JP2023156339A - 機能的なヌクレアーゼのための送達システム - Google Patents

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R Liu David
ズリス，ジョン，アンソニー
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トンプソン，デービッド，ビー．
B Thompson David
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Abstract

【課題】細胞内生体分子をターゲット化するために細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を送達するためのより良好な送達システムを提供する。【解決手段】機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質を含む組成物であって、超荷電蛋白質が、その対応する未改変蛋白質よりも大きくかつ充分量である正の総電荷を有し、細胞内への透過のために処方される、前記組成物を提供する。前記機能的なエフェクター蛋白質は、限定無しに、転写調節因子（例えば、抑制因子または活性化因子）、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡによってプログラミング可能なヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９蛋白質、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ）、デアミナーゼ、および他の遺伝子改変／編集酵素を包含する。【選択図】なし

Description

関連出願
本願は、２０１４年８月１８日出願のＵ．Ｓ．出願U.S.S.N.14/462,189および２０１４年８月１８日出願のＵ．Ｓ．出願U.S.S.N.14/462,163の米国特許法第３６５条（ｃ）の下で優先権を主張し、かつ２０１３年９月６日出願のＵ．Ｓ．仮特許出願U.S.S.N.61/874,746の米国特許法第１１９条（ｅ）の下で優先権をもまた主張し、そのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。
発明の背景
哺乳類細胞内への高分子送達は細胞操作のための魅力的な手法である。なぜなら、それは遺伝子発現の調節およびゲノムの改変を可能とし、翻って研究の新たな道を拓き、低分子による「新薬の開発につながらない」と現行では見られている分子の治療用のターゲット化を可能にするであろうからである。特に、疾患と結びついた遺伝子またはアレルをターゲット化する組み換えヌクレアーゼは、治療薬として大きな可能性を有する。高分子送達の現行の方法は、核酸分子のウイルス送達、核酸または蛋白質の受容体によって媒介される送達、および蛋白質の送達のためのＴＡＴ、Ａｒｇ９、またはペネトラチンなどの細胞透過ペプチドとの蛋白質融合体の使用を包含する。それらの送達システムのそれぞれは特定の応用に利益を提供する。しかしながら、大部分の場合では、有効性、細胞毒性、および調製の容易さに関する問題が残っている。有意な細胞毒性または他の有害な副作用無しに種々の細胞株に高分子（例えば、機能的なエフェクター蛋白質）を有効に送達することができる容易に調製される試薬は、相当の課題のまま残っている。
大部分の蛋白質は哺乳類細胞に自発的には入らず、それゆえに、研究ツールとしてのそれらの使用および治療薬としてのそれらの可能性は天然には限定される。哺乳類細胞内への蛋白質の送達のための技術が、細胞内ターゲットに対処するために最近になって開発された。それらの技術は、脂質に基づく試薬（Zelphati et al., J. Biol. Chem. 276, 35103-35110, 2001）、ナノ粒子（Hasadsri et al., J. Biol. Chem., 2009）、ヴォールトリボヌクレオ蛋白質粒子（Lai et al., ACS Nano 3, 691-699, 2009）、受容体リガンドへの遺伝学的または化学的融合（Gabel et al., J. Cell Biol. 103, 1817-1827, 1986、Rizk et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 11011-11015, 2009）、および細胞透過ペプチドへの融合（Wadia et al., Curr. Protein Pept. Sci. 4, 97-104, 2003、Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009）の使用を包含する。恐らく、蛋白質送達のための最も普通の方法は、ＨＩＶ－１のＴａｔ（転写のトランス活性化因子）ペプチドおよびポリアルギニンペプチドを包含する蛋白質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）への遺伝学的融合である。これらのカチオン性ＰＴＤは、外来性蛋白質の負に荷電した細胞表面構造との結びつきおよびその後のエンドサイトーシスを促進する。Ｔａｔおよびポリアルギニンは両方とも、インビトロおよびインビボの両方の細胞内に種々の高分子を送達するために用いられて来た（Wadia et al., Curr. Protein Pept. Sci. 4, 97-104, 2003、Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009、Myou et al, J. Immunol. 169, 2670-2676, 2002、Bae et al., Clin. Exp. Immunol. 157, 128-138, 2009、Schwarze et al., Science 285, 1569-1572, 1999）。これらの進歩にもかかわらず、細胞内ターゲットは外来性蛋白質を用いて影響を及ぼすことが困難なまま残っている。わずかな成功でさえも、蛋白質が細胞内に機能的に送達される低い効率が原因で、それぞれの形質導入剤の有毒な濃度を要求し得る（Zhou et al., Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009、Wang et al., Nat. Biotechnol. 26, 901-908, 2008）。そのため、細胞内生体分子をターゲット化するために細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を入らせるためのより良好な送達システムの必要が残っている。
本開示は、超荷電（supercharged）蛋白質（例えば、正に荷電した超荷電蛋白質）、カチオン性ポリマー、またはカチオン性脂質を用いて、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質（例えば、核酸に結合する部位特異的な蛋白質など）を送達するための新規のシステム、組成物、調製物、キット、および関連する方法を提供する。いくつかの態様において、ヌクレアーゼはＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＲＮＡによってプログラミング可能な（RNA-programmable）ヌクレアーゼもしくは操作されたＲＮＡによってプログラミング可能なゲノム編集酵素（例えば、Ｃａｓ９およびそのバリアントまたは融合体）、またはジンクフィンガーヌクレアーゼである。いくつかの態様において、転写因子はＴＡＬＥ転写活性化因子または抑制因子である。いくつかの態様において、エフェクター蛋白質はリコンビナーゼである。本明細書により詳細に記載される通り、機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）を正に荷電した超荷電蛋白質と融合することまたは結びつけることは、細胞の内部への蛋白質の送達を可能とし、例えば遺伝子発現またはゲノム改変に影響を及ぼす。機能的なエフェクター蛋白質を負に荷電した超荷電蛋白質と融合することまたは結びつけることは、蛋白質がカチオン性脂質またはカチオン性ポリマーと結びつくことを可能とし、これが細胞の内部への蛋白質の強力な送達を提供するということもまた見いだされた。さらに、天然に負に荷電している機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ＶＰ６４転写活性化因子、アニオン性３×ＦＬＡＧペプチドタグ、およびその融合体）または本来負に荷電している核酸（例えばガイドＲＮＡ、「ｇＲＮＡ」）と結びつく機能的なエフェクター蛋白質（例えば、Ｃａｓ９蛋白質ならびにそのバリアントおよび融合体）は、（例えば、超荷電蛋白質の非存在下において）細胞への送達のためのカチオン性脂質またはカチオン性ポリマーと結びつき得る。
エフェクター蛋白質の送達は細胞外ターゲットについては有効だと判明している一方で、細胞内ターゲットに対処するためのそれらの使用は、大部分の蛋白質が自発的に哺乳類細胞に入ることができないことが原因で、比較的未開発である。外来性蛋白質が細胞内ターゲットにアクセスすることを可能にすることは、化学的トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはウイルス送達を通じたそれらのコードＤＮＡ配列の送達によって、最も普通には達成される。しかしながら、細胞内への外来性ＤＮＡの導入は、ゲノム中への永久的な組み換え、内在性遺伝子の可能性ある破壊、およびコードされる薬剤に対する長期暴露の可能性を生ずる。いくつかの研究または治療応用（ゲノムＤＮＡの一度きりの永久的な改変を実現しようとするゲノム編集応用を包含する）のためには、複製不能な蛋白質薬剤の機能的な送達は、改善された安全性およびより幅広い応用性を提供し得る。さらに、脂質およびポリマーなどのカチオン性化合物を用いる蛋白質の送達は技術的に難しいまま残っており、かつ多くの場合で細胞毒性を誘導する一方で、本明細書において提供される組成物および方法を用いると、ある種の機能的なエフェクター蛋白質（例えば、Ｃａｓ９蛋白質ならびにそのバリアントおよび融合体、リコンビナーゼ、転写活性化因子／抑制因子など）が細胞に送達され得て、毒性が無いかまたは最小限の毒性が有り、いくつかの場合では、効率の有意な改善と低減されたオフターゲット効果とを有するゲノム改変を媒介するということが、驚くべきことに見いだされた。例えば、例７に記載される通り、カチオン性脂質によるＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体の送達は高度に効率的であり（単一の処置から、培養ヒト細胞の８０％までの改変）、プラスミドトランスフェクションと比較してより高いゲノム改変特異性をもまた誘導し、典型的には＞１０倍高いオンターゲット：オフターゲットＤＮＡ改変比をヒト細胞においてもたらす。
従って、１つの側面において、超荷電蛋白質が用いられて、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質（例えばヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、Ｃａｓ９蛋白質（その融合体およびバリアントを包含する）など）を送達する。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、対応する未改変蛋白質と比較してその総表面電荷の増大を示すように操作されている。他の態様において、超荷電蛋白質は、対応する未改変蛋白質と比較してその総表面電荷の減少を示すように操作されている。他の態様において、本開示の文脈で用いられる超荷電蛋白質は、天然に存在する超荷電蛋白質である。超荷電蛋白質は、共有結合的なまたは非共有結合的な相互作用を介して、送達されるべき蛋白質と結びつけられ得る。いずれかの特定の理論によって束縛されることを求めるものではないが、ｇＲＮＡと結びついたＣａｓ９蛋白質、バリアント、または融合蛋白質は正味の負電荷を有し、正に荷電した超荷電蛋白質との結びつきを容易にする。ある種の態様において、超荷電蛋白質と結びついた機能的なエフェクター蛋白質は、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とさらに結びついて、細胞内への送達に好適な組成物を形成する。好適な操作されたまたは天然に存在する超荷電蛋白質の例は国際ＰＣＴ特許出願PCT/US07/70254（２００７年６月１日出願、２００７年１２月１３日にWO2007/143574として公開）、国際ＰＣＴ出願PCT/US09/041984（２００９年４月２８日出願、２００９年１１月５日にWO2009/134808として公開）、および国際ＰＣＴ出願PCT/US10/001250（２０１０年４月２８日出願、２０１０年１１月１１日にWO2010/129023として公開）に記載されており、そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。細胞にヌクレアーゼを送達することへの使用のための超荷電蛋白質のさらなる例が本明細書に記載される。好適な機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼおよびＲＮＡによってプログラミング可能なエフェクター蛋白質、例えばＣａｓ９蛋白質）の追加の例は、「Engineered Transcription Activator-Like Effector (TALE) Domains and Uses Thereof」と題する２０１３年８月２２日出願のＵ．Ｓ．仮特許出願U.S.S.N.61/868,846、「Cas9 Variants and Uses Thereof」と題する2013年９月６日出願のＵ．Ｓ．仮特許出願U.S.S.N.61/874,609、「Switchable Cas9 Nucleases and Uses Thereof」と題する２０１３年９月６日出願のＵ．Ｓ．仮特許出願U.S.S.N.61/874,682、「Engineered Transcription Activator-Like Effector (TALE) Domains and Uses Thereof」と題する２０１４年６月２０日出願のＵ．Ｓ．非仮出願U.S.S.N.14/320,519、「Cas9-FokI Fusion Proteins And Uses Thereof」と題する２０１４年６月３０日出願のＵ．Ｓ．非仮出願U.S.S.N.14/320,498、「Cas9-Recombinase Fusion Proteins And Uses Thereof」と題する２０１４年６月３０日出願のＵ．Ｓ．非仮出願U.S.S.N.14/320,467、「Switchable gRNAs Comprising Aptamers」と題する２０１４年７月８日出願のＵ．Ｓ．非仮出願U.S.S.N.14/326,329、「mRNA-Sensing Switchable gRNAs」と題する２０１４年７月８日出願のＵ．Ｓ．非仮出願U.S.S.N.14/326,340、「Extended DNA-Sensing gRNAs」と題する２０１４年７月８日出願のＵ．Ｓ．非仮出願U.S.S.N.14/326,361、「Fusions Of Cas9 Domains And Nucleic Acid-Editing Domains」と題する２０１４年７月８日出願のＵ．Ｓ．非仮出願U.S.S.N.14/325,815、「Methods For Nucleic Acid Editing」と題する２０１４年７月８日出願のＵ．Ｓ．非仮出願U.S.S.N.14/326,109、「Methods For Correcting PI3K Point Mutations」と題する２０１４年７月８日出願のＵ．Ｓ．非仮出願U.S.S.N.14/326,140、「Methods For Correcting Presenilin Point Mutations」と題する２０１４年７月９日出願のＵ．Ｓ．非仮出願U.S.S.N.14/326,269、「Methods For Correcting α-Antitrypsin Point Mutations」と題する２０１４年７月８日出願のＵ．Ｓ．非仮出願U.S.S.N.14/326,290、「Methods For Correcting Von Willebrand Factor Point Mutations」と題する２０１４年７月８日出願のＵ．Ｓ．非仮出願U.S.S.N.14/326,318、「Methods For Correcting Caspase-9 Point Mutations」と題する２０１４年７月８日出願のＵ．Ｓ．非仮出願U.S.S.N.14/326,303、および「Cas9 Proteins Including Ligand-Dependent Inteins」と題するＵ．Ｓ．仮出願U.S.S.N.62/030,943に記載されており、そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、操作されたまたは天然に存在する超荷電蛋白質は正に荷電する。他の態様（例えば、カチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマーを用いるある種のエフェクター蛋白質の送達が関わるもの）において、超荷電蛋白質は負に荷電する。ある種の態様において、超正荷電または超負荷電蛋白質はエフェクター蛋白質と非共有結合的に結びつけられる。その代わりに、超正荷電または超負荷電蛋白質はエフェクター蛋白質に共有結合し得る。いくつかの態様において、エフェクター蛋白質は超荷電蛋白質に融合する。ある種の態様において、もたらされる融合蛋白質は、超荷電蛋白質とエフェクター蛋白質との間にリンカー（例えば切断可能なリンカー）を含む。
本開示のいくつかの側面は、機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）と結びついた超荷電蛋白質を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物はカチオン性脂質をさらに含む。いくつかの態様において、組成物はカチオン性ポリマーをさらに含む。いくつかの態様において、組成物は、緩衝液または賦形剤をさらに含む。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、その対応する未改変蛋白質よりも大きくかつ充分な量である正の総電荷を有し、細胞への送達および透過のために処方される。他の態様（例えばカチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマーを用いるある種のエフェクター蛋白質の送達が関わるもの）において、超荷電蛋白質は、その対応する未改変蛋白質よりも大きい負の総電荷を有する。いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質は部位特異的な酵素、例えばヌクレアーゼ、Ｃａｓ９蛋白質、リコンビナーゼなどである。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は野生型Ｃａｓ９蛋白質、Ｃａｓ９ニッカーゼであるか、またはヌクレアーゼ不活性型（ｄＣａｓ９）蛋白質を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はｄＣａｓ９を含む融合蛋白質である。いくつかの態様において、融合蛋白質は、転写活性化因子（例えばＶＰ６４）、転写抑制因子（例えば、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ）、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）、リコンビナーゼドメイン（例えば、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、またはＴｎ３）、デアミナーゼ（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ）、またはエピジェネティック修飾因子ドメイン（例えば、ＴＥＴ１）を含む。ヌクレアーゼが関わるいくつかの態様において、ヌクレアーゼはＴＡＬＥヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは核酸配列に特異的に結合して切断する。いくつかの態様において、ターゲット化される核酸配列は、治療ターゲットである遺伝子（例えば、疾患の処置において不活性化することが望ましい遺伝子）の配列である。いくつかの態様において、ターゲット化される核酸配列はＰＲＤＭ１６、ＰＰＡＲγ、ＶＥＧＦ－Ａ、Ｏｃｔ－４、ＰＩ３Ｋ、プレセニリン、α－アンチトリプシン、フォン・ヴィレブランド因子、またはカスパーゼ－９遺伝子配列である。
いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質は転写因子である。いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質はＴＡＬＥ転写活性化因子または抑制因子である。いくつかの態様において、転写因子、転写活性化因子、または転写抑制因子は遺伝子に特異的に結合し、活性化または抑制する。いくつかの態様において、遺伝子は治療ターゲットである。いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質はＴＡＬＥエフェクターである。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は機能的なエフェクター蛋白質に共有結合し、それゆえに融合蛋白質を形成する。いくつかの態様において、超荷電蛋白質はリンカーを介して機能的なエフェクター蛋白質と結びつく。いくつかの態様において、リンカーは切断可能なリンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、ＵＶによって切断可能なリンカーまたはリソソーム酵素によって切断されるリンカーである。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は機能的なエフェクター蛋白質と非共有結合的に結びつき、それゆえに複合体を形成する。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は正味の正の総電荷を有する。他の態様において、超荷電蛋白質は正味の負の総電荷を有し、蛋白質（単数または複数）はカチオン性脂質と結びつく。他の態様において、超荷電蛋白質は正味の負の総電荷を有し、蛋白質（単数または複数）はカチオン性ポリマーと結びつく。いくつかの態様において、正味の正の総電荷は約＋５～約＋４０であるか、または正味の負の総電荷は約－５～約－５０である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、その対応する未改変蛋白質よりも生理ｐＨにおいて多く正に荷電するかまたは負に荷電する。いくつかの態様において、対応する未改変蛋白質は天然に存在する蛋白質である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、その対応する未改変蛋白質よりも生理ｐＨにおいて少なくとも＋５多く正にまたは少なくとも－５多く負に荷電する。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は蛍光蛋白質である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は超正荷電ＧＦＰである。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は超正荷電ＧＦＰ（＋３６ＧＦＰ）であり、配列：
GGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK（配列番号１）
の少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基を含む。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、配列番号１に示されているアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、配列番号１に示されているアミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、組成物は医薬組成物である。いくつかの態様において、組成物は薬学的に許容可能な賦形剤を含む。いくつかの態様において、組成物は対象への投与のために処方され、対象の少なくとも１つの細胞への送達に有効な量で超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質を含む。いくつかの態様において、組成物は、対象への投与後に測定可能な治療効果を誘導するための有効な量で、超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質を含む。
本開示のいくつかの側面は、ｇＲＮＡおよびカチオン性脂質と結びついたＣａｓ９蛋白質を含む組成物を提供する。Ｃａｓ９蛋白質がｇＲＮＡと結びついたときに、複合体はカチオン性脂質によって封入されて細胞に有効に送達され得るということが、驚くべきことに見いだされた。これは、超荷電蛋白質有りまたは無しで成就され得る。いくつかの態様において、組成物は、負の超荷電蛋白質（例えば超負荷電ＧＦＰ）およびカチオン性脂質と結びついたＣａｓ９蛋白質を含み、これもまた細胞への成功した送達を可能にする。いくつかの態様において、組成物は、細胞の集団に送達されたときに低い毒性を示す。例えば、細胞の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、組成物の投与後に生存可能である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は野生型Ｃａｓ９蛋白質、Ｃａｓ９ニッカーゼであるか、またはヌクレアーゼ不活性型（ｄＣａｓ９）蛋白質を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はｄＣａｓ９を含む融合蛋白質である。いくつかの態様において、融合蛋白質は、転写活性化因子（例えば、ＶＰ６４）、転写抑制因子（例えばＫＲＡＢ、ＳＩＤ）、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）、リコンビナーゼドメイン（例えばＨｉｎ、Ｇｉｎ、またはＴｎ３）、デアミナーゼ（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ）、またはエピジェネティック修飾因子ドメイン（例えばＴＥＴ１）を含む。
本開示の他の側面は、ｇＲＮＡおよびカチオン性ポリマーと結びついたＣａｓ９蛋白質を含む組成物を提供する。カチオン性脂質と同じく、Ｃａｓ９蛋白質がｇＲＮＡと結びついたときには、複合体はカチオン性ポリマーと結びついて細胞に有効に送達され得る。これは、超荷電蛋白質有りまたは無しで成就され得る。いくつかの態様において、組成物は、負の超荷電蛋白質（例えば、超負荷電ＧＦＰ）およびカチオン性ポリマーと結びついたＣａｓ９蛋白質を含み、これもまた細胞への成功した送達を可能にする。いくつかの態様において、組成物は、細胞の集団に送達されたときに低い毒性を示す。例えば細胞の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、組成物の投与後に生存可能である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は野生型Ｃａｓ９蛋白質、Ｃａｓ９ニッカーゼであるか、またはヌクレアーゼ不活性型（ｄＣａｓ９）蛋白質を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はｄＣａｓ９を含む融合蛋白質である。いくつかの態様において、融合蛋白質は、転写活性化因子（例えば、ＶＰ６４）、転写抑制因子（例えば、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ）、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）、リコンビナーゼドメイン（例えば、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、またはＴｎ３）、デアミナーゼ（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ）、またはエピジェネティック修飾因子ドメイン（例えば、ＬＳＤ１、ＴＥＴ１）を含む。
本開示のいくつかの側面は、対象に本明細書において提供される組成物を投与するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、対象に本明細書に記載される組成物を投与することを含む。いくつかの態様において、対象は、疾患、障害、または状態の１つもしくは２つ以上の症状を患いやすいか、それを患っているか、またはそれを示す。いくつかの態様において、組成物は、投与の結果として少なくとも１つの兆候または症状が回復するための充分な量および好適な条件で、対象に投与される。いくつかの態様において、投与するステップは、機能的なエフェクター蛋白質が対象の細胞に透過するために充分な条件で実施される。いくつかの態様において、疾患、障害、または状態は、ｍＲＮＡ、蛋白質、またはその組み合わせの異常に高まったレベルと結びついている。いくつかの態様において、組成物は、ゲノム配列（例えば、正常なまたは病原性のアレル、疾患の患いやすさまたは始まりもしくは進行と結びついた遺伝子、病原性のＲＮＡまたは蛋白質をコードする遺伝子、あるいは、疾患細胞または組織において異常に高いレベルで発現されるＲＮＡまたは蛋白質をコードする遺伝子）に特異的に結合して切断するヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、投与するステップは、経口、静脈内、筋内、動脈内、皮下、脳室内、局所、吸入、および粘膜送達からなる群から選択される投与経路を含む。
本開示のいくつかの側面は、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を導入するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、機能的なエフェクター蛋白質が細胞に入るための好適な条件で、本明細書に記載される超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質を含む組成物と細胞を接触させることを含み、それによって細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を導入する。いくつかの態様において、方法は、Ｃａｓ９蛋白質が細胞に入るための好適な条件で、Ｃａｓ９蛋白質とカチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマーとを含む組成物と細胞を接触させることを含み、それによって細胞内にＣａｓ９蛋白質を導入する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は細胞の核に入る。例えば、Ｃａｓ９蛋白質は、蛋白質中に核局在シグナル（ＮＬＳ）を包含することによって核に導かれる。いくつかの態様において、方法は、機能的なエフェクター蛋白質（例えばＣａｓ９を包含する）が細胞に透過したことを確認することをさらに含む。いくつかの態様において、細胞は対象内にあり、接触はインビボでなされる。いくつかの態様において、対象は、遺伝子の異常な発現レベルと結びついた疾患を有するかまたは発症するリスクがあると診断され、機能的なエフェクター蛋白質（例えばＣａｓ９を包含する）が遺伝子の発現レベルを調節する。いくつかの態様において、方法は、遺伝子の発現のレベルの変化を検出することまたは対象の治療応答を検出することをさらに含む。いくつかの態様において、細胞は体細胞である。いくつかの態様において、細胞は、望まれる細胞運命への細胞のプログラミングを誘導するための充分な量、時間、および条件で組成物または医薬組成物と接触させられる。いくつかの態様において、方法は、細胞補充治療手法にプログラミングされた細胞を用いることをさらに含む。いくつかの態様において、細胞は、疾患と結びついたゲノムアレルを持っている細胞であり、機能的なエフェクター蛋白質はアレルを特異的にターゲット化する。いくつかの態様において、細胞はエクスビボで接触させられ、機能的なエフェクター蛋白質による望まれないアレルの成功したターゲット化後に対象に再投与される。
本開示のいくつかの側面は、本明細書に記載される組成物（例えば、機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質を含む組成物）を含むキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、Ｃａｓ９蛋白質および超荷電蛋白質を含む。いくつかの態様において、キットは、Ｃａｓ９蛋白質およびカチオン性脂質を含む。いくつかの態様において、キットは、Ｃａｓ９蛋白質およびカチオン性ポリマーを含む。いくつかの態様において、キットは、キット中に包含される構成物を用いるための取扱説明書をさらに含む。
本発明のこれらおよび他の側面および態様、さらには様々な利点および有用性は、図面および本発明の詳細な記載に関してより明らかになるであろう。
定義
本明細書および特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別様に示さない限り、単数および複数の参照を包含する。それゆえに、例えば「薬剤」の参照は単一の薬剤および複数の薬剤を包含する。
用語「と結びつく」は、２つまたは３つ以上の部分（例えば、蛋白質または蛋白質ドメイン）の文脈で本明細書において用いられる場合、部分が、直接的にまたは連結剤として働く１つもしくは２つ以上の追加の部分を介して互いに物理的に結びつきまたは繋がって、充分に安定な構造を形成し、その結果、部分は、構造が用いられる条件で（例えば生理条件で）物理的に結びついたまま残るという事実を言う。超荷電蛋白質は、非共有結合的な相互作用（例えば、静電気的相互作用）を介して機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）と結びつき得る。ある種の態様において、超荷電蛋白質は静電気的相互作用を介して機能的なエフェクター蛋白質と結びついて、複合体を形成し得る。いくつかの態様において、より弱い相互作用の充分な数は、部分が種々の異なる条件で物理的に結びついたまま残っているために充分な安定性を提供し得る。ある種の態様において、超荷電蛋白質は、共有結合（例えば、アミド結合）を介して機能的なエフェクター蛋白質と結びつく。いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質は、ペプチド結合によって直接的にまたはリンカーを介して間接的に超荷電蛋白質と結びつく。
用語「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ９蛋白質またはその断片を含む、ＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９の活性もしくは不活性なＤＮＡ切断ドメインまたは部分的に不活性なＤＮＡ切断ドメイン（例えばＣａｓ９「ニッカーゼ」）および／あるいはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含む蛋白質）を言う。いくつかの態様において、用語「Ｃａｓ９」はＣａｓ９またはその断片を含む融合蛋白質を言う。
いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_015683.1、NC_017317.1）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_016782.1、NC_016786.1）、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_021284.1）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_017861.1）、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_021846.1）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_021314.1）、Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_018010.1）、Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓｌ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NC_018721.1）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：YP_820832.1）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：NP_472073.1）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：YP_002344900.1）、またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＣＢＩのＲｅｆ：YP_002342100.1）からのＣａｓ９を言う。
用語「カチオン性脂質」は、生理ｐＨにおいてカチオン性の（または正の）電荷を有する脂質を言う。カチオン性脂質は種々の形態をとり得、リポソームまたはミセルを包含するが、これに限定されない。本開示のある種の側面に有用なカチオン性脂質は当分野において公知であり、一般的に極性および非極性ドメインを両方含み、ポリアニオン（例えば核酸分子または負の超荷電蛋白質）に結合し、典型的には細胞内への核酸の送達を容易にすることが公知である。有用なカチオン性脂質の例は、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）スターバーストデンドリマー、Lipofectin（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥの組み合わせ）、Lipofectase、LIPOFECTAMINE（登録商標）（例えば、LIPOFECTAMINE（登録商標）2000、LIPOFECTAMINE（登録商標）3000、LIPOFECTAMINE（登録商標）RNAiMAX、LIPOFECTAMINE（登録商標）LTX)、SAINT-RED（Synvolux Therapeutics, Groningen Netherlands）、ＤＯＰＥ、Cytofectin（Gilead Sciences, Foster City, Calif.）、およびEufectin（JBL, San Luis Obispo, Calif.）を包含する。例示的なカチオン性リポソームは、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオールオキシ（dioleoloxy））－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオールオキシ（dioleoloxy））－プロピル］－Ν，Ν，Ν－トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）、３β－［Ν－（Ν’，Ν’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、２，３，－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）から作られ得る。カチオン性脂質は、細胞に核酸分子を送達するために当分野において用いられて来た（例えば、U.S.Pat.No.5,855,910、5,851,548、5,830,430、5,780,053、5,767,099、8,569,256、8,691,750、8,748,667、8,758,810、8,759,104、8,771,728、Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3176、Hope et al. 1998. Molecular Membrane Biology 15: 1参照）。加えて、他の脂質組成物もまた当分野において公知であり、例えばU.S.Pat.No.4,235,871、U.S.Pat.No.4,501,728、4,837,028、4,737,323において教示されるものを包含する。
用語「カチオン性ポリマー」は、本明細書において用いられる場合、正味の正電荷を有するポリマーを言う。カチオン性ポリマーは当分野において周知であり、Samal et al., Cationic polymers and their therapeutic potential. Chem Soc Rev. 2012 Nov 7;41(21):7147-94、公開Ｕ．Ｓ．特許出願U.S.2014/0141487A1、U.S.2014/0141094A1、U.S.2014/0044793A1、U.S.2014/0018404A1、U.S.2014/0005269A1、およびU.S.2013/0344117A1、ならびにU.S.Pat.No.8,709,466、8,728,526、8,759,103、および8,790,664に記載されているものを包含し、それぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。例示的なカチオン性ポリマーは、ポリアリルアミン（ＰＡＨ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）、ポリ（Ｌ－アルギニン）（ＰＬＡ）、ポリビニルアミンホモまたはコポリマー、ポリ（ビニルベンジル－トリ－Ｃ１－Ｃ４－アルキルアンモニウム塩）、脂肪族または芳香脂肪族ジハライドおよび脂肪族Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル－アルキレンジアミンのポリマー、ポリ（ビニルピリジン）またはポリ（ビニルピリジニウム塩）、ポリ（Ｎ，Ｎ－ジアリル－Ｎ，Ｎ－ジ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル－アンモニウムハライド）、四級化ジ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル－アミノエチルアクリレートまたはメタクリレートのホモまたはコポリマー、POLYQUAD（商標）、ポリアミノアミド、および同類を包含するが、これに限定されない。
用語「デアミナーゼ」は、脱アミノ反応を触媒する酵素を言う。いくつかの態様において、デアミナーゼはシチジンデアミナーゼであり、シチジンまたはデオキシシチジンからそれぞれウラシルまたはデオキシウラシルへの加水分解的な脱アミノを触媒する。
用語「有効量」は、本明細書において用いられる場合、望まれる生体応答を惹起するために充分である生物活性剤の量を言う。例えば、いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）の有効量は、検出可能な効果（例えば、ターゲット部位の切断、ターゲット部位の改変、遺伝子発現の調節など）を誘導するために充分である蛋白質の量を言い得る。かかる効果は好適なアッセイにおいて（例えば、無細胞系アッセイにおいて、またはターゲット細胞、組織、もしくは対象生物において）検出され得る。当業者によって認められるであろう通り、薬剤（例えば機能的なエフェクター蛋白質）の有効量は、例えば、望まれる生体応答、ターゲット化されるべき特定のアレル、ターゲット化されようとするゲノム、ターゲット部位、細胞、または組織、および用いられようとする超荷電蛋白質のようなさまざまな因子に依存して変わり得る。
用語「エフェクター蛋白質」は、細胞内に導入されたときに、細胞の生物学的機能を調節する蛋白質を言う（例えば、細胞内の核酸分子の改変（例えば、切断、脱アミノ、組み換えなど）、または調節（例えば、増大もしくは減少）細胞内の遺伝子の発現もしくは発現レベル）。
用語「操作された」は、本明細書において用いられる場合、ヒトによって設計、生成、調製、合成、および／または製造された蛋白質分子、複合体、物質、または実体を言う。従って、操作された産物は、天然に存在しない産物である。いくつかの態様において、操作された蛋白質または組成物（例えば、ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）などの機能的なエフェクター蛋白質と結びついた操作された超荷電蛋白質）は、特定の要件に合うかまたは特定の望まれる特徴を有するように（例えば、規定の正味電荷を有するように、興味あるターゲット配列に特異的に結合および／もしくは切断または改変するように、特定の最小限もしくは最大限の切断もしくは酵素活性を有するように、および／または特定の安定性を有するように）設計された超荷電蛋白質である。
用語「エピジェネティック修飾因子」は、本明細書において用いられる場合、ＤＮＡ（例えば染色体ＤＮＡ）のエピジェネティックな修飾をもたらす酵素活性を有する蛋白質またはその触媒ドメインを言う。エピジェネティックな修飾はＤＮＡメチル化および脱メチル化、ヒストン修飾（メチル化および脱メチル化（例えば、モノ、ジ、およびトリメチル化）、ヒストンアセチル化および脱アセチル化、さらにはヒストンユビキチン化、リン酸化、およびＳＵＭＯ化を包含する）を包含するが、これに限定されない。
用語「機能的な蛋白質」は、それが特徴づけられる特性および／または活性を示す形態にある蛋白質を言う。
用語「融合蛋白質」は、ペプチド結合を介して互いに結びつきそれゆえに単一のアミノ酸配列を形成する複数の異種蛋白質、蛋白質ドメイン、またはペプチド（例えば、超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質）を含む、蛋白質を言う。ある種の態様において、融合蛋白質は遺伝子によってコードされる。
用語「遺伝子」は、当分野において理解される通りのその意味を有する。用語「遺伝子」が遺伝子制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）および／またはイントロン配列を包含し得るということは当業者によって認められるであろう。遺伝子の定義が、蛋白質をコードせずにむしろ機能性ＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡｉ薬剤、リボザイム、ｔＲＮＡなど）をコードする核酸への参照を包含するということは、さらに認められるであろう。明確さの目的のために、本願において用いられる場合、用語「遺伝子」は、蛋白質をコードする核酸の部分を一般的に言うということが注意されるべきである。用語は制御配列を任意で包含し得、これは当業者には文脈から明確であろう。この定義は、蛋白質をコードしない発現単位への用語「遺伝子」の適用を除外することではなく、むしろ大部分の場合で、用語は、本文書において用いられる場合、蛋白質をコードする核酸を言うということを明確にすることを意図されている。
用語「単離された」は、（１）（天然においてか実験の設定においてかにかかわらず）当初生成したときにそれが結びついていた構成物の少なくともいくつかから分離された、ならびに／または（２）ヒトによって生成、調製、合成、および／もしくは製造された、分子、複合体、物質、または実体を言う。単離された物質および／または実体は、それらが当初結びついていた他の構成物の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％以上から分離されており得る。いくつかの態様において、単離された薬剤は約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％よりも純粋である。本明細書において用いられる場合、物質は、他の構成物を実質的に含まない場合に「純粋」である。
用語「リンカー」は、本明細書において用いられる場合、２つの分子または部分（例えば超荷電蛋白質およびヌクレアーゼ）を連結する化学基または分子を言う。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に配置されるかまたはそれらによってフランキング（脇に接続）され、共有結合を介して互いに繋がり、それゆえに２つを繋ぐ。いくつかの態様において、リンカーは一アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたは蛋白質）を含む。いくつかの態様において、リンカーは有機分子、基、ポリマー、または化学的部分である。いくつかの態様において、リンカーは切断可能なリンカーである。例えば、リンカーは、切断活性（例えば、ＵＶ光または加水分解酵素、例えばリソソームプロテアーゼ）に対する暴露によって切断され得る結合を含む。いくつかの態様において、リンカーはアミノ酸のいずれかのストレッチであり、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、または５１個以上のアミノ酸を有する。いくつかの態様において、ペプチドリンカーはトリペプチドＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒのリピート（反復）を含み、例えば配列（ＧＧＳ）ｎを含み、ｎは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個以上のリピートを表す。いくつかの態様において、リンカーは配列（ＧＧＳ）６（配列番号２）を含む。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは１６残基「ＸＴＥＮ」リンカーまたはそのバリアントである（例えば、Schellenberger et al. A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009)参照）。いくつかの態様において、ＸＴＥＮリンカーは配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号４）、またはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号５）を含む。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、ＶＰＦＬＬＥＰＤＮＩＮＧＫＴＣ（配列番号６）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号７）、ＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡ（配列番号８）、ＭＫＩＩＥＱＬＰＳＡ（配列番号９）、ＶＲＨＫＬＫＲＶＧＳ（配列番号１０）、ＧＨＧＴＧＳＴＧＳＧＳＳ（配列番号１１）、ＭＳＲＰＤＰＡ（配列番号１２）、またはＧＧＳＭ（配列番号１３）から選択される１つまたは２つ以上である。
用語「ヌクレアーゼ」は、本明細書において用いられる場合、核酸分子中のヌクレオチド残基を繋ぐホスホジエステル結合を切断することができる薬剤（例えば蛋白質または低分子）を言う。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは蛋白質（例えば、核酸分子に結合して、核酸分子中のヌクレオチド残基を繋ぐホスホジエステル結合を切断し得る酵素）である。ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内でホスホジエステル結合を切断するエンドヌクレアーゼ、またはポリヌクレオチド鎖の末端でホスホジエステル結合を切断するエキソヌクレアーゼであり得る。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは部位特異的ヌクレアーゼであり、特異的なヌクレオチド配列中の特異的なホスホジエステル結合を結合および／または切断し、これは本明細書において「認識配列」、「ヌクレアーゼターゲット部位」、または「ターゲット部位」ともまた言われる。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは一本鎖ターゲット部位を認識し、一方、他の態様において、ヌクレアーゼは二本鎖ターゲット部位（例えば二本鎖ＤＮＡターゲット部位）を認識する。多くの天然に存在するヌクレアーゼ（例えば、多くの天然に存在するＤＮＡ制限ヌクレアーゼ）のターゲット部位は当業者に周知である。多くの場合では、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えばＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、またはＢａｍＨＩ）は長さ４～１０塩基対のパリンドローム二本鎖ＤＮＡターゲット部位を認識し、ターゲット部位内の特異的な位置において２つのＤＮＡ鎖のそれぞれを切断する。いくつかのエンドヌクレアーゼは二本鎖核酸ターゲット部位を対称的に切断し、すなわち、両方の鎖を同じ位置で切断して、その結果、末端は塩基対形成したヌクレオチド（本明細書においては平滑末端ともまた言われる）を含む。他のエンドヌクレアーゼは二本鎖核酸ターゲット部位を非対称的に切断し、すなわち各鎖を異なる位置で切断して、その結果、末端は非対合ヌクレオチドを含む。二本鎖ＤＮＡ分子の末端の非対合ヌクレオチドは「オーバーハング」（例えば、非対合ヌクレオチド（単数または複数）がそれぞれのＤＮＡ鎖の５’または３’末端を形成するかどうかに依存して「５’オーバーハング」または「３’オーバーハング」）ともまた言われる。非対合ヌクレオチド（単数または複数）で終わる二本鎖ＤＮＡ分子末端は粘着末端ともまた言われる。なぜなら、それらは、相補的な非対合ヌクレオチド（単数または複数）を含む他の二本鎖ＤＮＡ分子末端に「粘着」し得るからである。ヌクレアーゼ蛋白質は、「結合ドメイン」（これは、核酸基質との蛋白質の相互作用を媒介する）と「切断ドメイン」（これは、核酸バックボーン中のホスホジエステル結合の切断を触媒する）とを典型的には含む。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ蛋白質は単量体形態で核酸分子に結合して切断し得、一方、他の態様において、ヌクレアーゼ蛋白質はターゲット核酸分子を切断するために二量体化または多量体化しなければならない。天然に存在するヌクレアーゼの結合ドメインおよび切断ドメイン、さらには、特異的なターゲット部位に結合するヌクレアーゼを作製するために組み合わせられ得るモジュール的な結合ドメインおよび切断ドメインは、当業者に周知である。例えば、転写活性化因子様エレメントが、望まれるターゲット部位に特異的に結合する結合ドメインとして用いられ、切断ドメイン（例えばＦｏｋＩの切断ドメイン）に融合またはコンジュゲーションされて、望まれるターゲット部位を切断する操作されたヌクレアーゼを作製し得る。
用語「核酸」および用語「核酸分子」は、本明細書において交換可能に用いられ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを含む化合物を言う。典型的には、ポリマー核酸、例えば３または４ヌクレオチド以上を含む核酸分子はリニアな分子であり、隣接したヌクレオチドがホスホジエステル結合を介して互いに連結される。いくつかの態様において、「核酸」は個体の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を言う。いくつかの態様において、「核酸」は、３つまたは４つ以上の個体のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を言う。本明細書において用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、少なくとも３ヌクレオチドのストリング）を言うために交換可能に用いられ得る。いくつかの態様において、「核酸」は、ＲＮＡ、さらには一および／または二本鎖ＤＮＡを包含する。核酸は、例えばゲノム、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、クロマチド、または他の天然に存在する核酸分子の文脈において、天然に存在し得る。他方で、核酸分子は、天然に存在しない分子、例えば組み換えＤＮＡもしくはＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノムもしくはその断片、または合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得、または天然に存在しないヌクレオチドもしくはヌクレオシドを包含しており得る。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または類似の用語は、核酸アナログ、すなわちホスホジエステルバックボーン以外を有するアナログを包含する。核酸は天然ソースから精製され得、組み換え発現システムを用いて生成されて任意で精製され得、化学合成などされ得る。適切なところでは、例えば化学合成された分子の場合では、核酸はヌクレオシドアナログ（例えば、化学的に改変された塩基または糖を有するアナログ）およびバックボーン改変を含み得る。核酸配列は、別様に示さない限り５’から３’方向に提出される。いくつかの態様において、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）、化学的に改変された塩基、生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化された塩基）、インターカレーション塩基、改変された糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、および／または改変されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるか、またはそれを含む。
用語「医薬組成物」は、本明細書において用いられる場合、例えば疾患または障害の処置の文脈において対象に投与され得る組成物を言う。いくつかの態様において、医薬組成物は、有効成分（例えば、ヌクレアーゼなどの機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質、または、例えば融合蛋白質の形態で超荷電蛋白質と機能的なエフェクター蛋白質とをコードする核酸）と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。
用語「生理ｐＨ」は、本明細書において用いられる場合、正常な非病的な（non-pathologic）細胞または対象に見いだされるｐＨ値を言う。いくつかの態様において、生理ｐＨはｐＨ５～８である。いくつかの態様において、生理ｐＨはｐＨ７～７．５、例えばｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、またはｐＨ７．５である。いくつかの態様において、生理ｐＨはｐＨ６．５～７．５である。いくつかの態様において、生理ｐＨはｐＨ５、ｐＨ５．５、ｐＨ６、ｐＨ６．５、ｐＨ７、ｐＨ７．５、またはｐＨ８である。
用語「予防」または「予防する」は、対象が疾患、障害、もしくは状態を発症する確率の減少を（予防無しの確率と比較して）もたらす、疾患、障害、もしくは状態を発症するリスクがある（例えば、コントロールの対象もしくは対象のコントロール群と比較して高まったリスクがあるか、または年齢をマッチングおよび／もしくは性別をマッチングした対象の平均リスクと比較して高まったリスクがある）対象の予防処置、および／または既に確定した障害のさらなる進展の阻害を言う。
用語「増殖性疾患」は、本明細書において用いられる場合、細胞または細胞集団が異常に高まった増殖比率を示すという点で、細胞または組織のホメオスタシスが乱されているいずれかの疾患を言う。増殖性疾患は、前新生物性の過形成状態および新生物疾患などの増殖亢進性疾患を包含する。新生物疾患は細胞の異常な増殖によって特徴づけられ、良性および悪性新生物を両方とも包含する。悪性新生物は癌ともまた言われる。
用語「蛋白質」は本明細書において「ペプチド」および「ポリペプチド」と交換可能に用いられ、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを言う。用語は、いずれかのサイズ、構造、または機能の蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドを言う。典型的には、蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは少なくとも３アミノ酸長であろう。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、個体の蛋白質または蛋白質の集まりを言い得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチド中のアミノ酸の１つまたは２つ以上は、例えば化学的実体（例えば、コンジュゲーション、官能化、または他の改変のための炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、リンカーなど）の追加によって改変され得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは単一の分子でもまたあり得るか、または多分子複合体であり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在する蛋白質またはペプチドの単に断片であり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在する、組み換え、もしくは合成、またはそのいずれかの組み合わせであり得る。蛋白質は異なるドメインを含み得、例えば、ＴＡＬＥエフェクター蛋白質は核酸結合ドメインとエフェクタードメイン（例えば、核酸切断ドメインまたは転写活性化因子もしくは抑制因子ドメイン）とを含み得る。いくつかの態様において、蛋白質は蛋白質性部分（例えば、核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列）と有機化合物（例えば、核酸切断薬剤として作用し得る化合物）とを含む。
用語「ＲＮＡによってプログラミング可能なヌクレアーゼ」および「ＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼ」は本明細書において交換可能に用いられ、切断のターゲットではない１つまたは２つ以上のＲＮＡ分子と複合体を形成する（例えば、結合するかまたは結びつく）ヌクレアーゼを言う。いくつかの態様において、ＲＮＡによってプログラミング可能なヌクレアーゼは、ＲＮＡとの複合体であるときに、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体と言われ得る。ＲＮＡによってプログラミング可能なヌクレアーゼはＣａｓ９を包含する。典型的には、結合したＲＮＡ（単数または複数）はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と言われる。ｇＲＮＡは、２つもしくは３つ以上のＲＮＡの複合体としてまたは単一のＲＮＡ分子として存在し得る。単一のＲＮＡ分子として存在するｇＲＮＡはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と言われ得るが、「ｇＲＮＡ」は、単一の分子としてまたは２つもしくは３つ以上の分子の複合体としていずれかで存在するガイドＲＮＡを言うために交換可能に用いられる。典型的には、単一のＲＮＡ種として存在するｇＲＮＡは、２つのドメイン（１）ターゲット核酸に対する相同性を共有する（例えば、そしてターゲットへのＣａｓ９複合体の結合を導く）ドメインと（２）Ｃａｓ９蛋白質に結合するドメインとを含む。ｇＲＮＡはターゲット部位を相補するヌクレオチド配列を含み、これが、そのターゲット部位へのヌクレアーゼ／ＲＮＡ複合体の結合を媒介し、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体の配列特異性を提供する。
用語「リコンビナーゼ」は、本明細書において用いられる場合、リコンビナーゼ認識配列間におけるＤＮＡの組み換えを媒介する部位特異的酵素を言い、これはリコンビナーゼ認識配列間におけるＤＮＡ断片の切り出し、インテグレーション、逆位、または交換（例えば転座）をもたらす。リコンビナーゼは、２つの別個のファミリー、セリンリコンビナーゼ（例えば、リゾルベースおよびインベルターゼ）およびチロシンリコンビナーゼ（例えばインテグラーゼ）に分類され得る。セリンリコンビナーゼの例は、限定無しに、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｔｎ３、β－ｓｉｘ、ＣｉｎＨ、ＰａｒＡ、γδ、Ｂｘｂ１、φＣ３１、ＴＰ９０１、ＴＧ１、φＢＴ１、Ｒ４、φＲＶ１、φＦＣ１、ＭＲ１１、Ａ１１８、Ｕ１５３、およびｇｐ２９を包含する。チロシンリコンビナーゼの例は、限定無しに、Ｃｒｅ、ＦＬＰ、Ｒ、ラムダ、ＨＫ１０１、ＨＫ０２２、およびｐＳＡＭ２を包含する。セリンおよびチロシンリコンビナーゼの名前は、リコンビナーゼがＤＮＡを攻撃するために用い、鎖交換中にＤＮＡに共有結合的に連結される保存された求核性アミノ酸残基から来ている。リコンビナーゼは数々の応用を有し、遺伝子ノックアウト／ノックインの作製および遺伝子治療応用を包含する。例えば、Brown et al.,「Serine ricombinases as tools for genome engineering.」Methods. 2011;53(4):372-9、Hirano et al.,「Site-specific recombinases as tools for heterologous gene integration.」Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011; 92(2):227-39、Chavez and Calos,「Therapeutic applications of the φC31 integrase system.」Curr. Gene Ther. 2011;11(5):375-81、Turan and Bode,「Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications.」FASEB J. 2011; 25(12):4088-107、Venken and Bellen,「Genome-wide manipulations of Drosophila melanogaster with transposons, Flp recombinase, and φC31 integrase.」Methods Mol. Biol. 2012; 859:203-28、Murphy,「Phage recombinases and their applications.」Adv. Virus Res. 2012; 83:367-414、Zhang et al.,「Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era.」J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2012; 13(7):511-24、Karpenshif and Bernstein,「From yeast to mammals: recent advances in genetic control of homologous recombination.」DNA Repair (Amst). 2012; 1;11(10):781-8参照。それぞれの全内容はそれらの全体が参照によってここに組み込まれる。本明細書において提供されるリコンビナーゼは、本発明の態様に用いられ得るリコンビナーゼの排他的な例であることを意味されてはいない。本発明の方法および組成物は、新たな直交系リコンビナーゼについてデータベースをマイニングすることまたは定義されたＤＮＡ特異性を有する合成リコンビナーゼを設計することによって拡充され得る（例えば、Groth et al.,「Phage integrases: biology and applications.」J. Mol. Biol. 2004; 335, 667-678、Gordley et al.,「Synthesis of programmable integrases.」Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009; 106, 5053-5058参照。それぞれの全内容はそれらの全体が参照によってここに組み込まれる）。本明細書に記載される方法および組成物に有用であるリコンビナーゼの他の例は当業者に公知であり、発見または生成されるいずれかの新たなリコンビナーゼは、本発明の異なる態様に用いられる能力があると予想される。いくつかの態様において、リコンビナーゼ（またはその触媒ドメイン）はＣａｓ９蛋白質（例えば、ｄＣａｓ９）に融合する。
用語「組み換える」または「組み換え」は、核酸改変（例えばゲノム改変）の文脈で、２つもしくは３つ以上の核酸分子または単一核酸分子の２つもしくは３つ以上の領域がリコンビナーゼ蛋白質の作用によって改変されるプロセスを言うために用いられる。組み換えは、ことに、例えば１つまたは２つ以上の核酸分子内または間における核酸配列の挿入、逆位、切り出し、または転座をもたらし得る。
用語「対象」は、本明細書において用いられる場合、個体生物を言う。いくつかの態様において、対象はいずれかの性または成長のいずれかの段階のヒトである。いくつかの態様において、対象は非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象はげっ歯類である。いくつかの態様において、対象は実験動物、例えばマウス、ラット、アレチネズミ、モルモット、魚、カエル、またはハエである。いくつかの態様において、対象は家畜、例えばヒツジ、ヤギ、ブタ、またはウシである。いくつかの態様において、対象はコンパニオンアニマル、例えばネコまたはイヌである。いくつかの態様において、対象は脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、ハエ、または線虫である。いくつかの態様において、対象は遺伝子操作されており、例えば、遺伝子操作された非ヒト対象である。
用語「超荷電させる（supercharge）」は、蛋白質の正味の総電荷の増大または減少をもたらす蛋白質のいずれかの改変を言う。改変は、アミノ酸配列の変化または荷電部分（例えば、カルボン酸基、リン酸基、硫酸基、アミノ基）の追加を包含するが、これに限定されない。超荷電（supercharging）は、薬剤単独とは相対的に増大または減少した電荷を有する複合体を形成することになる、天然に存在するかまたは改変された荷電蛋白質との薬剤の結びつきをもまた言う。
用語「ターゲット部位」は、核酸分子に結合する機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼおよび転写活性化因子または抑制因子）の文脈で本明細書において用いられる場合、エフェクター蛋白質によって結合されて作用される（例えば、ヌクレアーゼによって切断されるか、または転写活性化因子もしくは抑制因子によってそれぞれ転写活性化もしくは抑制される）核酸分子中の配列を言う。ターゲット部位は一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡによってガイドされる（例えば、ＲＮＡによってプログラミング可能な）ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）の文脈では、ターゲット部位は、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼのｇＲＮＡに相補的であるヌクレオチド配列と、ｇＲＮＡ相補配列に隣接した３’末端にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とを典型的には含む。ＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼＣａｓ９（または、ｇＲＮＡ結合活性を有することを含むバリアントもしくは融合体）について、ターゲット部位は、いくつかの態様において、２０塩基対＋３塩基対ＰＡＭ（例えばＮＮＮ。Ｎはいずれかのヌクレオチドを表す）であり得る。典型的には、ＰＡＭの最初のヌクレオチドはいずれかのヌクレオチドであり得、一方、２つの下流ヌクレオチドは、特定のＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼに依存して規定される。Ｃａｓ９などのＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼの例示的なターゲット部位は当業者に公知であり、限定無しにＮＮＧ、ＮＧＮ、ＮＡＧ、およびＮＧＧを包含し、Ｎはいずれかのヌクレオチドを表す。加えて、異なる種（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの代わりにＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＣａｓ９ヌクレアーゼは、配列ＮＧＧＮＧを含むＰＡＭを認識する。追加のＰＡＭ配列が公知であり、ＮＮＡＧＡＡＷおよびＮＡＡＲを包含するが、これに限定されない（例えば、Esvelt and Wang, Molecular Systems Biology, 9:641 (2013)参照。その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。例えば、例えばＣａｓ９などのＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼのターゲット部位は構造［ＮＺ］－［ＰＡＭ］を含み得、各Ｎは独立していずれかのヌクレオチドであり、Ｚは１～５０の整数である。いくつかの態様において、Ｚは少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０である。いくつかの態様において、Ｚは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０である。いくつかの態様において、Ｚは２０である。いくつかの態様において、「ターゲット部位」は、ヌクレアーゼによって結合されるが切断はされない核酸分子中の配列をもまた言い得る。例えば、本明細書に記載されるある種の態様は、不活性な（または不活性型の）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインを含む蛋白質を提供する。かかる蛋白質は（例えば、Ｃａｓ９のＲＮＡ結合ドメインをもまた包含するときに）、ｇＲＮＡによって規定されるターゲット部位に結合する能力がある。しかしながら、ＤＮＡ切断部位が不活性化されているので、ターゲット部位はこの蛋白質によって切断されない。しかしながら、本明細書に記載されるかかる蛋白質は、典型的には、核酸分子の改変を媒介する別の蛋白質（例えばヌクレアーゼ、転写活性化因子、リコンビナーゼ、デアミナーゼなど）または分子にコンジュゲーション、融合、または結合される。いくつかの態様において、実際に切断される配列は、核酸分子の切断を媒介する蛋白質（例えばヌクレアーゼ）または分子に依存するであろう。いくつかの場合では、例えば、不活性型Ｃａｓ９蛋白質（単数または複数）が結合している近位または距離に関係するであろう。二量体化するヌクレアーゼ（例えば、不活性なＣａｓ９（またはＣａｓ９のＲＮＡ結合ドメイン）とＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ切断ドメインまたは活性なＣａｓ９切断ドメイン）とを含む蛋白質の二量体）の文脈では、ターゲット部位は、左ハーフ部位（１つの蛋白質によって結合される）、右ハーフ部位（第２の蛋白質によって結合される）、およびハーフ部位間のスペーサー配列（ここで切断がなされる）を典型的には含む。いくつかの態様においては、左ハーフ部位または右ハーフ部位いずれか（かつスペーサー配列では無い）が切断される。この構造（［左ハーフ部位］－［スペーサー配列］－［右ハーフ部位］）は、本明細書においてＬＳＲ構造と言われる。いくつかの態様において、左ハーフ部位および／または右ハーフ部位はＲＮＡによってガイドされるターゲット部位（例えばＣａｓ９ターゲット部位）に対応する。いくつかの態様において、いずれかまたは両方のハーフ部位は、例えばＣａｓ９によってターゲット化される典型的な領域よりも短いかまたは長く、例えば２０ヌクレオチドよりも短いかまたは長い。いくつかの態様において、左および右ハーフ部位は異なる核酸配列を含む。いくつかの態様において、ターゲット部位は、３つの（３）ＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼのターゲット部位配列（例えばＣａｓ９ターゲット部位配列に対応する３つの配列）を含む配列であり、第１および第２ならびに第２および第３のＣａｓ９ターゲット部位配列がスペーサー配列によって離間される。いくつかの態様において、スペーサー配列は少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、または少なくとも２５０ｂｐ長である。
用語「転写活性化因子」および「転写抑制因子」は、それぞれ、ターゲット核酸配列に結合して、ターゲット核酸配列と結びついた遺伝子産物の発現のレベルの増大または減少を引き起こす蛋白質（例えば、転写因子またはその断片）などの薬剤を言う。例えば、ターゲット核酸配列が遺伝子の制御領域内に位置する場合に、転写活性化因子は、遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現のレベルの増大を引き起こす（反対に、転写抑制因子は、遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現のレベルの減少を引き起こす）。遺伝子産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）、または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的には、ｍＲＮＡのレベルの増大または減少は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの減少、増大をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたは蛋白質を測定するための標準的な技術を用いて決定され得る。
用語「転写活性化因子様エフェクター」（ＴＡＬＥ）は、本明細書において用いられる場合、高度に可変の２アミノ酸モチーフ（リピート可変二残基、ＲＶＤ）を含む高度に保存された３３～３４アミノ酸配列を含有するＤＮＡ結合ドメインを含むエフェクター蛋白質を言う。ＲＶＤモチーフは核酸配列に対する結合特異性を決定し、当業者に周知の方法に従って操作されて、望まれるＤＮＡ配列に特異的に結合し得る（例えば、Miller, Jeffrey; et.al. (February 2011). 「A TALE nuclease architecture for efficient genome editing」. Nature Biotechnology 29 (2): 143-8、Zhang, Feng; et.al. (February 2011).「Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription」. Nature Biotechnology 29 (2): 149-53、Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed.「Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity」. PLoS ONE 6 (5): e19509、Boch, Jens (February 2011).「TALEs of genome targeting」. Nature Biotechnology 29 (2): 135-6、Boch, Jens; et.al. (December 2009). 「Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III Effectors」. Science 326 (5959): 1509-12、およびMoscou, Matthew J.; Adam J. Bogdanove (December 2009). 「A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors」. Science 326 (5959): 1501参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間の単純な関係性は、適切なＲＶＤを含有するリピートセグメントの組み合わせを選択することによって、特異的なＤＮＡ結合ドメインの操作を可能とした。ＴＡＬＥエフェクター蛋白質は、限定無しに、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ならびにＴＡＬＥ転写活性化因子および抑制因子を包含する。
用語「転写活性化因子様エレメントヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、本明細書において用いられる場合、ＤＮＡ切断ドメイン（例えばＦｏｋＩドメイン）に転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼを言う。操作されたＴＡＬＥ構築物を生成するためのいくつものモジュール的なアセンブリスキームが報告されている（Zhang, Feng; et.al. (February 2011).「Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription」. Nature Biotechnology 29 (2): 149-53、Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed.「Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity」. PLoS ONE 6 (5): e19509、Cermak, T.; Doyle, E. L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C; Bailer, J. A.; Somia, N. V. et al. (2011).「Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting」. Nucleic Acids Research、Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T. (2011).「Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning」. Nucleic Acids Research、Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D. A.; Carpenter, S.; Spalding, M. H.; Weeks, D. P.; Yang, B. (2011).「Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes」. Nucleic Acids Research.、Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C; Marillonnet, S. (2011). Bendahmane, Mohammed, ed. 「Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning」. PLoS ONE 6 (5): el9722。そのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる）。
用語「転写抑制因子」は、核酸配列に結合して、ターゲット核酸配列と結びついた遺伝子産物の発現のレベルの低減を引き起こす転写因子（例えば蛋白質）を言う。例えば、ターゲット核酸配列が遺伝子の制御領域内に位置する場合に、転写抑制因子は、遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現のレベルの低減を引き起こす。遺伝子産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）、または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的には、ｍＲＮＡのレベルの低減は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたは蛋白質を測定するための標準的な技術を用いて決定され得る。
用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、本明細書において用いられる場合、ジンクフィンガーアレイを含む結合ドメインにコンジュゲーションされた核酸切断ドメインを含むヌクレアーゼを示す。いくつかの態様において、切断ドメインはＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの切断ドメインである。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、切断のために所与の核酸分子中のほとんどいずれかの望まれる配列をターゲット化するように設計され得、複雑なゲノムの文脈でユニークな部位に結合するようにジンクフィンガー結合ドメインを設計する可能性は、生細胞内の単一のゲノム部位のターゲット化された切断を可能とし、例えば、治療上の価値があるターゲット化されたゲノム変化を達成する。望まれるゲノム遺伝子座への二本鎖切断をターゲット化することは、非相同ＤＮＡ修復経路の誤りがちな性質が原因で、遺伝子のコード配列中にフレームシフト変異を導入するために用いられ得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、当業者に周知の方法によって興味ある部位をターゲット化するように生成され得る。例えば、望まれる特異性を有するジンクフィンガー結合ドメインは、既知の特異性の個体のジンクフィンガーモチーフを組み合わせることによって設計され得る。ＤＮＡに結合したジンクフィンガー蛋白質Ｚｉｆ２６８の構造は、この分野における研究のかなりに情報を与えた。６４個の可能な塩基対トリプレットのそれぞれについてジンクフィンガーを得て、それからそれらのモジュール的なジンクフィンガーを混合およびマッチングし、いずれかの望まれる配列特異性を有する蛋白質を設計するというコンセプトが記載されている（Pavletich NP, Pabo CO (May 1991).「Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A」. Science 252 (5007): 809-17。その全内容は本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、それぞれ３塩基対ＤＮＡ配列を認識する別々のジンクフィンガーが組み合わされて、長さ９塩基対～１８塩基対に渡るターゲット部位を認識する３、４、５、または６フィンガーアレイを生成する。いくつかの態様において、より長いアレイが考えられる。他の態様において、６～８ヌクレオチドを認識する２フィンガーモジュールが組み合わされて、４、６、または８ジンクフィンガーアレイを生成する。いくつかの態様において、細菌またはファージディスプレイが使用されて、望まれる核酸配列（例えば長さ３～３０ｂｐの望まれるヌクレアーゼターゲット部位）を認識するジンクフィンガードメインを開発する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、いくつかの態様において、リンカー（例えばポリペプチドリンカー）を介して互いに融合または別様にコンジュゲーションされたジンクフィンガー結合ドメインと切断ドメインとを含む。リンカーの長さは、ジンクフィンガードメインによって結合される核酸配列からの切断の距離を決定する。より短いリンカーが用いられる場合、切断ドメインは、結合される核酸配列により近接した核酸を切断するであろう。一方、より長いリンカーは、切断および結合される核酸配列間のより大きい距離をもたらすであろう。いくつかの態様において、ジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメインは、結合した核酸を切断するために二量体化しなければならない。いくつかのかかる態様において、二量体は２つの単量体のへテロ二量体であり、そのそれぞれは異なるジンクフィンガー結合ドメインを含む。例えば、いくつかの態様において、二量体は、ＦｏｋＩ切断ドメインにコンジュゲーションされたジンクフィンガードメインＡを含む１つの単量体とＦｏｋＩ切断ドメインにコンジュゲーションされたジンクフィンガードメインＢを含む１つの単量体とを含み得る。この限定しない例において、ジンクフィンガードメインＡはターゲット部位の１つの側の核酸配列に結合し、ジンクフィンガードメインＢはターゲット部位のもう一方の側の核酸配列に結合し、二量体化ＦｏｋＩドメインは核酸をジンクフィンガードメイン結合部位間において切断する。
用語「ジンクフィンガー」は、本明細書において用いられる場合、小さい核酸結合蛋白質構造モチーフを言い、フォールドとフォールドを安定化する１つまたは２つ以上の亜鉛イオンの配位とによって特徴づけられる。ジンクフィンガーは、さまざまな異なる蛋白質構造を包含する（例えば、Klug A, Rhodes D (1987).「Zinc fingers: a novel protein fold for nucleic acid recognition」. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 52: 473-82参照。その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。ジンクフィンガーは、ヌクレオチドの特異的な配列に結合するように設計され得、一連のジンクフィンガーの融合体を含むジンクフィンガーアレイが、ほとんどいずれかの望まれるターゲット配列に結合するように設計され得る。かかるジンクフィンガーアレイは、蛋白質の（例えば、核酸切断ドメインにコンジュゲーションされた場合には、例えばヌクレアーゼの）結合ドメインを形成し得る。ジンクフィンガーモチーフの異なる型が当業者に公知であり、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２、Ｇａｇナックル、Ｔｒｅｂｌｅ－ｃｌｅｆ、Ｚｉｎｃリボン、Ｚｎ２／Ｃｙｓ６、およびＴＡＺ２ドメイン様モチーフを包含するが、これに限定されない（例えば、Krishna SS, Majumdar I, Grishin NV (January 2003).「Structural classification of zinc fingers: survey and summary」. Nucleic Acids Res. 31 (2): 532-50参照）。典型的には、単一のジンクフィンガーモチーフは核酸分子の３または４ヌクレオチドに結合する。従って、２つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは６～８ヌクレオチドに結合し得、３つのジンクフィンガーモチーフ含むジンクフィンガードメインは９～１２ヌクレオチドに結合し得、４つのジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガードメインは１２～１６ヌクレオチドに結合し得る、などである。いずれかの好適な蛋白質操作技術が使用されて、長さ３～３０ヌクレオチドのほとんどいずれかの望まれるターゲット配列に結合するように、ジンクフィンガーのＤＮＡ結合特異性を変化および／または新規のジンクフィンガー融合体を設計し得る（例えば、Pabo CO, Peisach E, Grant RA (2001).「Design and selection of novel cys2His2 Zinc finger proteins」. Annual Review of Biochemistry 70: 313-340、Jamieson AC, Miller JC, Pabo CO (2003).「Drug discovery with engineered zinc-finger proteins」. Nature Reviews Drug Discovery 2 (5): 361-368、およびLiu Q, Segal DJ, Ghiara JB, Barbas CF (May 1997).「Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes」. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (11)参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。操作されたジンクフィンガーアレイと核酸を切断する蛋白質ドメインとの間の融合は、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」を生成するために用いられ得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、核酸分子中の特異的なターゲット部位に結合するジンクフィンガードメインと、結合ドメインによって結合されたターゲット部位内またはその近位で核酸分子を切断する核酸切断ドメインとを典型的には含む。典型的な操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼは、３～６つの個体のジンクフィンガーモチーフを有しかつ長さ９塩基対～１８塩基対に渡るターゲット部位に結合する結合ドメインを含む。より長いターゲット部位は、所与のゲノム中のユニークであるターゲット部位に結合して切断することが望まれる状況において特に魅力的である。
用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される疾患もしくは障害またはその１つもしくは２つ以上の症状を逆転する、緩和する、その始まりを遅延させる、またはその進行を阻害することを狙った臨床的な措置を言う。本明細書において用いられる場合、用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される疾患もしくは障害またはその１つもしくは２つ以上の症状を逆転する、緩和する、その始まりを遅延させる、またはその進行を阻害することを狙った臨床的な措置を言う。いくつかの態様において、処置は、１つまたは２つ以上の症状が発症した後および／または疾患が診断された後に投与され得る。他の態様において、処置は、例えば症状を予防するもしくはその始まりを遅延させるまたは疾患の始まりもしくは進行を阻害するために、症状の非存在下で投与され得る。例えば、処置は、症状の始まりに先立って（例えば、症状の既往に照らしておよび／または遺伝学的もしくは他の患いやすい因子に照らして）患いやすい個体に投与され得る。処置は、例えばそれらの再発を予防するかまたは遅延させるために、症状が消散した後にもまた継続され得る。
哺乳類細胞内への高分子送達の模式図。 脂肪細胞細胞運命をプログラミングする：白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への切り換え。 ＰＰＡＲγまたはＰＲＤＭ１６をターゲット化するようにプログラミングされたＴＡＬＥ活性化因子を送達するするために、超荷電送達プラットフォームを用いる。 ＋３６ＧＦＰ融合体、１８．５ｍｅｒのＴＡＬＥドメイン、およびＶＰ６４活性化ドメインを含む融合蛋白質の模式図。 ＋３６ＧＦＰ－ＴＡＬＥ活性化因子－融合蛋白質の発現および精製。
＋３６ＧＦＰ－ＰＰＡＲγおよびＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達による脂肪細胞制御因子遺伝子の活性化についての試験。 異なる濃度での＋３６ＧＦＰ－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達有効性。 ＮＩＨ３Ｔ３細胞における２つの異なる＋３６ＧＦＰ－ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ融合蛋白質の送達有効性の比較。 ＰＰＡＲγ－ＴＡＬＥ活性化因子融合体の送達後のＰＰＡＲγ遺伝子発現と、様々なコントロールに対する比較。
ＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ活性化因子融合体の送達後のＰＲＤＭ１６遺伝子発現と、様々なコントロールに対する比較。 中程度のＴＡＬＥ活性が血清の存在下で観察される。 脂肪生成カクテルによる７日間の処置が続く、ＰＰＡＲγのウイルス送達の検証。 線維芽細胞をＷＡＴおよびＢＡＴにプログラミングするためのアッセイの模式図。 ＋３６ＧＦＰ－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質による処置によって観察された脂肪細胞形成。 LipidTOX redによる７日後の様々な処置の染色が、ウイルス送達後、さらには超荷電ＰＰＡＲγ－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達後の脂肪細胞の形成を示している。
LipidTOX redによる７日後の様々な処置の染色が、ウイルス送達後、さらには超荷電ＰＰＡＲγ－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達後の脂肪細胞の形成を示している。 ウイルス送達後、さらには超荷電ＰＰＡＲγ－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達後のＷＡＴバイオマーカー遺伝子の発現。 インビボで褐色脂肪の脂肪細胞を誘導するための超荷電ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達。堅牢な脂肪細胞形成が、ＰＰＡＲγおよびＰＲＤＭ１６のウイルス送達後に、かつ超荷電ＴＡＬＥ活性化因子蛋白質融合体の送達後にもまた観察された。 ＰＰＡＲγおよびＰＲＤＭ１６の発現による褐色脂肪マーカーのＴＡＬＥ／ＴＡＬＥ、ウイルス／ＴＡＬＥ、およびウイルス／ウイルスによって誘導される発現の比較。
ＲＴ－ｑＰＣＲ評価は、LipidTOX染色によって観察された脂肪細胞分化と一致している。 ＋３６ＧＦＰとの複合体としての機能的なＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達は、送達後のＴＡＬＥ活性化因子活性を改善する。 ＋３６ＧＦＰとの融合体（＋３６ＧＦＰ－ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ－３）または複合体（＋３６ＧＦＰ＋ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ－３）いずれかとしてのＴＡＬＥ活性化因子融合体送達後の、ＰＲＤＭ１６遺伝子発現。複合体の送達はＴＡＬＥ活性化因子活性を増大させる傾向がある。
（＋３６ＧＦＰとの融合体または複合体いずれかとしての）ＴＡＬＥ活性化因子融合体送達後のＰＲＤＭ１６遺伝子発現に、＋３６ＧＦＰへのＡｕｒｅｉｎペプチド融合が及ぼす効果。 Lipofectamine LTXによる融合体（＋３６ＧＦＰ－ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ－３）または複合体（＋３６ＧＦＰ＋ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ－３）いずれかとしてのＴＡＬＥ活性化因子融合体送達後の、ＰＲＤＭ１６遺伝子発現。 哺乳類細胞内へのＣａｓ９との超荷電融合蛋白質または複合体の送達。（ＧＧＳ）９－Ｔ－ＡＬＡＬ－ＰＫＫＫＲＫＶは配列番号２５１に対応する。 野生型Ｃａｓ９蛋白質ならびに＋３６ＧＦＰおよびＡｕｒｅｉｎ－ＧＧＳ９とのＣａｓ９融合蛋白質の精製。
ポリアニオン性高分子との融合または非共有結合的な複合体化、およびカチオン性脂質による封入によって哺乳類細胞内に蛋白質を送達するための戦略が示されている。図２７（Ａ）は、リコンビナーゼ、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）蛋白質、およびＣａｓ９エンドヌクレアーゼが核酸に結合し、自然にカチオン性であり（正味の理論上の電荷が黒色で示されている）、カチオン性脂質によって効率的には封入されないということを示している。しかしながら、それらの蛋白質は、（－３０）ＧＦＰなどの超負荷電蛋白質への融合によって、またはポリアニオン性核酸との複合体化によって高度にアニオン性にされ得る。図２７（Ｂ）は、ＤＮＡおよびＲＮＡをトランスフェクションするために普通に用いられるカチオン性脂質が、もたらされる高度にアニオン性の蛋白質または蛋白質：核酸複合体を封入して、哺乳類細胞内へのそれらの送達を媒介するということを表す模式図を示す。
培養ヒト細胞へのＣｒｅリコンビナーゼの送達。図２８（Ａ）において、Ｃｒｅリコンビナーゼへの高度にカチオン性の（＋３６）ＧＦＰまたは高度にアニオン性の（－３０）ＧＦＰいずれかの融合が示されている。Ｃｒｅによって媒介される組み換え時にＤｓＲｅｄを発現するＨｅＬａレポーター細胞株が、Ｃｒｅ送達効率を評価するために用いられた。（ＧＧＳ）９は配列番号２５２に対応し、Ｈｉｓ６は配列番号２５３に対応する。図２８（Ｂ）において、ＨｅＬａ－ｄｓＲｅｄ細胞は１０ｎＭの（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅおよびカチオン性脂質RNAiMAXによって処置された。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培地中での４８時間のインキュベーション後に可視化された。図２８（Ｃ）は、１０％ＦＢＳ培地または無血清培地における（＋３６）ＧＦＰ－Ｃｒｅ、および完全血清培地におけるカチオン性脂質RNAiMAX有りまたは無しでの（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅの送達を示している。図２８（Ｄ）は、１０％ＦＢＳを含有する２７５μＬの培地中での４８時間後の機能的な（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ送達有効性に及ぼすカチオン性脂質用量の効果を提出している。図２８（Ｅ）は、（－３０）ｄＧＦＰ－Ｃｒｅの機能的な送達有効性についての数個の市販のカチオン性脂質およびポリマーの比較である。図２８（Ｆ）は、Ｃｒｅに融合された複数のアニオン性ペプチドまたは蛋白質配列の、RNAiMAXによって媒介される送達を示している。エラーバーは、異なる日に実施された３つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。
培養ヒト細胞内へのＴＡＬＥ転写活性化因子の送達。図２９（Ａ）は、ＶＰ６４活性化ドメインにＣ末端融合されかつ（－３０）ＧＦＰおよびＮＬＳにＮ末端融合された１８．５リピートＴＡＬＥ活性化因子の設計を示す。（ＧＧＳ）９は配列番号２５１に対応し、Ｈｉｓ６は配列番号２５２に対応する。融合体の正味の理論上の総電荷は－４３である。図２９（Ｂ）は、ＮＴＦ３遺伝子内の部位をターゲット化するＴＡＬＥ－ＶＰ６４活性化因子をコードするプラスミドの従来型のトランスフェクションによる、または、対応するＮＴＦ３をターゲット化する（－３０）ＧＦＰ－ＴＡＬＥ－ＶＰ６４蛋白質のRNAiMAXカチオン性脂質によって媒介される送達による、ＮＴＦ３転写の活性化を実証している。遺伝子発現レベルはｑＲＴ－ＰＣＲによって測定され、ＧＡＰＤＨ発現レベルに対して正規化された。エラーバーは、異なる日に実施された３つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。
培養ヒト細胞へのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼ、およびｄＣａｓ９－ＶＰ６４転写活性化因子の送達。図３０（Ａ）は、Ｕ２ＯＳのＥＧＦＰレポーター細胞への、ＥＧＦＰをターゲット化するｓｇＲＮＡまたはＶＥＧＦをターゲット化するｓｇＲＮＡと複合体化したＣａｓ９蛋白質バリアントのカチオン性脂質によって媒介される送達を実証している。結果が、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現プラスミドの標準的なトランスフェクションのものと比較されている。図３０（Ｂ）は、ＥＧＦＰの改変を測定するためのＴ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）アッセイの結果を示している。処置無し（レーン１）、ＥＧＦＰをターゲット化するｓｇＲＮＡ単独による処置（レーン２）、Ｃａｓ９蛋白質単独（レーン３）、Ｃａｓ９蛋白質＋ＶＥＧＦをターゲット化するｓｇＲＮＡ＋RNAiMAX（レーン４）、Ｃａｓ９およびＥＧＦＰをターゲット化するｓｇＲＮＡを発現するプラスミドのトランスフェクション（レーン５）、またはＣａｓ９蛋白質＋ＥＧＦＰをターゲット化するｓｇＲＮＡ＋RNAiMAX（レーン６）から。密度測定によって計算されたインデル効率がゲル画像の下に示されている。図３０（Ｃ）は、４つのｓｇＲＮＡおよびRNAiMAXと複合体化したＣａｓ９の単一の送達による、ＥＧＦＰおよび３つの内在性遺伝子におけるゲノム改変のＴ７ＥＩアッセイの結果を提出している。密度測定によって計算されたインデル効率がゲル画像の下に示されている。図３０（Ｄ）は、プラスミドトランスフェクションまたはRNAiMAXによって媒介される蛋白質：ＲＮＡ複合体送達いずれかによる、ｓｇＲＮＡの対およびＣａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼの送達を示している。ＥＧＦＰを破壊するｓｇＲＮＡのＧＦＰｇ１＋ＧＦＰｇ５またはＧＦＰｇ３＋ＧＦＰｇ７は遺伝子破壊をもたらすと予想され、一方、ＧＦＰｇ５＋ＧＦＰｇ７は同じ鎖をターゲット化し、そのため非機能的であると予想される。図３０（Ｅ）は、プラスミドトランスフェクションまたはRNAiMAXによって媒介される蛋白質送達いずれかによる、ＮＴＦ３をターゲット化する触媒不能（ｄＣａｓ９）－ＶＰ６４転写活性化因子の送達を示す。ＶＥＧＦｇ３およびＶＥＧＦｇ５のｓｇＲＮＡ両方の送達は、ＮＴＦ３遺伝子活性化に負のコントロールとして働いた。エラーバーは、異なる日に実施された６つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。
プラスミドトランスフェクションまたはカチオン性脂質によって媒介される蛋白質：ｓｇＲＮＡ送達による、培養ヒト細胞におけるＣａｓ９によって媒介される内在性遺伝子切断のＤＮＡ配列特異性が示されている。図３１（Ａ）において、Ｔ７ＥＩアッセイは、内在性ＣＬＴＡ、ＥＭＸ、およびＶＥＧＦ遺伝子のオンターゲット改変について実施された。図３１（Ｂ～Ｄ）において、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡからもたらされるオンターゲット：オフターゲットＤＮＡ改変比が、プラスミドトランスフェクションまたはカチオン性脂質によって媒介される蛋白質：ｓｇＲＮＡ送達について示されている。各処置の条件は、約１０％のオンターゲット切断をもたらすように調整され、オンターゲット遺伝子改変効率が同程度である条件での２つの送達法間のＤＮＡ切断特異性の比較を可能にした。Ｐ値は表２に列挙されている。各オンおよびオフターゲットサンプルは一度シーケンシングされ、＞１０，０００個の配列がオンターゲットサンプルあたり分析され、平均＞１１１，０００個の配列がオフターゲットサンプルあたり分析された（表２）。
マウス内耳の有毛細胞へのＣｒｅリコンビナーゼおよびＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体のインビボ送達が示されている。図３２（Ａ）において、Ｐ０のｆｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウス（ｎ＝４）の中央階（蝸牛管）が、５０％RNAiMAX中の２３μＭの（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅの０．３μＬをまたはRNAiMAX単独（コントロール）を注射された。５日後に、Ｃｒｅによって媒介される組み換えを示すｔｄＴｏｍａｔｏ発現が、免疫組織学を用いて可視化された。赤色＝ｔｄＴｏｍａｔｏ、緑色＝Ｍｙｏ７ａ、白色＝Ｓｏｘ２、青色＝ＤＡＰＩ。黄色角括弧は外有毛細胞（ＯＨＣ）層を示している。図３２（Ｂ）は、コントロール蝸牛における不動毛と類似に、（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ送達の１０日後に、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性の外有毛細胞の無傷（intact）のｅｓｐｉｎ（Ｅｓｐ）を発現する不動毛が存在した（矢印）ということを示している。赤色＝ｔｄＴｏｍａｔｏ、緑色＝Ｅｓｐ、白色＝Ｓｏｘ２、青色＝ＤＡＰＩ。図３２（Ｃ）は、RNAiMAXの代わりにLipofectamine 2000を用いることを除いて図３２（Ａ）と同一である（ｎ＝４）。上および下パネルはそれぞれ低および高倍率でのマウス蝸牛の画像であり、送達の効率、さらには蝸牛構造および有毛細胞喪失に及ぼす効果を詳細に示している。図３２（Ｄ）は、Ｐ２のＡｔｏｈ１－ＧＦＰマウス（ｎ＝３）の中央階（蝸牛管）が５０％のRNAiMAXまたはLipofectamine 2000中の３３μＭのｓｇＲＮＡ、３３μＭのＣａｓ９の０．３μＬを注射されたときの結果を示している。Ｃａｓ９によって媒介される遺伝子破壊は、１０日後に可視化されたときにＧＦＰ発現の喪失をもたらす。上パネルはＧＦＰシグナルのみを示しており、一方、下パネルは追加の免疫組織学マーカーを包含している。下パネル中の黄色枠は、ＧＦＰ発現を喪失した有毛細胞を強調している。赤色＝ｔｄＴｏｍａｔｏ、緑色＝Ｍｙｏ７ａ、白色／淡青色＝Ｓｏｘ２、青色＝ＤＡＰＩ。全てのスケールバーは白色で示されており、１０μｍである。
Ｃｒｅリコンビナーゼのカチオン性脂質によって媒介される送達の最適化。図３３（Ａ）は、ＢＳＲ－ＴｄＴｏｍａｔｏ細胞（Ｃｒｅ組み換え効率を測定するために用いられる第２のレポーター細胞株）における（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ送達の最適化を示している。図３３Ｂは、ＨｅＬａのｄｓＲｅｄレポーター細胞における（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ組み換え効率と毒性とに及ぼすRNAiMAX用量の効果を実証しており、ＦＡＣＳによって測定された。ＨｅＬａ細胞が前方散乱および側方散乱ゲーティングによってソーティングされ、正常な形態を保持した生細胞を同定した。図３３（Ｃ）は、Ｃｒｅリコンビナーゼに融合された蛋白質の正味電荷とカチオン性脂質によって媒介される機能的なＣｒｅ送達効率との間の関係性を例証している。２５ｎＭの列挙されたドメインに融合されたＣｒｅリコンビナーゼが、１．５μＬのRNAiMAXと組み合わせられて、ＨｅＬａのｄｓＲｅｄレポーター細胞と一緒にインキュベーションされた。２日後に、組み換え効率がＦＡＣＳによって測定された。エラーバーは、異なる日に実施された３つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。
カチオン性脂質によって媒介される送達対超正荷電カチオン性蛋白質送達による、蛋白質取り込み。図３４（Ａ）は、未結合の蛋白質を取り除くためにＰＢＳ＋ヘパリン（２０Ｕ／ｍＬ）によって細胞を洗浄した後に、（－３０）ＧＦＰ－ＣｒｅおよびRNAiMAXまたは（＋３６）ＧＦＰ－Ｃｒｅいずれかによって処置された細胞からのＧＦＰ蛍光を定量している。図３４（Ｂ）は、（＋３６）ＧＦＰとの融合に起因するＣｒｅリコンビナーゼ送達効率と相対的に、（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ＋１．５μＬのRNAiMAXの機能的なＣｒｅリコンビナーゼ送達効率を示している。図３４（Ｃ）は、処置の４８時間後に合計の細胞集団の平均ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を測定することによって、（－３０）ＧＦＰ融合体＋１．５μＭのRNAiMAX処置対（＋３６）ＧＦＰ融合体によるｍＣｈｅｒｒｙ取り込みの比較を提供しており、ＰＢＳ＋ヘパリンによって細胞を洗浄している。図３４（Ｄ）は、RNAiMAXの存在下または非存在下での（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅまたは（＋３６）ＧＦＰ－Ｃｒｅの合計の細胞ＧＦＰ蛍光を示している。
ＮＴＦ３遺伝子をターゲット化するように設計されたＴＡＬＥ活性化因子の送達最適化。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、トランスフェクションによるＮＴＦ３－ＴＡＬＥプラスミドまたはＮＴＦ３－ＴＡＬＥ蛋白質のリポソーム送達いずれかによって処置された。細胞は、実験上決定された最適なインキュベーション時間の後に両方の処置について集められ、ＮＴＦ３のｍＲＮＡレベルについてｑＲＴ－ＰＣＲによって分析された。最適な蛋白質（２５～５０ｎＭ）および脂質用量（１．５μＬのRNAiMAX）が、図２９Ｂにおける２つの送達技術の比較のために選ばれた。エラーバーは、異なる日に実施された６つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。
Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡの送達とフローサイトメトリーによる分析とによる、ＥＧＦＰレポーター遺伝子の遺伝子破壊頻度の決定。図３６（Ａ）は、Ｃａｓ９二本鎖切断によって誘導されるＮＨＥＪによる、Ｕ２ＯＳ細胞におけるＥＧＦＰ破壊の模式図を提供している。図３６（Ｂ）は、RNAiMAXを用いる、（－３０）ｄＧＦＰ－Ｃａｓ９と複合体化したＥＧＦＰをターゲット化するｓｇＲＮＡまたはオフターゲットｓｇＲＮＡの送達を、プラスミドトランスフェクションの正のコントロール（橙色）と併せて示している。図３６（Ｃ）は、ＥＧＦＰ蛍光の破壊が細胞毒性の結果ではないという確認を、サンプルをTO-PRO-3 live/dead染色（Life Technologies, Carlsbad CA）によって処置し、もたらされる細胞をフローサイトメトリーによって分析することによって提供している。図３６（Ｄ）は、細胞透過化性だが完全には膜溶解性でない界面活性剤（０．５％Ｔｗｅｅｎ）の追加によるTO-PRO-3染色の試験を示している。
Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡの機能的な送達の最適化。図３７（Ａ）において、２つの試験された構築物のカチオン性脂質によって媒介される送達効率は、よりアニオン性の（－３０）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９が、自然のＣａｓ９と比較して、低い蛋白質およびｓｇＲＮＡ濃度でのより効率的な送達を容易にするということを示している。図３７（Ｂ）は、蛋白質およびｓｇＲＮＡ濃度の関数として、（－３０）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９の送達最適化を示している。図３７（Ｃ）は、蛋白質およびｓｇＲＮＡ濃度の関数として、いずれかの融合体またはタグ無しのＣａｓ９蛋白質の送達を示している。図３７（Ｄ）は、（－３０）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９および自然のＣａｓ９のRNAiMAXによって媒介される送達のための最適なｓｇＲＮＡ対蛋白質比を示している。エラーバーは、異なる日に実施された３つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。
ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９濃度両方の関数としての、機能的なＣａｓ９送達にＮＬＳおよび／または（－３０）ｄＧＦＰが及ぼす効果。ＥＧＦＰ遺伝子破壊が、３つの固定されたｓｇＲＮＡ濃度１０ｎＭ（図３８（Ａ））、２５ｎＭ（図３８（Ｂ））、および５０ｎＭ（図３８（Ｃ））において、グラフに示されている各種蛋白質濃度と併せて測定された。送達は０．８μＬのRNAiMAXを用いて実施され、ＥＧＦＰ蛍光シグナルの喪失について４８時間後にＦＡＣＳによってアッセイされた。
Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達効率および細胞毒性にRNAiMAXおよびLipofectamine 2000が及ぼす効果。図３９（Ａ）においては、RNAiMAXまたはLipofectamine 2000いずれかによって１６時間処置されたＵ２ＯＳのＥＧＦＰレポーター細胞において、異なるＣａｓ９蛋白質濃度と１００ｎＭのＥＧＦＰのｓｇＲＮＡの定常用量とにおけるＥＧＦＰ遺伝子破壊が示されている。１６時間後に培地が取り除かれ、蛋白質送達処置後４８～７２時間のアッセイのエンドポイントまで、新鮮な培地が細胞に添加された。生細胞集団はＦＡＣＳによってTO-PRO-3 Live/Dead染色を用いて決定された。図３９（Ｂ）は、Lipofectamine 2000用量の関数として、Ｕ２ＯＳ細胞へのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達について毒性プロファイルを示す。図３９（Ｃ）は、RNAiMAX用量の関数として細胞に対する毒性プロファイルを提供する。エラーバーは、異なる日に実施された３つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。
蛋白質およびｓｇＲＮＡの各種濃度における、ＮＴＦ３遺伝子をターゲット化するｄＣａｓ９－ＶＰ６４送達の最適化。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４活性化因子とＮＴＦ３をターゲット化するｇＲＮＡｇ２または全ての６つのＮＴＦ３をターゲット化するｓｇＲＮＡの混合物いずれかとによって１６時間、かつ０．８μＬのRNAiMAXによって、４８ウェルプレートフォーマットで処置された（２７５μＬの終体積）。ＮＴＦ３のｍＲＮＡレベルがｑＲＴ－ＰＣＲによって決定され、ＧＡＰＤＨのものに対して正規化された。エラーバーは、異なる日に実施された６つの生物学的レプリケートからの標準偏差を反映している。
モック処置、Ｃａｓ９プラスミドおよびｓｇＲＮＡのリニアなＤＮＡのＰＣＲ産物のトランスフェクション、またはカチオン性脂質によって媒介される蛋白質：ｓｇＲＮＡ送達いずれかによって処置された数個のヒト遺伝子のインデル頻度（ハイスループットシーケンシングによって測定された）が図示されている。モック処置には、ＥＧＦＰをターゲット化するｓｇＲＮＡのカチオン性脂質によって媒介される蛋白質：ｓｇＲＮＡ送達が、３つのヒト遺伝子をターゲット化するｓｇＲＮＡの代わりに関わった。図４１（Ａ）は、オンターゲットおよびオフターゲットインデル頻度をＣＬＴＡ遺伝子について示している。図４１（Ｂ）は、オンターゲットおよびオフターゲットインデル頻度をＥＭＸ遺伝子について提供している。図４１（Ｃ）は、オンターゲットおよびオフターゲットインデル頻度をＶＥＧＦ遺伝子について実証している。各オンおよびオフターゲットサンプルは一度シーケンシングされ、＞１０，０００個の配列がオンターゲットサンプルあたり分析され、平均＞１１１，０００個の配列がオフターゲットサンプルあたり分析された（表２）。
マウス胚性幹細胞へのＣａｓ９エンドヌクレアーゼの送達。図４２（Ａ）は、Ｃａｓ９蛋白質およびRNAiMAXによって処置されたがｓｇＲＮＡによって処置されなかった浮遊スフィア（コントロール）が強いＧＦＰ蛍光を保持し（右）、一方、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡおよびRNAiMAXによって処置されたものが減少したＧＦＰ蛍光を見せた（左）ということを示している。スケールバーは１００μｍである。図４２（Ｂ）は細胞接着後のコントロール前駆細胞を示しており、実質的に（virtualy）全てのコントロール前駆細胞はＧＦＰ陽性であった（右パネル）。Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ処置はＧＦＰ発現の有意な低減につながり（左パネル）、多くの前駆細胞は細胞接着後に完全なＧＦＰノックダウンを示した（矢印）。スケールバーは２０μｍである。図４２（Ｃ）は、イメージング後に集められた幹細胞のＴ７ＥＩアッセイが、ＧＦＰレポーターの切断を確認することを示している。類似の遺伝子ターゲット改変効率が、カチオン性脂質によって媒介されるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達ならびにＣａｓ９およびＥＧＦＰｓｇＲＮＡプラスミドのトランスフェクションから観察された。
インビボの内在性遺伝子座において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡのカチオン性脂質によって媒介される蛋白質送達によって誘導されたゲノム改変。図４３（Ａ）は、マウス有毛細胞において、Ｃａｓ９およびＥＧＦＰのｓｇＲＮＡのカチオン性脂質によって媒介される送達後に改変された、ＥＧＦＰオンターゲット遺伝子座のゲノムＤＮＡ配列の代表的な例を示す。示されている各例について、未改変ゲノム部位は最初の配列であり、欠失を含有する最も豊富な８つの配列と挿入を含有する３つの配列とが続く。各配列の前の数はシーケンシングカウントを示している。ｓｇＲＮＡターゲット部位は太字、緑色で下線を付されている。挿入および欠失は赤色で示されている。ＰＡＭ部位が青色で示されている。図４３（Ｂ）は、マウス有毛細胞内のＥＭＸオンターゲット部位について図４２（Ａ）と同一の分析を示している。図４３（Ａ）に示されている配列は、上から下へ、配列番号２２３～２３６に対応し、図４３（Ｂ）に示されている配列は、上から下へ、配列番号２３７～２５０に対応する。
本発明は、超荷電蛋白質、カチオン性ポリマー、および／またはカチオン性脂質の１つまたは２つ以上と機能的なエフェクター蛋白質を結びつけることによる、細胞への機能的なエフェクター蛋白質（例えばヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、およびＣａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼおよびデアミナーゼ、遺伝子編集酵素、転写抑制因子および活性化因子、エピジェネティック修飾因子などへのＣａｓ９融合体を包含する））の送達のための、複合体、組成物、調製物、キット、システム、および関連する方法を提供する。典型的には、機能的なエフェクター蛋白質は、細胞の内部に送達されて、例えば細胞内で生物学的効果（例えば、ゲノムターゲット配列の切断またはターゲット遺伝子の発現の調節）を引き起こす。いくつかの態様において、生物学的効果は、細胞が見いだされる対象に対して治療上の利益を行使する。機能的なエフェクター蛋白質の送達のための複合体、組成物、調製物、システム、キット、および関連する方法は、例えば、研究または治療目的のために細胞を操作する文脈で、細胞内にエフェクター蛋白質を導入することに有用である。本明細書において提供される機能的なエフェクター蛋白質の送達のための組成物、調製物、システム、キット、および関連する方法は、改善した有効性および低減された細胞毒性、ならびに調製の容易さを現行の技術と比較して示す。本明細書において提供される組成物、調製物、システム、キット、および関連する方法を用いるＴＡＬＥＮまたはＣａｓ９蛋白質（またはそのバリアントまたは融合体）などの部位特異的な蛋白質の送達は、インビトロまたはインビボのホスト細胞のゲノムのターゲット化された操作／改変を可能とし、一方で、より侵襲的な送達法（例えば、部位特異的な蛋白質をコードするベクターのウイルス送達）の使用を回避する。
いくつかの態様において、本発明の技術は、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を送達するために超荷電蛋白質を用いる。ある種の態様において、超荷電蛋白質は操作された蛋白質である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は天然に存在する超荷電蛋白質である。本発明のいくつかの側面は、超荷電蛋白質が細胞によってエンドサイトーシスされ、超荷電蛋白質と結びつき得る機能的なエフェクター蛋白質が超荷電蛋白質と一緒に細胞によって有効に取り込まれ、かかる機能的なエフェクター蛋白質が細胞内取り込み後にそれらの生物学的機能を保持する（例えば、それらがゲノムターゲット部位を切断もしくは改変するか、またはターゲット遺伝子の転写を調節する能力があるという点で）という認識に基づく。
いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）と結びついた超荷電蛋白質を含む本明細書において提供される組成物は、治療薬、診断剤、または研究ツールとして有用である。いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼまたは転写因子）は、例えば、疾患または障害と結びついた遺伝子をターゲット化するという点で治療活性であり得る。いくつかの態様において、超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質（例えばヌクレアーゼまたは転写因子）を含む本明細書において提供される組成物が用いられて、細胞内の遺伝子の発現を調節するか、または細胞内の生物学的経路（例えば、シグナル伝達経路、代謝経路）を調節する。いくつかの態様において、細胞は、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を導入するために本明細書に記載される本発明組成物と接触させられる。いくつかの態様において、本発明組成物は、対象内の細胞内に（例えば、疾患または障害と結びついた細胞内に）機能的なエフェクター蛋白質を導入するために、その必要がある対象に投与される。本開示のいくつかの側面に従う機能的なエフェクター蛋白質の送達のための好適な細胞および細胞型は、ヒト細胞、哺乳類細胞、Ｔ細胞、ニューロン、幹細胞、前駆細胞、血球、線維芽細胞、上皮細胞、新生物細胞、および腫瘍細胞を包含するが、これに限定されない。
超荷電蛋白質
本発明への使用のための超荷電蛋白質は、蛋白質の表面の保存されていないアミノ酸をより極性のまたは荷電したアミノ酸残基に変化させることによって生成し得る。ある種の態様において、蛋白質の表面の保存されていないアミノ酸は変異導入されて、生理ｐＨ（ｐＨ約７．４）で正に荷電したアミノ酸になる。改変されるべきアミノ酸残基は、疎水性で、親水性で、荷電して、またはその組み合わせであり得る。超荷電蛋白質は、蛋白質を超荷電させるための蛋白質への荷電部分の取り付けによってもまた生成し得る。超荷電蛋白質は、高頻度に凝集に対して耐性であり、リフォールディングする増大した能力を有し、不適切なフォールディングに対して抵抗力があり、改善した可溶性を有し、広範囲の条件（熱または界面活性剤の存在などの変性条件を包含する）で一般的により安定である。
本開示の側面に従う使用に好適な超荷電蛋白質は当分野において公知であり、限定無しに、国際ＰＣＴ特許出願PCT/US07/70254（２００７年６月１日出願、２００７年１２月１３日にWO2007/143574として公開）、国際ＰＣＴ出願PCT/US09/041984（２００９年４月２８日出願、２００９年１１月５日にWO2009/134808として公開）、および国際ＰＣＴ出願PCT/US10/001250（２０１０年４月２８日出願、２０１０年１１月１１日にWO2010/129023として公開）に開示されている超荷電蛋白質を包含し、そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は操作された超荷電蛋白質である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は天然に存在する超荷電蛋白質、例えば国際ＰＣＴ出願PCT/US10/001250（２０１０年４月２８日出願、２０１０年１１月１１日にWO2010/129023として公開）に開示されている天然の超荷電蛋白質であり、そのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、操作されたまたは天然に存在する超荷電蛋白質は、０．８よりも大きい（例えば≧０．８５、≧０．９、≧０．９５、≧１、≧１．１、≧１．２、≧１．３、≧１．４、≧１．５、≧１．６、≧１．７、≧１．８、≧１．９、≧２、≧２．５、≧３、≧４、≧５、≧６、≧７、≧８、または≧１０）電荷：分子量比を示す。
使用される超荷電蛋白質は植物、動物、および／または微生物のいずれかの種に由来し得る。ある種の態様において、超荷電蛋白質は哺乳類蛋白質である。ある種の態様において、超荷電蛋白質はヒト蛋白質である。ある種の態様において、蛋白質は、典型的には研究に用いられる生物に由来する。例えば、改変されるべき蛋白質は霊長類（例えば、類人猿、サル）、げっ歯類（例えば、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ）、ブタ、イヌ、ネコ、魚類（例えばＤａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）、線虫（例えばＣ．ｅｌｅｇａｎｓ）、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）からであり得る。ある種の態様において、蛋白質は非免疫原性である。ある種の態様において、蛋白質は非抗原性である。ある種の態様において、蛋白質は本来の生物活性を有さないか、または生物活性を有さないように改変されている。ある種の態様において、蛋白質はそのターゲット化能力に基づいて選ばれる。ある種の態様において、蛋白質は緑色蛍光蛋白質である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は超荷電グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は超荷電ストレプトアビジンである。
いくつかの態様において、正味の総電荷を増大させるようにまたは蛋白質表面上の荷電残基の合計数を増大させるように改変された超荷電蛋白質が用いられる。ある種の態様において、超荷電蛋白質の理論上の正味電荷は、未改変蛋白質と比較して少なくとも＋１、少なくとも＋２、少なくとも＋３、少なくとも＋４、少なくとも＋５、少なくとも＋１０、少なくとも＋１５、少なくとも＋２０、少なくとも＋２５、少なくとも＋３０、少なくとも＋３５、または少なくとも＋４０だけ増大している。ある種の態様において、超荷電蛋白質の理論上の正味電荷は、生理ｐＨ（すなわち約７．４）において少なくとも＋１、少なくとも＋２、少なくとも＋３、少なくとも＋４、少なくとも＋５、少なくとも＋１０、少なくとも＋１５、少なくとも＋２０、少なくとも＋２５、少なくとも＋３０、少なくとも＋３５、または少なくとも＋４０である。
他の態様（例えば、カチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマーの使用が関わるもの）において、正味の総電荷を減少させるようにまたは蛋白質表面上の荷電残基の合計数を減少させるように改変された超荷電蛋白質が用いられる。ある種の態様において、超荷電蛋白質の理論上の正味電荷は、未改変蛋白質と比較して少なくとも－１、少なくとも－２、少なくとも－３、少なくとも－４、少なくとも－５、少なくとも－１０、少なくとも－１５、少なくとも－２０、少なくとも－２５、少なくとも－３０、少なくとも－３５、少なくとも－４０、少なくとも－４５、または少なくとも－５０だけ減少している（「マイナス」または「負」は「－」によって表される）。ある種の態様において、超荷電蛋白質の理論上の正味電荷は少なくとも－１、少なくとも－２、少なくとも－３、少なくとも－４、少なくとも－５、少なくとも－１０、少なくとも－１５、少なくとも－２０、少なくとも－２５、少なくとも－３０、少なくとも－３５、少なくとも－４０、少なくとも－４５、または少なくとも－５０である。
いくつかの例示的な超荷電蛋白質が、本発明の技術を例示するために本明細書に記載される一方で、本開示はこの点で限定されない。当業者は、本開示に基づいて、細胞に機能的なエフェクター蛋白質を送達するための追加の好適な超荷電蛋白質を確かめる能力があるであろう。いくつもの天然に存在する蛋白質が、好適な超荷電蛋白質を生成するために改変され得る。かかる蛋白質中の望まれる改変は、当分野において公知のいずれかの技術を用いて成就され得る。蛋白質配列中のかかる変化を導入するための組み換えＤＮＡ技術は当分野において周知である。ある種の態様において、改変は、蛋白質をコードするポリヌクレオチドの部位特異的変異導入によってなされる。変異を導入するための他の技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch, and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)、the treatise, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999)において論じられており、そのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。
超荷電蛋白質はさらに改変され得る。超荷電蛋白質を包含する蛋白質は当業者に公知の技術を用いて改変され得る。例えば、超荷電蛋白質は化学的にまたは生物学的に改変され得る。１つまたは２つ以上のアミノ酸が、一次配列から追加、欠失、または変化させられ得る。例えば、ポリヒスチジンタグまたは他のタグが、蛋白質の精製を補助するために超荷電蛋白質に追加され得る。他のペプチドまたは蛋白質が、蛋白質の生物学的、生化学的、および／または生物物理学的特性を変化するために超荷電蛋白質に追加され得る。例えば、エンドソーム溶解性ペプチドが超荷電蛋白質の一次配列に追加され得、または、ターゲット化ペプチドが超荷電蛋白質の一次配列に追加され得る。超荷電蛋白質の他の改変は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、アシル化、脂質修飾、ファルネシル化、アセチル化、蛋白質加水分解など）を包含するが、これに限定されない。ある種の態様において、超荷電蛋白質は、その免疫原性を低減するために改変される。ある種の態様において、超荷電蛋白質は、細胞に機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）を送達するその能力を向上させるために改変される。ある種の態様において、超荷電蛋白質はポリマーにコンジュゲーションされる。例えば、蛋白質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーに蛋白質をコンジュゲーションすることによってＰＥＧ化され得る。他の方法が、蛋白質配列の改変無しに超荷電蛋白質を生成させるために用いられ得る。例えば、正味電荷を変化する部分が、超荷電を達成するための表面電荷を提供するために（例えば、化学または酵素反応によって）蛋白質に取り付けられ得る。ある種の態様において、Shaw et al., Protein Science 17: 1446, 2008に記載されている蛋白質を改変する方法が用いられて、本開示の本発明の技術に用いられる蛋白質を超荷電させる。
本開示の技術による使用に好適な数個の異なる超荷電蛋白質のバリアントの設計および作製が、国際ＰＣＴ特許出願PCT/US07/70254（２００７年６月１日出願、２００７年１２月１３日にWO2007/143574として公開）、国際ＰＣＴ出願PCT/US09/041984（２００９年４月２８日出願、２００９年１１月５日にWO2009/134808として公開）、および国際ＰＣＴ出願PCT/USlO/001250（２０１０年４月２８日出願、２０１０年１１月１１日にWO2010/129023として公開）に記載されており、そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。それらに記載された開示された超荷電蛋白質のいくつかは、より安定でありかつそれらの生物学的機能（例えば、蛍光蛋白質の場合ではそれらの蛍光）を保持するということが示されている。例えば、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａからの緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）はＧｅｎＢａｎｋ登録番号P42212に記載されており、参照によって本明細書に組み込まれる。この野生型ＧＦＰのアミノ酸配列は以下の通りである。
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK（配列番号１４）
野生型ＧＦＰは－７の理論上の正味電荷を有する。－２９、－３０、－２５、＋１５、＋２５、＋３６、＋４８、および＋４９の理論上の正味電荷を有するバリアントが、例えば国際ＰＣＴ出願PCT/USlO/001250（２０１０年４月２８日出願、２０１０年１１月１１日にWO2010/129023として公開）において報告されており、その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。＋３６ＧＦＰを９５℃まで熱した後でさえも、バリアント蛋白質の１００％が可溶性であり、蛋白質はその蛍光の≧７０％を保持する。
本開示のいくつかの側面は、＋３６ＧＦＰがターゲット細胞に機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）を効率的に送達し、そのように送達されたエフェクター蛋白質がそれらの生物学的機能を保持するという発見に基づく。そのため、少なくとも＋１５、少なくとも＋２５、少なくとも＋３０、少なくとも＋３５、または少なくとも＋４０の正味電荷を有するＧＦＰまたは他の蛋白質は、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を導入することに特に有用であると考えられる。
いくつかの態様において、特に有用な超荷電蛋白質は、＋３６ＧＦＰのものと類似の電荷分布または表面電荷密度を可能とする蛋白質である。さらに、いくつかの態様において、特に有用な超荷電蛋白質は、超荷電によって容易に撹乱されない安定なフォールディング構造を示す蛋白質であり、それゆえに超荷電蛋白質が良くフォールディングされることを可能とする。いくつかの態様において、特に有用な超荷電蛋白質は、本明細書または国際ＰＣＴ特許出願PCT/US07/70254（２００７年６月１日出願、２００７年１２月１３日にWO2007/143574として公開）、国際ＰＣＴ出願PCT/US09/041984（２００９年４月２８日出願、２００９年１１月５日にWO2009/134808として公開）、および国際ＰＣＴ出願PCT/US10/001250（２０１０年４月２８日出願、２０１０年１１月１１日にWO2010/129023として公開）（そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される超荷電蛋白質と構造的特徴を共有する蛋白質である（例えば球状構造またはβバレル構造）。蛋白質フォールディング、蛋白質フォールド構造安定性、および異なって荷電したアミノ酸による特異的なアミノ酸の置換による蛋白質フォールディングの撹乱、電荷分布、ならびに表面電荷密度は、本明細書において提供される方法およびアルゴリズムならびに当業者に公知の他のものによってインシリコモデリングされ得る。従って、問題の超荷電蛋白質が良くフォールディングするかどうかは慣例の実験法のみから当業者に明らかになるであろう。それゆえに、当業者は、所与の超荷電蛋白質が本明細書に記載される技術に従う機能的なエフェクター蛋白質の細胞内送達に有用であるかどうかを、所与のアミノ酸配列から同定する能力があるであろう。
ＧＦＰのいくつかの例示的な好適なバリアントは、限定無しに以下を包含する。
＋１５ＧＦＰ：
MGHHHHHHGGASKGERLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKKDGTYKTRAEVKFEGRTLVNRIELKGRDFKEKGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKRKNGIKANFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSALSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK（配列番号１５）
＋２５ＧＦＰ：
MGHHHHHHGGASKGERLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGTYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHNVYITADKRKNGIKANFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSALSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK（配列番号１６）
＋３６ＧＦＰ：
MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK（配列番号１７）
＋４２ＧＦＰ：
MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK（配列番号１８）
＋４８ＧＦＰ：
MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK（配列番号１９）
＋４９ＧＦＰ：
MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLKEFVTAAGIKHGRKERYK（配列番号２０）
（－）３０ＧＦＰ：
MGHHHHHHGGASKGEELFDGVVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPTLVTTLTYGVQCFSDYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDDHYLSTESALSKDPNEDRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK（配列番号２１）
上の配列がＮ末端Ｈｉｓ６タグを包含することと、かかるタグ無しまたは異なるタグ有りの配列もまた好適であるということとは当業者には明らかであろう。
細胞への送達後の機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）の生物学的機能を促進するためには、細胞内取り込み後の機能的なエフェクター蛋白質のエンドソーム脱出を向上させることが望ましくあり得る。超荷電蛋白質または機能的なエフェクター蛋白質が、エンドソーム分解またはエンドソームの溶解を向上させることが公知の蛋白質、ペプチド、または他の実体と融合されるかまたは結びつけられ得る。ある種の態様において、ペプチドはヘマグルチニン２（ＨＡ２）ペプチドであり、これはエンドソーム分解を向上させることが公知である。ある種の特定の態様において、ＨＡ２ペプチドは超荷電ＧＦＰ（例えば、＋３６ＧＦＰ）に融合する。ある種の特定の態様において、融合した蛋白質は以下の配列である。
＋３６ＧＦＰ－ＨＡ２
MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYKGSAGSAAGSGEFGLFGAIAGFIENGWEGMIDG（配列番号２２）
ある種の態様において、エンドソーム溶解性ペプチドはメリチンペプチド（ＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ。配列番号２３）である（Meyer et al., JACS 130(11): 3272-3273, 2008。これは参照によって本明細書に組み込まれる）。ある種の態様において、メリチンペプチドは１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換、欠失、および／または追加によって改変される。ある種の態様において、メリチンペプチドは配列ＣＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号２４）である。ある種の特定の態様において、メリチンペプチドは超荷電ＧＦＰ（例えば、＋３６ＧＦＰ）に融合する。
ある種の態様において、エンドソーム溶解性ペプチドはペネトラチンペプチド（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ－アミド。配列番号２５）、ウシＰｒＰ（１－３０）ペプチド（ＭＶＫＳＫＩＧＳＷＩＬＶＬＦＶＡＭＷＳＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ－アミド。配列番号２６）、ＭＰＧΔＮＬＳペプチド（Ｋ－＞Ｓ置換のため、機能的な核局在配列を欠く）（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＳＫＲＫＶ。配列番号２７）、ＴＰ－１０ペプチド（ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ－アミド。配列番号２８）、および／またはＥＢ１ペプチド（ＬＩＲＬＷＳＨＬＩＨＩＷＦＱＮＲＲＬＫＷＫＫＫ－アミド。配列番号２９）である（Lundberg et al., 2007, FASEB J. 21:2664。参照によって本明細書に組み込まれる）。ある種の態様において、ペネトラチン、ＰｒＰ（１－３０）、ＭＰＧ、ＴＰ－１０、および／またはＥＢ１ペプチドは、１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換、欠失、および／または追加によって改変される。ある種の特定の態様において、ＰｒＰ（１－３０）、ＭＰＧ、ＴＰ－１０、および／またはＥＢ１ペプチドは超荷電ＧＦＰ（例えば、＋３６ＧＦＰ）に融合する。いくつかの態様において、Ａｕｒｅｉｎペプチドは超荷電蛋白質に融合する。
他のペプチドまたは蛋白質もまた、超荷電蛋白質、または超荷電蛋白質と機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）とを含む融合蛋白質に融合され得る。例えば、ターゲット化ペプチドが、特定の細胞型に機能的なエフェクター蛋白質を選択的に送達するために超荷電蛋白質に融合され得る。機能的なエフェクター蛋白質の細胞内取り込みを向上させるペプチドまたは蛋白質もまた用いられ得る。ある種の態様において、超荷電蛋白質に融合されたペプチドはペプチドホルモンである。ある種の態様において、超荷電蛋白質に融合されたペプチドはペプチドリガンドである。
本明細書において詳細に記載される例示的な超荷電蛋白質は本開示を限定することは意味されていない。他の超荷電蛋白質が、機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）の細胞内送達のために用いられ得、他のＧＦＰ式蛍光蛋白質を包含するが、これに限定されないということを当業者は認めるであろう。ある種の態様において、超荷電蛋白質は青色蛍光蛋白質の超荷電バージョンである。ある種の態様において、超荷電蛋白質はシアン蛍光蛋白質の超荷電バージョンである。ある種の態様において、超荷電蛋白質は黄色蛍光蛋白質の超荷電バージョンである。例示的な好適な蛍光蛋白質は、エンハンスト緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）、ＡｃＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥＢＦＰ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＥＣＦＰ、ｍＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ－Ｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ、ｍＴＦＰ１（Ｔｅａｌ）、エンハンスト黄色蛍光蛋白質（ＥＹＦＰ）、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ－Ｔａｎｄｅｍ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、およびＡＱ１４３を包含するが、これに限定されない。
超荷電であり、かつ例えば本明細書に開示される機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）の送達に用いられ得るまだ他の蛋白質は、ヒストン構成物またはヒストン様蛋白質、高移動度グループ蛋白質（ＨＭＧ）、酵素（例えば、アミラーゼ、ペクチナーゼ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、グルコースイソメラーゼ、リパーゼ、フィターゼ、アルグルセラーゼ、イミグルセラーゼ、アガルシダーゼベータ、α－１－イズロニダーゼ、酸α－グルコシダーゼ、およびイズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼを包含する。
蛋白質以外の荷電ポリマーもまた、機能的なエフェクター蛋白質を送達するために用いられ得る。加えて、本明細書により詳細に記載される通り、カチオン性脂質および脂質様材料、さらにはカチオン性ポリマーもまた、機能的なエフェクター蛋白質を送達するために用いられ得る。好適なカチオン性脂質、脂質様材料、およびカチオン性ポリマーは本明細書に開示されており、追加の好適な脂質および脂質様材料は当業者に公知である（例えば、Akinc et al., Nature Biotechnology 26, 561-569 (2008)に記載されているもの参照。その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
超荷電蛋白質を用いる機能的なエフェクター蛋白質の送達
本発明は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロの細胞への機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）の送達のためのシステムおよび方法を提供する。かかるシステムおよび方法には、複合体または融合蛋白質を形成するための超荷電蛋白質との機能的なエフェクター蛋白質の結びつきと、細胞への複合体または融合蛋白質の送達とが典型的には関わる。いくつかの態様において、超荷電蛋白質によって送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質は治療活性を有する。いくつかの態様において、細胞への複合体または融合蛋白質の送達には、その必要がある対象に機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質を含む複合体または融合蛋白質を投与することが関わる。
いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）それ自体は細胞に入る能力がなくあり得るが、例えば共有結合または非共有結合的な相互作用を介して超荷電蛋白質と結びつけられたときには細胞に入る能力がある。いくつかの態様において、超荷電蛋白質に共有結合した機能的なエフェクター蛋白質を包含する組成物が提供される。いくつかの態様において、組成物は、ペプチド結合を介して（例えば、直接的な融合を介してまたはペプチドリンカーを介して）超荷電蛋白質に融合した機能的なエフェクター蛋白質を包含する。いくつかの態様において、組成物は、非共有結合的な相互作用によって超荷電蛋白質に結合した機能的なエフェクター蛋白質を包含する。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、機能的なエフェクター蛋白質が細胞に入ることを可能とするために利用される。いくつかの態様において、超荷電蛋白質に結びついた細胞に送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質は、例えば細胞内プロテアーゼ（例えばエンドソームプロテアーゼ）によるリンカーペプチドの切断によって、または特定の細胞内微小環境内における（例えばエンドソーム内における）超荷電蛋白質からの機能的なエフェクター蛋白質の解離によって、細胞への送達後に超荷電蛋白質から分離される。いくつかの態様において、本開示によって提供されるシステムまたは方法によって送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質は、治療活性を有する。
いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）は、本明細書において提供されるシステム、組成物、または方法によってインビボ、エクスビボ、またはインビトロで細胞に送達される。いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質は、ターゲット細胞内で生物学的機能を実行する能力がある蛋白質、例えば、その基質に結合してターゲット細胞内で酵素反応を触媒する能力がある酵素、例えば、ターゲット細胞内の核酸分子に結合して切断する能力があるヌクレアーゼ、またはターゲット細胞のゲノムと相互作用して細胞内のターゲット遺伝子の転写を活性化または阻害する能力がある転写因子である。
いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質と超荷電蛋白質との融合体を生成するための方法は、機能的な蛋白質および超荷電蛋白質のコード配列、さらには任意でペプチドリンカーをインフレームで含有する発現核酸構築物の生成、培養中の原核または真核細胞内でのかかる組み換え融合蛋白質の発現、融合蛋白質の融合蛋白質の抽出および精製を包含する。いくつかの態様において、核酸構築物は発現ベクター（例えば、細菌ホスト内での増数および原核または真核細胞内での発現に好適なベクター）の形態で生成される。
いくつかの態様において、融合蛋白質発現に好適なベクターは、両方のコード配列が互いにインフレームであることをもたらすクローニング手法によって、真核生物および／または原核生物プロモーターのコントロール下に超荷電蛋白質をコードするヌクレオチド配列を包含するクローニングベクター中への、送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質をコードするヌクレオチド配列のクローニングによって生成される。いくつかの態様において、クローニングベクターは、超荷電蛋白質をコードするヌクレオチド配列と、リンカーおよび超荷電蛋白質とインフレームで蛋白質をコードするヌクレオチド配列を挿入するために有用な制限部位との間に、ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を包含する。いくつかの態様において、クローニングベクターは、原核もしくは真核細胞内での融合蛋白質の発現を向上させるか、またはかかる細胞からの発現された融合蛋白質の精製を容易にする追加の配列をさらに包含する（例えば、融合蛋白質をコードする転写物を安定化する配列、例えばポリＡシグナル、スプライシング可能なイントロン、インフレームペプチドまたは蛋白質ドメインタグ（例えば、Ａｒｇタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、セルロース結合ドメインタグ、ＤｓｂＡタグ、ｃ－ｍｙｃタグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡＴタグ、Ｈｉｓタグ、マルトース結合蛋白質タグ、ＮｕｓＡタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、またはチオレドキシンタグ）をコードする配列、または、発現構築物を保有および発現する細胞の同定をならびに／もしくはかかる細胞における発現のレベルを定量することを可能とする選択マーカーもしくはレポーターカセット）。融合蛋白質をクローニングおよび発現するための方法は当業者に周知である。例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Volume 1-3, CSHL Press (1989)、Gellissen et al., Production of recombinant proteins, Wiley-VCH, 2005参照。
いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質は、ターゲット細胞への送達のために超荷電ＧＦＰ（例えば、＋３６ＧＦＰまたは－３０ＧＦＰ）と結びつけられる。超荷電蛋白質による高分子の送達におけるエンドソーム破壊の利益が以前に実証されており（Wadia et al., Nat. Med. 10, 310-315, 2004）、いくつかの態様において、向上したエンドソーム脱出を実現するための追加のステップが、本明細書において提供されるかまたは当分野において公知の通り実施される。高度に効率的な蛋白質内在化は、有効なエンドソーム放出とカップリングされたときに外来性蛋白質薬剤の要求される用量を最小化する可能性を有しており、研究ツールおよび治療薬開発のためのリードとしてのそれらの可能性を向上させる。
いくつかの態様において、超荷電蛋白質と結びついた機能的なエフェクター蛋白質を含む組成物は、単離および／または精製後にターゲット細胞に投与される。蛋白質単離法および技術は当業者に周知であり、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降を包含する。特定の機能的なエフェクター蛋白質、超荷電蛋白質、および／または融合蛋白質を単離および／または精製するための好適な方法は、それぞれの蛋白質の性質に依存するであろう。例えば、Ｈｉｓタグ融合蛋白質はＮｉまたはＣｏイオンクロマトグラフィーによって難なく単離および精製され得、一方、他のペプチドもしくはドメインによってタグづけされた融合蛋白質またはタグ無し融合蛋白質は、他の良く確立された方法によって精製され得る。
本明細書において提供されるシステムまたは方法によるインビボ、エクスビボ、またはインビトロのターゲット細胞への送達に好適な機能的なエフェクター蛋白質は当業者には明らかであろう。例えば、ＤＮＡ結合蛋白質（例えば転写因子およびヌクレアーゼ）、さらにはＣａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）を包含する。
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法、組成物、またはシステムは、細胞に治療用の機能的なエフェクター蛋白質を送達するために用いられる。治療用の蛋白質の例は、疾患または障害と結びついたゲノムアレルをターゲット化するヌクレアーゼおよびＣａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）、ならびに有益な遺伝子を活性化するかまたは病原性の遺伝子を抑制する転写因子を包含するが、これに限定されない。
いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、細胞への送達のために超荷電蛋白質に融合される。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は正に荷電する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９に融合される超荷電蛋白質は（＋３６）ＧＦＰである。いくつかの態様において、Ｃａｓ９と（＋３６）ＧＦＰとの融合体は（例えば、核局在シグナル（ＮＬＳ）有りまたは無しおよび６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３０のアミノ酸配列を含むか、または（例えば、核局在シグナル（ＮＬＳ）有りまたは無しおよび６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９に融合される超荷電蛋白質は（－３０）ＧＦＰである。いくつかの態様において、Ｃａｓ９と（－３０）ＧＦＰとの融合体は、（例えば、核局在シグナル（ＮＬＳ）有りまたは無しおよび６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、または（例えば、核局在シグナル（ＮＬＳ）有りまたは無しおよび６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
機能的なエフェクター蛋白質およびカチオン性脂質の組成物
本開示のある種の側面は、例えば「裸の」蛋白質調製物を送達することと対比して、エフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）の送達のためのカチオン性脂質の使用に関する。驚くべきことに、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸の送達のために操作された既存のリポソーム送達試薬が、本明細書に記載される通り、インビトロおよびインビボ両方である種のエフェクター蛋白質（例えば、そのバリアントおよび融合体を包含するＣａｓ９蛋白質）を有効に送達するということが見いだされた。核酸送達は、過去２０年間のリポソーム試薬の開発から大きく恩恵を受けて来た。カチオン性リポソーム製剤は、ＤＮＡおよびＲＮＡトランスフェクションが基礎研究における慣例の技術になることを可能にし、治験においてさえも用いられている。リポソームの脂質二重層は、封入された核酸を分解から保護し、核酸の裸の調製物に結合し得る抗体による特異的な中和を予防し得る。重要なことに、エンドソーム成熟中におけるエンドソーム膜とのリポソームの融合は、カチオン性脂質によって送達されるカーゴ（積み荷）の高度に効率的なエンドソーム脱出を可能にし得る。他の非カチオン性だが可逆的にイオン化可能な脂質ナノ粒子製剤は、核酸の効率的な封入および送達を可能にし、一方、非特異的な静電気的相互作用および帰結の隔離を回避した。しかしながら、蛋白質は化学的に多様であり、そのため高度にアニオン性の核酸とは違って、リポソーム製剤は蛋白質の効率的な送達については同様な成功はしなかった。例えば、蛋白質はインビトロの再水和脂質によって非特異的に封入および送達され得る一方で、封入の有効性は蛋白質濃度に依存し、一般的に非効率的であり、それゆえに広汎な応用はなされなかった。本開示の側面は、アニオン性蛋白質または蛋白質複合体（核酸と結びついた蛋白質を包含する）が、核酸送達のためのカチオン性リポソーム試薬によって用いられる同じ静電気学によって駆動される封入を活用する能力があり得るという認識に関する。少ない蛋白質が、核酸のリン酸バックボーン中に見いだされる負電荷の密度を自然に備えている一方で、本明細書に記載される負の超荷電蛋白質または核酸などのアニオン性担体との翻訳融合（translational fusion）または非共有結合的な結びつきは、もたらされるエフェクター蛋白質または蛋白質複合体を充分にアニオン性にして、カチオン性リポソーム試薬によるかかる蛋白質カーゴの効率的な封入を駆動する。
いくつかの態様において、操作された超負荷電ＧＦＰとの結びつきまたは融合は、核酸をトランスフェクションするために普通に用いられるカチオン性脂質による培養哺乳類細胞内への蛋白質の効率的な封入および送達を駆動することができる。この手法は低いナノモル蛋白質濃度および血清の存在下でさえも有効であり、カチオン性ペプチドまたは蛋白質への融合を用いる蛋白質送達法よりも１，０００倍まで効率的な機能的な蛋白質送達をもたらす。例に示されている通り、送達の有効性は、いくつかの態様において例えば融合タグの理論上の正味電荷に依存し、そのポピュラーな自然にアニオン性のペプチドタグ（例えば、３×ＦＬＡＧおよびＶＰ６４）は同様にリポソーム蛋白質送達を可能にし得る。
例は、ポリアニオン性ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と結びついたＣａｓ９ヌクレアーゼ蛋白質が、それらの普通のカチオン性リポソーム製剤によって哺乳類細胞内に機能的な形態で効率的に送達され得るということをさらに示す。なぜなら、いずれかの特定の理論によって束縛されることを求めるものではないが、ｇＲＮＡは、別様にはカチオン性のＣａｓ９蛋白質とカチオン性脂質との間のポリアニオン性の仲介物質として作用すると信じられるからである。Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体の送達は高度に効率的である（例えば、単一の処置からの８０％までの改変）のみならず、プラスミドトランスフェクションと比較して顕著に高いゲノム改変特異性をもまたもたらし、＞１０倍高いオンターゲット：オフターゲット改変比を典型的にはもたらす。これは、多分、送達されるＣａｓ９：ｇＲＮＡ活性の一過的な性質が原因である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体の送達は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍、または２５倍以上高いオンターゲット：オフターゲット改変比をもたらす。例は、例えばマウスの内耳の有毛細胞に機能的なＣｒｅリコンビナーゼおよび機能的なＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体を送達することによって、この蛋白質送達手法がインビボで有効であり得るということをもまた実証している。
従って、本発明のいくつかの側面は、Ｃａｓ９蛋白質（例えば、本明細書に記載される通り。例えば、下のＣａｓ９エフェクター蛋白質参照）と細胞の内部にＣａｓ９蛋白質を送達することができるカチオン性脂質とを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はｇＲＮＡと結びつき、これは例えば複合体にアニオン性電荷を提供し、それによって、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体がカチオン性脂質によって封入されることを可能とする。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はカチオン性脂質による有効な封入のためにｇＲＮＡと結びつく必要はなく、代わりに、本明細書に記載される負の超荷電蛋白質と結びつけられる。Ｃａｓ９蛋白質が負の超荷電蛋白質と結びつけられるいくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はｇＲＮＡともまた結びつけられる。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は野生型Ｃａｓ９蛋白質、野生型Ｃａｓ９蛋白質の断片、または野生型Ｃａｓ９蛋白質のバリアントである。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はｄＣａｓ９ドメイン（例えば、本明細書に記載される通り）を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はｄＣａｓ９ドメイン（例えば、本明細書に記載される通り）を含む融合蛋白質である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はＣａｓ９ニッカーゼである。
他の態様において、（例えば、Ｃａｓ９蛋白質以外の）エフェクター蛋白質とカチオン性脂質とを含む組成物が提供され、これが細胞の内部に（例えば細胞の核に）エフェクター蛋白質を送達することができる。エフェクター蛋白質は、天然に負に荷電しているか、正味の負の総電荷を有するように改変されるか、または本明細書に記載される負の超荷電蛋白質と結びつけられるかのいずれかである。いくつかの態様において、エフェクター蛋白質は本明細書に記載されるいずれかのエフェクター蛋白質である。いくつかの態様において、エフェクター蛋白質はリコンビナーゼ、例えば本明細書に記載されるいずれかのリコンビナーゼである。いくつかの態様において、リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。いくつかの態様において、Ｃｒｅリコンビナーゼは、（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３２のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃｒｅリコンビナーゼは、（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃｒｅリコンビナーゼは超荷電蛋白質（例えば、＋３６ＧＦＰまたは－３０ＧＦＰ）に融合される。いくつかの態様において超荷電蛋白質に融合されたＣｒｅリコンビナーゼは（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３３もしくは（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３４のアミノ酸配列を含むか、または（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３３もしくは配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、エフェクター蛋白質はＴＡＬＥ蛋白質である（例えば、本明細書に記載される通り。例において提供されるものを包含する）。いくつかの態様において、ＴＡＬＥ蛋白質はＶＰ６４転写活性化因子ドメイン（例えば、配列番号３５）の１つまたは２つ以上を含む。いくつかの態様において、ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを有するＴＡＬＥ蛋白質は、（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３６～３９からなる群から選択されるアミノ酸配列をさらに含む。いくつかの態様において、ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを有するＴＡＬＥ蛋白質は、（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３６～３９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＴＡＬＥエフェクター蛋白質は、（－３０）ＧＦＰドメイン（例えば、配列番号２１または配列番号４０）、ＴＡＬＥドメインのＮ末端領域（例えば、配列番号４１）、可変リピートドメイン（例えば、Maeder et al.,「Robust, synergistic regulation of human gene expression using TALE activators.」Nat. Methods. 2013; 10, 243-245において提供されている１８．５ｍｅｒリピートドメイン）、Ｃ末端ＴＡＬＥドメイン（例えば、配列番号４２）、ＶＰ６４活性化ドメイン（例えば、配列番号３５）、および任意で１つまたは２つ以上のリンカー（例えば、ＧＧＳ（９）、配列番号２５２）をいずれかのドメインと任意で配列タグ（例えば６×Ｈｉｓ。配列番号２５３）との間に含む。
ＤＮＡおよびＲＮＡなどのカーゴのリポソーム送達は、ターゲット化された細胞に毒性を誘導するということが公知である。一方で、本明細書に記載される本発明組成物は、驚くべきことに毒性無しでまたは低い毒性でインビトロおよびインビボ両方でそれらのカーゴを送達するということが見いだされた。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載されるＣａｓ９蛋白質または他のエフェクター蛋白質を含む組成物は、（例えば、インビトロまたはインビボの）細胞の集団に投与されたときに低い毒性を示す。いくつかの態様において、集団中の細胞の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、Ｃａｓ９蛋白質または他のエフェクター蛋白質とカチオン性脂質とを含む本発明組成物の投与後に生存可能である。細胞の集団に投与されたときに組成物の毒性を評価するための方法は当分野において周知であり、例に記載されるものを包含する。
Ｃｒｅ－６×Ｈｉｓ（６×Ｈｉｓタグは下線）：
MASNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGDGGSHHHHHH（配列番号３２）
（－３０）ＧＦＰ：
MGASKGEELFDGVVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPTLVTTLTYGVQCFSDYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDDHYLSTESALSKDPNEDRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK（配列番号４０）
Ｎ末端ＴＡＬＥドメイン：
APKKKRKVGIHRGVPMVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNL（配列番号４１）
Ｃ末端ＴＡＬＥドメイン：
LESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVADHAQVVRVLGFFQCHSHPAQAFDDAMTQFGMSGGGS（配列番号４２）
ＶＰ６４活性化ドメイン：
GRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDML（配列番号３５）
機能的なエフェクター蛋白質およびカチオン性ポリマーの組成物
本開示のある種の側面は、例えば「裸の」蛋白質調製物を送達することと対比して、エフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）の送達のためのカチオン性ポリマーの使用に関する。カチオン性脂質と同じく、本開示の側面は、アニオン性蛋白質または蛋白質複合体（核酸と結びついた蛋白質を包含する）が、機能的なエフェクター蛋白質の送達のために、カチオン性ポリマーによる静電気学によって駆動される封入および／または結びつきを活用し得るという認識に関する。少ない蛋白質が、核酸のリン酸バックボーン中に見いだされる負電荷の密度を自然に備えている一方で、本明細書に記載される負の超荷電蛋白質または核酸などのアニオン性担体との翻訳融合または非共有結合的な結びつきは、もたらされるエフェクター蛋白質または蛋白質複合体を充分にアニオン性にして、カチオン性ポリマーによるかかる蛋白質カーゴの効率的な封入／結びつきを駆動する。
いくつかの態様において、操作された超負荷電ＧＦＰとの結びつきまたは融合は、カチオン性ポリマーによる効率的な封入／結びつきと培養哺乳類細胞内への蛋白質の送達とを駆動することができる。いくつかの態様において、ポリアニオン性のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と結びついたＣａｓ９蛋白質は、カチオン性ポリマーを用いて哺乳類細胞内に機能的な形態で効率的に送達され得る。従って、いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質とカチオン性ポリマーとを含む組成物が提供され、Ｃａｓ９蛋白質はｇＲＮＡと結びつき、組成物は細胞の内部にＣａｓ９蛋白質を送達することができる。いくつかの態様において、カチオン性ポリマーを用いるＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体の送達は、Ｃａｓ９蛋白質のプラスミドトランスフェクションと比較して少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、２０倍、または２５倍以上高いオンターゲット：オフターゲット改変比をもたらす。
従って、本開示のいくつかの側面は、Ｃａｓ９蛋白質（例えば、本明細書に記載される通り。例えば、下のＣａｓ９エフェクター蛋白質参照）と細胞の内部にＣａｓ９蛋白質を送達することができるカチオン性ポリマーとを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はｇＲＮＡと結びつけられ、これが例えば複合体にアニオン性電荷を提供し、それによってＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体がカチオン性ポリマーによって封入および／または結びつかれることを可能とする。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はカチオン性脂質による有効な封入および／または結びつきのためにｇＲＮＡと結びつく必要はなく、代わりに、本明細書に記載される負の超荷電蛋白質と結びつけられる。Ｃａｓ９蛋白質が負の超荷電蛋白質と結びつけられるいくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はｇＲＮＡともまた結びつけられる。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は野生型Ｃａｓ９蛋白質、野生型Ｃａｓ９蛋白質の断片、または野生型Ｃａｓ９蛋白質のバリアントである。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は（例えば、本明細書に記載される通り）ｄＣａｓ９ドメインを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、（例えば、本明細書に記載される通り）ｄＣａｓ９ドメインを含む融合蛋白質である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質はＣａｓ９ニッカーゼである。
他の態様において、（例えば、Ｃａｓ９蛋白質以外の）エフェクター蛋白質とカチオン性ポリマーとを含む組成物が提供され、これが細胞の内部に（例えば細胞の核に）エフェクター蛋白質を送達することができる。エフェクター蛋白質は、天然に負に荷電しているか、正味の負の総電荷を有するように改変されるか、または本明細書に記載される負の超荷電蛋白質と結びつけられるかのいずれかである。いくつかの態様において、エフェクター蛋白質は本明細書に記載されるいずれかのエフェクター蛋白質である。いくつかの態様において、エフェクター蛋白質はリコンビナーゼ（例えば本明細書に記載されるいずれかのリコンビナーゼ）である。いくつかの態様において、リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。いくつかの態様において、Ｃｒｅリコンビナーゼは（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３２のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃｒｅリコンビナーゼは、（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃｒｅリコンビナーゼは超荷電蛋白質（例えば、＋３６ＧＦＰまたは－３０ＧＦＰ）に融合される。いくつかの態様において、超荷電蛋白質に融合されたＣｒｅリコンビナーゼは（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３３もしくは（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３４のアミノ酸配列を含むか、または（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３３もしくは配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、エフェクター蛋白質はＴＡＬＥ蛋白質である（例えば、本明細書に記載される通り、例において提供されるものを包含する）。いくつかの態様において、ＴＡＬＥ蛋白質はＶＰ６４転写活性化因子ドメイン（例えば、配列番号３５）の１つまたは２つ以上を包含する。いくつかの態様において、ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを有するＴＡＬＥ蛋白質は、（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３６～３９からなる群から選択されるアミノ酸配列をさらに含む。いくつかの態様において、ＶＰ６４転写活性化因子ドメインを有するＴＡＬＥ蛋白質は、（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号３６～３９からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＴＡＬＥエフェクター蛋白質は、（－３０）ＧＦＰドメイン（例えば、配列番号２１または配列番号４０）、ＴＡＬＥドメインのＮ末端領域（例えば、配列番号４１）、可変リピートドメイン（例えば、Maeder et al.,「Robust, synergistic regulation of human gene expression using TALE activators.」Nat. Methods. 2013; 10, 243-245において提供されている１８．５ｍｅｒリピートドメイン）、Ｃ末端ＴＡＬＥドメイン（例えば、配列番号４２）、ＶＰ６４活性化ドメイン（例えば、配列番号３５）、ならびに任意で１つまたは２つ以上のリンカー（例えばＧＧＳ（９）。配列番号２５２）をいずれかのドメインと任意で配列タグ（例えば６×Ｈｉｓ。配列番号２５３）との間に含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるＣａｓ９蛋白質または他のエフェクター蛋白質とカチオン性ポリマーとを含む組成物は、（例えば、インビトロまたはインビボの）細胞の集団に投与されたときに低い毒性を示す。いくつかの態様において、集団中の細胞の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、Ｃａｓ９蛋白質または他のエフェクター蛋白質とカチオン性ポリマーとを含む本発明組成物の投与後に生存可能である。細胞の集団に投与されたときに組成物の毒性を評価するための方法は当分野において周知であり、例に記載されるものを包含する。
Ｃａｓ９エフェクター蛋白質
いくつかの態様において、ＲＮＡによってプログラミング可能な蛋白質（またはその断片もしくはバリアント）を含むエフェクター蛋白質が、本明細書において提供されるシステムまたは方法によってターゲット細胞に送達される。いくつかの態様において、ＲＮＡによってガイドされるまたはＲＮＡによってプログラミング可能なヌクレアーゼが、本明細書において提供されるシステムまたは方法によってターゲット細胞に送達される。いくつかの態様において、ＲＮＡによってプログラミング可能な蛋白質はＣａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９バリアント、またはＣａｓ９蛋白質の融合体であり、これは本明細書において提供されるシステムまたは方法によってターゲット細胞に送達される。
いくつかの態様において、ＲＮＡによってプログラミング可能なヌクレアーゼは、（ＣＲＩＳＰＲ関連システム）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９（Ｃｓｎ１）である（例えば、「Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.」Ferretti J. J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L. expand/collapse author list McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)、「CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.」Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)、および「A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.」Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。ＲＮＡによってプログラミング可能なヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いてターゲットＤＮＡ切断部位を決定するので、それらの蛋白質は、ガイドＲＮＡによって規定されるいずれかの配列を原理的には切断する能力がある。部位特異的な切断のために（例えばゲノムを改変するために）Ｃａｓ９などのＲＮＡによってプログラミング可能なヌクレアーゼを用いる方法は、当分野において公知である（例えば、Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)、Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)、Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)、Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013)、Dicarlo, J.E. et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013)、Jiang, W. et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは場合によってはｃａｓｎ１ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的に点在する短いパリンドロームリピート）関連ヌクレアーゼともまた言われる。ＣＲＩＳＰＲは、可動性遺伝子エレメント（ウイルス、転移因子、および接合性プラスミド）からの保護を提供する適応免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー（先行可動性因子に相補的な配列）を含有し、侵入核酸をターゲット化する。ＣＲＩＳＰＲクラスターは転写およびプロセシングされてＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）になる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの正しいプロセシングはｔｒａｃｒＲＮＡ（トランスにコードされるスモールＲＮＡ）、内在性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）、およびＣａｓ９蛋白質を要求する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼ３によって補助されるプロセシングのためのガイドとして働く。その後に、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的なリニアなまたは環状のｄｓＤＮＡターゲットをエンド的に（endonucleolytically）切断する。ｃｒＲＮＡに相補的でないターゲット鎖が最初にエンド的に切断され、それから３’から５’にエキソ的に（exonucleolytically）トリミングされる。天然には、ＤＮＡ結合および切断は、典型的には蛋白質および両方のＲＮＡを要求する。しかしながら、シングルガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または単純に「ｇＮＲＡ」）は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ両方の側面を単一のＲＮＡ種に組み込むように操作され得る。例えば、Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照。その全内容は参照によってここに組み込まれる。Ｃａｓ９はＣＲＩＳＰＲリピート配列中の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己対非自己を見分けることを助ける。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列および構造は当業者に周知である（例えば、「Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.」Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L. expand/collapse author list McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)、「CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.」Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)、および「A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.」Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
Ｃａｓ９オーソログは様々な種において記載されており、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを包含するが、これに限定されない。追加の好適なＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。かかるＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier,「The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems」(2013) RNA Biology 10:5, 726-737に開示されている生物および遺伝子座からのＣａｓ９配列を包含し、その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質またはその断片を含む蛋白質は「Ｃａｓ９バリアント」と言われる。Ｃａｓ９バリアントはＣａｓ９またはその断片に対する相同性を共有する。例えば、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９バリアントはＣａｓ９の断片（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン、Ｎ末端ドメインまたはＣ末端ドメインなど）を含み、その結果、断片は野生型Ｃａｓ９の対応する断片と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％である。いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９に対応する（ＮＣＢＩ参照配列：NC_017053.1、配列番号４３（ヌクレオチド）、配列番号４４（アミノ酸））。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は不活性な（例えば不活性型の）ＤＮＡ切断ドメインを有する。ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９蛋白質は、交換可能に、（ヌクレアーゼ「不能（dead）」Ｃａｓ９として）「ｄＣａｓ９」蛋白質と言われ得る。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、部分的または全体的に、下の配列番号４５として示されているアミノ酸に対応するか、またはそれを含む。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９のバリアント（例えば、配列番号４５のバリアント）が提供される。例えば、いくつかの態様において、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ以外の変異を有するバリアントが提供され、これがヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をもたらす。かかる変異は、例として、Ｄ１０およびＨ８４０における他のアミノ酸置換、またはＣａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の置換（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよび／またはＲｕｖＣ１サブドメイン内の置換）を包含する。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９のバリアントまたはホモログ（例えば、配列番号４５のバリアント）が提供され、これらは配列番号４５と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％である。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９のバリアント（例えば、配列番号４５のバリアント）が提供され、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００または１０１アミノ酸以上だけ配列番号４５よりも短いかまたは長いアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９「ニッカーゼ」が提供され、これはＣａｓ９中の単一のヌクレアーゼドメインを不活性化する変異を含む。かかるニッカーゼは、二本鎖切断と対比してターゲット核酸中の一本鎖切断を誘導する。
Ｃａｓ９
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGATTATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGGCAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGCAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAATCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTAGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAGAAATGGCTTGTTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGATTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATAGTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAGCGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAGGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGCGCCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGGGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGATATTCAAAAAGCACAGGTGTCTGGACAAGGCCATAGTTTACATGAACAGATTGCTAACTTAGCTGGCAGTCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAATTGTTGATGAACTGGTCAAAGTAATGGGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTACAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCATTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTACTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA（配列番号４３）
Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD（配列番号４６）
いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質を含む融合蛋白質が、本明細書に記載される組成物および方法のいずれかへの使用のために提供される。いくつかの態様において、融合蛋白質はｄＣａｓ９蛋白質（例えば、本明細書に記載される通り）を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、リンカー（例えば、本明細書に記載される通り）をｄＣａｓ９と１つまたは２つ以上のドメイン（例えば、酵素ドメイン）との間に含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、ｄＣａｓ９と転写活性化因子ドメイン、転写抑制因子ドメイン、リコンビナーゼドメイン、遺伝子編集ドメイン（例えばデアミナーゼドメイン（doman））、またはエピジェネティック修飾因子ドメインとを含む。
いくつかの態様において、本明細書において提供される例示的な融合蛋白質の一般的な構造は、構造
［ＮＨ２］－［酵素ドメイン］－［ｄＣａｓ９］－［ＣＯＯＨ］、または
［ＮＨ２］－［ｄＣａｓ９］－［酵素ドメイン］－［ＣＯＯＨ］
を含み、ＮＨ２は融合蛋白質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合蛋白質のＣ末端であり、酵素ドメインは、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）、リコンビナーゼ触媒ドメイン（例えば、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、またはＴｎ３リコンビナーゼドメイン）、核酸編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン）、転写活性化因子ドメイン（例えば、ＶＰ６４、ｐ６５）、転写抑制因子ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ）、またはエピジェネティック修飾因子（例えば、ＬＳＤ１ヒストン脱メチル化酵素、ＴＥＴ１ヒドロキシラーゼ）を含む。
追加の特徴、例えばある種のドメイン間の１つまたは２つ以上のリンカー配列が存在し得る。存在し得る他の例示的な特徴は、局在配列、例えば核局在配列（ＮＬＳ。例えばＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＲＧＶＰ（配列番号４７））、細胞質局在配列、排出配列、例えば核外排出配列、または他の局在配列、さらには融合蛋白質の可溶化、精製、または検出に有用である配列タグである。好適な局在シグナル配列および蛋白質タグの配列が本明細書において提供されており、当分野において公知であり、ビオチンカルボキシラーゼキャリア蛋白質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ（例えば３×ＦＬＡＧタグ。ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号４８））、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ポリヒスチジンタグ（ヒスチジンタグまたはＨｉｓタグともまた言われる）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシンタグ、Ｓタグ、Ｓｏｆｔａｇ（例えば、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３）、ｓｔｒｅｐタグ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグ、およびＳＢＰタグを包含するが、これに限定されない。追加の好適な配列は当業者には明らかであろう。
いくつかの態様において、酵素ドメインはヌクレアーゼまたはその触媒ドメインを含む。例えば、いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメインを有する例示的なリガンド依存性ｄＣａｓ９融合蛋白質の一般的な構造は、構造
［ＮＨ２］－［ＮＬＳ］－［ｄＣａｓ９］－［ヌクレアーゼ］－［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］－［ＮＬＳ］－［ヌクレアーゼ］－［ｄＣａｓ９］－［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］－［ｄＣａｓ９］－［ヌクレアーゼ］－［ＣＯＯＨ］、または
［ＮＨ２］－［ヌクレアーゼ］－［ｄＣａｓ９］－［ＣＯＯＨ］
を含み、ＮＬＳは核局在シグナルであり、ＮＨ２は融合蛋白質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合蛋白質のＣ末端である。いくつかの態様において、リンカーがｄＣａｓ９とヌクレアーゼドメインとの間に挿入される。いくつかの態様において、リンカーがＮＬＳとヌクレアーゼおよび／またはｄＣａｓ９ドメインとの間に挿入される。いくつかの態様において、ＮＬＳはヌクレアーゼおよび／またはｄＣａｓ９ドメインのＣ末端に位置する。いくつかの態様において、ＮＬＳはヌクレアーゼとｄＣａｓ９ドメインとの間に位置する。配列タグなどの追加の特徴もまた存在し得る。いくつかの側面において、ヌクレアーゼドメインは、ターゲット核酸（例えばＤＮＡ）を切断するために二量体化（例えば、ヌクレアーゼの２つの単量体の一緒になること）を要求するヌクレアーゼである。いくつかの態様において、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインの単量体である。ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインは公知であり、いくつかの側面において、ＦｏｋＩのアミノ酸３８８～５８３に対応する（ＮＣＢＩ登録番号J04623）。いくつかの態様において、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインはＦｏｋＩのアミノ酸３００～５８３、３２０～５８３、３４０～５８３、または３６０～５８３に対応する。Wah et al.,「Structure of FokI has implications for DNA cleavage」Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 1 ;95(18): 10564-9、Li et al.,「TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain」Nucleic Acids Res. 2011; 39(l):359-72、Kim et al.,「Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain」Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996; 93: 1156-1160をもまた参照。それぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインは、配列番号４９として示されているアミノ酸配列に対応するか、またはそれを部分的にもしくは全体的に含む。いくつかの態様において、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインは、本明細書に記載されるＦｏｋＩのバリアント（例えば、配列番号４９のバリアント）である。ｄＣａｓ９－ヌクレアーゼ融合蛋白質を用いる他の例示的な組成物および方法は、２０１４年６月３０日出願の「Cas9-FokI Fusion Proteins and Uses Thereof」と題するＵ．Ｓ．特許出願U.S.S.N14/320,498に見いだされ得、その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン：
GSQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF（配列番号４９）
ｆＣａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９－ＮＬＳ－ＧＧＳ３リンカー－ＦｏｋＩ）：
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GTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTT（配列番号５０）
ｆＣａｓ９（例えば、ＮＬＳ－ｄＣａｓ９－ＧＧＳ３リンカー－ＦｏｋＩ）：
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACTCAGGTGGAAGTGGCGGCAGCGGAGGTTCTGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTT（配列番号５１）
ｆＣａｓ９（例えば、ＦｏｋＩ－ＧＧＳ３リンカー－ｄＣａｓ９－ＮＬＳ）：
ATGGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTGGCGGTAGTGGGGGATCTGGGGGAAGTATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGA（配列番号５２）
ｆＣａｓ９（例えば、ＮＬＳ－ＦｏｋＩ－ＧＧＳ３リンカー－ｄＣａｓ９）：
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTGGAGGTTCTATGGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTGGCGGTAGTGGGGGATCTGGGGGAAGTATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAA
TCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGAC（配列番号５３）
ｆＣａｓ９：
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTGGAGGTTCTGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTAGCGGCAGCGAGACTCCCGGGACCTCAGAGTCCGCCACACCCGAAAGTGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGAC（配列番号５４）
いくつかの態様において、酵素ドメインはリコンビナーゼまたはその触媒ドメインを含む。例えば、いくつかの態様において、リコンビナーゼドメインを有する例示的なリガンド依存性ｄＣａｓ９融合蛋白質の一般的な構造は、構造
［ＮＨ２］－［ＮＬＳ］－［ｄＣａｓ９］－［リコンビナーゼ］－［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］－［ＮＬＳ］－［リコンビナーゼ］－［ｄＣａｓ９］－［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］－［ｄＣａｓ９］－［リコンビナーゼ］－［ＣＯＯＨ］、または
［ＮＨ２］－［リコンビナーゼ］－［ｄＣａｓ９］－［ＣＯＯＨ］、
を含み、ＮＬＳは核局在シグナルであり、ＮＨ２は融合蛋白質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合蛋白質のＣ末端である。いくつかの態様において、リンカーがｄＣａｓ９とリコンビナーゼドメインとの間に挿入される。いくつかの態様において、リンカーがＮＬＳとリコンビナーゼおよび／またはｄＣａｓ９ドメインとの間に挿入される。いくつかの態様において、ＮＬＳはリコンビナーゼドメインおよび／またはｄＣａｓ９ドメインのＣ末端に位置する。いくつかの態様において、ＮＬＳはリコンビナーゼドメインとｄＣａｓ９ドメインとの間に位置する。配列タグなどの追加の特徴もまた存在し得る。「リコンビナーゼの触媒ドメイン」によって、融合蛋白質がリコンビナーゼの（例えばそれに由来する）アミノ酸配列を含むドメインを包含し、その結果、ドメインは（単独でかまたは追加の因子（他のリコンビナーゼ触媒ドメインを包含し、それらは融合蛋白質の一部を形成し得るかまたは形成せずにあり得る）と一緒にのいずれかで）ターゲット核酸と接触したときに組み換えを誘導するために充分であるということが意味されている。いくつかの態様において、リコンビナーゼの触媒ドメインはリコンビナーゼのＤＮＡ結合ドメインを包含しない。いくつかの態様において、リコンビナーゼの触媒ドメインはリコンビナーゼの一部または全てを包含する。例えば、触媒ドメインはリコンビナーゼドメインおよびＤＮＡ結合ドメインもしくはその一部を包含し得るか、または、触媒ドメインはリコンビナーゼドメインとＤＮＡ結合活性を廃するように変異導入または末端欠損されたＤＮＡ結合ドメインとを包含し得る。リコンビナーゼおよびリコンビナーゼの触媒ドメインは当業者に公知であり、例えば本明細書に記載されるものを包含する。いくつかの態様において、触媒ドメインはいずれかのリコンビナーゼに由来する。いくつかの態様において、リコンビナーゼ触媒ドメインは、Ｔｎ３リゾルベース、Ｈｉｎリコンビナーゼ、またはＧｉｎリコンビナーゼの触媒ドメインである。いくつかの態様において、触媒ドメインは、下で提供される配列番号５５を部分的にまたは全体的に含むヌクレオチド配列によってコードされるＴｎ３リゾルベース（例えば、ＳｔａｒｋのＴｎ３リコンビナーゼ）を含む。いくつかの態様において、Ｔｎ３触媒ドメインは配列番号５５のバリアントによってコードされる。いくつかの態様において、Ｔｎ３触媒ドメインは、配列番号５６に対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（またはそのバリアント）によってコードされる。いくつかの態様において、触媒ドメインは、下で提供される配列番号５７を部分的にまたは全体的に含むヌクレオチド配列によってコードされるＨｉｎリコンビナーゼを含む。いくつかの態様において、Ｈｉｎ触媒ドメインは配列番号５７のバリアントによってコードされる。いくつかの態様において、Ｈｉｎ触媒ドメインは、配列番号５８に対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（またはそのバリアント）によってコードされる。いくつかの態様において、触媒ドメインは、下で提供される配列番号５９を部分的にまたは全体的に含むヌクレオチド配列によってコードされるＧｉｎリコンビナーゼ（例えばＧｉｎベータリコンビナーゼ）を含む。いくつかの態様において、Ｇｉｎ触媒ドメインは配列番号５９のバリアントによってコードされる。いくつかの態様において、Ｇｉｎ触媒ドメインは、配列番号６０に対応するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（またはそのバリアント）によってコードされる。他の例示的な組成物とｄＣａｓ９－リコンビナーゼ融合蛋白質を用いる方法とは、２０１４年６月３０日出願の「Cas9 Variants and Uses Thereof」と題するＵ．Ｓ．特許出願U.S.S.N14/320,467に見いだされ得、その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
ＳｔａｒｋのＴｎ３リコンビナーゼ（ヌクレオチド：配列番号５５、アミノ酸：配列番号５６）：
ATGGCCCTGTTTGGCTACGCACGCGTGTCTACCAGTCAACAGTCACTCGATTTGCAAGTGAGGGCTCTTAAAGATGCCGGAGTGAAGGCAAACAGAATTTTTACTGATAAGGCCAGCGGAAGCAGCACAGACAGAGAGGGGCTGGATCTCCTGAGAATGAAGGTAAAGGAGGGTGATGTGATCTTGGTCAAAAAATTGGATCGACTGGGGAGAGACACAGCTGATATGCTTCAGCTTATTAAAGAGTTTGACGCTCAGGGTGTTGCCGTGAGGTTTATCGATGACGGCATCTCAACCGACTCCTACATTGGTCTTATGTTTGTGACAATTTTGTCCGCTGTGGCTCAGGCTGAGCGGAGAAGGATTCTCGAAAGGACGAATGAGGGACGGCAAGCAGCTAAGTTGAAAGGTATCAAATTTGGCAGACGAAGG（配列番号５５）
MALFGYARVSTSQQSLDLQVRALKDAGVKANRIFTDKASGSSTDREGLDLLRMKVKEGDVILVKKLDRLGRDTADMLQLIKEFDAQGVAVRFIDDGISTDSYIGLMFVTILSAVAQAERRRILERTNEGRQAAKLKGIKFGRRR（配列番号５６）
Ｈｉｎリコンビナーゼ（ヌクレオチド：配列番号５７、アミノ酸：配列番号５８）：
ATGGCAACCATTGGCTACATAAGGGTGTCTACCATCGACCAAAATATCGACCTGCAGCGCAACGCTCTGACATCCGCCAACTGCGATCGGATCTTCGAGGATAGGATCAGTGGCAAGATCGCCAACCGGCCCGGTCTGAAGCGGGCTCTGAAGTACGTGAATAAGGGCGATACTCTGGTTGTGTGGAAGTTGGATCGCTTGGGTAGATCAGTGAAGAATCTCGTAGCCCTGATAAGCGAGCTGCACGAGAGGGGTGCACATTTCCATTCTCTGACCGATTCCATCGATACGTCTAGCGCCATGGGCCGATTCTTCTTTTACGTCATGTCCGCCCTCGCTGAAATGGAGCGCGAACTTATTGTTGAACGGACTTTGGCTGGACTGGCAGCGGCTAGAGCACAGGGCCGACTTGGA（配列番号５７）
MATIGYIRVSTIDQNIDLQRNALTSANCDRIFEDRISGKIANRPGLKRALKYVNKGDTLVVWKLDRLGRSVKNLVALISELHERGAHFHSLTDSIDTSSAMGRFFFYVMSALAEMERELIVERTLAGLAAARAQGRLG（配列番号５８）
Ｇｉｎベータリコンビナーゼ（ヌクレオチド：配列番号５９、アミノ酸：配列番号６０）：
ATGCTCATTGGCTATGTAAGGGTCAGCACCAATGACCAAAACACAGACTTGCAACGCAATGCTTTGGTTTGCGCCGGATGTGAACAGATATTTGAAGATAAACTGAGCGGCACTCGGACAGACAGACCTGGGCTTAAGAGAGCACTGAAAAGACTGCAGAAGGGGGACACCCTGGTCGTCTGGAAACTGGATCGCCTCGGACGCAGCATGAAACATCTGATTAGCCTGGTTGGTGAGCTTAGGGAGAGAGGAATCAACTTCAGAAGCCTGACCGACTCCATCGACACCAGTAGCCCCATGGGACGATTCTTCTTCTATGTGATGGGAGCACTTGCTGAGATGGAAAGAGAGCTTATTATCGAAAGAACTATGGCTGGTATCGCTGCTGCCCGGAACAAAGGCAGACGGTTCGGCAGACCGCCGAAGAGCGGC（配列番号５９）
MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFYVMGALAEMERELIIERTMAGIAAARNKGRRFGRPPKSG（配列番号６０）
いくつかの態様において、酵素ドメインはデアミナーゼまたはその触媒ドメインを含む。例えば、いくつかの態様において、デアミナーゼ酵素またはドメインを有する例示的なｄＣａｓ９融合蛋白質の一般的な構造は、構造
［ＮＨ２］－［ＮＬＳ］－［Ｃａｓ９］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］－［ＮＬＳ］－［デアミナーゼ］－［Ｃａｓ９］－［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］－［Ｃａｓ９］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］、または
［ＮＨ２］－［デアミナーゼ］－［Ｃａｓ９］－［ＣＯＯＨ］
を含み、ＮＬＳは核局在シグナルであり、ＮＨ２は融合蛋白質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合蛋白質のＣ末端である。いくつかの態様において、リンカーがｄＣａｓ９とデアミナーゼドメインとの間に挿入される。いくつかの態様において、リンカーがＮＬＳとデアミナーゼおよび／またはｄＣａｓ９ドメインとの間に挿入される。いくつかの態様において、ＮＬＳはデアミナーゼおよび／またはｄＣａｓ９ドメインのＣ末端に位置する。いくつかの態様において、ＮＬＳはデアミナーゼドメインとｄＣａｓ９ドメインとの間に位置する。配列タグなどの追加の特徴もまた存在し得る。核酸編集酵素およびドメインの１つの例示的な好適な型は、例えば、シトシンデアミナーゼ酵素のアポリポ蛋白質ＢｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのシトシンデアミナーゼであり、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）およびアポリポ蛋白質Ｂ編集複合体３（ＡＰＯＢＥＣ３）酵素を包含する。本発明への使用に好適な核酸編集酵素およびそのドメインの別の例示的な好適な型は、アデノシンデアミナーゼを包含する。例えば、ＡＤＡＴファミリーアデノシンデアミナーゼがｄＣａｓ９ドメインに融合され得る。本開示の側面に従ってｄＣａｓ９ドメインに融合され得るいくつかの例示的な好適な核酸編集酵素およびドメイン（例えばデアミナーゼおよびデアミナーゼドメイン）が、下で提供される。いくつかの態様において、それぞれの配列の活性ドメイン、例えば局在シグナル（核局在シグナル、核外排出シグナル無し、細胞質局在シグナル）無しのドメインが用いられ得るということは理解されるであろう。ｄＣａｓ９－ヌクレアーゼ融合蛋白質を用いる他の例示的な組成物および方法は、２０１４年７月８日出願の「Fusions of Cas9 Domains and Nucleic Acid-Editing Domains」と題するＵ．Ｓ．特許出願U.S.S.N14/325,815に見いだされ得、その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる.
マウスＡＰＯＢＥＣ－３：
MGPFCLGCSHRKCYSPIRNLISQETFKFHFKNLGYAKGRKDTFLCYEVTRKDCDSPVSLHHGVFKNKDNIHAEICFLYWFHDKVLKVLSPREEFKITWYMSWSPCFECAEQIVRFLATHHNLSLDIFSSRLYNVQDPETQQNLCRLVQEGAQVAAMDLYEFKKCWKKFVDNGGRRFRPWKRLLTNFRYQDSKLQEILRPCYIPVPSSSSSTLSNICLTKGLPETRFCVEGRRMDPLSEEEFYSQFYNQRVKHLCYYHRMKPYLCYQLEQFNGQAPLKGCLLSEKGKQHAEILFLDKIRSMELSQVTITCYLTWSPCPNCAWQLAAFKRDRPDLILHIYTSRLYFHWKRPFQKGLCSLWQSGILVDVMDLPQFTDCWTNFVNPKRPFWPWKGLEIISRRTQRRLRRIKESWGLQDLVNDFGNLQLGPPMS（配列番号６５）（下線：核酸編集ドメイン）
ラットＡＰＯＢＥＣ－３：
MGPFCLGCSHRKCYSPIRNLISQETFKFHFKNLRYAIDRKDTFLCYEVTRKDCDSPVSLHHGVFKNKDNIHAEICFLYWFHDKVLKVLSPREEFKITWYMSWSPCFECAEQVLRFLATHHNLSLDIFSSRLYNIRDPENQQNLCRLVQEGAQVAAMDLYEFKKCWKKFVDNGGRRFRPWKKLLTNFRYQDSKLQEILRPCYIPVPSSSSSTLSNICLTKGLPETRFCVERRRVHLLSEEEFYSQFYNQRVKHLCYYHGVKPYLCYQLEQFNGQAPLKGCLLSEKGKQHAEILFLDKIRSMELSQVIITCYLTWSPCPNCAWQLAAFKRDRPDLILHIYTSRLYFHWKRPFQKGLCSLWQSGILVDVMDLPQFTDCWTNFVNPKRPFWPWKGLEIISRRTQRRLHRIKESWGLQDLVNDFGNLQLGPPMS（配列番号６６）（下線：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｆ：
MKPHFRNTVERMYRDTFSYNFYNRPILSRRNTVWLCYEVKTKGPSRPRLDAKIFRGQVYSQPEHHAEMCFLSWFCGNQLPAYKCFQITWFVSWTPCPDCVAKLAEFLAEHPNVTLTISAARLYYYWERDYRRALCRLSQAGARVKIMDDEEFAYCWENFVYSEGQPFMPWYKFDDNYAFLHRTLKEILRNPMEAMYPHIFYFHFKNLRKAYGRNESWLCFTMEVVKHHSPVSWKRGVFRNQVDPETHCHAERCFLSWFCDDILSPNTNYEVTWYTSWSPCPECAGEVAEFLARHSNVNLTIFTARLYYFWDTDYQEGLRSLSQEGASVEIMGYKDFKYCWENFVYNDDEPFKPWKGLKYNFLFLDSKLQEILE（配列番号７１）（下線：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ：
MNPQIRNPMERMYRDTFYDNFENEPILYGRSYTWLCYEVKIKRGRSNLLWDTGVFRGQVYFKPQYHAEMCFLSWFCGNQLPAYKCFQITWFVSWTPCPDCVAKLAEFLSEHPNVTLTISAARLYYYWERDYRRALCRLSQAGARVTIMDYEEFAYCWENFVYNEGQQFMPWYKFDENYAFLHRTLKEILRYLMDPDTFTFNFNNDPLVLRRRQTYLCYEVERLDNGTWVLMDQHMGFLCNEAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFEYCWDTFVYRQGCPFQPWDGLEEHSQALSGRLRAILQNQGN（配列番号７２）（下線：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｃ：
MNPQIRNPMKAMYPGTFYFQFKNLWEANDRNETWLCFTVEGIKRRSVVSWKTGVFRNQVDSETHCHAERCFLSWFCDDILSPNTKYQVTWYTSWSPCPDCAGEVAEFLARHSNVNLTIFTARLYYFQYPCYQEGLRSLSQEGVAVEIMDYEDFKYCWENFVYNDNEPFKPWKGLKTNFRLLKRRLRESLQ（配列番号７３）（下線：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ａ：
MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGN（配列番号７４）（下線：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｈ：
MALLTAETFRLQFNNKRRLRRPYYPRKALLCYQLTPQNGSTPTRGYFENKKKCHAEICFINEIKSMGLDETQCYQVTCYLTWSPCSSCAWELVDFIKAHDHLNLGIFASRLYYHWCKPQQKGLRLLCGSQVPVEVMGFPKFADCWENFVDHEKPLSFNPYKMLEELDKNSRAIKRRLERIKIPGVRAQGRYMDILCDAEV（配列番号７５）（下線：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－３Ｄ：
MNPQIRNPMERMYRDTFYDNFENEPILYGRSYTWLCYEVKIKRGRSNLLWDTGVFRGPVLPKRQSNHRQEVYFRFENHAEMCFLSWFCGNRLPANRRFQITWFVSWNPCLPCVVKVTKFLAEHPNVTLTISAARLYYYRDRDWRWVLLRLHKAGARVKIMDYEDFAYCWENFVCNEGQPFMPWYKFDDNYASLHRTLKEILRNPMEAMYPHIFYFHFKNLLKACGRNESWLCFTMEVTKHHSAVFRKRGVFRNQVDPETHCHAERCFLSWFCDDILSPNTNYEVTWYTSWSPCPECAGEVAEFLARHSNVNLTIFTARLCYFWDTDYQEGLCSLSQEGASVKIMGYKDFVSCWKNFVYSDDEPFKPWKGLQTNFRLLKRRLREILQ（配列番号７６）（下線：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＰＯＢＥＣ－１：
MTSEKGPSTGDPTLRRRIEPWEFDVFYDPRELRKEACLLYEIKWGMSRKIWRSSGKNTTNHVEVNFIKKFTSERDFHPSMSCSITWFLSWSPCWECSQAIREFLSRHPGVTLVIYVARLFWHMDQQNRQGLRDLVNSGVTIQIMRASEYYHCWRNFVNYPPGDEAHWPQYPPLWMMLYALELHCIILSLPPCLKISRRWQNHLTFFRLHLQNCHYQTIPPHILLATGLIHPSVAWR（配列番号７７）
マウスＡＰＯＢＥＣ－１：
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSVWRHTSQNTSNHVEVNFLEKFTTERYFRPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRHPYVTLFIYIARLYHHTDQRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQEYCYCWRNFVNYPPSNEAYWPRYPHLWVKLYVLELYCIILGLPPCLKILRRKQPQLTFFTITLQTCHYQRIPPHLLWATGLK（配列番号７８）
ラットＡＰＯＢＥＣ－１：
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLK（配列番号７９）
ヒトＡＤＡＴ－２：
MEAKAAPKPAASGACSVSAEETEKWMEEAMHMAKEALENTEVPVGCLMVYNNEVVGKGRNEVNQTKNATRHAEMVAIDQVLDWCRQSGKSPSEVFEHTVLYVTVEPCIMCAAALRLMKIPLVVYGCQNERFGGCGSVLNIASADLPNTGRPFQCIPGYRAEEAVEMLKTFYKQENPNAPKSKVRKKECQKS（配列番号８０）
マウスＡＤＡＴ－２：
MEEKVESTTTPDGPCVVSVQETEKWMEEAMRMAKEALENIEVPVGCLMVYNNEVVGKGRNEVNQTKNATRHAEMVAIDQVLDWCHQHGQSPSTVFEHTVLYVTVEPCIMCAAALRLMKIPLVVYGCQNERFGGCGSVLNIASADLPNTGRPFQCIPGYRAEEAVELLKTFYKQENPNAPKSKVRKKDCQKS（配列番号８１）
マウスＡＤＡＴ－１：
MWTADEIAQLCYAHYNVRLPKQGKPEPNREWTLLAAVVKIQASANQACDIPEKEVQVTKEVVSMGTGTKCIGQSKMRESGDILNDSHAEIIARRSFQRYLLHQLHLAAVLKEDSIFVPGTQRGLWRLRPDLSFVFFSSHTPCGDASIIPMLEFEEQPCCPVIRSWANNSPVQETENLEDSKDKRNCEDPASPVAKKMRLGTPARSLSNCVAHHGTQESGPVKPDVSSSDLTKEEPDAANGIASGSFRVVDVYRTGAKCVPGETGDLREPGAAYHQVGLLRVKPGRGDRTCSMSCSDKMARWNVLGCQGALLMHFLEKPIYLSAVVIGKCPYSQEAMRRALTGRCEETLVLPRGFGVQELEIQQSGLLFEQSRCAVHRKRGDSPGRLVPCGAAISWSAVPQQPLDVTANGFPQGTTKKEIGSPRARSRISKVELFRSFQKLLSSIADDEQPDSIRVTKKLDTYQEYKDAASAYQEAWGALRRIQPFASWIRNPPDYHQFK（配列番号８２）（下線：核酸編集ドメイン）
ヒトＡＤＡＴ－１：
MWTADEIAQLCYEHYGIRLPKKGKPEPNHEWTLLAAVVKIQSPADKACDTPDKPVQVTKEVVSMGTGTKCIGQSKMRKNGDILNDSHAEVIARRSFQRYLLHQLQLAATLKEDSIFVPGTQKGVWKLRRDLIFVFFSSHTPCGDASIIPMLEFEDQPCCPVFRNWAHNSSVEASSNLEAPGNERKCEDPDSPVTKKMRLEPGTAAREVTNGAAHHQSFGKQKSGPISPGIHSCDLTVEGLATVTRIAPGSAKVIDVYRTGAKCVPGEAGDSGKPGAAFHQVGLLRVKPGRGDRTRSMSCSDKMARWNVLGCQGALLMHLLEEPIYLSAVVIGKCPYSQEAMQRALIGRCQNVSALPKGFGVQELKILQSDLLFEQSRSAVQAKRADSPGRLVPCGAAISWSAVPEQPLDVTANGFPQGTTKKTIGSLQARSQISKVELFRSFQKLLSRIARDKWPHSLRVQKLDTYQEYKEAASSYQEAWSTLRKQVFGSWIRNPPDYHQFK（配列番号８３）
（下線：核酸編集ドメイン）
いくつかの態様において、酵素ドメインは転写活性化因子の１つまたは２つ以上を含む。例えば、いくつかの態様において、転写活性化因子ドメインを有する例示的なｄＣａｓ９融合蛋白質の一般的な構造は、構造
［ＮＨ２］－［ＮＬＳ］－［Ｃａｓ９］－［（転写活性化因子）ｎ］－［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］－［ＮＬＳ］－［（転写活性化因子）ｎ］－［Ｃａｓ９］－－［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］－［Ｃａｓ９］－［（転写活性化因子）ｎ］－［ＣＯＯＨ］、または
［ＮＨ２］－［（転写活性化因子）ｎ］－［Ｃａｓ９］－［ＣＯＯＨ］
を含み、ＮＬＳは核局在シグナルであり、ＮＨ２は融合蛋白質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合蛋白質のＣ末端である。いくつかの態様において、融合蛋白質は転写活性化因子の１つまたは２つ以上のリピートを含み、例えばｎ＝１～１０である（例えば、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）。いくつかの態様において、ｎ＝１～２０である。いくつかの態様において、リンカーがｄＣａｓ９と転写活性化因子ドメインとの間に挿入される。いくつかの態様において、リンカーがＮＬＳと転写活性化因子および／またはｄＣａｓ９ドメインとの間に挿入される。いくつかの態様において、ＮＬＳは転写活性化因子および／またはｄＣａｓ９ドメインのＣ末端に位置する。いくつかの態様において、ＮＬＳは転写活性化因子ドメインとｄＣａｓ９ドメインとの間に位置する。配列タグなどの追加の特徴もまた存在し得る。いくつかの態様において、転写活性化因子は、ＶＰ６４（配列番号８４または配列番号３５）、ＶＰ１６（配列番号８５）、およびｐ６５（配列番号８６）からなる群から選択される。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４融合蛋白質は（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号８７のアミノ酸配列を含むか、または（例えば６×Ｈｉｓタグ有りまたは無しで）配列番号８７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
ＶＰ６４
GSGRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLIN（配列番号８４）
ＶＰ１６
APPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPGFTPHDSAPYGALDMADFEFEQMFTDALGIDEYGGEFPGIRR（配列番号８５）
ｐ６５：
PSGQISNQALALAPSSAPVLAQTMVPSSAMVPLAQPPAPAPVLTPGPPQSLSAPVPKSTQAGEGTLSEALLHLQFDADEDLGALLGNSTDPGVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVSMSHSTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGTSGLPNGLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISSSGQ（配列番号８６）
ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－６×Ｈｉｓ：
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGSPKKKRKVSSDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKAAGGGGSGRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLHHHHHH（配列番号８７）
いくつかの態様において、酵素ドメインは転写抑制因子の１つまたは２つ以上を含む。例えば、いくつかの態様において、転写抑制因子ドメインを有する例示的なｄＣａｓ９融合蛋白質の一般的な構造は、構造
［ＮＨ２］－［ＮＬＳ］－［Ｃａｓ９］－［（転写抑制因子）ｎ］－［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］－［ＮＬＳ］－［（転写抑制因子）ｎ］－［Ｃａｓ９］－－［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］－［Ｃａｓ９］－［（転写抑制因子）ｎ］－［ＣＯＯＨ］、または
［ＮＨ２］－［（転写抑制因子）ｎ］－［Ｃａｓ９］－［ＣＯＯＨ］、
を含み、ＮＬＳは核局在シグナルであり、ＮＨ２は融合蛋白質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合蛋白質のＣ末端である。いくつかの態様において、融合蛋白質は転写抑制因子の１つまたは２つ以上のリピートを含み、例えばｎ＝１～１０である（例えば、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）。いくつかの態様において、ｎ＝１～２０である。いくつかの態様において、リンカーがｄＣａｓ９と転写抑制因子ドメインとの間に挿入される。いくつかの態様において、リンカーがＮＬＳと転写抑制因子および／またはｄＣａｓ９ドメインとの間に挿入される。いくつかの態様において、ＮＬＳは転写抑制因子および／またはｄＣａｓ９ドメインのＣ末端に位置する。いくつかの態様において、ＮＬＳは転写抑制因子ドメインとｄＣａｓ９ドメインとの間に位置する。配列タグなどの追加の特徴もまた存在し得る。いくつかの態様において、転写抑制因子は、Ｋｏｘ１のＫＲＡＢ（Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス）ドメイン、ＳＩＤ（ｍＳｉｎ３相互作用ドメイン）、ＨＰ１αのＣＳ（クロモシャドー）ドメイン、またはＨｅｓ１のＷＲＰＷドメインからなる群から選択される。これらおよび他の抑制因子ドメインは当分野において公知であり、いくつかの態様において、Urrutia, KRAB-containing zinc-finger repressor proteins. Genome Biol. 2003;4(10):231、Gilbert et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 2013; 154, 442-451、Konermann et al., Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 2013; 500, 472-476、およびU.S.2014/0186958A1として公開されている公開Ｕ．Ｓ．特許出願U.S.S.N.14/105,017に記載されているものに対応し、その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、転写抑制因子ドメインはＫＲＡＢドメインの１つまたは２つ以上のリピート（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のリピート）を含む。いくつかの態様において、ＫＲＡＢドメインは、配列番号８８～９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、転写抑制因子ドメインはＳＩＤ蛋白質の１つまたは２つ以上のリピートを含む。いくつかの態様において、ＳＩＤ蛋白質は、配列番号８０として示されているアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抑制因子ドメインは、ＳＩＤ蛋白質の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のリピートを含む（例えば、配列番号９２）。いくつかの態様において、抑制因子ドメインはＳＩＤの４つのリピート（例えばＳＩＤ４×。配列番号９３）を含む。
ＫＲＡＢ（ヒト。ＧｅｎＢａｎｋ：AAD20972.1）：
MNMFKEAVTFKDVAVAFTEEELGLLGPAQRKLYRDVMVENFRNLLSVGHPPFKQDVSPIERNEQLWIMTTATRRQGNLDTLPVKALLLYDLAQT（配列番号８８）
部分的なＫＲＡＢ蛋白質ドメイン（ヒト。ＧｅｎＢａｎｋ：CAB52478.1）：
EQVSFKDVCVDFTQEEWYLLDPAQKILYRDVILENYSNLVSVGYCITKPEVIFKIEQGEEPWILEKGFPSQCHP（配列番号８９）
部分的なＫＲＡＢＡドメイン（ヒト。ＧｅｎＢａｎｋ：AAB03530.1）：
EAVTFKDVAVVFTEEELGLLDPAQRKLYRDVMLENFRNLLSV（配列番号９０）
ＫＲＡＢ（マウス。Ｃ２Ｈ２型ドメイン含有蛋白質。ＧｅｎＢａｎｋ：CAM27971.1）：
MDLVTYDDVHVNFTQDEWALLDPSQKSLYKGVMLETYKNLTAIGYIWEEHTIEDHFQTSRSHGSNKKTH（配列番号９１）
ＳＩＤ抑制因子ドメイン：
GSGMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLP（配列番号９２）
ＳＩＤ４×抑制因子ドメイン：
GSGMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPGSGMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPGSGMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPGSGMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPSR（配列番号９３）
いくつかの態様において、酵素ドメインはエピジェネティック修飾因子またはその触媒ドメインを含む。例えば、いくつかの態様において、エピジェネティック修飾因子またはドメインを有する例示的なｄＣａｓ９融合蛋白質の一般的な構造は、構造
［ＮＨ２］－［ＮＬＳ］－［Ｃａｓ９］－［エピジェネティック修飾因子］－［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］－［ＮＬＳ］－［エピジェネティック修飾因子］－［Ｃａｓ９］－［ＣＯＯＨ］、
［ＮＨ２］－［Ｃａｓ９］－［エピジェネティック修飾因子］－［ＣＯＯＨ］、または
［ＮＨ２］－［エピジェネティック修飾因子］－［Ｃａｓ９］－［ＣＯＯＨ］、
を含み、ＮＬＳは核局在シグナルであり、ＮＨ２は融合蛋白質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合蛋白質のＣ末端である。いくつかの態様において、リンカーが、ｄＣａｓ９とエピジェネティック修飾因子ドメインとの間に挿入される。いくつかの態様において、リンカーが、ＮＬＳとエピジェネティック修飾因子および／またはｄＣａｓ９ドメインとの間に挿入される。いくつかの態様において、ＮＬＳはエピジェネティック修飾因子および／またはｄＣａｓ９ドメインのＣ末端に位置する。いくつかの態様において、ＮＬＳはエピジェネティック修飾因子ドメインとｄＣａｓ９ドメインとの間に位置する。配列タグなどの追加の特徴もまた存在し得る。エピジェネティック修飾因子は当分野において周知であり、ＤＮＡメチル化（および脱メチル化）またはヒストン修飾（例えば、ヒストンメチル化／脱メチル化、アセチル化／脱アセチル化、ユビキチン化、リン酸化、ＳＵＭＯ化など）を典型的には触媒する。１つ、２つ以上のエピジェネティックな修飾の存在は１つまたは２つ以上の遺伝子の転写活性に影響を及ぼし得、例えば遺伝子を「オン」状態から「オフ」状態に変え、逆もまた同様である。エピジェネティック修飾因子は、ヒストン脱メチル化酵素、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素、およびヒストンアセチルトランスフェラーゼを包含するが、これに限定されない。例示的なエピジェネティック修飾蛋白質は、Konermann et al., Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 2013; 500, 472-476、Mendenhall et al., Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers. Nat. Biotechnol. 2013; 31, 1133-1136、およびMaeder et al., Targeted DNA demethylation and activation of endogenous genes using programmable TALE-TET1 fusion proteins. Nat. Biotechnol. 2013; 31, 1137-1142に見いだされ得る。それぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、エピジェネティック修飾因子ドメインはＬＳＤ１（リシン（Ｋ）特異的脱メチル化酵素１Ａ）ヒストン脱メチル化酵素であり、これは、いくつかの態様において、配列番号９４または配列番号９５として示されるアミノ酸配列を全体的にまたは部分的に含む。いくつかの態様において、エピジェネティック修飾因子ドメインはＴＥＴ１ヒドロキシラーゼ触媒ドメインであり、これは、いくつかの態様において、配列番号９６として示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、エピジェネティック修飾因子はヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）エフェクタードメインである。いくつかの態様において、ＨＤＡＣエフェクタードメインは、Konermann et al., Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature.2013; 500, 472-476の補足の表２、配列番号９７～１０８において提供されているＨＤＡＣエフェクター蛋白質のいずれかに対応するアミノ酸配列を全体的に、部分的に含む。いくつかの態様において、エピジェネティック修飾因子はヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）エフェクタードメインである。いくつかの態様において、ＨＭＴエフェクタードメインは、Konermann et al., Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature.2013; 500, 472-476の補足の表３、配列番号１０９～１１８において提供されているＨＤＡＣエフェクター蛋白質のいずれかに対応するアミノ酸配列を全体的に、部分的に含む。
ＬＳＤ１、アイソフォームａ（ヒト）：
MLSGKKAAAAAAAAAAAATGTEAGPGTAGGSENGSEVAAQPAGLSGPAEVGPGAVGERTPRKKEPPRASPPGGLAEPPGSAGPQAGPTVVPGSATPMETGIAETPEGRRTSRRKRAKVEYREMDESLANLSEDEYYSEEERNAKAEKEKKLPPPPPQAPPEEENESEPEEPSGQAGGLQDDSSGGYGDGQASGVEGAAFQSRLPHDRMTSQEAACFPDIISGPQQTQKVFLFIRNRTLQLWLDNPKIQLTFEATLQQLEAPYNSDTVLVHRVHSYLERHGLINFGIYKRIKPLPTKKTGKVIIIGSGVSGLAAARQLQSFGMDVTLLEARDRVGGRVATFRKGNYVADLGAMVVTGLGGNPMAVVSKQVNMELAKIKQKCPLYEANGQADTVKVPKEKDEMVEQEFNRLLEATSYLSHQLDFNVLNNKPVSLGQALEVVIQLQEKHVKDEQIEHWKKIVKTQEELKELLNKMVNLKEKIKELHQQYKEASEVKPPRDITAEFLVKSKHRDLTALCKEYDELAETQGKLEEKLQELEANPPSDVYLSSRDRQILDWHFANLEFANATPLSTLSLKHWDQDDDFEFTGSHLTVRNGYSCVPVALAEGLDIKLNTAVRQVRYTASGCEVIAVNTRSTSQTFIYKCDAVLCTLPLGVLKQQPPAVQFVPPLPEWKTSAVQRMGFGNLNKVVLCFDRVFWDPSVNLFGHVGSTTASRGELFLFWNLYKAPILLALVAGEAAGIMENISDDVIVGRCLAILKGIFGSSAVPQPKETVVSRWRADPWARGSYSYVAAGSSGNDYDLMAQPITPGPSIPGAPQPIPRLFFAGEHTIRNYPATVHGALLSGLREAGRIADQFLGAMYTLPRQATPGVPAQQSPSM（配列番号９４）
ＬＳＤ１、アイソフォームｂ（ヒト）：
MLSGKKAAAAAAAAAAAATGTEAGPGTAGGSENGSEVAAQPAGLSGPAEVGPGAVGERTPRKKEPPRASPPGGLAEPPGSAGPQAGPTVVPGSATPMETGIAETPEGRRTSRRKRAKVEYREMDESLANLSEDEYYSEEERNAKAEKEKKLPPPPPQAPPEEENESEPEEPSGVEGAAFQSRLPHDRMTSQEAACFPDIISGPQQTQKVFLFIRNRTLQLWLDNPKIQLTFEATLQQLEAPYNSDTVLVHRVHSYLERHGLINFGIYKRIKPLPTKKTGKVIIIGSGVSGLAAARQLQSFGMDVTLLEARDRVGGRVATFRKGNYVADLGAMVVTGLGGNPMAVVSKQVNMELAKIKQKCPLYEANGQAVPKEKDEMVEQEFNRLLEATSYLSHQLDFNVLNNKPVSLGQALEVVIQLQEKHVKDEQIEHWKKIVKTQEELKELLNKMVNLKEKIKELHQQYKEASEVKPPRDITAEFLVKSKHRDLTALCKEYDELAETQGKLEEKLQELEANPPSDVYLSSRDRQILDWHFANLEFANATPLSTLSLKHWDQDDDFEFTGSHLTVRNGYSCVPVALAEGLDIKLNTAVRQVRYTASGCEVIAVNTRSTSQTFIYKCDAVLCTLPLGVLKQQPPAVQFVPPLPEWKTSAVQRMGFGNLNKVVLCFDRVFWDPSVNLFGHVGSTTASRGELFLFWNLYKAPILLALVAGEAAGIMENISDDVIVGRCLAILKGIFGSSAVPQPKETVVSRWRADPWARGSYSYVAAGSSGNDYDLMAQPITPGPSIPGAPQPIPRLFFAGEHTIRNYPATVHGALLSGLREAGRIADQFLGAMYTLPRQATPGVPAQQSPSM（配列番号９５）
ＴＥＴ１触媒ドメイン：
SIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVADHAQVVRVLGFFQCHSHPAQAFDDAMTQFGMSGGGSLPTCSCLDRVIQKDKGPYYTHLGAGPSVAAVREIMENRYGQKGNAIRIEIVVYTGKEGKSSHGCPIAKWVLRRSSDEEKVLCLVRQRTGHHCPTAVMVVLIMVWDGIPLPMADRLYTELTENLKSYNGHPTDRRCTLNENRTCTCQGIDPETCGASFSFGCSWSMYFNGCKFGRSPSPRRFRIDPSSPLHEKNLEDNLQSLATRLAPIYKQYAPVAYQNQVEYENVARECRLGSKEGRPFSGVTACLDFCAHPHRDIHNMNNGSTVVCTLTREDNRSLGVIPQDEQLHVLPLYKLSDTDEFGSKEGMEAKIKSGAIEVLAPRRKKRTCFTQPVPRSGKKRAAMMTEVLAHKIRAVEKKPIPRIKRKNNSTTTNNSKPSSLPTLGSNTETVQPEVKSETEPHFILKSSDNTKTYSLMPSAPHPVKEASPGFSWSPKTASATPAPLKNDATASCGFSERSSTPHCTMPSGRLSGANAAAADGPGISQLGEVAPLPTLSAPVMEPLINSEPSTGVTEPLTPHQPNHQPSFLTSPQDLASSPMEEDEQHSEADEPPSDEPLSDDPLSPAEEKLPHIDEYWSDSEHIFLDANIGGVAIAPAHGSVLIECARRELHATTPVEHPNRNHPTRLSLVFYQHKNLNKPQHGFELNKIKFEAKEAKNKKMKASEQKDQAANEGPEQSSEVNELNQIPSHKALTLTHDNVVTVSPYALTHVAGPYNHWV（配列番号９６）
ＨＤＡＣエフェクタードメイン：
ＨＤＡＣ８（Ｘ．ｌａｅｖｉｓ）：
ASSPKKKRKVEASMSRVVKPKVASMEEMAAFHTDAYLQHLHKVSEEGDNDDPETLEYGLGYDCPITEGIYDYAAAVGGATLTAAEQLIEGKTRIAVNWPGGWHHAKKDEASGFCYLNDAVLGILKLREKFDRVLYVDMDLHHGDGVEDAFSFTSKVMTVSLHKFSPGFFPGTGDVSDIGLGKGRYYSINVPLQDGIQDDKYYQICEGVLKEVFTTFNPEAVVLQLGADTIAGDPMCSFNMTPEGIGKCLKYVLQWQLPTLILGGGGYHLPNTARCWTYLTALIVGRTLSSEIPDHEFFTEYGPDYVLEITPSCRPDRNDTQKVQEILQSIKGNLKRVVEF（配列番号９７）
ＲＰＤ３（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）：
ASSPKKKRKVEASRRVAYFYDADVGNYAYGAGHPMKPHRIRMAHSLIMNYGLYKKMEIYRAKPATKQEMCQFHTDEYIDFLSRVTPDNLEMFKRESVKFNVGDDCPVFDGLYEYCSISGGGSMEGAARLNRGKCDVAVNYAGGLHHAKKSEASGFCYLNDIVLGIIELLRYHPRVLYIDIDVHHGDGVEEAFYTTDRVMTCSFHKYGEFFPGTGELRDIGVGAGKNYAVNVPLRDGIDDATYRSVFEPVIKKIMEWYQPSAVVLQCGGDSLSGDRLGCFNLSMEGHANCVNYVKSFGIPMMVVGGGGYTMRNVARTWCFETGLLNNVVLDKDLPYEF（配列番号９８）
ＭｅｓｏＬｏ４（Ｍ．ｌｏｔｉ）：
ASSPKKKRKVEASMPLQIVHHPDYDAGFATNHRFPMSKYPLLMEALRARGLASPDALNTTEPAPASWLKLAHAADYVDQVISCSVPEKIEREIGFPVGPRVSLRAQLATGGTILAARLALRHGIACNTAGGSHHARRAQGAGFCTFNDVAVASLVLLDEGAAQNILVVDLDVHQGDGTADILSDEPGVFTFSMHGERNYPVRKIASDLDIALPDGTGDAAYLRRLATILPELSARARWDIVFYNAGVDVHAEDRLGRLALSNGGLRARDEMVIGHFRALGIPVCGVIGGGYSTDVPALASRHAILFEVASTYAEF（配列番号９９）
ＨＤＡＣ１１（ヒト）：
ASSPKKKRKVEASMLHTTQLYQHVPETRWPIVYSPRYNITFMGLEKLHPFDAGKWGKVINFLKEEKLLSDSMLVEAREASEEDLLVVHTRRYLNELKWSFAVATITEIPPVIFLPNFLVQRKVLRPLRTQTGGTIMAGKLAVERGWAINVGGGFHHCSSDRGGGFCAYADITLAIKFLFERVEGISRATIIDLDAHQGNGHERDFMDDKRVYIMDVYNRHIYPGDRFAKQAIRRKVELEWGTEDDEYLDKVERNIKKSLQEHLPDVVVYNAGTDILEGDRLGGLSISPAGIVKRDELVFRMVRGRRVPILMVTSGGYQKRTARIIADSILNLFGLGLIGPESPSVSAQNSDTPLLPPAVPEF（配列番号１００）
ＨＤＴ１（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）：
ASSPKKKRKVEASMEFWGIEVKSGKPVTVTPEEGILIHVSQASLGECKNKKGEFVPLHVKVGNQNLVLGTLSTENIPQLFCDLVFDKEFELSHTWGKGSVYFVGYKTPNIEPQGYSEEEEEEEEEVPAGNAAKAVAKPKAKPAEVKPAVDDEEDESDSDGMDEDDSDGEDSEEEEPTPKKPASSKKRANETTPKAPVSAKKAKVAVTPQKTDEKKKGGKAANQSEF（配列番号１０１）
ＳＩＲＴ３（ヒト）：
ASSPKKKRKVEASMVGAGISTPSGIPDFRSPGSGLYSNLQQYDLPYPEAIFELPFFFHNPKPFFTLAKELYPGNYKPNVTHYFLRLLHDKGLLLRLYTQNIDGLERVSGIPASKLVEAHGTFASATCTVCQRPFPGEDIRADVMADRVPRCPVCTGVVKPDIVFFGEPLPQRFLLHVVDFPMADLLLILGTSLEVEPFASLTEAVRSSVPRLLINRDLVGPLAWHPRSRDVAQLGDVVHGVESLVELLGWTEEMRDLVQRETGKLDGPDKEF（配列番号１０２）
ＨＳＴ２（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）：
ASSPKKKRKVEASTEMSVRKIAAHMKSNPNAKVIFMVGAGISTSCGIPDFRSPGTGLYHNLARLKLPYPEAVFDVDFFQSDPLPFYTLAKELYPGNFRPSKFHYLLKLFQDKDVLKRVYTQNIDTLERQAGVKDDLIIEAHGSFAHCHCIGCGKVYPPQVFKSKLAEHPIKDFVKCDVCGELVKPAIVFFGEDLPDSFSETWLNDSEWLREKITTSGKHPQQPLVIVVGTSLAVYPFASLPEEIPRKVKRVLCNLETVGDFKANKRPTDLIVHQYSDEFAEQLVEELGWQEDFEKILTAQGGMGEF（配列番号１０３）
ＣｏｂＢ（Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｋ１２））：
ASSPKKKRKVEASMEKPRVLVLTGAGISAESGIRTFRAADGLWEEHRVEDVATPEGFDRDPELVQAFYNARRRQLQQPEIQPNAAHLALAKLQDALGDRFLLVTQNIDNLHERAGNTNVIHMHGELLKVRCSQSGQVLDWTGDVTPEDKCHCCQFPAPLRPHVVWFGEMPLGMDEIYMALSMADIFIAIGTSGHVYPAAGFVHEAKLHGAHTVELNLEPSQVGNEFAEKYYGPASQVVPEFVEKLLKGLKAGSIAEF（配列番号１０４）
ＨＳＴ２（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）：
ASSPKKKRKVEASMPSLDDILKPVAEAVKNGKKVTFFNGAGISTGAGIPDFRSPDTGLYANLAKLNLPFAEAVFDIDFFKEDPKPFYTLAEELYPGNFAPTKFHHFIKLLQDQGSLKRVYTQNIDTLERLAGVEDKYIVEAHGSFASNHCVDCHKEMTTETLKTYMKDKKIPSCQHCEGYVKPDIVFFGEGLPVKFFDLWEDDCEDVEVAIVAGTSLTVFPFASLPGEVNKKCLRVLVNKEKVGTFKHEPRKSDIIALHDCDIVAERLCTLLGLDDKLNEVYEKEKIKYSKAETKEIKMHEIEDKLKEEAHLKEDKHTTKVDKKEKQNDANDKELEQLIDKAKAEF（配列番号１０５）
ＳＩＲＴ５（ヒト）：
ASSPKKKRKVEASSSSMADFRKFFAKAKHIVIISGAGVSAESGVPTFRGAGGYWRKWQAQDLATPLAFAHNPSRVWEFYHYRREVMGSKEPNAGHRAIAECETRLGKQGRRVVVITQNIDELHRKAGTKNLLEIHGSLFKTRCTSCGVVAENYKSPICPALSGKGAPEPGTQDASIPVEKLPRCEEAGCGGLLRPHVVWFGENLDPAILEEVDRELAHCDLCLVVGTSSVVYPAAMFAPQVAARGVPVAEFNTETTPATNRFRFHFQGPCGTTLPEALACHENETVSEF（配列番号１０６）
Ｓｉｒ２Ａ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）：
ASSPKKKRKVEASMGNLMISFLKKDTQSITLEELAKIIKKCKHVVALTGSGTSAESNIPSFRGSSNSIWSKYDPRIYGTIWGFWKYPEKIWEVIRDISSDYEIEINNGHVALSTLESLGYLKSVVTQNVDGLHEASGNTKVISLHGNVFEAVCCTCNKIVKLNKIMLQKTSHFMHQLPPECPCGGIFKPNIILFGEVVSSDLLKEAEEEIAKCDLLLVIGTSSTVSTATNLCHFACKKKKKIVEINISKTYITNKMSDYHVCAKFSELTKVANILKGSSEKNKKIMEF（配列番号１０７）
ＳＩＲＴ６（ヒト）：
ASSPKKKRKVEASMSVNYAAGLSPYADKGKCGLPEIFDPPEELERKVWELARLVWQSSSVVFHTGAGISTASGIPDFRGPHGVWTMEERGLAPKFDTTFESARPTQTHMALVQLERVGLLRFLVSQNVDGLHVRSGFPRDKLAELHGNMFVEECAKCKTQYVRDTVVGTMGLKATGRLCTVAKARGLRACRGELRDTILDWEDSLPDRDLALADEASRNADLSITLGTSLQIRPSGNLPLATKRRGGRLVIVNLQPTKHDRHADLRIHGYVDEVMTRLMKHLGLEIPAWDGPRVLERALPPLEF（配列番号１０８）
ＨＭＴエフェクタードメイン：
ＮＵＥ（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）：
ASSPKKKRKVEASMTTNSTQDTLYLSLHGGIDSAIPYPVRRVEQLLQFSFLPELQFQNAAVKQRIQRLCYREEKRLAVSSLAKWLGQLHKQRLRAPKNPPVAICWINSYVGYGVFARESIPAWSYIGEYTGILRRRQALWLDENDYCFRYPVPRYSFRYFTIDSGMQGNVTRFINHSDNPNLEAIGAFENGIFHIIIRAIKDILPGEELCYHYGPLYWKHRKKREEFVPQEEEF（配列番号１０９）
ｖＳＥＴ（Ｐ．ｂｕｒｓａｒｉａコレラウイルス）：
ASSPKKKRKVEASMFNDRVIVKKSPLGGYGVFARKSFEKGELVEECLCIVRHNDDWGTALEDYLFSRKNMSAMALGFGAIFNHSKDPNARHELTAGLKRMRIFTIKPIAIGEEITISYGDDYWLSRPRLTQNEF（配列番号１１０）
ＳＵＶ３９Ｈ１（ヒト）：
ASSPKKKRKVEASNLKCVRILKQFHKDLERELLRRHHRSKTPRHLDPSLANYLVQKAKQRRALRRWEQELNAKRSHLGRITVENEVDLDGPPRAFVYINEYRVGEGITLNQVAVGCECQDCLWAPTGGCCPGASLHKFAYNDQGQVRLRAGLPIYECNSRCRCGYDCPNRVVQKGIRYDLCIFRTDDGRGWGVRTLEKIRKNSFVMEYVGEIITSEEAERRGQIYDRQGATYLFDLDYVEDVYTVDAAYYGNISHFVNHSCDPNLQVYNVFIDNLDERLPRIAFFATRTIRAGEELTFDYNMQVDPVDMESTRMDSNFGLAGLPGSPKKRVRIECKCGTESCRKYLFEF（配列番号１１１）
ＤＩＭ５（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）：
ASSPKKKRKVEASMEKAFRPHFFNHGKPDANPKEKKNCHWCQIRSFATHAQLPISIVNREDDAFLNPNFRFIDHSIIGKNVPVADQSFRVGCSCASDEECMYSTCQCLDEMAPDSDEEADPYTRKKRFAYYSQGAKKGLLRDRVLQSQEPIYECHQGCACSKDCPNRVVERGRTVPLQIFRTKDRGWGVKCPVNIKRGQFVDRYLGEIITSEEADRRRAESTIARRKDVYLFALDKFSDPDSLDPLLAGQPLEVDGEYMSGPTRFINHSCDPNMAIFARVGDHADKHIHDLALFAIKDIPKGTELTFDYVNGLTGLESDAHDPSKISEMTKCLCGTAKCRGYLWEF（配列番号１１２）
ＫＹＰ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）：
ASSPKKKRKVEASDISGGLEFKGIPATNRVDDSPVSPTSGFTYIKSLIIEPNVIIPKSSTGCNCRGSCTDSKKCACAKLNGGNFPYVDLNDGRLIESRDVVFECGPHCGCGPKCVNRTSQKRLRFNLEVFRSAKKGWAVRSWEYIPAGSPVCEYIGVVRRTADVDTISDNEYIFEIDCQQTMQGLGGRQRRLRDVAVPMNNGVSQSSEDENAPEFCIDAGSTGNFARFINHSCEPNLFVQCVLSSHQDIRLARVVLFAADNISPMQELTYDYGYALDSVHEF（配列番号１１３）
ＳＵＶＲ４（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）：
ASSPKKKRKVEASQSAYLHVSLARISDEDCCANCKGNCLSADFPCTCARETSGEYAYTKEGLLKEKFLDTCLKMKKEPDSFPKVYCKDCPLERDHDKGTYGKCDGHLIRKFIKECWRKCGCDMQCGNRVVQRGIRCQLQVYFTQEGKGWGLRTLQDLPKGTFICEYIGEILTNTELYDRNVRSSSERHTYPVTLDADWGSEKDLKDEEALCLDATICGNVARFINHRCEDANMIDIPIEIETPDRHYYHIAFFTLRDVKAMDELTWDYMIDFNDKSHPVKAFRCCCGSESCRDRKIKGSQGKSIERRKIVSAKKQQGSKEVSKKRKEF（配列番号１１４）
Ｓｅｔ４（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）：
ASSPKKKRKVEASMQLHEQIANISVTFNDIPRSDHSMTPTELCYFDDFATTLVVDSVLNFTTHKMSKKRRYLYQDEYRTARTVMKTFREQRDWTNAIYGLLTLRSVSHFLSKLPPNKLFEFRDHIVRFLNMFILDSGYTIQECKRYSQEGHQGAKLVSTGVWSRGDKIERLSGVVCLLSSEDEDSILAQEGSDFSVMYSTRKRCSTLWLGPGAYINHDCRPTCEFVSHGSTAHIRVLRDMVPGDEITCFYGSEFFGPNNIDCECCTCEKNMNGAFSYLRGNENAEPIISEKKTKYELRSRSEF（配列番号１１５）
Ｓｅｔ１（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）：
ASSPKKKRKVEASMKVAAKKLATSRMRKDRAAAASPSSDIENSENPSSLASHSSSSGRMTPSKNTRSRKGVSVKDVSNHKITEFFQVRRSNRKTSKQISDEAKHALRDTVLKGTNERLLEVYKDVVKGRGIRTKVNFEKGDFVVEYRGVMMEYSEAKVIEEQYSNDEEIGSYMYFFEHNNKKWCIDATKESPWKGRLINHSVLRPNLKTKVVEIDGSHHLILVARRQIAQGEELLYDYGDRSAETIAKNPWLVNTEF（配列番号１１６）
ＳＥＴＤ８（ヒト）
ASSPKKKRKVEASSCDSTNAAIAKQALKKPIKGKQAPRKKAQGKTQQNRKLTDFYPVRRSSRKSKAELQSEERKRIDELIESGKEEGMKIDLIDGKGRGVIATKQFSRGDFVVEYHGDLIEITDAKKREALYAQDPSTGCYMYYFQYLSKTYCVDATRETNRLGRLINHSKCGNCQTKLHDIDGVPHLILIASRDIAAGEELLYDYGDRSKASIEAFPWLKHEF（配列番号１１７）
ＴｇＳＥＴ８（Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ）：
ASSPKKKRKVEASASRRTGEFLRDAQAPSRWLKRSKTGQDDGAFCLETWLAGAGDDAAGGERGRDREGAADKAKQREERRQKELEERFEEMKVEFEEKAQRMIARRAALTGEIYSDGKGSKKPRVPSLPENDDDALIEIIIDPEQGILKWPLSVMSIRQRTVIYQECLRRDLTACIHLTKVPGKGRAVFAADTILKDDFVVEYKGELCSEREAREREQRYNRSKVPMGSFMFYFKNGSRMMAIDATDEKQDFGPARLINHSRRNPNMTPRAITLGDFNSEPRLIFVARRNIEKGEELLVDYGERDPDVIKEHPWLNSEF（配列番号１１８）
当業者は、例示的なＣａｓ９蛋白質（例えば、本明細書に記載される例示的なＣａｓ９ヌクレアーゼ、そのバリアントおよび融合体を包含する）のいずれかが、本開示の技術を用いて細胞に送達され得るということと、本開示がこの点で限定されないということを理解するであろう。
ヌクレアーゼエフェクター蛋白質
ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ切断ドメイン（例えばＦｏｋＩドメイン）と結びつけられた転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼである。操作されたＴＡＬＥ構築物を生成するためのいくつものモジュール的なアセンブリスキームが報告されている（Zhang, Feng; et.al. (February 2011).「Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription」. Nature Biotechnology 29 (2): 149-53、Geiβler, R.; Scholze, H.; Hahn, S.; Streubel, J.; Bonas, U.; Behrens, S. E.; Boch, J. (2011), Shiu, Shin-Han. ed.「Transcriptional Activators of Human Genes with Programmable DNA-Specificity」. PLoS ONE 6 (5): e19509、Cermak, T.; Doyle, E. L.; Christian, M.; Wang, L.; Zhang, Y.; Schmidt, C.; Baller, J. A.; Somia, N. V. et al. (2011). 「Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting」. Nucleic Acids Research、Morbitzer, R.; Elsaesser, J.; Hausner, J.; Lahaye, T. (2011).「Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning」. Nucleic Acids Research、Li, T.; Huang, S.; Zhao, X.; Wright, D. A.; Carpenter, S.; Spalding, M. H.; Weeks, D. P.; Yang, B. (2011).「Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes」. Nucleic Acids Research.、Weber, E.; Gruetzner, R.; Werner, S.; Engler, C.; Marillonnet, S. (2011). Bendahmane, Mohammed, ed.「Assembly of Designer TAL Effectors by Golden Gate Cloning」. PLoS ONE 6 (5): e19722。そのそれぞれの全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。当業者は、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、高い特異性でほとんどいずれかのゲノム配列をターゲット化するように操作され得るということ、およびかかる操作されたヌクレアーゼは、細胞内ゲノムを操作するための本技術の態様に用いられ得る（例えば、ＴＡＬＥＮが細胞内ゲノム中のそのターゲット配列に結合して切断するための好適な状況で、本明細書において開示される方法または戦略によってそれぞれのＴＡＬＥＮを送達することによる）ということを理解するであろう。いくつかの態様において、送達されるＴＡＬＥＮは、疾患または障害と結びついた遺伝子またはアレルをターゲット化する。いくつかの態様において、対象へのＴＡＬＥＮの送達は対象に治療上の利益を供与する。
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断ドメインとジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとを含む人工ヌクレアーゼの一クラスである。いくつかの態様において、ＤＮＡ切断ドメインは制限エンドヌクレアーゼの（例えばＦｏｋＩの）非特異的ＤＮＡ切断ドメインである。いくつかの態様において、ＤＮＡ切断ドメインは、同じ型の第２のＤＮＡ切断ドメインと二量体化したときにのみ二本鎖ＤＮＡを切断するドメインである。いくつかの態様において、ＤＮＡ切断ドメインはリンカー（例えばペプチドリンカー）を介してジンクフィンガードメインのＣ末端に融合される。いくつかの態様において、ジンクフィンガードメインは約３～約６つのジンクフィンガーを含み、長さ約９～２０ヌクレオチドのターゲット配列を特異的に認識して結合する。いくつかの態様において、複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ分子が、本発明によって提供されるシステムまたは方法によってターゲット細胞に送達され、１つのジンクフィンガーヌクレアーゼ分子のジンクフィンガードメインが、第２のジンクフィンガーヌクレアーゼ分子のターゲット配列の近接した近位にあるターゲット配列に結合する。いくつかの態様において、互いに近接した近位にあるターゲット配列に結合するジンクフィンガーヌクレアーゼ分子のジンクフィンガードメインは異なる。いくつかの態様において、本明細書において提供されるシステムまたは方法によって細胞に送達されるジンクフィンガーヌクレアーゼ分子は、別のジンクフィンガーヌクレアーゼ分子のターゲット配列の近接した近位にあるターゲット核酸配列に結合し、その結果、分子のＤＮＡ切断ドメインは２つのターゲット配列間の部位において二量体化して、ＤＮＡ分子を切断する。
いくつかの態様において、ターゲット細胞のゲノムは、本明細書において開示される戦略または方法によって細胞に送達されるヌクレアーゼによって（例えば、ＴＡＬＥＮもしくはジンクフィンガーヌクレアーゼ、または複数のかかるヌクレアーゼもしくはその組み合わせによって）編集される。いくつかの態様において、一または二本鎖切断がヌクレアーゼによってターゲット細胞のゲノム中の特異的な部位に導入され、ターゲット化されたゲノム配列の破壊をもたらす。いくつかの態様において、ターゲット化されるゲノム配列は遺伝子のコード領域内の核酸配列である。いくつかの態様において、ヌクレアーゼによって導入される鎖切断は、コードされる遺伝子産物の発現を損なうターゲット遺伝子内の変異につながる。いくつかの態様において、核酸がヌクレアーゼと一緒に細胞に共送達される。いくつかの態様において、核酸は、ヌクレアーゼターゲット部位に隣接する配列と同一または相同である配列を含む。いくつかのかかる態様において、ヌクレアーゼによって実現された鎖切断は、細胞内ＤＮＡ修復機構によって修復され、切断部位において細胞内ＤＮＡ中に共送達された核酸の全てまたは一部を導入し、共送達された核酸またはその一部のターゲット化された挿入をもたらす。いくつかの態様において挿入は、病原性のアレルの破壊または修復をもたらす。いくつかの態様において、挿入は、好適なアッセイ、例えばＤＮＡシーケンシングアッセイ、サザンブロットアッセイ、または共送達される核酸によってコードされるレポーター遺伝子（例えば、蛍光蛋白質もしくは抗生物質に対する耐性）についてのアッセイによって検出される。いくつかの態様において、核酸が超荷電蛋白質への結びつきによって共送達される。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は機能的なエフェクター蛋白質（例えばヌクレアーゼ）ともまた結びつけられる。いくつかの態様において、ターゲット細胞へのヌクレアーゼの送達は遺伝子の機能の臨床上または治療上有益な破壊をもたらす。
いくつかの態様において、対象からの細胞が得られ、ヌクレアーゼまたは他のエフェクター蛋白質は、本明細書において提供されるシステムまたは方法によってエクスビボで細胞に送達される。いくつかの態様において、処置された細胞は、望まれるヌクレアーゼによって媒介されるゲノム編集イベントが実現した細胞について選択される。いくつかの態様において、望まれるゲノム変異または変化を持っている処置された細胞は、それらが得られた対象に戻される。
特異的な配列をターゲット化するヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ）の操作、生成、および単離、ならびに特異的なターゲット配列において細胞内ゲノムを編集することのための方法は、当分野において周知である（例えば、Mani et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 335:447-457, 2005、Perez et al., Nature Biotechnology 26:808-16, 2008、Kim et al., Genome Research, 19: 1279-88, 2009、Urnov et al., Nature 435:646-51, 2005、Carroll et al., Gene Therapy 15: 1463-68, 2005、Lombardo et al., Nature Biotechnology 25: 1298-306, 2007、Kandavelou et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 388:56-61, 2009、およびHockemeyer et al., Nature Biotechnology 27(9):851-59, 2009、さらには各ヌクレアーゼについてそれぞれの項に記述されている参照を参照）。当業者は、本明細書において提供される手引きに基づいて、本開示の文脈への使用に好適な方法を確かめる能力があるであろう。
ＴＡＬＥエフェクター蛋白質
いくつかの態様において、ＴＡＬＥドメインを含むエフェクター蛋白質は、本明細書において提供されるシステムまたは方法によってターゲット細胞に送達される。いくつかの態様において、ＴＡＬＥエフェクター（例えば、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと異種転写活性化因子または抑制因子ドメインとを含む、操作されたＴＡＬＥ転写因子）は、本発明の側面によって提供されるシステムまたは方法によって細胞に送達される。いくつかの態様において、ＴＡＬＥエフェクター（例えば転写因子）は、細胞内の転写因子のターゲット遺伝子の転写を活性化または阻害するために充分な量で細胞に送達される。いくつかの態様において、転写因子は、ターゲット細胞の表現型の変化（例えば、細胞機能の変化または発生能の変化）を実現するために充分な量および期間で送達される。例示的なＴＡＬＥ転写因子が本明細書に記載されており、当業者は、本明細書において提供される手引きおよび当分野におけるかかるＴＡＬＥ転写因子の知識に基づいて追加の好適なＴＡＬＥ転写因子を同定する能力があるであろう。
いくつかの態様において、ターゲット細胞（例えば体細胞）は、本明細書において提供される超荷電蛋白質と結びついたＴＡＬＥ転写因子またはかかる因子の組み合わせと接触させられる。いくつかの態様において、ターゲット細胞は初代体細胞であり、超荷電蛋白質と結びついたＴＡＬＥ転写因子とインビトロまたはエクスビボで接触させられる。いくつかの態様において、ＴＡＬＥ転写因子は、例えば本明細書に記載される正に荷電した超荷電蛋白質と結びつく。いくつかの態様において、ＴＡＬＥ転写因子は、例えば本明細書に記載される負に荷電した超荷電蛋白質と結びつく。いくつかの態様において、ＴＡＬＥ転写因子は、例えば本明細書に記載されるカチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマーと結びつく。いくつかの態様において、ＴＡＬＥ転写因子は、負に荷電した超荷電蛋白質と例えば本明細書に記載されるカチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマーと結びつく。
いくつかの態様において、ターゲット細胞は、本明細書において提供される超荷電蛋白質（ならびに任意でカチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマー）と結びついたＴＡＬＥ転写因子と接触または反復的に接触させられ、細胞表現型または遺伝子発現の望まれる変化が検出される。いくつかの態様において、ターゲット細胞は、望まれる細胞表現型の形成が検出されるまで、本明細書において提供される超荷電蛋白質（ならびに任意でカチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマー）と結びついたＴＡＬＥ転写因子と反復的に接触させられる。細胞表現型および遺伝子発現を検出するための方法は当業者に周知であり、例えば、良く確立された方法（例えば、免疫組織化学、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、または蛍光顕微鏡法）によるマーカー遺伝子発現の検出および形態分析を包含する。いくつかの態様において、ターゲット細胞は、少なくとも３時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも１０～１２日、少なくとも１２～１５日、少なくとも１５～２０日、少なくとも２０～２５日、少なくとも２５～３０日、少なくとも３０～４０日、少なくとも４０～５０日、少なくとも５０～６０日、少なくとも６０～７０、または少なくとも７０～１００日の期間、本明細書において提供される超荷電蛋白質と結びついたＴＡＬＥ転写因子と接触させられる。
いくつかの態様において、ターゲット細胞は、異なる細胞状態に向けて細胞をプログラミングするために有効な量および期間で、本明細書において提供される超荷電蛋白質（ならびに任意でカチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマー）と結びついたＴＡＬＥ転写因子と接触させられる。当業者には明らかであろう通り、細胞をプログラミングまたはリプログラミングするために必要な量は、様々な因子（例えば細胞型および処置スケジュール）に依存するであろう。一般的に、本明細書において提供されるシステムまたは方法によるターゲット体細胞へのＴＡＬＥ転写因子の送達は、有意な毒性が観察され得る濃度よりも下の濃度においてであろう。臨界濃度は、例えば特定のＴＡＬＥ転写因子、それが結びつけられる超荷電蛋白質、結びつきの型、および処置されようとする細胞の型に依存するであろう。
特定の細胞型への送達のための、超荷電蛋白質（ならびに任意でカチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマー）と結びついた機能的なエフェクター蛋白質の有用な濃度は、慣例の実験法によって当業者によって確定され得る。いくつかの態様において、ターゲット細胞は、約１ｐＭ～約１μＭの濃度で、超荷電蛋白質（ならびに任意でカチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマー）と結びついた機能的なエフェクター蛋白質とインビトロまたはエクスビボで接触させられる。いくつかの態様において、ターゲット細胞は、約１ｐＭ、約２．５ｐＭ、約５ｐＭ、約７．５ｐＭ、約１０ｐＭ、約２０ｐＭ、約２５ｐＭ、約３０ｐＭ、約４０ｐＭ、約５０ｐＭ、約６０ｐＭ、約７０ｐＭ、約７５ｐＭ、約８０ｐＭ、約９０ｐＭ、約１００ｐＭ、約２００ｐＭ、約２５０ｐＭ、約３００ｐＭ、約４００ｐＭ、約５００ｐＭ、約６００ｐＭ、約７００ｐＭ、約７５０ｐＭ、約８００ｐＭ、約９００ｐＭ、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎｍ、約７０ｎＭ、約７５ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約２００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、約６００ｎＭ、約７００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約８００ｎＭ、約９００ｎＭ、または約１μＭの濃度で、超荷電蛋白質と結びついた機能的なエフェクター蛋白質とインビトロまたはエクスビボで接触させられる。機能的なエフェクター蛋白質に対するターゲット細胞の有用な暴露、および必要な場合には機能的なエフェクター蛋白質の非存在下での投与後のインキュベーションの時間、さらには望まれる生物学的効果（例えば、遺伝子転写の変化、送達されたヌクレアーゼによるターゲット部位の切断など）または望まれる細胞表現型を達成するために有用な投与／インキュベーションサイクル数もまた、慣例の実験法によって当業者によって確定され得る。
いくつかの態様において、本明細書において提供されるシステムまたは方法による機能的なエフェクター蛋白質の送達のためのターゲット細胞は、対象からの生検によって得られた初代細胞である。いくつかの態様において、対象は疾患を有すると診断される。いくつかの態様において、疾患は、特異的な細胞型（例えば神経細胞）の減損した機能によって特徴づけられる変性疾患である。いくつかの態様において、本明細書において開示される戦略もしくは方法に従って機能的なエフェクター蛋白質によって処置される細胞、またはかかる細胞の子孫は、細胞補充治療手法に用いられる。いくつかの態様において、処置された細胞は、自家細胞補充治療手法において体細胞が得られた対象に投与される。
いくつかの態様において、機能的なエフェクター蛋白質（例えば、細胞を１つの分化状態から別の状態に変換する能力があるＴＡＬＥ転写因子）は、本明細書において提供されるシステムまたは方法によって、インビトロまたはインビボでターゲット細胞に送達される。分化転換を実現する転写因子は当分野において公知である（例えば、Zhou et al., Nature 455:627-33, 2008参照）。いくつかの態様において、ＰＰＡＲγまたはＰＲＤＭ１６の発現を調節するＴＡＬＥ転写因子が、本発明者によって提供されるシステムまたは方法によって線維芽細胞に送達される。それらの転写因子の発現は、褐色脂肪または白色脂肪細胞状態に向かう線維芽細胞のプログラミングにおける中枢的なステップであるということが当分野において公知である。いくつかの態様において、プログラミングされた褐色脂肪細胞が、褐色脂肪細胞の必要がある対象から得られた線維芽細胞から生成されて、対象に投与される（例えば、対象が関わる細胞補充治療手法に用いられる）。
複合体の形成
本発明は、送達されるべき１つまたは２つ以上の機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質を含む複合体を提供する。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、非共有結合的な相互作用を介して、送達されるべき１つまたは２つ以上の機能的なエフェクター蛋白質と結びつけられる。いくつかの態様において、超荷電蛋白質は、静電気的相互作用を介して１つまたは２つ以上の機能的なエフェクター蛋白質と結びつけられる。ある種の態様において、超荷電蛋白質は正味の正の総電荷を有し、送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質は正味の負の総電荷を有する。いくつかの態様において、複合体はカチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマーをさらに含む。例えば、いくつかの態様において、複合体の超荷電蛋白質は超負荷電であり、カチオン性脂質および／またはポリマーとの結びつきを可能とする。
ある種の態様において、超荷電蛋白質は、共有結合によって、送達されるべき１つまたは２つ以上の機能的なエフェクター蛋白質と結びつけられる。例えば、超荷電蛋白質は、送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質に融合され得る。共有結合的な取り付けは直接的または間接的で（例えばリンカーを介して）あり得る。いくつかの態様において、共有結合的な取り付けは１つまたは２つ以上のリンカーを介して媒介される。いくつかの態様において、リンカーは切断可能なリンカーである。ある種の態様において、切断可能なリンカーはアミド、エステル、またはジスルフィド結合を含む。例えば、リンカーは、細胞内酵素によって切断可能なアミノ酸配列であり得る。ある種の態様において、酵素はプロテアーゼである。他の態様において、酵素はエステラーゼである。いくつかの態様において、酵素は、他の細胞型よりもある種の細胞型において高発現されるものである。例えば、酵素は、非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞において高発現されるものであり得る。例示的なリンカーおよびそれらのリンカーを切断する酵素が下で提出されている。
ほんの１つの特定の例を挙げると、＋３６ＧＦＰは、ＡＬＡＬ（配列番号２５４）などの切断可能なリンカーによって送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質と結びつけられて、＋３６ＧＦＰ－（ＧＧＳ）４－ＡＬＡＬ－（ＧＧＳ）４－［機能的なエフェクター蛋白質Ｘ］（配列番号２５５）を生成し得る。
ある種の態様において、送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質は、超荷電蛋白質と接触させられて複合体を形成する。いくつかの態様において、複合体の形成はｐＨ７でまたはそのあたりで実行される。いくつかの態様において、複合体の形成は約ｐＨ５、約ｐＨ６、約ｐＨ７、約ｐＨ８、または約ｐＨ９で実行される。複合体の形成は、超荷電蛋白質および／または機能的なエフェクター蛋白質の機能に負の影響を及ぼさないｐＨで典型的には実行される。いくつかの態様において、複合体の形成は室温で実行される。いくつかの態様において、複合体の形成は３７℃でまたはそのあたりで実行される。いくつかの態様において、複合体の形成は、４℃より下、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、または４０℃よりも高くで実行される。複合体の形成は、超荷電蛋白質および／または機能的なエフェクター蛋白質の機能に負の影響を及ぼさない温度で典型的には実行される。いくつかの態様において、複合体の形成は無血清培地中で実行される。いくつかの態様において、複合体の形成はＣＯ２（例えば、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％以上）の存在下で実行される。
いくつかの態様において、複合体の形成は、約１００ｎＭの機能的なエフェクター蛋白質の濃度を用いて実行される。いくつかの態様において、複合体の形成は、約２５ｎＭ、約５０ｎＭ、約７５ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２５ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１７５ｎＭ、または約２００ｎＭの機能的なエフェクター蛋白質の濃度を用いて実行される。いくつかの態様において、複合体の形成は、約４０ｎＭの超荷電蛋白質の濃度を用いて実行される。いくつかの態様において、複合体の形成は、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、または約１００ｎＭの超荷電蛋白質の濃度を用いて実行される。
いくつかの態様において、複合体の形成は、過剰な機能的なエフェクター蛋白質の条件で実行される。いくつかの態様において、複合体の形成は、約２０：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、または約１：１の機能的なエフェクター蛋白質：超荷電蛋白質の比で実行される。いくつかの態様において、複合体の形成は、約３：１の機能的なエフェクター蛋白質：超荷電蛋白質の比で実行される。いくつかの態様において、複合体の形成は、約２０：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、または約１：１の超荷電蛋白質：機能的なエフェクター蛋白質の比で実行される。
いくつかの態様において、複合体の形成は、機能的なエフェクター蛋白質と超荷電蛋白質を混合し、（例えば逆位によって）混合物を撹拌することによって実行される。いくつかの態様において、複合体の形成は、機能的なエフェクター蛋白質と超荷電蛋白質を混合し、混合物が静置されることを可能とすることによって実行される。いくつかの態様において、複合体の形成は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤の存在下で実行される。いくつかの態様において、複合体は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とさらに組み合わされる。例示的な賦形剤または担体は、水、溶媒、脂質、蛋白質、ペプチド、エンドソーム溶解剤（例えば、クロロキン、ピレンブチル酸）、低分子、炭水化物、緩衝液、天然ポリマー、合成ポリマー（例えば、ＰＬＧＡ、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカプロラクトン、ポリホスファゼン）、医薬剤などを包含する。
いくつかの態様において、超荷電蛋白質と機能的なエフェクター蛋白質とを含む複合体は、超荷電蛋白質単独または機能的なエフェクター蛋白質単独よりもゲル電気泳動アッセイにおいてより低速で移動し得る。
応用
本発明は、細胞に送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子／抑制因子、リコンビナーゼ、Ｃａｓ９蛋白質（そのバリアントおよび融合体を包含する）など）と結びついた天然に存在するかまたは操作された超荷電蛋白質を含む組成物、さらにはかかる組成物を用いる方法およびかかる組成物の使用を提供する。ある種の態様において、Ｃａｓ９蛋白質（例えば、Ｃａｓ９蛋白質はｇＲＮＡと結びついている）とカチオン性脂質とを含む組成物が提供される。ある種の態様において、Ｃａｓ９蛋白質（例えば、Ｃａｓ９蛋白質はｇＲＮＡと結びつけられている）とカチオン性ポリマーとを含む組成物が提供される。本発明組成物は、例えば細胞への薬剤の送達から恩恵を受け得るいずれかの疾患を処置または予防するために用いられ得る。本発明組成物は、研究目的のために細胞をトランスフェクションまたは処置するためにもまた用いられ得る。
いくつかの態様において、本発明に従う組成物は研究目的のために（例えば、研究の文脈で細胞に機能的なエフェクター蛋白質を効率的に送達するために）用いられ得る。いくつかの態様において、本発明に従う組成物は治療目的のために用いられ得る。いくつかの態様において、本発明に従う組成物は、種々の疾患、障害、および／または状態のいずれかの処置のために用いられ得、それらは以下の１つまたは２つ以上を包含するが、これに限定されない：自己免疫疾患（例えば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）、炎症性疾患（例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患）、感染症（例えばウイルス感染（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ）、細菌感染、真菌感染、敗血症）、神経疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、自閉症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、心血管障害（例えば、アテローム硬化症、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、黄斑変性などの血管新生障害）、増殖性障害（例えば、癌、良性新生物）、呼吸器系障害（例えば、慢性閉塞性肺疾患）、消化器障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍）、筋骨格系疾患（例えば、線維筋痛症、関節炎）、内分泌、代謝、および栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗しょう症）、泌尿器障害（例えば、腎疾患）、精神障害（例えば、抑うつ、統合失調症）、皮膚障害（例えば、創傷、湿疹）、血液およびリンパ系疾患（例えば、貧血症、血友病）など。
本発明の組成物は臨床の設定において用いられ得る。例えば、超荷電蛋白質は、治療応用のために用いられ得る機能的なエフェクター蛋白質と結びつけられ得る。かかる機能的なエフェクター蛋白質は、例えばヌクレアーゼまたは転写活性化因子であり得る。Ｃａｓ９蛋白質およびカチオン性脂質を含む他の組成物もまた治療応用のために用いられ得る。
いくつかの態様において、超荷電蛋白質または超荷電蛋白質と結びついた機能的なエフェクター蛋白質は、検出可能な標識を包含する。それらの分子は、検出、イメージング、病期決定、診断、または患者選別に用いられ得る。好適な標識は、蛍光、化学発光、酵素標識、比色、燐光、密度に基づく標識、例えば、電子密度に基づく標識、および一般的に造影剤、ならびに／または放射性標識を包含する。
医薬組成物
本発明は、送達されるべき少なくとも１つの機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質を含む組成物を提供し、いくつかの態様においてカチオン性脂質によって封入される。Ｃａｓ９蛋白質とカチオン性脂質とを含む他の組成物が提供される。それゆえに、本発明は医薬組成物を提供し、機能的なエフェクター蛋白質と結びついた１つもしくは２つ以上の超荷電蛋白質ならびに／またはカチオン性脂質および／もしくはカチオン性ポリマーと結びついた１つもしくは２つ以上の機能的なエフェクター蛋白質と、１つまたは２つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを含む。医薬組成物は、１つまたは２つ以上の追加の治療活性物質を任意で含み得る。いくつかの態様に従って、その必要がある対象に送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質と結びついた１つまたは２つ以上の超荷電蛋白質を含む医薬組成物を投与する方法が、提供される。いくつかの態様において、組成物はヒトに投与される。本開示の目的のためには、言い回し「有効成分」は、本明細書に記載される送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質、または機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質および／もしくはＣａｓ９蛋白質を一般的に示す。
本明細書において提供される医薬組成物の記載は、ヒトへの投与に好適である医薬組成物に主として導かれているが、かかる組成物が一般的に全ての種類の動物への投与に好適であるということは当業者によって理解されるであろう。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の改変は周知であり、獣医薬理学の当業者は、せいぜい単なる平均的な実験法によってかかる改変を設計し得るおよび／または実施し得る。医薬組成物の投与が考えられる対象は、ヒトおよび／または他の霊長類、哺乳動物（商業的に関係する哺乳動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／またはラットを包含する）、および／または鳥類（商業的に関係する鳥類、例えばニワトリ、鴨類、ガチョウ、および／またはシチメンチョウを包含する）を包含するが、これに限定されない。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学分野において公知のまたは以降で開発されるいずれかの方法によって調製され得る。一般的に、かかる調製法は、有効成分を賦形剤および／または１つもしくは２つ以上の他の補助的な成分と結びつけるステップと、それから、必要なおよび／または望ましい場合には、産物を成形および／またはパッケージングして望まれる単一または複数用量の単位にすることとを包含する。
本発明に従う医薬組成物は、バルクで、単一単位用量として、および／または複数の単一単位用量として調製、パッケージング、および／または販売され得る。本明細書において用いられる場合、「単位用量」は、有効成分の所定量を含む医薬組成物の個別的な量である。有効成分の量は、対象に投与されるであろう有効成分の用量および／またはかかる用量の便利な画分（例えば、かかる用量の１／２もしくは１／３）と一般的には等しい。
本発明に従う医薬組成物中の有効成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／またはいずれかの追加の成分の相対量は、処置される対象のアイデンティティ、サイズ、および／または状態に依存して、さらに組成物が投与されるべき経路に依存して変わるであろう。例えば、組成物は０．１％～１００％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み得る。
加えて、医薬製剤は薬学的に許容可能な賦形剤を含み得、それらは、本明細書において用いられる場合、いずれかおよび全ての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体基剤、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘もしくは乳化剤、保存料、固体結合剤、滑剤、および同類を、望まれる特定の剤形に適するように包含する。Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006。参照によって本明細書に組み込まれる）は、医薬組成物を処方することに用いられる様々な賦形剤およびその調製のための公知の技術を開示している。いずれかの従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と不適合性である（例えば、いずれかの望ましくない生物学的効果を生成すること、または別様に、医薬組成物のいずれかの他の構成物（単数または複数）と有害な様式で相互作用することによる）限りを除いて、その使用は本開示の範囲内であると考えられる。
いくつかの態様において、薬学的に許容可能な賦形剤は少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。いくつかの態様において、賦形剤はヒトへの使用および獣医学的使用を認可されている。いくつかの態様において、賦形剤は米国食品医薬品局によって認可されている。いくつかの態様において賦形剤は医薬グレードである。いくつかの態様において、賦形剤は米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準に合っている。
医薬組成物の製造に用いられる薬学的に許容可能な賦形剤は、不活性な希釈剤、分散および／もしくは造粒剤、界面活性剤および／もしくは乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存料、緩衝剤、滑剤、ならびに／または油を包含するが、これに限定されない。かかる賦形剤は製剤中に任意で包含され得る。ココアバターおよび座薬用ワックス、着色料、コーティング剤、甘味料、香料、および／または芳香剤などの賦形剤は処方者の判断に従って組成物中に存在し得る。
例示的な希釈剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥澱粉、コーンスターチ、粉糖など、および／またはその組み合わせを包含するが、これに限定されない。
例示的な造粒および／または分散剤は、馬鈴薯澱粉、コーンスターチ、タピオカ澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、シトラスパルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木材産物、天然海綿、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン（クロスポビドン）、カルボキシメチル澱粉ナトリウム（澱粉グリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、糊化澱粉（スターチ１５００）、微結晶澱粉、水不溶性澱粉、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム（ビーガム）、ラウリル硫酸ナトリウム、第４級アンモニウム化合物など、および／またはその組み合わせを包含するが、これに限定されない。
例示的な界面活性剤および／または乳化剤は、天然乳化剤（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（chondrux）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、ウールファット、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド状粘土（例えばベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびビーガム（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えばステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えばカルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［Ｓｐａｎ（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［Ｓｐａｎ（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［Ｓｐａｎ（登録商標）６５］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［Ｓｐａｎ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えばモノステアリン酸ポリオキシエチレン［Ｍｙｒｊ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン水添ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、およびソルトール（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えばクレモフォア（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル、（例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル［Ｂｒｉｊ（登録商標）３０］）、ポリビニルピロリドン、モノラウリン酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、ポロキサマー（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウムなど、および／またはその組み合わせを包含するが、これに限定されない。
例示的な結合剤は、澱粉（例えばコーンスターチおよび澱粉ペースト）、ゼラチン、糖（例えばスクロース、グルコース、ブドウ糖、デキストリン、モラセス、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、天然および合成ガム（例えばアカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスエキス、パンワール（panwar）ガム、ガティガム、イサポル（isapol）殻粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、酢酸セルロース、ポリビニルピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ビーガム（登録商標））、およびカラマツアラボガラクタン）、アルギン酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、無機カルシウム塩、ケイ酸、ポリメタクリレート、ワックス、水、アルコールなど、およびその組み合わせを包含するが、これに限定されない。
例示的な保存料は、抗酸化剤、キレート剤、抗微生物保存料、抗真菌保存料、アルコール保存料、酸性保存料、および／または他の保存料を包含し得るが、これに限定されない。例示的な抗酸化剤は、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル（acorbyl）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、ピロ亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、および／または亜硫酸ナトリウムを包含するが、これに限定されない。例示的なキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムを包含する。例示的な抗微生物保存料は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールを包含するが、これに限定されない。例示的な抗真菌保存料は、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸を包含するが、これに限定されない。例示的なアルコール保存料は、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸、および／またはフェニルエチルアルコールを包含するが、これに限定されない。例示的な酸性保存料は、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータカロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸を包含するが、これに限定されない。他の保存料は、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロオキシム（deteroxime）メシレート、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエンド（toluened）（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、ピロ亜硫酸カリウム、Glydant Plus（登録商標）、Phenonip（登録商標）、メチルパラベン、Germall（登録商標）115、Germaben（登録商標）II、Neolone（商標）、Kathon（商標）、および／またはEuxyl（登録商標）を包含するが、これに限定されない。
例示的な緩衝剤は、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルコヘプトン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、無発熱物質水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコールなど、および／またはその組み合わせを包含するが、これに限定されない。
例示的な滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸（behanate）グリセリル、水添植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど、およびその組み合わせを包含するが、これに限定されない。
例示的な油は、アーモンド、アンズ核、アボカド、ババス、ベルガモット、クロスグリ種子、ルリジサ、ケード、カモミール、キャノーラ、キャラウェイ、カルナウバ、ヒマシ、シナモン、ココアバター、ココナッツ、タラ肝、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、月見草、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ヒョウタン、葡萄種子、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイナッツ、ラバンジン、ラベンダー、レモン、アオモジ、マカデミアナッツ、ゼニアオイ、マンゴー種子、メドウフォーム種子、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、ヤシ、パーム核、ピーチ核、ピーナッツ、ケシ種子、カボチャ種子、セイヨウアブラナ、米ぬか、ローズマリー、ベニバナ、ビャクダン、サザンカ、キダチハッカ、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、大豆、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、椿、ベチバー、クルミ、および小麦胚芽油を包含するが、これに限定されない。例示的な油は、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、ミネラルオイル、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーンオイル、および／またはその組み合わせを含むが、これに限定されない。
経口および非経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容可能なエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁物、シロップ、および／またはエリキシル剤を包含するが、これに限定されない。有効成分に加えて、液体剤形は、当分野において普通に用いられる不活性な希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにその混合物などを含み得る。不活性な希釈剤以外に、経口組成物は、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味料、香料、ならびに／または芳香剤を包含し得る。非経口投与のためのある種の態様において、組成物は、可溶化剤、例えばクレモフォール（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはその組み合わせと混合される。
注射用調製物、例えば無菌の注射用の水性または油性懸濁物が、好適な分散剤、湿潤剤、および／または懸濁剤を用いて公知技術に従って処方され得る。無菌の注射用調製物は、無毒な非経口的に受け入れられる希釈剤および／または溶媒中の無菌の注射用溶液、懸濁物、および／またはエマルション、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液であり得る。使用され得る受け入れられる基剤および溶媒には、水、リンゲル液（ＵＳＰ）、および等張塩化ナトリウム溶液がある。無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒として従来使用されている。この目的のためには、いずれかの無刺激性の不揮発性油が使用され得、合成モノまたはジグリセリドを包含する。オレイン酸などの脂肪酸は注射剤の調製に用いられ得る。
注射用製剤は、例えば細菌リテーナフィルタによる濾過によって、および／または無菌化剤を無菌固体組成物の形態（これは、使用に先立って無菌水または他の無菌の注射用媒体中に溶解または分散され得る）で組み込むことによって、無菌化され得る。
有効成分の効果を長引かせるためには、多くの場合に、皮下または筋内注射からの有効成分の吸収を低速化させることが望ましい。これは、不良な水溶性を有する結晶または非結晶材料の液体懸濁物の使用によって成就され得る。それから、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、これは翻って結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。その代わりに、非経口投与された薬物形態の遅延した吸収は、薬物を油基剤中に溶解または懸濁することによって成就される。注射用デポ形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解ポリマー中の薬物のマイクロ封入マトリックスを形成することによって作られる。ポリマーに対する薬物の比および使用される特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出速度がコントロールされ得る。他の生分解ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）を包含する。デポ注射用製剤は、体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に薬物をトラップすることによって調製される。
直腸または膣内投与のための組成物は典型的には座薬であり、それらは、常温で固体であるが体温では液体であり、そのため直腸または膣腔において融けて有効成分を放出する好適な非刺激性賦形剤（例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、もしくは座薬ワックス）と組成物を混合することによって調製され得る。
経口投与のための固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸薬、粉末、および顆粒剤を包含する。かかる固体剤形において、有効成分は少なくとも１つの不活性な薬学的に許容可能な賦形剤と混合される。それらは例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／あるいは充填剤または増量剤（例えば澱粉、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、結合剤（例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、およびアカシア）、保湿剤（例えばグリセロール）、崩壊剤（例えば寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯もしくはタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えばパラフィン）、吸収促進剤（例えば第４級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸着剤（例えばカオリンおよびベントナイト粘土）、および滑剤（例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、およびその混合物である。カプセル剤、錠剤、および丸薬の場合では、剤形は緩衝剤を含み得る。
類似の型の固体組成物が、ソフトおよびハードの充填ゼラチンカプセル剤の充填剤として使用され得、ラクトースまたは乳糖、さらには高分子量ポリエチレングリコールおよび同類などの賦形剤を用いる。錠剤、糖衣剤、カプセル剤、丸薬、および顆粒剤の固体剤形は、コーティングおよびシェル（例えば腸溶コーティングおよび医薬処方分野において周知の他のコーティング）によって調製され得る。それらは任意で乳白剤を含み得、有効成分（単数または複数）を、腸管のある部位においてのみまたはそこにおいて優先的に、任意で遅延型様式で放出する組成物であり得る。用いられ得る包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを包含する。類似の型の固体組成物が、ソフトおよびハードの充填ゼラチンカプセル剤の充填剤として使用され得、ラクトースまたは乳糖、さらには高分子量ポリエチレングリコールおよび同類などの賦形剤を用いる。
組成物の局所および／または経皮投与のための剤形は、軟膏、ペースト剤、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、および／またはパッチを包含し得る。一般的に、有効成分は、無菌条件において、薬学的に許容可能な賦形剤および／またはいずれかの必要とされる保存料および／または緩衝液と、要求され得る通り混合される。加えて、本発明は経皮パッチの使用を考え、これは多くの場合に、体への化合物のコントロールされた送達を提供するという追加の利点を有する。かかる剤形は、例えば化合物を適当な媒体中に溶解および／または調合することによって調製され得る。その代わりにまたは加えて、速度は、速度コントロール膜を提供することによってならびに／または化合物をポリマーマトリックスおよび／もしくはゲル中に分散することによってのいずれかでコントロールされ得る。
本明細書に記載される皮内医薬組成物を送達することへの使用のための好適なデバイスは、短針デバイスを包含する。皮内組成物は、皮膚中への針の有効挿入長を限定するデバイス、およびその機能上の均等物によって投与され得る。液体噴射注射器によっておよび／または角質層を貫いて真皮に達する噴射を生成する針によって、液体組成物を真皮に送達する噴射注射デバイスが好適である。圧縮ガスを用いて粉末形態のワクチンを加速させ、皮膚の外層を通して真皮に至らせるバリスティックな粉末／粒子送達デバイスが好適である。その代わりにまたは加えて、従来のシリンジが皮内投与の古典的なマントゥー法で用いられ得る。
局所投与に好適な製剤は、液体および／または半液体調製物、例えばリニメント剤、ローション、水中油および／または油中水エマルション、例えばクリーム、軟膏、および／またはペースト剤、および／または溶液および／または懸濁物を包含するが、これに限定されない。局所投与可能な製剤は例えば約１％～約１０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み得るが、有効成分の濃度は溶媒中への有効成分の可溶性限度まで高くあり得る。局所投与のための製剤は、本明細書に記載される追加の成分の１つまたは２つ以上をさらに含み得る。
医薬組成物は、口腔からの経肺投与に好適な製剤として調製、パッケージング、および／または販売され得る。かかる製剤は、有効成分を含みかつ約０．５ｎｍ～約７ｎｍまたは約１ｎｍ～約６ｎｍの範囲の直径を有する乾燥粒子を含み得る。かかる組成物は、便宜的に、乾燥粉末レザーバ（これには噴射剤流が導かれて粉末を分散し得る）を含むデバイスを用いるおよび／または自己噴射性溶媒／粉末ディスペンサー容器（例えば、密封容器中の低沸点噴射剤中に溶解および／または懸濁された有効成分を含むデバイス）を用いる投与のための乾燥粉末の形態である。かかる粉末は、重量による粒子の少なくとも９８％が０．５ナノメートルよりも大きい直径を有し、数による粒子の少なくとも９５％が７ナノメートルよりも小さい直径を有する粒子を含む。その代わりに、重量による粒子の少なくとも９５％が１ナノメートルよりも大きい直径を有し、数による粒子の少なくとも９０％が６ナノメートルよりも小さい直径を有する。乾燥粉末組成物は糖などの固体微粉末希釈剤を含み得、便宜的に単位用量形態で提供される。
低沸点噴射剤は、一般的に、大気圧において華氏６５度未満の沸点を有する液体噴射剤を包含する。一般的に、噴射剤は組成物の５０～９９．９％（ｗ／ｗ）を構成し得、有効成分は組成物の０．１～２０％（ｗ／ｗ）を構成し得る。噴射剤は、追加の成分、例えば液体非イオン性および／もしくは固体アニオン性界面活性剤ならびに／または固体希釈剤（これは、有効成分を含む粒子と同じオーダーの粒径を有し得る）をさらに含み得る。
経肺送達のために処方される医薬組成物は、溶液および／または懸濁物の液滴の形態の有効成分を提供し得る。かかる製剤は、有効成分を含む任意で無菌の水性および／または希アルコール性溶液および／または懸濁物として調製、パッケージング、および／または販売され得、便宜的にいずれかのネブライゼーションおよび／または霧化デバイスを用いて投与され得る。かかる製剤は１つまたは２つ以上の追加の成分（香料、例えばサッカリンナトリウム、揮発油、緩衝剤、界面活性剤、および／または保存料、例えばメチルヒドロキシ安息香酸を包含するが、それらに限定されない）をさらに含み得る。この投与経路によって提供される液滴は、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
経肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、有効成分を含みかつ約０．２μｍ～５００μｍの平均粒子を有する粗粒粉末である。かかる製剤は、かぎタバコが吸われる様式で（すなわち、鼻孔に近接して支えられた粉末の容器からの鼻腔による急速な吸入によって）投与される。
鼻腔投与に好適な製剤は、例えば、有効成分の少なくは約０．１％（ｗ／ｗ）～多くは１００％（ｗ／ｗ）を含み得、本明細書に記載される追加の成分の１つまたは２つ以上を含み得る。医薬組成物は、口腔内投与に好適な製剤として調製、パッケージング、および／または販売され得る。かかる製剤は、例えば、従来の方法を用いて作られる錠剤および／またはロゼンジの形態であり得、例えば０．１％～２０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み得、残部は、経口的に溶解可能および／または分解可能な組成物と任意で本明細書に記載される追加の成分の１つまたは２つ以上とを含む。その代わりに、口腔内投与に好適な製剤は、有効成分を含む粉末ならびに／またはエアロゾル化および／もしくは霧化溶液および／もしくは懸濁物を含み得る。かかる粉末化、エアロゾル化および／またはエアロゾル化製剤は、分散されたときに約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均粒径および／または液滴サイズを有し得、本明細書に記載されるいずれかの追加の成分の１つまたは２つ以上をさらに含み得る。
医薬組成物は、眼投与に好適な製剤として調製、パッケージング、および／または販売され得る。かかる製剤は、例えば点眼薬の形態であり得、例えば水性または油性液体賦形剤中の有効成分の０．１／１．０％（ｗ／ｗ）溶液および／または懸濁物を包含する。かかる点薬は、緩衝剤、塩、および／または本明細書に記載されるいずれかの追加の成分の１つもしくは２つ以上の他のものをさらに含み得る。有用である他の眼投与可能な製剤は、有効成分を微結晶形態でおよび／またはリポソーム調製物中に含むものを包含する。点耳薬および／または点眼薬は本発明の範囲内であると考えられる。
医薬剤の製剤および／または製造における一般的な考慮事項は、例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005（参照によって本明細書に組み込まれる）に見いだされる。
投与
本発明は、その必要がある対象に、機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質の組成物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの態様において、他の機能的なエフェクター蛋白質（例えばＣａｓ９蛋白質）とカチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマーとを含む組成物を投与する方法が提供される。かかる組成物は、疾患、障害、および／または状態を予防、処置、診断、またはイメージングすることに有効ないずれかの量およびいずれかの投与経路を用いて対象に投与され得る。要求される正確な量は、対象の種、年齢、および一般的な状態、疾患の重さ、特定の組成物、その投与モード、その活性モード、ならびに同類に依存して対象毎に変わるであろう。本発明に従う組成物は、投与の容易さおよび用量の統一性のために単位剤形で典型的には処方される。しかしながら、本発明の組成物の合計の一日使用量が、正当な医学的判断の範囲内で担当医によって決められるであろうということは理解されるであろう。いずれかの特定の患者についての特定の治療有効、予防有効、または適切なイメージング用量レベルは種々の因子に依存するであろう。それらは、治療されようとする障害および障害の重さ、使用される特定の化合物の活性、使用される特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康、性、および食事、投与の時間、投与経路、および使用される特定の化合物の排泄速度、処置の長さ、使用される特定の化合物との組み合わせでまたは同時的に用いられる薬物、ならびに医学分野において周知の同類の因子を包含する。
送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質の組成物、さらには例えばＣａｓ９蛋白質とカチオン性脂質とを含む組成物は、いずれかの経路によって投与され得る。いくつかの態様において、かかる組成物は種々の経路（経口、静脈内、筋内、動脈内、脊髄内、髄腔内、皮下、脳室内、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および／または点薬による）、粘膜、鼻腔、口腔、経腸、硝子体、腫瘍内、舌下の、気管内点滴、気管支内点滴、および／もしくは吸入によっての、経口スプレー、鼻腔スプレー、および／またはエアロゾルとしての、ならびに／または門脈カテーテルを通しての、を包含する）の１つまたは２つ以上によって投与される。いくつかの態様において、超荷電蛋白質もしくは複合体、および／またはその医薬、予防、診断、またはイメージング組成物は、全身静注によって投与される。特定の態様において、超荷電蛋白質もしくは複合体および／またはその医薬、予防、診断、またはイメージング組成物は、静脈内および／または経口投与され得る。特定の態様において、かかる組成物は、機能的なエフェクター蛋白質が血流脳関門、血管バリア、または他の上皮バリアを横断することを可能とする方法で投与され得る。
ある種の態様において、本発明に従う組成物は、望まれる治療、診断、予防、またはイメージング効果を得るために、１日１回または２回以上、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ対象体重（１日あたり）の機能的なエフェクター蛋白質の量を送達するために充分な用量レベルで投与され得る。望まれる用量は、１日３回、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、毎週、２週毎、３週毎、または４週毎に送達され得る。ある種の態様において、望まれる用量は複数回の投与（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５回以上の投与）を用いて送達され得る。
機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質を含む組成物は、１つまたは２つ以上の他の治療、予防、診断、またはイメージング剤との組み合わせで投与され得る。「との組み合わせで」によって、薬剤が同時に投与および／または一緒に送達のために処方されなければならないとなることは意図されていないが、送達のそれらの方法は本発明の範囲内である。組成物は、１つまたは２つ以上の他の望まれる治療薬または手術と並行して、それに先立って、またはそのその後に投与され得る。一般的に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与されるであろう。いくつかの態様において、本発明は、それらのバイオアベイラビリティを改善、それらの代謝を低減および／もしくは改変、それらの排泄を阻害、ならびに／またはそれらの体内分布を改変し得る薬剤との組み合わせでの、医薬、予防、診断、またはイメージング組成物の送達を包含する。
キット
本発明は、本発明の方法を便利におよび／または有効に実行するための種々のキットを提供する。典型的には、キットは構成物の充分な量および／または数を含んで、ユーザが対象（単数または複数）の複数の処置を実施することおよび／または複数の実験を実施することを可能とするであろう。いくつかの態様において、キットは、（ｉ）本明細書に記載される超荷電蛋白質、（ｉｉ）送達されるべき機能的なエフェクター蛋白質、（ｉｉ）カチオン性脂質および／もしくはカチオン性ポリマー、ならびに（ｉｖ）超荷電蛋白質と結びついた機能的な蛋白質を含む組成物を処方するための取扱説明書の１つまたは２つ以上を含む。いくつかの態様において、キットはＣａｓ９蛋白質とカチオン性脂質とを含む。いくつかの態様において、キットは、超荷電蛋白質および／または送達されるべき機能的な蛋白質をコードする核酸を含む。いくつかの態様において、キットは、超荷電蛋白質とクローニング部位（融合蛋白質を生成するために、機能的なエフェクター蛋白質のインフレームクローニングを可能とする）とをコードするクローニングベクターを含む。いくつかの態様において、キットは、機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質を含む本明細書において提供される医薬組成物と、対象への医薬組成物の投与のためのシリンジ、針、またはアプリケータと、対象への医薬組成物の投与のための取扱説明書とを含む。
本発明のこれらおよび他の側面は、以下の例の考慮によってさらに認められるであろう。それらは本発明のある種の特定の態様を例証することを意図されているが、請求項によって定義されるその範囲を限定することは意図されていない。
例１：超荷電ＧＦＰに融合したＴＡＬＥ活性化因子の送達
褐色または白色脂肪細胞の細胞運命に向けて線維芽細胞の細胞運命をリプログラミングするための主要なターゲットは、白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への切り換えに在り、これはＰＲＤＭ１６およびＰＰＡＲγの発現によって支配されている。線維芽細胞内のＰＰＡＲγおよびＰＲＤＭ１６ゲノム配列をターゲット化する、＋３６ＧＦＰに融合した堅牢なＴＡＬＥ転写活性化因子を操作した。融合蛋白質は、ヘパリンカラムおよび／またはＳＥＣを用いて精製した。ゲルは１３０ｋＤに単一バンドを示している。ＴＡＬＥ活性化因子の送達後の発現の調節と細胞表現型に及ぼす効果とを、脂肪生成カクテルによる７日間の処置が続いたＰＰＡＲγのｃＤＮＡのウイルス送達後の調節と比較した。脂肪細胞が、＋３６ＧＦＰ－ＴＡＬＥ－ＰＲＤＭ１６融合体による処置によって形成したということが観察された。白色脂肪組織マーカー遺伝子の発現を、超荷電ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ活性化因子の送達後に検出した。
ＰＰＡＲγに対するＴＡＬＥ活性化因子の一度きりの超荷電蛋白質によって媒介される送達は、白色脂肪遺伝子の発現を誘導し、線維芽細胞を白色脂肪細胞に分化させるということが見いだされた。ＰＰＡＲγおよびＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ活性化因子両方の超荷電蛋白質によって媒介される送達は、脂肪細胞の分化を誘導し、褐色脂肪マーカー（例えばＰＲＤＭ１６、ｃｏｘ８ｂ、ｅｌｏｖ１３、およびｃｉｄｅａ）の増大した発現、さらには熱産生遺伝子発現マーカーＰＧＣ１ａおよびＵＣＰ１の小さい増大があった。
Ａｕｒｅｉｎペプチドを＋３６ＧＦＰ－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質のＮ末端に融合した。ヘパリンカラムによって精製されたＡｕｒｅｉｎ－＋３６ＧＦＰ－ＴＡＬＥの送達を、処置された細胞の核内の蛍光を検出することによって観察した。
図１は哺乳類細胞内への高分子送達の模式図を示している。図２は、白色脂肪組織（ＷＡＴ）から褐色脂肪組織（ＢＡＴ）への切り換えの模式図を示している。図３は、ＰＰＡＲγまたはＰＲＤＭ１６をターゲット化するようにプログラミングされたＴＡＬＥ活性化因子を送達するための超荷電送達プラットフォームの模式図である。図４は、＋３６ＧＦＰ融合体、１８．５ｍｅｒのＴＡＬＥドメイン、およびＶＰ６４活性化ドメインを含む融合蛋白質の模式図を示している。図５は、＋３６ＧＦＰ－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の発現および精製を示している。図６は、＋３６ＧＦＰ－ＰＰＡＲγおよびＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達による脂肪細胞制御因子遺伝子の活性化についての試験アッセイを示している。
図７は、異なる濃度での＋３６ＧＦＰ－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達有効性を示している。図８は、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞における２つの異なる＋３６ＧＦＰ－ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ融合蛋白質の送達有効性の比較を示している。図９は、ＰＰＡＲγ－ＴＡＬＥ活性化因子融合体の送達後のＰＰＡＲγ遺伝子発現と様々なコントロールに対する比較とを示している。図１０は、ＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ活性化因子融合体の送達後のＰＲＤＭ１６遺伝子発現と様々なコントロールに対する比較とを示している。図１１は、血清の存在下で観察された中程度のＴＡＬＥ活性を示している。
図１２は、脂肪生成カクテルによる７日間の処置が続くＰＰＡＲγのウイルス送達の検証を示している。図１３は、線維芽細胞をプログラミングしてＷＡＴおよびＢＡＴにするためのアッセイの模式図を示している。図１４は、＋３６ＧＦＰ－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質による処置によって観察された脂肪細胞形成を示している。図１５は、LipidTOX redによる７日後の様々な処置の染色を示しており、ウイルス送達後、さらには超荷電ＰＰＡＲγ－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達後の脂肪細胞の形成を実証している。図１６は、LipidTOX redによる７日後の様々な処置後の細胞の染色を示しており、ウイルス送達後、さらには超荷電ＰＰＡＲγ－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達後の脂肪細胞の形成を実証している。図１７は、ウイルス送達後、さらには超荷電ＰＰＡＲγ－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達後のＷＡＴバイオマーカー遺伝子の発現を示している。
例２：超荷電ＧＦＰに融合したＴＡＬＥ活性化因子のインビボ送達
ＮＩＨ－３Ｔ３細胞を７０～９０％コンフルエンスまで育て、血清無しで、ＤＭＥＭ中の＋３６ＧＦＰ－ＰＰＡＲγ－ＴＡＬＥおよび／または＋３６ＧＦＰ－ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ融合蛋白質の１μＭまたは０．５～５μＭによって処置した。無血清培地は、血清が蛋白質に基づく送達の有効さを減少させ得るので選んだ。細胞を、それぞれの融合蛋白質溶液と一緒に４時間インキュベーションした後、培地を取り除き、血清を含有する完全ＤＭＥＭを細胞に追加しなおした。コントロール細胞は、公知のプロトコールに従って、ＷＡＴおよびＢＡＴ遺伝子の発現についての正のコントロールとして働くためにＰＰＡＲγまたはＰＲＤＭ１６をコードするウイルス構築物に感染させた（例えば、Seale et al. 2008 Nature 454, 961-967参照。その全内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。一度全ての細胞が１００％コンフルエンスに達したら、イソブチルメチルキサンチン、インスリン、ロシグリタゾン、デキサメトゾン（dexamethosone）、Ｔ３、およびインドメタシンを含有する脂肪生成カクテルを細胞に追加し、４８時間後に、インスリン、Ｔ３、およびロシグリタゾンのみを含有するカクテルの形態と取り替えた。カクテルのこの第２の取り替え後の４８時間目に、Ｔ３、インスリン、およびロシグリタゾンの別の用量を細胞に追加した。翌日（これは、実験の開始からここで１週間である）、細胞をTRIzolによって集め、全ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ－ＰＣＲを実施して、ＰＰＡＲγ、ＰＲＤＭ１６、および他の褐色脂肪マーカー遺伝子（例えば、ＵＣＰ１、ＰＧＣ１ａ、Ｅｌｏｖ１３、およびＣｉｄｅａ）の遺伝子発現レベルを測定した。
図１８は、インビボで褐色脂肪の脂肪細胞を誘導するための超荷電ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達を示している。堅牢な脂肪細胞形成が、ＰＰＡＲγおよびＰＲＤＭ１６のウイルス送達後、かつ超荷電ＴＡＬＥ活性化因子蛋白質融合体の送達後にもまた観察された。図１９は、細胞へのＰＰＡＲγおよびＰＲＤＭ１６の超荷電（ＴＡＬＥ）およびウイルス送達の比較を示している。図は、ＰＰＡＲγおよびＰＲＤＭ１６の発現による褐色脂肪マーカーのＴＡＬＥ／ＴＡＬＥ、ウイルス／ＴＡＬＥ、およびウイルス／ウイルスによって誘導された発現を示している。図２０は、脂肪細胞分化と一致したＲＴ－ｑＰＣＲ評価を示しており、これはLipidTOX染色によってもまた観察された。
例３：超荷電ＧＦＰと複合体化したＴＡＬＥ活性化因子の送達
送達有効性を改善するために、機能的な蛋白質が超荷電蛋白質と非共有結合的に結びついた蛋白質複合体を生成して、細胞に投与した。図２１は、＋３６ＧＦＰとの複合体としての機能的なＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質の送達が、送達後のＴＡＬＥ活性化因子活性を改善するということを示している。図２２は、融合体（＋３６ＧＦＰ－ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ－３）または＋３６ＧＦＰとの複合体（＋３６ＧＦＰ＋ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ－３）いずれかとしてのＴＡＬＥ活性化因子融合体送達後の、ＰＲＤＭ１６遺伝子発現を示している。複合体の送達がＴＡＬＥ活性化因子活性を増大させる傾向があったということが観察された。
例４：送達有効性にＡｕｒｅｉｎ融合が及ぼす効果
図２３は、ＴＡＬＥ活性化因子融合体送達（＋３６ＧＦＰとの融合体または複合体いずれかとして）後のＰＲＤＭ１６遺伝子発現に及ぼす、＋３６ＧＦＰへのＮ末端Ａｕｒｅｉｎペプチド融合の効果を示している。Ａｕｒｅｉｎペプチドを、ＧＧＳ（９）（配列番号２５２）リンカーを介してＧＦＰ－ＴＡＬＥ構築物のＮ末端に融合して、Ａｕｒｅｉｎペプチド－ＧＧＳ（９）リンカー－（＋）３６ＧＦＰ蛋白質－ＧＧＳ（９）リンカー－ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ－３融合蛋白質をもたらした。蛋白質はサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。
例５：超荷電ＧＦＰまたはカチオン性脂質と複合体化したＴＡＬＥ活性化因子の送達
図２４は、＋３６ＧＦＰとの融合体（＋３６ＧＦＰ－ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ－３）、＋３６ＧＦＰとの複合体（＋３６ＧＦＰ＋ＰＲＤＭ１６－ＴＡＬＥ－３）、またはLipofectamine LTXとの複合体いずれかとしてのＴＡＬＥ－ＰＲＤＭ１６活性化因子蛋白質送達後のＰＲＤＭ１６遺伝子発現を示しており、それらでは遺伝子発現の増大が観察された。
例６：超荷電ＧＦＰに融合したＣａｓ９の送達
哺乳類細胞内へのＣａｓ９の超荷電送達は、先行の送達法の欠点を有さない、細胞への強力なＲＮＡによってプログラミング可能なヌクレアーゼ技術の応用を可能とするであろう。この目標のために、ＡＬＡＬリンカーを用いて＋３６ＧＦＰとのＣａｓ９融合体を生成した。図２５は、Ｃａｓ９との超荷電融合蛋白質の模式図を示している。図２６は、野生型Ｃａｓ９蛋白質ならびに＋３６ＧＦＰおよびＡｕｒｅｉｎ－ＧＧＳ９とのＣａｓ９融合蛋白質の精製を示している。融合蛋白質は、上のＴＡＬＥ活性化因子融合蛋白質と同じ様式で細胞に投与される。Ｃａｓ９は、一度細胞に送達されたら、細胞内ゲノム中のそのターゲット部位に結合して切断する。ターゲット細胞内のヌクレアーゼ活性は好適なアッセイによって（例えば、サザンブロットまたはシーケンシングアッセイによって）検出される。
例７：インビトロおよびインビボにおけるゲノム編集蛋白質の効率的な送達
核または細胞質への蛋白質の効率的な細胞内送達は、ゲノム編集薬剤を包含する蛋白質治療薬の可能性を完全に現実化するために必要とされる。蛋白質送達の現行の方法は、血清蛋白質に対する低い忍容性、不良なエンドソーム脱出、および限定されたインビボ有効性を多くの場合に被る。この例において実証されている通り、核酸トランスフェクションのために元々は開発された普通のカチオン性脂質試薬が、負の超荷電蛋白質に融合した、天然アニオン性ドメインを含有する、またはアニオン性核酸に自然に結合する蛋白質を強力に送達し得る。この手法は、１０％血清を含有する培地中において、低いナノモル濃度で、培養ヒト細胞内へのＣｒｅリコンビナーゼ、ＴＡＬＥおよびＣａｓ９に基づく転写活性化因子、およびＣａｓ９：ｓｇＲＮＡヌクレアーゼ複合体の機能的な送達を媒介する。脂質に基づく送達は、カチオン性蛋白質送達戦略よりも＞１，０００倍強力であり得る。Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体の送達は、標準的なＤＮＡトランスフェクションと比較して実質的に高い特異性で、８０％ほども高いゲノム改変効率をもたらした。これは、送達されるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体の一過的な性質が原因である可能性が高い。この手法は、インビボのマウス内耳へのＣｒｅリコンビナーゼおよびＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体の効率的な送達をもまた媒介し、９０％までのＣｒｅによって媒介される組み換えおよび２０％までのＣａｓ９によって媒介されるゲノム改変を、ターゲット化された有毛細胞集団において達成した。
材料および方法
Ｃａｓ９、Ｃｒｅ、およびＴＡＬＥ融合体およびｓｇＲＮＡ発現プラスミドの構築
本稿に用いた全ての構築物の配列は下に列挙されているか、または明細書の他所で提供される。全ての蛋白質構築物は、ｐＥＴ２９ａ発現プラスミドにクローニングされた興味ある蛋白質の以前に報告されたプラスミドから生成した。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９および他の蛋白質の発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉのBL21 STAR（DE3）コンピテントセル（Life Technologies）を、Ｎ末端１０×Ｈｉｓタグ／マルトース結合蛋白質に融合されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９をコードするｐＭＪ８０６４７によって形質転換した。もたらされた発現株は、アンピシリンの１００μｇ／ｍＬを含有するルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロスに３７℃で一晩接種した。細胞を同じ増殖培地中に１：１００希釈し、ＯＤ６００＝約０．６まで３７℃で育てた。培養物を２０℃で３０ｍｉｎインキュベーションし、イソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．５ｍＭで追加してＣａｓ９発現を誘導した。およそ１６時間後に、細胞を８，０００ｇでの遠心分離によって回収し、溶解緩衝液（５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ＭのＮａＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））中に再懸濁した。細胞をソニケーション（６Ｗ出力で合計１５分間の１ｓｅｃパルスオン、１ｓｅｃパルスオフ）によって溶解し、可溶性ライセートを３０分間の２０，０００ｇでの遠心分離によって得た。
細胞ライセートをHisPurニッケル－ニトリロ酢酸（ニッケルＮＴＡ）樹脂（Thermo Scientific）と一緒に４℃で３０分間インキュベーションして、ＨｉｓタグＣａｓ９を捕捉した。樹脂を２０ｍＬカラムに移し、溶解緩衝液の２０カラム体積によって洗浄した。Ｃａｓ９を５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ＭのＮａＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭのＴＣＥＰ、および３００ｍＭイミダゾール中に溶出し、Amiconウルトラ遠心分離フィルター（Millipore，１００ｋＤａ分子量カットオフ）によって約５０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。６×Ｈｉｓタグおよびマルトース結合蛋白質を、２０時間の４℃でのＴＥＶプロテアーゼ処置によって取り除き、第２のＮｉアフィニティー精製ステップによって捕捉した。Ｃａｓ９を含有する溶離液を、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ＭのＮａＣｌ、２０％グリセロール、および１０ｍＭのＴＣＥＰを含有する精製緩衝液中でHiTrap SP HPカラム（GE Healthcare）に注入した。Ｃａｓ９を、５カラム体積に０．１Ｍから１ＭのリニアなＮａＣｌ勾配を含有する精製緩衝液によって溶出した。Ｃａｓ９を含有する溶出画分を２００μＭの濃度まで濃縮した。これはビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）（Pierce Biotechnology）によって定量した。液体窒素中で瞬間凍結し、－８０℃のアリコートで貯蔵した。全ての他の蛋白質は、ＴＥＶ切断ステップ無しのこの方法によって精製した。（－３０）ＧＦＰを含有する蛋白質は、同じ精製プロトコールを用いて、Hi-Trap Q HPアニオン交換カラム（GE Healthcare）を用いるアニオン交換によって精製した。
ｓｇＲＮＡのインビトロ転写
２０ｂｐのｓｇＲＮＡターゲット配列が続くＴ７プロモーター結合部位を含有するリニアなＤＮＡ断片を、製造者の取扱説明書に従ってT7 High Yield RNA Synthesisキット（NEB）を用いてインビトロ転写した。インビトロ転写されたＲＮＡをエタノールによって沈殿し、Criterion１０％ポリアクリルアミドＴＢＥ－尿素ゲル（Bio-Rad）上でのゲル電気泳動によって精製した。切り出したゲル断片は、４℃で振盪表面上で一晩、３００ｍＭのＮａＣｌの４２０μＬ中で抽出した。ゲル精製されたｓｇＲＮＡをエタノールによって沈殿し、水中に再溶解し、ｓｇＲＮＡ濃度を最終的にＵＶ吸光度によって定量して、－８０℃で瞬間凍結した。
プラスミドトランスフェクション
プラスミドＤＮＡを、製造者のプロトコールに従ってLipofectamine 2000（Life Technologies）を用いてトランスフェクションした。ＴＡＬＥ活性化因子プラスミドについては、ＤＮＡの３００ｎｇをトランスフェクションした。活性化因子相乗作用実験のためには、５つのプラスミドのそれぞれの６０ｎｇをプールしてトランスフェクションした。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ送達実験のためには、ＣＬＴＡ、ＥＭＸ、ＶＥＧＦ、およびＧＦＰ中のゲノム部位をターゲット化するｓｇＲＮＡ（ニッカーゼ研究のためには、ｓｇＲＮＡのＧＦＰｇ１、ＧＦＰｇ３、ＧＦＰｇ５、およびＧＦＰｇ７）を発現するリニアなＤＮＡのＰＣＲ産物を、トランスフェクション実験に用いた。リニアなＤＮＡのＰＣＲ産物は、鋳型としてのＵ６プロモーターを含有するプラスミド、ならびにフォワードプライマー（Ｕ６プロモーター上流配列を負う）およびリバースプライマー（ｓｇＲＮＡ配列（各ターゲットにユニークな２０ｂｐ配列＋定常なｓｇＲＮＡバックボーン構造配列）が続くＵ６下流配列を含有する）を用いて生成した。リニアなＤＮＡ鋳型から発現されたｓｇＲＮＡは、Ｔ７転写のためにそれらの塩基を要求したインビトロ転写されるｓｇＲＮＡにマッチングする少なくとも２つの５’グアノシンを含有した。プライマー配列およびＰＣＲ条件は下に列挙されている。ｄＣａｓ９活性化因子実験のためには、Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９－ＶＰ６４プラスミドＤＮＡの７００ｎｇを、適切なｓｇＲＮＡ発現プラスミドの２５０ｎｇと一緒にコトランスフェクションした。活性化因子相乗作用実験のためには、６つのｓｇＲＮＡのそれぞれからのＤＮＡの５０ｎｇをプールし、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４プラスミドの７００ｎｇと一緒にコトランスフェクションした。
細胞培養におけるカチオン性脂質と複合体化した転写因子蛋白質の送達
インビトロおよびインビボ両方のゲノム編集蛋白質の送達のより深い記載が、下に見いだされる。簡潔には、培養細胞を、翌日約７０％コンフルエンスに達するために必要な細胞密度で、１０％ＦＢＳ（「完全血清培地」）および抗生物質を有するダルベッコの改変イーグル培地＋GlutaMAX（Life Technologies，Carlsbad，CA）中で４８ウェルフォーマット（２５０μＬ体積）にプレーティングした。完全血清培地を、送達の１時間前に、抗生物質を含有しないが同じ培地と取り替えた。ＣｒｅおよびＴＡＬＥ蛋白質の送達は、正常なプラスミドトランスフェクションのための製造者のプロトコール（インキュベーション時間を包含する）に従って、２５μＬのOPTIMEM培地（Life Technologies，Carlsbad，CA）中で市販のカチオン性脂質の０．５～１．５μＬと１ｎＭ～１μＭの蛋白質を組み合わせることによって実施した（２７５μＬの終体積中）。インビトロのＣａｓ９送達のためには、転写されたｓｇＲＮＡをＣａｓ９蛋白質と一緒に５ｍｉｎインキュベーションした後にカチオン性脂質試薬と複合体化した。OPTIMEM培地中の２５μＬの脂質複合体を細胞に追加し、別様に注意しない限り、培地を１２～１６時間後に新鮮な培地に取り替えた。細胞は、送達の４８時間後に組み換えについて、送達の４または１６時間後いずれかに遺伝子活性化について、送達の７２時間後に遺伝子改変についてアッセイされた。
ゲノム改変を検出するためのＴ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ
Ｕ２ＯＳ－ＥＧＦＰ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｃａｓ９発現およびｓｇＲＮＡ発現プラスミドもしくはリニアなＤＮＡのＰＣＲ産物（上で記載されている通り）によってトランスフェクションするか、またはＣａｓ９蛋白質のみ、インビトロ転写されたｓｇＲＮＡのみ、もしくはRNAiMAXのみによって処置した。ゲノムＤＮＡを、製造者の取扱説明書に従ってDNAdvanceキット（Agencourt）を用いて、トランスフェクションの２日後に細胞から単離した。ゲノムＤＮＡの２００ｎｇを鋳型としてＰＣＲ反応に用いて、下で規定されるフランキングサーベイ（survey）プライマー対によって、ターゲット化されたゲノム遺伝子座を増幅した。ＰＣＲ産物をQIAquick PCR精製キット（Qiagen）によって精製し、Quant-iT（商標）PicoGreen（登録商標）dsDNAキット（Life Technologies）によって定量した。精製されたＰＣＲのＤＮＡの２５０ｎｇをNEBuffer 2（NEB）の２μＬと組み合わせて１９μＬの合計体積にし、９５℃で５分間、９５から８５℃まで２℃／ｓ、８５から２０℃まで０．２℃／ｓでのサーモサイクルによって変性して、それからリアニーリングした。リアニーリングしたＤＮＡを、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（１０Ｕ／μＬ，NEB）の１μＬと一緒に３７℃で１５分間インキュベーションした。５０％グリセロールの１０μＬをＴ７エンドヌクレアーゼ反応に追加し、１２μＬを５％ＴＢＥの１８ウェルCriterionＰＡＧＥゲル（Bio-Rad）上で分析した（２００Ｖで３０分間電気泳動、それから１×SYBR Gold（Life Technologies）によって３０ｍｉｎ染色）。Ｃａｓ９によって誘導された切断バンドおよび未切断バンドをAlphaImager HP（Alpha Innotech）によって可視化し、ImageJソフトウェアを用いて定量した５４。切断されたバンドのピーク強度を全てのバンドの合計強度（未切断＋切断されたバンド）によって割って、切断された画分を決定し、これを用いて、以前に記載された通りに遺伝子改変レベルを見積もった４６。各サンプルについて、トランスフェクションおよびその後の改変測定は異なる日に三重（triplicate）で実施した。
幹細胞培養および送達
永久的なＧＦＰ遺伝子挿入を含有するマウス胚性幹細胞（ＥＳ）株Ｔａｕ－ＧＦＰを、ＤＭＥＭ中で、１５％ＦＢＳ（Gibco）、１００ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸（Gibco）、０．５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、および白血病阻止因子（１，０００単位／ｍｌ，Chemicon）と一緒に培養した。５日後に、ＧＦＰ蛍光を示す浮遊スフィアが形成された。Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡおよびRNAiMAXの複合体を、浮遊スフィアを含有する培養物に１６時間追加した。Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ処置後に、細胞を上の培地中で３日間培養した。浮遊スフィアを５分間トリプシンで処置し、それから７０μｍフィルターに通してシングルセルを回収した。細胞は、ラミニンコートスライド上で、１×Ν２、１×Ｂ２７、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、および１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２（1：1）中で、標識前に２日間培養した。免疫組織化学を抗ＧＦＰ抗体（#ab13970，Abcam）を用いて実施し、ＧＦＰ発現を評価した。ＧＦＰ陰性細胞の数を定量するために、本発明者は２０×倍率で３つの代表的な視野からのＧＦＰ陽性およびＧＦＰ陰性細胞の合計数をカウントし、平均効率を計算した。３つの独立した実験を各条件について実施した。
マウス内耳への蛋白質のマイクロインジェクション
Ｐ０のｆｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスを（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ注射に用い、Ｐ２のＡｔｏｈ１－ＧＦＰマウスをＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ注射に用いた。動物は、Massachusetts Eye & Ear Infirmary ALCUC committeeによって認可されたプロトコール下で用いた。マウスは、氷上でそれらの温度を下げることによって麻酔した。開窓（cochleostomy）は、耳介の後ろで切開して耳骨胞を暴露することによって実施した。マイクロマニピュレータによって支えられたガラスマイクロピペットを、中央階に複合体を送達するために用いた（これは内耳有毛細胞へのアクセスを可能とする）。（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅの送達のためには、４５μＭ蛋白質の３μＬをRNAiMAXまたはLipofectamine 2000いずれかの３μＬと混合し、注射に先立って３０分間室温でインキュベーションした。４匹のマウスを、処置群あたり注射した。Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体の送達のためには、２００μＭのＣａｓ９蛋白質の１μＬを１００μＭのｓｇＲＮＡの２μＬと混合し、室温で５分間インキュベーションした後、RNAiMAXまたはLipofectamine 2000いずれかの３μＬを混合し、注射に先立って追加の３０分間インキュベーションした。３匹のマウスが処置群あたり注射された。各注射の合計の送達体積は蝸牛あたり０．３μＬであり、放出は３２ｎＬ／ｓｅｃの速度でマイクロマニピュレータによってコントロールした。
免疫組織化学および定量
注射の５～１０日後に、マウスを屠殺し、蝸牛を標準的なプロトコールによって集めた５５。免疫組織化学のためには、有毛細胞マーカー（Ｍｙｏ７ａおよびＥｓｐ）および支持細胞（Ｓｏｘ２）に対する抗体を、以前に記載されたプロトコールに従って用いた５５。（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ後のｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞またはＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達後のＧＦＰ陰性細胞の数を定量するために、本発明者は、蝸牛の基部渦巻きの注射部位周囲の２００μｍに及ぶ領域内の外有毛細胞の合計数をカウントした。（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅによって誘導される組み換えまたはＣａｓ９：ｓｇＲＮＡによって誘導されるゲノム改変の効率を、ｔｄＴｏｍａｔｏを発現するまたはＧＦＰ発現を喪失した外有毛細胞のパーセンテージとして計算した。
ゲノム改変のハイスループットＤＮＡシーケンシング
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現プラスミドもしくはリニアなＤＮＡのＰＣＲ産物によってトランスフェクションするか、または５０ｎＭのＣａｓ９蛋白質、２５０ｎＭの精製されたｓｇＲＮＡ、およびカチオン性脂質によって処置するか（Ｕ２ＯＳ－ＥＧＦＰレポーター細胞へのＣａｓ９蛋白質送達について先に記載された通り）のいずれかをした。プラスミドに基づくトランスフェクション実験のためには、Ｃａｓ９発現プラスミドの７００ｎｇ＋ｓｇＲＮＡプラスミドの２５０ｎｇまたはリニアなＤＮＡのＰＣＲ産物の５０ｎｇ（ＥＭＸ１、ＣＬＴＡ２、またはＶＥＧＦ遺伝子座いずれかをターゲット化するためのｓｇＲＮＡを発現する）をLipofectamine 2000（Life Technologies）によってトランスフェクションし、細胞を２日後に単離した。インビボの蛋白質送達実験のためには、マウス組織の約３０ｍｇを、麻酔したマウスから以前に記載された通り単離し５５、ゲノムＤＮＡをAgencourt DNA AdvanceゲノムＤＮＡ単離キット（Beckman Coulter）を用いて抽出した。細胞培養実験のためには、ゲノムＤＮＡを上で記載されている通り単離した。ゲノムＤＮＡの１５０ｎｇを鋳型として用いて、下で規定されるフランキングＨＴＳプライマー対によってオンターゲットおよびオフターゲットゲノム部位をＰＣＲによって増幅した。粗製ＰＣＲ産物の相対量はゲル電気泳動によって定量し、異なるｓｇＲＮＡ対またはＣａｓ９ヌクレアーゼ型によって処置されたサンプルは、QIAquick PCR精製キット（Qiagen）による精製前に等モル濃度で別々にプールした。プールされたＤＮＡのおよそ１５０ｎｇを、５％ＴＢＥの１８ウェルCriterionPAGEゲル（BioRad）を用いて２００Ｖで３０ｍｉｎ電気泳動し、長さ約１２５ｂｐ～約３００ｂｐのＤＮＡをQIAquick PCR精製キット（Qiagen）によって単離および精製した。精製されたＤＮＡを、シーケンシングアダプターを含有するプライマーによるＰＣＲによって増幅し、精製し、以前に記載された通りにMiSeqハイスループットＤＮＡシーケンサー（Illumina）によってシーケンシングした４７。
データ分析
Illuminaシーケンシングリードを、下で略記されている通り、ＵｎｉｘのＢａｓｈで書かれたスクリプトによってフィルタリングおよびパースした。シーケンシング実験のためのサンプルサイズを（現実的な実験上の考慮事項の範囲内で）最大化して、効果を検出するための最大の検定力を保証した。Ｃａｓ９によって改変されたゲノム部位についての統計分析（表２）は、ボンフェローニ法を用いる多重比較補正によって、以前に記載されている通り実施した５６。
以下は、各ゲノムターゲット部位についての上流および下流フランキング配列のリストである。
ｓｇＲＮＡのＴ７転写のための基質として働くＰＣＲ産物を生成するためのプライマー。
Ｔ７＿ｇＲＮＡ－Ｒｅｖは全ての場合に用いた。用いたＤＮＡ鋳型は、上で注意された通りＥＧＦＰのｓｇＲＮＡプラスミドであった。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４活性化因子実験のためのＮＴＦ３およびＶＥＧＦのｓｇＲＮＡは以前に報告されている（Maeder et al., CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nat. Methods. 2013; 10, 977-979）。
トランスフェクションのためのリニアなＤＮＡのＰＣＲ産物を生成するためのプライマー
下に列挙されているＰＣＲ＿ｓｇＲＮＡ－ｆｗｄ１、ＰＣＲ＿ｓｇＲＮＡ－ｒｅｖ２、および適切なＰＣＲ＿ｓｇＲＮＡプライマーによる、鋳型としてのＵ６プロモーターを含有するプラスミドの（７２℃，３ｍｉｎ）でのＰＣＲ伸長。
結果
超負荷電蛋白質に融合されたＣｒｅリコンビナーゼの高度に効率的な送達
核酸の高度にアニオン性の静電気的特性をゲノム編集蛋白質に分け与えることは、カチオン性脂質を用いる哺乳類細胞内へのそれらの効率的な送達を可能にし得るということが推測された（図２７（Ａ））。自然には高度に負に荷電していない興味ある蛋白質については、天然のまたは操作された超負荷電蛋白質との融合が１７、ポリアニオン性の性格を分け与えるであろうと考えられた。核酸結合蛋白質については、自然のＤＮＡまたはＲＮＡ基質との単純な複合体化が、カチオン性脂質に基づく送達を支持するための充分なアニオン性の性格を提供し得るということが推測された（図２７（Ａ））。
操作された超負荷電ＧＦＰバリアント３５の（－３０）ＧＦＰが、融合した蛋白質カーゴの封入および送達を媒介し得るかどうかを、最初に試験した（図２７（Ｂ））。（－３０）ＧＦＰをＣｒｅリコンビナーゼに融合し、数個の市販のカチオン性脂質を、Ｃｒｅによって媒介される組み換え時にのみＤｓＲｅｄを発現するＨｅＬａ細胞内に融合体を機能的に送達するそれらの能力について試験した（図２８（Ａ））。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培地中で、１．５μＬのLipofectamine RNAiMAX（以降では「RNAiMAX」と言われる。Life Technologies，Carlsbad CA）と複合体化した１０ｎＭの（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅの送達は、処置された細胞の中で強いＤｓＲｅｄ蛍光シグナルにつながった。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）から、処置の４８時間後には細胞の５２％がＤｓＲｅｄを発現したということが明らかにされ、これはＣｒｅ組み換えと一致している（図２８（Ｂ））。
最適化は、１０％ＦＢＳを含有する培地の２５０μＬ中で、１．５μＬのRNAiMAXと複合体化した２５ｎＭの（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅを用いて６５％の組み換え効率をもたらした（図２８（Ｃ））。脂質によって媒介されるアニオン性Ｃｒｅ送達の効力は、カチオン性蛋白質によって媒介される送達のものと比較して著しい。１５～２０％の組み換えられた細胞をもたらすには、１ｎＭの（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅとカチオン性脂質のみを必要とした。一方、組み換えのこの程度を達成するためには１μＭの（＋３６）ＧＦＰ－Ｃｒｅが要求され、これは送達効力の１，０００倍の違いを表している（図２８（Ｃ））。ほぼ同一の結果が第２のＣｒｅレポーター細胞株（BSR TdTomato）において観察された（図３３（Ａ））。カチオン性脂質の量を増大させると毒性が増大し（図３３（Ｂ））、２５０μＬのサンプルあたり１．５μＬのRNAiMAXが組み換え効率を最大化し、一方で最小限の細胞毒性を誘導するということが見いだされた。それらの条件では、カチオン性脂質は、中性またはカチオン性のＣｒｅリコンビナーゼ融合体の送達効力を増大させなかった（図２８（Ｃ）および図３３（Ｃ））。これは、（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅの強い負の電荷が、カチオン性脂質によって媒介される送達に加わるために要求されたということを示している。カチオン性脂質の量を増大させると、最大限の組み換えに要求される蛋白質の濃度が増大するということもまた観察された。これは、送達可能な蛋白質がカチオン性脂質の特異的な化学量論と複合体化するというモデルと一致している（図２８（Ｄ））。これらの観察は、まとめると、カチオン性脂質が、血清の存在下であっても哺乳類細胞内へのポリアニオン性蛋白質の強力な送達を媒介し得るということを示している。
カチオン性蛋白質によって媒介される送達に対して、カチオン性脂質によって媒介される（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ送達のより高い効力が、細胞によるより多くの合計の蛋白質取り込みに起因するか、または細胞に入る機能的な非エンドソーム蛋白質分子のより高い画分に起因するかどうかを決定するために、フローサイトメトリーを用いて、細胞のＧＦＰ蛍光を測定した。細胞は、それらのそれぞれの最適なＣｒｅ送達条件で、（＋３６）ＧＦＰ－Ｃｒｅまたはリポソーム（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅいずれかによって処置された。細胞内蛍光および組み換え効率の比較は、（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅの脂質によって媒介される機能的な送達が、（＋３６）ＧＦＰ－Ｃｒｅの送達よりも、エンドサイトーシスされる蛋白質の量あたり９，８００倍強力であるということを明らかにしている（図３４）。一緒にすると、これらの結果は、アニオン性蛋白質の脂質によって媒介される送達の異常に高い効力が、各細胞の異常に高い蛋白質取り込みではなく、むしろ、細胞質へのエンドソーム脱出およびリソソーム蛋白質分解の回避を包含する可能性が高いエンドサイトーシス後プロセスに起因するということを示唆している。
ポリアニオン性蛋白質を送達する能力がRNAiMAXの固有の構成物に依存しているのか、または他のカチオン性脂質が強力な送達を類似に媒介することができるのかどうかを試験するために、核酸を送達するために設計された数個の他のトランスフェクション試薬を試験した（図２８（Ｅ））。RNAiMAXは（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅに最も有効な機能的な送達剤のまま残ったが、一方、他のカチオン性脂質製剤もまた強力な送達をもたらした。Lipofectamine 2000およびLipofectamine LTX（Life Technologies，Carlsbad CA）（カチオン性脂質製剤に基づく２つのプラスミドトランスフェクション試薬２１）ならびにSAINT-Red（Synvolux Therapeutics，Groningen Netherlands）（合成ピリジウム含有カチオン性脂質を含有するｓｉＲＮＡ送達製剤）は、全て、広範囲の濃度に渡って強い機能的な（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ送達をもたらした（図２８（Ｅ））。対照的に、カチオン性脂質ＤＯＴＡＰ（Roche Diagnostics，Indianapolis IN）またはペプチドに基づく核酸送達剤EZ-PLEX（Ascension Bio，Tampa FL）による強い送達は観察されなかった（図２８（Ｅ））。これらの観察は、まとめると、数個の（しかし全てではない）カチオン性脂質が負荷電蛋白質を封入してヒト細胞内に送達する能力があるということを示している。
（－３０）ＧＦＰ以外のポリアニオン性蛋白質を送達するためにカチオン性脂質を用いることが可能なはずだということが推測された。バイオメディカル研究に普通に用いられる操作されたポリアニオン性蛋白質ドメインは、ＶＰ６４活性化ドメイン（－２２の正味の理論上の電荷）（転写活性化のための操作されたジンクフィンガーアレイ、ＴＡＬＥリピートアレイ、またはｄＣａｓ９との融合体に広く用いられる）および３×ＦＬＡＧ（－７の正味の理論上の電荷）（蛋白質精製および可視化に用いられるエピトープタグ）を包含する（図２８（Ｆ））。ＶＰ６４および３×ＦＬＡＧが両方とも、（－３０）ＧＦＰほど有効にではないがカチオン性脂質によるＣｒｅリコンビナーゼの機能的な送達を向上させるということが観察された。これは、それらのより低い負の総電荷が原因である可能性が高い（図３３（Ｃ））。これらの観察は、（－３０）ＧＦＰ以外の異常に負に荷電した蛋白質が、哺乳類細胞内への効率的なカチオン性脂質に基づく送達を媒介し得るということを実証している。
ＴＡＬＥ活性化因子蛋白質の機能的な送達
培養ヒト細胞内へのＴＡＬＥ－ＶＰ６４転写活性化因子（およそ＋４の理論上の正味電荷。用いられるＴＡＬＥバリアントに依存する）の脂質によって媒介される送達を試験した。送達されたＴＡＬＥＮ蛋白質による内在性遺伝子のわずかに有効な切断が、Ａｒｇ９などのカチオン性ペプチドを用いて血清の非存在下の哺乳類細胞において実証されているが３６、一方で、ＴＡＬＥに基づく転写因子蛋白質の送達はまだ報告されておらず、血清中でのＴＡＬＥ蛋白質の有効な送達は本発明者の知る限り以前には記載されていない。ニューロトロフィン－３（ＮＴＦ３）（神経変性疾患と結びつけられている神経成長因子）の遺伝子をターゲット化した３７。以前に記載されているＮＴＦ３をターゲット化するＴＡＬＥ－ＶＰ６４３８を（－３０）ＧＦＰに融合し（図２９（Ａ））、Ｃｒｅ送達のために最適化された条件で２５ｎＭの（－３０）ＧＦＰ－ＮＴＦ３－ＴＡＬＥ１－ＶＰ６４およびRNAiMAXによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞を処置した。処置の４時間後のＮＴＦ３の遺伝子発現レベルは、２５ｎＭの（－３０）ＧＦＰ－ＮＴＦ３－ＴＡＬＥ－ＶＰ６４およびRNAiMAXによって処置された細胞においては、未処置の細胞、RNAiMAXのみによって処置された細胞、またはＶＥＧＦをターゲット化するＴＡＬＥ転写活性化因子によって処置された細胞よりも３．５倍高かった（図２９（Ｂ））。ＮＴＦ３発現の同程度のレベルが、同じＮＴＦ３をターゲット化するＴＡＬＥ－ＶＰ６４をコードするプラスミドのトランスフェクションの４８時間後に観察された（図２９（Ｂ））。
同じ遺伝子の異なる部位をターゲット化する複数のＴＡＬＥ活性化因子の相乗的発現は、遺伝子活性化を増強することが示されているので３８、（－３０）ＧＦＰに融合した５つの別個のＮＴＦ３をターゲット化するＴＡＬＥ活性化因子を、RNAiMAXを用いて一斉に送達した。蛋白質－脂質複合体を、５つの（－３０）ＧＦＰ－ＮＴＦ３－ＴＡＬＥ－ＶＰ６４蛋白質をそれぞれ５ｎＭで追加して合計で２５ｎＭ蛋白質にすることによって上の通り調製した。ＮＴＦ３発現の６．５倍の増大が４時間のインキュベーション後に観察され（図２９（Ｂ）および図３５）、一方、４８時間のインキュベーションが続く全ての５つのＮＴＦ３－ＴＡＬＥ活性化因子のプラスミドコトランスフェクションは、ＮＴＦ３発現レベルの１０倍の増大をもたらした（図２９（Ｂ））。これらの知見は、ＴＡＬＥ活性化因子蛋白質がカチオン性脂質を用いて送達されて、ヒト細胞において遺伝子発現を一過的に活性化し得るということを実証している。プログラミング可能な転写活性化因子蛋白質の送達はターゲット遺伝子の一度きりの活性化を可能にし得、一方では、慢性的な遺伝子発現（プログラミング可能な転写因子のＤＮＡに基づく送達の一般的な課題）を回避する。この能力は、一過的に発現されたときに細胞状態または細胞運命の一度きりの永久的な変化を実現する蛋白質に、とりわけ貴重になり得る３９。
ヒト細胞内へのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ蛋白質：ＲＮＡ複合体の高度に効率的な送達
完全血清培地中でのポリアニオン性のＣｒｅおよびＴＡＬＥ活性化因子蛋白質バリアントの強力な脂質によって媒介される送達を見ると、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体もまた、（－３０）ＧＦＰとの融合体としてまたは自然のポリアニオン性Ｃａｓ９：ガイドＲＮＡ複合体としてのいずれかで、この手法を用いてヒト細胞に送達され得るということが推測される。良く確立されたＣａｓ９によって誘導される遺伝子破壊アッセイ４０を用いて、ヒトＵ２ＯＳ細胞内のゲノムＥＧＦＰレポーター遺伝子中の特異的な部位をターゲット化した（図３６（Ａ））。オンターゲットＣａｓ９切断は、ＥＧＦＰ内の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および細胞の蛍光の喪失を誘導する。（－３０）ＧＦＰの蛍光からの干渉を回避するために、Ｙ６７Ｓ変異を（－３０）ＧＦＰに導入してその蛍光を消去し、この非蛍光性バリアントを（－３０）ｄＧＦＰと名付けた。
１０％ＦＢＳを含有する培地中での、２５ｎＭの（－３０）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９と５０ｎＭのＥＧＦＰをターゲット化するｓｇＲＮＡとによる、RNAiMAXによるＵ２ＯＳレポーター細胞の処置は、細胞の４８％においてＥＧＦＰ発現の喪失を示した（図３０（Ａ））。Ｃａｓ９またはｓｇＲＮＡを発現するプラスミドのコトランスフェクションは、細胞の３７％に類似のＥＧＦＰ喪失をもたらした（図３０（Ａ））。有意なＥＧＦＰ破壊は、ＥＧＦＰのｓｇＲＮＡをコードするプラスミド単独のトランスフェクション、Ｃａｓ９単独、またはＣａｓ９とＶＥＧＦ遺伝子座をターゲット化するように設計されたｓｇＲＮＡとをコードするプラスミドのコトランスフェクションによっては観察されなかった（図３０（Ａ）、図３６（Ｂ））。ＥＧＦＰの堅牢な破壊が細胞毒性の結果ではないということが確認された（図３６（Ｃ）～（Ｄ））。１０％ＦＢＳ血清の存在下での（＋３６）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡによる細胞の処置が、効率的な遺伝子破壊につながらないということもまた観察された（図３０（Ａ））。これは、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡのための送達のカチオン性ペプチドに基づく方法が有効でないということを示唆しており、恐らくは、超正荷電蛋白質によるｇＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体形成またはヌクレアーゼ機能の干渉が原因である４１。一緒にすると、これらの結果は、（－３０）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体のカチオン性脂質によって媒介される送達が、効率的なｓｇＲＮＡ依存的なターゲット遺伝子破壊をヒト細胞においてもたらし得るということを確立している。
ポリアニオン性ｓｇＲＮＡは、効率的な脂質によって媒介されるＣａｓ９送達に必要充分である
自然のＣａｓ９蛋白質（＋２２の正味の理論上の電荷）とｓｇＲＮＡ（約１０３個のアニオン性リン酸基）との複合体は総合的に高度にアニオン性であるはずなので、次に、ポリアニオン性蛋白質への融合無しの自然のＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体が、カチオン性脂質を用いてヒト細胞内に送達され得るかどうかを試験した。１００ｎＭのＣａｓ９、１００ｎＭのＥＧＦＰのｓｇＲＮＡ、および０．８μＬのRNAiMAXによるＵ２ＯＳのＥＧＦＰレポーター細胞の処置は、ＥＧＦＰレポーター遺伝子の６５％の破壊をもたらした（図３０（Ａ））。Ｃａｓ９蛋白質およびｓｇＲＮＡによる、RNAiMAX無しでの細胞の処置は、ＧＦＰ蛍光の喪失をもたらさなかった（図３０（Ａ））。これらの観察は、ｓｇＲＮＡ単独が、超負荷電融合蛋白質の非存在下でさえも、Ｃａｓ９のカチオン性脂質に基づく送達を媒介するために必用とされる高度にアニオン性の性格を提供し得るということを示唆している。
（－３０）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ対Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡのカチオン性脂質によって媒介される送達に起因する遺伝子破壊効率の比較から、低い用量では、（－３０）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９が自然のＣａｓ９よりも効率的な遺伝子破壊をもたらし（図３７（Ａ））、より高い濃度、さらにはいずれもの蛋白質のそれぞれの最適な蛋白質：ｓｇＲＮＡ用量では自然のＣａｓ９が凌ぐということが明らかになった（図３７（Ｂ）～３７（Ｃ））。これらの結果は、ｓｇＲＮＡが、複合体化したＣａｓ９蛋白質のカチオン性脂質に基づく送達を支持するために充分な負電荷を供給し得るということをさらに確立している。
（－３０）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９の最適な送達のためにはＣａｓ９よりも総合的により少ない蛋白質が要求されるが、一方で、最大限の（－３０）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９によって媒介されるＥＧＦＰ遺伝子破壊のためには、自然のＣａｓ９によって媒介される遺伝子破壊よりも高いｓｇＲＮＡ：蛋白質比が要求されるということもまた観察された（図３７（Ｄ））。ｓｇＲＮＡのより多い当量が、（－３０）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９と複合体化するために必用とされるということが推測される。なぜなら、融合した（－３０）ｄＧＦＰがＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体化に静電気的に干渉し得るからである。（－３０）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９によって媒介されるＥＧＦＰ遺伝子破壊のための理想的な蛋白質用量は、野生型Ｃａｓ９のものよりも１０倍低いので、結果は、（－３０）ｄＧＦＰ－Ｃａｓ９が、そのより高い負の総電荷が原因で、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡよりもカチオン性リポソームによってより良く封入されるということをもまた示唆している。しかし、この電荷の大きさはＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ相互作用に干渉し得、より多くのｓｇＲＮＡを蛋白質あたり要させ、可能性として、合計の送達されるＣａｓ９活性を低減する。加えて、ＮＬＳ－Ｃａｓ９およびＣａｓ９－ＮＬＳ蛋白質を生成して試験した。（－３０）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９中のＮＬＳの存在が、非常に低い濃度での送達有効性の違いを少なくとも部分的に説明し得るが、一方で、Ｃａｓ９、ＮＬＳ－Ｃａｓ９、およびＣａｓ９－ＮＬＳは全て、２５ｎＭ以上の濃度において（－３０）ｄＧＦＰ－ＮＬＳ－Ｃａｓ９よりも高いＥＧＦＰ破壊の効率をもたらすということが観察された（図３８（Ａ）～（Ｃ））。
RNAiMAX以外のカチオン性脂質製剤によるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達もまた試験した。Lipofectamine 2000による送達はRNAiMAXよりも著しく効率的であり、８０％までのＣａｓ９によって媒介される遺伝子破壊をもたらし（図３９（Ａ））、１ｎＭ蛋白質でさえも高い効率（６０％の遺伝子破壊）を維持した（図３９（Ａ））。しかしながら、細胞培養条件でRNAiMAXと比較してLipofectamine 2000のやや高い毒性が原因で（図３３（Ｂ）～（Ｃ））、RNAiMAXを全てのその後の細胞培養研究に用いた。
ＥＧＦＰ破壊がＣａｓ９結合のみではなくゲノム改変に起因するということを検証するために４２、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）アッセイ４３を用いて、ターゲットＥＧＦＰ遺伝子座におけるＣａｓ９によって媒介されるゲノム挿入／欠失変異（インデル）の頻度を検出および定量した（図３０（Ｂ））。Ｔ７ＥＩアッセイの結果は、Ｃａｓ９およびＥＧＦＰのｓｇＲＮＡプラスミド両方、またはＣａｓ９蛋白質および精製されたＥＧＦＰのｓｇＲＮＡによって処置された細胞のみが、ターゲット部位にインデルを含有するということを示した。一緒にすると、これらの知見は、活性なＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体が、ｓｇＲＮＡによって提供される負電荷に依存する様式で、カチオン性脂質と一緒にヒト細胞内に強力に送達され得るということを確立している。
Ｕ２ＯＳのＥＧＦＰレポーター細胞を、ＥＧＦＰ、ＣＬＴＡ、ＥＭＸ、およびＶＥＧＦをターゲット化する４つのｇＲＮＡの混合物と複合体化したＣａｓ９の、単一の脂質によって媒介される送達処置によってもまた処置した。この処置は、全ての４つのターゲットの効率的な破壊をそれぞれ５８％、２８％、１６％、および４０％の切断効率でもたらした（Ｔ７ＥＩ切断アッセイによって測定）。５０ｎＭのＣａｓ９および各ｓｇＲＮＡの２５ｎＭ（１００ｎＭの合計のｓｇＲＮＡ）の単一の送達からのこれらの高い遺伝子破壊効率は、脂質によって媒介されるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達が効率的な多重ゲノム編集を支持し得るということを実証している（図３０（Ｃ））。
Ｃａｓ９ニッカーゼおよびｄＣａｓ９活性化因子の機能的な送達
次に、カチオン性脂質に基づく蛋白質送達が拡張されて、他のＣａｓ９由来のゲノム操作ツール（例えばＣａｓ９ニッカーゼ４４およびＣａｓ９に基づく転写活性化因子）を送達し得るかどうかを試験した４５。Ｃａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼの送達からもたらされるＵ２ＯＳのＥＧＦＰレポーター細胞における遺伝子破壊効率を、ニッカーゼと適切な対のＥＧＦＰをターゲット化するｓｇＲＮＡプラスミドとのコトランスフェクションによって、またはRNAiMAXを用いてＥＧＦＰのｓｇＲＮＡの対と複合体化された精製された蛋白質として、いずれかで測定した（図３０（Ｄ））。二体型（dual）Ｃａｓ９ニッカーゼのプラスミドおよびカチオン性脂質によって媒介される蛋白質：ＲＮＡ送達は両方とも、反対鎖をターゲット化するｓｇＲＮＡ対（ｓｇＲＮＡ対ｇ１＋ｇ５およびｇ３＋ｇ７）の存在下のみで、類似の効率でＥＧＦＰ破壊をもたらしたが（図３０（Ｄ））、同じ鎖をターゲット化するｓｇＲＮＡ対（ｓｇＲＮＡ対ｇ５＋ｇ７）ではもたらさなかった（図３０（Ｄ））。これは、Ｃａｓ９ニッカーゼ切断要件の以前の報告と一致している４６。
ＶＰ６４活性化ドメインに融合したｄＣａｓ９のプラスミドトランスフェクションまたは直接的な蛋白質：ｓｇＲＮＡ複合体送達いずれかからもたらされるＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＮＴＦ３転写活性化効率もまた比較した４５。プラスミドトランスフェクションまたはRNAiMAXによって媒介される蛋白質送達いずれかによるｄＣａｓ９－ＶＰ６４活性化因子の送達は、ＮＴＦ３転写の強い（≧約１０倍）活性化をもたらした（図３０（Ｅ）および図４０）。プラスミドトランスフェクションからもたらされる転写活性化レベルは、各送達法の最適なアッセイ時間においては、蛋白質送達からもたらされる活性化よりも強力であった（図３０（Ｅ））。これは、可能性として、精製された蛋白質およびＲＮＡの一過的な単一の用量と比較して、プラスミドからのＣａｓ９活性化因子蛋白質およびｓｇＲＮＡ両方の持続的な発現が原因である。上の結果は、かかる因子が、送達されるＣａｓ９ヌクレアーゼおよびニッカーゼ蛋白質による不可逆的なゲノム改変の効力を限定しないということを示しているが（図４０（Ａ）および４０（Ｄ））、一方で、送達される蛋白質の低い用量および一過的な性質は、転写活性化などの動的プロセスの効力をより強く限定し得る。それにもかかわらず、これらの結果は、まとめると、Ｃａｓ９ニッカーゼおよびＣａｓ９転写活性化因子が両方とも、カチオン性脂質によって媒介される蛋白質：ＲＮＡ複合体送達によって有効に送達され得るということを示している。
Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達はＤＮＡトランスフェクションよりも高い特異性でゲノムを改変する
機能的なＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体のＤＮＡによらない送達は、ウイルスまたは他の遺伝子送達法と結びついたリスクを避けており、ターゲット遺伝子座が改変された後にゲノム編集薬剤の不必要な発現を回避することによって、ゲノム改変の特異性を改善する可能性を有する。記載される手法がヒト細胞内の内在性遺伝子を破壊し得るかどうかを試験するために、ＥＭＸ１、ＣＬＴＡ２、およびＶＥＧＦ遺伝子内のゲノム遺伝子座をターゲット化した。これは、それらの可能性あるバイオメディカルとの関係およびＣａｓ９オフターゲット切断活性の以前の研究におけるそれらの使用が原因である４０、４６、４７。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内へのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体のカチオン性脂質によって媒介される送達は、全ての３つのヒト遺伝子の堅牢な切断をもたらし、効率は、プラスミドトランスフェクション法のものと同程度かまたはそれよりも高かった。これは、Ｕ２ＯＳ細胞について以前に最適化された同じＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達条件を用いるＴ７ＥＩアッセイによって明らかにされた（図３１（Ａ））。
Ｃａｓ９についてプラスミド対蛋白質：ＲＮＡ送達法の内在性遺伝子改変特異性を比較するために、ＨＥＫ２９３細胞から単離されたゲノムＤＮＡから、オンターゲット遺伝子座、さらには数個の既知のオフターゲット部位を増幅した（図４４）。細胞は、同程度のオンターゲット改変効率をもたらした条件で、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡ発現プラスミドのトランスフェクションによって、またはRNAiMAXによって媒介されるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体送達によって、いずれかで処置された。３つのオンターゲットおよび１１個のオフターゲット部位におけるインデル頻度を、ハイスループットＤＮＡシーケンシングによってアッセイした（図４５）。全ての３つのターゲット遺伝子について、プラスミドまたは蛋白質：ｓｇＲＮＡ送達いずれかからもたらされるオンターゲットＤＮＡ改変の頻度は、およそ１０％であった（図４１（Ａ）～（Ｃ））。これは、非常に類似のオンターゲットゲノム改変効率をもたらす処置条件での２つの技術間のオフターゲット改変の比較を可能にする。重要なことに、全ての１１個のオフターゲット部位についてオフターゲットゲノム改変の頻度はプラスミド送達と比較して蛋白質：ｓｇＲＮＡ送達で低く、結果として、試験された全ての部位のオンターゲット対オフターゲット改変の比は、蛋白質：ｓｇＲＮＡ送達ではプラスミド送達よりも１９倍まで高かった（図３１（Ｂ）～（Ｄ））。
ＤＮＡ改変特異性は、オフターゲット改変の高いレベルを有する遺伝子座（例えば４つのＶＥＧＦオフターゲット部位。それらでは、プラスミド送達は４～２０倍の平均のオンターゲット：オフターゲット改変比を生むが、蛋白質：ＲＮＡ送達は９～４００倍の平均のオンターゲット：オフターゲット改変比を生む）、さらにはオフターゲット改変のより低いレベルを有する遺伝子座（例えば３つのＥＭＸオフターゲット遺伝子座。それらでは、プラスミド送達は６４倍ほども低い平均のオンターゲット：オフターゲット改変比を生むが、蛋白質：ＲＮＡ送達は５００～２，０００倍の平均のオンターゲット：オフターゲット改変比を生む）で、プラスミド送達よりも蛋白質：ｓｇＲＮＡ送達の方が高かった。一緒にすると、これらの結果は、カチオン性脂質を用いるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体の送達が、高い効率で、かつＣａｓ９およびｓｇＲＮＡを発現するＤＮＡの送達よりも実質的に高い特異性でターゲット遺伝子改変を実現し得るということを示している。
マウス胚性幹細胞内へのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡの送達
効率的で永久的な高度に特異的な遺伝子編集を実現するための、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡの強力で一過的なカチオン性脂質によって媒介される送達は、幹細胞においてとりわけ有用であり得る。この可能性を試験するために、Ｔａｕ－ＥＧＦＰを発現するマウス胚性幹細胞４８を、Ｃａｓ９とＥＧＦＰをターゲット化するｓｇＲＮＡとによって処置した。標準的な幹細胞培養条件で、ＥＧＦＰ陽性の浮遊スフィアが形成された。浮遊スフィアを、RNAiMAXと複合体化したＣａｓ９：ｓｇＲＮＡによって、またはコントロールとしてｓｇＲＮＡ無しのRNAiMAXおよびＣａｓ９によって処置した。処置後３日目に、コントロールサンプルと比較して、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡによって処置されたスフィアにおけるＧＦＰ蛍光の低減が観察された（図４２（Ａ））。処置されたスフィアを解離させ、細胞がゼラチンコートディッシュに接着して前駆細胞に分化することを可能とした。抗ＧＦＰ抗体を用いる免疫組織化学から、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡによって処置されたサンプルの細胞のＥＧＦＰ発現のノックダウンが確認され、多くの核はいずれかの明らかなＥＧＦＰを欠いていた。対照的に、コントロールスフィアに由来する全ての細胞はＥＧＦＰ陽性であった（図４２（Ｂ））。Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡによって処置された細胞から集めたゲノムＤＮＡをＴ７ＥＩアッセイに供して、Ｔａｕ－ＥＧＦＰ遺伝子座におけるインデルの明確な証拠がもたらされた（図４２（Ｃ））。このアッセイから、４２％のインデル頻度が、カチオン性脂質によって媒介されるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達とＣａｓ９およびｓｇＲＮＡのＤＮＡのトランスフェクションとの両方から計算された。ターゲット改変は、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡを欠くかまたはＣａｓ９と関連しないｇＲＮＡとを含有するコントロールサンプルにおいては検出されなかった。これらの知見は、カチオン性脂質によって媒介されるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達が、マウス胚性幹細胞において高度に効率的な遺伝子破壊を実現し得るということを実証している。
ＣｒｅリコンビナーゼおよびＣａｓ９：ｓｇＲＮＡのインビボのカチオン性脂質によって媒介される送達
インビボの機能的なゲノム編集蛋白質の高効率送達は、遺伝子疾患を修正するための非ウイルス治療用のゲノム編集を包含する広範な応用を可能にする。生体哺乳動物において上に記載された蛋白質送達法を評価するために、マウス内耳への送達を選んだ。これは、その限られた空間、良く特徴づけられた内耳細胞型、および将来の聴覚回復研究を可能にし得る遺伝性難聴マウスモデルの存在が原因である。マウス内耳（inner year）への蛋白質の２つの型のインビボ送達を試みた。最初に、（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ蛋白質の送達を試験して、内耳細胞型のターゲット化および機能的な蛋白質送達の効率を評価した。第２に、内耳へのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体の送達を評価して、カチオン性脂質によって媒介される蛋白質：ｇＲＮＡ複合体送達が、ＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子編集をインビボで支持し得るかどうかを決定した。
（＋３６）ＧＦＰ－Ｃｒｅがマウス網膜に送達され得るということが以前に示されているが１６、蛋白質は、非効率的なインビボ送達を示唆する組み換え変換のわずかなレベルのみをもたらした。本発明者の当初の内耳送達試験においては、（－３０）ＧＦＰ－ＣｒｅをRNAiMAXと複合体化し、複合体を、ゲノムインテグレーションされたｆｌｏｘｅｄ－ＳＴＯＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターを有する生後０日目（Ｐ０）のレポーターマウスの蝸牛に注射した。以前に記載されたインビトロＣｒｅレポーター細胞株と同じく、エンドソーム脱出、核局在、およびＣｒｅによって媒介される組み換えが続く内耳細胞へのＣｒｅの機能的な送達は、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現をもたらす。注射後に、ｔｄＴｏｍａｔｏとの共局在について内耳細胞マーカーを免疫標識するために蝸牛を集めた。RNAiMAX注射単独をコントロールとして用いた。（－３０）ＧＦＰ－ＣｒｅおよびRNAiMAXの注射に続く５日に、蝸牛の外有毛細胞（音を検出する聴覚感覚細胞）は有毛細胞マーカーミオシンＶＩＩａ（Ｍｙｏ７ａ）と共局在する強いｔｄＴｏｍａｔｏシグナルを示し、有毛細胞への機能的なＣｒｅ送達を実証した（図３２（Ａ）～（Ｂ））。ｔｄＴｏｍａｔｏ発現はコントロール蝸牛においては検出されなかった（図３２（Ａ））。ｔｄＴｏｍａｔｏシグナルは蝸牛の基部渦巻きの注射部位の領域に濃縮されていた。平均で、外有毛細胞の３３±３％が蝸牛の基部においてｔｄＴｏｍａｔｏ陽性であった（Ｐ＜０．００１、平均±ＳＥＭ、ｎ＝４）。
ターゲット化された細胞にカチオン性脂質によって媒介される（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ蛋白質送達が及ぼす効果をさらに決定するために、有毛細胞の不動毛（聴覚に必須である繊細な構造）を注射後１０日に調べた。ＴｄＴｏｍａｔｏ陽性の外有毛細胞は、コントロール不動毛と類似の典型的な不動毛構造（ｅｓｐｉｎ発現によってイメージングされる）を有した（図３２（Ｂ））。ｔｄＴｏｍａｔｏ発現はコントロール蝸牛においては検出されなかった。これらの観察は、（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ蛋白質のカチオン性脂質によって媒介される送達が、有毛細胞構造に明らかに影響を及ぼすこと無しに蝸牛の外有毛細胞における組み換えを実現するということを示している。
インビボのターゲット体積、蛋白質用量、およびｓｇＲＮＡ用量は細胞培養実験とは異なるので、上の実験は異なる送達条件で反復した。Lipofectamine 2000を用いる送達を、インビトロにおけるそのより高い効力が原因で試験し（図３９（Ａ））、劇的により高い組み換え効率が観察された。（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ＋Lipofectamine 2000によって処置された蝸牛の９０％超の外有毛細胞はｔｄＴｏｍａｔｏ陽性であった（図３２（Ｃ））。コントロールサンプルと比較して、若干の外有毛細胞喪失が観察された（図３２（Ｃ））。これは、Lipofectamine 2000のより高い細胞毒性の以前の観察と一致している。しかし、総合的な蝸牛構造は維持されていた。
インビボのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達の有効性を試験するために、Ｃａｓ９とＥＧＦＰをターゲット化するｓｇＲＮＡとをRNAiMAXと組み合わせ、もたらされた複合体を、生後２日目（Ｐ２）のトランスジェニックＡｔｏｈ１－ＧＦＰマウスの蝸牛（転写因子Ａｔｏｈ１の有毛細胞特異的なエンハンサーのコントロール下で全ての有毛細胞がＧＦＰを発現する４９）に注射した。このモデルを用いると、ＥＧＦＰのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡによって媒介される破壊は、外有毛細胞のＥＧＦＰ蛍光の喪失をもたらす。カチオン性脂質とＣａｓ９：ｓｇＲＮＡの注射の１０日後に、ＧＦＰの非存在が注射部位近くの外有毛細胞の１３％において観察された。対照的に、いずれかのｓｇＲＮＡ無しでＣａｓ９蛋白質およびRNAiMAXを注射されたコントロール蝸牛は、ＥＧＦＰシグナルの喪失を示さなかった（図３２（Ｄ））。Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡのRNAiMAX複合体を注射された蝸牛の外有毛細胞は、別様に影響を及ぼされないように見え、Ｍｙｏ７ａの類型的な発現と健康な核とを有した。これは最小限の有毛細胞毒性と一致している（図３２（Ｄ））。蝸牛組織サンプルから単離されたゲノムＤＮＡのハイスループットＤＮＡシーケンシングは、ｓｇＲＮＡを欠くコントロールサンプルではなく、処置されたサンプルにおいて、ＧＦＰターゲット遺伝子破壊と一致するインデルを明らかにした（図４３（Ａ））。加えて、ＥＭＸ遺伝子をターゲット化するｓｇＲＮＡを用いるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡの内耳のインビボ送達を反復し、コントロール動物ではなく処置された動物におけるＥＭＸ遺伝子内のインデルが類似に観察された（図４３（Ｂ））。
Lipofectamine 2000と複合体化した（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅは、RNAiMAXと複合体化した（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅよりもターゲット有毛細胞集団の効率的な改変をもたらしたので（図３２（Ａ）および３２（Ｃ））、Ａｔｏｈ１－ＧＦＰ蝸牛へのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ送達時のその使用を、上の通り試験した。ＧＦＰ発現の喪失が１０日後の注射部位近くの外有毛細胞の２０％において観察された。一方、全ての外有毛細胞は、ｓｇＲＮＡ無しでＣａｓ９およびLipofectamine 2000を注射されたコントロール蝸牛において強いＧＦＰ発現を維持した（図３２（Ｄ））。（－３０）ＧＦＰ－ＣｒｅのLipofectamine 2000送達後に観察されたわずかな有毛細胞喪失とは対照的に（図３２（Ｃ））、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡによってターゲット化された外有毛細胞は明らかな毒性または構造上の変化を示さなかった（図３２（Ｄ））。
（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅと同じく、マウス内耳へのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡのウイルスによらないカチオン性脂質によって媒介される送達は、外有毛細胞集団中の特異的なゲノム遺伝子座を首尾よく改変し、これはターゲット遺伝子発現の喪失につながった。遺伝性難聴の全ての型のほぼ半分は、有毛細胞の喪失または不全に起因する５０。本明細書において提出されている結果は、聴覚回復を実現するためにそれらの細胞を遺伝子改変するための、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体の送達に基づく可能性ある戦略を示唆している。
（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅについての蛋白質送達有効性の決定
カチオン性蛋白質送達のものと比較して、リポソームによって媒介される（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ送達の高い効力が、細胞によるより多くの合計の蛋白質取り込みに起因するのか、または細胞によって取り込まれる機能的な非エンドソーム蛋白質分子のより高い画分に起因するのかを決定するために、フローサイトメトリーを用いて、それらのそれぞれの最適なＣｒｅ送達条件で（＋３６）ＧＦＰ－Ｃｒｅまたはリポソーム（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅによって処置した細胞のＧＦＰ蛍光を測定した。細胞蛍光は、エンドソームまたは非エンドソーム局在に関係なく合計のエンドサイトーシスされた（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅまたは（＋３６）ＧＦＰ－Ｃｒｅを報告している１。脂質によって媒介される蛋白質送達は、脂質によって媒介される機能的なＣｒｅ送達の高効率にもかかわらず、合計の蛋白質取り込みの驚くほど小さい増大をもたらした（図３４（Ａ））。（＋３６）ＧＦＰ－Ｃｒｅ処置は、用量依存的な様式で３桁まで細胞内ＧＦＰ蛍光を増大させた（図３４（Ａ））。これは以前の報告と一致する１、２。一方、リポソーム（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅ処置は、細胞内ＧＦＰ蛍光の多くて５倍の増大を誘導した（図３４（Ａ））。細胞内蛍光および組み換え効率の比較は、（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅの脂質によって媒介される機能的な送達が、（＋３６）ＧＦＰ－Ｃｒｅの送達よりも、エンドサイトーシスされた蛋白質の量あたり９，８００倍強力であるということを明らかにしている（図３４（Ｂ））。
カチオン性脂質とのアニオン性（－３０）ＧＦＰの複合体化がＧＦＰ蛍光と干渉し、それゆえに細胞に入るカーゴの本当の量を覆い隠すかどうかを試験するために、ｍＣｈｅｒｒｙ（これは蛍光性だが高度にアニオン性ではない）を（－３０）ＧＦＰまたは（＋３６）ＧＦＰいずれかに融合し、ＨｅＬａ細胞に両方の蛋白質融合体を送達した。細胞表面に付着しており得るが細胞に入らなかった蛋白質をＰＢＳ＋ヘパリン（２０Ｕ／ｍＬ）によって洗浄した後、細胞を、処置の４時間および２４時間後にｍＣｈｅｒｒｙ蛍光についてＦＡＣＳによって分析した。（－３０）ＧＦＰが融合したｍＣｈｅｒｒｙの脂質によって媒介される送達は、細胞内ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の軽度の増大のみをもたらすということが観察された。一方、（＋３６）ＧＦＰ－ｍＣｈｅｒｒｙの送達によるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は一般的に≧１００倍高かった（図３４（Ｃ））。これは、（－３０）ＧＦＰへの融合が、蛋白質カーゴの実質的な量が細胞に入ることを引き起こさないということを示唆している。その上、（－３０）ＧＦＰ－Ｃｒｅへの脂質の追加は、カチオン性脂質およびアニオン性（－３０）ＧＦＰが明確に相互作用するという事実にもかかわらず、ＧＦＰ蛍光シグナルを測定可能には変化しなかった（図３４（Ｄ））。一緒にすると、これらの結果からは、アニオン性蛋白質の脂質によって媒介される送達の異常に高い効力が、各細胞における異常に高い蛋白質取り込みではなく、むしろ蛋白質分解の回避および細胞質へのエンドソーム脱出を包含する可能性が高いエンドサイトーシス後プロセスに起因するということが示唆される。
オフターゲット切断アッセイの感度限界
ゲノムオフターゲット切断を検出するためのハイスループットシーケンシング法の感度は、各ゲノムターゲット部位のＰＣＲ増幅へのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）インプット量によって限定される。ヒトｇＤＮＡの１ｎｇサンプルはおよそ３３０個のユニークなゲノムを表すのみであり、それゆえに各ゲノム部位のおよそ３３０個のユニークなコピーのみが存在する。各ゲノムターゲットのＰＣＲ増幅はインプットｇＤＮＡの合計１５０ｎｇで行った。これは、多くて５０，０００個のユニークなｇＤＮＡコピーに由来するアンプリコンをそれぞれ提供する。そのため、ハイスループットシーケンシングアッセイでは、５０，０００分の１（０．００２％）未満の頻度で起こる稀なゲノム改変イベントを検出し得ない。この限界は表２において注意されている。
一緒にすると、これらの知見は、ゲノム編集蛋白質のカチオン性脂質によって媒介される送達が、遺伝子疾患の処置に強力なツールおよびインビボ戦略として働き得るということを示唆している。
結論
インビトロ、とりわけインビボの効率的な細胞内蛋白質送達は、バイオメディカル研究および蛋白質治療薬の常なる難問であった。カチオン性ペプチドおよび蛋白質を用いる送達は２０年間以上広く研究されて来たが、一方、血清蛋白質に対する感受性、抗体による中和、細胞外および細胞内プロテアーゼによる分解、および内在化後の不良なエンドソーム脱出が、この手法を用いる蛋白質送達応用の範囲を限定して来た。
本例は、カチオン性リポソームとのアニオン性蛋白質複合体化を用いる蛋白質送達のための一般的な戦略を実証している。この方法を用いて、多様な蛋白質クラス（Ｃｒｅチロシンリコンビナーゼ、ＴＡＬＥ転写活性化因子、およびＣａｓ９ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、および転写活性化因子を包含する）（図２７（Ａ））を、培養細胞株、幹細胞コロニー、およびマウス内耳の治療に関係するインビボ部位に送達した。記載される手法は高度に効率的であり、細胞培養においては確立された核酸トランスフェクション法と比肩する改変比率を生成し、生体マウスの内耳有毛細胞集団においてそれぞれ９０％および２０％までのＣｒｅリコンビナーゼおよびＣａｓ９によって媒介されるゲノム改変比率を可能にする（図３２（Ｃ）～（Ｄ））。これらの結果は、核酸とそれらを複合体化することによって、他の核酸結合蛋白質（細胞運命の治療に関係する変化を誘導する転写因子を包含する）を効率的に送達するためにカチオン性脂質を用いることが可能であり得るということをもまた示唆している。
カチオン性脂質に基づくアニオン性蛋白質送達は、強力なカチオン性蛋白質送達融合パートナー（＋３６）ＧＦＰを、エンドサイトーシスされた蛋白質の量あたり９，８００倍まで凌ぎ、処置された細胞のより効率的な改変を蛋白質の数桁低い用量によって誘導する（図２８（Ｃ）３４）。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ送達については、この手法は、従来型のプラスミドトランスフェクションよりも＞１０倍特異的なゲノム改変をもまたもたらす（図３１（Ｂ）～（Ｄ））。これは、ＤＮＡ送達法と比較して、各ゲノムが暴露されるＣａｓ９活性の一過的なウインドウが原因である可能性が高く、以前の報告と一致している５１。
記載されている手法は実装することが単純であり、精製された送達可能な蛋白質とポピュラーな市販の核酸トランスフェクション試薬の使用とを要求するのみである（図２７（Ｂ））。所与の蛋白質をこの手法を適用可能にすることは、（－３０）ＧＦＰなどの高度にアニオン性のパートナーへの単純な翻訳融合を要求し（図２７（Ａ））、普通の翻訳融合タグ（ＶＰ６４活性化ドメインおよび３×ＦＬＡＧアフィニティータグを包含する）でさえも有効である（図２８（Ｆ）および図３３（Ｃ））。ある種の場合では、Ｃａｓ９蛋白質のように、相手の核酸（この場合ではｓｇＲＮＡ）との予備的な複合体化が充分である（図３０（Ａ））。なぜなら、部分的に暴露された結合した核酸は、カチオン性脂質との複合体化を媒介するために充分なアニオン性電荷を提供する可能性が高いからである。
他のグループは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ形態でのＣａｓ９発現構築物のインビボ送達を報告して来た５２、５３。本例は、蛋白質送達がインビボゲノム編集への現実的手法であるということを実証している。
表１．ＥＭＸ、ＶＥＧＦ、およびＣＬＴＡ内の部位をターゲット化するＣａｓ９：ｓｇＲＮＡのオンターゲットおよび公知オフターゲット基質。ＥＭＸ、ＶＥＧＦ、およびＣＬＴＡのゲノムオンターゲットおよびオフターゲット部位のリストが示されており、オンターゲット配列からの変異は小文字かつ太字で示されている。ＰＡＭは下線で示されている。
表２．ＥＭＸ、ＣＬＴＡ、およびＶＥＧＦオンターゲット部位ならびに１１個の既知のオフターゲット部位の、インデル頻度、Ｐ値、およびオンターゲット：オフターゲット切断特異性比。ＣＬＴＡ部位：合計：合計の配列カウント数。最初の１０，０００個の配列のみをオンターゲット部位配列については分析した。改変：パーセンテージとしての、合計の配列数によって除算されたインデル数。可能性ある改変の上限を、インデルが観察されなかった部位について計算した。これは、１つ未満のインデルがあると仮定し、それから合計の配列カウントによって除算して上限の改変パーセンテージに至ること、または理論上の検出限界（１／４９，５００。上の結果参照）を採ることによった（より大きいどちらかの値）。Ｐ値：モック処置、Ｃａｓ９プラスミドトランスフェクション、およびリポソームＣａｓ９蛋白質：ｓｇＲＮＡ送達について、Ｐ値は、両側のフィッシャーの正確検定を用いて、各ＣＬＴＡをターゲット化された処置サンプル（ＤＮＡトランスフェクションまたは蛋白質：ｓｇＲＮＡ送達いずれか）対Ｃａｓ９蛋白質およびＥＧＦＰをターゲット化するｓｇＲＮＡによって処置したコントロールサンプル（モック処置）の間で計算した。オン：オフ特異性は、各部位についてのオンターゲット対オフターゲットゲノム改変頻度の比である。ＥＭＸ部位は、ＥＭＸターゲット部位に応用されたＣＬＴＡ分析の実験および分析法を示している。ＶＥＧＦ部位は、ＶＥＧＦターゲット部位に応用されたＣＬＴＡ分析の実験および分析法を示している。インデルの合計数を決定するために、かつ本文の図３１において、図４１についてもまたオンターゲット：オフターゲット比を計算するために、モック処置コントロールのインデル数を、プラスミドトランスフェクションおよび蛋白質：ｓｇＲＮＡ送達インデル数両方から引いた。
均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される特定の態様の多くの均等物を認識するか、または慣例の実験法のみを用いて確かめる能力があるであろう。本発明の範囲は上の記載に限定されることを意図されておらず、むしろ添付の請求項に示される通りとする。
当業者は、本明細書に記載される本発明に従う特定の態様の多くの均等物を認識するか、または慣例の実験法のみを用いて確かめる能力があるであろう。本発明の範囲は上の記載に限定されることを意図されておらず、むしろ添付の請求項に示される通りとする。
請求項において、逆に示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は１つまたは１つよりも多くを意味し得る。逆に示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、群の１つまたは２つ以上のメンバー間に「または」を包含する請求項または記載は、群のメンバーの１つ、１つよりも多く、または全てが所与の産物またはプロセスにおいて存在する、使用される、または別様に関係する場合に満たされていると見なされる。本発明は、群の厳密に１つのメンバーが所与の産物またはプロセスにおいて存在する、使用される、または別様に関係する態様を包含する。本発明は、群のメンバーの１つよりも多くまたは全てが所与の産物またはプロセスにおいて存在する、使用される、または別様に関係する態様を包含する。さらにその上に、本発明は、列挙された請求項の１つまたは２つ以上からの１つまたは２つ以上の限定、要素、節、説明用語などが別の請求項中に導入される全てのバリエーション、組み合わせ、および入れ替えを包含するということが理解されるべきである。例えば、別の請求項に依存するいずれかの請求項が改変されて、同じ基礎請求項に依存するいずれかの他の請求項中に見いだされる１つまたは２つ以上の限定を包含し得る。さらにその上に、請求項が組成物を記述しているところでは、別様に示されない限り、または矛盾もしくは非一貫性が起因するであろうということが当業者に明白でない限り、本明細書において開示される目的のいずれかのために組成物を用いる方法が包含され、本明細書において開示される作る方法または当分野において公知の他の方法のいずれかに従って組成物を作る方法が包含されるということが理解されるべきである。
要素がリストとして（例えばマーカッシュ群フォーマットで）提出されているところでは、要素の各下位群もまた開示され、いずれかの要素（単数または複数）が群から取り除かれ得るということは理解されるべきである。一般的に、本発明または本発明の側面が特定の要素、特徴などを含むと言われるところでは、本発明のある種の態様または本発明の側面がかかる要素、特徴などからなるかまたは本質的になるということが理解されるべきである。単純の目的のために、それらの態様は本明細書においては一々具体的に示されなかった。用語「含む」は開放的であることが意図されており、追加の要素またはステップの包含を許可するということもまた注意される。
範囲が与えられているところでは、エンドポイントは包含される。さらにその上に、別様に示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表現されている値は、本発明の異なる態様において、記された範囲内のいずれかの特定の値または部分範囲を、文脈が明確に別様に述べていない限り、範囲の下限の単位の１／１０までとり得るいうことが理解されるべきである。
加えて、先行技術に属する本発明のいずれかの特定の態様が、請求項のいずれかの１つまたは２つ以上からはっきりと除外され得るということは、理解されるべきである。かかる態様は当業者に公知であると思われるので、それらは除外が本明細書にはっきりと示されていない場合であっても除外され得る。本発明の組成物のいずれかの特定の態様（例えば、いずれかの超荷電蛋白質、いずれかの核酸、生成のいずれかの方法、使用のいずれかの方法など）は、先行技術の存在に関連するかどうかにかかわらず、いずれかの理由でいずれかの１つまたは２つ以上の請求項から除外され得る。
全ての引用されたソース（例えば、本明細書に引用された参照、公開、データベース、データベースエントリー、および技術）は、引用においてわざわざ記されない場合であっても参照によって本願に組み込まれる。引用されたソースと本願との相反する記の場合では、本願の記がコントロールするものとする。

Claims (92)

  1. 機能的なエフェクター蛋白質と結びついた超荷電蛋白質を含む組成物であって、超荷電蛋白質が、その対応する未改変蛋白質よりも大きくかつ充分量である正の総電荷を有し、細胞内への透過のために処方される、前記組成物。
  2. 機能的なエフェクター蛋白質がヌクレアーゼである、請求項１に記載の組成物。
  3. ヌクレアーゼが、ＲＮＡによってプログラミング可能なヌクレアーゼである、請求項２に記載の組成物。
  4. ヌクレアーゼがＴＡＬＥヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項３に記載の組成物。
  5. ヌクレアーゼが核酸配列に特異的に結合して切断する、請求項２～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 核酸配列が、疾患または障害と結びついた遺伝子またはアレル内に含まれる、請求項５に記載の組成物。
  7. 組成物が、ヌクレアーゼによって結合および切断される核酸配列と同一のまたは相同な配列を含む核酸分子をさらに含む、請求項５または６に記載の組成物。
  8. 核酸配列が、治療ターゲットである遺伝子内に含まれる配列である、請求項５～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 遺伝子が、細胞運命をコントロールする遺伝子である、請求項８に記載の組成物。
  10. 遺伝子が、褐色脂肪細胞の細胞運命に向かう細胞プログラミングを誘導または阻害する遺伝子である、請求項９に記載の組成物。
  11. 遺伝子がＰＲＤＭ１６またはＰＰＡＲγである、請求項９または１０に記載の組成物。
  12. 機能的なエフェクター蛋白質が転写因子である、請求項１に記載の組成物。
  13. 機能的なエフェクター蛋白質がＴＡＬＥ転写活性化因子または抑制因子である、請求項１に記載の組成物。
  14. 転写因子、転写活性化因子、または転写抑制因子が遺伝子に特異的に結合して活性化または抑制する、請求項１２または１３に記載の組成物。
  15. 遺伝子が治療ターゲットである、請求項１４に記載の組成物。
  16. 機能的なエフェクター蛋白質がＴＡＬＥエフェクターである、請求項１に記載の組成物。
  17. 超荷電蛋白質が共有結合を介して機能的なエフェクター蛋白質と結びつき、それゆえに融合蛋白質を形成する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 超荷電蛋白質がリンカーを介して機能的なエフェクター蛋白質と結びつく、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項１８に記載の組成物。
  20. リンカーが、ＵＶによって切断可能なリンカーまたはリソソーム酵素によって切断されるリンカーである、請求項１９に記載の組成物。
  21. 超荷電蛋白質が非共有結合的な相互作用を介して機能的なエフェクター蛋白質と結びつき、それゆえに複合体を形成する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 超荷電蛋白質が正味の正の総電荷を有する、請求項２１に記載の組成物。
  23. 正味の正の総電荷が約＋５である、請求項２１に記載の組成物。
  24. 正味の正の総電荷が約＋１０である、請求項２１に記載の組成物。
  25. 正味の正の総電荷が約＋１５である、請求項２１に記載の組成物。
  26. 正味の正の総電荷が約＋２０である、請求項２１に記載の組成物。
  27. 正味の正の総電荷が約＋２５である、請求項２１に記載の組成物。
  28. 正味の正の総電荷が約＋３０である、請求項２１に記載の組成物。
  29. 正味の正の総電荷が約＋３５である、請求項２１に記載の組成物。
  30. 正味の正の総電荷が約＋４０である、請求項２１に記載の組成物。
  31. 超荷電蛋白質が、その対応する未改変蛋白質よりも生理ｐＨにおいて多く正に荷電する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 対応する未改変蛋白質が天然に存在する蛋白質である、請求項３１に記載の組成物。
  33. 超荷電蛋白質が、その対応する未改変蛋白質よりも生理ｐＨにおいて少なくとも＋５多く正に荷電する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 超荷電蛋白質が、その対応する未改変蛋白質よりも生理ｐＨにおいて少なくとも＋１０多く正に荷電する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 超荷電蛋白質が、その対応する未改変蛋白質よりも生理ｐＨにおいて少なくとも＋１５多く正に荷電する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 超荷電蛋白質が、その対応する未改変蛋白質よりも生理ｐＨにおいて少なくとも＋５多く正に荷電する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 超荷電蛋白質が蛍光蛋白質である、請求項１～３６のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 超荷電蛋白質が緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）である、請求項１～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 超荷電蛋白質が超正荷電ＧＦＰである、請求項１～３８のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 超荷電蛋白質が、配列
    GGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK（配列番号１）
    の少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基を含む超正荷電ＧＦＰ（＋３６ＧＦＰ）である、請求項１～３９のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 超荷電蛋白質が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項４０に記載の組成物。
  42. 組成物が医薬組成物である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 組成物が薬学的に許容可能な賦形剤を含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
  44. 組成物が対象への投与のために処方され、対象の少なくとも１つの細胞への送達に有効な量で超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質を含む、請求項４２または４３に記載の医薬組成物。
  45. 組成物が、対象への投与後に測定可能な治療効果を誘導することに有効な量で超荷電蛋白質および機能的なエフェクター蛋白質を含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  46. 疾患、障害、または状態の１つもしくは２つ以上の症状を患いやすいか、それを患っているか、またはそれを示す対象を提供すること；および
    請求項１～４１のいずれか一項に記載の組成物または請求項４２～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与し、その結果、少なくとも１つの症状が回復すること
    を含む、方法。
  47. 投与するステップが、機能的なエフェクター蛋白質が対象の細胞に透過するために充分な条件で実施される、請求項４６に記載の方法。
  48. 疾患、障害、または状態が、ｍＲＮＡ、蛋白質、またはその組み合わせの異常に高まったレベルと結びついている、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 組成物が、病原性のＲＮＡもしくは蛋白質をコードする遺伝子または疾患細胞または組織において異常に高いレベルで発現されるＲＮＡもしくは蛋白質をコードする遺伝子に、特異的に結合して切断するヌクレアーゼを含む、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 投与するステップが、経口、静脈内、筋内、動脈内、皮下、脳室内、局所、吸入、および粘膜送達からなる群から選択される投与経路を含む、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 機能的なエフェクター蛋白質が細胞に入るための好適な条件で、請求項１～４１のいずれか一項に記載の組成物または請求項４２～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物と細胞を接触させることを含み、それによって細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を導入する、細胞内に機能的なエフェクター蛋白質を導入する方法。
  52. 機能的なエフェクター蛋白質が細胞に透過したことを確認することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 細胞が対象内に含まれ、接触がインビボである、請求項５１または５２に記載の方法。
  54. 対象が、遺伝子の異常な発現レベルと結びついた障害を有するかまたは発症するリスクがあると診断され、機能的なエフェクター蛋白質が遺伝子の発現レベルを調節する、請求項５３に記載の方法。
  55. 遺伝子の発現のレベルの変化を検出することまたは対象の治療応答を検出することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 細胞が体細胞である、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 細胞が、望まれる細胞運命への細胞のプログラミングを誘導するために充分な量、時間、および条件で組成物または医薬組成物と接触させられる、請求項５１～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 細胞補充治療手法にプログラミングされた細胞を用いることをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 細胞が疾患と結びついたゲノムアレルを持っている細胞であり、機能的なエフェクター蛋白質がアレルを特異的にターゲット化するヌクレアーゼである、請求項５１～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 細胞がエクスビボで接触させられ、ヌクレアーゼによる望まれないアレルの成功したターゲット化後に対象に再投与される、請求項５９に記載の方法。
  61. 請求項１～４１のいずれか一項に記載の組成物または請求項４２～４５のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、キット。
  62. 請求項４６～６０のいずれか一項に記載の方法を実行するためのキット。
  63. Ｃａｓ９蛋白質およびカチオン性脂質を含む組成物であって、Ｃａｓ９蛋白質がｇＲＮＡと結びつき、組成物が細胞の内部にＣａｓ９蛋白質を送達することができる、前記組成物。
  64. 組成物が、細胞の集団に投与されたときに低い毒性を示す、請求項６３に記載の組成物。
  65. 細胞の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、組成物の投与後に生存可能である、請求項６３または６４に記載の組成物。
  66. カチオン性脂質が、Lipofectamine（登録商標）2000、Lipofectamine（登録商標）3000、Lipofectamine（登録商標）RNAiMAX、およびLipofectamine（登録商標）LTXからなる群から選択される、請求項６３～６５のいずれか一項に記載の組成物。
  67. Ｃａｓ９蛋白質が、野生型Ｃａｓ９蛋白質もしくはそのバリアント、Ｃａｓ９ニッカーゼ、またはヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）もしくはそのバリアントを含む、請求項６３～６６のいずれか一項に記載の組成物。
  68. ｄＣａｓ９が転写活性化因子または転写抑制因子に融合する、請求項６７に記載の組成物。
  69. 転写活性化因子がＶＰ１６、ＶＰ６４、およびｐ６５からなる群から選択されるか、または転写抑制因子がＫＲＡＢ蛋白質もしくはＳＩＤ蛋白質である、請求項６８に記載の組成物。
  70. ｄＣａｓ９がヌクレアーゼドメインに融合する、請求項６７に記載の組成物。
  71. ヌクレアーゼドメインがＦｏｋＩヌクレアーゼドメインを含む、請求項７０に記載の組成物。
  72. ｄＣａｓ９がリコンビナーゼ触媒ドメインに融合する、請求項６７に記載の組成物。
  73. リコンビナーゼ触媒ドメインがＨｉｎリコンビナーゼ触媒ドメイン、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメイン、またはＴｎ３リコンビナーゼ触媒ドメインを含む、請求項７２に記載の組成物。
  74. ｄＣａｓ９がデアミナーゼに融合する、請求項６７に記載の組成物。
  75. デアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＩＤ、およびＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼからなる群から選択されるシチジンデアミナーゼを含むか、または、デアミナーゼが、ＡＤＡＴファミリーデアミナーゼを任意で含むアデノシンデアミナーゼを含む、請求項７４に記載の組成物。
  76. ｄＣａｓ９がエピジェネティック修飾因子に融合する、請求項６７に記載の組成物。
  77. エピジェネティック修飾因子が、ヒストン脱メチル化酵素、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素、およびヒストンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項７６に記載の組成物。
  78. エピジェネティック修飾因子が、ＬＳＤ１ヒストン脱メチル化酵素またはＴＥＴ１ヒドロキシラーゼを含む、請求項７７に記載の組成物。
  79. Ｃａｓ９蛋白質が、正味の負電荷を有する超荷電蛋白質と結びつき、結びつきは正味の負電荷を有し、任意で結びつきは共有結合的な結びつきである、請求項６７に記載の組成物。
  80. 超荷電蛋白質が蛍光蛋白質であり、任意で超荷電蛋白質が超負荷電ＧＦＰである、請求項７９に記載の組成物。
  81. エフェクター蛋白質およびカチオン性脂質、カチオン性ポリマー、またはカチオン性脂質およびカチオン性ポリマーの両方を含む組成物であって、エフェクター蛋白質が正味の負電荷を有する超荷電蛋白質と結びつき、結びつきが正味の負電荷を有し、組成物が細胞の内部にエフェクター蛋白質を送達することができる、前記組成物。
  82. 組成物が、細胞の集団に投与されたときに低い毒性を示す、請求項８１に記載の組成物。
  83. 細胞の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、組成物の投与後に生存可能である、請求項８１または８２に記載の組成物。
  84. カチオン性脂質が、Lipofectamine（登録商標）2000、Lipofectamine（登録商標）3000、Lipofectamine（登録商標）RNAiMAX、およびLipofectamine（登録商標）LTXからなる群から選択される、請求項８１～８３のいずれか一項に記載の組成物。
  85. 超荷電蛋白質が蛍光蛋白質であり、任意で超荷電蛋白質が超負荷電ＧＦＰである、請求項８１～８４のいずれか一項に記載の組成物。
  86. エフェクター蛋白質がリコンビナーゼである、請求項８１～８５のいずれか一項に記載の組成物。
  87. リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項８６に記載の組成物。
  88. エフェクター蛋白質がＴＡＬＥ蛋白質を含む、請求項８１～８７のいずれか一項に記載の組成物。
  89. ＴＡＬＥ蛋白質がＶＰ６４転写活性化因子を含む、請求項８８に記載の組成物。
  90. 組成物が医薬組成物である、請求項８１～８９のいずれか一項に記載の組成物。
  91. その必要がある対象に請求項９０に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
  92. 細胞内にＣａｓ９蛋白質を導入する方法であって、Ｃａｓ９蛋白質が細胞内に入るための好適な条件で請求項８１～９０のいずれか一項に記載の組成物と細胞を接触させることを含み、それによって細胞内にＣａｓ９蛋白質を導入する、前記方法。
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