CN105745221A - 用于功能性核酸酶的投递系统 - Google Patents

用于功能性核酸酶的投递系统 Download PDF

Info

Publication number
CN105745221A
CN105745221A CN201480060598.1A CN201480060598A CN105745221A CN 105745221 A CN105745221 A CN 105745221A CN 201480060598 A CN201480060598 A CN 201480060598A CN 105745221 A CN105745221 A CN 105745221A
Authority
CN
China
Prior art keywords
albumen
compositions
cell
hypercharge
cas9
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201480060598.1A
Other languages
English (en)
Inventor
D.R.刘
J.A.祖里斯
D.B.汤普森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harvard College
Original Assignee
Harvard College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harvard College filed Critical Harvard College
Publication of CN105745221A publication Critical patent/CN105745221A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/463—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from amphibians
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/71—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing domain for transcriptional activaation, e.g. VP16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/85—Fusion polypeptide containing an RNA binding domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)

Abstract

提供了用于超电荷蛋白介导的功能性效应器蛋白对细胞的体内、离体、或体外投递的组合物、方法、策略、试剂盒和系统。还提供了使用阳离子脂质和阳离子聚合物来投递功能性效应器蛋白的组合物、方法、策略、试剂盒和系统。功能性效应器蛋白包括但不限于转录调控物(例如阻遏物或激活物)、重组酶、核酸酶(例如可RNA编程的核酸酶，如Cas9蛋白；TALE核酸酶，和锌指核酸酶)、脱氨酶，和其他基因修饰/编辑酶。功能性效应器蛋白包括TALE效应器蛋白，例如TALE转录激活物和阻遏物，以及TALE核酸酶。用于将功能性效应器蛋白投递到细胞中的组合物、方法、策略和系统可用于治疗和研究目的，包括但不限于与疾病有关的基因的靶向性操作，与疾病有关的基因的表达水平的调控，和细胞命运的编程。

