JP5413924B2 - 特定ゲノム領域の単離方法 - Google Patents
特定ゲノム領域の単離方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5413924B2 JP5413924B2 JP2011527713A JP2011527713A JP5413924B2 JP 5413924 B2 JP5413924 B2 JP 5413924B2 JP 2011527713 A JP2011527713 A JP 2011527713A JP 2011527713 A JP2011527713 A JP 2011527713A JP 5413924 B2 JP5413924 B2 JP 5413924B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- molecule
- genomic region
- binding
- specific genomic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1048—SELEX
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、特定ゲノム領域の単離方法に関するものであり、特に、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離する方法に関するものである。
クロマチン領域の生化学的および分子生物学的解析は、エピジェネティクス制御の分子機構を理解するために非常に重要である。しかし、未だクロマチン領域の生化学的な性質は十分に解析されていない。これは、クロマチン領域の生化学的および分子生物学的解析に利用可能な試料の採取方法が制限されていることに原因があると考えられる。
クロマチン領域の生化学的および分子生物学的解析を行うためには、ゲノムＤＮＡおよびゲノムＤＮＡと相互作用している分子の相互作用状態を保持した試料を解析に供することが必要である。相互作用分子との相互作用状態を保持した特定ゲノム領域を単離する方法として、以下の方法が知られている。
（１）クロマチン免疫沈降法
クロマチン免疫沈降（chromatin immunoprecipitation）法（以下、「ＣｈＩＰ法」という。）は、既知のＤＮＡ結合タンパク質に対する抗体を用いて特定ゲノム領域を免疫沈降させ、当該領域を単離する方法である（非特許文献１、２参照）。したがって、ＣｈＩＰ法は、ＤＮＡ結合タンパク質に関する情報がなければ使用することができないという制限がある。また、一般に、ＤＮＡ結合タンパク質はゲノムＤＮＡの複数の領域に結合するため、免疫沈降物中にはいろいろなゲノム領域が混在しており、ＣｈＩＰ法によって特定ゲノム領域のみを単離することは難しいという問題を有している。さらに、ＣｈＩＰ法では、既知のＤＮＡ結合タンパク質が結合しないゲノム領域を単離できないという問題がある。
クロマチン免疫沈降（chromatin immunoprecipitation）法（以下、「ＣｈＩＰ法」という。）は、既知のＤＮＡ結合タンパク質に対する抗体を用いて特定ゲノム領域を免疫沈降させ、当該領域を単離する方法である（非特許文献１、２参照）。したがって、ＣｈＩＰ法は、ＤＮＡ結合タンパク質に関する情報がなければ使用することができないという制限がある。また、一般に、ＤＮＡ結合タンパク質はゲノムＤＮＡの複数の領域に結合するため、免疫沈降物中にはいろいろなゲノム領域が混在しており、ＣｈＩＰ法によって特定ゲノム領域のみを単離することは難しいという問題を有している。さらに、ＣｈＩＰ法では、既知のＤＮＡ結合タンパク質が結合しないゲノム領域を単離できないという問題がある。
（２）Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ法（以下「３Ｃ法」という。）
３Ｃ法またはその派生法では、特定のゲノム領域と相互作用しているゲノム領域を同定することができる（非特許文献３〜５参照）。しかし、３Ｃ法では、制限酵素やライゲースによる酵素反応を、クロスリンク（架橋）下という非最適条件下で行わなくてはならないため、非生理的な相互作用を検出する可能性が高いという問題がある。また、クロスリンク下では制限酵素処理が不完全になるため、標的ゲノム領域に隣接する領域がＰＣＲで増幅されバックグラウンドが極めて高くなり、未知の相互作用の検出が難しいという問題がある。
３Ｃ法またはその派生法では、特定のゲノム領域と相互作用しているゲノム領域を同定することができる（非特許文献３〜５参照）。しかし、３Ｃ法では、制限酵素やライゲースによる酵素反応を、クロスリンク（架橋）下という非最適条件下で行わなくてはならないため、非生理的な相互作用を検出する可能性が高いという問題がある。また、クロスリンク下では制限酵素処理が不完全になるため、標的ゲノム領域に隣接する領域がＰＣＲで増幅されバックグラウンドが極めて高くなり、未知の相互作用の検出が難しいという問題がある。
（３）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法（以下、「ＦＩＳＨ法」という。）
ＦＩＳＨ法単独、もしくは蛍光抗体法と組み合わせることにより、特定ゲノム領域と別のゲノム領域やＲＮＡ、タンパク質との相互作用が検出可能である。しかし、この方法は解像度が低く、また、未知の分子との相互作用は検出できない。
ＦＩＳＨ法単独、もしくは蛍光抗体法と組み合わせることにより、特定ゲノム領域と別のゲノム領域やＲＮＡ、タンパク質との相互作用が検出可能である。しかし、この方法は解像度が低く、また、未知の分子との相互作用は検出できない。
（４）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｓｅｇｍｅｎｔｓ法（以下「ＰＩＣｈ法」という。）
ＰＩＣｈ法は、特異的な核酸プローブを用いて、特定ゲノム領域を単離する方法であり、プローブに相補的な多数の繰り返し配列からなるテロメア領域を単離できることが示されている（非特許文献６参照）。しかしながら、ＰＩＣｈ法ではクロスリンク下での核酸プローブと標的ゲノム領域のアニーリングが必要であり、低コピー数や１コピーの特定ゲノム領域の単離が可能か否かは示されていない。
ＰＩＣｈ法は、特異的な核酸プローブを用いて、特定ゲノム領域を単離する方法であり、プローブに相補的な多数の繰り返し配列からなるテロメア領域を単離できることが示されている（非特許文献６参照）。しかしながら、ＰＩＣｈ法ではクロスリンク下での核酸プローブと標的ゲノム領域のアニーリングが必要であり、低コピー数や１コピーの特定ゲノム領域の単離が可能か否かは示されていない。
（５）非特許文献７に記載の方法
非特許文献７には、アフィニティー精製により特定ゲノム領域を単離しようとする試みが記載されている。しかし、用いられている細胞は、酵母であり、高等真核細胞への応用は行われていない。また、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を利用して、特定ゲノム領域を切り出しているが、この操作により、クロマチン構造が変化してしまう可能性がある。加えて、ホルムアルデヒドによるクロスリンク処理を行っていないため、精製の過程で結合しているタンパク質やＤＮＡ等の分子が解離する可能性もある。
非特許文献７には、アフィニティー精製により特定ゲノム領域を単離しようとする試みが記載されている。しかし、用いられている細胞は、酵母であり、高等真核細胞への応用は行われていない。また、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を利用して、特定ゲノム領域を切り出しているが、この操作により、クロマチン構造が変化してしまう可能性がある。加えて、ホルムアルデヒドによるクロスリンク処理を行っていないため、精製の過程で結合しているタンパク質やＤＮＡ等の分子が解離する可能性もある。
Solomon, M.J., Larsen, P.L., Varshavsky, A., Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell (1988) 53, 937-947
Solomon, M.J., Varshavsky, A., Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 6470-6474
Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., and Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science (2002) 295, 1306-1311
Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., and de Laat, W. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nat. Genet. (2006) 38, 1348-1354
Simonis, M., Kooren, J., and de Laat, W. An evaluation of 3C-based methods to capture DNA interactions. Nat. Methods (2007) 4, 895-901
Dejardin, J., and Kingston, R.E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell (2009) 136, 175-186
Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J.S., and Kornberg, R.D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. (2003) 23, 9275-9282
上述のように、相互作用分子との相互作用状態を保持した特定ゲノム領域を単離する従来の方法には種々の問題点が存在するため、これらの問題点を解消し、クロマチン領域の生化学的および分子生物学的解析に適した材料を確実に提供できる新しい方法の開発が望まれていた。
そこで、本発明は、相互作用している分子との相互作用状を保持したまま、任意のゲノム領域を特異的に単離することができる方法を提供することを目的とする。
そこで、本発明は、相互作用している分子との相互作用状を保持したまま、任意のゲノム領域を特異的に単離することができる方法を提供することを目的とする。
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離する方法であって、以下の工程１〜５を包含することを特徴とする特定ゲノム領域の単離方法。
工程１：単離しようとするゲノム領域のゲノムＤＮＡに、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片が挿入された細胞を作製する工程
工程２：少なくとも前記外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む外来性分子を、前記細胞のゲノムＤＮＡと接触させる工程
工程３：前記細胞のゲノムＤＮＡと、当該ゲノムＤＮＡと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程
工程４：ゲノムＤＮＡを断片化する処理を行う工程
工程５：前記外来性分子と特異的に結合する分子を結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程
［２］前記外来性ＤＮＡ結合分子が、外来性ＤＮＡ結合タンパク質または外来性核酸であることを特徴とする前記［１］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［３］前記外来性分子が、タグ配列を含む融合分子であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［４］前記融合分子が、２種類のタグ配列を含み、両タグ配列がプロテアーゼ認識配列を介して連結されていることを特徴とする前記［３］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［５］前記外来性分子が、核移行シグナルを含む融合分子であることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［６］工程１において、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片を、相同組み換え法によりゲノムＤＮＡに挿入することを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［７］工程１において、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列と、特定ゲノム領域のＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ断片を、細胞に導入することを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［８］工程２において、工程１で作製した細胞に、前記外来性分子をコードする遺伝子を導入し、当該細胞内で発現させることを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［９］前記相互作用状態を保持する処理が、架橋処理であることを特徴とする前記［１］〜［８］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［１０］前記ゲノムＤＮＡを断片化する処理が、制限酵素処理、ＤＮＡ分解酵素による部分分解処理、または超音波処理であることを特徴とする前記［１］〜［９］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［１１］外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡに挿入するためのターゲッティングベクターを包含することを特徴とする特定ゲノム領域単離用キット。
［１２］外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列と、特定ゲノム領域のＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ断片を細胞に導入するためのベクターを包含することを特徴とする特定ゲノム領域単離用キット。
［１３］前記ＤＮＡ断片が、さらにレポーター遺伝子を含むことを特徴とする前記［１２］に記載の特定ゲノム領域単離用キット。
［１４］さらに、少なくとも前記外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む外来性分子、または当該外来性分子を発現させるための発現ベクターを包含することを特徴とする前記［１１］〜［１３］のいずれかに記載の特定ゲノム領域単離用キット。
［１］相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離する方法であって、以下の工程１〜５を包含することを特徴とする特定ゲノム領域の単離方法。
工程１：単離しようとするゲノム領域のゲノムＤＮＡに、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片が挿入された細胞を作製する工程
工程２：少なくとも前記外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む外来性分子を、前記細胞のゲノムＤＮＡと接触させる工程
工程３：前記細胞のゲノムＤＮＡと、当該ゲノムＤＮＡと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程
工程４：ゲノムＤＮＡを断片化する処理を行う工程
工程５：前記外来性分子と特異的に結合する分子を結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程
［２］前記外来性ＤＮＡ結合分子が、外来性ＤＮＡ結合タンパク質または外来性核酸であることを特徴とする前記［１］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［３］前記外来性分子が、タグ配列を含む融合分子であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［４］前記融合分子が、２種類のタグ配列を含み、両タグ配列がプロテアーゼ認識配列を介して連結されていることを特徴とする前記［３］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［５］前記外来性分子が、核移行シグナルを含む融合分子であることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［６］工程１において、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片を、相同組み換え法によりゲノムＤＮＡに挿入することを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［７］工程１において、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列と、特定ゲノム領域のＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ断片を、細胞に導入することを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［８］工程２において、工程１で作製した細胞に、前記外来性分子をコードする遺伝子を導入し、当該細胞内で発現させることを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［９］前記相互作用状態を保持する処理が、架橋処理であることを特徴とする前記［１］〜［８］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［１０］前記ゲノムＤＮＡを断片化する処理が、制限酵素処理、ＤＮＡ分解酵素による部分分解処理、または超音波処理であることを特徴とする前記［１］〜［９］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［１１］外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡに挿入するためのターゲッティングベクターを包含することを特徴とする特定ゲノム領域単離用キット。
［１２］外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列と、特定ゲノム領域のＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ断片を細胞に導入するためのベクターを包含することを特徴とする特定ゲノム領域単離用キット。
［１３］前記ＤＮＡ断片が、さらにレポーター遺伝子を含むことを特徴とする前記［１２］に記載の特定ゲノム領域単離用キット。
［１４］さらに、少なくとも前記外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む外来性分子、または当該外来性分子を発現させるための発現ベクターを包含することを特徴とする前記［１１］〜［１３］のいずれかに記載の特定ゲノム領域単離用キット。
本発明によれば、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま、任意のゲノム領域を特異的に単離することができる。単離されたゲノム領域には、相互作用している分子が保持されているので、当該ゲノム領域は、エピジェネティクス制御の分子機構解析のための試料として非常に有用である。
〔特定ゲノム領域の単離方法〕
本発明の特定ゲノム領域の単離方法（以下、「本発明の方法」という。）は、以下の工程１〜５を包含するものであればよい。本発明の方法により、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離することが可能となる。相互作用状態を保持した特定ゲノム領域が単離できる限り、工程１〜５以外の工程を包含してもよく、その内容は限定されない。
工程１：単離しようとするゲノム領域のゲノムＤＮＡに、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片が挿入された細胞を作製する工程
工程２：少なくとも前記外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む外来性分子を、前記細胞のゲノムＤＮＡと接触させる工程
工程３：前記細胞のゲノムＤＮＡと、当該ゲノムＤＮＡと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程
工程４：ゲノムＤＮＡを断片化する処理を行う工程
工程５：前記外来性分子と特異的に結合する分子を結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程
本発明の特定ゲノム領域の単離方法（以下、「本発明の方法」という。）は、以下の工程１〜５を包含するものであればよい。本発明の方法により、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離することが可能となる。相互作用状態を保持した特定ゲノム領域が単離できる限り、工程１〜５以外の工程を包含してもよく、その内容は限定されない。
工程１：単離しようとするゲノム領域のゲノムＤＮＡに、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片が挿入された細胞を作製する工程
工程２：少なくとも前記外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む外来性分子を、前記細胞のゲノムＤＮＡと接触させる工程
工程３：前記細胞のゲノムＤＮＡと、当該ゲノムＤＮＡと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程
工程４：ゲノムＤＮＡを断片化する処理を行う工程
工程５：前記外来性分子と特異的に結合する分子を結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程
以下、各工程順に本発明の方法を詳細に説明する。
（１）工程１
工程１は、単離しようとするゲノム領域のゲノムＤＮＡに、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片が挿入された細胞を作製する工程である。細胞の種類は特に限定されず、原核細胞、真核細胞のいずれの細胞も好適に用いることができる。単離しようとするゲノム領域は、任意に選択して決定することができる。外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡに挿入する方法は、公知の方法から選択すればよい。例えば、相同組み換え法などが挙げられる。相同組み換えは、例えば、Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ法（Copeland, N.G., Jenkins, N.A., Court, D.L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. (2001) 2, 769-779）を用いることにより容易に行うことができる。相同組み換え法を用いることによりゲノムＤＮＡ上の任意の位置に外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片を挿入することができるので、単離しようとするゲノム領域の選択が制限されず、任意に選択することが可能となる。この点において、本発明の方法は従来法と比較して非常に有用性が高い。
（１）工程１
工程１は、単離しようとするゲノム領域のゲノムＤＮＡに、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片が挿入された細胞を作製する工程である。細胞の種類は特に限定されず、原核細胞、真核細胞のいずれの細胞も好適に用いることができる。単離しようとするゲノム領域は、任意に選択して決定することができる。外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡに挿入する方法は、公知の方法から選択すればよい。例えば、相同組み換え法などが挙げられる。相同組み換えは、例えば、Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ法（Copeland, N.G., Jenkins, N.A., Court, D.L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. (2001) 2, 769-779）を用いることにより容易に行うことができる。相同組み換え法を用いることによりゲノムＤＮＡ上の任意の位置に外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片を挿入することができるので、単離しようとするゲノム領域の選択が制限されず、任意に選択することが可能となる。この点において、本発明の方法は従来法と比較して非常に有用性が高い。
また、解析対象ゲノム領域を単離して、そこに外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を挿入したトランスジーンを細胞に導入して解析を行うことも可能である。この場合には、本来の遺伝子座とは異なるゲノム領域に挿入されるが、遺伝子発現制御等の機能発現に必要充分な領域がトランスジーン中に含まれていれば、有用な情報が得られる。
上記トランスジーンを細胞に導入する場合、工程１において、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列と、特定ゲノム領域のＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ断片（トランスジーン）を作製し、これを細胞に導入すればよい。外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列は、特定ゲノム領域の内部に挿入されてもよく、近傍に挿入されてもよい。作製したトランスジーンを公知の遺伝子導入方法を用いて細胞に導入し、トランスジーンがゲノム領域に組み込まれた細胞を選択すればよい。トランスジーンがゲノム領域に組み込まれていることは、例えば、マーカー遺伝子を含むトランスジーンを用いることで容易に確認することができる。
外来性ＤＮＡ結合分子は、特異的なＤＮＡに結合する性質を持つ外来性の分子であれば特に限定されない。例えば、外来性ＤＮＡ結合タンパク質、外来性核酸などを好適に用いることができる。
外来性ＤＮＡ結合タンパク質は、公知のＤＮＡ結合タンパク質の中から適宜選択して用いることができる。使用する細胞のゲノムＤＮＡ上に、結合認識配列が存在しない外来性ＤＮＡ結合タンパク質を選択することが特に好ましいが、稀に存在するものを選択してもよい。また、使用する細胞のゲノムＤＮＡ上に存在しない結合認識配列と結合できるタンパク質またはペプチドを人工的に設計して使用することも可能である。外来性ＤＮＡ結合タンパク質の認識配列の情報は、用いる外来性ＤＮＡ結合タンパク質に応じて公知文献等から容易に取得することができる。
真核生物由来のＤＮＡ結合タンパク質としては、例えば、ｐ５３、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、ＧＣＮ４、ＧＡＬ４などが挙げられる。また、原核生物由来のＤＮＡ結合タンパク質としては、例えば、ＬｅｘＡレプレッサー（以下、「ＬｅｘＡ」という。）、Ｐ２２Ａｒｃレプレッサー、ＭｅｔＪ、ＣＥＮＰ−Ｂ、Ｒａｐ１、Ｘｙ１Ｓ／Ａｄａ／ＡｒａＣ、Ｂｉｒ５、ＤｔｘＲなどが挙げられる。また、ファージ由来のラムダｃＩタンパク質なども使用することができる。
外来性核酸は、例えば、ランダム核酸配列ライブラリーから標的ゲノムＤＮＡ配列に結合する分子種をアフィニティー精製し、ＰＣＲ法等を用いて濃縮・選別することにより取得することができる。また、こうして選別した核酸に適当な変異を導入して、標的ゲノムＤＮＡ配列との親和性を更に向上させることも可能である。
外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片は、少なくとも認識配列を含むものであればよいが、認識配列を複数回繰り返して含むことが好ましい。認識配列を複数回繰り返すことにより、外来性ＤＮＡ結合分子が当該認識配列を認識し、結合する確率を大幅に向上させることができる。また、特定ゲノム領域をトランスジーンとして細胞に導入する場合には、特定ゲノム領域を複数回繰り返して含むトランスジーンを用いてもよい。
（２）工程２
工程２は、少なくとも外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む外来性分子を、工程１で作製した細胞のゲノムＤＮＡと接触させる工程である。工程２で用いる外来性分子は、工程１でゲノムＤＮＡに挿入した認識配列と結合できる外来性分子であればよい。好ましくは、当該外来性分子と特異的に結合する分子（例えば抗体）を容易に入手できる分子である。したがって、外来性分子としては、当該認識配列と結合する外来性ＤＮＡ結合分子全体、当該認識配列と結合する外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む部分、またはこれらと他の分子との融合分子を好適に用いることができる。
外来性ＤＮＡ結合分子が外来性ＤＮＡ結合タンパク質である場合、外来性分子としては、当該認識配列と結合する外来性ＤＮＡ結合タンパク質の全長タンパク質、当該認識配列と結合する外来性ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む部分タンパク質、またはこれらと他のタンパク質との融合タンパク質を好適に用いることができる。
工程２は、少なくとも外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む外来性分子を、工程１で作製した細胞のゲノムＤＮＡと接触させる工程である。工程２で用いる外来性分子は、工程１でゲノムＤＮＡに挿入した認識配列と結合できる外来性分子であればよい。好ましくは、当該外来性分子と特異的に結合する分子（例えば抗体）を容易に入手できる分子である。したがって、外来性分子としては、当該認識配列と結合する外来性ＤＮＡ結合分子全体、当該認識配列と結合する外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む部分、またはこれらと他の分子との融合分子を好適に用いることができる。
外来性ＤＮＡ結合分子が外来性ＤＮＡ結合タンパク質である場合、外来性分子としては、当該認識配列と結合する外来性ＤＮＡ結合タンパク質の全長タンパク質、当該認識配列と結合する外来性ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含む部分タンパク質、またはこれらと他のタンパク質との融合タンパク質を好適に用いることができる。
融合分子の場合は、他の分子はタグ配列であることが好ましい。タグ配列との融合分子は、ゲノムＤＮＡに挿入した認識配列と結合でき、かつ、当該融合分子と特異的に結合する分子を容易に入手することができる。タグ配列は特に限定されず、公知のタグ配列から適宜選択して使用することができる。具体的には、例えば、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、カルモジュリン結合ペプチド、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグなどが挙げられる。
タグ配列との融合分子は、２種類のタグ配列を含み、両タグ配列がプロテアーゼ認識配列を介して連結されている構成としてもよい。このような構成とすることにより、当該融合分子が結合したゲノム領域を２段階で精製することが可能となるため、非特異的結合に基づくバックグラウンドを大幅に低減することができ、特定ゲノム領域の特異的な単離効率が大幅に向上する。
２種類のタグ配列を連結するプロテアーゼ認識配列は、タグ配列の切断に通常用いられるプロテアーゼが認識する配列を適宜選択して用いることができる。タグ配列の切断に用いられるプロテアーゼとしては、例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）プロテアーゼ、エンテロキナーゼ（ＥＫ）、トロンビン（Ｔｂ）、第Ｘａ因子（Ｘａ）などが知られている。
真核細胞を用いる場合には、核移行シグナルを含む融合分子とすることが好ましい。当該融合分子が核移行シグナルを有することにより、核内に移行してゲノムＤＮＡと接触することが可能となる。核移行シグナルは公知の核移行シグナルから適宜選択すればよい。具体的には、例えば、ＳＶ４０Ｔ抗原の核移行シグナル、ｃ−Ｍｙｃの核移行シグナル、ｐ５３の核移行シグナル、ＮＦ−κＢｐ５０の核移行シグナルなどが挙げられる。また、細胞内に取り込まれる性質を持つアミノ酸配列（タンパク質トランスダクションドメイン）を含む融合分子としてもよい。
工程２で用いる外来性分子が外来性タンパク質である場合、例えば、公知の遺伝子組換え技術により組換えタンパク質として製造することができる。すなわち、外来性タンパク質をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入して発現させ、公知の方法で精製すればよい。外来性タンパク質が融合タンパク質の場合は、融合させる各タンパク質をコードするＤＮＡを適宜連結して融合ＤＮＡを作製し、これを発現ベクターに挿入すればよい。
工程２で用いる外来性分子が外来性核酸である場合、例えば、公知の化学合成法、ＰＣＲ法、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法、ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法、細胞に組み込んだ遺伝子からの転写等により製造することができる。外来性核酸を融合分子とする場合は、公知の化学合成法を用いることができる。
外来性分子を工程１で作製した細胞のゲノムＤＮＡと接触させる方法は、特に限定されない。例えば、上述のように公知の遺伝子組換え技術等を用いて得られた外来性タンパク質や外来性核酸を、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション等により、工程１で作製した細胞に導入する方法が挙げられる。また、外来性分子として、上記の細胞内に取り込まれる性質を持つアミノ酸配列（タンパク質トランスダクションドメイン）を含む融合分子を用いて、工程１で作製した細胞に直接導入することも可能である。また、外来性分子とは別に、外来性分子と結合する性質を持つアミノ酸配列を融合させたタンパク質トランスダクションドメインを作製し、これを外来性分子と混合して工程１で作製した細胞に導入することも可能である。なお、工程１で作製した細胞が真核細胞の場合は、核移行シグナルを含む融合分子を使用する。
また、外来性分子を細胞内で発現させることもできる。この場合は、上記宿主細胞として工程１で作製した細胞を用い、当該細胞で発現可能な発現ベクターを作製して導入すればよい。宿主が原核細胞の場合、発現した外来性分子は細胞質中でゲノムＤＮＡと接触することができる。宿主が真核細胞の場合は、核移行シグナルを含む融合分子を発現させることにより、発現した外来性分子が細胞質から核に移行し、ゲノムＤＮＡと接触することができる。
（３）工程３
工程３は、工程１で作成した細胞のゲノムＤＮＡと、当該ゲノムＤＮＡと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程である。ゲノムＤＮＡには、転写因子等のＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、その他の分子などが細胞のステージに応じて相互作用している。また、ゲノムＤＮＡに挿入した外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列には、工程２において接触させた外来性分子が結合している。そこで、工程３では、ゲノムＤＮＡと他の分子との相互作用の状態を保持する処理を行う。なお、相互作用状態を保持する処理を行う前に、必要に応じて細胞に刺激を与えてもよい。
工程３は、工程１で作成した細胞のゲノムＤＮＡと、当該ゲノムＤＮＡと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程である。ゲノムＤＮＡには、転写因子等のＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、その他の分子などが細胞のステージに応じて相互作用している。また、ゲノムＤＮＡに挿入した外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列には、工程２において接触させた外来性分子が結合している。そこで、工程３では、ゲノムＤＮＡと他の分子との相互作用の状態を保持する処理を行う。なお、相互作用状態を保持する処理を行う前に、必要に応じて細胞に刺激を与えてもよい。
相互作用状態を保持する処理は、特に限定されないが、後に相互作用している分子を分離、精製して解析に供することができるように、相互作用状態の保持を必要に応じて解除できることが好ましい。好ましい処理としては、例えば架橋処理が挙げられる。架橋処理に用いる好ましい架橋処理剤としては、例えばホルムアルデヒドが挙げられる。
（４）工程４
工程４は、ゲノムＤＮＡを断片化する処理を行う工程である。すなわち、工程３において、相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行ったゲノムＤＮＡを切断して目的のゲノム領域を含み得る適当なサイズの断片を生成させる工程である。断片化処理を効率よく行うために、断片化処理の前に、公知の方法を用いて細胞を溶解または破砕またはクロマチン分画を抽出しておくことが好ましい。
工程４は、ゲノムＤＮＡを断片化する処理を行う工程である。すなわち、工程３において、相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行ったゲノムＤＮＡを切断して目的のゲノム領域を含み得る適当なサイズの断片を生成させる工程である。断片化処理を効率よく行うために、断片化処理の前に、公知の方法を用いて細胞を溶解または破砕またはクロマチン分画を抽出しておくことが好ましい。
断片化する処理の方法としては、例えば、制限酵素でゲノムＤＮＡを消化する方法、ＤＮＡ分解酵素（エンドヌクレアーゼ）でゲノムＤＮＡを部分分解（部分切断）する方法、超音波処理により物理的に切断する方法などが挙げられる。
制限酵素を用いる場合、単離しようとするゲノム領域の内部に認識配列がなく、目的のゲノム領域以外の部分をできるだけ含まない位置に認識配列が存在する制限酵素を選択することが好ましい。
ＤＮＡ分解酵素（エンドヌクレアーゼ）を用いる場合は、単離しようとするゲノム領域のサイズより少し大きい断片を生成する反応条件を予め決定しておくことが好ましい。
超音波処理を行う場合は、単離しようとするゲノム領域のサイズより少し大きい断片に切断される処理条件を予め決定しておくことが好ましい。
制限酵素を用いる場合、単離しようとするゲノム領域の内部に認識配列がなく、目的のゲノム領域以外の部分をできるだけ含まない位置に認識配列が存在する制限酵素を選択することが好ましい。
ＤＮＡ分解酵素（エンドヌクレアーゼ）を用いる場合は、単離しようとするゲノム領域のサイズより少し大きい断片を生成する反応条件を予め決定しておくことが好ましい。
超音波処理を行う場合は、単離しようとするゲノム領域のサイズより少し大きい断片に切断される処理条件を予め決定しておくことが好ましい。
（５）工程５
工程５は、外来性分子と特異的に結合する分子を結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程である。外来性分子は単離しようとするゲノム領域中の外来性ＤＮＡ結合分子認識配列部分でゲノムＤＮＡと結合しており、この結合（相互作用状態）は、工程３の処理により保持されているので、外来性分子と特異的に結合する分子が結合して生成する複合体には目的の特定ゲノム領域が含まれている。したがって、生成した複合体を回収することにより、目的の特定ゲノム領域が単離されたことになる。
工程５は、外来性分子と特異的に結合する分子を結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程である。外来性分子は単離しようとするゲノム領域中の外来性ＤＮＡ結合分子認識配列部分でゲノムＤＮＡと結合しており、この結合（相互作用状態）は、工程３の処理により保持されているので、外来性分子と特異的に結合する分子が結合して生成する複合体には目的の特定ゲノム領域が含まれている。したがって、生成した複合体を回収することにより、目的の特定ゲノム領域が単離されたことになる。
工程５で用いる方法は、外来性分子が結合した目的の特定ゲノム領域と、外来性分子と特異的に結合する分子との複合体を生成することができ、当該複合体を回収できる方法であれば、どのような方法であってもよい。例えば、外来性分子と特異的に結合する抗体やペプチド、ニッケルイオン等が固定された担体を用いて、複合体を沈降させて回収する方法などが挙げられる。
外来性分子として、２種類のタグ配列を含み、両タグ配列がプロテアーゼ認識配列を介して連結されている構成の融合分子を用いた場合には、第１のタグ配列と特異的に結合する分子を結合させて第１の複合体を生成した後、第１の複合体をプロテアーゼで処理してプロテアーゼ認識配列を切断し、続いて第２のタグ配列と特異的に結合する分子を、第１の複合体から遊離したゲノムＤＮＡに結合させて第２の複合体を生成することが好ましい。２段階で複合体を生成することにより、第１のタグ配列と特異的に結合する分子や、これを固定した担体に非特異的に結合する分子がバックグラウンドとして濃縮される不都合を回避でき、特定ゲノム領域の特異的な単離効率が大幅に向上する。
なお、プロテアーゼを使用せず、タグ配列と特異的に結合する分子を過剰に加えることにより、タグを融合させた外来性分子と担体から、複合体を遊離させることによりバックグラウンドを低減させることも可能である。具体的な例としては、ＦＬＡＧペプチドを加えることにより、ＦＬＡＧタグを融合させたＤＮＡ結合分子を結合させた担体から、複合体を遊離させる場合等が挙げられる。
〔単離した特定ゲノム領域の利用〕
本発明の方法により単離された特定ゲノム領域は、エピジェネティクス制御の分子機構解析のための試料として非常に有用である。すなわち、単離された特定ゲノム領域には、ゲノムＤＮＡと相互作用している分子（タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）の相互作用状態が保持されているので、相互作用している分子を同定し、その機能を推定することが可能となり、エピジェネティクス制御の分子機構解析に大きな貢献をもたらすことが期待できる。
本発明の方法により単離された特定ゲノム領域は、エピジェネティクス制御の分子機構解析のための試料として非常に有用である。すなわち、単離された特定ゲノム領域には、ゲノムＤＮＡと相互作用している分子（タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）の相互作用状態が保持されているので、相互作用している分子を同定し、その機能を推定することが可能となり、エピジェネティクス制御の分子機構解析に大きな貢献をもたらすことが期待できる。
単離された特定ゲノム領域において相互作用している分子の同定は、公知の方法を適宜組み合わせて行えばよく、特に限定されない。例えば、相互作用状態の保持を解除して、相互作用している分子を分離、精製し、公知の同定方法を適用することで行うことができる。相互作用状態を保持する処理がホルムアルデヒドを用いた架橋処理の場合には、高濃度の塩溶液（５Ｍ ＮａＣｌ溶液など）を添加して適当な温度で適当な時間（例えば約６５℃で一夜）インキュベートすることにより解除することができる。公知の同定方法としては、対象がタンパク質の場合には、例えば、質量分析、免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）などが挙げられ、対象がＤＮＡまたはＲＮＡの場合には、例えば、塩基配列解析、マイクロアレイ解析、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）などが挙げられる。
〔本発明の第１の実施形態〕
図１に、本発明の第１の実施形態を示す。ただし、本発明の方法は、当該実施形態に限定されるものではない。図１中、Ｘは制限酵素認識部位を表す。以下、図１に従って、本発明の一実施形態を説明する。
（１）図１（Ａ）に示すように、解析対象細胞の任意のゲノム領域（図１（Ａ）では、コーディング領域上流のプロモーター／エンハンサー領域）にＬｅｘＡ結合配列を複数回繰り返した配列を含むＤＮＡを挿入する。
（２）細菌のＤＮＡ結合タンパク質であるＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインに、ＳＶ４０Ｔ抗原の核移行シグナル、カルモジュリン結合ペプチド、ＴＥＶプロテアーゼ切断配列、およびＦＬＡＧタグが結合した融合タンパク質（ＦＣＮＬＤ、図１（Ｂ）参照）を発現させるための発現ベクターを作製し、解析対象細胞内で発現可能に導入する。２種類のタグ配列（ＦＬＡＧタグおよびカルモジュリン結合ペプチド）がＴＥＶプロテアーゼ切断配列で連結されているので、２段階の複合体回収操作が可能となっている。
（３）作製した細胞に対して、必要に応じで刺激を与える。続いてホルムアルデヒドで細胞を架橋処理する。この作業により、単離しようとするゲノム領域においてゲノムＤＮＡと相互作用しているタンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびその他の分子の相互作用状態を保持させることができる。もちろん、この作業により、ゲノムＤＮＡに挿入したＬｅｘＡ結合配列とＦＣＮＬＤとの結合状態も保持される（図１（Ｃ）上段参照）。
（４）細胞を溶解し、架橋処理されたゲノムＤＮＡを制限酵素で消化して断片化する（図１（Ｃ）中段参照）。断片化は、超音波処理で行ってもよい。この作業により、挿入したＬｅｘＡ結合配列を含むＤＮＡ断片と、これを含まないＤＮＡ断片（図１（Ｃ）中段の「その他のＤＮＡ蛋白複合体」）が生成する。
（５）ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインを含むゲノム領域は、抗ＦＬＡＧ抗体と結合して複合体（免疫沈降複合体）を生成する（図１（Ｃ）下段参照）。
（６）単離した複合体はゲノム領域と相互作用している分子を保持している。したがって、架橋を解除し、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびその他の分子を精製してこれらの分子を同定することができる。
図１に、本発明の第１の実施形態を示す。ただし、本発明の方法は、当該実施形態に限定されるものではない。図１中、Ｘは制限酵素認識部位を表す。以下、図１に従って、本発明の一実施形態を説明する。
（１）図１（Ａ）に示すように、解析対象細胞の任意のゲノム領域（図１（Ａ）では、コーディング領域上流のプロモーター／エンハンサー領域）にＬｅｘＡ結合配列を複数回繰り返した配列を含むＤＮＡを挿入する。
（２）細菌のＤＮＡ結合タンパク質であるＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインに、ＳＶ４０Ｔ抗原の核移行シグナル、カルモジュリン結合ペプチド、ＴＥＶプロテアーゼ切断配列、およびＦＬＡＧタグが結合した融合タンパク質（ＦＣＮＬＤ、図１（Ｂ）参照）を発現させるための発現ベクターを作製し、解析対象細胞内で発現可能に導入する。２種類のタグ配列（ＦＬＡＧタグおよびカルモジュリン結合ペプチド）がＴＥＶプロテアーゼ切断配列で連結されているので、２段階の複合体回収操作が可能となっている。
（３）作製した細胞に対して、必要に応じで刺激を与える。続いてホルムアルデヒドで細胞を架橋処理する。この作業により、単離しようとするゲノム領域においてゲノムＤＮＡと相互作用しているタンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびその他の分子の相互作用状態を保持させることができる。もちろん、この作業により、ゲノムＤＮＡに挿入したＬｅｘＡ結合配列とＦＣＮＬＤとの結合状態も保持される（図１（Ｃ）上段参照）。
（４）細胞を溶解し、架橋処理されたゲノムＤＮＡを制限酵素で消化して断片化する（図１（Ｃ）中段参照）。断片化は、超音波処理で行ってもよい。この作業により、挿入したＬｅｘＡ結合配列を含むＤＮＡ断片と、これを含まないＤＮＡ断片（図１（Ｃ）中段の「その他のＤＮＡ蛋白複合体」）が生成する。
（５）ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインを含むゲノム領域は、抗ＦＬＡＧ抗体と結合して複合体（免疫沈降複合体）を生成する（図１（Ｃ）下段参照）。
（６）単離した複合体はゲノム領域と相互作用している分子を保持している。したがって、架橋を解除し、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびその他の分子を精製してこれらの分子を同定することができる。
〔本発明の第２の実施形態〕
図１１に、実施例３に基づく本発明の第２の実施形態を示す。図中、ｃＨＳ４ｃｏｒｅは、実施例３で用いた特定ゲノム領域を表し、ｐＳＶ４０−Ｌｕｃは、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）カセットを表し、ｐＳＶ４０−Ｎｅｏｒは、薬剤耐性（ネオマイシン耐性）カセットを表す。以下、図１１に従って、本発明の第２の実施形態を説明する。
（１）ｃＨＳ４ｃｏｒｅ（特定ゲノム領域）とＬｅｘＡ結合配列（LexA binding elements）を含むＤＮＡ断片が挿入されたベクターを作製し、細胞に導入する。図１１に示されたベクター（cHS4 vector）は、ＬｅｘＡ結合配列の両側にｃＨＳ４ｃｏｒｅが６個ずつ、合計１２個のｃＨＳ４ｃｏｒｅを含むＤＮＡ断片をトランスジーンとしている。また、２個のトランスジーンがｐＳＶ４０−Ｌｕｃの両側に配置されている。ただし、ｐＳＶ４０−Ｌｕｃは必須の構成ではなく、トランスジーンは１個だけでもよい。薬剤耐性カセットも必須ではないが、含まれていることが好ましい。この場合、ネオマイシン耐性細胞を選択することにより、トランスジーンがゲノムＤＮＡに安定に組み込まれた細胞を選択することができる。
（２）実施例３ではＦＣＮＬＤ（図１（Ｂ）参照）を安定に発現する細胞に、トランスジーンを導入しているので、ゲノムに組み込まれたトランスジーンのＬｅｘＡ結合配列にＦＣＮＬＤが結合する。
（３）細胞をホルムアルデヒドで架橋処理し、制限酵素または超音波処理してゲノムＤＮＡを断片化する。
（４）ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインを含むゲノム領域は、抗ＦＬＡＧ抗体と結合して複合体（免疫沈降複合体）を生成するので、これを回収する。
（５）回収した複合体の架橋を解除し、ゲノム領域と相互作用している分子を質量分析等により同定する。
図１１に、実施例３に基づく本発明の第２の実施形態を示す。図中、ｃＨＳ４ｃｏｒｅは、実施例３で用いた特定ゲノム領域を表し、ｐＳＶ４０−Ｌｕｃは、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）カセットを表し、ｐＳＶ４０−Ｎｅｏｒは、薬剤耐性（ネオマイシン耐性）カセットを表す。以下、図１１に従って、本発明の第２の実施形態を説明する。
（１）ｃＨＳ４ｃｏｒｅ（特定ゲノム領域）とＬｅｘＡ結合配列（LexA binding elements）を含むＤＮＡ断片が挿入されたベクターを作製し、細胞に導入する。図１１に示されたベクター（cHS4 vector）は、ＬｅｘＡ結合配列の両側にｃＨＳ４ｃｏｒｅが６個ずつ、合計１２個のｃＨＳ４ｃｏｒｅを含むＤＮＡ断片をトランスジーンとしている。また、２個のトランスジーンがｐＳＶ４０−Ｌｕｃの両側に配置されている。ただし、ｐＳＶ４０−Ｌｕｃは必須の構成ではなく、トランスジーンは１個だけでもよい。薬剤耐性カセットも必須ではないが、含まれていることが好ましい。この場合、ネオマイシン耐性細胞を選択することにより、トランスジーンがゲノムＤＮＡに安定に組み込まれた細胞を選択することができる。
（２）実施例３ではＦＣＮＬＤ（図１（Ｂ）参照）を安定に発現する細胞に、トランスジーンを導入しているので、ゲノムに組み込まれたトランスジーンのＬｅｘＡ結合配列にＦＣＮＬＤが結合する。
（３）細胞をホルムアルデヒドで架橋処理し、制限酵素または超音波処理してゲノムＤＮＡを断片化する。
（４）ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインを含むゲノム領域は、抗ＦＬＡＧ抗体と結合して複合体（免疫沈降複合体）を生成するので、これを回収する。
（５）回収した複合体の架橋を解除し、ゲノム領域と相互作用している分子を質量分析等により同定する。
〔キット〕
本発明は、特定ゲノム領域単離用キットを提供する。本願発明のキットは、以下の（Ａ）および（Ｂ）のいずれか一方を包含するものであればよい。
（Ａ）外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片を、ゲノムＤＮＡに挿入するためのターゲッティングベクター
（Ｂ）外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列と、特定ゲノム領域のＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ断片を、細胞に導入するためのベクター
さらに、少なくとも前記外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む外来性分子、または当該外来性分子を発現させるための発現ベクターを包含することが好ましい。これら以外のキットの構成は特に限定されないが、例えば、架橋用試薬、外来性分子と特異的に結合する分子、反応用チューブ、取扱説明書等が挙げられる。本発明のキットを用いることにより、本発明の特定ゲノムの単離方法を簡便かつ迅速に実施することができる。
本発明は、特定ゲノム領域単離用キットを提供する。本願発明のキットは、以下の（Ａ）および（Ｂ）のいずれか一方を包含するものであればよい。
（Ａ）外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片を、ゲノムＤＮＡに挿入するためのターゲッティングベクター
（Ｂ）外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列と、特定ゲノム領域のＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ断片を、細胞に導入するためのベクター
さらに、少なくとも前記外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む外来性分子、または当該外来性分子を発現させるための発現ベクターを包含することが好ましい。これら以外のキットの構成は特に限定されないが、例えば、架橋用試薬、外来性分子と特異的に結合する分子、反応用チューブ、取扱説明書等が挙げられる。本発明のキットを用いることにより、本発明の特定ゲノムの単離方法を簡便かつ迅速に実施することができる。
外来性ＤＮＡ結合分子は、本発明の特定ゲノム領域の単離方法において説明した外来性ＤＮＡ結合分子を好適に用いることができる。真核細胞の特定ゲノム領域単離用キットに用いる場合、好ましくはＬｅｘＡであり、特に好ましくはＦＣＮＬＤである。また、（Ａ）のターゲッティングベクターの相同組み換え領域、および、（Ｂ）のベクターにおける特定ゲノム領域は、キットの使用者が任意に設定できることが好ましい。
（Ｂ）において、特定ゲノム領域に転写調節ＤＮＡ領域等の機能的ＤＮＡ領域を用いる場合には、（Ｂ）のベクターは、レポーター遺伝子を含むことが好ましい。転写調節ＤＮＡ領域等の機能的ＤＮＡ領域とレポーター遺伝子とを組み合わせることにより、相互作用分子による転写調節等の機能レベルを確認することが可能となる。レポーター遺伝子は、特に限定されず、公知のレポーター遺伝を好適に用いることができる。具体的には、例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼ、ヒトＣＤ２などが挙げられる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕
（１）ＦＣＮＬＤ−ＢＬＧ細胞の作製
ＢＬＧ細胞株（文献Ｉ：Hoshino A. et al. Mol. Cell, 15, 153-159 (2004).）を用いて実験を行った。ＢＬＧ細胞株はマウスプロＢ細胞株のＢａ／Ｆ３細胞に、ＬｅｘＡエレメントとｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ＧＦＰ遺伝子からなるＬｅｘＡ−ＧＦＰレポーター遺伝子（図２参照）を導入した細胞株である。
（１）ＦＣＮＬＤ−ＢＬＧ細胞の作製
ＢＬＧ細胞株（文献Ｉ：Hoshino A. et al. Mol. Cell, 15, 153-159 (2004).）を用いて実験を行った。ＢＬＧ細胞株はマウスプロＢ細胞株のＢａ／Ｆ３細胞に、ＬｅｘＡエレメントとｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ＧＦＰ遺伝子からなるＬｅｘＡ−ＧＦＰレポーター遺伝子（図２参照）を導入した細胞株である。
ＦＣＮＬＤ発現用プラスミド（ＦＣＮＬＤ／ｐＥＦ）をＢＬＧに導入し、ＦＣＮＬＤ−ＢＬＧ細胞を作製した。まず、ＦＣＮＬＤ／ｐＥＦを以下の手順で作製した。
(a) ＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインをコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅した。ｐＬＧプラスミド（上記文献Ｉ参照）を鋳型とし、以下のプライマー１および２を用いた。
プライマー１：5'-ccctttcctgagggaatgaaagcgttaacg-3'（配列番号１）
プライマー２：5'-tgcggccgcttagggttcaccggcagccac-3'（配列番号２）
(b) 得られたＰＣＲ産物を、制限酵素（Ｂｓｕ３６ＩおよびＮｏｔＩ）で消化した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のＳＶ４０Ｔ抗原の核移行シグナル（上記文献Ｉ参照）に連結した。
(c) ＤＮＡシーケンスにより挿入配列を確認した後、得られたコンストラクトを制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ）で消化し、ｐＭＩＲ−ＤＦＴベクターにサブクローニングした。このｐＭＩＲ−ＤＦＴベクターは、２つのＦＬＡＧタグと、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位と、カルモジュリン結合タンパク質とをＮ末端に有する融合タンパク質を発現するベクターである。
(d) 得られたコンストラクトからＦＣＮＬＤをコードするｃＤＮＡを切り出し、ｐＥＦ（文献ＩＩ：Fujii H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5482-5486 (1995).）にサブクローニングして、ＦＣＮＬＤ／ｐＥＦを得た。
(a) ＬｅｘＡのＤＮＡ結合ドメインをコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅した。ｐＬＧプラスミド（上記文献Ｉ参照）を鋳型とし、以下のプライマー１および２を用いた。
プライマー１：5'-ccctttcctgagggaatgaaagcgttaacg-3'（配列番号１）
プライマー２：5'-tgcggccgcttagggttcaccggcagccac-3'（配列番号２）
(b) 得られたＰＣＲ産物を、制限酵素（Ｂｓｕ３６ＩおよびＮｏｔＩ）で消化した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のＳＶ４０Ｔ抗原の核移行シグナル（上記文献Ｉ参照）に連結した。
(c) ＤＮＡシーケンスにより挿入配列を確認した後、得られたコンストラクトを制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ）で消化し、ｐＭＩＲ−ＤＦＴベクターにサブクローニングした。このｐＭＩＲ−ＤＦＴベクターは、２つのＦＬＡＧタグと、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位と、カルモジュリン結合タンパク質とをＮ末端に有する融合タンパク質を発現するベクターである。
(d) 得られたコンストラクトからＦＣＮＬＤをコードするｃＤＮＡを切り出し、ｐＥＦ（文献ＩＩ：Fujii H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5482-5486 (1995).）にサブクローニングして、ＦＣＮＬＤ／ｐＥＦを得た。
ＦＣＮＬＤ−ＢＬＧ細胞におけるＦＣＮＬＤの発現は、抗ＬｅｘＡ抗体（ミリポア社製、０６−７１９）を用いた免疫ブロット分析により確認した。図３は、ＢＬＧ親細胞およびＦＣＮＬＤ−ＢＬＧ細胞からそれぞれ抽出物を調製し、抗ＬｅｘＡ抗体を用いた免疫ブロット分析に供した結果を示す図である。図３からわかるように、ＦＣＮＬＤ−ＢＬＧ細胞はＦＣＮＬＤを発現していることを確認した。
（２）特定ゲノム領域の単離
ＢＬＧ親細胞およびＦＣＮＬＤ−ＢＬＧ細胞を用いて、以下の手順で行った。
(a)２×１０６個の細胞を含むＲＰＭＩ完全培地１０ｍＬに２７０μＬの３７％ホルムアルデヒドを添加して室温で１０分間置き、細胞をホルムアルデヒドで架橋処理した。続いて、１．２５Ｍグリシン溶液を１ｍＬ添加して室温で５分間置き、中和した。
(b) 遠心分離（１ｋｒｐｍ、５分間、室温）して、細胞を氷冷ＰＢＳを用いて２回洗浄した後、プロテアーゼインヒビターカクテル（コンプリートミニ ＥＤＴＡフリー、ロシュ製）を含む氷冷ＰＢＳに懸濁した。
(c) 遠心分離（７００×ｇ、５分間、４℃）後、ペレットを４００μＬのＳＤＳ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．１）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ、プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁した。
(d) 架橋されたＤＮＡを超音波処理により断片化した（超音波発生器：Cole Parmer, Ultra Sonic Processor, Model CP130; probe: CV18, 4273, amplitude 30, 10 sec x 4 with 10 sec intervals）。
(e) 遠心分離（１０ｋｒｐｍ、１０分間、４℃）して上清を回収し、希釈バッファー１（０．０１％ ＳＤＳ、１．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１６．７ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１６７ｍＭ ＮａＣｌ、プロテアーゼインヒビターカクテル）で希釈した。続いて、コントロールＩｇＧとプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）、または抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（シグマアルドリッチ）を用いてレポーター遺伝子を免疫沈降した。
(f) 洗浄後、免疫沈降複合体を２００μＬの溶出バッファー（１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１％ＳＤＳ）で溶出した。
(g) ８μＬの５Ｍ ＮａＣｌ溶液を添加し、６５℃で一夜インキュベートすることにより、架橋を解除した。
(h) ＲＮａｓｅＡおよびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで処理し、ＤＮＡを精製した。
(i) 得られたＤＮＡをＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲに供した。ＬｅｘＡ−ＧＦＰレポーターＤＮＡを検出するプライマーとして、以下のプライマー３および４を用いた（図２参照）。
プライマー３：5'-ccccagtgcaagtgcaggtgcc-3'（配列番号３）
プライマー４：5'-cgtcgccgtccagctcgaccag-3'（配列番号４）
ＢＬＧ親細胞およびＦＣＮＬＤ−ＢＬＧ細胞を用いて、以下の手順で行った。
(a)２×１０６個の細胞を含むＲＰＭＩ完全培地１０ｍＬに２７０μＬの３７％ホルムアルデヒドを添加して室温で１０分間置き、細胞をホルムアルデヒドで架橋処理した。続いて、１．２５Ｍグリシン溶液を１ｍＬ添加して室温で５分間置き、中和した。
(b) 遠心分離（１ｋｒｐｍ、５分間、室温）して、細胞を氷冷ＰＢＳを用いて２回洗浄した後、プロテアーゼインヒビターカクテル（コンプリートミニ ＥＤＴＡフリー、ロシュ製）を含む氷冷ＰＢＳに懸濁した。
(c) 遠心分離（７００×ｇ、５分間、４℃）後、ペレットを４００μＬのＳＤＳ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．１）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ、プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁した。
(d) 架橋されたＤＮＡを超音波処理により断片化した（超音波発生器：Cole Parmer, Ultra Sonic Processor, Model CP130; probe: CV18, 4273, amplitude 30, 10 sec x 4 with 10 sec intervals）。
(e) 遠心分離（１０ｋｒｐｍ、１０分間、４℃）して上清を回収し、希釈バッファー１（０．０１％ ＳＤＳ、１．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１６．７ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１６７ｍＭ ＮａＣｌ、プロテアーゼインヒビターカクテル）で希釈した。続いて、コントロールＩｇＧとプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア）、または抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲル（シグマアルドリッチ）を用いてレポーター遺伝子を免疫沈降した。
(f) 洗浄後、免疫沈降複合体を２００μＬの溶出バッファー（１００ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１％ＳＤＳ）で溶出した。
(g) ８μＬの５Ｍ ＮａＣｌ溶液を添加し、６５℃で一夜インキュベートすることにより、架橋を解除した。
(h) ＲＮａｓｅＡおよびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで処理し、ＤＮＡを精製した。
(i) 得られたＤＮＡをＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲに供した。ＬｅｘＡ−ＧＦＰレポーターＤＮＡを検出するプライマーとして、以下のプライマー３および４を用いた（図２参照）。
プライマー３：5'-ccccagtgcaagtgcaggtgcc-3'（配列番号３）
プライマー４：5'-cgtcgccgtccagctcgaccag-3'（配列番号４）
ＰＣＲの結果を図４に示した。図４中、ＰＣは精製したＬｅｘＡ−ＧＦＰレポーターＤＮＡを鋳型に使用した陽性対象を表し、Ｉｎｐｕｔは断片化したＤＮＡを免疫沈降を行わずにクロスリンク解除したサンプルを表す。ＦＣＮＬＤ（−）はＢＬＧ親細胞由来のサンプルを表し、ＦＣＮＬＤ（＋）はＦＣＮＬＤ−ＢＬＧ細胞由来のサンプルを表す。図４から明らかなように、免疫沈降を行った４種類のサンプル中、ＦＣＮＬＤ（＋）かつ抗ＦＬＡＧ抗体を用いた場合のみ免疫沈降複合体からＬｅｘＡ−ＧＦＰレポーターＤＮＡが検出された。免疫沈降を行わないサンプル（Ｉｎｐｕｔ）では、ＦＣＮＬＤの有無に関わらず、ＬｅｘＡ−ＧＦＰレポーターＤＮＡが検出された。この結果から、ＦＣＮＬＤ存在下において抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降により、ＬｅｘＡ−ＧＦＰレポーターＤＮＡを回収できることが明らかとなった。
リアルタイムＰＣＲにより定量したＬｅｘＡ−ＧＦＰレポーターＤＮＡ量に基づいて求めた免疫沈降複合体中のＬｅｘＡ−ＧＦＰレポーターＤＮＡの回収率を図５に示した。図５中、グラフ縦軸の「％ｉｎｐｕｔ」は、超音波処理後の全ＤＮＡ量に対する免疫沈降により回収されたＬｅｘＡ−ＧＦＰレポーターＤＮＡの量の割合（回収率）を表している。図５に示したように、ＦＣＮＬＤ−ＢＬＧ細胞由来のサンプルを抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降した場合、約２．５％のＬｅｘＡ−ＧＦＰレポーターＤＮＡが回収できた。
これらの結果から、本方法により特定のゲノム領域を単離し、回収できることが明らかとなった。
これらの結果から、本方法により特定のゲノム領域を単離し、回収できることが明らかとなった。
〔実施例２〕
（１）ＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞の作製
ＧＦＰ遺伝子と融合したヒトＩＲＦ−１プロモーターのＳｔａｔ結合配列の上流にＬｅｘＡ結合配列を挿入し、ＬｅｘＡエレメントＩＲＦ−１プロモーターＧＦＰレポーター（以下、「ＬＩＰＧ」という。）遺伝子を作製した（図６参照）。ヒトＩＲＦ−１プロモーターのＳｔａｔ結合配列は、インターフェロン−γが誘導するＩＲＦ−１遺伝子の転写に必須であることが知られている（文献ＩＩＩ：Sims S H et al. Mol. Cell. Biol., 13, 690-702 (1993).）。さらに、Ｓｔａｔ１は、インターフェロン−γが誘導するＩＲＦ−１遺伝子の転写に必要であることが知られている（文献ＩＶ：Durbin J E et al. Cell, 84, 443-450 (1996). 文献Ｖ：Meraz M A et al. Cell, 84, 431-442 (1996).）。
ＬＩＰＧ遺伝子がＢａ／Ｆ３細胞に安定にトランスフェクトされたＢＬＩＰＧ細胞株を作製した。続いて、ＦＣＮＬＤ遺伝子が安定にトランスフェクトされたＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞株を作製した。ＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞におけるＦＣＮＬＤの発現は、抗ＬｅｘＡ抗体を用いた免疫ブロット分析により確認した。
（１）ＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞の作製
ＧＦＰ遺伝子と融合したヒトＩＲＦ−１プロモーターのＳｔａｔ結合配列の上流にＬｅｘＡ結合配列を挿入し、ＬｅｘＡエレメントＩＲＦ−１プロモーターＧＦＰレポーター（以下、「ＬＩＰＧ」という。）遺伝子を作製した（図６参照）。ヒトＩＲＦ−１プロモーターのＳｔａｔ結合配列は、インターフェロン−γが誘導するＩＲＦ−１遺伝子の転写に必須であることが知られている（文献ＩＩＩ：Sims S H et al. Mol. Cell. Biol., 13, 690-702 (1993).）。さらに、Ｓｔａｔ１は、インターフェロン−γが誘導するＩＲＦ−１遺伝子の転写に必要であることが知られている（文献ＩＶ：Durbin J E et al. Cell, 84, 443-450 (1996). 文献Ｖ：Meraz M A et al. Cell, 84, 431-442 (1996).）。
ＬＩＰＧ遺伝子がＢａ／Ｆ３細胞に安定にトランスフェクトされたＢＬＩＰＧ細胞株を作製した。続いて、ＦＣＮＬＤ遺伝子が安定にトランスフェクトされたＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞株を作製した。ＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞におけるＦＣＮＬＤの発現は、抗ＬｅｘＡ抗体を用いた免疫ブロット分析により確認した。
（２）インターフェロン−γによるＧＦＰの発現誘導
インターフェロン−γによるＧＦＰの発現誘導を、フローサイトメトリーを用いて確認した。実験方法は、文献ＶＩ：Hoshino A. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 346, 1062-1066 (2006). の記載に従った。結果を図７に示した。図７からからわかるように、インターフェロン−γの添加によりチャートが右にシフトし、ＧＦＰが発現していることが確認された。
インターフェロン−γによるＧＦＰの発現誘導を、フローサイトメトリーを用いて確認した。実験方法は、文献ＶＩ：Hoshino A. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 346, 1062-1066 (2006). の記載に従った。結果を図７に示した。図７からからわかるように、インターフェロン−γの添加によりチャートが右にシフトし、ＧＦＰが発現していることが確認された。
（３）抗Ｓｔａｔ１抗体を用いた免疫沈降
２×１０７個のＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞に１０ｎｇ／ｍＬのインターフェロン−γを添加し、１５または３０分間インキュベートした。インターフェロン−γを添加しない対照を設けた。実施例１の（２）(a)〜(h)と同様に、細胞をホルムアルデヒドでクロスリンクし、溶解し、超音波処理により断片化し、免疫沈降を行い、クロスリンクを解除し、ＤＮＡを精製した。免疫沈降には、抗Ｓｔａｔ１抗体を用いた。
精製したＤＮＡをＰＣＲに供した。ＬＩＰＧを検出するプライマーとして、以下のプライマー５および６を用いた（図６参照）
プライマー５：5'-tgtacttccccttcgccgctagct-3'（配列番号５）
プライマー６：5'-gcaatccaaacacttagcgggatt-3'（配列番号６）
２×１０７個のＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞に１０ｎｇ／ｍＬのインターフェロン−γを添加し、１５または３０分間インキュベートした。インターフェロン−γを添加しない対照を設けた。実施例１の（２）(a)〜(h)と同様に、細胞をホルムアルデヒドでクロスリンクし、溶解し、超音波処理により断片化し、免疫沈降を行い、クロスリンクを解除し、ＤＮＡを精製した。免疫沈降には、抗Ｓｔａｔ１抗体を用いた。
精製したＤＮＡをＰＣＲに供した。ＬＩＰＧを検出するプライマーとして、以下のプライマー５および６を用いた（図６参照）
プライマー５：5'-tgtacttccccttcgccgctagct-3'（配列番号５）
プライマー６：5'-gcaatccaaacacttagcgggatt-3'（配列番号６）
結果を図８に示した。図８中、ＩＦＮγ（ｍｉｎ）０のサンプルはインターフェロン−γを添加しない対照を表す。また、Ｉｎｐｕｔは断片化したＤＮＡを免疫沈降を行わずにクロスリンク解除したサンプルを表す。図８から明らかなように、インターフェロン−γで処理したＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞から得たＤＮＡ断片と抗Ｓｔａｔ１抗体との免疫沈降複合体中にＬＩＰＧが検出され、インターフェロン−γで処理していない場合は免疫沈降複合体中にＬＩＰＧが検出されなかった。免疫沈降を行わないサンプル（Ｉｎｐｕｔ）では、インターフェロン−γ処理の有無に関わらず、ＬＩＰＧが検出された。
この結果から、ＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞をインターフェロン−γで処理すれば、ＬＩＰＧにＳｔａｔ１が結合し、抗Ｓｔａｔ１抗体を用いてＬＩＰＧを単離できることが明らかとなった。
この結果から、ＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞をインターフェロン−γで処理すれば、ＬＩＰＧにＳｔａｔ１が結合し、抗Ｓｔａｔ１抗体を用いてＬＩＰＧを単離できることが明らかとなった。
（４）抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降
１×１０８個のＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞に１０ｎｇ／ｍＬのインターフェロン−γを添加し、３０分間インキュベートした。インターフェロン−γを添加しない対照を設けた。実施例１の（２）(a)〜(h)と同様に、細胞をホルムアルデヒドでクロスリンクし、溶解し、超音波処理により断片化し、免疫沈降を行い、クロスリンクを解除し、ＤＮＡを精製した。
具体的には、免疫沈降は、コントロールＩｇＧとプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、または抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲルを用いて行った。精製したＤＮＡを鋳型として、上記プライマー５および６を用いてＰＣＲを行った。また、免疫沈降を行わないサンプル（Ｉｎｐｕｔ）についても同様にＰＣＲを行った。
１×１０８個のＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞に１０ｎｇ／ｍＬのインターフェロン−γを添加し、３０分間インキュベートした。インターフェロン−γを添加しない対照を設けた。実施例１の（２）(a)〜(h)と同様に、細胞をホルムアルデヒドでクロスリンクし、溶解し、超音波処理により断片化し、免疫沈降を行い、クロスリンクを解除し、ＤＮＡを精製した。
具体的には、免疫沈降は、コントロールＩｇＧとプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、または抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲルを用いて行った。精製したＤＮＡを鋳型として、上記プライマー５および６を用いてＰＣＲを行った。また、免疫沈降を行わないサンプル（Ｉｎｐｕｔ）についても同様にＰＣＲを行った。
結果を図９に示した。図９中、ＩＦＮγ（−）はインターフェロン−γで処理していないサンプルを表し、ＩＦＮγ（＋）はインターフェロン−γで処理したサンプルを表す。図９から明らかなように、コントロールＩｇＧの免疫沈降複合体からはＬＩＰＧが検出されず、抗ＦＬＡＧ抗体の免疫沈降複合体からはインターフェロン−γ処理の有無に関わらず、ＬＩＰＧが検出された。もちろん、免疫沈降を行わないサンプル（Ｉｎｐｕｔ）では、インターフェロン−γ処理の有無に関わらず、ＬＩＰＧが検出された。
この結果から、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＬＩＰＧを単離できることが明らかとなった。
この結果から、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＬＩＰＧを単離できることが明らかとなった。
（５）抗ＦＬＡＧ抗体と抗Ｓｔａｔ１抗体を用いた２段階免疫沈降
１×１０８個のＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞に１０ｎｇ／ｍＬのインターフェロン−γを添加し、３０分間インキュベートした。インターフェロン−γを添加しない対照を設けた。実施例１の（２）(a)〜(e)と同様に、細胞をホルムアルデヒドでクロスリンクし、溶解し、超音波処理により断片化し、免疫沈降を行った。１段階目の免疫沈降には抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲルを用いた。
続いて、免疫沈降複合体に１０００ユニットのＡｃＴＥＶプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、３０℃で３時間インキュベートした。これにより、ＬＩＰＧのＬｅｘＡ結合配列に結合したＦＣＮＬＤが切断され、ＬＩＰＧが抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲルから切り出された。切り出されたＬＩＰＧに対して、２段階目の免疫沈降を、コントロールＩｇＧまたは抗Ｓｔａｔ１抗体と、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとを用いて行った。その後、実施例１の手順に従いクロスリンクを解除し、ＤＮＡを精製した。
精製したＤＮＡを鋳型として、上記プライマー５および６を用いてＰＣＲを行った。また、別途免疫沈降を行わないサンプル（Ｉｎｐｕｔ）、およびＡｃＴＥＶプロテアーゼで切り出されたサンプル（２段階目の免疫沈降なし）についても同様にＰＣＲを行った。
１×１０８個のＦＣＮＬＤ−ＢＬＩＰＧ細胞に１０ｎｇ／ｍＬのインターフェロン−γを添加し、３０分間インキュベートした。インターフェロン−γを添加しない対照を設けた。実施例１の（２）(a)〜(e)と同様に、細胞をホルムアルデヒドでクロスリンクし、溶解し、超音波処理により断片化し、免疫沈降を行った。１段階目の免疫沈降には抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲルを用いた。
続いて、免疫沈降複合体に１０００ユニットのＡｃＴＥＶプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、３０℃で３時間インキュベートした。これにより、ＬＩＰＧのＬｅｘＡ結合配列に結合したＦＣＮＬＤが切断され、ＬＩＰＧが抗ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲルから切り出された。切り出されたＬＩＰＧに対して、２段階目の免疫沈降を、コントロールＩｇＧまたは抗Ｓｔａｔ１抗体と、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅとを用いて行った。その後、実施例１の手順に従いクロスリンクを解除し、ＤＮＡを精製した。
精製したＤＮＡを鋳型として、上記プライマー５および６を用いてＰＣＲを行った。また、別途免疫沈降を行わないサンプル（Ｉｎｐｕｔ）、およびＡｃＴＥＶプロテアーゼで切り出されたサンプル（２段階目の免疫沈降なし）についても同様にＰＣＲを行った。
結果を図１０に示した。免疫沈降を行わないサンプル（Ｉｎｐｕｔ）では、インターフェロン−γ処理の有無に関わらず、ＬＩＰＧが検出された。また、ＡｃＴＥＶプロテアーゼで切り出されたサンプルについても、インターフェロン−γ処理の有無に関わらず、ＬＩＰＧが検出された。２段階目の免疫沈降を行った場合は、インターフェロンγ処理を行い抗Ｓｔａｔ１抗体を用いた場合のみ２段階目の免疫沈降複合体からＬＩＰＧが検出された。
この結果から、細胞外シグナルにより活性化された転写因子を含むクロマチン複合体を単離でき、生化学的および分子生物学的解析に提供できることが示された。
この結果から、細胞外シグナルにより活性化された転写因子を含むクロマチン複合体を単離でき、生化学的および分子生物学的解析に提供できることが示された。
〔実施例３〕
インスレーターはゲノム上のインスレーター配列およびそれに結合する分子から構成されており、エンハンサー遮断効果の発揮およびポジション効果の抑制により、数万個の遺伝子が協調し、干渉せずに発現することができる（Chung,J.H., Bell,A.C. and Felsenfeld,G., Characterization of the chicken beta-globin insulator, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (2), 575-580 (1997)、Burgess-Beusse B, Farrell C, Gaszner M, Litt M, Mutskov V, Recillas-Targa F, Simpson M, West A, Felsenfeld G., The insulation of genes from external enhancers and silencing chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 16433-16437 (2002) ）。そこで、本発明の特定ゲノム領域の単離方法を用いて、インスレーター結合タンパク質の同定を試みた。
インスレーターはゲノム上のインスレーター配列およびそれに結合する分子から構成されており、エンハンサー遮断効果の発揮およびポジション効果の抑制により、数万個の遺伝子が協調し、干渉せずに発現することができる（Chung,J.H., Bell,A.C. and Felsenfeld,G., Characterization of the chicken beta-globin insulator, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (2), 575-580 (1997)、Burgess-Beusse B, Farrell C, Gaszner M, Litt M, Mutskov V, Recillas-Targa F, Simpson M, West A, Felsenfeld G., The insulation of genes from external enhancers and silencing chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 16433-16437 (2002) ）。そこで、本発明の特定ゲノム領域の単離方法を用いて、インスレーター結合タンパク質の同定を試みた。
（１）ＦＣＮＬＤ−ｃＨＳ4細胞の作製
ニワトリのグロビン遺伝子のインスレーター配列として知られているｃＨＳ４配列のコア配列をレポーターベクターｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（プロメガ）のルシフェラーゼ（Luc）遺伝子の上流および下流の２箇所にタンデム（１２配列ずつ）に挿入した。そして、タンデムに並べたｃＨＳ４コア配列の中央それぞれにＬｅｘＡ結合配列を挿入することで、ｃＨＳ４ベクターを作成した（図１１参照）。なお、ｃＨＳ４の塩基配列は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬにアクセッション番号：Ｕ７８７７５として登録されており、この塩基配列の第１位〜第２４４位がコア配列である。
ＦＣＮＬＤ遺伝子が安定にトランスフェクトされたＢａ／Ｆ３細胞株（ＦＣＮＬＤ細胞）を作製し、これにｃＨＳ４ベクターを安定にトランスフェクションすることで、ＦＣＮＬＤ−ｃＨＳ４細胞を作製した。ネガティブコントロールの細胞株として、ＦＣＮＬＤ細胞にｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌベクターを安定にトランスフェクトした細胞株ＦＣＮＬＤ−ｐＧＬ３Ｃも作製した。
ニワトリのグロビン遺伝子のインスレーター配列として知られているｃＨＳ４配列のコア配列をレポーターベクターｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（プロメガ）のルシフェラーゼ（Luc）遺伝子の上流および下流の２箇所にタンデム（１２配列ずつ）に挿入した。そして、タンデムに並べたｃＨＳ４コア配列の中央それぞれにＬｅｘＡ結合配列を挿入することで、ｃＨＳ４ベクターを作成した（図１１参照）。なお、ｃＨＳ４の塩基配列は、ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬにアクセッション番号：Ｕ７８７７５として登録されており、この塩基配列の第１位〜第２４４位がコア配列である。
ＦＣＮＬＤ遺伝子が安定にトランスフェクトされたＢａ／Ｆ３細胞株（ＦＣＮＬＤ細胞）を作製し、これにｃＨＳ４ベクターを安定にトランスフェクションすることで、ＦＣＮＬＤ−ｃＨＳ４細胞を作製した。ネガティブコントロールの細胞株として、ＦＣＮＬＤ細胞にｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌベクターを安定にトランスフェクトした細胞株ＦＣＮＬＤ−ｐＧＬ３Ｃも作製した。
（２）抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降
ＦＣＮＬＤ−ｃＨＳ４細胞およびＦＣＮＬＤ−ｐＧＬ３Ｃ細胞を用いて、以下の手順でｃＨＳ４領域を単離した。
(I) ４×１０７個の細胞を含むＲＰＭＩ完全培地４５ｍＬに１．２ｍＬの３７％ホムアルデヒドを添加し、３７℃で５分間置き、細胞をホルムアルデヒドで架橋処理した。続いて、１．２５Ｍグリシン溶液を４．５ｍＬ添加して室温で５分間置き、ホルムアルデヒドを中和した。
(II) 実施例１の（２）(b)と同様に、細胞を洗浄・回収した。
(III) 細胞のペレットを２０ｍＬの細胞質溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁し、氷上で１０分間置いた。遠心分離（２,０００ｒｐｍ、８分間、４℃）後、沈殿に２０ｍＬの核溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％ Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．５％ Ｓａｒｃｏｓｙｌ、プロテアーゼインヒビターカクテル）を加え懸濁し、氷上で１０分間置いた。遠心分離（２,０００ｒｐｍ、８分間、４℃）後の沈殿を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、クロマチン画分とした。
(IV) クロマチン画分を１．６ｍＬの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ ＳＤＳ）に懸濁し、０．８ｍＬずつ１．５ｍＬマイクロチューブに分注した。超音波処理（超音波発生機：TOMY UD-200、微量チップ TP-040、＜１チューブ当たりの条件＞出力3、10秒間超音波発生・50秒間氷冷×18回）によりクロマチン画分を断片化した。遠心分離（15,000rpm、10分間、4℃）して上清を回収した。
(V) 断片化したクロマチン（１．６ｍＬ）に正常マウスＩｇＧとプロテインＧ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ベリタス）を加え、４℃で１時間ローテートした。上清に抗ＦＬＡＧ抗体（和光純薬）とプロテインＧ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ベリタス）を加え、４℃で一晩ローテートし、ｃＨＳ４領域を免疫沈降した。
(VI) 洗浄後、免疫沈降複合体に５０μＬの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、９８℃で２０分間加熱した。
ＦＣＮＬＤ−ｃＨＳ４細胞およびＦＣＮＬＤ−ｐＧＬ３Ｃ細胞を用いて、以下の手順でｃＨＳ４領域を単離した。
(I) ４×１０７個の細胞を含むＲＰＭＩ完全培地４５ｍＬに１．２ｍＬの３７％ホムアルデヒドを添加し、３７℃で５分間置き、細胞をホルムアルデヒドで架橋処理した。続いて、１．２５Ｍグリシン溶液を４．５ｍＬ添加して室温で５分間置き、ホルムアルデヒドを中和した。
(II) 実施例１の（２）(b)と同様に、細胞を洗浄・回収した。
(III) 細胞のペレットを２０ｍＬの細胞質溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＮＰ−４０、プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁し、氷上で１０分間置いた。遠心分離（２,０００ｒｐｍ、８分間、４℃）後、沈殿に２０ｍＬの核溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％ Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．５％ Ｓａｒｃｏｓｙｌ、プロテアーゼインヒビターカクテル）を加え懸濁し、氷上で１０分間置いた。遠心分離（２,０００ｒｐｍ、８分間、４℃）後の沈殿を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、クロマチン画分とした。
(IV) クロマチン画分を１．６ｍＬの溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ ＳＤＳ）に懸濁し、０．８ｍＬずつ１．５ｍＬマイクロチューブに分注した。超音波処理（超音波発生機：TOMY UD-200、微量チップ TP-040、＜１チューブ当たりの条件＞出力3、10秒間超音波発生・50秒間氷冷×18回）によりクロマチン画分を断片化した。遠心分離（15,000rpm、10分間、4℃）して上清を回収した。
(V) 断片化したクロマチン（１．６ｍＬ）に正常マウスＩｇＧとプロテインＧ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ベリタス）を加え、４℃で１時間ローテートした。上清に抗ＦＬＡＧ抗体（和光純薬）とプロテインＧ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ベリタス）を加え、４℃で一晩ローテートし、ｃＨＳ４領域を免疫沈降した。
(VI) 洗浄後、免疫沈降複合体に５０μＬの２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、９８℃で２０分間加熱した。
（３）質量分析によるｃＨＳ４コア配列結合タンパク質の同定
免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、タンパク質を銀染色で検出した。結果を図１２に示した。図１２から明らかなように、ＦＣＮＬＤ−ｃＨＳ４細胞由来の免疫沈降物中に、ＦＣＮＬＤ−ｐＧＬ３Ｃ細胞（ネガティブコントロール）由来の免疫沈降物には存在しないバンドａおよびバンドｂを検出した。バンドａおよびバンドｂを切り出して、質量分析に供した結果、バンドａおよびバンドｂは、それぞれ新規なｃＨＳ４コア配列結合タンパク質（タンパク質ａおよびタンパク質ｂ）であることが判明した。
この結果から、特定ゲノム領域の配列に特異的に結合するタンパク質をクロマチン複合体として単離し、質量分析により同定できることが示された。
免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、タンパク質を銀染色で検出した。結果を図１２に示した。図１２から明らかなように、ＦＣＮＬＤ−ｃＨＳ４細胞由来の免疫沈降物中に、ＦＣＮＬＤ−ｐＧＬ３Ｃ細胞（ネガティブコントロール）由来の免疫沈降物には存在しないバンドａおよびバンドｂを検出した。バンドａおよびバンドｂを切り出して、質量分析に供した結果、バンドａおよびバンドｂは、それぞれ新規なｃＨＳ４コア配列結合タンパク質（タンパク質ａおよびタンパク質ｂ）であることが判明した。
この結果から、特定ゲノム領域の配列に特異的に結合するタンパク質をクロマチン複合体として単離し、質量分析により同定できることが示された。
（４）新規ｃＨＳ４コア配列結合タンパク質のｃＨＳ４領域への結合の確認
新規ｃＨＳ４コア配列結合タンパク質ａおよびｂがｃＨＳ４領域に結合することを、クロマチン免疫沈降法を用いて確認した。具体的には、上記（２）で調製したＦＣＮＬＤ−ｃＨＳ４細胞由来の断片化クロマチンを用い、抗ａ抗体または抗ｂ抗体でクロマチン免疫沈降した。免疫沈降複合体のクロスリンクを解除し、ＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡをＰＣＲに供した。ｃＨＳ４コア配列に挟まれたＬｅｘＡ結合配列領域を検出するプライマーとして、以下のプライマー７および８を用いた（図１３下段参照）。
プライマー７：5'-ttctctatcgataggtacctcg-3'（配列番号７）
プライマー８：5'-tctattcagcggatctcgagcg-3'（配列番号８）
新規ｃＨＳ４コア配列結合タンパク質ａおよびｂがｃＨＳ４領域に結合することを、クロマチン免疫沈降法を用いて確認した。具体的には、上記（２）で調製したＦＣＮＬＤ−ｃＨＳ４細胞由来の断片化クロマチンを用い、抗ａ抗体または抗ｂ抗体でクロマチン免疫沈降した。免疫沈降複合体のクロスリンクを解除し、ＤＮＡを精製した。精製したＤＮＡをＰＣＲに供した。ｃＨＳ４コア配列に挟まれたＬｅｘＡ結合配列領域を検出するプライマーとして、以下のプライマー７および８を用いた（図１３下段参照）。
プライマー７：5'-ttctctatcgataggtacctcg-3'（配列番号７）
プライマー８：5'-tctattcagcggatctcgagcg-3'（配列番号８）
結果を図１３に示した。図１３中、Ｉｎｐｕｔは断片化したＤＮＡを免疫沈降を行わずにクロスリンク解除したサンプルを表し、その他は免疫沈降に用いた抗体を表す。図１３上段に示したように、ＰＣＲ４０サイクルでは、抗ｂ抗体との免疫沈降複合体中に目的のＤＮＡ領域が検出された。また、抗ａ抗体との免疫沈降複合体の場合、４０サイクルのＰＣＲでは検出できなかったが、図１３中段に示したように、ＰＣＲを４５サイクル行うことにより目的のＤＮＡ領域が検出された。これらの結果により、タンパク質ａおよびタンパク質ｂがｃＨＳ４領域に結合することを確認した。
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
Claims (14)
- 相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離する方法であって、以下の工程１〜５を包含することを特徴とする特定ゲノム領域の単離方法。
工程１：単離しようとするゲノム領域のゲノムＤＮＡに、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片が挿入された細胞（但しヒト個体を除く）を作製する工程
工程２：少なくとも前記外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む外来性分子を、前記細胞のゲノムＤＮＡと接触させる工程
工程３：前記細胞のゲノムＤＮＡと、当該ゲノムＤＮＡと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程
工程４：ゲノムＤＮＡを断片化する処理を行う工程
工程５：前記外来性分子と特異的に結合する分子を結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程 - 前記外来性ＤＮＡ結合分子が、外来性ＤＮＡ結合タンパク質または外来性核酸であることを特徴とする請求項１に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 前記外来性分子が、タグ配列を含む融合分子であることを特徴とする請求項１または２に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 前記融合分子が、２種類のタグ配列を含み、両タグ配列がプロテアーゼ認識配列を介して連結されていることを特徴とする請求項３に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 前記外来性分子が、核移行シグナルを含む融合分子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 工程１において、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片を、相同組み換え法によりゲノムＤＮＡに挿入することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 工程１において、外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列と、特定ゲノム領域のＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ断片を、細胞に導入することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 工程２において、工程１で作製した細胞に、前記外来性分子をコードする遺伝子を導入し、当該細胞内で発現させることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 前記相互作用状態を保持する処理が、架橋処理であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 前記ゲノムＤＮＡを断片化する処理が、制限酵素処理、ＤＮＡ分解酵素による部分分解処理、または超音波処理であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列を含むＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡに挿入するためのターゲッティングベクターを包含することを特徴とする特定ゲノム領域単離用キット。
- 外来性ＤＮＡ結合分子の認識配列と、特定ゲノム領域のＤＮＡ配列とを含むＤＮＡ断片を、細胞に導入するためのベクターを包含することを特徴とする特定ゲノム領域単離用キット。
- 前記ＤＮＡ断片が、さらにレポーター遺伝子を含むことを特徴とする請求項１２に記載の特定ゲノム領域単離用キット。
- さらに、少なくとも前記外来性ＤＮＡ結合分子のＤＮＡ結合ドメインを含む外来性分子、または当該外来性分子を発現させるための発現ベクターを包含することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載の特定ゲノム領域単離用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011527713A JP5413924B2 (ja) | 2009-08-21 | 2010-08-20 | 特定ゲノム領域の単離方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009191762 | 2009-08-21 | ||
| JP2009191762 | 2009-08-21 | ||
| PCT/JP2010/064052 WO2011021684A1 (ja) | 2009-08-21 | 2010-08-20 | 特定ゲノム領域の単離方法 |
| JP2011527713A JP5413924B2 (ja) | 2009-08-21 | 2010-08-20 | 特定ゲノム領域の単離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2011021684A1 JPWO2011021684A1 (ja) | 2013-01-24 |
| JP5413924B2 true JP5413924B2 (ja) | 2014-02-12 |
Family
ID=43607132
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011527713A Active JP5413924B2 (ja) | 2009-08-21 | 2010-08-20 | 特定ゲノム領域の単離方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8415098B2 (ja) |
| JP (1) | JP5413924B2 (ja) |
| WO (1) | WO2011021684A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11466306B2 (en) | 2013-02-14 | 2022-10-11 | Osaka University | Method for isolating specific genomic regions with use of molecule capable of specifically binding to endogenous DNA sequence |
| US11414695B2 (en) * | 2013-05-29 | 2022-08-16 | Agilent Technologies, Inc. | Nucleic acid enrichment using Cas9 |
| GB2517936B (en) * | 2013-09-05 | 2016-10-19 | Babraham Inst | Chromosome conformation capture method including selection and enrichment steps |
| WO2017090543A1 (ja) * | 2015-11-27 | 2017-06-01 | 国立大学法人大阪大学 | Ｄｎａ間相互作用の解析方法 |
| JP6943376B2 (ja) * | 2016-08-30 | 2021-09-29 | 国立大学法人九州大学 | Ｄｎａ結合タンパク質の結合領域の近傍に所望のｄｎａ断片を挿入する方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009519039A (ja) * | 2005-12-13 | 2009-05-14 | ニンブルゲン システムズ インコーポレイテッド | 後成的修飾の同定及びモニタリング方法 |
-
2010
- 2010-08-20 US US13/390,170 patent/US8415098B2/en active Active
- 2010-08-20 WO PCT/JP2010/064052 patent/WO2011021684A1/ja active Application Filing
- 2010-08-20 JP JP2011527713A patent/JP5413924B2/ja active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009519039A (ja) * | 2005-12-13 | 2009-05-14 | ニンブルゲン システムズ インコーポレイテッド | 後成的修飾の同定及びモニタリング方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| JPN6010066907; ＳＩＭＯＮＩＳ， Ｍ． ｅｔ ａｌ: 'Ａｎ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ３Ｃ-ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｃａｐｔｕｒｅ ＤＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．' Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ． ４, 2007, ｐ． ８９５-９０１ * |
| JPN6010066910; ＥＩＶＡＺＯＶＡ， Ｅ． Ｒ． ｅｔ ａｌ: 'Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ ｆｌａｎｋｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｌｏｏｐ．' Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ． ３８６， Ｎｏ． ４, 20090306, ｐ． ９２９-９３７ * |
| JPN6010066911; ＤＥＫＫＥＲ， Ｊ． ｅｔ ａｌ: 'Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．' Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ． ２９５， Ｎｏ． ５５５８, 2002, ｐ． １３０６-１３１１ * |
| JPN6010066913; ＤＥＪＡＲＤＩＮ， Ｊ． ａｎｄ Ｒ． Ｅ． Ｋｉｎｇｓｔｏｎ: 'Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌｏｃｉ．' Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ． １３６， Ｎｏ． １, 200901, ｐ． １７５-１８６ * |
| JPN6010066916; ＳＩＭＯＮＩＳ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．: 'Ｎｕｃｌｅａｒ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｎａｃｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃ' Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｖｏｌ． ３８， Ｎｏ． １１, 2006, ｐ． １３４８-１３５４ * |
| JPN6010066927; ＨＯＳＨＩＮＯ， Ａ ａｎｄ Ｈ． ＦＵＪＩＩ: 'Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ： ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ．' Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． Ｖｏｌ． １０８， Ｎｏ． ５, 200911, ｐ． ４４６-４４９ * |
| JPN6010066929; ＦＵＪＩＩ， Ｈ: 'Ｎｏｖｅｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ-ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃ-ｍｙｃ ｇｅｎｅ．' Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． Ｖｏｌ． １０８， Ｎｏ． ５, 200911, ｐ． ４３８-４４０ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8415098B2 (en) | 2013-04-09 |
| US20120164689A1 (en) | 2012-06-28 |
| JPWO2011021684A1 (ja) | 2013-01-24 |
| WO2011021684A1 (ja) | 2011-02-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230046749A1 (en) | Method for isolating specific genomic regions with use of molecule capable of specifically binding to endogenous dna sequence | |
| AU2018289077B2 (en) | Nucleic acid-guided nucleases | |
| US11434262B2 (en) | Transcription activator-like effectors | |
| JP2019535287A (ja) | Ｃｒｉｓｐｒ／ｃｐｆ１システム及び方法 | |
| WO2021017883A1 (zh) | 一种用于单细胞ChIP-seq文库制备的融合蛋白及其应用 | |
| Iioka et al. | Efficient detection of RNA–protein interactions using tethered RNAs | |
| CN112410377A (zh) | VI-E型和VI-F型CRISPR-Cas系统及用途 | |
| EP3526326A1 (en) | Novel engineered and chimeric nucleases | |
| JP5413924B2 (ja) | 特定ゲノム領域の単離方法 | |
| JP2018532373A (ja) | 核酸の研究方法 | |
| Tacheny et al. | Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids | |
| Melo do Nascimento et al. | Functional insights from a surface antigen mRNA-bound proteome | |
| CN108285494B (zh) | 一种融合蛋白、试剂盒以及CHIP-seq检测方法 | |
| Donovan et al. | Basis of specificity for a conserved and promiscuous chromatin remodeling protein | |
| Fujita et al. | Locus-specific biochemical epigenetics/chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation | |
| EP2190989B1 (en) | Method for manufacturing a modified peptide | |
| Barchetta et al. | Combination of two regulatory elements in the Tetrahymena thermophila HSP70-1 gene controls heat shock activation | |
| Petela et al. | Multiple interactions between Scc1 and Scc2 activate cohesin’s DNA dependent ATPase and replace Pds5 during loading | |
| do Nascimento et al. | The trypanosome Variant Surface Glycoprotein mRNA is stabilized by an essential unconventional RNA-binding protein | |
| DeGrado-Warren et al. | Construction and characterization of a normalized yeast two-hybrid library derived from a human protein-coding clone collection | |
| US20090305272A1 (en) | Method of characterizing endogenous polynucleotide-polypeptide interactions | |
| WO2017090543A1 (ja) | Ｄｎａ間相互作用の解析方法 | |
| WO2008124111A2 (en) | System for pulling out regulatory elements in vitro | |
| Nair et al. | An aptamer-based mRNA affinity purification procedure (RaPID) for the identification of associated RNAs (RaPID-seq) and proteins (RaPID-MS) in yeast | |
| Trung et al. | SILAC-based quantitative proteomics approach to identify transcription factors interacting with a novel cis-regulatory element |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130903 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131002 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131029 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131106 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5413924 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |