Ьеи Агд 130 135 140
Зег Ьеи Зег Азп О1у О1п ТЬг РЬе Ьеи Ьеи РЬе Уа1О1и Шз 01у Рго 145 150 155 160
Ьеи С1п Азр Ьуз Рго Уа1 А1а С [у А1а РЬе Зег Зег Туг С1у Ьеи Зег 165 170 175
А1а Уа1 А1а ТЬг Пе Рго Тгр РЬе 180 <210> 23 <211> 28 <2Ι2> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 23 диисасидсс дидиаддсад сииадааа 28 <210> 24 <211> 188 <212> РКТ <213> ХапсЬошопаз аНнНпеапз <400> 24
Мес С Ιπ ΗΪ3 Туг Ьеи Азр Ьеи Шз Ьеи Агд Рго Азр Рго О1и Ьеи А1а 15 10 15
Рго Туг О1п Ьеи Ьеи С1у А1а Ьеи Туг А1а Агд Ьеи Шз Агд Зег Ьеи 20 25 30
Уа1 ТЬг Ьеи Азп ТЬг ТЬг Агд Пе С1у Уа1 Зег РЬе Рго О1у Шз Азр 35 40 45
Азп Агд Уа! Рго ТЬг Ьеи О1у ТЬг Шз Ьеи Агд Ьеи Шз С1у Азр Азр 50 55 60
Зег ТЬг Ьеи Шз Шз Ьеи Мес А1а ТНг ТЬг Тгр Ьеи Шз О1у Уа1 Агд 65 7 0 75 80
Азр Шз Уа1 ТЬг 11е ТЬг Зег Пе С1у А1а Уа1 Рго Зег СНи А1а Уа1 85 90 95
Шз Агд О1п Уа1 ТЬг Агд Уа1 О1п А1а Ьуз Зег Зег Рго СНи Агд Ьеи 100 105 ПО
- 41 024121
Агд Агд Агд А1а Ме1 Агд Агд №з 01у Пе Зег 01и Азр Ьеи А1а Уа1 115 120 125
О1п Агд Не Рго Азр Зег А1а А1а О1и О1п Ьеи Агд Ьеи Рго РЬе Уа1 130 135 140
Уа1 Ьеи <31у Зег Агд Зег ТНг О1у О1п ТНг А1а РНе Рго Уа1 РЬе Уа1 145 150 155 160
Агд Шз О1у Рго Уа1 <31п О1п О1и Рго Уа1 Рго О1у Азр РЬе Зег Зег 165 170 175
Туг С1у Ьеи Зег Агд 01у А1а ТЬг Уа1 Рго Тгр РЬе 180 185 <210> 25 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 25 диисасидсс дидиаддсад сисадааа 28 <210> 26 <211> 27 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 26 иисасидссд идиаддсадс исадааа 27 <210> 27 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 27 диисасидсс диаиаддсад сисадааа 28 <210> 28 <211> 184 <212> РКТ <213> Рес1оЪас1егшт а1гозерПсит <400> 28
Ме1 Азр Шз Туг Пе Азр Не Агд Уа1 О1п Рго Азр Рго О1и РНе ТНг 15 10 15
А1а Зег О1п Ьеи Ьеи Азп А1а Ьеи РЬе А1а Ьуз Ьеи Нгз Агд Уа1 Ьеи
- 42 024121
25 30
СПу Οίη Ьеи А1а Азп О1у Ьуз Пе С1у Не 5ег РЬе Рго О1и Уа1 О1у 35 40 45
Ьуз ТЬг Ьеи О1у О1и Суз Ьеи Агд Ьеи Шз С1у ТЬг О1и Азр А1а Ьеи 50 55 60
Зег ТЬг Ьеи О1и Ьуз ТЬг Зег Тгр Ьеи Ьуз О1у Ьеи Аг§ Азр Туг ТЬг 65 70 75 80
О1п Уа1 Зег О1и Суз Ьуз Уа1 Уа1 Рго Азп О1у Уа1 Ьуз РЬе Аг§ ТЬг 85 90 95
Уа1 Агд Агд Уа101п Ьеи Ьуз Зег Зег А1а СПи Агд Ьеи Аг§ Агд Агд 100 105 110
Зег Уа1 Зег Ьуз О1у Тгр Ьеи ТЬг А1а А1а СПи А1а А1а А1а Агд Пе 115 120 125
Рго Азр А1а Уа1 СПи Ьуз Агд Зег А1а Ьеи Рго РЬе Уа1 О1п Пе Ьуз 130 135 140
Зег Ьеи Зег Азп СПу О1п Ме1 РЬе РЬе Уа! РЬе Уа1 СПи ΗΪ3 СПу Рго 145 150 155 160
Ьеи О1п Азп А1а Рго ТЬг А1а О1у Агд РЬе Зег Зег Туг О1у Ьеи Зег 165 170 175
ТЬг О1и А1а ТЬг Уа1 Рго Тгр РЬе 180 <210> 29 <211> 184 <212> РКТ <213> РНогогЬаЬПиз 1иттезсепз <400> 29
Ме1 Азр Туг Туг Ьеи О1и Пе Агд Уа1 Ьеи Рго Азр Ьеи О1и РЬе Зег 15 10 15
О1п О1п Зег Ьеи РЬе О1и А1а Ьеи РЬе А1а Ьуз Ьеи Шз Аг§ А1а Ьеи 20 25 30
СПу О1п Ьеи Зег Азп О1у О1п Уа1 СПу Уа1 Зег РЬе Рго Суз А1а Агд 35 40 45
Ьуз ТЬг Ьеи СПу Азр ТЬг Ьеи Агд Пе ΗΪ5 О1у Зег Зег О1и А1а Ьеи 50 55 60
Азп Азр Ьеи О1п А1а Ьеи Рго Тгр Ьеи Ьуз СПу Ьеи Агд Азр Туг ТЬг 65 70 75 80
СПи Уа1 Пе Азр Пе С1п Рго Пе Рго С1п СПи ТЬг Ьуз Туг Агд Суз 85 90 95
Уа1 Зег Агд Уа1 С1п Уа! Ьуз Зег Зег А1а СНи Аге Ьеи Агд Агд Агд 100 105 110
А1а Пе Ьуз Ьуз С1у Тгр Ьеи ТЬг С1у С1и О1п А1а Агд С1п Агд Пе
- 43 024121
115 120 125
Рго Пе Зег Ьуз О1и О1п Аг§ ТНг Шз Ьеи Рго РЬе Ьеи РЬе Ьеи Ьу5 130 135 140
Зег Ьеи Зег Зег О1у О1п Зег РНе Ьеи Ьеи РНе Уа1 Ьуз О1п О1у Рго 145 150 155 160
Пе С1п Азр Ьуз Рго ТНг Зег О1у Не РНе Зег Зег Туг 01у Ьеи Зег 165 170 175
Зег Зег А1а ТНг Пе Рго Тгр РЬе 130 <210> 30 <211> 188 <212> РКТ <213> ЮезиПигмЬпо а1каНрЫ1из <400> 30
Ме! Уа1 Ме! А1а Ме! Азр Суз Туг Уа1 С1и Ие Зег Ьеи Ьеи Рго Азр 15 10 15
Рго О1и РЬе Рго Азр Зег Пе Ьеи Ме! Азп А1а Ьеи РНе А1а Ьуз Ьеи 20 25 30
Шз Аг§ А1а Ьеи А1а С1и Азп С1у Ьуз С1п О1и Пе О1у Уа1 Зег РНе 35 40 45
Рго О1и РНе О1у Ьуз Ьуз Ьеи Азп Зег Ьуз Ьеи Аг§ Пе Шз 01у Зег 50 55 60
О1и О1и Зег Ьеи Ьуз Аг£ Ьеи Ме! Азр Ьеи Азп Тгр Ие С1п С1у Ме! 65 70 75 80
Ьуз Азр Туг ТНг Аг£ Уа1 Зег О1у Пе А1а Ьуз Уа1 Рго Азр Зег Суз 85 90 95
О1п Туг Аг§ ТНг Уа1 Ьуз Аг§ Уа! О1п А1а Ьуз Зег Зег Уа1 Азр Аге 100 105 ПО
Ьеи Туг Аг§ Аг§ Зег Уа1 Ьуз Ьуз О1у Тгр Ьеи Зег О1и ОН) Азп А1а 115 120 125
О1и О1п О1п Ьуз О1и Аге А1а Аге О1и О1у Аг§ Ьеи Ьуз Ьеи Рго РЬе 130 135 140
Уа1 О1п Ьеи Ьуз Зег О1п ТЬг ТНг О1у О1п О1п РНе Аге Ьеи РНе Пе 145 150 155 160
ΟΙη Н13 О1у Зег Ьеи О1п О1и Ьуз Рго Уа1 ТЬг О1у Аге РЬе Зег Зег 165 170 175
Туг О1у Ьеи Зег Азп О1и А1а ТНг Уа1 Рго Тгр РЬе
180
<210> <211> <212> 31 28 ΚΝΑ
- 44 024121 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 31 йиисаси§сс ёсасаёёсае сиса§ааа 28 <210> 32 <211> 184 <212> РКТ <213> Оккеуа геае <400 32
Ме1 Аар НЕ Туг Пе С1и Пе Аг§ Уа1 Ьеи Рго Аар Ьеи 01и РЬе Зег 15 10 15
А1а Уа1 01п Ьеи Ьеи Зет А1а Ьеи РЬе А1а Ьуа Ьеи ΗΪ3 Аг« А1а Ьеи 20 25 30
О|у 01η 01п А1а ТЬг С1у А1а Пе 01у Уа1 Зег РЬе Рго Аар Уа1 С1у 35 40 45
Ьуа ТЬг Ьеи О1у 01и Аг§ Ьеи Ατβ Ьеи НЕ О1у 8ег С1и С1п А1а Ьеи 50 55 60
ТЬг А1а Ьеи С1и С1п ТЬг С1у Тгр Аг§ ТЬг С1у Ьеи Аг§ Аар Туг Зег 65 70 75 80
ТЬг Не ТЬг Аар Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Рго ТЬг О1у А1а О1п Туг Ат§ ТЬг 85 90 95
Уа1 Аг£ Аг§ Уа1 С1п Уа1 Ьуа 8ег Зег А1а О1и Аг§ Ьеи Агр Агд Аг§ 100 105 110
А1а Уа1 Зег Ьуа О1у Тгр Ьеи ТЬг А1а Аар О1и А1а А1а А1а Аг§ Пе 115 120 125
Рго Туг А1а Уа1 О1и Ьуа Аг^ ТЬг Зег Ьеи Рго Туг Ьеи Рго Ьеи Аг§ 130 135 140
Зег Ьеи Зег Зег О1у С1п Рго РЬе Ьеи Ьеи РЬе Уа1 С1и ΗΪ3 С1у Рго 145 150 155 160
Ьеи С1п Аар Ьуз Рго Уа1 А1а О1у ТЬг РЬе Зег Зег Туг О1у Ьеи Зег 165 170 175
А1а ТЬг А1а ТЬг Ие Рго Тгр РЬе 180 <210> 33 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 33
- 45 024121 дидсасидсс диаиаддсад сииадааа 28 <210> 34 <211> 184 <212> РКТ <213> Уегзпиа резНз <400> 34
Ме1 Азр Шз Туг Ьеи Азр Пе Агд Уа1 Ьеи Рго Азр Рго О1и РЬе Зег 15 10 15
А1а ΟΙη ТЬг Ьеи Ьеи С1и А1а Ьеи РЬе А1а Ьуз Ьеи Шз Агд А1а Ьеи 20 25 30
Уа! А1а ТЬг Пе Рго О1у Агд Уа1 01у Уа1 Зег РЬе Рго ТЬг А1а О1у 35 40 45
Ьуз ТЬг Ьеи О1у Зег ΟΙη Ьеи Агд Ьеи Шз О1у Зег Агд О1у Азр Ьеи 50 55 60
Ьеи О1и Ьеи О1п Зег А1а О1у Тгр Ьеи Ьуз СНу Ьеи С1п Азр Туг Суз 65 70 75 80
СНи Суз Зег СНи Пе Ьеи Рго Уа1 Рго А1а Азр Уа1 Ьуз Шз Агд ТЬг 85 90 95
Пе Агд Агд Уа1 ΟΙη Уа1 Ьуз Зег Зег А1а О1п Агд Ьеи Агд Агд Агд 100 105 110
Зег Уа1 Зег Ьуз О1у Тгр Ьеи ТЬг СНи СНи О1п А1а Агд Ьеи Агд Пе 115 120 125
Рго Азр Зег Шз Азр Ьуз Агд Суз Азр Ьеи Рго РЬе Ьеи Агд Ьеи Ьуз 130 135 140
Зег Агд Зег Зег СНи ΟΙη Туг РЬе Ьеи Ьеи РЬе Пе С1и ΟΙη О1у ТЬг 145 150 155 160
Ьеи О1п А1а Зег А1а ТЬг ТЬг С1у С1и РЬе Зег А1а Туг О1у Ьеи Зег 165 170 175
Уа1 Азп А1а ТЬг Пе Рго Тгр РЬе 180 <210> 35 <211> 30 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 35 идиисасидс сдсасаддса деииадаааа 30 <210> 36 <211> 184 <212> РКТ <213> О]скеуа НаНаптП
- 46 024121 <400> 36
Мег Азр Шз Тут Не СНи Пе Аг§ Уа1 Теи Рго Азр Рго О1и РЬе 5ег 15 10 15
А1а Уа1 О1п Ьеи Ьеи 8ет А1а Ьеи РЬе А1а Ьуз Ьеи Шз Аг£ А1а Ьеи 20 25 30
СЛу О1п Аг§ А1а ТЬг СЛу Азр Пе СЛу Уа1 Зег РЬе Рго Азр А1а СЛу 35 40 45
Ьуз ТНг Ьеи СЛу СЛи Аг§ Ьеи Аг§ Ьеи Шз СЛу Зег Уа1 Οίη А1а Ьеи 50 55 60
А1а А1а Ьеи СЛи О1п ТНг СНу Тгр Ьеи Ьуз О1у Ьеи Аг§ Азр Туг Зег 65 70 75 80
ТЬг Не ТНг Азр Уэ1 Ьеи ТЬг Уа1 Рго ТЬг СЛу А1а (Ли Туг Аг§ ТЬг 85 90 95
Уа1 Αη> Аг£ Уа1 О1п Уа1 Ьуз 8ег Зег А1а С1и Аг§ Ьеи Агь: Аг^ Аг§ 100 105 ПО
А1а Уа1 8ег Ьуз СЛу Аг§ МеГ ТЬг А1а Азр (Ли А1а А1а А1а Аг§ Пе 115 120 125
Рго Туг А1а А1а О1и Ьуз Аг§ ТЬг Зег Ьеи Рго Туг Ьеи Рго Ьеи Аг“ 130 135 140
Зег Ьеи Зег Зег О1у О1п ТЬг РЬе Ьеи Ьеи РНе Уа1 С1и Шз СЛу Рго 145 150 155 160
Ьеи О1п О1и Ьуз Рго Уа1 А1а СЛу Уа1 РЬе Зег Зег Туг СЛу Ьеи Зег 165 170 175
А1а Пе А1а ТЬг Пе Рго Тгр РЬе 180 <210> 37 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 37 §и§ааси§сс §саиа§£са§ сииаедаа 28 <210> 38 <211> 198 <212> РКТ <213> ЕзсЬепсЫа соН <400> 38
МеГ А1а Уа1 Зег Ьеи Уа1 Аг§ Азп Аг§ Азп Ьуз (Ли Ьеи Рго МеГ Азр 15 10 15
- 47 024121
Ηίί Туг Ьеи СПи Пе Агд Уа1 Ьеи Рго Азр Рго С1и РЬе Зег Зег С1и 20 25 30
Мег Ьеи Мег А1а А1а Ьеи РЬе А1а Ьуз Ьеи Нгз Агд Уа1 Ьеи О1у А1а 35 40 45
Агд СНу О1п СНу Азр Не СНу Уа1 Зег РЬе Рго Азр Уа1 Азп Уа1 МеГ 50 55 60
Рго С 1у А1а Агд Ьеи Агд Ьеи Нгз СНу Зег А1а О1п А1а Ьеи О1п А1а 65 70 75 80
Ьеи СНи А1а Зег ТЬг Тгр Агд Ьуз О1у Ьеи ТЬг Азр Туг Суз С!п Суз 85 90 95
Зег Рго Уа1 ТЬг Рго Уа1 Рго СНи Не Ьуз СНу Тгр Агд Уа1 Уа1 Зег 100 105 ПО
Агд Уа1 СНп Уа1 Ьуз Зег Азп Рго О1п Агд Ьеи Ьеи Агд Агд Зег Уа] 115 120 125
Ьуз Ьуз С1у Тгр Ьеи ТЬг С1и СНи СНп А1а Пе С1и Агд Ьеи А1а ТЬг 130 135 140
СНп А1а СИи С1п Агд ТЬг Азр Ьеи Рго РЬе Ьеи Азп МеГ Ьуз Зег Ьеи 145 150 155 160
Зег Зег О1п СНп Ьеи РЬе Ьуз Ьеи РЬе Пе Агд Н1з О1у Азр Ьеи Ьеи 165 170 175
Ьуз О1и Рго Уа1 Ьуз СНу СНи РЬе Зег Зег Туг СНу Ьеи Зег А1а ТКг 180 185 190
А1а ТЬг Не Рго Тгр РЬе 195 <210> 39 <211> 184 <212> РКТ <213> ЕзсЬеггсЫа соП <400> 39
МеГ Азр ΗΪ5 Туг Ьеи О1и Пе Агд Уа1 Ьеи Рго Азр Рго С1и РЬе Зег 15 10 15
Зег О1и МеГ Ьеи МеГ А1а А1а Ьеи РЬе А1а Ьуз Ьеи Нгз Агд Уа1 Ьеи 20 25 30
СНу А1а Агд СНу СНп СНу Азр Пе СНу Уа1 Зег РКе Рго Азр Уа1 Азп 35 40 45
Уа1 МеГ Рго 01у А1а Агд Ьеи Агд Ьеи Нгз О1у Зег А1а О1п А1а Ьеи 50 55 60
О1п А1а Ьеи О1и А1а Зег ТЬг Тгр Агд Ьуз СНу Ьеи ТЬг Азр Туг Суз 65 70 75 80
СНп Суз Зег Рго Уа1 ТЬг Рго Уа1 Рго СНи Пе Ьуз СНу Тгр Агд Уа1 85 90 95
- 48 024121
Уа1 Зег Аг8 Уа1 Οίη Уа! Ьуз Зег Азп Рго О1п Аг§ Ьеи Ьеи Лг§ Лг§ 100 105 110
Зег Уа1 Ьуз Ьуз О1у Тгр Ьеи ТЬг О1и О1и О1п А1а Пе О1и Аг§ Ьеи 115 120 125
А1а ТЬг О1п А1а О1и О1п Аг§ ТЬг Азр Ьеи Рго РЬе Ьеи Азп Ме! Ьуз 130 135 140
Зег Ьеи Зег Зег ΟΙη О1п Ьеи РЬе Ьуз Ьеи РЬе Не Аг§ Шз С1у Азр 145 150 155 160
Ьеи Ьеи Ьуз С1и Рго Уа1 Ьуз О1у О1и РЬе Зег Зег Туг О1у Ьеи Зег 165 170 175
А1а ТЬг А1а ТЬг Не Рго Тгр РЬе 180 <210> 40 <211> 184 <212> РКТ <213> ТоЬнпопазаиепзЬ <400> 40
Ме! Азр Шз Туг Ьеи Азр Не Аг§ Ьеи Ьеи Рго О1и О1и Рго О1и Уа1 15 10 15
Зег О1и Зег РЬе Ьеи Ьеи Азп А1а Ьеи РЬе А1а Ьуз Ьеи Шз Уа1 Аге 20 25 30
Ьеи С1у С1п О1п А1а О1п О1у Аге Уа101у Уа1 Зег РЬе Рго Азр Шз 35 40 45
Шз Ьуз Аге Ьеи О1у Азр Ьеи Ьеи Аге Ьеи Шз О1у О1п Аг£ ТЬг Азр 50 55 60
Ьеи О1п А1а Ьеи Ме! А1а Азр Азр Тгр Ьеи О1п О1у Ьеи Ьуз О1у Туг 65 70 75 80
ТЬг О1п Суз Зег О1и Уа1 Ьеи Рго Не Рго А1а ТЬг Уа1 Зег Туг Аг®
90 95
А1а Уа1 Ьуз Аге Уа] О1п А1а Ьуз Зег А1а Шз Азп Ьуз Аге О1п Аге 100 105 НО
Зег Не А1а Ьуз О1у Тгр Ьеи ТЬг О1и Зег О1и А1а С1п Пе Аг£ Не 115 120 125
Рго Азр ТКг О1п О1п Ьуз О1и Ьеи Шз Ьеи Рго РЬе Уа1 О1п Ьеи Ьуз 130 135 140
Зег Аге 8ег Азп С1у С1п Ме! Ме! Аге Уа1 Туг Уа1 С1и Шз С1у Рго 145 150 155 160
Уа1 Ьеи А1а Уа1 Рго Уа1 Зег 01у Туг РЬе Азп А1а Туг О1у Ьеи Зег 165 170 175
Зег Не А1а ТКг Пе Рго Тгр РЬе 180
- 49 024121 <210> 41 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 41 сиисасидсс дсасаддсад сииадааа 28 <210> 42 <211> 184 <212> РКТ <213> Εηνϊηίβ ругНоЬае <400> 42
Ме1 Азр Шз Туг О1п Азр Пе Агд Уа1 Агд Уа1 Азр О1и О1и Азп О1у 13 10 15
С1и А1а Уа1 Ьеи Ьеи А1а О1п Уа1 РЬе Ме1 Шз Ьеи Шз С1п Уа1 Ьеи 20 25 30
Ме1 Агд А1а А1а Азп С1у Агд Пе С1у Пе Зег РЬе Рго Азп Уа) Ьуз 35 40 45
Агд ТЬг Ьеи О1у Азр Агд Пе Агд Ьеи Шз 01у ТЬг Ьеи Азр Азр Ьеи 50 55 60
Зег А!а Ьеи О1п О1п Зег 01у Тгр Азп Ьуз Суз Ьеи Агд Азр Туг Пе 65 70 75 80
А1а Суз Зег Азр Пе А1а Рго Уа1 Рго Ьуз О1у А1а А1а Тгр Агд ТЬг 85 90 95
Уа1 Агд Агд Уа1 О1п Уа1 Ьуз Зег Зег А1а О1и Агд Ьеи Агд Агд Агд 100 105 НО
Зег Уа1 Азп Ьуз О1у Тгр Ьеи Зег О1и О1п С1и А1а А1а О1и Агд Пе 115 120 125
Зег Уа1 Ьеи Азп О1и О1п Агд Зег Азп Ьеи Рго РЬе Ьеи С1п Пе Ьуз 130 135 140
Зег 01у Зег Азп О1у О1п А1а Тгр Агд Ьеи РЬе Пе С1и Шз С1у Зег 145 150 155 160
Ьеи Уа1 Зег А1а Рго Зег Азр О1у Зег РЬе Зег Зег Туг О1у Ьеи Зег 165 170 175
А1а А1а А1а ТЬг Не Рго Тгр РЬе 180 <210> 43 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
- 50 024121 <223> Синтетический олигонуклеотид <400> 43 иисасидссд иасаддсадс ииадаааа 28 <210> 44 <211> 198 <212> РКТ <213> ЕзсЬепсЫа соИ <400> 44
Ме1 А1а Уа1 Зег Ьеи Уа! Агд Азп Агд Азп Ьуз С1и Ьеи Рго МеГ Азр 15 10 15
Шз Туг Ьеи С1и Пе Агд Уа1 Ьеи Рго Азр Рго С1и РЬе Зег 5ег С1и 20 25 30
Ме1 Ьеи Ме1 А1а А1а Ьеи РЬе А1а Ьуз Ьеи Шз Агд Уа1 Ьеи О1у А1а 35 40 45
Агд СНу О1п С1у Азр Пе О1у Уа1 5ег РЬе Рго Азр Уа1 Азп Уа1 МеГ 50 55 60
Рго О1у ТЬг Шз Ьеи Агд Ьеи Шз С1у Зег А1а Οίη А1а Ьеи О1п О1и 65 70 75 80
Ьеи О1и А1а Зег ТЬг Тгр Агд Ьуз О1у Ьеи ТЬг Азр Туг Суз О1п Суз 85 90 95
Зег Рго Уа1 ТЬг Рго Уа1 Рго О1и Пе Ьуз О1у Тгр Агд Уа1 Уа! Зег 100 105 110
Агд Уа101п Уа1 Ьуз Зег Азп Рго О1п Агд Ьеи Ьеи Агд Агд Зег Уа1 115 120 125
Ьуз Ьуз О1у Тгр Ьеи ТЬг О1и О1и О1п А1а Пе О1и Агд Ьеи А1а ТЬг 130 135 140
О1п А1а О1и О1п Агд ТЬг Азр Ьеи Рго РЬе Ьеи Азп МеГ Ьуз Зег Ьеи 145 150 155 160
Зег Зег О1п О1п О1п РЬе Ьуз Ьеи РЬе Не Агд Шз О1у Азр Ьеи Ьеи 165 170 175
Ьуз О1и Рго Уа1 Ьуз 01у О1и РЬе Зег Зег Туг О1у Ьеи Зег А1а ТЬг 180 185 190
А1а ТЬг Пе Рго Тгр РЬе 195 <210> 45 <211> 190 <212> РКТ <213> УегттерЬгоЬасГег егзешае <400> 45
Мег Зег ТЬг Шз Туг Ие Азр Пе ТЬг Ьеи Агд Рго Азр Рго О1и РЬе 15 10 15
- 51 024121
Зег Рго А1а ΗΪ3 Ьеи Ьеи Азп А1а Ьеи Шз А1а СНп Ьеи Шз Ьеи А1а 20 25 30
Ьеи Уа1 О1п Ьеи О1у ТЬг С1у Азр Уа1 О1у Уа! 8ег РЬе Рго О1у РЬе 35 40 45
Пе Ьеи Агд 01у О1и Шз Зег Шз Ьеи С1у ТЬг ТЬг Ьеи Агд Ьеи Шз 50 55 60
С1у А1а ТЬг Зег А1а Ьеи С1п Агд Ьеи С1п А1а Ьеи Зег Тгр Ьеи Агд 65 70 75 80
О1у Ме( Агд Азр Шз Уа1 Ьуз ТЬг Зег СНи Уа1 А1а Рго Уа1 Рго ТЬг 85 90 95
Шз ТЬг СНп Шз Агд Уа1 Уа1 Агд Агд Уа1 СНп А1а Ьуз Зег Зег Рго 100 105 110
О1и Агд Зег Агд Агд Агд Ьеи Ме1 Агд Агд Ьеи О1и Пе Азр О1и А1а 115 120 125
С1п А1а Ьеи С1п Агд Ие Рго Азр С1п С1и С1у Агд Агд Ьеи А1а Ьеи 130 135 140
Рго Туг Ьеи Агд Ьеи О1п Зег А1а Зег Ьуз О1у О1п Уа1 РЬе Агд Ьеи 145 150 155 160
РЬе Ие СНи Шз СЛу Рго Ьеи Ьеи Азр ТЬг Рго Зег Рго С1у Зег РЬе 165 170 175
СЛу ТЬг Туг С1у Ьеи Зег ТЬг С1п А1а ТЬг Пе Рго Тгр РЬе 180 185 190 <210> 46 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 46 диисасидсс ддаиаддсад сисадааа 28 <210> 47 <211> 195 <212> РКТ <213> СЬготоЪас(епит ую1асеит <400> 47
Ме1 Азр Шз Туг Ьеи Азр Не Агд Ьеи Ьеи Рго Азр А1а Азр РЬе О1у 15 10 15
Рго Рго Уа1 Ьеи Ме1 Азп А1а Ьеи Туг А1а Ьуз Ьеи Шз Агд А1а Ьеи 20 25 30
А1а А1а О1п О1п Агд О1п Азр Не СЛу Уа1 Зег РЬе Рго О1у Туг Азр 35 40 45
- 52 024121
Рго А1а Рго Зег Зег Шз Азр С1у Ьуз Рго Ьеи Рго Рго ТНг Ьеи С1у 50 55 60
Ьеи ТЬг Ьеи Агу Ьеи Шз О1у Зег А1а А1а А1а Ьеи Азр О1у Ьеи Ме! 65 70 75 80
А1а Агу Агу Тгр Ьеи Зег О1у РНе А1а Азр Шз А1а Пе Уа1 О1у Азр 85 90 95
Пе Агу Рго Уа1 Рго А1а О1у А1а Зег А1а Уа1 Зег Уа1 Агу Агу Агу 100 105 110
О1п А1а Ьуз Зег Зег Рго А1а Агу А1а Агу Азр Агу Ьеи Ме! Агу Агу 115 120 125
О1п О1у Пе Зег А1а О1и О1и А1а Агу Агу Агу Пе Рго Азр О1и ТНг 130 135 140
А1а О1п Агу Ьеи Азп Ьеи Рго Туг Ьеи ТНг Уа1 Азр Зег А1а Зег ТЬг 145 150 155 160
О1у С1п Суз РЬе Агу Ьеи РЬе Уа] О1и О1п О1п А1а А1а Рго Зег Пе 165 170 175
А1а А 1а О1у Зег РЬе Азп А1а Туг О1у Ьеи Зег А1а А1а А1а А1а Ьеи 180 185 190
Рго А1а Тгр 195 <210> 48 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 48 уиисасиусс ууаиауусау сииауааа 28 <210> 49 <2П> 184 <212> РКТ <213> Епуима ГазташегШз <400> 49
Ме! Азр Агу Туг <31п Азр Ие Агу Уа1 Агу Уа1 Азр А1а О1и Ме! ТЬг 15 10 15
А1а Рго Уа1 Ьеи Ьеи А1а О1п Уа1 РЬе Ме! Ату Ьеи Шз <31п Уа1 Ьеи 20 25 30
Ме! Агу А1а А1а Азп О1у Агу Ие О1у Пе Зег РЬе Рго Азр Уа1 Ьуз 35 40 45
Ьеи ТЬг Ьеи О1у Азр Агу Пе Агу Ьеи Шз О1у ТЬг Ьеи Азр Азр Ьеи 50 55 60
- 53 024121
Зег Зег Ьеи 01η ΟΙη Зег О1у Тгр Азр Ьуз О1у Ьеи ТЬг Азр Туг Пе 65 70 75 80
А1а Суз Зег А1а Пе Азр Рго Уа1 Рго Рго О1у А1а А1а Тгр Агд ТНг 85 90 95
Уа1 Агд Агд V®! С1п Уа1 Ьуз Зег Зег А1а О1и Аге Ней Аге Аге Аге 100 105 110
Зег Уа1 Азп Ьуз О1у Тгр Ьеи Азп О1и А1а С1и А1а А1а О1и Агд Пе 115 120 125
Азп Уа1 Ьеи Зег О1и ΟΙη Аге Зег Азр Ьеи Рго Туг Ьеи О1п Пе Ьуз 130 135 140
Зег О1у Зег Азп О1у Шз А1а Тгр Аг§ Ьеи РЬе Не О1и Шз О1у Рго 145 150 155 160
Ьеи Уа1 Зег Уа1 Рго Уа1 Азп О1у О1у РЬе Зег Зег Туг О1у Ьеи Зег 165 170 175
А1а ТЬг А1а ТЬг Уа1 Рго Тгр РЬе 180 <210> 50 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Синтетический олигонуклеотид <400> 50 диисасидсс диасаддсад сииаеаае 28 <210> 51 <211> 190 <212> РКТ <213> ЦеННа асЫокогапз <400> 51
Ме( А1а Ме1 ТЬг Зег Шз Туг Пе Азр ТЬг ТЬг Ьеи Ьеи Рго Азр Рго 15 10 15
О1и РЬе Зег Шз А1а Шз Ьеи Ьеи О1у А1а Ьеи Уа1 А1а Ьуз Ьеи Шз 20 25 30
Агд А1а Ьеи Уа1 С1п Ьеи О1у Зег ТЬг Азр Пе О1у Пе Зег РЬе Рго 35 40 45
О1у Туг Зег Ьеи Агд Рго Агд ТЬг Ьеи О1у ТЬг Пе Ьеи Агд Ьеи Шз 50 55 60
О1у Зег О1и А1а А1а Ьеи Агд О1у Ьеи Ме101и О1п Рго Тгр Ьеи О1п 65 70 75 80
О1у Ме( Агд Азр Шз Уа] Шз Суз ТЬг Рго Рго А1а Ьеи Уа1 Рго О1и 85 90 95
- 54 024121
01у А1а Уа1 Рго Суз Ьеи Уа1 ΟΙη Аг§ Аг§ ΟΙη РЬе Ьуз ТЬг Зег Рго 100 105 ПО
Азр Аг§ Ьеи Аг§ Аг§ Аг§ Аг§ Ме! Аг§ Аг§ Ьуз С1у С1и ТЬг А1а О1и 115 120 125
ΟΙη А1а А1а А1а А1а Пе Рго Азр Зег Уа101и Аг§ ТЬг Рго Азр Ьеи 130 135 140
Рго Туг Уа101п Ьеи Аг§ Зег А1а Зег ТЬг О1у ΟΙη Рго РЬе Суз Ьеи 145 150 155 160
РЬе Уа1 О1и ΟΙη Ьуз А1а Уа1 О1п О1у ТЬг А1а О1у ΟΙη О1и О1у РЬе 165 170 175
Азп ТЬг Туг О1у Ьеи Зег Ьеи О1у ТЬг А1а Уа1 Рго Тгр РЬе 180 185 190 <210> 52 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 52 £иис£си£сс §с§иа££са£ сиса^ааа 28 <210> 53 <211> 184 <212> РКТ <213> Еп!егоЬас!ег зр. 638 <400> 53
Ме1 Азр Шз Туг Ьеи С1и 11е Аг£ Уа1 Ьеи Зег Азр Рго О1и РЬе Зег 15 10 15
С1и О1и ТЬг Ьеи Ме! А1а А1а Ьеи РЬе А1а Ьуз Ьеи Шз Аг§ А1а Ьеи 20 25 30
О1у А1а Аг§ О1у О1п О1у Азр Пе О1у Уа1 Зег РЬе Рго Аг§ Туг Зег 35 40 45
Ьеи Ьуз Рго О1у Азр ТЬг Ьеи Аг§ Ьеи Шз 01у Зег А1а О1п Зег Ьеи 50 55 60
Азр О1и Ьеи О1и Ьуз Ме! А1а Тгр Аг§ Ьуз 01у Ьеи Зег Азр Туг Суз 65 70 75 80
Ьеи Суз Ьуз 01у Уа1 Ьеи Рго А1а Рго Азр Уа1 Азп А1а Тгр Лг§ Суз 85 90 95
Уа1 Зег Аг§ Уа1 О1п Уа! Ьуз Зег Зег Рго О1п Аг§ Ьеи Ме! Аг§ Аг§ 100 105 110
Зег Уа1 Ьуз Ьуз О1у Тгр Ьеи ТЬг О1и О1и О1и А1а О1п О1п Аг§ Ьеи 115 120 125
Ьеи Азп Ьеи О1п О1и А1а Аг§ ТЬг Азр Ьеи Рго Тгр Ьеи Азп Ьеи О1п
- 55 024121
130 135 140
Зег Ьеи Зег ТЬг С1у О1п Зег РЬе Агд Ьеи РЬе Пе Агд Нв О1у Азр 145 150 155 160
Не Уа1 Азр Ме! Рго Ме! Суз С1у С1и РЬе Зег Зег Туг С1у Ьеи Зег 165 170 175
А1а ТЬг А1а ТЬг Пе Рго Тгр РЬе 180 <210> 54 <2)1> 186 <212> РКТ <213> ТЫоа1ка1тЬпо зр. Κ90τηίχ <400> 54
Ме! Азр Н15 Тут Ьеи Азр Ьеи Агд Уа1 Ме( Рго Азр Рго О1и РЬе Ьуз 15 10 15
О1и ТЬг ТЬг Ьеи Ьеи С1у А1а Ьеи Уа1 Зег Ьуз Ьеи Шз Агд Агд Ьеи 20 25 30
Уа1 Зег Ме! Зег А1а Азр Азр Пе О1у Пе Зег Ьеи Рго Азр Шз О1и 35 40 45
О1п О1и Рго Рго Ьеи О1у Агд Агд Ьеи Агд Уа1 Шз О1у ТЬг О1п С1у 50 55 60
Агд Ьеи Азп Ьеи Ьеи Ме! С1п Азр О1и Тгр Ьеи С1у О1у Ме! С1п Зег 65 70 75 80
Ьеи Уа1 Азр А1а ТЬг Рго Уа1 О1п Рго Уа1 Рго Азр С1п Уа1 ТЬг Туг 85 90 95
Агд Рго Уа1 Агд Агд Агд С1п Тут Ьуз ТЬг Азп А1а О1и Агд Ьеи Агд 100 105 ПО
Агд Агд Агд Ме! Агд Агд Шз С1у О1и Зег Туг С1и О1и А1а Агд С1п 115 120 125
Шз Пе Рго Азр ТЬг Уа1 С1и Агд Агд Уа1 Азп ТЬг Рго РЬе Ьеи Зег 130 135 140
Уа1 О1п Зег А1а Зег ТЬг О1у О1п Агд РЬе Зег Ьеи РЬе Пе С1и Шз 145 150 155 160
О1у Рго Рго С1п С1п Шз А1а Зег Рго 01у Агд РЬе Азп ТЬг Туг О1у 165 170 175
Ьеи Зег О1п Азр А1а ТЬг Уа1 Рго Тгр РЬе 180 185 <210> 55 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
- 56 024121 <400 55 дииадсидсс дсасаддсад сисадааа 28 <210 56 <211> 193 <212> РКТ <213> 2ушотопаз тоЫНз <400 56
Ме! Ьеи А1а Азп Рго Уа1 Азр Зег Туг 01п Азр Пе Туг Пе Ьеи Рго 15 10 15
Азп С1п 01и Пе А1а Рго Шз Пе Пе Ме1 С1и Ьуз Ьеи РЬе Зег Ьеи 20 25 30
Ьеи Шз Ьеи 01и Ьеи Уа1 Агд Ьеи 01у Зег СПп Н<з Не СПу Не Зег 35 40 45
РЬе Рго С1и Шз Азр Азп Азп Ьуз Рго Суз Ьеи 01у Зег Агд Ьеи Агд 50 55 60
Ьеи Шз СПу ТЬг СПу А1а Азр Ьеи Шз СПи Ьеи А1а Ьеи Зег СПу Тгр 65 70 75 80
Пе ТНг Агд Ьеи Азр Азр Туг Ьеи Туг Суз С1и Азр Пе Ьуз Зег Уа1 85 90 95
Рго СПи Пе Агд 0!п Туг Суз Уа1 Уа1 8ег Агд Уа101п А1а Ьуз Зег 100 105 ПО
Зег Рго А1а Агд Ьеи Агд Агд Агд А!а Пе Агд Агд Шз 01у РЬе Шз 115 120 125
Азр СПи СПи А1а Ьуз Ьуз Уа1 Пе Рго Азр ТЬг А1а РЬе СПи Агд Ьеи 130 135 140
СНи Ьеи Рго РЬе Пе Ме1 ТЬг О1у Зег Суз Зег ТЬг Ьуз О1п Рго Агд 145 150 155 160
РЬе Рго Уа1 РЬе Не Зег Шз Ьуз Пе Не Οίη Азп Ьуз Ьеи Ме( Азп 165 170 175
О1у Азп РЬе Азп Зег Туг О1у Ьеи Зег Ьеи О1у А1а Зег Уа1 Рго Тгр 180 185 190
РЬе <210 57 <211> 193 <212> РКТ <213> гутотопаз тоЫНз <400> 57
Ме1 Ьеи А1а Азп Рго Уа! Азр Зег Туг С1п Азр Пе Туг Пе Ьеи Рго 15 10 15
- 57 024121
Азп 01п 01и Пе А1а Рго Шз Пе Пе Ме101и Ьуз Ьеи РЬе Зег Ьеи 20 25 30
Ьеи Шз Ьеи О1и Ьеи Уа1 Агд Ьеи СПу 8ег Οίη ΗΪ3 Пе О1у Пе Зег 35 40 45
РЬе Рго О1и Ηϊκ Азр Азп Азп Ьуз Рго Суз Ьеи 01у Зег Агд Ьеи Агд 50 55 60
Ьеи Шз О1у А1а О1у А1а Азр Ьеи Шз О1и Ьеи А1а Ьеи 5ег О1у Тгр 65 70 75 80
Пе ТЬг Агд Ьеи Азр Азр Туг Ьеи Туг Суз О1и Азр Пе Ьуз Бег Уа1 85 90 95
Рго О1и Пе Агд О1п Туг Суз Уа1 Уа1 Зег Агд Уа1 О1п А1а Ьуз Зег 100 105 НО
Зег Рго А1а Агд Ьеи Агд Агд Агд А1а Пе Агд Агд Шз О1у РЬе Шз 115 120 125
Азр О1и О1и А1а Ьуз Ьуз Уа1 Пе Рго Азр ТЬг А1а РЬе О1и Агд Ьеи 130 135 140
СНи Ьеи Рго РЬе Пе Мег ТЬг СПу Зег Суз Зег ТЬг Ьуз О1п Рго Агд 145 150 155 160
РЬе Рго Уа] РЬе Пе Зег Шз Ьуз Пе Не О1п Азр Ьуз Ьеи МеГ Азп 165 170 175
О!у Азп РЬе Азп Зег Туг О1у Ьеи Зег Ьеи О1у А1а Зег Уа1 Рго Тгр 180 185 190
РЬе <210> 58 <211> 191 <212> РКТ <213> АсИоуогах зр. 1342 <400> 58
Мег ТЬг ТЬг Шз Туг Не Азп Пе ТЬг Ьеи Ьеи Рго Азр Рго О1и РЬе 15 10 15
Зег Шз А1а Шз Ьеи Ьеи О1у А1а Ьеи Уа1 А1а Ьуз Ьеи Шз Агд А1а 20 25 30
Ьеи Уа1 СНп О1у Шз ТЬг ТЬг Азр Пе СПу Уа] Зег Туг Рго О1п Шз 35 40 45
Уа1 Зег Οίη Рго Ьеи ТЬг Ьуз Агд ТЬг Ьеи О1у А1а Уа1 Ьеи Агд Ьеи 50 55 60
Шз О1у ТЬг Рго О1и А1а Ьеи О1п Агд Ьеи Мес О1и О1и Азр Тгр Ьеи 65 70 75 80
Ьуз О1у МеГ Агд Азр Шз ТЬг О1п Уа1 01у СНи Ьеи Ьеи Рго Уа1 Рго 85 90 95
- 58 024121
А1а Азп А1а Οίη Шз Агд ТЬг Уа1 Агд Агд Агд Οίη РЬе Ьуз ТЬг Азп 100 105 110
А1а Азр Агд Ьеи Агд Агд Агд Агд МеГ О1п Агд Ьуз О1у О1и ТЬг А1а 115 120 125
О1и О1п А1а А1а А1а А1а Пе Рго Азр ТЬг Уа101и Агд Агд Рго Азр 130 135 140
Ьеи Рго РЬе Уа101п Ьеи Агд Зег Зег Зег ТЬг О1у О1п Зег РЬе Суз 145 150 155 160
Ьеи Суз Уа1 О1и Шз О1у Рго Ьеи О1п Рго Ьеи Рго Уа1 А1а О1у А1а 165 170 175
РЬе Азп А1а Туг О1у Ьеи О1у Шз Азр А1а ТЬг Уа1 Рго Тгр РЬе 180 185 100 <210> 59 <211> 28 <2Ι2> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 59 диисасидсс дсаиаддсад сисадааа 28 <210> 60 <211> 182 <212> РКТ <213> ОезиИйпзрМПцт ЬкПсит <400> 60
Мег Азр Зег Туг Пе СПи Пе Агд Пе Ьеи Рго Азр СНп СЛи РЬе О1и 15 10 15
А1а ТЬг ТЬг Ьеи Мег Зег ТЬг Уа1 РЬе А1а Ьуз Ьеи Шз Агд А1а Ьеи 20 25 30
Уа1 СПи Зег СНу Агд Зег Азр Пе О1у Уа1 Зег РЬе Рго СНи А1а СНу 35 40 45
Ьуз ТЬг Рго О1у А1а Ьеи Ьеи Агд Ьеи Шз О1у Зег Ьеи А1а А1а Ьеи 50 55 60
СНи Зет Пе Мех ТЬг Ьеи Зег Тгр Ьеи ТЬг С1у Ьеи СНп Азр Туг ТЬг 65 70 75 80
СНп ТЬг Зег СНу Не Ьеи О1п Уа1 Рго А1а С1п А1а А1а Туг Уа1 О1п 85 90 95
Уа1 А1а Агд Уа1 О1п Зег Ьуз МеГ ТЬг А1а Зег Агд Пе Агд Агд А1а 100 105 НО
Ьеи Ьуз Агд СНу Зег Ьеи Зег СНи СНи Агд А1а Ьеи СПи Ьеи Ьеи СНп 115 120 125
- 59 024121
Зег Агд Азр ΟΙη Ьеи Азп О1п Рго РЬе РЬе Агд Ьеи Ьеи Зег А1а Зег 130 135 140
ТЬг А1а О1п Ьуз РЬе Рго Ьеи РЬе Пе О1и О1п Агд Азп А1а О1и Ьуз 145 150 155 160
А1а О1у Ьуз О1п Зег Уа1 Туг Зег А1а Туг О1у Ьеи Зег Уа1 О1у О1у 165 170 175
Зег ТЬг Уа1 Рго Тгр РЬе 180 <210> 61 <211> 184 <212> РКТ <213> РЬо(оЬас(епит ргойлиЗит <400> 61
Ме! Ме! Азр Зег Туг Уа1 Азр Пе О1п Ьеи Ьуз Рго Азр А1а О1и Ме! 15 10 15
Агд О1и А1а О1и Ьеи Зег Зег Ьуз Уа1 РЬе ТЬг Ьуз РЬе Шз Ьуз А1а 20 25 30
Ьеи А1а ТЬг Ьеи Азл ТЬг Азп Ьуз Пе О1у Пе Зег РЬе Рго О1п Ме!
40 45
Азп Ьеи Ьуз Ьеи О1у Агд Ьеи РЬе Агд Пе Шз 01у Азп А1а Зег Ьеи 50 55 60
Ьеи Ьуз Азр Ьеи О1п О1у Пе Ьуз Тгр Ьеи О1у А1а Ьеи А1а О1у Туг 65 70 75 80
Суз О1п Уа1 О1у О1и Пе ТЬг Уа1 Уа1 Рго Азр О1п Уа10!п Туг Агд 85 90 95
Уа1 Пе Зег Уа1 Ьу5 Агд Зег Азп Ьеи Зег Ьуз А1а Ьуз Ьеи Ьуз Агд 100 105 НО
Ьеи Пе А1а Агд О1у Зег Пе Азр Ьуз Азр О1у О1и Ьуз Агд Туг Ьуз 115 120 125
Уа1 Ьуз Ме! Ьеи Зег О1п О1у РЬе Азр Азп Рго Туг Ьеи Азр Ьеи РЬе 130 135 140
Зег Зег Зег ТЬг О1у О1п Уа1 Туг Агд Ьуз РЬе РЬе О1и РЬе О1у Азр 145 150 155 160
Пе О1п А1а ТЬг Зег Уа1 Зег Азр О1и РЬе Азр Зег Туг О1у Ьеи Зег 165 170 175
Азп ТЬг А1а ТЬг Пе Рго Тгр РЬе 180 <210> 62 <2П> 184 <212> РКТ <213> ЬедюпеНа рпеиторЬНа
- 60 024121 <400> 62
Ме! Азр Шз Туг Ьеи Азр Не Зег Пе Ьеи Рго Азр Зег О1и РНе ТЬг 15 10 15
ТНг Рго Уа1 Ьеи Ме! Азп А1а Пе Туг ТНг Азп Ьеи Шз Ьуз А1а Ьеи 20 25 30
Шз ТНг Ьеи А1а Зег ТНг Азп Не СПу Уа1 Зег РНе Рго Ьуз Туг Зег 35 40 45
Зег ТЬг Ьеи О1у Азп Ьеи Ьеи Аге Пе Шз О1у Ьуз Ьуз О1и А1а Ьеи 50 55 60
О1п О1и Ьеи ΟΙη Азп Ьеи Азп Тгр Пе 01у О1у Ме! Пе О1у Туг Суз 65 70 75 80
О1и А1а Зег Ьеи Пе Ьуз ТНг Уа1 Рго А1а Азр ТНг Ьуз РНе Аге ТЬг 85 90 95
Уа1 Зег Аг§ Ьуз С1п Рго ТЬг Ме! Зег О1п Зег Ьуз Ьеи Аг§ Аге Ьеи 100 105 110
Пе Ьуз Аг§ Азп Зег Ьеи ТЬг О1и Азр О1и Ие Аг§ О1п Туг Ьуз А1а 115 120 125
Ьуз Ме! РЬе Зег Ьуз О1у Ьеи Азр Азп Рго Туг Не О1и Ьеи Уа1 Зег 130 135 140
Уа1 Зег Азп СПу О1п Аг§ Шз Аг§ Аг§ Туг Не О1и РЬе СИу СПи Ьеи 145 150 155 160
РНе Азп С1и Рго Пе Рго СПу Ьеи РНе Азр С1п РЬе С1у Ьеи Зег Азп 165 170 175
Зег А1а ТЬг Уа1 Рго Тгр РЬе Азр 180 <210> 63 <211> 184 <212> РКТ <213> ЬееюпеИа рпеиторЬНа <400> 63
Ме! Азр Шз Туг Ьеи О1и Пе Зег Пе Ьеи Рго Азр Зег О1и РНе ТЬг 15 10 15
ТЬг Рго Уа1 Ьеи Ме! Азп А1а Пе Туг ТНг Азп Ьеи Шз Ьуз А1а Ьеи 20 25 30
Шз ТНг Ьеи А1а Зег ТНг Зег Не О1у Уа1 Зег РНе Рго Ьуз Туг Зег 35 40 45
Зег ТЬг Ьеи СПу Азп Пе Ьеи Аге 4е ΗΪ3 О1у Ьуз Ьуз О1и Уа1 Ьеи 50 55 60
О1п Азр Ьеи С1п Азп Ьеи Азп Тгр Пе О1у 01у Ме! Пе 01у Туг Суз 65 70 75 80
О1и А1а Зег Ьеи Пе Ьуз ТНг Уа1 Рго А1а Азр ТЬг Ьуз РНе Аге ТЬг
- 61 024121
90 95
Уа1 Зег Аге Ьуз θΐη Рго ТЬг Мег Зег О1п Зег Ьуз Ьеи Аге Агд Ьеи 100 105 НО
Ие Ьуз Аг§ Азп ТЬг Ьеи ТЬг С1и Азр С1и Не Аге <-Нч Туг Ьуз А1а 115 120 125
Ьуз МеГ РЬе Зег Ьуз СЛу Ьеи Азр Азп Рго Туг Не СНи Ьеи Уа1 Зег 130 135 140
Уа1 Зег Азп СНу О1п Аг§ Шз Аге Аге Туг Не С1и РЬе СЛу С1и Ьеи 145 150 155 160
РЬе Азп О1и Рго Зег Рго СЛу Ьеи РЬе Азр СНп РЬе О!у Ьеи Зег Азп 165 170 175
Зег А1а ТЬг Уа1 Рго Тгр РЬе Азр 180 <210> 64 <211> 183 <212> РКТ <213> ЗЬслеапеНа риГтеТаскпз <400 64
МеГ Азп Зег Туг Пе Азр Ие Аг§ Ьеи Ьуз Рго Азр А1а С1и МеГ Агд 15 10 15
СНи А1а С1и Ьеи Зег Зег Ьуз Уа1 РЬе ТЬг Ьуз РЬе Н1з Ьуз А1а Ьеи 20 25 30
Уа1 ТЬг Ьеи Азп Зег Шз Ьуз Пе СЛу Пе Зег РЬе Рго С1п МеГ Ьуз 35 40 45
Ьеи Зег Ьеи СЛу О1п Ьеи РЬе Агд Пе Шз О1у Азр А1а Зег Ьеи Ьеи 50 55 60
Шз Азр Ьеи СЛп СЛу Ьеи Азр Тгр Ьеи 01у Рго Ьеи А1а СЛу Туг Суз 65 70 75 80
СНп Уа1 ТЬг А1а Уа1 Зег А1а Уа1 Рго Азр Шз Уа1 СНп Туг Агд Пе 85 90 95
Уа1 Зег Уа1 Ьуз Агд Зег Азп Ьеи Зег Ьуз А1а Ьуз Ьеи Ьуз Агд Ьеи 100 105 110
Ие А1а Агд (Лу Зег Пе Авр Ьуз Азр О1у О1и Ьуз Агд Туг Ьуз Уа! 115 120 125
Ьуз МеГ Ьеи СНу СНп СЛу РЬе Азр Азп Рго Туг Ьеи Азр Ьеи РЬе Зег 130 135 140
Зег Зег ТЬг СНу О1п Уа1 Туг Агд Ьуз РЬе РЬе СЛи РЬе Зег Азр Пе 145 150 155 160
СЛп А1а Шз Рго Ьеи Азр СНу СНи РЬе Азр Зег Туг СЛу Ьеи Зег Ьуз 165 170 175
- 62 024121
ТНг А1а ТНг Уа1 Рго Тгр РНе 180 <210> 65 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 65 §иисасс§сс §сас১с§§ сииа§ааа 28 <2Ю> 66 <211> 184 <212> РКТ <213> Ье^юпеПа рпеиторННа <400> 66
Ме1 Аар Туг Туг Уа1 Аар 11е Ьеи Пе Ьуа Рго Аар Зег О1и Ьуа Зег 15 10 15
Ьеи Аап РЬе Ьеи Ьеи Зег ТЬг Ьеи Туг ТЬг Ьуа Ьеи Ηΐ$ Ьуа Уа1 Ьеи 20 25 30
Ша Аар Ме1 А1а Зег ТЬг Аап Ие О1у Уа1 Зег РЬе Рго Ьуа Туг Азп 35 40 45
Пе ТЬг Ьеи О1у Аап Ие Ьеи Ат§ Не Н1а Зег Ьуа Ьуа Уа1 Уа1 Ьеи 50 55 60
Аар О1и Ьеи Ьеи О1у Ме( Азп РЬе Ьеи Зег О1у Пе Азп Азп Тут Туг 65 70 75 80
О1и Уа1 Зег Рго Не Ьуа Зег Уа1 Рго А1а Аар Зег Ьуа РЬе Лгр Не 85 90 95
Пе Зег Аг§ Ьуа О1п ТЬг ТЬг Мег Зег О1п Зет Ьуа Ме1 Аг§ Аг§ Ьеи 100 105 ПО
РЬе Ьуз Αηζ О1у Зег Ме! ТЬг Уа1 О1у Аар Ие Аг£ О1п Туг Ьуа А1а 115 120 125
Ьуа Ме( РЬе А1а Ьуа Зег Пе Азр Азп Рго Тут Ьеи С1и Ьеи Уа1 Зег 130 135 140
01у Зег Азп О1у Туг Аг§ Туг Аг§ Агу Туг Не СПи РЬе О1у С1и Ьеи 145 150 155 160
Ьеи Азр О1п Рго Уа1 Туг СИу О1и РЬе Аар Аг^ РЬе О1у Ьеи Зег Ьуа 165 170 175
ТЬг А1а ТЬг Уа1 Рго Тгр РЬе Азр
180
<210> <211> <212> 67 28 ΚΝΑ
- б3 024121 <213>
Искусственная последовательность <220>
<223>
Синтетический олигонуклеотид <400 <400> 67 дииаасидсс дсасаддсад си над аад <210> 68 <211> 183 <212> РКТ <213> УЛпо те1зсЬшкоуп <400> 68
Ме! Азр Зег Туг Не 01и Пе Агд Ьеи 01п Рго Азр А1а СНи Ме! Рго 15 10 15
СНи А1а 01и Ьеи Зег Зег Ьуз Уа1 РЬе ТЬг Ьуз РЬе Н1з Ьуз А1а Ьеи 20 25 30
Уа1 Пе Ьеи Н1з Зег Азп СНп Пе СЛу Не Зег РЬе Рго 01и Уа1 Азп 35 40 45
Уа1 Ьуз Ьеи <31у Агд Ьеи РЬе Агд Ьеи Шз О1у СНи А1а Зег РЬе Ьеи 50 55 60
Шз Азр Ьеи СНп СНу Ьеи Азп Тгр Ьеи СНу Рго Ьеи Зег СНу Туг Суз 65 70 75 80
СНп Уа1 Зег СНи Пе Ьеи А1а Пе Рго СНи СНп Уа1 СНп Туг Агд Уа1 85 90 95
Пе Зег Уа1 Ьуз Агд Зег Азп Ьеи Зег О1п А1а Ьуз Ьеи Агд Агд Ьеи 100 105 ПО
Ие А1а Агд С1у Зег Пе Азр Ьуз СНи СНу СНи Ьуз Агд Туг Ьуз Уа1 115 120 125
Ьуз Мег Ьеи Зег СНп СНу РЬе Азр Азп Рго Туг Ьеи Азр Ьеи РЬе Зег 130 135 140
Зег Зег ТЬг Ьуз СНп Уа1 Н1з Агд Ьуз РЬе РЬе СНи РЬе О1у СНи Пе 145 150 155 160
СНп Рго Ьеи Рго Уа1 Зег СНу Ьуз РЬе Азр Зег Туг С1у Ьеи Зег Шз 165 170 175
ТЬг ТЬг ТЬг Уа1 Рго Тгр РЬе 180 <210> 69 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 69
- 64 024121 диисасидсс дсаиаддсад сииадааа 28 <210> 70 <211> 102 <212> РКТ <213> СЬгоЬаПег козел <400> 70
Ме! А1а Пе ТЬг Рго Уа1 Рго А1а Уа1 Ьуз 01у Тгр Агд ТЬг Уа1 Зег 15 10 15
Агд Уа1 ΟΙη Уа1 Ьуз Зег Зег Рго ΟΙη Агд Ьеи Ьеи Агд Агд Зег Уа1 20 25 30
Агд Ьуз 01у Тгр Ьеи ТЬг О1и О1и О1п А1а О1п Ьеи Агд Ьеи Уа101и 35 40 45
Зег ТЬг О1и ΟΙη Н1з Зег Азр Ьеи Рго Туг Ьеи Азп Уа1 Ьуз Зег Ьеи 50 55 60
Зег Азп ΟΙη Οίη О1п РЬе Агд Уа1 РЬе Не Агд Н1з Зег О1и Ьеи Агд 65 70 75 80
Зег О1и Рго Уа1 Зег О1у ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг О1у Ьеи Зег Зег ТЬг 85 90 95
А1а ТЬг Пе Рго Тгр РЬе 100 <210> 71 <211> 183 <212> РКТ <213> Уй>по зр. КС586 <400> 71
Ме1 Азр А!а Туг Пе Азр Пе Агд Ьеи Ме! Рго Азр А1а О1и Ме! Агд 15 10 15
О1и А1а О1и Ьеи Зег Зег Ьуз Уа1 РЬе Пе Ьуз РЬе Шз Ьуз А1а Ьеи 20 25 30
Уа1 Ьуз Ьеи Агд Зег Азп Ьуз Пе О1у Пе Зег РЬе Рго О1и А1а Азп 35 40 45
Пе Ьуз Ьеи 01у Агд Ьеи РЬе Агд Ьеи Шз О1у О1и Ме! Зег А1а Ьеи 50 55 60
Шз Азр Ьеи О1п О!у Ьеи Азп Тгр Ьеи О1у Рго Ьеи А1а С1у Туг Суз 65 70 75 80
Ьуз Пе ТКг ТЬг Уа1 ТЬг Н1з Уа1 Рго Азр О1п Уа101п Туг Агд Не 85 90 95
Не Зег Уа1 Ьуз Агд Зег Азп Ьеи Зег Ьуз А1а Ьуз Ьеи ТЬг Агд Ьеи 100 105 110
Пе А1а Агд О1у Зег Не Азр Ьуз Азр О1у О1и Ьуз Агд Туг Ьуз Уа1 115 120 125
- 65 024121
Ьуз Ме1 Ьеи Зег 01п 01у РЬе Азр Азп Рго Туг Ьеи Азр Ьеи Зег Зег 130 135 140
Зег Зег ТЬг О1у О1п Уа1 Туг Агд Ьуз РЬе РЬе О1и РЬе Зег Азр Пе 145 150 155 160
О1п А1а Азр Рго Уа] Азр С1у О1и РЬе Азр Зег Туг С1у Ьеи Зег Ьуз 165 170 175
ТЬг А1а ТЬг Уа1 Рго Тгр РЬе 180 <210> 72 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 72 адидиисидс сдааиаддса дсиаадаа 28 <210> 73 <211> 184 <212> РКТ <213> У|Ьгю сЬо1егае <400> 73
Ме1 Ме! Азр А1а Туг Не Азр Не Агд Ьеи Ме! Рго Азр А1а С1и Ме! 15 10 15
Агд О1и А1а С1и Ьеи Зег Зег Ьуз Уа1 РЬе Пе Ьуз РЬе Шз Ьуз А1а 20 25 30
Ьеи Уа! Ьуз Ьеи О1п Зег Азп Ьуз Пе О1у Пе Зег РЬе Рго О1и А1а 35 40 45
Азп Не Ьуз Ьеи О1у Агд Ьеи РЬе Агд Ьеи Шз О1у <31и Уа! Зег А1а 50 55 60
Ьеи Шз Азр Ьеи О1п О1у Ьеи Азп Тгр Ьеи О1у Рго Ьеи А1а О1у Ту 65 70 75 80
Суз Ьуз Не ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Шз Уа1 Рго Азр О1п Уа101и Туг Агд 85 90 95
Пе Пе Зег Уа1 Ьуз Агд Зег Азп Ьеи Зег Ьуз А1а Ьуз Ьеи А1а Агд 100 105 НО
Ьеи Пе А1а Агд О1у Зег Не Азр Ьуз Азр О1у О1и Ьуз Агд Туг Ьуз 115 120 125
Уа1 Ьуз Ме! Ьеи Агд О1п 01у РЬе Азр Азп Рго Туг Ьеи Азр Ьеи Зег 130 135 140
Зег Зег Зег ТЬг С1у О1п Уа1 Туг Агд Ьуз РЬе РЬе О1и РЬе Зег Азр 145 150 155 160
- 66 024121
Пе Οίη А1а 01и Рго Уа1 Азр 01у С1и РЬе Азр Зег Туг 01у Ьеи 5ег 165 170 175
Ьуз ТЬг А1а ТЬг Уа1 Рго Тгр РЬе 180 <210> 74 <211> 29 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 74 уиисасиусс усасауусау сииауаааи 29 <210> 75 <211> 197 <212> РЯТ <213> Оха1оЬас!ег Готиуепез <400> 75
Ме! Ьуз Шз Туг Пе О1и Пе ТЬг Ьеи ТЬг 01у Зег Рго Азр РЬе Рго 15 10 15
Ьеи Туг Шз Ьеи Тгр Зег Ьуз Ьеи Туг ТЬг О1п Ьеи Шз Ьеи А1а Ьеи 20 25 30
Уа101и Азп Агу Азр А1а Зег Азр О1п Уа1 Азп Не О1у Уа1 Зег РЬе 35 40 45
Рго О1и Туг Туг РЬе Азп О1и СНи Ьуз О1у Ме101у РЬе Ьеи О1у ТЬг 50 55 60
Ьуз Ьеи Агу Ьеи РЬе А1а О1и Азр О1и ТЬг Зег Ьеи О1п Ьуз Не Азр 65 70 75 80
Ие О1п Ьуз Тгр РЬе Уа1 Агу Ьеи Азп Азр Суз Не Шз Пе ТЬг Рго 85 90 95
Уа1 Суз Агу Уа1 Рго Ьеи Азп О1и Ие ТЬг СНу Туг А1а ТЬг РЬе Зег 100 105 ПО
Агу Ьуз Шз Пе Ьуз Зег Азп А1а СНи Агу Ьеи А1а Агу Агу О1п Ме! 115 120 125
Ьуз Агу Шз Ьуз Азр Ьеи Зег РЬе Шз СНи ТЬг Уа101п Агу Туг О1п 130 135 140
Ьуз Азп Ьеи А1а Ьуз Зег Рго Ьеи Рго РЬе Пе О1п Ьеи СНи Зег Ьеи 145 150 155 160
ТЬг Азп Зег Шз Рго РЬе Ьуз Ьеи РЬе Не <31и Ьуз Ьуз Рго А1а Пе 165 170 175
Азп А1а Зег Ьеи Ьуз Уа] РЬе ТЬг ТЬг Туг СНу Ьеи Зег А1а О1и Зег 180 185 190
- 67 024121
ТЬг Пе Рго О1и РЬе 195 <2Ю> 76 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 76 диисасидсс диаиаддсад сииадаад 28 <210> 77 <211> 193 <212> РКТ <213> РзусЬготопаз тдгаЬатп <400> 77
Мег Ьуз Туг Туг Ьеи Азр Ие ТЬг Ьеи Ьеи Рго Азр Пе О1и Пе Рго 15 10 15
Ьеи СНу РЬе Пе Тгр О1п Ьуз Уа1 РЬе ΟΙη Οίη Уа1 Шз Ие А1а Ьеи 20 25 30
А1а Азр Азп Ьуз Уа101у О1и Азп О1и Зег Азр Ие А1а Ьеи Зег Ьеи 35 40 45
Рго Азп Туг О1у Азр Ьуз А1а РЬе Рго Ьеи СНу Азп Ьуз Ьеи Агд Ьеи 50 55 60
РЬе Зег Уа1 Зег О1и О1п А1а Ьеи О1и Агд Ьеи А1а Пе ТЬг Ьуз Тгр 65 70 75 80
Ьеи Ьуз Агд РЬе ТЬг Азр Шз ТЬг Шз Пе ТЬг Зег Уа1 Ьуз А1а Уа1 85 90 95
Рго О1и Зег А1а Азп О1и Туг А1а Суз РЬе ТЬг Агд Ьуз О1п РЬе Азп 100 105 ПО
ТЬг Азп Пе Зег Агд Ьеи А1а Агд Агд Агд А1а Ьуз Агд Шз МеГ О1и 115 120 125
ТЬг РЬе О1и Ьуз А1а Ьеи О1п Туг Туг Азр Азп РЬе А1а О1и О1и О1п 130 135 140
ТЬг Ьуз Ьеи Рго РЬе Ме1 Азп Пе Ьуз Зег Ьеи ТЬг Азп Азп А1а О1п 145 150 155 160
РЬе Агд Не РЬе Не О1и Агд Зег Пе ТЬг Ьуз Пе Рго Ьуз О1п О1у 165 170 175
ТЬг РЬе Азп Суз Туг О1у Ьеи Зег ОЬч А1а Не А1а ТЬг Уа! Рго Тгр 180 185 190
РЬе
- 68 024121 <210> 78 <211> 29 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 78 дидииссссд идсссасддд даидаассд 29
-=210=- 79 <211> 202 <212> РКТ <213> 01сЬе1оЬасГег поПозиз <400> 79
Ме( Азп РЬе Туг О1п О1и Пе ТЬг Ьеи Ьеи Рго Азр А1а О1и Уа1 Зег 15 10 15
Ьеи Тут РЬе Ьеи Тгр Зег Ьуз Уа1 Туг О1у О1п Ьеи Шз Пе А1а Ьеи 20 25 30
А1а Азр Уа1 Агд Азп Агд Тут СНу Не Азр ТЬг Не СНу Уа1 Азп РЬе 35 40 45
Рго ΗΪ3 Туг Уа1 Туг О1и СЛи С!1п Азп Шз Ьуз Уа1 Уа1 А1а А1а Агд 50 55 60
Ьеи СНу Азр С1п Ьеи Агд Пе РЬе А1а Ьеи А1а С1и Азп Азр Ьеи С1и 65 70 75 80
Ьуз Ьеи СПп Не Азп СНп Тгр Ьеи С1и Атд Ьеи Зег Азр Туг Уа! Шз 85 90 95
Не Ьуз Агд Пе Зег Ьуз Пе СЛи Рго Азп Ьуз Уа1 ТЬг С1у Туг Уа!
100 105 110
Уа1 Уа1 Ьу5 Агд Туг Агд Туг Рго Зет Ьеи Азр Ьуз Уа1 А1а Ьеи Агд 115 120 125
РЬе А1а О1п РЬе Агд Ьуз Не Азп РЬе СЛи СНи А1а Агд Ьуз ΗΪ5 Суз 130 135 140
ТЬг Ьуз Туг Ьуз Шз С1п А1а Ьуз Азп Туг Рго РЬе Пе МеГ Ьеи Ьуз 145 150 155 160
Зег Οίη Зег Азп О1п О1и Туг Туг Ьуз Ьеи Зег Пе Агд О1п СНи Азп 165 170 175
А1а О1п О1и Зег Уа1 Зет СНу Агд РЬе Азп Уа1 Туг О1у Пе Азп Зег 180 185 190
А1а ТЬг СНу Пе Уа1 ТЬг Уа1 Рго Азп Тгр 195 200 <210> 80 <211> 194 <212> РКТ
- 69 024121 <213> 5Ьем/апе11а ЬаМса <400> 80
Ме! Азп Шз Туг Ьеи Азр Пе ТНг Ьеи Ьеи Рго Азп СНи О1и Уа1 СНу 15 10 15
ΗΪ5 Туг РЬе Ьеи Тгр СНи Ьуз Ьеи Тут Шз О1п Уа1 Шз Ьеи А1а Ьеи 20 25 30
Уа1 С1и Шз Ьуз Азп Агд Уа1 01у О1п РЬе СНи Пе А1а А1а А1а РЬе 35 40 45
Рго СИп РЬе Азп О1и Ме! Азр Азп Зег Ьеи СНу Зег Ьуз Ьеи Атд Ьеи 50 55 60
Ьеи А1а ТЬг О1п Рго ΟΙη Шз Ьеи О1и Азр Ьеи Ьуз Уа1 Зег Азп Тгр 65 70 75 80
Ьеи Агд Шз РЬе ТЬг Азр Туг Ьеи Шз Не Зег Зег Пе Агд Рго Уа1 85 90 95
Рго СНи Ьуз Пе О1и Уа1 Туг Уа1 А1а Туг Зег Агд Рго А1а Пе Агд 100 105 НО
А1а Азп Ьуз А1а Агд О1и Пе А1а Агд Агд Ме( Ьуз Агд Шз Азп О1и 115 120 125
ТЬг Ьеи О1и О1п А1а ТЬг А1а Шз РЬе О1и 01у РЬе Ьуз Рго Ьуз Ьуз 130 135 140
ТЬг Ьуз А1а Рго РЬе Уа1 Туг Ме! О1п Зег Туг ТЬг Ьуз Азр Зег Агд 145 150 155 160
РЬе Рго Ьеи РЬе Не О1п О1п ТЬг Шз Зег А1а Уа1 Уа1 Ьуз С1и 01у 165 170 175
Зег Уа1 Зег РЬе Азр Зег Туг О1у Ьеи Зег Зег Агд О1у Туг Ьеи Рго 180 185 190
Ьуз РЬе <210> 81 <211> 194 <212> РКТ <213> ЗЬеадпеПа ЬаЫса <400> 81
Ме! Азп Шз Туг Ьеи Азр Пе ТНг Ьеи Ьеи Рго Азп О1и О1и Уа1 О1у 15 10 15
Шз Туг РЬе Ьеи Тгр О1и Ьуз Ьеи Туг Н5з О1п Ме! Шз Ьеи А1а Ьеи 20 25 30
Уа1 О1и Шз Ьуз Азп Агд Уа1 О1у О1п РЬе О1и Пе А1а А1а А1а РЬе 35 40 45
Рго С1п РЬе Азп О1и Ме! Азр Азп Азп Ьеи СНу Зег Ьуз Ьеи Агд Ьеи 50 55 60
- 70 024121
Ьеи А1а ТЬг ΟΙη Рго ΟΙη ΗΪ5 Ьеи О1и Азр Ьеи Ьуз Уа1 Зег Азп Тгр 65 70 75 80
Ьеи Агд Шз РЬе ТЬг Азр Туг Ьеи Шз Не Зег Зег Пе Агд Рго Уа1 85 90 95
Рго Азр Ьуз Пе С1и Уа1 Туг Уа1 А!а Туг Зег Агд Рго А1а Пе Агд 100 105 110
А1а Азп Ьуз А1а Агд О1и Не А1а Агд Агд Ме1 Ьуэ Агд Шз Азп О1и 115 120 125
ТЬг Ьеи Уа1 О1п А1а ТЬг А1а Шз РЬе О1и О1у РЬе Ьуз Рго Ьуз Ьуз 130 135 140
ТЬг Ьуз А1а Рго РЬе Уа! Туг Ме! Οίη Зег Туг ТЬг Ьуз Азр Зег Агд 145 150 155 160
РЬе Рго Ьеи РЬе Пе О1п О1п ТКг Шз Зег А1а Уа1 Уа1 Ьуз О1и О1у 165 170 175
Азп Уа1 Зег РЬе Азр Зег Туг О1у Ьеи Зег Зег Агд О1у Туг Ьеи Рго 180 185 190
Ьуз РЬе <210> 82 <211> 204 <212> РКТ <213> АсгпеюЬасГег ЬаитаппП <400> 82
Ме! Ме! Азп Тгр Туг С1п О1и Не ТЬг Ьеи Пе Азр О1п Азр О1и Пе 15 10 15
Зег Ьеи Туг РЬе Пе Тгр Зег Ьуз Уа1 Туг ТЬг О1п Ьеи Шз Пе А1а 20 25 30
РЬе А1а О1и Н1з Зег Азп О1и О1п О1у Агд Пе Зег РЬе О1у Уа1 Зег 35 40 45
РЬе Рго О1п Туг Агд Пе Азп О1и С1п Ьуз Ьуз Пе О1у РЬе Ьеи О1у 50 55 60
ТЬг Ьуз Пе Агд Уа1 РЬе А1а Зег Зег О1и Азп Азр Ьеи О1п С1п Ьеи 65 70 75 80
Азп Ьеи О1у Ьуз Тгр Ьеи О1и Агд РЬе Пе Азр Туг Уа1 Шз Пе ТЬг 85 90 95
О1п Рго Агд О1и Уа1 Рго Агд А1а Ьуз Не ТЬг О1у Туг А1а Шз Туг 100 105 110
Туг Агд Уа1 Азп Н1з Агд МеГ Зег Уа1 О1и О1и Агд Пе Уа! Шз О!п 115 120 125
А1а О1п Агд Агд Азп Не Зег Ьеи Акр О1п А1а Агд О1п Шз РЬе Ьуз 130 135 140
- 71 024121
01ц Туг Уа1 01и 01η Рго Уа1 Уа1 01и Рго Туг Уа1 Зег Ьеи Ьуз Зег 145 150 155 160
Ьеи Зег А1а Ьуз Агд 01и 01и Азп Уа1 Азр Агд Рго Туг Агд Ьеи Туг 165 170 175
Не О1у Ьуз Зег Ьеи Уа1 Азр О1и А1а Агд Азр С1у Ме( РЬе О1у ТЬг 180 185 190
Туг О1у Ьеи Зег Агд Ме( ТЬг ТЬг Уа1 Рго О1и РЬе 195 200 <210> 83 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 83 диисаиддсд дсаиасдсса иииадааа 28 <210> 84 <211> 203 <212> РКТ <213> Ас1пе1оЬас1ег ЬаитаппП <400> 84
Ме( Азп Тгр Туг О1п СПи Пе ТЬг Ьеи Пе Азр О1п Азр СПи Пе Зег 15 10 15
Ьеи Туг РЬе Пе Тгр Зег Ьуз Уа1 Туг ТЬг О1п Ьеи ΗΪ3 Не А1а РНе 20 25 30
А1а О1и Шз Зег Азп О1и О1п О1у Агд Пе Зег РЬе О1у Уа1 Зег РЬе 35 40 45
Рго О1п Туг Агд Пе Азп О1и О1п Ьуз Ьуз Пе О1у РЬе Ьеи О1у ТЬг 50 55 60
Ьуз Пе Агд Уа1 РЬе А1а Зег Зег О1и Азп Азр Ьеи С1п О1п Ьеи Азп 65 70 75 80
ЬеиО1у Ьуз Тгр Ьеи О1и Агд РЬе Не Азр Туг Уа1 Шз Пе ТЬг О1п 85 90 95
Рго Агд О1и Уа1 Рго Агд А1а Ьуз Пе ТЬг О1у Туг А1а Шз Туг Туг 100 105 110
Агд Уа1 Азп Шз Агд Ме1 Зег Уа1 О1и О1и Агд Пе Уа1 Ηί5 О1п А1а 115 120 125
О1п Агд Агд Азп Не Зег Ьеи Азр О1п А1а Агд О1п Шз РЬе Ьуз О1п 130 135 140
Туг Уа1 О1и О1п Рго Уа1 Уа1 О1и Рго Туг Уа! Зег Ьеи Ьуз Зег Ьеи 145 150 155 160
Зег А1а Ьуз Агд О1и О1и Азп Уа1 Азр Агд Рго Туг Агд Ьеи Туг Пе
- 72 024121
165 170 175
О1у Ьуз Зег Ьеи Уа1 Азр О1и А1а Агд Азр СПу Ме1 РЬе С1у ТЬг Туг 180 185 190
О1у Ьеи Зег Агд МеГ ТЬг ТЬг Уа1 Рго О1и РЬе 195 200 <210> 85 <211> 186 <212> РКТ <213> РазГеигеПа тикосИа <'400> 85
МеГ ТЬг ТЬг Шз Туг Пе СЛи Ьеи Ьуз А1а Пе Рго ΟΙη МеГ Азр МеГ 15 10 15
Ьеи ΟΙη Зег СЛи Уа1 Пе О1у Шз Суз Мег ΟΙη Пе Ьеи Шз ΟΙη РЬе 20 25 30
Ьеи Рго Шз РЬе О1и О1у Агд Уа1 С1у Уа1 А1а РЬе Рго А1а Туг О1у 35 40 45
Ьеи СПу Агд ТЬг Ьеи О1у О1у Пе Уа1 Агд Ьеи РЬе А1а Азп О1п О1и 50 55 60
Азр Суз Азп О1п Ьеи Шз О1п О1п Ьеи Ьеи Агд Зег О1у Ьеи Зег Азр 65 70 75 80
Туг А1а Ьеи Пе Зег О1и Уа1 Зег Ьуз ТЬг Рго Ьеи Рго ТЬг О1и Н1з 85 90 95
Агд Зег Туг Зег Агд Уа1 Нгз Агд Ьуз СПу О1п Зег А1а Пе Агд Агд 100 105 110
ТЬг О1и Ьуз Агд Ьеи Ьуз Зег О1п О1у Агд Тгр Азр О1и Зег Пе Агд 115 120 125
А1а Азр МеГ О1п О1п Агд О1п О1п Азп Уа1 А1а РЬе РЬе Рго Шз Суз 130 135 140
Шз Ьеи Ьуз Зег А1а Зег ТЬг О1у О1п Агд РЬе Пе Ьеи А1а Уа1 Ьуз 145 150 155 160
О1и Азп Агд МеГ Рго О1п Зег Суз Уа101у Уа1 РЬе Азп А1а Туг О1у 165 170 175
Ьеи Зег Азп Зег А1а ТКг Уа! Рго Н1з РЬе 180 185 <210> 86 <211> 28 <212^ ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 86 диисассаис дидиадаидд сииадааа 28
- 73 024121 <210> 87 <2П> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 87 дииаасидсс диаиаддсад сииадааа 28 <210> 88 <211> 187 <212> РКТ <213> АддгедаИЬасГег аеПпотусеГетсопиГапз <400> 88
Ме! ТЬг Уа1 О1п ТЬг ΗΪ3 Туг Не СЛи Пе Ьуз А1а Пе Рго О1п Уа1 15 10 15
Азр Мег Ьеи О1п ТНг С1и Уа1 Ие С1у РНе Суз Ьеи О1п Ьуз Ьеи Шз 20 25 30
О1п Ие Ьеи Рго Шз РНе СНи СНу Агд Пе О1у Ьеи А1а РНе Рго А1а 35 40 45
Туг <Лу Аяи Азр Ьуз ТНг Ьеи С1у СЛу Пе Пе Агд Ьеи РНе СЛу ТЬг 50 55 60
О1и Азп Азр Суз СНу РНе Ие Шз РНе Ьуз Ьеи СНп Зег Ьеи Агд Азр 65 70 75 80
Туг А1а Ьеи Пе Зег С1и Уа1 МеГ Рго Пе Рго СНи Ьуз Уа) Агд Зег 85 90 95
Туг Агд Пе Туг СЛп Агд Пе СЛп Рго Ьуз (Лу О1п Зег Зег Пе Агд 100 105 ПО
Агд А1а С1и Ьуз Агд Ьеи ТЬг А1а СЛп О1у Ьуз Тгр Азп О1и СЛи Уа1 115 120 125
Ьеи СНп Азп МеГ Ьеи О1п Ьуз СНп А1а ТЬг О1п Агд Пе Туг Рго Шз 130 135 140
А1а Шз Ьеи Ьуз Зег Зег Зег ТЬг Ьуз О1п (Ли РЬе Пе Ьеи А1а Ие 145 150 155 160
Ьуз Зег Уа! Шз (Лп ТЬг Ьуз А1а Уа1 (Ли О1у Уа1 РЬе Зег А1а Туг 165 170 175 (Лу Ьеи Зег СЛп ТЬг ТЬг ТЬг Уа) Рго Шз РЬе 180 185 <210> 89 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность
- 74 024121 <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400 89 сиисасидсс §ааиа»»сае сииадааа 28 <210 90 <211> 199 <212> РКТ <213> Маппотопаз зр. ΜΆΎΜ <400 90
Ме! Ьуз Шз Туг Пе Азр Пе ТЬг Ьеи Ьеи Рго Зег Азр Азр Пе С1у 15 10 15
Уа1 Шз РЬе Ьеи Тгр Зег Ьуз Ьеи Ме! Ме! ΟΙη Уа1 Шз Ьеи А1а Ьеи 20 25 30
Уа! 01и Пе 01п Азп 0!и 01п Ьуз О1п Уа! Рго Уа! А1а Уа1 Зег РЬе 35 40 45
Рго Ьуз Туг 01п Рго Аг§ 01и Азп 01и Ьуз Ьеи 01у РЬе Уа! 01у Азп 50 55 60
Ьуз Ьеи Аг§ Ьеи РЬе А1а Азп Азр Ьуз ТЬг Азр Ьеи 01и Аг» Ьеи Азп 65 70 75 80
РЬе О1у Ьуз Тгр Ьеи ЬПз Аг« Ьеи О1и Азр Туг Уа1 ΗΪ5 Не Ьуз Зег 85 90 95
Пе А1а Азр Уа1 Рго Азп Азр Уа! Пе Зег Туг О1и Зег РЬе Азп Аг»
100 105 ПО
Агц Зег Ьуз Зег О1у Зег Рго Азр Ьуз ΗΪ3 Не Ьуз Агц Аг» Ме! О1п 115 120 125
Аг£ Н1з Азп О1и ТЬг Тгр О1и С1п А1а А1а А1а РЬе РЬе Ьуз О1у Туг ПО П5 140
Зег Ме! 01и Ьуз А1а Азр Ьуз Азр Ьеи Рго РЬе Не Аг£ Ме! Ьуз Зег 145 150 155 160
Ьеи Шз Зег Азр Азп О1и РЬе Суз Ме! Зег Пе Пе Ап; Ьуз О1и А1а 165 170 175
А1а Рго Зег Азп Ьуз Шз Пе Ме! РЬе Азп ТЬг Туг О1у Ьеи Зег А1а 180 185 190
О1и С1у Уа1 Ьеи Рго Ьуз РЬе 195 <210> 91 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
- 75 024121 <400> 91 диисдссдсс дадсасдсдд сииадааа 28 <210> 92 <211> 190 <212> РКТ <213> О|аНз1ег Ьшзиз <400> 92
Ме( О1и Туг Туг О1п О1и Пе ТЬг Ьеи Ьеи Рго Суз А1а О1и Уа1 Зег 15 10 15
Ьеи А1а РЬе Ьеи Тгр ТЬг Ьуз Уа1 РЬе ТЬг С1п Ьеи Шз Пе А1а РЬе 20 25 30
А1а Азр О1и Ьуз Азп Ьуз Зег С1у ΗΪ5 Азп Ьеи Туг А1а Уа1 Зег РЬе 35 40 45
Рго С1и Туг Агд С1и ТЬг <31у Ьеи О1у С1и Ьу5 Пе Агд Уа1 РЬе А1а 50 55 60
О1и А1а О1п О1и Ьеи О1и Агд Ьеи Азп Ьеи Зег Ьуз Уа1 Ьеи О1у Агд 65 70 75 80
Ьеи Ьеи Азр Туг Уа! Шз Суз ТЬг Зег Не Агд Ьуз Уа1 Рго С1и Агд 85 90 95
Ьуз Ьеи Агд О1у Туг А1а Уа1 Туг Зег Агд Туг О1п Рго О1и О1у Зег 100 105 ПО
Пе Тгр Уа1 Ьуз А1а Агд Агд Туг А1а Ьуз Агд Шз Рго С1у Уа1 ТЬг 115 120 125
Пе О1и О!и А1а А1а Агд Ьеи Ьеи С1п С1у Ьуз Агд Ьуз Зег Уа1 Агд 130 135 140
Ьеи Рго Туг Пе С1п Ме1 Ьуз Зег Ьеи Зег Агд О1у С1у ТЬг РЬе Зег 145 150 155 160
Ьеи РЬе Пе Ьуз Ьуз Агд Уа) О1и Ьуз О1и Зег А1а Ьеи ТЬг О1и Суз 165 170 175
О1у ТЬг Туг О1у Ьеи Зег Азп Азп Агд ТЬг Уа1 Рго О1и РЬе 180 185 190 <210> 93 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 93 дииаасидсс дсаиаддиад иииадааа 28 <210 94 <211> 28 <212> ΚΝΑ
- 76 024121 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 94 дииаисидсс диаиаддсад сииадааа 28 <210> 95 <211> 189 <212> РКТ <213> АсПпоЬасШиз р1еигорпеитогиае <400> 95
Ме!Зег О1и Ьеи ТЬг Шз Туг Пе С1и Ьеи Ьуз А1а Пе Рго С1п Уа1 15 10 15
Азр Ие Ьеи С1п ТКг Азр Уа1 Пе А1а Шз С1у Ьеи О1п Пе Ьеи Шз 20 25 30
Ьуз РКе Ьеи Рго Ьеи Туг О1п О1у О1и Пе О1у Ьеи Зег РКе Рго А1а 35 40 45
Туг С1у Ьеи СНу Агд ТКг Ьеи СНу СНу Не Пе Агд Уа1 РКе СНу Азп 50 55 60
СНи О1п Шз Суз ТКг Οίη Не Ьуз ТКг О1п Ьеи Пе О1у СНи О1у Ьеи 65 70 75 80
О1п Азр Туг Уа1 Ьеи Не ТКг Зег Уа1 ТКг Рго Уа1 Рго О1и О1и Не 85 90 95
Уа101и Туг Шз Агд Туг О1п Агд Уа1 Шз Агд Ьуз О1у Οίη Зег А1а 100 105 110
Пе Агд Агд ТКг О1и О1п РКе Ьеи Уа101п О1п О1у Ьуз Тгр ТКг О1и 115 120 125
О1и Пе Агд О1п О1и Ме! Ьеи Пе Шз С1п О1п Азп О1п Ьуз Уа1 РКе 130 135 140
Рго Туг Уа] Ьуз Ьеи Ьуз Зег О|у Зег ТЬг Ьуз О1п Шз РЬе Уа1 Ьеи 145 150 155 160
А1а Пе Агд О1п Ьеи Агд Ьеи А1а О1и Рго А1а Зег О1у Ьеи РКе Азп 165 170 175
А1а Туг О1у Ьеи Зег О1п А1а А1а ТЬг Уа1 Рго Шз РКе 180 185 <210> 96 <211> 28 <212> ΚΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400 96
- 77 024121 сиисаси£сс виаиа£§са§ сииа^ааа 28 <210> 97 <2П> 189 <212> РКТ <213> АсНпоЬасШиз р1еигорпеитошае <400> 97
Ме1 Зег С1и Ьеи ТЬг Шз Туг Ие О1и Ьеи Ьуз А1а Пе Рго О1п Уа1 15 10 15
Аэр Пе Ьеи ΟΙη ТЬг Азр Уа1 Пе А1а Шз О1у Ьеи О1п Пе Ьеи Шз 20 25 30
Ьуз РЬе Ьеи Рго Ьеи Туг С1п О1у О1и Пе О1у Ьеи Зег РЬе Рго А1а 35 40 45
Туг О1у Ьеи О1у Аг§ ТЬг Ьеи О1у О1у Пе Не Аг§ Уа1 РЬе О1у Азп 50 55 60 <31и С1п Шз Суз ТЬг О1п Пе Ьуз ТЬг О1п Ьеи Пе О1у О1и О1у Ьеи 65 70 75 80
О1п Азр Туг Уа1 Ьеи Не ТЬг Зег Уа1 ТНг Рго Уа1 Рго О1и О1и Пе 85 90 95
Уа1 СПи Туг Шз Аг& Туг О1п Лг§ Уа1 Н)5 Аго Ьуз СПу О1п Зег А1а 100 105 ПО
Пе Аг§ Агц ТНг О1и О1п РНе Ьеи Уа1 ΟΙη О1п СПу Ьуз Тгр ТНг СПи 115 120 125
СПи Пе Аг§ О1п СПи Ме( Ьеи Пе Шз ΟΙη Οίη Азп ΟΙη Ьуз Уа1 РНе 130 135 140
Рго Туг Уа1 Ьуз Ьеи Ьуз Зег О1у Зег ТНг Ьуз О1п Шз РНе Уа1 Ьеи 145 150 155 160
А1а Пе Аг£ О1п Ьеи Лг§ Ьеи А1а О1и Рго Уа1 Зег О1у Ьеи РНе Азп 165 170 175
А1а Туг 01у Ьеи Зег Ьуз Пе А1а ТНг Уа1 Рго Шз РНе 180 185 <210> 98 <211> 189 <212> РКТ <213> АсНпоЬасШиз р1еигорпеитошае <400> 98
Ме1 Зег О1и Ьеи ТЬг Шз Туг Пе О1и Ьеи Ьуз А1а Пе Рго О1п Уа1 15 10 15
Азр Пе Ьеи О1п ТНг Азр Уа1 Пе А1а Шз О1у Ьеи О1п Пе Ьеи Шз 20 25 30
Ьуз РНе Ьеи Рго Ьеи Туг О1п О1у О1и Пе О1у Ьеи Зег РЬе Рго А1а 35 40 45
- 78 024121
Туг 01у Ьеи 01у Агд ТЬг Ьеи 01у С1у Пе Пе Агд Уа1 РНе 01у Азп 50 55 60
О1и ΟΙη ΗΪ3 Суз ТЬг О1п Пе Ьуз ТЬг О1п Ьеи Пе О1у О1и 01у Ьеи 65 70 75 80
О1п Азр Туг Уа1 Ьеи Пе ТЬг 5ег Уа1 ТЬг Рго Уа1 Рго О1и О1и Не 85 90 95
Уа1 О1и Туг Шз Агд Туг О1п Агд Уа1 Шз Агд Ьуз О1у О1п Зег А1а 100 105 110
Пе Агд Агд ТЬг О1и О1п РЬе Ьеи Уа101п С1п 01у Ьуз Тгр ТЬг О1и 115 120 125
О1и Пе Агд С1п О1и Ме( Ьеи Пе Шз Οίη ΟΙη Азп С1п Ьуз Уа1 РЬе 130 135 140
Рго Шз Уа1 Ьуз Ьеи Ьуз Зег О1у Зег ТЬг Ьуз О1п Шз РЬе Уа1 Ьеи 145 150 155 160
А1а Не Агд О1п Ьеи Агд Ьеи А1а О1и Рго Зег РЬе О1у Ьеи РЬе Азп 165 170 175
ТЬг Туг О1у Ьеи Зег Ьуз Пе А1а ТЬг Уа1 Рго Шз РЬе 180 185 <210> 99 <211> 189 <212> РКТ <213> АсйпоЬасШиз р1еигорпеитоп1ае <400> 99
Ме1 Зег О1и Ьеи ТЬг Шз Туг Пе О1и Ьеи Ьуз А1а Пе Рго О1п Уа1 15 10 15
Азр Не Ьеи О1п ТЬг Азр Уа1 Пе А1а Шз 01у Ьеи О1п Пе Ьеи Шз 20 25 30
Ьуз РЬе Ьеи Рго Ьеи Туг О1п О1у О1и Пе О1у Ьеи Зег РЬе Рго А1а 35 40 45
Туг О1у Ьеи О1у Агд ТЬг Ьеи 01у С1у Не Пе Агд Уа1 Ьеи С1у Азп 50 55 60
О1и О1п Шз Суз ТЬг О1п Не Ьуз ТЬг О1п Ьеи Пе О1у О1и 01у Ьеи 65 70 75 80
О1п Азр Туг Уа1 Ьеи Пе ТЬг Зег Уа1 ТЬг Рго Уа1 Рго О1и О1и Пе 85 90 95
Уа101и Туг Н1з Агд Туг О1п Агд Уа1 Шз Агд Ьуз О1у О1п Зег А1а 100 105 ПО
Пе Агд Агд ТЬг О1и О1п РЬе Ьеи Уа1 Οίη ΟΙη О!у Ьуз Тгр ТЬг О1и 115 120 125
О1и Пе Агд О1п О1и Ме( Ьеи Пе Шз О!п О1п Азп О1п Ьуз Уа1 РЬе 130 135 140
- 79 024121
Рго Ηίδ Уа1 Ьуз Ьеи Ьуз Зег О1у Зег ТЬг Ьуз Οίη Шз РЬе Уа1 Ьеи 145 150 155 160
А1а Пе Агд ΟΙη Ьеи Агд Ьеи А1а О1и Рго Зег РЬе О1у Ьеи РЬе Азп 165 170 175
ТЬг Туг О!у Ьеи Зег Ьуз Не А1а ТЬг Уа1 Рго ΗΪ3 РЬе 180 185 <210> 100 <211> 201 <212> РКТ <213> 31гер1ососсиз ГЬегторЬПиз <400> 100
Ме1 Зег Ьуз ТЬг Ме1 Пе Пе О1у Ьеи ТЬг О1у О1у Не А1а Зег О1у 15 10 15
Ьуз Зег ТЬг Уа1 Уа1 О1и Пе Пе Ьуз Азр А1а О1у Туг Ьуз Уа! Пе 20 25 30
Азр А1а Азр О1п Ьеи Уа1 Шз Азр Ме101п Уа1 Ьуз О1у О1у Агд Ьеи 35 40 45
Туг О1п А1а Ьеи Ьеи Азр Тгр Ьеи О1у Азр О1у Пе Ьеи Ьеи Рго Азп 50 55 60
О1у О1и Ьеи Азп Агд Рго Ьуз Ьеи О1у О1п Ьеи Пе РЬе Зег Зег О1и 65 70 75 80
О1и Ме1 Агд Туг О1п Зег А1а О1и Пе О1п О1у Ьуз Пе Пе Агд О1и 85 90 95
О1и Ьеи А1а А1а Ьуз Агд Азр Суз Ьеи А1а Ьуз О1и О1и Азр Уа1 РЬе 100 105 110
РЬе Ме( Азр Ие Рго Ьеи Ьеи РЬе О1и Азп Азр Туг О1п Азр Тгр РЬе 115 120 125
Азр О1п Ие Тгр Ьеи Уа1 А1а Уа1 Зег Рго О1п Уа1О1п О1у Οίη Агд 130 135 140
Ьеи Ме1 Ьуз Агд Азп Шз Ьеи Зег А1а О1и О1и А1а О1у Ме1 Агд Не 145 150 155 160
А1а Зег С1п Мег Рго Ьеи А1а О1и Ьуз Ьеи Рго Туг А1а Зег Ьеи Уа1 165 170 175
Не Азр Азп Азп О1у Азп Пе Азр Азр Ьеи Ьуз Ьуз Ьуз Уа1 Ьуз О1у 180 185 190
А1а Пе Ьуз Азр Ьеи А1а Азп Ьеи Уа!
195 200 <210> 101 <211> 187 <212> РКТ <213> Рзеиботопаз аегидтоза <400> 101
- 80 024121
Ме1 Азр Ηί3 Туг Ьеи Азр Не Агу Ьеи Агу Рго Азр Рго О1и РЬе Рго 15 10 15
Рго А1а О1п Ьеи Ме! 5ег Уа1 Ьеи РЬе О1у Ьуз Ьеи А1а <31п А1а Ьеи 20 25 30
Уа1 А1а С1п С1у О1у Азр Агу Пе С1у Уа1 Зег РЬе Рго Азр Ьеи Азр 35 40 45
С1и Зег Агу Зег Агу Ьеи С1у О1и Агу Ьеи Агу Пе Ηί5 А1а Зег А1а 50 55 60
Азр Азр Ьеи Агу А1а Ьеи Ьеи А1а Агу Рго Тгр Ьеи О1и О1у Ьеи Агу 65 70 75 80
Азр (Из Ьеи О1п РЬе СНу О1и Рго А1а Уа1 Уа1 Рго ΗΪ5 Рго ТЬг Рго 85 90 95
Туг Агу СНп Уа1 Зег Агу Уа1 СНп Уа1 Ьуз Зег Азп Рго О1и Агу Ьеи 100 105 НО
Агу Агу Агу Ьеи Ме1 Агу Агу Шз Азр Ьеи Зег С1и С1и О1и А1а Агу 115 120 125
Ьуз Агу Пе Рго Азр ТЬг Уа1 А1а Агу А1а Ьеи Азр Ьеи Рго РЬе Уа1 130 135 140
ТЬг Ьеи Агу Зег С1п Зег ТЬг С1у О1п Шз РЬе Агу Ьеи РЬе Пе Агу 145 150 155 160
Шз О1у Рго Ьеи О1п А1а ТЬг А1а СНи СНи С1у С1у РЬе ТЬг Суз Туг 165 170 175
СНу Ьеи Зег Ьуз СНу С1у РЬе Уа1 Рго Тгр РЬе 180 185 <210> 102 <211> 187 <212> РКТ <213> РзеиНошопаз аегиутоза <400> 102
Ме( Азр Шз Туг Ьеи Азр Пе Агу Ьеи Агу Рго Азр Рго СНи РЬе Рго 15 10 15
Рго А1а О1п Ьеи Ме( Зег Уа! Ьеи РЬе О1у Ьуз Ьеи А1а СНп А1а Ьеи 20 25 30
Уа1 А1а О1п СНу СНу Азр Агу Пе СНу Уа1 Зег РЬе Рго Азр Ьеи Азр 35 40 45
СНи Суз Агу Зег Агу Ьеи СНу СНи Агу Ьеи Агу Пе Шз А1а Зег А1а 50 55 60
Азр Азр Ьеи Агу А1а Ьеи Ьеи А1а Агу Рго Тгр Ьеи О1и СНу Ьеи Агу 65 70 75 80
Азр Шз Ьеи СНп РЬе О1у О1и Рго А1а Уа1 Уа! Рго Шз Рго ТЬг Рго 85 90 95
- 81 024121
Туг Аге θΐη Уа1 8<т Аг§ Уа1 01п Уа1 Ьу5 Бег Азп Рго О1и Агд Ьеи 100 105 ПО
Агд Аг§ Аге 6°и Ме1 Аге Аге Шз Азр Ьеи Бег О1и О1и С1и А1а Аге 115 120 125
Ьуз Аге Не Рго Азр ТКг Уа1 А1а Аге А1а Ьеи Азр Ьеи Рго РКе Уа! ВО В5 140
ТКг Ьеи Аге бег С1п Бег ТКг С1у С1п Шз РКе Агд Ьеи РЬе Пе Агд 145 150 155 160
Шз О1у Рго Ьеи О1п А1а ТЬг А1а О1и О1и О1у О1у РКе ТЬг Суз Туг 165 170 175
О1у Ьеи Бег Ьуз С1у О1у РКе Уа1 Рго Тгр РКе 180 185 <210> 103 <211> 20 <2Ι2> ΕΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический олигонуклеотид <400> 103
ЕиисасиЕсе 2иаиа£Еса® 20

Claims (35)

1. Вариант Ску4 эндорибонуклеазы, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере около 95% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, изложенной на фиг. 6, при этом эндорибонуклеаза включает в себя аминокислотную замену в Н18-29, а вариант Ску4 эндорибонуклеазы является ферментативно неактивным в отсутствие имидазола и при этом вариант Ску4 эндорибонуклеазы является активируемым в присутствии имидазола.
2. Вариант Ску4 эндорибонуклеазы по п.1, отличающийся тем, что замена аминокислоты является заменой Н1б29 на А1а29.
3. Вариант Ску4 эндорибонуклеазы по п.1, отличающийся тем, что включает в себя функциональную группу, которая обеспечивает детектируемый сигнал.
4. Вариант Ску4 эндорибонуклеазы по п.1, отличающийся тем, что функциональная группа, которая обеспечивает детектируемый сигнал, является флуорофором, квантовой точкой, ферментом, другим, чем эндорибонуклеаза, или наночастицей.
5. Вариант Ску4 эндорибонуклеазы по п.1, отличающийся тем, что эндорибонуклеаза является иммобилизованной на нерастворимой подложке.
6. Вариант Ску4 эндорибонуклеазы по п.5, отличающийся тем, что нерастворимая подложка является шариком.
7. Вариант Ску4 эндорибонуклеазы по п.1, отличающийся тем, что связывает субстрат РНК, содержащий нуклеотидную последовательность 5'-СииСАСиССССиАиАСССАССИААСААА-3' (8ЕЦ ГО N0: 1).
8. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант Ску4 эндорибонуклеазы по п.1.
9. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую различные Ску4 эндорибонуклеазы по п.1.
10. Рекомбинантный вектор экспрессии по п.9, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая различные Ску4 эндорибонуклеазы, функционально связана с промотором.
11. Рекомбинантный вектор экспрессии по п.10, отличающийся тем, что промотор является индуцируемым промотором.
12. Ιη νίΐτο генетически модифицированная клетка-носитель, содержащая рекомбинантный вектор экспрессии по п.9.
13. Набор для очистки РНК-мишени, представленной в смешанной популяции нуклеиновых кислот, включающий вариант Ску4 эндорибонуклеазы по п.1.
14. Набор по п.13, отличающийся тем, что дополнительно содержит рекомбинантный вектор экспрессии, включающий в порядке от 5' к 3' и в функциональной связи:
а) нуклеотидную последовательность, кодирующую субстрат РНК, которая является специфически связанной посредством различных Ску4 эндорибонуклеаз по п.1;
- 82 024121
б) сайт множественного клонирования, подходящий для введения нуклеиновой кислоты, кодирующей РНК-мишень.
15. Набор по п.14, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая субстрат РНК, функционально связана с промотором.
16. Набор по п.15, отличающийся тем, что промотор является индуцируемым промотором.
17. Набор по п.14, отличающийся тем, что субстрат РНК содержит нуклеотидную последовательность 5'-СииСАСиССССиАиАСССАССиААСААА-3' (8ЕО ГО N0: 1).
18. Набор по п.14, отличающийся тем, что рекомбинантный вектор экспрессии включает в себя вставляемую в сайт множественного клонирования нуклеотидную последовательность, кодирующую РНК-мишень.
19. Набор по п.13, отличающийся тем, что дополнительно включает имидазол.
20. Набор по п.13, отличающийся тем, что дополнительно включает один или более буферов отмывки.
21. Набор по п.13, отличающийся тем, что дополнительно включает положительный контрольный вектор экспрессии.
22. Набор по п.13, отличающийся тем, что вариант С8у4 эндорибонуклеазы иммобилизован на нерастворимую подложку.
23. Способ выделения РНК-мишени, присутствующей в смешанной популяции нуклеиновых кислот, включающий в себя:
а) взаимодействие смешанной популяции нуклеиновых кислот с различными С8у4 эндорибонуклеазами по п.1, при этом различные С8у4 эндорибонуклеазы иммобилизованы на нерастворимой подложке, при этом смешанная популяция нуклеиновых кислот содержит меченую целевую РНК, содержащую распознаваемую нуклеотидную последовательность, которая специфически связана посредством иммобилизованных различных С8у4 эндорибонуклеаз, образуя комплекс меченая целевая РНК-иммобилизованный вариант С8у4 эндорибонуклеазы, при этом указанное взаимодействие осуществляется в связывающем растворе в отсутствие имидазола;
б) добавление имидазола в связывающий раствор до конечной концентрации от примерно 100 до около 500 мМ, тем самым формируя реактивационный раствор, который ферментативно реактивирует иммобилизованный вариант С8у4 эндорибонуклеазы, при этом реактивированный иммобилизованный вариант С8у4 эндорибонуклеазы расщепляет РНК-мишень по метке; и
в) сбор выделенной РНК-мишени.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что дополнительно включает стадию отмывки, которую проводят после стадии (а) и до стадии (б).
25. Способ выделения полипептида, связывающегося с РНК-мишенью, включающий:
а) взаимодействие иммобилизованного комплекса с жидким раствором, содержащим полипептид, который связывается с РНК-мишенью, в котором иммобилизованный комплекс включает в себя вариант С8у4 эндорибонуклеазы и меченую РНК-мишень, содержащую распознаваемую нуклеотидную последовательность, которая является специфически связанной посредством различных С8у4 эндорибонуклеаз, в котором указанное взаимодействие приводит к связыванию полипептида с РНК-мишенью, в котором указанное взаимодействие осуществляется в связывающем растворе в отсутствие имидазола; и
б) элюирование связанного полипептида.
26. Способ регулирования производства РНК-мишени в эукариотической клетке, включающий взаимодействие генетически модифицированной клетки-носителя с агентом, который активирует индуцируемый промотор, в котором генетически модифицированная клетка-носитель имеет генетически модифицированный рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую ферментативно активную сайт-специфическую С8у4 эндорибонуклеазу, которая катализирует расщепление в сайт-специфическом центре расщепления в субстрате полирибонуклеотида, при этом фермент-кодирование нуклеотидной последовательности функционально связано с индуцируемым промотором, в котором при активации индуцируемого промотора фермент вырабатывается в клетке и отщепляет указанную РНК-мишень от предшественника РНК.
27. Способ по п.26, отличающийся тем, что дополнительно включает разновидность РНК-мишени, являющейся регуляторной РНК.
28. Способ по п.26, отличающийся тем, что включает отщепление указанной РНК-мишени от предшественника РНК и инактивирует предшественника РНК.
29. Способ обнаружения специфической последовательности в целевом полирибонуклеотиде, включающий:
а) взаимодействие целевого полирибонуклеотида с олигонуклеотидным зондом, содержащим специфическую последовательность, и ферментативно активной сайт-специфической С8у4 эндорибонуклеазой при условиях, которые способствуют формированию дуплекса между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом, в котором дуплекс расщепляется С8у4 эндорибонуклеазой; и
б) детектирование специфического связывания между олигонуклеотидным зондом и целевым полирибонуклеотидом, в котором детектирование образования дуплекса между олигонуклеотидным зондом и
- 83 024121 целевым полирибонуклеотидом указывает на наличие определенной последовательности в целевом полирибонуклеотиде.
30. Способ по п.29, отличающийся тем, что олигонуклеотидный зонд связан с пептидом, в котором пептид высвобождается при расщеплении дуплекса Сзу4 эндорибонуклеазой, и где этап детектирования включает в себя выявление выделения пептида.
31. Способ по п.29, отличающийся тем, что выделение пептида обнаруживается путем связывания с антителом, специфичным для пептида.
32. Способ по п.31, отличающийся тем, что антитело иммобилизовано.
33. Способ по п.29, отличающийся тем, что целевой полирибонуклеотид иммобилизован на твердой подложке.
34. Способ по п.29, отличающийся тем, что целевой полирибонуклеотид является полирибонуклеотидом патогена.
35. Способ по п.29 отличающийся тем, что ферментативно активная Сзу4 эндорибонуклеаза содержит последовательность аминокислот Сзу4 аминокислотной последовательности, изображенной на фиг. 5.
- 84 024121
Фиг. 2А
Фиг. 2В
- 85 024121
Фиг. 4
- 86 024121
Последовательность С«у4 >д! 11 Ϊ6ί?5ι3369] ге£ | ΥΡ 790814.11 ЪуросЬес1са1 ргогехп РА14 ЗЗЗОС· [Рзеиботопаз аегидтоеа 8СВГР-РА14} МЗуЪГСКЕКОАЬ7А006ПК1д75РРСЬОЕ5Р5КЬСЕВЪВ1НА2АОСЬК.АЫ-АР.РИЬЕеЬЕСНЬС)РСЕРА^7РНРТР‘1РдаВУ(?АК5НРЕКЬЕЕКЬМКНН ОЬ5ЕЕЕАйКР1РОТ7АКАЬОЬРР7ТЬР5С5ТСОНгеЬГ1ННеРЬ(Эчг?АЕЕ5СРТСУСЬ5КССР7РК? (5£ζ) Ю N0:5)
Последовательность распознавания РНК ал-сАсиестчАикес&симсллл овд ю υο:ΐι
Фиг. 5А
Последовательность С$у4 >αι1107Г01Й71 ίгеГι ΖΡ 01365785.1| Ьуро1йеТ1са1 ргосехп РаегРА 01002916 (Рзеибошопаз аегидшоза ЕАС52] М0Н¥ЬШР.ЕЕРОРЕГРРАСЬИ5уГ,ГеК5НСАЬ7АОССРРЛС73ГРОЪОЕ5РЕР.ЕСЕРий1ЯА5АОРЬРАРЬАКРШ;СЬКОН1£РСЕРА77РНРТР¥ЕОУЗР7(Ж5М РЕРЬРР.КЬМРВНОЬ5ЕЕЕАМ<Р1 РОТ7А^А1ГОЬРР7ТЬР.503ТССЯРЯГГ1 РВСРЬ0УТАЕЕ5СРТС¥СЬ5КССР.’РКТ (ЗЕО Т? N0:6)
Последовательность распознавания РНК
СиЦСАСиССССи’ЗиАСССАССиААСААА (ЗЕО ТО ПОН)
ЗиоСАСиССССиАиАСССАССиААСААА (зео ιονο:ι>
Фиг. 5В .>•31; χθ4235455 ι ге£I ΖΡ 04928756.1 ί ΗγροίΗβίίνδΙ рго^ет РАСС 01340 [Рзеэйотопаз аегидтоБа С3719] МОНУЬ01гиРРОРЕгРРАЗЕга£УЪГ'СКЗНОАЕУАОССОР.1С78ЕРОЬЕ'Е5Н5ЙЕеЕВ1К1НА5АООЬКАЬ ΕΑΕΡΓΛΈΕαΕλΡΗΕ0Γ0τΕ£ΑννΕΗΡΤΡΪ?ς)ν5Ρνζ·ΑΚ5[ΐΡΕΡ1ΚΡ.ΚίΜΚΕΚθΕ3ΕΕ£ΑΕΚΕΙΡί>?νΑΚΤίΠ Ь?тЪЕ505ТС0НтР1РЛСРЬ0АТАЕЕСЭГТСУСЬ5КС«СР/РКГ (ЗЕО ΙΡ М0:8>
Последовательность распознавания РНК
ЗСЬСАСиССССисиАЗССАССи.ААСААА (ЗЕ£ 10 N0:7)
С-О'иСАСиСССОиАОАОССАССиААСЛАА (ЗЕС ЮЖ):1>
Фиг. 5С :254240857 ΐ ΐ'*ί ί ΖΡ 04934179,1 [ НуроС Ο.βίιοί ргсЛеш РА2С 01531 (Ρ3ουόοτηοηά5 аегидтопа 2192} НСЕГ1ЕтР5Р.РОРЕГРРАОЬИ£л’ЬЕСК2КСАЪ7АОССОН1СУ2ЕРСЬОЕ5Р.5РЕС£кЬК1НА5АСОи1АЬ ЕЛНРи’ЬЕСЪ^НЬСГСЕАА1ЛТНРТР¥К07$К70АК2МРЕНЬЕКЕЬМИ?Я0Ь5ЕЕЕлККЕ’РОТ7АЕТЬи ЬРПТЪКЗОЗТССНГКЪРТРНСРКОАТАЕЕССГТСУСЬгКССРУРКГ (ЗЕО ТР N0:9)
Фиг. 5Ό
Последовательность распознавания РНК сиисАсиеСсеисидсссйзсиААСААА. оео ιονο:7) еиисяси<зссбОАиАббСА(5сиААеААА (зео ΐϋΝ0:ΐί
-><μ ί 2422381811 геГ(ΥΡ 002986362.11 СК13РК-аз5ОСД.аЬес1 ргоГехп, Сгу4 ГатИу [Сд-скеуа бабапГ-П ЕсЬ703] МС‘Н¥1Е1В7ЬРОЬЕК2А70Ы5АЕГАКЬНКАЬО2ВА.ТСА1ет5РРЭУОКТЬ5ЕКШЬНС5УС!Ек^АЪЕ0Т ΟνιΙΚΟΙΡ.ΟΥΤΑΙΤΕΡΕΡνΡΑΟΑΚΗΒΤ'ΤΚΚνζ^’ΤΚ^δΑΕΡΕΕΡΡΑνεΚΟΡΜΤΕΏΕΑΑΤΚΙΡΥΑνΕΚΡΟΟΕΡΥ ВР1Е5Е35С0ТРЬЬЕ7ЕНСРЬ0ВКР7АСАГ55УСЬ£АТТТТРКЕ (5Е0 10 N0:10)
Последовательность распознавания РНК сиисАсис^ссссиАсесйссииАСААА сзео ю νοπι)
СУиСАСиССССАСиАЦ0САССии/4бАА.4 (ЗЕО ТО N0:12)
Фиг. 5Е
Λοΐ | 2618228901 ге£| ΥΡ 003260596.И СЕ15РР-а$5ое1а£ес1 ргосехп, Сзу4 ГатИу (РесгоЬасгегхит мазаЬ1а* (а'РР163] МСК¥1С1РУОРПРЕГТхАРОЪГКАЪГАКЬНКАЬСС1А[ХЗК1СХ5РРЕУСКТЬСЕСЪЕЬНСТАОАЕЗТЬЕКТ δϊίΕΚΟίΗϋΙ'ΤΟνοΕΟΚΑνΡί^ίνΚΕΗΤνΡ,Ρ.νΟΙ^ΤδΑΕΡΧΕΚΚδνΝλΘίΙΤΕΑΕΑΑΑΒΙΡΟΑνΕΚΕΕΤΙΡΡ \’01Х51,ЗКС<аМРГ;Г7ЕНСРиЖРАТСКР55УСЬ5АЕАТ’/РКР (ЗЕО 1С N0:13)
Последовательность распознавания РНК сиисАсисСссилиАсссАссиилсАлл (ж> ιο νο:14ϊ
Фиг. 5Р >σιI253990195Iге£|ΥΡ 003041551.1! ЬуросЬеь1са1 ргоьехп РАН 02916 [РКоСогЬаМиз азупЫоСюа зиЬар. аэутЫоЫса АТСС 439Т9! МО'ТТГЕ11,УЬРЬ?ЕР5К051ЖаЬРАК1ЛГ!Аь607СНСК1С/8РРСАИ(ТЬСГЖЬК1ЙСА5ЕА1ЛОЦ)АЬ РКЁКСЕКСГТЕ1И010РУРС[)ТОТККгеКТО'/К53АЕКЕВКВ51КК№'ЬТЕЕОАКОР.1Р15КЕОКТНЬРГ
ЫЛТ\5155ЕГ)ТгР1.ГТЕ23Р1ЕС'КРТРСУГ55УСЬ5.65ЛТ1РКГ (5Е<Э 10 №0:151 Последовательность распознавания РНК сиссАсиеЗсс;иАСАСосАЭсиоАеА.ААА (зесз ю νο:16> сисСАСиССССиАСАСОСАССииАСААА (2Е0 ΙΕ N0:17) лсиосссссАСАоесАеиЩАСААА обо ю N0:18) бОССАСиСССССАСАСОСАОСООАСААА (ЗЕО 10 N0:19) оисиАсиссссиАСАебСАесииАбААА (зео ιο νο:20) еиссАсиессбиАСАСбСйзсииАСААА (зео μνο:2ι>
Фиг. 5С >ςι | 3071 32482 | ге£ | ΥΡ 003884498.1] ПуртЬес:1са1 ргссехп ОдаЗЭЗ? 03453 [ϋΐοΗβνβ дабаηШ 3937] МСК71Е1Р7ЬРОРЕЕ5С7О1ЪЗАЕГАКЕНЕА560РАТОА1СУ5ГРОАСКТЬСЕЕ11КЕНС5\’0ЕЕАА1Е0Т ‘ СЙЕР.СЬК0УТА1ТЕРЕР7РАС'/КНР.Т7ЕЕ707К55АЕКЬР^РА¥ПКСЕМТ70ЕА0АВ1Р¥ТУЕККТ5ЬР¥ 1РЬРЗЕ5МС0?ЕЬЬГ?ЕНСРЬ0ОКР7АСАЕ55У6ЬЗА7АТ1РКГ (ЗЕО ГО N0:22)
Последовательность распознавания РНК оиисАсисссоиои.АСосАссоиАСААА (зео ю но:23>
оиисАсисссс;лоиАзосАосииАбААА (зео ю монз»
Фиг. 5Н >дιI2850198131ге£IΥΡ 00337^524.1] СЕ13РЕ-355Ос1аС.еб огосехп, сзу4 СатПу 1ХапсЬотопаз а1Ы1теап5 СРЕ РС73] МОИУЬОЬНЬЕРСРЕЕАРУОЬГСАЬУАЯьНКЗ^ТЬНТТРЛСу'ЗГРСНОМКУРТЕбТНтНСОбЗТЬННЬ МАТТ(л'ЬЕСУЕОН7Т1Т510АУР5ЕАЛ’НКО\'ТРЛ’САК55РЕКЕР.КРАМР,КНб15ЕОЬА70Е1РО$ААЕ<2ЬР. ΕΡΓΥ.τ6$Ε5Τ00ΤΑΕΡνΓνΈΗ6Ρ·ν00ΕΡνΡΠ0Γ55Υ3Ε5Ε6ΑΤνΡ«Ε (5ЕО ΙΟ N0:24)
Последовательность распознавания РНК сиисАсцсСсоиоиАСос^осисАОА^А <зео ю нопз) иисАсиоссеисиАсссАссисАСААА (зез ιο νο:25) бииСАСиС-СССи!АиАббСА5С1!СА6ААА (ЗЕО Ю N0:27)
Фиг. 5Ι
- 87 024121 >ςμ 150122605 ι ! ΪΡ 051772.11 буюооЪёбХса! ргобеш ЕСА3634 (РесбоЬастепат аогозер11Сит 5СРЛ1043] №НПО1Р.75РОРЕГТА30ЕЕКАХЕАКЕНК71.С0ЕА1адК1315РРЕ7аКТ1,еЕСГ.К1,НСТЕ0А1.3иЕКТ 51\1,КС1РОУТО''.'ЗЕСК>'’'/РНО'2КЕЕТ'1,'КЕ’.'О5Кг5АЕКЬККЙ5УЗК0КЬТААЕАААЯ1 РОАуЕКРЗАЬРГ ’ОСЛКЗЬЗНСОМГЕ'АгУЕ.ЧСРЬЗНАРТАСРЕ'ггУСЬЗТЕАТСРКЕ (ЗЕО Ю N0:28)
Последовательность распознавания РНК
СииСАСиОСССиАСАСССЙССии.АСААА ОЕС Ю N0:21)
Фиг. 51 >02. | 37525730 | гег | ΝΡ 929074.11 Ьурс1П€Г1са1 рго£ет р1и! '96 IРЪоЮгЬэЪдиз Зиппп^зеепз зиЬзр. 1аитэпаИ ТТ01) МО37ЬЕ1ЕУЕР[)ЬЕГ50О5ЕГЕАЬГДКЬНКАЬв0ЬЗ^(307е7£Е'РСАИКТЬСГТ1Е1ЯС55БАЬМ0Ь0АЬ РКЬКСЬНГ//ТЕ7Ю10РТР9ЕТК¥ЕСУ5Р';о\Т<53АЕКЬКВРА1ККСКЬТ!ЗЕОАйОР.1Р15КЕОКТНЕРГ ΕΡΕΚ5Ε53355ΕΕΕ?7Κ06ΡΙΟΟΚΡΊ'5ΰ±Γ55Υαί5£5ΑΤ3ΡΝΓ (5ЕЭ 10 N0:29)
Фиг. 5К
Последовательность распознавания РНК
С^САС0бгаиАЖбС^ССиэА?3.йАА (5Е£ 1С НО:17) еиисАсиссссиАСА0ССА0сизА(ЗААА (Зео ιο ио:2и >дх 12575694941 геГ|ΥΡ 033650333.1) СР.13РР-а550С1аЕес1 ргоЕеЕп, Сзу4 ГаппГ/ (ΟβδυΙίυι-ϊνίΕνιο βΙΧδΙιρΝιΙυδ АНТ2} ИЛ'1АМ0С'Г7Е132ЬР0РЕГР031ЬММАЬРАКЬНЕАЬАЕНСК0Е1С75ЕРЕЕОККЬМ5К2Р,1Н05ЕЕ5ЬКК Ы-ЮШл'ЮСМКО'/ТРЛ'ЗСЕчКХ-ГОЗСОУР.Г.'КК'^АКЗЗУОЕЕУРРЗ'.ТСКСКЬгЕЕНАЕООКЕРАНЕСРЕ КЕРГ.'01КЗОТТОООРКЕРЮН65ЕОЕКР\ГГОРР53¥СЬ5НЕАТ*^^Р <5Εζ) 10 N0:30)
Последовательность распознавания РНК
СииСАСиеССССАСАСССАССиСьАСААА (ЗЕО ΙΟ N0:31)
Фиг. 5Ь >дх I 25П88340 ί ге£ IΥΡ 003003061-11 Сзу4 £аго11у СК1$РР.-а£50С1а1:е0 ргоЕст (ЭЕскеуэ геле Есл1591) МОН¥1Е1К7ЕР01ЕР5А701,Е5АЕРАК1.НЕА1.СООАФ<ЗА1СУ5ГР07ЙКТЕСЕКЕКЬНС5ЕОАЕТАЕЕ<ЗТ '
ΟΚΕΤ6ΕΕηΥ3ΤΙΤΟνΈΤνΡΤ3Αζ5ΪΛ7νΡΚνθνΚ55ΑΕΚΕΕΡΡΑ73Κΰ'Λ·ΕΤΑΠΕΑΑΑΚΙΡΥΑνΕί<ΡΤ3ΕΡΪ ЕРЬВ2Ь25<ОТГ1ЬГ7ЕН6РЬ00КР7А6ТР55¥013АТАТ1Ыà (5Е£ 10 МО: 32 >
Последовательность распознавания РНК сиисАсиоссоисиАСссАбсииА<ЗАаАА <зео ю ыо:23)
ОиССАСЕ’ССССЕАиАСОСАССииЛЗААА (ЗЕО 10 N0:33)
Фиг. 5М >д: ! 2212 5621 | геί! КР 669044.11 НурсбНеШса1 ρτουθΐη у1727 [Уег£1П1а ρ$5ί.ί8 ΕΙΜ 10
МОНУЬГ;1КУЬРОРЕГ5АОТТ:СЕАЬРАКЬНКАЕУЙТ1РСКУСУЗЕР?АСКТЬСЗОЬКЪНС5КеОЬЬЕЬО5А
С'Л'1КС1.00УСЕС5Е1ЕРУРАОУККлТ1ЕР70\'Кг5А<2ЕЬРКН575ЕС«ЬТЕЕОАКЬР1Р05НЕККСОЪРЕ
ЬКЬК5Е55Е£^ГЬЬГ1Е0СТЬСА5А?ТСЕГ5АУ6ЬЗУЖТ1РаТ (5ЕО Ю N0:34)
Последовательность распознавания РНК
ОииСАСЗСССССАСАеССАССЦиАОААА (ЗЕ<2 Ю N0:15) иаииСАсисссссАСАСссАбсиидСАААА (зео ю ыо:35)
Фиг. 5Ν >д: ) 271ЫЧ 9Ь21 ге£ | ΥΡ 003334978.11 Сзу4 ГатНу СК.15РР«-а530с1асес1 ρχοΐβίη (Охскеуа бадапЫ! Ес|-)58б‘ (•ГОНУТЕ Ϊ 97Т.РОРЕР5А701Е2АЬРАКЬННАЬСОЯАТСР1С75Г^ОАСКТЬСЕКЪРЬН6570АЪААЬЕОТ ΟΚίΚϋ1ΕΓΎ5ΤΙΤθνΕΤνΡΤΟΑΟΥλ?7ΚΡνονΚ23ΑΕΚΕΚΕΕΑν3ΚΟΚΜΤΑΟΕΑΑΑΕ.ΙΡϊΑΑΕΚΚΤ5ΙΤϊ ЬЕЬК5Ь53С0ТГЫР7ЕНСРЬ^ЕКР7АС7Г55¥СЬЗа1АТ1РлТ (5Е<2 10 N0:36)
Последовательность распознавания РНК
СиСААС-ЗОССОСАиЛОеСАСССиАСЛАА (ЗЕС Ю N0:371 СииСАСООСССАСиАСССАбСииАСААА <5Е0 Ю N0:12)
Фиг. 50 >д! 11762 3967 11'е£ | ΥΡ 851380,1 | ЬуроЬНет тса1 ргогетп АРЕСО1 1206 [ЕзсЬегхсЫа со11 АРЕС 01) иаузеугжкыкеьрмонуьеткуерорерзземемааегакьяруесаесоссюуеетоунумрзакьк
ЕИйЗАГ!АЕОАЕЕА5ТКККСЬТОУ1.'ОС5?ОТРУРЕ1КС№л'\г5Р’А27КЗ№ОЕЬЬКЕ8'7ККеИЬТЕЕОА1Е
РЬАТЗАЕПРТОЬРР^МНКЗЕЕЗ'ЗОЬРКЬПКНСЫЬКЕРУГСЕЕЗЗУСЬЗАТАТТРКГ (5Е0 ΙΡ N0:381
Фиг. 5Р
Последовательность распознавания РНК •ЗииСАСПССССиАСДСССАОСиСАбААА (ЗЕС 10 N0:21) >9ϋ 91205927 |ге£|¥? 535913.1! ЪуроСЬебюа! ргоСехл 7ΤΙ85 С0896 [ЕзсЬег!сЫа соП ΌΤΙ89] ΜΕΗΥ ЕЕ IВУЬРС РЕРЗ£ЕМША.и.ГАКЬНЕУЕСА!КЗ(2С01ет5ГРОУЫУМРОАКЬКЕНеЗА0АЬ0АЬЕ А5 ТлККСЕТС-¥СОСЗР5Т?Р\?Е1КСЛКУ’23КУО'ЛК5КРОКШ1Е£'/ККОТЕТЕЕОА1ЕРЬАТОАЕО)КТОЬРР ЕЫЖ5Е5£00ЬРКЬР1ЕНССЬЬЕЕРУКСЕГ55УСЬ2АТАТ1РКГ (ΞΕ® 10 N0:35)
Последовательность распознавания РНК
ОНиСАСОССССиАСА-ЗССХССНиАОААА (£Е0 10 N0:21)
Фиг. 50
12378081241ие£|ΥΡ 032852564.1ί СГСЗРР-аззссхаЪеЗ ргоСехп, Сзу4 £ат11у 'То1итопаз аиепз15 05М 91071
МОНУЬ01КЬЪРЕЕРЕ\/5;Е5ЕТЬМАЬГАьКЬН7ККСООАОС^27’5ГРРНИКВЬСПЬЬЕЬКООВТ£)ЬОАЪМА ’
ОГйт’ЬОСЬКС УТ0С5Е'7ЬР1 Ρ.ΑΤ\’5ΥΚΑνΚΚν0ΑΚ5ΑΗΝΚΚ0Κ5Ι АКС«ЬТЕ5ЕА01 ΡΙ Р0Т<22КЕЬНЬР Г νθΕΚ5Κ$Ν00ΜΜΒ.’ΛΓνΕΗ{3ΡνΐΑνΡν5ΟΥΓΝΑΥ015$ΙΑΤΙΡΚΡ (5Е0 Ιϋ N0:40)
Последовательность распознавания РНК сиисАсийссс-САслсесАСсии/дСААА (зео ю мо;4п
Фиг. 5К
- 88 024121 >9ί I 2599ΰ75051 геί 1 ΥΡ 002647861.1! СК13РК-а550с1аб.ес1 ргс-Ьегп Сзу4 [ЕгиггТа руггСоНае Ερ1/96] МРН¥ОИ1В'.’К/С1ЕЕ.ЧСЕАУЬБАО7ГМНЬН071МКАМ{еК1С15сРЯУККТЬС1Ж1КЬНСТЬОбЬ5АЬ00е ' СИНКСЬКС¥1ДСЗО1АРУРКСАА«КТУККУ2УК55АЕКЬККК5УЫ?:0КЬЗЕСЕААЕР.13УШЕОК5НЬРР 1О1К565МС0Атл’Р.ЬР1ЕКС51УЗАР5К35Г55УСЪ5АААТ1№Р !ЗЕО 10 Ж: 42)
Последовательность распознаем ния РНК сиисАсисСсссАСлбесАОсииАеААА гзео τ о νο:ιэ) иисАсиссссоАСАббслссииАСАААА (зео юнойз»
Фиг. 5δ >αί I 218688670 I ге£ | ΥΡ 002396882.11 ЬуросЬеЫсэ! ргоСетп ЕСЕО1 0855 [ЕесНег гсЫа ссИ ЕС1а] МАУгЬУРЛРЛКЕЬРМОНУЬЕТКУЕРОРЕГЗеЕМЬМААЬЕАКЬНКУЬСАКСОСОЮ/ЗГРЙТИУМРСТНЬВ 1ЯС5АОА10Е1ЕА5'№№.СЪТОУС0С5Р'7ТРУРЕ1КСКЕ,Лг5КУ0\гК5ЫР0Р1,ЬКК£\,’ККСК1ТЕЕ0А1Е РЬАТОАЕ0РТ01РЕ1№!К5155(2О0ЕКЬГ1РН<ЗОЫКЕР’Л;СЕЕ35УС15АТАТ1РглТ (ЗЕО Ю N0:44)
Последовательность распознавания РНК
СиОСАСиССССиАСАСеСАССииАбААА (£Е0 Ю N0:21)
Фиг. 5Т >αί| 12160842ό|геί.'|ΥΡ 996233.11 СР.13РР-а55ос1аЬес Сзу4 Гапй1у ргоИехп (Уегш!перпгоЬасвег θίΞθπίύθ ЕР01-21 М5ТН¥101Т1?.Р0РЕР5РАНЫЛ1АЬНА0ЬН1АЬУ0Ь0ТС0У0У5ГРСР1ЬКСЕН5НЬСТТЕМНСАТ5АЬ СдажЗглтЬЕС№11Н’7КТЗЕ7АР\ТТНТСНК1^/Кг:70АК55?ЕЕ59Я?1МНКЪЕ1СБА0АЬ0В1РЕ)0ЕСЕ К1АЬР''ЬКЬ05А5КС07РКЕР1ЕНСРЬЫ7ГР5Ри5РбТУ(5ЬЗТОАТ1РИР <ЗЕ£ 10 N0:45}
Последовательность распознавания РНК
СииСАСиСССССАОАСССАССиСАСААА (5Е0 !_)МО:46)
Фиг. 5и >-3Ϊ )34497206)ге£ΙΝΡ 901421.11 Ьуро[Ьес1са1 ргоЬехп СУ 1751 [СЬгспоЬасСег1иш νιοΑιγριιγι АТСС 12472] МЁНУ11'1Р.и,РОАЕ1РСРРУ1М1А1¥АК1НКА1АА0<2Е001СУ5РРС¥Е’РАР35НССКРЪРРТ1СЬТЬК1Н О5ААА1ПС1МАРККЬЗСГАОНА1УСП1ВРУРАСА5АУ5УККН1ЭАК55РАКАКОК1МКК0С15АЕЕАРКЕ1 РОЕТАОЕЬКАРУЬТУОЕАЕТСССГРа.Е'.ТООРАРЗТААСЗП'.'АУСЪгААААЬРАК (5ΕΏ Ю N0:47)
Последовательность распознаваний РНК етиСАСисССССАир.СОС.А&СииАСААА (5Б0 10 N0:48)
Фиг. 5Υ >31! 188532992 1 ге£ | ΥΡ 001906789.1 [ ЬуросЬеНса! ргобесп ЕТА 08450 ΙΕΓ«ίηίό Са5тап1еп£15 Ес1/99]
ΜβΚΥΟΠΙΕ',’κνΟΑΕΜΤΑΡνί-ΕΑίνΡΜΚΙΗΟνΕΜΚΑΑΝΟΚΙ С1ЗГРОУКЬТЪСОКГКЬНСТПЖЬЗ ЗЦ»5
СМОКСЬТС ΥIАСЗА1 ОРУРРСАА.ККТУЕЕУОУКЗЗАЕКШРВЭУМКСКЬНЕАЕААЕИ МУЬЗЕ(]Е2 21ΡΪ
ЮГК&ЗЗКСНАКЕЬПЕНСРЬУЗУРУМСеРЗЗУСЕЗАТАТУРКГ 'БЕС 10 N0:49)
Последовательность распознавания РНК соисдсисссбСАгасссАссиидсААА {зес гп коз9)
ОШСАСОСИООиАСАОССАССииАСААе (ЗЕС 1С N0:50)
Фиг. 5\А >3111608960631 ге£ 1ΥΡ 001562245.11 СК13РК-а5£ос1а6е<1 С$у4 ЕатПу рготет [0е1£Па аскЗоуогапз ЗРН-1] МАМТЗНУЮТТИРОРЕГЗНАНЫСАЬУАКЬаКАЬУОЕСЗТСХСГЗРРбУЗЬКРЙТЬСТИРЛЛбЗЕААЬ Е61МЕСРИ113СМЕОНУЕСТРРАЬУРЕСАУРСЬУОРЛОЕКТЗРОК1ЕРРЛМР1ЖСЕТАЕО.АААА.1РЕЗУЕК ТРОЬРУУСЬЕЗАЗТЗОРРСЬЕ'ЖОКАУССТАСОЕСВ'ЫТУСЬЗЬСТАУРКГ (3Ξ0 IГ) N0:51)
Последовательность распознавания РНК
СииСССиСССССОиЛСССАССиСАСА.ЧА (5Е0 ΙΟ N0: 52)
Фиг. 5Х >311146311064 I геСI ΥΡ 001176138.1! СК15РК-аззос1аС.еб Сзу4 ϊ'όιπύΐν ргоСегп [ЕтегсЬасЬег зр. 638] МОНГЕЕ1КУЪ5ОРЕГ5ЕЕТ]ЛААЬГАКЪНКА1ОАК606О1ОТ5Ртъи(РССТЬКШ35А<25ЬОЕЬЕКМ АИККСЬЗОУСЕСКСУгРАРОУМАККСУЗР.УйУКЗгР'ЗКЬМЕКЗУККеКЬТЕЕЕАООКЪЕМЬОЕАКТОЪРК ШЬ05Ь5Т(305РИ,Р1КНСБ-1У»!РМССЕР35УСЬ5АТЛТ1РЬТ <5Е0 Ю N0:53)
Последовательность распознавания РНК сиисАсисссеиАслббсАесииАбААА ($ео ю νο;2ό
Фиг. 5Υ >да! 289209612 | ге£ 1 УР 00.3461678.11 СК13РК-аеаос1а6ед ΡΓΟϊ,βίη, Сзу4 РатНу [ТЫоа1ка1 ίνίΕτίο зр. Кгп·] МСНУЮ1КУКРОРЕРКЕТТЫаАЬУ5КЬНККЬУ5М5АОО1С15ЬРПНЕ0ЕРР1СКК1КУНСТ0СК1НЫМ ССЕИЬССЗМОЗЕУОАТРУОРУтОУТУКРУЕКВОУКТМАЕКЕКВКВНВВНСЕЗУЕЕАВОНТРОТУЕВРУЫТ РРЬ5ТОЗАЗТО0КГ51Р1ЕНСР?СОНА5?ЙКРНТУЙ150[)АТУРКГ ($Е0 10 N0:54)
Последовательность распознавания РНК
СиаАССиСССССАСАСССАСС01САС.ААА (ЗЕ'З 10 N0:55)
Фиг. 5Ζ >31;283856310Iге£1УР 162420.21 Сзу4 (агоНу СК13РК-аа5ос1а6е<1 огобеЗп [Уутогаопас тоЫПз киЬар. ™ο6ι1ΐ£ ΖΜ4] М:АЛРУОЗУе01У1’.РМ0Е1АР411КЕКЪГ5ЫЫЕи'К1С30Н1С15РРЕНО1ТОКРСЬС5тЕЬНеТСА 01Н-ЕАЬ5СЙ:1ТЕЕОЕ'УЬУСЕ01К5УРЕ1ВОУС'Л'ЗКУОАК55РАКЬККРА1РБНСРНОЕЕАККУ1РОТА КЕКЬЕЬРЕ1МТС5С5ТКОРВРРУР15НК110НК12.аСЫ™5У5ЬЗЬеА5УРК? (ЗЕ'2 10 N0:56)
Последовательность распознавания РНК сиислсис<с^АСАС5-зсАС-сиилоАЛА {зео ю ыопэ}
Фиг. 5АА
- 89 024121 >д1[260752821|1е£ΙΥΡ 003225714.11 С^ЗРВ-азБссьйСес огоЁет, Сзу4 £апи1у (2утопюпаз тоЪгПз $иЬ5р. пюЬтНз ЫСМ 11163} МЪАМ?УОЗ^ОГ¥ИРМСЕ1АРН11МЕКЬГ5ЬЬН1ЕЬуУЕС50Н1С15РРЕНОМЖ<РСЬС5КЬКЬНСАСА ОЕНЕЬАЪ5С,л'1ТВЬСОТЬУСЕС1К57РЕ1Н01'С\7У5К70АК55РАКЬКЕВА.ГККНСГНПЕЕАКК71Р1УГА
ГЕР1ЕЬРЕ1МТС5С5ТК0РЕГР7ГГ5НК1Ю^КЪМЮ™5У6Ь5Ь0А57РглТ (ЗЕО Ю N0:57)
Последовательность распознавания РНК
СииСАСи'ЗССОСАСАОбСХбСииАСААА (ЗЕО Ιϋ N0:19)
Фиг. 5АВ >ςι( 1215929151 ие£1УР 984611,11 СК13РК-аз50С1аСеб Сзу4 £апи1у рсоЮш [Асхботогах эр. 7842] МТТ.Ч ΥIΝIΊΊ, ЬРСРЕГЗНАНГЬСАЬУАКЬНКАЕУОСНТТО1 ЕУЗУРОН’/ЗОРЬТККТЬСАУЬКЬНСТРЕА ЬСКЬМЕЕ гаЬКСМВОНТРУеЕЬЬРУРАЫАОГО Т’/КККОГКТЫАОКЬЗКККМОККСЕТ АЕ0АААА1Р0ТУЕ
РВРЕЬРР;0ЬК535ТОД5ГСЬСтеНЕР1£РЕРУАеАГНАУ’СЬаН0АТУЫР(ЗЕО ГО N0:58)
Последовательность распознавания РНК
ССТСАСиОСС&САиАОС-СЙССиСАСААА (ЗЕО Ю N0:59)
Фиг. 5АС >ςι 13170511031 ιβι IΥΡ С04112219.11 Сзу4 £аиз.1у СЕ15РР,-азз._.С1аг«5 огоЬехг. [ОезиИипзрюПит тсксиги 551 НО5У1Е:Е1ЪРОаЕРЕАТТ1Ж1УГАКЬНКАЬУЕ5СК5ОЮТ5ГРЕА0КТР13АЬЬКЬНС5ЬААЬЁ51ИГЪ 3«ЬТеЬОС¥ТС1Т5О1Ь07РА9ЙА¥УСУАЕ\'05КМТА5Р.1ККАЬККС5Ь5ЕЕКАЬЕЫО5КС01Л0РГГК1 Ь5А5ТА<5КРРЬР1Е(ЗКНАЕКАС.КО5УУ5АУСЬ5УСОЗТУРКР (ЗЕО Ю Н0:6С)
Последовательность распознавания РНК
ЯДиСАСиСЙСОСАиАСЗССЙЕСиСАЦААА (ЗЕО ГО КО:55)
Фиг. 5ΑΏ >дхI 545036431 ге£!УР 133636.11 НуросЬеС1са1 ргоьеъп РЗРРВ1551 [РЬоСоЬасСеггигп рго£ипбит 355] ММ05УУ ϋΤ ОЬКРОАЕМЕЕАЕЬЗ ЗКУРГКРНКАЬАТЬЫТТЖ1015Р РОВДЬКЪСКЬГРХ Η5ΝАЗШЮЬОС 1ККЬСА1АСТС0УСЕ1Т'.’УР1)0\г0УКУ15УККЗНЬ5КАКЬРЖЫА1’£-51К'(156ЕКК¥КУКМЬ505РОНРУ Г.ОЬге35те0У¥ККРгЕРбОЮАТ5У5Г)ЕРП5УСЬ5НТАТ1РИГ (552 10 N0:61)
Последовательность распознавания РНК сиисАсиоСсосАСАоесйесииАбААА |5ео ю мс·: 19)
Фиг. 5АЕ >дх! 542929531 ге£|ΪΡ 122340.11 ЬтросЬесХса! рго0е±п р!р10047 [ЬедхопеПа рпеияюрЪПа $(:г. Εβηε МОНУШ131ЬРОЗЕРТТР\ТЖА1¥таЬНКАЬНТЬАЗТК1СУЗГРКУ55ТЬОМЬЕК1НОККЕАЬОЕЬОНЬ ^Ι66ΜΣ6ΥΟΕΑ5ΕΐΚΤνΡΑΕΤΚΠ^'5ΒΚΟΡΤΜ5Ο5ΚΕΒΜΙΚΕΝ3ίΤΕΏΕΙΚ0ΥΚΑΚΝΡ3ΚΟίΟΝΡΥΙ ЕЬ7575МС<ЗВН^1ЕГСЕЬг^ЕР1?6ЬГО(ЗРСЬ5И5АТ/РКЕО (ЗЕО ΙΕ N0:62)
Последовательность распознавания РНК биисАсиссссиАСАсссАссиидсмА (зе$ ιο ю:2ц
СииСАСиеССССАСАСССАОСииАСААА (5Е0 ΙΟ N0:19)
Фиг. 5АР >о ι. (54295752 ! геЕ(ΥΡ 126167,1! Ь/роЕЗеЕ 1сэ1 с-гоъехп 1р12842 [1.ед1опе11а рпеиторЬПа зег. Ьепз] МОНУЬЕ151 ЬРОЗЕГТТР'ЛМШ УТШНКАЪНТЬАБТЗIОТ5ГРК¥55ТШ411ΚΙ НСККЕУЩОЪОЫЬ Ж15СН1СУСЕАЗ Ы КТУРА 0ТКРР.ТУ5КК0РТЙ505КЬКЫ.1 ΚΚΗΤΣΤΕϋΕΙ ΗΟΪΚΑΗ4Γ5ΚΟΙ.ΟΝΡΥΙ ЕЬ7575НС0ЙНКНУ1ЕРСЕЬРНЕР5РСЬГаЭГСЬ5Ы5АТУРКГО (5Е<2 ГО N0:63)
Последовательность распознавания РНК
СииСАСНЗССциАСАОССА&СииАСААА (ЗЕО Ю КО:21)
С'Л’САСТСССССАСА«?САОСииАСААА (5Е0 ТГ? N0:19)
Фиг. 5АС >д)|146292921(ге£|ΥΡ 001183345.11 СЕ15РК-аззог1а1еб Сау4 ЕагаПу ρτοΐείη (5Ье>:апе11а ри£ге£ас1епз 61)-32( №ЗУ1Е1КЬКР0.АЕМКЕАЕЬЗЗКУГТКГНКАЪУТЬИ5НК1С15РРЗМКЬ5Ьв2ЬГЕХНСРАЗЫНРЬ0СЬ КлЬеРЬАСУСОУТАУЗАУРРНУОУКТУЗУККЗШЗКАКЬККИАЙСЗЮКОЗЕККУКУКМЮТОГОМРУЬ 0ЕР553ТС<У¥ККГГЕР5010АНРЬГСЕР05УСЬ5КТАТ7РКГ (ЗЕО Ю N0:64)
Последовательность распознавания РНК
СииСАССОССССАСАСССеССТОАОААА (ЗЕО Ю N0:65)
Фиг. 5АН >д1|296106567|1еГ|ΥΡ 003613267.11 Ьурос.Иег1са1 рго^ехп 1ра 01476 [Ьед1опе11а рпеиторЗтИа 2300/99 А1соу] М0\’¥У01ЫКР05ЕК5ЬНРЫ5ТЬУТКЬНК\ЪНША5ТН1СУ5ГРК¥М1Т1ЛН1ЬЕ1Н5ККУ\Ъ0ЕЬЕСМ КГЬ5С1ЫМУУЕ72Р1КЗУРА05КГЕ115ККОТТМ505КМКЕЬГККС5МТ7С01Р.2УКАКМРАК510ЫРУЬ ЕЬг’ЗСЗЫСУНУКРЛ'ХЕГОЕЪЬОО^СЕГОВРСЬЗКТАТУРКГО (ЗЕО Ю N0:66)
Последовательность распознавания РНК сииААсисСсссАСАссс^ссииАОААС (Зео ю но:67)
Фиг. 5ΑΙ
- 90 024121 >д! 12607727361 ге£( Ζ.Ρ 05381652.1( 1туоот.НеЫса1 ргосегп УГВ 001132 )1/1Ьг1о теС.зс(1П1 ксл’П С1Р 69.14) МО5¥1Е1КЦ2РОАЕМРЕАЕЬ55К7ГТКГНКАЬ71Ш5№21е15ГРЕУ№/К1ЙМ,ГКЬВеЕА5Е'1.НОЕ0С1,
ЪКЮЕЧЗС.УСОУЗЕТ ΕΑΙ 1;Е0‘/Г;’ГР'/15νΚΚ5ΝΙ^ζΑΚΕΡ.Μ,1 АК35 ΙΟΚΕεΕΚΡΥΚνΚΜ15ΰΟΡϋΝΡΥί С'ЬР5Е5ТК0УНККЕРЕРСЕ10РЬР75СКЕЕвУСЬ£НТТТс'РКЕ (ΞΕ0 10 N0:66)
Последовательность распознавания РНК
ОиОСАСиСССбСАСАСССЖСииЛСАРА (£Г.О 10 N0:19) сиисАсисссесдиАсссАссииАеААА (рео ю ж.:69)
Фиг. 5ΛΙ >9111571464371ге£I УР 001453756.11 ЬтоотЬегЛса! ргогет СКО 02137 (СЬСгоЬасСег козегх АТСС ВАА-895) МАТТРУРАТКСККТУБКУО'/КЗЗРОКЬЬККЗХ'ККСИ.ТЕЕОАОЬКЕУЕЗТЕХЗНЕОЬР’ЛЖКгЬЗМОСЙГ Е7г1КН5Еи!5ЕРУ5<5ТГТ5¥0Ь55ТАТ1РКР <ЗЕ<2 10 N0:70)
Последовательность распознавания РНК иСииСАСиССССОАСАОССАбСиОАСААА (ЗЕО 10 N0:21)
Фиг. 5АК >д11 262402Й03 ί геГί ЗР 06079364.11 ’πνροίЬеОίса1 ρτούθίη ν’ΟΑ 000765 [У1Ьг1о зр. КС536) Μ0ΑΥΙ 01КйМР0АРМКЕАЕЬ53К1Т1КГНКАЬ'7КЬК5МК1С13ГРЕАМ1К1ХЖЬГКЬНСЕМ5АЬН0ЫЭСЬ ЫКЬ6РЬА5УСК1 ΓΤνΤΗνΡΟΟνΟΥΡ.Ι 13<2ККЗМЪ5КАКЬТКЫАР,С51 ОК1ХЖКЕ¥КУКМЬ8ОСРСЫРУЬ
ОЕЗббЗТСОУУККГРЕРЗОЮАВРОССЕГОЗУСЬЗКТАТУРКР (ЗЕО 1С МО;71)
Последовательность распознавания РНК
СдаСАСПСлСССАСАСССАОСииАСААА (5Е0 Ю N0:13)
Аеи5ЦиСТ)ССССААиАСОСАССиААСАА (5Е0 ΙΠ N0:72)
Фиг. 5АЬ >αί:229623353Iге£I2Р 04412760.11 6уро£Ъе(Лса1 ргоСехп 7ΙΡ 000211 [’ЛЪгЬо сЬо1егае ТМ 11079-60) ΜΜΏΑ Υ110 ЕЬМРОАЕИКЕАЕЕЗ 5Κν ΪΊ ΚΕΚΚΑΙ,νΚΚΒΝΚ IС15Р ΡΕΑΝΙΚ1СР1 ЕРХНСЕ’ОЗАЬН ПЬСО Ι24ΚΕΠΡΙΑΰΥΟΚΙΤΤνΤΗνΡΙΧ2\ΈΥΚΙΙ3νΚΚ3ΝΕ2ΚΑΕΕΑΙ11ΙΑΚ03ΙΟΚ[Χ3ΕΚΚΥΕνΚΗίϊ(ΟΟΡΟΝΡΥ ΕΠΕ5355Τ32νΥΚΚΡΕΈΓ50Ι0ΑΕΡ·νΌ5ΕΓΡ5ΥΘ15ΚΤΑΤνΡΚΡ (5Κ· ΙΕ N0:73)
Последовательность распознавания РНК соисАс^СссслслсссЛссиидс^и <зео ιο νο :~4)
Фиг. 5АМ хи 1 2 377480151 се! ί ΖΡ 04578495.11 спзог-аэзосгаЬеб огоЬесг: )0ха1оЬас£ег Гогтхдепев ОХСС13) ΜΚΗΥΙЕIТ1ТС5РСР РЬУНЬКЕКЬУТдЬНЕ.МУЕМКОАЕОО'Л: 1373 РРЕ Υ Υ ЕЫЕЕКСМСЕЬСТК ЗОНА ЕЭЕТ5ЮК1010ККЕ7Рг,Ы[)С1Н1ТР'/СК7РШЕ1ТС¥АТЕЗЕКН1К5ИАЕЕ1АКЕ0МКЕНК0ЕйгНЕТУ ζ>ΡΎ<2ΚΝΙ,ΑΚ5ΡΪ,ΡΓτ<2Ι,ΕΞΙ/ΓΝ5ΗΡΓΚΙ,ΡΙΕΚΚΡΑΙΝΑ51κνΡΤΪΥ61.5ΑΕ5ΤΙΡΕΕ (5Е0 Л) N0:75)
Последовательность распознавания РНК сгасАсис£ссиАиАсссХеотиАСА№ (зео ю но: 76)
Фиг. 5ΑΝ >д1ί119945137(хе£:ΥΡ 34261·'.1! СЕ15РК-аааос1ь£е6 Сау4 £аго11у ргоьехп (Рзусбгоптопаа ιпдгайапп ι З7) НКУ¥11|1Т1ЬРО1Е1?ЬЗЕ1К0:К7Р00УН1АЪАСМК’7СЕЫЕ5О1А1£Ь№УСОКАЕР1еНКи(ЬГ375ЕО
Α1ΕΚΙ,ΑΓΤΚΚΙΧΚΡΤΚ1ΤΗΤΤ5\'ΚΑν?Ε3ΑΝΕΥΑ€(ΤΚΚ0ΡΝΤΝΙ5ΚΙΑΕΚΚΑΚΕΗΜΕΤΡΕΚΑυ2ΥΥϋΝΓ
АЕЕОТКЬРП™1КБЬтаИАО?К1Р1ЕК5ПК1РКОЭТП!С¥С1,52А1АТ7РКР (552 1С N0:77)
Последовательность распознавания РНК сисоисссссисссс.АссбссАисААССС <зео ю ηοχβι
Фиг. 5АО >С11146328647! се£ I ΥΡ 001209099.11 Ьурс(±еС1Са1 ргОСеш ΟΝΟ 0170 [О1сНе1еЬасГег повозив УС31703А]
ΜΝ?Υ0ΕΙΤ11ΡΟΑΕν5ΕΪΕ1Β3ΕνΥ001ΗΙΑΙΑθνΚΝΚΥβΙ17ΓΙ3νΝΡΡΗινΥ5Εζ34ΗΚνΑ'ΑΑβΙΧ1ΐΧ5£Κ
1РА1АЕИОЬЕК101К9К5ЕЕЬгСГиН1КЕ15К1ЕРМК7ТСУ’ЛЛГККУК¥Р5ЧЖУАЬКЕА0РЕК1НРЕЕА
ΡΚΗ0ΤΚΥΚΗ0ΑΚΝΥΡΡΙΙ4Ι.Κ505Ν0ΕΥΥΚΙ.3ΙΚςεΝΑ0Ε3ν53ΚΕΝνΥ37Ν5ΑΤΟΙΥ'Τ,/Ρ№ί !ЗЕ'> 10 N0:79)
Последовательность распознавания РНК
СииСАСССССССАСАССССССииАйААА (ΞΕΟ ΙΟ N0:65)
Фиг. 5АР >αί 1160876478] ι*β£|ΥΡ 001555794.11 СЫЗРИ-аезосГагеб. Сзу4 £апй1у ргоЬе1л 15Ьеиапе11а Ьа1Ыса 051^5] ΜΝΗΥΕΟΙΤΙΧΡΝΕΕνΰΗΥΓΕί?£ΚΙΥΗθνΗΕΑΓνΕΗΚΝΚν^ΓΕΪΑΑΑΓΡΟΓΝΕΜϋΜ5ΙΟδΚΕΗΙΐΑΤΟΡΟ ΗΕΕΟΕΚν5Ν«ΕΠΗΡτθΥΕΗΙ55ΙΡΡνΡΕΚΙΕ,Λ,νΑΥ5ΚΡΑΓΡΑΝΚΑΡ£ΙΑΚΡΜΚΚΗΝΈΤΕΕΟΑΤΑΗΓΕ5Γ' ΚΡΚΙ?ΓΚΑΡ^ΙΉ3ΥΤΚϋ5ΡΓΡΕΓΙ00ΤΗ5ΑννΚΕ£5ν3ΓΕ5Υ6Ε55Κ(Λ'ΕΡΚΡ (5Εζ) ГР N0:80)
Последовательность распознавания РНК еиисАссбСс'зсАСАСсссссиидсААА (зео ю мо.-65)
Фиг. 5АЦ
- 91 024121 >д1I153001745Iге£|ΥΡ 001367426,1! СР15РК-аззос1а7е0 Сзх4 £аш11у ρΕΟίβίη [ЗЪехапеПа ЬаШса О51Й5) ИЫН¥ЬО1Т11,РЖЕУСНУГЬ55ЕКЬУНОШЧ1АЬУЕНК»ЙУСС!РЕ1АААГРОРВЕМЮ1НЬ65КЕК11АТОР<2 НЬЕОиО/31ЖЬКНРТЕУ1Е11351КРУРПК1Е1,УУА¥5КРА1РАЖАКЕ1АМ1МКР.НЖТ1УОАТАНРЕС? кркктк/зртмазуркозкрргжюстазл’лкцонузгозуоьззкзугркр (зес ю νο:8Η Последовательность распознавания РНК
С(.Ч)САССеССССАСАОСС05СШАеААА !ЗЕ<3 10 N0:65)
Фиг. 5АР >σί!169795154‘ге£ίΥΡ 00171294,1| ЬуооЫ1еЫсс1 рю1е1п ΑΒΑΥΕ1000 [АфпегоЬасЬех ЪаитаппП ΑΥΕ] №ΙΚΒΥζ3ΕΤΤΕΙΐΧ?0ΞΙ5ίΥΕΊΚ3ΚνΥΤ0υϊΙΑΡΑΕΚ5ΝΕ0(5ΡΊ5Γ0ν5?ΡςΥΚΙΚΕ<2ΚΚΙ0ίΧ6ΤΚΙΚν?
А53ЕНРадО1,К5СЬ'глЪЕР,Г1 ?1ΎΗΙΤΟΡΚΕνΡΡ.4ΚΙΤΟΥΑΗΥΥΚνΝΗ(ΪΜ57ΕΕΕΐνΗ2ΑΟΚΚΝΙ311ΌΑΚ 0ΗΓΚ9ΥνΕ(3Ρνιπ;ργν5ΕΚ5ΕΞΑΚΚΕΕΚν0ΚΡΥΚΕΥΙ0Κ5ίν0ΕΑΚϋ6ΜΡ0ΤΥ51.5ΕΜΤΤ'/ΡΕΓ (ΞΕΟ ΙΕ N0:82)
Последовательность распознавания РНК
СииСАиОССЗССАиАСОССАиииАСААА (ВЕС ΙΕ ΝΟ: 83>
Фиг. 5А8 >д!1213156184IгеГIΥΡ С02320235.11 ст:1зрг-аззос1а6еа ρηοίθίη, Сзу4 РатНу [АсгпесоЬасГег ЬвигааппН АВ0057) МйгУОЕ1ТЫООЕЕ15Ь¥Р1ИЕЮТТОЬН1АГАЕНЗНЕООК13ГСУЗГРОУК1ИЕОКК1еГЬСТК1КУГА 35ЕОТ1ЬООЪКЬеККЬЕКЕ10ТЛ11ТОРНЕУРКАЕ1ТеУАН¥УК7ННКМ5УЕЕК17йОАОККМ15ЬООАКО НРВДУЕО№ЕРУУ51Ж5Ь5А1ЖЕЕЫТСЕРУЕЬ¥1еК5ЬУиЕАКгемгеТ¥ЗЬ5даГТУРЕГ (5Е<2 Ю N0:84)
Последовательность распознавания РНК
ОииСАОС-ЗСООСАОАССССА'ХиАСААА (5Е0 ИЗ 110:83}
Фиг. 5АТ >д!115602173 I ге£I ΝΡ 245245.Ιι ЬуроСЪеСхса! ргозехл РМ0э08 [РазНеигеПа тиКосхйэ зиЬгр. пиХСосхс^а зёг. Ргп?Р] МТТН¥1РЬКА1Р^СМЬО5ЕУ1СНСМС1ЬН0ГЬРНГЕСЕУСЛ(АГРАУ6ЬСРТЬ(361УКЬРАМ0ЕЕ)СК0ЬН «20ЫР.301Я0¥АЪ15Е\г£КТРЬРТЕКРЗ¥5Е7НРКОЭ5А1РКТЕК1СК50СЕКОЕ51ЕА1>10СНС0К7АР ЕРНСНЬК5А5ТеСЕЕ1ЪА7КЕКЕМРС)5С\'’67П1А¥СЬ5К5АТ7РНЕ {$Е£ 1Э N0:85)
Последовательность распознавании РНК сиисАссАОсоисиАСАибссииАСААА. оео хо ηοχββ) (ЗиУААСиСССбОАиАСССАСССиАСААА (5Е<2 10 N0:87)
Фиг. 5Аи >д!|2933504341ге£ IгР_С66347Ь8.И Сзу4 £ат!1у СК13РК-аз80с1аьес1 ргог.еа.п [АддгедасхЬастег асб!потусесетсоппЪапз 075-11
ΜΤνζΙΊΉΥΙΕ ΙΚΑΙ Р0ТОМ1/)ТЕУ16ГСЬ0КЬН01ЬРНГЕ6К16ЬАР?АУСН0КТЬСС11КЬГСТЕНЮТЕ 1ΗΓΚ005ίΚΟΥΑΠ5ΕνΜΡΙΡΕΚνΕ3ΥΕΙΥΟΚΙΟΡΚβ055ΙΕΕΑΕΚΚΙΤΑΟ6ΚΚΒΞΕνΐΧ?ΝΜΐΧ>Κι2ΑΤΟΚ
ТУРНАЯЕКЗЗЗТКООтАТКгУНОТКАУЕСУГЗАУСЬЗОТТТСРНГ (ЗЕО Ю N0:68)
Последовательность распознавания РНК сиисАсиесссАлиАсасАСсгиАСААл (εεο ιώ νο:89>
Фиг. 5АУ >д! ί 15259&699ИеР!ΎΡ 001341534.11 СК13РР-а5£Ос1аое<3 С8у4 5ат11у ососехп [ Ма г ί потопа е ар, ΜΗΎ1.1} ΜΚΗΥΙΜΤΕΕΡ5ΟϋΙΰνΗΠί?5Κ1ΜΜ0νΚΙΑΕνΕΤ(3ΝΕ0Κ(?/ΡνΑν3ΓΡΚΥζ1ΡΓ!ΕΝΕΚΚ3ίνθΝΚυ:ΕΡΑ Ν1ΚΤΏΕΕΡ1ΝΡΰΚΚΕΗΚΕΕηνΗΙΚΞΙΑθνΡΜϋνΐ5ΥΕ5Γΐ1Ρ1>.3Κ3Ο5ΡΕ«ΗΙΚΕΕΜ0ΚΗΗΕΤΗΕΰΑΑΑΓ ЕКеУ5МЕКА0К0ЬРЕ1га1К5ЬН5И)ЕГСМ511ККЕАДР5ЫКН1МгаТ¥6Ь5АЕОТЕРКГ (ЗЕО) Ю N0:90)
Последовательность распознавания РНК
СииСССССССЗАЙСАСеССССиОАСААА НЕу Ю ВО:91)
Фиг. 5АУ >οΐI 2586456901 ге£ 12Р 05733155.11 СЕХоРР.-агеосьасей ргосегп, С5\*4 £апПу [01а115£ег ΐηνΐδϋδ Р5М 15470] МЕ¥У0ЕГТЕЬРСАЕ75ЬАГЕКТК7ГТ0ЬН1АРА0ЕКЫК5СННЪУАУ5РРЕУКЕТСЬ6ЕКГЕ7РАЕА0ЕЬЕ ЕГ1йЬ5Ю/1,СЕЬЕОПгЕЮТ51ЕК7РЕЕК1ЕСУА7¥5РУ0РЕС5Хгл^КАРЕ¥АКЕНРС7Т1ЕЕААВЫ^СКЕ К5^/ЕЬР¥10МК5ЬЗЕССТГ$ЬПККЕ\,ЕКЕ$АЪТЕССТ¥СЬ5^ЕТУРЕР {5Е£ 10 N0:92)
Последовательность распознавания РНК сшААсис&ссАидссийс-иииАСААА. (зес то мо:53>
ооадисисссаиАиАсссАссииАСААА <зес ιο νο:94>
Фиг. 5АУ >ςί11659756711ге!!ΥΡ_061ό51264.11 ЬуроСЬеС 1са1 ριοεβίη АРЛ,_0216 1 АсС1поЬас111из р1еигорпеита[11ае геютаг 3 зСг. ЛС-31 ’
М5ЕЬТНУ1ЕЕКА1РСУ011£ТС71АНСЩ11НКГЬР1¥0бЕ1С1ЛГРАУ013ВТЬСОПР,7ГенК>НСТа тЕГОЫСЕСЩОУ'/ЫТЗ’ЛРУРЕЕГ^УНКУ'аКУНККЙаЗАНТ.ТЕОт’ЗССКЖТЕЕТВОЕИЫНООН 0Κ’/?ΡΎ5'Κ1Κ5ΰ5ΤΚ0ΗΡνΙΑΙΒ0ΕΕ1ΑΕΡΑ3<31ηΐΑΥ0Ε50ΑΑΤνΡΗΓ (ЗЕО Ю N0:95)
Последовательность распознавания РНК сиисйсиссссиАипсссАосииАСААА (зео ιβ νο;96ι
Фиг. А2 >^ί ί 190145486 | ге£| ΥΡ 001968011.11 Ьуро£Ье!:1са1 ргоСехп АРР7 0217 (АсЫпоЬасхНиз р1еисорпеитот.0.е зегогаг 7 5СГ. АР?6*
МЗЁЬ?Н¥1£5КА1Р071)11з0ТО71АНСЬС1ЬНКГЬРП06Е16Е5ЕРА¥СЬСРТЬСС11Р.УЕСЫЕС'НСТ0
1КТОЫСЬСЬ?ОУ¥7ЫТ27ТР7РЕЕ17ЕУНК¥ОРУНККС25А1КЯТЕОЕЬу(>2СК№ТЕЕ1Рда1ЫНООК
0КУРРтЕК5Гт5ТК0НГ/1аА1Р0ЬЙ1аАЕР75(;т1АУСЬ5К1АТ7РНР {5Ξζ) ТО МО:97) '
Последовательность распознавания РНК соисАсисСсоиАиАоссХссиаАСААА <зео
Фиг. 5ВА
- 92 024121 >д= 1 303254029 : ге£ι ΖΡ 07339182.1] 1'л-’рае’пеЫ.са1 ргоеаёп АРР2 1978 [Асе1поЬасе11из р1еигорпеитотае зогоуаг 2 зег. 42261 ~ ~
МЗЁПНУ1£1,КА1РОУ011вТ17У1АНСЬОШ;КРЬРЪУОСЕ1еЪ5РРА¥еЬСКТЬЖ11КтесНЕОНСТа
ΙΚΤςιΙΙΟΕΟΙΟΟϊΙΤ,ΙτενΤΡνΡΕΕΙνΈΥΗΕΥΟΕν’ΗΕΚΟΟεΑΙΕΕΤΕΟΓί'ΛΧΙΟΚΜΤΕΕΙΚΏΕΜΙΙΗΟΟΝ
9К<РРНУК1К5С5ТК0НРУТ.ЧКО1МАЕР5РОЕПт(Ж5К1АТУРНГ !£ЕО 10 N0:98)
Фиг. 5ВВ >,! ί 303251662 ί ее£] ΖΡ 07337835.1] КуроеЬеНса! ргоеееп АГР6 0866 1Ас1 щэЬасШиз р1еигорпеитоп1ае зегоуаг 6 зег. Гете]
М5ЕЬТНУ1Е1КА1Р0У01Ь0Т0'ЛАНСЮННКР1Р1А'абЕ1СЕ5РРАУСЬСЕТ1С511Е’Л0ЫЕ12НСТ0
ΙΚΤ0ΕΙ(3Εδϊ0ΟΥνΕΙΤΕ'ΛΡνΡΕΕΙ\ΈΥΗΡ.Υ9ΚνΗΕΚΟ05ΑΙ№ΤΕΙ0ΓΕν0ΰΟΚΗΤΕΕΙΚ0ΞΜΙ·ΙΗ0<3Ν
0ΚνΡ?ΗνΚΕΚ3δΰΤΚ0ΗΓ0ίΑΙΚ0ΕΚΕΑΕΡ2ΡΰΕΓΝΤΥ0Ε5ΚΧΑΤνΡΗΓ (8Е0 10 N0:59)
Фиг. 5ВС >αί]Π662ΐ507 [ι-<?ί1ΥΡ 920126.11 беоЬсэрЬо-СсА ктазе [ЗОгерюссссоз (ЛегпорЬНие Ш>9] МЗКТМПСЬТССТАЗСКЗТУТЕПКСАСУКТЮ^ССЬУНЕМОтеСбЕЕУОАГ.Т.К'ХЗЕСТЕЕРКСЕЬНКР КЬСС1,1Р55ЕЕМ?.У05АЕ193К1 1КЕЕ1ААККГСЬАКЕЕ№/г ГМ01РЬЬГЕЕТУдаТ!УДХ1Л7Л'5РОУ· 0©-2РЬМККННЬ5АЕЁАС?П’1А50МР1АЕЕЬР¥А5ЬУ10№1СНХООЬККК7Кй3'.1КРЬАКЫ' (5Е0 Ю N0:100)
Фиг. 5ΒΌ
Н523А1а
I ΐΓύηγΙάίυΐΕ ре!ре£ррсд1 тБ\:1£дк1жч аЗл'адддск! г$г1дег1гь
61 Ьазас1д1га1 1агр'лг’1ес1г сШ1д£дерау урЬрЬругср згусгукзпре г1ггг1шггЬ. 121 сЯззэеагкг 1р^куаг=1с1 1р£’Л.1г£Ч5 Сдд££г1£з.г ЬдрЩаСаее дд££суд1зк 181 дд£^£ (5Е0- Ю N0:101)
Н&29А1а/5ег50Су$
1 гг<1Ь\Тс)1г1г рбре£рргд1 ш5У1£дк1жа а1уасддЦг1 ду$£рс!1<3ес гзг1дег1г1 61 НазоскПга! 1агрм1ед1г ЗЫд£дера\? чрЬр£ругду згудукзпре г1ггг1шггЪ
121 еПзеееагкг ΐράΐ.νόΓό1ά 1ρ£ν£ΐί5ς5 £ддН£г1Нг Ьдр1да£зее дд££.суд!ек 181 дд£ур;Я (5Е0 ТО N0:102)
Фиг. 6
Фиг. 7
- 93 024121
Фиг. 8
Фиг. 9
- 94 024121
Фиг. 10
EA201291024A 2010-05-10 2011-05-09 Композиции эндорибонуклеаз и способы их использования EA024121B9 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33316310P 2010-05-10 2010-05-10
US36562710P 2010-07-19 2010-07-19
US41328710P 2010-11-12 2010-11-12
PCT/US2011/035775 WO2011143124A2 (en) 2010-05-10 2011-05-09 Endoribonuclease compositions and methods of use thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201291024A1 EA201291024A1 (ru) 2013-11-29
EA024121B1 true EA024121B1 (ru) 2016-08-31
EA024121B9 EA024121B9 (ru) 2017-01-30

Family

ID=44914921

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201291024A EA024121B9 (ru) 2010-05-10 2011-05-09 Композиции эндорибонуклеаз и способы их использования

Country Status (14)

Country Link
US (3) US9115348B2 (ru)
EP (2) EP2569425B1 (ru)
JP (1) JP5926242B2 (ru)
KR (1) KR101867359B1 (ru)
CN (1) CN103038338B (ru)
AU (1) AU2011253222B2 (ru)
BR (1) BR112012028805A2 (ru)
CA (1) CA2798703A1 (ru)
DK (1) DK2569425T3 (ru)
EA (1) EA024121B9 (ru)
ES (1) ES2590343T3 (ru)
MX (1) MX2012013037A (ru)
SG (1) SG185481A1 (ru)
WO (1) WO2011143124A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020197436A1 (ru) 2019-03-28 2020-10-01 Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Центральный Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека Метод получения препарата высокоочищенной рекомбинантной cas нуклеазы

Families Citing this family (167)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2012013037A (es) 2010-05-10 2013-07-29 Univ California Composiciones de endorribonucleasa y metodos de uso de las mismas.
AU2012333134B2 (en) 2011-07-22 2017-05-25 John Paul Guilinger Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
DK2800811T3 (en) 2012-05-25 2017-07-17 Univ Vienna METHODS AND COMPOSITIONS FOR RNA DIRECTIVE TARGET DNA MODIFICATION AND FOR RNA DIRECTIVE MODULATION OF TRANSCRIPTION
US9102936B2 (en) 2012-06-11 2015-08-11 Agilent Technologies, Inc. Method of adaptor-dimer subtraction using a CRISPR CAS6 protein
WO2013188638A2 (en) * 2012-06-15 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Endoribonucleases and methods of use thereof
BR112014031891A2 (pt) 2012-06-19 2017-08-01 Univ Minnesota direcionamento genético nas plantas utilizando vírus de dna
JP2015527889A (ja) 2012-07-25 2015-09-24 ザ ブロード インスティテュート， インコーポレイテッド 誘導可能なｄｎａ結合タンパク質およびゲノム撹乱ツール、ならびにそれらの適用
EP2880171B1 (en) * 2012-08-03 2018-10-03 The Regents of The University of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
DE202013012610U1 (de) * 2012-10-23 2017-11-24 Toolgen, Inc. Zusammensetzung zum Spalten einer Ziel-DNA, umfassend eine für die Ziel-DNA spezifische guide-RNA und eine Cas-Protein-codierende Nukleinsäure oder ein Cas-Protein, sowie deren Verwendung
WO2014089290A1 (en) 2012-12-06 2014-06-12 Sigma-Aldrich Co. Llc Crispr-based genome modification and regulation
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
US8993233B2 (en) 2012-12-12 2015-03-31 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
EP3825401A1 (en) 2012-12-12 2021-05-26 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP2931892B1 (en) 2012-12-12 2018-09-12 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
AU2013359212B2 (en) 2012-12-12 2017-01-19 Massachusetts Institute Of Technology Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
ES2658401T3 (es) 2012-12-12 2018-03-09 The Broad Institute, Inc. Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas
ES2598115T3 (es) 2012-12-12 2017-01-25 The Broad Institute, Inc. Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias
MY170059A (en) 2012-12-17 2019-07-02 Harvard College Rna-guided human genome engineering
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
NZ712727A (en) 2013-03-14 2017-05-26 Caribou Biosciences Inc Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
KR102271292B1 (ko) 2013-03-15 2021-07-02 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 Rna-안내 게놈 편집의 특이성을 증가시키기 위한 rna-안내 foki 뉴클레아제(rfn)의 용도
US9902973B2 (en) 2013-04-11 2018-02-27 Caribou Biosciences, Inc. Methods of modifying a target nucleic acid with an argonaute
KR102512979B1 (ko) 2013-06-04 2023-03-22 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 전사 조절
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
AU2014281027A1 (en) 2013-06-17 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
CN106062197A (zh) 2013-06-17 2016-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
EP3011033B1 (en) 2013-06-17 2020-02-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
WO2014204729A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
SG11201600060VA (en) 2013-07-10 2016-02-26 Harvard College Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing
US10563225B2 (en) 2013-07-26 2020-02-18 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
BR112016003591A8 (pt) 2013-08-22 2018-01-30 Du Pont promotor u6 de polimerase iii de soja e métodos de uso
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
ES2681622T3 (es) 2013-09-18 2018-09-14 Kymab Limited Métodos, células y organismos
US20160237451A1 (en) * 2013-09-30 2016-08-18 Regents Of The University Of Minnesota Conferring resistance to geminiviruses in plants using crispr/cas systems
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
WO2015070083A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine,Inc. CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
US10787684B2 (en) 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
JP7103750B2 (ja) 2013-12-12 2022-07-20 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
WO2015089427A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes
BR112016013547A2 (pt) 2013-12-12 2017-10-03 Broad Inst Inc Composições e métodos de uso de sistemas crispr-cas em distúrbios de repetições de nucleotídeos
EP3080271B1 (en) 2013-12-12 2020-02-12 The Broad Institute, Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
CA2935032C (en) * 2013-12-26 2024-01-23 The General Hospital Corporation Multiplex guide rnas
EP3114227B1 (en) 2014-03-05 2021-07-21 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
DK3116997T3 (da) 2014-03-10 2019-08-19 Editas Medicine Inc Crispr/cas-relaterede fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af lebers kongenitale amaurose 10 (lca10)
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
EP3981876A1 (en) 2014-03-26 2022-04-13 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
AU2015280069B2 (en) 2014-06-23 2021-08-12 The General Hospital Corporation Genomewide unbiased identification of dsbs evaluated by sequencing (guide-seq)
WO2016007347A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US10435685B2 (en) 2014-08-19 2019-10-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
US9970030B2 (en) 2014-08-27 2018-05-15 Caribou Biosciences, Inc. Methods for increasing CAS9-mediated engineering efficiency
EP3191595B1 (en) 2014-09-12 2019-12-25 E. I. du Pont de Nemours and Company Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use
US10040048B1 (en) 2014-09-25 2018-08-07 Synthego Corporation Automated modular system and method for production of biopolymers
WO2016094867A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
KR20190112855A (ko) 2015-01-28 2019-10-07 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 Crispr 하이브리드 dna/rna 폴리뉴클레오티드 및 사용 방법
CA2978314A1 (en) 2015-03-03 2016-09-09 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity
US10066256B2 (en) 2015-03-17 2018-09-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection of genome editing
EP3274460A1 (en) 2015-03-27 2018-01-31 E. I. du Pont de Nemours and Company Soybean u6 small nuclear rna gene promoters and their use in constitutive expression of small rna genes in plants
CN107690480B (zh) 2015-04-24 2022-03-22 爱迪塔斯医药公司 Cas9分子/指导rna分子复合物的评价
US20180296537A1 (en) 2015-06-05 2018-10-18 Novartis Ag Methods and compositions for diagnosing, treating, and monitoring treatment of shank3 deficiency associated disorders
US20160362667A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Caribou Biosciences, Inc. CRISPR-Cas Compositions and Methods
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
MX2017016289A (es) 2015-06-18 2018-08-15 Broad Inst Inc Mutaciones de la enzima crispr que reducen los efectos fuera del blanco.
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
KR20240090567A (ko) 2015-08-28 2024-06-21 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 조작된 crispr-cas9 뉴클레아제
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
WO2017044843A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 The General Hospital Corporation Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq)
EP3356526B1 (en) 2015-09-30 2021-08-25 The General Hospital Corporation Comprehensive in vitro reporting of cleavage events by sequencing (circle-seq)
US9677090B2 (en) 2015-10-23 2017-06-13 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic-acid targeting nucleic acids
WO2017070632A2 (en) 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
MX2018005611A (es) 2015-11-03 2018-11-09 Harvard College Metodo y aparato para la formacion de imagenes volumetricas de una matriz tridimensional que contiene acido nucleico.
SG11201803593QA (en) 2015-12-04 2018-06-28 Caribou Biosciences Inc Engineered nucleic-acid targeting nucleic acids
WO2017139309A1 (en) 2016-02-12 2017-08-17 Ceres, Inc. Methods and materials for high throughput testing of mutagenized allele combinations
WO2017165862A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency
CN116200465A (zh) 2016-04-25 2023-06-02 哈佛学院董事及会员团体 用于原位分子检测的杂交链反应方法
DK3604527T3 (da) 2016-06-02 2021-05-31 Sigma Aldrich Co Llc Anvendelse af programmerbare dna-bindingsproteiner til at forbedre målrettet genommodifikation
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
CA3032822A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating cep290 associated disease
CA3032699A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
WO2018031683A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
EP3525832A4 (en) 2016-10-14 2020-04-29 The General Hospital Corp. SITE SPECIFIC NUCLEASES WITH EPIGENETIC REGULATION
EP3526320A1 (en) 2016-10-14 2019-08-21 President and Fellows of Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
US9816093B1 (en) 2016-12-06 2017-11-14 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
KR102687373B1 (ko) 2017-03-23 2024-07-23 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제
CA3059757A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 The Broad Institute, Inc. Novel type vi crispr orthologs and systems
CN116555353A (zh) 2017-04-20 2023-08-08 E开创生物技术股份有限公司 产生基因修改的动物的方法
EP3612551B1 (en) 2017-04-21 2024-09-04 The General Hospital Corporation Variants of cpf1 (cas12a) with altered pam specificity
WO2018209158A2 (en) 2017-05-10 2018-11-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
US20200172895A1 (en) 2017-05-25 2020-06-04 The General Hospital Corporation Using split deaminases to limit unwanted off-target base editor deamination
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
SI3645719T1 (sl) 2017-06-30 2022-07-29 Inscripta, Inc., Postopki, moduli, instrumenti in sistemi za avtomatizirano obdelavo celic
EP3658573A1 (en) 2017-07-28 2020-06-03 President and Fellows of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace)
CA3073448A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
AU2018338990B2 (en) 2017-09-30 2022-06-23 Inscripta, Inc. Flow through electroporation instrumentation
WO2019075197A1 (en) 2017-10-11 2019-04-18 The General Hospital Corporation METHODS OF DETECTION OF INDIVIDUAL SITE-SPECIFIC PARASITE GENOMIC DEAMINATION BY BASE EDITING TECHNOLOGIES
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
US11661599B1 (en) 2017-12-14 2023-05-30 National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc CRISPR-Cas based system for targeting single-stranded sequences
US20190233816A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
KR20200124702A (ko) 2018-02-23 2020-11-03 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 신규한 cas9 오르소로그
CN108486098B (zh) * 2018-03-06 2021-07-06 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种用SLFN13从总RNA中纯化总mRNA的方法
AU2019236209A1 (en) 2018-03-14 2020-10-01 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2019190874A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Inscripta, Inc. Automated control of cell growth rates for induction and transformation
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
CA3097044A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 The General Hospital Corporation Sensitive in vitro assays for substrate preferences and sites of nucleic acid binding, modifying, and cleaving agents
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
US10508273B2 (en) 2018-04-24 2019-12-17 Inscripta, Inc. Methods for identifying selective binding pairs
US10227576B1 (en) 2018-06-13 2019-03-12 Caribou Biosciences, Inc. Engineered cascade components and cascade complexes
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
IL292273B2 (en) 2018-08-14 2023-10-01 Inscripta Inc Devices, modules and methods for improved detection of edited sequences in living cells
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US11965154B2 (en) 2018-08-30 2024-04-23 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
AU2019368215B2 (en) 2018-10-22 2023-05-18 Inscripta, Inc. Engineered enzymes
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
WO2020123887A2 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel crispr-cas systems for genome editing
EP3921417A4 (en) 2019-02-04 2022-11-09 The General Hospital Corporation ADENINE DNA BASE EDITOR VARIANTS WITH REDUCED OFF-TARGET RNA EDITING
WO2020191249A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020198174A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
US10837021B1 (en) 2019-06-06 2020-11-17 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
WO2020257395A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in e. coli
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
US11767524B2 (en) * 2019-09-24 2023-09-26 Abclonal Science, Inc. His-MBP tagged DNA endonuclease for facilitated enzyme removal
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
US10883095B1 (en) 2019-12-10 2021-01-05 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
KR20220118498A (ko) 2019-12-18 2022-08-25 인스크립타 인코포레이티드 핵산-가이드된 뉴클레아제 편집된 세포의 생체 내 검출을 위한 캐스케이드/dcas3 상보 검정
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
EP4096770A1 (en) 2020-01-27 2022-12-07 Inscripta, Inc. Electroporation modules and instrumentation
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
MX2022014008A (es) 2020-05-08 2023-02-09 Broad Inst Inc Métodos y composiciones para la edición simultánea de ambas cadenas de una secuencia de nucleótidos de doble cadena objetivo.
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
US11299731B1 (en) 2020-09-15 2022-04-12 Inscripta, Inc. CRISPR editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
AU2021415461A1 (en) 2021-01-04 2023-08-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
EP4373963A2 (en) 2021-07-21 2024-05-29 Montana State University Nucleic acid detection using type iii crispr complex
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
CN114410635B (zh) * 2022-03-29 2022-06-14 中国科学院天津工业生物技术研究所 威尼斯镰刀菌内源U6启动子及其基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法
CN115976080B (zh) * 2022-11-28 2024-04-19 南方医科大学南方医院 一种鉴定与人脑lncRNA互作蛋白的载体及其应用

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
ATE237694T1 (de) 1991-08-20 2003-05-15 Us Gov Health & Human Serv Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
EP0905253A3 (en) 1992-12-03 2000-11-02 Genzyme Corporation Adenoviral vector deleted of all E4-ORF except ORF6
JP3532566B2 (ja) 1993-06-24 2004-05-31 エル． グラハム，フランク 遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター
ATE314482T1 (de) 1993-10-25 2006-01-15 Canji Inc Rekombinante adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung
US5625048A (en) 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
WO1996017951A2 (en) 1994-12-09 1996-06-13 Rpms Technology Limited Identification of genes responsible for in vivo survival of microorganisms
US5958713A (en) 1995-01-31 1999-09-28 Novo Nordisk A/S Method of detecting biologically active substances by using green fluorescent protein
US5968738A (en) 1995-12-06 1999-10-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Two-reporter FACS analysis of mammalian cells using green fluorescent proteins
US6020192A (en) 1996-01-18 2000-02-01 University Of Florida Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
TW371617B (en) 1996-10-09 1999-10-11 Of Animal And Plant Health Inspection And Quarantine Council Of Agriculture Executive Yuan Bureau Method to transplant GFP into autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus for inflicting pest in an attempt to detect and flow up it existence and to improve life span against UV
US6080849A (en) 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
US6322901B1 (en) 1997-11-13 2001-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Highly luminescent color-selective nano-crystalline materials
US5990479A (en) 1997-11-25 1999-11-23 Regents Of The University Of California Organo Luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
US6207392B1 (en) 1997-11-25 2001-03-27 The Regents Of The University Of California Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
US6426513B1 (en) 1998-09-18 2002-07-30 Massachusetts Institute Of Technology Water-soluble thiol-capped nanocrystals
US6251303B1 (en) 1998-09-18 2001-06-26 Massachusetts Institute Of Technology Water-soluble fluorescent nanocrystals
US6306610B1 (en) 1998-09-18 2001-10-23 Massachusetts Institute Of Technology Biological applications of quantum dots
US5985577A (en) 1998-10-14 1999-11-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Protein conjugates containing multimers of green fluorescent protein
US6325144B1 (en) 2000-06-09 2001-12-04 Baker Hughes, Inc. Inflatable packer with feed-thru conduits
US6649138B2 (en) 2000-10-13 2003-11-18 Quantum Dot Corporation Surface-modified semiconductive and metallic nanoparticles having enhanced dispersibility in aqueous media
US6576291B2 (en) 2000-12-08 2003-06-10 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of nanocrystallites
GB0105924D0 (en) 2001-03-09 2001-04-25 Microscience Ltd Promoter
AU2002306849A1 (en) 2001-03-21 2002-10-08 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes in microorganisms
EP1409240B1 (en) 2001-07-20 2012-05-09 Life Technologies Corporation Luminescent nanoparticles and methods for their preparation
US7268229B2 (en) 2001-11-02 2007-09-11 Promega Corporation Compounds to co-localize luminophores with luminescent proteins
EP1639086A4 (en) 2003-06-13 2007-07-11 Univ New Jersey Med RNA INTERFERASES AND METHODS OF USE
WO2005074986A2 (en) 2004-02-10 2005-08-18 Genobiotix Aps Bioactive species capable of interfering with a microbial toxin-antitoxin complex and methods for evaluation and use of said bioactive species
US7919277B2 (en) 2004-04-28 2011-04-05 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains
JPWO2006123537A1 (ja) * 2005-05-16 2008-12-25 タカラバイオ株式会社 新規なエンドリボヌクレア−ゼ
WO2007013265A1 (ja) 2005-07-26 2007-02-01 Takara Bio Inc. 新規なエンドリボヌクレアーゼ
CA2961849C (en) 2005-08-26 2022-08-02 Dupont Nutrition Biosciences Aps Use of crispr associated genes (cas)
JP4889647B2 (ja) * 2005-09-21 2012-03-07 タカラバイオ株式会社 新規なエンドリボヌクレアーゼ
ES2373586T3 (es) 2006-05-19 2012-02-06 Danisco A/S Microorganismos marcados y métodos para marcar.
US8431698B2 (en) 2007-08-29 2013-04-30 Biolume Inc. Bioluminescent endoscopy methods and compounds
WO2010011961A2 (en) * 2008-07-25 2010-01-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic rnai-like system and methods of use
US9404098B2 (en) 2008-11-06 2016-08-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for cleaving a target RNA using a Cas6 polypeptide
EP2362915B1 (en) 2008-11-07 2016-12-21 DuPont Nutrition Biosciences ApS Bifidobacteria crispr sequences
US8771766B2 (en) 2008-12-12 2014-07-08 Dupont Nutrition Biosciences Aps Genetic cluster of strains of Streptococcus thermophilus having unique rheological properties for dairy fermentation
MX2012013037A (es) 2010-05-10 2013-07-29 Univ California Composiciones de endorribonucleasa y metodos de uso de las mismas.
US20140113376A1 (en) 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
UA115772C2 (uk) 2011-12-16 2017-12-26 Таргітджин Байотекнолоджиз Лтд Композиція програмованого нуклеопротеїнового молекулярного комплексу і спосіб модифікування заданої послідовності нуклеїнової кислоти-мішені
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
EP2880171B1 (en) 2012-08-03 2018-10-03 The Regents of The University of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BELOGLAZOVA N. et al. "A novel family of sequence-specific endoribonucleases associated with the clustered regularly interspaced short palindromic repeats", Journal of Biological Chemistry, vol. 283(29), pp. 20361-20371 (15 May 2008), See the abstract; fig. 7. *
CARTE J. et al. "Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes", Genes and Development. vol. 22(24), pp. 3489-3496 (15 December 2008), See the abstract; fig. 1. *
HALE C. R. et al. "RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex", Cell. vol. 139(5), pp. 945-956 (25 November 2009), See the abstract; fig. 6. *
HAURWITZ R. E. et al. "Sequence- and Structure-specific RNA processing by a CRISPR Endonuclease", Science, vol. 329, pp. 1355-1358 (10 September 2010), See the whole document, especially fig. 1 & fig. 3. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020197436A1 (ru) 2019-03-28 2020-10-01 Федеральное Бюджетное Учреждение Науки "Центральный Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии" Федеральной Службы По Надзору В Сфере Защиты Прав Потребителей И Благополучия Человека Метод получения препарата высокоочищенной рекомбинантной cas нуклеазы

Also Published As

Publication number Publication date
MX2012013037A (es) 2013-07-29
US9708646B2 (en) 2017-07-18
EP3078753B1 (en) 2018-04-18
AU2011253222B2 (en) 2014-08-21
DK2569425T3 (en) 2016-10-03
US20170166958A1 (en) 2017-06-15
US20130130248A1 (en) 2013-05-23
KR101867359B1 (ko) 2018-07-23
EP2569425A2 (en) 2013-03-20
SG185481A1 (en) 2012-12-28
ES2590343T3 (es) 2016-11-21
JP2013528372A (ja) 2013-07-11
EP3078753A1 (en) 2016-10-12
CN103038338B (zh) 2017-03-08
WO2011143124A3 (en) 2012-04-19
US20150284697A1 (en) 2015-10-08
EA024121B9 (ru) 2017-01-30
JP5926242B2 (ja) 2016-05-25
EA201291024A1 (ru) 2013-11-29
CN103038338A (zh) 2013-04-10
US9115348B2 (en) 2015-08-25
KR20130079420A (ko) 2013-07-10
EP2569425A4 (en) 2014-03-12
WO2011143124A2 (en) 2011-11-17
CA2798703A1 (en) 2011-11-17
AU2011253222A1 (en) 2012-12-06
US9605246B2 (en) 2017-03-28
BR112012028805A2 (pt) 2019-09-24
EP2569425B1 (en) 2016-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA024121B1 (ru) Композиции эндорибонуклеаз и способы их использования
Parker et al. A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly
US11390908B2 (en) Detection of gene loci with CRISPR arrayed repeats and/or polychromatic single guide ribonucleic acids
van Gent et al. Similarities between initiation of V (D) J recombination and retroviral integration
Pellegrini The Pol α-primase complex
US9688971B2 (en) Endoribonuclease and methods of use thereof
McInerney et al. Characterization of a triple DNA polymerase replisome
Buckanovich et al. The neuronal RNA binding protein Nova-1 recognizes specific RNA targets in vitro and in vivo
Bird et al. Helicases: a unifying structural theme?
ES2901396T3 (es) Composiciones y métodos de ácidos nucleicos dirigidos a ácido nucleico
Prakash et al. The structure and function of replication protein A in DNA replication
Maltseva et al. Crosslinking of the NER damage recognition proteins XPC-HR23B, XPA and RPA to photoreactive probes that mimic DNA damages
Nüesch et al. Initiation of minute virus of mice DNA replication is regulated at the level of origin unwinding by atypical protein kinase C phosphorylation of NS1
Yao et al. Replisome structure and conformational dynamics underlie fork progression past obstacles
JP5587528B2 (ja) ｃ−Ｊｕｎ蛋白質と複合体を形成する蛋白質、及び、それをコードする核酸、ならびに、それらの利用方法
AU2014259510B2 (en) Endoribonuclease compositions and methods of use thereof
Pilsl Reconstitution of the RNA polymerase I initiation complex from recombinant initiation factors and regulation of its activity
Jagga Structural and Mechanistic Basis for Nucleocytoplasmic Shuttling of SOX Transcription Factors
Perera Unveiling the Orientation, Conformations, and Contacts of Replicative Hexameric DNA Helicases that Govern DNA Replication Dynamics
Han Interaction of the non coding RNA 7SK, a regulator of human transcription elongation, with the LaRP7 protein
Greetham Proteins that function at telomeres: genetic and biochemical investigation
Pitchai Structural Studies on the Dosage Compensation Complex from Drosophila melanogaster
Jordan Helicase-SSB interactions in recombination-dependent DNA repair and replication
JPWO2004053121A1 (ja) ｃ−Ｆｏｓ蛋白質と複合体を形成する蛋白質、及び、それをコードする核酸、ならびに、それらの利用方法

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU