WO2014125668A1 - 内在性dna配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法 - Google Patents

内在性dna配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2014125668A1
WO2014125668A1 PCT/JP2013/074107 JP2013074107W WO2014125668A1 WO 2014125668 A1 WO2014125668 A1 WO 2014125668A1 JP 2013074107 W JP2013074107 W JP 2013074107W WO 2014125668 A1 WO2014125668 A1 WO 2014125668A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
molecule
dna
foreign
genomic dna
genomic region
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/074107
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
穂高 藤井
藤田　敏次
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人大阪大学 filed Critical 国立大学法人大阪大学
Priority to US14/767,068 priority Critical patent/US11466306B2/en
Priority to PL13875109T priority patent/PL2963113T3/pl
Priority to JP2015500088A priority patent/JP5954808B2/ja
Priority to DK13875109.4T priority patent/DK2963113T3/da
Priority to ES13875109T priority patent/ES2768291T3/es
Priority to EP13875109.4A priority patent/EP2963113B1/en
Publication of WO2014125668A1 publication Critical patent/WO2014125668A1/ja
Priority to US17/823,685 priority patent/US20230046749A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection

Definitions

  • the present invention relates to a method for isolating a specific genomic region using an endogenous DNA sequence-specific binding molecule.
  • the specific genomic region is retained while maintaining the interaction state with the interacting molecule.
  • the present invention relates to a method for isolation using a sex DNA sequence-specific binding molecule.
  • Biochemical and molecular biological analysis of the chromatin region is very important for understanding the molecular mechanism of genome function expression.
  • biochemical properties of the chromatin region have not been fully analyzed. This is thought to be due to the limited sampling methods available for biochemical and molecular biological analysis of the chromatin region.
  • Chromatin immunoprecipitation method The chromatin immunoprecipitation method (hereinafter referred to as “ChIP method”) immunoprecipitates a specific genomic region using an antibody against a known DNA-binding protein and isolates the region.
  • ChIP method has a limitation that it cannot be used without information on the DNA-binding protein.
  • DNA-binding proteins bind to multiple regions of genomic DNA, various genomic regions are mixed in the immunoprecipitate and it is difficult to isolate only a specific genomic region by the ChIP method. Have a problem.
  • the ChIP method has a problem that a genomic region to which a known DNA binding protein does not bind cannot be isolated.
  • 3C method Chromosome Conformation Capture method
  • a genomic region interacting with a specific genomic region can be identified (see Non-Patent Documents 3 to 5).
  • the enzyme reaction with restriction enzymes and DNA ligase must be performed under non-optimal conditions under cross-linking (cross-linking), so there is a high possibility of detecting non-physiological interactions.
  • restriction enzyme treatment is incomplete under cross-linking, so that the region adjacent to the target genome region is amplified by PCR and the background becomes extremely high, which makes it difficult to detect unknown interactions.
  • FISH method Fluorescence in situ Hybridization method
  • PICh method Proteomics of Isolated Chromatin segments method
  • the PICh method is a method of isolating a specific genomic region using a specific nucleic acid probe, and it has been shown that a telomeric region consisting of a large number of repetitive sequences complementary to a probe can be isolated (Non-patent literature). 6).
  • the PICh method requires annealing of the nucleic acid probe and the target genomic region under cross-linking, and it has not been shown whether or not it is possible to isolate a specific genomic region with a low copy number or one copy.
  • Non-Patent Document 7 describes an attempt to isolate a specific genomic region by affinity purification.
  • the cells used are yeast and are not applied to higher eukaryotic cells.
  • a specific genomic region is cut out using the Cre-loxP system, but this operation may change the chromatin structure.
  • cross-linking with formaldehyde cannot be performed, molecules such as proteins and DNA bound in the purification process may be dissociated.
  • iChIP method This is a method developed by the present inventors (see Patent Document 1, Non-Patent Documents 8 and 9).
  • the following operation is performed. (1) Insert a recognition sequence for an exogenous DNA-binding molecule into a region near the target genome region of the cell to be analyzed. (2) A fusion molecule between a DNA binding domain of an exogenous DNA binding molecule and a tag recognized by an existing antibody or other protein is expressed in a cell to be analyzed. (3) If necessary, cross-link the cells with formaldehyde. This operation crosslinks proteins, RNA, DNA, and other molecules that interact with the target genomic region.
  • This operation also crosslinks the tagged foreign DNA-binding molecule and the inserted recognition sequence.
  • the cells are disrupted, and the cross-linked DNA is fragmented by treatment with a DNA cleaving enzyme such as a restriction enzyme or ultrasonic treatment.
  • a DNA cleaving enzyme such as a restriction enzyme or ultrasonic treatment.
  • the complex containing the tagged foreign DNA-binding molecule is precipitated using a carrier on which an antibody or protein that recognizes the tag is immobilized.
  • (6) Analyze molecules interacting with the target genomic region in the precipitated complex.
  • the problem with the iChIP method is that it takes time to insert the recognition sequence of the foreign DNA-binding molecule in the vicinity of the target genomic region of the analysis target cell, and the insertion of the recognition sequence may affect the interaction. Can not be excluded.
  • the present invention does not require an operation for inserting a recognition sequence of a foreign DNA-binding molecule into the vicinity of the target genomic region of the analysis target cell, and utilizes an endogenous DNA sequence in or near the target genomic region of the analysis target cell. It is an object of the present invention to provide a method capable of specifically isolating an arbitrary genomic region while maintaining an interaction state with interacting molecules.
  • a method for isolating a specific genomic region while maintaining an interaction state with an interacting molecule comprising the following steps (A) and (B): Isolation method.
  • the step [2] further comprising the step of: (C) a step of maintaining the interaction state between the genomic DNA and the molecule interacting with the genomic DNA.
  • a method for isolating a specific genomic region as described.
  • Step 1 Contacting the exogenous molecule with genomic DNA in the cell
  • Step 2 Fragmenting the genomic DNA in the cell that maintains the interaction state with the interacting molecule 3: A step of binding a molecule that specifically binds to the foreign molecule to a genomic DNA fragment to which the foreign molecule is bound to form a complex, and recovering the complex
  • the foreign molecule Is a fusion molecule comprising one or more tag sequences, [5], the method for isolating a specific genomic region according to [5] above.
  • [7] The method for isolating a specific genomic region according to [5] or [6] above, wherein the foreign molecule is a fusion molecule containing a nuclear translocation signal.
  • Step I Fragmentation of genomic DNA retaining an interaction state with interacting molecules
  • Step II Contacting the foreign molecule with fragmented genomic DNA
  • Step III The step [10] of recovering a genomic DNA fragment bound to a foreign molecule
  • the foreign molecule immobilized on a carrier is brought into contact with the fragmented genomic DNA
  • an arbitrary genomic region can be specifically identified while maintaining an interaction state with an interacting molecule using an endogenous DNA sequence in or near a target genomic region of a cell to be analyzed. It can be isolated.
  • the method for isolating a specific genomic region of the present invention uses an endogenous DNA sequence in or near a target genomic region of a cell to be analyzed, and does not insert a recognition sequence for a foreign DNA-binding molecule. The influence on the interaction can be eliminated. Therefore, the isolated genomic region is very useful as a sample for analyzing the molecular mechanism of genomic functional expression.
  • FIG. 3 is a view showing the expression level of each protein by flow cytometry. It is the figure which showed that the genomic DNA of the telomere area
  • (A) and (B) are the results of confirming reproducibility. It is a figure which shows the result of having detected the telomerase RNA contained in the isolated telomere region by RT-PCR. It is the figure which showed the expression level of each protein in the TAL effector protein (3xFN-Sox2-TAL) expression cell couple
  • the figure shows that the genomic DNA of the human Sox2 gene promoter region could be isolated using TAL effector protein (3 ⁇ FN-Sox2-TAL) that binds to the DNA sequence of the human Sox2 gene promoter region. is there. It is a figure which shows the scheme of one Embodiment (The isolation method of a specific genome area
  • TAL effector protein 3 ⁇ FN-Sox2-TAL
  • the human IRF-1 locus Using gRNA (gRNA-hIRF-1 # 12) corresponding to the sequence present in the human IRF-1 locus and dCas9 protein with 3 ⁇ FLAG tag (3 ⁇ F-dCas9), the human IRF-1 locus It is the figure which showed that genomic DNA was able to be isolated by real-time PCR. In order to identify the proteins contained in the isolated IRF-1 region by mass spectrometry, the isolated IRF-1 region is subjected to SDS-PAGE, electrophoresed until the sample enters the gel about 1.0 cm, and Coomassie Brilliant. It is the figure which showed dividing into 5 after carrying out blue dyeing
  • the method for isolating a specific genomic region of the present invention (hereinafter referred to as “the method of the present invention”) only needs to include the following steps (A) and (B).
  • the order of the process steps (A) and (B) for contacting is not limited, and the process (A) and the process (B) may be performed first, and the process (B) and the process (A) are performed first. You may go.
  • the method of the present invention preferably further includes the following step (C).
  • (C) It is preferable to perform the process step (C) which performs the process which maintains the interaction state of genomic DNA and the molecule
  • the exogenous molecule is not particularly limited as long as it is an exogenous molecule having a property of binding to a specific endogenous DNA sequence in genomic DNA.
  • exogenous DNA-binding protein exogenous nucleic acid, exogenous protein-nucleic acid complex and the like can be preferably used.
  • the foreign DNA-binding protein is preferably a protein that can be designed by associating the amino acid sequence of the protein with the base sequence of the target DNA.
  • exogenous DNA-binding proteins include zinc finger proteins and TAL effector proteins.
  • exogenous nucleic acids include DNA aptamers and RNA aptamers.
  • the foreign protein-nucleic acid complex include a complex of inactive Cas9 protein and gRNA.
  • Zinc finger proteins are known to be modifiable to recognize any DNA base sequence (eg, Beerli et al., (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo et al. , (2001) Ann. Rev. Biochem. 70: 313-340; Isalan et al., (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al., (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 632 -637; see Choo et al., (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 411-416).
  • the modified zinc finger protein can have a novel binding specificity that a natural zinc finger protein does not have.
  • the modification method is not particularly limited, and examples thereof include a method of joining individual zinc finger modules having known specificities. Specificity selection methods using phage display, two-hybrid systems, etc. are described in US Pat. No. 5,789,538; US Pat. No. 5,925,523; US Pat. No. 6,007,988; US Pat. No. 6,013,453; US Pat. No. 6,410,248; US Pat. U.S. Patent No. 6,200,759; U.S. Patent No. 6,242,568; International Publication WO98 / 37186; International Publication WO98 / 53057; International Publication WO00 / 27878; International Publication WO01 / 88197, British Patent No. 2,338,237, and the like.
  • TAL effector protein is a protein isolated from the phytopathogenic bacterium Zanthomonas.
  • the DNA binding domain of the TAL effector protein has an almost complete tandem repeat structure in which one unit consists of about 34 amino acids.
  • the 12th and 13th amino acids of the unit change frequently and are called RVD (repeat variable diresidue). Differences in RVD determine DNA base recognition specificity.
  • RVD repeat variable diresidue
  • Differences in RVD determine DNA base recognition specificity.
  • the exogenous nucleic acid can be obtained, for example, by affinity-purifying a molecular species that binds to a target genomic DNA sequence from a random nucleic acid sequence library, and concentrating and selecting using a PCR method or the like. It is also possible to further improve the affinity with the target genomic DNA sequence by introducing an appropriate mutation into the nucleic acid thus selected.
  • the exogenous protein-nucleic acid complex is preferably a complex of inactive Cas9 protein and gRNA.
  • Cas9 protein is an enzyme derived from bacteria and archaea, and cleaves a specific sequence of the RNA under the RNA guide (CRISPR system).
  • Inactive Cas9 is a Cas9 mutant lacking DNA-cleaving activity and has the property of binding to a complementary DNA sequence under the RNA guide (Jinek et al., (2012) Science, 337: 816). -821). Therefore, a complex of RNA containing a sequence complementary to a target DNA sequence and inactive Cas9 is suitable as a foreign molecule used in the method of the present invention.
  • a DNA sequence existing in or near the genomic region to be isolated may be selected. It is preferable that the DNA sequence to be selected exists only in or near the genomic region to be isolated and does not exist on any other genomic DNA. May be.
  • the method for bringing the foreign molecule and genomic DNA into contact in the step (B) is not particularly limited. You may make it contact within the nucleus of a cell, and you may make contact after extracting the genomic DNA of the state which maintained the interaction state with the molecule
  • the fragmentation of the genomic DNA in the step (A) is performed to generate a genomic DNA fragment of an appropriate size that can contain the target genomic region.
  • the genomic DNA fragmentation methods include, for example, digestion of genomic DNA with restriction enzymes, partial digestion (partial cleavage) of genomic DNA with a DNA degrading enzyme (endonuclease), and physical treatment by sonication. And the like.
  • a restriction enzyme it is preferable to select a restriction enzyme that does not cut the inside of the genomic region to be isolated and can be cut at a position that does not contain as much portions as possible other than the target genomic region.
  • a DNA degrading enzyme enzyme
  • sonication it is preferable to determine in advance the treatment conditions for cutting into fragments slightly larger than the size of the genomic region to be isolated.
  • fragmentation of genomic DNA is performed in a state where the interaction state with the molecule with which the genomic DNA interacts is maintained. Therefore, before fragmentation of genomic DNA, it is preferable to perform a treatment (step (C)) for maintaining the interaction state between genomic DNA and molecules interacting with the genomic DNA as necessary.
  • the treatment for maintaining the interaction state is not particularly limited, but it is preferable that the interaction state can be released as necessary so that the interacting molecules can be separated, purified and used for analysis later.
  • An example of a preferable treatment is a crosslinking treatment.
  • An example of a preferable crosslinking agent used for the crosslinking treatment is formaldehyde.
  • the method of the present invention only needs to include the following steps 1 to 3.
  • the method of the present invention it is possible to isolate a specific genomic region while maintaining an interaction state with interacting molecules.
  • steps other than steps 1 to 3 may be included, and the content is not limited.
  • the analysis object cell of 1st Embodiment is a living cell.
  • Step 1 A step of bringing a foreign molecule that binds to a specific endogenous DNA sequence in genomic DNA into contact with a genomic DNA in a cell
  • Step 2 An interaction state between interacting molecules is maintained
  • Step 3 A molecule that specifically binds to the foreign molecule is bound to a genomic DNA fragment to which the foreign molecule is bound to form a complex, and the complex.
  • Step 1 is a step in which an exogenous molecule that binds to a specific endogenous DNA sequence in genomic DNA is brought into contact with genomic DNA in the cell.
  • the foreign molecule is preferably a fusion molecule containing one or more tag sequences.
  • a foreign molecule contains a tag sequence, a molecule that specifically binds to the foreign molecule can be easily obtained.
  • the tag sequence is not particularly limited, and can be appropriately selected from known tag sequences. Specific examples include a histidine tag, a FLAG tag, a Strep tag, a calmodulin-binding peptide, a GST tag, an MBP tag, a Halo tag, and an HA tag.
  • the fusion molecule of the exogenous molecule and the tag sequence may contain two or more types of tag sequences. Two or more types of tag sequences may be directly linked, or may be linked via a protease recognition sequence or a spacer sequence.
  • the protease recognition sequence for linking the tag sequence can be used by appropriately selecting a sequence recognized by a protease usually used for cleavage of the tag sequence.
  • proteases used for cleaving tag sequences include tobacco etch virus (TEV) protease, human rhinovirus (HRV) protease, enterokinase (EK), thrombin (Tb), and factor Xa (Xa). ing.
  • a fusion molecule containing a nuclear translocation signal When using eukaryotic cells as analysis target cells, it is preferable to use a fusion molecule containing a nuclear translocation signal.
  • the fusion molecule When the fusion molecule has a nuclear translocation signal, it can translocate into the nucleus and come into contact with genomic DNA.
  • the nuclear translocation signal may be appropriately selected from known nuclear translocation signals. Specific examples include SV40T antigen nuclear translocation signal, c-Myc nuclear translocation signal, p53 nuclear translocation signal, and NF- ⁇ Bp50 nuclear translocation signal.
  • the exogenous molecule when the exogenous molecule is a protein, for example, the exogenous molecule can be produced as a recombinant protein by a known gene recombination technique. That is, DNA encoding a foreign protein may be inserted into a known expression vector, the obtained expression vector introduced into an appropriate host cell for expression, and purified by a known method.
  • the exogenous protein is a fusion protein, a DNA encoding each protein to be fused is appropriately linked to prepare a fusion DNA, which is inserted into an expression vector.
  • the exogenous molecule is a nucleic acid
  • the nucleic acid can be produced by, for example, a known chemical synthesis method, PCR method, in vitro transcription method, reverse transcription method, transcription from a gene incorporated into a cell, or the like.
  • a known chemical synthesis method can be used.
  • the method for bringing the foreign molecule into contact with the genomic DNA in the cell is not particularly limited.
  • the foreign protein or foreign nucleic acid obtained by using a known gene recombination technique as described above, microinjection examples thereof include a method of introduction into a cell to be analyzed by electroporation, lipofection, or the like.
  • a protein transduction domain fused with an amino acid sequence capable of binding to the foreign molecule can be prepared, mixed with the foreign molecule, and introduced into the cell to be analyzed. Is possible.
  • exogenous molecules may be expressed in cells.
  • an analysis target cell may be used as a host cell, and an expression vector capable of expressing a foreign molecule in the cell may be prepared and introduced.
  • the expressed foreign molecule can contact genomic DNA in the cytoplasm.
  • the host is a eukaryotic cell
  • the expressed foreign molecule can be transferred from the cytoplasm to the nucleus and contacted with genomic DNA by expressing a fusion molecule containing a nuclear translocation signal.
  • the foreign molecule can be brought into contact with intracellular genomic DNA.
  • An exogenous molecule in contact with the genomic DNA can bind to the target endogenous DNA sequence.
  • Step 2 is a step of fragmenting the genomic DNA in the cell that maintains the interaction state with the interacting molecule.
  • step 2 it is preferable to perform a process for maintaining the interaction state between the genomic DNA and the molecule interacting with the genomic DNA.
  • the process 2 May be performed.
  • Genomic DNA interacts with DNA-binding proteins such as transcription factors, nucleic acids such as DNA and RNA, and other molecules according to the cell cycle and external stimuli. It is preferable to carry out a treatment for maintaining the interaction state or a fragmentation treatment of genomic DNA. Moreover, you may give a stimulus to a cell as needed before performing these processes.
  • Step 2 generates a DNA fragment to which the foreign molecule is bound and a DNA fragment to which the foreign molecule is not bound.
  • Process 3 Step 3 is a step of binding a molecule that specifically binds to the foreign molecule to a DNA fragment to which the foreign molecule is bound to produce a complex and recovering the complex. Since the foreign molecule is bound to the genomic DNA at a specific endogenous DNA sequence that exists in or near the genomic region to be isolated, the target DNA fragment to which the foreign molecule is bound It is thought that a specific genomic region is included. Therefore, the target specific genomic region can be isolated by recovering the complex formed by the binding of the molecule that specifically binds to the foreign molecule.
  • the method used in step 3 can generate a complex of a DNA fragment containing a specific genomic region of interest bound to a foreign molecule and a molecule that specifically binds to the foreign molecule, and recovers the complex. Any method can be used as long as it is possible. For example, a method of precipitating and recovering the complex using an antibody or peptide that specifically binds to an exogenous molecule, a carrier on which nickel ions or the like are immobilized may be used.
  • the first complex is treated with a protease to cleave the protease recognition sequence, followed by a molecule that specifically binds to the second tag sequence.
  • the second complex is formed by binding to genomic DNA released from the complex of one.
  • the background is released by releasing the complex from the molecule that specifically binds to the tag sequence. It is possible to reduce. Specifically, for example, when a FLAG tag is used as the tag sequence, the complex is released from the complex bound to the anti-FLAG antibody by adding a FLAG peptide.
  • an endogenous DNA sequence that is present in or near the target genomic region of the cell to be analyzed and is targeted by a foreign molecule is determined.
  • Design a TAL effector protein that specifically binds to the determined endogenous DNA sequence An expression vector for expression of a fusion protein (3 ⁇ FN-TAL, see FIG. 1B) of this, a nuclear localization signal (NLS) sequence, and a tag sequence in which FLAG is repeated three times is prepared and analyzed. It is introduced so that it can be expressed in cells.
  • a DNA fragment to which 3 ⁇ FN-TAL is bound and a DNA fragment to which 3 ⁇ FN-TAL is not bound are generated.
  • the DNA fragment to which 3 ⁇ FN-TAL is bound binds to the anti-FLAG antibody to form a complex (immunoprecipitation complex) (see the lower part of FIG. 1C).
  • the isolated complex retains molecules that interact with the genomic region. Thus, interactions (cross-linking) can be broken and proteins, RNA, DNA, and other molecules can be purified to identify these molecules.
  • the method of the present invention only needs to include the following steps I to III.
  • the method of the present invention it is possible to isolate a specific genomic region while maintaining an interaction state with interacting molecules.
  • steps other than steps I to III may be included, and the contents thereof are not limited.
  • the analysis object cell of 2nd Embodiment is not limited to a living cell, Cells, such as a tissue specimen, are also suitable as an analysis object cell.
  • Step I Fragmentation of genomic DNA that retains its interaction state with interacting molecules
  • Step II Fragmentation with foreign molecules that bind to specific endogenous DNA sequences in genomic DNA
  • Step III for contacting the genomic DNA Step for recovering a genomic DNA fragment bound to the foreign molecule
  • Process I Step I is a step of fragmenting genomic DNA that maintains an interaction state with interacting molecules.
  • living cells When living cells are used as the analysis target, it is preferable to perform a process for maintaining the interaction state between the genomic DNA and the molecule interacting with the genomic DNA before performing Step 1, but the interaction state
  • the process 1 may be performed without performing the process of holding. Since living cells are thought to interact with different molecules depending on the cell cycle of the cell and external stimuli, etc., processing that maintains the interaction state or fragmentation of genomic DNA at the timing appropriate for the purpose of analysis It is preferable to carry out the treatment. Moreover, you may give a stimulus to a cell as needed before performing these processes.
  • the cells When cells such as tissue specimens are to be analyzed, it is considered that the interaction state with the molecule interacting with the genomic DNA is retained, so it is usually necessary to perform processing that retains the interaction state again. Is not required.
  • the cells may be lysed or disrupted or the chromatin fraction extracted using a known method before the fragmentation treatment. preferable.
  • Step II is a step of bringing a foreign molecule that binds to a specific endogenous DNA sequence in genomic DNA into contact with the fragmented genomic DNA.
  • the exogenous molecule is preferably immobilized on a carrier in advance before contacting with the fragmented genomic DNA prepared in Step I.
  • the foreign molecule may be immobilized on a carrier after contacting the foreign molecule with the fragmented genomic DNA. By immobilizing the foreign molecule on the carrier, only the DNA fragment containing the endogenous DNA sequence to which the foreign molecule binds can be bound to the carrier.
  • the foreign molecule can be produced by the method described in the first embodiment.
  • the carrier for immobilizing exogenous molecules is not particularly limited as long as it is a carrier that can immobilize proteins or nucleic acids.
  • beads, magnetic beads, disks, sticks made of materials such as glass, polyethylene, polypropylene, polyvinyl acetate, polyvinyl chloride, methacrylate, latex, agarose, cellulose, dextran, starch, dextrin, silica gel, porous ceramics , Tubes, microtiter plates, microsensor chips, microarrays and the like.
  • known methods such as physical adsorption, covalent bonding, and crosslinking can be appropriately selected and used.
  • Step III is a step of recovering a genomic DNA fragment bound to the foreign molecule. Since the foreign molecule binds to genomic DNA at a specific endogenous DNA sequence that exists in or near the genomic region to be isolated, the genomic DNA fragment bound to the foreign molecule contains the target specific genomic region. Is considered to be included. Therefore, the target specific genomic region can be isolated by recovering the genomic DNA fragment bound to the foreign molecule.
  • Steps II and III The specific method used in Steps II and III is not particularly limited.
  • a carrier on which a foreign molecule is immobilized is packed in a column, the DNA fragment prepared in Step I is passed through the column, the target genomic DNA region is bound to the foreign molecule, the column is then washed, A method of recovering by eluting the target genomic DNA region can be mentioned.
  • the DNA fragment prepared in Step I is added to a tube containing a carrier on which a foreign molecule is immobilized, and the foreign molecule and the target genomic DNA region are brought into contact with each other by a stirring operation, and then the carrier is washed.
  • a method of eluting and collecting the target genomic DNA region can be mentioned.
  • FIG. 2 shows one specific example of the second embodiment of the present invention.
  • the method of the present invention is not limited to the embodiment.
  • An example of the second embodiment of the present invention will be described below with reference to FIG. (1)
  • an endogenous DNA sequence that is present in or near a target genomic region of a cell to be analyzed and is targeted by a foreign molecule is determined.
  • a TAL effector protein that specifically binds to the determined endogenous DNA sequence is designed and obtained as a recombinant protein with a tag attached thereto.
  • the tag is, for example, HaloTag (registered trademark) manufactured by Promega.
  • the tag is a GST tag, for example. This is immobilized by affinity binding to Glutathione Sepharose 4B manufactured by GE Healthcare.
  • a stimulus is given to the analysis target cell as necessary.
  • the cells are cross-linked with a cross-linking agent such as formaldehyde as necessary. (See the upper part of FIG. 2C).
  • Cells are lysed and genomic DNA retaining the interaction state is digested with a DNA-cleaving enzyme such as a restriction enzyme and fragmented. Fragmentation may be performed by sonication. By this step, a DNA fragment containing an endogenous DNA sequence to which TAL-conjugated beads bind and a DNA fragment not containing this are generated.
  • a DNA fragment containing an endogenous DNA sequence to which TAL-conjugated beads bind binds to TAL-conjugated beads (see the lower part of FIG. 2C).
  • the target genomic region can be isolated by collecting TAL-conjugated beads. An isolated genomic region retains interacting molecules. Thus, interactions (cross-linking) can be broken and proteins, RNA, DNA, and other molecules can be purified to identify these molecules.
  • the specific genomic region isolated by the method of the present invention is very useful as a sample for analyzing the molecular mechanism of genome function expression.
  • the isolated specific genomic region retains the interaction state of molecules (protein, DNA, RNA, etc.) interacting with genomic DNA. It is possible to estimate the function, and it can be expected to make a great contribution to the analysis of the molecular mechanism of genomic function expression.
  • Identification of molecules interacting in the isolated specific genomic region may be performed by appropriately combining known methods, and is not particularly limited. For example, it can be performed by releasing the retention of the interaction state, separating and purifying interacting molecules, and applying a known identification method. If the treatment to maintain the interaction state is a crosslinking treatment using formaldehyde, add a high-concentration salt solution (5M NaCl solution, etc.) and incubate at an appropriate temperature for an appropriate time (eg, at about 65 ° C overnight). By doing so, crosslinking can be released.
  • a crosslinking treatment using formaldehyde add a high-concentration salt solution (5M NaCl solution, etc.) and incubate at an appropriate temperature for an appropriate time (eg, at about 65 ° C overnight).
  • Known identification methods include, for example, mass spectrometry, immunoblotting, ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) when the target is a protein, and base sequences, for example, when the target is DNA or RNA. Analysis, microarray analysis, PCR (polymerase chain reaction) and the like.
  • Example 1 Isolation of telomere region
  • TTAGGG TAL effector protein that recognizes telomere repeat
  • a DNA encoding Telomere-TAL that binds to a 19-mer double-stranded DNA (TAGGGTTAGGGTTAGGGTT: SEQ ID NO: 1) containing telomeric repeats of TAGGGTTAGGGTTAGGGTT (SEQ ID NO: 1) was synthesized. Synthesis was outsourced to Life Technologies.
  • Retroviral vector 3 ⁇ FN-Tel-TAL / pMXs-puro expressing protein 3 ⁇ FN-Tel-TAL (SEQ ID NO: 2) fused to Telomere-TAL with 3 ⁇ FLAG tag and nuclear localization signal (NLS) Then, it was infected with the mouse blood cell line Ba / F3, and only infected cells were selected by puromycin selection.
  • the amino acid sequence of 3 ⁇ FN-Tel-TAL protein is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Negative control cells were prepared as follows. Retroviral vector 3 ⁇ FNLDD / pMXs- expressing 3 ⁇ FNLDD (Fujita and Fujii. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012)), a fusion protein consisting of 3 ⁇ FLAG tag, NLS and bacterial LexA protein Puro was infected into Ba / F3 cells, and only infected cells were selected by puromycin selection.
  • nucleolysis buffer (10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 1% Trion X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.5% lauroylsarcosine salt, protease inhibitor cocktail) was suspended on ice for 10 minutes while vortexing every 2-3 minutes. After centrifugation (2.0 krpm, 8 minutes, 4 ° C.), the supernatant was discarded, and the pellet washed with ice-cold PBS was used as a chromatin fraction.
  • 160 ⁇ L (equivalent to 4 ⁇ 10 6 cells) was added with 240 ⁇ L of lysis buffer 3, 50 ⁇ L of lysis buffer 3 containing 10% Triton X-100, and 50 ⁇ L of 10 ⁇ protease inhibitor solution to make 500 ⁇ L.
  • a pre-clear operation was performed using Dynabeads to which control IgG was bound to remove non-specific binding substances.
  • immunoprecipitation was performed using Dynabeads to which an anti-FLAG antibody M2 (manufactured by Sigma-Aldrich, anti-FLAG M2, F1804) was bound.
  • the immunoprecipitate complex was suspended in 300 ⁇ L of TE, subjected to RNase A and proteinase K treatment after cross-linking removal, and then purified by phenol / chloroform treatment.
  • the obtained DNA was used for Southern blot analysis.
  • Roche's Telo TAGGG Telomerase Length Assay kit (12209136001) was used.
  • FIGS. 4 (A) and (B) The results of Southern blot analysis are shown in FIGS. 4 (A) and (B).
  • (A) and (B) are the results of confirming reproducibility.
  • telomeric DNA was detected from the immunoprecipitate complex only when 3 ⁇ FN-Tel-TAL was used in the two types of immunoprecipitated samples. It was. From this result, it was revealed that the telomeric region can be recovered by immunoprecipitation using 3 ⁇ FN-Tel-TAL.
  • Proteins detected in relatively large amounts in 3 ⁇ FN-Tel-TAL compared to 3 ⁇ FNLDD include known telomere-binding proteins, proteins known to bind to other telomere-binding proteins, and genetics Many proteins that were shown to be involved in telomere function from statistical analysis were included (see Table 1). From these results, it was shown that a protein that specifically binds to a sequence of a specific genomic region can be isolated as a chromatin complex and identified by mass spectrometry by the method of the present invention.
  • RNA contained in the isolated telomere region (i) An immunoprecipitate was obtained in the same manner as in the above (a) to (e). RNasin Plus (Promega) was added to all buffers. After Proteinase K treatment, RNA was purified using Isogen II (Nippon Gene). (j) Next, RT-PCR was performed using TITANIUM One-Step RT-PCR (Clontech) to try to detect telomerase RNA.
  • Primers used for RT-PCR were 5'-CCGGCGCCCCGCGGCTGACAGAG-3 '(SEQ ID NO: 3) (for reverse transcription), 5'-GCTGTGGGTTCTGGTCTTTTGTTC-3' (SEQ ID NO: 4), 5'-GCGGCAGCGGAGTCCTAAG-3 '(SEQ ID NO: 5 ).
  • RNA that specifically binds to the sequence of a specific genomic region can be isolated as a chromatin complex and quantified by RT-PCR by the method of the present invention.
  • Example 2 Isolation of Sox2 gene promoter region
  • NLS nuclear translocation signal
  • DNA encoding a TAL effector protein that recognizes the base sequence (TCTTACTTATAAC, SEQ ID NO: 7) present in the human KLF4 gene promoter region and the base sequence (ACCACTCACTATA, SEQ ID NO: 8) present in the cytomegavirus promoter region )
  • DNA encoding TAL effector proteins are purchased from Addgene, and the same operation is performed to express each protein (3 ⁇ FN-KLF4-TAL, 3 ⁇ FN-CMV-TAL8). Cells were made.
  • each of these TAL effector proteins was detected by Western blotting using an antibody against FLAG tag (Sigma-Aldrich, anti-FLAG M2, F1804). The results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 6, the expression of the TAL effector protein was almost the same.
  • Primers used for real-time PCR were 5′-ATTGGTCGCTAGAAACCCATTTATT-3 ′ (SEQ ID NO: 9) and 5′-CTGCCTTGACAACTCCTGATACTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 10), and 3 ⁇ FN-Sox2-TAL in the human Sox2 gene promoter region. It was designed to sandwich the recognition sequence (TTATTCCCTGACA, SEQ ID NO: 6) (see FIG. 7).
  • Example 3 Isolation of IRF-1 locus using inactive Cas9 protein and RNA complex (CRISPR system)]
  • CRISPR system The scheme of this example is shown in FIG. (1) Preparation of CRISPR system for analysis
  • a plasmid encoding a Cas9 D10A mutant containing a nuclear translocation signal derived from SV40 T antigen was purchased from Addgene (Addgene # 41816). Based on this, the H840A mutation was introduced to prepare a Cas9 mutant (dCas9) having no enzyme activity.
  • the coding sequence of dCas9 was incorporated into p3XFLAG-CMV-7.1 (Sigma-Aldrich) to prepare a vector 3 ⁇ F-dCas9 / pCMV-7.1 that expresses a 3 ⁇ FLAG-tagged dCas9 protein.
  • Human fetal kidney-derived 293T cells were transiently transfected with 3 ⁇ F-dCas9 / pCMV-7.1 to express 3 ⁇ F-dCas9.
  • 3 ⁇ FNLDD / pCMV-7.1 was transiently transfected into 293T cells and compared with those in which 3 ⁇ F-dCas9 was expressed.
  • Nuclear extracts were prepared from each cell, and 3xF-dCas9 expression and 3xFNLDD expression were detected by Western blot using an antibody against the FLAG tag (Sigma-Aldrich, anti-FLAG M2, F1804). did. The results are shown in FIG. In the figure, (-) represents only host cells. It can be seen from the lower CBB stained image that the sample amount in each lane is the same. From the results of Western blotting, the expression of 3 ⁇ F-dCas9 and the expression of 3 ⁇ FNLDD were comparable.
  • an expression vector for gRNA corresponding to the 5′-CCGGGGGCGCTGGGCTGTCCCGG-3 ′ sequence (SEQ ID NO: 11) present in the human IRF-1 locus is constructed according to Mali et al., Science (2013) 339: 823-826 did.
  • oligonucleotides 5'-TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCGGGGGCGCTGGGCTGTCC-3 '(SEQ ID NO: 12) and 5'-GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGGACAGCCCAGCGCCCCCGCGC-3' (SEQ ID NO: 13) are annealed using Phusion Polymerase (New England Biolabs 100 Double-stranded DNA fragments were synthesized. This fragment was purified by agarose electrophoresis and ligated with a gRNA cloning vector (Addgene # 41824) using a Gibson assembly kit (New England Biolabs) to express gRNA-hIRF-1 # 12 Was made.
  • the primers used for real-time PCR were 5′-CGCCTGCGTTCGGGAGATATAC-3 ′ (SEQ ID NO: 14) and 5′-CTGTCCTCTCACTCCGCCTTGT-3 ′ (SEQ ID NO: 15), which were designed near the target DNA sequence of the human IRF-1 locus. .
  • primers of SEQ ID NOs: 9 and 10 were used for quantification of the Sox2 locus, which is an irrelevant region.
  • the detected proteins contained many known chromatin-constituting proteins such as histones, histone-binding proteins, metabolic enzyme proteins, RNA helicases and the like (see Table 2). From this result, it was shown that the protein that binds to the sequence of a specific genomic region can be isolated as a chromatin complex and identified by mass spectrometry by the method of the present invention.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　（Ａ）相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程、および（Ｂ）ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、ゲノムDNAとを接触させる工程を含む方法により、解析対象細胞の標的ゲノム領域近傍領域へ外来性DNA結合分子の認識配列を挿入する操作を必要とせず、解析対象細胞の標的ゲノム領域内または近傍の内在性DNA配列を利用して、相互作用している分子との相互作用状を保持したまま、任意のゲノム領域を特異的に単離することができる。

Description

内在性DNA配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法
　本発明は、内在性DNA配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法に関するものであり、特に、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま、特定ゲノム領域を、内在性DNA配列特異的結合分子を用いて単離する方法に関するものである。
　クロマチン領域の生化学的および分子生物学的解析は、ゲノム機能発現の分子機構を理解するために非常に重要である。しかし、未だクロマチン領域の生化学的な性質は十分に解析されていない。これは、クロマチン領域の生化学的および分子生物学的解析に利用可能な試料の採取方法が制限されていることに原因があると考えられる。
　クロマチン領域の生化学的および分子生物学的解析を行うためには、ゲノムDNAおよびゲノムDNAと相互作用している分子の相互作用状態を保持した試料を解析に供することが必要である。相互作用分子との相互作用状態を保持した特定ゲノム領域を単離する方法として、以下の方法が知られている。
(i) クロマチン免疫沈降法
　クロマチン免疫沈降（chromatin immunoprecipitation）法（以下、「ChIP法」という。）は、既知のDNA結合蛋白質に対する抗体を用いて特定ゲノム領域を免疫沈降させ、当該領域を単離する方法である（非特許文献１、２参照）。したがって、ChIP法は、DNA結合蛋白質に関する情報がなければ使用することができないという制限がある。また、一般に、DNA結合蛋白質はゲノムDNAの複数の領域に結合するため、免疫沈降物中にはいろいろなゲノム領域が混在しており、ChIP法によって特定ゲノム領域のみを単離することは難しいという問題を有している。さらに、ChIP法では、既知のDNA結合蛋白質が結合しないゲノム領域を単離できないという問題がある。
(ii) Chromosome Conformation Capture法（以下「3C法」という。）
　3C法またはその派生法では、特定のゲノム領域と相互作用しているゲノム領域を同定することができる（非特許文献３～５参照）。しかし、3C法では、制限酵素やDNAリガーゼによる酵素反応を、クロスリンク（架橋）下という非最適条件下で行わなくてはならないため、非生理的な相互作用を検出する可能性が高いという問題がある。また、クロスリンク下では制限酵素処理が不完全になるため、標的ゲノム領域に隣接する領域がPCRで増幅されバックグラウンドが極めて高くなり、未知の相互作用の検出が難しいという問題がある。
(iii) Fluorescence in situ Hybridization法（以下、「FISH法」という。）
　FISH法単独、もしくは蛍光抗体法と組み合わせることにより、特定ゲノム領域と別のゲノム領域やRNA、蛋白質との相互作用が検出可能である。しかし、この方法は解像度が低く、また、未知の分子との相互作用は検出できない。
(iv) Proteomics of Isolated Chromatin segments法（以下「PICh法」という。）
　PICh法は、特異的な核酸プローブを用いて、特定ゲノム領域を単離する方法であり、プローブに相補的な多数の繰り返し配列からなるテロメア領域を単離できることが示されている（非特許文献６参照）。しかしながら、PICh法ではクロスリンク下での核酸プローブと標的ゲノム領域のアニーリングが必要であり、低コピー数や１コピーの特定ゲノム領域の単離が可能か否かは示されていない。
(v) 非特許文献７に記載の方法
　非特許文献７には、アフィニティー精製により特定ゲノム領域を単離しようとする試みが記載されている。しかし、用いられている細胞は、酵母であり、高等真核細胞への応用は行われていない。また、Cre-loxP系を利用して、特定ゲノム領域を切り出しているが、この操作により、クロマチン構造が変化してしまう可能性がある。加えて、ホルムアルデヒドによるクロスリンク処理を行えないため、精製の過程で結合している蛋白質やDNA等の分子が解離する可能性もある。
(vi)iChIP法
　本発明者らにより開発された方法である（特許文献１、非特許文献８、９参照）。生理的なクロマチン構造を保持したまま特定ゲノム領域を単離するために、以下の操作を行う。(1)解析対象細胞の標的ゲノム領域近傍領域へ外来性DNA結合分子の認識配列を挿入する。(2)外来性DNA結合分子のDNA結合ドメインと、既存の抗体もしくは他の蛋白質等で認識されるタグとの融合分子を、解析対象細胞に発現させる。(3)上記細胞を必要に応じてホルムアルデヒド等でクロスリンクする。この操作により、標的ゲノム領域と相互作用する蛋白質、RNA、DNAおよび他の分子がクロスリンクされる。また、この操作により、タグ付き外来性DNA結合分子と挿入された認識配列もクロスリンクされる。(4)次いで、細胞を破砕し、クロスリンクされたDNAを制限酵素等のDNA切断酵素処理または超音波処理により断片化する。(5)タグ付き外来性DNA結合分子を含んだ複合体を、タグを認識する抗体または蛋白質等を固定した担体を用いて沈降させる。(6)沈降された複合体中の標的ゲノム領域と相互作用している分子を解析する。
　iChIP法の問題点としては、解析対象細胞の標的ゲノム領域の近傍へ外来性DNA結合分子の認識配列を挿入する操作に手間がかかること、および認識配列の挿入が相互作用に影響を及ぼす可能性を排除できないことが挙げられる。
国際公開WO2011/021684号
Solomon, M.J., Larsen, P.L., Varshavsky, A., Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell (1988) 53, 937-947 Solomon, M.J., Varshavsky, A., Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 6470-6474 Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., and Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science (2002) 295, 1306-1311 Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., and de Laat, W. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nat. Genet. (2006) 38, 1348-1354 Simonis, M., Kooren, J., and de Laat, W. An evaluation of 3C-based methods to capture DNA interactions. Nat. Methods (2007) 4, 895-901 Dejardin, J., and Kingston, R.E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell (2009) 136, 175-186 Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J.S., and Kornberg, R.D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. (2003) 23, 9275-9282 Hoshino, A., and Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. (2009) 108, 446-449 Fujita, H., and Fujii, H. Direct identification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One (2011) 6, e26109
　本発明は、解析対象細胞の標的ゲノム領域の近傍へ外来性DNA結合分子の認識配列を挿入する操作を必要とせず、解析対象細胞の標的ゲノム領域内または近傍の内在性DNA配列を利用して、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま、任意のゲノム領域を特異的に単離することができる方法を提供することを課題とする。
　本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離する方法であって、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする特定ゲノム領域の単離方法。
（Ａ）相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
（Ｂ）ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、ゲノムDNAとを接触させる工程
［２］さらに、（Ｃ）ゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程を含むことを特徴とする前記［１］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［３］前記外来性分子が、外来性DNA結合蛋白質、外来性核酸または外来性蛋白質－核酸複合体であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［４］前記外来性分子が、ジンクフィンガー蛋白質、TALエフェクター蛋白質または不活性型Cas9蛋白質とガイドRNA（gRNA）の複合体であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［５］以下の工程１～３を含むことを特徴とする前記［１］～［４］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
工程１：前記外来性分子と、細胞内のゲノムDNAとを接触させる工程
工程２：相互作用している分子との相互作用状態を保持している前記細胞内のゲノムDNAを断片化する工程
工程３：前記外来性分子と特異的に結合する分子を、外来性分子が結合しているゲノムDNA断片に結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程
［６］前記外来性分子が、１種以上のタグ配列を含む融合分子であることを特徴とする前記［５］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［７］前記外来性分子が、核移行シグナルを含む融合分子であることを特徴とする前記［５］または［６］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［８］工程１において、解析対象細胞に、前記外来性分子をコードする遺伝子を導入し、当該細胞内で発現させることを特徴とする前記［５］～［７］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［９］以下の工程Ｉ～ＩＩＩを含むことを特徴とする前記［１］～［４］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
工程Ｉ：相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
工程ＩＩ：前記外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させる工程
工程ＩＩＩ：前記外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収する工程
［１０］工程ＩＩにおいて、担体に固定化された前記外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させることを特徴とする前記［９］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［１１］工程ＩＩにおいて、前記外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させた後に、前記外来性分子を担体に固定化することを特徴とする前記［９］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
　本発明によれば、解析対象細胞の標的ゲノム領域内または近傍の内在性DNA配列を利用して、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま、任意のゲノム領域を特異的に単離することができる。本発明の特定ゲノム領域の単離方法は、解析対象細胞の標的ゲノム領域内または近傍の内在性DNA配列を利用するものであり、外来性DNA結合分子の認識配列を挿入しないので、挿入配列による相互作用への影響を排除することができる。したがって、単離されたゲノム領域は、ゲノム機能発現の分子機構解析のための試料として非常に有用である。
本発明の特定ゲノム領域の単離方法の第１の実施形態を示す図である。 本発明の特定ゲノム領域の単離方法の第２の実施形態を示す図である。 テロメア配列に結合するTALエフェクター蛋白質（Telomere-TAL）に3×FLAGタグおよび核移行シグナルを融合させた蛋白質である3×FN-Tel-TALの発現細胞および対照蛋白質（3×FNLDD）発現細胞における、各蛋白質の発現レベルをフローサイトメトリーにより示した図である。 3×FN-Tel-TALを用いて、テロメア領域のゲノムDNAが単離できたことを、テロメア配列に対するプローブを用いたサザンブロット解析により示した図である。（Ａ）および（Ｂ）は再現性を確認した結果である。 単離したテロメア領域に含まれるテロメラーゼRNAを、RT-PCRにより検出した結果を示す図である。 ヒトSox2遺伝子プロモーター領域のDNA配列に結合するTALエフェクター蛋白質（3×FN-Sox2-TAL）発現細胞および２種類の対照蛋白質発現細胞における、各蛋白質の発現レベルを免疫ブロット解析により示した図である。 ヒトSox2遺伝子プロモーター領域の模式図であり、矢印はリアルタイムPCRのプライマーを表す。 ヒトSox2遺伝子プロモーター領域のDNA配列に結合するTALエフェクター蛋白質（3×FN-Sox2-TAL）を用いて、ヒトSox2遺伝子プロモーター領域のゲノムDNAが単離できたことを、リアルタイムPCRにより示した図である。 本発明の特定ゲノム領域の単離方法の一実施形態（不活性型Cas9蛋白質とgRNAの複合体（CRISPR系）を用いた特定ゲノム領域の単離方法）のスキームを示す図である。 3×FLAGタグ付きのdCas9蛋白質（3×F-dCas9）発現細胞および対照蛋白質（3×FNLDD）発現細胞における、各蛋白質の発現レベルを免疫ブロット解析により示した図である。 ヒトIRF-1遺伝子座に存在する配列に対応するgRNA（gRNA-hIRF-1 #12）と3×FLAGタグ付きのdCas9蛋白質（3×F-dCas9）を用いて、ヒトIRF-1遺伝子座のゲノムDNAが単離できたことを、リアルタイムPCRにより示した図である。 単離したIRF-1領域に含まれる蛋白質を質量分析により同定するために、単離したIRF-1領域をSDS-PAGEに供し、サンプルが1.0 cm程ゲル内に入るまで電気泳動し、クマシーブリリアントブルー染色した後、5分割することを示した図である。
〔特定ゲノム領域の単離方法〕
　本発明の特定ゲノム領域の単離方法（以下、「本発明の方法」という。）は、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むものであればよい。
（Ａ）相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
（Ｂ）ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、ゲノムDNAとを接触させる工程
工程（Ａ）および（Ｂ）の順序は限定されず、先に工程（Ａ）、後に工程（Ｂ）を行ってもよく、先に工程（Ｂ）、後に工程（Ａ）を行ってもよい。
　本発明の方法は、さらに以下の工程（Ｃ）を含むことが好ましい。
（Ｃ）ゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程
工程（Ｃ）は、工程（Ａ）より先に行うことが好ましい。
　外来性分子は、ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する性質を持つ外来性の分子であれば特に限定されない。例えば、外来性DNA結合蛋白質、外来性核酸、外来性蛋白質－核酸複合体などを好適に用いることができる。外来性DNA結合蛋白質としては、蛋白質のアミノ酸配列を標的DNAの塩基配列に関連付けて設計することが可能な蛋白質が好ましい。このような外来性DNA結合蛋白質としては、例えば、ジンクフィンガー蛋白質、TALエフェクター蛋白質などが挙げられる。外来性核酸としては、DNAアプタマー、RNAアプタマーなどが挙げられる。外来性蛋白質－核酸複合体としては、不活性型Cas9蛋白質とgRNAの複合体などが挙げられる。
　ジンクフィンガー蛋白質は、任意のDNAの塩基配列を認識するように改変可能であることが知られている（例えば、Beerli et al., (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al., (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al., (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al., (2001) Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637;Choo et al.,(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416を参照）。改変されたジンクフィンガー蛋白質は、天然のジンクフィンガー蛋白質が持たない新規な結合特異性を持つことができる。改変する方法は特に限定されないが、例えば既知の特異性を持つ個々のジンクフィンガーモジュールをつなぎ合わせる方法が挙げられる。
　ファージディスプレイやツーハイブリッドシステム等を用いる特異性の選択方法は、米国特許第5,789,538号；米国特許第5,925,523号；米国特許第6,007,988号；米国特許第6,013,453号；米国特許第6,410,248号；米国特許第6,140,466号；米国特許第6,200,759号；米国特許第6,242,568号；国際公開WO98/37186；国際公開WO98/53057；国際公開WO00/27878；国際公開WO01/88197、英国特許第2,338,237号等に開示されている。
　TALエフェクター蛋白質は、植物病原細菌ザントモナス属から単離された蛋白質である。TALエフェクター蛋白質のDNA結合ドメインは、１つのユニットが約３４アミノ酸からなる、ほぼ完全なタンデムリピート構造を有する。ユニットの１２および１３番目のアミノ酸は高頻度に変化しておりRVD（repeat variable diresidue）と呼ばれる。RVDの違いがDNA塩基認識特異性を決定する。特定の塩基配列を認識するTALエフェクター蛋白質を作製するためには、対応するRVDを含んだユニットをつなぎ合わせればよい（Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501、Boch et al., (2009) Science 326:1509-1512、Miller et al., (2011) Nat. Biotechnol., 29:143-148を参照）。
　外来性核酸は、例えば、ランダム核酸配列ライブラリーから標的のゲノムDNA配列に結合する分子種をアフィニティー精製し、PCR法等を用いて濃縮・選別することにより取得することができる。また、こうして選別した核酸に適当な変異を導入して、標的ゲノムDNA配列との親和性を更に向上させることも可能である。
　外来性蛋白質－核酸複合体としては、不活性型Cas9蛋白質とgRNAの複合体が好ましい。Cas9蛋白質は細菌および古細菌由来の酵素で、RNAガイド下にそのRNAに特異的な配列を切断する（CRISPR系）。不活性型Cas9は、DNA切断活性を欠くCas9変異体であり、RNAガイド下にそれと相補的なDNA配列に結合する性質を有している（Jinek et al., (2012) Science, 337:816-821）。したがって、標的DNA配列と相補的な配列を含むRNAと不活性型Cas9の複合体は、本発明の方法に用いる外来分子として好適である。
　外来性分子が結合するゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列は、単離しようとするゲノム領域内またはその近傍に存在するDNA配列を選択すればよい。選択するDNA配列は、単離しようとするゲノム領域内またはその近傍のみに存在し、それ以外のゲノムDNA上に存在しないことが好ましいが、それ以外のゲノムDNA上に稀に存在するものを選択してもよい。
　工程（Ｂ）における外来性分子とゲノムDNAとを接触させる方法は特に限定されない。細胞の核内で接触させてもよく、相互作用している分子との相互作用状態を保持した状態のゲノムDNAを細胞から抽出した後に接触させてもよい。また、単離しようとするゲノム領域内またはその近傍に存在する内在性DNA配列を複数選択し、それぞれのDNA配列に結合する複数の外来性分子を接触させてもよい。複数の外来性分子を接触させて、順次精製を行うことにより、単離しようとするゲノム領域の特異性を増加させることができる。
　工程（Ａ）におけるゲノムDNAの断片化は、目的のゲノム領域を含み得る適当なサイズのゲノムDNA断片を生成させるために行われる。ゲノムDNAを断片化する処理の方法としては、例えば、制限酵素でゲノムDNAを消化する方法、DNA分解酵素（エンドヌクレアーゼ）でゲノムDNAを部分分解（部分切断）する方法、超音波処理により物理的に切断する方法などが挙げられる。
　制限酵素を用いる場合、単離しようとするゲノム領域の内部を切断せず、目的のゲノム領域以外の部分をできるだけ含まない位置で切断可能な制限酵素を選択することが好ましい。
　DNA分解酵素（エンドヌクレアーゼ）を用いる場合は、単離しようとするゲノム領域のサイズより少し大きい断片を生成する反応条件を予め決定しておくことが好ましい。
　超音波処理を行う場合は、単離しようとするゲノム領域のサイズより少し大きい断片に切断される処理条件を予め決定しておくことが好ましい。
　ゲノムDNAの断片化は、当該ゲノムDNAが相互作用している分子との相互作用状態を保持している状態で行うことが好ましい。そのため、ゲノムDNAの断片化を行う前に、必要に応じてゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理（工程（Ｃ））を行うことが好ましい。相互作用状態を保持する処理は、特に限定されないが、後に相互作用している分子を分離、精製して解析に供することができるように、相互作用状態の保持を必要に応じて解除できることが好ましい。好ましい処理としては、例えば架橋処理が挙げられる。架橋処理に用いる好ましい架橋処理剤としては、例えばホルムアルデヒドが挙げられる。
〔第１の実施形態〕
　本発明の方法は、以下の工程１～３を含むものであればよい。本発明の方法により、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離することが可能となる。相互作用状態を保持した特定ゲノム領域が単離できる限り、工程１～３以外の工程を含んでもよく、その内容は限定されない。なお、第１の実施形態の解析対象細胞は、生細胞であることが好ましい。
　工程１：ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、細胞内のゲノムDNAとを接触させる工程
　工程２：相互作用している分子との相互作用状態を保持している前記細胞内のゲノムDNAを断片化する工程
　工程３：前記外来性分子と特異的に結合する分子を、外来性分子が結合しているゲノムDNA断片に結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程
　以下、各工程順に本発明の方法を詳細に説明する。
（１）工程１
　工程１は、ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、細胞内のゲノムDNAとを接触させる工程である。
　本発明の方法を第１の実施形態で行う場合、外来性分子は１種以上のタグ配列を含む融合分子であることが好ましい。外来性分子がタグ配列を含むことにより、当該外来性分子と特異的に結合する分子を容易に入手することができる。タグ配列は特に限定されず、公知のタグ配列から適宜選択して使用することができる。具体的には、例えば、ヒスチジンタグ、FLAGタグ、Strepタグ、カルモジュリン結合ペプチド、GSTタグ、MBPタグ、Haloタグ、HAタグなどが挙げられる。
　外来性分子とタグ配列との融合分子は、２種類以上のタグ配列を含んでいてもよい。２種以上のタグ配列は直接連結されていてもよく、プロテアーゼ認識配列やスペーサー配列を介して連結されている構成としてもよい。このような構成とすることにより、当該融合分子が結合したゲノム領域を２段階以上で精製することが可能となるため、非特異的結合に基づくバックグラウンドを大幅に低減することができ、特定ゲノム領域の特異的な単離効率が大幅に向上する。
　タグ配列を連結するプロテアーゼ認識配列は、タグ配列の切断に通常用いられるプロテアーゼが認識する配列を適宜選択して用いることができる。タグ配列の切断に用いられるプロテアーゼとしては、例えば、タバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼ、ヒトライノウイルス（HRV）プロテアーゼ、エンテロキナーゼ（EK）、トロンビン（Tb）、第Xa因子（Xa）などが知られている。
　解析対象細胞として真核細胞を用いる場合には、核移行シグナルを含む融合分子とすることが好ましい。当該融合分子が核移行シグナルを有することにより、核内に移行してゲノムDNAと接触することが可能となる。核移行シグナルは公知の核移行シグナルから適宜選択すればよい。具体的には、例えば、SV40T抗原の核移行シグナル、c-Mycの核移行シグナル、p53の核移行シグナル、NF-κBp50の核移行シグナルなどが挙げられる。また、細胞内に取り込まれる性質を持つアミノ酸配列（蛋白質トランスダクションドメイン）を含む融合分子としてもよい。
　外来性分子が蛋白質である場合、例えば、公知の遺伝子組換え技術により組換え蛋白質として当該外来性分子を製造することができる。すなわち、外来性蛋白質をコードするDNAを公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入して発現させ、公知の方法で精製すればよい。外来性蛋白質が融合蛋白質の場合は、融合させる各蛋白質をコードするDNAを適宜連結して融合DNAを作製し、これを発現ベクターに挿入すればよい。
　外来性分子が核酸である場合、例えば、公知の化学合成法、PCR法、in vitro transcription法、reverse transcription法、細胞に組み込んだ遺伝子からの転写等により当該核酸を製造することができる。外来性核酸を融合分子とする場合は、公知の化学合成法を用いることができる。
　外来性分子を細胞内のゲノムDNAと接触させる方法は特に限定されず、例えば、上述のように公知の遺伝子組換え技術等を用いて得られた外来性蛋白質や外来性核酸を、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション等により、解析対象の細胞に導入する方法が挙げられる。また、外来性分子として、上記の細胞内に取り込まれる性質を持つアミノ酸配列（蛋白質トランスダクションドメイン）を含む融合分子を用いて、解析対象の細胞に直接導入することも可能である。また、外来性分子とは別に、外来性分子と結合する性質を持つアミノ酸配列を融合させた蛋白質トランスダクションドメインを作製し、これを外来性分子と混合して解析対象の細胞に導入することも可能である。
　また、外来性分子を細胞内で発現させてもよい。この場合は、解析対象細胞を宿主細胞とし、当該細胞で外来性分子を発現可能な発現ベクターを作製して導入すればよい。宿主が原核細胞の場合、発現した外来性分子は細胞質中でゲノムDNAと接触することができる。宿主が真核細胞の場合は、核移行シグナルを含む融合分子を発現させることにより、発現した外来性分子が細胞質から核に移行し、ゲノムDNAと接触することができる。また、外来性分子をコードする遺伝子が発現可能に導入されたトランスジェニック生物を用いることにより、外来性分子を細胞内のゲノムDNAと接触させることもできる。
　ゲノムDNAと接触した外来性分子は、標的の内在性DNA配列に結合することができる。
（２）工程２
　工程２は、相互作用している分子との相互作用状態を保持している前記細胞内のゲノムDNAを断片化する工程である。工程２を行う前にゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行うことが好ましいが、相互作用状態を保持する処理を行うことなく、工程２を行ってもよい。
　ゲノムDNAには、転写因子等のDNA結合蛋白質、DNA、RNAなどの核酸、その他の分子などが細胞周期や外からの刺激等に応じて相互作用しているので、解析目的に合わせたタイミングで、相互作用状態を保持する処理またはゲノムDNAの断片化処理を行うことが好ましい。また、これらの処理を行う前に、必要に応じて細胞に刺激を与えてもよい。なお、断片化処理を効率よく行うために、断片化処理の前に、公知の方法を用いて細胞を溶解または破砕またはクロマチン分画を抽出しておくことが好ましい。
　工程２により、外来性分子が結合しているDNA断片と、外来性分子が結合していないDNA断片が生成する。
（３）工程３
　工程３は、前記外来性分子と特異的に結合する分子を、外来性分子が結合しているDNA断片に結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程である。外来性分子は、単離しようとするゲノム領域内またはその近傍に存在する特定の内在性DNA配列部分でゲノムDNAと結合しているので、外来性分子が結合しているDNA断片には目的の特定ゲノム領域が含まれていると考えられる。したがって、外来性分子と特異的に結合する分子が結合して生成した複合体を回収することにより、目的の特定ゲノム領域を単離することができる。
　工程３で用いる方法は、外来性分子が結合した目的の特定ゲノム領域を含むDNA断片と、外来性分子と特異的に結合する分子との複合体を生成することができ、当該複合体を回収できる方法であれば、どのような方法であってもよい。例えば、外来性分子と特異的に結合する抗体やペプチド、ニッケルイオン等が固定された担体を用いて、複合体を沈降させて回収する方法などが挙げられる。
　外来性分子として、例えば２種類のタグ配列を含み、両タグ配列がプロテアーゼ認識配列を介して連結されている構成の融合分子を用いた場合には、第１のタグ配列と特異的に結合する分子を結合させて第１の複合体を生成した後、第１の複合体をプロテアーゼで処理してプロテアーゼ認識配列を切断し、続いて第２のタグ配列と特異的に結合する分子を、第１の複合体から遊離したゲノムDNAに結合させて第２の複合体を生成することが好ましい。２段階で複合体を生成することにより、第１のタグ配列と特異的に結合する分子や、これを固定した担体に非特異的に結合する分子がバックグラウンドとして濃縮される不都合を回避でき、特定ゲノム領域の特異的な単離効率が大幅に向上する。
　なお、２種類のタグ配列がプロテアーゼ認識配列を介して連結されている構成の外来性分子を用いない場合でも、タグ配列と特異的に結合する分子から、複合体を遊離させることによりバックグラウンドを低減させることが可能である。具体的には、例えばタグ配列としてFLAGタグを用いた場合に、FLAGペプチドを加えることにより、抗FLAG抗体と結合した複合体から複合体を遊離させる場合等が挙げられる。
　図１に従って、本発明の第１の実施形態の一つの具体例を以下に説明する。ただし、本発明の方法は、当該実施形態に限定されるものではない。
（１）図１Ａに示すように、解析対象細胞の目的のゲノム領域内またはその近傍に存在し、外来性分子の標的とする内在性DNA配列を決定する。
（２）決定した内在性DNA配列に特異的に結合するTALエフェクター蛋白質を設計する。これと核移行シグナル（NLS: Nuclear localization signal）配列およびFLAGを３回繰り返したタグ配列との融合蛋白質（3×FN-TAL、図１Ｂ参照）を発現させるための発現ベクターを作製し、解析対象細胞内で発現可能に導入する。
（３）3×FN-TALの発現ベクターを導入した解析対象細胞に対して、必要に応じで刺激を与える。単離しようとするゲノム領域においてゲノムDNAと相互作用している蛋白質、RNA、DNA、およびその他の分子の相互作用状態を保持させるために、必要に応じてホルムアルデヒド等の架橋剤で細胞を架橋処理する。もちろん、3×FN-TALは、標的の内在性DNA配列と結合している（図１Ｃ上段参照）。
（４）細胞を溶解し、相互作用状態を保持しているゲノムDNAを制限酵素等のDNA切断酵素で消化して断片化する。断片化は、超音波処理で行ってもよい。この工程により、3×FN-TALが結合しているDNA断片と、3×FN-TALが結合していないDNA断片が生成する。
（５）3×FN-TALが結合しているDNA断片は、抗FLAG抗体と結合して複合体（免疫沈降複合体）を生成する（図１Ｃ下段参照）。
（６）単離した複合体はゲノム領域と相互作用している分子を保持している。したがって、相互作用（架橋）を解除し、蛋白質、RNA、DNA、およびその他の分子を精製してこれらの分子を同定することができる。
〔第２の実施形態〕
　本発明の方法は、以下の工程Ｉ～ＩＩＩを含むものであればよい。本発明の方法により、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離することが可能となる。相互作用状態を保持した特定ゲノム領域が単離できる限り、工程Ｉ～ＩＩＩ以外の工程を含んでもよく、その内容は限定されない。なお、第２の実施形態の解析対象細胞は生細胞に限定されず、組織標本等の細胞も解析対象細胞として好適である。
工程Ｉ：相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
工程ＩＩ：ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させる工程
工程ＩＩＩ：前記外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収する工程
　以下、各工程順に本発明の方法を詳細に説明する。
（１）工程Ｉ
　工程Ｉは、相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程である。解析対象として生細胞を用いる場合には、工程１を行う前にゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行うことが好ましいが、相互作用状態を保持する処理を行うことなく、工程１を行ってもよい。生細胞は細胞の細胞周期や外からの刺激等に応じて相互作用している分子が異なると考えられるので、解析目的に合わせたタイミングで、相互作用状態を保持する処理またはゲノムDNAの断片化処理を行うことが好ましい。また、これらの処理を行う前に、必要に応じて細胞に刺激を与えてもよい。
　組織標本等の細胞を解析対象とする場合には、ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態は保持されていると考えられるので、通常改めて相互作用状態を保持する処理を行うことは要しない。
　いずれの細胞を解析対象とする場合も、断片化処理を効率よく行うために、断片化処理の前に、公知の方法を用いて細胞を溶解または破砕またはクロマチン分画を抽出しておくことが好ましい。
（２）工程ＩＩ
　工程ＩＩは、ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させる工程である。外来性分子は、工程Ｉで調製した断片化ゲノムDNAと接触させる前に、予め担体に固定化されていることが好ましい。あるいは、外来性分子と断片化ゲノムDNAと接触させた後に、外来性分子を担体に固定化してもよい。外来性分子を担体に固定化することにより、外来性分子が結合する内在性DNA配列を含むDNA断片のみを担体に結合させることができる。外来性分子は、第１の実施形態において説明した方法で製造することができる。
　外来性分子を固定化する担体は、蛋白質または核酸を固定化できる担体であれば特に限定されない。例えば、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、メタアクリレート、ラテックス、アガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、デキストリン、シリカゲル、多孔性セラミックス等の素材できたビーズ、マグネチックビーズ、ディスク、スティック、チューブ、マイクロタイタープレート、マイクロセンサーチップ、マイクロアレイ等が挙げられる。外来性分子の担体への固定化方法は、物理的吸着、共有結合、架橋等の公知の方法を適宜選択して用いることができる。
（３）工程ＩＩＩ
　工程ＩＩＩは、前記外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収する工程である。外来性分子は、単離しようとするゲノム領域内またはその近傍に存在する特定の内在性DNA配列部分でゲノムDNAと結合するので、外来性分子に結合したゲノムDNA断片には目的の特定ゲノム領域が含まれていると考えられる。したがって、外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収することにより、目的の特定ゲノム領域を単離することができる。
　工程ＩＩおよびＩＩＩで用いる具体的な方法は特に限定されない。例えば、外来性分子を固定化した担体をカラムに詰めて、ここに工程Ｉで調製したDNA断片を通し、外来性分子に目的のゲノムDNA領域を結合させた後、カラムを洗浄し、その後、目的のゲノムDNA領域を溶出させることで回収する方法が挙げられる。あるいは、外来性分子を固定化した担体を入れたチューブに工程Ｉで調整したDNA断片を加え、撹拌操作等により外来性分子と目的のゲノムDNA領域を接触させ、その後、担体を洗浄した後、目的のゲノムDNA領域を溶出して回収する方法が挙げられる。
　図２に、本発明の第２の実施形態の一つの具体例を示す。ただし、本発明の方法は、当該実施形態に限定されるものではない。以下、図２に従って、本発明の第２の実施形態の一例を説明する。
（１）図２Ａに示すように、解析対象細胞の目的のゲノム領域内またはその近傍に存在し、外来性分子の標的とする内在性DNA配列を決定する。
（２）決定した内在性DNA配列に特異的に結合するTALエフェクター蛋白質を設計し、これにタグを付けた組み換え蛋白質として取得する。タグは、例えばプロメガ社製のHaloTag（登録商標）である。これをプロメガ社製のHaloLink Magnetic Beads（商品名）に共有結合により固定化する（TAL-conjugated beads、図２Ｂ参照）。あるいは、タグは、例えばGSTタグである。これをGEヘルスケア社製のGlutathione Sepharose 4Bにアフィニティー結合により固定化する。
（３）解析対象細胞に対して、必要に応じて刺激を与える。単離しようとするゲノム領域においてゲノムDNAと相互作用している蛋白質、RNA、DNA、およびその他の分子の相互作用状態を保持させるために、必要に応じてホルムアルデヒド等の架橋剤で細胞を架橋処理する（図２Ｃ上段参照）。
（４）細胞を溶解し、相互作用状態を保持しているゲノムDNAを制限酵素等のDNA切断酵素で消化して断片化する。断片化は、超音波処理で行ってもよい。この工程により、TAL-conjugated beadsが結合する内在性DNA配列を含むDNA断片と、これを含まないDNA断片が生成する。
（５）TAL-conjugated beadsが結合する内在性DNA配列を含むDNA断片は、TAL-conjugated beadsと結合する（図２Ｃ下段参照）。
（６）TAL-conjugated beadsを回収することにより目的のゲノム領域を単離することができる。単離したゲノム領域は相互作用している分子を保持している。したがって、相互作用（架橋）を解除し、蛋白質、RNA、DNA、およびその他の分子を精製してこれらの分子を同定することができる。
〔単離した特定ゲノム領域の利用〕
　本発明の方法により単離した特定ゲノム領域は、ゲノム機能発現の分子機構解析のための試料として非常に有用である。すなわち、単離した特定ゲノム領域には、ゲノムDNAと相互作用している分子（蛋白質、DNA、RNAなど）の相互作用状態が保持されているので、相互作用している分子を同定し、その機能を推定することが可能となり、ゲノム機能発現の分子機構解析に大きな貢献をもたらすことが期待できる。
　単離した特定ゲノム領域において相互作用している分子の同定は、公知の方法を適宜組み合わせて行えばよく、特に限定されない。例えば、相互作用状態の保持を解除して、相互作用している分子を分離、精製し、公知の同定方法を適用することで行うことができる。相互作用状態を保持する処理がホルムアルデヒドを用いた架橋処理の場合には、高濃度の塩溶液（5M NaCl溶液など）を添加して適当な温度で適当な時間（例えば約６５℃で一夜）インキュベートすることにより架橋を解除することができる。公知の同定方法としては、対象が蛋白質の場合には、例えば、質量分析、免疫ブロット、ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）などが挙げられ、対象がDNAまたはRNAの場合には、例えば、塩基配列解析、マイクロアレイ解析、PCR（polymerase chain reaction）などが挙げられる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：テロメア領域の単離〕
（１）解析用細胞の作製
　テロメアリピート（TTAGGG）を認識するTALエフェクター蛋白質を発現する細胞を作製した。TAGGGTTAGGGTTAGGGTT（配列番号１）のテロメアリピートを含む19-merの二本鎖DNA（TAGGGTTAGGGTTAGGGTT：配列番号１）に結合するTelomere-TALをコードするDNAを合成した。合成はライフテクノロジーズ社に委託した。Telomere-TALに3×FLAGタグおよび核移行シグナル（NLS）を融合した蛋白質3×FN-Tel-TAL（配列番号２）を発現するレトロウイルスベクター3×FN-Tel-TAL/pMXs-puroを作製し、マウス血球系細胞株Ba/F3に感染させ、ピューロマイシンセレクションにより、感染細胞のみを選別した。3×FN-Tel-TAL蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２に示した。
　陰性対照細胞は以下のようにして作製した。3×FLAGタグ、NLSおよび細菌のLexA蛋白質からなる融合蛋白質3×FNLDD（Fujita and Fujii. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012)）を発現するレトロウイルスベクター3×FNLDD/pMXs-puroをBa/F3細胞に感染させ、ピューロマイシンセレクションにより、感染細胞のみを選別した。
　3×FN-Tel-TAL蛋白質と3×FNLDD蛋白質の発現を、FLAGタグに対する抗体（シグマ－アルドリッチ社製、フルオレセインイソチオシアネート結合anti-FLAG M2、F4049）を用いて細胞内染色を行い、フローサイトメトリーによって検出した。結果を図３に示した。図中、Ba/F3（左）は宿主細胞のみ、3×FNLDD（中）は3×FNLDD蛋白質発現細胞、3×FN-Tel-TAL（右）は3×FN-Tel-TAL蛋白質発現細胞の結果である。図３からわかるように、3×FN-Tel-TAL蛋白質と3×FNLDD蛋白質の発現レベルは、同程度であった。
（２）特定ゲノム領域の単離
(a) インターロイキン３含有RPMI完全培地30mL中に2×107個の細胞を含む細胞懸濁液に810μLの37％ホルムアルデヒドを添加して37℃で5分間置き細胞を架橋処理した。続いて、1.25Mグリシン溶液を3 mL添加して室温で10分間置き、中和した。
(b) 遠心分離（1.3 krpm、5分間、4℃）により細胞を氷冷PBSで２回洗浄した後、10 mLの細胞溶解バッファー（10 mM Tris (pH8.0)、1 mM EDTA、0.5％ IGEPAL CA-630、プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁した。氷上で10分間置いた後、遠心分離 (2.0 krpm、8分間、4℃)後、上清を捨て、ペレットを10 mLの核溶解バッファー（10 mM Tris (pH8.0)、1 mM EDTA、0.5M NaCl、1% Trion X-100、0.5% sodium deoxycholate、0.5% lauroylsarcosine salt、プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁し、2～3分おきにボルテックスをかけながら氷上で10分間置いた。遠心分離（2.0 krpm、8分間、4℃）後、上澄みを捨て、氷冷PBSを用いて洗浄したペレットをクロマチン分画とした。
(c) クロマチン分画を800μLの溶解バッファー３（10 mM Tris (pH8.0)、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、150mM NaCl、0.1% sodium deoxycholate、0.1% SDS、プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁し、架橋されたゲノムDNAを超音波処理により断片化した（超音波発生機：TOMY SEIKO社製、Ultrasonic disruptor UD-201、output: 3、Duty: 100%、10 sec x 6 with 20 sec intervals を２分間の間隔を空けて3セット（計18回））。
(d) 遠心分離（1.3 krpm、10分間、4℃）して上清800μLを回収した。このうち、160μL（4×106細胞相当）に240μLの溶解バッファー３、50μLの10％ Triton X-100を含んだ溶解バッファー３、50μLの10×プロテアーゼインヒビター溶液を加えて、500μLとした。続いて、対照IgGを結合させたDynabeadsを用いて、プレクリアー操作を行い、非特異的結合物を除いた。次いで、抗FLAG抗体M2（シグマ－アルドリッチ社製、anti-FLAG M2、F1804）を結合させたDynabeadsを用いて、免疫沈降した。
(e) 洗浄後、免疫沈降物複合体を300μLのTEに懸濁し、架橋除去後、RNase AおよびProteinase K処理を行い、次いでフェノール／クロロフォルム処理によって、DNAを精製した。
(f) 得られたDNAをサザンブロット解析に用いた。テロメアDNAの検出には、Roche社製Telo TAGGG Telomerase Length Assay kit（12209136001）を用いた。
　サザンブロット解析の結果を図４（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）および（Ｂ）は再現性を確認した結果である。図４（Ａ）および（Ｂ）から明らかなように、免疫沈降を行った２種類のサンプル中、3×FN-Tel-TALを用いた場合のみ、免疫沈降物複合体からテロメアDNAが検出された。この結果から、3×FN-Tel-TALを用いた免疫沈降により、テロメア領域が回収できることが明らかとなった。
（３）単離したテロメア領域に含まれる蛋白質の同定
(g) 上記(a)～(d)と同様の操作により、免疫沈降物を得た。免疫沈降には、300μLのDynabeadsと、30μLの抗体を用いた。免疫沈降物に200μLの3×FLAGペプチド溶液（シグマ－アルドリッチ社製、F4799、0.5 mg/mL）を加えて37℃、20分間インキュベートすることでビーズから溶出した。イソプロパノールを用いて溶出した免疫沈降物を沈殿させ、40μLの2×SDSサンプルバッファーに懸濁して100℃、30分間インキュベートし、蛋白質の変性と架橋の解除を同時に行った。
(h) 次いで、4-20％SDS-PAGEゲルで、サンプルが1.5 cm程ゲル内に入るまで電気泳動し、クマシーブリリアントブルー (CBB) 染色した後、5分割して質量分析解析を行った。
　3×FNLDDと比較して相対的に3×FN-Tel-TALに多く検出された蛋白質には、既知のテロメア結合蛋白質、他のテロメア結合蛋白質に結合することが知られている蛋白質、遺伝学的解析からテロメア機能に関与することが示されている蛋白質が多数含まれていた（表１参照）。この結果から、本発明の方法により、特定ゲノム領域の配列に特異的に結合する蛋白質をクロマチン複合体として単離し、質量分析により同定できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（４）単離したテロメア領域に含まれるRNAの同定
(i) 上記(a)～(e)と同様の操作により、免疫沈降物を得た。全てのバッファーにRNasin Plus（プロメガ社）を加えた。Proteinase K処理後に、Isogen II（ニッポンジーン社）を用いてRNAを精製した。
(j) 次いで、TITANIUM One-Step RT-PCR（クローンテック社）を用いてRT-PCRを行い、テロメラーゼRNAの検出を試みた。RT-PCRに用いたプライマーは5’-CCGGCGCCCCGCGGCTGACAGAG-3’（配列番号３）（逆転写用）、5'-GCTGTGGGTTCTGGTCTTTTGTTC-3'（配列番号４）、5’-GCGGCAGCGGAGTCCTAAG-3’（配列番号５）である。
　RT-PCRの結果を図５に示した。図５から明らかなように、3×FN-Tel-TALを用いた場合に特異的に、テロメレラーゼRNAが検出された。この結果から、本発明の方法により、特定ゲノム領域の配列に特異的に結合するRNAをクロマチン複合体として単離し、RT-PCRにより定量することができることが示された。
〔実施例２：Sox2遺伝子プロモーター領域の単離〕
（１）解析用細胞の作製
　ヒトSox2遺伝子プロモーター領域に存在する塩基配列（TTATTCCCTGACA、配列番号６）を認識するTALエフェクター蛋白質を発現する細胞を作製した。上記配列（配列番号６）を認識するTALエフェクター蛋白質をコードするDNAをAddgeneより購入した（Addgene #35388）。この蛋白質に3×FLAGタグおよび核移行シグナル（NLS）を融合した蛋白質3×FN-Sox2-TALを発現するプラスミドベクターを作製し、ヒト胎児腎細胞293Tにトランスフェクションし、3×FN-Sox2-TAL発現細胞を作製した。
　陰性対照として、以下の細胞を作製した。ヒトKLF4遺伝子プロモーター領域に存在する塩基配列（TCTTACTTATAAC、配列番号７）を認識するTALエフェクター蛋白質をコードするDNA（Addgene #35389）およびサイトメガウイルスのプロモーター領域に存在する塩基配列（ACCACTCACTATA、配列番号８）を認識するTALエフェクター蛋白質をコードするDNA（Addgene #27970）をそれぞれAddgeneより購入し、同様の操作を行って、各蛋白質（3×FN-KLF4-TAL、3×FN-CMV-TAL8）発現細胞を作製した。
　これらの各TALエフェクター蛋白質の発現を、FLAGタグに対する抗体（シグマ－アルドリッチ社製、anti-FLAG M2、F1804）を用いてウエスタンブロットにより検出した。結果を図６に示した。図６からわかるように、TALエフェクター蛋白質の発現は、いずれも同程度であった。
（２）特定ゲノム領域の単離
(a) DMEM完全培地30 mL中に1.5×107個の細胞を含む細胞懸濁液に810μLの37％ホルムアルデヒドを添加して37℃で5分間置き、細胞を架橋処理した。続いて、1.25Mグリシン溶液を3 mL添加して室温で10分間置き、中和した。
(b)～(d) 実施例１の（２）(b)～(d)と同様の操作を行い、解析対象領域であるSox2プロモーター領域を免疫沈降した。
(e) 洗浄後、免疫沈降物に40μLの3×FLAGペプチド溶液（シグマ－アルドリッチ社製、F4799、0.5 mg/mL）を加えて37℃、30分間インキュベートすることでビーズから溶出した。溶出した免疫沈降物を60μLのTEに懸濁し、RNase AおよびProteinase K処理、ならびに架橋除去後、ChIP DNA Clean & Concentrator-Capped column（ZYMO RESEARCH社製、D5205）を用いてDNAを精製した。
(f) 得られたDNAを用いてリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRに用いたプライマーは、5’-ATTGGTCGCTAGAAACCCATTTATT-3’（配列番号９）、5’-CTGCCTTGACAACTCCTGATACTTT-3’（配列番号１０）であり、ヒトSox2遺伝子プロモーター領域内の3×FN-Sox2-TAL認識配列（TTATTCCCTGACA、配列番号６）を挟むように設計した（図７参照）。
　リアルタイムPCRの結果を図８に示した。図８から明らかなように、3×FN-Sox2-TALを用いた場合、陰性対照と比較し、2.5～3倍程度Sox2プロモーター領域の濃縮が見られた。この結果から、3×FN-Sox2-TALを用いた免疫沈降により、Sox2プロモーター領域が回収できることが明らかとなった。以上の結果から、細胞あたり１あるいは２コピーの解析対象ゲノム領域についても、本発明の方法を応用できることが示唆された。
〔実施例３：不活性型Cas9蛋白質とRNAの複合体（CRISPR系）を用いたIRF-1遺伝子座の単離〕
　本実施例のスキームを図９に示した。
（１）解析用CRISPR系の作製
　SV40 T抗原由来の核移行シグナルを含むCas9 D10A変異体をコードするプラスミドをAddgeneより購入した（Addgene #41816）。これを基に、H840A変異を導入して、酵素活性を持たないCas9変異体（dCas9）を作製した。dCas9のコーディング配列をp3XFLAG-CMV-7.1（シグマ－アルドリッチ社）に組み込み、3×FLAGタグ付きのdCas9蛋白質を発現するベクター3×F-dCas9/pCMV-7.1を作製した。ヒト胎児腎由来の293T細胞に3×F-dCas9/pCMV-7.1を一過性にトランスフェクトして、3×F-dCas9を発現させた。また、3×FNLDD/pCMV-7.1を293T細胞に一過性にトランスフェクトして、3×F-dCas9を発現させたものと比較した。
　各細胞から核抽出物を調製し、3×F-dCas9の発現および3×FNLDDの発現を、FLAGタグに対する抗体（シグマ－アルドリッチ社製、anti-FLAG M2、F1804）を用いてウエスタンブロットにより検出した。結果を図１０に示した。図中（－）は宿主細胞のみを表す。下段のCBB染色像から、各レーンのサンプル量が同じであることがわかる。ウエスタンブロットの結果から、3×F-dCas9の発現および3×FNLDDの発現は同程度であった。
　次に、Mali et al., Science (2013) 339: 823-826に従って、ヒトIRF-1遺伝子座に存在する5'-CCGGGGGCGCTGGGCTGTCCCGG-3'配列（配列番号１１）に対応するgRNAの発現ベクターを構築した。二つのオリゴヌクレオチド5'-TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCGGGGGCGCTGGGCTGTCC-3'（配列番号１２）と5'-GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGGACAGCCCAGCGCCCCCGC-3'（配列番号１３）をアニールさせ、Phusionポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブズ社）を用いて、100ベースペアの二重鎖DNA断片を合成した。アガロース電気泳動により、この断片を精製し、ギブソンアセンブリー法キット（ニューイングランドバイオラブズ社）を用いて、gRNAクローニングベクター（Addgene #41824）と結合させ、gRNAを発現するgRNA-hIRF-1 #12を作製した。
（２）ヒトIRF-1遺伝子座の単離
(a) 上記3×F-dCas9/pCMV-7.1とgRNA-hIRF-1 #12を、ヒト胎児腎由来の293T細胞3×106個にリポフェクタミン2000（インビトロジェン社）を用いて導入した。トランスフェクションの翌日に、細胞を播き直し、更に翌日に、DMEM完全培地30 mL中の細胞に810μLの37%ホルムアルデヒドを添加して37℃で5分間置き、細胞を架橋処理した。続いて、1.25Mグリシン溶液を3 mL添加して室温で10分間置き、中和した。
(b)～(d) 実施例１の（２）(b)～(d)と同様の操作を行い、解析対象領域であるIRF-1領域を免疫沈降した。
(e) 洗浄後、免疫沈降物複合体を285μLのTEに懸濁し、12μLの5M NaClを加えて65℃で終夜処理し、架橋除去後、RNase AおよびProteinase K処理を行い、次いでフェノール／クロロフォルム処理によって、DNAを精製した。
(f) 得られたDNAを用いてリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRに用いたプライマーは、5'-CGCCTGCGTTCGGGAGATATAC-3'（配列番号１４）、5'-CTGTCCTCTCACTCCGCCTTGT-3'（配列番号１５）であり、ヒトIRF-1遺伝子座の標的DNA配列近傍に設計した。また、無関係な領域であるSox2遺伝子座の定量のため、配列番号９および１０のプライマーを用いた。
　リアルタイムPCRの結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、陰性対照では、ほとんどIRF-1遺伝子座が濃縮されなかったのに対して、3×F-dCas9とgRNA-hIRF-1 #12とを用いた場合、インプットに対して7.7％もの濃縮が認められた。また、関係のないSox2遺伝子座は全く濃縮されなかった。この結果から、3×F-dCas9とgRNAを用いた免疫沈降により、標的遺伝子座が特異的かつ効率的に回収できることが明らかとなった。以上の結果から、細胞あたり１あるいは２コピーの解析対象ゲノム領域についても、本発明の方法を応用できることが示唆された。
（３）単離したIRF-1領域に含まれる蛋白質の同定
(g) 上記(a)～(d)と同様の操作により、免疫沈降物を得た。免疫沈降には、300μLのDynabeadsと、30μLの抗体を用いた。免疫沈降物に200μLの3×FLAGペプチド溶液（シグマ－アルドリッチ社製、F4799、0.5 mg/mL）を加えて37℃、20分間インキュベートすることでビーズから溶出した。イソプロパノールを用いて溶出した免疫沈降物を沈殿させ、40μLの2×SDSサンプルバッファーに懸濁して100℃、30分間インキュベートし、蛋白質の変性と架橋の解除を同時に行った。
(h) 次いで、4-20％SDS-PAGEゲルで、サンプルが1.0 cm程ゲル内に入るまで電気泳動し、クマシーブリリアントブルー染色した後、5分割して質量分析解析を行った（図１２参照）。
　検出された蛋白質には、ヒストン等の既知のクロマチン構成蛋白質、ヒストン結合蛋白質、代謝酵素蛋白質、RNAヘリカーゼ等が多数含まれていた（表２参照）。この結果から、本発明の方法により、特定ゲノム領域の配列に結合する蛋白質をクロマチン複合体として単離し、質量分析により同定できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (11)

  1. 　相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離する方法であって、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする特定ゲノム領域の単離方法。
    （Ａ）相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
    （Ｂ）ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、ゲノムDNAとを接触させる工程
  2. 　さらに、（Ｃ）ゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
  3. 　前記外来性分子が、外来性DNA結合蛋白質、外来性核酸または外来性蛋白質－核酸複合体であることを特徴とする請求項１または２に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
  4. 　前記外来性分子が、ジンクフィンガー蛋白質、TALエフェクター蛋白質または不活性型Cas9蛋白質とガイドRNA（gRNA）の複合体であることを特徴とする請求項１または２に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
  5. 　以下の工程１～３を含むことを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
    工程１：前記外来性分子と、細胞内のゲノムDNAとを接触させる工程
    工程２：相互作用している分子との相互作用状態を保持している前記細胞内のゲノムDNAを断片化する工程
    工程３：前記外来性分子と特異的に結合する分子を、外来性分子が結合しているゲノムDNA断片に結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程
  6. 　前記外来性分子が、１種以上のタグ配列を含む融合分子であることを特徴とする請求項５に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
  7. 　前記外来性分子が、核移行シグナルを含む融合分子であることを特徴とする請求項５または６に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
  8. 　工程１において、解析対象細胞に、前記外来性分子をコードする遺伝子を導入し、当該細胞内で発現させることを特徴とする請求項５～７のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
  9. 　以下の工程Ｉ～ＩＩＩを含むことを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
    工程Ｉ：相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
    工程ＩＩ：前記外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させる工程
    工程ＩＩＩ：前記外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収する工程
  10. 　工程ＩＩにおいて、担体に固定化された前記外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させることを特徴とする請求項９に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
  11. 　工程ＩＩにおいて、前記外来性分子と断片化した前記ゲノムDNAとを接触させた後に、前記外来性分子を担体に固定化することを特徴とする請求項９に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
PCT/JP2013/074107 2013-02-14 2013-09-06 内在性dna配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法 WO2014125668A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/767,068 US11466306B2 (en) 2013-02-14 2013-09-06 Method for isolating specific genomic regions with use of molecule capable of specifically binding to endogenous DNA sequence
PL13875109T PL2963113T3 (pl) 2013-02-14 2013-09-06 Sposób izolowania określonych regionów genomowych z wykorzystaniem cząsteczki zdolnej do specyficznego wiązania się z endogenną sekwencją DNA
JP2015500088A JP5954808B2 (ja) 2013-02-14 2013-09-06 内在性ｄｎａ配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法
DK13875109.4T DK2963113T3 (da) 2013-02-14 2013-09-06 Fremgangsmåde til isolering af specifik genomregion under anvendelse af molekyle, der binder specifikt til endogen dna-sekvens
ES13875109T ES2768291T3 (es) 2013-02-14 2013-09-06 Método para aislar una región genómica específica utilizando una molécula que se une específicamente a una secuencia de ADN endógena
EP13875109.4A EP2963113B1 (en) 2013-02-14 2013-09-06 Method for isolating specific genomic region using molecule binding specifically to endogenous dna sequence
US17/823,685 US20230046749A1 (en) 2013-02-14 2022-08-31 Method for isolating specific genomic regions with use of molecule capable of specifically binding to endogenous dna sequence

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-026310 2013-02-14
JP2013026310 2013-02-14
JP2013143282 2013-07-09
JP2013-143282 2013-07-09

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/767,068 A-371-Of-International US11466306B2 (en) 2013-02-14 2013-09-06 Method for isolating specific genomic regions with use of molecule capable of specifically binding to endogenous DNA sequence
US17/823,685 Division US20230046749A1 (en) 2013-02-14 2022-08-31 Method for isolating specific genomic regions with use of molecule capable of specifically binding to endogenous dna sequence

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014125668A1 true WO2014125668A1 (ja) 2014-08-21

Family

ID=51353688

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/074107 WO2014125668A1 (ja) 2013-02-14 2013-09-06 内在性dna配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11466306B2 (ja)
EP (1) EP2963113B1 (ja)
JP (1) JP5954808B2 (ja)
DK (1) DK2963113T3 (ja)
ES (1) ES2768291T3 (ja)
PL (1) PL2963113T3 (ja)
PT (1) PT2963113T (ja)
WO (1) WO2014125668A1 (ja)

Cited By (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140356867A1 (en) * 2013-05-29 2014-12-04 Agilent Technologies, Inc. Nucleic acid enrichment using cas9
WO2016014409A1 (en) * 2014-07-21 2016-01-28 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
US20160244829A1 (en) * 2015-02-25 2016-08-25 University-Industry Foundation, Yonsei University Method for target dna enrichment using crispr system
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
WO2017090543A1 (ja) * 2015-11-27 2017-06-01 国立大学法人大阪大学 Ｄｎａ間相互作用の解析方法
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
CN114438174A (zh) * 2014-11-11 2022-05-06 伊鲁米那股份有限公司 使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US11999947B2 (en) 2023-02-24 2024-06-04 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2901396T3 (es) * 2013-03-14 2022-03-22 Caribou Biosciences Inc Composiciones y métodos de ácidos nucleicos dirigidos a ácido nucleico
CN109415727A (zh) 2016-06-13 2019-03-01 格里尔公司 富集突变的无细胞核酸以供癌症检测的方法
WO2018035062A1 (en) 2016-08-16 2018-02-22 The Regents Of The University Of California Method for finding low abundance sequences by hybridization (flash)
GB201616590D0 (en) 2016-09-29 2016-11-16 Oxford Nanopore Technologies Limited Method
US11680261B2 (en) 2018-11-15 2023-06-20 Grail, Inc. Needle-based devices and methods for in vivo diagnostics of disease conditions

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
WO1998037186A1 (en) 1997-02-18 1998-08-27 Actinova Limited In vitro peptide or protein expression library
WO1998053057A1 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Gendaq Limited Nucleic acid binding polypeptide library
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
GB2338237A (en) 1997-02-18 1999-12-15 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
US6007988A (en) 1994-08-20 1999-12-28 Medical Research Council Binding proteins for recognition of DNA
WO2000027878A1 (en) 1998-11-09 2000-05-18 Gendaq Limited Screening system for zinc finger polypeptides for a desired binding ability
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
WO2001088197A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for interaction trap assays
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
WO2011021684A1 (ja) * 2009-08-21 2011-02-24 国立大学法人大阪大学 特定ゲノム領域の単離方法
JP2012514976A (ja) * 2009-01-12 2012-07-05 ボーナス，ウラ モジュラーｄｎａ結合ドメインおよび使用方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0312676D0 (en) 2003-06-02 2003-07-09 Babraham Inst Binding assay
WO2009024781A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 The General Hospital Corporation Isolation of protein factors that associate directly or indirectly with nucleic acids
JP2009019762A (ja) 2008-05-23 2009-01-29 Hitachi Kokusai Electric Inc 断熱壁体の製造方法
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
US20120040857A1 (en) 2009-02-13 2012-02-16 The General Hospital Corporation Isolation of factors that associate directly or indirectly with chromatin
PE20150336A1 (es) * 2012-05-25 2015-03-25 Univ California Metodos y composiciones para la modificacion de adn objetivo dirigida por arn y para la modulacion de la transcripcion dirigida por arn
US8697359B1 (en) * 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6007988A (en) 1994-08-20 1999-12-28 Medical Research Council Binding proteins for recognition of DNA
US6013453A (en) 1994-08-20 2000-01-11 Medical Research Council Binding proteins for recognition of DNA
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
US6200759B1 (en) 1996-08-23 2001-03-13 President And Fellows Of Harvard College Interaction trap assay, reagents and uses thereof
GB2338237A (en) 1997-02-18 1999-12-15 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
WO1998037186A1 (en) 1997-02-18 1998-08-27 Actinova Limited In vitro peptide or protein expression library
WO1998053057A1 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Gendaq Limited Nucleic acid binding polypeptide library
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
WO2000027878A1 (en) 1998-11-09 2000-05-18 Gendaq Limited Screening system for zinc finger polypeptides for a desired binding ability
WO2001088197A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for interaction trap assays
JP2012514976A (ja) * 2009-01-12 2012-07-05 ボーナス，ウラ モジュラーｄｎａ結合ドメインおよび使用方法
WO2011021684A1 (ja) * 2009-08-21 2011-02-24 国立大学法人大阪大学 特定ゲノム領域の単離方法

Non-Patent Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEERLI ET AL., NATURE BIOTECHNOL., vol. 20, 2002, pages 135 - 141
BOCH ET AL., SCIENCE, vol. 326, 2009, pages 1509 - 1512
CHOO ET AL., CURR. OPIN. STRUCT. BIOL., vol. 10, 2000, pages 411 - 416
DEJARDIN, J. ET AL.: "Purification of proteins associated with specific genomic Loci.", CELL, vol. 136, 9 January 2009 (2009-01-09), pages 175 - 186, XP002619108 *
DEJARDIN, J.; KINGSTON, R.E.: "Purification of proteins associated with specific genomic loci", CELL, vol. 136, 2009, pages 175 - 186
DEKKER, J.; RIPPE, K.; DEKKER, M.; KLECKNER, N.: "Capturing chromosome conformation", SCIENCE, vol. 295, 2002, pages 1306 - 1311
FUJITA, H.; FUJII, H.: "Direct identification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation", PLOS ONE, vol. 6, 2011, pages E26109
FUJITA, T. ET AL.: "Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR.", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 439, 11 August 2013 (2013-08-11), pages 132 - 136, XP028715147 *
FUJITA, T. ET AL.: "Identification of telomere- associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP).", SCI. REP., vol. 3, no. 3171, 8 November 2013 (2013-11-08), pages 1 - 7, XP055279015 *
FUJITA; FUJII, ADV. BIOSCI. BIOTECHNOL., vol. 3, 2012, pages 626 - 629
GRIESENBECK, J.; BOEGER, H.; STRATTAN, J.S.; KORNBERG, R.D.: "Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast", MOL. CELL BIOL., vol. 23, 2003, pages 9275 - 9282
HOSHINO, A. ET AL.: "Insertional chromatin immunoprecipitation: A method for isolating specific genomic regions.", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, vol. 108, no. 5, November 2009 (2009-11-01), pages 446 - 449, XP026699038 *
HOSHINO, A.; FUJII, H.: "Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions", J. BIOSCI. BIOENG., vol. 108, 2009, pages 446 - 449
ISALAN ET AL., NATURE BIOTECHNOL., vol. 19, 2001, pages 656 - 660
JINEK ET AL., SCIENCE, vol. 337, 2012, pages 816 - 821
JINEK, M. ET AL.: "A programmable dual-RNA- guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.", SCIENCE, vol. 337, 17 August 2012 (2012-08-17), pages 816 - 821, XP055229606 *
MALI ET AL., SCIENCE, vol. 339, 2013, pages 823 - 826
MILLER ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 29, 2011, pages 143 - 148
MOSCOU; BOGDANOVE, SCIENCE, vol. 326, 2009, pages 1501
PABO ET AL., ANN. REV. BIOCHEM., vol. 70, 2001, pages 313 - 340
See also references of EP2963113A4
SEGAL ET AL., CURR. OPIN. BIOTECHNOL., vol. 12, 2001, pages 632 - 637
SIMONIS, M.; KLOUS, P.; SPLINTER, E.; MOSHKIN, Y.; WILLEMSEN, R.; DE WIT, E.; VAN STEENSEL, B.; DE LAAT, W.: "Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C", NAT. GENET., vol. 38, 2006, pages 1348 - 1354
SIMONIS, M.; KOOREN, J.; DE LAAT, W.: "An evaluation of 3C-based methods to capture DNA interactions", NAT. METHODS, vol. 4, 2007, pages 895 - 901
SOLOMON, M.J.; LARSEN, P.L.; VARSHAVSKY, A.: "Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene", CELL, vol. 53, 1988, pages 937 - 947
SOLOMON, M.J.; VARSHAVSKY, A.: "Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 82, 1985, pages 6470 - 6474

Cited By (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20140356867A1 (en) * 2013-05-29 2014-12-04 Agilent Technologies, Inc. Nucleic acid enrichment using cas9
US11414695B2 (en) * 2013-05-29 2022-08-16 Agilent Technologies, Inc. Nucleic acid enrichment using Cas9
US10954548B2 (en) 2013-08-09 2021-03-23 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US11920181B2 (en) 2013-08-09 2024-03-05 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US11299755B2 (en) 2013-09-06 2022-04-12 President And Fellows Of Harvard College Switchable CAS9 nucleases and uses thereof
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10912833B2 (en) 2013-09-06 2021-02-09 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US10682410B2 (en) 2013-09-06 2020-06-16 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US11124782B2 (en) 2013-12-12 2021-09-21 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US10465176B2 (en) 2013-12-12 2019-11-05 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
WO2016014409A1 (en) * 2014-07-21 2016-01-28 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
US10457969B2 (en) 2014-07-21 2019-10-29 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment using CRISPR-Cas systems
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US11578343B2 (en) 2014-07-30 2023-02-14 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
CN114438174A (zh) * 2014-11-11 2022-05-06 伊鲁米那股份有限公司 使用crispr-cas系统的多核苷酸扩增
US20160244829A1 (en) * 2015-02-25 2016-08-25 University-Industry Foundation, Yonsei University Method for target dna enrichment using crispr system
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US11214780B2 (en) 2015-10-23 2022-01-04 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
WO2017090543A1 (ja) * 2015-11-27 2017-06-01 国立大学法人大阪大学 Ｄｎａ間相互作用の解析方法
US11702651B2 (en) 2016-08-03 2023-07-18 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10947530B2 (en) 2016-08-03 2021-03-16 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11820969B2 (en) 2016-12-23 2023-11-21 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR2 receptor gene to protect against HIV infection
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11932884B2 (en) 2017-08-30 2024-03-19 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11795452B2 (en) 2019-03-19 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11643652B2 (en) 2019-03-19 2023-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US12006520B2 (en) 2019-06-14 2024-06-11 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US11999947B2 (en) 2023-02-24 2024-06-04 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP5954808B2 (ja) 2016-07-20
EP2963113A4 (en) 2016-12-07
US20230046749A1 (en) 2023-02-16
EP2963113B1 (en) 2019-11-06
PT2963113T (pt) 2020-02-14
JPWO2014125668A1 (ja) 2017-02-02
US20160138081A1 (en) 2016-05-19
US11466306B2 (en) 2022-10-11
DK2963113T3 (da) 2020-02-17
PL2963113T3 (pl) 2020-07-13
EP2963113A1 (en) 2016-01-06
ES2768291T3 (es) 2020-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5954808B2 (ja) 内在性ｄｎａ配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法
US11434262B2 (en) Transcription activator-like effectors
US10858647B2 (en) Removal of DNA fragments in mRNA production process
ES2779798T3 (es) Métodos para estudiar ácidos nucleicos
Singh et al. RIPiT-Seq: a high-throughput approach for footprinting RNA: protein complexes
EP2505666B1 (en) Methods and compositions for enriching either target polynucleotides or non-target polynucleotides from a mixture of target and non-target polynucleotides
Wang et al. CLIP: construction of cDNA libraries for high-throughput sequencing from RNAs cross-linked to proteins in vivo
US20140038241A1 (en) Genomic enrichment method, composition, and reagent kit
Cotten et al. Selection of proteins with desired properties from natural proteome libraries using mRNA display
Cui et al. Allosteric inhibition of CRISPR-Cas9 by bacteriophage-derived peptides
JP5413924B2 (ja) 特定ゲノム領域の単離方法
US20230365637A1 (en) Identification of pax3-foxo1 binding genomic regions
WO2017090543A1 (ja) Ｄｎａ間相互作用の解析方法
US11828684B2 (en) Detection of molecular associations
JP6502854B2 (ja) ポリユビキチン化基質の同定方法
Nascimento et al. Essential PBP1-associated proteins of Trypanosoma brucei
WO2008124111A2 (en) System for pulling out regulatory elements in vitro
Nair et al. An aptamer-based mRNA affinity purification procedure (RaPID) for the identification of associated RNAs (RaPID-seq) and proteins (RaPID-MS) in yeast
El Sayyed et al. Mapping E. coli topoisomerase IV binding and activity sites
Fujita et al. In vitro Engineered DNA-binding Molecule-mediated Chromatin Immunoprecipitation (in vitro enChIP) Using CRISPR Ribonucleoproteins in Combination with Next-generation Sequencing (in vitro enChIP-Seq) for the Identification of Chromosomal Interactions
JP2019030226A (ja) ゲノムｄｎａ−ポリペプチド複合体、又はそれに含まれるゲノムｄｎａおよび／もしくはポリペプチドを単離又は解析する方法
Han et al. Hfq Globally Binds and Destabilizes the bound sRNAs and mRNAs in Yersinia pestis
Serdar The Functional Relationship between the Nonsense-Mediated mRNA Decay Pathway and the Prematurely Terminating Ribosome
EP2898070A2 (en) Screening polynucleotide libraries for variants that encode functional proteins
MacPherson Biochemical Studies of the CTCF Insulator Protein: Determination of Protein Interactions with CTCF Using Tandem Affinity Purification, Characterization of Its Post-translational Modification by the Small Ubiquitin-like Modifier Proteins and Studies of CTCF DNA Looping Ability

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13875109

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015500088

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013875109

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14767068

Country of ref document: US