JPWO2014125668A1 - 内在性ｄｎａ配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法 - Google Patents
内在性ｄｎａ配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2014125668A1 JPWO2014125668A1 JP2015500088A JP2015500088A JPWO2014125668A1 JP WO2014125668 A1 JPWO2014125668 A1 JP WO2014125668A1 JP 2015500088 A JP2015500088 A JP 2015500088A JP 2015500088 A JP2015500088 A JP 2015500088A JP WO2014125668 A1 JPWO2014125668 A1 JP WO2014125668A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- molecule
- dna
- foreign
- genomic dna
- specific
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 130
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 title description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 143
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 57
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 64
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 21
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 claims description 18
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 17
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 16
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 16
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 16
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 16
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 11
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 claims description 6
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 claims description 6
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 26
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 95
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 56
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 17
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 17
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 17
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 16
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 15
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 10
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 10
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 9
- 238000002487 chromatin immunoprecipitation Methods 0.000 description 9
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 9
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 7
- 102100032049 E3 ubiquitin-protein ligase LRSAM1 Human genes 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100257362 Homo sapiens SOX2 gene Proteins 0.000 description 6
- 108090000890 Interferon regulatory factor 1 Proteins 0.000 description 6
- 102000004289 Interferon regulatory factor 1 Human genes 0.000 description 6
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 101000598002 Homo sapiens Interferon regulatory factor 1 Proteins 0.000 description 5
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 4
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 4
- 108010020195 FLAG peptide Proteins 0.000 description 4
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 3
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108010057210 telomerase RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 2
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 102000010823 Telomere-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010038599 Telomere-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- JYCQQPHGFMYQCF-UHFFFAOYSA-N 4-tert-Octylphenol monoethoxylate Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCO)C=C1 JYCQQPHGFMYQCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101100510266 Homo sapiens KLF4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical class CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108090000944 RNA Helicases Proteins 0.000 description 1
- 102000004409 RNA Helicases Human genes 0.000 description 1
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150037203 Sox2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000033785 histone binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091009732 histone binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 230000032965 negative regulation of cell volume Effects 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000003032 phytopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
（Ａ）相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程、および（Ｂ）ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、ゲノムDNAとを接触させる工程を含む方法により、解析対象細胞の標的ゲノム領域近傍領域へ外来性DNA結合分子の認識配列を挿入する操作を必要とせず、解析対象細胞の標的ゲノム領域内または近傍の内在性DNA配列を利用して、相互作用している分子との相互作用状を保持したまま、任意のゲノム領域を特異的に単離することができる。
Description
本発明は、内在性DNA配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法に関するものであり、特に、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま、特定ゲノム領域を、内在性DNA配列特異的結合分子を用いて単離する方法に関するものである。
クロマチン領域の生化学的および分子生物学的解析は、ゲノム機能発現の分子機構を理解するために非常に重要である。しかし、未だクロマチン領域の生化学的な性質は十分に解析されていない。これは、クロマチン領域の生化学的および分子生物学的解析に利用可能な試料の採取方法が制限されていることに原因があると考えられる。
クロマチン領域の生化学的および分子生物学的解析を行うためには、ゲノムDNAおよびゲノムDNAと相互作用している分子の相互作用状態を保持した試料を解析に供することが必要である。相互作用分子との相互作用状態を保持した特定ゲノム領域を単離する方法として、以下の方法が知られている。
(i) クロマチン免疫沈降法
クロマチン免疫沈降（chromatin immunoprecipitation）法（以下、「ChIP法」という。）は、既知のDNA結合蛋白質に対する抗体を用いて特定ゲノム領域を免疫沈降させ、当該領域を単離する方法である（非特許文献１、２参照）。したがって、ChIP法は、DNA結合蛋白質に関する情報がなければ使用することができないという制限がある。また、一般に、DNA結合蛋白質はゲノムDNAの複数の領域に結合するため、免疫沈降物中にはいろいろなゲノム領域が混在しており、ChIP法によって特定ゲノム領域のみを単離することは難しいという問題を有している。さらに、ChIP法では、既知のDNA結合蛋白質が結合しないゲノム領域を単離できないという問題がある。
クロマチン免疫沈降（chromatin immunoprecipitation）法（以下、「ChIP法」という。）は、既知のDNA結合蛋白質に対する抗体を用いて特定ゲノム領域を免疫沈降させ、当該領域を単離する方法である（非特許文献１、２参照）。したがって、ChIP法は、DNA結合蛋白質に関する情報がなければ使用することができないという制限がある。また、一般に、DNA結合蛋白質はゲノムDNAの複数の領域に結合するため、免疫沈降物中にはいろいろなゲノム領域が混在しており、ChIP法によって特定ゲノム領域のみを単離することは難しいという問題を有している。さらに、ChIP法では、既知のDNA結合蛋白質が結合しないゲノム領域を単離できないという問題がある。
(ii) Chromosome Conformation Capture法（以下「3C法」という。）
3C法またはその派生法では、特定のゲノム領域と相互作用しているゲノム領域を同定することができる（非特許文献３〜５参照）。しかし、3C法では、制限酵素やDNAリガーゼによる酵素反応を、クロスリンク（架橋）下という非最適条件下で行わなくてはならないため、非生理的な相互作用を検出する可能性が高いという問題がある。また、クロスリンク下では制限酵素処理が不完全になるため、標的ゲノム領域に隣接する領域がPCRで増幅されバックグラウンドが極めて高くなり、未知の相互作用の検出が難しいという問題がある。
3C法またはその派生法では、特定のゲノム領域と相互作用しているゲノム領域を同定することができる（非特許文献３〜５参照）。しかし、3C法では、制限酵素やDNAリガーゼによる酵素反応を、クロスリンク（架橋）下という非最適条件下で行わなくてはならないため、非生理的な相互作用を検出する可能性が高いという問題がある。また、クロスリンク下では制限酵素処理が不完全になるため、標的ゲノム領域に隣接する領域がPCRで増幅されバックグラウンドが極めて高くなり、未知の相互作用の検出が難しいという問題がある。
(iii) Fluorescence in situ Hybridization法（以下、「FISH法」という。）
FISH法単独、もしくは蛍光抗体法と組み合わせることにより、特定ゲノム領域と別のゲノム領域やRNA、蛋白質との相互作用が検出可能である。しかし、この方法は解像度が低く、また、未知の分子との相互作用は検出できない。
FISH法単独、もしくは蛍光抗体法と組み合わせることにより、特定ゲノム領域と別のゲノム領域やRNA、蛋白質との相互作用が検出可能である。しかし、この方法は解像度が低く、また、未知の分子との相互作用は検出できない。
(iv) Proteomics of Isolated Chromatin segments法（以下「PICh法」という。）
PICh法は、特異的な核酸プローブを用いて、特定ゲノム領域を単離する方法であり、プローブに相補的な多数の繰り返し配列からなるテロメア領域を単離できることが示されている（非特許文献６参照）。しかしながら、PICh法ではクロスリンク下での核酸プローブと標的ゲノム領域のアニーリングが必要であり、低コピー数や１コピーの特定ゲノム領域の単離が可能か否かは示されていない。
PICh法は、特異的な核酸プローブを用いて、特定ゲノム領域を単離する方法であり、プローブに相補的な多数の繰り返し配列からなるテロメア領域を単離できることが示されている（非特許文献６参照）。しかしながら、PICh法ではクロスリンク下での核酸プローブと標的ゲノム領域のアニーリングが必要であり、低コピー数や１コピーの特定ゲノム領域の単離が可能か否かは示されていない。
(v) 非特許文献７に記載の方法
非特許文献７には、アフィニティー精製により特定ゲノム領域を単離しようとする試みが記載されている。しかし、用いられている細胞は、酵母であり、高等真核細胞への応用は行われていない。また、Cre-loxP系を利用して、特定ゲノム領域を切り出しているが、この操作により、クロマチン構造が変化してしまう可能性がある。加えて、ホルムアルデヒドによるクロスリンク処理を行えないため、精製の過程で結合している蛋白質やDNA等の分子が解離する可能性もある。
非特許文献７には、アフィニティー精製により特定ゲノム領域を単離しようとする試みが記載されている。しかし、用いられている細胞は、酵母であり、高等真核細胞への応用は行われていない。また、Cre-loxP系を利用して、特定ゲノム領域を切り出しているが、この操作により、クロマチン構造が変化してしまう可能性がある。加えて、ホルムアルデヒドによるクロスリンク処理を行えないため、精製の過程で結合している蛋白質やDNA等の分子が解離する可能性もある。
(vi)iChIP法
本発明者らにより開発された方法である（特許文献１、非特許文献８、９参照）。生理的なクロマチン構造を保持したまま特定ゲノム領域を単離するために、以下の操作を行う。(1)解析対象細胞の標的ゲノム領域近傍領域へ外来性DNA結合分子の認識配列を挿入する。(2)外来性DNA結合分子のDNA結合ドメインと、既存の抗体もしくは他の蛋白質等で認識されるタグとの融合分子を、解析対象細胞に発現させる。(3)上記細胞を必要に応じてホルムアルデヒド等でクロスリンクする。この操作により、標的ゲノム領域と相互作用する蛋白質、RNA、DNAおよび他の分子がクロスリンクされる。また、この操作により、タグ付き外来性DNA結合分子と挿入された認識配列もクロスリンクされる。(4)次いで、細胞を破砕し、クロスリンクされたDNAを制限酵素等のDNA切断酵素処理または超音波処理により断片化する。(5)タグ付き外来性DNA結合分子を含んだ複合体を、タグを認識する抗体または蛋白質等を固定した担体を用いて沈降させる。(6)沈降された複合体中の標的ゲノム領域と相互作用している分子を解析する。
iChIP法の問題点としては、解析対象細胞の標的ゲノム領域の近傍へ外来性DNA結合分子の認識配列を挿入する操作に手間がかかること、および認識配列の挿入が相互作用に影響を及ぼす可能性を排除できないことが挙げられる。
本発明者らにより開発された方法である（特許文献１、非特許文献８、９参照）。生理的なクロマチン構造を保持したまま特定ゲノム領域を単離するために、以下の操作を行う。(1)解析対象細胞の標的ゲノム領域近傍領域へ外来性DNA結合分子の認識配列を挿入する。(2)外来性DNA結合分子のDNA結合ドメインと、既存の抗体もしくは他の蛋白質等で認識されるタグとの融合分子を、解析対象細胞に発現させる。(3)上記細胞を必要に応じてホルムアルデヒド等でクロスリンクする。この操作により、標的ゲノム領域と相互作用する蛋白質、RNA、DNAおよび他の分子がクロスリンクされる。また、この操作により、タグ付き外来性DNA結合分子と挿入された認識配列もクロスリンクされる。(4)次いで、細胞を破砕し、クロスリンクされたDNAを制限酵素等のDNA切断酵素処理または超音波処理により断片化する。(5)タグ付き外来性DNA結合分子を含んだ複合体を、タグを認識する抗体または蛋白質等を固定した担体を用いて沈降させる。(6)沈降された複合体中の標的ゲノム領域と相互作用している分子を解析する。
iChIP法の問題点としては、解析対象細胞の標的ゲノム領域の近傍へ外来性DNA結合分子の認識配列を挿入する操作に手間がかかること、および認識配列の挿入が相互作用に影響を及ぼす可能性を排除できないことが挙げられる。
Solomon, M.J., Larsen, P.L., Varshavsky, A., Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell (1988) 53, 937-947
Solomon, M.J., Varshavsky, A., Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 6470-6474
Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., and Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science (2002) 295, 1306-1311
Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., and de Laat, W. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nat. Genet. (2006) 38, 1348-1354
Simonis, M., Kooren, J., and de Laat, W. An evaluation of 3C-based methods to capture DNA interactions. Nat. Methods (2007) 4, 895-901
Dejardin, J., and Kingston, R.E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell (2009) 136, 175-186
Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J.S., and Kornberg, R.D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. (2003) 23, 9275-9282
Hoshino, A., and Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. (2009) 108, 446-449
Fujita, H., and Fujii, H. Direct identification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One (2011) 6, e26109
本発明は、解析対象細胞の標的ゲノム領域の近傍へ外来性DNA結合分子の認識配列を挿入する操作を必要とせず、解析対象細胞の標的ゲノム領域内または近傍の内在性DNA配列を利用して、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま、任意のゲノム領域を特異的に単離することができる方法を提供することを課題とする。
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離する方法であって、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする特定ゲノム領域の単離方法。
（Ａ）相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
（Ｂ）ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、ゲノムDNAとを接触させる工程
［２］さらに、（Ｃ）ゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程を含むことを特徴とする前記［１］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［３］前記外来性分子が、外来性DNA結合蛋白質、外来性核酸または外来性蛋白質−核酸複合体であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［４］前記外来性分子が、ジンクフィンガー蛋白質、TALエフェクター蛋白質または不活性型Cas9蛋白質とガイドRNA（gRNA）の複合体であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［５］以下の工程１〜３を含むことを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
工程１：前記外来性分子と、細胞内のゲノムDNAとを接触させる工程
工程２：相互作用している分子との相互作用状態を保持している前記細胞内のゲノムDNAを断片化する工程
工程３：前記外来性分子と特異的に結合する分子を、外来性分子が結合しているゲノムDNA断片に結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程
［６］前記外来性分子が、１種以上のタグ配列を含む融合分子であることを特徴とする前記［５］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［７］前記外来性分子が、核移行シグナルを含む融合分子であることを特徴とする前記［５］または［６］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［８］工程１において、解析対象細胞に、前記外来性分子をコードする遺伝子を導入し、当該細胞内で発現させることを特徴とする前記［５］〜［７］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［９］以下の工程Ｉ〜ＩＩＩを含むことを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
工程Ｉ：相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
工程ＩＩ：前記外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させる工程
工程ＩＩＩ：前記外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収する工程
［１０］工程ＩＩにおいて、担体に固定化された前記外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させることを特徴とする前記［９］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［１１］工程ＩＩにおいて、前記外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させた後に、前記外来性分子を担体に固定化することを特徴とする前記［９］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［１］相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離する方法であって、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする特定ゲノム領域の単離方法。
（Ａ）相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
（Ｂ）ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、ゲノムDNAとを接触させる工程
［２］さらに、（Ｃ）ゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程を含むことを特徴とする前記［１］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［３］前記外来性分子が、外来性DNA結合蛋白質、外来性核酸または外来性蛋白質−核酸複合体であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［４］前記外来性分子が、ジンクフィンガー蛋白質、TALエフェクター蛋白質または不活性型Cas9蛋白質とガイドRNA（gRNA）の複合体であることを特徴とする前記［１］または［２］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［５］以下の工程１〜３を含むことを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
工程１：前記外来性分子と、細胞内のゲノムDNAとを接触させる工程
工程２：相互作用している分子との相互作用状態を保持している前記細胞内のゲノムDNAを断片化する工程
工程３：前記外来性分子と特異的に結合する分子を、外来性分子が結合しているゲノムDNA断片に結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程
［６］前記外来性分子が、１種以上のタグ配列を含む融合分子であることを特徴とする前記［５］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［７］前記外来性分子が、核移行シグナルを含む融合分子であることを特徴とする前記［５］または［６］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［８］工程１において、解析対象細胞に、前記外来性分子をコードする遺伝子を導入し、当該細胞内で発現させることを特徴とする前記［５］〜［７］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［９］以下の工程Ｉ〜ＩＩＩを含むことを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
工程Ｉ：相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
工程ＩＩ：前記外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させる工程
工程ＩＩＩ：前記外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収する工程
［１０］工程ＩＩにおいて、担体に固定化された前記外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させることを特徴とする前記［９］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
［１１］工程ＩＩにおいて、前記外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させた後に、前記外来性分子を担体に固定化することを特徴とする前記［９］に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
本発明によれば、解析対象細胞の標的ゲノム領域内または近傍の内在性DNA配列を利用して、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま、任意のゲノム領域を特異的に単離することができる。本発明の特定ゲノム領域の単離方法は、解析対象細胞の標的ゲノム領域内または近傍の内在性DNA配列を利用するものであり、外来性DNA結合分子の認識配列を挿入しないので、挿入配列による相互作用への影響を排除することができる。したがって、単離されたゲノム領域は、ゲノム機能発現の分子機構解析のための試料として非常に有用である。
〔特定ゲノム領域の単離方法〕
本発明の特定ゲノム領域の単離方法（以下、「本発明の方法」という。）は、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むものであればよい。
（Ａ）相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
（Ｂ）ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、ゲノムDNAとを接触させる工程
工程（Ａ）および（Ｂ）の順序は限定されず、先に工程（Ａ）、後に工程（Ｂ）を行ってもよく、先に工程（Ｂ）、後に工程（Ａ）を行ってもよい。
本発明の方法は、さらに以下の工程（Ｃ）を含むことが好ましい。
（Ｃ）ゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程
工程（Ｃ）は、工程（Ａ）より先に行うことが好ましい。
本発明の特定ゲノム領域の単離方法（以下、「本発明の方法」という。）は、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むものであればよい。
（Ａ）相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
（Ｂ）ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、ゲノムDNAとを接触させる工程
工程（Ａ）および（Ｂ）の順序は限定されず、先に工程（Ａ）、後に工程（Ｂ）を行ってもよく、先に工程（Ｂ）、後に工程（Ａ）を行ってもよい。
本発明の方法は、さらに以下の工程（Ｃ）を含むことが好ましい。
（Ｃ）ゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程
工程（Ｃ）は、工程（Ａ）より先に行うことが好ましい。
外来性分子は、ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する性質を持つ外来性の分子であれば特に限定されない。例えば、外来性DNA結合蛋白質、外来性核酸、外来性蛋白質−核酸複合体などを好適に用いることができる。外来性DNA結合蛋白質としては、蛋白質のアミノ酸配列を標的DNAの塩基配列に関連付けて設計することが可能な蛋白質が好ましい。このような外来性DNA結合蛋白質としては、例えば、ジンクフィンガー蛋白質、TALエフェクター蛋白質などが挙げられる。外来性核酸としては、DNAアプタマー、RNAアプタマーなどが挙げられる。外来性蛋白質−核酸複合体としては、不活性型Cas9蛋白質とgRNAの複合体などが挙げられる。
ジンクフィンガー蛋白質は、任意のDNAの塩基配列を認識するように改変可能であることが知られている（例えば、Beerli et al., (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al., (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al., (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al., (2001) Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637;Choo et al.,(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416を参照）。改変されたジンクフィンガー蛋白質は、天然のジンクフィンガー蛋白質が持たない新規な結合特異性を持つことができる。改変する方法は特に限定されないが、例えば既知の特異性を持つ個々のジンクフィンガーモジュールをつなぎ合わせる方法が挙げられる。
ファージディスプレイやツーハイブリッドシステム等を用いる特異性の選択方法は、米国特許第5,789,538号；米国特許第5,925,523号；米国特許第6,007,988号；米国特許第6,013,453号；米国特許第6,410,248号；米国特許第6,140,466号；米国特許第6,200,759号；米国特許第6,242,568号；国際公開WO98/37186；国際公開WO98/53057；国際公開WO00/27878；国際公開WO01/88197、英国特許第2,338,237号等に開示されている。
ファージディスプレイやツーハイブリッドシステム等を用いる特異性の選択方法は、米国特許第5,789,538号；米国特許第5,925,523号；米国特許第6,007,988号；米国特許第6,013,453号；米国特許第6,410,248号；米国特許第6,140,466号；米国特許第6,200,759号；米国特許第6,242,568号；国際公開WO98/37186；国際公開WO98/53057；国際公開WO00/27878；国際公開WO01/88197、英国特許第2,338,237号等に開示されている。
TALエフェクター蛋白質は、植物病原細菌ザントモナス属から単離された蛋白質である。TALエフェクター蛋白質のDNA結合ドメインは、１つのユニットが約３４アミノ酸からなる、ほぼ完全なタンデムリピート構造を有する。ユニットの１２および１３番目のアミノ酸は高頻度に変化しておりRVD（repeat variable diresidue）と呼ばれる。RVDの違いがDNA塩基認識特異性を決定する。特定の塩基配列を認識するTALエフェクター蛋白質を作製するためには、対応するRVDを含んだユニットをつなぎ合わせればよい（Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501、Boch et al., (2009) Science 326:1509-1512、Miller et al., (2011) Nat. Biotechnol., 29:143-148を参照）。
外来性核酸は、例えば、ランダム核酸配列ライブラリーから標的のゲノムDNA配列に結合する分子種をアフィニティー精製し、PCR法等を用いて濃縮・選別することにより取得することができる。また、こうして選別した核酸に適当な変異を導入して、標的ゲノムDNA配列との親和性を更に向上させることも可能である。
外来性蛋白質−核酸複合体としては、不活性型Cas9蛋白質とgRNAの複合体が好ましい。Cas9蛋白質は細菌および古細菌由来の酵素で、RNAガイド下にそのRNAに特異的な配列を切断する（CRISPR系）。不活性型Cas9は、DNA切断活性を欠くCas9変異体であり、RNAガイド下にそれと相補的なDNA配列に結合する性質を有している（Jinek et al., (2012) Science, 337:816-821）。したがって、標的DNA配列と相補的な配列を含むRNAと不活性型Cas9の複合体は、本発明の方法に用いる外来分子として好適である。
外来性分子が結合するゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列は、単離しようとするゲノム領域内またはその近傍に存在するDNA配列を選択すればよい。選択するDNA配列は、単離しようとするゲノム領域内またはその近傍のみに存在し、それ以外のゲノムDNA上に存在しないことが好ましいが、それ以外のゲノムDNA上に稀に存在するものを選択してもよい。
工程（Ｂ）における外来性分子とゲノムDNAとを接触させる方法は特に限定されない。細胞の核内で接触させてもよく、相互作用している分子との相互作用状態を保持した状態のゲノムDNAを細胞から抽出した後に接触させてもよい。また、単離しようとするゲノム領域内またはその近傍に存在する内在性DNA配列を複数選択し、それぞれのDNA配列に結合する複数の外来性分子を接触させてもよい。複数の外来性分子を接触させて、順次精製を行うことにより、単離しようとするゲノム領域の特異性を増加させることができる。
工程（Ａ）におけるゲノムDNAの断片化は、目的のゲノム領域を含み得る適当なサイズのゲノムDNA断片を生成させるために行われる。ゲノムDNAを断片化する処理の方法としては、例えば、制限酵素でゲノムDNAを消化する方法、DNA分解酵素（エンドヌクレアーゼ）でゲノムDNAを部分分解（部分切断）する方法、超音波処理により物理的に切断する方法などが挙げられる。
制限酵素を用いる場合、単離しようとするゲノム領域の内部を切断せず、目的のゲノム領域以外の部分をできるだけ含まない位置で切断可能な制限酵素を選択することが好ましい。
DNA分解酵素（エンドヌクレアーゼ）を用いる場合は、単離しようとするゲノム領域のサイズより少し大きい断片を生成する反応条件を予め決定しておくことが好ましい。
超音波処理を行う場合は、単離しようとするゲノム領域のサイズより少し大きい断片に切断される処理条件を予め決定しておくことが好ましい。
制限酵素を用いる場合、単離しようとするゲノム領域の内部を切断せず、目的のゲノム領域以外の部分をできるだけ含まない位置で切断可能な制限酵素を選択することが好ましい。
DNA分解酵素（エンドヌクレアーゼ）を用いる場合は、単離しようとするゲノム領域のサイズより少し大きい断片を生成する反応条件を予め決定しておくことが好ましい。
超音波処理を行う場合は、単離しようとするゲノム領域のサイズより少し大きい断片に切断される処理条件を予め決定しておくことが好ましい。
ゲノムDNAの断片化は、当該ゲノムDNAが相互作用している分子との相互作用状態を保持している状態で行うことが好ましい。そのため、ゲノムDNAの断片化を行う前に、必要に応じてゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理（工程（Ｃ））を行うことが好ましい。相互作用状態を保持する処理は、特に限定されないが、後に相互作用している分子を分離、精製して解析に供することができるように、相互作用状態の保持を必要に応じて解除できることが好ましい。好ましい処理としては、例えば架橋処理が挙げられる。架橋処理に用いる好ましい架橋処理剤としては、例えばホルムアルデヒドが挙げられる。
〔第１の実施形態〕
本発明の方法は、以下の工程１〜３を含むものであればよい。本発明の方法により、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離することが可能となる。相互作用状態を保持した特定ゲノム領域が単離できる限り、工程１〜３以外の工程を含んでもよく、その内容は限定されない。なお、第１の実施形態の解析対象細胞は、生細胞であることが好ましい。
工程１：ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、細胞内のゲノムDNAとを接触させる工程
工程２：相互作用している分子との相互作用状態を保持している前記細胞内のゲノムDNAを断片化する工程
工程３：前記外来性分子と特異的に結合する分子を、外来性分子が結合しているゲノムDNA断片に結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程
本発明の方法は、以下の工程１〜３を含むものであればよい。本発明の方法により、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離することが可能となる。相互作用状態を保持した特定ゲノム領域が単離できる限り、工程１〜３以外の工程を含んでもよく、その内容は限定されない。なお、第１の実施形態の解析対象細胞は、生細胞であることが好ましい。
工程１：ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、細胞内のゲノムDNAとを接触させる工程
工程２：相互作用している分子との相互作用状態を保持している前記細胞内のゲノムDNAを断片化する工程
工程３：前記外来性分子と特異的に結合する分子を、外来性分子が結合しているゲノムDNA断片に結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程
以下、各工程順に本発明の方法を詳細に説明する。
（１）工程１
工程１は、ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、細胞内のゲノムDNAとを接触させる工程である。
本発明の方法を第１の実施形態で行う場合、外来性分子は１種以上のタグ配列を含む融合分子であることが好ましい。外来性分子がタグ配列を含むことにより、当該外来性分子と特異的に結合する分子を容易に入手することができる。タグ配列は特に限定されず、公知のタグ配列から適宜選択して使用することができる。具体的には、例えば、ヒスチジンタグ、FLAGタグ、Strepタグ、カルモジュリン結合ペプチド、GSTタグ、MBPタグ、Haloタグ、HAタグなどが挙げられる。
（１）工程１
工程１は、ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、細胞内のゲノムDNAとを接触させる工程である。
本発明の方法を第１の実施形態で行う場合、外来性分子は１種以上のタグ配列を含む融合分子であることが好ましい。外来性分子がタグ配列を含むことにより、当該外来性分子と特異的に結合する分子を容易に入手することができる。タグ配列は特に限定されず、公知のタグ配列から適宜選択して使用することができる。具体的には、例えば、ヒスチジンタグ、FLAGタグ、Strepタグ、カルモジュリン結合ペプチド、GSTタグ、MBPタグ、Haloタグ、HAタグなどが挙げられる。
外来性分子とタグ配列との融合分子は、２種類以上のタグ配列を含んでいてもよい。２種以上のタグ配列は直接連結されていてもよく、プロテアーゼ認識配列やスペーサー配列を介して連結されている構成としてもよい。このような構成とすることにより、当該融合分子が結合したゲノム領域を２段階以上で精製することが可能となるため、非特異的結合に基づくバックグラウンドを大幅に低減することができ、特定ゲノム領域の特異的な単離効率が大幅に向上する。
タグ配列を連結するプロテアーゼ認識配列は、タグ配列の切断に通常用いられるプロテアーゼが認識する配列を適宜選択して用いることができる。タグ配列の切断に用いられるプロテアーゼとしては、例えば、タバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼ、ヒトライノウイルス（HRV）プロテアーゼ、エンテロキナーゼ（EK）、トロンビン（Tb）、第Xa因子（Xa）などが知られている。
解析対象細胞として真核細胞を用いる場合には、核移行シグナルを含む融合分子とすることが好ましい。当該融合分子が核移行シグナルを有することにより、核内に移行してゲノムDNAと接触することが可能となる。核移行シグナルは公知の核移行シグナルから適宜選択すればよい。具体的には、例えば、SV40T抗原の核移行シグナル、c-Mycの核移行シグナル、p53の核移行シグナル、NF-κBp50の核移行シグナルなどが挙げられる。また、細胞内に取り込まれる性質を持つアミノ酸配列（蛋白質トランスダクションドメイン）を含む融合分子としてもよい。
外来性分子が蛋白質である場合、例えば、公知の遺伝子組換え技術により組換え蛋白質として当該外来性分子を製造することができる。すなわち、外来性蛋白質をコードするDNAを公知の発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを適切な宿主細胞に導入して発現させ、公知の方法で精製すればよい。外来性蛋白質が融合蛋白質の場合は、融合させる各蛋白質をコードするDNAを適宜連結して融合DNAを作製し、これを発現ベクターに挿入すればよい。
外来性分子が核酸である場合、例えば、公知の化学合成法、PCR法、in vitro transcription法、reverse transcription法、細胞に組み込んだ遺伝子からの転写等により当該核酸を製造することができる。外来性核酸を融合分子とする場合は、公知の化学合成法を用いることができる。
外来性分子を細胞内のゲノムDNAと接触させる方法は特に限定されず、例えば、上述のように公知の遺伝子組換え技術等を用いて得られた外来性蛋白質や外来性核酸を、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション等により、解析対象の細胞に導入する方法が挙げられる。また、外来性分子として、上記の細胞内に取り込まれる性質を持つアミノ酸配列（蛋白質トランスダクションドメイン）を含む融合分子を用いて、解析対象の細胞に直接導入することも可能である。また、外来性分子とは別に、外来性分子と結合する性質を持つアミノ酸配列を融合させた蛋白質トランスダクションドメインを作製し、これを外来性分子と混合して解析対象の細胞に導入することも可能である。
また、外来性分子を細胞内で発現させてもよい。この場合は、解析対象細胞を宿主細胞とし、当該細胞で外来性分子を発現可能な発現ベクターを作製して導入すればよい。宿主が原核細胞の場合、発現した外来性分子は細胞質中でゲノムDNAと接触することができる。宿主が真核細胞の場合は、核移行シグナルを含む融合分子を発現させることにより、発現した外来性分子が細胞質から核に移行し、ゲノムDNAと接触することができる。また、外来性分子をコードする遺伝子が発現可能に導入されたトランスジェニック生物を用いることにより、外来性分子を細胞内のゲノムDNAと接触させることもできる。
ゲノムDNAと接触した外来性分子は、標的の内在性DNA配列に結合することができる。
ゲノムDNAと接触した外来性分子は、標的の内在性DNA配列に結合することができる。
（２）工程２
工程２は、相互作用している分子との相互作用状態を保持している前記細胞内のゲノムDNAを断片化する工程である。工程２を行う前にゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行うことが好ましいが、相互作用状態を保持する処理を行うことなく、工程２を行ってもよい。
ゲノムDNAには、転写因子等のDNA結合蛋白質、DNA、RNAなどの核酸、その他の分子などが細胞周期や外からの刺激等に応じて相互作用しているので、解析目的に合わせたタイミングで、相互作用状態を保持する処理またはゲノムDNAの断片化処理を行うことが好ましい。また、これらの処理を行う前に、必要に応じて細胞に刺激を与えてもよい。なお、断片化処理を効率よく行うために、断片化処理の前に、公知の方法を用いて細胞を溶解または破砕またはクロマチン分画を抽出しておくことが好ましい。
工程２により、外来性分子が結合しているDNA断片と、外来性分子が結合していないDNA断片が生成する。
工程２は、相互作用している分子との相互作用状態を保持している前記細胞内のゲノムDNAを断片化する工程である。工程２を行う前にゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行うことが好ましいが、相互作用状態を保持する処理を行うことなく、工程２を行ってもよい。
ゲノムDNAには、転写因子等のDNA結合蛋白質、DNA、RNAなどの核酸、その他の分子などが細胞周期や外からの刺激等に応じて相互作用しているので、解析目的に合わせたタイミングで、相互作用状態を保持する処理またはゲノムDNAの断片化処理を行うことが好ましい。また、これらの処理を行う前に、必要に応じて細胞に刺激を与えてもよい。なお、断片化処理を効率よく行うために、断片化処理の前に、公知の方法を用いて細胞を溶解または破砕またはクロマチン分画を抽出しておくことが好ましい。
工程２により、外来性分子が結合しているDNA断片と、外来性分子が結合していないDNA断片が生成する。
（３）工程３
工程３は、前記外来性分子と特異的に結合する分子を、外来性分子が結合しているDNA断片に結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程である。外来性分子は、単離しようとするゲノム領域内またはその近傍に存在する特定の内在性DNA配列部分でゲノムDNAと結合しているので、外来性分子が結合しているDNA断片には目的の特定ゲノム領域が含まれていると考えられる。したがって、外来性分子と特異的に結合する分子が結合して生成した複合体を回収することにより、目的の特定ゲノム領域を単離することができる。
工程３は、前記外来性分子と特異的に結合する分子を、外来性分子が結合しているDNA断片に結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程である。外来性分子は、単離しようとするゲノム領域内またはその近傍に存在する特定の内在性DNA配列部分でゲノムDNAと結合しているので、外来性分子が結合しているDNA断片には目的の特定ゲノム領域が含まれていると考えられる。したがって、外来性分子と特異的に結合する分子が結合して生成した複合体を回収することにより、目的の特定ゲノム領域を単離することができる。
工程３で用いる方法は、外来性分子が結合した目的の特定ゲノム領域を含むDNA断片と、外来性分子と特異的に結合する分子との複合体を生成することができ、当該複合体を回収できる方法であれば、どのような方法であってもよい。例えば、外来性分子と特異的に結合する抗体やペプチド、ニッケルイオン等が固定された担体を用いて、複合体を沈降させて回収する方法などが挙げられる。
外来性分子として、例えば２種類のタグ配列を含み、両タグ配列がプロテアーゼ認識配列を介して連結されている構成の融合分子を用いた場合には、第１のタグ配列と特異的に結合する分子を結合させて第１の複合体を生成した後、第１の複合体をプロテアーゼで処理してプロテアーゼ認識配列を切断し、続いて第２のタグ配列と特異的に結合する分子を、第１の複合体から遊離したゲノムDNAに結合させて第２の複合体を生成することが好ましい。２段階で複合体を生成することにより、第１のタグ配列と特異的に結合する分子や、これを固定した担体に非特異的に結合する分子がバックグラウンドとして濃縮される不都合を回避でき、特定ゲノム領域の特異的な単離効率が大幅に向上する。
なお、２種類のタグ配列がプロテアーゼ認識配列を介して連結されている構成の外来性分子を用いない場合でも、タグ配列と特異的に結合する分子から、複合体を遊離させることによりバックグラウンドを低減させることが可能である。具体的には、例えばタグ配列としてFLAGタグを用いた場合に、FLAGペプチドを加えることにより、抗FLAG抗体と結合した複合体から複合体を遊離させる場合等が挙げられる。
図１に従って、本発明の第１の実施形態の一つの具体例を以下に説明する。ただし、本発明の方法は、当該実施形態に限定されるものではない。
（１）図１Ａに示すように、解析対象細胞の目的のゲノム領域内またはその近傍に存在し、外来性分子の標的とする内在性DNA配列を決定する。
（２）決定した内在性DNA配列に特異的に結合するTALエフェクター蛋白質を設計する。これと核移行シグナル（NLS: Nuclear localization signal）配列およびFLAGを３回繰り返したタグ配列との融合蛋白質（3×FN-TAL、図１Ｂ参照）を発現させるための発現ベクターを作製し、解析対象細胞内で発現可能に導入する。
（３）3×FN-TALの発現ベクターを導入した解析対象細胞に対して、必要に応じで刺激を与える。単離しようとするゲノム領域においてゲノムDNAと相互作用している蛋白質、RNA、DNA、およびその他の分子の相互作用状態を保持させるために、必要に応じてホルムアルデヒド等の架橋剤で細胞を架橋処理する。もちろん、3×FN-TALは、標的の内在性DNA配列と結合している（図１Ｃ上段参照）。
（４）細胞を溶解し、相互作用状態を保持しているゲノムDNAを制限酵素等のDNA切断酵素で消化して断片化する。断片化は、超音波処理で行ってもよい。この工程により、3×FN-TALが結合しているDNA断片と、3×FN-TALが結合していないDNA断片が生成する。
（５）3×FN-TALが結合しているDNA断片は、抗FLAG抗体と結合して複合体（免疫沈降複合体）を生成する（図１Ｃ下段参照）。
（６）単離した複合体はゲノム領域と相互作用している分子を保持している。したがって、相互作用（架橋）を解除し、蛋白質、RNA、DNA、およびその他の分子を精製してこれらの分子を同定することができる。
（１）図１Ａに示すように、解析対象細胞の目的のゲノム領域内またはその近傍に存在し、外来性分子の標的とする内在性DNA配列を決定する。
（２）決定した内在性DNA配列に特異的に結合するTALエフェクター蛋白質を設計する。これと核移行シグナル（NLS: Nuclear localization signal）配列およびFLAGを３回繰り返したタグ配列との融合蛋白質（3×FN-TAL、図１Ｂ参照）を発現させるための発現ベクターを作製し、解析対象細胞内で発現可能に導入する。
（３）3×FN-TALの発現ベクターを導入した解析対象細胞に対して、必要に応じで刺激を与える。単離しようとするゲノム領域においてゲノムDNAと相互作用している蛋白質、RNA、DNA、およびその他の分子の相互作用状態を保持させるために、必要に応じてホルムアルデヒド等の架橋剤で細胞を架橋処理する。もちろん、3×FN-TALは、標的の内在性DNA配列と結合している（図１Ｃ上段参照）。
（４）細胞を溶解し、相互作用状態を保持しているゲノムDNAを制限酵素等のDNA切断酵素で消化して断片化する。断片化は、超音波処理で行ってもよい。この工程により、3×FN-TALが結合しているDNA断片と、3×FN-TALが結合していないDNA断片が生成する。
（５）3×FN-TALが結合しているDNA断片は、抗FLAG抗体と結合して複合体（免疫沈降複合体）を生成する（図１Ｃ下段参照）。
（６）単離した複合体はゲノム領域と相互作用している分子を保持している。したがって、相互作用（架橋）を解除し、蛋白質、RNA、DNA、およびその他の分子を精製してこれらの分子を同定することができる。
〔第２の実施形態〕
本発明の方法は、以下の工程Ｉ〜ＩＩＩを含むものであればよい。本発明の方法により、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離することが可能となる。相互作用状態を保持した特定ゲノム領域が単離できる限り、工程Ｉ〜ＩＩＩ以外の工程を含んでもよく、その内容は限定されない。なお、第２の実施形態の解析対象細胞は生細胞に限定されず、組織標本等の細胞も解析対象細胞として好適である。
工程Ｉ：相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
工程ＩＩ：ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させる工程
工程ＩＩＩ：前記外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収する工程
本発明の方法は、以下の工程Ｉ〜ＩＩＩを含むものであればよい。本発明の方法により、相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離することが可能となる。相互作用状態を保持した特定ゲノム領域が単離できる限り、工程Ｉ〜ＩＩＩ以外の工程を含んでもよく、その内容は限定されない。なお、第２の実施形態の解析対象細胞は生細胞に限定されず、組織標本等の細胞も解析対象細胞として好適である。
工程Ｉ：相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
工程ＩＩ：ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させる工程
工程ＩＩＩ：前記外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収する工程
以下、各工程順に本発明の方法を詳細に説明する。
（１）工程Ｉ
工程Ｉは、相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程である。解析対象として生細胞を用いる場合には、工程１を行う前にゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行うことが好ましいが、相互作用状態を保持する処理を行うことなく、工程１を行ってもよい。生細胞は細胞の細胞周期や外からの刺激等に応じて相互作用している分子が異なると考えられるので、解析目的に合わせたタイミングで、相互作用状態を保持する処理またはゲノムDNAの断片化処理を行うことが好ましい。また、これらの処理を行う前に、必要に応じて細胞に刺激を与えてもよい。
組織標本等の細胞を解析対象とする場合には、ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態は保持されていると考えられるので、通常改めて相互作用状態を保持する処理を行うことは要しない。
いずれの細胞を解析対象とする場合も、断片化処理を効率よく行うために、断片化処理の前に、公知の方法を用いて細胞を溶解または破砕またはクロマチン分画を抽出しておくことが好ましい。
（１）工程Ｉ
工程Ｉは、相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程である。解析対象として生細胞を用いる場合には、工程１を行う前にゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行うことが好ましいが、相互作用状態を保持する処理を行うことなく、工程１を行ってもよい。生細胞は細胞の細胞周期や外からの刺激等に応じて相互作用している分子が異なると考えられるので、解析目的に合わせたタイミングで、相互作用状態を保持する処理またはゲノムDNAの断片化処理を行うことが好ましい。また、これらの処理を行う前に、必要に応じて細胞に刺激を与えてもよい。
組織標本等の細胞を解析対象とする場合には、ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態は保持されていると考えられるので、通常改めて相互作用状態を保持する処理を行うことは要しない。
いずれの細胞を解析対象とする場合も、断片化処理を効率よく行うために、断片化処理の前に、公知の方法を用いて細胞を溶解または破砕またはクロマチン分画を抽出しておくことが好ましい。
（２）工程ＩＩ
工程ＩＩは、ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させる工程である。外来性分子は、工程Ｉで調製した断片化ゲノムDNAと接触させる前に、予め担体に固定化されていることが好ましい。あるいは、外来性分子と断片化ゲノムDNAと接触させた後に、外来性分子を担体に固定化してもよい。外来性分子を担体に固定化することにより、外来性分子が結合する内在性DNA配列を含むDNA断片のみを担体に結合させることができる。外来性分子は、第１の実施形態において説明した方法で製造することができる。
工程ＩＩは、ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させる工程である。外来性分子は、工程Ｉで調製した断片化ゲノムDNAと接触させる前に、予め担体に固定化されていることが好ましい。あるいは、外来性分子と断片化ゲノムDNAと接触させた後に、外来性分子を担体に固定化してもよい。外来性分子を担体に固定化することにより、外来性分子が結合する内在性DNA配列を含むDNA断片のみを担体に結合させることができる。外来性分子は、第１の実施形態において説明した方法で製造することができる。
外来性分子を固定化する担体は、蛋白質または核酸を固定化できる担体であれば特に限定されない。例えば、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、メタアクリレート、ラテックス、アガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、デキストリン、シリカゲル、多孔性セラミックス等の素材できたビーズ、マグネチックビーズ、ディスク、スティック、チューブ、マイクロタイタープレート、マイクロセンサーチップ、マイクロアレイ等が挙げられる。外来性分子の担体への固定化方法は、物理的吸着、共有結合、架橋等の公知の方法を適宜選択して用いることができる。
（３）工程ＩＩＩ
工程ＩＩＩは、前記外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収する工程である。外来性分子は、単離しようとするゲノム領域内またはその近傍に存在する特定の内在性DNA配列部分でゲノムDNAと結合するので、外来性分子に結合したゲノムDNA断片には目的の特定ゲノム領域が含まれていると考えられる。したがって、外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収することにより、目的の特定ゲノム領域を単離することができる。
工程ＩＩＩは、前記外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収する工程である。外来性分子は、単離しようとするゲノム領域内またはその近傍に存在する特定の内在性DNA配列部分でゲノムDNAと結合するので、外来性分子に結合したゲノムDNA断片には目的の特定ゲノム領域が含まれていると考えられる。したがって、外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収することにより、目的の特定ゲノム領域を単離することができる。
工程ＩＩおよびＩＩＩで用いる具体的な方法は特に限定されない。例えば、外来性分子を固定化した担体をカラムに詰めて、ここに工程Ｉで調製したDNA断片を通し、外来性分子に目的のゲノムDNA領域を結合させた後、カラムを洗浄し、その後、目的のゲノムDNA領域を溶出させることで回収する方法が挙げられる。あるいは、外来性分子を固定化した担体を入れたチューブに工程Ｉで調整したDNA断片を加え、撹拌操作等により外来性分子と目的のゲノムDNA領域を接触させ、その後、担体を洗浄した後、目的のゲノムDNA領域を溶出して回収する方法が挙げられる。
図２に、本発明の第２の実施形態の一つの具体例を示す。ただし、本発明の方法は、当該実施形態に限定されるものではない。以下、図２に従って、本発明の第２の実施形態の一例を説明する。
（１）図２Ａに示すように、解析対象細胞の目的のゲノム領域内またはその近傍に存在し、外来性分子の標的とする内在性DNA配列を決定する。
（２）決定した内在性DNA配列に特異的に結合するTALエフェクター蛋白質を設計し、これにタグを付けた組み換え蛋白質として取得する。タグは、例えばプロメガ社製のHaloTag（登録商標）である。これをプロメガ社製のHaloLink Magnetic Beads（商品名）に共有結合により固定化する（TAL-conjugated beads、図２Ｂ参照）。あるいは、タグは、例えばGSTタグである。これをGEヘルスケア社製のGlutathione Sepharose 4Bにアフィニティー結合により固定化する。
（３）解析対象細胞に対して、必要に応じて刺激を与える。単離しようとするゲノム領域においてゲノムDNAと相互作用している蛋白質、RNA、DNA、およびその他の分子の相互作用状態を保持させるために、必要に応じてホルムアルデヒド等の架橋剤で細胞を架橋処理する（図２Ｃ上段参照）。
（４）細胞を溶解し、相互作用状態を保持しているゲノムDNAを制限酵素等のDNA切断酵素で消化して断片化する。断片化は、超音波処理で行ってもよい。この工程により、TAL-conjugated beadsが結合する内在性DNA配列を含むDNA断片と、これを含まないDNA断片が生成する。
（５）TAL-conjugated beadsが結合する内在性DNA配列を含むDNA断片は、TAL-conjugated beadsと結合する（図２Ｃ下段参照）。
（６）TAL-conjugated beadsを回収することにより目的のゲノム領域を単離することができる。単離したゲノム領域は相互作用している分子を保持している。したがって、相互作用（架橋）を解除し、蛋白質、RNA、DNA、およびその他の分子を精製してこれらの分子を同定することができる。
（１）図２Ａに示すように、解析対象細胞の目的のゲノム領域内またはその近傍に存在し、外来性分子の標的とする内在性DNA配列を決定する。
（２）決定した内在性DNA配列に特異的に結合するTALエフェクター蛋白質を設計し、これにタグを付けた組み換え蛋白質として取得する。タグは、例えばプロメガ社製のHaloTag（登録商標）である。これをプロメガ社製のHaloLink Magnetic Beads（商品名）に共有結合により固定化する（TAL-conjugated beads、図２Ｂ参照）。あるいは、タグは、例えばGSTタグである。これをGEヘルスケア社製のGlutathione Sepharose 4Bにアフィニティー結合により固定化する。
（３）解析対象細胞に対して、必要に応じて刺激を与える。単離しようとするゲノム領域においてゲノムDNAと相互作用している蛋白質、RNA、DNA、およびその他の分子の相互作用状態を保持させるために、必要に応じてホルムアルデヒド等の架橋剤で細胞を架橋処理する（図２Ｃ上段参照）。
（４）細胞を溶解し、相互作用状態を保持しているゲノムDNAを制限酵素等のDNA切断酵素で消化して断片化する。断片化は、超音波処理で行ってもよい。この工程により、TAL-conjugated beadsが結合する内在性DNA配列を含むDNA断片と、これを含まないDNA断片が生成する。
（５）TAL-conjugated beadsが結合する内在性DNA配列を含むDNA断片は、TAL-conjugated beadsと結合する（図２Ｃ下段参照）。
（６）TAL-conjugated beadsを回収することにより目的のゲノム領域を単離することができる。単離したゲノム領域は相互作用している分子を保持している。したがって、相互作用（架橋）を解除し、蛋白質、RNA、DNA、およびその他の分子を精製してこれらの分子を同定することができる。
〔単離した特定ゲノム領域の利用〕
本発明の方法により単離した特定ゲノム領域は、ゲノム機能発現の分子機構解析のための試料として非常に有用である。すなわち、単離した特定ゲノム領域には、ゲノムDNAと相互作用している分子（蛋白質、DNA、RNAなど）の相互作用状態が保持されているので、相互作用している分子を同定し、その機能を推定することが可能となり、ゲノム機能発現の分子機構解析に大きな貢献をもたらすことが期待できる。
本発明の方法により単離した特定ゲノム領域は、ゲノム機能発現の分子機構解析のための試料として非常に有用である。すなわち、単離した特定ゲノム領域には、ゲノムDNAと相互作用している分子（蛋白質、DNA、RNAなど）の相互作用状態が保持されているので、相互作用している分子を同定し、その機能を推定することが可能となり、ゲノム機能発現の分子機構解析に大きな貢献をもたらすことが期待できる。
単離した特定ゲノム領域において相互作用している分子の同定は、公知の方法を適宜組み合わせて行えばよく、特に限定されない。例えば、相互作用状態の保持を解除して、相互作用している分子を分離、精製し、公知の同定方法を適用することで行うことができる。相互作用状態を保持する処理がホルムアルデヒドを用いた架橋処理の場合には、高濃度の塩溶液（5M NaCl溶液など）を添加して適当な温度で適当な時間（例えば約６５℃で一夜）インキュベートすることにより架橋を解除することができる。公知の同定方法としては、対象が蛋白質の場合には、例えば、質量分析、免疫ブロット、ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）などが挙げられ、対象がDNAまたはRNAの場合には、例えば、塩基配列解析、マイクロアレイ解析、PCR（polymerase chain reaction）などが挙げられる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：テロメア領域の単離〕
（１）解析用細胞の作製
テロメアリピート（TTAGGG）を認識するTALエフェクター蛋白質を発現する細胞を作製した。TAGGGTTAGGGTTAGGGTT（配列番号１）のテロメアリピートを含む19-merの二本鎖DNA（TAGGGTTAGGGTTAGGGTT：配列番号１）に結合するTelomere-TALをコードするDNAを合成した。合成はライフテクノロジーズ社に委託した。Telomere-TALに3×FLAGタグおよび核移行シグナル（NLS）を融合した蛋白質3×FN-Tel-TAL（配列番号２）を発現するレトロウイルスベクター3×FN-Tel-TAL/pMXs-puroを作製し、マウス血球系細胞株Ba/F3に感染させ、ピューロマイシンセレクションにより、感染細胞のみを選別した。3×FN-Tel-TAL蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２に示した。
陰性対照細胞は以下のようにして作製した。3×FLAGタグ、NLSおよび細菌のLexA蛋白質からなる融合蛋白質3×FNLDD（Fujita and Fujii. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012)）を発現するレトロウイルスベクター3×FNLDD/pMXs-puroをBa/F3細胞に感染させ、ピューロマイシンセレクションにより、感染細胞のみを選別した。
（１）解析用細胞の作製
テロメアリピート（TTAGGG）を認識するTALエフェクター蛋白質を発現する細胞を作製した。TAGGGTTAGGGTTAGGGTT（配列番号１）のテロメアリピートを含む19-merの二本鎖DNA（TAGGGTTAGGGTTAGGGTT：配列番号１）に結合するTelomere-TALをコードするDNAを合成した。合成はライフテクノロジーズ社に委託した。Telomere-TALに3×FLAGタグおよび核移行シグナル（NLS）を融合した蛋白質3×FN-Tel-TAL（配列番号２）を発現するレトロウイルスベクター3×FN-Tel-TAL/pMXs-puroを作製し、マウス血球系細胞株Ba/F3に感染させ、ピューロマイシンセレクションにより、感染細胞のみを選別した。3×FN-Tel-TAL蛋白質のアミノ酸配列を配列番号２に示した。
陰性対照細胞は以下のようにして作製した。3×FLAGタグ、NLSおよび細菌のLexA蛋白質からなる融合蛋白質3×FNLDD（Fujita and Fujii. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012)）を発現するレトロウイルスベクター3×FNLDD/pMXs-puroをBa/F3細胞に感染させ、ピューロマイシンセレクションにより、感染細胞のみを選別した。
3×FN-Tel-TAL蛋白質と3×FNLDD蛋白質の発現を、FLAGタグに対する抗体（シグマ−アルドリッチ社製、フルオレセインイソチオシアネート結合anti-FLAG M2、F4049）を用いて細胞内染色を行い、フローサイトメトリーによって検出した。結果を図３に示した。図中、Ba/F3（左）は宿主細胞のみ、3×FNLDD（中）は3×FNLDD蛋白質発現細胞、3×FN-Tel-TAL（右）は3×FN-Tel-TAL蛋白質発現細胞の結果である。図３からわかるように、3×FN-Tel-TAL蛋白質と3×FNLDD蛋白質の発現レベルは、同程度であった。
（２）特定ゲノム領域の単離
(a) インターロイキン３含有RPMI完全培地30mL中に2×107個の細胞を含む細胞懸濁液に810μLの37％ホルムアルデヒドを添加して37℃で5分間置き細胞を架橋処理した。続いて、1.25Mグリシン溶液を3 mL添加して室温で10分間置き、中和した。
(b) 遠心分離（1.3 krpm、5分間、4℃）により細胞を氷冷PBSで２回洗浄した後、10 mLの細胞溶解バッファー（10 mM Tris (pH8.0)、1 mM EDTA、0.5％ IGEPAL CA-630、プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁した。氷上で10分間置いた後、遠心分離 (2.0 krpm、8分間、4℃)後、上清を捨て、ペレットを10 mLの核溶解バッファー（10 mM Tris (pH8.0)、1 mM EDTA、0.5M NaCl、1% Trion X-100、0.5% sodium deoxycholate、0.5% lauroylsarcosine salt、プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁し、2〜3分おきにボルテックスをかけながら氷上で10分間置いた。遠心分離（2.0 krpm、8分間、4℃）後、上澄みを捨て、氷冷PBSを用いて洗浄したペレットをクロマチン分画とした。
(a) インターロイキン３含有RPMI完全培地30mL中に2×107個の細胞を含む細胞懸濁液に810μLの37％ホルムアルデヒドを添加して37℃で5分間置き細胞を架橋処理した。続いて、1.25Mグリシン溶液を3 mL添加して室温で10分間置き、中和した。
(b) 遠心分離（1.3 krpm、5分間、4℃）により細胞を氷冷PBSで２回洗浄した後、10 mLの細胞溶解バッファー（10 mM Tris (pH8.0)、1 mM EDTA、0.5％ IGEPAL CA-630、プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁した。氷上で10分間置いた後、遠心分離 (2.0 krpm、8分間、4℃)後、上清を捨て、ペレットを10 mLの核溶解バッファー（10 mM Tris (pH8.0)、1 mM EDTA、0.5M NaCl、1% Trion X-100、0.5% sodium deoxycholate、0.5% lauroylsarcosine salt、プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁し、2〜3分おきにボルテックスをかけながら氷上で10分間置いた。遠心分離（2.0 krpm、8分間、4℃）後、上澄みを捨て、氷冷PBSを用いて洗浄したペレットをクロマチン分画とした。
(c) クロマチン分画を800μLの溶解バッファー３（10 mM Tris (pH8.0)、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、150mM NaCl、0.1% sodium deoxycholate、0.1% SDS、プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁し、架橋されたゲノムDNAを超音波処理により断片化した（超音波発生機：TOMY SEIKO社製、Ultrasonic disruptor UD-201、output: 3、Duty: 100%、10 sec x 6 with 20 sec intervals を２分間の間隔を空けて3セット（計18回））。
(d) 遠心分離（1.3 krpm、10分間、4℃）して上清800μLを回収した。このうち、160μL（4×106細胞相当）に240μLの溶解バッファー３、50μLの10％ Triton X-100を含んだ溶解バッファー３、50μLの10×プロテアーゼインヒビター溶液を加えて、500μLとした。続いて、対照IgGを結合させたDynabeadsを用いて、プレクリアー操作を行い、非特異的結合物を除いた。次いで、抗FLAG抗体M2（シグマ−アルドリッチ社製、anti-FLAG M2、F1804）を結合させたDynabeadsを用いて、免疫沈降した。
(d) 遠心分離（1.3 krpm、10分間、4℃）して上清800μLを回収した。このうち、160μL（4×106細胞相当）に240μLの溶解バッファー３、50μLの10％ Triton X-100を含んだ溶解バッファー３、50μLの10×プロテアーゼインヒビター溶液を加えて、500μLとした。続いて、対照IgGを結合させたDynabeadsを用いて、プレクリアー操作を行い、非特異的結合物を除いた。次いで、抗FLAG抗体M2（シグマ−アルドリッチ社製、anti-FLAG M2、F1804）を結合させたDynabeadsを用いて、免疫沈降した。
(e) 洗浄後、免疫沈降物複合体を300μLのTEに懸濁し、架橋除去後、RNase AおよびProteinase K処理を行い、次いでフェノール／クロロフォルム処理によって、DNAを精製した。
(f) 得られたDNAをサザンブロット解析に用いた。テロメアDNAの検出には、Roche社製Telo TAGGG Telomerase Length Assay kit（12209136001）を用いた。
(f) 得られたDNAをサザンブロット解析に用いた。テロメアDNAの検出には、Roche社製Telo TAGGG Telomerase Length Assay kit（12209136001）を用いた。
サザンブロット解析の結果を図４（Ａ）および（Ｂ）に示した。（Ａ）および（Ｂ）は再現性を確認した結果である。図４（Ａ）および（Ｂ）から明らかなように、免疫沈降を行った２種類のサンプル中、3×FN-Tel-TALを用いた場合のみ、免疫沈降物複合体からテロメアDNAが検出された。この結果から、3×FN-Tel-TALを用いた免疫沈降により、テロメア領域が回収できることが明らかとなった。
（３）単離したテロメア領域に含まれる蛋白質の同定
(g) 上記(a)〜(d)と同様の操作により、免疫沈降物を得た。免疫沈降には、300μLのDynabeadsと、30μLの抗体を用いた。免疫沈降物に200μLの3×FLAGペプチド溶液（シグマ−アルドリッチ社製、F4799、0.5 mg/mL）を加えて37℃、20分間インキュベートすることでビーズから溶出した。イソプロパノールを用いて溶出した免疫沈降物を沈殿させ、40μLの2×SDSサンプルバッファーに懸濁して100℃、30分間インキュベートし、蛋白質の変性と架橋の解除を同時に行った。
(h) 次いで、4-20％SDS-PAGEゲルで、サンプルが1.5 cm程ゲル内に入るまで電気泳動し、クマシーブリリアントブルー (CBB) 染色した後、5分割して質量分析解析を行った。
(g) 上記(a)〜(d)と同様の操作により、免疫沈降物を得た。免疫沈降には、300μLのDynabeadsと、30μLの抗体を用いた。免疫沈降物に200μLの3×FLAGペプチド溶液（シグマ−アルドリッチ社製、F4799、0.5 mg/mL）を加えて37℃、20分間インキュベートすることでビーズから溶出した。イソプロパノールを用いて溶出した免疫沈降物を沈殿させ、40μLの2×SDSサンプルバッファーに懸濁して100℃、30分間インキュベートし、蛋白質の変性と架橋の解除を同時に行った。
(h) 次いで、4-20％SDS-PAGEゲルで、サンプルが1.5 cm程ゲル内に入るまで電気泳動し、クマシーブリリアントブルー (CBB) 染色した後、5分割して質量分析解析を行った。
3×FNLDDと比較して相対的に3×FN-Tel-TALに多く検出された蛋白質には、既知のテロメア結合蛋白質、他のテロメア結合蛋白質に結合することが知られている蛋白質、遺伝学的解析からテロメア機能に関与することが示されている蛋白質が多数含まれていた（表１参照）。この結果から、本発明の方法により、特定ゲノム領域の配列に特異的に結合する蛋白質をクロマチン複合体として単離し、質量分析により同定できることが示された。
（４）単離したテロメア領域に含まれるRNAの同定
(i) 上記(a)〜(e)と同様の操作により、免疫沈降物を得た。全てのバッファーにRNasin Plus（プロメガ社）を加えた。Proteinase K処理後に、Isogen II（ニッポンジーン社）を用いてRNAを精製した。
(j) 次いで、TITANIUM One-Step RT-PCR（クローンテック社）を用いてRT-PCRを行い、テロメラーゼRNAの検出を試みた。RT-PCRに用いたプライマーは5’-CCGGCGCCCCGCGGCTGACAGAG-3’（配列番号３）（逆転写用）、5'-GCTGTGGGTTCTGGTCTTTTGTTC-3'（配列番号４）、5’-GCGGCAGCGGAGTCCTAAG-3’（配列番号５）である。
(i) 上記(a)〜(e)と同様の操作により、免疫沈降物を得た。全てのバッファーにRNasin Plus（プロメガ社）を加えた。Proteinase K処理後に、Isogen II（ニッポンジーン社）を用いてRNAを精製した。
(j) 次いで、TITANIUM One-Step RT-PCR（クローンテック社）を用いてRT-PCRを行い、テロメラーゼRNAの検出を試みた。RT-PCRに用いたプライマーは5’-CCGGCGCCCCGCGGCTGACAGAG-3’（配列番号３）（逆転写用）、5'-GCTGTGGGTTCTGGTCTTTTGTTC-3'（配列番号４）、5’-GCGGCAGCGGAGTCCTAAG-3’（配列番号５）である。
RT-PCRの結果を図５に示した。図５から明らかなように、3×FN-Tel-TALを用いた場合に特異的に、テロメレラーゼRNAが検出された。この結果から、本発明の方法により、特定ゲノム領域の配列に特異的に結合するRNAをクロマチン複合体として単離し、RT-PCRにより定量することができることが示された。
〔実施例２：Sox2遺伝子プロモーター領域の単離〕
（１）解析用細胞の作製
ヒトSox2遺伝子プロモーター領域に存在する塩基配列（TTATTCCCTGACA、配列番号６）を認識するTALエフェクター蛋白質を発現する細胞を作製した。上記配列（配列番号６）を認識するTALエフェクター蛋白質をコードするDNAをAddgeneより購入した（Addgene #35388）。この蛋白質に3×FLAGタグおよび核移行シグナル（NLS）を融合した蛋白質3×FN-Sox2-TALを発現するプラスミドベクターを作製し、ヒト胎児腎細胞293Tにトランスフェクションし、3×FN-Sox2-TAL発現細胞を作製した。
陰性対照として、以下の細胞を作製した。ヒトKLF4遺伝子プロモーター領域に存在する塩基配列（TCTTACTTATAAC、配列番号７）を認識するTALエフェクター蛋白質をコードするDNA（Addgene #35389）およびサイトメガウイルスのプロモーター領域に存在する塩基配列（ACCACTCACTATA、配列番号８）を認識するTALエフェクター蛋白質をコードするDNA（Addgene #27970）をそれぞれAddgeneより購入し、同様の操作を行って、各蛋白質（3×FN-KLF4-TAL、3×FN-CMV-TAL8）発現細胞を作製した。
（１）解析用細胞の作製
ヒトSox2遺伝子プロモーター領域に存在する塩基配列（TTATTCCCTGACA、配列番号６）を認識するTALエフェクター蛋白質を発現する細胞を作製した。上記配列（配列番号６）を認識するTALエフェクター蛋白質をコードするDNAをAddgeneより購入した（Addgene #35388）。この蛋白質に3×FLAGタグおよび核移行シグナル（NLS）を融合した蛋白質3×FN-Sox2-TALを発現するプラスミドベクターを作製し、ヒト胎児腎細胞293Tにトランスフェクションし、3×FN-Sox2-TAL発現細胞を作製した。
陰性対照として、以下の細胞を作製した。ヒトKLF4遺伝子プロモーター領域に存在する塩基配列（TCTTACTTATAAC、配列番号７）を認識するTALエフェクター蛋白質をコードするDNA（Addgene #35389）およびサイトメガウイルスのプロモーター領域に存在する塩基配列（ACCACTCACTATA、配列番号８）を認識するTALエフェクター蛋白質をコードするDNA（Addgene #27970）をそれぞれAddgeneより購入し、同様の操作を行って、各蛋白質（3×FN-KLF4-TAL、3×FN-CMV-TAL8）発現細胞を作製した。
これらの各TALエフェクター蛋白質の発現を、FLAGタグに対する抗体（シグマ−アルドリッチ社製、anti-FLAG M2、F1804）を用いてウエスタンブロットにより検出した。結果を図６に示した。図６からわかるように、TALエフェクター蛋白質の発現は、いずれも同程度であった。
（２）特定ゲノム領域の単離
(a) DMEM完全培地30 mL中に1.5×107個の細胞を含む細胞懸濁液に810μLの37％ホルムアルデヒドを添加して37℃で5分間置き、細胞を架橋処理した。続いて、1.25Mグリシン溶液を3 mL添加して室温で10分間置き、中和した。
(b)〜(d) 実施例１の（２）(b)〜(d)と同様の操作を行い、解析対象領域であるSox2プロモーター領域を免疫沈降した。
(e) 洗浄後、免疫沈降物に40μLの3×FLAGペプチド溶液（シグマ−アルドリッチ社製、F4799、0.5 mg/mL）を加えて37℃、30分間インキュベートすることでビーズから溶出した。溶出した免疫沈降物を60μLのTEに懸濁し、RNase AおよびProteinase K処理、ならびに架橋除去後、ChIP DNA Clean & Concentrator-Capped column（ZYMO RESEARCH社製、D5205）を用いてDNAを精製した。
(f) 得られたDNAを用いてリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRに用いたプライマーは、5’-ATTGGTCGCTAGAAACCCATTTATT-3’（配列番号９）、5’-CTGCCTTGACAACTCCTGATACTTT-3’（配列番号１０）であり、ヒトSox2遺伝子プロモーター領域内の3×FN-Sox2-TAL認識配列（TTATTCCCTGACA、配列番号６）を挟むように設計した（図７参照）。
(a) DMEM完全培地30 mL中に1.5×107個の細胞を含む細胞懸濁液に810μLの37％ホルムアルデヒドを添加して37℃で5分間置き、細胞を架橋処理した。続いて、1.25Mグリシン溶液を3 mL添加して室温で10分間置き、中和した。
(b)〜(d) 実施例１の（２）(b)〜(d)と同様の操作を行い、解析対象領域であるSox2プロモーター領域を免疫沈降した。
(e) 洗浄後、免疫沈降物に40μLの3×FLAGペプチド溶液（シグマ−アルドリッチ社製、F4799、0.5 mg/mL）を加えて37℃、30分間インキュベートすることでビーズから溶出した。溶出した免疫沈降物を60μLのTEに懸濁し、RNase AおよびProteinase K処理、ならびに架橋除去後、ChIP DNA Clean & Concentrator-Capped column（ZYMO RESEARCH社製、D5205）を用いてDNAを精製した。
(f) 得られたDNAを用いてリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRに用いたプライマーは、5’-ATTGGTCGCTAGAAACCCATTTATT-3’（配列番号９）、5’-CTGCCTTGACAACTCCTGATACTTT-3’（配列番号１０）であり、ヒトSox2遺伝子プロモーター領域内の3×FN-Sox2-TAL認識配列（TTATTCCCTGACA、配列番号６）を挟むように設計した（図７参照）。
リアルタイムPCRの結果を図８に示した。図８から明らかなように、3×FN-Sox2-TALを用いた場合、陰性対照と比較し、2.5〜3倍程度Sox2プロモーター領域の濃縮が見られた。この結果から、3×FN-Sox2-TALを用いた免疫沈降により、Sox2プロモーター領域が回収できることが明らかとなった。以上の結果から、細胞あたり１あるいは２コピーの解析対象ゲノム領域についても、本発明の方法を応用できることが示唆された。
〔実施例３：不活性型Cas9蛋白質とRNAの複合体（CRISPR系）を用いたIRF-1遺伝子座の単離〕
本実施例のスキームを図９に示した。
（１）解析用CRISPR系の作製
SV40 T抗原由来の核移行シグナルを含むCas9 D10A変異体をコードするプラスミドをAddgeneより購入した（Addgene #41816）。これを基に、H840A変異を導入して、酵素活性を持たないCas9変異体（dCas9）を作製した。dCas9のコーディング配列をp3XFLAG-CMV-7.1（シグマ−アルドリッチ社）に組み込み、3×FLAGタグ付きのdCas9蛋白質を発現するベクター3×F-dCas9/pCMV-7.1を作製した。ヒト胎児腎由来の293T細胞に3×F-dCas9/pCMV-7.1を一過性にトランスフェクトして、3×F-dCas9を発現させた。また、3×FNLDD/pCMV-7.1を293T細胞に一過性にトランスフェクトして、3×F-dCas9を発現させたものと比較した。
各細胞から核抽出物を調製し、3×F-dCas9の発現および3×FNLDDの発現を、FLAGタグに対する抗体（シグマ−アルドリッチ社製、anti-FLAG M2、F1804）を用いてウエスタンブロットにより検出した。結果を図１０に示した。図中（−）は宿主細胞のみを表す。下段のCBB染色像から、各レーンのサンプル量が同じであることがわかる。ウエスタンブロットの結果から、3×F-dCas9の発現および3×FNLDDの発現は同程度であった。
本実施例のスキームを図９に示した。
（１）解析用CRISPR系の作製
SV40 T抗原由来の核移行シグナルを含むCas9 D10A変異体をコードするプラスミドをAddgeneより購入した（Addgene #41816）。これを基に、H840A変異を導入して、酵素活性を持たないCas9変異体（dCas9）を作製した。dCas9のコーディング配列をp3XFLAG-CMV-7.1（シグマ−アルドリッチ社）に組み込み、3×FLAGタグ付きのdCas9蛋白質を発現するベクター3×F-dCas9/pCMV-7.1を作製した。ヒト胎児腎由来の293T細胞に3×F-dCas9/pCMV-7.1を一過性にトランスフェクトして、3×F-dCas9を発現させた。また、3×FNLDD/pCMV-7.1を293T細胞に一過性にトランスフェクトして、3×F-dCas9を発現させたものと比較した。
各細胞から核抽出物を調製し、3×F-dCas9の発現および3×FNLDDの発現を、FLAGタグに対する抗体（シグマ−アルドリッチ社製、anti-FLAG M2、F1804）を用いてウエスタンブロットにより検出した。結果を図１０に示した。図中（−）は宿主細胞のみを表す。下段のCBB染色像から、各レーンのサンプル量が同じであることがわかる。ウエスタンブロットの結果から、3×F-dCas9の発現および3×FNLDDの発現は同程度であった。
次に、Mali et al., Science (2013) 339: 823-826に従って、ヒトIRF-1遺伝子座に存在する5'-CCGGGGGCGCTGGGCTGTCCCGG-3'配列（配列番号１１）に対応するgRNAの発現ベクターを構築した。二つのオリゴヌクレオチド5'-TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCGGGGGCGCTGGGCTGTCC-3'（配列番号１２）と5'-GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGGACAGCCCAGCGCCCCCGC-3'（配列番号１３）をアニールさせ、Phusionポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラブズ社）を用いて、100ベースペアの二重鎖DNA断片を合成した。アガロース電気泳動により、この断片を精製し、ギブソンアセンブリー法キット（ニューイングランドバイオラブズ社）を用いて、gRNAクローニングベクター（Addgene #41824）と結合させ、gRNAを発現するgRNA-hIRF-1 #12を作製した。
（２）ヒトIRF-1遺伝子座の単離
(a) 上記3×F-dCas9/pCMV-7.1とgRNA-hIRF-1 #12を、ヒト胎児腎由来の293T細胞3×106個にリポフェクタミン2000（インビトロジェン社）を用いて導入した。トランスフェクションの翌日に、細胞を播き直し、更に翌日に、DMEM完全培地30 mL中の細胞に810μLの37%ホルムアルデヒドを添加して37℃で5分間置き、細胞を架橋処理した。続いて、1.25Mグリシン溶液を3 mL添加して室温で10分間置き、中和した。
(b)〜(d) 実施例１の（２）(b)〜(d)と同様の操作を行い、解析対象領域であるIRF-1領域を免疫沈降した。
(e) 洗浄後、免疫沈降物複合体を285μLのTEに懸濁し、12μLの5M NaClを加えて65℃で終夜処理し、架橋除去後、RNase AおよびProteinase K処理を行い、次いでフェノール／クロロフォルム処理によって、DNAを精製した。
(f) 得られたDNAを用いてリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRに用いたプライマーは、5'-CGCCTGCGTTCGGGAGATATAC-3'（配列番号１４）、5'-CTGTCCTCTCACTCCGCCTTGT-3'（配列番号１５）であり、ヒトIRF-1遺伝子座の標的DNA配列近傍に設計した。また、無関係な領域であるSox2遺伝子座の定量のため、配列番号９および１０のプライマーを用いた。
(a) 上記3×F-dCas9/pCMV-7.1とgRNA-hIRF-1 #12を、ヒト胎児腎由来の293T細胞3×106個にリポフェクタミン2000（インビトロジェン社）を用いて導入した。トランスフェクションの翌日に、細胞を播き直し、更に翌日に、DMEM完全培地30 mL中の細胞に810μLの37%ホルムアルデヒドを添加して37℃で5分間置き、細胞を架橋処理した。続いて、1.25Mグリシン溶液を3 mL添加して室温で10分間置き、中和した。
(b)〜(d) 実施例１の（２）(b)〜(d)と同様の操作を行い、解析対象領域であるIRF-1領域を免疫沈降した。
(e) 洗浄後、免疫沈降物複合体を285μLのTEに懸濁し、12μLの5M NaClを加えて65℃で終夜処理し、架橋除去後、RNase AおよびProteinase K処理を行い、次いでフェノール／クロロフォルム処理によって、DNAを精製した。
(f) 得られたDNAを用いてリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRに用いたプライマーは、5'-CGCCTGCGTTCGGGAGATATAC-3'（配列番号１４）、5'-CTGTCCTCTCACTCCGCCTTGT-3'（配列番号１５）であり、ヒトIRF-1遺伝子座の標的DNA配列近傍に設計した。また、無関係な領域であるSox2遺伝子座の定量のため、配列番号９および１０のプライマーを用いた。
リアルタイムPCRの結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、陰性対照では、ほとんどIRF-1遺伝子座が濃縮されなかったのに対して、3×F-dCas9とgRNA-hIRF-1 #12とを用いた場合、インプットに対して7.7％もの濃縮が認められた。また、関係のないSox2遺伝子座は全く濃縮されなかった。この結果から、3×F-dCas9とgRNAを用いた免疫沈降により、標的遺伝子座が特異的かつ効率的に回収できることが明らかとなった。以上の結果から、細胞あたり１あるいは２コピーの解析対象ゲノム領域についても、本発明の方法を応用できることが示唆された。
（３）単離したIRF-1領域に含まれる蛋白質の同定
(g) 上記(a)〜(d)と同様の操作により、免疫沈降物を得た。免疫沈降には、300μLのDynabeadsと、30μLの抗体を用いた。免疫沈降物に200μLの3×FLAGペプチド溶液（シグマ−アルドリッチ社製、F4799、0.5 mg/mL）を加えて37℃、20分間インキュベートすることでビーズから溶出した。イソプロパノールを用いて溶出した免疫沈降物を沈殿させ、40μLの2×SDSサンプルバッファーに懸濁して100℃、30分間インキュベートし、蛋白質の変性と架橋の解除を同時に行った。
(h) 次いで、4-20％SDS-PAGEゲルで、サンプルが1.0 cm程ゲル内に入るまで電気泳動し、クマシーブリリアントブルー染色した後、5分割して質量分析解析を行った（図１２参照）。
(g) 上記(a)〜(d)と同様の操作により、免疫沈降物を得た。免疫沈降には、300μLのDynabeadsと、30μLの抗体を用いた。免疫沈降物に200μLの3×FLAGペプチド溶液（シグマ−アルドリッチ社製、F4799、0.5 mg/mL）を加えて37℃、20分間インキュベートすることでビーズから溶出した。イソプロパノールを用いて溶出した免疫沈降物を沈殿させ、40μLの2×SDSサンプルバッファーに懸濁して100℃、30分間インキュベートし、蛋白質の変性と架橋の解除を同時に行った。
(h) 次いで、4-20％SDS-PAGEゲルで、サンプルが1.0 cm程ゲル内に入るまで電気泳動し、クマシーブリリアントブルー染色した後、5分割して質量分析解析を行った（図１２参照）。
検出された蛋白質には、ヒストン等の既知のクロマチン構成蛋白質、ヒストン結合蛋白質、代謝酵素蛋白質、RNAヘリカーゼ等が多数含まれていた（表２参照）。この結果から、本発明の方法により、特定ゲノム領域の配列に結合する蛋白質をクロマチン複合体として単離し、質量分析により同定できることが示された。
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
Claims (11)
- 相互作用している分子との相互作用状態を保持したまま特定ゲノム領域を単離する方法であって、以下の工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする特定ゲノム領域の単離方法。
（Ａ）相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
（Ｂ）ゲノムDNA中の特定の内在性DNA配列に結合する外来性分子と、ゲノムDNAとを接触させる工程 - さらに、（Ｃ）ゲノムDNAと、当該ゲノムDNAと相互作用している分子との相互作用状態を保持する処理を行う工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 前記外来性分子が、外来性DNA結合蛋白質、外来性核酸または外来性蛋白質−核酸複合体であることを特徴とする請求項１または２に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 前記外来性分子が、ジンクフィンガー蛋白質、TALエフェクター蛋白質または不活性型Cas9蛋白質とガイドRNA（gRNA）の複合体であることを特徴とする請求項１または２に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 以下の工程１〜３を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
工程１：前記外来性分子と、細胞内のゲノムDNAとを接触させる工程
工程２：相互作用している分子との相互作用状態を保持している前記細胞内のゲノムDNAを断片化する工程
工程３：前記外来性分子と特異的に結合する分子を、外来性分子が結合しているゲノムDNA断片に結合させて複合体を生成し、当該複合体を回収する工程 - 前記外来性分子が、１種以上のタグ配列を含む融合分子であることを特徴とする請求項５に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 前記外来性分子が、核移行シグナルを含む融合分子であることを特徴とする請求項５または６に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 工程１において、解析対象細胞に、前記外来性分子をコードする遺伝子を導入し、当該細胞内で発現させることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 以下の工程Ｉ〜ＩＩＩを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の特定ゲノム領域の単離方法。
工程Ｉ：相互作用している分子との相互作用状態を保持しているゲノムDNAを断片化する工程
工程ＩＩ：前記外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させる工程
工程ＩＩＩ：前記外来性分子に結合したゲノムDNA断片を回収する工程 - 工程ＩＩにおいて、担体に固定化された前記外来性分子と、断片化した前記ゲノムDNAとを接触させることを特徴とする請求項９に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
- 工程ＩＩにおいて、前記外来性分子と断片化した前記ゲノムDNAとを接触させた後に、前記外来性分子を担体に固定化することを特徴とする請求項９に記載の特定ゲノム領域の単離方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013026310 | 2013-02-14 | ||
| JP2013026310 | 2013-02-14 | ||
| JP2013143282 | 2013-07-09 | ||
| JP2013143282 | 2013-07-09 | ||
| PCT/JP2013/074107 WO2014125668A1 (ja) | 2013-02-14 | 2013-09-06 | 内在性dna配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP5954808B2 JP5954808B2 (ja) | 2016-07-20 |
| JPWO2014125668A1 true JPWO2014125668A1 (ja) | 2017-02-02 |
Family
ID=51353688
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015500088A Active JP5954808B2 (ja) | 2013-02-14 | 2013-09-06 | 内在性ｄｎａ配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11466306B2 (ja) |
| EP (1) | EP2963113B1 (ja) |
| JP (1) | JP5954808B2 (ja) |
| DK (1) | DK2963113T3 (ja) |
| ES (1) | ES2768291T3 (ja) |
| PL (1) | PL2963113T3 (ja) |
| PT (1) | PT2963113T (ja) |
| WO (1) | WO2014125668A1 (ja) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3613852A3 (en) | 2011-07-22 | 2020-04-22 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| EP2971167B1 (en) | 2013-03-14 | 2019-07-31 | Caribou Biosciences, Inc. | Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids |
| US9873907B2 (en) * | 2013-05-29 | 2018-01-23 | Agilent Technologies, Inc. | Method for fragmenting genomic DNA using CAS9 |
| US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
| US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
| US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
| US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
| US9068179B1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-30 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting presenilin point mutations |
| SG11201702066UA (en) | 2014-07-21 | 2017-04-27 | Illumina Inc | Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems |
| AU2015298571B2 (en) | 2014-07-30 | 2020-09-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
| DK3218513T3 (en) * | 2014-11-11 | 2019-02-04 | Illumina Inc | Polynucleotide amplification using CRISPR-CAS systems |
| KR20160103953A (ko) * | 2015-02-25 | 2016-09-02 | 연세대학교 산학협력단 | Crispr 시스템을 이용한 다중 위치 염기서열의 동시 포획 방법 |
| CN108513575A (zh) | 2015-10-23 | 2018-09-07 | 哈佛大学的校长及成员们 | 核碱基编辑器及其用途 |
| WO2017090543A1 (ja) * | 2015-11-27 | 2017-06-01 | 国立大学法人大阪大学 | Ｄｎａ間相互作用の解析方法 |
| CN109415727A (zh) * | 2016-06-13 | 2019-03-01 | 格里尔公司 | 富集突变的无细胞核酸以供癌症检测的方法 |
| WO2018027078A1 (en) | 2016-08-03 | 2018-02-08 | President And Fellows Of Harard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| CA3033327A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| US11046995B2 (en) | 2016-08-16 | 2021-06-29 | The Regents Of The University Of California | Method for finding low abundance sequences by hybridization (FLASH) |
| WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| GB201616590D0 (en) | 2016-09-29 | 2016-11-16 | Oxford Nanopore Technologies Limited | Method |
| KR20240007715A (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-16 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| JP2020510439A (ja) | 2017-03-10 | 2020-04-09 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | シトシンからグアニンへの塩基編集因子 |
| SG11201908658TA (en) | 2017-03-23 | 2019-10-30 | Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins |
| US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
| US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
| CN111757937A (zh) | 2017-10-16 | 2020-10-09 | 布罗德研究所股份有限公司 | 腺苷碱基编辑器的用途 |
| US11680261B2 (en) | 2018-11-15 | 2023-06-20 | Grail, Inc. | Needle-based devices and methods for in vivo diagnostics of disease conditions |
| DE112020001342T5 (de) | 2019-03-19 | 2022-01-13 | President and Fellows of Harvard College | Verfahren und Zusammensetzungen zum Editing von Nukleotidsequenzen |
| EP4146804A1 (en) | 2020-05-08 | 2023-03-15 | The Broad Institute Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6140466A (en) | 1994-01-18 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
| US6242568B1 (en) | 1994-01-18 | 2001-06-05 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
| GB9824544D0 (en) | 1998-11-09 | 1999-01-06 | Medical Res Council | Screening system |
| JP4118327B2 (ja) | 1994-08-20 | 2008-07-16 | ゲンダック・リミテッド | Ｄｎａ認識のための結合タンパク質におけるまたはそれに関連する改良 |
| US5789538A (en) | 1995-02-03 | 1998-08-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities |
| US5925523A (en) | 1996-08-23 | 1999-07-20 | President & Fellows Of Harvard College | Intraction trap assay, reagents and uses thereof |
| GB9703369D0 (en) | 1997-02-18 | 1997-04-09 | Lindqvist Bjorn H | Process |
| GB2338237B (en) | 1997-02-18 | 2001-02-28 | Actinova Ltd | In vitro peptide or protein expression library |
| GB9710809D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
| US6410248B1 (en) | 1998-01-30 | 2002-06-25 | Massachusetts Institute Of Technology | General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites |
| US20030044787A1 (en) | 2000-05-16 | 2003-03-06 | Joung J. Keith | Methods and compositions for interaction trap assays |
| GB0312676D0 (en) | 2003-06-02 | 2003-07-09 | Babraham Inst | Binding assay |
| DK2191016T3 (en) | 2007-08-20 | 2015-06-08 | Gen Hospital Corp | INSULATION OF PROTEIN FACTORS BINDING DIRECT OR INDIRECT WITH NUCLEIC ACIDS |
| JP2009019762A (ja) | 2008-05-23 | 2009-01-29 | Hitachi Kokusai Electric Inc | 断熱壁体の製造方法 |
| EP2206723A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
| US20110239315A1 (en) | 2009-01-12 | 2011-09-29 | Ulla Bonas | Modular dna-binding domains and methods of use |
| WO2010093860A2 (en) | 2009-02-13 | 2010-08-19 | The General Hospital Corporation | Isolation of factors that associate directly or indirectly with chromatin |
| JP5413924B2 (ja) * | 2009-08-21 | 2014-02-12 | 国立大学法人大阪大学 | 特定ゲノム領域の単離方法 |
| DK3401400T3 (da) * | 2012-05-25 | 2019-06-03 | Univ California | Fremgangsmåder og sammensætninger til rna-styret mål-dna-modifikation og til rna-styret transskriptionsmodulering |
| US8697359B1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
-
2013
- 2013-09-06 EP EP13875109.4A patent/EP2963113B1/en active Active
- 2013-09-06 PL PL13875109T patent/PL2963113T3/pl unknown
- 2013-09-06 JP JP2015500088A patent/JP5954808B2/ja active Active
- 2013-09-06 ES ES13875109T patent/ES2768291T3/es active Active
- 2013-09-06 DK DK13875109.4T patent/DK2963113T3/da active
- 2013-09-06 WO PCT/JP2013/074107 patent/WO2014125668A1/ja active Application Filing
- 2013-09-06 PT PT138751094T patent/PT2963113T/pt unknown
- 2013-09-06 US US14/767,068 patent/US11466306B2/en active Active
-
2022
- 2022-08-31 US US17/823,685 patent/US20230046749A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2963113B1 (en) | 2019-11-06 |
| EP2963113A4 (en) | 2016-12-07 |
| JP5954808B2 (ja) | 2016-07-20 |
| PL2963113T3 (pl) | 2020-07-13 |
| ES2768291T3 (es) | 2020-06-22 |
| US11466306B2 (en) | 2022-10-11 |
| EP2963113A1 (en) | 2016-01-06 |
| DK2963113T3 (da) | 2020-02-17 |
| WO2014125668A1 (ja) | 2014-08-21 |
| US20160138081A1 (en) | 2016-05-19 |
| PT2963113T (pt) | 2020-02-14 |
| US20230046749A1 (en) | 2023-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5954808B2 (ja) | 内在性ｄｎａ配列特異的結合分子を用いる特定ゲノム領域の単離方法 | |
| US11434262B2 (en) | Transcription activator-like effectors | |
| CN108368540B (zh) | 研究核酸的方法 | |
| Singh et al. | RIPiT-Seq: a high-throughput approach for footprinting RNA: protein complexes | |
| Wang et al. | CLIP: construction of cDNA libraries for high-throughput sequencing from RNAs cross-linked to proteins in vivo | |
| EP3526326A1 (en) | Novel engineered and chimeric nucleases | |
| EP2505666B1 (en) | Methods and compositions for enriching either target polynucleotides or non-target polynucleotides from a mixture of target and non-target polynucleotides | |
| US20140038241A1 (en) | Genomic enrichment method, composition, and reagent kit | |
| Cotten et al. | Selection of proteins with desired properties from natural proteome libraries using mRNA display | |
| Cui et al. | Allosteric inhibition of CRISPR-Cas9 by bacteriophage-derived peptides | |
| JP5413924B2 (ja) | 特定ゲノム領域の単離方法 | |
| US20230365637A1 (en) | Identification of pax3-foxo1 binding genomic regions | |
| US20240125783A1 (en) | Detection of molecular associations | |
| US20080248958A1 (en) | System for pulling out regulatory elements in vitro | |
| WO2017090543A1 (ja) | Ｄｎａ間相互作用の解析方法 | |
| US11053553B2 (en) | Detection of CLDN18-ARHGAP6 fusion gene or CLDN18-ARHGAP26 fusion gene in pancreatic cancer | |
| JP6502854B2 (ja) | ポリユビキチン化基質の同定方法 | |
| Nascimento et al. | Essential PBP1-associated proteins of Trypanosoma brucei | |
| Nair et al. | An aptamer-based mRNA affinity purification procedure (RaPID) for the identification of associated RNAs (RaPID-seq) and proteins (RaPID-MS) in yeast | |
| JP2019030226A (ja) | ゲノムｄｎａ−ポリペプチド複合体、又はそれに含まれるゲノムｄｎａおよび／もしくはポリペプチドを単離又は解析する方法 | |
| Serdar | The Functional Relationship between the Nonsense-Mediated mRNA Decay Pathway and the Prematurely Terminating Ribosome | |
| Fujita et al. | In vitro Engineered DNA-binding Molecule-mediated Chromatin Immunoprecipitation (in vitro enChIP) Using CRISPR Ribonucleoproteins in Combination with Next-generation Sequencing (in vitro enChIP-Seq) for the Identification of Chromosomal Interactions | |
| WO2024073414A2 (en) | Programmable nuclease-peptidase compositions | |
| WO2024137771A1 (en) | Methods and compositions for in situ identification of protein-nucleic acid interaction sites | |
| WO2023215751A1 (en) | Programmable nuclease-peptidase compositions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160510 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160608 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5954808 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |