WO2017090543A1 - Dna間相互作用の解析方法 - Google Patents

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WO2017090543A1
WO2017090543A1 PCT/JP2016/084358 JP2016084358W WO2017090543A1 WO 2017090543 A1 WO2017090543 A1 WO 2017090543A1 JP 2016084358 W JP2016084358 W JP 2016084358W WO 2017090543 A1 WO2017090543 A1 WO 2017090543A1
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WO
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dna
analyzed
pcr
analysis method
complex
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PCT/JP2016/084358
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English (en)
French (fr)
Inventor
穂高 藤井
藤田 敏次
Original Assignee
国立大学法人大阪大学
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing an interaction between DNAs.
  • genomic DNA in the nucleus may play an important role in regulating the expression of genomic functions.
  • the following methods are known as methods for detecting interactions between genomic DNAs.
  • (i) Chromosome Conformation Capture (3C) method (Non-Patent Documents 1 to 3)
  • the basic scheme of the 3C method is the following (1) to (5).
  • Cleave genomic DNA with restriction enzymes (2) Cleave genomic DNA with restriction enzymes.
  • (3) Intramolecular ligation between adjacent DNA fragments contained in the same complex by interaction is performed by ligation reaction using DNA ligase.
  • PCR reaction is performed using primers that anneal to each fragment, and it is examined whether or not a specific genomic DNA is ligated.
  • the enzyme reaction with restriction enzymes and ligases must be performed under non-optimal conditions such as under cross-linking.
  • the efficiency of cleavage with restriction enzymes becomes low, resulting in problems such as not complete digestion.
  • the background becomes extremely high, and it becomes difficult to detect an unknown interaction.
  • a restriction enzyme can cleave a certain genomic region depends on accessibility to the region, there is a great difference in the ease of cleaving due to factors such as heterochromatinization in the target region.
  • FISH method alone or in combination with the fluorescent antibody method can detect the interaction between a specific genomic region and another genomic region, RNA, or protein.
  • this method has low resolution and cannot detect interactions with unknown molecules.
  • expensive equipment such as a confocal microscope is necessary, and a high technique for using them is necessary.
  • Locus-specific chromatin immunoprecipitation method Locus-specific chromatin immunoprecipitation method (locus-specific ChIP method) (Non-patent Documents 8 and 9)
  • locus-specific ChIP method By combining the locus-specific ChIP method with the PCR method, microarray analysis, or next-generation sequencing method, a genomic sequence that interacts with a specific genomic region can be identified.
  • Insertional chromatin immunoprecipitation a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. (2009) 2009108, 446-449. Fujita T, and Fujii H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. 2013) -132 .
  • the present invention provides a DNA interaction analysis method that does not require expensive equipment or skill in equipment operation, can be easily performed by a general researcher, and can obtain highly reliable results. This is the issue.
  • Another object of the present invention is to provide a method for analyzing an interaction between DNAs that can be performed without using a restriction enzyme.
  • a method for analyzing an interaction between DNAs comprising the following steps (1) to (4): (1) including a DNA in a state where the DNA to be analyzed interacts with another DNA , Step of preparing fragmented DNA by sonication or partial degradation treatment with endonuclease not having DNA sequence specificity, (2) step of ligating fragmented DNA, (3) subject to analysis from DNA after ligation A step of amplifying and / or purifying a complex containing DNA and DNA interacting with the DNA, and (4) a step of analyzing the interacting DNA in the amplified and / or purified complex .
  • step (1) before the DNA is fragmented, a process for maintaining an interaction state between the DNA to be analyzed and the DNA interacting with the DNA is performed [1] Analysis method described in 1. [3] The analysis method according to [1], wherein in the step (2), the ends of the fragmented DNA are repaired before ligation. [4] In the step (3), before the complex is amplified and / or purified, a treatment for releasing the interaction state held in the DNA after ligation is performed [1] Analysis method described in 1.
  • the primer is designed for each of the DNA to be analyzed and the DNA expected to interact, and PCR is performed to amplify a region sandwiched between the two locations [1]
  • PCR is performed by designing primers that do not amplify the region sandwiched between the two locations in the DNA to be analyzed and that are reversely directed. ] To [4].
  • the exogenous molecule or exogenous molecule complex is a complex of a zinc finger protein, a TAL effector protein, an exogenous nucleic acid, or an inactive Cas9 protein and a guide RNA (gRNA).
  • the present invention provides a method for analyzing an interaction between DNAs that can be easily carried out by a general researcher and can obtain highly reliable results without requiring expensive equipment or skill in equipment operation. can do.
  • the present invention it is possible to very easily confirm the actual interaction of DNA that is expected to interact with the DNA to be analyzed.
  • the analysis method of the present invention does not use a restriction enzyme, the DNA to be analyzed is not limited by the presence or frequency of the restriction enzyme site, and any DNA can be analyzed.
  • the present invention provides a novel method for analyzing an interaction between DNAs.
  • the analysis method of the present invention only needs to include the following steps (1) to (4).
  • (1) A step of preparing a fragmented DNA by sonication or partial degradation with an endonuclease having no DNA sequence specificity, including DNA in a state where the DNA to be analyzed and other DNA interact with each other; (2) ligation of fragmented DNA, (3) a step of amplifying and / or purifying a complex containing the DNA to be analyzed and DNA interacting with the DNA from the ligated DNA, and (4) in the amplified and / or purified complex Analyzing the interacting DNA.
  • the DNA to be analyzed in the analysis method of the present invention is not particularly limited, and genomic DNA, mitochondrial DNA, chloroplast DNA, plasmid DNA, artificially synthesized DNA, and the like can be analyzed. Therefore, the analysis method of the present invention can be used for analyzing the interaction between the above-exemplified DNAs and the interaction between the above-exemplified DNAs.
  • genomic DNAs or between genomic DNAs and other DNAs mitochondrial DNA, It is preferably used for analysis of interaction with chloroplast DNA, plasmid DNA, artificially synthesized DNA and the like.
  • any interaction of DNA in the same chromosome and interaction of DNA between different chromosomes can be analyzed using the analysis method of the present invention.
  • the interaction between the host cell DNA and the microorganism DNA parasitic on the host cell can also be analyzed using the analysis method of the present invention.
  • step (1) a fragmented DNA preparation is prepared.
  • the DNA in a state where the DNA to be analyzed contained in the DNA preparation obtained in the step (1) interacts with other DNA is the target of the analysis method of the present invention.
  • the preparation method of the DNA preparation in the step (1) is not particularly limited, for example, the following preparation method of Procedure 1 or Procedure 2 can be preferably used.
  • Step 1 is a procedure for preparing a DNA preparation suitable for analyzing the interaction between DNAs of DNA prepared from cells or tissues.
  • the target DNA preparation can be usually obtained by preparing DNA in a state where the DNA to be analyzed interacts with other DNA and then performing DNA fragmentation.
  • the method for preparing DNA in a state where the DNA to be analyzed interacts with other DNA is not particularly limited, and a known method for preparing DNA from cells or tissues can be appropriately selected and used. For example, a method of extracting a fraction containing DNA from cells or tissues by combining a cell lysate containing a surfactant such as IGEPAL-CA-630 and a high salt concentration nuclear extract.
  • a portion by endonuclease (DNA degrading enzyme that is not a restriction enzyme) that does not have sonication or DNA sequence specificity is obtained. It is preferable to cleave DNA by a decomposition (partial cleavage) treatment. When sonication is performed, it is preferable to predetermine processing conditions for cutting into fragments of an appropriate size according to the size of the DNA to be analyzed.
  • an endonuclease having no DNA sequence specificity it is preferable to predetermine reaction conditions for cleavage into fragments of an appropriate size according to the size of the DNA to be analyzed.
  • the endonuclease having no DNA sequence specificity include micrococcus deoxyribonuclease.
  • step 1 it is preferable to perform a process for maintaining the interaction state between the DNA to be analyzed and the DNA interacting with the DNA before fragmenting the DNA.
  • the treatment for maintaining the interaction state is not particularly limited as long as it is a treatment capable of separating and purifying molecules interacting later and subjecting them to analysis.
  • An example of a preferable treatment is a crosslinking treatment.
  • An example of a preferable crosslinking agent used for the crosslinking treatment is formaldehyde.
  • Step 2 is a procedure for preparing a DNA preparation suitable for analyzing the interaction between DNA reconstructed in a test tube.
  • DNA may be fragmented after reconstructing the interaction between DNAs in a test tube, or the interaction between DNAs may be reconstructed in a test tube after fragmenting the DNA.
  • the method for reconstructing the interaction between DNAs in a test tube is not particularly limited.
  • the target DNA is analyzed by mixing the target DNA with another DNA expected to interact in the test tube under optimal conditions.
  • a method of reconstructing DNA in a state where DNA and other DNA interact with each other can be mentioned.
  • the DNA used for reconstructing the interaction between DNAs may be any DNA, and can be prepared by a known method according to the type of DNA.
  • sonication or partial degradation (partial cleavage) treatment with an endonuclease having no DNA sequence specificity a DNA degrading enzyme that is not a restriction enzyme
  • a treatment for maintaining the interaction state of DNA after reconstructing the interaction between DNAs.
  • the treatment for maintaining the interaction state is not particularly limited as long as it is a treatment that can separate and purify molecules interacting later and use them for analysis, as in Procedure 1.
  • An example of a preferable treatment is a crosslinking treatment.
  • An example of a preferable crosslinking agent used for the crosslinking treatment is formaldehyde.
  • step (2) fragmented DNA is ligated.
  • a treatment for repairing the ends of the fragmented DNA is performed before ligation.
  • end repair include smoothing the end using T4 DNA polymerase or the like and phosphorylating the 5 ′ end using T4 polynucleotide kinase or the like.
  • Ligation can be performed using T4 DNA ligase or the like. Specific techniques for DNA end blunting, 5 ′ end phosphorylation and ligation reactions are well known in the art.
  • ligation is preferably performed under conditions where intramolecular ligation is likely to occur. It is preferable that the DNA concentration in the ligation reaction solution is determined in advance in consideration of the size of the DNA fragment that maintains the interaction state.
  • step (3) the analysis target DNA and the complex containing the DNA interacting with the DNA are amplified and / or purified from the ligated DNA.
  • Step (3) is a step performed to increase the content of the target complex. As long as the purpose can be achieved, only amplification may be performed, purification only, or amplification and purification may be combined.
  • a treatment for maintaining the interaction state when a treatment for maintaining the interaction state is performed, a treatment for releasing the interaction state held in the DNA after ligation before the complex is amplified and / or purified. It is preferable to carry out.
  • the method for canceling the interaction state is not particularly limited, and can be appropriately selected from known cancellation methods according to the processing method for maintaining the interaction state.
  • the treatment for maintaining the interaction state is a crosslinking treatment using formaldehyde
  • a high-concentration salt solution 5M NaCl solution, etc.
  • an appropriate temperature for an appropriate time eg, at about 65 ° C. overnight.
  • Crosslinking can be released by incubating.
  • the amplification method used in step (3) is not particularly limited, and a known nucleic acid amplification method can be appropriately selected and used. PCR is preferred.
  • the design of primers used in PCR is not particularly limited, but for example, it is preferable to design as follows. If DNA that interacts with the DNA to be analyzed is expected, primers should be used to amplify the region between the DNA to be analyzed and the DNA portion that is expected to interact with the DNA. Design (see Figure 1D). If the DNA to be analyzed and the DNA expected to interact are linked by ligation, a PCR product is generated by this primer set (see FIG. 1E).
  • a method in which PCR is performed using a modified primer for affinity purification and the amplification product is affinity purified can be suitably used.
  • the modification for affinity purification include a terminal base sequence that can be used for biotinylation, digoxigenation, methylation of cytosine when using a methylated DNA-binding protein, and hybridization after heat denaturation. Biotinylation is preferred. Since a biotinylated PCR product is amplified by performing PCR using a biotinylated primer, the amplified PCR product can be affinity purified using, for example, beads bound with streptavidin.
  • step (3) in order to increase the content of the target complex, a complex containing the DNA to be analyzed and the DNA interacting with the DNA is amplified by PCR, and then DNA other than the PCR product is removed.
  • An operation may be performed.
  • the ligated DNA is reacted with DNA methylase prior to PCR and methylated, and after PCR, only the methylated DNA is subjected to methylation-specific endonuclease. Examples include a method of cleaving, and a method of removing methylated DNA by bringing the reaction solution into contact with a carrier on which a methylated DNA binding protein is immobilized after PCR.
  • a method of purification using an exogenous molecule or an exogenous molecule complex (hereinafter referred to as “exogenous molecule etc.”) that binds to a specific DNA sequence of the DNA to be analyzed is preferably used.
  • the foreign molecule is not particularly limited as long as it has a property of binding to a specific DNA sequence.
  • exogenous DNA binding protein, exogenous nucleic acid, exogenous protein-nucleic acid complex and the like can be mentioned.
  • the foreign DNA-binding protein is preferably a protein that can be designed by associating the amino acid sequence of the protein with the base sequence of the target DNA. Examples of such exogenous DNA-binding proteins include zinc finger proteins and TAL effector proteins.
  • the foreign nucleic acid may be any nucleic acid that can hybridize with the genomic region to be analyzed.
  • nucleic acids include LNA (Locked nucleic acid), ODN (oligodeoxyribonucleotides), ORN (oligoribonucleotides), and hybrids thereof.
  • LNA Locked nucleic acid
  • ODN oligodeoxyribonucleotides
  • ORN oligoribonucleotides
  • Examples of the foreign protein-nucleic acid complex include a complex of Cas9 protein and guide RNA (gRNA).
  • the exogenous nucleic acid can be produced, for example, by chemical synthesis. Alternatively, it can be obtained by affinity-purifying a molecular species that binds to a target DNA sequence from a random nucleic acid sequence library, and concentrating and selecting using a PCR method or the like. It is also possible to further improve the affinity with the target DNA sequence by introducing an appropriate mutation into the nucleic acid thus selected.
  • Zinc finger proteins are known to be modifiable to recognize any DNA base sequence (eg, Beerli et al., (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo et al. , (2001) Ann. Rev. Biochem. 70: 313-340; Isalan et al., (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660; Segal et al., (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 632 -637; see Choo et al., (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 411-416).
  • the modified zinc finger protein can have a novel binding specificity that a natural zinc finger protein does not have.
  • the modification method is not particularly limited, and examples thereof include a method of joining individual zinc finger modules having known specificities. Specificity selection methods using phage display, two-hybrid systems, etc. are described in US Pat. No. 5,789,538; US Pat. No. 5,925,523; US Pat. No. 6,007,988; US Pat. No. 6,013,453; US Pat. No. 6,410,248; US Pat. U.S. Patent No. 6,200,759; U.S. Patent No. 6,242,568; International Publication WO98 / 37186; International Publication WO98 / 53057; International Publication WO00 / 27878; International Publication WO01 / 88197, British Patent No. 2,338,237, and the like.
  • TAL effector protein is a protein isolated from the phytopathogenic bacterium Zanthomonas.
  • the DNA binding domain of the TAL effector protein has an almost complete tandem repeat structure in which one unit consists of about 34 amino acids.
  • the 12th and 13th amino acids of the unit change frequently and are called RVD (repeat variable diresidue). Differences in RVD determine DNA base recognition specificity.
  • RVD repeat variable diresidue
  • Differences in RVD determine DNA base recognition specificity.
  • Cas9 protein is an enzyme derived from bacteria and archaea and cleaves a specific sequence of the RNA under the RNA guide (CRISPR system). Cas9 protein can be used in both wild type and inactive type, but inactive type is preferred.
  • inactive Cas9 protein is a Cas9 mutant that lacks DNase activity but retains DNA binding activity, and has the property of binding to a complementary DNA sequence under RNA guide. (Jinek et al., (2012) Science, 337: 816-821).
  • proteins having the same function as Cas9 are known.
  • the origin species is not particularly limited as long as the protein has such a function.
  • Cas9 proteins such as Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Neisseriaissmeningitidis, Streptococcus thermophilus, Treponema denticola, and Cpf1 proteins such as Acidaminococcus, Lachnospiraceae bacterium, and Francisella novicida can also be suitably used.
  • a DNA sequence existing in the DNA to be analyzed may be selected.
  • the DNA sequence to be selected exists only in the DNA portion to be analyzed and preferably does not exist in the other DNA portion, but may be selected that rarely exists in the DNA portion other than the analysis target.
  • the method of purification using an exogenous molecule that binds to a specific DNA sequence of the DNA to be analyzed is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the exogenous molecule used. For example, there may be mentioned a method in which a DNA that has been released from the interaction state is brought into contact with an exogenous molecule, and then the exogenous molecule is recovered and the DNA bound to the exogenous molecule is eluted.
  • a purification tag may be added to an exogenous molecule or the like. It is also possible to use a carrier on which foreign molecules or the like are immobilized.
  • a carrier on which exogenous molecules and the like are immobilized for example, a carrier on which exogenous molecules and the like are immobilized is packed in a column, the DNA in which the interaction state is released is passed through the column, the column is washed, A method of eluting DNA bound to foreign molecules, etc., adding the DNA released from the interaction state to a tube containing a carrier on which foreign molecules are immobilized, stirring, and then washing the carrier, And a method for eluting DNA bound to the like.
  • the carrier for immobilizing exogenous molecules is not particularly limited as long as it is a carrier that can immobilize proteins or nucleic acids.
  • beads, magnetic beads, disks, sticks made of materials such as glass, polyethylene, polypropylene, polyvinyl acetate, polyvinyl chloride, methacrylate, latex, agarose, cellulose, dextran, starch, dextrin, silica gel, porous ceramics , Tubes, microtiter plates, microsensor chips, microarrays and the like.
  • known methods such as physical adsorption, covalent bonding, and crosslinking can be appropriately selected and used.
  • the size of DNA fragments may be selected before or after the start of amplification and / or purification.
  • the size selection method for DNA fragments include agarose gel electrophoresis and gel filtration chromatography.
  • step (4) the interacting DNA in the purified complex is analyzed.
  • the method for analyzing interacting DNA is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. If the DNA that interacts with the DNA to be analyzed is expected and the purpose is to confirm whether or not the actually expected DNA is interacting, Examples include a method of designing a primer set for amplifying a part of the DNA portion, performing PCR using the primer set, and confirming the presence or absence of an amplification product. On the other hand, when the purpose is to find an unknown DNA that interacts with the DNA to be analyzed, a microarray analysis or a base sequence analysis of the DNA purified in step (3) can be mentioned.
  • microarray analysis for example, an Agilent microarray system, an Affymetrix microarray system, or the like can be suitably used.
  • the method for analyzing the base sequence is not particularly limited, and a known method can be suitably used. It is preferable to use the next-generation sequencing method from the viewpoint that a large amount of base sequence analysis can be performed.
  • the analysis method of the present invention is not limited to these embodiments. 1 to 5, the solid line represents the analysis target DNA (analysis target genomic region), and the broken line represents the interacting DNA (interactive genomic region).
  • A indicates a state in which the analysis target genomic region interacts with another genomic region.
  • B shows the fragment
  • C shows a state in which one end of the genomic region to be analyzed and one end of the interacting genomic region are linked by intramolecular ligation by ligation in step (2).
  • the analysis target genomic region connected by ligation and the genomic region where interaction with the genomic region is expected are performed. Primers are designed to amplify the region sandwiched between the two locations.
  • the primer on the genomic region to be analyzed is labeled with biotin.
  • PCR When PCR is performed using such a primer set, a biotinylated PCR product is amplified as shown in E if the genomic region to be analyzed and the genomic region expected to interact are linked by ligation.
  • The By purifying the PCR product using streptavidin beads, the complex of the genomic region to be analyzed and the interacting genomic region is concentrated.
  • PCR is performed using a primer set that amplifies within the genomic region where the interaction is expected, and the presence of the PCR product is confirmed so that the genomic region to be analyzed becomes the expected genomic region. It can be confirmed that they are actually interacting.
  • step (1) are the same as in FIG. C shows a state in which both ends of the genomic region to be analyzed are linked by intramolecular ligation at both ends of the interacting genomic region by ligation in step (2). Proceeding to step (3), when the interaction state of the complex in which intramolecular ligation shown in C occurs is released, a cyclic molecule as shown in D is obtained.
  • reverse primer sets that do not amplify the region sandwiched between the two locations are designed at two locations in the genomic region to be analyzed, and one of them is biotinylated.
  • PCR is performed using such a primer set, a biotinylated PCR product sandwiching the entire interacting genomic region in the complex is amplified as shown in E.
  • the complex of the genomic region to be analyzed and the interacting genomic region is concentrated.
  • step (4) as in FIG. 1, PCR is performed using a primer set that amplifies the region of the genome that is expected to interact, and the presence of the PCR product is confirmed. It can be confirmed that it actually interacts with the genomic region.
  • step (4) the base sequence analysis of the PCR product purified in step (3) is performed.
  • the interacting genomic region is comprehensively identified using the next-generation sequencing method.
  • microarray analysis may be performed instead of the next-generation sequencing method.
  • step (3) is embodiments in which purification is performed using the exogenous molecule or the like in the step (3).
  • A, B, C and steps (1) to (2) are the same as those in FIG.
  • step (3) as shown in D, an exogenous molecule with a purification tag that specifically binds to the endogenous DNA sequence of the genomic region to be analyzed is bound to the genomic region to be analyzed, The complex of interacting genomic region linked to this is purified.
  • step (4) in the embodiment of FIG. 4, as in FIGS. 1 and 2 PCR is performed using a primer set that amplifies the genomic region where interaction is expected, and the presence of the PCR product is confirmed.
  • the genomic region to be analyzed actually interacts with the expected genomic region.
  • the unknown genomic region interacting with the analysis target genomic region is identified by comprehensively identifying the interacting genomic region using the next generation sequencing method as in FIG. Can be identified.
  • microarray analysis may be performed instead of the next-generation sequencing method.
  • the analysis method of the present invention has the following characteristics as compared with a conventional method for detecting an interaction between genomic DNAs such as the 3C method.
  • Genomic DNA is randomly cleaved using sonication or partial degradation treatment with endonuclease having no DNA sequence specificity for fragmenting genomic DNA. This enables analysis even when there is no appropriate restriction enzyme site in the vicinity of the interacting genomic region.
  • restriction enzyme cleavage under a cross-link is extremely difficult to completely digest, whereas the analysis method of the present invention has an advantage that a method and conditions that allow reliable cleavage can be selected.
  • Example 1 Detection of ZNF670 gene region interacting with 5'HS5 region
  • (a) The human leukemia cell line K562 was cultured for 4 days in 30 mL of RPMI complete medium containing 1 mM sodium butyric acid (NaB). 810 ⁇ L of 37% formaldehyde was added to 30 mL of a cell suspension containing 1 ⁇ 10 7 cells, and the cells were crosslinked at 37 ° C. for 5 minutes. Subsequently, 3 mL of a 1.25 M glycine solution was added and left at room temperature for 10 minutes to neutralize.
  • NaB sodium butyric acid
  • nucleolysis buffer 10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5 M NaCl, 1% Trion X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.5% Lauroylsarcosine salt, protease inhibitor cocktail
  • the supernatant was discarded and the pellet washed with ice-cold PBS was used as a chromatin fraction.
  • the designed primers are 5'-CCGGTAGGGATAACAGGGTAATTTGAGAAGGTAGGGTTGCATGAG-3 '(SEQ ID NO: 1) (including I-Sce-I site, 5' labeled with biotin), 5'-GAGTCTTGGACTCGGGCTCA-3 '(SEQ ID NO: 2).
  • the primer of SEQ ID NO: 1 was designed to anneal to the 5'HS5 region, and the primer of SEQ ID NO: 2 was annealed to the ZNF670 gene region.
  • the PCR reaction solution was prepared using KOD FX (Toyobo Co., Ltd., KFX-101).
  • reaction solution containing 2 ⁇ L of the purified DNA of (1) (d), 1 ⁇ Buffer, 0.4 mM dNTPs, 0.3 ⁇ M of each primer, and 0.3 ⁇ L of KOD FX in 15 ⁇ L was prepared.
  • the reaction was first performed at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of denaturation at 98 ° C. for 10 seconds, primer annealing at 60 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 68 ° C. for 6 minutes.
  • a primer for amplifying the ZNF670 gene region was designed and PCR was performed.
  • the designed primers are 5′-ATCTTTGGGGTGAAGTTCCCTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 3) and 5′-CCAAGAGATCTGGCTGCTAAACA-3 ′ (SEQ ID NO: 4).
  • the PCR reaction solution was prepared using AmpliTaq Gold 360 PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, 4399876).
  • reaction solution containing 2 ⁇ L of the DNA fragments (including Dynabeads M-280 Streptavidin) affinity-purified in (2) (b), 1 ⁇ AmpliTaq Gold 360 PCR Master Mix, and 0.5 ⁇ M of each primer in 15 ⁇ L. did.
  • a negative control for PCR a reaction solution to which 2 ⁇ L of purified water was added instead of the DNA fragment was prepared. The reaction was first carried out at 95 ° C. for 10 minutes, followed by 35 cycles of denaturation at 95 ° C. for 30 seconds, primer annealing at 60 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C. for 1 minute.
  • the recombinant protein (r3xFLAG-dCas9 was purified by affinity purification. -D) was purified (Sysmex Corporation). The purified r3xFLAG-dCas9-D was bound to Dynabeads Protein G (Thermo Fisher Scientific, 10004D) to which an anti-FLAG antibody M2 (Sigma-Aldrich, anti-FLAG M2, F1804) was bound.
  • a gRNA corresponding to the 5′-CCGGGGGCGCTGGGCTGTCCCGG-3 ′ sequence (SEQ ID NO: 5) present in the human IRF-1 locus was chemically synthesized (Gene Design).
  • the chemically synthesized sequence is 5′-CCGGGGGCGCUGGGCUGUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3 ′ (SEQ ID NO: 6).
  • the dissolved gRNA was heated at 100 ° C. for 2 minutes and returned to room temperature.
  • Genomic DNA was extracted from human fetal kidney-derived 293T cells, and 5 ⁇ g of genomic DNA was suspended in 800 ⁇ L of in vitro CRISPR buffer and then fragmented by sonication (ultrasonic generator: manufactured by TOMY SEIKO) , Ultrasonic disruptor UD-201, output: 3, Duty: 100%, 10 sec). Subsequently, a pre-clear operation was performed using Dynabeads Protein G to which mouse normal IgG was bound to remove non-specific binding substances.
  • 5′-CCAGTTTCTCCAGTTTCCCTTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 9) and 5′-TTTTCAAAATGCAAGGTGATGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 10) primers were used for quantification of the 5′HS5 genomic region, which is an irrelevant region.
  • Example 2 Detection of MIR422A gene region interacting with 5'HS5 region
  • (1) Maintaining the interaction state between genomes and binding DNA ends between interacting genomes The treatment of NaB treatment of human leukemia cell line K562, maintaining the interaction state between genomes, and the operation of joining DNA ends between interacting genomes The same method as in Example 1 (1) (a) to (d) was performed.
  • NaB-untreated K562 was prepared as a negative control, and the operation of maintaining the interaction state between genomes and the operation of binding DNA ends between interacting genomes were performed in the same manner.
  • the designed primers are 5′-CCGGTAGGGATAACAGGGTAATTTGAGAAGGTAGGGTTGCATGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 1) (including I-Sce-I site, 5 ′ biotin-labeled), 5′-GGCTATCCTAGCTTGGCTCAGAA-3 ′ (SEQ ID NO: 11).
  • the primer of SEQ ID NO: 1 was designed to anneal to the 5'HS5 region, and the primer of SEQ ID NO: 11 was annealed to the MIR422A gene region.
  • the PCR reaction solution was prepared using KOD FX (Toyobo Co., Ltd., KFX-101).
  • reaction solution containing 2 ⁇ L of the purified DNA prepared in (1) above, 1 ⁇ Buffer, 0.4 mM dNTPs, 0.3 ⁇ M of each primer, and 0.3 ⁇ L of KOD FX in 15 ⁇ L was prepared.
  • the reaction was first performed at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 40 cycles of denaturation at 98 ° C. for 10 seconds, primer annealing at 60 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 68 ° C. for 6 minutes.
  • a primer for amplifying the MIR422A gene region was designed and PCR was performed.
  • the designed primers are 5′-CTGGACAGCTCCCATGCTATTA-3 ′ (SEQ ID NO: 12) and 5′-TACTCTGGAGCTCTGGGTCTGAT-3 ′ (SEQ ID NO: 13).
  • the PCR reaction solution was prepared using AmpliTaq Gold 360 PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, 4399876).
  • reaction solution containing 2 ⁇ L of the DNA fragment (I-SceI inactivated) recovered in (2) and (b), 1 ⁇ AmpliTaq Gold 360 PCR Master Mix, and 0.5 ⁇ M of each primer in 15 ⁇ L was prepared.
  • a negative control for PCR a reaction solution to which 2 ⁇ L of purified water was added instead of the DNA fragment was prepared. The reaction was first carried out at 95 ° C. for 10 minutes, followed by 23 cycles of denaturation at 95 ° C. for 30 seconds, primer annealing at 60 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C. for 1 minute.
  • Example 3 Detection of YIF1A gene region interacting with 5'HS5 region
  • (1) Maintaining the interaction state between genomes and binding DNA ends between interacting genomes The treatment of NaB treatment of human leukemia cell line K562, maintaining the interaction state between genomes, and the operation of joining DNA ends between interacting genomes The same method as in Example 1 (1) (a) to (d) was performed.
  • NaB-untreated K562 was prepared as a negative target, and the operation of maintaining the interaction state between genomes and the operation of binding DNA ends between interacting genomes were performed in the same manner.
  • the designed primers are 5′-CCGGTAGGGATAACAGGGTAATTTGAGAAGGTAGGGTTGCATGAG-3 ′ (SEQ ID NO: 1) (including I-Sce-I site, 5 ′ labeled with biotin), 5′-TATCAGTGACAGAGCTGCCAAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 14).
  • the primer of SEQ ID NO: 1 was designed to anneal to the 5'HS5 region, and the primer of SEQ ID NO: 14 to anneal to the YIF1A gene region.
  • the PCR reaction solution was prepared using KOD FX (Toyobo Co., Ltd., KFX-101).
  • reaction solution containing 2 ⁇ L of the purified DNA prepared in (1) above, 1 ⁇ Buffer, 0.4 mM dNTPs, 0.3 ⁇ M of each primer, and 0.3 ⁇ L of KOD FX in 15 ⁇ L was prepared.
  • the reaction was first performed at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 40 cycles of denaturation at 98 ° C. for 10 seconds, primer annealing at 60 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 68 ° C. for 6 minutes.
  • a primer for amplifying the YIF1A gene region was designed and PCR was performed.
  • the designed primers are 5′-AGACCCCAAATCTTCCCATACG-3 ′ (SEQ ID NO: 15) and 5′-AAGCCCCAGGATGCTGACTC-3 ′ (SEQ ID NO: 16).
  • the PCR reaction solution was prepared using AmpliTaq Gold 360 PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, 4399876).
  • reaction solution containing 2 ⁇ L of the DNA fragment (I-SceI inactivated) recovered in (2) and (b), 1 ⁇ AmpliTaq Gold 360 PCR Master Mix, and 0.5 ⁇ M of each primer in 15 ⁇ L was prepared.
  • a negative control for PCR a reaction solution to which 2 ⁇ L of purified water was added instead of the DNA fragment was prepared. The reaction was first carried out at 95 ° C. for 10 minutes, followed by 27 cycles of denaturation at 95 ° C. for 30 seconds, primer annealing at 60 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C. for 1 minute.

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Abstract

(1)解析対象DNAと他のDNAとが相互作用している状態のDNAを含み、超音波処理またはDNA配列特異性を持たないエンドヌクレアーゼによる部分分解処理により断片化DNAを調製する工程、(2)断片化DNAのライゲーションを行う工程、(3)ライゲーション後のDNAから、解析対象DNAおよび当該DNAと相互作用しているDNAを含む複合体を増幅および/または精製する工程、ならびに(4)増幅および/または精製された複合体中の前記相互作用しているDNAを解析する工程を含むDNA間相互作用の解析方法を提供する。本方法は、高価な機器や熟練を必要とせず、一般の研究者が簡便に実施することができ、信頼性の高い結果を得ることができるDNA間相互作用の解析方法であり、かつ、制限酵素を用いずに実施できるDNA間相互作用の解析方法である。

Description

DNA間相互作用の解析方法
 本発明は、DNA間相互作用の解析方法に関するものである。
 近年、核内でゲノムDNAが形成する三次元構造が、ゲノム機能の発現調節に重要な役割を果たしている可能性が示唆されている。ゲノムDNAの三次元構造の実態を理解するためには、ゲノムDNA間の相互作用を検出することが必要である。ゲノムDNA間の相互作用を検出する方法として、以下の方法が知られている。
(i) Chromosome Conformation Capture (3C) 法(非特許文献1~3)
 3C法の基本スキームは以下の(1)~(5)である。
(1) ホルムアルデヒドなどの架橋剤を用いてゲノムDNAをクロスリンクし、分子間相互作用を保持する。
(2) 制限酵素によりゲノムDNAを切断する。
(3) DNAリガーゼを用いたライゲーション反応により、相互作用によって同一複合体に含まれて近接するDNA断片間を分子内ライゲートする。
(4) 熱処理などによりクロスリンクを解除し、フェノール/クロロホルム処理などによりDNAを精製する。
(5) ライゲートされたDNA断片が増幅するように、それぞれの断片にアニールするプライマーを用いてPCR反応を行い、特定のゲノムDNA間がライゲートされているか否か、を調べる。
 しかし3C法では、制限酵素やリガーゼによる酵素反応を、クロスリンク下という非最適条件下で行わなくてはならないため、例えば、制限酵素による切断の効率が低くなる、完全消化でない、といった問題が生じる。また、例えば標的ゲノム領域に隣接する領域がPCR反応で増幅されるためにバックグラウンドが極めて高くなり、未知の相互作用の検出が難しくなるという問題が生じる。また、制限酵素が、あるゲノム領域を切断できるか否かはその領域へのアクセシビリティーによって左右されるため、対象領域におけるヘテロクロマチン化等の要因によって切断のされやすさに大きな違いが生じる。切断されやすいゲノム領域は反応液中に多く存在することになるため、分子間ライゲーションの基質になりやすく、その結果、出てきたシグナルは、ゲノム領域間相互作用ではなく、単にその領域の切れやすさ、すなわち、その領域のアクセシビリティーを示しているに過ぎないという可能性がある。実際、3C法やその派生法で得られた結果と後述するFISH(Fluorescence in situ Hybridization)法による結果を照合すると、FISH法では相互作用が確認できなかったという状況も多々生じていることが報告されている。
 最近、(2)の制限酵素処理に代わりにエンドヌクレアーゼ処理を行い、ビオチン化されているヌクレオチドを用いて末端を修復した後、ライゲートし、クロスリンク解除およびDNA精製を行い、ストレプトアビジンビーズによってライゲーション産物のみを精製し、次世代シークエンスをすることで、ヌクレオソームレベルの解像度でDNA間相互作用を検出できるとするmicro-C法が報告されている(非特許文献4)。この方法にも、クロスリンク下という非至適条件でのエンドヌクレアーゼ処理を行うという問題がある。また、ライゲーション産物全体を精製し、ヌクレオソームレベルという非常に短いライゲーション産物が生じる。このため、特異的ライゲーション産物をPCR法により検出しようとすれば、バックグラウンドが高くなる。また、最適なプライマーの設計が難しい。こうしたことから、相互作用ゲノムDNAの検出にPCR法を利用することは極めて難しい。この方法は、ライゲーション産物全体を次世代シークエンス法で配列決定することを前提としており、相互作用が予想される特定DNA領域間の相互作用のみを検出するといった用途には向かない。
(ii) FISH法
 FISH法単独、もしくは蛍光抗体法と組み合わせることにより、特定ゲノム領域と別のゲノム領域やRNA、蛋白質との相互作用が検出可能である。しかし、この方法は解像度が低く、また、未知の分子との相互作用は検出できない。また、共焦点顕微鏡等の高価な機器が必要であり、それらを使いこなす高い技術が必要である。
(iii) 人工DNA結合分子と蛍光分子の融合分子/複合体による特定ゲノム領域のライブイメージング(非特許文献5,6,7)
 人工DNA結合分子と蛍光分子を組み合わせた融合分子もしくは複合体によって、特定のゲノム領域を生細胞の中で可視化する技術が最近開発された。しかし、この方法も解像度が低く、また、未知の分子との相互作用は検出できない。また、ゲノム領域間相互作用の検出に使用したという報告はない。さらにライブイメージングを可能とする解像度の高い顕微鏡が必要であり、それらを使いこなす高い技術が必要である。
(iv) 遺伝子座特異的クロマチン免疫沈降法(遺伝子座特異的ChIP法)(非特許文献8,9)
 遺伝子座特異的ChIP法とPCR法、マイクロアレイ解析、もしくは次世代シークエンス法を組み合わせることで、特定ゲノム領域と相互作用するゲノム配列を同定することができる。しかし、遺伝子座特異的ChIP法の実施に手間がかかるという問題点がある。
Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., and Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science (2002) 295, 1306-1311. Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., and de Laat, W. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nat. Genet. (2006) 38, 1348-1354. Simonis, M., Kooren, J., and de Laat, W. An evaluation of 3C-based methods to capture DNA interactions. Nat. Methods (2007) 4, 895-901. Hsieh, T.-S., Weiner, A., Lajoie, B., Dekker, J., Friedman, N., Rando, O.J. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C. Cell (2015) 162, 108-119. Lindhout, B.I., Fransz, P., Tessadori, F., Meckel, T., Hooykaas, P.J.J., van der Zaal, B.J. Live cell imaging of repetitive DNA sequences via GFP-tagged polydactyl zinc finger proteins. Nucleic Acids Res. (2007) 35, e107. Gilbert, L.A., Larson, M.H., Morsut, L., Liu, Z., Brar, G.A., Torres, S.E., Stern-Ginossar, N., Brandman, O., Whitehead, E.H., Doudna, J.A., Lim, W.A., Weissman, J.S., Qi, L.S. Cell (2013) 154, 442-51. Miyanari, Y., Ziegler-Birling, C., Torres-Padilla, M.E. Live visualization of chromatin dynamics with fluorescent TALEs. Nat. Struct. Mol. Biol. (2013) 20, 1321-1324. Hoshino, A., and Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. (2009) 108, 446-449. Fujita T, and Fujii H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2013) 439, 132-136.
 本発明は、高価な機器や機器操作の熟練を必要とせず、一般の研究者が簡便に実施することができ、信頼性の高い結果を得ることができるDNA間相互作用の解析方法を提供することを課題とする。また、制限酵素を用いずに実施できるDNA間相互作用の解析方法を提供することを課題とする。
 本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
[1]以下の工程(1)~(4)を含むことを特徴とするDNA間相互作用の解析方法:(1)解析対象DNAと他のDNAとが相互作用している状態のDNAを含み、超音波処理またはDNA配列特異性を持たないエンドヌクレアーゼによる部分分解処理により断片化DNAを調製する工程、(2)断片化DNAのライゲーションを行う工程、(3)ライゲーション後のDNAから、解析対象DNAおよび当該DNAと相互作用しているDNAを含む複合体を増幅および/または精製する工程、ならびに(4)増幅および/または精製された複合体中の前記相互作用しているDNAを解析する工程。
[2]前記工程(1)において、DNAを断片化する前に、解析対象DNAおよび当該DNAと相互作用しているDNAの相互作用状態を保持する処理を行うことを特徴とする前記[1]に記載の解析方法。
[3]前記工程(2)において、ライゲーションを行う前に、断片化DNAの末端を修復することを特徴とする前記[1]に記載の解析方法。
[4]前記工程(3)において、前記複合体を増幅および/または精製する前に、ライゲーション後のDNAに保持されている相互作用状態を解除する処理を行うことを特徴とする前記[1]に記載の解析方法。
[5]前記工程(3)において、解析対象DNAおよび相互作用が予想されるDNAにそれぞれプライマーを設計し、当該2箇所で挟まれる領域を増幅するPCRを行うことを特徴とする前記[1]~[4]のいずれかに記載の解析方法。
[6]前記工程(3)において、解析対象DNAの2箇所に、当該2箇所で挟まれる領域を増幅せずかつ逆向きのプライマーをそれぞれ設計し、PCRを行うことを特徴とする前記[1]~[4]のいずれかに記載の解析方法。
[7]前記工程(3)において、アフィニティー精製用修飾したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物をアフィニティー精製することを特徴とする前記[5]または[6]に記載の解析方法。
[8]前記工程(3)において、ビオチン化プライマーを用いてPCRを行うことを特徴とする前記[7]に記載の解析方法。
[9]前記工程(3)において、PCR産物以外のDNAを除去することを特徴とする前記[5]~[8]のいずれかに記載の解析方法。
[10]前記工程(3)において、解析対象DNAの特定のDNA配列に結合する外来性分子または外来性分子複合体を用いて精製することを特徴とする前記[1]~[9]のいずれかに記載の解析方法。
[11]前記外来性分子または外来性分子複合体が、ジンクフィンガー蛋白質、TALエフェクター蛋白質、外来性核酸、または不活性型Cas9蛋白質とガイドRNA(gRNA)の複合体であることを特徴とする前記[10]に記載の解析方法。
[12]前記工程(4)において、工程(3)で増幅および/または精製した複合体を鋳型とし、解析対象DNAとの相互作用が予想されるDNAを増幅するためのプライマーセットを用いてPCRを行うことを特徴とする前記[1]~[11]のいずれかに記載の解析方法。
[13]前記工程(4)において、工程(3)で増幅および/または精製した複合体をマイクロアレイ解析することを特徴とする前記[1]~[11]のいずれかに記載の解析方法。
[14]前記工程(4)において、工程(3)で増幅および/または精製した複合体の塩基配列を解析することを特徴とする前記[1]~[11]のいずれかに記載の解析方法。
[15]前記DNAがゲノムDNAであることを特徴とする前記[1]~[14]のいずれかに記載の解析方法。
 本発明により、高価な機器や機器操作の熟練を必要とせず、一般の研究者が簡便に実施することができ、信頼性の高い結果を得ることが可能なDNA間相互作用の解析方法を提供することができる。本発明を用いれば、解析対象DNAとの相互作用が予想されるDNAの実際の相互作用の確認を極めて簡単に実施することができる。また、本発明の解析方法は制限酵素を使用しないため、制限酵素部位の有無や頻度により解析対象DNAが制限されず、任意のDNAを解析対象とすることができる。
本発明の解析方法の第1の実施形態を示す図である。 本発明の解析方法の第2の実施形態を示す図である。 本発明の解析方法の第3の実施形態を示す図である。 本発明の解析方法の第4の実施形態を示す図である。 本発明の解析方法の第5の実施形態を示す図である。 本発明の解析方法により、ヒトゲノムの5'HS5領域と相互作用するゲノム領域を検出した結果を示す図である。 不活性型Cas9蛋白質とgRNAの複合体(CRISPR系)を用いて、ヒトゲノムのIRF-1遺伝子座領域をアフィニティー精製した結果を示す図である。 本発明の解析方法により、ヒトゲノムの5'HS5領域と相互作用するMIR422A遺伝子領域を検出した結果を示す図である。 本発明の解析方法により、ヒトゲノムの5'HS5領域と相互作用するYIF1A遺伝子領域を検出した結果を示す図である。
 本発明は、新規なDNA間相互作用の解析方法を提供する。本発明の解析方法は、以下の工程(1)~(4)を含むものであればよい。
(1)解析対象DNAと他のDNAとが相互作用している状態のDNAを含み、超音波処理またはDNA配列特異性を持たないエンドヌクレアーゼによる部分分解処理により断片化DNAを調製する工程、
(2)断片化DNAのライゲーションを行う工程、
(3)ライゲーション後のDNAから、解析対象DNAおよび当該DNAと相互作用しているDNAを含む複合体を増幅および/または精製する工程、ならびに
(4)増幅および/または精製された複合体中の前記相互作用しているDNAを解析する工程。
 本発明の解析方法において対象となるDNAは特に限定されず、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA、プラスミドDNA、人工合成DNAなどを解析対象とすることができる。したがって、本発明の解析方法は、上記例示したDNA同士の相互作用、上記例示したDNA間の相互作用の解析に用いることができるが、ゲノムDNA同士、またはゲノムDNAと他のDNA(ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA、プラスミドDNA、人工合成DNAなど)との相互作用の解析に用いることが好ましい。解析対象がゲノムDNA同士の相互作用である場合、同一染色体内のDNAの相互作用および異なる染色体間のDNAの相互作用のいずれの相互作用も本発明の解析方法を用いて解析することができる。あるいは、宿主細胞のDNAとその宿主細胞に寄生する微生物のDNAの相互作用も本発明の解析方法を用いて解析することができる。
 工程(1)では、断片化されたDNA調製物を調製する。工程(1)で得られるDNA調製物に含まれる解析対象DNAと他のDNAとが相互作用している状態のDNAが、本発明の解析方法の対象となる。工程(1)におけるDNA調製物の調製方法は特に限定されないが、例えば以下の手順1または手順2の調製方法を好ましく用いることができる。
 手順1:
 手順1は、細胞や組織から調製したDNAのDNA間相互作用の解析に適したDNA調製物を調製する手順である。手順1では、通常、解析対象DNAと他のDNAとが相互作用している状態のDNAを調製した後に、DNAの断片化を行うことにより、目的のDNA調製物を得ることができる。解析対象DNAと他のDNAとが相互作用している状態のDNAの調製方法は特に限定されず、細胞や組織からDNAを調製する公知の方法を適宜選択して用いることができる。例えば、IGEPAL-CA-630などの界面活性剤を含む細胞溶解液および高塩濃度の核抽出液を組み合わせることで、細胞や組織からDNAを含む画分を抽出する方法が挙げられる。
 本発明の解析方法では、制限酵素による切断では得られないランダムに切断された断片を取得するために、超音波処理またはDNA配列特異性を持たないエンドヌクレアーゼ(制限酵素でないDNA分解酵素)による部分分解(部分切断)処理により、DNAを切断することが好ましい。超音波処理を行う場合は、解析対象DNAのサイズに応じて、適切な大きさの断片に切断される処理条件を予め決定しておくことが好ましい。DNA配列特異性を持たないエンドヌクレアーゼを用いる場合も、解析対象DNAのサイズに応じて、適切な大きさの断片に切断される反応条件を予め決定しておくことが好ましい。DNA配列特異性を持たないエンドヌクレアーゼとしては、例えば、ミクロコッカスデオキシリボヌクレアーゼが挙げられる。
 手順1において、DNAを断片化する前に、解析対象DNAおよび当該DNAと相互作用しているDNAの相互作用状態を保持する処理を行うことが好ましい。相互作用状態を保持する処理は、後に相互作用している分子を分離、精製して解析に供することができる処理であれば特に限定されない。好ましい処理としては、例えば架橋処理が挙げられる。架橋処理に用いる好ましい架橋剤としては、例えばホルムアルデヒドが挙げられる。
 手順2:
 手順2は、試験管内で再構築したDNA間相互作用の解析に適したDNA調製物を調製する手順である。手順2では、試験管内でDNA間相互作用を再構築した後にDNAを断片化してもよく、DNAを断片化した後に試験管内でDNA間相互作用を再構築してもよい。試験管内でDNA間相互作用を再構築する方法は特に限定されず、例えば、解析対象DNAと相互作用が予想される他のDNAとを至適条件下において試験管内で混合することにより、解析対象DNAと他のDNAとが相互作用している状態のDNAを再構築する方法が挙げられる。DNA間相互作用を再構築するために用いるDNAはどのようなDNAでもよく、DNAの種類に応じて公知の方法で調製することができる。
 DNAの断片化は、手順1と同様に、超音波処理またはDNA配列特異性を持たないエンドヌクレアーゼ(制限酵素でないDNA分解酵素)による部分分解(部分切断)処理を好適に用いることができる。また、DNA間相互作用を再構築させた後に、DNAの相互作用状態を保持する処理を行うことが好ましい。DNA間相互作用を再構築させた後にDNAの断片化を行う場合は、断片化の前にDNAの相互作用状態を保持する処理を行うことが好ましい。相互作用状態を保持する処理は、手順1と同様に、後に相互作用している分子を分離、精製して解析に供することができる処理であれば特に限定されない。好ましい処理としては、例えば架橋処理が挙げられる。架橋処理に用いる好ましい架橋剤としては、例えばホルムアルデヒドが挙げられる。
 工程(2)では、断片化DNAのライゲーションを行う。好ましくは、ライゲーションを行う前に、断片化DNAの末端を修復する処理を行う。末端を修復することにより、ライゲーション反応の効率を向上させることができる。末端の修復としては、T4 DNAポリメラーゼ等を用いて末端を平滑化し、T4 ポリヌクレオチドキナーゼ等を用いて5'末端をリン酸化することが挙げられる。ライゲーションは、T4 DNAリガーゼ等を用いて行うことができる。DNAの末端平滑化、5'末端リン酸化およびライゲーション反応の具体的な手法は、当該技術分野において周知である。本発明の解析方法では、分子内ライゲーションが起こりやすい条件でライゲーションを行うことが好ましい。相互作用状態を保持したDNA断片の大きさを考慮して、ライゲーション反応液中のDNA濃度を予め決定しておくことが好ましい。
 工程(3)では、ライゲーション後のDNAから、解析対象DNAおよび当該DNAと相互作用しているDNAを含む複合体を増幅および/または精製する。工程(3)は、目的の複合体の含有率を高めるために行われる工程であり、目的が達成できる限り増幅のみでもよく、精製のみでもよく、増幅と精製を組み合わせてもよい。また、工程(1)において、相互作用状態を保持する処理を行った場合には、複合体を増幅および/または精製する前に、ライゲーション後のDNAに保持されている相互作用状態を解除する処理を行うことが好ましい。相互作用状態を解除する方法は特に限定されず、相互作用状態を保持する処理の方法に応じて、公知の解除方法から適宜選択することができる。例えば、相互作用状態を保持する処理がホルムアルデヒドを用いた架橋処理の場合には、高濃度の塩溶液(5M NaCl溶液など)を添加して適当な温度で適当な時間(例えば約65℃で一夜)インキュベートすることにより架橋を解除することができる。
 工程(3)で用いる増幅方法は特に限定されず、公知の核酸増幅方法を適宜選択して用いることができる。好ましくはPCRである。PCRで用いるプライマーの設計は特に限定されないが、例えば以下のように設計することが好ましい。解析対象DNAと相互作用するDNAが予想されている場合は、解析対象DNA部分および当該DNAとの相互作用が予想されるDNA部分に、当該2箇所で挟まれる領域を増幅するようにそれぞれプライマーを設計する(図1D参照)。解析対象DNAと相互作用が予想されるDNAとがライゲーションにより連結していれば、このプライマーセットによりPCR産物が生成される(図1E参照)。解析対象DNAと相互作用するDNAが予想されておらず、未知の相互作用領域を検出する場合は、解析対象DNA部分の2箇所に、当該2箇所で挟まれる領域を増幅せずかつ逆向きのプライマーをそれぞれ設計する(図2D参照)。解析対象DNAと相互作用が予想されるDNAとがライゲーションにより連結していれば、このプライマーセットによりPCR産物が生成される(図2E参照)。
 増幅と精製を組み合わせる場合は、例えば、アフィニティー精製用修飾したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物をアフィニティー精製する方法を好適に用いることができる。アフィニティー精製用修飾としては、例えばビオチン化、ジゴキシゲニン化、メチル化DNA結合蛋白質などを用いる際のシトシンのメチル化、熱変性後のハイブリッド形成ができるような末端塩基配列などが挙げられる。好ましくはビオチン化である。ビオチン化プライマーを用いてPCRを行うことによりビオチン化されたPCR産物が増幅されるので、例えばストレプトアビジンが結合したビーズ等を用いて増幅されたPCR産物をアフィニティー精製することができる。
 工程(3)において、目的の複合体の含有率を高めるために、解析対象DNAおよび当該DNAと相互作用しているDNAを含む複合体をPCRで増幅した後に、PCR産物以外のDNAを除去する操作を行ってもよい。PCR産物以外のDNAを除去する方法としては、例えば、PCRを行う前にライゲーションしたDNAをDNAメチル化酵素と反応させてメチル化しておき、PCR後にメチル化特異的エンドヌクレアーゼによってメチル化DNAのみを切断する方法や、PCR後に反応液をメチル化DNA結合蛋白質が固定されている担体に接触させてメチル化DNAを除去する方法などが挙げられる。
 工程(3)において、解析対象DNAの特定のDNA配列に結合する外来性分子または外来性分子複合体(以下、「外来性分子等」と記す。)を用いて精製する方法を好適に用いることができる。外来性分子等は、特定のDNA配列に結合する性質を持つものであれば特に限定されない。例えば、外来性DNA結合蛋白質、外来性核酸、外来性蛋白質-核酸複合体などが挙げられる。外来性DNA結合蛋白質としては、蛋白質のアミノ酸配列を標的DNAの塩基配列に関連付けて設計することが可能な蛋白質が好ましい。このような外来性DNA結合蛋白質としては、例えば、ジンクフィンガー蛋白質、TALエフェクター蛋白質などが挙げられる。外来性核酸は、解析対象ゲノム領域とハイブリダイズ可能な核酸であればよい。核酸としては、例えばLNA(Locked nucleic acid)、ODN(oligodeoxyribonucleotides)、ORN(oligoribonucleotides)、およびそれらのハイブリッドなどが挙げられる。外来性蛋白質-核酸複合体としては、Cas9蛋白質とガイドRNA(gRNA)の複合体などが挙げられる。
 外来性核酸は、例えば化学合成により作製することができる。あるいは、ランダム核酸配列ライブラリーから標的のDNA配列に結合する分子種をアフィニティー精製し、PCR法等を用いて濃縮・選別することにより取得することができる。また、こうして選別した核酸に適当な変異を導入して、標的DNA配列との親和性を更に向上させることも可能である。
 ジンクフィンガー蛋白質は、任意のDNAの塩基配列を認識するように改変可能であることが知られている(例えば、Beerli et al., (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al., (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al., (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al., (2001) Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637;Choo et al.,(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416を参照)。改変されたジンクフィンガー蛋白質は、天然のジンクフィンガー蛋白質が持たない新規な結合特異性を持つことができる。改変する方法は特に限定されないが、例えば既知の特異性を持つ個々のジンクフィンガーモジュールをつなぎ合わせる方法が挙げられる。
 ファージディスプレイやツーハイブリッドシステム等を用いる特異性の選択方法は、米国特許第5,789,538号;米国特許第5,925,523号;米国特許第6,007,988号;米国特許第6,013,453号;米国特許第6,410,248号;米国特許第6,140,466号;米国特許第6,200,759号;米国特許第6,242,568号;国際公開WO98/37186;国際公開WO98/53057;国際公開WO00/27878;国際公開WO01/88197、英国特許第2,338,237号等に開示されている。
 TALエフェクター蛋白質は、植物病原細菌ザントモナス属から単離された蛋白質である。TALエフェクター蛋白質のDNA結合ドメインは、1つのユニットが約34アミノ酸からなる、ほぼ完全なタンデムリピート構造を有する。ユニットの12および13番目のアミノ酸は高頻度に変化しておりRVD(repeat variable diresidue)と呼ばれる。RVDの違いがDNA塩基認識特異性を決定する。特定の塩基配列を認識するTALエフェクター蛋白質を作製するためには、対応するRVDを含んだユニットをつなぎ合わせればよい(Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501、Boch et al., (2009) Science 326:1509-1512、Miller et al., (2011) Nat. Biotechnol., 29:143-148を参照)。
 Cas9蛋白質は細菌および古細菌由来の酵素で、RNAガイド下にそのRNAに特異的な配列を切断する(CRISPR系)。Cas9蛋白質は野生型および不活性型のどちらも使用できるが、不活性型であることが好ましい。本明細書において、不活性型Cas9蛋白質は、DNase活性を欠損しているが、DNA結合活性は保持しているCas9変異体であり、RNAガイド下にそれと相補的なDNA配列に結合する性質を有している(Jinek et al., (2012) Science, 337:816-821)。様々な細菌および古細菌で、Cas9と同様の機能を持った蛋白質が知られており、本明細書においては、そうした機能を保持している蛋白質であれば、特に由来の種は限定されない。例えば、Streptococcus pyogenes、Staphylococcus aureus、Neisseria meningitidis、Streptococcus thermophilus、Treponema denticolaなどのCas9蛋白質や、Acidaminococcus、Lachnospiraceae bacterium、Francisella novicidaなどのCpf1蛋白質も好適に用いることができる。
 外来性分子が結合する特定のDNA配列は、解析対象DNA内に存在するDNA配列を選択すればよい。選択するDNA配列は、解析対象DNA部分のみに存在し、それ以外のDNA部分に存在しないことが好ましいが、解析対象以外のDNA部分に稀に存在するものを選択してもよい。
 解析対象DNAの特定のDNA配列に結合する外来性分子等を用いて精製する方法は特に限定されず、用いた外来性分子等に応じて、適宜選択することができる。例えば、相互作用状態を解除したDNAと外来性分子等を接触させ、その後外来性分子等を回収し、外来性分子等に結合したDNAを溶出させる方法が挙げられる。外来性分子等には精製用タグを付加してもよい。また、外来性分子等を固定化した担体を用いることも可能である。外来性分子等を固定化した担体を用いる精製方法としては、例えば、外来性分子等を固定化した担体をカラムに詰め、前記相互作用状態を解除したDNAをカラムに通し、カラムを洗浄後、外来性分子等に結合したDNAを溶出させる方法、外来性分子等を固定化した担体を入れたチューブに前記相互作用状態を解除したDNAを加えて攪拌し、その後担体を洗浄し、外来性分子等に結合したDNAを溶出させる方法、などが挙げられる。
 外来性分子を固定化する担体は、蛋白質または核酸を固定化できる担体であれば特に限定されない。例えば、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、メタアクリレート、ラテックス、アガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、デキストリン、シリカゲル、多孔性セラミックス等の素材できたビーズ、マグネチックビーズ、ディスク、スティック、チューブ、マイクロタイタープレート、マイクロセンサーチップ、マイクロアレイ等が挙げられる。外来性分子の担体への固定化方法は、物理的吸着、共有結合、架橋等の公知の方法を適宜選択して用いることができる。
 工程(3)において、増幅および/または精製操作開始前または終了後に、DNA断片のサイズ選別を行ってもよい。DNA断片のサイズ選別方法としては、例えばアガロースゲル電気泳動、ゲルろ過クロマトグラフィーなどが挙げられる。DNA断片のサイズ選別を行うことにより、切断されていないDNAを排除することができ、そのDNA断片内に含まれる領域を誤って相互作用領域と判断する可能性を排除できる。
 工程(4)では、精製した複合体中の相互作用しているDNAを解析する。相互作用しているDNAの解析方法は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。解析対象DNAと相互作用するDNAが予想されており、実際に予想されるDNAが相互作用しているか否かを確認することが目的である場合は、例えば、予想されるDNA部分の内部に当該DNA部分の一部を増幅するためのプライマーセットを設計し、当該プライマーセットを用いてPCRを行い、増幅産物の有無を確認する方法が挙げられる。一方、解析対象DNAと相互作用する未知のDNAを見出すことを目的とする場合は、工程(3)で精製したDNAのマイクロアレイ解析や塩基配列を解析する方法が挙げられる。マイクロアレイ解析には、例えば、Agilent社マイクロアレイシステム、Affymetrix社マイクロアレイシステムなどを好適に用いることができる。塩基配列の解析方法は特に限定されず、公知の方法を好適に用いることができる。高速、大量の塩基配列解析ができる点で、次世代シークエンス法を用いることが好ましい。
 本発明の代表的な実施形態を、図1~5を用いて以下に説明する。ただし、本発明の解析方法は、これらの実施形態に限定されるものではない。図1~5において、実線は解析対象DNA(解析対象ゲノム領域)を表し、破線は相互作用DNA(相互作用ゲノム領域)を表す。
 図1の実施形態において、Aは解析対象ゲノム領域が他のゲノム領域と相互作用している状態を示す。Bは工程(1)により得られた調製物に含まれる相互作用領域の断片を示す。Cは工程(2)のライゲーションにより、解析対象ゲノム領域の片方の末端と、相互作用しているゲノム領域の片方の末端が分子内ライゲーションにより連結した状態を示す。次に、工程(3)に進み、相互作用状態を解除した後、Dに示すように、ライゲーションにより連結した解析対象ゲノム領域側と、当該ゲノム領域との相互作用が予想されるゲノム領域側に当該2箇所に挟まれる領域を増幅するようにプライマーを設計する。ここでは、解析対象ゲノム領域側のプライマーはビオチン標識されている。このようなプライマーセットを用いてPCRを行うと、解析対象ゲノム領域と相互作用が予想されるゲノム領域とがライゲーションにより連結されていれば、Eに示すようにビオチン化されたPCR産物が増幅される。このPCR産物をストレプトアビジンビーズを用いて精製することにより、解析対象ゲノム領域と相互作用ゲノム領域との複合体が濃縮される。工程(4)では、前記相互作用が予想されるゲノム領域内を増幅するプライマーセットを用いてPCRを行い、PCR産物の存在を確認することで、解析対象ゲノム領域が、予想されたゲノム領域と実際に相互作用していることを確認することができる。
 図2の実施形態において、A、Bおよび工程(1)は、図1と同じである。Cは、工程(2)のライゲーションにより、解析対象ゲノム領域の両方の末端が、相互作用しているゲノム領域の両方の末端それぞれ分子内ライゲーションにより連結した状態を示す。工程(3)に進み、Cに示す分子内ライゲーションが生じた複合体の相互作用状態を解除すると、Dに示すような環状分子になる。図2の実施形態では、解析対象ゲノム領域内の2箇所に、当該2箇所で挟まれる領域を増幅しない逆向きのプライマーセットを設計し、その一方をビオチン化する。このようなプライマーセットを用いてPCRを行うと、Eに示すように複合体中の相互作用ゲノム領域の全体を挟むビオチン化PCR産物が増幅される。このPCR産物ストレプトアビジンビーズを用いて精製することにより、解析対象ゲノム領域と相互作用ゲノム領域との複合体が濃縮される。工程(4)では、図1と同様に、相互作用が予想されるゲノム領域内を増幅するプライマーセットを用いてPCRを行い、PCR産物の存在を確認することで、解析対象ゲノム領域が、予想されたゲノム領域と実際に相互作用していることを確認することができる。
 図3の実施形態において、A、B、C、D、E、ならびに工程(1)~(3)は図2と同じである。工程(4)では、工程(3)で精製されたPCR産物の塩基配列解析を行う。ここでは、次世代シークエンス法を用いて相互作用ゲノム領域を網羅的に同定する。これにより、解析対象ゲノム領域と相互作用する未知のゲノム領域を同定することができる。工程(4)では、次世代シークエンス法に代えて、マイクロアレイ解析を行ってもよい。
 図4および図5の実施形態は、工程(3)において前記外来性分子等を用いて精製する実施形態である。図4および図5の実施形態において、A、B、C、ならびに工程(1)~(2)は図1と同じである。工程(3)では、Dに示したように、解析対象ゲノム領域の内在性DNA配列に特異的に結合する精製用タグ付き外来性分子を解析対象ゲノム領域に結合させ、当該解析対象ゲノム領域およびこれと連結している相互作用ゲノム領域の複合体を精製する。図4の実施形態における工程(4)では、図1、図2と同様に、相互作用が予想されるゲノム領域内を増幅するプライマーセットを用いてPCRを行い、PCR産物の存在を確認することで、解析対象ゲノム領域が、予想されたゲノム領域と実際に相互作用していることを確認することができる。図5の実施形態における工程(4)では、図3と同様に次世代シークエンス法を用いて相互作用ゲノム領域を網羅的に同定することにより、解析対象ゲノム領域と相互作用する未知のゲノム領域を同定することができる。工程(4)では、次世代シークエンス法に代えて、マイクロアレイ解析を行ってもよい。
 本発明の解析方法は、3C法等のゲノムDNA間の相互作用を検出するための従来の方法と比較して、以下の特徴を有している。
(I) ゲノムDNAの断片化に超音波処理またはDNA配列特異性を持たないエンドヌクレアーゼによる部分分解処理を用いて、ランダムにゲノムDNAを切断する。これにより、相互作用しているゲノム領域近傍に適当な制限酵素サイトがない場合でも解析可能となる。また、一般に、クロスリンク下での制限酵素切断は完全消化させることが極めて難しいのに対して、本発明の解析方法では確実に切断できる方法および条件を選択できるという利点がある。
(II) 解析対象DNAおよび当該DNAと相互作用しているDNAを含む複合体を増幅および/または精製することによって、相互作用しているゲノム領域間の増幅産物を濃縮できる。これによって、元の溶液中に存在する細胞由来のゲノムDNAに起因するバックグラウンドを大幅に低減することができる。
(III) 相互作用の検出をPCR法で行う場合、用いるプライマーは、相互作用が予想されるゲノム領域内部に一対のプライマーを設計するだけでよい。すなわち、3C法のように検出用PCRプライマーの設計に頭を悩ませる必要がない。
(IV) こうした特徴のため、ゲノムDNA間の相互作用の検出が他の方法に比べて極めて簡便に行うことができる。
 以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例1:5'HS5領域と相互作用するZNF670遺伝子領域の検出〕
(1)ゲノム間相互作用状態の保持および相互作用ゲノム間でのDNA末端の結合
(a) ヒト白血病細胞株K562を1mMのナトリウム酪酸(NaB)を含むRPMI完全培地30mLで4日間培養した。1×107個の細胞を含む細胞懸濁液30mLに810μLの37%ホルムアルデヒドを添加して37℃で5分間置き細胞を架橋処理した。続いて、1.25Mグリシン溶液を3mL添加して室温で10分間置き、中和した。
(b) 遠心分離(1.3krpm、5分間、4℃)により細胞を氷冷PBSで2回洗浄した後、10mLの細胞溶解バッファー(10mM Tris (pH8.0)、1mM EDTA、0.5% IGEPAL CA-630、プロテアーゼインヒビターカクテル)に懸濁した。氷上で10分間置いた後、遠心分離 (2.0krpm、8分間、4℃)し、上清を捨て、ペレットを10mLの核溶解バッファー(10mM Tris (pH8.0)、1mM EDTA、0.5M NaCl、1% Trion X-100、0.5% sodium deoxycholate、0.5% lauroylsarcosine salt、プロテアーゼインヒビターカクテル)に懸濁し、2~3分おきにボルテックスをかけながら氷上で10分間置いた。遠心分離(2.0krpm、8分間、4℃)後、上澄みを捨て、氷冷PBSを用いて洗浄したペレットをクロマチン分画とした。
(c) クロマチン分画を800μLのTEバッファー(10mM Tris (pH8.0)、1mM EDTA、プロテアーゼインヒビターカクテル)に懸濁し、架橋されたゲノムDNAを超音波処理により断片化した(超音波発生機:TOMY SEIKO社製、Ultrasonic disruptor UD-201、output:3、Duty:100%、10sec×6 with 20sec intervalsを2分間の間隔を空けて3セット(計18回))。遠心分離(1.3krpm、10分間、4℃)して上清800μLを回収した。
(d) 上清34μLをEnd-It DNA End-Repair kit (epicentre社製、ER0720)で反応させ(反応液合計50μL、室温、45分)、DNA末端を修復した。70℃で10分間処理して酵素活性を失活させた後、23.5μLの反応液を4ユニットのT4 DNA ligase (Roche社製、10716359001)で反応させ(室温、2時間)、DNA末端同士をライゲーションさせた。なお、陰性対象として、T4 DNA ligaseを含まない反応液も同様に処理した。65℃で一晩処理し、分子の架橋を解除した後、RNase AおよびProteinase K処理し、ChIP DNA Clean & Concentrator-Capped column(ZYMO RESEARCH社製、D5205)を用いてDNAを精製した。
(2)PCR反応による相互作用ゲノム領域の増幅および精製
(a) 本発明者らは、K562細胞において、NaB処理によってヒト5'HS5領域とZNF670遺伝子領域が相互作用することを見出している(未発表データ)。したがって、上記(d)でゲノム末端同士がライゲーションされたDNA複合体には、5'HS5領域およびZNF670遺伝子領域のライゲーション産物が含まれることが予想される。そこで、ライゲーションされた5'HS5領域およびZNF670遺伝子領域が増幅されるプライマーを設計し、PCR反応を行った。設計したプライマーは、5'-CCGGTAGGGATAACAGGGTAATTTGAGAAGGTAGGGTTGCATGAG-3'(配列番号1)(I-Sce-Iサイトを含む、5'にビオチン標識)、5'-GAGTCTTGGACTCGGGCTCA-3'(配列番号2)である。なお配列番号1のプライマーは5'HS5領域と、配列番号2のプライマーはZNF670遺伝子領域とアニーリングするように設計した。PCR反応液はKOD FX(東洋紡社製、KFX-101)を用いて調製した。すなわち、15μL中に、上記(1)(d)の精製DNAを2μL、1×Buffer、0.4mMのdNTPs、0.3μMの各プライマー、および0.3μLのKOD FXを含む反応液を調製した。反応は、最初に94℃2分間の変性を行った後、98℃10秒間の変性、60℃30秒間のプライマーアニーリング、68℃6分間の伸長反応を30サイクル行った。
(b) 次に、15μLのDynabeads M-280 Streptavidin(Thermo Fisher Scientific社製、11205D)を用いて、PCR増幅したDNA断片をアフィニティー精製した。洗浄後、精製DNAを20μLの1×NEBuffer 2(New England BioLabs社製、B7002S)に懸濁した。
(3)ZNF670遺伝子領域の検出
(a) ZNF670遺伝子座を検出するため、ZNF670遺伝子領域が増幅されるプライマーを設計し、PCR反応を行った。設計したプライマーは、5'-ATCTTTGGGGTGAAGTTCCCTTT-3'(配列番号3)、5'-CCAAGAGATCTGGCTGCTAAACA-3'(配列番号4)である。PCR反応液はAmpliTaq Gold 360 PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific社製、4398876)を用いて調製した。すなわち、15μL中に、(2)(b)でアフィニティー精製したDNA断片(Dynabeads M-280 Streptavidinを含む)を2μL、1×AmpliTaq Gold 360 PCR Master Mix、0.5μMの各プライマーを含む反応液を調製した。なお、PCRの陰性対照としてDNA断片に代えて精製水を2μL添加した反応液を調製した。反応は、最初に95℃10分間の反応を行った後、95℃30秒間の変性、60℃30秒間のプライマーアニーリング、72℃1分間の伸長反応を35サイクル行った。
(b) 結果を図6に示した。図6から明らかなように、ライゲーション反応なしの陰性対照サンプル(図中-)では増幅が見られなかった。一方、ライゲーション反応を行ったサンプル(図中+)では、約0.1 kbpのバンドが検出された。以上の結果から、本発明の方法を用いることで、ゲノム間の相互作用を同定できることが示された。
〔参考例1:不活性型Cas9蛋白質とgRNAの複合体(CRISPR系)を用いたゲノム領域の精製〕
(1)不活性型Cas9蛋白質とgRNAの複合体の調製
(a) SV40 T抗原由来の核移行シグナルを含むCas9 D10A変異体をコードするプラスミドをAddgeneより購入した(Addgene #41816)。これを基に、H840A変異を導入して、DNase活性を持たないCas9変異体(dCas9)を作製した。N末端に3×FLAGタグ、C末端にDockタグを融合させたdCas9蛋白質を発現するベクターを作製し、カイコ発現系で組換え蛋白質を発現させた後、アフィニティー精製によって組換え蛋白質(r3xFLAG-dCas9-D)を精製した(シスメックス社)。精製したr3xFLAG-dCas9-D は、抗FLAG抗体M2(シグマ-アルドリッチ社製、anti-FLAG M2、F1804)を結合させたDynabeads Protein G(Thermo Fisher Scientific社製、10004D)に結合させた。
(b)ヒトIRF-1遺伝子座に存在する5'-CCGGGGGCGCTGGGCTGTCCCGG-3'配列(配列番号5)に対応するgRNAを化学合成した(ジーンデザイン社)。なお、化学合成した配列は、5'-CCGGGGGCGCUGGGCUGUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3'(配列番号6)である。溶解したgRNAは、100℃2分間で加熱し、室温に戻した。
(c) Dynabeadsに結合させたr3xFLAG-dCas9-DとgRNAを100μLのin vitro CRISPRバッファー(20 mM HEPES(pH7.5)、150 mM KCl、0.1 mM EDTA、10 mM MgCl2、0.5 mM DTT)に加え、37℃10分間で反応させることで、r3xFLAG-dCas9-D/gRNA複合体を形成させた。
(2)ゲノム領域の精製
(a) ヒト胎児腎由来の293T細胞からゲノムDNAを抽出し、5μgのゲノムDNAを800μLのin vitro CRISPRバッファーに懸濁後、超音波処理により断片化した(超音波発生機:TOMY SEIKO社製、Ultrasonic disruptor UD-201、output:3、Duty:100%、10 sec)。続いて、マウス正常IgGを結合させたDynabeads Protein Gを用いて、プレクリアー操作を行い、非特異的結合物を除いた。
(b) プレクリアー操作を行ったゲノムDNAと上記(1)(c)の複合体を37℃で20分間反応させ、IRF-1遺伝子座をアフィニティー精製した。
(c) 洗浄後、アフィニティー精製複合体をRNase AおよびProteinase Kで処理し、続いてChIP DNA Clean & Concentrator-Capped columnを用いてDNAを精製した。
(d) 得られたDNAを用いてリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRに用いたプライマーは、5'-CGCCTGCGTTCGGGAGATATAC-3'(配列番号7)、5'-CTGTCCTCTCACTCCGCCTTGT-3'(配列番号8)であり、ヒトIRF-1遺伝子座におけるgRNAの標的DNA配列近傍に設計した。また、無関係な領域である5'HS5ゲノム領域の定量のため、5'-CCAGTTTCTCCAGTTTCCCTTTT-3'(配列番号9)、5'-TTTTCAAAATGCAAGGTGATGTC-3'(配列番号10)のプライマーを用いた。
(e) リアルタイムPCRの結果を図7に示した。図7から明らかなように、IRF-1遺伝子座は、インプットに対して40%の濃縮が認められた。また、無関係な5'HS5ゲノム領域は、インプットに対して4%であり、IRF-1遺伝子座の1/10であった。この結果から、不活性型Cas9蛋白質とgRNAの複合体を用いたアフィニティー精製により、目的のゲノム領域を効率的に精製できることが明らかとなった。
〔実施例2:5'HS5領域と相互作用するMIR422A遺伝子領域の検出〕
(1)ゲノム間相互作用状態の保持および相互作用ゲノム間でのDNA末端の結合
 ヒト白血病細胞株K562のNaB処理、ゲノム間相互作用状態の保持、相互作用ゲノム間でのDNA末端の結合操作は、実施例1(1)(a)~(d)と同じ方法で行った。なお、陰性対照としてNaB未処理のK562を準備し、ゲノム間相互作用状態の保持および相互作用ゲノム間でのDNA末端の結合操作を同様に行った。
(2)PCR反応による相互作用ゲノム領域の増幅および精製
(a) 本発明者らは、K562細胞において、NaB処理によってヒト5'HS5領域とMIR422A遺伝子領域が相互作用することを見出している(未発表データ)。したがって、上記(1)のNaB処理サンプルでゲノム末端同士がライゲーションされたDNA複合体には、5'HS5領域およびMIR422A遺伝子領域のライゲーション産物が含まれることが予想される。そこで、ライゲーションされた5'HS5領域およびMIR422A遺伝子領域が増幅されるプライマーを設計し、PCR反応を行った。設計したプライマーは、5'-CCGGTAGGGATAACAGGGTAATTTGAGAAGGTAGGGTTGCATGAG-3'(配列番号1)(I-Sce-Iサイトを含む、5'にビオチン標識)、5'-GGCTATCCTAGCTTGGCTCAGAA-3'(配列番号11)である。なお配列番号1のプライマーは5'HS5領域と、配列番号11のプライマーはMIR422A遺伝子領域とアニーリングするように設計した。PCR反応液はKOD FX(東洋紡社製、KFX-101)を用いて調製した。すなわち、15μL中に、上記(1)で用意した精製DNAを2μL、1×Buffer、0.4mMのdNTPs、0.3μMの各プライマー、および0.3μLのKOD FXを含む反応液を調製した。反応は、最初に94℃2分間の変性を行った後、98℃10秒間の変性、60℃30秒間のプライマーアニーリング、68℃6分間の伸長反応を40サイクル行った。
(b) 次に、15μLのDynabeads M-280 Streptavidin(Thermo Fisher Scientific社製、11205D)を用いて、PCR増幅したDNA断片をアフィニティー精製した。洗浄後、精製DNAを49μLの1X CutSmart Buffer(New England BioLabs社製、B7204S)を含む反応液に懸濁し、1μLのI-SceI (New England BioLabs社製、R0694S)を加えた後、37℃で2時間反応させた。反応後、Dynabeads M-280 Streptavidinを含まない上清画分を回収し、65℃で20分間加熱することでI-SceIを失活させた。
(3)MIR422A遺伝子領域の検出
(a) MIR422A遺伝子座を検出するため、MIR422A遺伝子領域が増幅されるプライマーを設計し、PCR反応を行った。設計したプライマーは、5'-CTGGACAGCTCCCATGCTATTA-3'(配列番号12)、5'-TACTCTGGAGCTCTGGGTCTGAT-3'(配列番号13)である。PCR反応液はAmpliTaq Gold 360 PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific社製、4398876)を用いて調製した。すなわち、15μL中に、(2)(b)で回収したDNA断片(I-SceI失活済)を2μL、1×AmpliTaq Gold 360 PCR Master Mix、0.5μMの各プライマーを含む反応液を調製した。なお、PCRの陰性対照としてDNA断片に代えて精製水を2μL添加した反応液を調製した。反応は、最初に95℃10分間の反応を行った後、95℃30秒間の変性、60℃30秒間のプライマーアニーリング、72℃1分間の伸長反応を23サイクル行った。
(b) 結果を図8に示した。図8から明らかなように、NaB未処理サンプルおよびNaB処理のライゲーション反応なしの陰性対照サンプルでは増幅が見られなかった。一方、NaB処理とライゲーション反応を行ったサンプルでは、約0.1 kbpのバンドが検出された。以上の結果から、本発明の方法を用いることで、ゲノム間の相互作用を同定できることが示された。
〔実施例3:5'HS5領域と相互作用するYIF1A遺伝子領域の検出〕
(1)ゲノム間相互作用状態の保持および相互作用ゲノム間でのDNA末端の結合
 ヒト白血病細胞株K562のNaB処理、ゲノム間相互作用状態の保持、相互作用ゲノム間でのDNA末端の結合操作は、実施例1(1)(a)~(d)と同じ方法で行った。なお、陰性対象としてNaB未処理のK562を準備し、ゲノム間相互作用状態の保持および相互作用ゲノム間でのDNA末端の結合操作を同様に行った。
(2)PCR反応による相互作用ゲノム領域の増幅および精製
(a) 本発明者らは、K562細胞において、NaB処理によってヒト5'HS5領域とYIF1A遺伝子領域が相互作用することを見出している(未発表データ)。したがって、上記(1)のNaB処理サンプルでゲノム末端同士がライゲーションされたDNA複合体には、5'HS5領域およびYIF1A遺伝子領域のライゲーション産物が含まれることが予想される。そこで、ライゲーションされた5'HS5領域およびYIF1A遺伝子領域が増幅されるプライマーを設計し、PCR反応を行った。設計したプライマーは、5'-CCGGTAGGGATAACAGGGTAATTTGAGAAGGTAGGGTTGCATGAG-3'(配列番号1)(I-Sce-Iサイトを含む、5'にビオチン標識)、5'-TATCAGTGACAGAGCTGCCAAGC-3'(配列番号14)である。なお配列番号1のプライマーは5'HS5領域と、配列番号14のプライマーはYIF1A遺伝子領域とアニーリングするように設計した。PCR反応液はKOD FX(東洋紡社製、KFX-101)を用いて調製した。すなわち、15μL中に、上記(1)で用意した精製DNAを2μL、1×Buffer、0.4mMのdNTPs、0.3μMの各プライマー、および0.3μLのKOD FXを含む反応液を調製した。反応は、最初に94℃2分間の変性を行った後、98℃10秒間の変性、60℃30秒間のプライマーアニーリング、68℃6分間の伸長反応を40サイクル行った。
(b) 次に、15μLのDynabeads M-280 Streptavidin(Thermo Fisher Scientific社製、11205D)を用いて、PCR増幅したDNA断片をアフィニティー精製した。洗浄後、精製DNAを49μLの1X CutSmart Buffer(New England BioLabs社製、B7204S)を含む反応液に懸濁し、1μLのI-SceI (New England BioLabs社製、R0694S)を加えた後、37℃で2時間反応させた。反応後、Dynabeads M-280 Streptavidinを含まない上清画分を回収し、65℃で20分間加熱することでI-SceIを失活させた。
(3)YIF1A遺伝子領域の検出
(a) YIF1A遺伝子座を検出するため、YIF1A遺伝子領域が増幅されるプライマーを設計し、PCR反応を行った。設計したプライマーは、5'-AGACCCCAAATCTTCCCATACG-3'(配列番号15)、5'-AAGCCCCAGGATGCTGACTC-3'(配列番号16)である。PCR反応液はAmpliTaq Gold 360 PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific社製、4398876)を用いて調製した。すなわち、15μL中に、(2)(b)で回収したDNA断片(I-SceI失活済)を2μL、1×AmpliTaq Gold 360 PCR Master Mix、0.5μMの各プライマーを含む反応液を調製した。なお、PCRの陰性対照としてDNA断片に代えて精製水を2μL添加した反応液を調製した。反応は、最初に95℃10分間の反応を行った後、95℃30秒間の変性、60℃30秒間のプライマーアニーリング、72℃1分間の伸長反応を27サイクル行った。
(b) 結果を図9に示した。図9から明らかなように、NaB未処理サンプルおよびNaB処理のライゲーション反応なしの陰性対照サンプルでは増幅が見られなかった。一方、NaB処理とライゲーション反応を行ったサンプルでは、約0.1 kbpのバンドが検出された。以上の結果から、本発明の方法を用いることで、ゲノム間の相互作用を同定できることが示された。
 なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (15)

  1.  以下の工程(1)~(4)を含むことを特徴とするDNA間相互作用の解析方法:
    (1)解析対象DNAと他のDNAとが相互作用している状態のDNAを含み、超音波処理またはDNA配列特異性を持たないエンドヌクレアーゼによる部分分解処理により断片化DNAを調製する工程、
    (2)断片化DNAのライゲーションを行う工程、
    (3)ライゲーション後のDNAから、解析対象DNAおよび当該DNAと相互作用しているDNAを含む複合体を増幅および/または精製する工程、ならびに
    (4)増幅および/または精製された複合体中の前記相互作用しているDNAを解析する工程。
  2.  前記工程(1)において、DNAを断片化する前に、解析対象DNAおよび当該DNAと相互作用しているDNAの相互作用状態を保持する処理を行うことを特徴とする請求項1に記載の解析方法。
  3.  前記工程(2)において、ライゲーションを行う前に、断片化DNAの末端を修復することを特徴とする請求項1に記載の解析方法。
  4.  前記工程(3)において、前記複合体を増幅および/または精製する前に、ライゲーション後のDNAに保持されている相互作用状態を解除する処理を行うことを特徴とする請求項1に記載の解析方法。
  5.  前記工程(3)において、解析対象DNAおよび相互作用が予想されるDNAにそれぞれプライマーを設計し、当該2箇所で挟まれる領域を増幅するPCRを行うことを特徴とする請求項1~4のいずれかに記載の解析方法。
  6.  前記工程(3)において、解析対象DNAの2箇所に、当該2箇所で挟まれる領域を増幅せずかつ逆向きのプライマーをそれぞれ設計し、PCRを行うことを特徴とする請求項1~4のいずれかに記載の解析方法。
  7.  前記工程(3)において、アフィニティー精製用修飾したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物をアフィニティー精製することを特徴とする請求項5または6に記載の解析方法。
  8.  前記工程(3)において、ビオチン化プライマーを用いてPCRを行うことを特徴とする請求項7に記載の解析方法。
  9.  前記工程(3)において、PCR産物以外のDNAを除去することを特徴とする請求項5~8のいずれかに記載の解析方法。
  10.  前記工程(3)において、解析対象DNAの特定のDNA配列に結合する外来性分子または外来性分子複合体を用いて精製することを特徴とする請求項1~9のいずれかに記載の解析方法。
  11.  前記外来性分子または外来性分子複合体が、ジンクフィンガー蛋白質、TALエフェクター蛋白質、外来性核酸、または不活性型Cas9蛋白質とガイドRNA(gRNA)の複合体であることを特徴とする請求項10に記載の解析方法。
  12.  前記工程(4)において、工程(3)で増幅および/または精製した複合体を鋳型とし、解析対象DNAとの相互作用が予想されるDNAを増幅するためのプライマーセットを用いてPCRを行うことを特徴とする請求項1~11のいずれかに記載の解析方法。
  13.  前記工程(4)において、工程(3)で増幅および/または精製した複合体をマイクロアレイ解析することを特徴とする請求項1~11のいずれかに記載の解析方法。
  14.  前記工程(4)において、工程(3)で増幅および/または精製した複合体の塩基配列を解析することを特徴とする請求項1~11のいずれかに記載の解析方法。
  15.  前記DNAがゲノムDNAであることを特徴とする請求項1~14のいずれかに記載の解析方法。
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