Description

用于功能性核酸酶的投递系统
相关申请
本申请要求35U.S.C.§365(c)下2014年8月18日提交的美国申请U.S.S.N.14/462,189和2014年8月18日提交的美国申请U.S.S.N.14/462,163的优先权，其还要求35U.S.C.§119(e)下2013年9月6日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.61/874,746的优先权，其各自通过提述并入本文。
发明背景
将大分子投递到哺乳动物细胞中是用于细胞操作的一种有吸引力的办法，因为其将允许调控基因表达和修饰基因组，这相应地将开启研究和实现对目前视为通过小分子“不可给药”的分子的靶向性治疗的新途径。具体而言，靶向与疾病有关的基因或等位基因的重组核酸酶具有作为治疗剂的极大潜力。目前大分子投递的方法包括核酸分子的病毒投递，核酸或蛋白质的受体介导的投递，和具有细胞穿透肽如TAT、Arg9或Penetratin用于投递蛋白质的蛋白融合物的使用。这些投递系统的每一种提供了对特定应用的益处；然而，在大多数情况下，仍存在关于功效、细胞毒性和制备容易性的问题。能够将大分子(例如功能性效应器蛋白)有效投递到多种细胞系而没有显著细胞毒性或其他不良副作用的容易制备的试剂仍是重要的关注点所在。
大多数蛋白质不自发进入哺乳动物细胞中，因此其用作研究工具和其作为治疗剂的潜力受到天然限制。最近开发了用于将蛋白质投递到哺乳动物细胞中的技术来针对胞内靶物。这些技术包括使用基于脂质的试剂(Zelphati等,J.Biol.Chem.276,35103-35110,2001)，纳米颗粒(Hasadsri等,J.Biol.Chem.,2009)，vault核糖核蛋白颗粒(Lai等,ACSNano3,691-699,2009)；对受体配体的遗传或化学融合(Gabel等,J.CellBiol.103,1817-1827,1986；Rizk等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106,11011-11015,2009)；和对细胞穿透肽的融合(Wadia等,Curr.ProteinPept.Sci.4,97-104,2003；Zhou等,CellStemCell4,381-384,2009)。可能用于蛋白质投递的最常见的方法是对蛋白转导域(PTD)的遗传融合，所述转导域包含HIV-1转录反式激活物(transactivatoroftranscription)(Tat)肽和聚精氨酸肽。这些阳离子PTD促进与带负电荷的细胞表面结构的关联和后续对外源蛋白的胞吞作用。Tat和聚精氨酸两者均已被用于将多种大分子体外和体内投递到细胞中(Wadia等,Curr.ProteinPept.Sci.4,97-104,2003；Zhou等,CellStemCell4,381-384,2009；Myou等,J.Immunol.169,2670-2676,2002；Bae等,Clin.Exp.Immunol.157,128-138,2009；Schwarze等,Science285,1569-1572,1999)。尽管有这些进展，但使用外源蛋白仍难以影响胞内靶物，且甚至适度成功也可能需要毒性浓度的相应转导剂，原因是将蛋白质投递到细胞中的效率较低(Zhou等,CellStemCell4,381-384,2009；Wang等,Nat.Biotechnol.26,901-908,2008)。因此，仍然需要用于使功能性效应器蛋白进入细胞中以靶向胞内生物分子的更好的投递系统。
发明概述
本公开提供用于将功能性效应器蛋白如例如结合核酸的位点特异性蛋白质投递到细胞中的新的系统、组合物、制备物、试剂盒和相关方法，其使用超电荷(supercharged)的蛋白质(例如带正电荷的超电荷蛋白)、阳离子聚合物或阳离子脂质。在一些实施方案中，所述核酸酶是TALE核酸酶、可RNA编程的核酸酶或工程化的可RNA编程的基因组编辑酶(如Cas9及其变体或融合物)、或锌指核酸酶。在一些实施方案中，转录因子是TALE转录激活物或阻遏物。在一些实施方案中，效应器蛋白是重组酶。如本文中以更多细节描述的，使功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、Cas9蛋白包括其变体和融合物，等等)与带正电荷的超电荷蛋白融合或关联允许将该蛋白质投递到细胞内部，例如来影响基因表达或基因组修饰。还发现使功能性效应器蛋白与带负电荷的超电荷蛋白融合或关联允许该蛋白与阳离子脂质或阳离子聚合物关联，这使得该蛋白有力投递到细胞内部。此外，天然带负电荷的功能性效应器蛋白(例如VP64转录激活物、阴离子3xFLAG肽标签、及其融合物)或与固有地带负电荷的核酸(例如导引RNA；“gRNA”)关联的功能性效应器蛋白(例如Cas9蛋白、及其变体和融合物)可与阳离子脂质或阳离子聚合物关联以投递至细胞(例如在没有超电荷蛋白的情况下)。
虽然已证明效应器蛋白的投递对于胞外靶物有效，但由于大多数蛋白不能自发进入哺乳动物细胞，其针对胞内靶物的用途相比之下开发较少。最常见通过以下来实现外源蛋白对胞内靶物的访问：经由化学转染、电穿孔或病毒投递来投递其编码DNA序列。然而，将外源DNA引入细胞带来了永久重组到基因组中、可能破坏内源基因、和长期暴露于编码的物质的可能性。对于一些研究或治疗应用(包括寻求实现基因组DNA的一次性、永久修饰的基因组编辑应用)，不可复制的蛋白质剂的功能性投递可以提供改进的安全性或更广的适用性。此外，虽然使用阳离子化合物如脂质和聚合物来投递蛋白质仍然是技术上困难且在许多情况中诱导细胞毒性，但令人惊讶地发现，使用本文中提供的组合物和方法，可以以无毒性或最小毒性将某些功能性效应器蛋白(例如Cas9蛋白及其变体和融合物、重组酶、转录激活物/阻遏物等等)投递至细胞，在某些情况中介导基因组修饰时具有效率中的显著改进和降低的脱靶(off-target)效应。例如，如实施例7中描述的，将Cas9:gRNA复合物与阳离子脂质一起投递是高度有效的(从单次处理，培养的人细胞中有多达80％修饰)且相比于质粒转染还诱导更高的基因组修饰特异性，通常在人细胞中产生高>10倍的在靶:脱靶DNA修饰比。
因此，在一个方面，使用超电荷蛋白来将功能性效应器蛋白投递到细胞中，例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、Cas9蛋白(包括其融合物和变体)等。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白已工程化为相比于相应的未经修饰的蛋白展现其总体表面电荷的增加。在其他实施方案中，所述超电荷蛋白已工程化为相比于相应的未经修饰的蛋白展现其总体表面电荷的降低。在其他实施方案中，用于本公开背景中的超电荷蛋白是天然存在的超电荷蛋白。所述超电荷蛋白可以与要投递的蛋白经由共价或非共价相互作用关联。不希望受任何具体理论束缚的，与gRNA关联的Cas9蛋白、变体或融合蛋白与带正电荷的超电荷蛋白的关联受净负电荷促进。在某些实施方案中，与超电荷蛋白关联的功能性效应器蛋白进一步与阳离子聚合物或阳离子脂质关联以形成适用于投递到细胞中的组合物。适宜工程化的或天然存在的超电荷蛋白的例子记载于2007年6月1日提交的国际PCT专利申请PCT/US07/70254，在2007年12月13日公开为WO2007/143574；2009年4月28日提交的国际PCT申请PCT/US09/041984，在2009年11月5日公开为WO2009/134808；和2010年4月28日提交的国际PCT申请PCT/US10/001250，在2010年11月11日公开为WO2010/129023；其各自完整内容通过提述并入本文。本文中描述了用于将核酸酶投递到细胞的超电荷蛋白的别的例子。适宜功能性效应器蛋白的另外的例子，例如核酸酶和可RNA编程的效应器蛋白如Cas9蛋白，记载于2013年8月22日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.61/868,846，题目为“EngineeredTranscriptionActivator-LikeEffector(TALE)DomainsandUsesThereof”，2013年9月6日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.61/874,609，题目为“Cas9VariantsandUsesThereof”，2014年9月6日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.61/874,682，题目为“SwitchableCas9NucleasesandUsesThereof”，2014年6月20日提交的美国非临时申请U.S.S.N.14/320,519，题目为“EngineeredTranscriptionActivator-LikeEffector(TALE)DomainsandUsesThereof”，2014年6月30日提交的美国非临时申请U.S.S.N.14/320,498，题目为“Cas9-FokIFusionProteinsAndUsesThereof”，2014年6月30日提交的美国非临时申请U.S.S.N.14/320,467，题目为“Cas9-重组酶FusionProteinsAndUsesThereof”，2014年6月8日提交的美国非临时申请U.S.S.N.14/326,329，题目为“SwitchablegRNAsComprisingAptamers”，2014年7月8日提交的美国非临时申请U.S.S.N.14/326,340，题目为“mRNA-SensingSwitchablegRNAs”，2014年7月8日提交的美国非临时申请U.S.S.N.14/326,361，题目为“ExtendedDNA-SensinggRNAs”，2014年7月8日提交的美国非临时申请U.S.S.N.14/325,815，题目为“FusionsOfCas9DomainsAndNucleicAcid-EditingDomains”，2014年7月8日提交的美国非临时申请U.S.S.N.14/326,109，题目为“MethodsForNucleicAcidEditing”，2014年7月8日提交的美国非临时申请U.S.S.N.14/326,140，题目为“MethodsForCorrectingPI3KPointMutations”，2014年7月9日提交的美国非临时申请U.S.S.N.14/326,269，题目为“MethodsForCorrectingPresenilinPointMutations”，2014年7月8日提交的美国非临时申请U.S.S.N.14/326,290，题目为“MethodsForCorrectingα-AntitrypsinPointMutations”，2014年7月8日提交的美国非临时申请U.S.S.N.14/326,318，题目为“MethodsForCorrectingVonWillebrandFactorPointMutations”，2014年7月8日提交的美国非临时申请U.S.S.N.14/326,303，题目为“MethodsForCorrectingCaspase-9PointMutations”，和美国临时申请U.S.S.N.62/030,943，题目为“Cas9ProteinsIncludingLigand-DependentInteins”，其各自完整内容通过提述并入本文。
在一些实施方案中，工程化或天然存在的超电荷蛋白是带正电荷的。在其他实施方案中，例如涉及使用阳离子脂质和/或阳离子聚合物投递特定效应器蛋白的那些实施方案中，所述超电荷蛋白是带负电荷的。在某些实施方案中，超正电荷或超级带负电荷的蛋白与效应器蛋白非共价关联。或者，超正电荷或超级带负电荷的蛋白可以共价结合于效应器蛋白。在一些实施方案中，效应器蛋白融合于超电荷蛋白。在某些实施方案中，所得融合蛋白包含接头，例如可切割的接头，其在超电荷蛋白和效应器蛋白之间。
本公开的一些方面提供了组合物，其包含与功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)关联的超电荷蛋白。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含阳离子脂质。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含阳离子聚合物。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含缓冲剂或赋形剂。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白具有大于其相应未经修饰蛋白的总体正电荷，其量足以用于配制且配制为用于投递至和穿透入细胞。在其他实施方案中，例如涉及使用阳离子脂质和/或阳离子聚合物投递特定效应器蛋白的那些实施方案中，所述超电荷蛋白具有大于其相应未经修饰蛋白的总体负电荷。在一些实施方案中，所述功能性效应器蛋白是位点特异性酶，例如核酸酶、Cas9蛋白、重组酶等。在一些实施方案中，Cas9蛋白是野生型Cas9蛋白，Cas9切口酶，或包含核酸酶失活(dCas9)蛋白。在一些实施方案中，Cas9蛋白是包含dCas9的融合蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含转录激活物(例如VP64)、转录阻遏物(例如KRAB,SID)、核酸酶域(例如FokI)、重组酶域(例如Hin,Gin或Tn3)、脱氨酶(例如胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶)或表观遗传修饰物(epigeneticmodifier)域(例如TET1)。在牵涉核酸酶的一些实施方案中，所述核酸酶是TALE核酸酶、Cas9核酸酶、Cas9切口酶或锌指核酸酶。在一些实施方案中，所述核酸酶特异性结合和切割核酸序列。在一些实施方案中，靶向的核酸序列是作为治疗靶物的基因的序列，例如期望在疾病的治疗中失活的基因。在一些实施方案中，靶向的核酸序列是PRDM16、PPARγ、VEGF-A、Oct-4、PI3K、早老蛋白(presenilin)、α-抗胰蛋白酶、血管假性血友病因子(vonwillebrandfactor)、或胱天蛋白酶-9基因序列。
在一些实施方案中，所述功能性效应器蛋白是转录因子。在一些实施方案中，所述功能性效应器蛋白是TALE转录激活物或阻遏物。在一些实施方案中，转录因子、转录激活物或转录阻遏物特异性结合并活化或抑制基因。在一些实施方案中，所述基因是治疗靶物。在一些实施方案中，所述功能性效应器蛋白是TALE效应器。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白共价结合于功能性效应器蛋白，由此形成融合蛋白。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白与功能性效应器蛋白经由接头关联。在一些实施方案中，接头是可切割的接头。在一些实施方案中，所述接头是UV可切割的接头或可通过溶酶体酶切割的接头。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白与功能性效应器蛋白非共价关联，由此形成复合物。在一些实施方案中，超电荷蛋白具有总体净正电荷。在其他实施方案中，超电荷蛋白具有总体净负电荷，且一种或多种蛋白与阳离子脂质关联。在其他实施方案中，超电荷蛋白具有总体净负电荷，且一种或多种蛋白与阳离子聚合物关联。在一些实施方案中，总体净正电荷为约+5至约+40，或总体净负电荷为约-5至约-50。在一些实施方案中，超电荷蛋白在生理pH比其相应未经修饰的蛋白带更多正电荷或带更多负电荷的。在一些实施方案中，相应未经修饰的蛋白是天然存在的蛋白。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白在生理pH比其相应未经修饰的蛋白带多至少+5的正电荷或带多至少-5的负电荷。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白是荧光蛋白。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施方案中，超电荷蛋白是超级带正电荷的GFP。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白是超级带正电荷的GFP(+36GFP)，其包含以下序列的至少20个连续氨基酸残基：GGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK(SEQIDNO:1)。
在一些实施方案中，所述超电荷蛋白包含SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，超电荷蛋白由SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，组合物包含药学可接受的赋形剂。在一些实施方案中，组合物被配置为用于施用给受试者且包含足以有效投递给受试者的至少一个细胞的量的超电荷蛋白和功能性效应器蛋白。在一些实施方案中，组合物包含超电荷蛋白和功能性效应器蛋白，其量足以在施用给受试者后有效诱导可测量的治疗效果。
本公开的一些方面提供组合物，其包含与gRNA和阳离子脂质关联的Cas9蛋白。令人惊讶地发现，当Cas9蛋白与gRNA关联时，复合物可由阳离子脂质包封并有效投递至细胞。这可在有或无超电荷蛋白的情况下完成。在一些实施方案中，所述组合物包含与超级负电荷蛋白(例如超级带负电荷的GFP)和阳离子脂质关联的Cas9蛋白，其也提供对细胞的成功投递。在一些实施方案中，所述组合物在投递至细胞群体时展现出较低的毒性，例如其中至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％或至少99％的细胞在施用组合物后是存活的。在一些实施方案中，所述Cas9蛋白是野生型Cas9蛋白、Cas9切口酶、或包含核酸酶失活(dCas9)蛋白。在一些实施方案中，Cas9蛋白是包含dCas9的融合蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含转录激活物(例如VP64)、转录阻遏物(例如KRAB,SID)、核酸酶域(例如FokI)、重组酶域(例如Hin,Gin或Tn3)、脱氨酶(例如胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶)或表观遗传修饰物域(例如TET1)。
本公开的其他方面提供组合物，其包含与gRNA和阳离子聚合物关联的Cas9蛋白。与具有阳离子脂质的情况相同，当Cas9蛋白与gRNA关联时，该复合物可与阳离子聚合物关联并有效投递至细胞。这可在有或无超电荷蛋白的情况下完成。在一些实施方案中，所述组合物包含与超级负电荷蛋白(例如超级带负电荷的GFP)和阳离子聚合物关联的Cas9蛋白，其也提供对细胞的成功投递。在一些实施方案中，所述组合物在投递至细胞群体时展现出较低的毒性，例如其中至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％或至少99％的细胞在施用组合物后是存活的。在一些实施方案中，所述Cas9蛋白是野生型Cas9蛋白、Cas9切口酶、或包含核酸酶失活(dCas9)蛋白。在一些实施方案中，Cas9蛋白是包含dCas9的融合蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含转录激活物(例如VP64)、转录阻遏物(例如KRAB,SID)、核酸酶域(例如FokI)、重组酶域(例如Hin,Gin或Tn3)、脱氨酶(例如胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶)或表观遗传修饰物域(例如LSD1,TET1)。
本公开的一些方面提供用于将本文提供的组合物施用给受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将本文中描述的组合物施用给受试者。在一些实施方案中，所述受试者易感于或患有或展现出疾病、病症或状况的一种或多种症状。在一些实施方案中，将所述组合物以足以使至少一种迹象或症状作为施用结果改善的量和在适用于使至少一种迹象或症状作为施用结果改善的条件下施用给受试者。在一些实施方案中，施用的步骤在足以使功能性效应器蛋白穿透受试者的细胞的条件下实施。在一些实施方案中，所述疾病、病症或状况与mRNA、蛋白或其组合的异常升高的水平有关。在一些实施方案中，所述组合物包含特异性结合和切割基因组序列的核酸酶，所述序列例如正常或病原性等位基因；与对疾病的易感性或疾病的发作或进展有关的基因；编码病原性RNA或蛋白质的基因；或编码在患病细胞或组织中以异常高水平表达的RNA或蛋白质的基因。在一些实施方案中，施用的步骤包括选自下组的施用路径：口服、静脉内、肌内、动脉内、皮下、心室内、局部、吸入和粘膜投递。
本公开的一些方面提供用于将功能性效应器蛋白引入细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与如本文描述的包含超电荷蛋白和功能性效应器蛋白的组合物在适用于所述功能性效应器蛋白进入细胞的条件下接触，由此将功能性效应器蛋白引入细胞中。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与包含Cas9蛋白和阳离子脂质和/或阳离子聚合物的组合物在适用于使Cas9蛋白进入细胞的条件下接触，由此将Cas9蛋白引入细胞。在一些实施方案中，Cas9蛋白进入细胞的细胞核，例如通过将核定位信号(NLS)包含在蛋白中将Cas9蛋白导向细胞核。在一些实施方案中，所述方法进一步包括确认功能性效应器蛋白(例如包含Cas9)已穿透入细胞。在一些实施方案中，细胞在受试者中，且所述接触是体内完成的。在一些实施方案中，受试者诊断为患有或有风险形成与某基因的异常表达水平有关的疾病，且其中功能性效应器蛋白(例如包含Cas9)调控所述基因的表达水平。在一些实施方案中，所述方法还包括检测基因表达水平的变化或检测受试者中的治疗应答。在一些实施方案中，所述细胞是体细胞。在一些实施方案中，所述细胞与所述组合物或药物组合物在足以诱导细胞的程序化到达期望的细胞命运的量、时间段和条件下接触。在一些实施方案中，所述方法还包括在细胞替换治疗办法中使用经编程的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是携带与疾病有关的基因组等位基因的细胞且功能性效应器蛋白特异性靶向该等位基因。在一些实施方案中，细胞离体接触和在由功能性效应器蛋白成功靶向于不期望的等位基因后重施用给受试者。
本公开的一些方面提供包含如本文中描述的组合物，例如包含与功能性效应器蛋白关联的超电荷蛋白的组合物的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含Cas9蛋白和超电荷蛋白。在一些实施方案中，所述试剂盒包含Cas9蛋白和阳离子脂质。在一些实施方案中，该试剂盒包含Cas9蛋白和阳离子聚合物。在一些实施方案中，该试剂盒还包含用于使用试剂盒中包含的组分的用法说明。
本发明的这些和其他方面和实施方案以及多种优点和效用从本发明的附图和详细描述将变得更明显。
定义
如本文和权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括单数和复数指代物，除非上下文清楚地另外指示。因此，例如对“一个/种药剂”的指代包括单个药剂和多种药剂。
如本文中在两种或更多种模块(例如蛋白质或蛋白质域)的上下文中使用的，术语“与…关联”指模块与另一模块实体直接或经由一个或多个另外的充当连接剂的模块关联或连接以形成以下结构的事实，该结构足够稳定，从而所述模块在使用该结构的条件，例如在生理学条件下保持实体关联。超电荷蛋白可以经由非共价相互作用(例如静电相互作用)与功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)关联。在某些实施方案中，超电荷蛋白可以经由静电相互作用与功能性效应器蛋白关联以形成复合物。在一些实施方案中，充足数量的更弱的相互作用能提供使得模块在多种不同条件下保持实体关联的足够稳定性。在某些实施方案中，超电荷蛋白经由共价键(例如酰胺键)与功能性效应器蛋白关联。在一些实施方案中，功能性效应器蛋白通过肽键与超电荷蛋白直接关联，或经由接头间接关联。
术语“Cas9”或“Cas9核酸酶”指包含Cas9蛋白的RNA导引的核酸酶，或其片段(例如包含Cas9的活性或失活的DNA切割域或部分失活的DNA切割域(例如Cas9“切口酶”)，和/或Cas9的gRNA结合域的蛋白质)。在一些实施方案中，术语“Cas9”指包含Cas9或其片段的融合蛋白。
在一些实施方案中，Cas9指来自以下的Cas9：溃疡棒状杆菌(Corynebacteriumulcerans)(NCBIRefs:NC_015683.1,NC_017317.1)；白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)(NCBIRefs:NC_016782.1,NC_016786.1)；Spiroplasmasyrphidicola(NCBIRef:NC_021284.1)；中间普雷沃菌(Prevotellaintermedia)(NCBIRef:NC_017861.1)；台湾螺原体(Spiroplasmataiwanense)(NCBIRef:NC_021846.1)；海豚链球菌(Streptococcusiniae)(NCBIRef:NC_021314.1)；Belliellabaltica(NCBIRef:NC_018010.1)；扭曲冷弯曲菌(PsychroflexustorquisI)(NCBIRef:NC_018721.1)；嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)(NCBIRef:YP_820832.1)；无害利斯特菌(Listeriainnocua)(NCBIRef:NP_472073.1)；空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)(NCBIRef:YP_002344900.1)；或脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria.meningitidis)(NCBIRef:YP_002342100.1)。
术语“阳离子脂质”指在生理pH具有阳离子或正电荷的脂质。阳离子脂质可采取多种形式，包括但不限于脂质体或微团(micelle)。可用于本公开的某些方面的阳离子脂质是本领域公知的，且一般包含极性和非极性域两者，结合聚阴离子如核酸分子或超负电荷蛋白，且一般已知促进核酸投递到细胞中。可用的阳离子脂质的例子包括聚乙烯亚胺，聚酰胺-胺(polyamidoamine)(PAMAM)starburst树状分子，Lipofectin(DOTMA和DOPE的组合),Lipofectase,(例如2000,3000,RNAiMAX,LTX),SAINT-RED(SynvoluxTherapeutics,GroningenNetherlands),DOPE,Cytofectin(GileadSciences,FosterCity,Calif.)和Eufectins(JBL,SanLuisObispo,Calif.)。例示性阳离子脂质体可从以下制备：N-[1-(2,3-二油氧基(dioleoloxy))-丙基]-N,N,N-三甲基铵氯(DOTMA)，N-[1-(2,3-二油氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基铵硫酸甲酯(DOTAP)，3β-[N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰]胆固醇(DC-Chol)，2,3,-二油氧基-N-[2(精胺羧基氨基(sperminecarboxamido))乙基]-N,N-二甲基-1-丙基三氟乙酸铵(DOSPA)，1,2-双十四烷基氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵；和二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)。阳离子脂质已在本领域中用于投递核酸分子至细胞(参见例如美国专利Nos.5,855,910；5,851,548；5,830,430；5,780,053；5,767,099；8,569,256；8,691,750；8,748,667；8,758,810；8,759,104；8,771,728；Lewis等1996.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:3176；Hope等1998.MolecularMembraneBiology15:1)。另外，其他脂质组合物在本领域中也是已知的，且包括例如美国专利No.4,235,871；美国专利Nos.4,501,728；4,837,028；4,737,323中教导的那些。
如本文中使用的，术语“阳离子聚合物”指具有净正电荷的聚合物。阳离子聚合物是本领域中公知的，且包括以下中描述的那些：Samal等,Cationicpolymersandtheirtherapeuticpotential.ChemSocRev.2012Nov7；41(21):7147-94；公开的美国专利申请U.S.2014/0141487A1,U.S.2014/0141094A1,U.S.2014/0044793A1,U.S.2014/0018404A1,U.S.2014/0005269A1和U.S.2013/0344117A1；和美国专利Nos.8,709,466；8,728,526；8,759,103；和8,790,664；其各自完整内容通过提述并入本文。例示性阳离子聚合物包括但不限于，聚丙烯胺(PAH)；聚乙烯亚胺(PEI)；聚(L-赖氨酸)(PLL)；聚(L-精氨酸)(PLA)；聚乙烯基胺同型或共聚物；聚(乙烯基苯甲基-三-C1-C4-烷基铵盐)；脂肪族或脂肪族二卤化物和脂肪族N,N,N',N'-四-C1-C4-烷基-烯二胺的聚合物；聚(乙烯基吡啶(vinylpyridin))或聚(乙烯基吡啶盐)；聚(N,N-二烯丙基-N,N-二-C1-C4-烷基-卤化铵)；季铵化二-C1-C4-烷基-氨基乙基丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的同型或共聚物；聚QUADTM；聚氨基酰胺；等等。
术语“脱氨酶”指催化脱氨基反应的酶。在一些实施方案中，所述脱氨酶是胞苷脱氨酶，其催化胞苷或脱氧胞苷分别水解脱氨基为尿嘧啶或脱氧尿嘧啶。
如本文中使用的，术语“有效量”指足以引发期望的生物学应答的生物活性试剂/药剂的量。例如，在一些实施方案中，功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)的有效量可以指足以诱导可检测的效果(例如靶位点的切割，靶位点的修饰，基因表达的调控，等等)的蛋白质的量。这类效果可以在适宜的测定法中检测，例如在无细胞测定法中或在靶细胞、组织或受试生物体中。如熟练技术人员将林辉的，药剂(agent)例如功能性效应器蛋白的有效量可以随着多种因素而变化，如例如期望的生物学应答，要靶向的具体等位基因，靶向的基因组、靶位点、细胞或组织，以及使用的超电荷蛋白。
术语“效应器蛋白”指当引入细胞时调控细胞的生物学功能的蛋白，例如修饰细胞中的核酸分子(如切割、脱氨基、重组等等)，或调控基因在细胞中的表达或表达水平(例如增加或降低)。
如本文中使用的，术语“工程化的”指由人设计、产生、制备、合成和/或制造的蛋白质分子、复合物、物质或实体。因此，工程化的产物是不在自然界中存在的产物。在一些实施方案中，工程化的蛋白或组合物，例如与功能性效应器蛋白如核酸酶、Cas9蛋白(包括其变体和融合物)关联的工程化的超电荷蛋白是以下超电荷蛋白，其已设计为满足特定要求或具有特定的期望特征，例如具有指定的净电荷，特异性结合和/或切割或修饰感兴趣的靶序列，具有特定的最小或最大切割或酶活性，和/或具有特定稳定性。
如本文中使用的，术语“表观遗传修饰物(epigeneticmodifier)”指一种蛋白质或其催化域，其具有导致DNA例如染色体DNA的表观遗传修饰的酶活性。表观遗传修饰包括但不限于DNA甲基化和脱甲基化；组蛋白修饰，包括甲基化和脱甲基化(例如单、双和三甲基化)，组蛋白乙酰化和脱乙酰化，以及组蛋白泛素化(ubiquitylation)，磷酸化和类泛素化。
术语“功能蛋白”指处于以下形式的蛋白，其表现出用来表征其的特性和/或活性。
术语“融合蛋白”指包含多个异源蛋白质、蛋白质域或肽的蛋白质，例如超电荷蛋白和功能性效应器蛋白，其经由肽连接彼此关联，从而形成单个氨基酸序列。在某些实施方案中，融合蛋白由基因编码。
术语“基因”具有如其在本领域中所理解的含义。本领域普通技术人员将领会，术语“基因”可以包括基因调控序列(例如启动子、增强子等等)和/或内含子序列。还将领会基因的定义包括对不编码蛋白质而是编码功能性RNA分子(如RNAi试剂、核酶、tRNA等等)的核酸的指代。为了清楚目的，应注意，如本申请中使用的，术语“基因”一般指编码蛋白质的核酸的一部分；该术语可任选地涵盖调控序列，如本领域普通技术人员从上下文将是清楚的。该定义不意图排除术语“基因”对非蛋白编码表达单元的应用，而是为了澄清在大多数情况下，如本文件中使用的术语指编码蛋白的核酸。
术语“分离的”指一种分子、复合物、物质或实体，其已(1)从当初始产生时(在自然界中或在实验背景中)其所关联的至少一些组分分离，和/或(2)由人产生、制备、合成和/或制备。分离的物质和/或实体可与至少约10％,约20％,约30％,约40％,约50％,约60％,约70％,约80％,约90％或更多的其所初始关联的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的试剂/物质是超过约80％,约85％,约90％,约91％,约92％,约93％,约94％,约95％,约96％,约97％,约98％,约99％，或超过约99％纯的。如本文中使用的，如果某物质基本上没有其他组分，则该物质是“纯”的。
如本文中使用的，术语“接头”指连接两个分子或模块例如超电荷蛋白个核酸酶的化学基团或分子。典型地，接头位于以下之间或由以下侧接：两个基团、分子或其他实体，且经由共价键连接每个，从而连接两者。在一些实施方案中，接头包含一个氨基酸或多个氨基酸(例如肽或蛋白质)。在一些实施方案中，接头是有机分子、基团、聚合物或化学模块。在一些实施方案中，接头是可切割的接头，例如该接头包含在暴露于切割活性如UV光或水解酶(如溶酶体蛋白酶)时可切割的键。在一些实施方案中，接头是具有至少1,至少2,至少3,至少4,至少5,至少6,至少7,至少8,至少9,至少10,至少15,至少20,至少25,至少30,至少40,至少50或更多个氨基酸的任意区段(stretch)氨基酸。在一些实施方案中，肽接头包含三肽Gly-Gly-Ser的重复，例如包含序列(GGS)n，其中n代表至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多个重复。在一些实施方案中，接头包含序列(GGS)6(SEQIDNO:2)。在一些实施方案中，肽接头是16残基的“XTEN”接头或其变体(参见例如Schellenberger等Arecombinantpolypeptideextendstheinvivohalf-lifeofpeptidesandproteinsinatunablemanner.Nat.Biotechnol.27,1186–1190(2009))。在一些实施方案中，XTEN接头包含序列SGSETPGTSESATPES(SEQIDNO:3),SGSETPGTSESA(SEQIDNO:4)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS(SEQIDNO:5)。在一些实施方案中，肽接头是选自以下的一种或多种：VPFLLEPDNINGKTC(SEQIDNO:6),GSAGSAAGSGEF(SEQIDNO:7),SIVAQLSRPDPA(SEQIDNO:8),MKIIEQLPSA(SEQIDNO:9),VRHKLKRVGS(SEQIDNO:10),GHGTGSTGSGSS(SEQIDNO:11),MSRPDPA(SEQIDNO:12)；或GGSM(SEQIDNO:13)。
术语“核酸酶”，如本文中使用的，指能切割连接核酸分子中的核苷酸残基的磷酸二酯键的试剂，例如蛋白质或小分子。在一些实施方案中，核酸酶是蛋白质，例如能结合核酸分子和切割连接核酸分子中的核苷酸残基的磷酸二酯键的酶。核酸酶可以是内切核酸酶，其切割多核苷酸链中的磷酸二酯键，或者是外切核酸酶，其切割在多核苷酸链末端处的磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸酶是位点特异性核酸酶，其结合和/或切割特定核苷酸序列内的特定磷酸二酯键，该核苷酸序列在本文中亦称为“识别序列”、“核酸酶靶位点”或“靶位点”。在一些实施方案中，核酸酶识别单链的靶位点，而在其他实施方案中，核酸酶识别双链的靶位点，例如双链的DNA靶位点。许多天然存在的核酸酶例如许多天然存在的DNA限制核酸酶的靶位点是本领域技术人员公知的。在许多情况中，DNA核酸酶如EcoRI、HindIII或BamHI识别长度为4至10个碱基对的回文双链DNA靶位点，并在该靶位点内的特定位置处切割两条DNA链的每条。一些内切核酸酶对称地切割双链核酸靶位点，即在相同位置切割两条链，从而使得末端包含碱基配对的核苷酸，在本文中也称为平末端。其他内切核酸酶不对称地切割双链核酸靶位点，即在不同位置切割每条链，从而使得末端包含不配对的核苷酸。双链DNA分子的末端处不配对的核苷酸也称为“突出”，例如“5′-突出”或“3′-突出”，根据不配对的核苷酸形成的是相应DNA链的5′还是3′端。以不配对核苷酸为末端的双链DNA分子端也称为粘端，因此它们能“黏着于”包含互补的不配对核苷酸的其他双链DNA分子端。核酸酶蛋白通常包含介导蛋白与核酸底物的相互作用的“结合域”和催化核酸骨架内的磷酸二酯键的切割的“切割域”。在一些实施方案中，核酸酶蛋白能以单体形式结合和切割核酸分子，而在其他实施方案中，核酸酶蛋白必须二聚化或多聚化以切割靶核酸分子。天然存在的核酸酶的结合域和切割域，以及能组合以创建结合特定靶位点的核酸酶的模式结合域和切割域，是本领域技术人员公知的。例如，转录激活物样元件可用作结合域以特异性结合期望的靶位点，并融合或缀合于切割域，例如FokI的切割域，以创造切割期望靶位点的工程化的核酸酶。
术语“核酸”和“核酸分子”，如本文中可交换使用的，指包含核苷、核苷酸或核苷酸聚合物的化合物。通常地，聚合核酸，例如包含3个或更多个核苷酸的核酸分子是线性分子，其中相邻的核苷酸经由磷酸二酯键彼此连接。在一些实施方案中，“核酸”指单个核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”指包含3个或更多个个体核苷酸残基的寡核苷酸链。如本文中使用的，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以交换使用以指核苷酸的聚合物(例如至少3个核苷酸的串)。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA。核酸可以是天然存在的，例如在基因组、转录本、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、质粒、粘粒、染色体、染色单体、或其他天然存在的核酸分子的背景中。在另一方面，核酸分子可以是非天然存在的分子，例如重组的DNA或RNA，人工染色体，工程化的基因组，或其片段，或合成的DNA、RNA、DNA/RNA杂合体，或包含非天然存在的核苷酸或核苷。例如，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即具有磷酸二酯骨架以外的形式的类似物。可从天然来源纯化核酸，使用重组表达系统产生，并任选地纯化，化学合成等等。在适宜时，例如在化学合成的分子的情况中，核酸可以包含核苷类似物如具有经化学修饰的碱基或糖和骨架修饰的类似物。除非另外说明，核酸序列以5′至3′方向呈现。在一些实施方案中，核酸是或包含天然的核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔-尿苷、C5-丙炔-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷(deazaadenosine)、7-脱氮尿苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)；插入的碱基；经修饰的糖(例如2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸根基团(例如硫代磷酸酯和5′-N-亚磷酰胺连接)。
术语“药物组合物”，如本文中使用的，指在疾病或病症治疗的背景中可施用给受试者的组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含活性成分，例如与功能性效应器蛋白如核酸酶关联的超电荷蛋白或编码超电荷蛋白和功能性效应器蛋白(例如以融合蛋白的形式)的核酸，和药学可接受的赋形剂。
如本文中使用的，术语“生理学pH”指在正常、非病理细胞或受试者中可见的pH值。在一些实施方案中，生理学pH为pH5–8之间。在一些实施方案中，生理学pH是pH7-7.5，例如pH7.0,pH7.1,pH7.2,pH7.3,pH7.4或pH7.5。在一些实施方案中，生理学pH是pH6.5-7.5。在一些实施方案中，生理学pH是pH5,pH5.5,pH6,pH6.5,pH7,pH7.5或pH8。
术语“预防”或“防止”指对有风险形成疾病、病症或状况的受试者(例如相比于对照受试者或对照受试者组有升高的风险，或相比于年龄匹配和/或性别匹配的受试者的平均风险有升高的风险)的防护性治疗，其导致受试者形成所述疾病、病症或状况的可能性的降低(如相比于无预防时的可能性)，和/或抑制已经建立的病症的进一步进展。
术语“增殖性疾病”，如本文中使用的，指其中由于细胞或细胞群体展现出异常升高的增殖率而细胞或组织内稳态被扰乱的任何疾病。增殖性疾病包括增殖过多疾病，如赘生前增生状况和赘生性(neoplastic)疾病。赘生性疾病特征在于细胞的异常增殖且包括良性和恶性赘生物形成。恶性赘生物形成也称为癌症。
术语“蛋白质”在本文中可与术语“肽”和“多肽”交换使用，且指通过肽(酰胺)键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。该术语指任意大小、结构或功能的蛋白质、肽或多肽。通常地，蛋白质、肽或多肽长度将至少为3个氨基酸。蛋白质、肽或多肽可以指个体蛋白质或蛋白质的集合。可以修饰蛋白质、肽或多肽中的一个或多个氨基酸，例如通过添加化学实体如糖基团、羟基基团、磷酸基团、法呢基(farnesyl)基团、异法呢基基团、脂肪酸基团、用于缀合的接头，功能化，或其他修饰等等。蛋白质、肽或多肽还可以是单分子或可以是多分子复合物。蛋白质、肽或多肽可以仅是天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质、肽或多肽可以是天然存在的、重组的或合成的，或其任意组合。蛋白质可以包含不同的域，例如TALE效应器蛋白可以包含核酸结合域和效应器域，例如核酸切割域或转录激活物或阻遏物域。在一些实施方案中，蛋白质包含蛋白质性部分，例如构成核酸结合域的氨基酸序列，和有机化合物，例如可充当核酸切割剂的化合物。
术语“可RNA编程的核酸酶”和“RNA导引的核酸酶”在本文中可交换使用且指与一种或多种不是切割靶物的RNA形成复合物(例如结合或关联)的核酸酶。在一些实施方案中，可RNA编程的核酸酶在与RNA复合时可以称为核酸酶:RNA复合物。可RNA编程的核酸酶包括Cas9。通常，结合的一种或多种RNA称为导引RNA(gRNA)。以单RNA分子存在的gRNA可称为单导引RNA(sgRNA)，不过“gRNA”可交换使用以指作为单分子或作为两个或更多分子的复合物存在的导引RNA。单RNA分子存在的gRNA通常包含两个域：(1)与靶核酸共享同源性的域(例如，指导Cas9复合物对靶物的结合)；和(2)结合Cas9蛋白的域。gRNA包含与靶位点互补的核苷酸序列，其介导核酸酶/RNA复合物对所述靶位点的结合并提供核酸酶:RNA复合物的序列特异性。
如本文中使用的，术语“重组酶”指一种位点特异性酶，其介导重组酶识别序列之间的DNA的重组，导致重组酶识别序列之间的DNA片段的切除、整合、倒置或交换(例如易位)。重组酶可分类为两个不同的家族：丝氨酸重组酶(例如解离酶和转化酶)和酪氨酸重组酶(例如整合酶)。丝氨酸重组酶的例子包括但不限于，Hin,Gin,Tn3,β-six,CinH,ParA,γδ,Bxb1,C31,TP901,TG1,R4,MR11,A118,U153和gp29。酪氨酸重组酶的例子包括但不限于，Cre,FLP,R,Lambda,HK101,HK022和pSAM2。丝氨酸和酪氨酸重组酶名称来自重组酶用于攻击DNA且在链交换期间变为共价连接于DNA的保守的亲核氨基酸残基。重组酶具有众多应用，包括创建基因敲除/敲入和基因疗法应用。参见，例如Brown等,“Serinerecombinasesastoolsforgenomeengineering.”Methods.2011；53(4):372-9；Hirano等,“Site-specificrecombinasesastoolsforheterologousgeneintegration.”Appl.Microbiol.Biotechnol.2011；92(2):227-39；Chavez和Calos,“TherapeuticapplicationsoftheΦC31integrasesystem.”Curr.GeneTher.2011；11(5):375-81；Turan和Bode,“Site-specificrecombinases:fromtag-and-target-totag-and-exchange-basedgenomicmodifications.”FASEBJ.2011；25(12):4088-107；Venken和Bellen,“Genome-widemanipulationsofDrosophilamelanogasterwithtransposons,Flprecombinase,andΦC31integrase.”MethodsMol.Biol.2012；859:203-28；Murphy,“Phagerecombinasesandtheirapplications.”Adv.VirusRes.2012；83:367-414；Zhang等,“Conditionalgenemanipulation:Cre-atinganewbiologicalera.”J.ZhejiangUniv.Sci.B.2012；13(7):511-24；Karpenshif和Bernstein,“Fromyeasttomammals:recentadvancesingeneticcontrolofhomologousrecombination.”DNARepair(Amst).2012；1；11(10):781-8；其各自全部内容通过提述完整并入本文。本文中提供的重组酶不意为仅指可在本发明的实施方案中使用的重组酶的例子。本发明的方法和组合物可通过挖掘数据库中的新直系同源重组酶或设计具有限定的DNA特异性的合成重组酶来扩展(参见，例如Groth等,“Phageintegrases:biologyandapplications.”J.Mol.Biol.2004；335,667-678；Gordley等,“Synthesisofprogrammableintegrases.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2009；106,5053-5058；其各自全部内容通过提述完整并入本文)。可用于本文中描述的方法和组合物的重组酶的其他例子是本领域技术人员已知的，且预期发现或生成的任何新的重组酶都能用于本发明的不同实施方案中。在一些实施方案中，重组酶(或其催化域)融合于Cas9蛋白(例如dCas9)。
术语“重组”，在核酸修饰(例如基因组修饰)的背景中，用于指通过重组酶蛋白的作用修饰两种或更多种核酸分子，或单个核酸分子的两个或更多个区域的过程。重组可导致例如一个或多个核酸分子中或之间的核酸序列的插入、倒置、切除或易位。
如本文中使用的，术语“受试者”，指个体生物。在一些实施方案中，受试者是处于任何发育阶段的任意性别的人。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是非人灵长类。在一些实施方案中，受试者是啮齿动物。在一些实施方案中，受试者是实验室动物，例如小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、鱼、蛙或蝇。在一些实施方案中，受试者是农场动物，例如绵羊、山羊、猪或牛。在一些实施方案中，受试者是伴侣动物，例如猫或犬。在一些实施方案中，受试者是脊椎动物、两栖动物、爬行动物、鱼、昆虫、蝇或线虫。在一些实施方案中，受试者是经遗传工程化的，例如经遗传工程化的非人受试者。
术语“超电荷”指导致蛋白质总体净电荷的增加或降低的蛋白质的任意修饰。修饰包括但不限于，氨基酸序列的改变或带电荷模块的添加(例如羧酸基团，磷酸根基团，硫酸根基团，氨基基团)。超电荷还指试剂/药剂与带电荷的蛋白质(天然存在或经修饰的)联合以形成相对于单独的试剂/药剂具有增加或降低的电荷的复合物。
术语“靶位点”，如本文中在结合核酸分子的功能性效应器蛋白(如核酸酶和转录激活物或阻遏物)的背景中使用的，指核酸分子内的序列，其被效应器蛋白结合和作用，例如被核酸酶切割或分别被转录激活物或阻遏物转录激活或抑制。靶位点可以是单链或双链的。在RNA导引的(例如可RNA编程的)核酸酶(例如Cas9)的背景中，靶位点通常包含与可RNA编程的核酸酶的sgRNA互补的核苷酸序列，和在临近gRNA互补性序列的3′端处的原间隔区临近基序(PAM)。对于RNA导引的核酸酶Cas9(或具有gRNA结合活性的变体或融合物)，所述靶位点在一些实施方案中可以是20个碱基对加上3碱基对PAM(例如NNN，其中N代表任意核苷酸)。通常地，PAM的第一个核苷酸可以是任意核苷酸，而两个下游核苷酸根据具体的RNA导引的核酸酶指定。RNA导引的核酸酶如Cas9的例示性靶位点是本领域技术人员已知的，且包括但不限于，NNG,NGN,NAG和NGG，其中N代表任意核苷酸。另外，来自不同物种(例如嗜热链球菌(S.thermophilus)而非酿脓链球菌(S.pyogenes))的Cas9核酸酶识别包含序列NGGNG的PAM。已知另外的PAM序列，包括但不限于NNAGAAW和NAAR(参见，例如Esvelt和Wang,MolecularSystemsBiology,9:641(2013)，其完整内容通过提述并入本文)。例如，RNA导引的核酸酶如例如Cas9的靶位点可以包含结构[NZ]-[PAM]，其中每个N独立地为任意核苷酸，且Z是1至50的整数。在一些实施方案中，Z为至少2,至少3,至少4,至少5,至少6,至少7,至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少25,至少30,至少35,至少40,至少45或至少50。在一些实施方案中，Z为5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49或50。在一些实施方案中，Z为20。在一些实施方案中，“靶位点”还可以指被核酸酶结合但不被其切割的核酸分子内的序列。例如，本文中描述的某些实施方案提供包含无活性(或失活)Cas9DNA切割域的蛋白。这类蛋白(例如当还包含Cas9RNA结合域时)能结合gRNA指定的靶位点，然而由于DNA切割位点是失活的，因此靶位点不被具体蛋白切割。然而，如本文中描述的这类蛋白质通常与另一蛋白(例如核酸酶、转录激活物、重组酶、脱氨酶，等等)或分子缀合、融合或结合，所述另一蛋白或分子介导核酸分子的修饰。在一些实施方案中，实际切割的序列将依赖于介导核酸分子切割的蛋白(例如核酸酶)或分子，且例如在一些情况中，将与失活的一种或多种Cas9蛋白结合的近端或所相距距离。在二聚化的核酸酶，例如包含失活Cas9(或Cas9RNA结合域)和DNA切割域(例如FokI切割域或活性Cas9切割域)的蛋白二聚体的背景中，靶位点通常包含左半位点(由一个蛋白结合)、右半位点(由第二蛋白结合)，和其中进行切割的两个各半位点之间的间隔序列。在一些实施方案中，切割左半位点或右半位点(而非间隔序列)。该结构([左半位点]-[间隔序列]-[右半位点])在本文中称为LSR结构。在一些实施方案中，左半位点和/或右半位点对应于RNA导引的靶位点(例如Cas9靶位点)。在一些实施方案中，两个半位点之一或两者比Cas9靶向的典型区域更短或更长，例如短于或长于20个核苷酸。在一些实施方案中，左和右半位点包含不同的核酸序列。在一些实施方案中，靶位点是包含三(3)个RNA导引的核酸酶靶位点序列的序列，例如3个对应于Cas9靶位点序列的序列，其中第一和第二，以及第二和第三Cas9靶位点序列由间隔序列分开。在一些实施方案中，间隔序列长至少5,至少6,至少7,至少8,至少9,至少10,至少11,至少12,至少13,至少14,至少15,至少16,至少17,至少18,至少19,至少20,至少25,至少30,至少35,至少40,至少45,至少50,至少60,至少70,至少80,至少90,至少100,至少125,至少150,至少175,至少200或至少250bp。
术语“转录激活物”和“转录阻遏物”指结合靶核酸序列且导致与靶核酸序列有关的基因产物的表达水平分别增加或降低的物质/试剂，如蛋白质(例如转录因子或其片段)。例如，如果靶核酸序列位于基因的调控区内，则转录激活物导致由该基因编码的基因产物的表达水平增加(相反，转录阻遏物导致由基因编码的基因产物的表达水平降低)。所述基因产物可以是从基因转录的RNA(例如mRNA)或从自基因转录的mRNA翻译的多肽。通常mRNA水平中的增加或降低导致从其翻译的多肽水平的增加或降低。可以使用测量mRNA或蛋白的标准技术来测定表达水平。
术语“转录激活物样效应子”(TALE)，如本文中使用的，指包含DNA结合域的效应器蛋白，该DNA结合域含有高度保守的33-34氨基酸序列，该序列包含高度可变的两氨基酸基序(重复可变二残基，RepeatVariableDiresidue,RVD)。RVD基序决定对核酸序列的结合特异性，且可以依照本领域技术人员公知的方法工程化以特异性结合期望的DNA序列(参见，例如Miller,Jeffrey；等(February2011).“ATALEnucleasearchitectureforefficientgenomeediting”.NatureBiotechnology29(2):143–8；Zhang,Feng；等(February2011).”Efficientconstructionofsequence-specificTALeffectorsformodulatingmammaliantranscription”.NatureBiotechnology29(2):149–53；Geiβler,R.；Scholze,H.；Hahn,S.；Streubel,J.；Bonas,U.；Behrens,S.E.；Boch,J.(2011),Shiu,Shin-Han.编“TranscriptionalActivatorsofHumanGeneswithProgrammableDNA-Specificity”.PLoSONE6(5):e19509；Boch,Jens(February2011).“TALEsofgenometargeting”.NatureBiotechnology29(2):135–6；Boch,Jens；等(December2009).“BreakingtheCodeofDNABindingSpecificityofTAL-TypeIIIEffectors”.Science326(5959):1509–12；和Moscou,MatthewJ.；AdamJ.Bogdanove(December2009).“ASimpleCipherGovernsDNARecognitionbyTALEffectors”.Science326(5959):1501；其各自完整内容通过提述并入本文)。氨基酸序列和DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适宜RVD的重复区段的组合来工程化特定的DNA结合域。TALE效应器蛋白包括但不限于，TALE核酸酶(TALEN)和TALE转录激活物和阻遏物。
术语“转录激活物样元件核酸酶”(TALEN)，如本文中使用的，指包含针对DNA切割域例如FokI域的转录激活物样效应子DNA结合域的人工核酸酶。已报道了一些用于生成工程化的TALE构建体的模式装配方案(Zhang,Feng；等(February2011).”Efficientconstructionofsequence-specificTALeffectorsformodulatingmammaliantranscription”.NatureBiotechnology29(2):149–53；Geiβler,R.；Scholze,H.；Hahn,S.；Streubel,J.；Bonas,U.；Behrens,S.E.；Boch,J.(2011),Shiu,Shin-Han.编“TranscriptionalActivatorsofHumanGeneswithProgrammableDNA-Specificity”.PLoSONE6(5):e19509；Cermak,T.；Doyle,E.L.；Christian,M.；Wang,L.；Zhang,Y.；Schmidt,C.；Baller,J.A.；Somia,N.V.等(2011).“EfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector-basedconstructsforDNAtargeting”.NucleicAcidsResearch；Morbitzer,R.；Elsaesser,J.；Hausner,J.；Lahaye,T.(2011).“AssemblyofcustomTALE-typeDNAbindingdomainsbymodularcloning”.NucleicAcidsResearch；Li,T.；Huang,S.；Zhao,X.；Wright,D.A.；Carpenter,S.；Spalding,M.H.；Weeks,D.P.；Yang,B.(2011).“ModularlyassembleddesignerTALeffectornucleasesfortargetedgeneknockoutandgenereplacementineukaryotes”.NucleicAcidsResearch.；Weber,E.；Gruetzner,R.；Werner,S.；Engler,C.；Marillonnet,S.(2011).Bendahmane,Mohammed.编“AssemblyofDesignerTALEffectorsbyGoldenGateCloning”.PLoSONE6(5):e19722；其各自内容通过提述并入本文)。
术语“转录阻遏物”指结合靶核酸序列且导致与该靶核酸序列有关的基因产物的表达水平降低的转录因子，例如蛋白质。例如，如果靶核酸序列位于基因的调控区内，则转录阻遏物导致由该基因编码的基因产物表达水平的降低。所述基因产物可以是从基因转录的RNA(例如mRNA)或从自基因转录的mRNA翻译的多肽。通常mRNA水平中的降低导致从其翻译的多肽水平的降低。可以使用测量mRNA或蛋白的标准技术来测定表达水平。
术语“锌指核酸酶”，如本文中使用的，指包含缀合于结合域的核酸切割域的核酸酶，所述结合域包含锌指阵列。在一些实施方案中，切割域是II型限制内切核酸酶FokI的切割域。锌指核酸酶可以设计为靶向给定核酸分子中用于切割的实际上任意期望的序列，且设计锌指结合域结合复杂基因组背景中的独特位点的可能性允许对活细胞中单个基因组位点的靶向性切割，例如以实现具有治疗价值的靶向性基因组改变。将双链断裂靶向至期望的基因组基因座可用于将移码突变(frame-shiftmutation)引入基因的编码序列中，这是由非同源DNA修复途径的易错性质所致。可通过本领域技术人员公知的方法生成锌指核酸酶以靶向感兴趣的位点。例如，可以设计具有期望特异性的锌指结合域，其通过组合具有已知特异性的个体锌指基序。结合DNA的锌指蛋白Zif268的结构已显示了本领域中的很多工作，且已描述了对于64种可能的碱基对三联体的每种，获得锌指然后混合和匹配这些模式锌指来设计具有任何期望的序列特异性的蛋白质的思路(PavletichNP,PaboCO(May1991).“Zincfinger-DNArecognition:crystalstructureofaZif268-DNAcomplexat2.1A”.Science252(5007):809–17，其完整内容通过提述并入本文)。在一些实施方案中，组合各自识别3碱基对DNA序列的分别的锌指以生成识别长度范围从9碱基对至18碱基对的靶位点的3、4、5或6锌指阵列。在一些实施方案中，涵盖更长的阵列。在其他实施方案中，组合识别6-8个核苷酸的2锌指模块以生成4-,6-或8-锌指阵列。在一些实施方案中，利用细菌或噬菌体展示来开发识别期望核酸序列，例如长度为3-30bp的期望核酸酶靶位点的锌指域。在一些实施方案中，锌指核酸酶包含融合或者经由接头(例如多肽接头)彼此缀合的锌指结合域和切割域。接头的长度决定切割离锌指域结合的核酸序列的距离。如果使用较短的接头，那么切割域将切割更接近结合的核酸序列的核酸，而更长的接头将导致切割与结合的核酸序列之间的更大的距离。在一些实施方案中，锌指核酸酶的切割域必须二聚化以切割结合的核酸。在一些这类实施方案中，二聚体是两个单体的异二聚体，其各自包含不同的锌指结合域。例如在一些实施方案中，二聚体可以包含包括缀合于FokI切割域的锌指域A的一个单体，和包含缀合于FokI切割域的锌指域B的一个单体。在该非限制性例子中，锌指域A在靶位点的一侧结合核酸序列，锌指域B在靶位点的另一侧结合核酸序列，且二聚化FokI域切割锌指域结合位点之间的核酸。
术语“锌指”，如本文中使用的，指小核酸结合蛋白结构基序，其特征在于折叠和稳定该折叠的一个或多个锌离子的配位。锌指涵盖很多种不同的蛋白结构(参见，例如KlugA,RhodesD(1987).“Zincfingers:anovelproteinfoldfornucleicacidrecognition”.ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol.52:473–82，其完整内容通过提述并入本文)。锌指可以设计为结合核苷酸的特定序列，且包含一系列锌指的融合物的锌指阵列可以设计为结合实际上任何期望的靶序列。这类锌指阵列可以形成蛋白质例如核酸酶的结合域，例如如果缀合于核酸切割域时。不同类型的锌指基序是本领域技术人员已知的，包括但不限于Cys2His2、Gag指节(knuckle)、Trebleclef、锌带(Zincribbon)、Zn2/Cys6和TAZ2域样基序(参见，例如KrishnaSS,MajumdarI,GrishinNV(January2003).“StructuralclassificationofZincfingers:surveyandsummary”.NucleicAcidsRes.31(2):532–50)。单个锌指基序通常结合核酸分子的3或4个核苷酸。因此，包含2个锌指基序的锌指域可以结合6-8个核苷酸，包含3个锌指基序的锌指域可以结合9-12个核苷酸，包含4个锌指基序的锌指域可以结合12-16个核苷酸，如此类推。可以采用任何适宜的蛋白质工程化技术来改变锌指的DNA结合特异性和/或设计新的锌指融合物来结合实际上任何期望的长度从3–30个核苷酸的靶序列(参见，例如PaboCO,PeisachE,GrantRA(2001).“Designandselectionofnovelcys2His2Zincfingerproteins”.AnnualReviewofBiochemistry70:313–340；JamiesonAC,MillerJC,PaboCO(2003).“Drugdiscoverywithengineeredzinc-fingerproteins”.NatureReviewsDrugDiscovery2(5):361–368；andLiuQ,SegalDJ,GhiaraJB,BarbasCF(May1997).“Designofpolydactylzinc-fingerproteinsforuniqueaddressingwithincomplexgenomes”.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(11)；其各自完整内容通过提述并入本文)。工程化的锌指阵列和切割核酸的蛋白质域之间的融合物可用于生成“锌指核酸酶”。锌指核酸酶通常包含结合核酸分子内的特定靶位点的锌指域，和切割在由结合域结合的靶位点内或附近处的核酸分子的核酸切割域。典型的工程化的锌指核酸酶包含结合域，其具有3至6个个体锌指基序和长度范围从9个碱基对至18个碱基对的结合靶位点。更长的靶位点在期望结合和切割在给定基因组中是独特的靶位点的情况下特别有吸引力。
术语“治疗/处理”指目的为如本文中描述的疾病或病症或其一种或多种症状的逆转、减轻、延迟其发作、或抑制其进展的临床干预。如本文中使用的，术语“治疗/处理”指目的为如本文中描述的疾病或病症或其一种或多种症状的逆转、减轻、延迟其发作、或抑制其进展的临床干预。在一些实施方案中，治疗可以在一种或多种症状已形成和/或已诊断出疾病后施用。在其他实施方案中，治疗可以在不存在症状的情况下施用，例如以预防或延迟症状的发作或抑制疾病的发作或进展。例如，治疗可以在症状发作之前对易感个体施用(例如根据症状史和/或根据遗传或其他易感性因素)。治疗还可以在症状已消退后持续，例如以预防或延迟其复发。
附图简述
图1。大分子投递到哺乳动物细胞内的示意图。
图2。编程的脂肪细胞命运：从白色脂肪组织(WAT)转换为棕色脂肪组织(BAT)。
图3。使用超电荷的投递平台投递编程为靶向PPARγ或PRDM16的TALE激活物。
图4。包含+36GFP融合物、18.5聚体TALE域和VP64激活域的融合蛋白的示意图。
图5。+36GFP-TALE激活物融合蛋白的表达和纯化。
图6。在投递+36GFPPPARγ和PRDM16TALE激活物融合蛋白后测试脂肪细胞调控基因的激活。
图7。+36GFPTALE激活物融合蛋白在不同浓度的投递功效。
图8。两种不同的+36GFP-PRDM16TALE融合蛋白在NIH3T3细胞中的投递功效的比较。
图9。PPARγ-TALE激活物的融合物投递后PPARγ的基因表达和与多种对照的比较。
图10。RDM16-TALE激活物的融合物投递后PRDM16的基因表达和与多种对照的比较。
图11。在存在血清时观察到适中的TALE活性。
图12。验证PPARγ的病毒投递继之以用脂肪生成混合物(cocktail)的7天处理。图13。用于将成纤维细胞编程为WAT和BAT的测定法的示意图。
图14。用+36GFPTALE激活物融合蛋白处理后观察到的脂肪细胞形成。
图15。多种处理7天后用脂质TOX红染色显示在病毒投递之后以及在超电荷的PPARγTALE激活物融合蛋白投递之后脂肪细胞的形成。
图16。多种处理7天后用脂质TOX红染色显示在病毒投递之后以及在超电荷的PPARγTALE激活物融合蛋白投递之后脂肪细胞的形成。
图17。在病毒投递之后以及在超电荷的PPARγTALE激活物融合蛋白投递之后WAT生物标志物基因的表达。
图18。投递超电荷的PRDM16TALE激活物融合蛋白以体内诱导棕色脂肪的脂肪细胞。在PPARγ和PRDM16的病毒投递之后以及在超电荷的TALE激活物蛋白的融合物投递之后观察到有力的脂肪细胞形成。
图19。通过PPARγ和PRDM16的表达比较棕色脂肪标志物的TALE/TALE、病毒/TALE和病毒/病毒诱导的表达。
图20。RT-qPCR评估与通过脂质TOX染色观察到的脂肪细胞分化一致。
图21。将功能性TALE激活物融合蛋白作为与+36GFP的复合物投递改进了投递后TALE激活物的活性。
图22。在以融合物(+36GFPPRDM16TALE-3)或与+36GFP的复合物(+36GFP+PRDM16TALE-3)进行TALE激活物的融合物投递后的PRDM16基因表达。复合物的投递倾向于增加TALE激活物活性。
图23。Aurein肽与+36GFP融合对TALE激活物融合物投递(以融合物或与+36GFP的复合物)后PRDM16基因表达的影响。
图24。以融合物(+36GFPPRDM16TALE-3)或与LipofectamineLTX的复合物(+36GFP+PRDM16TALE-3)进行TALE激活物融合物投递后的PRDM16基因表达。
图25。将超电荷的融合蛋白或与Cas9的复合物投递到哺乳动物细胞中。(GGS)9-T-ALAL-PKKKRKV对应于SEQIDNO:251。
图26。野生型Cas9蛋白和具有+36GFP和Aurein-GGS9的Cas9融合蛋白的纯化。
图27A-B.显示了用于将蛋白质投递到哺乳动物细胞中的策略，其通过与聚阴离子大分子融合或非共价复合和用阳离子脂质包封。图27(A)显示重组酶，转录激活物样效应器(TALE)蛋白和Cas9内切核酸酶结合核酸且天然是阳离子(理论净电荷显示为黑色)且未被阳离子脂质有效包封。然而，这些蛋白质可通过融合于超级带负电荷的蛋白如(–30)GFP，或通过与聚阴离子核酸复合使其成为高度阴离子性的。图27(B)显示代表通常用于转染DNA和RNA包封所得高度阴离子性蛋白或蛋白:核酸复合物，介导其投递到哺乳细胞中的阳离子脂质。
图28A-F.Cre重组酶对培养的人细胞的投递。在图28(A)中，显示了高度阳离子(+36)GFP或高度阴离子(–30)GFP对Cre重组酶的融合。使用在Cre介导的重组时表达DsRed的HeLa报道细胞系来评估Cre投递功效；(GGS)9对应于SEQIDNO:252和His6对应于SEQIDNO:253。在图28(B)中，将HeLadsRed细胞用10nM(–30)GFP-Cre和阳离子脂质RNAiMAX处理。在含有10％胎牛血清(FBS)的培养基中温育48小时后使细胞可见。图28(C)显示在10％FBS培养基或在无血清培养基中投递(+36)GFP-Cre，和在全血清培养基中在有或无阳离子脂质RNAiMAX的情况下投递(–30)GFP-Cre。图28(D)呈现了48小时后在含有10％FBS的275μL培养基中，阳离子脂质剂量对于功能性(–30)GFP-Cre投递功效的影响。图28(E)是几种商品化的阳离子脂质和聚合物对于(–30)dGFP-Cre的功能投递功效的比较。图28(F)显示融合于Cre的多种阴离子肽或蛋白质序列的RNAiMAX介导的投递。误差条反映来自在不同日实施的3个生物重复的标准偏差。
图29A-B.TALE转录激活物投递到培养的人细胞中。图29(A)显示18.5个重复的TALE激活物的设计，其C末端融合于VP64激活域而N末端融合于(–30)GFP和NLS；(GGS)9对应于SEQIDNO:251和His6对应于SEQIDNO:252。融合物的总体净理论电荷为–43。图29(B)显示了对NTF3转录的激活，其通过编码靶向NTF3基因中位点的TALE-VP64激活物的质粒的传统转染，或通过相应NTF3靶向性(–30)GFP-TALE-VP64蛋白的RNAiMAX阳离子脂质介导的投递。通过qRT-PCR测量基因表达水平并相对于GAPDH表达水平标准化。误差条反映来自在不同日实施的3个生物重复的标准偏差。
图30A-E.Cas9:sgRNA、Cas9D10A切口酶、和dCas9-VP64转录激活物投递到培养的人细胞中。图30(A)显示将与EGFP靶向性sgRNA或VEGF靶向性sgRNA复合的Cas9蛋白变体以阳离子脂质介导的方式投递到U2OSEGFP报道细胞中。将结果与标准转染Cas9和sgRNA表达质粒的结果比较。图30(B)显示采用T7内切核酸酶I(T7EI)测定法测量来自以下处理的EGFP修饰的结果：无处理(第1道)，仅用EGFP靶向性sgRNA(第2道)，仅Cas9蛋白(第3道)，Cas9蛋白+VEGF靶向性sgRNA+RNAiMAX(第4道)，转染表达Cas9和EGFP靶向性sgRNA的质粒(第5道)，或Cas9蛋白+EGFP靶向性sgRNA+RNAiMAX(第6道)。通过密度测定计算的Indel效率显示在凝胶图像下方。图30(C)呈现了使用与4种sgRNA和RNAiMAX复合的Cas9的单投递，在EGFP和3种内源基因处基因组修饰的T7EI测定法的结果。通过密度测定计算的Indel效率显示在凝胶图像下方。图30(D)显示Cas9D10A切口酶和sgRNA对的投递，其通过质粒转染或RNAiMAX介导的蛋白质:RNA复合物投递。预期破坏EGFP的sgRNAsGFPg1+GFPg5或GFPg3+GFPg7导致基因破坏，而GFPg5+GFPg7靶向同一链，因此预期是非功能性的。图30(E)显示靶向NTF3的催化性死亡的(dCas9)-VP64转录激活物的投递，其通过质粒转染或RNAiMAX介导的蛋白质投递。VEGFg3和VEGFg5sgRNA两者的投递充当NTF3基因失活的阴性对照。误差条反映来自在不同日实施的6个生物重复的标准偏差。
图31A-B.显示了通过质粒转染或阳离子脂质介导的蛋白质:sgRNA投递，在培养的人细胞中Cas9介导的内源性基因切割的DNA序列特异性。在图31(A)中，对于内源性CLTA,EMX和VEGF基因的在靶(on-target)修饰实施T7EI测定法。在图31(B-D)中，显示了对于质粒转染或阳离子脂质介导的蛋白质:sgRNA投递，来自Cas9:sgRNA的在靶:脱靶(off-target)DNA修饰比率。调整每次处理的条件以产生～10％在靶切割，从而实现对在在靶基因修饰效率可比的条件下两种投递方法之间的DNA切割特异性的比较。P值列于表2。对每份在靶和脱靶样品测序一次，其中每份在靶样品有>10,000个分析的序列，和每份脱靶样品平均有>111,000个分析的序列(表2)。
图32A-D.显示了Cre重组酶和Cas9:sgRNA复合物对小鼠内耳中毛细胞的体内投递。在图32(A)中，将P0floxP-tdTomato小鼠(n＝4)的中阶(scalamedia)(蜗管)注射有0.3μL的50％RNAiMAX中23μM(–30)GFP-Cre或仅RNAiMAX(对照)注射。5天后，使用免疫组织学使得指示Cre介导的重组的tdTomato表达可视化。红色＝tdTomato；绿色＝Myo7a；白色＝Sox2；蓝色＝DAPI。黄色括弧指示外部毛细胞(OHC)层。图32(B)显示，在(–30)GFP-Cre投递后10天，存在tdTomato阳性外部毛细胞的完整的表达espin(Esp)的硬纤毛(箭头)，类似于对照耳蜗中的硬纤毛。红色＝tdTomato；绿色＝Esp；白色＝Sox2；蓝色＝DAPI。图32(C)等同于图32(A)，只不过使用Lipofectamine2000而不是RNAiMAX。(n＝4)。上部分和下部分的图是小鼠耳蜗分别在低和高放大率的图，详细显示了投递的效率以及对耳蜗体系和毛细胞丧失的影响。图32(D)显示当将P2Atoh1-GFP小鼠(n＝3)的中阶(蜗管)注射有0.3μL的50％RNAiMAX或Lipofectamine2000中33μMCas9,33μMsgRNA的结果。当10天后看时，Cas9介导的基因破坏导致GFP表达的丧失。上部分图仅显示GFP信号，而下部分图包括另外的免疫组织学标志。下部分图中的黄框突出了具有丧失的GFP表达的毛细胞。红色＝tdTomato；绿色＝Myo7a；白色/浅蓝色＝Sox2；蓝色＝DAPI。以白色显示的所有比例尺均为10μm。
图33A-C.阳离子脂质介导的Cre重组酶的投递的优化。图33(A)显示优化(–30)GFP-Cre在BSR-TdTomato细胞中的投递，该细胞是用于处理Cre重组效率的第二种报道细胞系。图33B显示RNAiMAX剂量对HeLadsRed报道细胞中(–30)GFP-Cre重组效率的影响和毒性，如通过FACS测量的。通过前向散射(forward-scatter)和侧向散射设门来分选HeLa细胞以鉴定保留正常形态的活细胞。图33(C)例示了融合于Cre重组酶的蛋白质的静电荷与阳离子脂质介导的功能性Cre投递效率之间的关系。将列于25nM的与域融合的Cre重组酶与1.5μLRNAiMAX组合并与HeLadsRed报道细胞温育。2天后，通过FACS测量重组效率。误差条反映来自在不同日实施的3个生物重复的标准偏差。
图34A-D.通过阳离子脂质介导的投递相对于超级带正电荷的阳离子蛋白投递的蛋白质摄取。图34(A)量化了来自细胞的GFP荧光，所述细胞在用PBS+heparin(20U/mL)清洗以除去未结合蛋白后用(–30)GFP-Cre和RNAiMAX或(+36)GFP-Cre处理。图34(B)显示相对于来自与(+36)GFP融合的Cre重组酶投递效率，(–30)GFP-Cre+1.5μLRNAiMAX的功能性Cre重组酶投递效率。图34(C)提供了通过(–30)GFP融合物+1.5μMRNAiMAX处理相对于(+36)GFP融合物的mCherry摄取的比较，其通过测量在处理和用PBS+肝素清洗细胞后48小时时总细胞群体的均值mCherry荧光。图34(D)显示在存在或缺失RNAiMAX的情况下，(–30)GFP-Cre或(+36)GFP-Cre的总细胞GFP荧光。
图35.设计为靶向NTF3基因的TALE激活物的投递优化。将HEK293T细胞通过转染NTF3TALE质粒处理或通过脂质体投递NTF3TALE蛋白处理。在经验确定的两种处理的最佳温育时间后，收获细胞并通过qRT-PCR分析NTF3的mRNA水平。选择最佳蛋白质(25-50nM)和脂质剂量(1.5μLRNAiMAX)来比较图29B中的两种投递技术。误差条反映来自在不同日实施的6个生物重复的标准偏差。
图36A-D.确定EGFP报道基因的基因破坏频率，其通过投递Cas9:sgRNA和通过流式细胞术分析。图36(A)提供通过由Cas9双链短链诱导的NHEJ在U2OS细胞中的EGFP破坏的示意图。图36(B)显示与(–30)dGFP-Cas9复合的EGFP靶向性sgRNA或脱靶sgRNA的投递，其使用RNAiMAX连同质粒转染阳性对照(橙色)。图36(C)提供EGFP荧光的破坏不是细胞毒性的结果的确认，其通过用TO-PRO-3存活/死亡染料(LifeTechnologies,CarlsbadCA)处理样品并通过流式细胞术分析所得细胞。图36(D)显示对TO-PRO-3染色的测试，其通过添加细胞渗透性但非完全膜裂解性的去污剂(0.5％Tween)。
图37A-D.Cas9:sgRNA功能性投递的优化。在图37(A)中，两种测试构建体的阳离子脂质介导的投递效率显示，在低蛋白和sgRNA浓度，与天然Cas9相比，更多的阴离子(–30)dGFP-NLS-Cas9促进更有效的投递。图37(B)显示(–30)dGFP-NLS-Cas9的投递优化作为蛋白和sgRNA浓度的函数。图37(C)显示没有任何融合物或标签的Cas9蛋白的投递作为蛋白和sgRNA浓度的函数。图37(D)提供对于(–30)dGFP-NLS-Cas9和天然Cas9的NAiMAX介导的投递，最佳的sgRNA对蛋白比率。误差条反映来自在不同日实施的3个生物重复的标准偏差。
图38A-C.NLS和/或(–30)dGFP对功能性Cas9投递的影响作为sgRNA和Cas9两者浓度的函数。在3个固定的sgRNA浓度测量EGFP基因破坏：10nM(图38(A))、25nM(图38(B))和50nM(图38(C))，连同图中显示的不同蛋白浓度。使用0.8μLRNAiMAX进行投递并在48小时后通过FACS测定EGFP荧光信号的丧失。
图39A-C.RNAiMAX和Lipofectamine2000对Cas9:sgRNA投递效率和细胞毒性的影响。在图39(A)中，显示了在用RNAiMAX或Lipofectamine2000处理16小时的U2OSEGFP报道细胞中，在不同Cas9蛋白浓度和恒定剂量的100nMEGFPsgRNA时的EGFP基因破坏。在16小时后，除去培养基并向细胞添加新鲜培养基直至蛋白投递处理后48-72小时的测定终点。通过FACS使用TO-PRO-3存活/死亡染料测定活细胞群体。图39(B)显示Cas9:sgRNA投递至U2OS细胞的毒性概况(profile)作为Lipofectamine2000剂量的函数。图39(C)提供细胞的毒性概况作为RNAiMAX剂量的函数。误差条反映来自在不同日实施的3个生物重复的标准偏差。
图40.在不同的蛋白和sgRNA浓度靶向NTF3基因的dCas9-VP64投递的优化。将HEK293T细胞用dCas9-VP64激活物和NTF3靶向性gRNAg2或所有6种NTF3靶向性sgRNA的混合物处理16小时，和0.8μLRNAiMAX在48孔板形式中(275μL终体积)。通过qRT-PCR测定NTF3mRNA水平并相对于GAPDH的那些标准化。误差条反映来自在不同日实施的6个生物重复的标准偏差。
图41A-C.绘出了通过高通量测序测量的7个人类基因的Indel频率，所述人类基因通过伪处理、通过转染Cas9质粒和sgRNA线性DNAPCR产物、或通过阳离子脂质介导的蛋白质:sgRNA投递处理。伪处理涉及EGFP靶向性sgRNA而非3种人类基因靶向性sgRNA之一的阳离子脂质介导的蛋白质:sgRNA投递。图41(A)显示CLTA基因的在靶和脱靶indel频率。图41(B)提供EMX基因的在靶和脱靶indel频率。图41(C)显示VEGF基因的在靶和脱靶indel频率。对每份在靶和脱靶样品测序一次，其中每份在靶样品有>10,000个分析的序列，和每份脱靶样品平均有>111,000个分析的序列(表2)。
图42A-C.Cas9内切核酸酶对小鼠胚胎干细胞的投递。图42(A)显示用Cas9蛋白和RNAiMAX但无sgRNA(对照)处理的浮球(floatingsphere)保留强GFP荧光(右)，而用Cas9:sgRNA和RNAiMAX处理的那些展现降低的GFP荧光(左)。比例尺为100μm。图42(B)显示细胞粘附后的对照祖细胞，且实质上所有对照祖细胞是GFP阳性的(右小图)。Cas9:sgRNA处理导致GFP表达的显著降低(左小图)且许多祖细胞在细胞粘附后显示完全的GFP敲低(箭头)。比例尺为20μm。图42(C)显示在成像后收获的干细胞上的T7EI测定确认了GFP报道子的切割。类似的基因靶物修饰效率从阳离子脂质介导的Cas9:sgRNA投递和Cas9和EGFPsgRNA质粒的转染观察到。
图43A-B.在体内内源性基因座处由阳离子脂质介导的Cas9核酸酶和sgRNA的蛋白投递诱导的基因组修饰。图43(A)显示在小鼠毛细胞中在Cas9和EGFPsgRNA的阳离子脂质介导的投递之后，在EGFP在靶基因座处基因组DNA序列的代表性例子。对于显示的每个例子，未经修饰的基因组位点是第一序列，之后是含有缺失的丰度最高的8个序列和含有插入的3个序列。每个序列之前的数字指示序列计数。sgRNA靶位点为粗体并绿色划线。插入和缺失红色显示。PAM位点蓝色显示。图43(B)显示对于EMX在靶位点在小鼠毛细胞中与图42(A)中相同的分析。图43(A)中显示的序列从上到下对应于SEQIDNOs:223-236；且图43(B)中显示的序列从上到下对应于SEQIDNOs:237-250。
本发明特定实施方案的详细描述
本发明提供用于投递功能性效应器蛋白至细胞的复合物、组合物、制备物、试剂盒、系统和相关方法，所述功能性效应器蛋白为例如核酸酶、重组酶和Cas9蛋白(包括其变体和融合物，例如Cas9切口酶和Cas9融合至脱氨酶、基因编辑酶、转录阻遏物和激活物、表观遗传修饰物等等)，其通过将功能性效应器蛋白与超电荷蛋白、阳离子聚合物、和/或阳离子脂质的一种或多种联合。典型地，将功能性效应器蛋白投递至细胞内部，例如以引起细胞中的生物学作用，如切割基因组靶序列或调控靶基因的表达。在一些实施方案中，所述生物学作用对该细胞所在的受试者施加治疗益处。用于投递功能性效应器蛋白的复合物、组合物、制备物、系统、试剂盒和相关方法可用于将效应器蛋白引入细胞，例如在操纵细胞用于研究或治疗目的的背景中。本文中提供的用于投递功能性效应器蛋白的组合物、制备物、系统、试剂盒和相关方法展现出改进的功效和降低的细胞毒性，以及相比于当前技术的便于制备。使用本文中提供的组合物、制备物、系统、试剂盒和相关方法来投递位点特异性蛋白质，如TALEN或Cas9蛋白(或其变体或融合物)允许在体外或体内靶向性操纵/修饰宿主细胞的基因组，同时避免使用更侵入性的投递方法，如编码位点特异性蛋白的载体的病毒投递。
在一些实施方案中，本发明技术使用超电荷蛋白来将功能性效应器蛋白投递到细胞中。在某些实施方案中，所述超电荷蛋白是工程化的蛋白。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白是天然存在的超电荷蛋白。本发明的一些方面基于以下认知，即超电荷蛋白被细胞内吞；可与超电荷蛋白关联的功能性效应器蛋白能被细胞连同超电荷蛋白一起有效摄取；以及这类功能性效应器蛋白在细胞摄取后保留其生物学功能，例如它们能切割或修饰基因组靶位点或调控靶基因的转录。
在一些实施方案中，本文中提供的包含与功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)关联的超电荷蛋白的组合物可用作治疗剂、诊断剂或研究工具。在一些实施方案中，功能性效应器蛋白，如核酸酶或转录因子，可以是治疗活性的，例如其靶向与疾病或病症有关的基因。在一些实施方案中，将本文提供的包含超电荷蛋白和功能性效应器蛋白(如核酸酶或转录因子)的组合物用于调控细胞中基因的表达或调控细胞中的生物途径(例如信号传导途径、代谢途径)。在一些实施方案中，使细胞与本文中描述的创造性组合物接触以将功能性效应器蛋白引入细胞中。在一些实施方案中，将创造性的组合物施用给有此需要的受试者以将功能性效应器蛋白引入受试者的细胞内，例如与疾病或病症有关的细胞内。依照本公开的一些方面用于投递功能性效应器蛋白的适宜细胞和细胞类型包括但不限于，人细胞，哺乳动物细胞，T细胞，神经元，干细胞，祖细胞，血细胞，成纤维细胞，上皮细胞，赘生性细胞和肿瘤细胞。
超电荷蛋白
用于本发明的超电荷蛋白可通过将蛋白表面上的非保守氨基酸改变为更极性或带电荷的氨基酸残基产生。在某些实施方案中，蛋白表面上的非保守氨基酸突变为在生理学pH(pH～7.4)带正电荷的氨基酸。要修饰的氨基酸残基可以是疏水、亲水、带电荷的或其组合。超电荷蛋白还可以通过将带电荷模块附接于蛋白质以使蛋白质带超电荷来产生。超电荷蛋白经常对于聚集呈抗性，具有增加的重折叠能力，抵抗不适当折叠，具有改进的溶解度，且一般在宽范围的条件下更稳定，包括变性条件如热或存在去污剂。
适用于依照本发明的方面的超电荷蛋白是本领域中已知的且包括但不限于，以下中公开的那些超电荷蛋白：2007年6月1日提交的国际PCT专利申请PCT/US07/70254，在2007年12月13日公开为WO2007/143574；2009年4月28日提交的国际PCT申请PCT/US09/041984，在2009年11月5日公开为WO2009/134808；和2010年4月28日提交的国际PCT申请PCT/US10/001250，在2010年11月11日公开为WO2010/129023；其各自完整内容通过提述并入本文。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白是工程化的超电荷蛋白。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白是天然存在的超电荷蛋白，例如在以下公开的天然超电荷蛋白：2010年4月28日提交的国际PCT申请PCT/US10/001250，在2010年11月11日公开为WO2010/129023；其各自通过提述并入本文。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白，工程化的或天然存在的，展现出大于0.8的电荷:分子量比，例如≥0.85,≥0.9,≥0.95,≥1,≥1.1,≥1.2,≥1.3,≥1.4,≥1.5,≥1.6,≥1.7,≥1.8,≥1.9,≥2,≥2.5,≥3,≥4,≥5,≥6,≥7,≥8或≥10。
采用的超电荷蛋白可以源自任意物种的植物、动物和/或微生物。在某些实施方案中，所述超电荷蛋白是哺乳动物蛋白。在某些实施方案中，所述超电荷蛋白是人蛋白。在某些实施方案中，所述蛋白源自研究中通常使用的生物体。例如，要修饰的蛋白可能来自灵长类(例如猿、猴)、啮齿类(例如家兔、仓鼠、沙鼠)、猪、犬、猫、鱼(例如Daniorerio)、线虫(例如秀丽线虫(C.elegans))、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))或细菌(例如大肠杆菌(E.coli))。在某些实施方案中，所述蛋白是非免疫原性的。在某些实施方案中，所述蛋白是非抗原性的。在某些实施方案中，所述蛋白不具有内在的生物学活性或已经修饰为不具生物学活性。在某些实施方案中，蛋白的选择基于其靶向能力。在某些实施方案中，所述蛋白是绿色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白是带超电荷的谷胱甘肽S-转移酶(GST)。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白是带超电荷的链霉亲合素。
在一些实施方案中，使用已修饰为增加总体净电荷，或者增加蛋白表面上带电荷残基的总数目的超电荷蛋白。在某些实施方案中，超电荷蛋白的理论净电荷相比于未经修饰的蛋白增加了至少+1,至少+2,至少+3,至少+4,至少+5,至少+10,至少+15,至少+20,至少+25,至少+30,至少+35或至少+40。在某些实施方案中，超电荷蛋白的理论净电荷在生理学pH(即～7.4)为至少+1,至少+2,至少+3,至少+4,至少+5,至少+10,至少+15,至少+20,至少+25,至少+30,至少+35或至少+40。
在其他实施方案中，例如涉及使用阳离子脂质和/或阳离子聚合物的那些实施方案中，使用已经过修饰以降低总体净电荷或降低蛋白表面带电荷残基的总数目的超电荷蛋白。在某些实施方案中，超电荷蛋白的理论净电荷相比于未经修饰的蛋白降低了(“负(minus)”或“阴(negative)”由‘-’表示)至少-1,至少-2,至少-3,至少-4,至少-5,至少-10,至少-15,至少-20,至少-25,至少-30,至少-35,至少-40,至少-45或至少-50。在某些实施方案中，超电荷蛋白的理论净电荷为至少-1,至少-2,至少-3,至少-4,至少-5,至少-10,至少-15,至少-20,至少-25,至少-30,至少-35,至少-40,至少-45或至少-50。
尽管本文中描述了一些例示性超电荷蛋白以例示本发明的技术，但本公开在此方面不受限制。本领域技术人员基于本公开将能够确定另外的适宜超电荷蛋白用于将功能性效应器蛋白投递至细胞。可以修饰一些天然存在的蛋白质来生成适宜的超电荷蛋白。这类蛋白中的期望修饰可使用本领域中已知的任何技术完成。用于将这类变化引入蛋白序列的重组DNA技术是本领域公知的。在某些实施方案中，所述修饰可通过对编码蛋白质的多核苷酸的定点诱变完成。用于引入突变的其他技术论述于MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.,Sambrook,Fritsch和Maniatis编(ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989)；论文MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.)；Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,1999)；其各自通过提述并入本文。
超电荷蛋白可进一步修饰。包含超电荷蛋白的蛋白可使用本领域技术人员已知的技术修饰。例如，可以化学或生物学修饰超电荷蛋白。可以从初始序列添加、删除或改变一个或多个氨基酸。例如，可以将聚组氨酸标签或其他标签添加至超电荷蛋白以辅助蛋白质的纯化。可将其他肽或蛋白质添加至超电荷蛋白上以改变该蛋白的生物学、生物化学和/或生物物理学特性。例如，可将核内体裂解性(endosomlytic)肽添加至超电荷蛋白的初始序列，或将靶向性肽添加至超电荷蛋白的初始序列。超电荷蛋白的其他修饰包括但不限于，翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化、酰化、脂质化、法呢基化(farnesylation)、乙酰化、蛋白酶解等等)。在某些实施方案中，修饰所述超电荷蛋白以降低其免疫原性。在某些实施方案中，修饰所述超电荷蛋白以增强其投递功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)至细胞的能力。在某些实施方案中，所述超电荷蛋白缀合于聚合物。例如，可以通过将蛋白缀合于聚乙二醇(PEG)聚合物使蛋白PEG化。可使用其他方法来产生超电荷蛋白而不修饰蛋白质序列。例如，可将改变静电荷的模块附接于蛋白(例如通过化学或酶反应)以提供表面电荷来实现带超电荷。在某些实施方案中，使用记载于Shaw等,ProteinScience17:1446,2008的修饰蛋白质的方法来使当前公开的本发明技术中使用的蛋白质带超电荷。
适用于本发明公开的技术的几种不同超电荷蛋白的变体的设计和创造记载于2007年6月1日提交的国际PCT专利申请PCT/US07/70254，在2007年12月13日公开为WO2007/143574；2009年4月28日提交的国际PCT申请PCT/US09/041984，在2009年11月5日公开为WO2009/134808；和2010年4月28日提交的国际PCT申请PCT/US10/001250，在2010年11月11日公开为WO2010/129023；其各自完整内容通过提述并入本文。其中描述的一些公开的超电荷蛋白已显示为更稳定且保留其生物学功能，例如在荧光蛋白的情况中保留其荧光。例如，来自维多利亚发光水母(Aequoreavictoria)的绿色荧光蛋白(GFP)记载于GenBank登录号P42212，通过提述并入本文。该野生型GFP的氨基酸序列如下：
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(SEQIDNO:14)
野生型GFP具有的理论净电荷为-7。已报道了具有理论净电荷-29,-30,-25,+15,+25,+36,+48和+49的变体，例如在2010年4月28日提交的国际PCT申请PCT/US10/001250中，在2010年11月11日公开为WO2010/129023，其全部内容通过提述并入本文。即使将该+36GFP加热至95℃后，100％的变体蛋白是可溶的且该蛋白保留其荧光的≥70％。
本公开的一些方面基于以下发现，+36GFP有效将功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)投递至靶细胞，以及如此投递的效应器蛋白保留其生物学功能。因此，认为具有静电荷为至少+15,至少+25,至少+30,至少+35或至少+40的GFP或其他蛋白对于将功能性效应器蛋白引入细胞特别有用。
在一些实施方案中，特别有用的超电荷蛋白是允许类似于+36GFP的电荷分布或表面电荷密度的蛋白质。进一步地，在一些实施方案中，特别有用的超电荷蛋白是展现出不容易被超电荷扰乱的稳定折叠结构的蛋白，由此允许该超电荷蛋白较好地折叠。在一些实施方案中，特别有用的超电荷蛋白是与本文或以下申请中描述的超电荷蛋白共享结构特征的蛋白：2007年6月1日提交的国际PCT专利申请PCT/US07/70254，在2007年12月13日公开为WO2007/143574；2009年4月28日提交的国际PCT申请PCT/US09/041984，在2009年11月5日公开为WO2009/134808；和2010年4月28日提交的国际PCT申请PCT/US10/001250，在2010年11月11日公开为WO2010/129023；其各自完整内容通过提述并入本文；例如球状结构或β桶结构。可以通过本文中提供的方法和算法和本领域技术人员已知的其他方法将蛋白质折叠、蛋白质折叠结构稳定性和通过将特定氨基酸取代为不同电荷的氨基酸对蛋白质折叠的扰乱、电荷分布和表面电荷密度用计算机建模。因此，对于本领域技术人员来说，论述的超电荷蛋白是否将较好折叠在常规实验范围以内是明显的。如此，本领域技术人员将能从给定的氨基酸序列鉴定出给定的超电荷蛋白是否将可用于依照本文描述的技术的功能性效应器蛋白的细胞投递。
一些例示性的GFP的适宜变体包括但不限于：
+15GFP:
MGHHHHHHGGASKGERLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKKDGTYKTRAEVKFEGRTLVNRIELKGRDFKEKGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKRKNGIKANFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSALSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(SEQIDNO:15)
+25GFP:
MGHHHHHHGGASKGERLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGTYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHNVYITADKRKNGIKANFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSALSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(SEQIDNO:16)
+36GFP:
MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK(SEQIDNO:17)
+42GFP:
MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK(SEQIDNO:18)
+48GFP:
MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK(SEQIDNO:19)
+49GFP:
MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLKEFVTAAGIKHGRKERYK(SEQIDNO:20)
(-)30GFP:
MGHHHHHHGGASKGEELFDGVVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPTLVTTLTYGVQCFSDYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDDHYLSTESALSKDPNEDRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK(SEQIDNO:21)
对于熟练技术人员而言以下将是明显的，上述序列包含N末端His6标签，和没有这类标签或具有不同标签的序列也是适宜的。
为了在投递至细胞后促进功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)的生物学功能，可能期望在细胞摄取后增强功能性效应器蛋白的核内体逃离。可将超电荷蛋白或功能性效应器蛋白与已知增强核内体降解或核内体的裂解的蛋白、肽或其他实体融合或联合。在某些实施方案中，所述肽是血凝素2(HA2)肽，已知其增加核内体降解。在某些具体的实施方案中，HA2肽融合于带超电荷的GFP(例如+36GFP)。在某些具体的实施方案中，融合的蛋白具有序列：
+36GFP-HA2
MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYKGSAGSAAGSGEFGLFGAIAGFIENGWEGMIDG(SEQIDNO:22)
在某些实施方案中，核内体裂解性肽是蜂毒肽(melittin)(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ,SEQIDNO:23)(Meyer等,JACS130(11):3272-3273,2008；其通过提述并入本文)。在某些实施方案中，通过1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失和/或添加修饰蜂毒肽。在某些实施方案中，蜂毒肽具有序列：CIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQIDNO:24)。在某些具体的实施方案中，蜂毒肽融合于带超电荷的GFP(例如+36GFP)。
在某些实施方案中，核内体裂解性肽是penetratin肽(RQIKIWFQNRRMKWKK-酰胺,SEQIDNO:25)，牛PrP(1-30)肽(MVKSKIGSWILVLFVAMWSDVGLCKKRPKP-酰胺,SEQIDNO:26)，MPGΔNLS肽(由于K->S取代，其缺少功能性核定位序列)(GALFLGWLGAAGSTMGAPKSKRKV,SEQIDNO:27)，TP-10肽(AGYLLGKINLKALAALAKKIL-酰胺,SEQIDNO:28)，和/或EB1肽(LIRLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK-酰胺,SEQIDNO:29)(Lundberg等,2007,FASEBJ.21:2664；通过提述并入本文)。在某些实施方案中，通过1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失和/或添加修饰penetratin,PrP(1-30),MPG,TP-10,和/或EB1肽。在某些具体的实施方案中，PrP(1-30)、MPG、TP-10和/或EB1肽融合于带超电荷的GFP(例如+36GFP)。在一些实施方案中，Aurein肽融合于所述超电荷蛋白。
可将其他肽或蛋白质融合于超电荷蛋白或包含超电荷蛋白和功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)的融合蛋白。例如，靶向性肽可融合于超电荷蛋白以将功能性效应器蛋白选择性投递至特定细胞类型。还可以使用增强功能性效应器蛋白的细胞摄取的肽或蛋白。在某些实施方案中，融合于超电荷蛋白的肽是肽激素。在某些实施方案中，融合于超电荷蛋白的肽是肽配体。
本文中详细描述的例示性超电荷蛋白不意图限制本公开，且本领域技术人员将领会其他超电荷蛋白可用于功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)的细胞投递，所述功能性效应器蛋白包括但不限于其他GFP类型的荧光蛋白。在某些实施方案中，所述超电荷蛋白是蓝色荧光蛋白的超电荷型式。在某些实施方案中，所述超电荷蛋白是青色荧光蛋白的超电荷型式。在某些实施方案中，所述超电荷蛋白是黄色荧光蛋白的超电荷型式。例示性的适宜荧光蛋白包括但不限于，增强的绿色荧光蛋白(EGFP),AcGFP,TurboGFP,Emerald,AzamiGreen,ZsGreen,EBFP,Sapphire,T-Sapphire,ECFP,mCFP,Cerulean,CyPet,AmCyan1,Midori-IshiCyan,mTFP1(Teal),增强的黄色荧光蛋白(EYFP),Topaz,Venus,mCitrine,YPet,PhiYFP,ZsYellow1,mBanana,KusabiraOrange,mOrange,dTomato,dTomato-Tandem,DsRed,DsRed2,DsRed-Express(T1),DsRed-Monomer,mTangerine,mStrawberry,AsRed2,mRFP1,JRed,mCherry,HcRed1,mRaspberry,HcRed1,HcRed-Tandem,mPlum和AQ143。
仍然有其他蛋白可以超电荷和使用在例如如本文中公开的功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)的投递中，其包括组蛋白组分或组蛋白样蛋白、高速泳动族蛋白(high-mobility-groupproteins，HMG)、酶(例如淀粉酶、果胶酶、水解酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、脂肪酶、肌醇六磷酸酶、阿糖脑苷酶(alglucerase)、伊米苷酶(imiglucerase)、半乳糖苷酶(agalsidase)beta,α-1-艾杜糖苷酸酶(iduronidase)、酸性α-葡糖苷酶和艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶。
还可以使用带电荷的聚合物而非蛋白来投递功能性效应器蛋白。另外，如本文中以更多细节描述的，还可以使用阳离子脂质和脂质样材料以及阳离子聚合物来投递功能性效应器蛋白。适宜的阳离子脂质、脂质样材料和阳离子聚合物在本文中公开且另外的适宜脂质和脂质样材料是本领域技术人员已知的(参见，例如记载于Akinc等,NatureBiotechnology26,561-569(2008)的那些，其完整内容通过提述并入本文)。
使用超电荷蛋白投递功能性效应器蛋白
本发明提供用于体内、离体或体外向细胞投递功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)的系统和方法。这类系统和方法通常牵涉将功能性效应器蛋白与超电荷蛋白联合以形成复合物或融合蛋白，并将该复合物或融合蛋白投递给细胞。在一些实施方案中，要通过超电荷蛋白投递的功能性效应器蛋白具有治疗活性。在一些实施方案中，将所述复合物或融合蛋白投递给细胞牵涉将包含与功能性效应器蛋白联合的超电荷蛋白的复合物或融合蛋白施用给有此需要的受试者。
在一些实施方案中，功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)本身不能进入细胞，但当与超电荷蛋白联合(例如经由共价键或非共价相互作用)时能进入细胞。在一些实施方案中，提供包含共价结合于超电荷蛋白的功能性效应器蛋白的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含经由肽键，例如经由直接融合或经由肽接头融合于超电荷蛋白的功能性效应器蛋白。在一些实施方案中，所述组合物包含功能性效应器蛋白，其通过非共价相互作用结合于超电荷蛋白。在一些实施方案中，利用超电荷蛋白以允许功能性效应器蛋白进入细胞。在一些实施方案中，在投递至细胞后将投递给细胞的与超电荷蛋白联合的功能性效应器蛋白与超电荷蛋白分开，例如通过在特定细胞微环境例如核内体中的细胞蛋白酶(例如核内体蛋白酶)切割接头肽或通过将功能性效应器蛋白从超电荷蛋白解离。在一些实施方案中，通过本公开的系统或方法投递给细胞的功能性效应器蛋白具有治疗活性。
在一些实施方案中，通过本文中提供的系统、组合物或方法体内、离体或体外地将功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)投递给细胞。在一些实施方案中，功能性效应器蛋白是能在靶细胞内实施生物学功能的蛋白质，例如能结合其底物和催化靶细胞内的酶反应的酶，例如能结合和切割靶细胞内的核酸分子的核酸酶，或能与靶细胞的基因组相互作用和活化或抑制细胞中靶基因的转录的转录因子。
在一些实施方案中，生成功能性效应器蛋白和超电荷蛋白的融合物的方法包括生成表达核酸构建体，其含有功能蛋白和超电荷蛋白的编码序列，以及任选地，符合阅读框的肽接头；在原核或真核细胞中培养来表达这类重组融合蛋白，融合蛋白的提取和纯化。在一些实施方案中，以表达载体的形式生成核酸构建体，例如适用于在细菌宿主中增殖和适用于在原核或真核细胞中表达的载体。
在一些实施方案中，通过以下生成适用于融合蛋白表达的载体：将编码要投递的功能性效应器蛋白的核苷酸序列克隆到克隆载体中，所述载体包含在真核和/或原核启动子控制下的编码超电荷蛋白的核苷酸序列，通过产生两个编码序列均彼此符合阅读框地克隆办法来进行。在一些实施方案中，所述克隆载体包含在编码超电荷蛋白的核苷酸序列和限制性位点之间的编码肽接头的核苷酸序列，所述限制性位点可用于插入编码与该接头和超电荷蛋白符合阅读框的蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，该克隆载体还包含另外的序列，其增强融合蛋白在原核或真核细胞中的表达或促进所表达的融合蛋白从这类细胞的纯化，例如所述序列是稳定化编码融合蛋白的转录本的序列，如聚A信号、可剪接内含子、编码符合阅读框的肽或蛋白质域标签的序列(例如Arg标签、钙调蛋白结合肽标签、纤维素结合域标签、DsbA标签、c-myc标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、FLAG标签、HAT标签、His标签、麦芽糖结合性蛋白标签、NusA标签、S标签、SBP标签、Strep标签或硫氧还蛋白标签)，或选择标志或报道盒，其允许鉴定携带且表达所述表达构建体的细胞和/或量化这类细胞中的表达水平。用于克隆和表达融合蛋白的方法是本领域技术人员公知的，参见例如，Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,Volume1-3,CSHLPress(1989)；Gellissen等,Productionofrecombinantproteins,Wiley-VCH,2005。
在一些实施方案中，所述功能性效应器蛋白与超电荷的GFP例如+36GFP或-30GFP联合以投递至靶细胞。先前已证明了核内体破坏在通过超电荷蛋白投递大分子中的益处(Wadia等,Nat.Med.10,310-315,2004)且在一些实施方案中，实施另外的步骤来实现增强的核内体逃离，如本文提供的或本领域已知的。当与有效的核内体释放偶联时，高度有效的蛋白质内化具有最小化外源蛋白剂的必要剂量的潜力，从而增强其作为研究工具和导致治疗进展的潜力。
在一些实施方案中，在分离和/或纯化后将包含与超电荷蛋白联合的功能性效应器蛋白的组合物施用给靶细胞。蛋白质纯化方法和技术是本领域技术人员公知的，且包括例如，亲和层析或免疫沉淀。适用于分离和/或纯化特定功能性效应器蛋白、超电荷蛋白、和/或融合蛋白的方法将取决于相应蛋白质的性质。例如，带His标签的融合蛋白可容易地经由Ni或Co离子层析分离和纯化，而带有其他肽或域的融合蛋白或未带标签的融合蛋白可通过其他确立的方法来纯化。
适用于通过本文提供的系统或方法体内、离体或体外投递至靶细胞的功能性效应器蛋白对于本领域技术人员将是明显的，且包括例如DNA结合蛋白，如转录因子和核酸酶，以及Cas9蛋白(包括其变体和融合物)。
在一些实施方案中，使用本文提供的方法、组合物或系统来投递功能性效应器蛋白至细胞。治疗性蛋白的例子包括但不限于，靶向与疾病或病症有关的基因组等位基因的核酸酶和Cas9蛋白(包括其变体和融合物)，和激活有益基因或抑制致病基因的转录因子。
在一些实施方案中，Cas9融合于超电荷蛋白以投递至细胞。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白是带正电荷的。在一些实施方案中，融合于Cas9的所述超电荷蛋白是(+36)GFP。在一些实施方案中，Cas9和(+36)GFP的融合物包含SEQIDNO:30的氨基酸序列(例如有或无核定位信号(NLS)和有或无6xHis标签)，或包含与SEQIDNO:30的氨基酸序列至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少98％或至少99％相同的氨基酸序列(例如有或无核定位信号(NLS)和有或无6xHis标签)。在一些实施方案中，融合于Cas9的所述超电荷蛋白是(-30)GFP。在一些实施方案中，Cas9和(-30)GFP的融合物包含SEQIDNO:31的氨基酸序列(例如有或无核定位信号(NLS)和有或无6xHis标签)，或包含与SEQIDNO:31的氨基酸序列至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少98％或至少99％相同的氨基酸序列(例如有或无核定位信号(NLS)和有或无6xHis标签)。
(+36)dGFP-NLS-Cas9-6xHis :
MGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYKTGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGTALALPKKKRKVMDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDHHHHHH(SEQIDNO:30)
(–30)dGFP-NLS-Cas9-6xHis :
MGASKGEELFDGVVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPTLVTTLTGVQCFSDYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDDHYLSTESALSKDPNEDRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYKTGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGTALALPKKKRKVMDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDHHHHHH(SEQIDNO:31)
功能性效应器蛋白和阳离子脂质的组合物
本公开的某些方面涉及使用阳离子脂质来投递效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)，例如与投递“裸”蛋白制备物相对。令人惊讶地，发现已工程化用于投递核酸如DNA和RNA的现有脂质体投递试剂有效体外或体内投递某些效应器蛋白(例如Cas9蛋白包含其变体和融合物)，如本文中描述的。核酸投递极大地受益于在过去二十年的脂质体试剂的进展。阳离子脂质体制剂使得DNA和RNA转染变为基础研究的常规技术且已用于临床试验。脂质体的脂质双层保护包封的核酸免于降解且可防止可结合核酸的裸制备物的抗体的特异性中和。重要地是，在核内体熟化期间脂质体与核内体膜的融合能实现高度有效的阳离子脂质投递货物的核内体逃离。其他非阳离子的然而可可逆离子化的脂质纳米颗粒制备物实现核酸的有效包封和投递，同时避免非特异性静电相互作用和相应的扣留。然而，蛋白质是化学上多样的，因此不同于高度阴离子的核酸，脂质体制剂对于有效投递蛋白质不那么成功。例如，虽然蛋白质可以由再水合的脂质非特异性包封并体外投递，包封的功效依赖于蛋白质浓度且通常低效，如此没有广泛应用。本公开的方面涉及以下认知，阴离子蛋白或蛋白复合物(包含与核酸联合的那些蛋白)可以能利用与阳离子脂质体试剂用于核酸投递相同的静电驱动的包封。尽管很少的蛋白质天然拥有在核酸的磷酸骨架中见到的负电荷的密度，但如本文描述的翻译融合于或非共价联合于阴离子载体如带超负电荷的蛋白或核酸使得所得效应器蛋白或蛋白复合物足够阴离子化的，从而驱动这类蛋白货物被阳离子脂质体试剂有效包封。
在一些实施方案中，与工程化的带超负电荷的GFP联合或融合能驱动通过常用于转染核酸的阳离子脂质将蛋白质有效包封和投递到培养的哺乳动物细胞中。此办法甚至在低纳米摩尔蛋白浓度和存在血清时也有效，从而比使用与阳离子肽或蛋白质的融合物的蛋白投递方法高1,000倍有效的投递功能性蛋白。如实施例中显示的，投递功效在一些实施方案中依赖于例如融合标签的理论净电荷，和流行的天然阴离子肽标签例如3xFLAG和VP64可类似地实现脂质体蛋白投递。
实施例进一步显示与聚阴离子导引RNA(gRNA)联合的Cas9核酸酶蛋白可以通过这些常用的阳离子脂质体制剂以功能性形式有效投递到哺乳动物细胞中，因为，不希望受任何具体理论束缚地，认为gRNA充当另外阳离子的Cas9蛋白和阳离子脂质之间的聚阴离子介导物。Cas9:gRNA复合物的投递不仅高度有效(例如从单次处理高达80％修饰)，而且还导致与质粒转染相比显著更高的基因组修饰特异性，其通常导致在在靶:脱靶修饰比上高>10倍，推定是由于投递的Cas9:gRNA活性的瞬时性质。在一些实施方案中，Cas9:gRNA复合物的投递导致至少2倍,3倍,4倍,5倍,6倍,7倍,8倍,9倍,10倍,11倍,12倍,13倍,14倍,15倍,20倍或25倍或更高的在靶:脱靶修饰比。实施例还显示该蛋白投递办法可以是体内有效的，例如通过将功能性Cre重组酶和功能性Cas9:gRNA复合物投递至小鼠内耳的毛细胞。
因此，本公开的一些方面提供包含Cas9蛋白(例如如本文描述的；见例如下文Cas9效应器蛋白)和阳离子脂质的组合物，其能将Cas9蛋白投递至细胞的内部。在一些实施方案中，Cas9蛋白与gRNA联合，后者例如提供阴离子电荷给复合物，从而允许Cas9:gRNA复合物被阳离子脂质包封。在一些实施方案中，Cas9蛋白不需要与gRNA联合以被阳离子脂质有效包封，而是与超负电荷蛋白联合，如本文描述的。在其中Cas9蛋白与超负电荷蛋白联合的一些实施方案中，Cas9蛋白还与gRNA联合。在一些实施方案中，Cas9蛋白是野生型Cas9蛋白，野生型Cas9蛋白的片段，或野生型Cas9蛋白的变体。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含dCas9域(例如如本文描述的)。在一些实施方案中，Cas9蛋白是包含dCas9域(例如如本文描述的)的融合蛋白。在一些实施方案中，Cas9蛋白是Cas9切口酶。
在其他实施方案中，提供包含效应器蛋白(例如除Cas9蛋白以外的)和阳离子脂质的组合物，其能将效应器蛋白投递至细胞内部(例如至细胞的核)。效应器蛋白是天然带负电荷的，经修饰以具有总体净负电荷的，或与超负电荷蛋白关联，如本文描述的。在一些实施方案中，效应器蛋白是本文描述的任意效应器蛋白。在一些实施方案中，效应器蛋白是重组酶，例如本文描述的任意重组酶。在一些实施方案中，重组酶是Cre重组酶。在一些实施方案中，所述Cre重组酶包含SEQIDNO:32的氨基酸序列(例如有或无6xHis标签)。在一些实施方案中，Cre重组酶包含与SEQIDNO:32的氨基酸序列至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少98％或至少99％相同的氨基酸序列(例如有或无6xHis标签)。在一些实施方案中，Cre重组酶融合于超电荷蛋白(例如+36GFP或-30GFP)。在一些实施方案中，融合于超电荷蛋白的Cre重组酶包含SEQIDNO:33(例如有或无6xHis标签)或SEQIDNO:34(例如有或无6xHis标签)的氨基酸序列，或包含与SEQIDNO:33或SEQIDNO:34的氨基酸序列至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少98％或至少99％相同的氨基酸序列(例如有或无6xHis标签)。在一些实施方案中，效应器蛋白是TALE蛋白(例如如本文描述的包含实施例中提供的那些)。在一些实施方案中，TALE蛋白包含一个或多个VP64转录激活物域(例如SEQIDNO:35)。在一些实施方案中，具有VP64转录激活物域的TALE蛋白还包含选自下组的氨基酸序列：SEQIDNO:36-39(例如有或无6xHis标签)。在一些实施方案中，具有VP64转录激活物域的TALE蛋白包含与选自下组的氨基酸序列至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少98％或至少99％相同的氨基酸序列(例如有或无6xHis标签)：SEQIDNO:36-39。在一些实施方案中，TALE效应器蛋白包含(-30)GFP域(例如SEQIDNO:21或SEQIDNO:40)，TALE域的N末端区(例如SEQIDNO:41)，可变重复域(例如18.5聚体重复域，如Maeder等,“Robust,synergisticregulationofhumangeneexpressionusingTALEactivators.”Nat.Methods.2013；10,243–245中提供的)，C末端TALE域(例如SEQIDNO:42)，VP64激活域(例如SEQIDNO:35)，和任选地在任何域之间的一个或多个接头(例如GGS(9),SEQIDNO:252)以及任选地序列标签(例如6xHis,SEQIDNO:253)。
尽管已知货物如DNA和RNA的脂质体投递诱导靶向的细胞中的毒性，但发现本文描述的本发明组合物令人惊讶地在体外和体内均无毒性或低毒性地投递其货物。例如，在一些实施方案中，本文描述的包含Cas9蛋白或其他效应器蛋白的组合物在施用给(例如体外或体内)细胞群体时展现出低毒性。在一些实施方案中，群体中至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％或至少99％的细胞在施用本发明组合物后是活的，所述组合物包含Cas9蛋白或其他效应器蛋白和阳离子脂质。用于评估当施用给细胞群体时组合物毒性的方法是本领域公知的且包括实施例中描述的那些。
Cre-6xHis(6xHis标签划线):
MASNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGDGGSHHHHHH(SEQIDNO:32)
(+36)GFP-Cre-6xHis(+36GFP双下划线；6xHis标签划线):
ASNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGDGGSHHHHHH(SEQIDNO:33)
(–30)GFP-Cre-6xHis(-30GFP双下划线；6xHis标签划线):
ASNLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGDGGSHHHHHH(SEQIDNO:34)
(+36)GFP-PPARγ-TALE-2(+36GFP双下划线；6xHis标签划线):
APKKKRKVGIHRGVPMVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVADHAQVVRVLGFFQCHSHPAQAFDDAMTQFGMSGGGSGRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLHHHHHH(SEQIDNO:36)
(+36)GFP-PRDM16_TALE-3(+36GFP双下划线；6xHis标签划线):
APKKKRKVGIHRGVPMVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVADHAQVVRVLGFFQCHSHPAQAFDDAMTQFGMSGGGSGRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLHHHHHH(SEQIDNO:37)
(-30)GFP-PPARγ-TALE-2(-30GFP双下划线；6xHis标签划线):
APKKKRKVGIHRGVPMVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVADHAQVVRVLGFFQCHSHPAQAFDDAMTQFGMSGGGSGRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLHHH HHH(SEQIDNO:38)
(-30)GFP-PRDM16TALE-3(-30GFP双下划线；6xHis标签划线):
APKKKRKVGIHRGVPMVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPEQVVAIANNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVADHAQVVRVLGFFQCHSHPAQAFDDAMTQFGMSGGGSGRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLHHH HHH(SEQIDNO:39)
(-30)GFP:
MGASKGEELFDGVVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPTLVTTLTYGVQCFSDYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDDHYLSTESALSKDPNEDRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK(SEQIDNO:40)
N末端TALE域:
APKKKRKVGIHRGVPMVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNL(SEQIDNO:41)
C末端TALE域:
LESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVADHAQVVRVLGFFQCHSHPAQAFDDAMTQFGMSGGGS(SEQIDNO:42)
VP64激活域:
GRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDML(SEQIDNO:35)
功能性效应器蛋白和阳离子聚合物的组合物
本公开的某些方面涉及将阳离子聚合物用于投递效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)，例如与投递“裸”蛋白制备物相对。如使用阳离子脂质的，本公开的方面涉及以下认知，即阴离子蛋白或蛋白复合物(包含与核酸联合的那些蛋白)能利用通过阳离子聚合物的静电驱动的包封和/或与阳离子聚合物的联合来投递功能性效应器蛋白。尽管很少的蛋白质天然拥有在核酸的磷酸骨架中见到的负电荷的密度，但如本文描述的翻译融合于或非共价联合于阴离子载体如带超负电荷的蛋白或核酸使得所得效应器蛋白或蛋白复合物足够阴离子化的，从而驱动这类蛋白货物被阳离子聚合物有效包封/联合。
在一些实施方案中，与工程化的带超负电荷的GFP联合或融合能驱动通过阳离子聚合物将蛋白质有效包封/联合和投递到培养的哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，可以使用阳离子聚合物将与聚阴离子导引RNA(gRNA)联合的Cas9蛋白以功能性形式有效投递到哺乳动物细胞中。因此，在一些实施方案中，提供包含Cas9蛋白和阳离子聚合物的组合物，其中所述Cas9蛋白与gRNA联合，且所述组合物能将Cas9蛋白投递至细胞内部。在一些实施方案中，使用阳离子聚合物投递Cas9:gRNA复合物导致与质粒转染Cas9蛋白相比至少2倍,3倍,4倍,5倍,6倍,7倍,8倍,9倍,10倍,11倍,12倍,13倍,14倍,15倍,20倍或25倍或更高的在靶:脱靶修饰比率。
因此，本公开的一些方面提供包含Cas9蛋白(例如如本文描述的；见例如下文Cas9效应器蛋白)和阳离子聚合物的组合物，其能将Cas9蛋白投递至细胞的内部。在一些实施方案中，Cas9蛋白与gRNA联合，后者例如提供阴离子电荷给复合物，从而允许Cas9:gRNA复合物被阳离子聚合物有效包封和/或与其联合。在一些实施方案中，Cas9蛋白不需要与gRNA联合以被阳离子聚合物有效包封和/或与其联合，而是与超负电荷蛋白联合，如本文描述的。在其中Cas9蛋白与超负电荷蛋白联合的一些实施方案中，Cas9蛋白还与gRNA联合。在一些实施方案中，Cas9蛋白是野生型Cas9蛋白，野生型Cas9蛋白的片段，或野生型Cas9蛋白的变体。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含dCas9域(例如如本文描述的)。在一些实施方案中，Cas9蛋白是包含dCas9域(例如如本文描述的)的融合蛋白。在一些实施方案中，Cas9蛋白是Cas9切口酶。
在其他实施方案中，提供包含效应器蛋白(例如除Cas9蛋白以外的)和阳离子聚合物的组合物，其能将效应器蛋白投递至细胞内部(例如至细胞的核)。效应器蛋白是天然带负电荷的，经修饰以具有总体净负电荷的，或与超负电荷蛋白关联，如本文描述的。在一些实施方案中，效应器蛋白是本文描述的任意效应器蛋白。在一些实施方案中，效应器蛋白是重组酶，例如本文描述的任意重组酶。在一些实施方案中，重组酶是Cre重组酶。在一些实施方案中，所述Cre重组酶包含SEQIDNO:32的氨基酸序列(例如有或无6xHis标签)。在一些实施方案中，Cre重组酶包含与SEQIDNO:32的氨基酸序列至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少98％或至少99％相同的氨基酸序列(例如有或无6xHis标签)。在一些实施方案中，Cre重组酶融合于超电荷蛋白(例如+36GFP或-30GFP)。在一些实施方案中，融合于超电荷蛋白的Cre重组酶包含SEQIDNO:33(例如有或无6xHis标签)或SEQIDNO:34(例如有或无6xHis标签)的氨基酸序列，或包含与SEQIDNO:33或SEQIDNO:34的氨基酸序列至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少98％或至少99％相同的氨基酸序列(例如有或无6xHis标签)。在一些实施方案中，效应器蛋白是TALE蛋白(例如如本文描述的包含实施例中提供的那些)。在一些实施方案中，TALE蛋白包含一个或多个VP64转录激活物域(例如SEQIDNO:35)。在一些实施方案中，具有VP64转录激活物域的TALE蛋白还包含选自下组的氨基酸序列：SEQIDNO:36-39(例如有或无6xHis标签)。在一些实施方案中，具有VP64转录激活物域的TALE蛋白包含与选自下组的氨基酸序列至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少98％或至少99％相同的氨基酸序列(例如有或无6xHis标签)：SEQIDNO:36-39。在一些实施方案中，TALE效应器蛋白包含(-30)GFP域(例如SEQIDNO:21或SEQIDNO:40)，TALE域的N末端区(例如SEQIDNO:41)，可变重复域(例如18.5聚体重复域，如Maeder等,“Robust,synergisticregulationofhumangeneexpressionusingTALEactivators.”Nat.Methods.2013；10,243–245中提供的)，C末端TALE域(例如SEQIDNO:42)，VP64激活域(例如SEQIDNO:35)，和任选地在任何域之间的一个或多个接头(例如GGS(9),SEQIDNO:252)以及任选地序列标签(例如6xHis,SEQIDNO:253)。
在一些实施方案中，本文描述的包含Cas9蛋白或其他效应器蛋白的组合物在施用给(例如体外或体内)细胞群体时展现出低毒性。在一些实施方案中，群体中至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％或至少99％的细胞在施用本发明组合物后是活的，所述组合物包含Cas9蛋白或其他效应器蛋白和阳离子聚合物。用于评估当施用给细胞群体时组合物毒性的方法是本领域公知的且包括实施例中描述的那些。
Cas9效应器蛋白
在一些实施方案中，通过本文提供的系统或方法将包含可RNA编程的蛋白(或其片段或变体)的效应器蛋白投递给靶细胞。在一些实施方案中，通过本文提供的系统或方法将RNA导引的或可RNA编程的核酸酶投递给靶细胞。在一些实施方案中，所述可RNA编程的蛋白是Cas9核酸酶、Cas9变体、或Cas9蛋白的融合物，其通过本文提供的系统或方法投递给靶细胞。
在一些实施方案中，所述可RNA编程的核酸酶是(CRISPR-associatedsystem，CRISPR关联系统)Cas9内切核酸酶，例如来自酿脓链球菌的Cas9(Csn1)(参见，例如“CompletegenomesequenceofanM1strainofStreptococcuspyogenes.”FerrettiJ.J.,McShanW.M.,AjdicD.J.,SavicD.J.,SavicG.,LyonK.,PrimeauxC.,SezateS.,SuvorovA.N.,KentonS.,LaiH.S.,LinS.P.,QianY.,JiaH.G.,NajarF.Z.,RenQ.,ZhuH.,SongL.expand/collapseauthorlistMcLaughlinR.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001)；“CRISPRRNAmaturationbytrans-encodedsmallRNAandhostfactorRNaseIII.”DeltchevaE.,ChylinskiK.,SharmaC.M.,GonzalesK.,ChaoY.,PirzadaZ.A.,EckertM.R.,VogelJ.,CharpentierE.,Nature471:602-607(2011)；和“Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.”JinekM.,ChylinskiK.,FonfaraI.,HauerM.,DoudnaJ.A.,CharpentierE.Science337:816-821(2012)，其各自完整内容通过提述并入本文。由于可RNA编程的核酸酶(例如Cas9)利用RNA:DNA杂交来确定靶DNA切割位点，因此这些蛋白质在原理上能切割由导引RNA指定的任意序列。使用可RNA编程的核酸酶如Cas9用于位点特异性切割(例如以修饰基因组)的方法是本领域中公知的(参见例如Cong,L.等MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science339,819-823(2013)；Mali,P.等RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science339,823-826(2013)；Hwang,W.Y.等EfficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPR-Cassystem.Naturebiotechnology31,227-229(2013)；Jinek,M.等RNA-programmedgenomeeditinginhumancells.eLife2,e00471(2013)；Dicarlo,J.E.等GenomeengineeringinSaccharomycescerevisiaeusingCRISPR-Cassystems.Nucleicacidsresearch(2013)；Jiang,W.等RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems.Naturebiotechnology31,233-239(2013)；其各自完整内容通过提述并入本文)。
Cas9核酸酶有时还称为casn1核酸酶或CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat))有关的核酸酶。CRISPR是提供对移动性遗传元件(例如病毒、转座元件和接合质粒)的保护的适应性免疫系统。CRISPR簇含有间隔物、与前期移动元件互补的序列和靶物侵入性核酸。CRISPR簇转录和加工成CRISPRRNA(crRNA)。在II型CRISPR系统中，对前crRNA的正确加工需要反式编码的小RNA(tracrRNA)、内源核糖核酸酶3(rnc)和Cas9蛋白。tracrRNA充当核糖核酸酶3辅助的对前crRNA加工的导引。随后，Cas9/crRNA/tracrRNA以内切核苷酸方式切割与间隔物互补的线性或环状dsDNA靶物。不与crRNA互补的靶链首先被内切核苷酸方式切割，然后以外切核苷酸方式在3′-5′修剪。在自然界中，DNA结合和切割通常需要蛋白质和两种RNA种类。然而，可以工程化单导引RNA(“sgRNA”或简称为“gNRA”)以将crRNA和tracrRNA两者的示象(aspect)均纳入到单RNA种类中。参见例如，JinekM.,ChylinskiK.,FonfaraI.,HauerM.,DoudnaJ.A.,CharpentierE.Science337:816-821(2012)，其完整内容通过提述据此并入本文。Cas9识别CRISPR重复序列中的短基序(PAM或原间隔区临近基序)来帮助区分自身和非自身。Cas9核酸酶序列和结构是本领域技术人员公知的(参见，例如“CompletegenomesequenceofanM1strainofStreptococcuspyogenes.”FerrettiJ.J.,McShanW.M.,AjdicD.J.,SavicD.J.,SavicG.,LyonK.,PrimeauxC.,SezateS.,SuvorovA.N.,KentonS.,LaiH.S.,LinS.P.,QianY.,JiaH.G.,NajarF.Z.,RenQ.,ZhuH.,SongL.expand/collapseauthorlistMcLaughlinR.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001)；“CRISPRRNAmaturationbytrans-encodedsmallRNAandhostfactorRNaseIII.”DeltchevaE.,ChylinskiK.,SharmaC.M.,GonzalesK.,ChaoY.,PirzadaZ.A.,EckertM.R.,VogelJ.,CharpentierE.,Nature471:602-607(2011)；和“Aprogrammabledual-RNA导引的DNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.”JinekM.,ChylinskiK.,FonfaraI.,HauerM.,DoudnaJ.A.,CharpentierE.Science337:816-821(2012)，其各自完整内容通过提述并入本文)。
已在多种物种中描述了Cas9直系同源物，包括但不限于酿脓链球菌(S.pyogenes)和嗜热链球菌(S.thermophilus)。基于本公开，其他适宜的Cas9核酸酶和序列对于本领域技术人员将是明显的，而且这类Cas9核酸酶和序列包括来自Chylinski,Rhun和Charpentier,“ThetracrRNAandCas9familiesoftypeIICRISPR-Casimmunitysystems”(2013)RNABiology10:5,726-737(其完整内容通过提述并入本文)中公开的生物和基因座的Cas9序列。在一些实施方案中，包含Cas9或其片段的蛋白质称为“Cas9变体”。Cas9变体与Cas9或其片段共享同源性。例如，Cas9变体与野生型Cas9至少约70％相同，至少约80％相同，至少约90％相同，至少约95％相同，至少约98％相同，至少约99％相同，至少约99.5％相同，或至少约99.9％相同。在一些实施方案中，Cas9变体包含Cas9的片段(例如gRNA结合域或DNA切割域、N末端域或C末端域，等等)，从而该片段与野生型Cas9的相应片段至少约70％相同，至少约80％相同，至少约90％相同，至少约95％相同，至少约98％相同，至少约99％相同，至少约99.5％相同，或至少约99.9％相同。在一些实施方案中，野生型Cas9对应于来自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9(NCBI参考序列：NC_017053.1,SEQIDNO:43(核苷酸)；SEQIDNO:44(氨基酸))。在一些实施方案中，Cas9蛋白具有无活性的(例如失活的)DNA切割域。核酸酶失活的Cas9蛋白可交换地称为“dCas9”蛋白(对于核酸酶“死亡的”Cas9)。在一些实施方案中，dCas9对应于或包含，部分或全部地，如下文SEQIDNO:45中所列的氨基酸。在一些实施方案中，提供dCas9的变体(例如SEQIDNO:45的变体)。例如，在一些实施方案中，提供具有D10A和H840A以外的突变的变体，其导致核酸酶失活的Cas9(dCas9)举例而言，这类突变包括在D10和H840处的其他氨基酸取代，或Cas9核酸酶域内的其他取代(例如HNH核酸酶子域和/或RuvC1子域中的取代)。在一些实施方案中，提供dCas9的变体或同源物(例如SEQIDNO:45的变体)，其与SEQIDNO:45至少约70％相同,至少约80％相同,至少约90％相同,至少约95％相同,至少约98％相同,至少约99％相同,至少约99.5％相同或至少约99.9％相同。在一些实施方案中，提供dCas9的变体(例如SEQIDNO:45的变体)，其具有比SEQIDNO:45短或长约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸或更多的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供Cas9“切口酶”，其包含使Cas9中单个核酸酶域失活的突变。这类切口酶诱导靶核酸中的单链断裂，如与双链断裂相对的。
Cas9
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGATTATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGGCAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGCAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAATCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTAGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAGAAATGGCTTGTTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGATTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATAGTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAGCGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAGGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGCGCCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGGGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGATATTCAAAAAGCACAGGTGTCTGGACAAGGCCATAGTTTACATGAACAGATTGCTAACTTAGCTGGCAGTCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAATTGTTGATGAACTGGTCAAAGTAATGGGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTACAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCATTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTACTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA(SEQIDNO:43)
MDKKAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGENQTTQKGQKNSR ERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNK VLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERG GGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQIDNO:44)
(单下划线：HNH域；双下划线：RuvC域)
dCas9(D10A和H840A):
MDKKAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGRENQTTQKGQKNSR ERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNK VLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERG GGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQIDNO:45)
(单下划线：HNH域；双下划线：RuvC域)
Cas9切口酶(D10A):
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQIDNO:46)
在一些实施方案中，提供包含Cas9蛋白的融合蛋白用于本文描述的任意组合物和方法中。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含dCas9蛋白(例如如本文描述的)。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含dCas9和一个或多个域(例如酶域)之间的接头(例如如本文描述的)。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含dCas9和转录激活物域、转录阻遏物域、重组酶域、基因编辑域(例如脱氨酶域)、或表观遗传修饰物域。
在一些实施方案中，本文中提供的例示性融合蛋白的一般体系结构包含以下结构：
[NH2]-[酶域]-[dCas9]-[COOH]或
[NH2]-[dCas9]-[酶域]-[COOH]；
其中NH2是融合蛋白的N末端，COOH是融合蛋白的C末端，且所述酶域包含核酸酶域(例如FokI)、重组酶催化域(例如Hin,Gin或Tn3重组酶于)、核酸编辑域(例如脱氨酶域)、转录激活物域(例如VP64、p65)、转录阻遏物域(例如KRAB、SID)、或表观遗传修饰物(例如LSD1组蛋白去甲基化酶、TET1羟基化酶)。
可以存在另外的特征，例如某些域之间的一个或多个接头序列。其他可能存在的例示性特征是定位序列，如核定位序列(NLS；例如MAPKKKRKVGIHRGVP(SEQIDNO:47))；细胞质定位序列；输出序列，如核输出序列；或其他定位序列，以及可用于增溶、纯化或检测融合蛋白的序列标签。本文中提供了适宜的信号序列和蛋白标签序列且是本领域已知的，包括但不限于，生物素羧化酶载体蛋白(BCCP)标签、myc标签、钙调蛋白标签、FLAG标签(例如3xFLAG标签：MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK(SEQIDNO:48))、血凝素(HA)标签、多组氨酸标签(也称为组氨酸标签或His标签)、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、nus标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、绿色荧光蛋白(GFP)标签、硫氧还蛋白标签、S标签、Softag(例如Softag1、Softag3)、strep标签、生物素连接酶标签、FlAsH标签、V5标签和SBP标签。其他适宜序列对于本领域技术人员将是明显的。
在一些实施方案中，所述酶域包含核酸酶或其催化域。例如，在一些实施方案中，例示性的具有核酸酶域的配体依赖性dCas9融合蛋白的一般体系结构包含以下结构：
[NH2]-[NLS]-[dCas9]-[核酸酶]-[COOH],
[NH2]-[NLS]-[核酸酶]-[dCas9]-[COOH],
[NH2]-[dCas9]-[核酸酶]-[COOH],或
[NH2]-[核酸酶]-[dCas9]-[COOH]；
其中NLS是核定位信号，NH2是融合蛋白的N末端，且COOH是融合蛋白的C末端。在一些实施方案中，接头插入在dCas9和核酸酶域之间。在一些实施方案中，接头插入在NLS与核酸酶和/或dCas9域之间。在一些实施方案中，NLS位于核酸酶和/或dCas9域的C末端。在一些实施方案中，NLS位于核酸酶和dCas9域之间。还可以存在另外的特征，如序列标签。在一些方面，所述核酸酶域是需要二聚化以切割靶核酸(例如DNA)的核酸酶(例如两个核酸酶的单体在一起)。在一些实施方案中，核酸酶域是FokIDNA切割域的单体。FokIDNA切割域是已知的，且在一些方面对应于FokI(NCBI登录号J04623)的氨基酸388–583。在一些实施方案中，FokIDNA切割域对应于FokI的氨基酸300-583,320-583,340-583或360-583。亦参见Wah等,“StructureofFokIhasimplicationsforDNAcleavage”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998；1；95(18):10564-9；Li等,“TALnucleases(TALNs):hybridproteinscomposedofTALeffectorsandFokIDNA-cleavagedomain”NucleicAcidsRes.2011；39(1):359-72；Kim等,“Hybridrestrictionenzymes:zincfingerfusionstoFokIcleavagedomain”Proc.NatlAcad.Sci.USA.1996；93:1156–1160；其各自完整内容通过提述并入本文)。在一些实施方案中，所述FokIDNA切割域对应于或包含，部分或全部地，如SEQIDNO:49中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述FokIDNA切割域是FokI的变体(例如SEQIDNO:49的变体)，如本文描述的。使用dCas9-核酸酶融合蛋白的其他例示性组合物和方法可见于2014年6月30日提交的美国专利申请U.S.S.N14/320,498；名称为“Cas9-FokIfusionProteinsandUsesThereof”，其完整内容通过提述并入本文。
FokI核酸酶域:
GSQLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF(SEQIDNO:49)
fCas9(例如dCas9-NLS-GGS3接头-FokI):
ATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGATCAGGTGGAAGTGGCGGCAGCGGAGGTTCTGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTT(SEQIDNO:50)
fCas9(例如NLS-dCas9-GGS3接头–FokI):
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACTCAGGTGGAAGTGGCGGCAGCGGAGGTTCTGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTT(SEQIDNO:51)
fCas9(例如FokI-GGS3接头-dCas9-NLS):
ATGGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTGGCGGTAGTGGGGGATCTGGGGGAAGTATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACGGATCCCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTCGAGCGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGGCTGCAGGA(SEQIDNO:52)
fCas9(例如NLS-FokI-GGS3接头-dCas9):
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTGGAGGTTCTATGGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTGGCGGTAGTGGGGGATCTGGGGGAAGTATGGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGAC(SEQIDNO:53)
fCas9:
ATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGATGGCCCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGGGCATTCACCGCGGGGTACCTGGAGGTTCTGGATCCCAACTAGTCAAAAGTGAACTGGAGGAGAAGAAATCTGAACTTCGTCATAAATTGAAATATGTGCCTCATGAATATATTGAATTAATTGAAATTGCCAGAAATTCCACTCAGGATAGAATTCTTGAAATGAAGGTAATGGAATTTTTTATGAAAGTTTATGGATATAGAGGTAAACATTTGGGTGGATCAAGGAAACCGGACGGAGCAATTTATACTGTCGGATCTCCTATTGATTACGGTGTGATCGTGGATACTAAAGCTTATAGCGGAGGTTATAATCTGCCAATTGGCCAAGCAGATGAAATGCAACGATATGTCGAAGAAAATCAAACACGAAACAAACATATCAACCCTAATGAATGGTGGAAAGTCTATCCATCTTCTGTAACGGAATTTAAGTTTTTATTTGTGAGTGGTCACTTTAAAGGAAACTACAAAGCTCAGCTTACACGATTAAATCATATCACTAATTGTAATGGAGCTGTTCTTAGTGTAGAAGAGCTTTTAATTGGTGGAGAAATGATTAAAGCCGGCACATTAACCTTAGAGGAAGTCAGACGGAAATTTAATAACGGCGAGATAAACTTTAGCGGCAGCGAGACTCCCGGGACCTCAGAGTCCGCCACACCCGAAAGTGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCTATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCATGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGATTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATGCCATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAAATCACAAAGCATGTTGCACAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGAC(SEQIDNO:54)
在一些实施方案中，所述酶域包含重组酶或其催化域。例如，在一些实施方案中，例示性的具有重组酶域的配体依赖性dCas9融合蛋白的一般体系结构包含以下结构：
[NH2]-[NLS]-[dCas9]-[重组酶]-[COOH],
[NH2]-[NLS]-[重组酶]-[dCas9]-[COOH],
[NH2]-[dCas9]-[重组酶]-[COOH],或
[NH2]-[重组酶]-[dCas9]-[COOH]；
其中NLS是核定位信号，NH2是融合蛋白的N末端，且COOH是融合蛋白的C末端。在一些实施方案中，接头插入在dCas9和重组酶域之间。在一些实施方案中，接头插入在NLS与重组酶和/或dCas9域之间。在一些实施方案中，NLS位于重组酶和/或dCas9域的C末端。在一些实施方案中，NLS位于重组酶和dCas9域之间。还可以存在另外的特征，如序列标签。“重组酶的催化域”意指融合蛋白包含包括重组酶的氨基酸序列(例如衍生于重组酶)的域，从而使得该域在与靶核酸接触(单独地或与包含别的重组酶催化域的其他因子组合，所述别的重组酶催化域可能或可能不形成融合蛋白的部分)时足以诱导重组)。在一些实施方案中，重组酶的催化域不包含重组酶的DNA结合域。在一些实施方案中，重组酶的催化域包含部分或全部的重组酶，例如催化域可以包含重组酶域和DNA结合域，或其部分，或者催化域可以包含重组酶域和DNA结合域，其突变或截短以消除DNA结合活性。重组酶和重组酶的催化域是本领域技术人员已知的，且包括例如本文描述的那些。在一些实施方案中，所述催化域源自任意重组酶。在一些实施方案中，重组酶催化域是aTn3解离酶、Hin重组酶或Gin重组酶的催化域。在一些实施方案中，催化域包含Tn3解离酶(例如StarkTn3重组酶)，其由包含部分或全部的如下文提供的SEQIDNO:55的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，Tn3催化域由SEQIDNO:55的变体编码。在一些实施方案中，Tn3催化域由编码对应于SEQIDNO:56的多肽的多核苷酸(或其变体)编码。在一些实施方案中，所述催化域包含Hin重组酶，其由包含部分或全部的如下文提供的SEQIDNO:57的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，Hin催化域由SEQIDNO:57的变体编码。在一些实施方案中，Hin催化域由编码对应于SEQIDNO:58的多肽的多核苷酸(或其变体)编码。在一些实施方案中，所述催化域包含Gin重组酶(例如Ginbeta重组酶)，其由包含部分或全部的如下文提供的SEQIDNO:59的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，Gin催化域由SEQIDNO:59的变体编码。在一些实施方案中，Gin催化域由编码对应于SEQIDNO:60的多肽的多核苷酸(或其变体)编码。使用dCas9-重组酶融合蛋白的其他例示性组合物和方法可见于2014年6月30日提交的美国专利申请U.S.S.N14/320,467；名称为“Cas9VariantsandUsesThereof”；其完整内容通过提述并入本文。
StarkTn3重组酶(核苷酸：SEQIDNO:55；氨基酸：SEQIDNO:56):
ATGGCCCTGTTTGGCTACGCACGCGTGTCTACCAGTCAACAGTCACTCGATTTGCAAGTGAGGGCTCTTAAAGATGCCGGAGTGAAGGCAAACAGAATTTTTACTGATAAGGCCAGCGGAAGCAGCACAGACAGAGAGGGGCTGGATCTCCTGAGAATGAAGGTAAAGGAGGGTGATGTGATCTTGGTCAAAAAATTGGATCGACTGGGGAGAGACACAGCTGATATGCTTCAGCTTATTAAAGAGTTTGACGCTCAGGGTGTTGCCGTGAGGTTTATCGATGACGGCATCTCAACCGACTCCTACATTGGTCTTATGTTTGTGACAATTTTGTCCGCTGTGGCTCAGGCTGAGCGGAGAAGGATTCTCGAAAGGACGAATGAGGGACGGCAAGCAGCTAAGTTGAAAGGTATCAAATTTGGCAGACGAAGG(SEQIDNO:55)
MALFGYARVSTSQQSLDLQVRALKDAGVKANRIFTDKASGSSTDREGLDLLRMKVKEGDVILVKKLDRLGRDTADMLQLIKEFDAQGVAVRFIDDGISTDSYIGLMFVTILSAVAQAERRRILERTNEGRQAAKLKGIKFGRRR(SEQIDNO:56)
Hin重组酶(核苷酸：SEQIDNO:57；氨基酸：SEQIDNO:58):
ATGGCAACCATTGGCTACATAAGGGTGTCTACCATCGACCAAAATATCGACCTGCAGCGCAACGCTCTGACATCCGCCAACTGCGATCGGATCTTCGAGGATAGGATCAGTGGCAAGATCGCCAACCGGCCCGGTCTGAAGCGGGCTCTGAAGTACGTGAATAAGGGCGATACTCTGGTTGTGTGGAAGTTGGATCGCTTGGGTAGATCAGTGAAGAATCTCGTAGCCCTGATAAGCGAGCTGCACGAGAGGGGTGCACATTTCCATTCTCTGACCGATTCCATCGATACGTCTAGCGCCATGGGCCGATTCTTCTTTTACGTCATGTCCGCCCTCGCTGAAATGGAGCGCGAACTTATTGTTGAACGGACTTTGGCTGGACTGGCAGCGGCTAGAGCACAGGGCCGACTTGGA(SEQIDNO:57)
MATIGYIRVSTIDQNIDLQRNALTSANCDRIFEDRISGKIANRPGLKRALKYVNKGDTLVVWKLDRLGRSVKNLVALISELHERGAHFHSLTDSIDTSSAMGRFFFYVMSALAEMERELIVERTLAGLAAARAQGRLG(SEQIDNO:58)
Ginbeta重组酶(核苷酸：SEQIDNO:59；氨基酸：SEQIDNO:60):
ATGCTCATTGGCTATGTAAGGGTCAGCACCAATGACCAAAACACAGACTTGCAACGCAATGCTTTGGTTTGCGCCGGATGTGAACAGATATTTGAAGATAAACTGAGCGGCACTCGGACAGACAGACCTGGGCTTAAGAGAGCACTGAAAAGACTGCAGAAGGGGGACACCCTGGTCGTCTGGAAACTGGATCGCCTCGGACGCAGCATGAAACATCTGATTAGCCTGGTTGGTGAGCTTAGGGAGAGAGGAATCAACTTCAGAAGCCTGACCGACTCCATCGACACCAGTAGCCCCATGGGACGATTCTTCTTCTATGTGATGGGAGCACTTGCTGAGATGGAAAGAGAGCTTATTATCGAAAGAACTATGGCTGGTATCGCTGCTGCCCGGAACAAAGGCAGACGGTTCGGCAGACCGCCGAAGAGCGGC(SEQIDNO:59)
MLIGYVRVSTNDQNTDLQRNALVCAGCEQIFEDKLSGTRTDRPGLKRALKRLQKGDTLVVWKLDRLGRSMKHLISLVGELRERGINFRSLTDSIDTSSPMGRFFFYVMGALAEMERELIIERTMAGIAAARNKGRRFGRPPKSG(SEQIDNO:60)
在一些实施方案中，所述酶域包含脱氨酶或其催化域。例如，在一些实施方案中，具有脱氨酶或域的例示性dCas9融合蛋白的一般体系结构包含以下结构：
[NH2]-[NLS]-[Cas9]-[脱氨酶]-[COOH],
[NH2]-[NLS]-[脱氨酶]-[Cas9]-[COOH],
[NH2]-[Cas9]-[脱氨酶]-[COOH],或
[NH2]-[脱氨酶]-[Cas9]-[COOH]；
其中NLS是核定位信号，NH2是融合蛋白的N末端，且COOH是融合蛋白的C末端。在一些实施方案中，接头插入在dCas9和脱氨酶域之间。在一些实施方案中，接头插入在NLS与脱氨酶和/或dCas9域之间。在一些实施方案中，NLS位于脱氨酶和/或dCas9域的C末端。在一些实施方案中，NLS位于脱氨酶和dCas9域之间。还可以存在另外的特征，如序列标签。一个例示性的核酸编辑酶和域的适宜类型是胞嘧啶脱氨酶，例如，胞嘧啶脱氨酶的载脂蛋白BmRNA编辑复合物(APOBEC)家族的，其包含活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)和载脂蛋白B编辑复合物3(APOBEC3)酶。适用于本发明的另一个例示性的核酸编辑酶和域的适宜类型包括腺苷脱氨酶。例如，ADAT家族腺苷脱氨酶可以融合于dCas9域。下文提供了一些例示性的适宜核酸编辑酶和域，例如脱氨酶和脱氨酶域，其可依照本公开的方面融合于dCas9域。将理解，在一些实施方案中，可以使用相应序列的活性域，例如没有定位信号(核定位信号，没有核输出信号，细胞质定位信号)的域。使用dCas9-核酸酶融合蛋白的其他例示性组合物和方法可见于2014年7月8日提交的美国专利申请U.S.S.N14/325,815；名称为“FusionsofCas9DomainsandNucleicAcid-EditingDomains”；其完整内容通过提述并入本文
人AID:
MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENHERTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLP(SEQIDNO:61)
(划线：核定位信号；双划线：核输出信号)
小鼠AID:
MDSLLMKQKKFLYHFKNVRWAKGRHETYLCYVVKRRDSATSCSLDFGHLRNKSGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVAEFLRWNPNLSLRIFTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIGIMTFKDYFYCWNTFVENRERTFKAWEGLHENSVRLTRQLRRILLP(SEQIDNO:62)
(划线：核定位信号；双划线：核输出信号)
犬AID:
MDSLLMKQRKFLYHFKNVRWAKGRHETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGHLRNKSGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGYPNLSLRIFAARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENREKTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLP(SEQIDNO:63)
(划线：核定位信号；双划线：核输出信号)
牛AID:
MDSLLKKQRQFLYQFKNVRWAKGRHETYLCYVVKRRDSPTSFSLDFGHLRNKAGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGYPNLSLRIFTARLYFCDKERKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENHERTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLP(SEQIDNO:64)
(划线：核定位信号；双划线：核输出信号)
小鼠APOBEC-3:
MGPFCLGCSHRKCYSPIRNLISQETFKFHFKNLGYAKGRKDTFLCYEVTRKDCDSPVSLHHGVFKNKDNIHAEICFL YWFHDKVLKVLSPREEFKITWYMSWSPCFECAEQIVRFLATHHNLSLDIFSSRLYNVQDPETQQNLCRLVQEGAQVAAMDLYEFKKCWKKFVDNGGRRFRPWKRLLTNFRYQDSKLQEILRPCYIPVPSSSSSTLSNICLTKGLPETRFCVEGRRMDPLSEEEFYSQFYNQRVKHLCYYHRMKPYLCYQLEQFNGQAPLKGCLLSEKGKQHAEILFLDKIRSMELSQVTIT CYLTWSPCPNCAWQLAAFKRDRPDLILHIYTSRLYFHWKRPFQKGLCSLWQSGILVDVMDLPQFTDCWTNFVNPKRPFWPWKGLEIISRRTQRRLRRIKESWGLQDLVNDFGNLQLGPPMS(SEQIDNO:65)
(划线：核酸编辑域)
大鼠APOBEC-3:
MGPFCLGCSHRKCYSPIRNLISQETFKFHFKNLRYAIDRKDTFLCYEVTRKDCDSPVSLHHGVFKNKDNIHAEICFL YWFHDKVLKVLSPREEFKITWYMSWSPCFECAEQVLRFLATHHNLSLDIFSSRLYNIRDPENQQNLCRLVQEGAQVAAMDLYEFKKCWKKFVDNGGRRFRPWKKLLTNFRYQDSKLQEILRPCYIPVPSSSSSTLSNICLTKGLPETRFCVERRRVHLLSEEEFYSQFYNQRVKHLCYYHGVKPYLCYQLEQFNGQAPLKGCLLSEKGKQHAEILFLDKIRSMELSQVIIT CYLTWSPCPNCAWQLAAFKRDRPDLILHIYTSRLYFHWKRPFQKGLCSLWQSGILVDVMDLPQFTDCWTNFVNPKRPFWPWKGLEIISRRTQRRLHRIKESWGLQDLVNDFGNLQLGPPMS(SEQIDNO:66)
(划线：核酸编辑域)
恒河猴(Rhesusmacaque)APOBEC-3G:
MVEPMDPRTFVSNFNNRPILSGLNTVWLCCEVKTKDPSGPPLDAKIFQGKVYSKAKY ANSVATFLAKDPKVTLTIFVARLYYFWKPDYQQALRILCQKRGGPHATMKIMNYNEFQDCWNKFVDGRGKPFKPRNNLPKHYTLLQATLGELLRHLMDPGTFTSNFNNKPWVSGQHETYLCYKVERLHNDTWVPLNQHRGFLRNQAPNIHGFPKGR AQEMAKFISNNEHVSLCIFAARIYDDQGRYQEGLRALHRDGAKIAMMNYSEFEYCWDTFVDRQGRPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAI(SEQIDNO:67)
(粗斜体：核酸编辑域；划线：细胞质定位信号)
黑猩猩(Chimpanzee)APOBEC-3G:
KLKYHPEMRFFHWFSKWRKLHRDQEYEVTWYISWSPCTKCTRDVATFLAEDPKVTLTIFVARLYYFWDPDYQEALRSLCQKRDGPRATMKIMNYDEFQHCWSKFVYSQRELFEPWNNLPKYYILLHIMLGEILRHSMDPPTFTSNFNNELWVRGRHETYLCYEVERLHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLHQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISNNKHVSLCIFAARIYDDQGRCQEGLRTLAKAGAKISIMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLEEHSQALSGRLRAILQNQGN(SEQIDNO:68)
(划线：核酸编辑域；双划线：细胞质定位信号)
绿猴(Greenmonkey)APOBEC-3G:
EAKDHPEMKFLHWFRKWRQLHRDQEYEVTWYVSWSPCTRCANSVATFLAEDPKVTLTIFVARLYYFWKPDYQQALRILCQERGGPHATMKIMNYNEFQHCWNEFVDGQGKPFKPRKNLPKHYTLLHATLGELLRHVMDPGTFTSNFNNKPWVSGQRETYLCYKVERSHNDTWVLLNQHRGFLRNQAPDRHGFPKGRHAELCFLDLIPFWKLDDQQYRVTCFTSWSPCFSCAQKMAKFISNNKHVSLCIFAARIYDDQGRCQEGLRTLHRDGAKIAVMNYSEFEYCWDTFVDRQGRPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAI(SEQIDNO:69)
(划线：核酸编辑域；双划线：细胞质定位信号)
人APOBEC-3G:
ELKYHPEMRFFHWFSKWRKLHRDQEYEVTWYISWSPCTKCTRDMATFLAEDPKVTLTIFVARLYYFWDPDYQEALRSLCQKRDGPRATMKIMNYDEFQHCWSKFVYSQRELFEPWNNLPKYYILLHIMLGEILRHSMDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYDDQGRCQEGLRTLAEAGAKISIMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQNQEN(SEQIDNO:70)
(划线：核酸编辑域；双划线：细胞质定位信号)
人APOBEC-3F:
MKPHFRNTVERMYRDTFSYNFYNRPILSRRNTVWLCYEVKTKGPSRPRLDAKIFRGQVYSQPEHHAEMCFLSWFCGN QLPAYKCFQITWFVSWTPCPDCVAKLAEFLAEHPNVTLTISAARLYYYWERDYRRALCRLSQAGARVKIMDDEEFAYCWENFVYSEGQPFMPWYKFDDNYAFLHRTLKEILRNPMEAMYPHIFYFHFKNLRKAYGRNESWLCFTMEVVKHHSPVSWKRGVFRNQVDPETHCHAERCFLSWFCDDILSPNTNYEVTWYTSWSPCPECAGEVAEFLARHSNVNLTIFTARLYYFWDTDYQEGLRSLSQEGASVEIMGYKDFKYCWENFVYNDDEPFKPWKGLKYNFLFLDSKLQEILE(SEQIDNO:71)
(划线：核酸编辑域域)
人APOBEC-3B:
MNPQIRNPMERMYRDTFYDNFENEPILYGRSYTWLCYEVKIKRGRSNLLWDTGVFRGQVYFKPQYHAEMCFLSWFCG NQLPAYKCFQITWFVSWTPCPDCVAKLAEFLSEHPNVTLTISAARLYYYWERDYRRALCRLSQAGARVTIMDYEEFAYCWENFVYNEGQQFMPWYKFDENYAFLHRTLKEILRYLMDPDTFTFNFNNDPLVLRRRQTYLCYEVERLDNGTWVLMDQHMGFLCNEAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFEYCWDTFVYRQGCPFQPWDGLEEHSQALSGRLRAILQNQGN(SEQIDNO:72)
(划线：核酸编辑域)
人APOBEC-3C:
MNPQIRNPMKAMYPGTFYFQFKNLWEANDRNETWLCFTVEGIKRRSVVSWKTGVFRNQVDSETHCHAERCFLSWFCD DILSPNTKYQVTWYTSWSPCPDCAGEVAEFLARHSNVNLTIFTARLYYFQYPCYQEGLRSLSQEGVAVEIMDYEDFKYCWENFVYNDNEPFKPWKGLKTNFRLLKRRLRESLQ(SEQIDNO:73)
(划线：核酸编辑域)
人APOBEC-3A:
MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLD LVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGN(SEQIDNO:74)
(划线：核酸编辑域)
人APOBEC-3H:
MALLTAETFRLQFNNKRRLRRPYYPRKALLCYQLTPQNGSTPTRGYFENKKKCHAEICFINEIKSMGLDETQCYQVT CYLTWSPCSSCAWELVDFIKAHDHLNLGIFASRLYYHWCKPQQKGLRLLCGSQVPVEVMGFPKFADCWENFVDHEKPLSFNPYKMLEELDKNSRAIKRRLERIKIPGVRAQGRYMDILCDAEV(SEQIDNO:75)
(划线：核酸编辑域)
人APOBEC-3D:
MNPQIRNPMERMYRDTFYDNFENEPILYGRSYTWLCYEVKIKRGRSNLLWDTGVFRGPVLPKRQSNHRQEVYFRFENHAEMCFLSWFCGNRLPANRRFQITWFVSWNPCLPCVVKVTKFLAEHPNVTLTISAARLYYYRDRDWRWVLLRLHKAGARVKIMDYEDFAYCWENFVCNEGQPFMPWYKFDDNYASLHRTLKEILRNPMEAMYPHIFYFHFKNLLKACGRNESWLCFTMEVTKHHSAVFRKRGVFRNQVDPETHCHAERCFLSWFCDDILSPNTNYEVTWYTSWSPCPECAGEVAEFLARHSNVNLTIFTARLCYFWDTDYQEGLCSLSQEGASVKIMGYKDFVSCWKNFVYSDDEPFKPWKGLQTNFRLLKRRLREILQ(SEQIDNO:76)
(划线：核酸编辑域)
人APOBEC-1:
MTSEKGPSTGDPTLRRRIEPWEFDVFYDPRELRKEACLLYEIKWGMSRKIWRSSGKNTTNHVEVNFIKKFTSERDFHPSMSCSITWFLSWSPCWECSQAIREFLSRHPGVTLVIYVARLFWHMDQQNRQGLRDLVNSGVTIQIMRASEYYHCWRNFVNYPPGDEAHWPQYPPLWMMLYALELHCIILSLPPCLKISRRWQNHLTFFRLHLQNCHYQTIPPHILLATGLIHPSVAWR(SEQIDNO:77)
小鼠APOBEC-1:
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSVWRHTSQNTSNHVEVNFLEKFTTERYFRPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRHPYVTLFIYIARLYHHTDQRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQEYCYCWRNFVNYPPSNEAYWPRYPHLWVKLYVLELYCIILGLPPCLKILRRKQPQLTFFTITLQTCHYQRIPPHLLWATGLK(SEQIDNO:78)
大鼠APOBEC-1:
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLK(SEQIDNO:79)
人ADAT-2:
MEAKAAPKPAASGACSVSAEETEKWMEEAMHMAKEALENTEVPVGCLMVYNNEVVGKGRNEVNQTKNATRHAEMVAIDQVLDWCRQSGKSPSEVFEHTVLYVTVEPCIMCAAALRLMKIPLVVYGCQNERFGGCGSVLNIASADLPNTGRPFQCIPGYRAEEAVEMLKTFYKQENPNAPKSKVRKKECQKS(SEQIDNO:80)
小鼠ADAT-2:
MEEKVESTTTPDGPCVVSVQETEKWMEEAMRMAKEALENIEVPVGCLMVYNNEVVGKGRNEVNQTKNATRHAEMVAIDQVLDWCHQHGQSPSTVFEHTVLYVTVEPCIMCAAALRLMKIPLVVYGCQNERFGGCGSVLNIASADLPNTGRPFQCIPGYRAEEAVELLKTFYKQENPNAPKSKVRKKDCQKS(SEQIDNO:81)
小鼠ADAT-1:
MWTADEIAQLCYAHYNVRLPKQGKPEPNREWTLLAAVVKIQASANQACDIPEKEVQVTKEVVSMGTGTKCIGQSKMR ESGDILNDSHAEIIARRSFQRYLLHQLHLAAVLKEDSIFVPGTQRGLWRLRPDLSFVFFSSHTPCGDASIIPMLEFE EQPCCPVIRSWANNSPVQETENLEDSKDKRNCEDPASPVAKKMRLGTPARSLSNCVAHHGTQESGPVKPDVSSSDLT KEEPDAANGIASGSFRVVDVYRTGAKCVPGETGDLREPGAAYHQVGLLRVKPGRGDRTCSMSCSDKMARWNVLGCQG ALLMHFLEKPIYLSAVVIGKCPYSQEAMRRALTGRCEETLVLPRGFGVQELEIQQSGLLFEQSRCAVHRKRGDSPGR LVPCGAAISWSAVPQQPLDVTANGFPQGTTKKEIGSPRARSRISKVELFRSFQKLLSSIADDEQPDSIRVTKKLDTY QEYKDAASAYQEAWGALRRIQPFASWIRNPPDYHQFK(SEQIDNO:82)(划线：核酸编辑域)
人ADAT-1:
MWTADEIAQLCYEHYGIRLPKKGKPEPNHEWTLLAAVVKIQSPADKACDTPDKPVQVTKEVVSMGTGTKCIGQSKMR KNGDILNDSHAEVIARRSFQRYLLHQLQLAATLKEDSIFVPGTQKGVWKLRRDLIFVFFSSHTPCGDASIIPMLEFE DQPCCPVFRNWAHNSSVEASSNLEAPGNERKCEDPDSPVTKKMRLEPGTAAREVTNGAAHHQSFGKQKSGPISPGIH SCDLTVEGLATVTRIAPGSAKVIDVYRTGAKCVPGEAGDSGKPGAAFHQVGLLRVKPGRGDRTRSMSCSDKMARWNV LGCQGALLMHLLEEPIYLSAVVIGKCPYSQEAMQRALIGRCQNVSALPKGFGVQELKILQSDLLFEQSRSAVQAKRA DSPGRLVPCGAAISWSAVPEQPLDVTANGFPQGTTKKTIGSLQARSQISKVELFRSFQKLLSRIARDKWPHSLRVQK LDTYQEYKEAASSYQEAWSTLRKQVFGSWIRNPPDYHQFK(SEQIDNO:83)(划线：核酸编辑域)
在一些实施方案中，所述酶域包含一个或多个转录激活物。例如，在一些实施方案中，具有转录激活物域的例示性dCas9融合蛋白的一般体系结构包含以下结构：
[NH2]-[NLS]-[Cas9]-[(转录激活物)n]-[COOH],
[NH2]-[NLS]-[(转录激活物)n]-[Cas9]--[COOH],
[NH2]-[Cas9]-[(转录激活物)n]-[COOH],或
[NH2]-[(转录激活物)n]-[Cas9]-[COOH]；
其中NLS是核定位信号，NH2是融合蛋白的N末端，且COOH是融合蛋白的C末端。在一些实施方案中，融合蛋白包含一个或多个转录激活物重复，例如其中n＝1-10(例如n是1,2,3,4,5,6,7,8,9或10)。在一些实施方案中，n＝1-20。在一些实施方案中，接头插入在dCas9和转录激活物域之间。在一些实施方案中，接头插入在NLS与转录激活物和/或dCas9域之间。在一些实施方案中，NLS位于转录激活物和/或dCas9域的C末端。在一些实施方案中，NLS位于转录激活物域和dCas9域之间。还可以存在另外的特征，如序列标签。在一些实施方案中，转录激活物选自下组：VP64,(SEQIDNO:84或SEQIDNO:35),VP16(SEQIDNO:85)和p65(SEQIDNO:86)。在一些实施方案中，dCas9-VP64融合蛋白包含SEQIDNO:87的氨基酸序列(例如有或无6xHis标签)，或包含与SEQIDNO:87的氨基酸序列至少80％,至少85％,至少90％,至少95％,至少98％或至少99％相同的氨基酸序列(例如有或无6xHis标签)。
VP64
GSGRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLIN(SEQIDNO:84)
VP16
APPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPGFTPHDSAPYGALDMADFEFEQMFTDALGIDEYGGEFPGIRR(SEQIDNO:85)
p65:
PSGQISNQALALAPSSAPVLAQTMVPSSAMVPLAQPPAPAPVLTPGPPQSLSAPVPKSTQAGEGTLSEALLHLQFDADEDLGALLGNSTDPGVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVSMSHSTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGTSGLPNGLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISSSGQ(SEQIDNO:86)
dCas9-VP64-6xHis:
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGSPKKKRKVSSDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKAAGGGGSGRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLHHHHHH(SEQIDNO:87)
在一些实施方案中，所述酶域包含一个或多个转录阻遏物。例如，在一些实施方案中，具有转录阻遏物的例示性dCas9融合蛋白的一般体系结构包含以下结构：
[NH2]-[NLS]-[Cas9]-[(转录阻遏物)n]-[COOH],
[NH2]-[NLS]-[(转录阻遏物)n]-[Cas9]--[COOH],
[NH2]-[Cas9]-[(转录阻遏物)n]-[COOH],或
[NH2]-[(转录阻遏物)n]-[Cas9]-[COOH]；
其中NLS是核定位信号，NH2是融合蛋白的N末端，且COOH是融合蛋白的C末端。在一些实施方案中，融合蛋白包含一个或多个转录阻遏物重复，例如其中n＝1-10(例如n是1,2,3,4,5,6,7,8,9或10)。在一些实施方案中，n＝1-20。在一些实施方案中，接头插入在dCas9和转录阻遏物域之间。在一些实施方案中，接头插入在NLS与转录阻遏物和/或dCas9域之间。在一些实施方案中，NLS位于转录阻遏物和/或dCas9域的C末端。在一些实施方案中，NLS位于转录阻遏物域和dCas9域之间。还可以存在另外的特征，如序列标签。在一些实施方案中，the转录阻遏物选自下组：Kox1的KRAB(Krüppel关联框(associatedbox))域、SID(mSin3相互作用域)、HP1α的CS(ChromoShadow)域、或Hes1的WRPW域。这些和其他阻遏物域是本领域已知的，且在一些实施方案中对应于Urrutia,KRAB-containingzinc-fingerrepressorproteins.GenomeBiol.2003；4(10):231；Gilbert等CRISPRmediatedmodularRNA-guidedregulationoftranscriptionineukaryotes.Cell.2013；154,442-451；Konermann等,Opticalcontrolofmammalianendogenoustranscriptionandepigeneticstates.Nature.2013；500,472-476；和公开的美国专利申请U.S.S.N.14/105,017(其公开为U.S.2014/0186958A1)中描述的那些，其完整内容通过提述并入本文。在一些实施方案中，所述转录阻遏物域包含KRAB域的一个或多个重复(例如2,3,4,5,6,7,8,9或10个重复)。在一些实施方案中，KRAB域包含选自下组的氨基酸序列：SEQIDNOs:88-91。在一些实施方案中，所述转录阻遏物域包含SID蛋白的一个或多个重复。在一些实施方案中，所述SID蛋白包含如SEQIDNO:80中列出的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述阻遏物域包含SID蛋白的2,3,4,5,6,7,8,9或10个重复(例如SEQIDNO:92)。在一些实施方案中，所述阻遏物域包含SID的4个重复(例如SID4x；SEQIDNO:93)。
KRAB(人；GenBank:AAD20972.1)
MNMFKEAVTFKDVAVAFTEEELGLLGPAQRKLYRDVMVENFRNLLSVGHPPFKQDVSPIERNEQLWIMTTATRRQGNLDTLPVKALLLYDLAQT(SEQIDNO:88)
KRAB蛋白域，部分(人；GenBank:CAB52478.1):
EQVSFKDVCVDFTQEEWYLLDPAQKILYRDVILENYSNLVSVGYCITKPEVIFKIEQGEEPWILEKGFPSQCHP(SEQIDNO:89)
KRABA域，部分(人；GenBank:AAB03530.1):
EAVTFKDVAVVFTEEELGLLDPAQRKLYRDVMLENFRNLLSV(SEQIDNO:90)
KRAB(小鼠；含C2H2型域的蛋白；GenBank:CAM27971.1):
MDLVTYDDVHVNFTQDEWALLDPSQKSLYKGVMLETYKNLTAIGYIWEEHTIEDHFQTSRSHGSNKKTH(SEQIDNO:91)
SID阻遏物域:
GSGMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLP(SEQIDNO:92)
SID4x阻遏物域:
GSGMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPGSGMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPGSGMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPGSGMNIQMLLEAADYLERREREAEHGYASMLPSR(SEQIDNO:93)
在一些实施方案中，所述酶域包含表观遗传修饰物或其催化域。例如，在一些实施方案中，具有表观遗传修饰物或域的例示性dCas9融合蛋白的一般体系结构包含以下结构：
[NH2]-[NLS]-[Cas9]-[表观遗传修饰物]-[COOH],
[NH2]-[NLS]-[表观遗传修饰物]-[Cas9]-[COOH],
[NH2]-[Cas9]-[表观遗传修饰物]-[COOH],或
[NH2]-[表观遗传修饰物]-[Cas9]-[COOH]；
其中NLS是核定位信号，NH2是融合蛋白的N末端，且COOH是融合蛋白的C末端。在一些实施方案中，接头插入在dCas9和表观遗传修饰物域之间。在一些实施方案中，接头插入在NLS与表观遗传修饰物和/或dCas9域之间。在一些实施方案中，NLS位于表观遗传修饰物和/或dCas9域的C末端。在一些实施方案中，NLS位于表观遗传修饰物域和dCas9域之间。还可以存在另外的特征，如序列标签。表观遗传修饰物是本领域公知的，且通常催化DNA甲基化(和脱甲基化)或组蛋白修饰(例如组蛋白甲基化/脱甲基化，乙酰化/去乙酰化，泛素化，磷酸化，类泛素化(sumoylation)等等)。一种或多种表观遗传修饰的存在可以影响一种或多种基因的转录活性，例如将基因从“打开”状态调为“关闭”状态，反之亦然。表观遗传修饰物包括但不限于，组蛋白脱甲基酶、组蛋白甲基转移酶、羟化酶、组蛋白脱乙酰基酶和组蛋白乙酰转移酶。例示性的表观遗传修饰蛋白可见于Konermann等,Opticalcontrolofmammalianendogenoustranscriptionandepigeneticstates.Nature.2013；500,472-476；Mendenhall等,Locus-specificeditingofhistonemodificationsatendogenousenhancers.Nat.Biotechnol.2013；31,1133-1136；和Maeder等,TargetedDNAdemethylationandactivationofendogenousgenesusingprogrammableTALE-TET1fusionproteins.Nat.Biotechnol.2013；31,1137-1142；其各自完整内容通过提述并入本文。在一些实施方案中，所述表观遗传修饰物域是LSD1(赖氨酸(K)特异性脱甲基酶1A)组蛋白脱甲基酶，其在一些实施方案中全部或部分地包含如SEQIDNO:94或SEQIDNO:95中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述表观遗传修饰物域是TET1羟化酶催化域，其在一些实施方案中，包含如SEQIDNO:96中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述表观遗传修饰物是组蛋白去乙酰基酶(HDAC)效应子域。在一些实施方案中，所述HDAC效应子域全部或部分地包含对应于如Konermann等,Opticalcontrolofmammalianendogenoustranscriptionandepigeneticstates.Nature.2013；500,472-476；SEQIDNOs:97-108的附录表2中提供的任意HDAC效应器蛋白的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述表观遗传修饰物是组蛋白甲基转移酶(HMT)效应子域。在一些实施方案中，所述HMT效应子域全部或部分地包含对应于如Konermann等,Opticalcontrolofmammalianendogenoustranscriptionandepigeneticstates.Nature.2013；500,472-476；SEQIDNOs:97-108的附录表3中提供的任意HDAC效应器蛋白的氨基酸序列。
LSD1，同等型a(人):
MLSGKKAAAAAAAAAAAATGTEAGPGTAGGSENGSEVAAQPAGLSGPAEVGPGAVGERTPRKKEPPRASPPGGLAEPPGSAGPQAGPTVVPGSATPMETGIAETPEGRRTSRRKRAKVEYREMDESLANLSEDEYYSEEERNAKAEKEKKLPPPPPQAPPEEENESEPEEPSGQAGGLQDDSSGGYGDGQASGVEGAAFQSRLPHDRMTSQEAACFPDIISGPQQTQKVFLFIRNRTLQLWLDNPKIQLTFEATLQQLEAPYNSDTVLVHRVHSYLERHGLINFGIYKRIKPLPTKKTGKVIIIGSGVSGLAAARQLQSFGMDVTLLEARDRVGGRVATFRKGNYVADLGAMVVTGLGGNPMAVVSKQVNMELAKIKQKCPLYEANGQADTVKVPKEKDEMVEQEFNRLLEATSYLSHQLDFNVLNNKPVSLGQALEVVIQLQEKHVKDEQIEHWKKIVKTQEELKELLNKMVNLKEKIKELHQQYKEASEVKPPRDITAEFLVKSKHRDLTALCKEYDELAETQGKLEEKLQELEANPPSDVYLSSRDRQILDWHFANLEFANATPLSTLSLKHWDQDDDFEFTGSHLTVRNGYSCVPVALAEGLDIKLNTAVRQVRYTASGCEVIAVNTRSTSQTFIYKCDAVLCTLPLGVLKQQPPAVQFVPPLPEWKTSAVQRMGFGNLNKVVLCFDRVFWDPSVNLFGHVGSTTASRGELFLFWNLYKAPILLALVAGEAAGIMENISDDVIVGRCLAILKGIFGSSAVPQPKETVVSRWRADPWARGSYSYVAAGSSGNDYDLMAQPITPGPSIPGAPQPIPRLFFAGEHTIRNYPATVHGALLSGLREAGRIADQFLGAMYTLPRQATPGVPAQQSPSM(SEQIDNO:94)
LSD1，同等型b(人):
MLSGKKAAAAAAAAAAAATGTEAGPGTAGGSENGSEVAAQPAGLSGPAEVGPGAVGERTPRKKEPPRASPPGGLAEPPGSAGPQAGPTVVPGSATPMETGIAETPEGRRTSRRKRAKVEYREMDESLANLSEDEYYSEEERNAKAEKEKKLPPPPPQAPPEEENESEPEEPSGVEGAAFQSRLPHDRMTSQEAACFPDIISGPQQTQKVFLFIRNRTLQLWLDNPKIQLTFEATLQQLEAPYNSDTVLVHRVHSYLERHGLINFGIYKRIKPLPTKKTGKVIIIGSGVSGLAAARQLQSFGMDVTLLEARDRVGGRVATFRKGNYVADLGAMVVTGLGGNPMAVVSKQVNMELAKIKQKCPLYEANGQAVPKEKDEMVEQEFNRLLEATSYLSHQLDFNVLNNKPVSLGQALEVVIQLQEKHVKDEQIEHWKKIVKTQEELKELLNKMVNLKEKIKELHQQYKEASEVKPPRDITAEFLVKSKHRDLTALCKEYDELAETQGKLEEKLQELEANPPSDVYLSSRDRQILDWHFANLEFANATPLSTLSLKHWDQDDDFEFTGSHLTVRNGYSCVPVALAEGLDIKLNTAVRQVRYTASGCEVIAVNTRSTSQTFIYKCDAVLCTLPLGVLKQQPPAVQFVPPLPEWKTSAVQRMGFGNLNKVVLCFDRVFWDPSVNLFGHVGSTTASRGELFLFWNLYKAPILLALVAGEAAGIMENISDDVIVGRCLAILKGIFGSSAVPQPKETVVSRWRADPWARGSYSYVAAGSSGNDYDLMAQPITPGPSIPGAPQPIPRLFFAGEHTIRNYPATVHGALLSGLREAGRIADQFLGAMYTLPRQATPGVPAQQSPSM(SEQIDNO:95)
TET1催化域:
SIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVADHAQVVRVLGFFQCHSHPAQAFDDAMTQFGMSGGGSLPTCSCLDRVIQKDKGPYYTHLGAGPSVAAVREIMENRYGQKGNAIRIEIVVYTGKEGKSSHGCPIAKWVLRRSSDEEKVLCLVRQRTGHHCPTAVMVVLIMVWDGIPLPMADRLYTELTENLKSYNGHPTDRRCTLNENRTCTCQGIDPETCGASFSFGCSWSMYFNGCKFGRSPSPRRFRIDPSSPLHEKNLEDNLQSLATRLAPIYKQYAPVAYQNQVEYENVARECRLGSKEGRPFSGVTACLDFCAHPHRDIHNMNNGSTVVCTLTREDNRSLGVIPQDEQLHVLPLYKLSDTDEFGSKEGMEAKIKSGAIEVLAPRRKKRTCFTQPVPRSGKKRAAMMTEVLAHKIRAVEKKPIPRIKRKNNSTTTNNSKPSSLPTLGSNTETVQPEVKSETEPHFILKSSDNTKTYSLMPSAPHPVKEASPGFSWSPKTASATPAPLKNDATASCGFSERSSTPHCTMPSGRLSGANAAAADGPGISQLGEVAPLPTLSAPVMEPLINSEPSTGVTEPLTPHQPNHQPSFLTSPQDLASSPMEEDEQHSEADEPPSDEPLSDDPLSPAEEKLPHIDEYWSDSEHIFLDANIGGVAIAPAHGSVLIECARRELHATTPVEHPNRNHPTRLSLVFYQHKNLNKPQHGFELNKIKFEAKEAKNKKMKASEQKDQAANEGPEQSSEVNELNQIPSHKALTLTHDNVVTVSPYALTHVAGPYNHWV(SEQIDNO:96)
HDAC效应子域:
HDAC8(光滑爪蟾(X.laevis)):
ASSPKKKRKVEASMSRVVKPKVASMEEMAAFHTDAYLQHLHKVSEEGDNDDPETLEYGLGYDCPITEGIYDYAAAVGGATLTAAEQLIEGKTRIAVNWPGGWHHAKKDEASGFCYLNDAVLGILKLREKFDRVLYVDMDLHHGDGVEDAFSFTSKVMTVSLHKFSPGFFPGTGDVSDIGLGKGRYYSINVPLQDGIQDDKYYQICEGVLKEVFTTFNPEAVVLQLGADTIAGDPMCSFNMTPEGIGKCLKYVLQWQLPTLILGGGGYHLPNTARCWTYLTALIVGRTLSSEIPDHEFFTEYGPDYVLEITPSCRPDRNDTQKVQEILQSIKGNLKRVVEF(SEQIDNO:97)
RPD3(酿酒酵母):
ASSPKKKRKVEASRRVAYFYDADVGNYAYGAGHPMKPHRIRMAHSLIMNYGLYKKMEIYRAKPATKQEMCQFHTDEYIDFLSRVTPDNLEMFKRESVKFNVGDDCPVFDGLYEYCSISGGGSMEGAARLNRGKCDVAVNYAGGLHHAKKSEASGFCYLNDIVLGIIELLRYHPRVLYIDIDVHHGDGVEEAFYTTDRVMTCSFHKYGEFFPGTGELRDIGVGAGKNYAVNVPLRDGIDDATYRSVFEPVIKKIMEWYQPSAVVLQCGGDSLSGDRLGCFNLSMEGHANCVNYVKSFGIPMMVVGGGGYTMRNVARTWCFETGLLNNVVLDKDLPYEF(SEQIDNO:98)
MesoLo4(M.loti):
ASSPKKKRKVEASMPLQIVHHPDYDAGFATNHRFPMSKYPLLMEALRARGLASPDALNTTEPAPASWLKLAHAADYVDQVISCSVPEKIEREIGFPVGPRVSLRAQLATGGTILAARLALRHGIACNTAGGSHHARRAQGAGFCTFNDVAVASLVLLDEGAAQNILVVDLDVHQGDGTADILSDEPGVFTFSMHGERNYPVRKIASDLDIALPDGTGDAAYLRRLATILPELSARARWDIVFYNAGVDVHAEDRLGRLALSNGGLRARDEMVIGHFRALGIPVCGVIGGGYSTDVPALASRHAILFEVASTYAEF(SEQIDNO:99)
HDAC11(人):
ASSPKKKRKVEASMLHTTQLYQHVPETRWPIVYSPRYNITFMGLEKLHPFDAGKWGKVINFLKEEKLLSDSMLVEAREASEEDLLVVHTRRYLNELKWSFAVATITEIPPVIFLPNFLVQRKVLRPLRTQTGGTIMAGKLAVERGWAINVGGGFHHCSSDRGGGFCAYADITLAIKFLFERVEGISRATIIDLDAHQGNGHERDFMDDKRVYIMDVYNRHIYPGDRFAKQAIRRKVELEWGTEDDEYLDKVERNIKKSLQEHLPDVVVYNAGTDILEGDRLGGLSISPAGIVKRDELVFRMVRGRRVPILMVTSGGYQKRTARIIADSILNLFGLGLIGPESPSVSAQNSDTPLLPPAVPEF(SEQIDNO:100)
HDT1(拟南芥(A.thaliana)):
ASSPKKKRKVEASMEFWGIEVKSGKPVTVTPEEGILIHVSQASLGECKNKKGEFVPLHVKVGNQNLVLGTLSTENIPQLFCDLVFDKEFELSHTWGKGSVYFVGYKTPNIEPQGYSEEEEEEEEEVPAGNAAKAVAKPKAKPAEVKPAVDDEEDESDSDGMDEDDSDGEDSEEEEPTPKKPASSKKRANETTPKAPVSAKKAKVAVTPQKTDEKKKGGKAANQSEF(SEQIDNO:101)
SIRT3(人):
ASSPKKKRKVEASMVGAGISTPSGIPDFRSPGSGLYSNLQQYDLPYPEAIFELPFFFHNPKPFFTLAKELYPGNYKPNVTHYFLRLLHDKGLLLRLYTQNIDGLERVSGIPASKLVEAHGTFASATCTVCQRPFPGEDIRADVMADRVPRCPVCTGVVKPDIVFFGEPLPQRFLLHVVDFPMADLLLILGTSLEVEPFASLTEAVRSSVPRLLINRDLVGPLAWHPRSRDVAQLGDVVHGVESLVELLGWTEEMRDLVQRETGKLDGPDKEF(SEQIDNO:102)
HST2(酿酒酵母):
ASSPKKKRKVEASTEMSVRKIAAHMKSNPNAKVIFMVGAGISTSCGIPDFRSPGTGLYHNLARLKLPYPEAVFDVDFFQSDPLPFYTLAKELYPGNFRPSKFHYLLKLFQDKDVLKRVYTQNIDTLERQAGVKDDLIIEAHGSFAHCHCIGCGKVYPPQVFKSKLAEHPIKDFVKCDVCGELVKPAIVFFGEDLPDSFSETWLNDSEWLREKITTSGKHPQQPLVIVVGTSLAVYPFASLPEEIPRKVKRVLCNLETVGDFKANKRPTDLIVHQYSDEFAEQLVEELGWQEDFEKILTAQGGMGEF(SEQIDNO:103)
CobB(大肠杆菌(K12)):
ASSPKKKRKVEASMEKPRVLVLTGAGISAESGIRTFRAADGLWEEHRVEDVATPEGFDRDPELVQAFYNARRRQLQQPEIQPNAAHLALAKLQDALGDRFLLVTQNIDNLHERAGNTNVIHMHGELLKVRCSQSGQVLDWTGDVTPEDKCHCCQFPAPLRPHVVWFGEMPLGMDEIYMALSMADIFIAIGTSGHVYPAAGFVHEAKLHGAHTVELNLEPSQVGNEFAEKYYGPASQVVPEFVEKLLKGLKAGSIAEF(SEQIDNO:104)
HST2(白色念珠菌(C.albicans)):
ASSPKKKRKVEASMPSLDDILKPVAEAVKNGKKVTFFNGAGISTGAGIPDFRSPDTGLYANLAKLNLPFAEAVFDIDFFKEDPKPFYTLAEELYPGNFAPTKFHHFIKLLQDQGSLKRVYTQNIDTLERLAGVEDKYIVEAHGSFASNHCVDCHKEMTTETLKTYMKDKKIPSCQHCEGYVKPDIVFFGEGLPVKFFDLWEDDCEDVEVAIVAGTSLTVFPFASLPGEVNKKCLRVLVNKEKVGTFKHEPRKSDIIALHDCDIVAERLCTLLGLDDKLNEVYEKEKIKYSKAETKEIKMHEIEDKLKEEAHLKEDKHTTKVDKKEKQNDANDKELEQLIDKAKAEF(SEQIDNO:105)
SIRT5(人):
ASSPKKKRKVEASSSSMADFRKFFAKAKHIVIISGAGVSAESGVPTFRGAGGYWRKWQAQDLATPLAFAHNPSRVWEFYHYRREVMGSKEPNAGHRAIAECETRLGKQGRRVVVITQNIDELHRKAGTKNLLEIHGSLFKTRCTSCGVVAENYKSPICPALSGKGAPEPGTQDASIPVEKLPRCEEAGCGGLLRPHVVWFGENLDPAILEEVDRELAHCDLCLVVGTSSVVYPAAMFAPQVAARGVPVAEFNTETTPATNRFRFHFQGPCGTTLPEALACHENETVSEF(SEQIDNO:106)
Sir2A(恶性疟原虫(P.falciparum)):
ASSPKKKRKVEASMGNLMISFLKKDTQSITLEELAKIIKKCKHVVALTGSGTSAESNIPSFRGSSNSIWSKYDPRIYGTIWGFWKYPEKIWEVIRDISSDYEIEINNGHVALSTLESLGYLKSVVTQNVDGLHEASGNTKVISLHGNVFEAVCCTCNKIVKLNKIMLQKTSHFMHQLPPECPCGGIFKPNIILFGEVVSSDLLKEAEEEIAKCDLLLVIGTSSTVSTATNLCHFACKKKKKIVEINISKTYITNKMSDYHVCAKFSELTKVANILKGSSEKNKKIMEF(SEQIDNO:107)
SIRT6(人):
ASSPKKKRKVEASMSVNYAAGLSPYADKGKCGLPEIFDPPEELERKVWELARLVWQSSSVVFHTGAGISTASGIPDFRGPHGVWTMEERGLAPKFDTTFESARPTQTHMALVQLERVGLLRFLVSQNVDGLHVRSGFPRDKLAELHGNMFVEECAKCKTQYVRDTVVGTMGLKATGRLCTVAKARGLRACRGELRDTILDWEDSLPDRDLALADEASRNADLSITLGTSLQIRPSGNLPLATKRRGGRLVIVNLQPTKHDRHADLRIHGYVDEVMTRLMKHLGLEIPAWDGPRVLERALPPLEF(SEQIDNO:108)
HMT效应子域:
NUE(C.trachomatis):
ASSPKKKRKVEASMTTNSTQDTLYLSLHGGIDSAIPYPVRRVEQLLQFSFLPELQFQNAAVKQRIQRLCYREEKRLAVSSLAKWLGQLHKQRLRAPKNPPVAICWINSYVGYGVFARESIPAWSYIGEYTGILRRRQALWLDENDYCFRYPVPRYSFRYFTIDSGMQGNVTRFINHSDNPNLEAIGAFENGIFHIIIRAIKDILPGEELCYHYGPLYWKHRKKREEFVPQEEEF(SEQIDNO:109)
vSET(P.bursariachlorellavirus):
ASSPKKKRKVEASMFNDRVIVKKSPLGGYGVFARKSFEKGELVEECLCIVRHNDDWGTALEDYLFSRKNMSAMALGFGAIFNHSKDPNARHELTAGLKRMRIFTIKPIAIGEEITISYGDDYWLSRPRLTQNEF(SEQIDNO:110)
SUV39H1(人):
ASSPKKKRKVEASNLKCVRILKQFHKDLERELLRRHHRSKTPRHLDPSLANYLVQKAKQRRALRRWEQELNAKRSHLGRITVENEVDLDGPPRAFVYINEYRVGEGITLNQVAVGCECQDCLWAPTGGCCPGASLHKFAYNDQGQVRLRAGLPIYECNSRCRCGYDCPNRVVQKGIRYDLCIFRTDDGRGWGVRTLEKIRKNSFVMEYVGEIITSEEAERRGQIYDRQGATYLFDLDYVEDVYTVDAAYYGNISHFVNHSCDPNLQVYNVFIDNLDERLPRIAFFATRTIRAGEELTFDYNMQVDPVDMESTRMDSNFGLAGLPGSPKKRVRIECKCGTESCRKYLFEF(SEQIDNO:111)
DIM5(N.crassa):
ASSPKKKRKVEASMEKAFRPHFFNHGKPDANPKEKKNCHWCQIRSFATHAQLPISIVNREDDAFLNPNFRFIDHSIIGKNVPVADQSFRVGCSCASDEECMYSTCQCLDEMAPDSDEEADPYTRKKRFAYYSQGAKKGLLRDRVLQSQEPIYECHQGCACSKDCPNRVVERGRTVPLQIFRTKDRGWGVKCPVNIKRGQFVDRYLGEIITSEEADRRRAESTIARRKDVYLFALDKFSDPDSLDPLLAGQPLEVDGEYMSGPTRFINHSCDPNMAIFARVGDHADKHIHDLALFAIKDIPKGTELTFDYVNGLTGLESDAHDPSKISEMTKCLCGTAKCRGYLWEF(SEQIDNO:112)
KYP(拟南芥):
ASSPKKKRKVEASDISGGLEFKGIPATNRVDDSPVSPTSGFTYIKSLIIEPNVIIPKSSTGCNCRGSCTDSKKCACAKLNGGNFPYVDLNDGRLIESRDVVFECGPHCGCGPKCVNRTSQKRLRFNLEVFRSAKKGWAVRSWEYIPAGSPVCEYIGVVRRTADVDTISDNEYIFEIDCQQTMQGLGGRQRRLRDVAVPMNNGVSQSSEDENAPEFCIDAGSTGNFARFINHSCEPNLFVQCVLSSHQDIRLARVVLFAADNISPMQELTYDYGYALDSVHEF(SEQIDNO:113)
SUVR4(拟南芥):
ASSPKKKRKVEASQSAYLHVSLARISDEDCCANCKGNCLSADFPCTCARETSGEYAYTKEGLLKEKFLDTCLKMKKEPDSFPKVYCKDCPLERDHDKGTYGKCDGHLIRKFIKECWRKCGCDMQCGNRVVQRGIRCQLQVYFTQEGKGWGLRTLQDLPKGTFICEYIGEILTNTELYDRNVRSSSERHTYPVTLDADWGSEKDLKDEEALCLDATICGNVARFINHRCEDANMIDIPIEIETPDRHYYHIAFFTLRDVKAMDELTWDYMIDFNDKSHPVKAFRCCCGSESCRDRKIKGSQGKSIERRKIVSAKKQQGSKEVSKKRKEF(SEQIDNO:114)
Set4(秀丽线虫):
ASSPKKKRKVEASMQLHEQIANISVTFNDIPRSDHSMTPTELCYFDDFATTLVVDSVLNFTTHKMSKKRRYLYQDEYRTARTVMKTFREQRDWTNAIYGLLTLRSVSHFLSKLPPNKLFEFRDHIVRFLNMFILDSGYTIQECKRYSQEGHQGAKLVSTGVWSRGDKIERLSGVVCLLSSEDEDSILAQEGSDFSVMYSTRKRCSTLWLGPGAYINHDCRPTCEFVSHGSTAHIRVLRDMVPGDEITCFYGSEFFGPNNIDCECCTCEKNMNGAFSYLRGNENAEPIISEKKTKYELRSRSEF(SEQIDNO:115)
Set1(秀丽线虫):
ASSPKKKRKVEASMKVAAKKLATSRMRKDRAAAASPSSDIENSENPSSLASHSSSSGRMTPSKNTRSRKGVSVKDVSNHKITEFFQVRRSNRKTSKQISDEAKHALRDTVLKGTNERLLEVYKDVVKGRGIRTKVNFEKGDFVVEYRGVMMEYSEAKVIEEQYSNDEEIGSYMYFFEHNNKKWCIDATKESPWKGRLINHSVLRPNLKTKVVEIDGSHHLILVARRQIAQGEELLYDYGDRSAETIAKNPWLVNTEF(SEQIDNO:116)
SETD8(人)
ASSPKKKRKVEASSCDSTNAAIAKQALKKPIKGKQAPRKKAQGKTQQNRKLTDFYPVRRSSRKSKAELQSEERKRIDELIESGKEEGMKIDLIDGKGRGVIATKQFSRGDFVVEYHGDLIEITDAKKREALYAQDPSTGCYMYYFQYLSKTYCVDATRETNRLGRLINHSKCGNCQTKLHDIDGVPHLILIASRDIAAGEELLYDYGDRSKASIEAFPWLKHEF(SEQIDNO:117)
TgSET8(T.gondii):
ASSPKKKRKVEASASRRTGEFLRDAQAPSRWLKRSKTGQDDGAFCLETWLAGAGDDAAGGERGRDREGAADKAKQREERRQKELEERFEEMKVEFEEKAQRMIARRAALTGEIYSDGKGSKKPRVPSLPENDDDALIEIIIDPEQGILKWPLSVMSIRQRTVIYQECLRRDLTACIHLTKVPGKGRAVFAADTILKDDFVVEYKGELCSEREAREREQRYNRSKVPMGSFMFYFKNGSRMMAIDATDEKQDFGPARLINHSRRNPNMTPRAITLGDFNSEPRLIFVARRNIEKGEELLVDYGERDPDVIKEHPWLNSEF(SEQIDNO:118)
本领域技术人员将理解使用本发明公开的技术可将任意例示性的Cas9蛋白，包括例示性的Cas9核酸酶、变体及其融合物，例如本文描述的，投递至细胞，且本公开在此方面不受限。
核酸酶效应器蛋白
TALE核酸酶或TALEN是包含与DNA切割域(例如FokI域)联合的转录激活物样效应子DNA结合域的人工核酸酶。已报道了一些用于生成工程化的TALE构建体的模式装配设计方案(Zhang,Feng；等(February2011).”Efficientconstructionofsequence-specificTALeffectorsformodulatingmammaliantranscription”.NatureBiotechnology29(2):149–53；Geiβler,R.；Scholze,H.；Hahn,S.；Streubel,J.；Bonas,U.；Behrens,S.E.；Boch,J.(2011),Shiu,Shin-Han.编“TranscriptionalActivatorsof人GeneswithProgrammableDNA-Specificity”.PLoSONE6(5):e19509；Cermak,T.；Doyle,E.L.；Christian,M.；Wang,L.；Zhang,Y.；Schmidt,C.；Baller,J.A.；Somia,N.V.等(2011).“EfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector-basedconstructsforDNAtargeting”.NucleicAcidsResearch；Morbitzer,R.；Elsaesser,J.；Hausner,J.；Lahaye,T.(2011).“AssemblyofcustomTALE-typeDNAbindingdomainsbymodularcloning”.NucleicAcidsResearch；Li,T.；Huang,S.；Zhao,X.；Wright,D.A.；Carpenter,S.；Spalding,M.H.；Weeks,D.P.；Yang,B.(2011).“ModularlyassembleddesignerTALeffectornucleasesfortargetedgeneknockoutandgenereplacementineukaryotes”.NucleicAcidsResearch.；Weber,E.；Gruetzner,R.；Werner,S.；Engler,C.；Marillonnet,S.(2011).Bendahmane,Mohammed.编“AssemblyofDesignerTALEffectorsbyGoldenGateCloning”.PLoSONE6(5):e19722；其各自完整内容通过提述并入本文)。本领域技术人员将理解TALE核酸酶可经工程化以高特异性靶向实际上任何基因组序列，且这类工程化的核酸酶可用于本发明技术的实施方案中以操纵细胞的基因组，例如通过经由本文中公开的方法或策略在适合TALEN结合并切割细胞基因组内的其靶序列的情况下投递相应的TALEN。在一些实施方案中，投递的TALEN靶向与疾病或病症有关的基因或等位基因。在一些实施方案中，对受试者投递TALEN赋予对受试者的治疗益处。
锌指核酸酶是一类人工核酸酶，其包含DNA切割域和锌指DNA结合域。在一些实施方案中，所述DNA切割域是限制性内切核酸酶，例如FokI的非特异性DNA切割域。在一些实施方案中，所述DNA切割域是仅在与同一类型的第二DNA切割域二聚化时切割双链DNA的域。在一些实施方案中，所述DNA切割域经由接头，例如肽接头融合于锌指域的C末端。在一些实施方案中，所述锌指域包含约3至约6个锌指且特异性识别和结合长度约9-20个核苷酸的靶序列。在一些实施方案中，通过本发明提供的系统或方法将多个锌指核酸酶分子投递给靶细胞，其中一个锌指核酸酶分子的锌指域在第二锌指核酸酶分子的靶序列的紧密近端结合靶序列。在一些实施方案中，在彼此的紧密近端结合靶序列的锌指核酸酶分子的锌指域是不同的。在一些实施方案中，通过本文提供的系统或方法投递至细胞的锌指核酸酶分子在另一锌指核酸酶分子的靶序列的紧密近端结合靶核酸序列，从而分子的DNA切割域二聚化并在两个靶序列之间的位点处切割DNA分子。
在一些实施方案中，经由本文公开的策略或方法通过投递至细胞的核酸酶来编辑靶细胞的基因组，例如通过TALEN、或锌指核酸酶、或多种这类核酸酶或这类核酸酶的组合。在一些实施方案中，通过核酸酶将单链或双链断裂引入靶细胞基因组内的特定位点，从而导致靶向的基因组序列的破坏。在一些实施方案中，靶向的基因组序列是基因编码区内的核酸序列。在一些实施方案中，核酸酶引入的链断裂导致靶基因内的突变，其损害编码的基因产物的表达。在一些实施方案中，核酸与核酸酶一起共投递至细胞。在一些实施方案中，所述核酸包含与邻近核酸酶靶位点的序列相同或同源的序列。在一些这类实施方案中，通过细胞DNA修复体系修复由核酸酶引起的链断裂以将全部或部分的共投递的核酸在断裂位点处引入细胞DNA，从而导致共投递的核酸或其部分的靶向性插入。在一些实施方案中，插入导致致病性等位基因的破坏或修复。在一些实施方案中，通过适宜的测定法检测插入，例如DNA测序测定、southern印迹测定、或针对由共投递的核酸编码的报道基因的测定法，例如荧光蛋白或对抗生素的抗性。在一些实施方案中，所述核酸通过与超电荷蛋白联合来共投递。在一些实施方案中，所述超电荷蛋白还与功能性效应器蛋白例如核酸酶联合。在一些实施方案中，核酸酶投递至靶细胞导致基因功能的临床或治疗上有益的破坏。
在一些实施方案中，从受试者获得细胞并通过本文提供的系统或方法离体将核酸酶或其他效应器蛋白投递至细胞。在一些实施方案中，从经处理的细胞选择其中已引起期望的核酸酶介导的基因组编辑事件的那些细胞。在一些实施方案中，将携带期望的基因组突变或改变的经处理细胞返回至获得其的受试者。
用于靶向特定序列的核酸酶(例如TALE或锌指核酸酶)的工程化、生成和分离，和在特定靶序列处编辑细胞基因组的方法是本领域公知的(参见，例如Mani等,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications335:447-457,2005；Perez等,NatureBiotechnology26:808-16,2008；Kim等,GenomeResearch,19:1279-88,2009；Urnov等,Nature435:646-51,2005；Carroll等,GeneTherapy15:1463-68,2005；Lombardo等,NatureBiotechnology25:1298-306,2007；Kandavelou等,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications388:56–61,2009；和Hockemeyer等,NatureBiotechnology27(9):851-59,2009，以及在每种核酸酶的相应部分中记载的参考文献)。熟练技术人员基于本文中提供的指导将能够确定适用于本公开上下文的方法。
TALE效应器蛋白
在一些实施方案中，通过本文提供的系统或方法将包含TALE域的效应器蛋白投递给靶细胞。在一些实施方案中，通过由本发明的方面提供的系统或方法将TALE效应器，例如工程化的TALE转录因子(包含TALEDNA结合域和异源转录激活物或阻遏物域)投递给细胞。在一些实施方案中，所述TALE效应器，例如转录因子，以足以激活或抑制细胞中转录因子对靶基因的转录的量投递给细胞。在一些实施方案中，以足以引起靶细胞内的表型变化，例如细胞功能的变化或发育潜力的变化的量和一段时间段来投递转录因子。例示性TALE转录因子在本文描述，且熟练技术人员将能基于本文提供的指导和本领域中这类TALE转录因子的知识来鉴定另外的适宜TALE转录因子。
在一些实施方案中，使靶细胞例如体细胞与TALE转录因子或这类因子的组合接触，所述因子与本文中提供的超电荷蛋白联合。在一些实施方案中，所述靶细胞是原代体细胞且体外或离体与联合于超电荷蛋白的TALE转录因子接触。在一些实施方案中，所述TALE转录因子与正电荷的超电荷蛋白联合，例如如本文描述的。在一些实施方案中，所述TALE转录因子与带负电荷的超电荷蛋白联合，例如如本文描述的。在一些实施方案中，所述TALE转录因子与阳离子脂质和/或阳离子聚合物联合，例如如本文描述的。在一些实施方案中，所述TALE转录因子与带负电荷的超电荷蛋白和阳离子脂质和/或阳离子聚合物联合，例如如本文描述的。
在一些实施方案中，使靶细胞与如本文中提供的联合于超电荷蛋白(和任选地阳离子脂质和/或阳离子聚合物)的TALE转录因子接触或反复接触，并检测到细胞表型或基因表达中的期望变化。在一些实施方案中，使靶细胞与如本文中提供的联合于超电荷蛋白(和任选地阳离子脂质和/或阳离子聚合物)的TALE转录因子反复接触，直至检测到期望的细胞表型的形成。用于检测细胞表型和基因表达的方法是本领域技术人员公知的，且包括例如，形态学分析，和通过确立的方法如免疫组化、荧光活化的细胞分选(FACS)或荧光显微术来检测标志物基因表达。在一些实施方案中，使靶细胞与如本文中提供的联合于超电荷蛋白的TALE转录因子接触至少3小时,至少6小时,至少12小时,至少1天,至少2天,至少3天,至少4天,至少5天,至少6天,至少7天,至少10-12天,至少12-15天,至少15-20天,至少20-25天,至少25-30天,至少30-40天,至少40-50天,至少50-60天,至少60-70或至少70-100天的时间段。
在一些实施方案中，使靶细胞与如本文中提供的联合于超电荷蛋白(和任选地阳离子脂质和/或阳离子聚合物)的TALE转录因子接触，其量和时间段足以将细胞程序化导向至不同的细胞状态。如对于本领域技术人员明显的，程序化或再程序化细胞的所需量将取决于多种因素，例如细胞类型和处理时程安排。一般地，通过本文提供的系统或方法投递TALE转录因子至靶向的体细胞将在低于可观察到显著毒性的浓度的浓度。临界浓度将依赖于例如具体的TALE转录因子，其所联合的超电荷蛋白，联合类型，和所处理的细胞类型。
本领域技术人员可通过常规实验手段确立用于投递至特定细胞类型的联合于超电荷蛋白(和任选地阳离子脂质和/或阳离子聚合物)的功能性效应器蛋白的有用浓度。在一些实施方案中，使靶细胞与浓度为约1pM至约1μM的联合于超电荷蛋白(和任选地阳离子脂质和/或阳离子聚合物)的功能性效应器蛋白体外或离体接触。在一些实施方案中，使靶细胞与浓度为以下的联合于超电荷蛋白的功能性效应器蛋白体外或离体接触：约1pM、约2.5pM、约5pM、约7.5pM、约10pM、约20pM、约25pM、约30pM、约40pM、约50pM、约60pM、约70pM、约75pM、约80pM、约90pM、约100pM、约200pM、约250pM、约300pM、约400pM、约500pM、约600pM、约700pM、约750pM、约800pM、约900pM、约1nM、约2nM、约3nM、约4nM、约5nM、约6nM、约7nM、约8nM、约9nM、约10nM、约20nM、约25nM、约30nM、约40nM、约50nM、约60nm、约70nM、约75nM、约80nM、约90nM、约100nM、约200nM、约250nM、约300nM、约400nM、约500nM、约600nM、约700nM、约750nM、约800nM、约900nM,或约1μM。靶细胞暴露于功能性效应器蛋白，和如果必要的话，在缺少功能性效应器蛋白情况下的施用后温育的有用时间，以及可用于实现期望的生物学效果(例如基因转录变化，通过投递的核酸酶切割靶位点等等)的施用/温育循环数，或期望的细胞表型也可以由本领域技术人员通过常规实验手段确定。
在一些实施方案中，用于通过本文提供的系统或方法投递功能性效应器蛋白的靶细胞是通过从受试者的活组织检查获得的原代细胞。在一些实施方案中，该受试者诊断为患有疾病。在一些实施方案中，所述疾病是变性疾病(degenerativedisease)，其特征为特定细胞类型例如神经细胞的降低的功能。在一些实施方案中，依照本文公开的策略或方法用功能性效应器蛋白处理的细胞，或这类细胞的后代，用在细胞替换治疗办法中。在一些实施方案中，在自体同源细胞替换治疗办法中对获得体细胞的受试者施用经处理的细胞。
在一些实施方案中，将能使细胞从一个分化状态转化为另一个的功能性效应器蛋白，例如TALE转录因子，通过本文提供的系统或方法体外或体内投递给靶细胞。引起转分化的转录因子是本领域中已知的(参见，例如Zhou等,Nature455:627-33,2008)。在一些实施方案中，将调控PPARγ或PRDM16的表达的TALE转录因子通过如本发明提供的系统或方法投递至成纤维细胞。本领域已知表达这些转录因子在将成纤维细胞程序化为褐色脂肪或白色脂肪细胞状态中是关键步骤。在一些实施方案中，从自需要褐色脂肪细胞的受试者获得的成纤维细胞生成程序化的褐色脂肪细胞，并施用给该受试者，例如用在涉及该受试者的细胞替换治疗办法中。
复合物的形成
本发明提供包含与要投递的一种或多种功能性效应器蛋白联合的超电荷蛋白的复合物。在一些实施方案中，超电荷蛋白经由非共价相互作用与要投递的一种或多种功能性效应器蛋白联合。在一些实施方案中，超电荷蛋白经由静电相互作用与一种或多种功能性效应器蛋白联合。在某些实施方案中，超电荷蛋白具有总体净正电荷，而要投递的功能性效应器蛋白具有总体净负电荷。在一些实施方案中，复合物还包含阳离子脂质和/或阳离子聚合物。例如，在一些实施方案中，复合物的超电荷蛋白是超级带负电荷的，从而允许与阳离子脂质和/或聚合物联合。
在某些实施方案中，超电荷蛋白经由共价键与要投递的一种或多种功能性效应器蛋白联合。例如，超电荷蛋白可以融合于要投递的功能性效应器蛋白。共价附接可以是直接或间接的(例如经由接头)。在一些实施方案中，共价附接经由一个或多个接头介导。在一些实施方案中，接头是可切割接头。在某些实施方案中，所述可切割的接头包含酰胺、酯或二硫键。例如，所述接头可以是可被细胞酶切割的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述酶是蛋白酶。在其他实施方案中，所述酶是酯酶。在一些实施方案中，所述酶是在特定细胞类型中比在其他细胞类型中更高度表达的酶。例如，所述酶可以是在肿瘤细胞中比在非肿瘤细胞中更高度表达的酶。例示性接头和切割那些接头的酶在下文呈现。
可切割接头
1X表示超电荷蛋白或要投递的功能性效应器蛋白
*指观察到的切割位点
为了仅给出一个具体的例子是，+36GFP可以与要投递的功能性效应器蛋白通过可切割接头如ALAL(SEQIDNO:254)联合，以产生+36GFP-(GGS)4-ALAL-(GGS)4-[功能性效应器蛋白X](SEQIDNO:255)。
在某些实施方案中，使要投递的功能性效应器蛋白与超电荷蛋白接触以形成复合物。在一些实施方案中，复合物的形成在pH7或约pH7进行。在一些实施方案中，合物的形成在约pH5、约pH6、约pH7、约pH8或约pH9进行。复合物的形成通常在不对超电荷蛋白和/或功能性效应器蛋白的功能有不利影响的pH进行。在一些实施方案中，复合物的形成在室温进行。在一些实施方案中，复合物的形成在37℃或其附近进行。在一些实施方案中，复合物的形成在低于4℃，在约4℃，在约10℃，在约15℃，在约20℃，在约25℃，在约30℃，在约35℃，在约37℃，在约40℃或高于40℃进行。复合物的形成通常在不对超电荷蛋白和/或功能性效应器蛋白的功能有不利影响的温度进行。在一些实施方案中，复合物的形成在无血清培养基中进行。在一些实施方案中，复合物的形成在存在CO2(例如约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％或更多)的情况下进行。
在一些实施方案中，使用约100nM的功能性效应器蛋白的浓度实施复合物的形成。在一些实施方案中，使用浓度为约25nM、约50nM、约75nM、约90nM、约100nM、约110nM、约125nM、约150nM、约175nM或约200nM的功能性效应器蛋白的浓度实施复合物的形成。在一些实施方案中，使用约40nM的超电荷蛋白浓度实施复合物的形成。在一些实施方案中，使用浓度为约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM或约100nM的超电荷蛋白的浓度实施复合物的形成。
在一些实施方案中，在过量功能性效应器蛋白的条件下实施复合物的形成。在一些实施方案中，以功能性效应器蛋白:超电荷蛋白为约20:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1或约1:1的比率实施复合物的形成。在一些实施方案中，以功能性效应器蛋白:超电荷蛋白的比率为约3:1实施复合物的形成。在一些实施方案中，超电荷蛋白:功能性效应器蛋白为约20:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1或约1:1实施复合物的形成。
在一些实施方案中，通过将超电荷蛋白与功能性效应器蛋白混合，并搅动混合物(例如通过颠倒)实施复合物的形成。在一些实施方案中，通过将超电荷蛋白与功能性效应器蛋白混合并允许混合物静置实施复合物的形成。在一些实施方案中，在存在药学可接受载体或赋形剂的情况下实施复合物的形成。在一些实施方案中，将所述复合物进一步与药学可接受载体或赋形剂组合。例示性赋形剂或载体包括水、溶剂、脂质、蛋白、肽、核内体裂解剂(例如氯奎、芘丁酸)、小分子、糖类、缓冲剂、天然聚合物、合成聚合物(例如PLGA、聚氨酯、聚酯、聚已酸内酯、聚磷腈(polyphosphazenes))、药学试剂等。
在一些实施方案中，包含超电荷蛋白和功能性效应器蛋白的复合物可能比单独的超电荷蛋白或单独的功能性效应器蛋白在凝胶电泳测定法中更缓慢地迁移。
应用
本发明提供包含与要投递至细胞的功能性效应器蛋白(例如核酸酶、转录激活物/阻遏物、重组酶、Cas9蛋白包含其变体和融合物，等等)联合的超电荷蛋白(天然存在或经工程化的)的组合物，以及使用这类组合物的方法和这类组合物的用途。在某些实施方案中，提供包含Cas9蛋白(例如其中Cas9蛋白与gRNA联合)和阳离子脂质的组合物。在某些实施方案中，提供包含Cas9蛋白(例如其中Cas9蛋白与gRNA联合)和阳离子聚合物的组合物。本发明的组合物可用于治疗或预防任何可能受益于例如药剂投递至细胞的疾病。本发明组合物还可以用于转染或处理细胞用于研究目的。
在一些实施方案中，依照本发明的组合物可用于研究目的，例如以在研究背景中将功能性效应器蛋白有效投递至细胞。在一些实施方案中，依照本发明的组合物可用于治疗目的。在一些实施方案中，依照本发明的组合物可用于治疗任意的多种疾病、病症和/或状况，包括但不限于以下一种或多种：自身免疫性病症(例如糖尿病、狼疮、多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎)；炎性病症(例如关节炎、盆腔炎(pelvicinflammatorydisease))；感染性疾病(例如病毒感染(例如HIV,HCV,RSV)、细菌感染、真菌感染、败血症)；神经学病症(例如阿尔兹海默病(Alzheimer’sdisease)、亨廷顿氏病(Huntington’sdisease)；孤独症；迪谢内肌营养不良(Duchennemusculardystrophy))；新血管病症(例如动脉粥样硬化、血胆脂醇过多、血栓形成、凝血病症、血管生成性病症如黄斑变性)；增殖性病症(例如癌症、良性赘生物)；呼吸病症(例如慢性阻塞性肺病)；消化病症(例如炎性肠病、溃疡)；肌骨骼病症(例如纤维肌痛(fibromyalgia)、关节炎)；内分泌、代谢和营养病症(例如糖尿病、骨质疏松)；泌尿病症(例如肾病)；心理病症(例如抑郁、精神分裂症)；皮肤病症(例如伤口、湿疹)；血液和淋巴病症(例如贫血、血友病)；等等。
本发明的组合物可用于临床背景。例如，超电荷蛋白可以与可用于治疗应用的功能性效应器蛋白联合。这类功能性效应器蛋白可以是，例如核酸酶或转录激活物。也可以使用包含Cas9蛋白和阳离子脂质的其他组合物用于治疗应用。
在一些实施方案中，与超电荷蛋白联合的超电荷蛋白或功能性效应器蛋白包含可检测标记物。这些分子可用于检测、成像、疾病分期、诊断或患者选择。适宜的标签包括荧光、化学发光、酶标记物，比色、磷光、基于密度的标记物，例如基于电子密度的标记物，和一般的对比剂(contrastagent)和/或放射性标记物。
药物组合物
本发明提供包含与要投递的至少一种功能性效应器蛋白(且在一些实施方案中被阳离子脂质包封)联合的超电荷蛋白的组合物。提供包含Cas9蛋白和阳离子脂质的其他组合物。如此，本发明提供药物组合物，其包含与功能性效应器蛋白联合的一种或多种超电荷蛋白；和/或与阳离子脂质和/或阳离子聚合物联合的一种或多种功能性效应器蛋白，以及一种或多种药学可接受的赋形剂。药物组合物可任选地包含一种或多种另外的治疗活性物质。依照一些实施方案，提供将包含与要投递的功能性效应器蛋白联合的一种或多种超电荷蛋白的药物组合物施用给有此需要的受试者的方法。在一些实施方案中，组合物施用给人。就本公开目的而言，短语“活性成分”一般指与功能性效应器蛋白联合的Cas9蛋白和/或超电荷蛋白，或如本文描述的要投递的功能性效应器蛋白。
尽管本文中提供的药物组合物的描述主要针对适用于施用给人的药物组合物，熟练技术人员将理解这类组合物一般适用于施用给所有种类的动物。能较好地理解对适用于施用给人的药物组合物更改以使得该组合物适用于施用给各种动物，且普通技能的兽医药理学家能仅使用普通的实验手段(若有的话)设计和/或实施这类更改。施用所述药物组合物的受试者包括但不限于，人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物如牛、猪、马、绵羊、猫、犬、小鼠和/或大鼠；和/或禽类，包括商业相关的禽类如鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
可以通过药理学领域中已知或后来开发的任何方法制备本文中描述的药物组合物的配制剂。一般地，此类制备方法包括下述步骤，即使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分联合，然后若必要和/或想要的话，运输和/或包装产品成期望的单剂量或多剂量形式。
依照本发明的药物组合物可以以单单位剂量和/或多个单单位剂量大批制备、包装和/或销售。如本文中使用的，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量一般等于将施用给受试者的活性成分剂量和/或这类剂量的方便分数，例如，这类剂量的一半或三分之一。
依照本发明的药物组合物中活性成分、药学可接受赋形剂和/或任何另外的成分的相对量将随着治疗的受试者的身份、块头和/或状况以及进一步随着要施用组合物的路径而变化。例如，所述组合物可以包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。
另外，药物组合物可以包含药学可接受赋形剂，如本文中使用的，其包括任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等张剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，如适合于期望的特定剂量形式的。Remington’sTheScienceandPracticeofPharmacy,21stEdition,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；其通过提及完整并入本文)公开了配制药物组合物中使用的各种赋形剂及其已知的制备技术。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，诸如通过产生任何不想要的生物效应或以其它方式与药物组合物的任何其它组分以有害的方式相互作用，涵盖其用途在本公开内容的范围内。
在一些实施方案中，药学可接受的赋形剂是至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％纯的。在一些实施方案中，批准赋形剂用于人和用于兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂被美国食品和药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂是药物级的。在一些实施方案中，赋形剂满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
用于制造药物组合物的药学可接受的赋形剂包括但不限于，惰性稀释剂、分散剂和/或粒化剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、结合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。这类赋形剂可以任选地包含在药学配制剂中。赋形剂如可可油和栓剂蜡(suppositorywaxe)、着色剂、包被剂、甜化剂、调味剂和/或芳香剂可根据配制者的判断而存在于组合物中。
例示性稀释剂包括但不限于，碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、乳糖磷酸钠、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、粉化糖、等等和/或其组合。
例示性粒化剂和/或分散剂包括但不限于，马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羧基乙酸淀粉钠、黏土、褐藻酸、瓜尔豆胶(guargum)、柑橘浆、琼脂、膨润土、纤维素和木材产品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸钠、碳酸钠、交联的聚(乙烯吡咯烷酮)(交聚维酮，crospovidone)、羧甲基淀粉钠(羧基乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联的羧甲基纤维素钠(交联甲羧纤维素，croscarmellose)、甲基纤维素、预胶凝淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝(Veegum)、十二醇硫酸钠(sodiumlaurylsulfate)、季铵化合物，等等和/或其组合。
例示性表面活性剂和/或乳化剂包括但不限于，天然乳化剂(例如，阿拉伯树胶、琼脂、褐藻酸、藻酸钠、黄芪胶、chondrux、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶体状黏土(例如，膨润土[硅酸铝]和[硅酸镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如硬脂酰醇、十六烷醇、油醇、三乙酸甘油酯单硬脂酸酯(triacetinmonostearate)、乙二醇二硬脂酸酯(ethyleneglycoldistearate)、甘油基单硬脂酸酯、和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(carbomer)(例如羧基聚亚甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、角叉胶、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素钠、粉状纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、山梨聚糖脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯(20)、聚氧乙烯山梨聚糖(60)、聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯[80]、山梨聚糖单棕榈酸酯[40]、山梨聚糖单硬脂酸酯[60]、山梨聚糖三硬脂酸酯[65]、甘油基单油酸酯、山梨聚糖单油酸酯[80])、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯单硬脂酸酯[45]、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚氧亚甲基硬脂酸酯和)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如)、聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂基醚(30))、聚(乙烯-吡咯烷酮)、二乙二醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、十二烷基硫酸钠、F68、188、西曲溴铵(cetrimoniumbromide)、氯化十六烷基吡啶(cetylpyridiniumchloride)、苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)、多库酯钠(docusatesodium)等等和/或其组合。
例示性结合剂包括但不限于，淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)；天然和合成的胶质(例如阿拉伯树胶、藻酸钠、爱尔兰藓提取物(extractofIrishmoss)、Panwar胶、印度胶(ghattigum)、isapol壳的胶浆、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、醋酸纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸镁铝和落叶松阿拉伯半乳糖)；藻酸盐；聚环氧乙烷；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇；等等；及其组合。
例示性防腐剂可以包括但不限于，抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其他防腐剂。例示性抗氧化剂包括但不限于，alpha生育酚、抗坏血酸、维生素c棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、二羟基丙硫醇、偏亚硫酸氢钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、重亚硫酸钠、偏亚硫酸氢钠和/或亚硫酸钠。例示性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、延胡索酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。例示性抗微生物防腐剂包括但不限于，苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、溴硝丙二醇(bronopol)、溴化十六烷基三甲铵、西吡氯铵、氯己定、三氯叔丁醇、氯化甲酚、盐酸辛可芬、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶、咪脲、酚、苯氧基乙醇、苯乙基醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞(thimerosal)。例示性抗真菌防腐剂包括但不限于，尼泊金丁酯(butylparaben)、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。例示性醇防腐剂包括但不限于，乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸和/或苯乙基醇。例示性酸性防腐剂包括但不限于，维生素A、维生素C、维生素E、beta-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸(phyticacid)。其他防腐剂包括但不限于，生育酚、醋酸生育酚、甲磺酸去铁胺(deteroximemesylate)、溴化十六烷基三甲铵、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、乙二胺、、十二烷基硫酸钠(SLS)、月桂基乙醚硫酸钠(SLES)、重亚硫酸钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、偏亚硫酸氢钾、Glydant尼泊金甲酯、115、II、NeoloneTM、KathonTM和/或
例示性缓冲剂包括但不限于，柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙(calciumgluceptate)、葡糖酸钙、D-葡糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、二碱式磷酸钙、磷酸、三碱式磷酸钙、磷酸氢氧化钙、氯化钾、葡糖酸钾、钾混合物、二碱式磷酸钾、单碱式磷酸钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、二碱式磷酸钠、单碱式磷酸钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、褐藻酸、无致热原水、等张盐水、林格氏溶液、乙醇等等和/或其组合。
例示性润滑剂包括但不限于，硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、glycerylbehanate、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、十二烷基硫酸镁、十二烷基硫酸钠等等及其组合。
例示性油包括但不限于，杏仁油、杏核油、鳄梨油、巴巴苏仁油、佛手柑油、黑醋栗籽油、琉璃苣油、刺桧油、甘菊油、芸苔油、蒿子油、蜡棕榈油、蓖麻油、肉桂油、可可脂、椰子油、鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉树油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶油、葫芦油、葡萄籽油、榛子油、牛膝草油、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴油、夏威夷果油、熏衣草精油(lavandin)、熏衣草油、柠檬油、山苍子(litseacubeba)油、澳洲胡桃油、锦葵油、芒果籽油、白芒花籽油、貂油、肉豆蔻油、橄揽油、橙油、深海鱼油(orangeroughy)、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟子油、南瓜子油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀香油、山茶花油、香油、沙棘油、芝麻油、牛油树脂、硅油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、椿油、香根草油、胡桃油、和麦芽油。例示性的油包括但不限于硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环甲硅油、癸二酸二乙酯、二甲硅油360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油、和/或其组合。
用于口服和胃肠外给药的液体剂量形式包括但不限于，药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和/或酏剂。除了活性成分，液体剂体剂量形式还可以包含本领域中常用的惰性稀释剂(诸如例如水或其它溶剂)、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3–丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油、和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、及其混合物。在惰性稀释剂外，口服组合物可以包含佐剂诸如湿润剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂、和/或芳香剂。在用于胃肠外给药的一些实施方案中，组合物与增溶剂，诸如醇、油、经修饰的油、二醇、聚山梨酸酯、环糊精、聚合物、和/或其组合。
可以使用合适的分散剂、湿润剂和/或悬浮剂根据已知技术配制可注射制剂(例如无菌可注射水性或油脂性悬浮液)。无菌可注射制剂可以是无毒性胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳剂，例如，作为1,3–丁二醇中的溶液。可以采用的可接受媒介物和溶剂是水、林格氏溶液、U.S.P.和等张氯化钠溶液。另外，常规采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用任何温和不挥发性油，包括合成的单甘油酸酯或甘油二酯。另外，在制备注射液中使用脂肪酸诸如油酸。
可以如下灭菌可注射制剂：例如通过截留细菌滤器过滤，和/或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，所述无菌固体组合物可以在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。
为了延长活性成分的效果，经常期望减缓来自皮下或肌内注射的活性成分的吸收。这可以通过使用具有较差水溶解度的晶体或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，其继而取决于晶体大小和晶型。或者，胃肠外给药药物形式的延迟吸收通过在油性媒介物中溶解或悬浮药物来实现。通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成微胶囊基质来制备可注射的depot形式。根据药物对聚合物的比率以及采用的具体聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他可生物降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。Depot可注射配制剂通过将药物囊括在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。
用于直肠或阴道给药的组合物通常为栓剂，其可以通过将组合物与合适的非-刺激性赋形剂(例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡(其在室温为固体但在体温为液体，因此其在直肠或阴道腔中熔化并释放活性成分))混合制备。
用于口服给药的固体剂量形式包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在此类固体剂体剂量形式中，混合活性成分与至少一种惰性、药学可接受赋形剂，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙诸如和/或填充剂或增量剂(extender)(诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和硅酸)，粘合剂(诸如例如羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶)，润湿剂(诸如甘油)，崩解剂(诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠)，溶解延迟剂(诸如石蜡)，吸收加速剂(诸如季铵化合物)，湿润剂(诸如例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯)，吸收剂(诸如高岭土和膨润土粘土)，和润滑剂(诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)、及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂量形式可以包含缓冲剂。
可以使用诸如乳糖或乳液糖及高分子量聚乙二醇等赋形剂在软和硬的填充明胶胶囊中采用类似形式的固体组合物作为填充剂。可以用包衣和壳，诸如肠溶包衣和药学配制领域中公知的其它包衣制备片剂、锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂量形式。任选地，它们可以包含遮光剂，并且可以属于如下的组合物：它们仅或优先在肠道的某个部分中任选以延迟方式释放活性成分。可以使用的嵌入组合物的例子包括聚合物质和蜡。可以使用诸如乳糖或乳液糖及高分子量聚乙二醇等赋形剂在软和硬的填充明胶胶囊中采用类似形式的固体组合物作为填充剂。
用于局部和/或经皮给药组合物的剂量形式可以包括软膏剂、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和/或贴片。一般地，在无菌条件下混合活性成分与药学可接受赋形剂和/或任何需要的防腐剂和/或缓冲剂(如果需要的话)。另外，本发明涵盖使用经皮贴片，其经常具有对身体提供化合物的受控递送的额外优点。此类剂量形式可以例如通过在适当的介质中溶解和/或分散化合物来制备。或者/另外，可以通过提供速率控制膜和/或通过在聚合物基质和/或凝胶中分散化合物控制速率。
适合用于递送本文中描述的皮内药物组合物的装置包括短针装置。皮内组合物可以通过限制针在皮肤内的有效穿透长度的装置及其功能等同物给药。经由液体喷射注射器和/或经由针将液体组合物递送到真皮的喷射注射装置是合适的，所述针穿透角质层，并且产生达到真皮的喷射。弹道粉末/颗粒递送装置是合适的，其使用压缩气体将粉末形式的疫苗加速通过皮肤的外层到真皮。或者/另外，可以在皮内给药的经典mantoux法中使用常规的注射器。
适合于局部给药的制剂包括但不限于液体和/或半液体制剂，诸如搽剂、洗剂、水包油和/或油包水乳剂诸如乳膏、软膏剂和/或糊剂、和/或溶液和/或悬浮液。局部可给药制剂可以例如包含约1％-约10％(w/w)活性成分，尽管活性成分的浓度可以高达活性成分在溶剂中的溶解度限度。用于局部给药的制剂可以进一步包含一种或多种本文中描述的别的成分。
药物组合物可以以适合经过口腔用于肺部给药的配制剂制备、包装和/或销售。该配制剂可以包括干颗粒，其包含活性成分且其直径为大约0.5至大约7纳米或大约1至大约6纳米的范围。这类组合物方便地为干粉的形式给药，使用包括干粉储存器(可以向其导入推进剂的气流以分散粉末)的装置，和/或使用自推进溶剂/粉末分散容器，例如装有溶解和/或悬浮在密闭容器的低沸点推进剂中的活性成分的装置。这类粉剂包括颗粒，其中至少98％重量的颗粒的直径大于0.5纳米且至少95％数量的颗粒的直径小于7纳米。或者，至少95％重量的颗粒的直径大于1纳米且至少90％数量的颗粒的直径小于6纳米。干粉组合物可以包括固体细粉稀释剂(例如糖)并且方便地以单位剂量形式提供。
低沸点推进剂通常包括液体推进剂，其沸点在大气压低于65°F。通常，所述推进剂可以占所述组合物的50至99.9％(w/w)，并且活性成分可以占所述组合物的0.1至20％(w/w)。推进剂还可以包括其它成分，例如液体非-离子和/或固体阴离子表面活性剂和/或固体稀释剂(其粒度与包含活性成分的颗粒为一个量级)。
被配制为用于肺部递送的药物组合物还提供溶液和/或悬液的微滴形式的活性成分。这类制剂可以被制备、包装和/或销售为包含活性成分的水性和/或稀醇性溶液和/或悬浮液，任选为无菌的，并且可以方便地使用任何喷雾和/或雾化装置给药。这类制剂还可以包含一种或多种其它成分，包括但不限于，调味剂(例如糖精钠)、挥发油、缓冲剂、表面活性剂和/或防腐剂(例如羟苯甲酯)。通过该给药途径提供的微滴可以具有大约0.1至大约200纳米范围内的平均直径。
作为可用于肺部递送的本文所述的制剂可用于鼻内递送药物组合物。适合鼻内给药的另一制剂为包含活性成分的粗粉并且具有大约0.2至500微米的平均颗粒。这类制剂以鼻子呼吸的方式给药，即通过经过鼻道的快速吸入从放在鼻孔附近的粉末容器中给药。
适用于鼻腔给药的制剂可以，例如包含大约少至0.1％(w/w)至多至100％(w/w)的活性成分，并且可以包含一种或多种本文所述的其它成分。药物组合物可以以适用于含服给药的制剂制备、包装和/或销售。此类制剂可以，例如为使用常规方法制得的片剂和/或锭剂的形式，并且可以包含，例如，0.1至20％(w/w)的活性成份，包括口腔可溶解和/或可降解组成的平衡，任选地，一种或多中本文所述的活性成分。或者，用于含服给药的制剂可以包括包含活性成分的粉末化形式和/或气化和/或雾化的溶液和/或悬浮液形式。分散时，此类粉末化、气化和/或雾化的制剂可以具有大约0.1至大约200纳米范围内的平均颗粒和/或微滴尺寸，并且还包含一种或多种本文所述的其它成分。
药物组合物可以以用于眼部给药的制剂制备、包装和/或销售。此类制剂可以，例如为滴眼剂的形式，包括，例如，0.1/1.0％(w/w)活性成分在水性或油性液体赋形剂中的溶液和/或悬浮液。此类滴眼剂还可以包括缓冲剂、盐和/或一个或多种本文所述的其它成分。有用的其它可眼部给药的制剂包括以微晶型和/或脂质体制剂包含活性成分的那些。滴耳剂和/或滴眼剂也包含在本发明范围内。
在配制和/或制造药物药剂中的通常考虑可见于，例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy21sted.,LippincottWilliams&Wilkins,2005(通过提述并入本文)。
施用
本发明提供方法，其包括对有此需要的受试者施用包含与功能性效应器蛋白联合的超电荷蛋白的组合物。在一些实施方案中，提供施用包含其他功能性效应器蛋白(例如Cas9蛋白)和阳离子脂质和/或阳离子聚合物的组合物的方法。这类组合物可使用对于预防、治疗、诊断或成像疾病、病症和/或状况有效的任意量和任意施用路径施用给受试者。需要的确切量将随着受试者的种族、年龄和一般状况，疾病的严重性，具体组合物，其施用模式，其活性模式等在受试者之间变化。依照本发明的组合物通常以剂量单位形式配制以用于施用的便易和剂量的均匀性。然而，将理解本发明的组合物的总日常剂量将由主治医师通过合理的医学判断来决定。任何具体患者的特定治疗有效的、防护有效的或适当的成像剂量水平将依赖于多种因素，包括所治疗的病症和该病症的严重性；采用的特定化合物的活性；采用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；采用的特定化合物的施用时间、施用路径和排泄速率；治疗的持续时间；与采用的特定化合物组合或巧合使用的药物；以及医学领域中公知的类似因素。
与要投递的功能性效应器蛋白联合的超电荷蛋白的组合物以及包含例如Cas9蛋白和阳离子脂质的组合物可通过任意路径施用。在一些实施方案中，通过多种路径的一种或多种来施用此类组合物，包括口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、皮下、心室内、经皮、皮内、直肠、阴道内、腹膜内、局部(例如通过粉剂、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂)、粘膜、鼻、含服、肠、玻璃体、肿瘤内、舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；和口腔喷雾、鼻喷雾和/或气雾剂，和/或经由门静脉导管。在一些实施方案中，通过系统性静脉内注射来施用超电荷蛋白或复合物，和/或其药学、防护性、诊断性或成像组合物。在特定的实施方案中，可静脉内和/或口服施用超电荷蛋白或复合物，和/或其药学、防护性、诊断性或成像组合物。在特定的实施方案中，这类组合物可以以允许功能性效应器蛋白跨越血脑屏障、血管屏障或其他上皮屏障的方式施用。
在某些实施方案中，依照本发明的组合物可以以下剂量水平施用，该水平足以将从约0.0001mg/kg至约100mg/kg、从约0.01mg/kg至约50mg/kg、从约0.1mg/kg至约40mg/kg、从约0.5mg/kg至约30mg/kg、从约0.01mg/kg至约10mg/kg、从约0.1mg/kg至约10mg/kg、或从约1mg/kg至约25mg/kg受试者体重的功能性效应器蛋白量每日、每日一次或多次地投递，从而获得期望的治疗、诊断、防护或成像效果。期望的剂量可以每日三次、每日两次、每日一次、每隔一日、每三日、每周、每两周、每三周或每四周投递。在某些实施方案中，可以利用多次施用来投递期望的剂量(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多次施用)。
包含与功能性效应器蛋白联合的超电荷蛋白的组合物可以与一种或多种其他治疗剂、防护剂、诊断剂或成像剂组合施用。“组合”不意图指所述药剂同时施用和/或配制为用于一起投递，尽管这些投递方法在本发明的范围内。组合物可以与一种或多种其他期望的治疗学或医学规程同时、在前或在后施用。一般地，每种药剂将以对该药剂确定的剂量和/或时间安排施用。在一些实施方案中，本发明涵盖投递药学、防护性、诊断性或成像组合物与可以改进其生物利用度、降低和/或改良其代谢、抑制其排泄和/或改良其在体内的分布的药剂的组合。
试剂盒
本发明提供用于方便和/或有效地实施本发明方法的多种试剂盒。通常试剂盒将包括有效量和/或数量的组分来允许使用者实施对一个或多个受试者的多次处理和/或实施多次试验。在一些实施方案中，试剂盒包含以下一或多种：(i)超电荷蛋白，如本文描述的；(ii)功能性效应器蛋白要投递的；(ii)阳离子脂质和/或阳离子聚合物；和(iv)用于配制包含与超电荷蛋白联合的功能性蛋白的组合物的使用说明。在一些实施方案中，试剂盒包含Cas9蛋白和阳离子脂质。在一些实施方案中，试剂盒包含编码超电荷蛋白和/或要投递的功能蛋白的核酸。在一些实施方案中，试剂盒包含克隆载体，其编码超电荷蛋白和克隆位点，所述位点允许符合阅读框地克隆功能性效应器蛋白以生成融合蛋白。在一些实施方案中，试剂盒包含本文提供的组合物，其包含与功能性效应器蛋白联合的超电荷蛋白；注射器、针或给药器具以对受试者施用药物组合物；和用于对受试者施用药物组合物的用法说明。
本发明的这些和其他方面将在考虑以下实施例的基础上进一步领会，所述实施例意图例示本发明的某些特定实施方案但不意图限制其范围，该范围由权利要求限定。
实施例
实施例1:投递融合于超电荷GFP的TALE激活物
用于将成纤维细胞细胞命运重新程序化到褐色或白色脂肪细胞细胞命运的主要目标在于从白色脂肪组织(WAT)到褐色脂肪组织(BAT)的切换，该切割由PRDM16和PPARγ的表达控制。将融合于+36GFP的有力的TALE转录激活物工程化，其靶向成纤维细胞中的PPARγ和PRDM16基因组序列。融合蛋白使用肝素柱和/或SEC纯化，且凝胶在130kD处显示单个条带。将投递TALE激活物后的表达调控和对细胞表型的影响与在病毒投递PPARγcDNA，继之以用脂肪生成混合物(cocktail)处理7天后的调控相比较。观察到在用+36GFPTALEPRDM16融合物处理后形成脂肪细胞。在投递超电荷的PRDM16TALE激活物后检测到白色脂肪组织标志物基因的表达。
发现针对PPARγ的TALE激活物的超电荷蛋白介导的一次性投递诱导白色脂肪基因的表达和将成纤维细胞分化成白色脂肪细胞。PPARγ和PRDM16TALE激活物两者的超电荷蛋白介导的投递诱导脂肪细胞的分化，其具有褐色脂肪标志物如PRDM16,cox8b,elovl3和cidea的增加的表达以及生热基因表达标志物PGC1a和UCP1的小量增加。
Aurein肽融合于+36GFP-TALE-激活物融合蛋白的N末端。通过检测经处理细胞的细胞核中的荧光来观察通过肝素柱纯化的Aurein+36GFPTALE的投递。
图1显示大分子投递到哺乳动物细胞中的示意图。图2显示从白色脂肪组织(WAT)到褐色脂肪组织(BAT)的转换的概图。图3显示超电荷的投递平台的示意图，其投递程序化为靶向PPARγ或PRDM16的TALE激活物。图4显示融合蛋白的示意图，其包含+36GFP融合、18.5聚体TALE域和VP64激活域。图5显示+36GFP-TALE激活物融合蛋白的表达和纯化。图6显示投递+36GFPPPARγ和PRDM16TALE激活物融合蛋白后用于激活脂肪细胞调控物基因的测试测定法。
图7显示在不同浓度+36GFPTALE激活物融合蛋白的投递功效。图8显示两种不同的+36GFP-PRDM16TALE融合蛋白在NIH3T3细胞中的投递功效的比较。图9显示在投递PPARγ-TALE激活物融合物后的PPARγ基因表达和与多种对照的比较。图10显示在投递RDM16-TALE激活物融合物后的PRDM16基因表达和与多种对照的比较。图11显示在存在血清情况下观察到的适度TALE活性。
图12显示病毒投递PPARγ，接着用脂肪生成混合物处理7天的验证。图13显示用于程序化成纤维细胞为WAT和BAT的测定法的示意图。图14显示在用+36GFPTALE激活物融合蛋白处理后观察到的脂肪细胞形成。图15显示在用LipidTOXred染色7天后多种处理，其证明在病毒投递后以及超电荷PPARγTALE激活物融合蛋白的投递后形成脂肪细胞。图16显示用脂质TOXred染色在多种处理后7天后的细胞，其证明在病毒投递后以及超电荷PPARγTALE激活物融合蛋白的投递后形成脂肪细胞。图17显示在病毒投递后以及超电荷PPARγTALE激活物融合蛋白的投递后WAT生物标志物基因的表达。
实施例2：体内投递融合于超电荷的GFP的TALE激活物
将NIH3T3细胞培养至70-90％汇合并用在无血清的DMEM中1μM或0.5-5μM的+36GFPPPARγTALE和/或+36GFPPRDM16TALE融合蛋白处理。选择无血清培养基，因为血清可能降低基于蛋白投递的有效性。将细胞与相应的融合蛋白溶液温育4小时，接着除去培养基并将含有血清的完整DMEM添加回细胞。根据已知方案将对照细胞用编码PPARγ或PRDM16的病毒构建体感染以充当WAT和BAT基因的表达的阳性对照(参见，例如Seale等2008Nature454,961-967，其完整内容通过提述并入本文)。一旦所有细胞达到100％汇合，将含有异丁基甲基黄嘌呤、胰岛素、罗格列酮(rosiglitazone)、地塞米松(dexamethosone)、T3和茚甲新(indomethacin)的脂肪生成混合物添加至细胞并在48小时后用仅含有胰岛素、T3和罗格列酮的混合物形式替换。在混合物的第二轮此替换后48小时时，将T3、胰岛素和罗格列酮的另一剂量添加至细胞。次日(即从实验开始到现在一周)，用TRIzol收获细胞，提取总RNA，并实施qRT-PCR以测量PPARγ,PRDM16和其他褐色脂肪标志物基因如UCP1,PGC1a,Elovl3和Cidea的基因表达水平。
图18显示体内投递超电荷的PRDM16TALE激活物融合蛋白以诱导褐色脂肪脂肪细胞。在PPARγ和PRDM16的病毒投递以及还有超电荷的TALE激活物蛋白融合物的投递后观察到有力的脂肪细胞形成。图19显示对细胞的超电荷的(TALE)和病毒投递PPARγ和PRDM16的比较。该图显示通过PPARγ和PRDM16的表达，TALE/TALE、病毒/TALE和病毒/病毒诱导的褐色脂肪标志物的表达。图20显示与脂肪细胞分化一致的RT-qPCR评估，所述细胞分化也通过脂质TOX染色观察到。
实施例3：投递与超电荷的GFP复合的TALE激活物
为了改进投递功效，生成其中功能性蛋白与超电荷蛋白非共价联合的蛋白复合物并施用给细胞。图21显示以与+36GFP的复合物的形式投递功能性TALE激活物融合蛋白在投递后改进了TALE激活物活性。图22显示在作为与+36GFP的融合物(+36GFPPRDM16TALE-3)或复合物(+36GFP+PRDM16TALE-3)的TALE激活物融合物投递后的PRDM16基因表达。观察到复合物的投递倾向于增加TALE激活物活性。
实施例4：Aurein融合对投递功效的影响
图23显示N末端Aurein肽融合于+36GFP在TALE激活物融合物投递(作为与+36GFP的融合物或复合物)后对PRDM16基因表达的影响。Aurein肽经由GGS(9)(SEQIDNO:252)接头融合于GFP-TALE构建体的N末端，产生Aurein肽-GGS(9)接头-(+)36GFP蛋白-GGS(9)接头-PRDM16TALE-3融合蛋白。使用大小排阻层析纯化该蛋白。
实施例5：投递与超电荷的GFP或阳离子脂质复合的TALE激活物
图24显示在以与+36GFP的融合物(+36GFPPRDM16TALE-3)，与+36GFP的复合物(+36GFP+PRDM16TALE-3)，或与LipofectamineLTX的复合物(对其观察到基因表达的增加)投递TALEPRDM16激活物蛋白后的PRDM16基因表达。
实施例6：投递融合于超电荷的GFP的Cas9
Cas9到哺乳细胞中的超电荷投递将允许将强大的可RNA编程的核酸酶技术应用到细胞中，却没有先前的投递方法的缺点。为此，使用ALAL接头生成具有+36GFP的Cas9融合物。图25显示具有Cas9的超电荷的融合蛋白的示意图。图26显示纯化野生型Cas9蛋白以及具有+36GFP和Aurein-GGS9的Cas9融合蛋白。将融合蛋白以与上文TALE激活物融合蛋白相同的方式施用给细胞。Cas9一旦投递给细胞，就结合并切割其在细胞基因组中的靶位点。经由合适的测定法，经由southern印迹或测序测定法检测到靶细胞中的核酸酶活性。
实施例7：基因组编辑蛋白在体外和体内的有效投递
需要蛋白到细胞核或细胞质的有效胞内投递以完全实现包括基因组编辑药剂在内的蛋白治疗物的潜力。目前的蛋白质投递方法经常受限于对血清蛋白的低容忍，较差的核内体逃离，和有限的体内功效。如本实施例证明的，最初开发用于核酸转染的常见阳离子脂质试剂能有力地投递融合于超负电荷蛋白(其含有天然阴离子域或天然结合阴离子核酸)的蛋白。该办法介导Cre重组酶、基于TALE和Cas9的转录激活物，和Cas9:sgRNA核酸酶复合物以低纳米摩尔浓度在含有10％血清的培养基中功能性投递到培养的人细胞中。基于脂质的投递可以比阳离子蛋白投递策略强大>1,000倍。Cas9:sgRNA复合物的投递导致高达80％的基因组修饰效率和相比于标准DNA转染实质性更高的特异性，这可能是由于投递的Cas9:sgRNA复合物的瞬时性质。该办法还介导Cre重组酶和Cas9:sgRNA复合物有效体内投递到小鼠内耳中，在靶向的毛细胞群体中实现高达90％的Cre介导的充足和20％Cas9介导的基因组修饰。
材料和方法
构建Cas9,Cre和TALE融合物及sgRNA表达质粒。
本文中使用的所有构建体的序列在下文列出或在说明书的别处提供。所有蛋白构建体均从先前报道的用于克隆到pET29a表达质粒的感兴趣的蛋白质的质粒生成。
表达和纯化酿脓链球菌Cas9和其他蛋白质。
将大肠杆菌BL21STAR(DE3)感受态细胞(LifeTechnologies)用pMJ80647转化，其编码酿脓链球菌Cas9融合于N末端10xHis标签/麦芽糖结合蛋白。将所得表达菌株接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养液中，在37℃过夜。将细胞以1:100稀释到相同的培养基中并在37℃生长至OD600＝～0.6。将培养物在20℃温育30min，并以0.5mM添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)以诱导Cas9表达。在约16小时后，通过在8,000g离心收集细胞并重悬于裂解缓冲液(50mMtris(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)-HCl,pH8.0,1MNaCl,20％甘油,10mMtris(2-羧乙基)膦(TCEP))。通过超声裂解细胞(1秒脉冲开，1秒脉冲关，总计达15分钟，6W输出)，且通过在20,000g离心30min获得可溶裂解物。
将细胞裂解物与His-Pur镍-氮川乙酸(镍-NTA)树脂(ThermoScientific)在4℃温育30分钟以捕捉带His标签的Cas9。将树脂转移至20-mL柱并用20个柱体积的裂解缓冲液清洗。Cas9在50mMTris-HCl(pH8),0.1MKCl,20％甘油,1mMTCEP和300mM咪唑中洗脱，并通过Amiconultra离心滤器(Millipore,100-kDa分子量截留)浓缩至～50mg/mL。除去6xHis标签和麦芽糖结合蛋白，其通过在4℃用TEV蛋白酶处理20小时，并通过第二Ni亲和纯化步骤捕捉。将含有Cas9的洗脱物注入到HiTrapSPHP柱(GEHealthcare)中，该柱在含有50mMTris-HCl(pH8),0.1MKCl,20％甘油和10mMTCEP的纯化缓冲液中。将Cas9用含有从0.1M至1M的线性NaCl梯度的纯化缓冲液在5个柱体积中洗脱。将洗脱的含有Cas9的级分浓缩至200μM的浓度(如通过二辛可宁酸(Bicinchoninicacid)测定法(BCA)(PierceBiotechnology)量化的)，在液氮中速冻，并以等分试样储藏于-80℃。所有其他蛋白均通过此方法纯化，但是没有TEV切割步骤，且含有(-30)GFP的蛋白通过阴离子交换纯化，其使用相同的纯化方案使用Hi-TrapQHP阴离子交换柱(GEHealthcare)进行。
sgRNA的体外转录。
依照制造商用法说明使用T7HighYieldRNA合成试剂盒(NEB)，将含有T7启动子结合位点之后是20-bpsgRNA靶序列的线性DNA片段体外转录。体外转录的RNA用乙醇沉淀并通过凝胶电泳在Criterion10％聚丙烯酰胺TBE-Urea凝胶(Bio-Rad)上纯化。在4℃在摇动表面上将切取的凝胶片段过夜提取到420μL的300mMNaCl中。将凝胶纯化的sgRNA用乙醇沉淀并再溶于水，并通过UV吸光度最终量化sgRNA浓度，速冻于-80℃。
质粒转染。
使用Lipofectamine2000(LifeTechnologies)按照制造商方案转染质粒DNA。对于TALE激活物质粒，转染300ng的DNA，且对于激活物协同实验，合并60ng的5种质粒的每种并转染。对于Cas9核酸酶投递实验，将表达sgRNA的线性DNAPCR产物用于转染实验中，其靶向CLTA,EMX,VEGF和GFP中的基因组位点(sgRNAGFPg1,GFPg3,GFPg5和GFPg7用于切口酶研究)。生成线性DNAPCR产物，其使用含有U6启动子的质粒作为模板和携带U6启动子上游序列的正向引物和含有U6下游序列继之以sgRNA序列(对每个靶物独特的20-bp序列加上恒定的sgRNA骨架体系结构序列)的逆向引物。从线性DNA模板表达的sgRNA含有至少两个5’鸟苷以匹配体外转录的sgRNA，这些碱基是T7转录所需的。引物序列和PCR条件在下文列出。对于dCas9激活物实验，将700ng的Cas9或dCas9-VP64质粒DNA与250ng的适宜sgRNA表达质粒共转染。对于激活物协同实验，合并来自6种sgRNA的每种的50ngDNA，并与700ng的dCas9-VP64质粒共转染。
在细胞培养物中投递与阳离子脂质复合的转录因子蛋白。
对体外和体内两者的基因组编辑蛋白的投递的更深度的描述可见于下文。简言之，将培养的细胞以次日达到～70％汇合所需的细胞密度铺板于48孔形式(250μL体积)的具有10％FBS(“完全血清培养基”)和抗生素的Dulbecco氏改良的Eagle’sMedia加GlutaMAX(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)中。在投递前一小时，将完全血清培养基用不含有抗生素的相同培养基替换。依照制造商用于正常质粒转染的方案(包括温育时间)，通过将1nM至1μM蛋白(275μL终体积中)与0.5-1.5μL的商品化的阳离子脂质在25μLOPTIMEM培养基(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)中组合来实施Cre和TALE蛋白的投递。对于体外Cas9投递，将转录的sgRNA与Cas9蛋白温育5min，接着与阳离子脂质试剂复合。将25μLOPTIMEM培养基中的脂质复合物添加至细胞并在12-16小时后用新鲜培养基替换培养基，除非另外说明。在投递后48小时对细胞测定重组，在投递后4或16小时测定基因活化，和在投递后72小时测定基因修饰。
检测基因组修饰的T7内切核酸酶I测定法。
将U2OS-EGFP细胞或HEK293T细胞用Cas9表达和sgRNA表达质粒或线性DNAPCR产物转染(如上文描述的)或仅用Cas9蛋白，仅用体外转录的sgRNA或仅用RNAiMAX处理。转染后2天，使用DNAdvance试剂盒(Agencourt)依照制造商用法说明从细胞分离基因组DNA。将200ng的基因组DNA用作PCR反应中的模板以扩增靶向的基因组基因座，其使用如下文制定的侧翼侦测引物对。使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物并使用Quant-iTTM dsDNA试剂盒(LifeTechnologies)量化。将250ng纯化的PCRDNA与2μLNEBuffer2(NEB)在总体积19μL中组合并变性，然后采用以下热循环重退火：95℃5分钟，95至85℃以2℃/s；85至20℃以0.2℃/s。将重退火的DNA与1μlT7内切核酸酶I(10U/μl,NEB)在37℃温育15分钟。将10μL50％甘油添加至T7内切核酸酶反应，并在以200V电泳30分钟的5％TBE18孔CriterionPAGE凝胶(Bio-Rad)上分析12μL，然后用1xSYBRGold(LifeTechnologies)染色30min。在AlphaImagerHP(AlphaInnotech)上使Cas9诱导的切割条带和未切割的条带可见，并使用ImageJ软件54量化。将切割条带的峰值强度除以所有条带(未切割+切割的条带)的总强度来确定切割的分数，其用来如先前描述的46估测基因修饰水平。对于每份样品，在不同日一式三份地实施转染和后续修饰测量。
干细胞培养和投递。
将含有永久GFP基因插入的小鼠胚胎干细胞(ES)系Tau-GFP在具有15％FBS(Gibco),100mMMEM非必需氨基酸(Gibco),0.55mM2-巯基乙醇和白血病抑制因子(1,000units/ml；Chemicon)的DMEM中培养。5天后，形成展现GFP荧光的浮球。将Cas9:sgRNA和RNAiMAX的复合物添加至含有浮球的培养物达16小时。在Cas9:sgRNA处理后，将细胞在上述培养基中培养3天。将浮球用胰蛋白酶处理5分钟，然后通过70m滤器以收集单细胞。在标记之前，将细胞在用核纤层蛋白包被的载玻片上在补充有1xN2、1xB27、青霉素-链霉素(100g/mL)和10％FBS的DMEM/F12(1:1)中培养2天。使用抗GFP抗体(#ab13970,Abcam)实施免疫组化以评估GFP表达。为了量化GFP阴性细胞的数目，我们从20X放大率的3个代表性视场中计算了GFP阳性和GFP阴性细胞的总数目，并计算了平均效率。对于每个条件实施了3次独立的实验。
将蛋白微注射到小鼠内耳。
将P0floxP-tdTomato小鼠用于(–30)GFP-Cre注射并将P2Atoh1-GFP小鼠用于Cas9:sgRNA注射。在马萨诸塞州Eye&EarInfirmaryALCUC委员会批准的方案下使用动物。通过在冰上降低其温度来麻痹小鼠。通过在耳后制造切口以暴露耳泡(oticbulla)来实施耳蜗造口术(Cochleostomy)。使用显微操作器持握的玻璃微量移液器来将复合物投递到蜗管中，其允许到达内耳毛细胞。对于(-30)GFP-Cre的投递，将3μL的45μM蛋白与3μL的RNAiMAX或Lipofectamine2000混合并在注射前在室温温育30分钟。每个处理组注射4只小鼠。对于Cas9:sgRNA复合物的投递，将1μL的200μMCas9蛋白与2μL的100μMsgRNA混合并在室温温育5分钟，接着与3μL的RNAiMAX或Lipofectamine2000混合并再温育30分钟，然后注射。每个处理组注射3只小数。每次注射的总投递体积为0.3μL每耳蜗，且释放由显微操作器控制在32nL/秒的速度。
免疫组化和定量。
注射后5-10天，通过标准方案55杀死小鼠并收获耳蜗。对于免疫组化，遵循先前描述的方案55来使用针对毛细胞标志物(Myo7a和Esp)和支持细胞(Sox2)的抗体。为了量化Cas9:sgRNA投递后(–30)GFP-Cre或GFP阴性细胞后tdTomato阳性细胞的数目，我们计算了在耳蜗的底部转角(baseturn)中注射部位周围跨越200m区域中的外毛细胞的总数目。将(–30)GFP-Cre诱导的重组或Cas9:sgRNA诱导的基因组修饰的效率计算为表达tdTomato或丧失GFP表达的外毛细胞的百分数。
对基因组修饰的高通量DNA测序。
将HEK293T细胞用Cas9和sgRNA表达质粒或线性DNAPCR产物转染，或用50nMCas9蛋白、250nM纯化的sgRNA和阳离子脂质处理，如之前对于Cas9蛋白投递到U2OS-EGFP报道细胞所描述的。对于基于质粒的转染实验，将700ng的Cas9表达质粒加250ng的sgRNA质粒或50ng的线性DNAPCR产物(表达用于靶向EMX1,CLTA2或VEGF基因座的任一的sgRNA)与Lipofectamine2000(LifeTechnologies)转染，并在2天后分离细胞。对于体内蛋白投递实验，如先前描述的55从麻醉的小鼠分离～30mg的小鼠组织，并使用AgencourtDNAAdvance基因组DNA分离试剂盒(BeckmanCoulter)提取基因组DNA。对于细胞培养实验，如上文描述的分离基因组DNA。将150ng的基因组DNA用作模板来通过PCR扩增在靶和脱靶基因组位点，其使用下文制定的侧翼HTS引物对。粗PCR产物的相对量通过凝胶电泳定量并将用不同sgRNA对或Cas9核酸酶类型处理的样品分别以等摩尔浓度合并，接着用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。使用5％TBE18孔CriterionPAGE凝胶(BioRad)将约150ng的合并的DNA在200V电泳30min，且分离长度为～125bp至～300bp的DNA并通过QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。使用含有测序接头的引物将纯化的DNA通过PCR扩增，纯化，并在MiSeq高通量DNA测序仪(Illumina)上测序，如先前描述的47。
数据分析
如下文列出的使用以UnixBash编写的脚本来过滤和解析Illumina测序读段。将用于测序实验的样本大小最大化(在实际实验考虑内)以确保检测效果的最大能力。如先前描述的56实施对Cas9修饰的基因组位点的统计学分析(表2)，其中使用Bonferroni方法进行多比较校正。
下面是每个基因组靶位点的上游和下游侧翼序列的列表。
用于生成PCR产物以充当sgRNA的T7转录的底物的引物。
T7_gRNA-Rev在所有情况中使用。使用的DNA模板是如上文说明的EGFPsgRNA质粒。用于dCas9-VP64激活物实验的NTF3和VEGFsgRNA之前有报道(Maeder等,CRISPRRNA-guidedactivationofendogenoushumangenes.Nat.Methods.2013；10,977–979)。
用于生成线性DNAPCR产物用于转染的引物。
在作为模板的含有U6启动子的质粒上使用下文列出的PCR_sgRNA-fwd1,PCR_sgRNA-rev2和适宜的PCR_sgRNA引物的PCR延伸(72℃,3min)。
用于实施T7内切核酸酶IDNA切割测定法的引物。
用于对人基因组中的在靶和脱靶靶位点的高通量测序的引物.
结果
融合于带超负电荷的蛋白的Cre重组酶的高度有效投递
推测使用阳离子脂质将核酸的高度阴离子的静电特性赋予基因组编辑蛋白质可以实现其有效投递到哺乳动物细胞中(图27(A))。对于不天然高度带负电荷的的感兴趣的蛋白质，认为与天然或工程化的超带负电荷的蛋白17融合将赋予聚阴离子性质。对于核酸结合蛋白，推测与天然DNA或RNA底物的简单复合可以提供充足的阴离子性质来支持基于阳离子脂质的投递(图27(A))。
首先测试工程化的超带负电荷的GFP变体35(–30)GFP是否能介导融合的蛋白货物的包封和投递(图27(B))。将(–30)GFP融合于Cre重组酶和几种商品化的阳离子脂质，并测试其将融合物功能性投递到仅在Cre介导的重组时表达DsRed的HeLa细胞中(图28(A))。在含有10％胎牛血清(FBS)的培养基中投递与1.5μLLipofectamineRNAiMAX(后文成为“RNAiMAX”,LifeTechnologies,CarlsbadCA)复合的10nM(–30)GFP-Cre导致在经处理细胞中的强DsRed荧光信号。荧光活化的细胞分选(FACS)揭示在处理后48小时时，52％的细胞表达DsRed，与Cre重组一致(图28(B))。
使用在含有10％FBS的250μL培养基中与1.5μLRNAiMAX复合的25nM(–30)GFP-Cre，优化导致65％的重组效率(图28(C))。脂质介导的阴离子Cre投递的效力相比于阳离子蛋白介导的投递的效力是显著的。仅需要1nM(–30)GFP-Cre和阳离子脂质来产生15-20％重组的细胞，而需要1μM(+36)GFP-Cre来实现这一重组程度，代表了投递效力中的1,000倍差异(图28(C))。在第二种Cre报道细胞系(BSRTdTomato)中观察到了几乎相同的结果(图33(A))。增加阳离子脂质的量增加了毒性(图33(B))且发现1.5μLRNAiMAX每250μL样品将重组效率最大化且诱导最小的细胞毒性。在这些条件下，阳离子脂质不增加中性或阳离子Cre重组酶融合物的投递效力(图28(C)和图33(C))，表明需要(–30)GFP-Cre的强负电荷来参与阳离子脂质介导的投递，还观察到增加阳离子脂质的量增加了最大重组所需的蛋白质的浓度，这与其中可投递蛋白质与阳离子脂质的特定化学计量(stiochiometry)复合的模型一致(图28(D))。这些观察统一指示阳离子脂质可能介导聚阴离子蛋白到哺乳动物细胞中的有力投递，即使在存在血清的情况下。
为了确定阳离子脂质介导的(–30)GFP-Cre投递相对于阳离子蛋白介导的投递的更高效力来自细胞的更多的总蛋白摄取，或来自更高部分的进入细胞的功能性、非核内体蛋白分子，使用流式细胞术来测量用(+36)GFP-Cre或脂质体(–30)GFP-Cre在其相应的最佳Cre投递条件下处理的细胞的GFP荧光。对细胞荧光和重组效率的比较揭示(–30)GFP-Cre的脂质介导的功能投递比(+36)GFP-Cre的投递为每份量的内吞蛋白效力高9,800倍(图34)。总之，这些结果表示阴离子蛋白的脂质介导投递的不寻常的高效力不是来自于每个细胞中的异常高的蛋白摄取，而是来自于内吞作用后过程，其可能包括核内体逃离到细胞质中和避免溶酶体蛋白降解。
为了测试投递聚阴离子蛋白的能力是否依赖于RNAiMAX中的专有组分或者其他阳离子脂质是否能介导类似的有力投递，测试了设计为投递核酸的几种其他转染试剂(图28(E))。尽管RNAiMAX仍然是(–30)GFP-Cre的最有效的功能性投递试剂，但其他阳离子脂质制剂也导致有力投递。Lipofectamine2000和LipofectamineLTX(LifeTechnologies,CarlsbadCA)，两种基于阳离子脂质制剂的质粒转染试剂21，和SAINT-Red(SynvoluxTherapeutics,GroningenNetherlands)，一种含有合成的含pyridium的阳离子脂质的siRNA投递制剂，均在一定浓度范围内导致较强的功能性(–30)GFP-Cre投递(图28(E))。相比之下，未观察到使用阳离子脂质DOTAP(RocheDiagnostics,IndianapolisIN)或基于肽的核酸投递试剂EZ-PLEX(AscensionBio,TampaFL)的强投递(图28(E))。这些观察统一指示几种(并非所有)阳离子脂质能包封和投递带负电荷的蛋白质至人细胞中。
推测应可以使用阳离子脂质来投递(–30)GFP以外的聚阴离子蛋白。常用语生物医学研究中的工程化的聚阴离子蛋白域包括VP64激活域(–22净理论电荷)，其广泛用于与工程化的锌指阵列、TALE重复阵列或用于转录激活的dCas9的融合中，和3xFLAG(–7净理论电荷)，一种用于蛋白纯化和可视化的表位标签(图28(F))。观察到VP64和3xFLAG两者增强使用阳离子脂质的Cre重组酶的功能性投递，尽管没有(–30)GFP那么有效，可能是由于其更低的总体负电荷(图33(C))。这些观察证明除(–30)GFP以外的不寻常的带负电荷的蛋白能介导到哺乳动物细胞中的基于阳离子脂质的有效投递。
TALE激活物蛋白的功能性投递
测试了TALE-VP64转录激活物(约+4理论净电荷，依赖于使用的TALE变体)到培养的人细胞中的脂质介导的投递。尽管已在哺乳动物细胞中在缺少血清的情况下使用阳离子肽(如Arg9 36)证明了通过投递的TALEN蛋白进行的适度有效的内源性基因切割，但尚未报道基于TALE的转录因子蛋白的投递，且据我们所知，尚未有在血清中的TALE蛋白的有效投递。靶向神经营养因子(neurotrophin)-3(NTF3)的基因，该蛋白是一种与神经退行性疾病有关的神经生长因子37。将之前描述的靶向NTF3的TALE-VP6438融合于(–30)GFP(图29(A))并将HEK293T细胞用25nM(–30)GFP-NTF3TALE1-VP64和RNAiMAX在针对Cre投递优化的条件下处理。在用25nM(–30)GFP-NTF3TALE-VP64和RNAiMAX处理的细胞中，处理后4小时NTF3的基因表达水平比未经处理的细胞、仅用RNAiMAX处理的细胞或用VEGF靶向性TALE转录激活物处理的细胞高3.5倍(图29(B))。在转染编码相同NTF3靶向性TALE-VP64的质粒后48小时观察到NTF3表达的可比的水平(图29(B))。
由于已显示靶向同一基因上的不同位点的多个TALE激活物的协同表达增加基因活化38，使用RNAiMAX同时投递融合于(–30)GFP的5种不同的NTF3靶向性TALE激活物。如上文所述制备蛋白质-脂质复合物，其通过以5nM各自添加5种(–30)GFP-NTF3-TALE-VP64蛋白，总共25nM蛋白。在4小时温育后观察到NTF3表达中的6.5倍增加(图29(B)和图35)，而所有5种NTF3TALE激活物的质粒共转染继之以48小时温育，导致NTF3表达水平的10倍增加(图29(B))。这些发现证明TALE激活物蛋白可使用阳离子脂质投递以短暂激活人细胞中的基因表达。可编程的转录激活物蛋白的投递可以实现靶基因的一次性激活而同时避免长期基因表达，后者是可编程转录因子的基于DNA投递的一个通常的关注所在。该能力可对当短暂表达时在细胞状态或细胞命运中产生一次性永久变化的蛋白质特别有价值39。
Cas9:sgRNA蛋白:RNA复合物到人细胞中的高度有效投递
鉴于聚阴离子Cre和TALE激活物蛋白变体在全血清培养基中的有力的脂质介导投递，推测CRISPR-Cas9:sgRNA复合物(作为与(–30)GFP的融合物或作为天然聚阴离子Cas9:导引RNA的复合物)也可以使用该办法投递到人细胞中。使用确立的Cas9诱导的基因破坏测定法40，靶向人U2OS细胞中基因组EGFP报道基因内的特定位点(图36(A))。在靶Cas9切割诱导EGFP中的非同源末端连接(NHEJ)和细胞荧光的丧失。为了避免(–30)GFP荧光的干扰，将Y67S突变引入(–30)GFP以消除其荧光，并称此非荧光变体为(–30)dGFP。
将U2OS报道细胞用25nM(–30)dGFP-NLS-Cas9和50nMEGFP靶向性sgRNA和RNAiMAX在含有10％FBS的培养基中处理显示在48％的细胞中的EGFP表达的丧失(图30(A))。表达Cas9或sgRNA的质粒的共转染导致37％的细胞中的类似的EGFP丧失(图30(A))。在转染编码仅EGFPsgRNA，仅Cas9的质粒或共转染编码Cas9和sgRNA(设计为靶向VEGF基因座)的质粒后未观察到显著的EGFP破坏(图30(A),图36(B))。确认对EGFP的有力破坏不是细胞毒性的结果(图36(C)-(D))。还观察到在存在10％FBS血清的情况下将细胞用(+36)dGFP-NLS-Cas9和sgRNA处理不导致有效的基因破坏(图30(A))，表明投递Cas9和sgRNA的基于阳离子肽的方法无效，可能是由于带超正电荷的蛋白对gRNA:Cas9复合物形成或核酸酶功能的干扰41。总之，这些结果建立(–30)dGFP-NLS-Cas9:sgRNA复合物的阳离子脂质介导的投递能导致人细胞中的有效的sgRNA依赖性靶基因破坏。
聚阴离子sgRNA对于有效的脂质介导的Cas9投递是必要且充分的
由于天然Cas9蛋白(+22净理论电荷)和sgRNA(～103个阴离子磷酸根基团)的复合物应是总体高阴离子性的接下来测试没有融合于聚阴离子蛋白的天然Cas9:sgRNA复合物是否可使用阳离子脂质投递到人细胞中。将U2OSEGFP报道细胞用100nMCas9,100nMEGFPsgRNA和0.8μLRNAiMAX处理导致EGFP报道基因的65％破坏(图30(A))。将细胞用Cas9蛋白和sgRNA但没有RNAiMAX处理导致GFP荧光没有丧失(图30(A))。这些观察表明仅sgRNA，甚至在缺少超带负电荷的融合蛋白的情况下，也能提供介导Cas9的基于阳离子脂质的投递所需的高度阴离子性质。
对来自(–30)dGFP-NLS-Cas9:sgRNA相对于Cas9:sgRNA的阳离子脂质介导的投递的基因破坏效率的比较揭示低剂量(–30)dGFP-NLS-Cas9比天然Cas9导致更有效的基因破坏(图37(A))，其在更高的浓度以及每种蛋白的相应最佳蛋白质:sgRNA剂量处不如天然Cas9(图37(B)-37(C))。这些结果进一步建立了sgRNA能供应充足的负电荷来支持复合Cas9蛋白的基于阳离子脂质的投递。
还观察到尽管(–30)dGFP-NLS-Cas9需要比Cas9总体上更少的蛋白用于最佳投递，但对于最大(–30)dGFP-NLS-Cas9介导的EGFP基因破坏需要比天然Cas9介导的基因破坏更高的sgRNA:蛋白比率(图37(D))。推测需要更多的sgRNA等同物以与(–30)dGFP-NLS-Cas9复合，因为融合的(–30)dGFP可能静电干扰Cas9:sgRNA复合。由于对于(–30)dGFP-NLS-Cas9介导的EGFP基因破坏的理想蛋白剂量比野生型Cas9的低10倍，该结果还表明(–30)dGFP-Cas9由于其更高的总体负电荷比Cas9:sgRNA更好地被阳离子脂质体包封，但该电荷大小可能干扰Cas9:sgRNA相互作用，从而需要更多的sgRNA每蛋白和潜在地降低投递的Cas9总活性。另外，生成和测试NLS-Cas9和Cas9-NLS蛋白，且观察到尽管NLS在(–30)dGFP-NLS-Cas9中的存在能至少部分地揭示在非常低的浓度时投递功效中的差异，但Cas9,NLS-Cas9和Cas9-NLS在25nM或更高的浓度均导致比(–30)dGFP-NLS-Cas9更高的EGFP破坏效率(图38(A)-(C))。
还测试了使用阳离子脂质制剂而非RNAiMAX的Cas9:sgRNA投递。使用Lipofectamine2000的投递比使用RNAiMAX显著地更有效，导致多达80％的Cas9介导的基因破坏(图39(A))，且甚至在1nM蛋白处也维持高效率(60％基因破坏)(图39(A))。然而，由于在细胞培养条件下Lipofectamine2000比RNAiMAX的稍微更高的毒性(图33(B)-C))，将RNAiMAX用于所有后续的细胞培养研究。
为了验证EGFP破坏来自基因组修饰而不仅是Cas9结合42，使用T7内切核酸酶I(T7EI)测定法43来检测和量化在靶EGFP基因座处Cas9介导的基因组插入/缺失突变(indel)的频率(图30(B))。T7EI测定结果显示仅用Cas9和EGFPsgRNA质粒两者，或Cas9蛋白和纯化的EGFPsgRNA处理的那些细胞在靶位点处含有indel。总之，这些发现建立了活性Cas9:sgRNA复合物可使用阳离子脂质，以依赖于由sgRNA提供的负电荷的方式，有力地投递到人细胞中。
还将U2OSEGFP报道细胞用Cas9的单次脂质介导的投递处理来处理，所述Cas9与靶向EGFP,CLTA,EMX和VEGF的四种gRNA的混合物复合。该处理导致所有4种靶物的有效破坏，切割效率分别为58％,28％,16％和40％，如通过T7E1切割测定法测量的。来自50nMCas9和25nM每种sgRNA(总计100nMsgRNA)的单投递的这些高基因破坏效率证明脂质介导的Cas9:sgRNA投递能支持有效的多重基因组编辑(图30(C))。
Cas9切口酶和dCas9激活物的功能性投递
接着，测试了基于阳离子脂质的蛋白投递是否能扩展到投递其他Cas9衍生的基因组工程化工具如Cas9切口酶44和基于Cas9的转录激活物45。测量了U2OSEGFP报道细胞中来自Cas9D10A切口酶的投递的基因破坏效率，其通过共转染切口酶和适宜的成对的EGFP靶向性sgRNA质粒，或使用RNAiMAX与EGFPsgRNA对复合的纯化的蛋白(图30(D))。仅在存在靶向相对链的sgRNA对(sgRNA对g1+g5、和g3+g7)而非靶向相同链的sgRNA对(sgRNA对g5+g7)的情况下(图30(D))，双重Cas9切口酶的质粒和阳离子脂质介导的蛋白:RNA投递两者导致具有类似效率的EGFP破坏(图30(D))，这与之前的Cas9切口酶切割要求的报道一致46。
比较了HEK293T细胞中的NTF3转录激活效率，其来自质粒转染或直接的融合于VP64激活域的dCas9的蛋白质:sgRNA复合物投递45。通过质粒转染或RNAiMAX介导的蛋白投递来投递dCas9-VP64激活物导致较强的(≥～10倍)NTF3转录的活化(图30(E)和图40)。对于每种投递方法在最佳测定次数，来自质粒转染的转录激活水平比来自蛋白投递的活化更有力(图30(E))，可能是由于来自质粒的Cas9激活物蛋白和sgRNA两者的持续表达相比于纯化的蛋白和RNA的短暂的单剂量。虽然上述结果指示这类因素不限制通过投递的Cas9核酸酶和切口酶蛋白对不可逆基因组修饰的效力(图40(A)和40(D))，但投递蛋白的低剂量和短暂性质可能更强地限制动态过程如转录激活的效力。但是，这些结果统一指示Cas9切口酶和Cas9转录激活物两者还可通过阳离子脂质介导的蛋白:RNA复合物投递来有效投递。
Cas9:sgRNA投递以比DNA转染更大的特异性修饰基因组
功能性Cas9:sgRNA复合物的无DNA投递绕开了与病毒或其他基因投递方法有关的风险，且通过避免修饰靶基因座后基因组编辑剂的不必要的表达从而具有改进基因组修饰的特异性的潜力。为了测试这一所述办法是否能破坏人细胞中的内源性基因，靶向EMX1,CLTA2和VEGF基因中的基因组基因座，原因是所述基因的潜在的生物医学相关性和其在之前Cas9脱靶切割活性研究中的使用40,46,47。Cas9:sgRNA复合物到HEK293T细胞中的阳离子脂质介导的投递导致所有3种人基因的有力的切割，其效率与质粒转染方法的那些可比或更大，如通过使用先前对U2OS细胞优化的相同Cas9:sgRNA投递条件的T7EI测定法所揭示的(图31(A))。
为了比较对于Cas9质粒相对于蛋白:RNA投递方法的内源性基因修饰特异性，从自HEK293细胞分离的基因组DNA扩增在靶基因座以及几个已知的脱靶位点(图44)，所述细胞在产生可比的在靶修饰效率的条件下通过转染Cas9和sgRNA表达质粒，或通过RNAiMAX介导的Cas9:sgRNA复合物投递处理。通过高通量DNA测序分析在3个在靶和11个脱靶位点处的indel频率(图45)。对于所有3种靶基因，来自质粒或蛋白质:sgRNA投递的在靶DNA修饰的频率为约10％(图41(A)-(C))，其实现在导致非常相似的在靶基因组修饰效率的处理条件下两种技术之间的脱靶修饰的比较。重要地，对于所有11个脱靶位点的脱靶基因组修饰的频率在来自蛋白质:sgRNA投递时比质粒投递低，且因此对于所有测试位点的在靶对脱靶修饰的比率对于蛋白质:sgRNA投递比对于质粒投递高达19倍(图31(B)-(D))。
在具有高水平的脱靶修饰的基因座(如4个VEGF脱靶位点，质粒投递对其得到了4至20倍的平均在靶:脱靶修饰比率，而蛋白:RNA投递得到了9至400倍的平均在靶:脱靶修饰比率)以及具有较低水平的脱靶修饰的基因座(如3个EMX脱靶基因座，质粒投递对其得到了低至64倍的平均在靶:脱靶修饰比率，而蛋白:RNA投递得到了500至2,000倍的平均在靶:脱靶修饰比率)处，蛋白质:sgRNA投递的DNA修饰特异性高于质粒投递的。总之，这些结果指示使用阳离子脂质投递Cas9:sgRNA复合物能实现高效率的靶基因修饰，其具有比投递表达Cas9和sgRNA的DNA实质性更高的特异性。
将Cas9:sgRNA投递到小鼠胚胎干细胞中
有力和短暂的阳离子脂质介导的Cas9:sgRNA投递以实现有效、永久和高度特异性的基因编辑可能在干细胞中特别有用。为了测试该可能性，将表达Tau-EGFP48的小鼠胚胎干细胞用Cas9和EGFP靶向性sgRNA处理。在标准的干细胞培养条件下，形成EGFP阳性浮球。将浮球用与RNAiMAX复合的Cas9:sgRNA处理，或用Cas9和RNAiMAX无sgRNA处理作为对照。处理后3天，观察到与对照样品相比在用Cas9:sgRNA处理的球中的GFP荧光降低(图42(A))。将经处理的球解离，允许细胞附着于用明胶包被的皿并分化成祖细胞。使用抗GFP抗体的免疫组化确认了EGFP表达在用Cas9:sgRNA处理的样品的细胞中的敲低，其中许多细胞核具有缺少任何表观的EGFP。相比之下，源自对照球的所有细胞均是EGFP阳性的(图42(B))。对从用Cas9:sgRNA处理的细胞收获的基因组DNA进行T7EI测定，其产生在Tau-EGFP基因座处的indel的清楚证据(图42(C))。从该测定，从阳离子脂质介导的Cas9:sgRNA投递和Cas9和sgRNADNA的转染两者计算出42％的indel频率。在缺少Cas9:sgRNA或含有Cas9和不相关gRNA的对照样品中未检测到靶物修饰。这些发现证明阳离子脂质介导的Cas9:sgRNA投递能在小鼠胚胎干细胞中实现高度有效的基因破坏。
Cre重组酶和Cas9:sgRNA的体内阳离子脂质介导的投递
功能性基因组编辑蛋白的体内高效投递实现广泛范围的应用，包括校正遗传疾病的非病毒治疗性基因组编辑。为了在活哺乳动物中评估上文描述的蛋白投递方法，选择对小鼠内耳的投递，因为其具有有限的空间、研究较多的内耳细胞类型、以及可以实现将来听力恢复的遗传聋小鼠模型的存在。尝试将两种类型的蛋白体内投递到小鼠内耳中。首先，测试(–30)GFP-Cre蛋白的投递来评估对内耳细胞类型的靶向和功能性蛋白投递的效率。其次，评估Cas9:sgRNA复合物对内耳的投递来确定阳离子脂质介导的蛋白:gRNA复合物投递是否能支持基于CRISPR的体内基因编辑。
之前已显示(+36)GFP-Cre可投递到小鼠视网膜16，虽然该蛋白仅导致重组转化的适度水平，表明低效的体内投递。对于我们的初始内耳投递试验，将(–30)GFP-Cre与RNAiMAX复合，并将复合物注射到出生后第0天(P0)的报道小鼠的耳蜗中，该小鼠具有基因组整合的敲入的(floxed)-STOPtdTomato报道物。如先前在体外Cre报道细胞系中描述的，将Cre功能性投递到内耳细胞中，继之以核内体逃离、核定位和Cre介导的重组导致tdTomato的表达。在注射后，收获耳蜗用于使用内耳细胞标志物进行免疫标记，用于与tdTomato的共定位。将单独的RNAiMAX注射用作独照。在注射(–30)GFP-Cre和RNAiMAX后5天，耳蜗外毛细胞(检测声音的耳部感觉细胞)显示与毛细胞标志物肌球蛋白VIIa(Myo7a)共定位的强烈的tdTomato信号，从而证明了到毛细胞的功能性Cre投递(图32(A)-(B))。在对照耳蜗中未检测到tdTomato表达(图32(A))。tdTomato信号集中在耳蜗底部转角处的注射部位区域中。在耳蜗底处平均33±3％的外毛细胞是tdTomato阳性的(P<0.001；均值±SEM,n＝4)。
为了进一步确定阳离子脂质介导的(–30)GFP-Cre蛋白投递对靶细胞的影响，在注射后10天检查毛细胞静纤毛(stereocilia)，一种对于听力必要的精细结构。TdTomato阳性的外毛细胞具有典型的静纤毛结构，如通过espin表达成像的，其类似于对照静纤毛(图32(B))。在对照耳蜗中未检测到tdTomato表达。这些观察表明阳离子脂质介导的(–30)GFP-Cre蛋白投递实现了在耳蜗外毛细胞中的重组，且没有明显地影响毛细胞体系结构。
由于靶物体积、蛋白剂量和sgRNA剂量在体内不同于在细胞培养实验中，因此在不同的投递条件下重复上述实验。由于其在体外的高效力，测试了使用Lipofectamine2000的投递(图39(A))且观察到急剧更高的重组效率：在用(–30)GFP-Cre+Lipofectamine2000处理的耳蜗中超过90％的外毛细胞是tdTomato阳性的(图32(C))。与对照样品相比，观察到一些外毛细胞丧失(图32(C))，这与先前观察到的Lipofectamine2000的高细胞毒性一致，尽管保持总体耳蜗体系结构。
为了测试体内Cas9:sgRNA投递的有效性，将Cas9和靶向EGFP的sgRNA与RNAiMAX组合，并将所得复合物注射到出生后第2天(P2)的转基因Atoh1-GFP小鼠耳蜗中，其中所有毛细胞在转录因子Atoh149的毛细胞特异性增强子的调控下表达GFP。使用此模型，Cas9:sgRNA介导的EGFP的破坏导致外毛细胞中EGFP荧光的丧失。注射Cas9:sgRNA和阳离子脂质后10天，在注射部位附近处13％的外毛细胞中观察到GFP的缺失。相比之下，注射有Cas9蛋白和RNAiMAX且无任何sgRNA的对照耳蜗显示出没有EGFP信号的丧失(图32(D))。注射有Cas9:sgRNARNAiMAX复合物的耳蜗的外毛细胞似乎另外未受影响的，其具有Myo7a的典型表达和健康的细胞核，与最小的毛细胞毒性一致(图32(D))。对从耳蜗组织样品分离的基因组DNA的高通量DNA测序揭示了与经处理样品而非缺少sgRNA的对照样品中的GFP靶基因破坏一致的indel(图43(A))。另外，重复使用靶向EMX基因的sgRNA的内耳体内投递Cas9:sgRNA，且类似地观察到在经处理动物而非对照动物的EMX基因中的indel(图43(B))。
由于与Lipofectamine2000复合的(–30)GFP-Cre产生比与RNAiMAX复合的(–30)GFP-Cre更有效的靶毛细胞群体修饰(图32(A)和32(C))，如上文所述测试其在Cas9:sgRNA投递到Atoh1-GFP耳蜗上的使用。10天后在注射部位附近的20％的外毛细胞中观察到GFP表达的丧失，而在对照耳蜗中所有外毛细胞维持强GFP表达，所述对照耳蜗注射有Cas9和Lipofectamine2000但无sgRNA(图32(D))。与在Lipofectamine2000投递(–30)GFP-Cre后观察到的适度的毛细胞丧失(图32(C))形成对比的是，Cas9:sgRNA靶向的外毛细胞展现出无明显的毒性或结构改变(图32(D))。
与(–30)GFP-Cre一样，无病毒的、阳离子脂质介导的Cas9:sgRNA投递至小鼠内耳成功地修饰了外毛细胞群体中的特定基因组基因座，从而导致靶基因表达的丧失。几乎一半的所有遗传耳聋类型源自毛细胞丧失或功能障碍50，本文中呈现的结果提出了基于Cas9:sgRNA复合物的投递来遗传修饰这些细胞从而实现听力恢复的潜在策略。
确定(–30)GFP-Cre的蛋白投递功效
为了确定脂质体介导的(–30)GFP-Cre投递比阳离子蛋白投递更高的效力来自细胞的更多的总蛋白摄取或来自细胞摄取的功能性、非核内体蛋白分子的更高分数，使用流式细胞术来测量用(+36)GFP-Cre或脂质体(–30)GFP-Cre在其相应的最佳Cre投递条件下处理的细胞的GFP荧光。细胞荧光报告总的内吞的(–30)GFP-Cre或(+36)GFP-Cre，而不管是核内体或非核内体定位1。脂质介导的蛋白投递令人惊讶地导致总蛋白摄取中的少量增加(图34(A))，尽管脂质介导的功能性Cre投递具有高效率。虽然(+36)GFP-Cre处理以剂量依赖性方式将细胞GFP荧光增加了高达3个量级(图34(A))，与先前的报道一致1 , 2，但是脂质体(–30)GFP-Cre处理诱导细胞GFP荧光中至多5倍的增加(图34(A))。对细胞荧光和重组效率的比较揭示，(–30)GFP-Cre的脂质介导的功能投递比(+36)GFP-Cre的投递为每份量的内吞蛋白效力高9,800倍(图34(B))。
为了测试阴离子(–30)GFP与阳离子脂质的复合是否干扰GFP荧光，由此遮蔽了进入细胞的货物的真实量，将mCherry(其为荧光但不是高度阴离子的)融合于(–30)GFP或(+36)GFP并将两种蛋白融合物投递至HeLa细胞。在用PBS+肝素(20U/mL)洗掉可能附在细胞表面但不进入细胞的蛋白后，在处理后4小时和24小时通过FACS分析细胞的mCherry荧光。观察到融合(–30)GFP的mCherry的脂质介导的投递导致细胞mCherry荧光的仅稍微增加，而在投递(+36)GFP-mCherry后的mCherry荧光一般高≥100倍(图34(C))，表明融合于(–30)GFP不导致大量的蛋白货物进入细胞。而且，将脂质添加至(–30)GFP-Cre没有可测量地改变GFP荧光信号(图34(D))，尽管存在阳离子脂质和阴离子(–30)GFP显然相互作用的事实。总之，这些结果表明阴离子蛋白的脂质介导投递的不寻常的高效力不是来自于每个细胞中的异常高的蛋白摄取，而是来自于内吞作用后过程，其可能包括避免溶酶体蛋白降解和核内体逃离到细胞质中。
脱靶切割测定法的灵敏性限制
用于检测基因组脱靶切割的高通量测序方法的灵敏性受限于输入每个基因组靶位点的PCR扩增中的基因组DNA(gDNA)量。人gDNA的1ng样品代表仅约330个独特的基因组，且如此仅存在每个基因组位点的约330个独特拷贝。在总共150ng的输入gDNA上实施每个基因组靶物的PCR扩增，其分别提供了源自至多50,000个独特gDNA拷贝的扩增子。因此，高通量测序测定法不能检测到以低于1/50,000(0.002％)频率存在的稀有的基因组修饰事件。该限制在表2中陈述。
总之，这些发现表明基因组编辑蛋白的阳离子脂质介导的投递能充当用于治疗遗传疾病的强大工具和体内策略。
结论
体外且尤其是体内的有效胞内蛋白投递一直是生物医学研究和蛋白治疗学中的长久以来的挑战。虽然已对使用阳离子肽和蛋白的投递广泛研究了超过20年，但对血清蛋白的敏感性，抗体的中和，通过胞外和胞内蛋白酶的降解以及内化后较差的核内体逃离限制了使用该办法进行蛋白投递应用的范围。
在本发明的实施例中，显示了蛋白投递的一种一般性策略，其利用阴离子蛋白与阳离子脂质体复合。该方法用于向培养的细胞系、干细胞集落和小鼠内耳中的治疗相关的体内部位投递多样化的蛋白类别，包括Cre酪氨酸重组酶、TALE转录激活物和Cas9核酸酶、切口酶、和转录激活物(图27(A))。所描述的办法是高度有效的，其产生与细胞培养中确立的核酸转染方法相当的修饰率，并在活小鼠的内耳毛细胞群体内分别实现高达90％和20％的Cre重组酶和Cas9介导的基因组修饰率(图32(C)-(D))。这些结果还表明可以使用阳离子脂质来有效投递其他核酸结合蛋白(包括诱导细胞命运中的治疗相关变化的转录因子)，这是通过将其与核酸复合来进行。
基于阳离子脂质的阴离子蛋白投递比有力的阳离子蛋白投递融合伴侣(+36)GFP的性能每分量的内吞蛋白高多达9,800倍，其使用更低数量级的蛋白剂量诱导了对经处理细胞的更有效的修饰(图28(C)34)。对于Cas9核酸酶投递，该办法还导致比传统质粒转染特异性高>10倍的基因组修饰(图31(B)-(D))，可能是由于与DNA投递方法相比，每个基因组所被暴露的Cas9活性的短暂窗口，这与先前的报道一致51。
所描述的办法易于执行，仅需要纯化的可投递的蛋白和使用通常的商品化核酸转染试剂(图27(B))。使得给定的蛋白可用于该办法需要简单翻译融合于高度阴离子性的伴侣如(–30)GFP(图27(A))，且使用常见的翻译融合标签(包括VP64激活域和3xFLAG亲和标签)甚至更有效(图28(F)和图33(C))。在某些例子中(如与Cas9蛋白一样)，与关联核酸(此例中为sgRNA)的预先复合是足够的(图30(A))，因为部分暴露的结合的核酸可能提供充足的负电荷来介导与阳离子脂质的复合。
其他小组报道了以DNA或mRNA形式体内投递Cas9表达构建体52 , 53。本发明实施例证明蛋白投递是进行体内基因组编辑的可行办法。
表1.
表1.Cas9:sgRNA(靶向MX,VEGF和CLTA中的位点)的在靶和已知的脱靶底物。显示EMX,VEGF和CLTA的基因组在靶和脱靶位点，来自在靶序列的突变以小写和粗体显示。PAM划线显示。
表2
表2.EMX、CLTA和VEGF在靶位点和11个已知脱靶位点的Indel频率、P值和在靶:脱靶切割特异性比率。CLTA位点：总计：序列计数的总数目；仅对头10,000个序列分析在靶位点序列。经修饰：Indel数目除以序列总数作为百分比。对没有观察到的Indel的位点计算可能修饰的上限，其通过假定有少于1个indel然后除以总序列计数以得到上限修饰百分比，或取理论检测限(1/49,500；参见上文结果部分)，看哪个数值更大。P值：对于伪处理、Cas9质粒转染和脂质体Cas9蛋白:sgRNA投递，使用每个CLTA靶向性处理样品(DNA转染或蛋白质:sgRNA投递)相对于用Cas9蛋白和靶向EGFP的sgRNA处理的对照样品(伪处理)之间的双侧Fisher确切检验来计算P值。在靶:脱靶特异性是对于每个位点，在靶对脱靶基因组修饰频率的比率。EMX位点显示应用于EMX靶位点的CLTA分析的实验和分析方法。VEGF位点显示如应用于VEGF靶位点的CLTA分析的实验和分析方法。从质粒转染和蛋白质:sgRNA投递两者的indel数目减去伪处理对照中的Indel数目来确定Indel的总数目和计算图31正文以及图41中的在靶:脱靶比率。
参考文献
1.Putney,S.D.&Burke,P.A.Improvingproteintherapeuticswithsustained-releaseformulations.Nat.Biotechnol.16,153–157(1998).
2.Mullen,L.等Latentcytokinesfortargetedtherapyofinflammatorydisorders.ExpertOpin.DrugDeliv.11,101–110(2014).
3.Song,E.等AntibodymediatedinvivodeliveryofsmallinterferingRNAsviacell-surfacereceptors.Nat.Biotechnol.23,709–717(2005).
4.Leader,B.,Baca,Q.J.&Golan,D.E.Proteintherapeutics:asummaryandpharmacologicalclassification.Nat.Rev.DrugDiscov.7,21–39(2008).
5.Hartung,S.D.等CorrectionofMetabolic,Craniofacial,andNeurologicAbnormalitiesinMPSIMiceTreatedatBirthwithAdeno-associatedVirusVectorTransducingtheHumanα-L-IduronidaseGene.Mol.Ther.9,866–875(2004).
6.Wang,J.等Neutralizingantibodiestotherapeuticenzymes:considerationsfortesting,preventionandtreatment.Nat.Biotechnol.26,901–908(2008).
7.Urnov,F.D.,Rebar,E.J.,Holmes,M.C.,Zhang,H.S.&Gregory,P.D.Genomeeditingwithengineeredzincfingernucleases.Nat.Rev.Genet.11,636–646(2010).
8.Sander,J.D.&Joung,J.K.CRISPR-Cassystemsforediting,regulatingandtargetinggenomes.Nat.Biotechnol.32,347–355(2014).
9.Gaj,T.,Gersbach,C.A.&Barbas,C.F.ZFN,TALEN,andCRISPR/Cas-basedmethodsforgenomeengineering.TrendsBiotechnol.31,397–405(2013).
10.Midoux,P.,Pichon,C.,Yaouanc,J.-J.&Jaffrès,P.-A.Chemicalvectorsforgenedelivery:acurrentreviewonpolymers,peptidesandlipidscontaininghistidineorimidazoleasnucleicacidscarriers.Br.J.Pharmacol.157,166–178(2009).
11.Bodles-Brakhop,A.M.,Heller,R.&Draghia-Akli,R.ElectroporationfortheDeliveryofDNA-basedVaccinesandImmunotherapeutics:CurrentClinicalDevelopments.Mol.Ther.17,585–592(2009).
12.Kay,M.A.,Glorioso,J.C.&Naldini,L.Viralvectorsforgenetherapy:theartofturninginfectiousagentsintovehiclesoftherapeutics.Nat.Med.7,33–40(2001).
13.Zangi,L.等ModifiedmRNAdirectsthefateofheartprogenitorcellsandinducesvascularregenerationaftermyocardialinfarction.Nat.Biotechnol.31,898–907(2013).
14.Wadia,J.S.,Stan,R.V.&Dowdy,S.F.TransducibleTAT-HAfusogenicpeptideenhancesescapeofTAT-fusionproteinsafterlipidraftmacropinocytosis.Nat.Med.10,310–315(2004).
15.Daniels,D.S.&Schepartz,A.Intrinsicallycell-permeableminiatureproteinsbasedonaminimalcationicPPIImotif.J.Am.Chem.Soc.129,14578–14579(2007).
16.Cronican,J.J.等PotentdeliveryoffunctionalproteinsintoMammaliancellsinvitroandinvivousingasuperchargedprotein.ACSChem.Biol.5,747–752(2010).
17.Thompson,D.B.,Cronican,J.J.&Liu,D.R.Engineeringandidentifyingsuperchargedproteinsformacromoleculedeliveryintomammaliancells.MethodsEnzymol.503,293–319(2012).
18.Thompson,D.B.,R.,Dorr,B.M.,Zerial,M.&Liu,D.R.Cellularuptakemechanismsandendosomaltraffickingofsuperchargedproteins.Chem.Biol.19,831–843(2012).
19.Heitz,F.,Morris,M.C.&Divita,G.Twentyyearsofcell-penetratingpeptides:frommolecularmechanismstotherapeutics.Br.J.Pharmacol.157,195–206(2009).
20.Caron,N.J.等IntracellulardeliveryofaTat-eGFPfusionproteinintomusclecells.Mol.Ther.J.Am.Soc.GeneTher.3,310–318(2001).
21.Chesnoy,S.&Huang,L.Structureandfunctionoflipid-DNAcomplexesforgenedelivery.Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.29,27–47(2000).
22.Al-Taei,S.等IntracellulartrafficandfateofproteintransductiondomainsHIV-1TATpeptideandoctaarginine.Implicationsfortheirutilizationasdrugdeliveryvectors.Bioconjug.Chem.17,90–100(2006).
23.Shete,H.K.,Prabhu,R.H.&Patravale,V.B.Endosomalescape:abottleneckinintracellulardelivery.J.Nanosci.Nanotechnol.14,460–474(2014).
24.Aguilera,T.A.,Olson,E.S.,Timmers,M.M.,Jiang,T.&Tsien,R.Y.Systemicinvivodistributionofactivatablecellpenetratingpeptidesissuperiortothatofcellpenetratingpeptides.Integr.Biol.Quant.Biosci.NanoMacro1,371–381(2009).
25.Coelho,T.等SafetyandefficacyofRNAitherapyfortransthyretinamyloidosis.N.Engl.J.Med.369,819–829(2013).
26.Judge,A.D.,Bola,G.,Lee,A.C.H.&MacLachlan,I.DesignofnoninflammatorysyntheticsiRNAmediatingpotentgenesilencinginvivo.Mol.Ther.J.Am.Soc.GeneTher.13,494–505(2006).
27.Basha,G.等InfluenceofcationiclipidcompositionongenesilencingpropertiesoflipidnanoparticleformulationsofsiRNAinantigen-presentingcells.Mol.Ther.J.Am.Soc.GeneTher.19,2186–2200(2011).
28.Semple,S.C.等RationaldesignofcationiclipidsforsiRNAdelivery.Nat.Biotechnol.28,172–176(2010).
29.Boeckle,S.,Fahrmeir,J.,Roedl,W.,Ogris,M.&Wagner,E.MelittinanalogswithhighlyticactivityatendosomalpHenhancetransfectionwithpurifiedtargetedPEIpolyplexes.J.Control.ReleaseOff.J.Control.ReleaseSoc.112,240–248(2006).
30.Allen,T.M.&Cullis,P.R.Liposomaldrugdeliverysystems:fromconcepttoclinicalapplications.Adv.DrugDeliv.Rev.65,36–48(2013).
31.Zelphati,O.等Intracellulardeliveryofproteinswithanewlipid-mediateddeliverysystem.J.Biol.Chem.276,35103–35110(2001).
32.Adrian,J.E.等TargetedSAINT-O-SomesforimprovedintracellulardeliveryofsiRNAandcytotoxicdrugsintoendothelialcells.J.Control.ReleaseOff.J.Control.ReleaseSoc.144,341–349(2010).
33.Morris,M.C.,Depollier,J.,Mery,J.,Heitz,F.&Divita,G.Apeptidecarrierforthedeliveryofbiologicallyactiveproteinsintomammaliancells.Nat.Biotechnol.19,1173–1176(2001).
34.Colletier,J.-P.,Chaize,B.,Winterhalter,M.&Fournier,D.Proteinencapsulationinliposomes:efficiencydependsoninteractionsbetweenproteinandphospholipidbilayer.BMCBiotechnol.2,9(2002).
35.Lawrence,M.S.,Phillips,K.J.&Liu,D.R.Superchargingproteinscanimpartunusualresilience.J.Am.Chem.Soc.129,10110–10112(2007).
36.Liu,J.,Gaj,T.,Patterson,J.T.,Sirk,S.J.&BarbasIII,C.F.Cell-PenetratingPeptide-MediatedDeliveryofTALENProteinsviaBioconjugationforGenomeEngineering.PLoSONE9,e85755(2014).
37.Tessarollo,L.,Vogel,K.S.,Palko,M.E.,Reid,S.W.&Parada,L.F.Targetedmutationintheneurotrophin-3generesultsinlossofmusclesensoryneurons.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,11844–11848(1994).
38.Maeder,M.L.等Robust,synergisticregulationofhumangeneexpressionusingTALEactivators.Nat.Methods10,243–245(2013).
39.Jopling,C.,Boue,S.&Belmonte,J.C.I.Dedifferentiation,transdifferentiationandreprogramming:threeroutestoregeneration.Nat.Rev.Mol.CellBiol.12,79–89(2011).
40.Fu,Y.,Sander,J.D.,Reyon,D.,Cascio,V.M.&Joung,J.K.ImprovingCRISPR-CasnucleasespecificityusingtruncatedguideRNAs.Nat.Biotechnol.32,279–284(2014).
41.McNaughton,B.R.,Cronican,J.J.,Thompson,D.B.&Liu,D.R.Mammaliancellpenetration,siRNAtransfection,andDNAtransfectionbysuperchargedproteins.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106,6111–6116(2009).
42.Qi,L.S.等RepurposingCRISPRasanRNA-GuidedPlatformforSequence-SpecificControlofGeneExpression.Cell152,1173–1183(2013).
43.Guschin,D.Y.等Arapidandgeneralassayformonitoringendogenousgenemodification.MethodsMol.Biol.CliftonNJ649,247–256(2010).
44.Ran,F.A.等DoublenickingbyRNA-guidedCRISPRCas9forenhancedgenomeeditingspecificity.Cell154,1380–1389(2013).
45.Maeder,M.L.等CRISPRRNA-guidedactivationofendogenoushumangenes.Nat.Methods10,977–979(2013).
46.Guilinger,J.P.,Thompson,D.B.&Liu,D.R.FusionofcatalyticallyinactiveCas9toFokInucleaseimprovesthespecificityofgenomemodification.Nat.Biotechnol.32,577–582(2014).
47.Pattanayak,V.等High-throughputprofilingofoff-targetDNAcleavagerevealsRNA-programmedCas9nucleasespecificity.Nat.Biotechnol.31,839–843(2013).
48.Li,H.等Differentiationofneuronsfromneuralprecursorsgeneratedinfloatingspheresfromembryonicstemcells.BMCNeurosci.10,122(2009).
49.Lumpkin,E.A.等Math1-drivenGFPexpressioninthedevelopingnervoussystemoftransgenicmice.GeneExpr.PatternsGEP3,389–395(2003).
50.VanCamp,G.&Smith,R.HereditaryHearingLoss.at<http://hereditaryhearingloss.org>
51.Kim,S.,Kim,D.,Cho,S.W.,Kim,J.&Kim,J.-S.HighlyefficientRNA-guidedgenomeeditinginhumancellsviadeliveryofpurifiedCas9ribonucleoproteins.GenomeRes.24,1012–1019(2014).
52.Yin,H.等GenomeeditingwithCas9inadultmicecorrectsadiseasemutationandphenotype.Nat.Biotechnol.32,551–553(2014).
53.Wang,H.等One-stepgenerationofmicecarryingmutationsinmultiplegenesbyCRISPR/Cas-mediatedgenomeengineering.Cell153,910–918(2013).
54.Schneider,C.A.,Rasband,W.S.&Eliceiri,K.W.NIHImagetoImageJ:25yearsofimageanalysis.Nat.Methods9,671–675(2012).
55.Sage,C.等Proliferationoffunctionalhaircellsinvivointheabsenceoftheretinoblastomaprotein.Science307,1114–1118(2005).
56.Sander,J.D.等Insilicoabstractionofzincfingernucleasecleavageprofilesrevealsanexpandedlandscapeofoff-targetsites.NucleicAcidsRes.41,e181(2013).
等同方案和范围
本领域技术人员将认可或能确定，仅使用常规实验法的本文描述的具体实施方案的许多等同体。本发明的范围不意图受限于上述描述，而是如所附权利要求描述的。
本领域技术人员将认可或能确定，仅使用常规实验法的根据本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同体。本发明的范围不意图受限于上述描述，而是如所附权利要求中列出的。
在权利要求中，除非指定为相反含义或从上下文是明显的，冠词如“一个/一种”和“该”可以意指一种或超过一种。除非指定为相反含义或从上下文是明显的，如果一种、超过一种或所有的组成员存在于、用于给定产品或方法或与给定产品或方法相关，则该组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述被视为满足的。本发明包括以下实施方案，其中组的正好一个成员存在于、用于给定产品或方法或与给定产品或方法相关。本发明还包括以下实施方案，其中组的超过一个或所有成员存在于、用于给定产品或方法或与给定产品或方法相关。此外，应理解本发明涵盖所有变体、组合和排列，其中来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、子句、描述术语等被引入另一个权利要求。例如，可将从属于另一权利要求的任何权利要求修改为包括在从属于同一基础权利要求的任何其他权利要求中所见的一个或多个限制。此外，除非另外指示或对于本领域技术人员显而易见将产生冲突或不一致，当权利要求记载组合物时，应理解包括使用该组合物用于本文公开的任意目的的方法，和包括依照本文公开的制备方法或本领域已知的其他方法的制备组合物的方法。
当要素呈现为表时，例如马库什组形式时，应理解还公开了要素的每个亚组，且可从该组除去任何一种或多种要素。应理解，一般来说，当本发明或本发明的方面称为包含具体的要素、特征等时，本发明或本发明方面的某些实施方案组成或基本组成为这类要素、特征等。出于简洁目的，那些实施方案并未逐字地具体在本文中列出。还注意术语“包含”意图为开放式的且允许纳入别的要素或步骤。
当给出范围时，包括端点。此外，应理解除非另外指示或从上下文或和本领域普通技术人员的理解来看是明显的，以范围表示的值可涵盖在本发明的不同实施方案中在指定范围内的任何具体值或子范围，到该范围的下限的1/10单位，除非上下文清楚地另外指示。
另外，应理解可从任意一项或多项权利要求中明确排除落入现有技术中的本发明的任何具体实施方案。由于这类实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，即使未在本文中明确陈述该排除也可将其排除。出于任何原因，不管是否与现有技术的存在有关，均可从任意一项或多项权利要求中排除本发明的组合物的任何具体实施方案(例如任何超电荷蛋白；任何核酸；任何生产方法；任何使用方法等)。
所有引用来源，例如本文中引用的参考文献、公开出版物、数据库、数据库录入和现有技术均通过提述并入本申请，即使未在引用中明确陈述。在引用来源和本申请有冲突的情况下，以本申请中的说明为准。

Claims (92)

1.一种包含与功能性效应器蛋白联合的超电荷蛋白的组合物，其中所述超电荷蛋白具有大于其相应未经修饰蛋白的总体正电荷并且为充足的量，并且配制为用于穿透入细胞中。
2.权利要求1的组合物，其中所述功能性效应器蛋白是核酸酶。
3.权利要求2的组合物，其中所述核酸酶是可RNA编程的核酸酶。
4.权利要求3的组合物，其中所述核酸酶是TALE核酸酶、Cas9核酸酶或锌指核酸酶。
5.权利要求2-4中任一项的组合物，其中所述核酸酶特异性结合并切割核酸序列。
6.权利要求5的组合物，其中所述核酸序列包含在与疾病或病症有关的基因或等位基因中。
7.权利要求5或6的组合物，其中所述组合物还包含核酸分子，所述核酸分子包含与由所述核酸酶结合并切割的核酸序列相同或同源的序列。
8.权利要求中5-7任一项的组合物，其中所述核酸序列是包含在基因中的序列，所述基因是治疗靶物。
9.权利要求8的组合物，其中所述基因是控制细胞命运的基因。
10.权利要求9的组合物，其中所述基因是诱导或抑制朝向褐色脂肪细胞细胞命运的细胞程序化的基因。
11.权利要求9或10的组合物，其中所述基因是PRDM16或PPARγ。
12.权利要求1的组合物，其中所述功能性效应器蛋白是转录因子。
13.权利要求1的组合物，其中所述功能性效应器蛋白是TALE转录激活物或阻遏物。
14.权利要求12或13的组合物，其中所述转录因子、转录激活物或转录阻遏物特异性结合并激活或抑制基因。
15.权利要求14的组合物，其中所述基因是治疗靶物。
16.权利要求1的组合物，其中所述功能性效应器蛋白是TALE效应器。
17.权利要求1-16中任一项的组合物，其中所述超电荷蛋白经由共价键与所述功能性效应器蛋白联合，从而形成融合蛋白。
18.权利要求1-17中任一项的组合物，其中所述超电荷蛋白经由接头与功能性效应器蛋白联合。
19.权利要求18的组合物，其中所述接头是可切割接头。
20.权利要求19的组合物，其中所述接头是UV可切割接头或由溶酶体酶切割的接头。
21.权利要求1-16中任一项的组合物，其中所述超电荷蛋白经由非共价相互作用与功能性效应器蛋白联合，从而形成复合物。
22.权利要求21的组合物，其中所述超电荷蛋白具有总体净正电荷。
23.权利要求21的组合物，其中所述总体净正电荷为约+5。
24.权利要求21的组合物，其中所述总体净正电荷为约+10。
25.权利要求21的组合物，其中所述总体净正电荷为约+15。
26.权利要求21的组合物，其中所述总体净正电荷为约+20。
27.权利要求21的组合物，其中所述总体净正电荷为约+25。
28.权利要求21的组合物，其中所述总体净正电荷为约+30。
29.权利要求21的组合物，其中所述总体净正电荷为约+35。
30.权利要求21的组合物，其中所述总体净正电荷为约+40。
31.权利要求1-30中任一项的组合物，其中所述超电荷蛋白在生理学pH比其相应未经修饰的蛋白带更多的正电荷。
32.权利要求31的组合物，其中所述相应未经修饰的蛋白是天然存在的蛋白。
33.权利要求1-32中任一项的组合物，其中所述超电荷蛋白在生理学pH比其相应未经修饰的蛋白至少多带+5个正电荷。
34.权利要求1-32中任一项的组合物，其中所述超电荷蛋白在生理学pH比其相应未经修饰的蛋白至少多带+10个正电荷。
35.权利要求1-32中任一项的组合物，其中所述超电荷蛋白在生理学pH比其相应未经修饰的蛋白至少多带+15个正电荷。
36.权利要求1-32中任一项的组合物，其中所述超电荷蛋白在生理学pH比其相应未经修饰的蛋白至少多带+5个正电荷。
37.权利要求1-36中任一项的组合物，其中所述超电荷蛋白是荧光蛋白。
38.权利要求1-37中任一项的组合物，其中所述超电荷蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。
39.权利要求1-38中任一项的组合物，其中所述超电荷蛋白是超带正电荷的GFP。
40.权利要求中任一项的组合物，1-39，其中所述超电荷蛋白是超带正电荷的GFP(+36GFP)，其包含以下序列的至少20个连续氨基酸残基：GGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK(SEQIDNO:1)。
41.权利要求40的组合物，其中所述超电荷蛋白包含SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列或由SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列组成。
42.权利要求1-41中任一项的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
43.权利要求42的药物组合物，其中所述组合物包含药学可接受的赋形剂。
44.权利要求42或43的药物组合物，其中所述组合物配制为用于施用给受试者，且以有效投递给所述受试者的至少一个细胞的量包含所述超电荷蛋白和所述功能性效应器蛋白。
45.权利要求42-44中任一项的药物组合物，其中所述组合物以在施用给受试者后有效诱导可测量的治疗效果的量包含所述超电荷蛋白和所述功能性效应器蛋白。
46.一种方法，包括：
提供易感疾病、病症或状况、患有疾病、病症或状况或展现出疾病、病症或状况的一种或多种症状的受试者；和
向所述受试者施用权利要求1-41中任一项的组合物或权利要求42-45中任一项的药物组合物，从而使得至少一种症状得到改善。
47.权利要求46的方法，其中所述施用的步骤在足以使得所述功能性效应器蛋白穿透所述受试者的细胞的条件下实施。
48.权利要求46或47的方法，其中所述疾病、病症或状况与mRNA、蛋白或其组合的异常升高水平有关。
49.权利要求46-48中任一项的方法，其中所述组合物包含特异性结合并切割编码致病性RNA或蛋白的基因，或编码在患病细胞或组织中以异常高水平表达的RNA或蛋白的基因的核酸酶。
50.权利要求46-49中任一项的方法，其中所述施用的步骤包括选自下组的施用路径：口服、静脉内、肌内、动脉内、皮下、心室内、局部、吸入和粘膜投递。
51.一种将功能性效应器蛋白导入细胞中的方法，该方法包括使所述细胞与权利要求1-41中任一项的组合物或权利要求42-45中任一项的药物组合物在适合所述功能性效应器蛋白进入所述细胞的条件下接触，由此将所述功能性效应器蛋白导入所述细胞中。
52.权利要求51的方法，其进一步包括确认所述功能性效应器蛋白已穿透所述细胞。
53.权利要求51或52的方法，其中所述细胞包含在受试者中，并且所述接触在体内。
54.权利要求53的方法，其中所述受试者诊断为患有或有风险形成与基因的异常表达水平有关的病症，且其中所述功能性效应器蛋白调控所述基因的表达水平。
55.权利要求54的方法，其中所述方法进一步包括检测所述基因表达水平的变化或检测所述受试者中的治疗应答。
56.权利要求51-55中任一项的方法，其中所述细胞是体细胞。
57.权利要求51-56中任一项的方法，其中在一定条件下使所述细胞与一定量的所述组合物或所述药物组合物接触一定时间，所述条件、量和时间足以将细胞的程序化诱导到期望的细胞命运。
58.权利要求57的方法，其进一步包括在细胞替换治疗办法中使用所述程序化的细胞。
59.权利要求51-58中任一项的方法，其中所述细胞是携带与疾病有关的基因组等位基因的细胞且所述功能性效应器蛋白是特异性靶向所述等位基因的核酸酶。
60.权利要求59的方法，其中所述细胞离体接触，且在所述核酸酶成功靶向不期望的等位基因后重新施用给所述受试者。
61.试剂盒，其包含权利要求1-41中任一项的组合物，或权利要求42-45中任一项的药物组合物。
62.用于实施权利要求46-60中任一项的方法的试剂盒。
63.包含Cas9蛋白和阳离子脂质的组合物，其中所述Cas9蛋白与gRNA联合，
且所述组合物能将所述Cas9蛋白投递到细胞的内部。
64.权利要求63的组合物，其中所述组合物在施用给细胞群体时展现出低毒性。
65.权利要求63或64的组合物，其中至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％或至少99％的细胞在施用所述组合物之后是活的。
66.权利要求63-65中任一项的组合物，其中所述阳离子脂质选自下组：2000,3000,RNAiMAX和LTX。
67.权利要求63-66中任一项的组合物，其中所述Cas9蛋白包含野生型Cas9蛋白或其变体、Cas9切口酶、或核酸酶失活的Cas9(dCas9)或其变体。
68.权利要求67的组合物，其中所述dCas9融合于转录激活物或转录阻遏物。
69.权利要求68的组合物，其中所述转录激活物选自下组：VP16,VP64和p65；或其中所述转录阻遏物是KRAB蛋白或SID蛋白。
70.权利要求67的组合物，其中所述dCas9融合于核酸酶域。
71.权利要求70的组合物，其中所述核酸酶域包含FokI核酸酶域。
72.权利要求67的组合物，其中所述dCas9融合于重组酶催化域。
73.权利要求72的组合物，其中所述重组酶催化域包括Hin重组酶催化域、Gin重组酶催化域或Tn3重组酶催化域。
74.权利要求67的组合物，其中所述dCas9融合于脱氨酶。
75.权利要求74的组合物，其中所述脱氨酶包括选自下组的胞苷脱氨酶：APOBEC1、AID和ACF1/ASE脱氨酶；或其中所述脱氨酶包括腺苷脱氨酶，其任选地包含ADAT家族脱氨酶。
76.权利要求67的组合物，其中所述dCas9融合于表观遗传修饰物。
77.权利要求76的组合物，其中所述表观遗传修饰物选自下组：组蛋白脱甲基酶、组蛋白甲基转移酶、羟化酶、组蛋白脱乙酰基酶和组蛋白乙酰转移酶。
78.权利要求77的组合物，其中所述表观遗传修饰物包含LSD1组蛋白脱甲基酶或TET1羟化酶。
79.权利要求67的组合物，其中所述Cas9蛋白与具有净负电荷的超电荷蛋白联合，其中所述联合具有净负电荷，任选地其中所述联合是共价联合。
80.权利要求79的组合物，其中所述超电荷蛋白是荧光蛋白，任选地其中所
述超电荷蛋白是超带负电荷的GFP。
81.一种组合物，其包含效应器蛋白和阳离子脂质、阳离子聚合物、或阳离子脂质和阳离子聚合物两者，其中所述效应器蛋白与具有净负电荷的超电荷蛋白联合，所述联合具有净负电荷，且所述组合物能将所述效应器蛋白投递至细胞内部。
82.权利要求81的组合物，其中所述组合物在施用给细胞群体时展现出低毒性。
83.权利要求81或82的组合物，其中至少60％,至少65％,至少70％,至少75％,至少80％,至少85％,至少90％,至少95％或至少99％的细胞在施用所述组合物之后是活的。
84.权利要求81-83中任一项的组合物，其中所述阳离子脂质选自下组：2000,3000,RNAiMAX和LTX。
85.权利要求81-84中任一项的组合物，其中所述超电荷蛋白是荧光蛋白，任选地其中所述超电荷蛋白是超带负电荷的GFP。
86.权利要求81-85中任一项的组合物，其中所述效应器蛋白是重组酶。
87.权利要求86的组合物，其中所述重组酶是Cre重组酶。
88.权利要求81-87中任一项的组合物，其中所述效应器蛋白包含TALE蛋白。
89.权利要求88的组合物，其中所述TALE蛋白包含VP64转录激活物。
90.权利要求81-89中任一项的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
91.方法，包括：
对有此需要的受试者施用权利要求90的药物组合物。
92.一种将Cas9蛋白导入细胞中的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求81-90中任一项的组合物在适合所述Cas9蛋白进入所述细胞的条件下接触，从而将所述Cas9蛋白导入所述细胞。
CN201480060598.1A 2013-09-06 2014-09-05 用于功能性核酸酶的投递系统 Withdrawn CN105745221A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361874746P 2013-09-06 2013-09-06
US61/874,746 2013-09-06
US14/462,163 2014-08-18
US14/462,189 2014-08-18
US14/462,163 US9526784B2 (en) 2013-09-06 2014-08-18 Delivery system for functional nucleases
US14/462,189 US9737604B2 (en) 2013-09-06 2014-08-18 Use of cationic lipids to deliver CAS9
PCT/US2014/054247 WO2015035136A2 (en) 2013-09-06 2014-09-05 Delivery system for functional nucleases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105745221A true CN105745221A (zh) 2016-07-06

Family

ID=52625840

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480060598.1A Withdrawn CN105745221A (zh) 2013-09-06 2014-09-05 用于功能性核酸酶的投递系统

Country Status (11)

Country Link
US (7) US9737604B2 (zh)
EP (2) EP3041858B1 (zh)
JP (4) JP6629734B2 (zh)
KR (2) KR102357911B1 (zh)
CN (1) CN105745221A (zh)
AU (5) AU2014315132B2 (zh)
CA (2) CA2923409A1 (zh)
IL (3) IL274280B (zh)
NZ (1) NZ717691A (zh)
SG (2) SG11201601658YA (zh)
WO (1) WO2015035136A2 (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106978438A (zh) * 2017-02-27 2017-07-25 北京大北农生物技术有限公司 提高同源重组效率的方法
CN107530399A (zh) * 2014-10-10 2018-01-02 马萨诸塞眼科耳科诊所 治疗分子在体外和体内的有效递送
CN107722125A (zh) * 2017-09-28 2018-02-23 中山大学 一种高效的人工转录激活因子dCas9‑TV及其编码基因与应用
CN109152848A (zh) * 2016-03-15 2019-01-04 马萨诸塞大学 抗-crispr化合物以及使用方法
CN109312315A (zh) * 2015-12-30 2019-02-05 阿维塔斯有限公司 基因编辑蛋白和组合物向细胞和组织的无载体递送
CN109789185A (zh) * 2016-07-28 2019-05-21 基础科学研究院 用于治疗眼部疾病的含cas9蛋白和向导rna的药物组合物
CN109804066A (zh) * 2016-08-09 2019-05-24 哈佛大学的校长及成员们 可编程cas9-重组酶融合蛋白及其用途
CN110234770A (zh) * 2017-01-17 2019-09-13 基础科学研究院 通过dna单链断裂识别碱基编辑脱靶位点的方法
CN110997728A (zh) * 2017-05-25 2020-04-10 通用医疗公司 二分型碱基编辑器(bbe)结构和ii-型-cas9锌指编辑
US11946040B2 (en) 2019-02-04 2024-04-02 The General Hospital Corporation Adenine DNA base editor variants with reduced off-target RNA editing

Families Citing this family (204)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012088381A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 President And Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9737480B2 (en) 2012-02-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College ARRDC1-mediated microvesicles (ARMMs) and uses thereof
ES2883590T3 (es) 2012-12-12 2021-12-09 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas
ES2701749T3 (es) 2012-12-12 2019-02-25 Broad Inst Inc Métodos, modelos, sistemas y aparatos para identificar secuencias diana para enzimas Cas o sistemas CRISPR-Cas para secuencias diana y transmitir resultados de los mismos
AU2014207618A1 (en) 2013-01-16 2015-08-06 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
CA2915834A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
CN105793425B (zh) 2013-06-17 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 使用病毒组分靶向障碍和疾病的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
GB201315321D0 (en) * 2013-08-28 2013-10-09 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Transduction Buffer
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
DK3066201T3 (en) 2013-11-07 2018-06-06 Editas Medicine Inc CRISPR-RELATED PROCEDURES AND COMPOSITIONS WITH LEADING GRADES
AU2014361781B2 (en) 2013-12-12 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR -Cas systems and compositions for genome editing
WO2015089486A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
US20150166982A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting pi3k point mutations
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
JP6712948B2 (ja) 2013-12-12 2020-06-24 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法
EP3114227B1 (en) 2014-03-05 2021-07-21 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
EP3115457B1 (en) 2014-03-05 2019-10-02 National University Corporation Kobe University Genomic sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
EP3553176A1 (en) 2014-03-10 2019-10-16 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
EP3981876A1 (en) 2014-03-26 2022-04-13 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
WO2016037163A1 (en) 2014-09-07 2016-03-10 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating gene therapy anti-viral transfer vector immune responses
CN113930455A (zh) * 2014-10-09 2022-01-14 生命技术公司 Crispr寡核苷酸和基因剪辑
WO2016061523A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 Howard Hughes Medical Institute Genomic probes
US10920208B2 (en) 2014-10-22 2021-02-16 President And Fellows Of Harvard College Evolution of proteases
WO2016065341A1 (en) 2014-10-24 2016-04-28 Avectas Limited Delivery across cell plasma membranes
US11370823B2 (en) * 2014-10-29 2022-06-28 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Efficient delivery of therapeutic molecules to cells of the inner ear
US9816080B2 (en) * 2014-10-31 2017-11-14 President And Fellows Of Harvard College Delivery of CAS9 via ARRDC1-mediated microvesicles (ARMMs)
DK3597740T3 (da) 2014-11-06 2022-06-20 Dupont Us Holding Llc Peptidmedieret indføring af rna-styret endonuklease i celler
CN107250148B (zh) 2014-12-03 2021-04-16 安捷伦科技有限公司 具有化学修饰的指导rna
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
WO2016149422A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 The Broad Institute, Inc. Encoding of dna vector identity via iterative hybridization detection of a barcode transcript
KR102648489B1 (ko) 2015-04-06 2024-03-15 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
US11299729B2 (en) 2015-04-17 2022-04-12 President And Fellows Of Harvard College Vector-based mutagenesis system
AU2016253150B2 (en) 2015-04-24 2022-04-21 Editas Medicine, Inc. Evaluation of Cas9 molecule/guide RNA molecule complexes
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
EP3324999A1 (en) * 2015-05-29 2018-05-30 Agenovir Corporation Compositions and methods for cell targeted hpv treatment
KR20180034389A (ko) 2015-06-12 2018-04-04 론자 워커스빌 아이엔씨. 합성 전사인자를 이용한 핵 역분화 방법
WO2016205703A1 (en) * 2015-06-17 2016-12-22 The Uab Research Foundation Crispr/cas9 complex for genomic editing
JP2018518181A (ja) * 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション 血液細胞系列の細胞に機能的ポリペプチドを導入するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
CN108290933A (zh) 2015-06-18 2018-07-17 布罗德研究所有限公司 降低脱靶效应的crispr酶突变
WO2017015545A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 President And Fellows Of Harvard College Evolution of site-specific recombinases
US11524983B2 (en) 2015-07-23 2022-12-13 President And Fellows Of Harvard College Evolution of Bt toxins
WO2017019895A1 (en) 2015-07-30 2017-02-02 President And Fellows Of Harvard College Evolution of talens
CA2998087A1 (en) * 2015-09-09 2017-03-16 National University Corporation Kobe University Method for modifying genome sequence that specifically converts nucleobase of targeted dna sequence, and molecular complex used in said method
JP6940262B2 (ja) * 2015-09-09 2021-09-22 株式会社日本触媒 ゲノム配列が特異的に変換された遺伝子改変クロストリジウム・サッカロパーブチルアセトニカム種微生物、その製造方法およびその用途
DK3348638T3 (da) * 2015-09-09 2023-02-13 Univ Kobe Nat Univ Corp Fremgangsmåde til at konvertere genomsekvens fra gram-positiv bakterie ved specifikt at konvertere nukleinsyrebase i tilsigtet dna-sekvens, og molekylkompleks anvendt dertil
CN105177110A (zh) * 2015-09-11 2015-12-23 中国科学院微生物研究所 核酸的检测方法
EP3349730B1 (en) 2015-09-18 2020-12-02 Dnarx Systems for nucleic acid expression in vivo
CN108368516A (zh) * 2015-10-06 2018-08-03 基础科学研究院 用于从原生质体生成整个植物的方法
EP3362102A1 (en) 2015-10-14 2018-08-22 Life Technologies Corporation Ribonucleoprotein transfection agents
JP7109784B2 (ja) 2015-10-23 2022-08-01 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝子編集のための進化したＣａｓ９蛋白質
WO2017081288A1 (en) 2015-11-11 2017-05-18 Lonza Ltd Crispr-associated (cas) proteins with reduced immunogenicity
ES2914623T3 (es) 2015-11-27 2022-06-14 Univ Kobe Nat Univ Corp Método para convertir una secuencia genómica de una planta monocotiledónea en la que una base de ácido nucleico en la secuencia de ADN diana se convierte de manera específica y el complejo molecular utilizado en el mismo
WO2017123609A1 (en) * 2016-01-12 2017-07-20 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for enhanced genome editing
CA3011458A1 (en) * 2016-01-14 2017-07-20 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Genome editing for treating glioblastoma
CA3011049A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
EP3433364A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency
WO2017205503A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Indiana University Research And Technology Corporation Ku inhibitors and their use
CN117431234A (zh) * 2016-05-27 2024-01-23 阿迪根有限公司 用于基因组编辑分子的细胞内递送的肽和纳米颗粒
US20190100732A1 (en) * 2016-06-02 2019-04-04 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Assay for the removal of methyl-cytosine residues from dna
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
US11471462B2 (en) 2016-06-27 2022-10-18 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diabetes
BR112019001887A2 (pt) 2016-08-02 2019-07-09 Editas Medicine Inc composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
KR101710026B1 (ko) 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물
WO2018035388A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
US20200283743A1 (en) 2016-08-17 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
EP3510152A4 (en) * 2016-09-07 2020-04-29 Flagship Pioneering, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING GENE EXPRESSION
EP3518981A4 (en) 2016-10-03 2020-06-10 President and Fellows of Harvard College DELIVERING THERAPEUTIC RNAS VIA ARRDC1-MEDIATED MICROVESICLES
US11629170B2 (en) * 2016-10-12 2023-04-18 Feldan Bio Inc. Rationally-designed synthetic peptide shuttle agents for delivering polypeptide cargos from an extracellular space to the cytosol and/or nucleus of a target eukaryotic cell, uses thereof, methods and kits relating to same
WO2018071868A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 President And Fellows Of Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018083606A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 Novartis Ag Methods and compositions for enhancing gene editing
AR110075A1 (es) 2016-11-14 2019-02-20 Inst Genetics & Developmental Biology Cas Un método para edición basal en plantas
US11643655B2 (en) 2016-11-15 2023-05-09 City Of Hope Methods for intracellular delivery and enhanced gene targeting
US20180237787A1 (en) * 2016-12-23 2018-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene editing of pcsk9
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
EP3565891B1 (en) 2017-01-09 2023-04-12 Whitehead Institute for Biomedical Research Methods of altering gene expression by perturbing transcription factor multimers that structure regulatory loops
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
KR20190123328A (ko) 2017-03-09 2019-10-31 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 암 백신
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
KR20190127797A (ko) 2017-03-10 2019-11-13 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 시토신에서 구아닌으로의 염기 편집제
WO2018170184A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
KR20190130608A (ko) * 2017-03-22 2019-11-22 노파르티스 아게 면역종양학을 위한 조성물 및 방법
CA3057192A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
US11541130B2 (en) 2017-03-23 2023-01-03 DNARx Systems and methods for nucleic acid expression in vivo
US20200405639A1 (en) 2017-04-14 2020-12-31 The Broad Institute, Inc. Novel delivery of large payloads
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2018211990A1 (ja) * 2017-05-15 2018-11-22 国立研究開発法人産業技術総合研究所 固体支持体からタンパク質を細胞に送達する方法およびそのためのアレイ
AU2018270088A1 (en) * 2017-05-18 2020-01-16 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
KR102206676B1 (ko) * 2017-06-14 2021-01-26 한국과학기술원 비바이러스성 유전자편집 crispr 나노복합체 및 이의 제조방법
CA3067382A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 The Regents Of The University Of California Targeted non-viral dna insertions
US20200140896A1 (en) 2017-06-30 2020-05-07 Novartis Ag Methods for the treatment of disease with gene editing systems
WO2019010164A1 (en) 2017-07-06 2019-01-10 President And Fellows Of Harvard College EVOLUTION OF ARNT SYNTHÉTASES
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
EP3681999A4 (en) * 2017-09-11 2021-06-09 The Regents of the University of California CAS9 ANTIBODY MEDIA ADMINISTRATION TO MAMMAL CELLS
US11624130B2 (en) 2017-09-18 2023-04-11 President And Fellows Of Harvard College Continuous evolution for stabilized proteins
CN107557373A (zh) * 2017-09-19 2018-01-09 安徽大学 一种基于I‑B型CRISPR‑Cas系统基因cas3的基因编辑方法
WO2019075360A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Selecta Biosciences, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MITIGATING ANTI-VECTOR VIRAL TRANSFER IGM RESPONSES
CA3082251A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
BR112020008201A2 (pt) 2017-10-27 2020-10-06 The Regents Of The University Of California substituição-alvo de receptores de células t endógenos
EP3704245A1 (en) 2017-11-01 2020-09-09 Novartis AG Synthetic rnas and methods of use
EP3710039A4 (en) 2017-11-13 2021-08-04 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR CANCER TREATMENT BY TARGETING THE CLEC2D-KLRB1 PATH
US20210180059A1 (en) 2017-11-16 2021-06-17 Astrazeneca Ab Compositions and methods for improving the efficacy of cas9-based knock-in strategies
EP3752647B1 (en) 2018-02-15 2022-05-25 The Broad Institute, Inc. Cell data recorders and uses thereof
KR20200124702A (ko) * 2018-02-23 2020-11-03 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 신규한 cas9 오르소로그
KR20200139679A (ko) 2018-02-26 2020-12-14 안톨알엑스, 인크. 면역관용성 리포솜 및 그의 사용 방법
US20220307001A1 (en) 2018-02-27 2022-09-29 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 variants and uses thereof
GB201803419D0 (en) * 2018-03-02 2018-04-18 Ucl Business Plc Complex for the delivery of cas9 proteins guide RNA to cells
US10968257B2 (en) 2018-04-03 2021-04-06 The Broad Institute, Inc. Target recognition motifs and uses thereof
US20210155959A1 (en) 2018-04-06 2021-05-27 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting
GB2587970B (en) 2018-04-19 2023-02-08 Univ California Compositions and methods for gene editing
WO2019241649A1 (en) 2018-06-14 2019-12-19 President And Fellows Of Harvard College Evolution of cytidine deaminases
KR20210041008A (ko) * 2018-08-03 2021-04-14 빔 테라퓨틱스, 인크. 핵산 표적 서열을 변형시키기 위한 다중-이펙터 핵염기 편집기 및 이를 이용하는 방법
EP3847251A1 (en) 2018-09-07 2021-07-14 Astrazeneca AB Compositions and methods for improved nucleases
WO2020102659A1 (en) 2018-11-15 2020-05-22 The Broad Institute, Inc. G-to-t base editors and uses thereof
EP3880245A4 (en) * 2018-11-15 2022-07-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS FOR CYTOPLASMATIC DELIVERY OF ANTIBODIES AND OTHER PROTEINS
CA3124395A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Basf Plant Science Company Gmbh Native delivery of biomolecules into plant cells using ionic complexes with cell-penetrating peptides
US20230002745A1 (en) * 2019-01-23 2023-01-05 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
US20220118060A1 (en) * 2019-02-04 2022-04-21 The Regents Of The University Of California Exercise-induced circulatory factors for amelioration of cognitive, neurological, and regenerative dysfunction during aging
WO2020181180A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. A:t to c:g base editors and uses thereof
WO2020181193A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through adenosine methylation
WO2020181178A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through thymine alkylation
WO2020181202A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. A:t to t:a base editing through adenine deamination and oxidation
WO2020181195A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through adenine excision
US20220177863A1 (en) 2019-03-18 2022-06-09 The Broad Institute, Inc. Type vii crispr proteins and systems
MX2021011426A (es) 2019-03-19 2022-03-11 Broad Inst Inc Metodos y composiciones para editar secuencias de nucleótidos.
WO2020210751A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 The Broad Institute, Inc. System for genome editing
EP3953470A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 Astrazeneca AB Compositions and methods for improved gene editing
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
JP2022531253A (ja) * 2019-05-02 2022-07-06 モンサント テクノロジー エルエルシー 標的化核酸配列に多様性を生じさせるための組成物及び方法
EP3966323A4 (en) * 2019-05-06 2024-04-24 Univ Michigan Regents TARGETED THERAPY
WO2020236982A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Aav delivery of nucleobase editors
BR112021023594A2 (pt) 2019-05-28 2022-02-08 Selecta Biosciences Inc Métodos e composições para resposta imune de vetor de transferência antiviral atenuada
KR20220066225A (ko) * 2019-05-29 2022-05-24 엔코디드 테라퓨틱스, 인크. 선택적 유전자 조절을 위한 조성물 및 방법
EP4010474A1 (en) 2019-08-08 2022-06-15 The Broad Institute, Inc. Base editors with diversified targeting scope
WO2021030666A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 The Broad Institute, Inc. Base editing by transglycosylation
WO2021072328A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing rna
EP4041287A4 (en) * 2019-10-11 2023-11-29 University of Washington MODIFIED ENDONUCLEASES AND RELATED METHODS
WO2021108717A2 (en) 2019-11-26 2021-06-03 The Broad Institute, Inc Systems and methods for evaluating cas9-independent off-target editing of nucleic acids
WO2021138560A2 (en) * 2020-01-02 2021-07-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Programmable and portable crispr-cas transcriptional activation in bacteria
WO2021155065A1 (en) 2020-01-28 2021-08-05 The Broad Institute, Inc. Base editors, compositions, and methods for modifying the mitochondrial genome
EP4100032A1 (en) 2020-02-05 2022-12-14 The Broad Institute Inc. Gene editing methods for treating spinal muscular atrophy
US20230123669A1 (en) 2020-02-05 2023-04-20 The Broad Institute, Inc. Base editor predictive algorithm and method of use
WO2021158921A2 (en) 2020-02-05 2021-08-12 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors and uses thereof
US20230127008A1 (en) 2020-03-11 2023-04-27 The Broad Institute, Inc. Stat3-targeted base editor therapeutics for the treatment of melanoma and other cancers
US20230096378A1 (en) 2020-03-12 2023-03-30 Institute For Basic Science Composition for inducing apoptosis of cells having genomic sequence variation and method for inducing apoptosis of cells by using composition
US20230159913A1 (en) 2020-04-28 2023-05-25 The Broad Institute, Inc. Targeted base editing of the ush2a gene
EP4146797A1 (en) 2020-05-06 2023-03-15 Orchard Therapeutics (Europe) Limited Treatment for neurodegenerative diseases
IL297761A (en) 2020-05-08 2022-12-01 Broad Inst Inc Methods and compositions for simultaneously editing two helices of a designated double-helix nucleotide sequence
AU2021409729A1 (en) 2020-12-22 2023-07-13 Chroma Medicine, Inc. Compositions and methods for epigenetic editing
EP4274894A2 (en) 2021-01-11 2023-11-15 The Broad Institute, Inc. Prime editor variants, constructs, and methods for enhancing prime editing efficiency and precision
CN112843222B (zh) * 2021-01-21 2023-01-31 暨南大学 Ankrd22蛋白在制备治疗或延缓自身免疫性疾病的产品中的应用
WO2022204543A1 (en) * 2021-03-25 2022-09-29 The Regents Of The University Of California Methods and materials for treating huntington's disease
EP4095265A1 (en) * 2021-05-26 2022-11-30 Université Paris-Saclay Detection of kdm1a loss of activity for diagnosing endocrine disorders
WO2022248506A1 (en) * 2021-05-26 2022-12-01 Universite Paris-Saclay Detection of kdm1a loss of activity for diagnosing endocrine disorders
CN117396602A (zh) 2021-05-27 2024-01-12 阿斯利康(瑞典)有限公司 具有增强的稳定性的cas9效应蛋白
WO2022261509A1 (en) 2021-06-11 2022-12-15 The Broad Institute, Inc. Improved cytosine to guanine base editors
CN113343589B (zh) * 2021-06-30 2022-07-26 西南石油大学 一种基于遗传-随机常数的基因表达式编程的酸性天然气水合物生成条件预测方法
WO2023010133A2 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
AU2022318664A1 (en) 2021-07-30 2024-02-29 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
AU2022325166A1 (en) 2021-08-06 2024-02-08 President And Fellows Of Harvard College Improved prime editors and methods of use
AU2022343300A1 (en) 2021-09-10 2024-04-18 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing
WO2023052508A2 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Astrazeneca Ab Use of inhibitors to increase efficiency of crispr/cas insertions
WO2023064367A1 (en) 2021-10-12 2023-04-20 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses
WO2023076898A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing a genome with prime editing and a recombinase
WO2023077148A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2023122764A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
WO2023172624A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Selecta Biosciences, Inc. Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing
WO2023196802A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 The Broad Institute, Inc. Cas9 variants having non-canonical pam specificities and uses thereof
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023212715A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 The Broad Institute, Inc. Aav vectors encoding base editors and uses thereof
WO2023215711A1 (en) 2022-05-01 2023-11-09 Chroma Medicine, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of pcsk9 expression
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
WO2023230613A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 The Broad Institute, Inc. Improved mitochondrial base editors and methods for editing mitochondrial dna
WO2023240137A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 The Board Institute, Inc. Evolved cas14a1 variants, compositions, and methods of making and using same in genome editing
WO2023250512A1 (en) 2022-06-23 2023-12-28 Chroma Medicine, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of ciita expression
WO2023250509A1 (en) 2022-06-23 2023-12-28 Chroma Medicine, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of b2m expression
WO2023250490A1 (en) 2022-06-23 2023-12-28 Chroma Medicine, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of trac expression
WO2023250511A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression
WO2024015881A2 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024030432A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Gensaic, Inc. Therapeutic phage-derived particles
WO2024040083A1 (en) 2022-08-16 2024-02-22 The Broad Institute, Inc. Evolved cytosine deaminases and methods of editing dna using same
US20240067968A1 (en) 2022-08-19 2024-02-29 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for regulation of hepatitis b virus through targeted gene repression
WO2024052681A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 The University Court Of The University Of Edinburgh Rett syndrome therapy
WO2024059618A2 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed tgfbr shrnas
WO2024059824A2 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells with combination gene perturbations
WO2024064642A2 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for modulating t cell function
WO2024064910A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Chroma Medicine, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of hbv gene expression
WO2024081879A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 Chroma Medicine, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of cd247 expression

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010129023A2 (en) * 2009-04-28 2010-11-11 President And Fellows Of Harvard College Supercharged proteins for cell penetration
CN102066405A (zh) * 2008-04-28 2011-05-18 哈佛大学校长及研究员协会 用于细胞穿透的超荷电蛋白

Family Cites Families (1566)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7993A (en) * 1851-03-18 Coktstetiction
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4182449A (en) 1978-04-18 1980-01-08 Kozlow William J Adhesive bandage and package
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4880635B1 (en) 1984-08-08 1996-07-02 Liposome Company Dehydrated liposomes
US4921757A (en) 1985-04-26 1990-05-01 Massachusetts Institute Of Technology System for delayed and pulsed release of biologically active substances
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
JPH0825869B2 (ja) 1987-02-09 1996-03-13 株式会社ビタミン研究所 抗腫瘍剤包埋リポソ−ム製剤
US4917951A (en) 1987-07-28 1990-04-17 Micro-Pak, Inc. Lipid vesicles formed of surfactants and steroids
US4911928A (en) 1987-03-13 1990-03-27 Micro-Pak, Inc. Paucilamellar lipid vesicles
JPH068256B2 (ja) 1987-04-23 1994-02-02 エフ エム シー コーポレーション 殺虫性シクロプロピル置換ジ（アリール）化合物類
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US6872816B1 (en) 1996-01-24 2005-03-29 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection kits
JPH05274181A (ja) 1992-03-25 1993-10-22 Nec Corp ブレークポイント設定・解除方式
US5651981A (en) 1994-03-29 1997-07-29 Northwestern University Cationic phospholipids for transfection
US5449639A (en) 1994-10-24 1995-09-12 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company Ltd. Disposable metal anti-reflection coating process used together with metal dry/wet etch
US5767099A (en) 1994-12-09 1998-06-16 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing amino acid or dervatized amino acid groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
US6057153A (en) 1995-01-13 2000-05-02 Yale University Stabilized external guide sequences
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
US5851548A (en) 1995-06-07 1998-12-22 Gen-Probe Incorporated Liposomes containing cationic lipids and vitamin D
US5962313A (en) 1996-01-18 1999-10-05 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a gene encoding a lyosomal enzyme
US5981182A (en) 1997-03-13 1999-11-09 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Vector constructs for the selection and identification of open reading frames
US8097648B2 (en) 1998-06-17 2012-01-17 Eisai R&D Management Co., Ltd. Methods and compositions for use in treating cancer
JP4854853B2 (ja) 1998-11-12 2012-01-18 ライフ テクノロジーズ コーポレーション トランスフェクション薬剤
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US20090130718A1 (en) 1999-02-04 2009-05-21 Diversa Corporation Gene site saturation mutagenesis
CA2365601A1 (en) 1999-03-29 2000-10-05 Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd. Novel cytidine deaminase
CA2386341A1 (en) 1999-11-18 2001-05-25 Epimmune Inc. Heteroclitic analogs and related methods
WO2001038547A2 (en) 1999-11-24 2001-05-31 Mcs Micro Carrier Systems Gmbh Polypeptides comprising multimers of nuclear localization signals or of protein transduction domains and their use for transferring molecules into cells
WO2001040798A2 (en) 1999-12-06 2001-06-07 Sangamo Biosciences, Inc. Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
WO2001059450A2 (en) 2000-02-08 2001-08-16 Sangamo Biosciences, Inc. Cells expressing zinc finger protein for drug discovery
KR101045144B1 (ko) 2000-10-30 2011-06-30 유로-셀티크 소시에떼 아노뉨 서방성 하이드로코돈 제형
US20040003420A1 (en) 2000-11-10 2004-01-01 Ralf Kuhn Modified recombinase
ATE375394T1 (de) 2001-01-25 2007-10-15 Evolva Ltd Concatemere unterschiedlich exprimierter multipler gene
US20050222030A1 (en) 2001-02-21 2005-10-06 Anthony Allison Modified annexin proteins and methods for preventing thrombosis
DE60227069D1 (de) 2001-02-27 2008-07-24 Univ Rochester VERFAHREN UND ZUSAMMENSETZUNGEN ZUR MODIFIKATION DER BEARBEITUNG VON APOLIPOPROTEIN B-mRNA
JP2005502322A (ja) 2001-04-19 2005-01-27 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート 非天然アミノ酸のインビボ組込み
US20030108890A1 (en) 2001-05-30 2003-06-12 Baranova Anna Vjacheslavovna In silico screening for phenotype-associated expressed sequences
CA2492203A1 (en) 2002-07-12 2004-01-22 Affymetrix, Inc. Synthetic tag genes
CA2499770A1 (en) 2002-09-20 2004-04-01 Yale University Riboswitches, methods for their use, and compositions for use with riboswitches.
AU2004230592B2 (en) 2003-04-14 2007-10-04 Caliper Life Sciences, Inc. Reduction of migration shift assay interference
AU2004267359B2 (en) 2003-07-07 2010-09-09 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal lysyl-tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase pairs and uses thereof
CA2534296C (en) 2003-08-08 2013-03-26 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
WO2005098043A2 (en) 2004-03-30 2005-10-20 The President And Fellows Of Harvard College Ligand-dependent protein splicing
US7919277B2 (en) 2004-04-28 2011-04-05 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains
CA2632216C (en) 2004-07-06 2013-11-12 Societe De Commercialisation Des Produits De La Recherche Appliquee Socpra Sciences Sante Et Humaines S.E.C. A target-dependent nucleic acid adapter
US8728526B2 (en) 2004-08-19 2014-05-20 The United States of America, Represented by Secretary of Department of Health and Human Services, NIH Coacervate microparticles useful for the sustained release administration of therapeutic agents
JP5101288B2 (ja) 2004-10-05 2012-12-19 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー アプタマー調節される核酸及びその利用
JP2006248978A (ja) 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
PL2325332T3 (pl) 2005-08-26 2013-03-29 Dupont Nutrition Biosci Aps Zastosowanie genów związanych z CRISPR (genów CAS)
AU2015252023B2 (en) 2005-08-26 2017-06-29 Dupont Nutrition Biosciences Aps Use
AU2012244264B2 (en) 2005-08-26 2015-08-06 Dupont Nutrition Biosciences Aps Use
US20080051317A1 (en) 2005-12-15 2008-02-28 George Church Polypeptides comprising unnatural amino acids, methods for their production and uses therefor
EP2604255B1 (en) 2006-05-05 2017-10-25 Molecular Transfer, Inc. Novel reagents for transfection of eukaryotic cells
ATE530669T1 (de) 2006-05-19 2011-11-15 Danisco Markierte mikroorganismen und entsprechende markierungsverfahren
WO2007143574A1 (en) 2006-06-02 2007-12-13 President And Fellows Of Harvard College Protein surface remodeling
DK2860267T3 (en) 2007-03-02 2019-04-23 Dupont Nutrition Biosci Aps CULTURES WITH IMPROVED PROFESS RESISTANCE
CA2700231C (en) 2007-09-27 2018-09-18 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
US9273310B2 (en) 2007-10-08 2016-03-01 Synthetic Genomics, Inc. Methods for cloning and manipulating genomes
US9029524B2 (en) 2007-12-10 2015-05-12 California Institute Of Technology Signal activated RNA interference
WO2009146179A1 (en) 2008-04-15 2009-12-03 University Of Iowa Research Foundation Zinc finger nuclease for the cftr gene and methods of use thereof
US8394604B2 (en) 2008-04-30 2013-03-12 Paul Xiang-Qin Liu Protein splicing using short terminal split inteins
WO2010011961A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic rnai-like system and methods of use
EP2159286A1 (en) 2008-09-01 2010-03-03 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Method for obtaining oligonucleotide aptamers and uses thereof
US8790664B2 (en) 2008-09-05 2014-07-29 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Multimodular assembly useful for intracellular delivery
US8636884B2 (en) 2008-09-15 2014-01-28 Abbott Diabetes Care Inc. Cationic polymer based wired enzyme formulations for use in analyte sensors
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
US9404098B2 (en) 2008-11-06 2016-08-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for cleaving a target RNA using a Cas6 polypeptide
RU2570562C2 (ru) 2008-11-07 2015-12-10 ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС Последовательности crispr бифидобактерий
EP2370598B1 (en) 2008-12-11 2017-02-15 Pacific Biosciences Of California, Inc. Classification of nucleic acid templates
US9175338B2 (en) 2008-12-11 2015-11-03 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods for identifying nucleic acid modifications
WO2010075424A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 The Regents Of University Of California Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
US8389679B2 (en) 2009-02-05 2013-03-05 The Regents Of The University Of California Targeted antimicrobial moieties
AU2010245304B2 (en) 2009-04-27 2015-06-04 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time sequencing methods and systems
WO2010132092A2 (en) 2009-05-12 2010-11-18 The Scripps Research Institute Cytidine deaminase fusions and related methods
US9063156B2 (en) 2009-06-12 2015-06-23 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time analytical methods and systems
CA2765488C (en) 2009-06-30 2018-01-02 Sangamo Biosciences, Inc. Rapid screening of biologically active nucleases and isolation of nuclease-modified cells
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
EP2462230B1 (en) 2009-08-03 2015-07-15 Recombinetics, Inc. Methods and compositions for targeted gene modification
US20120178647A1 (en) 2009-08-03 2012-07-12 The General Hospital Corporation Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly
GB0913681D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
AU2010313247A1 (en) 2009-10-30 2012-05-24 Synthetic Genomics, Inc. Encoding text into nucleic acid sequences
BR112012010202A2 (pt) 2009-11-02 2015-09-22 Univ Washington molécula de nuclease hibrida polipeptideo dimerico, composição farmacêutica molécula de acido nucleico vetor de expressão recombinante célula hospedeira transformada metodo para preparar a molécula de nuclease e metodo para tratar ou previnir uma condição associada com uma imune anormal
US20110104787A1 (en) 2009-11-05 2011-05-05 President And Fellows Of Harvard College Fusion Peptides That Bind to and Modify Target Nucleic Acid Sequences
WO2011068916A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Intezyne Technologies, Incorporated Pegylated polyplexes for polynucleotide delivery
WO2011075627A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Use of cytidine deaminase-related agents to promote demethylation and cell reprogramming
BR112012017896A2 (pt) 2010-01-22 2015-09-01 Dow Agrosciences Llc Excisão de transgenes em organismos geneticamente modificados
JP2013520989A (ja) 2010-03-05 2013-06-10 シンセティック ジェノミクス インコーポレーテッド ゲノムのクローニングおよび操作のための方法
US8557961B2 (en) 2010-04-02 2013-10-15 Amunix Operating Inc. Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same
SG185481A1 (en) 2010-05-10 2012-12-28 Univ California Endoribonuclease compositions and methods of use thereof
CA2798988C (en) 2010-05-17 2020-03-10 Sangamo Biosciences, Inc. Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof
GB201008267D0 (en) 2010-05-18 2010-06-30 Univ Edinburgh Cationic lipids
JP5957646B2 (ja) 2010-06-04 2016-07-27 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． オリゴヌクレオチド送達のための新規な低分子量カチオン性脂質
WO2011159369A1 (en) 2010-06-14 2011-12-22 Iowa State University Research Foundation, Inc. Nuclease activity of tal effector and foki fusion protein
MX364560B (es) 2010-09-20 2019-05-02 Spi Pharma Inc Star Proceso de microencapsulacion y producto.
EP2630156B1 (en) 2010-10-20 2018-08-22 DuPont Nutrition Biosciences ApS Lactococcus crispr-cas sequences
WO2012070031A1 (en) 2010-11-26 2012-05-31 University Of The Witwatersrand, Johannesburg Polymeric matrix of polymer-lipid nanoparticles as a pharmaceutical dosage form
KR101255338B1 (ko) 2010-12-15 2013-04-16 포항공과대학교 산학협력단 표적 세포에 대한 폴리뉴클레오티드 전달체
ES2753198T5 (es) 2010-12-16 2023-05-31 Amgen Europe Gmbh Formas farmacéuticas orales de liberación controlada de fármacos poco solubles y sus usos
US9499592B2 (en) 2011-01-26 2016-11-22 President And Fellows Of Harvard College Transcription activator-like effectors
US9528124B2 (en) 2013-08-27 2016-12-27 Recombinetics, Inc. Efficient non-meiotic allele introgression
US9200045B2 (en) 2011-03-11 2015-12-01 President And Fellows Of Harvard College Small molecule-dependent inteins and uses thereof
US9164079B2 (en) 2011-03-17 2015-10-20 Greyledge Technologies Llc Systems for autologous biological therapeutics
US20120244601A1 (en) 2011-03-22 2012-09-27 Bertozzi Carolyn R Riboswitch based inducible gene expression platform
US8709466B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 International Business Machines Corporation Cationic polymers for antimicrobial applications and delivery of bioactive materials
US20140115726A1 (en) 2011-04-05 2014-04-24 Cellectis New tale-protein scaffolds and uses thereof
WO2012148953A1 (en) 2011-04-25 2012-11-01 Stc.Unm Solid compositions for pharmaceutical use
SG194089A1 (en) 2011-04-27 2013-11-29 Amyris Inc Methods for genomic modification
US8691750B2 (en) 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
WO2012158985A2 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Methods for site-specific genetic modification in spermatogonial stem cells using zinc finger nuclease (zfn) for the creation of model organisms
US20140201858A1 (en) 2011-05-17 2014-07-17 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc Methods for site-specific genetic modification in stem cells using xanthomonas tal nucleases (xtn) for the creation of model organisms
US20140113376A1 (en) 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
WO2013012674A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 The General Hospital Corporation Methods of transcription activator like effector assembly
EP2734622B1 (en) 2011-07-19 2018-09-05 Vivoscript, Inc. Compositions and methods for re-programming cells without genetic modification for repairing cartilage damage
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
AU2012317323B2 (en) 2011-09-28 2017-10-05 Fujimoto Pharmaceutical Corporation NGF aptamer and application thereof
GB2496687A (en) 2011-11-21 2013-05-22 Gw Pharma Ltd Tetrahydrocannabivarin (THCV) in the protection of pancreatic islet cells
KR20140102759A (ko) 2011-12-16 2014-08-22 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9737480B2 (en) 2012-02-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College ARRDC1-mediated microvesicles (ARMMs) and uses thereof
DK2836226T3 (en) 2012-02-24 2017-09-18 Hutchinson Fred Cancer Res COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR TREATING HEMOGLOBINOPATHY
CA2865011C (en) 2012-02-29 2021-06-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating huntington's disease
SG11201405783VA (en) 2012-03-17 2014-10-30 Univ California Fast diagnosis and personalized treatments for acne
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013152359A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 The Regents Of The University Of California Novel tetrazines and method of synthesizing the same
BR112014026203A2 (pt) 2012-04-23 2017-07-18 Bayer Cropscience Nv engenharia do genoma direcionado nas plantas
CN104428414B (zh) 2012-05-02 2022-01-21 陶氏益农公司 苹果酸脱氢酶的靶向修饰
RU2650819C2 (ru) 2012-05-07 2018-04-17 Сангамо Терапьютикс, Инк. Способы и композиции для опосредованной нуклеазой направленной интеграции трансгенов
US11120889B2 (en) 2012-05-09 2021-09-14 Georgia Tech Research Corporation Method for synthesizing a nuclease with reduced off-site cleavage
US20150017136A1 (en) 2013-07-15 2015-01-15 Cellectis Methods for engineering allogeneic and highly active t cell for immunotherapy
EP3964567A1 (en) 2012-05-25 2022-03-09 Cellectis Methods for engineering allogeneic and immunosuppressive resistant t cell for immunotherapy
EA038924B1 (ru) 2012-05-25 2021-11-10 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции рнк-специфической модификации днк-мишени и рнк-специфической модуляции транскрипции
US20140056868A1 (en) 2012-05-30 2014-02-27 University of Washington Center for Commercialization Supercoiled MiniVectors as a Tool for DNA Repair, Alteration and Replacement
US9102936B2 (en) 2012-06-11 2015-08-11 Agilent Technologies, Inc. Method of adaptor-dimer subtraction using a CRISPR CAS6 protein
KR20150023670A (ko) 2012-06-12 2015-03-05 제넨테크, 인크. 조건적 녹아웃 대립유전자의 생성 방법 및 이를 위한 조성물
EP2674501A1 (en) 2012-06-14 2013-12-18 Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation,de l'environnement et du travail Method for detecting and identifying enterohemorrhagic Escherichia coli
US9688971B2 (en) 2012-06-15 2017-06-27 The Regents Of The University Of California Endoribonuclease and methods of use thereof
BR112014031891A2 (pt) 2012-06-19 2017-08-01 Univ Minnesota direcionamento genético nas plantas utilizando vírus de dna
CA2877962C (en) 2012-06-29 2018-06-05 Massachusetts Institute Of Technology Massively parallel combinatorial genetics
US9125508B2 (en) 2012-06-30 2015-09-08 Seasons 4, Inc. Collapsible tree system
US10883119B2 (en) 2012-07-11 2021-01-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for delivery of biologics
HUE051612T2 (hu) 2012-07-11 2021-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Eljárások és készítmények lizoszomális tárolási betegségek kezelésére
CN116622704A (zh) 2012-07-25 2023-08-22 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
US10058078B2 (en) 2012-07-31 2018-08-28 Recombinetics, Inc. Production of FMDV-resistant livestock by allele substitution
JP6340366B2 (ja) 2012-07-31 2018-06-06 イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド 運動ニューロン疾患を診断および処置する方法
EP2880171B1 (en) 2012-08-03 2018-10-03 The Regents of The University of California Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing
CN104704110B (zh) 2012-08-29 2018-06-01 桑格摩生物科学股份有限公司 用于治疗遗传性病状的方法和组合物
US9937205B2 (en) 2012-09-04 2018-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of diacylglycerol kinase to augment adoptive T cell transfer
AU2013312801B2 (en) 2012-09-04 2018-11-15 The Scripps Research Institute Chimeric polypeptides having targeted binding specificity
AU2013312838B2 (en) 2012-09-04 2018-11-29 Cellectis Multi-chain chimeric antigen receptor and uses thereof
CN105264067B (zh) 2012-09-07 2020-11-10 美国陶氏益农公司 Fad3性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白
AR092482A1 (es) 2012-09-07 2015-04-22 Dow Agrosciences Llc Enriquecimiento de la clasificacion de las celulas activadas por fluorescencia (facs) para generar plantas
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
WO2014043143A1 (en) 2012-09-11 2014-03-20 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
GB201216564D0 (en) 2012-09-17 2012-10-31 Univ Edinburgh Genetically edited animal
WO2014047103A2 (en) 2012-09-18 2014-03-27 The Translational Genomics Research Institute Isolated genes and transgenic organisms for producing biofuels
ES2824024T3 (es) 2012-10-10 2021-05-11 Sangamo Therapeutics Inc Compuestos modificadores de células T y usos de los mismos
EP3789405A1 (en) 2012-10-12 2021-03-10 The General Hospital Corporation Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins
CN105441440B (zh) 2012-10-23 2020-12-15 基因工具股份有限公司 包含特异于靶dna的向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的用于切割靶dna的组合物及其用途
US20140115728A1 (en) 2012-10-24 2014-04-24 A. Joseph Tector Double knockout (gt/cmah-ko) pigs, organs and tissues
EP2914714A4 (en) 2012-10-30 2016-09-21 Recombinetics Inc CONTROLLING GENDER TREATMENT IN ANIMALS
WO2014071006A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Cellectis Coupling herbicide resistance with targeted insertion of transgenes in plants
AR093296A1 (es) 2012-10-31 2015-05-27 Kiss György Botond Identificacion de un gen de resistencia a xanthomonas euvesicatoria de pimienta (capsicum annuum) y metodo para generar plantas a esa resistencia
KR20230154283A (ko) 2012-11-01 2023-11-07 팩터 바이오사이언스 인크. 세포에서 단백질을 발현시키는 방법들과 생성물들
US20150315576A1 (en) 2012-11-01 2015-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Genetic device for the controlled destruction of dna
US20140127752A1 (en) 2012-11-07 2014-05-08 Zhaohui Zhou Method, composition, and reagent kit for targeted genomic enrichment
EP2917336B1 (en) 2012-11-09 2018-06-27 Marco Archetti Diffusible factors and cancer cells
WO2014081730A1 (en) 2012-11-20 2014-05-30 Cold Spring Harbor Laboratory Mutations in solanaceae plants that modulate shoot architecture and enhance yield-related phenotypes
KR20150085846A (ko) 2012-11-20 2015-07-24 제이.알.심프롯캄패니 Tal-매개 전이 DNA 삽입방법
WO2014081855A1 (en) 2012-11-20 2014-05-30 Universite De Montreal Methods and compositions for muscular dystrophies
SG11201504038XA (en) 2012-11-27 2015-06-29 Childrens Medical Center Targeting bcl11a distal regulatory elements for fetal hemoglobin reinduction
CA2892551A1 (en) 2012-11-29 2014-06-05 North Carolina State University Synthetic pathway for biological carbon dioxide sequestration
WO2014082644A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 WULFF, Peter, Samuel Circular rna for inhibition of microrna
US20160010154A1 (en) 2012-11-30 2016-01-14 The Parkinson's Institute Screening assays for therapeutics for parkinson's disease
AU2013355327A1 (en) 2012-12-05 2015-06-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for regulation of metabolic disorders
KR102531576B1 (ko) 2012-12-06 2023-05-11 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
WO2014089513A1 (en) 2012-12-06 2014-06-12 Synthetic Genomics, Inc. Autonomous replication sequences and episomal dna molecules
CA3144049A1 (en) 2012-12-06 2014-06-12 Synthetic Genomics, Inc. Algal mutants having a locked-in high light acclimated phenotype
WO2014089348A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Synthetic Genomics, Inc. Nannochloropsis spliced leader sequences and uses therefor
US10272163B2 (en) 2012-12-07 2019-04-30 The Regents Of The University Of California Factor VIII mutation repair and tolerance induction
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
CN113528577A (zh) 2012-12-12 2021-10-22 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化
EP4234696A3 (en) 2012-12-12 2023-09-06 The Broad Institute Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
JP6552965B2 (ja) 2012-12-12 2019-07-31 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための改善された系、方法および酵素組成物のエンジニアリングおよび最適化
RU2701662C9 (ru) 2012-12-12 2019-10-31 Те Брод Инститьют, Инк. Компоненты системы crispr-cas, способы и композиции для манипуляции с последовательностями
ES2701749T3 (es) 2012-12-12 2019-02-25 Broad Inst Inc Métodos, modelos, sistemas y aparatos para identificar secuencias diana para enzimas Cas o sistemas CRISPR-Cas para secuencias diana y transmitir resultados de los mismos
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
EP2932421A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
ES2883590T3 (es) 2012-12-12 2021-12-09 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas
ES2576128T3 (es) 2012-12-12 2016-07-05 The Broad Institute, Inc. Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias con dominios funcionales
AR093980A1 (es) 2012-12-13 2015-07-01 Dow Agrosciences Llc Genes de precision que tienen como objetivo un locus particular en el maiz
CN105144204B (zh) 2012-12-13 2018-02-27 麻省理工学院 基于重组酶的逻辑与存储系统
AU2013359146B2 (en) 2012-12-13 2017-12-07 Corteva Agriscience Llc DNA detection methods for site specific nuclease activity
RU2766685C2 (ru) 2012-12-17 2022-03-15 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Рнк-направляемая инженерия генома человека
TR201808715T4 (tr) 2012-12-21 2018-07-23 Cellectis Düşük soğuk indüklü tatlandırması olan patatesler.
ES2705033T3 (es) 2012-12-27 2019-03-21 Keygene Nv Método para eliminar un ligamiento genético en una planta
EP2943579B1 (en) 2013-01-10 2018-09-12 Dharmacon, Inc. Libraries and methods for generating molecules
CN105142396A (zh) 2013-01-14 2015-12-09 重组股份有限公司 缺角家畜
AU2014207618A1 (en) 2013-01-16 2015-08-06 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
CN103233028B (zh) 2013-01-25 2015-05-13 南京徇齐生物技术有限公司 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列
US10137188B2 (en) 2013-02-05 2018-11-27 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cell lines for virus production and methods of use
US10660943B2 (en) 2013-02-07 2020-05-26 The Rockefeller University Sequence specific antimicrobials
PL2963113T3 (pl) 2013-02-14 2020-07-13 Osaka University Sposób izolowania określonych regionów genomowych z wykorzystaniem cząsteczki zdolnej do specyficznego wiązania się z endogenną sekwencją DNA
WO2014127287A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for in vivo tergated mutagenesis
WO2014130706A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
US20150353885A1 (en) 2013-02-21 2015-12-10 Cellectis Method to counter-select cells or organisms by linking loci to nuclease components
ES2522765B2 (es) 2013-02-22 2015-03-18 Universidad De Alicante Método para dectectar inserciones de espaciadores en estructuras CRISPR
AU2014218621B2 (en) 2013-02-25 2019-11-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
WO2014131833A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
US10047366B2 (en) 2013-03-06 2018-08-14 The Johns Hopkins University Telomerator-a tool for chromosome engineering
WO2014143381A1 (en) 2013-03-09 2014-09-18 Agilent Technologies, Inc. Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple crispr/cas selections of recombineering events
UA123532C2 (uk) 2013-03-12 2021-04-21 Е. І. Дю Пон Де Немур Енд Компані Спосіб ідентифікації варіантного сайта розпізнавання для сконструйованого засобу, що рідко розщеплює, для індукції двониткового розриву
CN105283539A (zh) 2013-03-12 2016-01-27 桑格摩生物科学股份有限公司 用于hla的修饰的方法和组合物
AU2014235794A1 (en) 2013-03-14 2015-10-22 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
WO2014153118A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of diseases and conditions associated with dysregulation of mammalian target of rapamycin complex 1 (mtorc1)
MX2015011985A (es) 2013-03-15 2016-04-07 Univ Minnesota Ingenieria genomica de plantas utilizando sistemas crispr/cas.
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US20140363561A1 (en) 2013-03-15 2014-12-11 J.R. Simplot Company Tal-mediated transfer dna insertion
EP2971006A4 (en) 2013-03-15 2017-02-08 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Reproducible method for testis-mediated genetic modification (tgm) and sperm-mediated genetic modification (sgm)
US20140349400A1 (en) 2013-03-15 2014-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Programmable Modification of DNA
US10287594B2 (en) 2013-03-15 2019-05-14 Cibus Us Llc Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
CN112301024A (zh) 2013-03-15 2021-02-02 通用医疗公司 使用RNA引导的FokI核酸酶(RFN)提高RNA引导的基因组编辑的特异性
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
WO2014153470A2 (en) 2013-03-21 2014-09-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
US20160053274A1 (en) 2013-04-02 2016-02-25 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in eukaryotes
AU2014248119B2 (en) 2013-04-03 2019-06-20 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Effective generation of tumor-targeted T-cells derived from pluripotent stem cells
JP6576904B2 (ja) 2013-04-04 2019-09-18 トラスティーズ・オブ・ダートマス・カレッジ ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡのｉｎｖｉｖｏ切除のための組成物及び方法
CN115261411A (zh) 2013-04-04 2022-11-01 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
EP2981166B1 (en) 2013-04-05 2020-09-09 Dow AgroSciences LLC Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants
US20150056629A1 (en) 2013-04-14 2015-02-26 Katriona Guthrie-Honea Compositions, systems, and methods for detecting a DNA sequence
LT3456831T (lt) 2013-04-16 2021-09-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tikslinis žiurkės genomo modifikavimas
WO2014172458A1 (en) 2013-04-16 2014-10-23 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Activating an alternative pathway for homology-directed repair to stimulate targeted gene correction and genome engineering
US20160186208A1 (en) 2013-04-16 2016-06-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal
EP2796558A1 (en) 2013-04-23 2014-10-29 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Improved gene targeting and nucleic acid carrier molecule, in particular for use in plants
CN103224947B (zh) 2013-04-28 2015-06-10 陕西师范大学 一种基因打靶系统
US10471099B2 (en) 2013-05-10 2019-11-12 Whitehead Institute For Biomedical Research In vitro production of red blood cells with proteins comprising sortase recognition motifs
WO2014182700A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
MX2015015638A (es) 2013-05-13 2016-10-28 Cellectis Metodos para diseñar celulas t altamente activas para inmunoterapia.
KR102248157B1 (ko) 2013-05-13 2021-05-03 셀렉티스 Ｃｄ19 특이적 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
CA2910489A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
WO2014186686A2 (en) 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
US20140349405A1 (en) 2013-05-22 2014-11-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
US9890393B2 (en) 2013-05-29 2018-02-13 Cellectis Methods for engineering T cells for immunotherapy by using RNA-guided CAS nuclease system
WO2014191518A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Cellectis A method for producing precise dna cleavage using cas9 nickase activity
JP6670743B2 (ja) 2013-05-29 2020-03-25 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｉｉ型ｃｒｉｓｐｒシステムにおける新規のコンパクトなｃａｓ９足場
US11414695B2 (en) 2013-05-29 2022-08-16 Agilent Technologies, Inc. Nucleic acid enrichment using Cas9
US20150067922A1 (en) 2013-05-30 2015-03-05 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
ES2716867T3 (es) 2013-05-31 2019-06-17 Cellectis Sa Endonucleasa de asentamiento LAGLIDADG que escinde el gen de receptor de células T alfa y usos de la misma
US20140359796A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Recombinetics, Inc. Genetically sterile animals
US10006052B2 (en) 2013-05-31 2018-06-26 Cellectis Laglidadg homing endonuclease cleaving the C-C chemokine receptor type-5 (CCR5) gene and uses thereof
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
CN105451778B (zh) 2013-06-04 2021-08-03 哈佛大学校长及研究员协会 Rna-导向的转录调控
KR20230136697A (ko) 2013-06-05 2023-09-26 듀크 유니버시티 Rna-가이드 유전자 편집 및 유전자 조절
US9593356B2 (en) 2013-06-11 2017-03-14 Takara Bio Usa, Inc. Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same
US20150315252A1 (en) 2013-06-11 2015-11-05 Clontech Laboratories, Inc. Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same
EP3008181B1 (en) 2013-06-11 2019-11-06 The Regents of The University of California Methods and compositions for target dna modification
EP3008186B1 (en) 2013-06-14 2018-11-28 Cellectis Methods for non-transgenic genome editing in plants
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
CA2915834A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
EP3011035B1 (en) 2013-06-17 2020-05-13 The Broad Institute, Inc. Assay for quantitative evaluation of target site cleavage by one or more crispr-cas guide sequences
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
RU2725502C2 (ru) 2013-06-17 2020-07-02 Те Брод Инститьют Инк. Доставка, конструирование и оптимизация систем, способы и композиции для целенаправленного воздействия и моделирования заболеваний и нарушений постмитотических клеток
CN105793425B (zh) 2013-06-17 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 使用病毒组分靶向障碍和疾病的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
KR20160021812A (ko) 2013-06-19 2016-02-26 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 표적된 통합
AU2014301147B2 (en) 2013-06-25 2020-07-30 Cellectis Modified diatoms for biofuel production
WO2015002780A1 (en) 2013-07-01 2015-01-08 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Transcription activator-like effector (tale) libraries and methods of synthesis and use
EP3019595A4 (en) 2013-07-09 2016-11-30 THERAPEUTIC USES OF A GENERIC CHANGE WITH CRISPR / CAS SYSTEMS
CN116042726A (zh) 2013-07-09 2023-05-02 哈佛大学校长及研究员协会 多重rna向导的基因组工程
CA2917961A1 (en) 2013-07-10 2015-01-15 Joseph A. Majzoub Mrap2 knockouts
IL282489B (en) 2013-07-10 2022-07-01 Harvard College Cas9 proteins are orthogonal to the regulation and editing of guided genes - RNA
CA2916905A1 (en) 2013-07-10 2015-01-15 Novartis Ag Multiple proteases deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof
DK3019619T3 (da) 2013-07-11 2021-10-11 Modernatx Inc Sammensætninger, der omfatter syntetiske polynukleotider, som koder for crispr-beslægtede proteiner, og syntetiske sgrna'er, og anvendelsesfremgangsmåder
WO2015007194A1 (zh) 2013-07-16 2015-01-22 中国科学院上海生命科学研究院 植物基因组定点修饰方法
JP6482546B2 (ja) 2013-07-19 2019-03-13 ラリクス・バイオサイエンス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＬａｒｉｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｌｃ 二重対立遺伝子ノックアウトを生成するための方法および組成物
GB201313235D0 (en) 2013-07-24 2013-09-04 Univ Edinburgh Antiviral Compositions Methods and Animals
CN103388006B (zh) 2013-07-26 2015-10-28 华东师范大学 一种基因定点突变的构建方法
US10563225B2 (en) 2013-07-26 2020-02-18 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US10421957B2 (en) 2013-07-29 2019-09-24 Agilent Technologies, Inc. DNA assembly using an RNA-programmable nickase
ES2915377T3 (es) 2013-08-02 2022-06-22 Enevolv Inc Procedimientos y células huésped para ingeniería genómica, de vías y biomolécular
ITTO20130669A1 (it) 2013-08-05 2015-02-06 Consiglio Nazionale Ricerche Vettore adeno-associato ricombinante muscolo-specifico e suo impiego nel trattamento di patologie muscolari
US20150044772A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 Sage Labs, Inc. Crispr/cas system-based novel fusion protein and its applications in genome editing
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
WO2015024017A2 (en) 2013-08-16 2015-02-19 President And Fellows Of Harvard College Rna polymerase, methods of purification and methods of use
WO2015021990A1 (en) 2013-08-16 2015-02-19 University Of Copenhagen Rna probing method and reagents
NO3036326T3 (zh) 2013-08-20 2018-03-03
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
EP3611268A1 (en) 2013-08-22 2020-02-19 E. I. du Pont de Nemours and Company Plant genome modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
EP3988654A1 (en) 2013-08-28 2022-04-27 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
GB201315321D0 (en) 2013-08-28 2013-10-09 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Transduction Buffer
EA037850B1 (ru) 2013-08-29 2021-05-27 Тэмпл Юниверсити Оф Зе Коммонвэлс Систем Оф Хайе Эдьюкейшн Способы и композиции для рнк-направленного лечения вич-инфекции
EP4279496A3 (en) 2013-09-04 2024-03-13 Corteva Agriscience LLC Rapid targeting analysis in crops for determining donor insertion
CA3127948A1 (en) 2013-09-04 2015-03-12 Kws Saat Se Helminthosporium turcicum-resistant plant
SG11201601570QA (en) 2013-09-04 2016-04-28 Csir Site-specific nuclease single-cell assay targeting gene regulatory elements to silence gene expression
DK3041498T3 (da) 2013-09-05 2022-05-09 Massachusetts Inst Technology Afstemning af mikrobielle populationer med programmerbare nukleaser
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
WO2015040402A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 Kymab Limited Methods. cells & organisms
WO2015040075A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 Genome Research Limited Genomic screening methods using rna-guided endonucleases
CN105579068A (zh) 2013-09-23 2016-05-11 伦斯勒理工学院 在各种细胞群中纳米颗粒介导的基因传递、基因组编辑和靶向配体的修饰
WO2015048577A2 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
US10822606B2 (en) 2013-09-27 2020-11-03 The Regents Of The University Of California Optimized small guide RNAs and methods of use
WO2015048801A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 The Regents Of The University Of Califorinia Identification of cxcr8, a novel chemokine receptor
US20160237451A1 (en) 2013-09-30 2016-08-18 Regents Of The University Of Minnesota Conferring resistance to geminiviruses in plants using crispr/cas systems
WO2015051191A1 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Northeastern University Methods and compositions for generation of developmentally-incompetent eggs in recipients of nuclear genetic transfer
JP5774657B2 (ja) 2013-10-04 2015-09-09 国立大学法人京都大学 エレクトロポレーションを利用した哺乳類の遺伝子改変方法
US20160237402A1 (en) 2013-10-07 2016-08-18 Northeastern University Methods and Compositions for Ex Vivo Generation of Developmentally Competent Eggs from Germ Line Cells Using Autologous Cell Systems
WO2015052231A2 (en) 2013-10-08 2015-04-16 Technical University Of Denmark Multiplex editing system
DE102013111099B4 (de) 2013-10-08 2023-11-30 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Permanente Genkorrektur mittels nukleotidmodifizierter messenger RNA
US20150098954A1 (en) 2013-10-08 2015-04-09 Elwha Llc Compositions and Methods Related to CRISPR Targeting
EP3055423B1 (en) 2013-10-11 2019-12-25 Cellectis Method for detecting nucleic acid sequences of interest using talen protein
WO2015057671A1 (en) 2013-10-14 2015-04-23 The Broad Institute, Inc. Artificial transcription factors comprising a sliding domain and uses thereof
KR102339240B1 (ko) 2013-10-15 2021-12-15 더 스크립스 리서치 인스티튜트 펩타이드 키메라 항원 수용체 t 세포 스위치 및 이의 용도
US20150238631A1 (en) 2013-10-15 2015-08-27 The California Institute For Biomedical Research Chimeric antigen receptor t cell switches and uses thereof
CA2926078C (en) 2013-10-17 2021-11-16 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
CA2926094C (en) 2013-10-17 2024-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
EP3060658B1 (en) 2013-10-25 2020-07-15 Cellectis Design of rare-cutting endonucleases for efficient and specific targeting dna sequences comprising highly repetitive motives
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
WO2015066119A1 (en) 2013-10-30 2015-05-07 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-ii crispr-cas system in lactobacillus buchneri
JP6560203B2 (ja) 2013-11-04 2019-08-14 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 遺伝子ターゲッティングのためのユニバーサルドナー系
CN107223156A (zh) 2013-11-04 2017-09-29 美国陶氏益农公司 最优玉米座位
US10093940B2 (en) 2013-11-04 2018-10-09 Dow Agrosciences Llc Optimal maize loci
MX358066B (es) 2013-11-04 2018-08-03 Dow Agrosciences Llc Óptimos loci de soya.
AU2014341925B2 (en) 2013-11-04 2017-06-29 Corteva Agriscience Llc Optimal soybean loci
WO2015069682A2 (en) 2013-11-05 2015-05-14 President And Fellows Of Harvard College Precise microbiota engineering at the cellular level
DK3066201T3 (en) 2013-11-07 2018-06-06 Editas Medicine Inc CRISPR-RELATED PROCEDURES AND COMPOSITIONS WITH LEADING GRADES
WO2015077058A2 (en) 2013-11-08 2015-05-28 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for selecting a treatment for b-cell neoplasias
BR112016010175A2 (pt) 2013-11-11 2017-10-03 Sangamo Biosciences Inc Repressor genético, seus usos, e composição farmacêutica
WO2015070193A1 (en) 2013-11-11 2015-05-14 Liu Oliver Compositions and methods for targeted gene disruption in prokaryotes
SI3068881T1 (sl) 2013-11-13 2019-05-31 Children's Medical Center Corporation Z nukleazo posredovano uravnavanje izražanja genov
WO2015073867A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Engineering neural stem cells using homologous recombination
JP2016538342A (ja) 2013-11-18 2016-12-08 イエール ユニバーシティ トランスポゾンを使用する組成物および方法
WO2015071474A2 (en) 2013-11-18 2015-05-21 Crispr Therapeutics Ag Crispr-cas system materials and methods
US10787684B2 (en) 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
WO2015075056A1 (en) 2013-11-19 2015-05-28 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Programmable enzymes for isolation of specific dna fragments
CA2930282A1 (en) 2013-11-20 2015-05-28 Fondazione Telethon Artificial dna-binding proteins and uses thereof
CA2930973A1 (en) 2013-11-22 2015-05-28 Pal SAERTROM C/ebp alpha short activating rna compositions and methods of use
CA2930784C (en) 2013-11-22 2023-01-31 Cellectis Method for generating batches of allogeneic t cells with averaged potency
WO2015075195A1 (en) 2013-11-22 2015-05-28 Cellectis Method of engineering chemotherapy drug resistant t-cells for immunotherapy
CN103642836A (zh) 2013-11-26 2014-03-19 苏州同善生物科技有限公司 一种基于crispr基因敲除技术建立脆性x综合症灵长类动物模型的方法
CN103614415A (zh) 2013-11-27 2014-03-05 苏州同善生物科技有限公司 一种基于crispr基因敲除技术建立肥胖症大鼠动物模型的方法
CA2928635C (en) 2013-11-28 2022-06-21 Horizon Genomics Gmbh Somatic haploid human cell line
ES2813367T3 (es) 2013-12-09 2021-03-23 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para ingeniería genómica
WO2015088643A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
US20150166982A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting pi3k point mutations
WO2015089486A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
WO2015089473A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
JP6712948B2 (ja) 2013-12-12 2020-06-24 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法
BR112016013207A2 (pt) 2013-12-12 2017-09-26 Massachusetts Inst Technology administração, uso e aplicações terapêuticas dos sistemas crispr-cas e composições para o hbv e distúrbios e doenças virais
MX2016007327A (es) 2013-12-12 2017-03-06 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapeuticas de sistemas y composiciones crispr-cas para dirigirlos a trastornos y enfermedades usando componentes para suministro de particulas.
AU2014361781B2 (en) 2013-12-12 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR -Cas systems and compositions for genome editing
EP3080266B1 (en) 2013-12-12 2021-02-03 The Regents of The University of California Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid
CA2932439A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes
WO2015086798A2 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Cellectis New method of selection of algal-transformed cells using nuclease
JP2016539653A (ja) 2013-12-13 2016-12-22 セレクティス 微小藻類のゲノム操作のためのＣａｓ９ヌクレアーゼプラットフォーム
US20150191744A1 (en) 2013-12-17 2015-07-09 University Of Massachusetts Cas9 effector-mediated regulation of transcription, differentiation and gene editing/labeling
CN106029886B (zh) 2013-12-19 2021-02-05 阿迈瑞斯公司 基因组整合的方法
EP3985124A1 (en) 2013-12-26 2022-04-20 The General Hospital Corporation Multiplex guide rnas
CA2935216C (en) 2013-12-30 2021-11-09 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Fusion genes associated with progressive prostate cancer
WO2015103153A1 (en) 2013-12-31 2015-07-09 The Regents Of The University Of California Cas9 crystals and methods of use thereof
CN103668472B (zh) 2013-12-31 2014-12-24 北京大学 利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法
SG10201805815YA (en) 2014-01-08 2018-08-30 Harvard College Rna-guided gene drives
EP3094729A1 (en) 2014-01-14 2016-11-23 Lam Therapeutics, Inc. Mutagenesis methods
US10774338B2 (en) 2014-01-16 2020-09-15 The Regents Of The University Of California Generation of heritable chimeric plant traits
EP3097194A4 (en) 2014-01-21 2017-08-23 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Modified plants
GB201400962D0 (en) 2014-01-21 2014-03-05 Kloehn Peter C Screening for target-specific affinity binders using RNA interference
EP3096609B1 (en) 2014-01-24 2021-09-22 Children's Medical Center Corporation High-throughput mouse model for optimizing antibody affinities
CA2936646A1 (en) 2014-01-24 2015-07-30 North Carolina State University Methods and compositions for sequences guiding cas9 targeting
WO2015113063A1 (en) 2014-01-27 2015-07-30 Georgia Tech Research Corporation Methods and systems for identifying crispr/cas off-target sites
CN104805078A (zh) 2014-01-28 2015-07-29 北京大学 用于高效基因组编辑的rna分子的设计、合成及其应用
WO2015116686A1 (en) 2014-01-29 2015-08-06 Agilent Technologies, Inc. Cas9-based isothermal method of detection of specific dna sequence
US10233456B2 (en) 2014-01-30 2019-03-19 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Method, vectors, cells, seeds and kits for stacking genes into a single genomic site
US20150291969A1 (en) 2014-01-30 2015-10-15 Chromatin, Inc. Compositions for reduced lignin content in sorghum and improving cell wall digestibility, and methods of making the same
GB201401707D0 (en) 2014-01-31 2014-03-19 Sec Dep For Health The Adeno-associated viral vectors
MX2016009771A (es) 2014-01-31 2016-11-14 Factor Bioscience Inc Metodos y productos para la produccion y administracion de acido nucleico.
WO2015115903A1 (en) 2014-02-03 2015-08-06 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Site-specific dna break-induced genome editing using engineered nucleases
HUE051232T2 (hu) 2014-02-03 2021-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Béta-talasszémia kezelésére szolgáló eljárások és készítmények
EP3102722B1 (en) 2014-02-04 2020-08-26 Jumpcode Genomics, Inc. Genome fractioning
WO2015118156A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 Vib Vzw Inhibition of neat1 for treatment of solid tumors
EP3690044B1 (en) 2014-02-11 2024-01-10 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
CN113215219A (zh) 2014-02-13 2021-08-06 宝生物工程(美国) 有限公司 从核酸的初始集合中耗尽靶分子的方法、以及用于实践其的组合物和试剂盒
PT3105317T (pt) 2014-02-14 2019-02-27 Cellectis Células para imunoterapia manipuladas para atuar sobre antigénios presentes tanto em células imunitárias como em células patológicas
RU2016136977A (ru) 2014-02-18 2018-03-20 Дьюк Юниверсити Композиции для инактивации репликации вируса и способы их получения и применения
WO2015124718A1 (en) 2014-02-20 2015-08-27 Dsm Ip Assets B.V. Phage insensitive streptococcus thermophilus
AU2015220762B2 (en) 2014-02-21 2019-05-02 Cellectis Method for in situ inhibition of regulatory T cells
WO2015127428A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Massachusetts Institute Of Technology Methods for in vivo genome editing
US10370680B2 (en) 2014-02-24 2019-08-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating factor IX deficiency using nuclease-mediated targeted integration
WO2015129686A1 (ja) 2014-02-25 2015-09-03 国立研究開発法人 農業生物資源研究所 標的ｄｎａに変異が導入された植物細胞、及びその製造方法
EP3971283A1 (en) 2014-02-27 2022-03-23 Monsanto Technology LLC Compositions and methods for site directed genomic modification
CN103820441B (zh) 2014-03-04 2017-05-17 黄行许 CRISPR‑Cas9特异性敲除人CTLA4基因的方法以及用于特异性靶向CTLA4基因的sgRNA
CN103820454B (zh) 2014-03-04 2016-03-30 上海金卫生物技术有限公司 CRISPR-Cas9特异性敲除人PD1基因的方法以及用于特异性靶向PD1基因的sgRNA
EP3114227B1 (en) 2014-03-05 2021-07-21 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
EP3115457B1 (en) 2014-03-05 2019-10-02 National University Corporation Kobe University Genomic sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same
EP3553176A1 (en) 2014-03-10 2019-10-16 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
KR102228828B1 (ko) 2014-03-11 2021-03-16 셀렉티스 동종이형 이식에 양립성인 t-세포들을 만들어내는 방법
EP3116533B1 (en) 2014-03-12 2020-08-12 Precision Biosciences, Inc. Dystrophin gene exon deletion using engineered nucleases
WO2015138870A2 (en) 2014-03-13 2015-09-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeted epigenetic modification
DK3116305T3 (da) 2014-03-14 2024-03-04 Cibus Us Llc Fremgangsmåder og sammensætninger til forøgelse af effektiviteten af målrettet genmodifikation ved anvendelse af oligonukleotidmedieret genreparation
WO2015138855A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 The Regents Of The University Of California Vectors and methods for fungal genome engineering by crispr-cas9
WO2015143046A2 (en) 2014-03-18 2015-09-24 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression
JP2017514513A (ja) 2014-03-20 2017-06-08 ユニベルシテ ラバル フラタキシンレベルを増加させるためのｃｒｉｓｐｒ系の方法及び生成物、ならびにそれらの使用
KR102417915B1 (ko) 2014-03-21 2022-07-07 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 뉴클레아제 없는 게놈 편집
PL3122766T3 (pl) 2014-03-24 2021-09-13 IMMCO Diagnostics, Inc. Ulepszone wykrywanie i diagnostyka przeciwciał przeciwjądrowych dla układowych i nieukładowych zaburzeń autoimmunologicznych
AU2015236128A1 (en) 2014-03-25 2016-11-10 Editas Medicine Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating HIV infection and AIDS
WO2015148680A1 (en) 2014-03-25 2015-10-01 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods and genetic systems for cell engineering
JP6815986B2 (ja) 2014-03-26 2021-01-20 ユニバーシティ オブ メリーランド， カレッジ パーク 大型家畜の接合体における標的化ゲノム編集
WO2015148860A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta-thalassemia
EP3981876A1 (en) 2014-03-26 2022-04-13 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
EP3125946B1 (en) 2014-03-28 2022-12-07 Aposense Ltd. Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
US9993563B2 (en) 2014-03-28 2018-06-12 Aposense Ltd. Compounds and methods for trans-membrane delivery of molecules
WO2015153760A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a nervous system disorder
WO2015153791A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 2 (hsv-2)
WO2015153789A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 1 (hsv-1)
WO2015153780A1 (en) 2014-04-02 2015-10-08 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating primary open angle glaucoma
WO2015153889A2 (en) 2014-04-02 2015-10-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Materials and methods for the treatment of latent viral infection
US20170022499A1 (en) 2014-04-03 2017-01-26 Massachusetts Institute Of Techology Methods and compositions for the production of guide rna
CN103911376B (zh) 2014-04-03 2017-02-15 黄行许 CRISPR‑Cas9靶向敲除乙肝病毒cccDNA及其特异性sgRNA
CA2944978C (en) 2014-04-08 2024-02-13 North Carolina State University Methods and compositions for rna-directed repression of transcription using crispr-associated genes
EP3556858A3 (en) 2014-04-09 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating cystic fibrosis
US10253311B2 (en) 2014-04-10 2019-04-09 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for using argonaute to modify a single stranded target nucleic acid
AU2015245469B2 (en) 2014-04-11 2020-11-12 Cellectis Method for generating immune cells resistant to arginine and/or tryptophan depleted microenvironment
DK3132034T3 (da) 2014-04-14 2020-10-19 Nemesis Bioscience Ltd Terapeutikum
CN103923911B (zh) 2014-04-14 2016-06-08 上海金卫生物技术有限公司 CRISPR-Cas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的sgRNA
JP2017513477A (ja) 2014-04-14 2017-06-01 マックスサイト インコーポレーティッド ゲノムｄｎａを改変するための方法および組成物
GB201406968D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Deletion mutants
GB201406970D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Targeted mutations
EP3800248A3 (en) 2014-04-18 2021-08-04 Editas Medicine, Inc. Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
CN105039399A (zh) 2014-04-23 2015-11-11 复旦大学 多能干细胞-遗传性心肌病心肌细胞及其制备方法
US9522936B2 (en) 2014-04-24 2016-12-20 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered transcription activator like effector (TALE) proteins
KR101823661B1 (ko) 2014-04-24 2018-01-30 기초과학연구원 마이크로 상동 기반의 유전자 녹아웃을 위한 뉴클레아제 표적 서열을 확인하는 방법
AU2015249371B2 (en) 2014-04-24 2020-04-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Application of induced pluripotent stem cells to generate adoptive cell therapy products
AU2015253536A1 (en) 2014-04-28 2016-11-17 Dow Agrosciences Llc Haploid maize transformation
AU2015253352A1 (en) 2014-04-28 2016-12-08 Recombinetics, Inc. Multiplex Gene Editing
WO2015168158A1 (en) 2014-04-28 2015-11-05 Fredy Altpeter Targeted genome editing to modify lignin biosynthesis and cell wall composition
GB2540694A (en) 2014-04-29 2017-01-25 Seattle Children's Hospital (Dba Seattle Children's Res Institute) CCR5 disruption of cells expressing anti-hiv chimeric antigen receptor (CAR) derived from broadly neutralizing antibodies
WO2015165276A1 (zh) 2014-04-30 2015-11-05 清华大学 利用tale转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路的试剂盒
EP3636765A1 (en) 2014-04-30 2020-04-15 Tsinghua University Use of tale transcriptional repressor for modulator construction of synthetic gene line in mammalian cells
WO2015168404A1 (en) 2014-04-30 2015-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Toehold-gated guide rna for programmable cas9 circuitry with rna input
CN104178506B (zh) 2014-04-30 2017-03-01 清华大学 Taler蛋白通过空间位阻发挥转录抑制作用及其应用
CA2947466A1 (en) 2014-05-01 2015-11-05 University Of Washington In vivo gene engineering with adenoviral vectors
GB201407852D0 (en) 2014-05-02 2014-06-18 Iontas Ltd Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules
WO2015171603A1 (en) 2014-05-06 2015-11-12 Two Blades Foundation Methods for producing plants with enhanced resistance to oomycete pathogens
BR112016025849A2 (pt) 2014-05-08 2017-10-17 Chdi Foundation Inc métodos e composições para o tratamento da doença de huntington
US10487336B2 (en) 2014-05-09 2019-11-26 The Regents Of The University Of California Methods for selecting plants after genome editing
EP3139954A4 (en) 2014-05-09 2018-02-28 Indiana University Research and Technology Corporation Methods and compositions for treating hepatitis b virus infections
EP3140403A4 (en) 2014-05-09 2017-12-20 Université Laval Prevention and treatment of alzheimer's disease by genome editing using the crispr/cas system
US9574211B2 (en) 2014-05-13 2017-02-21 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
CN104017821B (zh) 2014-05-16 2016-07-06 安徽省农业科学院水稻研究所 定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法
CN104004782B (zh) 2014-05-16 2016-06-08 安徽省农业科学院水稻研究所 一种延长水稻生育期的育种方法
CN103981211B (zh) 2014-05-16 2016-07-06 安徽省农业科学院水稻研究所 一种创制闭颖授粉水稻材料的育种方法
WO2015173436A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Vrije Universiteit Brussel Genetic correction of myotonic dystrophy type 1
CN103981212B (zh) 2014-05-16 2016-06-01 安徽省农业科学院水稻研究所 将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法
WO2015179540A1 (en) 2014-05-20 2015-11-26 Regents Of The University Of Minnesota Method for editing a genetic sequence
CA2852593A1 (en) 2014-05-23 2015-11-23 Universite Laval Methods for producing dopaminergic neurons and uses thereof
WO2015183885A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for perturbing gene expression in hematopoietic stem cell lineages in vivo
WO2015183025A1 (ko) 2014-05-28 2015-12-03 주식회사 툴젠 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 표적 dna의 민감한 검출 방법
US10066241B2 (en) 2014-05-30 2018-09-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods of delivering treatments for latent viral infections
WO2015188065A1 (en) 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
WO2015188135A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 The California Institute For Biomedical Research Constant region antibody fusion proteins and compositions thereof
CN104004778B (zh) 2014-06-06 2016-03-02 重庆高圣生物医药有限责任公司 含有CRISPR/Cas9系统的靶向敲除载体及其腺病毒和应用
WO2015188094A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 President And Fellows Of Harvard College Methods for targeted modification of genomic dna
US11030531B2 (en) 2014-06-06 2021-06-08 Trustees Of Boston University DNA recombinase circuits for logical control of gene expression
US20170327577A1 (en) 2014-06-06 2017-11-16 The California Institute For Biomedical Research Methods of constructing amino terminal immunoglobulin fusion proteins and compositions thereof
ES2784754T3 (es) 2014-06-06 2020-09-30 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para modificar un locus objetivo
US11274302B2 (en) 2016-08-17 2022-03-15 Diacarta Ltd Specific synthetic chimeric Xenonucleic acid guide RNA; s(XNA-gRNA) for enhancing CRISPR mediated genome editing efficiency
CA2951707A1 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
DK3155102T3 (da) 2014-06-11 2023-01-30 Univ Duke Sammensætninger og metoder til hurtig og dynamisk regulering af gennemstrømning ved brug af syntetiske metaboliske klapper
WO2015191899A1 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Howard Tom E FACTOR VIII MUTATION REPAIR AND TOLERANCE INDUCTION AND RELATED CDNAs, COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS
WO2015191911A2 (en) 2014-06-12 2015-12-17 Clontech Laboratories, Inc. Protein enriched microvesicles and methods of making and using the same
WO2015189693A1 (en) 2014-06-12 2015-12-17 King Abdullah University Of Science And Technology Targeted viral-mediated plant genome editing using crispr/cas9
MX2016016833A (es) 2014-06-16 2017-10-04 Univ Johns Hopkins Composiciones y metodos para la expresion de arns guias crispr que usan el promotor h1.
WO2015195547A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 University Of Washington Methods for controlling stem cell potential and for gene editing in stem cells
CA2952613A1 (en) 2014-06-17 2015-12-23 Poseida Therapeutics, Inc. A method for directing proteins to specific loci in the genome and uses thereof
US10301637B2 (en) 2014-06-20 2019-05-28 Cellectis Potatoes with reduced granule-bound starch synthase
SI3354732T1 (sl) 2014-06-23 2020-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Z nukleazo posredovan DNA sklop
JP6784601B2 (ja) 2014-06-23 2020-11-11 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション シークエンシングによって評価されるゲノムワイドでバイアスのないＤＳＢの同定（ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ）
WO2015200555A2 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Caribou Biosciences, Inc. Rna modification to engineer cas9 activity
GB201411344D0 (en) 2014-06-26 2014-08-13 Univ Leicester Cloning
SI3161128T1 (sl) 2014-06-26 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Postopki in sestavki za ciljano genetsko spremembo in postopki uporabe
WO2016001988A1 (ja) 2014-06-30 2016-01-07 日産自動車株式会社 内燃機関
WO2016001978A1 (ja) 2014-06-30 2016-01-07 花王株式会社 冷却用貼付シート
WO2016004010A1 (en) 2014-07-01 2016-01-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Regulated gene expression from viral vectors
US20170198268A1 (en) 2014-07-09 2017-07-13 Gen9, Inc. Compositions and Methods for Site-Directed DNA Nicking and Cleaving
EP2966170A1 (en) 2014-07-10 2016-01-13 Heinrich-Pette-Institut Leibniz-Institut für experimentelle Virologie-Stiftung bürgerlichen Rechts - HBV inactivation
CN106687594A (zh) 2014-07-11 2017-05-17 纳幕尔杜邦公司 用于产生对草甘膦除草剂具有抗性的植物的组合物和方法
CN106795524A (zh) 2014-07-11 2017-05-31 先锋国际良种公司 使用向导rna/cas内切核酸酶系统改变农学性状及其使用方法
CN104109687A (zh) 2014-07-14 2014-10-22 四川大学 运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用
WO2016011080A2 (en) 2014-07-14 2016-01-21 The Regents Of The University Of California Crispr/cas transcriptional modulation
MA40253A (fr) 2014-07-15 2017-05-24 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
US9944933B2 (en) 2014-07-17 2018-04-17 Georgia Tech Research Corporation Aptamer-guided gene targeting
EP3193944B1 (en) 2014-07-17 2021-04-07 University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education Methods of treating cells containing fusion genes
US20160053304A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Depleting Target Sequences Using CRISPR
US20160053272A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Modifying A Sequence Using CRISPR
US10975406B2 (en) 2014-07-18 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Directed endonucleases for repeatable nucleic acid cleavage
CN106687483B (zh) 2014-07-21 2020-12-04 诺华股份有限公司 使用人源化抗-bcma嵌合抗原受体治疗癌症
EP3172321B2 (en) 2014-07-21 2023-01-04 Illumina, Inc. Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
JP6653420B2 (ja) 2014-07-22 2020-02-26 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 複合磁性材料とこれを用いたコイル部品ならびに複合磁性材料の製造方法
US10244771B2 (en) 2014-07-24 2019-04-02 Dsm Ip Assets B.V. Non-CRISPR-mediated phage resistant Streptococcus thermophilus
WO2016014837A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Sangamo Biosciences, Inc. Gene editing for hiv gene therapy
WO2016012544A2 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Enhanced reprogramming to ips cells
US9816074B2 (en) 2014-07-25 2017-11-14 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
WO2016016119A1 (en) 2014-07-26 2016-02-04 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Compositions and methods for treatment of muscular dystrophy
FR3024464A1 (fr) 2014-07-30 2016-02-05 Centre Nat Rech Scient Ciblage de vecteurs integratifs non-viraux dans les sequences d'adn nucleolaires chez les eucaryotes
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US9616090B2 (en) 2014-07-30 2017-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Gene correction of SCID-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
US9850521B2 (en) 2014-08-01 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. In vitro assay buffer for Cas9
US20160076093A1 (en) 2014-08-04 2016-03-17 University Of Washington Multiplex homology-directed repair
EP2982758A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) Genome editing for the treatment of huntington's disease
US10280402B2 (en) 2014-08-06 2019-05-07 College Of Medicine Pochon Cha University Industry-Academic Cooperation Foundation Immune-compatible cells created by nuclease-mediated editing of genes encoding HLA
JP6715419B2 (ja) 2014-08-06 2020-07-01 トゥールジェン インコーポレイテッド カンピロバクター・ジェジュニｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムに由来するｒｇｅｎを使用したゲノム編集
US11299732B2 (en) 2014-08-07 2022-04-12 The Rockefeller University Compositions and methods for transcription-based CRISPR-Cas DNA editing
WO2016022866A1 (en) 2014-08-07 2016-02-11 Agilent Technologies, Inc. Cis-blocked guide rna
EP3180034B1 (en) 2014-08-11 2022-04-20 The Board of Regents of The University of Texas System Prevention of muscular dystrophy by crispr/cas9-mediated gene editing
US10513711B2 (en) 2014-08-13 2019-12-24 Dupont Us Holding, Llc Genetic targeting in non-conventional yeast using an RNA-guided endonuclease
US11071289B2 (en) 2014-08-14 2021-07-27 Biocytogen Boston Corp DNA knock-in system
CN104178461B (zh) 2014-08-14 2017-02-01 北京蛋白质组研究中心 携带cas9的重组腺病毒及其应用
US9879270B2 (en) 2014-08-15 2018-01-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Constructs and methods for genome editing and genetic engineering of fungi and protists
WO2016028682A1 (en) 2014-08-17 2016-02-25 The Broad Institute Inc. Genome editing using cas9 nickases
WO2016028887A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
CA2958292A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided systems for probing and mapping of nucleic acids
WO2016026444A1 (en) 2014-08-20 2016-02-25 Shanghai Institutes For Biological Sciences, Chinese Academy Of Sciences Biomarker and therapeutic target for triple negative breast cancer
TW201614073A (en) 2014-08-25 2016-04-16 Geneweave Biosciences Inc Non-replicative transduction particles and transduction particle-based reporter systems
EP3194427A1 (en) 2014-08-26 2017-07-26 The Regents of The University of California Hypersensitive aba receptors
US9970030B2 (en) 2014-08-27 2018-05-15 Caribou Biosciences, Inc. Methods for increasing CAS9-mediated engineering efficiency
WO2016033298A1 (en) 2014-08-28 2016-03-03 North Carolina State University Novel cas9 proteins and guiding features for dna targeting and genome editing
US10570418B2 (en) 2014-09-02 2020-02-25 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification
WO2016035044A1 (en) 2014-09-05 2016-03-10 Vilnius University Programmable rna shredding by the type iii-a crispr-cas system of streptococcus thermophilus
US11219670B2 (en) 2014-09-05 2022-01-11 The Johns Hopkins University Targeting CAPN9/CAPNS2 activity as a therapeutic strategy for the treatment of myofibroblast differentiation and associated pathologies
WO2016040594A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 The Regents Of The University Of California Reconstruction of ancestral cells by enzymatic recording
CA2956487A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use
RS62334B1 (sr) 2014-09-16 2021-10-29 Sangamo Therapeutics Inc Postupci i sastavi za inženjering genoma posredovan nukleazom i korekciju kod matičnih ćelija hematopoeze
EA201790369A1 (ru) 2014-09-16 2017-10-31 Джилид Сайэнс, Инк. Твердые формы модулятора толл-подобного рецептора
DK3198018T3 (da) 2014-09-24 2021-03-01 Hope City Vektorvarianter af adenoassocieret virus til højeffektiv genomredigering og fremgangsmåder dertil
WO2016049251A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling mutations in leukocytes
WO2016049163A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder
WO2016049024A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
WO2016046635A1 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Institut Pasteur Methods for characterizing human papillomavirus associated cervical lesions
WO2016054225A1 (en) 2014-09-30 2016-04-07 Stc.Unm Plasmid delivery in the treatment of cancer and other disease states
US11021718B2 (en) 2014-10-01 2021-06-01 The General Hospital Corporation Methods for increasing efficiency of nuclease-induced homology-directed repair
CN113930455A (zh) 2014-10-09 2022-01-14 生命技术公司 Crispr寡核苷酸和基因剪辑
WO2016057850A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Seattle Children' S Hospital (Dba Seattle Children' S Research Institute) Long poly (a) plasmids and methods for introduction of long poly (a) sequences into the plasmid
AU2015330699B2 (en) 2014-10-10 2021-12-02 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
CN107530399B (zh) 2014-10-10 2022-03-18 马萨诸塞眼科耳科诊所 治疗分子在体外和体内的有效递送
WO2016061073A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Composition and method for in vivo engineering of chromosomal rearrangements
EP3561052A1 (en) 2014-10-15 2019-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating or maintaining pluripotent cells
CN104342457A (zh) 2014-10-17 2015-02-11 杭州师范大学 一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法
WO2016061523A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Howard Hughes Medical Institute Genomic probes
WO2016061481A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 The Penn State Research Foundation Methods and compositions for multiplex rna guided genome editing and other rna technologies
JP2017536813A (ja) 2014-10-20 2017-12-14 エンバイロロジックス インコーポレイテッド Ｒｎａウイルスを検出するための組成物及び方法
US20170247762A1 (en) 2014-10-27 2017-08-31 The Board Institute Inc. Compositions, methods and use of synthetic lethal screening
EP3212770B1 (en) 2014-10-29 2022-06-29 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Methods for efficient delivery of therapeutic molecules in vitro and in vivo
EP3212165B1 (en) 2014-10-30 2024-02-28 President and Fellows of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
MA40880A (fr) 2014-10-30 2017-09-05 Temple Univ Of The Commonwealth Éradication guidée par l'arn du virus jc humain et d'autres polyomavirus
US9816080B2 (en) 2014-10-31 2017-11-14 President And Fellows Of Harvard College Delivery of CAS9 via ARRDC1-mediated microvesicles (ARMMs)
JP6879910B2 (ja) 2014-10-31 2021-06-02 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア Ｃａｒｔ細胞における遺伝子発現の改変およびその使用
JP6788584B2 (ja) 2014-10-31 2020-11-25 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー Ｃｒｉｓｐｒについての超並列コンビナトリアル遺伝学
SG11201703528YA (en) 2014-11-03 2017-05-30 Univ Nanyang Tech A recombinant expression system that senses pathogenic microorganisms
CN104504304B (zh) 2014-11-03 2017-08-25 深圳先进技术研究院 一种成簇的规律间隔的短回文重复序列识别方法及装置
CN104404036B (zh) 2014-11-03 2017-12-01 赛业（苏州）生物科技有限公司 基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法
WO2016072399A1 (ja) 2014-11-04 2016-05-12 国立大学法人神戸大学 脱塩基反応により標的化したｄｎａ配列に特異的に変異を導入する、ゲノム配列の改変方法、並びにそれに用いる分子複合体
US20180291382A1 (en) 2014-11-05 2018-10-11 The Regents Of The University Of California Methods for Autocatalytic Genome Editing and Neutralizing Autocatalytic Genome Editing
DK3597740T3 (da) 2014-11-06 2022-06-20 Dupont Us Holding Llc Peptidmedieret indføring af rna-styret endonuklease i celler
WO2016073990A2 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
AU2015346514B2 (en) 2014-11-11 2021-04-08 Illumina, Inc. Polynucleotide amplification using CRISPR-Cas systems
CN107532142A (zh) 2014-11-11 2018-01-02 应用干细胞有限公司 使用同源重组改造间充质干细胞
CN107109486B (zh) 2014-11-14 2021-08-13 基础科学研究院 用于检测基因组中遗传剪刀的脱靶位点的方法
DK3218490T3 (en) 2014-11-15 2019-02-18 Zumutor Biologics Inc DNA BINDING DOMAIN OF CRISPR SYSTEM FOR PRODUCING NON-FUCOSYLED AND PARTICULAR FUCOSYLED PROTEINS
JP6190995B2 (ja) 2014-11-17 2017-09-06 国立大学法人 東京医科歯科大学 簡便で高効率の遺伝子改変非ヒト哺乳動物の作製方法
US10858662B2 (en) 2014-11-19 2020-12-08 Institute For Basic Science Genome editing with split Cas9 expressed from two vectors
US11319555B2 (en) 2014-11-20 2022-05-03 Duke University Compositions, systems and methods for cell therapy
RS58893B1 (sr) 2014-11-21 2019-08-30 Regeneron Pharma Postupci i kompozicije za ciljanu genetičku modifikaciju korišćenjem parnih vodećih rnk
US10227661B2 (en) 2014-11-21 2019-03-12 GeneWeave Biosciences, Inc. Sequence-specific detection and phenotype determination
US20180334732A1 (en) 2014-11-25 2018-11-22 Drexel University Compositions and methods for hiv quasi-species excision from hiv-1-infected patients
JP6860483B2 (ja) 2014-11-26 2021-04-14 テクノロジー イノベーション モメンタム ファンド（イスラエル）リミテッド パートナーシップＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｍｏｍｅｎｔｕｍ Ｆｕｎｄ（ｉｓｒａｅｌ）Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ 細菌遺伝子の標的化削減
CN105695485B (zh) 2014-11-27 2020-02-21 中国科学院上海生命科学研究院 一种用于丝状真菌Crispr-Cas系统的Cas9编码基因及其应用
WO2016084084A1 (en) 2014-11-27 2016-06-02 Danziger Innovations Ltd. Nucleic acid constructs for genome editing
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
WO2016082135A1 (zh) 2014-11-27 2016-06-02 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种利用定点切割系统对猪h11位点定点插入的方法
EP3227446A1 (en) 2014-12-01 2017-10-11 Novartis AG Compositions and methods for diagnosis and treatment of prostate cancer
WO2016089866A1 (en) 2014-12-01 2016-06-09 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided systems for in vivo gene editing
CN107250148B (zh) 2014-12-03 2021-04-16 安捷伦科技有限公司 具有化学修饰的指导rna
CN104450774A (zh) 2014-12-04 2015-03-25 中国农业科学院作物科学研究所 一种大豆CRISPR/Cas9体系的构建及其在大豆基因修饰中的应用
WO2016090385A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Applied Stemcell, Inc. Site-directed crispr/recombinase compositions and methods of integrating transgenes
CN104531704B (zh) 2014-12-09 2019-05-21 中国农业大学 利用CRISPR-Cas9系统敲除动物FGF5基因的方法
CN104531705A (zh) 2014-12-09 2015-04-22 中国农业大学 利用CRISPR-Cas9系统敲除动物myostatin基因的方法
US9888673B2 (en) 2014-12-10 2018-02-13 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
EP3230452A1 (en) 2014-12-12 2017-10-18 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
CN107249645A (zh) 2014-12-12 2017-10-13 朱坚 用于选择性消除所关注细胞的方法和组合物
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
JP6997623B2 (ja) 2014-12-12 2022-02-04 エム． ウルフ、トッド オリゴヌクレオチドを利用して細胞内の核酸を編集するための組成物および方法
CN104480144B (zh) 2014-12-12 2017-04-12 武汉大学 用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒
WO2016094880A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
WO2016100389A1 (en) 2014-12-16 2016-06-23 Synthetic Genomics, Inc. Compositions of and methods for in vitro viral genome engineering
JP6814142B2 (ja) 2014-12-16 2021-01-13 ダニスコ・ユーエス・インク 真菌ゲノム改変システムおよび使用方法
ES2865268T3 (es) 2014-12-17 2021-10-15 Dupont Us Holding Llc Composiciones y métodos para la edición eficaz de genes en E. coli utilizando sistemas de ARN guía/endonucleasa CAS en combinación con moldes de modificación de polinucleótido circulares
AU2015367317A1 (en) 2014-12-17 2017-06-01 Cellectis Inhibitory chimeric antigen receptor (iCAR or N-CAR) expressing non-T cell transduction domain
AU2015367378A1 (en) 2014-12-17 2017-06-15 Proqr Therapeutics Ii B.V. Targeted RNA editing
JP2017538427A (ja) 2014-12-18 2017-12-28 インテグレイテッド ディーエヌエイ テクノロジーズ インコーポレイテッド Ｃｒｉｓｐｒ系組成物及び使用方法
WO2016097751A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 The University Of Bath Method of cas9 mediated genome engineering
WO2016100974A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
CN104745626B (zh) 2014-12-19 2018-05-01 中国航天员科研训练中心 一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法及应用
JP6947638B2 (ja) 2014-12-20 2021-10-13 アーク バイオ， エルエルシー Ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ系タンパク質を使用する核酸の標的化枯渇、富化および分割のための組成物および方法
US10190106B2 (en) 2014-12-22 2019-01-29 Univesity Of Massachusetts Cas9-DNA targeting unit chimeras
CN104560864B (zh) 2014-12-22 2017-08-11 中国科学院微生物研究所 利用CRISPR‑Cas9系统构建的敲除IFN‑β基因的293T细胞系
US11053271B2 (en) 2014-12-23 2021-07-06 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for nucleic acid integration
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
CN104651398A (zh) 2014-12-24 2015-05-27 杭州师范大学 利用CRISPR-Cas9特异敲出microRNA基因家族的方法
EP3237017A4 (en) 2014-12-24 2018-08-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Systems and methods for genome modification and regulation
AU2015101792A4 (en) 2014-12-24 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Engineering of systems, methods and optimized enzyme and guide scaffolds for sequence manipulation
WO2016106244A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Crispr having or associated with destabilization domains
EP3239298A4 (en) 2014-12-26 2018-06-13 Riken Gene knockout method
CN104498493B (zh) 2014-12-30 2017-12-26 武汉大学 CRISPR/Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒的方法以及用于特异性靶向HBV DNA的gRNA
WO2016108926A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 The Broad Institute Inc. Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis
WO2016109255A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 University Of South Florida Methods and compositions for cloning into large vectors
WO2016109840A2 (en) 2014-12-31 2016-07-07 Synthetic Genomics, Inc. Compositions and methods for high efficiency in vivo genome editing
CN104651399B (zh) 2014-12-31 2018-11-16 广西大学 一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除的方法
US10619170B2 (en) 2015-01-06 2020-04-14 Dsm Ip Assets B.V. CRISPR-CAS system for a yeast host cell
CN104651392B (zh) 2015-01-06 2018-07-31 华南农业大学 一种利用CRISPR/Cas9系统定点突变P/TMS12-1获得温敏不育系的方法
DK3242950T3 (da) 2015-01-06 2021-12-20 Dsm Ip Assets Bv Crispr-cas-system til en trådformet svampeværtscelle
EP3242948B1 (en) 2015-01-06 2021-12-22 DSM IP Assets B.V. A crispr-cas system for a yarrowia host cell
EP3498843B1 (en) 2015-01-06 2021-06-23 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Endonuclease targeting blood coagulation factor viii gene and composition for treating hemophilia comprising same
WO2016112242A1 (en) 2015-01-08 2016-07-14 President And Fellows Of Harvard College Split cas9 proteins
CN104593422A (zh) 2015-01-08 2015-05-06 中国农业大学 一种抗蓝耳病克隆猪的制备方法
WO2016112351A1 (en) 2015-01-09 2016-07-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection of genome editing
WO2016115179A1 (en) 2015-01-12 2016-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Gene editing through microfluidic delivery
US11208638B2 (en) 2015-01-12 2021-12-28 The Regents Of The University Of California Heterodimeric Cas9 and methods of use thereof
WO2016112963A1 (en) 2015-01-13 2016-07-21 Riboxx Gmbh Delivery of biomolecules into cells
MA41349A (fr) 2015-01-14 2017-11-21 Univ Temple Éradication de l'herpès simplex de type i et d'autres virus de l'herpès associés guidée par arn
CN107429263A (zh) 2015-01-15 2017-12-01 斯坦福大学托管董事会 调控基因组编辑的方法
CN104611370A (zh) 2015-01-16 2015-05-13 深圳市科晖瑞生物医药有限公司 一种剔除β2-微球蛋白基因片段的方法
US20180073035A1 (en) 2015-01-19 2018-03-15 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences A method for precise modification of plant via transient gene expression
CN104725626B (zh) 2015-01-22 2016-06-29 漳州亚邦化学有限公司 一种适用于人造石英石的不饱和树脂的制备方法
CN105821072A (zh) 2015-01-23 2016-08-03 深圳华大基因研究院 用于DNA组装的CRISPR-Cas9系统及DNA组装方法
US20180023139A1 (en) 2015-01-26 2018-01-25 Cold Spring Harbor Laboratory Methods of identifying essential protein domains
US10059940B2 (en) 2015-01-27 2018-08-28 Minghong Zhong Chemically ligated RNAs for CRISPR/Cas9-lgRNA complexes as antiviral therapeutic agents
CN104561095B (zh) 2015-01-27 2017-08-22 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 一种能够生产人神经生长因子的转基因小鼠的制备方法
BR112017016080B1 (pt) 2015-01-28 2024-02-20 Caribou Biosciences, Inc Polinucleotídeo crispr da classe 2 único, sistema crispr da classe 2 e método in vitro de modificação de uma molécula de ácido nucleico alvo em um organismo não-humano, ou em uma célula
US11180792B2 (en) 2015-01-28 2021-11-23 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
WO2016120480A1 (fr) 2015-01-29 2016-08-04 Meiogenix Procede pour induire des recombinaisons meiotiques ciblees
JP6886404B2 (ja) 2015-01-30 2021-06-16 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアＴｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 初代造血細胞におけるタンパク質送達
PL3265563T3 (pl) 2015-02-02 2021-09-13 Meiragtx Uk Ii Limited Regulacja ekspresji genów poprzez modulację alternatywnego splicingu za pośrednictwem aptamerów
CN104593418A (zh) 2015-02-06 2015-05-06 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种人源化大鼠药物评价动物模型建立的方法
JP6929791B2 (ja) 2015-02-09 2021-09-01 デューク ユニバーシティ エピゲノム編集のための組成物および方法
KR101584933B1 (ko) 2015-02-10 2016-01-13 성균관대학교산학협력단 항생제 내성 억제용 재조합 벡터 및 이의 용도
WO2016130697A1 (en) 2015-02-11 2016-08-18 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods and kits for generating vectors that co-express multiple target molecules
CN104726494B (zh) 2015-02-12 2018-10-23 中国人民解放军第二军医大学 CRISPR-Cas9技术构建染色体易位干细胞及动物模型的方法
CN104928321B (zh) 2015-02-12 2018-06-01 中国科学院西北高原生物研究所 一种由Crispr/Cas9诱导的鳞片缺失斑马鱼模式及建立方法
EP3256170B1 (en) 2015-02-13 2020-09-23 University of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
US20160244784A1 (en) 2015-02-15 2016-08-25 Massachusetts Institute Of Technology Population-Hastened Assembly Genetic Engineering
WO2016132122A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 University Of Edinburgh Assay construct
CN107406846A (zh) 2015-02-19 2017-11-28 国立大学法人德岛大学 通过电穿孔将Cas9 mRNA导入到哺乳动物的受精卵的方法
WO2016135559A2 (en) 2015-02-23 2016-09-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
US20180245073A1 (en) 2015-02-23 2018-08-30 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
BR112017017812A2 (pt) 2015-02-23 2018-04-10 Crispr Therapeutics Ag materiais e métodos para tratamento de hemoglobinopatias
KR20160103953A (ko) 2015-02-25 2016-09-02 연세대학교 산학협력단 Crispr 시스템을 이용한 다중 위치 염기서열의 동시 포획 방법
BR112017018327A2 (pt) 2015-02-25 2018-04-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. método para a expressão regulada de um complexo, planta ou célula vegetal, semente, método para modificação de uma sequência, método para alteração da expressão de pelo menos um polinucleotídeo
WO2016135507A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 University Of Edinburgh Nucleic acid editing systems
CN104805099B (zh) 2015-03-02 2018-04-13 中国人民解放军第二军医大学 一种安全编码Cas9蛋白的核酸分子及其表达载体
EP3858990A1 (en) 2015-03-03 2021-08-04 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases with altered pam specificity
CN104673816A (zh) 2015-03-05 2015-06-03 广东医学院 一种pCr-NHEJ载体及其构建方法及其用于细菌基因定点敲除的应用
CN104651401B (zh) 2015-03-05 2019-03-08 东华大学 一种mir-505双等位基因敲除的方法
WO2016145150A2 (en) 2015-03-11 2016-09-15 The Broad Institute Inc. Selective treatment of prmt5 dependent cancer
GB201504223D0 (en) 2015-03-12 2015-04-29 Genome Res Ltd Biallelic genetic modification
EP3309255A4 (en) 2015-03-12 2018-08-01 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Method for increasing ability of plant to resist invading dna virus
SG11201707393SA (en) 2015-03-13 2017-10-30 Jackson Lab A three-component crispr/cas complex system and uses thereof
UA125246C2 (uk) 2015-03-16 2022-02-09 Інстітьют Оф Генетікс Енд Дівелопментл Байолоджі, Чайніз Екадемі Оф Сайнсис Спосіб здійснення сайт-спрямованої модифікації рослинних геномів із застосуванням неуспадковуваних матеріалів
CN106032540B (zh) 2015-03-16 2019-10-25 中国科学院上海生命科学研究院 CRISPR/Cas9核酸内切酶体系的腺相关病毒载体构建及其用途
WO2016149484A2 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Compositions and methods for specific reactivation of hiv latent reservoir
CN113846144B (zh) 2015-03-17 2023-09-26 生物辐射实验室股份有限公司 检测基因组编辑
MA41382A (fr) 2015-03-20 2017-11-28 Univ Temple Édition génique basée sur le système crispr/endonucléase à induction par tat
WO2016150855A1 (en) 2015-03-20 2016-09-29 Danmarks Tekniske Universitet Crispr/cas9 based engineering of actinomycetal genomes
CN104726449A (zh) 2015-03-23 2015-06-24 国家纳米科学中心 一种用于预防和/或治疗HIV的CRISPR-Cas9系统及其制备方法和用途
CN106148416B (zh) 2015-03-24 2019-12-17 华东师范大学 Cyp基因敲除大鼠的培育方法及其肝微粒体的制备方法
EP3274454B1 (en) 2015-03-25 2021-08-25 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods, compositions and components
WO2016154579A2 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-mediated gene conversion
CA2981509A1 (en) 2015-03-30 2016-10-06 The Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Educ. On Behalf Of The University Of Nevada, La Compositions comprising talens and methods of treating hiv
CN108124453B (zh) 2015-03-31 2022-04-05 爱克莱根科技公司 用于将DNA序列靶向并入细胞或生物体的基因组中的Cas9逆转录病毒整合酶和Cas9重组酶系统
WO2016161380A1 (en) 2015-04-01 2016-10-06 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating duchenne muscular dystrophy and becker muscular dystrophy
CA3000187A1 (en) 2015-04-02 2016-10-06 Agenovir Corporation Gene delivery methods and compositions
US20170166928A1 (en) 2015-04-03 2017-06-15 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions And Methods For Genetically Modifying Yeast
CN106167810A (zh) 2015-04-03 2016-11-30 内蒙古中科正标生物科技有限责任公司 基于CRISPR/Cas9技术的单子叶植物基因敲除载体及其应用
WO2016161446A1 (en) 2015-04-03 2016-10-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of b-cells
KR102648489B1 (ko) 2015-04-06 2024-03-15 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
WO2016164797A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Activatable crispr/cas9 for spatial and temporal control of genome editing
US11390860B2 (en) 2015-04-13 2022-07-19 The University Of Tokyo Set of polypeptides exhibiting nuclease activity or nickase activity with dependence on light or in presence of drug or suppressing or activating expression of target gene
US10155938B2 (en) 2015-04-14 2018-12-18 City Of Hope Coexpression of CAS9 and TREX2 for targeted mutagenesis
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
EP3286322A1 (en) 2015-04-21 2018-02-28 Novartis AG Rna-guided gene editing system and uses thereof
CN104762321A (zh) 2015-04-22 2015-07-08 东北林业大学 基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法及其crRNA原件
CN104805118A (zh) 2015-04-22 2015-07-29 扬州大学 一种苏禽黄鸡胚胎干细胞特定基因进行靶向敲除方法
WO2016172359A2 (en) 2015-04-24 2016-10-27 The Regents Of The University Of California Systems for detecting, monitoring or treating diseases or conditions using engineered cells and methods for making and using them
AU2016253150B2 (en) 2015-04-24 2022-04-21 Editas Medicine, Inc. Evaluation of Cas9 molecule/guide RNA molecule complexes
US11268158B2 (en) 2015-04-24 2022-03-08 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Assay for safety assessment of therapeutic genetic manipulations, gene therapy vectors and compounds
US11104897B2 (en) 2015-04-27 2021-08-31 Genethon Compositions and methods for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders
WO2016176191A1 (en) 2015-04-27 2016-11-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Dual aav vector system for crispr/cas9 mediated correction of human disease
EP3087974A1 (en) 2015-04-29 2016-11-02 Rodos BioTarget GmbH Targeted nanocarriers for targeted drug delivery of gene therapeutics
US20190002920A1 (en) 2015-04-30 2019-01-03 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and kits for cloning-free genome editing
US20190275168A1 (en) 2015-04-30 2019-09-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Gene therapy for autosomal dominant diseases
ES2905181T3 (es) 2015-05-01 2022-04-07 Prec Biosciences Inc Deleción precisa de secuencias cromosómicas in vivo
US20160346359A1 (en) 2015-05-01 2016-12-01 Spark Therapeutics, Inc. Adeno-associated Virus-Mediated CRISPR-Cas9 Treatment of Ocular Disease
CN104894068A (zh) 2015-05-04 2015-09-09 南京凯地生物科技有限公司 一种利用CRISPR/Cas9制备CAR-T细胞的方法
US11845928B2 (en) 2015-05-04 2023-12-19 Tsinghua University Methods and kits for fragmenting DNA
GB2531454A (en) 2016-01-10 2016-04-20 Snipr Technologies Ltd Recombinogenic nucleic acid strands in situ
EP3563684A1 (en) 2015-05-06 2019-11-06 Snipr Technologies Limited Altering microbial populations & modifying microbiota
ES2835861T3 (es) 2015-05-08 2021-06-23 Childrens Medical Ct Corp Direccionamiento de regiones funcionales del potenciador de BCL11A para la reinducción de hemoglobina fetal
WO2016182893A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Teh Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems for saturating mutagenesis of non-coding elements, compositions, methods, libraries and applications thereof
AU2016261358B2 (en) 2015-05-11 2021-09-16 Editas Medicine, Inc. Optimized CRISPR/Cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
AU2016262521A1 (en) 2015-05-11 2017-12-14 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating HIV infection and AIDS
KR101785847B1 (ko) 2015-05-12 2017-10-17 연세대학교 산학협력단 선형 이중가닥 ＤＮＡ를 활용한 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ 시스템을 이용한 표적 유전체 교정
US10808020B2 (en) 2015-05-12 2020-10-20 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
US10563226B2 (en) 2015-05-13 2020-02-18 Seattle Children's Hospital Enhancing endonuclease based gene editing in primary cells
CN105886498A (zh) 2015-05-13 2016-08-24 沈志荣 CRISPR-Cas9特异性敲除人PCSK9基因的方法以及用于特异性靶向PCSK9基因的sgRNA
WO2016181357A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 Zumutor Biologics, Inc. Afucosylated protein, cell expressing said protein and associated methods
US10920221B2 (en) 2015-05-13 2021-02-16 President And Fellows Of Harvard College Methods of making and using guide RNA for use with Cas9 systems
EP3294879A4 (en) 2015-05-14 2019-02-20 University of Southern California OPTIMIZED GENETIZATION WITH A RECOMBINANT ENDONUCLEASE SYSTEM
US20180291372A1 (en) 2015-05-14 2018-10-11 Massachusetts Institute Of Technology Self-targeting genome editing system
EP3294877A1 (en) 2015-05-15 2018-03-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Rapid characterization of cas endonuclease systems, pam sequences and guide rna elements
EP3294880A4 (en) 2015-05-15 2018-12-26 Dharmacon, Inc. Synthetic single guide rna for cas9-mediated gene editing
PT3298134T (pt) 2015-05-16 2023-08-18 Genzyme Corp Edição génica de mutações intrónicas profundas
CN104846010B (zh) 2015-05-18 2018-07-06 安徽省农业科学院水稻研究所 一种删除转基因水稻筛选标记基因的方法
EP3298149A1 (en) 2015-05-18 2018-03-28 King Abdullah University Of Science And Technology Method of inhibiting plant virus pathogen infections by crispr/cas9-mediated interference
EP3095870A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Kws Saat Se Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom
CN106011104B (zh) 2015-05-21 2019-09-27 清华大学 利用拆分Cas系统进行基因编辑和表达调控方法
WO2016187904A1 (zh) 2015-05-22 2016-12-01 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA
CN105518135B (zh) 2015-05-22 2020-11-24 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪CMAH基因的方法及用于特异性靶向CMAH基因的sgRNA
WO2016187717A1 (en) 2015-05-26 2016-12-01 Exerkine Corporation Exosomes useful for genome editing
US20180148711A1 (en) 2015-05-28 2018-05-31 Coda Biotherapeutics, Inc. Genome editing vectors
CN104894075B (zh) 2015-05-28 2019-08-06 华中农业大学 CRISPR/Cas9和Cre/lox系统编辑伪狂犬病毒基因组制备疫苗方法和应用
CN105624146B (zh) 2015-05-28 2019-02-15 中国科学院微生物研究所 基于CRISPR/Cas9和酿酒酵母细胞内源的同源重组的分子克隆方法
KR102451796B1 (ko) 2015-05-29 2022-10-06 노쓰 캐롤라이나 스테이트 유니버시티 크리스퍼 핵산을 사용하여 박테리아, 고세균, 조류 및 효모를 스크리닝하는 방법
EP3302556A4 (en) 2015-05-29 2018-12-05 Clark Atlanta University Human cell lines mutant for zic2
US20160346362A1 (en) 2015-05-29 2016-12-01 Agenovir Corporation Methods and compositions for treating cytomegalovirus infections
US20160348074A1 (en) 2015-05-29 2016-12-01 Agenovir Corporation Methods and compositions for treating cells for transplant
EP3324999A1 (en) 2015-05-29 2018-05-30 Agenovir Corporation Compositions and methods for cell targeted hpv treatment
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
JP2018516983A (ja) 2015-05-29 2018-06-28 アジェノビア コーポレーション ウイルス感染を処置するための組成物および方法
EP3325620A4 (en) 2015-05-29 2019-06-26 Agenovir Corporation ANTIVIRAL PROCEDURES AND COMPOSITIONS
DK3302709T3 (da) 2015-06-01 2021-08-23 Univ Temple Fremgangsmåder og sammensætninger til rna-guidet behandling af hiv-infektion
WO2016191869A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 The Hospital For Sick Children Delivery of structurally diverse polypeptide cargo into mammalian cells by a bacterial toxin
CN105112445B (zh) 2015-06-02 2018-08-10 广州辉园苑医药科技有限公司 一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒
CN108368502B (zh) 2015-06-03 2022-03-18 内布拉斯加大学董事委员会 使用单链dna的dna编辑
US10392607B2 (en) 2015-06-03 2019-08-27 The Regents Of The University Of California Cas9 variants and methods of use thereof
US10626393B2 (en) 2015-06-04 2020-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Delivering CRISPR therapeutics with lipid nanoparticles
US20180245074A1 (en) 2015-06-04 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
CA3001683A1 (en) 2015-06-05 2016-12-08 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for generating crispr/cas guide rnas
CN105039339B (zh) 2015-06-05 2017-12-19 新疆畜牧科学院生物技术研究所 一种以RNA介导的特异性敲除绵羊FecB基因的方法及其专用sgRNA
AU2016276702B2 (en) 2015-06-09 2022-07-28 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for improving transplantation
EP3726218B1 (en) 2015-06-10 2023-08-09 Firmenich Sa Cell lines for screening odorant and aroma receptors
JP7085841B2 (ja) 2015-06-10 2022-06-17 フイルメニツヒ ソシエテ アノニム ムスク化合物の同定方法
US20160362667A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Caribou Biosciences, Inc. CRISPR-Cas Compositions and Methods
WO2016198500A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for rna-guided treatment of human cytomegalovirus (hcmv) infection
WO2016197354A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪PDX1基因的方法及用于特异性靶向PDX1基因的sgRNA
CN105593367A (zh) 2015-06-11 2016-05-18 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-1基因的方法及用于特异性靶向SLA-1基因的sgRNA
CN106414740A (zh) 2015-06-11 2017-02-15 深圳市第二人民医院 CRISPR‑Cas9特异性敲除猪SLA‑3基因的方法及用于特异性靶向SLA‑3基因的sgRNA
CN105492609A (zh) 2015-06-11 2016-04-13 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪GGTA1基因的方法及用于特异性靶向GGTA1基因的sgRNA
WO2016197358A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪FGL2基因的方法及用于特异性靶向FGL2基因的sgRNA
WO2016197360A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪GFRA1基因的方法及用于特异性靶向GFRA1基因的sgRNA
WO2016197356A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-2基因的方法及用于特异性靶向SLA-2基因的sgRNA
CN105518137B (zh) 2015-06-11 2021-04-30 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪SALL1基因的方法及用于特异性靶向SALL1基因的sgRNA
WO2016197362A1 (zh) 2015-06-11 2016-12-15 深圳市第二人民医院 CRISPR-Cas9特异性敲除猪vWF基因的方法及用于特异性靶向vWF基因的sgRNA
WO2016200263A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Erasmus University Medical Center Rotterdam New crispr assays
EP3307762B1 (en) 2015-06-12 2021-12-15 The Regents of The University of California Reporter cas9 variants and methods of use thereof
GB201510296D0 (en) 2015-06-12 2015-07-29 Univ Wageningen Thermostable CAS9 nucleases
EP3307872B1 (en) 2015-06-15 2023-09-27 North Carolina State University Methods and compositions for efficient delivery of nucleic acids and rna-based antimicrobials
JP2018518181A (ja) 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション 血液細胞系列の細胞に機能的ポリペプチドを導入するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体
WO2016205703A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 The Uab Research Foundation Crispr/cas9 complex for genomic editing
WO2016205623A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 North Carolina State University Methods and compositions for genome editing in bacteria using crispr-cas9 systems
WO2016205728A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Crispr mediated recording of cellular events
FI3430134T3 (fi) 2015-06-18 2023-01-13 Uusia CRISPR-entsyymejä ja järjestelmiä
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
WO2016205688A2 (en) 2015-06-18 2016-12-22 Bowles Robert D Rna-guided transcriptional regulation and methods of using the same for the treatment of back pain
CN108290933A (zh) 2015-06-18 2018-07-17 布罗德研究所有限公司 降低脱靶效应的crispr酶突变
WO2016205745A2 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Cell sorting
WO2016205749A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
US11279928B2 (en) 2015-06-29 2022-03-22 Massachusetts Institute Of Technology Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same
GB201511376D0 (en) 2015-06-29 2015-08-12 Ecolab Usa Inc Process for the treatment of produced water from chemical enhanced oil recovery
JP2018519811A (ja) 2015-06-29 2018-07-26 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 修飾ｃｒｉｓｐｒ ｒｎａ及び修飾単一ｃｒｉｓｐｒ ｒｎａならびにその使用
EP4043556B1 (en) 2015-06-30 2024-02-07 Cellectis Methods for improving functionality in nk cell by gene inactivation using specific endonuclease
MX2017016921A (es) 2015-07-02 2018-04-10 Univ Johns Hopkins Tratamientos basados en crispr / cas9.
US20170009242A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Whitehead Institute For Biomedical Research CRISPR-Mediated Genome Engineering for Protein Depletion
CN108026523B (zh) 2015-07-06 2021-11-30 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 向导rna组装载体
CN105132451B (zh) 2015-07-08 2019-07-23 电子科技大学 一种CRISPR/Cas9单一转录单元定向修饰骨架载体及其应用
CN108024544B (zh) 2015-07-13 2022-04-29 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于核酸酶介导的基因组工程化的递送方法及组合物
US20170014449A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Elwha LLC, a limited liability company of the State of Delaware Site-specific epigenetic editing
WO2017009399A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Institut Pasteur Improving sequence-specific antimicrobials by blocking dna repair
EP3323890A4 (en) 2015-07-14 2019-01-30 Fukuoka University METHOD FOR INDUCING SITE SPECIFIC RNA MUTATIONS, TARGET EDITION GUIDING RNA-GUIDE USED IN THE METHOD, AND TARGET EDITING GUID-RNA TARGET RNA COMPLEX
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
WO2017011721A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Rutgers, The State University Of New Jersey Nuclease-independent targeted gene editing platform and uses thereof
US20170020922A1 (en) 2015-07-16 2017-01-26 Batu Biologics Inc. Gene editing for immunological destruction of neoplasia
WO2017015101A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 University Of Washington Methods for maximizing the efficiency of targeted gene correction
WO2017015015A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 Emory University Crispr-associated protein from francisella and uses related thereto
EP3325018A4 (en) 2015-07-22 2019-04-24 Duke University HIGH EFFICIENCY SCREENING OF REGULATORY ELEMENT FUNCTION USING EPIGENOUS EDITING TECHNOLOGIES
WO2017015545A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 President And Fellows Of Harvard College Evolution of site-specific recombinases
CA2997535A1 (en) 2015-07-23 2017-01-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research Editing mitochondrial dna
EP3325622B1 (en) 2015-07-25 2023-06-07 Frost, Habib A system, device and a method for providing a therapy or a cure for cancer and other pathological states
CN106399360A (zh) 2015-07-27 2017-02-15 上海药明生物技术有限公司 基于crispr技术敲除fut8基因的方法
EP3329001B1 (en) 2015-07-28 2021-09-22 Danisco US Inc. Genome editing systems and methods of use
CN105063061B (zh) 2015-07-28 2018-10-30 华南农业大学 一种水稻千粒重基因tgw6突变体及其制备方法与应用
CN106701808A (zh) 2015-07-29 2017-05-24 深圳华大基因研究院 Dna聚合酶i缺陷型菌株及其构建方法
WO2017019895A1 (en) 2015-07-30 2017-02-02 President And Fellows Of Harvard College Evolution of talens
WO2017023803A1 (en) 2015-07-31 2017-02-09 Regents Of The University Of Minnesota Modified cells and methods of therapy
US20200123533A1 (en) 2015-07-31 2020-04-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York High-throughput strategy for dissecting mammalian genetic interactions
WO2017024047A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Emendobio Inc. Compositions and methods for increasing nuclease induced recombination rate in cells
US20180230450A1 (en) 2015-08-03 2018-08-16 President And Fellows Of Harvard College Cas9 Genome Editing and Transcriptional Regulation
EP3331906A1 (en) 2015-08-06 2018-06-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tunable endogenous protein degradation
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
CN104962523B (zh) 2015-08-07 2018-05-25 苏州大学 一种测定非同源末端连接修复活性的方法
US11606940B2 (en) 2015-08-07 2023-03-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method for producing an animal comprising a germline genetic modification
AU2016307050A1 (en) 2015-08-11 2018-02-15 Cellectis Cells for immunotherapy engineered for targeting CD38 antigen and for CD38 gene inactivation
KR102127418B1 (ko) 2015-08-14 2020-06-26 인스티튜트 오브 제네틱스 앤드 디벨롭멘털 바이오롤지, 차이니즈 아카데미 오브 사이언시스 부위-특이적인 뉴클레오티드 치환을 통해 글리포세이트-내성 벼를 수득하는 방법
CN105255937A (zh) 2015-08-14 2016-01-20 西北农林科技大学 一种真核细胞III型启动子表达CRISPR sgRNA的方法及其应用
EP3985111A1 (en) 2015-08-19 2022-04-20 Arc Bio, LLC Capture of nucleic acids using a nucleic acid-guided nuclease-based system
WO2017031483A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 Applied Stemcell, Inc. Nuclease with enhanced efficiency of genome editing
CN105112519A (zh) 2015-08-20 2015-12-02 郑州大学 一种基于crispr的大肠杆菌o157:h7菌株检测试剂盒及检测方法
CN105177126B (zh) 2015-08-21 2018-12-04 东华大学 一种利用荧光pcr技术对小鼠的分型鉴定方法
CA2996001A1 (en) 2015-08-25 2017-03-02 Duke University Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases
CN106480083B (zh) 2015-08-26 2021-12-14 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 CRISPR/Cas9介导的大片段DNA拼接方法
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
CA2996888A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
WO2017040709A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Caribou Biosciences, Inc. Directed nucleic acid repair
WO2017040511A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Agilent Technologies, Inc. Compounds and methods for crispr/cas-based genome editing by homologous recombination
CN105087620B (zh) 2015-08-31 2017-12-29 中国农业大学 一种过表达猪共刺激受体4‑1bb载体及其应用
EP3344766B8 (en) 2015-09-01 2021-03-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Systems and methods for selection of grna targeting strands for cas9 localization
CA3035810A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 University Of Massachusetts Detection of gene loci with crispr arrayed repeats and/or polychromatic single guide ribonucleic acids
WO2017040786A1 (en) 2015-09-04 2017-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Multilayer genetic safety kill circuits based on single cas9 protein and multiple engineered grna in mammalian cells
CN105400810B (zh) 2015-09-06 2019-05-07 吉林大学 采用敲除技术建立低磷性佝偻病模型的方法
CA3036409C (en) 2015-09-08 2023-07-11 Erik J. Sontheimer Dnase h activity of neisseria meningitidis cas9
DK3348638T3 (da) 2015-09-09 2023-02-13 Univ Kobe Nat Univ Corp Fremgangsmåde til at konvertere genomsekvens fra gram-positiv bakterie ved specifikt at konvertere nukleinsyrebase i tilsigtet dna-sekvens, og molekylkompleks anvendt dertil
CA2998087A1 (en) 2015-09-09 2017-03-16 National University Corporation Kobe University Method for modifying genome sequence that specifically converts nucleobase of targeted dna sequence, and molecular complex used in said method
EP3347469A4 (en) 2015-09-10 2019-02-27 Youhealth Biotech, Limited METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING GLAUCOMA
WO2017044776A1 (en) 2015-09-10 2017-03-16 Texas Tech University System Single-guide rna (sgrna) with improved knockout efficiency
CN105274144A (zh) 2015-09-14 2016-01-27 徐又佳 通过CRISPR/Cas9技术得到敲除铁调素基因斑马鱼的制备方法
CN105210981B (zh) 2015-09-15 2018-09-28 中国科学院生物物理研究所 建立可应用于人类疾病研究的雪貂模型的方法及其应用
US10301613B2 (en) 2015-09-15 2019-05-28 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Targeted remodeling of prokaryotic genomes using CRISPR-nickases
CN105112422B (zh) 2015-09-16 2019-11-08 中山大学 基因miR408和UCL在培育高产水稻中的应用
WO2017049129A2 (en) 2015-09-18 2017-03-23 President And Fellows Of Harvard College Methods of making guide rna
WO2017053312A1 (en) 2015-09-21 2017-03-30 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for target nucleic acid modification
EP3353298B1 (en) 2015-09-21 2023-09-13 Arcturus Therapeutics, Inc. Allele selective gene editing and uses thereof
CN105132427B (zh) 2015-09-21 2019-01-08 新疆畜牧科学院生物技术研究所 一种以RNA介导的特异性敲除双基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA
AU2016325613B2 (en) 2015-09-23 2020-06-25 Sangamo Therapeutics, Inc. Htt repressors and uses thereof
EP3786294A1 (en) 2015-09-24 2021-03-03 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
CA2998287A1 (en) 2015-09-24 2017-04-20 Crispr Therapeutics Ag Novel family of rna-programmable endonucleases and their uses in genome editing and other applications
WO2017053762A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Sigma-Aldrich Co. Llc Methods and reagents for molecular proximity detection using rna-guided nucleic acid binding proteins
KR101795999B1 (ko) 2015-09-25 2017-11-09 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체
KR101745863B1 (ko) 2015-09-25 2017-06-12 전남대학교산학협력단 Crispr/cas9 시스템을 이용한 프로히비틴2 유전자 제거용 시발체
WO2017053729A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
WO2017053713A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Tarveda Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genome editing
EP3147363B1 (en) 2015-09-26 2019-10-16 B.R.A.I.N. Ag Activation of taste receptor genes in mammalian cells using crispr-cas-9
EP3356521A4 (en) 2015-09-28 2019-03-13 Temple University - Of The Commonwealth System of Higher Education METHOD AND COMPOSITIONS FOR RNA-TREATED TREATMENT OF HIV INFECTIONS
US20170088587A1 (en) 2015-09-29 2017-03-30 Agenovir Corporation Antiviral fusion proteins and genes
AU2016332704A1 (en) 2015-09-29 2018-04-19 Agenovir Corporation Delivery methods and compositions
WO2017058791A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 Agenovir Corporation Compositions and methods for treatment of latent viral infections
EP3356528A4 (en) 2015-09-29 2019-08-28 Agenovir Corporation COMPOSITIONS AND METHODS FOR REGULATING LATENT VIRAL TRANSCRIPTION
CN105177038B (zh) 2015-09-29 2018-08-24 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种高效定点编辑植物基因组的CRISPR/Cas9系统
CN105331627B (zh) 2015-09-30 2019-04-02 华中农业大学 一种利用内源CRISPR-Cas系统进行原核生物基因组编辑的方法
EP3356520B1 (en) 2015-10-02 2022-03-23 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Lentiviral protein delivery system for rna-guided genome editing
WO2017062605A1 (en) 2015-10-06 2017-04-13 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating fragile x syndrome and related syndromes
US10760081B2 (en) 2015-10-07 2020-09-01 New York University Compositions and methods for enhancing CRISPR activity by POLQ inhibition
WO2017062886A1 (en) 2015-10-08 2017-04-13 Cellink Corporation Battery interconnects
MX2018004263A (es) 2015-10-08 2019-08-16 Harvard College Edición genómica multiplexada.
WO2017062983A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating huntington's disease and related disorders
US11692182B2 (en) 2015-10-09 2023-07-04 Monsanto Technology Llc RNA-guided DNA nucleases and uses thereof
JP7011590B2 (ja) 2015-10-12 2022-02-10 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 細胞内での遺伝子組換えおよび相同組換えの増加のための保護ｄｎａ鋳型および使用方法
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
EP3362102A1 (en) 2015-10-14 2018-08-22 Life Technologies Corporation Ribonucleoprotein transfection agents
CN105400779A (zh) 2015-10-15 2016-03-16 芜湖医诺生物技术有限公司 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用
FR3042506B1 (fr) 2015-10-16 2018-11-30 IFP Energies Nouvelles Outil genetique de transformation de bacteries clostridium
CA3001130A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods and compositions utilizing cpf1 for rna-guided gene editing
WO2017064566A2 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Astrazeneca Ab Inducible modification of a cell genome
CN105331607A (zh) 2015-10-19 2016-02-17 芜湖医诺生物技术有限公司 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用
EP3365269A4 (en) 2015-10-19 2019-06-19 The Methodist Hospital DISTRIBUTION, BY MEMBRANE DEFORMATION, FROM CRISPR-CAS9 TO DIFFICULT CELLS TO BE TRANSFERRED
CN105331609A (zh) 2015-10-20 2016-02-17 芜湖医诺生物技术有限公司 脑膜炎双球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用
CN105316337A (zh) 2015-10-20 2016-02-10 芜湖医诺生物技术有限公司 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用
WO2017068077A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and products for genetic engineering
US20180273960A1 (en) 2015-10-20 2018-09-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for marker-free genome modification
CN105316324A (zh) 2015-10-20 2016-02-10 芜湖医诺生物技术有限公司 嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用
CN105331608A (zh) 2015-10-20 2016-02-17 芜湖医诺生物技术有限公司 脑膜炎双球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CXCR4基因的靶序列和sgRNA及其应用
AU2016341919A1 (en) 2015-10-21 2018-04-19 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating hepatitis b virus
CA3024543A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 The Broad Institute, Inc. Type vi-b crispr enzymes and systems
CN105219799A (zh) 2015-10-22 2016-01-06 天津吉诺沃生物科技有限公司 一种基于CRISPR/Cas系统的多年生黑麦草的育种方法
DK3350327T3 (en) 2015-10-23 2019-01-21 Caribou Biosciences Inc CONSTRUCTED CRISPR CLASS-2-NUCLEIC ACID TARGETING-NUCLEIC ACID
JP7109784B2 (ja) 2015-10-23 2022-08-01 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 遺伝子編集のための進化したＣａｓ９蛋白質
EP3159407A1 (en) 2015-10-23 2017-04-26 Silence Therapeutics (London) Ltd Guide rnas, methods and uses
TW201715041A (zh) 2015-10-26 2017-05-01 國立清華大學 細菌基因編輯方法
US9988637B2 (en) 2015-10-26 2018-06-05 National Tsing Hua Univeristy Cas9 plasmid, genome editing system and method of Escherichia coli
CA3006465A1 (en) 2015-10-27 2017-05-04 Recombinetics, Inc. Engineering of humanized car t-cells and platelets by genetic complementation
US10280411B2 (en) 2015-10-27 2019-05-07 Pacific Biosciences of California, In.c Methods, systems, and reagents for direct RNA sequencing
US20180230489A1 (en) 2015-10-28 2018-08-16 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
CN108473976B (zh) 2015-10-28 2022-07-19 桑格摩生物治疗股份有限公司 肝特异性构建体、因子viii表达盒及其使用方法
JP2019507579A (ja) 2015-10-28 2019-03-22 クリスパー セラピューティクス アーゲー デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のための材料および方法
CN109312338B (zh) 2015-10-30 2022-09-27 爱迪塔斯医药公司 治疗单纯疱疹病毒的crispr/cas相关方法及组合物
WO2017074962A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Brandeis University Modified cas9 compositions and methods of use
CN105238806B (zh) 2015-11-02 2018-11-27 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用
CN105316327B (zh) 2015-11-03 2019-01-29 中国农业科学院作物科学研究所 小麦TaAGO4a基因CRISPR/Cas9载体及其应用
WO2017079428A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 President And Fellows Of Harvard College Site specific germline modification
SG10202107602XA (en) 2015-11-04 2021-08-30 Univ Pennsylvania Methods and compositions for gene editing in hematopoietic stem cells
AU2016349504B2 (en) 2015-11-04 2023-02-09 Fate Therapeutics, Inc. Genomic engineering of pluripotent cells
GB2544270A (en) 2015-11-05 2017-05-17 Fundació Centre De Regulació Genòmica Nucleic acids, peptides and methods
JP2018533376A (ja) 2015-11-05 2018-11-15 セントロ デ インベスティガシオン ビオメディカ エン レッド 赤血球系譜を冒す代謝疾患に罹患している被験体から単離された細胞の遺伝子編集の方法、上記方法により得られた細胞、及びそれらの使用
WO2017079724A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 The Jackson Laboratory Large genomic dna knock-in and uses thereof
WO2017078751A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 The Methodist Hospital Micoluidic cell deomailiy assay for enabling rapid and efficient kinase screening via the crispr-cas9 system
EP3165314A1 (de) 2015-11-06 2017-05-10 Siegfried Plasch Auftragsschweissverfahren
US20180340176A1 (en) 2015-11-09 2018-11-29 Ifom Fondazione Istituto Firc Di Oncologia Molecolare Crispr-cas sgrna library
EP3374494A4 (en) 2015-11-11 2019-05-01 Coda Biotherapeutics, Inc. CRISPR COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR GENE THERAPY
WO2017081288A1 (en) 2015-11-11 2017-05-18 Lonza Ltd Crispr-associated (cas) proteins with reduced immunogenicity
WO2017083368A1 (en) 2015-11-12 2017-05-18 Pfizer Inc. Tissue-specific genome engineering using crispr-cas9
US11306308B2 (en) 2015-11-13 2022-04-19 Massachusetts Institute Of Technology High-throughput CRISPR-based library screening
KR101885901B1 (ko) 2015-11-13 2018-08-07 기초과학연구원 5' 말단의 인산기가 제거된 rna를 포함하는 리보핵산단백질 전달용 조성물
US20170191047A1 (en) 2015-11-13 2017-07-06 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Adenosine-specific rnase and methods of use
BR112018009954A2 (pt) 2015-11-16 2018-11-13 Res Inst Nationwide Childrens Hospital materiais e métodos para o tratamento de miopatias baseadas em titinas e outras titinopatias
CN106893739A (zh) 2015-11-17 2017-06-27 香港中文大学 用于靶向基因操作的新方法和系统
CA3005968A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 The Regents Of The University Of California Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9
CN105602987A (zh) 2015-11-23 2016-05-25 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 一种高效的dc细胞xbp1基因敲除方法
US20170145438A1 (en) 2015-11-24 2017-05-25 University Of South Carolina Viral Vectors for Gene Editing
EP3382018B1 (en) 2015-11-25 2022-03-30 National University Corporation Gunma University Dna methylation editing kit and dna methylation editing method
US10240145B2 (en) 2015-11-25 2019-03-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University CRISPR/Cas-mediated genome editing to treat EGFR-mutant lung cancer
WO2017091510A1 (en) 2015-11-27 2017-06-01 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for the production of hydrocarbons, hydrogen and carbon monoxide using engineered azotobacter strains
CN105505979A (zh) 2015-11-28 2016-04-20 湖北大学 一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术打靶Badh2基因获得香稻品系的方法
CN106811479B (zh) 2015-11-30 2019-10-25 中国农业科学院作物科学研究所 利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用
KR101906491B1 (ko) 2015-11-30 2018-12-05 기초과학연구원 F. novicida 유래 Cas9을 포함하는 유전체 교정용 조성물
CN105296518A (zh) 2015-12-01 2016-02-03 中国农业大学 一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法
RU2634395C1 (ru) 2015-12-01 2017-10-26 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский Федеральный Университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома crispr/cas9, кодирующая нуклеазу cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека
EP3383409A4 (en) 2015-12-02 2019-10-02 The Regents of The University of California COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING TARGET NUCLEIC ACID
MX2018006814A (es) 2015-12-02 2019-08-05 Ceres Inc Metodos para la modificacion genetica de plantas.
WO2017093370A1 (en) 2015-12-03 2017-06-08 Technische Universität München T-cell specific genome editing
CN105779448B (zh) 2015-12-04 2018-11-27 新疆农业大学 一种棉花启动子GbU6-7PS及应用
CN105779449B (zh) 2015-12-04 2018-11-27 新疆农业大学 一种棉花启动子GbU6-5PS及应用
CN106845151B (zh) 2015-12-07 2019-03-26 中国农业大学 CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法及装置
CN105462968B (zh) 2015-12-07 2018-10-16 北京信生元生物医学科技有限公司 一种靶向apoCⅢ的CRISPR-Cas9系统及其应用
CN108473527A (zh) 2015-12-09 2018-08-31 切除生物治疗公司 用于消除免疫抑制疗法期间jc病毒激活和pml(进行性多灶性白质脑病)风险的基因编辑方法和组合物
EP3387134B1 (en) 2015-12-11 2020-10-14 Danisco US Inc. Methods and compositions for enhanced nuclease-mediated genome modification and reduced off-target site effects
CN105463003A (zh) 2015-12-11 2016-04-06 扬州大学 一种消除卡那霉素耐药基因活性的重组载体及其构建方法
CN105296537A (zh) 2015-12-12 2016-02-03 西南大学 一种基于睾丸内注射的基因定点编辑技术
WO2017105350A1 (en) 2015-12-14 2017-06-22 Cellresearch Corporation Pte Ltd A method of generating a mammalian stem cell carrying a transgene, a mammalian stem cell generated by the method and pharmaceuticals uses of the mammalian stem cell
CN105400773B (zh) 2015-12-14 2018-06-26 同济大学 应用于大规模筛选癌症基因的CRISPR/Cas9富集测序方法
NO343153B1 (en) 2015-12-17 2018-11-19 Hydra Systems As A method of assessing the integrity status of a barrier plug
CN105463027A (zh) 2015-12-17 2016-04-06 中国农业大学 一种高肌肉量及肥厚型心肌病模型克隆猪的制备方法
WO2017106616A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Varicella zoster virus encoding regulatable cas9 nuclease
JP7128741B2 (ja) 2015-12-18 2022-08-31 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｔ細胞受容体の標的化破壊
CN108699132B (zh) 2015-12-18 2023-08-11 桑格摩生物治疗股份有限公司 Mhc细胞受体的靶向破坏
EP3708665A1 (en) 2015-12-18 2020-09-16 Danisco US Inc. Methods and compositions for t-rna based guide rna expression
WO2017106569A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Regents Of The University Of California Modified site-directed modifying polypeptides and methods of use thereof
US20190233814A1 (en) 2015-12-18 2019-08-01 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
MX2018007290A (es) 2015-12-18 2019-01-10 Danisco Us Inc Metodos y composiciones para expresion de acido ribonucleico (arn) guia basada en polimerasa ii (pol-ii).
US11761007B2 (en) 2015-12-18 2023-09-19 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a CRISPR/Cas9 system
JP6700306B2 (ja) 2015-12-18 2020-05-27 国立研究開発法人科学技術振興機構 受精前の卵細胞、受精卵、及び標的遺伝子の改変方法
WO2017112620A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of crispr based antimicrobials
EP3701963A1 (en) 2015-12-22 2020-09-02 CureVac AG Method for producing rna molecule compositions
CA3009308A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Chad Albert COWAN Materials and methods for treatment of amyotrophic lateral sclerosis and/or frontal temporal lobular degeneration
CN105543270A (zh) 2015-12-24 2016-05-04 中国农业科学院作物科学研究所 双抗性CRISPR/Cas9载体及应用
CN105505976A (zh) 2015-12-25 2016-04-20 安徽大学 一种维吉尼亚链霉菌ibl14产青霉素重组菌株的构建方法
CN105543266A (zh) 2015-12-25 2016-05-04 安徽大学 一种维吉尼亚链霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系统及应用其进行基因编辑的方法
CA3009727A1 (en) 2015-12-28 2017-07-06 Novartis Ag Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
AU2016380351B2 (en) 2015-12-29 2023-04-06 Monsanto Technology Llc Novel CRISPR-associated transposases and uses thereof
CN105441451B (zh) 2015-12-31 2019-03-22 暨南大学 一种特异靶向人ABCB1基因的sgRNA导向序列及应用
CN105567735A (zh) 2016-01-05 2016-05-11 华东师范大学 一种凝血因子基因突变的定点修复载体系统及方法
WO2017118720A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Novozymes A/S Genome editing in bacillus host cells
CN105647922A (zh) 2016-01-11 2016-06-08 中国人民解放军疾病预防控制所 基于一种新gRNA序列的CRISPR-Cas9系统在制备乙肝治疗药物中的应用
US11441146B2 (en) 2016-01-11 2022-09-13 Christiana Care Health Services, Inc. Compositions and methods for improving homogeneity of DNA generated using a CRISPR/Cas9 cleavage system
WO2017123609A1 (en) 2016-01-12 2017-07-20 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for enhanced genome editing
KR20180134847A (ko) 2016-01-14 2018-12-19 멤피스 미츠 인코포레이티드 생체외 배양 과정 동안 체세포의 복제 능력을 증가시키는 방법
CA3011458A1 (en) 2016-01-14 2017-07-20 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Genome editing for treating glioblastoma
JP2019501659A (ja) 2016-01-15 2019-01-24 ザ ジャクソン ラボラトリー Ｃａｓ９タンパク質のマルチサイクルエレクトロポレーションによる遺伝子修飾非ヒト哺乳動物
WO2017126987A1 (ru) 2016-01-18 2017-07-27 Анатолий Викторович ЗАЗУЛЯ Эритроциты для направленного транспорта лекарственного средства
CN105567734A (zh) 2016-01-18 2016-05-11 丹弥优生物技术（湖北）有限公司 一种基因组dna序列精准编辑方法
CN105567738A (zh) 2016-01-18 2016-05-11 南开大学 使用基因组编辑技术CRISPR-Cas9诱导CCR5Δ32缺失的方法
WO2017127807A1 (en) 2016-01-22 2017-07-27 The Broad Institute Inc. Crystal structure of crispr cpf1
CN105543228A (zh) 2016-01-25 2016-05-04 宁夏农林科学院 一种快速将水稻转化为香稻的方法
CN105567689B (zh) 2016-01-25 2019-04-09 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司 CRISPR/Cas9靶向敲除人TCAB1基因及其特异性gRNA
RU2018130641A (ru) 2016-01-25 2020-02-26 Эксижн Биотерапьютикс Направляемое рнк, удаление вируса jc человека и других полиомавирусов
CA3011874A1 (en) 2016-01-25 2017-08-03 Excision Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for rna-guided treatment of hiv infection
EP3199632A1 (en) 2016-01-26 2017-08-02 ACIB GmbH Temperature-inducible crispr/cas system
CN105567688A (zh) 2016-01-27 2016-05-11 武汉大学 一种可用于艾滋病基因治疗的CRISPR/SaCas9系统
US11142550B2 (en) 2016-01-29 2021-10-12 The Trustees Of Princeton University Split inteins with exceptional splicing activity
JP6800171B2 (ja) 2016-01-30 2020-12-16 株式会社ボナック 人工単一ガイドｒｎａ及びその用途
CN105647968B (zh) 2016-02-02 2019-07-23 浙江大学 一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用
CN107022562B (zh) 2016-02-02 2020-07-17 中国种子集团有限公司 利用CRISPR/Cas9系统对玉米基因定点突变的方法
US11845933B2 (en) 2016-02-03 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide RNA and its applications
CN105671083B (zh) 2016-02-03 2017-09-29 安徽柯顿生物科技有限公司 PD‑1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti‑PD‑1‑Puro及包装与应用
US11208652B2 (en) 2016-02-04 2021-12-28 President And Fellows Of Harvard College Mitochondrial genome editing and regulation
US20190038780A1 (en) 2016-02-05 2019-02-07 Regents Of The University Of Minnesota Vectors and system for modulating gene expression
WO2017139264A1 (en) 2016-02-09 2017-08-17 President And Fellows Of Harvard College Dna-guided gene editing and regulation
RU2016104674A (ru) 2016-02-11 2017-08-16 Анатолий Викторович Зазуля Устройство модификации эритроцита с механизмом направленного транспорта лекарственного средства для функций генной терапии crispr/cas9
EP3413908A4 (en) 2016-02-11 2019-09-25 The Regents of The University of California METHOD AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING A MUTANT DYSTROPHINE IN A CELL GENOM
CN109415728A (zh) 2016-02-15 2019-03-01 天普大学-联邦高等教育系统 逆转录病毒核酸序列的切除
US9896696B2 (en) 2016-02-15 2018-02-20 Benson Hill Biosystems, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
CN105647962A (zh) 2016-02-15 2016-06-08 浙江大学 运用CRISPR-Cas9系统敲除水稻MIRNA393b茎环序列的基因编辑方法
CN105647969B (zh) 2016-02-16 2020-12-15 湖南师范大学 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法
CN105594664B (zh) 2016-02-16 2018-10-02 湖南师范大学 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法
US11136597B2 (en) 2016-02-16 2021-10-05 Yale University Compositions for enhancing targeted gene editing and methods of use thereof
CN105624187A (zh) 2016-02-17 2016-06-01 天津大学 酿酒酵母基因组定点突变的方法
EP3417065A4 (en) 2016-02-18 2019-07-17 President and Fellows of Harvard College METHOD AND SYSTEMS FOR MOLECULAR RECORDING BY CRISPR-CAS SYSTEM
CN105646719B (zh) 2016-02-24 2019-12-20 无锡市妇幼保健院 一种高效定点转基因的工具及其应用
US20170247703A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Agenovir Corporation Antiviral nuclease methods
AU2017223964A1 (en) 2016-02-25 2018-09-06 Agenovir Corporation Viral and oncoviral nuclease treatment
US20170246260A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Agenovir Corporation Modified antiviral nuclease
US11530253B2 (en) 2016-02-25 2022-12-20 The Children's Medical Center Corporation Customized class switch of immunoglobulin genes in lymphoma and hybridoma by CRISPR/CAS9 technology
SG11201807025SA (en) 2016-02-26 2018-09-27 Lanzatech New Zealand Ltd Crispr/cas systems for c-1 fixing bacteria
WO2017151444A1 (en) 2016-02-29 2017-09-08 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for blocking off-target nucleic acids from cleavage by crispr proteins
CN105671070B (zh) 2016-03-03 2019-03-19 江南大学 一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法
EP3423580A1 (en) 2016-03-04 2019-01-09 Editas Medicine, Inc. Crispr-cpf1-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
CN105821040B (zh) 2016-03-09 2018-12-14 李旭 联合免疫基因抑制高危型HPV表达的sgRNA、基因敲除载体及其应用
CN107177591A (zh) 2016-03-09 2017-09-19 北京大学 利用CRISPR技术编辑CCR5基因的sgRNA序列及其用途
CN105821039B (zh) 2016-03-09 2020-02-07 李旭 联合免疫基因抑制HBV复制的特异性sgRNA、表达载体及其应用
CN105861547A (zh) 2016-03-10 2016-08-17 黄捷 身份证号码永久嵌入基因组的方法
WO2017155717A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas9 systems and methods of use
EP3430142A1 (en) 2016-03-14 2019-01-23 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta hemoglobinopathies
US20180112234A9 (en) 2016-03-14 2018-04-26 Intellia Therapeutics, Inc. Methods and compositions for gene editing
US11530394B2 (en) 2016-03-15 2022-12-20 University Of Massachusetts Anti-CRISPR compounds and methods of use
EP3430332B1 (en) 2016-03-15 2020-01-01 Carrier Corporation Refrigerated sales cabinet
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
WO2017161068A1 (en) 2016-03-18 2017-09-21 President And Fellows Of Harvard College Mutant cas proteins
EP3433364A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency
US11597924B2 (en) 2016-03-25 2023-03-07 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
CN106047803A (zh) 2016-03-28 2016-10-26 青岛市胶州中心医院 CRISPR/Cas9靶向敲除兔BMP2基因的细胞模型及其应用
CA3019362A1 (en) 2016-03-28 2017-10-05 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Bacteriophage engineering methods
WO2017173004A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Mikuni Takayasu A method for in vivo precise genome editing
BR112018069795A2 (pt) 2016-03-30 2019-01-29 Intellia Therapeutics Inc formulações de nanopartículas lipídicas para componentes de crispr/cas
WO2017172860A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for the single tube preparation of sequencing libraries using cas9
US20190093128A1 (en) 2016-03-31 2019-03-28 The Regents Of The University Of California Methods for genome editing in zygotes
CN106167525B (zh) 2016-04-01 2019-03-19 北京康明百奥新药研发有限公司 筛选超低岩藻糖细胞系的方法和应用
US10301619B2 (en) 2016-04-01 2019-05-28 New England Biolabs, Inc. Compositions and methods relating to synthetic RNA polynucleotides created from synthetic DNA oligonucleotides
CN109072191B (zh) 2016-04-04 2024-03-22 苏黎世联邦理工学院 用于蛋白生产和文库产生的哺乳动物细胞系
WO2017176529A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Temple Univesity-Of The Commonwealth System Of Higher Education Compositions for eradicating flavivirus infections in subjects
CN105802980A (zh) 2016-04-08 2016-07-27 北京大学 Gateway兼容性CRISPR/Cas9系统及其应用
CN106399306B (zh) 2016-04-12 2019-11-05 西安交通大学第一附属医院 靶向人lncRNA-UCA1抑制膀胱癌的sgRNA、基因载体及其应用
WO2017180915A2 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
WO2017180694A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules gene editing systems, and methods of use thereof
WO2017180711A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Editas Medicine, Inc. Grna fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
EP3442596A1 (en) 2016-04-14 2019-02-20 Université de Lausanne Treatment and/or prevention of dna-triplet repeat diseases or disorders
US20170298348A1 (en) 2016-04-14 2017-10-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genome editing of human neural stem cells using nucleases
CN105821116A (zh) 2016-04-15 2016-08-03 扬州大学 一种绵羊mstn基因定向敲除及其影响成肌分化的检测方法
WO2017181107A2 (en) 2016-04-16 2017-10-19 Ohio State Innovation Foundation Modified cpf1 mrna, modified guide rna, and uses thereof
WO2017184334A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Generation of genetically engineered animals by crispr/cas9 genome editing in spermatogonial stem cells
WO2017182468A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Means and methods for inactivating therapeutic dna in a cell
CA3026110A1 (en) 2016-04-19 2017-11-02 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
CN106086062A (zh) 2016-04-19 2016-11-09 上海市农业科学院 一种获得番茄基因组定点敲除突变体的方法
KR102424476B1 (ko) 2016-04-19 2022-07-25 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신규한 crispr 효소 및 시스템
AU2017253107B2 (en) 2016-04-19 2023-07-20 Massachusetts Institute Of Technology CPF1 complexes with reduced indel activity
CN105886616B (zh) 2016-04-20 2020-08-07 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种用于猪基因编辑的高效特异性sgRNA识别位点引导序列及其筛选方法
CN105821075B (zh) 2016-04-22 2017-09-12 湖南农业大学 一种茶树咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建方法
CN107304435A (zh) 2016-04-22 2017-10-31 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种Cas9/RNA系统及其应用
WO2017189336A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for genomic editing
CN105861552B (zh) 2016-04-25 2019-10-11 西北农林科技大学 一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法
CN107326046A (zh) 2016-04-28 2017-11-07 上海邦耀生物科技有限公司 一种提高外源基因同源重组效率的方法
EP4166660A1 (en) 2016-04-29 2023-04-19 BASF Plant Science Company GmbH Improved methods for modification of target nucleic acids using fused guide rna - donor molecules
CN105821049B (zh) 2016-04-29 2019-06-04 中国农业大学 一种Fbxo40基因敲除猪的制备方法
CN105886534A (zh) 2016-04-29 2016-08-24 苏州溯源精微生物科技有限公司 一种抑制肿瘤转移的方法
WO2017190257A1 (en) 2016-05-01 2017-11-09 Neemo Inc Harnessing heterologous and endogenous crispr-cas machineries for efficient markerless genome editing in clostridium
WO2017192544A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Massachusetts Institute Of Technology AMPHIPHILIC NANOPARTICLES FOR CODELIVERY OF WATER-INSOLUBLE SMALL MOLECULES AND RNAi
CN105950639A (zh) 2016-05-04 2016-09-21 广州美格生物科技有限公司 金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备及其在构建小鼠模型中的应用
WO2017191210A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Novozymes A/S Genome editing by crispr-cas9 in filamentous fungal host cells
CN105907785B (zh) 2016-05-05 2020-02-07 苏州吉玛基因股份有限公司 化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用
WO2017190664A1 (zh) 2016-05-05 2017-11-09 苏州吉玛基因股份有限公司 化学合成的crRNA和修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
JP7075597B2 (ja) 2016-05-05 2022-05-26 デューク ユニバーシティ デュシェンヌ型筋ジストロフィーを治療するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ関連の方法および組成物
US20190093092A1 (en) 2016-05-05 2019-03-28 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Rna guided eradication of varicella zoster virus
CN106244591A (zh) 2016-08-23 2016-12-21 苏州吉玛基因股份有限公司 修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
CN105985985B (zh) 2016-05-06 2019-12-31 苏州大学 Crispr技术编辑并用igf优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心梗中应用
CA3022319A1 (en) 2016-05-06 2017-11-09 Tod M. Woolf Improved methods for genome editing with and without programmable nucleases
WO2017196768A1 (en) 2016-05-09 2017-11-16 President And Fellows Of Harvard College Self-targeting guide rnas in crispr system
JP2019519250A (ja) 2016-05-10 2019-07-11 ユナイテッド ステイツ ガバメント アズ リプレゼンテッド バイ ザ デパートメント オブ ベテランズ アフェアーズＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ａｓ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ Ｂｙ Ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｖｅｔｅｒａｎｓ Ａｆｆａｉｒｓ Ｈｉｖ−１感染と複製に必須な遺伝子を切断するｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓの構築物のレンチウィルスによる送達
CN105861554B (zh) 2016-05-10 2020-01-31 华南农业大学 一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用
CN107365786A (zh) 2016-05-12 2017-11-21 中国科学院微生物研究所 一种将spacer序列克隆至CRISPR-Cas9系统中的方法及其应用
WO2017197301A1 (en) 2016-05-12 2017-11-16 Hanley Brian P Safe delivery of crispr and other gene therapies to large fractions of somatic cells in humans and animals
US20190345483A1 (en) 2016-05-12 2019-11-14 President And Fellows Of Harvard College AAV Split Cas9 Genome Editing and Transcriptional Regulation
CN105907758B (zh) 2016-05-18 2020-06-05 世翱（上海）生物医药科技有限公司 CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建方法
CN106011171B (zh) 2016-05-18 2019-10-11 西北农林科技大学 一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法
CN105838733A (zh) 2016-05-18 2016-08-10 云南省农业科学院花卉研究所 Cas9 介导的香石竹基因编辑载体和应用
EP3457840B1 (en) 2016-05-20 2024-04-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas
CN106446600B (zh) 2016-05-20 2019-10-18 同济大学 一种基于CRISPR/Cas9的sgRNA的设计方法
WO2017205290A1 (en) 2016-05-23 2017-11-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Bypassing the pam requirement of the crispr-cas system
US20190201551A1 (en) 2016-05-23 2019-07-04 Washington University Pulmonary targeted cas9/crispr for in vivo editing of disease genes
CN105950560B (zh) 2016-05-24 2019-07-23 苏州系统医学研究所 人源化pd-l1肿瘤细胞系及具有该细胞系的动物模型与应用
CN106011167B (zh) 2016-05-27 2019-11-01 上海交通大学 雄性不育基因OsDPW2的应用及水稻育性恢复的方法
EA201892810A1 (ru) 2016-06-01 2019-06-28 Квс Заат Се Гибридные последовательности нуклеиновых кислот для геномной инженерии
EP3272867B1 (en) 2016-06-02 2019-09-25 Sigma Aldrich Co. LLC Using programmable dna binding proteins to enhance targeted genome modification
US20190100732A1 (en) 2016-06-02 2019-04-04 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Assay for the removal of methyl-cytosine residues from dna
US11140883B2 (en) 2016-06-03 2021-10-12 Auburn University Gene editing of reproductive hormones to sterilize aquatic animals
CN109640946A (zh) 2016-06-03 2019-04-16 天普大学-联邦高等教育系统 通过基因编辑策略进行hiv-1的负反馈调节
WO2017213898A2 (en) 2016-06-07 2017-12-14 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Rna guided compositions for preventing and treating hepatitis b virus infections
CN106119275A (zh) 2016-06-07 2016-11-16 湖北大学 基于CRISPR/Cas9技术将非糯性水稻株系改造成糯性株系的打靶载体和方法
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
CN106086008B (zh) 2016-06-10 2019-03-12 中国农业科学院植物保护研究所 烟粉虱MED隐种TRP基因的CRISPR/cas9系统及其应用
WO2017222834A1 (en) 2016-06-10 2017-12-28 City Of Hope Compositions and methods for mitochondrial genome editing
CN106434752A (zh) 2016-06-14 2017-02-22 南通大学附属医院 敲除Wnt3a基因的过程及其验证方法
US20200332305A1 (en) 2016-06-14 2020-10-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of cpfi endonuclease for plant genome modifications
CN106167821A (zh) 2016-06-16 2016-11-30 郑州大学 一种金黄色葡萄球菌crispr位点检测试剂盒及检测方法
CN105950633B (zh) 2016-06-16 2019-05-03 复旦大学 基因OsARF4在控制水稻粒长和千粒重中的应用
CN106167808A (zh) 2016-06-16 2016-11-30 郑州大学 一种基于CRISPR/Cas9技术消除mecA质粒的方法
US20190330603A1 (en) 2016-06-17 2019-10-31 Genesis Technologies Limited Crispr-cas system, materials and methods
WO2017219033A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 Montana State University Bidirectional targeting for genome editing
CN105950626B (zh) 2016-06-17 2018-09-28 新疆畜牧科学院生物技术研究所 基于CRISPR/Cas9获得不同毛色绵羊的方法及靶向ASIP基因的sgRNA
EP3455357A1 (en) 2016-06-17 2019-03-20 The Broad Institute Inc. Type vi crispr orthologs and systems
AU2017282623B2 (en) 2016-06-20 2023-09-21 Keygene N.V. Method for targeted DNA alteration in plant cells
US20190100745A1 (en) 2016-06-20 2019-04-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel cas systems and methods of use
US20170362635A1 (en) 2016-06-20 2017-12-21 University Of Washington Muscle-specific crispr/cas9 editing of genes
WO2017223107A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Unity Biotechnology, Inc. Genome modifying enzyme therapy for diseases modulated by senescent cells
CN106148370A (zh) 2016-06-21 2016-11-23 苏州瑞奇生物医药科技有限公司 肥胖症大鼠动物模型和构建方法
KR102418185B1 (ko) 2016-06-22 2022-07-06 프로큐알 테라퓨틱스 Ⅱ 비.브이. 단일 가닥 rna-편집 올리고뉴클레오타이드
EP3475416A4 (en) 2016-06-22 2020-04-29 Icahn School of Medicine at Mount Sinai VIRAL DELIVERY OF RNA USING SELF-CLeavING RIBOZYMES AND CRISPR-BASED APPLICATIONS
CN106047877B (zh) 2016-06-24 2019-01-11 中山大学附属第一医院 一种靶向敲除FTO基因的sgRNA及CRISPR/Cas9慢病毒系统与应用
CN105925608A (zh) 2016-06-24 2016-09-07 广西壮族自治区水牛研究所 一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除ALK6基因的方法
CN106119283A (zh) 2016-06-24 2016-11-16 广西壮族自治区水牛研究所 一种利用CRISPR‑Cas9靶向敲除MSTN基因的方法
CN106148286B (zh) 2016-06-29 2019-10-29 牛刚 一种用于检测热原的细胞模型的构建方法和细胞模型及热原检测试剂盒
US11913017B2 (en) 2016-06-29 2024-02-27 The Regents Of The University Of California Efficient genetic screening method
WO2018005873A1 (en) 2016-06-29 2018-01-04 The Broad Institute Inc. Crispr-cas systems having destabilization domain
US20190185849A1 (en) 2016-06-29 2019-06-20 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for gene editing
US10927383B2 (en) 2016-06-30 2021-02-23 Ethris Gmbh Cas9 mRNAs
US10892034B2 (en) 2016-07-01 2021-01-12 Microsoft Technology Licensing, Llc Use of homology direct repair to record timing of a molecular event
CN109477130B (zh) 2016-07-01 2022-08-30 微软技术许可有限责任公司 通过迭代dna编辑的存储
US20180004537A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Microsoft Technology Licensing, Llc Molecular State Machines
BR112019000057A2 (pt) 2016-07-05 2019-04-02 The Johns Hopkins University composições e métodos com base em crispr/cas9 para o tratamento de degeneração de retina
CN109312353A (zh) 2016-07-06 2019-02-05 诺维信公司 通过crispr-抑制来改善微生物
CN106191057B (zh) 2016-07-06 2018-12-25 中山大学 一种用于敲除人CYP2E1基因的sgRNA序列、CYP2E1基因缺失细胞株的构建方法及其应用
CN106051058A (zh) 2016-07-07 2016-10-26 上海格昆机电科技有限公司 用于航天贮箱和粒子治疗仪的旋转机架及其传动机构
CN107586777A (zh) 2016-07-08 2018-01-16 上海吉倍生物技术有限公司 人PDCD1基因sgRNA的用途及其相关药物
WO2018009822A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Ohio State Innovation Foundation Modified nucleic acids, hybrid guide rnas, and uses thereof
CN106047930B (zh) 2016-07-12 2020-05-19 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 一种PS1基因条件性敲除flox大鼠的制备方法
BR112019000430A2 (pt) 2016-07-13 2019-07-09 Dsm Ip Assets Bv sistema crispr-cas para uma célula hospedeira de algas
US20190330659A1 (en) 2016-07-15 2019-10-31 Zymergen Inc. Scarless dna assembly and genome editing using crispr/cpf1 and dna ligase
CN106191061B (zh) 2016-07-18 2019-06-18 暨南大学 一种特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列及其应用
CN106191062B (zh) 2016-07-18 2019-06-14 广东华南疫苗股份有限公司 一种tcr-/pd-1-双阴性t细胞及其构建方法
CN106190903B (zh) 2016-07-18 2019-04-02 华中农业大学 鸭疫里氏杆菌Cas9基因缺失突变株及其应用
CN106434651B (zh) 2016-07-19 2021-05-18 广西大学 根癌农杆菌和CRISPR-Cas9介导的基因定点插入失活方法及其应用
WO2018017754A1 (en) 2016-07-19 2018-01-25 Duke University Therapeutic applications of cpf1-based genome editing
KR20190031306A (ko) 2016-07-21 2019-03-25 맥스시티 인코포레이티드 게놈 dna를 변경하기 위한 방법 및 조성물
CN106191107B (zh) 2016-07-22 2020-03-20 湖南农业大学 一种降低水稻籽粒落粒性的分子改良方法
CN106191064B (zh) 2016-07-22 2019-06-07 中国农业大学 一种制备mc4r基因敲除猪的方法
WO2018015444A1 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Novozymes A/S Crispr-cas9 genome editing with multiple guide rnas in filamentous fungi
WO2018022480A1 (en) 2016-07-25 2018-02-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating cancer
WO2018022634A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 The General Hospital Corporation Variants of crispr from prevotella and francisella 1 (cpf1)
WO2018018979A1 (zh) 2016-07-26 2018-02-01 浙江大学 植物重组载体及无转基因成分的基因编辑植株的筛选方法
CN106222193B (zh) 2016-07-26 2019-09-20 浙江大学 一种重组载体及无转基因基因编辑植株的筛选方法
CN106086061A (zh) 2016-07-27 2016-11-09 苏州泓迅生物科技有限公司 一种基于CRISPR‑Cas9系统的酿酒酵母基因组编辑载体及其应用
CN106191099A (zh) 2016-07-27 2016-12-07 苏州泓迅生物科技有限公司 一种基于CRISPR‑Cas9系统的酿酒酵母基因组并行多重编辑载体及其应用
GB201613135D0 (en) 2016-07-29 2016-09-14 Medical Res Council Genome editing
CN106191114B (zh) 2016-07-29 2020-02-11 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 利用CRISPR-Cas9系统敲除鱼类MC4R基因的育种方法
CN106191113B (zh) 2016-07-29 2020-01-14 中国农业大学 一种mc3r基因敲除猪的制备方法
CN106434748A (zh) 2016-07-29 2017-02-22 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 一种热激诱导型 Cas9 酶转基因斑马鱼的研制及应用
CN106191124B (zh) 2016-07-29 2019-10-11 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 一种利用鱼卵保存液提高CRISPR-Cas9基因编辑和传代效率的鱼类育种方法
CN106434688A (zh) 2016-08-01 2017-02-22 云南纳博生物科技有限公司 一种水稻直立密穗dep1基因人工定点突变体及其应用
CN106011150A (zh) 2016-08-01 2016-10-12 云南纳博生物科技有限公司 一种水稻穗粒数Gn1a基因人工定点突变体及其应用
CA3030340A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Human induced pluripotent stem cells for high efficiency genetic engineering
BR112019001887A2 (pt) 2016-08-02 2019-07-09 Editas Medicine Inc composições e métodos para o tratamento de doença associada a cep290
US20190153430A1 (en) 2016-08-02 2019-05-23 Kyoto University Method for genome editing
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CN106282241A (zh) 2016-08-05 2017-01-04 无锡市第二人民医院 通过CRISPR/Cas9得到敲除bmp2a基因的斑马鱼的方法
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
KR101710026B1 (ko) 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물
CN106222203A (zh) 2016-08-10 2016-12-14 云南纳博生物科技有限公司 利用CRISPR/Cas技术获得家蚕丝素重链基因突变体及突变方法和应用
CN106172238B (zh) 2016-08-12 2019-01-22 中南大学 miR-124基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
CN106222177B (zh) 2016-08-13 2018-06-26 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种靶向人STAT6的CRISPR-Cas9系统及其用于治疗过敏性疾病的应用
WO2018035250A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying class 2 crispr-cas systems
US20210000091A1 (en) 2016-08-17 2021-01-07 The Regents Of The University Of California Split Trans-Complementing Gene-Drive System for Suppressing Aedes Aegypti Mosquitos
US11810649B2 (en) 2016-08-17 2023-11-07 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying novel gene editing elements
JP2019524162A (ja) 2016-08-18 2019-09-05 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア モジュラーＡＡＶ送達システムによるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集
CA3034101A1 (en) 2016-08-19 2018-02-22 Bluebird Bio, Inc. Genome editing enhancers
KR20230155013A (ko) 2016-08-20 2023-11-09 아벨리노 랩 유에스에이, 인크. 단일 가이드 RNA, CRISPR/Cas9 시스템, 및 이의 사용방법
CN106191116B (zh) 2016-08-22 2019-10-08 西北农林科技大学 基于CRISPR/Cas9的外源基因敲入整合系统及其建立方法和应用
CN106191071B (zh) 2016-08-22 2018-09-04 广州资生生物科技有限公司 一种CRISPR-Cas9系统及其用于治疗乳腺癌疾病的应用
CN106086028B (zh) 2016-08-23 2019-04-23 中国农业科学院作物科学研究所 一种通过基因组编辑提高水稻抗性淀粉含量的方法及其专用sgRNA
CN106244555A (zh) 2016-08-23 2016-12-21 广州医科大学附属第三医院 一种提高基因打靶的效率的方法及β‑球蛋白基因位点的碱基原位修复方法
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
SG11201901364VA (en) 2016-08-24 2019-03-28 Sangamo Therapeutics Inc Engineered target specific nucleases
KR101856345B1 (ko) 2016-08-24 2018-06-20 경상대학교산학협력단 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 APOBEC3H 및 APOBEC3CH 이중-넉아웃 고양이를 제조하는 방법
CN106109417A (zh) 2016-08-24 2016-11-16 李因传 一种肝细胞膜仿生脂质体药物载体、制作方法及其应用
CN106244609A (zh) 2016-08-24 2016-12-21 浙江理工大学 一种调节pi3k‑akt信号通路的非编码基因的筛选系统及筛选方法
MX2019002207A (es) 2016-08-24 2019-07-15 Sangamo Therapeutics Inc Regulacion de la expresion genica usando nucleasas modificadas.
CN106544357B (zh) 2016-08-25 2018-08-21 湖南杂交水稻研究中心 一种培育镉低积累籼稻品种的方法
CN106318973B (zh) 2016-08-26 2019-09-13 深圳市第二人民医院 一种基于CRISPR-Cas9的基因调控装置及基因调控方法
CN106350540A (zh) 2016-08-26 2017-01-25 苏州系统医学研究所 一种由慢病毒介导的高效可诱导型CRISPR/Cas9基因敲除载体及其应用
CN107784200B (zh) 2016-08-26 2020-11-06 深圳华大生命科学研究院 一种筛选新型CRISPR-Cas系统的方法和装置
CN106399375A (zh) 2016-08-31 2017-02-15 南京凯地生物科技有限公司 利用CRISPR/Cas9敲除人PD‑1基因构建靶向CD19CAR‑T细胞的方法
CN106480097A (zh) 2016-10-13 2017-03-08 南京凯地生物科技有限公司 利用CRISPR/Cas9技术敲除人PD‑1基因构建可靶向MSLN新型CAR‑T细胞的方法及其应用
CN106399367A (zh) 2016-08-31 2017-02-15 深圳市卫光生物制品股份有限公司 提高crispr介导的同源重组效率的方法
CN107794272B (zh) 2016-09-06 2021-10-12 中国科学院上海营养与健康研究所 一种高特异性的crispr基因组编辑体系
CN106367435B (zh) 2016-09-07 2019-11-08 电子科技大学 一种水稻miRNA定向敲除的方法
CN106399377A (zh) 2016-09-07 2017-02-15 同济大学 一种基于CRISPR/Cas9高通量技术筛选药物靶点基因的方法
CN106399311A (zh) 2016-09-07 2017-02-15 同济大学 用于Chip‑seq全基因组结合谱的内源蛋白标记的方法
US20180105806A1 (en) 2016-09-07 2018-04-19 Massachusetts Institute Of Technology Method for rna-guided endonuclease-based dna assembly
WO2018049168A1 (en) 2016-09-09 2018-03-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High-throughput precision genome editing
CN107574179B (zh) 2016-09-09 2018-07-10 康码（上海）生物科技有限公司 一种为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统
WO2018051347A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Crisp-seq, an integrated method for massively parallel single cell rna-seq and crispr pooled screens
CN106318934B (zh) 2016-09-21 2020-06-05 上海交通大学 胡萝卜β(1,2)木糖转移酶的基因全序列及用于转染双子叶植物的CRISPR/CAS9的质粒构建
CN109715804A (zh) 2016-09-23 2019-05-03 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于宿主细胞的指导rna表达系统
WO2018058064A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership Compositions and methods for gene editing
CN106957858A (zh) 2016-09-23 2017-07-18 西北农林科技大学 一种利用CRISPR/Cas9系统共同敲除绵羊MSTN、ASIP、BCO2基因的方法
WO2018062866A2 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Cellivery Therapeutics, Inc. CELL-PERMEABLE (CP)-Cas9 RECOMBINANT PROTEIN AND USES THEREOF
JP2019532644A (ja) 2016-09-30 2019-11-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｒｎａ誘導型核酸修飾酵素及びその使用方法
CN106480027A (zh) 2016-09-30 2017-03-08 重庆高圣生物医药有限责任公司 CRISPR/Cas9 靶向敲除人PD‑1基因及其特异性gRNA
CN107881184B (zh) 2016-09-30 2021-08-27 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种基于Cpf1的DNA体外拼接方法
CN107880132B (zh) 2016-09-30 2022-06-17 北京大学 一种融合蛋白及使用其进行同源重组的方法
EP3532089A4 (en) 2016-09-30 2020-05-13 The Regents of The University of California RNA-GUIDED NUCLEIC ACID MODIFYING ENZYMES AND METHOD FOR USE THEREOF
US20200024610A1 (en) 2016-09-30 2020-01-23 Monsanto Technology Llc Method for selecting target sites for site-specific genome modification in plants
EP3518981A4 (en) 2016-10-03 2020-06-10 President and Fellows of Harvard College DELIVERING THERAPEUTIC RNAS VIA ARRDC1-MEDIATED MICROVESICLES
US20190241899A1 (en) 2016-10-05 2019-08-08 President And Fellows Of Harvard College Methods of Crispr Mediated Genome Modulation in V. Natriegens
US10669539B2 (en) 2016-10-06 2020-06-02 Pioneer Biolabs, Llc Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries
CA3039409A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Integrated Dna Technologies, Inc. S. pyogenes cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same
CN106479985A (zh) 2016-10-09 2017-03-08 上海吉玛制药技术有限公司 病毒介导的Cpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
WO2018071623A2 (en) 2016-10-12 2018-04-19 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Combination therapies for eradicating flavivirus infections in subjects
IT201600102542A1 (it) 2016-10-12 2018-04-12 Univ Degli Studi Di Trento Plasmide e sistema lentivirale contenente un circuito autolimitante della Cas9 che ne incrementa la sicurezza.
CN106434663A (zh) 2016-10-12 2017-02-22 遵义医学院 CRISPR/Cas9靶向敲除人ezrin基因增强子关键区的方法及其特异性gRNA
WO2018071663A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Emendobio Inc. Rna compositions for genome editing
CN106434782B (zh) 2016-10-14 2020-01-10 南京工业大学 一种产顺式-4-羟脯氨酸的方法
WO2018071868A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 President And Fellows Of Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
CA3040481A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 The General Hospital Corporation Epigenetically regulated site-specific nucleases
WO2018074979A1 (en) 2016-10-17 2018-04-26 Nanyang Technological University Truncated crispr-cas proteins for dna targeting
US10640810B2 (en) 2016-10-19 2020-05-05 Drexel University Methods of specifically labeling nucleic acids using CRISPR/Cas
EP3532616A1 (en) 2016-10-28 2019-09-04 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus
WO2018080573A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Crispr/cas global regulator screening platform
US20180127759A1 (en) 2016-10-28 2018-05-10 Massachusetts Institute Of Technology Dynamic genome engineering
US11795453B2 (en) 2016-10-31 2023-10-24 Emendobio, Inc. Compositions for genome editing
WO2018079134A1 (ja) 2016-10-31 2018-05-03 株式会社江口高周波 リアクトル
US11787795B2 (en) 2016-11-01 2023-10-17 President And Fellows Of Harvard College Inhibitors of RNA guided nucleases and uses thereof
WO2018083606A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 Novartis Ag Methods and compositions for enhancing gene editing
GB201618507D0 (en) 2016-11-02 2016-12-14 Stichting Voor De Technische Wetenschappen And Wageningen Univ Microbial genome editing
CN106544353A (zh) 2016-11-08 2017-03-29 宁夏医科大学总医院 一种利用CRISPR‑Cas9清除鲍曼不动杆菌耐药性基因的方法
CN106755088A (zh) 2016-11-11 2017-05-31 广东万海细胞生物科技有限公司 一种自体car‑t细胞制备方法及应用
EP3538561A4 (en) 2016-11-11 2020-10-21 The Regents of The University of California RNA-GUIDED POLYPEPTIDE VARIANTS AND METHOD OF USING
CN106566838B (zh) 2016-11-14 2019-11-01 上海伯豪生物技术有限公司 一种基于CRISPR-Cas9技术的miR-126全长基因敲除试剂盒及其应用
AR110075A1 (es) 2016-11-14 2019-02-20 Inst Genetics & Developmental Biology Cas Un método para edición basal en plantas
CN106554969A (zh) 2016-11-15 2017-04-05 陕西理工学院 基于抑菌杀菌的多靶点CRISPR/Cas9表达载体
CN106754912B (zh) 2016-11-16 2019-11-08 上海交通大学 一类定向清除肝细胞中HBVcccDNA的质粒及制剂
EP3541932A4 (en) 2016-11-16 2021-03-03 The Regents of the University of California CRISPR-CAS9 INHIBITORS
CN106480067A (zh) 2016-11-21 2017-03-08 中国农业科学院烟草研究所 烟草NtNAC096基因控制烟草衰老的应用
US20180282722A1 (en) 2016-11-21 2018-10-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric DNA:RNA Guide for High Accuracy Cas9 Genome Editing
US11136567B2 (en) 2016-11-22 2021-10-05 Integrated Dna Technologies, Inc. CRISPR/CPF1 systems and methods
CN106755091A (zh) 2016-11-28 2017-05-31 中国人民解放军第三军医大学第附属医院 基因敲除载体，mh7a细胞nlrp1基因敲除方法
CA3044531A1 (en) 2016-11-28 2018-05-31 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Prevention of muscular dystrophy by crispr/cpf1-mediated gene editing
CN106480036B (zh) 2016-11-30 2019-04-09 华南理工大学 一种具有启动子功能的dna片段及其应用
CN106834323A (zh) 2016-12-01 2017-06-13 安徽大学 一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7‑5‑3的基因编辑方法
CA3045335A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Universite Laval Crispr-based treatment of friedreich ataxia
CN107043779B (zh) 2016-12-01 2020-05-12 中国农业科学院作物科学研究所 一种CRISPR/nCas9介导的定点碱基替换在植物中的应用
US9816093B1 (en) 2016-12-06 2017-11-14 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
CN106701830B (zh) 2016-12-07 2020-01-03 湖南人文科技学院 一种敲除猪胚胎p66shc基因的方法
CN108165573B (zh) 2016-12-07 2022-01-14 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 叶绿体基因组编辑方法
EP3551757A1 (en) 2016-12-08 2019-10-16 Intellia Therapeutics, Inc. Modified guide rnas
CN106544351B (zh) 2016-12-08 2019-09-10 江苏省农业科学院 CRISPR-Cas9体外敲除耐药基因mcr-1的方法及其专用细胞穿透肽
US11192929B2 (en) 2016-12-08 2021-12-07 Regents Of The University Of Minnesota Site-specific DNA base editing using modified APOBEC enzymes
WO2018107103A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-systems for modifying a trait of interest in a plant
SI3551753T1 (sl) 2016-12-09 2022-09-30 The Broad Institute, Inc. Diagnostika, temelječa na sistemu CRISPR EFFECTOR
US11293022B2 (en) 2016-12-12 2022-04-05 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing enhancement
US20190032131A1 (en) 2016-12-12 2019-01-31 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing detection
CN107893074A (zh) 2016-12-13 2018-04-10 广东赤萌医疗科技有限公司 一种用于敲除CXCR4基因的gRNA、表达载体、敲除系统、试剂盒
WO2018109101A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Wageningen Universiteit Thermostable cas9 nucleases
WO2018108272A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Wageningen Universiteit Thermostable cas9 nucleases
KR101748575B1 (ko) 2016-12-16 2017-06-20 주식회사 엠젠플러스 Ins 유전자 녹아웃 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 동물모델 및 이의 제조방법
WO2018112336A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Ohio State Innovation Foundation Systems and methods for dna-guided rna cleavage
EP3555629A4 (en) 2016-12-18 2020-11-25 Selonterra, Inc. USE OF APOE4 PATTERNED MEDIATION GENES FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF ALZHEIMER'S DISEASE
CN106755026A (zh) 2016-12-18 2017-05-31 吉林大学 sgRNA表达载体的构建及牙釉质钙化不全模型的建立
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US20180237787A1 (en) 2016-12-23 2018-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene editing of pcsk9
CN106755424B (zh) 2016-12-26 2020-11-06 郑州大学 一种基于crispr的大肠杆菌st131系菌株检测引物、试剂盒及检测方法
CN107354173A (zh) 2016-12-26 2017-11-17 浙江省医学科学院 基于crispr技术和水动力尾静脉注射建立肝脏特异性敲除小鼠模型的方法
CN106834347A (zh) 2016-12-27 2017-06-13 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 一种山羊cdk2基因敲除载体及其构建方法
CN106755097A (zh) 2016-12-27 2017-05-31 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所 一种山羊tlr4基因敲除载体及其构建方法
CN106701763B (zh) 2016-12-30 2019-07-19 重庆高圣生物医药有限责任公司 CRISPR/Cas9靶向敲除人乙肝病毒P基因及其特异性gRNA
CN106834341B (zh) 2016-12-30 2020-06-16 中国农业大学 一种基因定点突变载体及其构建方法和应用
CN106755077A (zh) 2016-12-30 2017-05-31 华智水稻生物技术有限公司 利用crispr‑cas9技术对水稻cenh3基因定点突变的方法
CN106868008A (zh) 2016-12-30 2017-06-20 重庆高圣生物医药有限责任公司 CRISPR/Cas9靶向敲除人Lin28A基因及其特异性gRNA
CN106701818B (zh) 2017-01-09 2020-04-24 湖南杂交水稻研究中心 一种培育水稻普通核不育系的方法
EP3568476A1 (en) 2017-01-11 2019-11-20 Oxford University Innovation Limited Crispr rna
CN107012164B (zh) 2017-01-11 2023-03-03 电子科技大学 CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该功能单元的载体及其应用
JP2020505062A (ja) 2017-01-17 2020-02-20 インスティテュート フォー ベーシック サイエンスＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｎａ一本鎖切断による塩基編集非標的位置確認方法
CN106701823A (zh) 2017-01-18 2017-05-24 上海交通大学 生产无岩藻糖单克隆抗体的cho细胞系建立及其应用
CN107058372A (zh) 2017-01-18 2017-08-18 四川农业大学 一种应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法
US20180201921A1 (en) 2017-01-18 2018-07-19 Excision Biotherapeutics, Inc. CRISPRs
CN106801056A (zh) 2017-01-24 2017-06-06 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用
WO2018138385A1 (en) 2017-01-30 2018-08-02 Kws Saat Se Repair template linkage to endonucleases for genome engineering
TWI608100B (zh) 2017-02-03 2017-12-11 國立清華大學 Ｃａｓ９表達質體、大腸桿菌基因剪輯系統及其方法
WO2018148246A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for rna-guided genetic circuits
EP3579858A4 (en) 2017-02-07 2020-12-23 The Regents of The University of California GENE THERAPY AGAINST HAPLOINSUFFICIENCY
US11866699B2 (en) 2017-02-10 2024-01-09 University Of Washington Genome editing reagents and their use
IT201700016321A1 (it) 2017-02-14 2018-08-14 Univ Degli Studi Di Trento Mutanti di cas9 ad alta specificita' e loro applicazioni.
WO2018152197A1 (en) 2017-02-15 2018-08-23 Massachusetts Institute Of Technology Dna writers, molecular recorders and uses thereof
CN106957855B (zh) 2017-02-16 2020-04-17 上海市农业科学院 使用CRISPR/Cas9技术靶向敲除水稻矮杆基因SD1的方法
US20190367924A1 (en) 2017-02-17 2019-12-05 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Gene editing therapy for hiv infection via dual targeting of hiv genome and ccr5
JP2020508046A (ja) 2017-02-20 2020-03-19 インスティテュート・オブ・ジェネティクス・アンド・ディヴェロプメンタル・バイオロジー、チャイニーズ・アカデミー・オブ・サイエンシズＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ゲノム編集システムおよび方法
WO2018154439A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 1 (sca1) and other spinocerebellar ataxia type 1 protein (atxn1) gene related conditions or disorders
EP3585896A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of merosin-deficient cogenital muscular dystrophy (mdcmd) and other laminin, alpha 2 (lama2) gene related conditions or disorders
WO2018156372A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 The Regents Of The University Of California Genetically modified non-human animals and products thereof
WO2018154413A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of dystrophic epidermolysis bullosa (deb) and other collagen type vii alpha 1 chain (col7a1) gene related conditions or disorders
WO2018154418A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of early onset parkinson's disease (park1) and other synuclein, alpha (snca) gene related conditions or disorders
WO2018154459A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of primary hyperoxaluria type 1 (ph1) and other alanine-glyoxylate aminotransferase (agxt) gene related conditions or disorders
JP7277052B2 (ja) 2017-02-22 2023-05-18 クリスパー セラピューティクス アーゲー プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ｐｃｓｋ９）関連障害の処置のための組成物および方法
US20200216857A1 (en) 2017-02-22 2020-07-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of spinocerebellar ataxia type 2 (sca2) and other spinocerebellar ataxia type 2 protein (atxn2) gene related conditions or disorders
JP2020508056A (ja) 2017-02-22 2020-03-19 クリスパー・セラピューティクス・アクチェンゲゼルシャフトＣＲＩＳＰＲ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＡＧ 遺伝子編集のための組成物および方法
CN106868031A (zh) 2017-02-24 2017-06-20 北京大学 一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法及应用
WO2018161009A1 (en) 2017-03-03 2018-09-07 Yale University Aav-mediated direct in vivo crispr screen in glioblastoma
US11111492B2 (en) 2017-03-06 2021-09-07 Florida State University Research Foundation, Inc. Genome engineering methods using a cytosine-specific Cas9
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
KR20190127797A (ko) 2017-03-10 2019-11-13 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 시토신에서 구아닌으로의 염기 편집제
WO2018170015A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 The Regents Of The University Of California Engineering crispr cas9 immune stealth
CN106978428A (zh) 2017-03-15 2017-07-25 上海吐露港生物科技有限公司 一种Cas蛋白特异结合靶标DNA、调控靶标基因转录的方法及试剂盒
KR20190140918A (ko) 2017-03-15 2019-12-20 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 바이러스 검출을 위한 crispr 이펙터 시스템 기반 진단
CN106906242A (zh) 2017-03-16 2017-06-30 重庆高圣生物医药有限责任公司 一种提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因产生非同源性末端接合效率的方法
US20180271954A1 (en) 2017-03-21 2018-09-27 Anthony P. Shuber Treating cancer with cas endonuclease complexes
CA3057192A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
CN107012213A (zh) 2017-03-24 2017-08-04 南开大学 结直肠癌的生物标记物
CN106947780A (zh) 2017-03-28 2017-07-14 扬州大学 一种兔mstn基因的编辑方法
CA3084252A1 (en) 2017-03-28 2018-10-04 Caribou Biosciences, Inc. Crispr-associated (cas) protein
CN106906240A (zh) 2017-03-29 2017-06-30 浙江大学 运用CRISPR‑Cas9系统敲除大麦VE合成通路中的关键基因HPT的方法
US11680262B2 (en) 2017-03-30 2023-06-20 Kyoto University Method for inducing exon skipping by genome editing
CN108660161B (zh) 2017-03-31 2023-05-09 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法
CN107058358B (zh) 2017-04-01 2020-06-09 中国科学院微生物研究所 一种双spacer序列识别切割CRISPR-Cas9载体构建及其在疣孢菌中的应用
CN106967726B (zh) 2017-04-05 2020-12-29 华南农业大学 一种创建亚洲栽培稻与非洲栽培稻种间杂种亲和系的方法和应用
US9938288B1 (en) 2017-04-05 2018-04-10 President And Fellows Of Harvard College Macrocyclic compound and uses thereof
CN107142282A (zh) 2017-04-06 2017-09-08 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中实现大片段DNA定点整合的方法
CN107034229A (zh) 2017-04-07 2017-08-11 江苏贝瑞利生物科技有限公司 一种植物中高效筛选CRISPR/CAS9基因编辑系统候选sgRNA系统及应用
CN107058320B (zh) 2017-04-12 2019-08-02 南开大学 Il7r基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用
CN106916852B (zh) 2017-04-13 2020-12-04 上海科技大学 一种碱基编辑系统及其构建和应用方法
CN108728476A (zh) 2017-04-14 2018-11-02 复旦大学 一种利用crispr系统产生多样性抗体文库的方法
CN107298701B (zh) 2017-04-18 2020-10-30 上海大学 玉米转录因子ZmbZIP22及其应用
CN116732106A (zh) 2017-04-20 2023-09-12 E开创生物技术股份有限公司 产生基因修改的动物的方法
CN106957844A (zh) 2017-04-20 2017-07-18 华侨大学 一种能有效敲除HTLV‑1病毒基因组的CRISPR/Cas9的gRNA序列
CN110799525A (zh) 2017-04-21 2020-02-14 通用医疗公司 具有改变的PAM特异性的CPF1(CAS12a)的变体
US11773409B2 (en) 2017-04-21 2023-10-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University CRISPR/Cas 9-mediated integration of polynucleotides by sequential homologous recombination of AAV donor vectors
CN107043775B (zh) 2017-04-24 2020-06-16 中国农业科学院生物技术研究所 一种能促进棉花侧根发育的sgRNA及其应用
EP3615665A1 (en) 2017-04-24 2020-03-04 DuPont Nutrition Biosciences ApS Novel anti-crispr genes and proteins and methods of use
CN206970581U (zh) 2017-04-26 2018-02-06 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司 一种用于辅助CRISPR/cas9基因敲除的试剂盒
WO2018197020A1 (en) 2017-04-27 2018-11-01 Novozymes A/S Genome editing by crispr-cas9 using short donor oligonucleotides
CN110832074A (zh) 2017-05-03 2020-02-21 科沃施种子欧洲股份两合公司 CRISPR-Cas核酸内切酶在植物基因组工程中的应用
CN110785489A (zh) 2017-05-04 2020-02-11 宾夕法尼亚大学董事会 使用CRISPR/Cpf1在T细胞中进行基因编辑的组合物和方法
CN107012174A (zh) 2017-05-04 2017-08-04 昆明理工大学 CRISPR/Cas9技术在获得家蚕锌指蛋白基因突变体中的应用
CN107254485A (zh) 2017-05-08 2017-10-17 南京农业大学 一种能够快速构建植物基因定点敲除载体的新反应体系
WO2018208755A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for tagging target proteins in proximity to a nucleotide sequence of interest
CN107129999A (zh) 2017-05-09 2017-09-05 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法
CA3062595A1 (en) 2017-05-10 2018-11-15 The Regents Of The University Of California Directed editing of cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
CN107130000B (zh) 2017-05-12 2019-12-17 浙江卫未生物医药科技有限公司 一种同时敲除KRAS基因和EGFR基因的CRISPR-Cas9系统及其应用
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN106957830B (zh) 2017-05-16 2020-12-25 上海交通大学 一种Cas9核酸酶ΔF916及其用途
CN106939303B (zh) 2017-05-16 2021-02-23 上海交通大学 一种Cas9核酸酶R919P及其用途
CN106987570A (zh) 2017-05-16 2017-07-28 上海交通大学 一种Cas9核酸酶R780A及其用途
CN106916820B (zh) 2017-05-16 2019-09-27 吉林大学 能有效编辑猪ROSA26基因的sgRNA及其应用
CN107326042A (zh) 2017-05-16 2017-11-07 上海交通大学 水稻tms10基因的定点敲除系统及其应用
CN106947750B (zh) 2017-05-16 2020-12-08 上海交通大学 一种Cas9核酸酶Q920P及其用途
CN106967697B (zh) 2017-05-16 2021-03-26 上海交通大学 一种Cas9核酸酶G915F及其用途
CN106957831B (zh) 2017-05-16 2021-03-12 上海交通大学 一种Cas9核酸酶K918A及其用途
CN107012250B (zh) 2017-05-16 2021-01-29 上海交通大学 一种适用于CRISPR/Cas9系统的基因组DNA片段编辑精准度的分析方法及应用
AU2018270088A1 (en) 2017-05-18 2020-01-16 Massachusetts Institute Of Technology Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
US20200181623A1 (en) 2017-05-18 2020-06-11 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
EP3625340A4 (en) 2017-05-18 2021-02-24 Cargill, Incorporated GENOME EDITING SYSTEM
EP3625359A4 (en) 2017-05-18 2021-03-03 Children's National Medical Center APTAMERIC AND NUCLEIC ACID PAYLOAD COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
CN107236737A (zh) 2017-05-19 2017-10-10 上海交通大学 特异靶向拟南芥ILK2基因的sgRNA序列及其应用
CN107043787B (zh) 2017-05-19 2017-12-26 南京医科大学 一种基于CRISPR/Cas9获得MARF1定点突变小鼠模型的构建方法和应用
WO2018217852A1 (en) 2017-05-23 2018-11-29 Gettysburg College Crispr based tool for characterizing bacterial serovar diversity
CN107034188B (zh) 2017-05-24 2018-07-24 中山大学附属口腔医院 一种靶向骨的外泌体载体、CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用
WO2018218166A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 The General Hospital Corporation Using split deaminases to limit unwanted off-target base editor deamination
EP3630975A4 (en) 2017-05-26 2021-03-10 North Carolina State University CHANGED GUIDE RNAS FOR MODULATING CAS9 ACTIVITY AND USAGE PROCEDURES
CN107287245B (zh) 2017-05-27 2020-03-17 南京农业大学 一种基于CRISPR/Cas9技术的Glrx1基因敲除动物模型的构建方法
CN107142272A (zh) 2017-06-05 2017-09-08 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种控制大肠杆菌中质粒复制的方法
CN107034218A (zh) 2017-06-07 2017-08-11 浙江大学 用于猪APN基因编辑的靶向sgRNA、修饰载体及其制备方法和应用
CN107119071A (zh) 2017-06-07 2017-09-01 江苏三黍生物科技有限公司 一种降低植物直链淀粉含量的方法及应用
CN107177595A (zh) 2017-06-07 2017-09-19 浙江大学 用于猪CD163基因编辑的靶向sgRNA、修饰载体及其制备方法和应用
CN106987757A (zh) 2017-06-12 2017-07-28 苏州双金实业有限公司 一种耐腐蚀型奥氏体镍基合金
CN107236739A (zh) 2017-06-12 2017-10-10 上海捷易生物科技有限公司 CRISPR/SaCas9特异性敲除人CXCR4基因的方法
CN107227352A (zh) 2017-06-13 2017-10-03 西安医学院 基于eGFP的GPR120基因表达的检测方法及应用
CN107083392B (zh) 2017-06-13 2020-09-08 中国医学科学院病原生物学研究所 一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其在分枝杆菌中的应用
CN107245502B (zh) 2017-06-14 2020-11-03 中国科学院武汉病毒研究所 Cd2结合蛋白(cd2ap)和其相互作用蛋白
CN107312798B (zh) 2017-06-16 2020-06-23 武汉大学 含特异靶向CCR5基因的gRNA序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及应用
CN107099850B (zh) 2017-06-19 2018-05-04 东北农业大学 一种通过酶切基因组构建CRISPR/Cas9基因组敲除文库的方法
CN107266541B (zh) 2017-06-20 2021-06-04 上海大学 玉米转录因子ZmbHLH167及其应用
CN107446951B (zh) 2017-06-20 2021-01-08 温氏食品集团股份有限公司 一种通过CRISPR/Cas9系统快速筛选重组鸡痘病毒的方法及其应用
CN107058328A (zh) 2017-06-22 2017-08-18 江苏三黍生物科技有限公司 一种提高植物直链淀粉含量的方法及应用
CN107227307A (zh) 2017-06-23 2017-10-03 东北农业大学 一种特异靶向猪IRS1基因的sgRNA导向序列及其应用
CN107119053A (zh) 2017-06-23 2017-09-01 东北农业大学 一种特异靶向猪MC4R基因的sgRNA导向序列及其应用
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
CN107099533A (zh) 2017-06-23 2017-08-29 东北农业大学 一种特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列及应用
CN107177631B (zh) 2017-06-26 2020-11-24 中国农业大学 利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法
WO2019005886A1 (en) 2017-06-26 2019-01-03 The Broad Institute, Inc. CRISPR / CAS-CYTIDINE DEAMINASE COMPOSITIONS, SYSTEMS AND METHODS FOR TARGETED EDITING OF NUCLEIC ACIDS
CN107217075B (zh) 2017-06-28 2021-07-02 西安交通大学医学院第一附属医院 一种构建epo基因敲除斑马鱼动物模型的方法及引物、质粒与制备方法
CN107356793A (zh) 2017-07-01 2017-11-17 合肥东玖电气有限公司 一种防火电表箱
CN107312793A (zh) 2017-07-05 2017-11-03 新疆农业科学院园艺作物研究所 Cas9介导的番茄基因编辑载体及其应用
CN107190006A (zh) 2017-07-07 2017-09-22 南通大学附属医院 一种靶向IGF‑IR基因的sgRNA及其应用
CN107354156B (zh) 2017-07-19 2021-02-09 广州医科大学附属第五医院 一种敲除野生型T细胞TCR beta链的gRNA及方法
CN107190008A (zh) 2017-07-19 2017-09-22 苏州吉赛基因测序科技有限公司 一种基于Crispr/cas9的捕获基因组目标序列的方法及其在高通量测序中的应用
CN107236741A (zh) 2017-07-19 2017-10-10 广州医科大学附属第五医院 一种敲除野生型T细胞TCR alpha链的gRNA及方法
CN107400677B (zh) 2017-07-19 2020-05-22 江南大学 一种基于CRISPR-Cas9系统的地衣芽孢杆菌基因组编辑载体及其制备方法
CN107446954A (zh) 2017-07-28 2017-12-08 新乡医学院 一种sd大鼠t细胞缺失遗传模型的制备方法
CN107384922A (zh) 2017-07-28 2017-11-24 重庆医科大学附属儿童医院 CRISPR/Cas9靶向敲除人CNE9基因及其特异性gRNA
CN107418974A (zh) 2017-07-28 2017-12-01 新乡医学院 一种利用单克隆细胞分选快速获得CRISPR/Cas9基因敲除稳定细胞株的方法
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
CN107435051B (zh) 2017-07-28 2020-06-02 新乡医学院 一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法
CN107267515B (zh) 2017-07-28 2020-08-25 重庆医科大学附属儿童医院 CRISPR/Cas9靶向敲除人CNE10基因及其特异性gRNA
CN107435069A (zh) 2017-07-28 2017-12-05 新乡医学院 一种细胞系CRISPR/Cas9基因敲除的快速检测方法
CN107217042B (zh) 2017-07-31 2020-03-06 江苏东抗生物医药科技有限公司 一种生产无岩藻糖基化蛋白的基因工程细胞系及其建立方法
CN107446922A (zh) 2017-08-03 2017-12-08 无锡市第二人民医院 一种敲除人成骨细胞株中hepcidin基因的gRNA序列及其使用方法
CN107502618B (zh) 2017-08-08 2021-03-12 中国科学院微生物研究所 可控载体消除方法及易用型CRISPR-Cas9工具
CN107312785B (zh) 2017-08-09 2019-12-06 四川农业大学 OsKTN80b基因在降低水稻株高方面的应用
CN107384926B (zh) 2017-08-13 2020-06-26 中国人民解放军疾病预防控制所 一种靶向清除细菌耐药性质粒的CRISPR-Cas9系统及应用
CN107365804B (zh) 2017-08-13 2019-12-20 中国人民解放军疾病预防控制所 一种使用温和噬菌体载体包装CRISPR-Cas9系统的方法
CN107446923B (zh) 2017-08-13 2019-12-31 中国人民解放军疾病预防控制所 rAAV8-CRISPR-SaCas9系统及在制备乙肝治疗药物中的应用
CN107815463A (zh) 2017-08-15 2018-03-20 西南大学 CRISPR/Cas9技术介导miR167前体序列编辑体系的建立方法
CN108034656A (zh) 2017-08-16 2018-05-15 四川省农业科学院生物技术核技术研究所 与水稻红褐色颖壳性状有关的sgRNA、CRISPR/Cas9载体、载体构建、应用
CN107446924B (zh) 2017-08-16 2020-01-14 中国科学院华南植物园 一种基于CRISPR-Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用
CN107384894B (zh) 2017-08-21 2019-10-22 华南师范大学 功能化氧化石墨烯高效运载CRISPR/Cas9用于基因编辑的方法
CN107299114B (zh) 2017-08-23 2021-08-27 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种高效的酵母菌染色体融合方法
CN107557393B (zh) 2017-08-23 2020-05-08 中国科学院上海应用物理研究所 一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统及其制备方法和应用
CN107312795A (zh) 2017-08-24 2017-11-03 浙江省农业科学院 运用CRISPR/Cas9系统创制粉色果实番茄的基因编辑方法
CN107460196A (zh) 2017-08-25 2017-12-12 同济大学 一种免疫缺陷小鼠动物模型的构建方法及应用
CN107488649A (zh) 2017-08-25 2017-12-19 南方医科大学 一种Cpf1和p300核心结构域的融合蛋白、相应的DNA靶向激活系统和应用
CN107541525B (zh) 2017-08-26 2021-12-10 内蒙古大学 一种基于CRISPR/Cas9技术介导山羊Tβ4基因定点敲入的方法
CN107446932B (zh) 2017-08-29 2020-02-21 江西省农业科学院 一个控制水稻雄性生殖发育基因及其应用
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
CN107519492B (zh) 2017-09-06 2019-01-25 武汉迈特维尔生物科技有限公司 使用CRISPR技术敲除miR-3187-3p在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用
CN107641631A (zh) 2017-09-07 2018-01-30 浙江工业大学 一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法
CN107362372B (zh) 2017-09-07 2019-01-11 佛山波若恩生物科技有限公司 使用crispr技术在冠状动脉粥样硬化性心脏病中的应用
CN107502608B (zh) 2017-09-08 2020-10-16 中山大学 用于敲除人ALDH2基因的sgRNA、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及应用
CN107557455A (zh) 2017-09-15 2018-01-09 国家纳米科学中心 一种基于CRISPR‑Cas13a的特异性核酸片段的检测方法
CN107557390A (zh) 2017-09-18 2018-01-09 江南大学 一种筛选cho细胞系高表达位点的方法
CN107475300B (zh) 2017-09-18 2020-04-21 上海市同济医院 Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
CN107630042A (zh) 2017-09-19 2018-01-26 安徽大学 一种源于I型Cas系统4个cas基因的原核生物基因编辑方法
CN107557378A (zh) 2017-09-19 2018-01-09 安徽大学 一种基于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas7‑3的真核基因编辑方法
CN107523583A (zh) 2017-09-19 2017-12-29 安徽大学 一种源于I型CRISPR‑Cas系统中基因cas5‑3的原核基因编辑方法
CN107630041A (zh) 2017-09-19 2018-01-26 安徽大学 一种基于维吉尼亚链霉菌IBL14 I‑B型Cas系统的真核基因编辑方法
CN107557373A (zh) 2017-09-19 2018-01-09 安徽大学 一种基于I‑B型CRISPR‑Cas系统基因cas3的基因编辑方法
CN107619837A (zh) 2017-09-20 2018-01-23 西北农林科技大学 利用Cas9切割核酸酶介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法
CN107513531B (zh) 2017-09-21 2020-02-21 无锡市妇幼保健院 用于内源性过表达lncRNA-XIST的gRNA靶点序列及其应用
CN107686848A (zh) 2017-09-26 2018-02-13 中山大学孙逸仙纪念医院 转座子协同CRISPR/Cas9系统的稳定敲除单质粒载体及其应用
CN107557394A (zh) 2017-09-29 2018-01-09 南京鼓楼医院 降低CRISPR/Cas9介导的胚胎基因编辑脱靶率的方法
CN107760652A (zh) 2017-09-29 2018-03-06 华南理工大学 CRISPR/CAS9介导药物转运体靶向性敲除的caco‑2细胞模型及其方法
CN107760663A (zh) 2017-09-30 2018-03-06 新疆大学 油莎草pepc基因的克隆及表达载体的构建和应用
CN107828794A (zh) 2017-09-30 2018-03-23 上海市农业生物基因中心 一种水稻耐盐基因OsRR22突变体、其编码的氨基酸序列、植株及该突变体的创制方法
CN107630006B (zh) 2017-09-30 2020-09-11 山东兴瑞生物科技有限公司 一种制备tcr与hla双基因敲除的t细胞的方法
CN107604003A (zh) 2017-10-10 2018-01-19 南方医科大学 一种基于线性化crispr‑cas9慢病毒载体基因敲除试剂盒及其应用
CN108102940B (zh) 2017-10-12 2021-07-13 中石化上海工程有限公司 一株利用CRISPR/Cas9系统敲除XKS1基因的工业酿酒酵母菌株及构建方法
CN107474129B (zh) 2017-10-12 2018-10-19 江西汉氏联合干细胞科技有限公司 特异性增强crispr-cas系统基因编辑效率的方法
CN107557381A (zh) 2017-10-12 2018-01-09 南京农业大学 一种白菜CRISPR‑Cas9基因编辑体系的建立及其应用
CN108103586A (zh) 2017-10-13 2018-06-01 上海科技大学 一种CRISPR/Cas9随机文库及其构建和应用
CN107586779B (zh) 2017-10-14 2018-08-28 天津金匙生物科技有限公司 使用crispr-cas系统对间充质干细胞进行casp3基因敲除的方法
CN107619829B (zh) 2017-10-14 2018-08-24 南京平港生物技术有限公司 使用crispr-cas系统对间充质干细胞进行gins2基因敲除的方法
CN107523567A (zh) 2017-10-16 2017-12-29 遵义医学院 一种敲除人ezrin基因增强子的食管癌细胞株的构建方法
CA3082251A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CN107760715B (zh) 2017-10-17 2021-12-10 张业胜 一种转基因载体及其构建方法和应用
CN107937427A (zh) 2017-10-20 2018-04-20 广东石油化工学院 一种基于CRISPR/Cas9体系的同源修复载体构建方法
CN107893086B (zh) 2017-10-24 2021-09-03 中国科学院武汉植物园 快速构建配对sgRNA的Cas9双元表达载体文库的方法
CN107760684B (zh) 2017-11-03 2018-09-25 上海拉德钫斯生物科技有限公司 使用crispr-cas系统对间充质干细胞进行rbm17基因敲除的方法
CN107858346B (zh) 2017-11-06 2020-06-16 天津大学 一种敲除酿酒酵母染色体的方法
CN107794276A (zh) 2017-11-08 2018-03-13 中国农业科学院作物科学研究所 一种crispr介导快速有效的农作物定点基因片段或等位基因替换方法和体系
CN107630043A (zh) 2017-11-14 2018-01-26 吉林大学 采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法
CN108441519A (zh) 2017-11-15 2018-08-24 中国农业大学 在crispr/cas9基因编辑中提高同源修复效率的方法
CN107858373B (zh) 2017-11-16 2020-03-17 山东省千佛山医院 内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法
CN107893075A (zh) 2017-11-17 2018-04-10 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR‑Cas9靶向敲除人肠癌细胞RITA基因及其特异性的sgRNA
CN108192956B (zh) 2017-11-17 2021-06-01 东南大学 一种基于Cas9核酸酶的DNA检测分析方法及其应用
CN107828874B (zh) 2017-11-20 2020-10-16 东南大学 一种基于crispr的dna检测和分型方法及其应用
CN107904261A (zh) 2017-11-21 2018-04-13 福州大学 CRISPR/Cas9纳米基因系统的制备及其在转染方面的应用
CN107653256A (zh) 2017-11-21 2018-02-02 云南省烟草农业科学研究院 一种烟草多酚氧化酶基因NtPPO1及其定点突变方法与应用
CN107893076A (zh) 2017-11-23 2018-04-10 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR‑Cas9靶向敲除人乳腺癌细胞RASSF2基因及其特异性的sgRNA
CN107937432B (zh) 2017-11-24 2020-05-01 华中农业大学 一种基于crispr系统的基因组编辑方法及其应用
CN107937501A (zh) 2017-11-24 2018-04-20 安徽师范大学 一种快速简便的筛选CRISPR/Cas基因编辑阳性对象的方法
CN107828738A (zh) 2017-11-28 2018-03-23 新乡医学院 一种dna甲基转移酶缺陷型cho细胞系及其制备方法及应用
CN107988256B (zh) 2017-12-01 2020-07-28 暨南大学 人亨廷顿基因敲入用重组载体及其构建方法和在模型猪构建中的应用
CN108570479B (zh) 2017-12-06 2020-04-03 内蒙古大学 一种基于CRISPR/Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点敲入的方法
CN108148873A (zh) 2017-12-06 2018-06-12 南方医科大学 一种cav-1基因缺失斑马鱼及其制备方法
CN108148835A (zh) 2017-12-07 2018-06-12 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除SLC30A1基因及其特异性的sgRNA
CN108251423B (zh) 2017-12-07 2020-11-06 嘉兴市第一医院 CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及激活方法和应用
CN108315330B (zh) 2017-12-07 2020-05-19 嘉兴市第一医院 CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用
CN107974466B (zh) 2017-12-07 2020-09-29 中国科学院水生生物研究所 一种鲟鱼CRISPR/Cas9基因编辑方法
CN107828826A (zh) 2017-12-12 2018-03-23 南开大学 一种体外高效获得神经干细胞的方法
CN108103098B (zh) 2017-12-14 2020-07-28 华南理工大学 一种化合物皮肤致敏体外评估细胞模型及其构建方法
WO2019118949A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
CN107988268A (zh) 2017-12-18 2018-05-04 湖南师范大学 一种基因敲除选育tcf25基因缺失型斑马鱼的方法
CN108018316A (zh) 2017-12-20 2018-05-11 湖南师范大学 一种基因敲除选育rmnd5b基因缺失型斑马鱼的方法
CN108048466B (zh) 2017-12-21 2020-02-07 嘉兴市第一医院 CRISPR-Cas13a系统特异性靶向人RSPO2基因的crRNA及系统和应用
RU2652899C1 (ru) 2017-12-28 2018-05-03 Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) РНК-проводники для подавления репликации вируса гепатита B и для элиминации вируса гепатита B из клетки-хозяина
CN107893080A (zh) 2017-12-29 2018-04-10 江苏省农业科学院 一种靶向大鼠Inhba基因的sgRNA及其应用
CN108103092B (zh) 2018-01-05 2021-02-12 中国农业科学院作物科学研究所 利用CRISPR-Cas系统修饰OsHPH基因获得矮化水稻的系统及其应用
CN107988229B (zh) 2018-01-05 2020-01-07 中国农业科学院作物科学研究所 一种利用CRISPR-Cas修饰OsTAC1基因获得分蘖改变的水稻的方法
CN107988246A (zh) 2018-01-05 2018-05-04 汕头大学医学院 一种基因敲除载体及其斑马鱼胶质瘤模型
CN108559760A (zh) 2018-01-09 2018-09-21 陕西师范大学 基于CRISPR靶向基因组修饰技术建立荧光素酶knock-in细胞系的方法
CN108148837A (zh) 2018-01-12 2018-06-12 南京医科大学 ApoE-CRISPR/Cas9载体及其在敲除ApoE基因中的应用
CN108559730B (zh) 2018-01-12 2021-09-24 中国人民解放军第四军医大学 利用CRISPR/Cas9技术构建Hutat2:Fc基因敲入单核细胞的实验方法
CN108251451A (zh) 2018-01-16 2018-07-06 西南大学 HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及其应用
CN108251452A (zh) 2018-01-17 2018-07-06 扬州大学 一种表达Cas9基因的转基因斑马鱼及其构建方法和应用
CN108359712B (zh) 2018-02-09 2020-06-26 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法
CN108559745A (zh) 2018-02-10 2018-09-21 和元生物技术（上海）股份有限公司 基于CRISPR-Cas9技术提高B16F10细胞转染效率的方法
CN108486145A (zh) 2018-02-12 2018-09-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法
CN108359691B (zh) 2018-02-12 2021-09-28 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 利用mito-CRISPR/Cas9系统敲除异常线粒体DNA的试剂盒及方法
CN109021111B (zh) 2018-02-23 2021-12-07 上海科技大学 一种基因碱基编辑器
CN108396027A (zh) 2018-02-27 2018-08-14 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞DEAF1基因及其特异性的sgRNA
CN108486159B (zh) 2018-03-01 2021-10-22 南通大学附属医院 一种敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统及其应用
CN108342480B (zh) 2018-03-05 2022-03-01 北京医院 一种基因变异检测质控物及其制备方法
CN108410906A (zh) 2018-03-05 2018-08-17 淮海工学院 一种适用于海洋甲壳类线粒体基因组的CRISPR/Cpf1基因编辑方法
CN108410907B (zh) 2018-03-08 2021-08-27 湖南农业大学 一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法
CN108410911B (zh) 2018-03-09 2021-08-20 广西医科大学 基于CRISPR/Cas9技术构建的LMNA基因敲除的细胞系
CN108486108B (zh) 2018-03-16 2020-10-09 华南农业大学 一种敲除人hmgb1基因的细胞株及其应用
CN108486146B (zh) 2018-03-16 2021-02-19 中国农业科学院作物科学研究所 LbCpf1-RR突变体用于CRISPR/Cpf1系统在植物基因编辑中的应用
CN108384784A (zh) 2018-03-23 2018-08-10 广西医科大学 一种利用CRISPR/Cas9技术敲除Endoglin基因的方法
CN108504685A (zh) 2018-03-27 2018-09-07 宜明细胞生物科技有限公司 一种利用CRISPR/Cas9系统同源重组修复IL-2RG缺陷基因的方法
CN108410877A (zh) 2018-03-27 2018-08-17 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除人细胞SANIL1基因及其特异性的sgRNA
CN108424931A (zh) 2018-03-29 2018-08-21 内蒙古大学 CRISPR/Cas9技术介导山羊VEGF基因定点整合的方法
CN108486234B (zh) 2018-03-29 2022-02-11 东南大学 一种crispr分型pcr的方法及其应用
CN108753772B (zh) 2018-04-04 2020-10-30 南华大学 基于CRISPR/Cas技术敲除CAPNS1基因的人神经母细胞瘤细胞系的构建方法
CN108504693A (zh) 2018-04-04 2018-09-07 首都医科大学附属北京朝阳医院 利用Crispr技术敲除T合酶基因构建的O-型糖基化异常的结肠癌细胞系
CN108441520B (zh) 2018-04-04 2020-07-31 苏州大学 利用CRISPR/Cas9系统构建的基因条件性敲除方法
CN108486111A (zh) 2018-04-04 2018-09-04 山西医科大学 CRISPR-Cas9靶向敲除人SMYD3基因的方法及其特异性sgRNA
CN108486154A (zh) 2018-04-04 2018-09-04 福州大学 一种唾液酸酶基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用
CN108504657B (zh) 2018-04-12 2019-06-14 中南民族大学 利用crispr-cas9技术敲除hek293t细胞kdm2a基因的方法
CN108588182A (zh) 2018-04-13 2018-09-28 中国科学院深圳先进技术研究院 基于crispr-链取代的等温扩增及检测技术
CN108753817A (zh) 2018-04-13 2018-11-06 北京华伟康信生物科技有限公司 增强细胞的抗癌能力的方法及采用该方法获得的增强型细胞
CN108753832A (zh) 2018-04-20 2018-11-06 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑大白猪CD163基因的方法
CN108823248A (zh) 2018-04-20 2018-11-16 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑陆川猪CD163基因的方法
CN108588071A (zh) 2018-04-25 2018-09-28 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞CNR1基因及其特异性的sgRNA
CN108546712B (zh) 2018-04-26 2020-08-07 中国农业科学院作物科学研究所 一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法
CN108707621B (zh) 2018-04-26 2021-02-12 中国农业科学院作物科学研究所 一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法
CN108588128A (zh) 2018-04-26 2018-09-28 南昌大学 一种高效率大豆CRISPR/Cas9系统的构建方法及应用
CN108642053A (zh) 2018-04-28 2018-10-12 和元生物技术（上海）股份有限公司 CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞PPP1R1C基因及其特异性的sgRNA
CN108611364A (zh) 2018-05-03 2018-10-02 南京农业大学 一种非转基因crispr突变体的制备方法
CN108588123A (zh) 2018-05-07 2018-09-28 南京医科大学 CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用
CN108610399B (zh) 2018-05-14 2019-09-27 河北万玛生物医药有限公司 特异性增强crispr-cas系统在表皮干细胞中进行基因编辑效率的方法
CN108546717A (zh) 2018-05-15 2018-09-18 吉林大学 反义lncRNA介导顺式调控抑制靶基因表达的方法
CN108624622A (zh) 2018-05-16 2018-10-09 湖南艾佳生物科技股份有限公司 一种基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株
CN108546718B (zh) 2018-05-16 2021-07-09 康春生 crRNA介导的CRISPR/Cas13a基因编辑系统在肿瘤细胞中的应用
CN108642055B (zh) 2018-05-17 2021-12-03 吉林大学 能有效编辑猪miR-17-92基因簇的sgRNA
CN108642077A (zh) 2018-05-18 2018-10-12 江苏省农业科学院 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术选育绿豆不育突变体的方法及专用gRNA
CN108642090A (zh) 2018-05-18 2018-10-12 中国人民解放军总医院 基于CRISPR/Cas9技术获得Nogo-B敲除模式小鼠的方法及应用
CN108642078A (zh) 2018-05-18 2018-10-12 江苏省农业科学院 基于CRISPR/Cas9基因编辑技术选育绿豆开花传粉突变体的方法及专用gRNA
CN108559732A (zh) 2018-05-21 2018-09-21 陕西师范大学 基于CRISPR/Cas9靶向基因组修饰技术建立KI-T2A-luciferase细胞系的方法
CN108707620A (zh) 2018-05-22 2018-10-26 西北农林科技大学 一种Gene drive载体及构建方法
US20210198330A1 (en) 2018-05-23 2021-07-01 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
CN108690844B (zh) 2018-05-25 2021-10-15 西南大学 HTT的CRISPR/Cas9-gRNA打靶序列对、质粒及HD细胞模型
CN108823249A (zh) 2018-05-28 2018-11-16 上海海洋大学 CRISPR/Cas9构建notch1a突变体斑马鱼的方法
CN108707628B (zh) 2018-05-28 2021-11-23 上海海洋大学 斑马鱼notch2基因突变体的制备方法
CN108707629A (zh) 2018-05-28 2018-10-26 上海海洋大学 斑马鱼notch1b基因突变体的制备方法
CN108707604B (zh) 2018-05-30 2019-07-23 江西汉氏联合干细胞科技有限公司 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行CNE10基因敲除
CN108753835A (zh) 2018-05-30 2018-11-06 中山大学 一种利用CRISPR/Cas9编辑猪BMP15基因的方法
CN108753836B (zh) 2018-06-04 2021-10-12 北京大学 一种利用rna干扰机制的基因调控或编辑系统
CN108715850B (zh) 2018-06-05 2020-10-23 艾一生命科技(广东)有限公司 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行GING2基因敲除
CN108753813B (zh) 2018-06-08 2021-08-24 中国水稻研究所 获得无标记转基因植物的方法
CN108753783A (zh) 2018-06-13 2018-11-06 上海市同济医院 Sqstm1全基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用
CN108728486A (zh) 2018-06-20 2018-11-02 江苏省农业科学院 一种茄子CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法和应用
CN108841845A (zh) 2018-06-21 2018-11-20 广东石油化工学院 一种带有筛选标记的CRISPR/Cas9载体及其构建方法
CN108893529A (zh) 2018-06-25 2018-11-27 武汉博杰生物医学科技有限公司 一种基于CRISPR技术特异性检测人KRAS基因2号及3号外显子突变的crRNA
CN108866093B (zh) 2018-07-04 2021-07-09 广东三杰牧草生物科技有限公司 一种利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法
CN108913714A (zh) 2018-07-05 2018-11-30 江西省超级水稻研究发展中心 一种利用CRISPR/Cas9系统敲除BADH2基因创制香稻的方法
CN108795902A (zh) 2018-07-05 2018-11-13 深圳三智医学科技有限公司 一种安全高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术
US20220033785A1 (en) 2018-07-09 2022-02-03 The Broad Institute, Inc. Rna programmable epigenetic rna modifiers and uses thereof
CN108913691B (zh) 2018-07-16 2020-09-01 山东华御生物科技有限公司 表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行Card3基因敲除
CN108913664B (zh) 2018-07-20 2020-09-04 嘉兴学院 一种CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除卵巢癌细胞中CFP1基因的方法
CN108823291B (zh) 2018-07-25 2022-04-12 领航医学科技(深圳)有限公司 基于crispr技术的特异性核酸片段定量检测方法
CN108853133A (zh) 2018-07-25 2018-11-23 福州大学 一种PAMAM与CRISPR/Cas9系统重组质粒递送纳米粒的制备方法
CN108913717A (zh) 2018-08-01 2018-11-30 河南农业大学 一种利用CRISPR/Cas9系统对水稻PHYB基因定点突变的方法
EP3841203A4 (en) 2018-08-23 2022-11-02 The Broad Institute Inc. CAS9 VARIANTS WITH NON-CANONICAL PAM SPECIFICITIES AND USES OF THEM

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102066405A (zh) * 2008-04-28 2011-05-18 哈佛大学校长及研究员协会 用于细胞穿透的超荷电蛋白
WO2010129023A2 (en) * 2009-04-28 2010-11-11 President And Fellows Of Harvard College Supercharged proteins for cell penetration

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107530399A (zh) * 2014-10-10 2018-01-02 马萨诸塞眼科耳科诊所 治疗分子在体外和体内的有效递送
CN109312315A (zh) * 2015-12-30 2019-02-05 阿维塔斯有限公司 基因编辑蛋白和组合物向细胞和组织的无载体递送
CN109152848A (zh) * 2016-03-15 2019-01-04 马萨诸塞大学 抗-crispr化合物以及使用方法
CN109152848B (zh) * 2016-03-15 2022-12-09 马萨诸塞大学 抗-crispr化合物以及使用方法
CN109789185A (zh) * 2016-07-28 2019-05-21 基础科学研究院 用于治疗眼部疾病的含cas9蛋白和向导rna的药物组合物
CN109804066A (zh) * 2016-08-09 2019-05-24 哈佛大学的校长及成员们 可编程cas9-重组酶融合蛋白及其用途
CN110234770A (zh) * 2017-01-17 2019-09-13 基础科学研究院 通过dna单链断裂识别碱基编辑脱靶位点的方法
CN106978438A (zh) * 2017-02-27 2017-07-25 北京大北农生物技术有限公司 提高同源重组效率的方法
CN110997728A (zh) * 2017-05-25 2020-04-10 通用医疗公司 二分型碱基编辑器(bbe)结构和ii-型-cas9锌指编辑
CN107722125A (zh) * 2017-09-28 2018-02-23 中山大学 一种高效的人工转录激活因子dCas9‑TV及其编码基因与应用
CN107722125B (zh) * 2017-09-28 2021-05-07 中山大学 一种人工转录激活因子dCas9-TV及其编码基因与应用
US11946040B2 (en) 2019-02-04 2024-04-02 The General Hospital Corporation Adenine DNA base editor variants with reduced off-target RNA editing

Also Published As

Publication number Publication date
US10912833B2 (en) 2021-02-09
US20160200779A1 (en) 2016-07-14
SG10202002948RA (en) 2020-05-28
CA2965967A1 (en) 2016-05-06
EP3041858A2 (en) 2016-07-13
US9526784B2 (en) 2016-12-27
AU2018208708A1 (en) 2018-08-16
US20150071903A1 (en) 2015-03-12
WO2015035136A2 (en) 2015-03-12
IL274280B (en) 2022-08-01
IL294492A (en) 2022-09-01
WO2015035136A3 (en) 2015-05-14
WO2015035136A8 (en) 2016-03-24
JP2023156339A (ja) 2023-10-24
JP2016534132A (ja) 2016-11-04
CA2923409A1 (en) 2015-03-12
AU2015338968A1 (en) 2017-05-18
AU2014315132B2 (en) 2018-04-26
JP6830517B2 (ja) 2021-02-17
AU2015338968C1 (en) 2021-02-04
AU2021200127A1 (en) 2021-03-18
AU2015338968B2 (en) 2020-10-22
US20150118216A1 (en) 2015-04-30
AU2018208708B2 (en) 2020-06-18
IL244420A0 (en) 2016-04-21
US20180236081A1 (en) 2018-08-23
US20210315994A1 (en) 2021-10-14
KR20160050070A (ko) 2016-05-10
EP3848384A1 (en) 2021-07-14
KR20220020392A (ko) 2022-02-18
US9737604B2 (en) 2017-08-22
NZ717691A (en) 2022-07-01
SG11201601658YA (en) 2016-04-28
US10682410B2 (en) 2020-06-16
KR102357911B1 (ko) 2022-02-03
JP6629734B2 (ja) 2020-01-15
US20200323984A1 (en) 2020-10-15
AU2020233745B2 (en) 2024-02-29
JP7324523B2 (ja) 2023-08-10
US9999671B2 (en) 2018-06-19
IL274280A (en) 2020-06-30
AU2020233745A1 (en) 2020-10-08
JP2021090422A (ja) 2021-06-17
JP2020073463A (ja) 2020-05-14
AU2014315132A1 (en) 2016-03-24
US20150071906A1 (en) 2015-03-12
EP3041858B1 (en) 2020-11-11
IL244420B (en) 2020-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105745221A (zh) 用于功能性核酸酶的投递系统
US20230167426A1 (en) Anti-crispr compounds and methods of use
Li et al. Discovery and characterization of a peptide that enhances endosomal escape of delivered proteins in vitro and in vivo
US10258697B2 (en) Efficient delivery of therapeutic molecules in vitro and in vivo
Zuris et al. Efficient delivery of genome-editing proteins in vitro and in vivo
CA2837858C (en) Blockade of inflammatory proteases with theta - defensins
US20220226503A1 (en) Methods for efficient delivery of therapeutic molecules in vitro and in vivo
EP3074512A1 (en) Tal effector means useful for partial or full deletion of dna tandem repeats
SONTHEIMER et al. Patent 3029735 Summary
JP2016516749A (ja) 人工転写因子、および眼の不適合創傷治癒の治療のためのその使用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20160706