CN105283539A - 用于hla的修饰的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本文中公开了用于调节HLA基因座的表达的方法和组合物,包括缺乏一种或多种经典HLA基因的表达但不被天然杀伤(NK)细胞靶向而被裂解的细胞。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月12日提交的美国临时申请第61/777,627号的权益,其内容据此通过引用整体并入。
对在联邦资助的研究下进行的本发明的权利的声明
不适用。
技术领域
本公开属于基因表达、基因组工程和基因疗法的领域。
背景
MHC抗原最先被表征为在移植反应中起主要作用的蛋白。排斥通过T细胞对植入组织表面上的组织相容性抗原的反应的介导,并且这些抗原的最大的组是主要组织相容性抗原(MHC)。这些蛋白在所有高等脊椎动物的表面上上表达,并且在小鼠中称为H-2抗原(对于组织相容性-2抗原而言)和在人细胞中称为HLA抗原(对于人白细胞抗原而言)。
MHC蛋白在T细胞刺激中起着至关重要的作用。抗原呈递细胞(通常树突细胞)在细胞表面上展示在MHC上的作为外来蛋白质的降解产物的肽。在共刺激信号存在的情况下,T细胞被激活,并将作用于也展示相同肽/MHC复合物的靶细胞。例如被刺激的T辅助细胞将靶向展示与其MHC结合的抗原的巨噬细胞,或细胞毒性T细胞(CTL)将作用于展示外灭病毒肽的病毒感染的细胞。
MHC蛋白具有两种类型I类和II类。I类MHC蛋白是两种蛋白(为由MHC1I类基因编码的跨膜蛋白的α链和为由不存在于MHC基因簇内的基因编码的小的细胞外蛋白的β2微球蛋白链)的异二聚体。所述α链折叠成3个球状结构域,并且当β2微球蛋白链被结合时,球状蛋白结构复合物与抗体复合物相似。外来肽被呈现在也是最可变的两个最N末端结构域上。II类MHC蛋白也是异二聚体,但该异二聚体包含由MHC复合物内的基因编码的两个跨膜蛋白。I类MHC:抗原复合物与细胞毒性T细胞相互作用,而II类MHC将抗原呈递至辅助T细胞。另外,I类MHC蛋白倾向于在几乎所有有核细胞和血小板(以及在小鼠中红细胞)中表达,而II类MHC蛋白被更加选择性地表达。通常地,II类MHC蛋白在B细胞、某些巨噬细胞和单核细胞、郎格尔汉斯细胞和树突细胞上表达。
人中的I类HLA基因簇包含3个大基因座B、C和A以及几个小基因座。II类HLA簇也包含3个大基因座DP、DQ和DR,并且I类和II类基因簇是多态性的,因为在群体中存在I类和II类基因的几个不同等位基因。还存在也在HLA功能中起作用的几种辅助蛋白。Tap1和Tap2亚单位是在将肽抗原加载至I类HLA复合物所必需的TAP转运蛋白复合物的部分,并且LMP2和LMP7蛋白体亚单位在将抗原蛋白水解成肽以在HLA上展示中起作用。已显示LMP7的减少使细胞表面上的MHCI类的量减少,可能通过稳定化的不存在来实现(见Fehling等(1999)Science265:1234-1237)。除了TAP和LMP以外,还存在甲巯蛋白基因,其表达产物形成TAP复合物与HLAI类链之间的桥并且增加肽加载。甲巯蛋白的减少导致具有受损的MHCI类装配的细胞,减少MHCI类的细胞表面表达和削弱免疫反应(见Grandea等(2000)Immunity13:213-222和Garbi等(2000)NatImmunol1:234-238)。
I类表达的调控通常是在转录水平上的,并且几种刺激物诸如病毒感染等可引起转录的变化。I类基因在一些特定组织中被下调,并且该下调的来源似乎在启动子和3’基因间序列内(见Cohen等(2009)PLosONE4(8):e6748)。还有证据表明微RNA能够调控一些I类MHC基因(见Zhu等,(2010)Am.J.ObstetGynecol202(6):592)。
II类MHC表达的调控取决于MHCII增强体复合物的活性。增强体组分(得到最高度研究的增强体复合物的组分之一是RFX5基因产物(见Villard等(2000)MCB20(10):3364-3376))几乎被普遍地表达,并且这些组分的表达似乎不控制MHCII类基因的组织特异性表达或它们的IFN-γ诱导的上调。相反地,作为非DNA结合蛋白的称为CIITA的蛋白(II类反式激活因子)似乎用作MCHII表达的主控制因子。与其它增强体成员相反,CIITA确实展示组织特异性表达,被IFN-γ上调,并且已显示其被几种细菌和病毒抑制,所述细菌和病毒可引起MHCII类表达的下调(被认为是试图逃避免疫监督的细菌的部分(见LeibundGut-Landmann等(2004)Eur.J.Immunol34:1513-1525))。
I或II类基因的调控可在一些肿瘤存在的情况下被破坏,并且此类破坏可对患者的预后具有后果。例如,在一些实施方案中,发现观察到的Tap1、Tap2和HLAI类抗原的减少在转移性黑素瘤中比在原发性肿瘤中更常见(P<0.05)(见,Kagashita等(1999)AmJourofPathol154(3):745-754)。
在人中,对几种疾病的易感性被怀疑与HLA单体型密切相关。这些疾病包括阿狄森氏病、强直性脊柱炎、白塞氏病、伯格氏病、乳糜泻、慢性活动性肝炎、格雷夫斯病、幼年型类风湿关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征和红斑狼疮等。
HLA还在移植排斥中起主要作用。移植排斥的急性期可在约1-3周内发生并且通常包括因宿主系统对供体I类和II类HLA分子的敏化而产生的宿主T淋巴细胞对供体组织的作用。在大多数情况下,触发抗原是I类HLA。为了获得最佳的成功,针对HLA对供体进行分型并尽可能完全地将其与患者受者匹配。但即使在家庭成员(其可共享高百分比的HLA同一性)之间捐赠,通常仍然是不成功的。因此,为了保护受者内的移植组织,患者常常必须经受深度的免疫抑制治疗,以防止排斥。这种治疗可导致因患者可能难以克服的机会致病菌感染而引起的并发症和显著的病态。
细胞疗法是其中将特定类型的细胞(例如,对肿瘤抗原具有反应性的T细胞或B细胞)施予受者的特化类型的移植。细胞疗法可利用为自体的(来源于受者的)或同种异体的(来源于供体的)细胞来进行,并且所述细胞可以是是未成熟细胞诸如干细胞,或完全成熟的功能性细胞诸如T细胞。事实上,在某些疾病如某些癌症中,可离体操作T细胞来增强它们对某些肿瘤抗原的亲合力,扩增其,随后将其引入患有该癌症类型的患者以试图根除肿瘤。当内源性T细胞应答被肿瘤本身抑制时,这是特别有用的。然而,正如适用于关于排斥的更加众所周知的实体器官移植一样,同样的警告适用于细胞疗法。供体T细胞表达I类HLA抗原,并因此而能够引发来自受者的内源免疫系统的排斥应答。
美国专利公布第2012/0060230号描述了经典HLA基因诸如HLA-A、HLA-B、HLA-C的特异性锌指蛋白调节剂。这些调节剂可用于产生不表达一种或多种经典HLA基因的细胞(例如,干细胞),并因此可用于自体移植物。然而,经典HLA表达的丢失可使经遗传修饰的细胞能够成为基于KIR的配体的丢失的天然杀伤(NK)细胞介导的细胞毒性的靶。参见,例如,Parham等(2005)NatRevImmunol.5(3):201-214。
因此,仍然需要对用于开发缺乏一些或所有经典HLA表达但细胞不被NK靶向而裂解的细胞的组合物和方法。
概述
本文中公开了用于修饰HLA表达的方法和组合物。具体地,本文中提供了用于调节HLA基因的表达以治疗HLA相关病症,例如与个体的HLA单体型相关的人病症的方法和组合物。另外,本文中提供了用于删除(灭活)或抑制HLA基因以产生HLA无效的细胞、细胞碎片(例如,血小板)、组织或完整生物,例如不表达一种或多种经典HLA基因的细胞的方法和组合物。另外,这些方法和组合物可用于产生仅对于正好一个经典HLA基因,或不止一个经典HLA基因无效的,或对于所有经典HLA基因完全无效的的癌细胞、细胞碎片、组织或生物体。在某些实施方案中,经典HLA无效细胞或组织是对于在移植中的使用是有利的人细胞或组织。
因此,在一个方面,本文中描述了其中一种或多种经典HLA基因被灭活并且其中一种或多种非经典HLA蛋白(例如,HLA-E、HLA-F、HLA-G)存在于细胞内的细胞。非经典I类HLA分子可由内源基因表达(过表达),可被添加至细胞和/或可通过细胞铁遗传修饰来表达(例如,表达一种或多种非经典HLA分子的多核苷酸的稳定或瞬时转染)。在某些实施方案中,非经典HLA分子包含HLA-E和/或HLA-G。
经修饰的细胞何以是淋巴样细胞(例如,天然杀伤(NK)细胞、T细胞、B细胞)、髓样细胞(例如,单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、嗜碱粒细胞、肥大细胞);干细胞(例如,诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(例如,人ES)、间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)或神经元干细胞)或其碎片(例如,血小板)。干细胞可以全能或多能的(例如,部分分化的,诸如为多能髓细胞样或淋巴样干细胞HSC)。在一些实施方案中,其中不止一个经典HLA基因的表达已被改变的,一种或多种非经经典HLA的表达也被改变的经修饰的细胞。在其它实施方案中,本发明提供了用于产生具有一种或多种或全部经典HLA基因的无效表型的干细胞的方法。随后可将本文中描述的任何经修饰的干细胞(在HLA基因座上经修饰)分化以产生为本文中描述的干细胞后代的分化的(体内或体外)细胞。
在其它实施方案中,本文中描述了减少缺乏一种或多种经典HLA基因(例如,通过一种或多种基因的核酸酶介导的灭活)的细胞的天然杀伤(NK)细胞裂解的方法,所述方法包括提供如本文所述的细胞(例如,其中经典HLA基因被灭活并且其中一种或多种非经典HLA分子存在的细胞),从而减少NK介导的细胞裂解。
在另一个方面,本文中所述组合物(经修饰的细胞)和方法可用于例如治疗或预防或改善任何HLA相关病症(即,与HLA单体型相关的)。所述方法通常包括(a)使用核酸酶(例如,ZFN或TALEN)或具有工程化crRNA/tracrRNA的核酸酶体系诸如CRISPR/Cas裂解分离的细胞(例如,T细胞或淋巴细胞)中的内源HLA基因或HLA调控基因,以便HLA或HLA调控基因被灭活;(b)将非经典HLA分子引入细胞;和(c)将所述细胞引入受试者,从而治疗或预防HLA相关病症。在某些实施方案中,所述HLA相关病症是移植物抗宿主病(GVHD)。可将核酸酶作为mRNA、以蛋白质形式和/或作为编码核酸酶的DNA序列引入。同样地,可将非经典HLA分子(例如,HLA-E和/或HLA-G)作为mRNA、以蛋白质形式和/或作为编码核酸酶的DNA序列引入。在某些实施方案中,被引入受试者的分离的细胞还包含另外的基因组修饰,例如整合的外源序列(至裂解的HLA或HLA调控基因或不同的基因,例如安全港基因)和/或另外的基因诸如一种或多种TCR基因的灭活(例如,核酸酶介导的)。可通过载体(例如Ad、AAV、LV)或通过使用技术诸如电穿孔引入外源序列。在一些方面,所述组合物可包含分离的细胞碎片和/或分化的(部分或完全地)细胞。
还提供了包含如本文中所述的经修饰的细胞(例如,具有灭活的经典HLA基因并且表达非经典HLA基因的干细胞)的药物组合物。在某些实施方案中,所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。此类药物组合物可被预防性或治疗性使用,并且可包含iPSC、hES、MSC、HSC或其组合和/或衍生物。在其它实施方案中,提供了细胞、细胞片段(例如,血小板)或来源于此类经修饰的干细胞的组织,以便必要时在HLA基因座中修饰此类组织。在一些方面,此类细胞被部分分化(例如造血干细胞)然而在其它方面提供了完全分化的细胞(例如淋巴细胞或巨核细胞),然而在其它方面,提供了分化的细胞的碎片。在其它实施方案中,提供了可含有改变的HLA或HLA调控基因的它们的分化的后代,并且它们还含有另外的遗传修饰,包括在另一个目标基因座上的供体DNA的缺失、改变或插入。
在一些实施方案中,如本文中所述的细胞可以是成熟细胞诸如CD4+T细胞或NK细胞。在一些方面,所述成熟细胞可用于所有细胞疗法,例如用于T细胞移植。在其它实施方案中,用于T细胞移植的细胞含有另一个目标基因修饰。在一个方面,所述T细胞含有插入的对于癌症标志物是特异的嵌合抗原受体(CAR)。在其它方面,所述插入的CAR对于B细胞恶性肿瘤的CD19标志物特征是特异的。此类细胞可用于用于治疗患者而不必匹配HLA的治疗性组合物,并且因此能够用作用于有此需要的任何患者的“下架”治疗剂。在一些方面,提供了其中编码T细胞受体(TCR)基因(例如,TCRα和/或TCRβ链)的基因已被操作或其中编码具有所需的特异性和亲和力的TCR链的基因已被引入的细胞。在其它实施方案中,HLA经修饰的血小板被提供来治疗性用于治疗病症诸如血小板减少症或其它出血障碍。
可在体外、体内和/或活体外实践本文中所述的任何方法。在某些实施方案中,活体外实践所述方法例如以修饰干细胞、T细胞或NK细胞,随后用于治疗有此需要的受试者。
总体上根据公开内容,这些和其它方面将对技术人员显而易见。
附图简述
图1,图框A和B,显示通过SurveyorTM核酸酶测定评估的HLA-A3(图1A)和HLA-A2(图1B)的基因破坏的水平。较低(快速移动)的条带(箭头)是指示ZFN介导的基因修饰的消化产物。条带底部的数字表示基于光密度测定法的的经修饰的HLA-A等位基因的百分比。来自模拟转染的细胞和利用GFP表达载体转染的细胞的DNA用于阴性对照。
图2,图框A和B,显示HLA-AnegHEK293的分离。图2A显示HLA-A2和HLA-A3蛋白表达的丢失。亲代HEK293细胞和3个具有HLA-A丢失的衍生的经遗传修饰的克隆(编号为18.1、8.18、83)上的HLA-A2和HLA-A3表达的流式细胞术分析。点线代表同种型(HLA-A2)或SA-PE(HLA-A3)对照,实线代表无IFN-γ和TNF-α的HLA-A表达,并且填充线代表在用600IU/mL的IFN-γ和10ng/mL的TNF-α培养48小时后HLA-A的表达。亲代栏中的虚线代表EBV-LCL上的HLA-A2或HLA-A3表达。图2B显示HLA经修饰的克隆对CTL介导的裂解的抗性。亲代HEK293和衍生的HLA-Aneg克隆与IFN-γ和TNF-α一起培养48小时,随后用从PANE1(可选地着丝粒蛋白M同种型c)衍生的并且被CTL克隆7A7识别的同源HLA-A3肽RVWDLPGVLK(SEQIDNO:1,也见NP_001103685.1)或从C19ORF48/A2衍生的并且被CTL克隆GAS2B3-5识别的HLA-A2肽CIPPDSLLFPA(SEQIDNO:2,也是NM_199250.1的可选择的开放阅读框架)脉冲,随后在4小时的51Cr释放测定中以20:1的效应子对靶的比率评价其被CTL克隆的识别。将表达PANE1mHAg(未加载肽的)的HLA-A2+LCL(有阴影线的条块)用作阳性对照。
图3,图框A和B,显示在用ZFN进行的遗传编辑后在原代OKT3繁殖的T细胞上的HLA-A表达的丢失。图3A(顶图框)显示在编码靶向HLA-A2的ZFN-L和ZFN-R的mRNA种类(分别为SBS#18889和SBS#18881,见美国专利公布第20120060230号)电转移后HLA-A2的细胞表面表达的丢失。在分级剂量的编码ZFN-L和ZFN-R的mRNA种类的电转移后4天分析HLA-A2、CD4和CD8的共表达。对碘化丙啶阴性的活细胞群体的流式细胞术数据进行门控。右下象限中的数目表示为HLA-Aneg的CD4和CD8+T的百分比。图3A(底图框)显示增加的“冷激”对HLA-A表达的破坏。在分级剂量的编码ZFN-L和ZFN-R的mRNA种类的电转移后4天收集数据。从ZFN的电转移后第1至3天在30℃培养细胞,随后返回37℃并再培养一天,随后进行分析。图3B显示提高的融合于异二聚体FokI结构域变体的ZFN-L和ZFN-R对HLA-A的破坏效率。将编码ZFN-L和ZFN-R异二聚体FokI突变体靶向HLA-A的EL:KK的mRNA种类电转移至原代T细胞中。在将细胞于37℃培养4天,或在30℃培养3天随后再在37℃培养1天后分析HLA-A2表达。X轴代表CD4和CD8表达,y-轴代表HLA-A2表达。
图4,图框A至C,显示非经典HLA分子的表达保护NK介导的细胞免于裂解。图4A显示从来自健康供体(每一个供体被称为NK-1和NK-2)的两个单独PBMC分离的NK细胞的免疫表型。针对PIneg群体门控显示的流式细胞术数据。数字代表每一个上面的象限的非分比。图4B显示表达HLA-E和/或HLA-G的HLAI类low721.221细胞的遗传修饰。SB转座子/转座酶用于在721.221细胞的3个克隆中同源表达HLA-E和/或HLA-G。每一个数字代表HLA-G、HLA-E或HLA-G和HLA-E两者的百分比表达,如通过流式细胞术检测的。图4C显示由靶向721.221的NK细胞产生的特异性裂解。NK细胞杀伤亲代(HLAI类low)、HLA-E+、HLA-G+和HLA-E+HLA-G+721.221细胞的相对能力。每一栏代表平均值±标准差(SD)*。01<P<0.05,**P<.01;和***P<.001。
图5,图框A至C,显示在利用ZFN的遗传编辑后HLA-Aneg原代T细胞的富集。图5A显示HLA-A2negT-细胞群体的产生。HLA-A2negT细胞通过基于磁珠的选择来富集。显示编码ZFN的mRNA的输入剂量和mRNA的电转移后的3天培养条件(37℃相对30℃)。数字代表CD4和CD8阳性群体内的HLA-A2阴性群体。图5B显示HLA-A2negT细胞的SurveyorTM核酸酶测定。针对HLA-A2表达的丢失富集的T细胞的分析显示通过快速移动条带(箭头)的出现表示的HLA-A2基因座的破坏。图5C显示HLAnegT细胞的测序的结果(SEQIDNO:39至53)。将使用HLA-A2-特异性引物从富集的细胞(2.5μgZFN,EL:KKFokI结构域,30℃处理)产生的PCR产物克隆进TOPO载体(Invitrogen),并且对质粒产物进行测序。野生型序列列于顶上,预期的ZFN结合位点加以下划线。下面显示的是获自ZFN处理的并且被富集的细胞的序列。缺失通过连字符来指示,序列变化以粗体突显。所有18个序列变化均导致经预测阻止蛋白质翻译的框内移码。
图6,图框A至C,显示利用ZFN遗传编辑的原代CD19-特异性CAR+T细胞上的HLA-A表达的丢失。图6A显示编码ZFN的mRNA的电转移对CAR+T细胞中的HLA-A2的破坏。将来自HLA-A2+供体的T细胞电穿孔并繁殖以表达CD19-特异性CAR(CD19RCD28)。用2.5μg的每一种编码HLA-A-特异性ZFN的异二聚化FokI结构域变体(ZFN-L-EL和ZFN-R-KK)的mRNA对这些T细胞进行重新电穿孔。在于30℃培养3天,随后在37℃培养1天后分析HLA-A2表达。通过顺磁性选择进行HLA-A2neg群体的富集。图6B显示HLA-AnegCAR+T逃避由HLA-A2限制的CTL产生的裂解。在于CRA中用作靶之前,用同源肽的系列稀释物脉冲指定的CAR+T细胞的混合物。以20:1的效应子对靶的比率添加对于C19ORF48/A2是特异的CTL克隆GAS2B3-5。图6C显示经ZFN修饰的HLAnegCAR+T细胞维持所需的抗原特异性细胞毒性。使用经遗传修饰以表达人CD19的截短的变体的小鼠T细胞系EL4证明表达CD19RCD28CAR的HLA-AnegT细胞对CD19的重定向特异性。EL4上引入的人CD19的表达是100%。
图7显示人ESC上的HLA-A表达的ZFN介导的消除。利用ZFN和编码抗生素抗性的供体质粒修饰HLAA2+HLA-24+hES亲代细胞系WIBR3。选择具有HLA-A表达的丢失的克隆(5230、5255、5258),将其分化成成纤维细胞。在用600IU/mL的IFN-γ和10ng/mL的TNF-α培养48小时后通过流式细胞术评估衍生的成纤维细胞上的HLA-A2和HLA-A24的表达。亲代图中的虚线代表同种型对照。
详述
本文中公开了用于产生其中一种或多种经典HLA基因被灭活但表达一种或多种非经典HLA基因的细胞的组合物和方法。以该方式靶向修饰的细胞可用作治疗剂,例如,移植物,因为非经典HLA基因的存在减少或消除了HLA无效细胞的NK介导的裂解。另外,可将其它目标基因插入其中HLA基因被操作的细胞中。
因此,本文所述方法和组合物提供了治疗HLA相关病症的方法,并且这些方法和组合物可包含能够调节靶基因的锌指转录因子以及工程化锌指核酸酶。
概述
除非另外指出,所述方法的实践以及本文公开的组合物的制备和使用采用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA和属于本领域技术范围内的相关领域的常规技术。在文献中全面解释了这些技术。见,例如,Sambrook等,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989和第3版,2001;Ausubel等,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NewYork,1987和定期更新;METHODSINENZYMOLOGY系列,AcademicPress,SanDiego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION,第3版,AcademicPress,SanDiego,1998;METHODSINENZYMOLOGY,第304卷,“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编辑),AcademicPress,SanDiego,1999;和METHODSINMOLECULARBIOLOGY,第119卷,“ChromatinProtocols”(P.B.Becker编辑)HumanaPress,Totowa,1999。
定义
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可交换使用并且指呈线性或环状构象并且呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本公开的目的,这些术语不得视为关于聚合物长度的限制。术语可涵盖天然核苷酸的已知类似物以及在碱基、糖和/或磷酸部分(硫代磷酸骨架)中经修饰的核苷酸。一般而言,特定核苷酸的类似物具有相同碱基配对特异性;即,A的类似物将与T碱基配对。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可交换使用并且指氨基酸残基的聚合物。术语还适用于其中一种或多种氨基酸为相应天然存在的氨基酸的化学类似物或经修饰衍生物的氨基酸聚合物。
“结合”指大分子之间(例如蛋白质和核酸之间)的序列特异性、非共价相互作用。并非结合相互作用的所有组成部分均需要有序列特异性(例如,与DNA骨架中的磷酸残基接触),只要总体上相互作用有序列特异性。此类相互作用通常特征在于解离常数(Kd)为10-6M-1或更低。“亲和力”指结合强度:结合亲和力增加与较低的Kd相关联。
“结合蛋白”是能够与另一分子非共价结合的蛋白质。例如,结合蛋白可与DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)结合。在为蛋白质结合蛋白的情况下,其可与自身结合(形成同型二聚体、同型三聚体等)和/或其可与不同蛋白质的一个或多个分子结合。结合蛋白可具有一种以上类型的结合活性。例如,锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白质结合活性。
“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是以序列特异性方式,通过一个或多个锌指结合DNA的蛋白质或较大蛋白质中的结构域,锌指是其结构通过锌离子配位稳定的结合结构域中的氨基酸序列区域。术语锌指DNA结合蛋白常常缩写为锌指蛋白或ZFP。
“TALEDNA结合结构域”或“TALE”是包含一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。重复结构域牵涉于TALE与其同源靶DNA序列的结合中。单个“重复单元”(也称为“重复”)通常长度为33-35个氨基酸并且与天然存在的TALE蛋白中的其它TALE重复序列至少表现出一定的序列同源性。参见,例如,美国专利号8,586,526,通过引用整体并入本文。
例如,可通过工程化天然存在的锌指蛋白的识别螺旋区(改变一种或多种氨基酸)或通过工程化参与DNA结合的氨基酸(重复可变的二残基或RVD区)将锌指和TALEDNA-结合结构域“工程化”为与预定核苷酸序列结合。因此,工程化锌指蛋白或TALE蛋白是非天然存在的蛋白质。工程化锌指蛋白和TALE的方法的非限制性实例为设计和选择。设计的蛋白是在自然界中不存在的蛋白质,其设计/组成主要由合理标准产生。设计的合理标准包括应用取代规则和计算机算法处理保存现有ZFP或TALE设计和结合数据信息的数据库中的信息。见,例如,美国专利第8,586,526、6,140,081、6,453,242和6,534,261号;还见WO98/53058、WO98/53059、WO98/53060、WO02/016536和WO03/016496。
“选定的”锌指蛋白或TALE是在自然界中未发现的蛋白质,其生成主要由经验过程引起,例如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交选择。见例如US5,789,538、US5,925,523、US6,007,988、US6,013,453、US6,200,759、WO95/19431、WO96/06166、WO98/53057、WO98/54311、WO00/27878、WO01/60970、WO01/88197和WO02/099084。
“重组”指两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。为了本公开的目的,“同源重组(HR)”指例如在细胞中通过同源介导修复机制修复双链断裂期间发生的此类交换的特化形式。这个过程需要核苷酸序列同源性,将“供体”分子用于“靶”分子(即,经历双链断裂的分子)的模板修复,并且因为其导致遗传信息从供体转移到靶标,所以不同地称为“非交换型基因转化(non-crossovergeneconversion)”或“短序列基因转化(shorttractgeneconversion)”。不希望受任何特定理论约束,此类转移可涉及在断裂靶标和供体之间形成的异源双链体DNA的错配校正和/或其中供体用于重新合成将成为靶标的一部分的遗传信息的“合成依赖式链退火”和/或相关过程。此类特化HR常常导致靶分子的序列改变,以致供体多核苷酸的部分或全部序列并入靶多核苷酸中。
在本公开的方法中,如本文所述的一种或多种靶向核酸酶在靶序列(例如,细胞染色质)的预定位点产生双链断裂,并且可将与断裂区内的核苷酸序列具有同源性的“供体”多核苷酸引入细胞中。已经证实双链断裂的存在利于供体序列的整合。供体序列可物理整合,或可选地,将供体多核苷酸用作通过同源重组修复断裂的模板,导致与供体中一样,所有或部分核苷酸序列引入细胞染色质中。因此,细胞染色质中的第一序列可改变并且,在某些实施方案中,可转化为供体多核苷酸中存在的序列。因此,术语“置换(replace)”或“置换(replacement)”的使用可理解为表示一个核苷酸序列经另一个置换,(即,在信息意义上置换序列),并不一定需要一个多核苷酸经另一个物理或化学置换。
在本文所述的任何方法中,附加对的锌指蛋白可用于细胞中附加靶位点的附加双链裂解。
在靶向重组和/或置换和/或改变细胞染色质中目标区域内的序列的方法的某些实施方案中,通过与外源“供体”核苷酸序列的同源重组改变染色体序列。如果存在与断裂区域同源的序列,则细胞染色质中双链断裂的存在刺激此类同源重组。
在本文所述任何方法中,第一核苷酸序列(“供体序列”)可含有与目标区域内的基因组序列同源,但是不相同的序列,从而刺激同源重组以将不同序列插入目标区域。因此,在某些实施方案中,与目标区域内的序列同源的供体序列的部分表现出与被置换基因组序列约80-99%(或之间的任何整数)序列同一性。在其它实施方案中,例如如果在100个以上连续碱基对的供体和基因组序列之间仅1个核苷酸不同,则供体和基因组序列之间的同源性高于99%。在某些情况下,供体序列的非同源部分可含有在目标区域内不存在的序列,以致将新序列引入目标区域。在这些情况下,非同源序列两侧通常为与目标区域内的序列同源或相同的50-1,000个碱基对(或之间的任何整数值)或大于1,000的任何数量的碱基对的序列。在其它实施方案中,供体序列与第一序列非同源,并且通过非同源重组机制插入基因组中。
本文所述任何方法均可用于通过靶向整合破坏目标基因表达的供体序列,使细胞中的一个或多个靶序列部分或完全失活。还提供了具有部分或完全失活基因的细胞系。
此外,如本文所述靶向整合的方法也可用于整合一个或多个外源序列。例如,外源性核酸序列可包含一个或多个基因或cDNA分子或任何类型的编码或非编码序列以及一个或多个控制元件(例如,启动子)。另外,外源性核酸序列可产生一种或多种RNA分子(例如,小发夹RNA(shRNA)、抑制RNA(RNAi)、微RNA(miRNA)等)。
“裂解”指DNA分子的共价骨架的断裂。可通过多种方法,包括但不限于酶或化学水解磷酸二酯键引发裂解。单链裂解和双链裂解均有可能,并且双链裂解可由于两个不同单链裂解事件而发生。DNA裂解可导致产生平末端或交错末端。在某些实施方案中,融合多肽用于靶向双链DNA裂解。
“裂解半结构域”是连同第二多肽(相同或不同)一起形成具有裂解活性(优选为双链裂解活性)的复合物的多肽序列。术语“第一和第二裂解半结构域”、“+和-裂解半结构域”和“右侧和左侧裂解半结构域”可交换用于指二聚化的成对裂解半结构域。
“工程化裂解半结构域”是已经修饰以便与另一裂解半结构域(例如,另一工程化裂解半结构域)一起形成专性杂二聚体的裂解半结构域。同样见通过引用整体并入本文的美国专利公布第7,888,121、7,914,796、8,034,598、8,623,618号和美国专利公布2011/0201055号。
术语“序列”指可为DNA或RNA,可为直链、环状或支链并且可为单链或双链的任何长度的核苷酸序列。术语“供体序列”指插入基因组中的核苷酸序列。供体序列可具有任何长度,例如长度介于2和10,000个核苷酸之间(或之间或以上的任何整数值),优选长度介于约100和1,000个核苷酸之间(或之间的任何整数值),更优选长度介于约200和500个核苷酸之间。
“染色质”是包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸(主要为DNA)和蛋白质,包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白。大部分真核细胞染色质呈核小体形式存在,其中核小体核包含与包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个的八聚物缔合的DNA的约150个碱基对;并且接头DNA(根据生物体而言长度可变)在核小体核之间延伸。组蛋白H1的分子通常与接头DNA缔合。为了本公开的目的,术语“染色质”意在涵盖所有类型的原核和真核细胞核蛋白。细胞染色质包括染色体和附加体染色质。
“染色体”是包含细胞的全部或部分基因组的染色质复合物。细胞基因组常常特征在于其核型,这是包含细胞基因组的所有染色体的集合。细胞基因组可包含一条或多条染色体。
“附加体”为复制核酸、核蛋白复合物或包含并非细胞染色体核型的一部分的核酸的其它结构。附加体的实例包括质粒和某些病毒基因组。
“靶位点”或“靶序列”是限定结合分子将与之结合的核酸部分的核酸序列,条件是存在供结合的足够条件。例如,序列5’GAATTC3’是EcoRI重组内切核酸酶的靶位点。
“外源”分子是细胞中通常不存在,但是可通过一种或多种遗传、生物化学或其它方法引入细胞中的分子。相对于细胞的特定发育阶段和环境条件测定“细胞中正常存在”。因此,例如,仅在肌肉胚胎发育期存在的分子相对于成人肌肉细胞为外源分子。类似地,由热休克诱导的分子相对于非热休克细胞为外源分子。例如,外源分子可包含功能形式的功能障碍内源分子或功能障碍形式的正常功能内源分子。
其中,外源分子可为小分子,例如通过组合化学过程生成的小分子,或大分子例如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、以上分子的任何经修饰衍生物或包含以上一种或多种分子的任何复合物。核酸包括DNA和RNA,可为单链或双链;可为直链、支链或环状;并且可具有任何长度。核酸包括能够形成双链体的核酸以及形成三链体的核酸。见,例如,美国专利第5,176,996和5,422,251号。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重构因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基酶、乙酰基转移酶、脱乙酰基酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解螺旋酶。
外源分子可为与内源分子相同类型的分子,例如外源蛋白质或核酸。例如,外源性核酸可包括感染病毒基因组、引入细胞的质粒或附加体或细胞中通常不存在的染色体。将外源分子引入细胞的方法为本领域的技术人员已知并且包括但不限于脂质介导的转移(即,脂质体,包括中性和阳离子性脂质)、电穿孔、直接注入、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。外源分子也可为与内源分子相同类型的分子,但是源自与所述细胞来源不同的物种。例如,人核酸序列可引入最初源自小鼠或仓鼠的细胞系中。
相反,“内源”分子是特定细胞中,在特定环境条件下的特定发育阶段通常存在的分子。例如,内源性核酸可包括染色体、线粒体、叶绿体或其它细胞器的基因组或天然存在的附加体核酸。另外的内源分子可包括蛋白质,例如转录因子和酶。
“融合”分子是其中两个或更多个亚基分子优选共价连接的分子。亚基分子可为相同化学类型的分子,或可为不同化学类型的分子。第一种类型的融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如,ZFP或TALEDNA结合结构域和一个或多个激活结构域之间的融合)和融合核酸(例如,编码如上所述融合蛋白的核酸)。第二种类型的融合分子的实例包括但不限于形成三链体的核酸与多肽之间的融合和小沟结合物与核酸之间的融合。
细胞中融合蛋白的表达可由向细胞递送融合蛋白引起或通过向细胞递送编码融合蛋白的多核苷酸引起,其中转录多核苷酸并且翻译转录物以生成融合蛋白。在细胞中蛋白质的表达中还可牵涉反式剪接、多肽裂解和多肽连接。在本公开其它地方提出了向细胞递送多核苷酸和多肽的方法。
为了本公开的目的,“基因”包括编码基因产物的DNA区域(见下文)以及调控基因产物的生成的所有DNA区域,不论此类调控序列是否与编码和/或转录序列相邻。相应地,基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列(例如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区。
“基因表达”指将基因内所含信息转化为基因产物。基因产物可为基因的直接转录产物(例如,mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其它类型的RNA)或通过翻译mRNA生成的蛋白质。基因产物还包括通过例如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑的过程修饰的RNA和(例如)通过甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、豆蔻酰化和糖基化修饰的蛋白质。
基因表达的“调节”指基因活性的变化。表达的调节可包括但不限于基因激活和基因阻遏。基因组编辑(例如,裂解、改变、失活、随机突变)可用于调节表达。基因失活指与不包括如本文所述的ZFP的细胞相比,基因表达的任何减少。因此,基因失活可为部分或全部。
“目标区域”为细胞染色质的任何区域,例如需要结合外源分子的基因或基因内或相邻的非编码序列。结合可能是为了靶向DNA裂解和/或靶向重组的目的。例如,目标区域可存在于染色体、附加体、细胞器基因组(例如,线粒体、叶绿体)或感染病毒基因组。目标区域可在基因的编码区内、经转录的非编码区例如前导序列、尾随序列或内含子内,或在编码区上游或下游的非转录区内。目标区域长度可小到单个核苷酸对或多达2,000个核苷酸对或任何整数值的核苷酸对。
“真核”细胞包括但不限于真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞(例如,T细胞)。
术语“操作性连接”和“操作性地连接”(或“可操作地连接”)对于两个或更多个组成部分(例如序列元件)的并置可交换使用,其中组成部分排列成以致两个组成部分正常作用并且允许至少一个组成部分可介导对其它组成部分中的至少一个发挥的作用的可能性。举例而言,如果转录调控序列控制编码序列响应于一种或多种转录调控因子的存在或缺乏而转录的水平,则转录调控序列例如启动子与编码序列操作性地连接。转录调控序列通常与编码序列顺式操作性地连接,但不需要与之直接相邻。例如,增强子是与编码序列操作性地连接的转录调控序列,即使它们不连续。
对于融合多肽,术语“操作性地连接”可指每个组成部分在与其它组成部分的连接中,执行与如果不这样连接时相同的功能。例如,对于其中DNA结合结构域(例如,ZFP、TALE)与激活结构域融合的融合多肽,如果在融合多肽中,DNA结合结构域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点,而激活结构域能够上调基因表达,则DNA结合结构域和激活结构域处于操作性连接。对于DNA结合结构域与裂解结构域融合的融合多肽,如果在融合多肽中,DNA结合结构域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点,而裂解结构域能够在靶位点附近裂解DNA,则DNA结合结构域和裂解结构域处于操作性连接。类似地,对于DNA结合结构域与激活或阻遏结构域融合的融合多肽,如果在融合多肽中,DNA结合结构域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点,而激活结构域能够上调基因表达或阻遏结构域能够下调基因表达,则DNA结合结构域和激活或阻遏结构域处于操作性连接。
蛋白质、多肽或核酸的“功能片段”是其序列与全长蛋白质、多肽或核酸不同,但是保持了与全长蛋白质、多肽或核酸相同的功能的蛋白质、多肽或核酸。功能片段可具有比相应天然分子更多、更少或相同数量的残基,和/或可含有一种或多种氨基酸或核苷酸取代。测定核酸功能(例如,编码功能、与另一核酸杂交的能力)的方法在本领域中众所周知。类似地,测定蛋白质功能的方法众所周知。例如,可通过过滤结合、电泳迁移或免疫沉淀测定法测定多肽的DNA结合功能。可通过凝胶电泳测定DNA裂解。见Ausubel等,同上。例如,可通过遗传和生化免疫共沉淀、双杂交测定法或互补作用测定蛋白质与另一种蛋白质相互作用的能力。见,例如,Fields等(1989)Nature340:245-246;美国专利第5,585,245号和PCTWO98/44350。
“载体”能够将基因序列转移到靶细胞中。通常,“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够指导目标基因的表达并且可将基因序列转移到靶细胞中的任何核酸构建体。因此,术语包括克隆和表达媒介物以及整合载体。
“报告基因”或“报告序列”指生成优选不一定在常规测定中易于测量的蛋白质产物的任何序列。适合的报告基因包括但不限于编码介导抗生素抗性(例如,氨苄青霉素(ampicillin)抗性、新霉素(neomycin)抗性、G418抗性、嘌呤霉素(puromycin)抗性)的蛋白质的序列、编码有色或荧光或发光蛋白质(例如,绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶)和介导增强细胞生长和/或基因扩增的蛋白质(例如,二氢叶酸还原酶)的序列。表位标签包括(例如)一个或多个拷贝的FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可检测的氨基酸序列。“表达标签”包括编码可能与所需基因序列可操作地连接以便监测目标基因的表达的报告基因的序列。
DNA结合结构域
本文描述了包含与包含HLA基因或HLA调节剂的任何基因中的靶位点特异性结合的DNA结合结构域的组合物。任何DNA结合结构域均可用于本文公开的组合物和方法中。
在某些实施方案中,DNA结合结构域包含锌指蛋白。优选地,锌指蛋白为非天然存在,因为其经工程化为与所选靶位点结合。见,例如,Beerli等(2002)NatureBiotechnol.20:135-141;Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340;Isalan等(2001)NatureBiotechnol.19:656-660;Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637;Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416;美国专利第6,453,242、6,534,261、6,599,692、6,503,717、6,689,558、7,030,215、6,794,136、7,067,317、7,262,054、7,070,934、7,361,635、7,253,273号;和美国专利公布第2005/0064474、2007/0218528、2005/0267061号,全部通过引用整体并入本文。在某些实施方案中,DNA结合结构域包含美国专利公布第2012/0060230号(通过引用整体并入本文)中公开的锌指蛋白(例如,表1)。
与天然存在的锌指蛋白相比,工程化锌指结合结构域可具有新型的结合特异性。工程化方法包括但不限于合理的设计和各种类型的选择。合理的设计包括(例如)使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库,其中每个三联体或四联体核苷酸序列与锌指的结合特定三联体或四联体序列的一个或多个氨基酸序列缔合。见,例如,美国专利6,453,242和6,534,261,其通过引用整体并入本文。
在美国专利5,789,538、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,410,248、6,140,466、6,200,759和6,242,568以及WO98/37186、WO98/53057、WO00/27878、WO01/88197和GB2,338,237中公开了示例性选择方法,包括噬菌体展示和双杂交体系。另外,例如在美国专利号6,794,136中已描述了锌指结合结构域结合特异性的增强。
另外,如这些和其它参考文献中所公开那样,锌指结构域和/或多指锌指蛋白可使用任何适合的接头序列,包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头连接在一起。对于长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头,同样见美国专利第6,479,626、6,903,185和7,153,949号。本文所述蛋白质可包括在蛋白质的单独锌指之间适合接头的任何组合。另外,例如在美国专利号6,794,136中描述了对于锌指结合结构域的结合特异性的增强。
靶位点的选择、ZFP和设计和构建融合蛋白(和编码融合蛋白的多核苷酸)的方法为本领域的技术人员已知并且在美国专利第6,140,0815、789,538、6,453,242、6,534,261、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,200,759号、WO95/19431、WO96/06166、WO98/53057、WO98/54311、WO00/27878、WO01/60970、WO01/88197、WO02/099084、WO98/53058、WO98/53059、WO98/53060、WO02/016536和WO03/016496中有详细描述。
另外,如这些和其它参考文献中所公开那样,锌指结构域和/或多指锌指蛋白可使用任何适合接头序列,包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头连接在一起。对于长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头,同样见美国专利第6,479,626、6,903,185和7,153,949号。本文所述蛋白质可包括在蛋白质的单独锌指之间适合接头的任何组合。
在某些实施方案中,DNA结合结构域为结合(以序列特异性方式)结合HLA基因或HLA调控基因中的靶位点并且调节HLA的表达的工程化锌指蛋白。ZFP可选择性结合特定的目标单体型。关于美国群体中鉴定的HLA单体型以及根据人种的其频率的论述,见Maiers等(2007)HumanImmunology68:779-788(通过引用并入本文)。
另外,提供了结合功能性HLA调控基因(包括但不限于Tap1、Tap2、Tapascin、CTFIIA,和RFX5)的ZFP。HLA靶位点通常包括至少一个锌指但可包括多个锌指(例如,2、3、4、5、6或更多个指)。通常地,ZFP包括至少3个指。某些ZFP包括4、5或6指。包括3指的ZFP通常识别包括9或10个核苷酸的靶位点;包括4指的ZFP通常识别包括12至14个核苷酸的靶位点;而具有6指的ZFP可识别包括18至21个核苷酸的靶位点。ZFP还可以是融合蛋白,其包括一个或多个调控结构域,所述结构域可以是转录激活或阻遏结构域。
ZFP的特定实例公开于美国专利公布第20120060230号中的表1中。
在一些实施方案中,DNA结合结构域可源自核酸酶。例如,已知归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的识别序列,例如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。还见美国专利第5,420,032号、美国专利第6,833,252号;Belfort等(1997)NucleicAcidsRes.25:3379–3388;Dujon等(1989)Gene82:115–118;Perler等(1994)NucleicAcidsRes.22,1125–1127;Jasin(1996)TrendsGenet.12:224–228;Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263:163–180;Argast等(1998)J.Mol.Biol.280:345–353和NewEnglandBiolabs目录。另外,归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性可经工程化为结合非天然靶位点。见,例如,Chevalier等(2002)Molec.Cell10:895-905;Epinat等(2003)NucleicAcidsRes.31:2952-2962;Ashworth等(2006)Nature441:656-659;Paques等(2007)CurrentGeneTherapy7:49-66;美国专利公布第20070117128号。
在其它实施方案中,DNA结合结构域包含来自与来源于植物病原菌黄单孢菌属(Xanthomonas)(见Boch等,(2009)Science326:1509-1512以及Moscou和Bogdanove,(2009)Science326:1501)和罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)(见Heuer等(2007)AppliedandEnvironmentalMicrobiology73(13):4379-4384);美国专利申请第20110301073和20110145940号)的那些效应子相似的TAL效应子的工程化结构域。已知黄单孢菌属的植物病原菌在重要作物中引起许多疾病。黄单孢菌属的病原性取决于向植物细胞注入25种以上不同效应子蛋白的保守型III分泌(T3S)系统。其中注入的蛋白质为模拟植物转录激活因子并且操纵植物转录组的转录激活因子样效应子(TALE)(见Kay等(2007)Science318:648-651)。这些蛋白质含有DNA结合结构域和转录激活结构域。表征最清楚的TALE之一为来自野油菜黄单胞菌疱病致病变种(Xanthomonascampestgrispv.Vesicatoria)的AvrBs3(见Bonas等(1989)MolGenGenet218:127-136和WO2010079430)。TALE含有串联重复的集中式结构域,每个重复含有对这些蛋白质的DNA结合特异性关键的大约34个氨基酸。另外,其含有核定位序列和酸性转录激活结构域(对于综述,见SchornackS等(2006)JPlantPhysiol163(3):256-272)。另外,在植物病原细菌青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)中,已经发现在青枯病菌(R.solanacearum)生物变种1菌株GMI1000和生物变种4菌株RS1000中称为brg11和hpx17的两个基因与黄单孢菌属的AvrBs3家族同源(见Heuer等(2007)ApplandEnvirMicro73(13):4379-4384)。这些基因在核苷酸序列上98.9%彼此相同,但是不同之处在于hpx17的重复结构域中缺失1,575bp。然而,两种基因产物与黄单孢菌属的AvrBs3家族蛋白具有低于40%的序列同一性。
另外,如这些和其它参考文献中公开的,可使用任何合适的接头序列,包括例如在长度上具有5或更多个氨基酸的的接头来将锌指结构域和/或多指化锌指蛋白或TALE连接在一起。关于例如长度为6或更多个氨基酸的示例性接头,也见,美国专利第6,479,626、6,903,185和7,153,949号。本文所述蛋白质可包括蛋白质的单独锌指之间的合适的接头的任意组合。另外,对于锌指结合结构域的结合特异性的增强已描述于例如美国专利第6,794,136号中。
融合蛋白
还提供了包含如本文所述的DNA结合蛋白(例如,ZFP或TALE)和异源调控(功能)结构域(或其功能片段)的融合蛋白。常见结构域包括(例如)转录因子结构域(激活因子、阻遏因子、辅助激活因子、辅助阻遏因子)、沉默子、致癌基因(例如,myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mos家族成员等);DNA修复酶及其相关因子和修饰因子;DNA重排酶及其相关因子和修饰因子;染色质相关蛋白及其修饰因子(例如,激酶、乙酰基转移酶和脱乙酰基酶);和DNA修饰酶(例如,甲基转移酶、拓扑异构酶、解螺旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、内切核酸酶)及其相关因子和修饰因子。关于DNA结合结构域和核酸酶裂解结构域融合的详情,见美国专利申请公布第20050064474、20060188987和2007/0218528号,其通过引用整体并入本文。
用于实现激活的适合结构域包括HSVVP16激活结构域(见,例如Hagmann等,J.Virol.71,5952-5962(1997))核激素受体(见,例如Torchia等,Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-383(1998));核因子κB的p65亚基(Bitko和Barik,J.Virol.72:5610-5618(1998)及Doyle和Hunt,Neuroreport8:2937-2942(1997));Liu等,CancerGeneTher.5:3-28(1998))或人工嵌合功能结构域例如VP64(Beerli等,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:14623-33)和降解决定子(Molinari等,(1999)EMBOJ.18,6439-6447)。另外的示例性激活结构域包括Oct1、Oct-2A、Sp1、AP-2和CTF1(Seipel等,EMBOJ.11,4961-4968(1992)以及p300、CBP、PCAF、SRC1PvALF、AtHD2A和ERF-2。见,例如,Robyr等(2000)Mol.Endocrinol.14:329-347;Collingwood等(1999)J.Mol.Endocrinol.23:255-275;Leo等(2000)Gene245:1-11;Manteuffel-Cymborowska(1999)ActaBiochim.Pol.46:77-89;McKenna等(1999)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.69:3-12;Malik等(2000)TrendsBiochem.Sci.25:277-283;和Lemon等(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504。另外的示例性激活结构域包括但不限于OsGAI、HALF-1、C1、AP1、ARF-5、-6、-7、和-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1。见,例如,Ogawa等(2000)Gene245:21-29;Okanami等(1996)GenesCells1:87-99;Goff等(1991)GenesDev.5:298-309;Cho等(1999)PlantMol.Biol.40:419-429;Ulmason等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:5844-5849;Sprenger-Haussels等(2000)PlantJ.22:1-8;Gong等(1999)PlantMol.Biol.41:33-44;和Hobo等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:15,348-15,353。
对于本领域的技术人员而言,明确的是在DNA结合结构域和功能结构域之间的融合蛋白(或编码融合蛋白的核酸)的形成中,激活结构域或与激活结构域相互作用的分子适合作为功能结构域。基本上能够为靶基因募集激活复合物和/或激活活性(例如,组蛋白乙酰化)的任何分子均可用作融合蛋白的激活结构域。例如在美国专利申请2002/0115215和2003/0082552及WO02/44376中描述了适合用作融合分子中的功能结构域的绝缘子结构域、定位结构域和染色质重构蛋白例如含ISWI的结构域和/或甲基结合结构域蛋白。
示例性阻遏结构域包括但不限于KRABA/B、KOX、TGF-β-诱导型早期基因(TIEG)、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMT家族成员(例如,DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb和MeCP2。见,例如,Bird等(1999)Cell99:451-454;Tyler等(1999)Cell99:443-446;Knoepfler等(1999)Cell99:447-450;和Robertson等(2000)NatureGenet.25:338-342。另外的示例性阻遏结构域包括但不限于ROM2和AtHD2A。见,例如,Chem等(1996)PlantCell8:305-321;和Wu等(2000)PlantJ.22:19-27。
通过本领域技术人员众所周知的克隆和生物化学偶联方法构建融合分子。融合分子包含DNA结合结构域和功能结构域(例如,转录激活或阻遏结构域)。融合分子还任选包含核定位信号(例如,来自SV40基质T抗原)和表位标签(例如,FLAG和血细胞凝集素)。设计融合蛋白(和编码融合蛋白的核酸),以便将翻译阅读框保存在融合组成部分中。
通过本领域技术人员众所周知的生物化学偶联方法构建一只手上功能结构域(或其功能片段)的多肽组成部分与另一只手上非蛋白DNA结合结构域(例如,抗生素、嵌入剂、小沟结合剂、核酸)之间的融合。见,例如,PierceChemicalCompany(Rockford,IL)目录。已经描述了用于在小沟结合剂与多肽之间产生融合的方法和组合物。Mapp等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:3930-3935。
在某些实施方案中,由锌指蛋白结合的靶位点存在于细胞染色质的可达区域。例如,可如美国专利第7,217,509和7,923,542号中所述测定可达区域。如果靶位点不存在于细胞染色质的可达区域,可如美国专利第7,785,792和8,071,370号中所述生成一个或多个可达区域。在另外的实施方案中,融合分子的DNA结合结构域能够与细胞染色质结合,不管其靶位点是否在可达区域内。例如,此类DNA结合结构域能够与接头DNA和/或核小体DNA结合。在某些类固醇受体和肝细胞核因子3(HNF3)中发现这类“先锋”DNA结合结构域的实例。Cordingley等(1987)Cell48:261-270;Pina等(1990)Cell60:719-731;和Cirillo等(1998)EMBOJ.17:244-254。
如本领域的技术人员所知,融合分子可与药学上可接受的载体配制。见,例如,Remington'sPharmaceuticalSciences,第17版,1985;和美国专利第6,453,242和6,534,261号。
融合分子的功能组成部分/结构域可选自一旦融合分子经由其DNA结合结构域与靶序列结合,就能够影响基因转录的多种不同组成部分。因此,功能组成部分可包括但不限于各种转录因子结构域,例如激活因子、阻遏因子、辅助激活因子、辅助阻遏因子和沉默子。
例如,在美国专利第6,534,261和6,933,113号中公开了另外的示例性功能结构域。
也可选择受外源小分子或配体调控的功能结构域。例如,可采用技术,其中功能结构域只有在外部RheoChemTM配体的存在下呈现其活性构象(见例如US20090136465)。因此,ZFP可与可调控的功能结构域可操作地连接,其中所产生的ZFP-TF活性受外部配体控制。
核酸酶
在某些实施方案中,融合蛋白包含DNA结合结构域和裂解(核酸酶)结构域。同样,可使用核酸酶,例如工程化核酸酶实现基因修饰。工程化核酸酶技术基于天然存在的DNA结合蛋白的工程化。例如,已经描述了具有定制DNA结合特异性的归巢内勤核酸酶的工程化。(Chames等(2005)NucleicAcidsRes33(20):e178;Arnould等(2006)J.Mol.Biol.355:443-458)。另外,还已经描述了ZFP的工程化。见,例如,美国专利第6,534,261、6,607,882、6,824,978、6,979,539、6,933,113、7,163,824和7,013,219号。
另外,ZFP和/或TALE已经与核酸酶结构域融合以产生能够通过其经工程化的(ZFP或TALE)DNA结合结构域识别其预期核酸靶标并经由核酸酶活性引起在DNA结合位点附近裂解DNA的ZFN和TALEN-功能实体。见,例如,Kim等(1996)ProcNat'lAcadSciUSA93(3):1156-1160。最近,此类核酸酶已经用于多种生物中的基因组修饰。见,例如,美国专利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060188987、20060063231和国际公布WO07/014275。
因此,本文所述的方法和组合物广泛适用并且可能牵涉任何目标核酸酶。核酸酶的非限制性实例包括大范围核酸酶、TALEN和锌指核酸酶。核酸酶可能包含异源DNA结合和裂解结构域(例如,锌指核酸酶;大范围核酸酶DNA结合结构域与异源裂解结构域),或可选地,天然存在的核酸酶的DNA结合结构域可改变为与所选靶位点结合(例如,已经工程化为与不同于同源结合位点的位点结合的大范围核酸酶)。
在本文所述的任何核酸酶中,所述核酸酶可包含工程化TALEDNA结合结构域和核酸酶结构域(例如,内切核酸酶和/或大范围核酸酶结构域),也称为TALEN。用于工程化这些TALEN蛋白以与用户选择的靶序列发生强劲的位点特异性相互作用的组合物已被公布(见,美国专利第8,586,526号)。在一些实施方案中,所述TALEN包含内切核酸酶(例如,FokI)裂解结构域或裂解半结构域。在其它实施方案中,所述TALE核酸酶是大范围TAL。这些大范围TAL核酸酶是包含TALEDNA结构值勤玫大范围核酸酶裂解结构域的融合蛋白。大范围核酸酶裂解结构域作为单体是有活性的并且不需要二聚化俨产生活性。(见Boissel等,(2013)NuclAcidRes:1-13,doi:10.1093/nar/gkt1224)。另外,核酸酶结构域还可展示DNA结合功能性。
在另外的实施方案中,所述核酸酶包含紧凑型TALEN(cTALEN)。这些核酸酶是将TALEDNA结合域连接于TevI核酸酶结构域的单链融合蛋白。所述融合蛋白可用作通过TALE区域定位的切口酶,或可产生双链断裂,这取决于其中TALEDNA结合结构域相对于TevI核酸酶结构域的定位(见,Beurdeley等(2013)NatComm:1-8DOI:10.1038/ncomms2782)。可将任何TALEN与另外的TALEN(例如,一种或多种具有一个或多个mega-TAL的TALEN(cTALEN或FokI-TALEN))或其它DNA裂解酶组合使用。
在某些实施方案中,核酸酶包含大范围核酸酶(归巢内切核酸酶)或展示裂解活性的其部分。天然存在的大范围核酸酶识别15-40个碱基对裂解位点并且常分为4个家族:LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst盒家族和HNH家族。示例性归巢内切核酸酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。其识别序列已知。同样见美国专利第5,420,032号;美国专利第6,833,252号;Belfort等(1997)NucleicAcidsRes.25:3379–3388;Dujon等(1989)Gene82:115–118;Perler等(1994)NucleicAcidsRes.22,1125–1127;Jasin(1996)TrendsGenet.12:224–228;Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263:163–180;Argast等(1998)J.Mol.Biol.280:345–353和NewEnglandBiolabs目录。
来自主要来自LAGLIDADG家族的天然存在的大范围核酸酶的DNA结合结构域已经用于促进植物、酵母、果蝇属(Drosophila)、哺乳动物细胞和小鼠中的位点特异性基因组修饰,但是这种方法已限于保存大范围核酸酶识别序列的同源基因的修饰(Monet等(1999),Biochem.Biophysics.Res.Common.255:88-93)或已经向其中引入了识别序列的预工程化基因组(Route等(1994),Mol.Cell.Biol.14:8096-106;Chilton等(2003)PlantPhysiology.133:956-65;Puchta等(1996),Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:5055-60;Rong等(2002),GenesDev.16:1568-81;Gouble等(2006),J.GeneMed.8(5):616-622)。相应地,已经尝试在医学或生物技术相关位点工程化大范围核酸酶以表现出新型结合特异性(Porteus等(2005),Nat.Biotechnol.23:967-73;Sussman等(2004),J.Mol.Biol.342:31-41;Epinat等(2003),NucleicAcidsRes.31:2952-62;Chevalier等(2002)Molec.Cell10:895-905;Epinat等(2003)NucleicAcidsRes.31:2952-2962;Ashworth等(2006)Nature441:656-659;Paques等(2007)CurrentGeneTherapy7:49-66;美国专利公布第20070117128、20060206949、20060153826、20060078552和20040002092号)。另外,来自大范围核酸酶的非天然存在或经工程化的DNA结合结构域也已经与来自异源核酸酶(例如,FokI)的裂解结构域可操作地连接和/或来自大范围核酸酶的裂解结构域可与异源DNA结合结构域(例如,ZFP或TALE)可操作地连接。
在其它实施方案中,核酸酶为锌指核酸酶(ZFN)或TALEDNA结合结构域-核酸酶融合物(TALEN)。ZFN和TALEN包含已经工程化为与所选基因中的靶位点和裂解结构域或裂解半结构域结合(例如,来自如本文所述的限制性和/或大范围核酸酶)的DNA结合结构域(锌指蛋白或TALEDNA结合结构域)。
如以上所详细描述,锌指结合结构域和TALEDNA结合结构域可经工程化为与所选序列结合。见,例如,Beerli等(2002)NatureBiotechnol.20:135-141;Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340;Isalan等(2001)NatureBiotechnol.19:656-660;Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637;Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416。与天然存在的蛋白相比,工程化锌指结合结构域或TALE蛋白可具有新型结合特异性。工程化方法包括但不限于合理的设计和各种类型的选择。合理的设计包括(例如)使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单独锌指或TALE氨基酸序列的数据库,其中每个三联体或四联体核苷酸序列与锌指或TALE重复单位的结合特定三联体或四联体序列的一个或多个氨基酸序列缔合。见,例如,美国专利6,453,242和6,534,261,其通过引用整体并入本文。
靶位点的选择;和用于融合蛋白(和编码其的多核苷酸)的设计和构建对于本领域普通技术人员来说是已知的并且描述于美国专利第7,888,121和8,409,861号(通过引用整体并入本文)中。
另外,如这些和其它参考文献中所公开那样,锌指结构域、TALE和/或多指锌指蛋白可使用任何适合的接头序列,包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头(例如,TGEKP(SEQIDNO:3)、TGGQRP(SEQIDNO:4)、TGQKP(SEQIDNO:5)和/或TGSQKP(SEQIDNO:6))连接在一起。对于长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头,见例如美国专利第6,479,626、6,903,185和7,153,949号。本文所述蛋白质可包括在蛋白质的单独锌指之间适合接头的任何组合。同样见,美国临时专利申请第61/343,729号。
因此,核酸酶例如ZFN、TALEN和/或大范围核酸酶可包含任何DNA结合结构域和任何核酸酶(裂解)结构域(裂解结构域、裂解半结构域)。如上所述,裂解结构域可能与DNA结合结构域异源,例如锌指或TAL效应子DNA结合结构域和来自核酸酶的裂解结构域,或大范围核酸酶DNA结合结构域和来自不同核酸酶的裂解结构域。异源裂解结构域可从内切核酸酶或外切核酸酶获得。可从中得到裂解结构域的示例性内切核酸酶包括但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。见,例如,2002-2003目录,NewEnglandBiolabs,Beverly,MA;和Belfort等(1997)NucleicAcidsRes.25:3379-3388。已知另外的裂解DNA的酶(例如,S1核酸酶;绿豆核酸酶;胰腺DNA酶I;微球菌核酸酶;酵母HO内切核酸酶;同样见Linn等(编辑)Nucleases,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1993)。这些酶中的一种或多种(或其功能片段)可用作裂解结构域和裂解半结构域的来源。
类似地,裂解半结构域可源自正如上面提出的对于裂解活性需要二聚化的任何核酸酶或其部分。一般而言,如果融合蛋白包含裂解半结构域,则裂解需要两个融合蛋白。可选地,可使用包含两个裂解半结构域的单一蛋白质。所述两个裂解半结构域可源自相同内切核酸酶(或其功能片段),或每个裂解半结构域可源自不同内切核酸酶(或其功能片段)。另外,两个融合蛋白的靶位点优选相对于彼此布置,以致两个融合蛋白与其各自靶位点的结合使裂解半结构域处于允许(例如)通过二聚化使裂解半结构域形成功能裂解结构域的相互空间定位。因此,在某些实施方案中,靶位点的近边间隔5-8个核苷酸或15-18个核苷酸。然而,任何整数数量的核苷酸或核苷酸对可插入两个靶位点之间(例如,2至50个核苷酸对或更多)。一般而言,裂解位点位于靶位点之间。
限制性内切核酸酶(限制酶)存在于许多物种中并且能够与DNA进行序列特异性结合(在识别位点),并在结合位点或附近裂解DNA。某些限制酶(例如IIS型)在从识别位点移出的位点处裂解DNA并且具有可分离的结合和裂解结构域。例如,IIS型酶FokI在从一条链上的识别位点开始9个核苷酸处和从另一条链上的识别位点开始13个核苷酸处催化DNA的双链裂解。见,例如,美国专利5,356,802、5,436,150和5,487,994;以及Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279;Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768;Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887;Kim等(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此,在一个实施方案中,融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制酶的裂解结构域(或裂解半结构域)和可能或可能未经工程化的一种或多种锌指结合结构域。
裂解结构域可与结合结构域分离的示例性IIS型限制酶为FokI。这种特殊的酶呈二聚体时有活性。Bitinaite等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。相应地,为了本公开的目的,将FokI酶用于公开的融合蛋白中的部分视为裂解半结构域。因此,为了使用锌指-FokI融合进行靶向双链裂解和/或靶向置换细胞序列,各包含FokI裂解半结构域的两种融合蛋白可用于重新组成有催化活性的裂解结构域。可选地,也可使用含有锌指结合结构域和两个FokI裂解半结构域的单一多肽分子。在本公开的其它地方提供了使用锌指-FokI融合进行靶向裂解和靶向序列改变的参数。
裂解结构域或裂解半结构域可为保持裂解活性,或保持多聚化(例如,二聚化)以形成功能裂解结构域的能力的蛋白质的任何部分。
在整体并入本文的国际公布WO07/014275中描述了示例性IIS型限制酶。另外的限制酶还含有可分离的结合和裂解结构域,并且这些为本公开所涵盖。见,例如,Roberts等(2003)NucleicAcidsRes.31:418-420。
在某些实施方案中,例如美国专利第7,914,796、8,034,598和8,623,618号;和美国专利公布第20110201055号中所述,裂解结构域包含最小化或防止均二聚的一个或多个工程化裂解半结构域(也称为二聚化结构域突变体),其全部内容通过引用整体并入本文。FokI的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538的氨基酸残基全部为影响FokI裂解半结构域二聚化的靶标。
形成专性杂二聚体的FokI的示例性工程化裂解半结构域包括一对,其中第一裂解半结构域包括在FokI的位置490和538的氨基酸残基处的突变而第二裂解半结构域包括在氨基酸残基486和499处的突变。
因此,在一个实施方案中,490处的突变以Lys(K)置换Glu(E);538处的突变以Lys(K)置换Iso(I);486处的突变以Glu(E)置换Gln(Q);并且位置499处的突变以Lys(K)置换Iso(I)。具体地,通过使一个裂解半结构域中的位置490(E→K)和538(I→K)突变以生成命名为“E490K:I538K”的工程化裂解半结构域并且通过使另一裂解半结构域中的位置486(Q→E)和499(I→L)突变以生成命名为“Q486E:I499L”的工程化裂解半结构域制备本文所述的工程化裂解半结构域。本文所述的工程化裂解半结构域为其中异常裂解减到最少或消除的专性杂二聚体突变体。见,例如,美国专利公布第2008/0131962号,出于种种目的,其公开内容通过引用整体并入。在某些实施方案中,工程化裂解半结构域包含位置486、499和496(相对于野生型FokI编号)处的突变,例如以Glu(E)残基置换位置486处的野生型Gln(Q)残基,以Leu(L)残基置换位置499处的野生型Iso(I)残基和以Asp(D)或Glu(E)残基置换位置496处的野生型Asn(N)残基的突变(也分别称为“ELD”和“ELE”结构域)。在其它实施方案中,工程化裂解半结构域包含位置490、538和537(相对于野生型FokI编号)处的突变,例如以Lys(K)残基置换位置490处的野生型Glu(E)残基,以Lys(K)残基置换位置538处的野生型Iso(I)残基和以Lys(K)残基或Arg(R)残基置换位置537处的野生型His(H)残基的突变(也分别称为“KKK”和“KKR”结构域)。在其它实施方案中,工程化裂解半结构域包含位置490和537(相对于野生型FokI编号)处的突变,例如以Lys(K)残基置换位置490处的野生型Glu(E)残基和以Lys(K)残基或Arg(R)残基置换位置537处的野生型His(H)残基的突变(也分别称为“KIK”和“KIR”结构域)。(见美国专利公布第20110201055号)。
可使用任何适合方法,例如如美国专利第7,914,796、8,034,598和8,623,618号;和美国专利公布第20110201055号中所述,通过定点诱变野生型裂解半结构域(FokI)制备本文所述的工程化裂解半结构域。
可选地,可使用所称的“裂解酶”技术,在体内在核酸靶位点处组装核酸酶(见例如美国专利公布第20090068164号)。此类裂解酶的组成部分可在任一单独表达构建体上表达,或者可连接在一开放阅读框中,其中例如通过自我裂解2A肽或IRES序列将单独组成部分分隔开。组成部分可为单独锌指结合结构域或大范围核酸酶核酸结合结构域的结构域。
使用之前,例如在如WO2009/042163和20090068164中所述的基于酵母的染色体体系中,可筛选核酸酶(例如,ZFN和/或TALEN)的活性。使用本领域已知的方法可容易地设计核酸酶表达构建体。见,例如,美国专利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060188987、20060063231;和国际公布WO07/014275。核酸酶的表达受组成型启动子或诱导型启动子,例如在棉子糖和/或半乳糖的存在下激活(去阻遏)而在葡萄糖的存在下阻遏的半乳糖激酶启动子的控制。
在某些实施方案中,核酸酶包含CRISPR/Cas体系。CRISPR(成簇的规律性间隔的短回文重复序列)基因座(其编码所述体生活经验的RNA组分)和cas(CRISPR-结合的)基因座(其编码蛋白质(Jansen等,2002.Mol.Microbiol.43:1565-1575;Makarova等,2002.NucleicAcidsRes.30:482-496;Makarova等,2006.Biol.Direct1:7;Haft等,2005.PLoSComput.Biol.1:e60))组成CRISPR/Cas核酸酶体系的基因序列。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR-结合的(Cas)基因以及能够对CRISPR介导的核酸裂解的特异性编程的非编码RNA元件的组合。
II型CRISPR是最充分表征的体系之一并且在4个连续步骤中进行靶向DNA双链断裂。首先,从CRISPR基因座转录两个非编码RNA、前-crRNA阵列和tracrRNA。第二,tracrRNA与前-crRNA的重复区域杂交,并且介导前-crRNA至含有单个间隔子序列的成熟crRNA的加工。第三,所述成熟的crRNA:tracrRNA复合物通过crRNA上的间隔子与紧接原型间隔序列邻近基序(PAM)的靶DNA上的原型间隔序列之间的沃尔森-克里克碱基配(靶识别的额外要求)对将Cas9导向靶DNA。最后,Cas9介导靶DNA的裂解以在原型间隔序列内产生双链断裂。CRISPR/Cas体系的活性由3个步骤组成:(i)外来DNA序列至CRISPR阵列的插入,以在称为‘适应’的过程中预防将来的攻击,(ii)相关蛋白质的表达,以及阵列的表达和加工,随后(iii)RNA介导的干扰异形核酸。因此,在细菌细胞中,几种所谓的‘Cas’蛋白牵涉CRISPR/Cas体系的天然功能并且在功能诸如外来DNA的插入等中起作用。
在某些实施方案中,Cas蛋白可以是天然存在的Cas蛋白的"功能性衍生物"。天然序列多肽的"功能性衍生物"是具有与天然序列多肽共同的定性生物学性质的化合物。"功能性衍生物"包括,但不限于,天然序列的片段和天然序列多肽的衍生物及其片段,只要它们具有与相应天然序列多肽共同的生物活性。本文中涉及的生物活性是功能性衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语"衍生物"包括多肽的氨基酸序列变体、共价修饰和其融合物。Cas多肽的合适的衍生物或其片段包括,但不限于Cas蛋白或其片段的突变体、融合物、共价修饰。包括Cas蛋白或其片段的Cas蛋白以及Cas蛋白的衍生物或其片段可从细胞获得或化学合成,或通过这两种方法的组合获得。所述细胞可以是天然产生Cas蛋白的细胞,或天然产生Cas蛋白和经遗传工程化以更高表达水平产生内源Cas蛋白或从外源引入的核酸产生Cas蛋白的细胞,所述核酸编码与内源Cas相同或不同的Cas。在一些情况下,所述细胞不天然产生Cas蛋白并且经遗传工程化产生Cas蛋白。
在例如美国临时申请第61/823,689号中公开了靶向HLA和其它基因的示例性CRISPR/Cas核酸酶体系。
递送
可通过任何适合方式,包括(例如)通过注射蛋白和/或mRNA,向靶细胞递送蛋白质(例如,核酸酶和非经典HLA分子)、编码蛋白质的多核苷酸和包含本文所述的蛋白质和/或多核苷酸的组合物。
适合的细胞包括但不限于真核和原核细胞和/或细胞系。此类细胞或由此类细胞产生的细胞系的非限制性实例包括T细胞、COS、CHO(例如,CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如,HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6细胞以及昆虫细胞例如草地贪夜蛾(Spodopterafugiperda)(Sf)或真菌细胞例如酵母属(Saccharomyces),毕赤酵母(Pichia)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces)。在某些实施方案中,细胞系为CHO-K1、MDCK或HEK293细胞系。适合的细胞还包括干细胞,举例而言,例如胚胎干细胞、诱导多能干细胞(iPS细胞)、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。
例如,在美国专利第6,453,242、6,503,717、6,534,261、6,599,692、6,607,882、6,689,558、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219和7,163,824号中描述了递送包含如本文所述的DNA结合结构域的蛋白质的方法,所述专利全部的公开内容通过引用整体并入本文。
还可使用含有编码一种或多种DNA结合蛋白的序列的载体来递送如本文所述的DNA结合结构域和包含这些DNA结合结构域的融合蛋白。另外,还可通过这些载体递送另外的核酸(例如,供体和/或编码非经典HLA蛋白的序列)。可使用任何载体体系,包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等。同样,见,美国专利第6,534,261、6,607,882、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219和7,163,824号,其通过引用整体并入本文。此外,明显的是,任何这些载体可包含一个或多个编码DNA结合蛋白的序列和/或适当时另外的核酸。因此,当向细胞引入一种或多种如本文所述的DNA结合蛋白和适当时另外的DNA时,可在相同载体或不同载体上携带它们。当使用多个载体时,每个载体均可包含编码一个或多个DNA结合蛋白的序列和必需时另外的核酸。
基于病毒和非病毒的常规基因转移方法可用于在细胞(例如,哺乳动物细胞)和靶组织中引入编码工程化DNA结合蛋白的核酸以及必要时共引入另外的核苷酸序列。此类方法也可用于在体外向细胞施用核酸(例如,编码DNA结合蛋白、供体和/或非经典HLA蛋白)。在某些实施方案中,施用核酸用于体内或体外基因治疗用途。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、裸露核酸和与递送媒介物例如脂质体或泊洛沙姆(poloxamer)复合的核酸。病毒载体递送系统包括在递送到细胞后具有附加体或整合基因组的DNA和RNA病毒。对于基因治疗过程的综述,见Anderson,Science256:808-813(1992);Nabel和Felgner,TIBTECH11:211-217(1993);Mitani和Caskey,TIBTECH11:162-166(1993);Dillon,TIBTECH11:167-175(1993);Miller,Nature357:455-460(1992);VanBrunt,Biotechnology6(10):1149-1154(1988);Vigne,RestorativeNeurologyandNeuroscience8:35-36(1995);Kremer和Perricaudet,BritishMedicalBulletin51(1):31-44(1995);Haddada等,在CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology中,Doerfler和(编辑)(1995);和Yu等,GeneTherapy1:13-26(1994)。
核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪法、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、mRNA、人工病毒粒子和试剂增强的DNA摄取。使用(例如)Sonitron2000系统(Rich-Mar)的声致穿孔法也可用于核酸的递送。在一个优选实施方案中,将一种或多种核酸作为mRNA递送。还优选使用加帽的mRNA以增加翻译效率和/或mRNA稳定性。尤其优选ARCA(抗-反向帽类似物)帽或其变体。见美国专利第7,074,596和8,153,773号,其通过引用并入本文。
另外的示例性核酸递送系统包括AmaxaBiosystems(Cologne,Germany)、Maxcyte,Inc.(Rockville,Maryland)、BTXMolecularDeliverySystems(Holliston,MA)和CopernicusTherapeuticsInc.提供的核酸递送系统(见例如US6008336)。例如US5,049,386、US4,946,787和US4,897,355中描述了脂质转染并且脂质转染试剂在市场上有售(例如,TransfectamTM、LipofectinTM和LipofectamineTMRNAiMAX)。适合多核苷酸的有效受体-识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括Felgner(WO91/17424、WO91/16024)的脂质。可向细胞(活体外施用)或靶组织(体内施用)递送。
脂质:核酸复合物,包括靶向脂质体例如免疫脂质复合物的制备为本领域的技术人员众所周知(见,例如,Crystal,Science270:404-410(1995);Blaese等,CancerGeneTher.2:291-297(1995);Behr等,BioconjugateChem.5:382-389(1994);Remy等,BioconjugateChem.5:647-654(1994);Gao等,GeneTherapy2:710-722(1995);Ahmad等,CancerRes.52:4817-4820(1992);美国专利第4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787号)。
另外的递送方法包括利用将待递送核酸包装到EnGeneIC递送媒介物(EDV)中。使用双特异性抗体将这些EDV特异性地递送到靶组织,其中所述抗体的一臂对靶组织具有特异性而另一臂对EDV具有特异性。抗体将EDV带到靶细胞表面,然后通过胞吞作用将EDV带入细胞。一旦进入细胞,就释放内含物(见MacDiarmid等(2009)NatureBiotechnology第27卷(7)第643页)。
使用基于RNA或DNA病毒的系统递送编码工程化DNA结合蛋白、非经典HLA分子和/或所需的其它供体的核酸利用使病毒靶向体内的特定细胞并且将病毒有效载荷运输到核的高度进化过程。病毒载体可直接向患者(体内)施用或其可用于在体外处理细胞并且向患者(在活体外)施用经修饰的细胞。递送核酸的基于病毒的常规系统包括但不限于用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关、牛痘和单纯性疱疹病毒载体。用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法可能整合在宿主基因组中,常常导致插入的转基因长期表达。另外,已经在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
可通过并入外源包膜蛋白,扩增靶细胞的潜在靶群体改变逆转录病毒的向性。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。逆转录病毒基因转移系统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体由包装容量高达6-10kb外源序列的顺式作用长末端重复组成。最小的顺式作用LTR足以复制和包装载体,然后用于将治疗性基因整合到靶细胞中以提供永久性转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于小鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些(见,例如,Buchscher等,J.Virol.66:2731-2739(1992);Johann等,J.Virol.66:1635-1640(1992);Sommerfelt等,Virol.176:58-59(1990);Wilson等,J.Virol.63:2374-2378(1989);Miller等,J.Virol.65:2220-2224(1991);PCT/US94/05700)。
在其中优选瞬时表达的应用中,可使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体在许多细胞类型中能够具有非常高的转导效率并不需要细胞分裂。用此类载体,已经获得高滴度和高水平的表达。在相对简单的系统中可大量生成这种载体。腺相关病毒(“AAV”)载体也用于例如在核酸和肽的体外生成中用核酸转导细胞,并且用于体内和活体外基因治疗过程(见,例如,West等,Virology160:38-47(1987);美国专利第4,797,368号;WO93/24641;Kotin,HumanGeneTherapy5:793-801(1994);Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)。在许多出版物中描述了重组AAV载体的构建,包括美国专利第5,173,414号;Tratschin等,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985);Tratschin等,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984);Hermonat和Muzyczka,PNAS81:6466-6470(1984);和Samulski等,J.Virol.63:03822-3828(1989)。
至少6种病毒载体方法目前可用于临床试验中的基因转移,其利用牵涉由插入辅助细胞系中的基因互补缺陷型载体的方法以生成转导剂。
pLASN和MFG-S为已经用于临时试验的逆转录病毒载体的实例(Dunbar等,Blood85:3048-305(1995);Kohn等,Nat.Med.1:1017-102(1995);Malech等,PNAS94:2212133-12138(1997))。PA317/pLASN为用于基因治疗试验的首例治疗性载体。(Blaese等,Science270:475-480(1995))。对于MFG-S包装载体已经观察到50%或更高的转导效率。(Ellem等,ImmunolImmunother.44(1):10-20(1997);Dranoff等,Hum.GeneTher.1:111-2(1997)。
重组腺相关病毒载体(rAAV)是基于缺陷型和非病原性细小病毒腺相关2型病毒的有前景的可供选择的基因递送系统。所有载体源自仅保留了在转基因表达盒两侧的AAV145bp反向末端重复的质粒。由于整合到转导细胞基因组中的有效基因转移和稳定的转基因递送是这种载体系统的关键特征。(Wagner等,Lancet351:91171702-3(1998),Kearns等,GeneTher.9:748-55(1996))。也可根据本发明使用其它AAV血清型,包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV8.2、AAV9和AAVrh10及假型AAV例如AAV2/8、AAV2/5和AAV2/6。
复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad)可在高滴度下生成并且容易感染许多不同细胞类型。大部分腺病毒载体经工程化,以致转基因置换AdE1a、E1b和/或E3基因;随后使复制缺陷型载体在反式供给缺失基因功能的人293细胞中增殖。Ad载体可在体内转导多种类型的组织,包括非分裂、分化细胞例如存在于肝脏、肾脏和肌肉中的细胞。常规Ad载体承载容量大。临床试验中使用Ad载体的实例包括经肌肉内注射进行抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法(Sterman等,Hum.GeneTher.7:1083-9(1998))。在临床试验中使用腺病毒载体进行基因转移的另外实例包括Rosenecker等,Infection24:15-10(1996);Sterman等,Hum.GeneTher.9:71083-1089(1998);Welsh等,Hum.GeneTher.2:205-18(1995);Alvarez等,Hum.GeneTher.5:597-613(1997);Topf等,GeneTher.5:507-513(1998);Sterman等,Hum.GeneTher.7:1083-1089(1998)。
包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒粒子。此类细胞包括包装腺病毒的293细胞和包装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。通常由将核酸载体包装在病毒粒子中的生产细胞系生成用于基因治疗的病毒载体。所述载体通常含有包装和后续整合到宿主(若适用)所需的最小病毒序列,由编码待表达蛋白质的表达盒置换的其它病毒序列。由包装细胞系反式供给缺少的病毒功能。例如,用于基因治疗的AAV载体通常仅仅具有来自于AAV基因组的包装和整合到宿主基因组中所需的反向末端重复(ITR)序列。病毒DNA包装在含有编码其它AAV基因,即rep和cap的辅助质粒,但是缺乏ITR序列的细胞系中。细胞系还受作为辅助因子的腺病毒感染。辅助病毒促进AAV载体的复制和AAV基因由辅助质粒表达。由于缺乏ITR序列,辅助质粒未大量包装。例如,可通过腺病毒比AAV更敏感的热处理减轻受腺病毒的污染。
在许多基因治疗应用中,以对特定组织类型的高度特异性,递送基因治疗载体是可取的。相应地,可通过表达配体作为与病毒外表面上的病毒外壳蛋白的融合蛋白,将病毒载体修饰为对指定细胞类型具有特异性。选择所述配体对已知存在于目标细胞类型上的受体具有亲和力。例如,Han等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:9747-9751(1995)报道可将莫洛尼鼠白血病病毒修饰为表达与gp70融合的人调蛋白(heregulin),并且重组病毒感染表达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。这种原理可延伸到其它病毒-靶细胞对,其中靶细胞表达受体而病毒表达包含细胞表面受体的配体的融合蛋白。例如,丝状噬菌体可经工程化为展示对几乎所选任何细胞受体具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如,FAB或Fv)。虽然以上描述主要适用于病毒载体,但是可将相同原理应用于非病毒载体。此类载体可经工程化为含有利于被特定靶细胞摄取的特定摄取序列。
可通过向患者个体施用,通常通过如下所述的全身施用(例如,静脉内、腹膜内、肌肉日、皮下或颅内输注)或局部应用,在体内递送基因治疗载体。可选地,可在活体外向细胞,例如从患者个体移植的细胞(例如淋巴细胞、骨髓穿刺液、组织活检)或万能供血者造血干细胞递送载体,接着通常在为已经并入载体的细胞选择后,将细胞再植入患者体内。
用于诊断、研究、移植或基因治疗的活体外细胞转染(例如,通过将转染细胞再次输注到宿主生物中)为本领域的技术人员众所周知。在一个优选实施方案中,从受试生物分离细胞,用DNA结合蛋白的核酸(基因或cDNA)转染,并且再次输注至受试生物(例如,患者)体内。适合活体外转染的各种细胞类型为本领域的技术人员众所周知(见,例如,Freshney等,CultureofAnimalCells,AManualofBasicTechnique(1994年第3版))和本文引用以讨论如何从患者分离和培养细胞的参考文献)。
在一个实施方案中,干细胞用于细胞转染和基因治疗的活体外过程。使用干细胞的优点是它们可在体外分化为其它细胞类型,或可引入哺乳动物(例如细胞供体)中,在这里它们将植入骨髓中。已知使用细胞因子例如GM-CSF、IFN-γ和TNF-α使CD34+细胞在体外分化成临床上重要的免疫细胞类型的方法(见Inaba等,J.Exp.Med.176:1693-1702(1992))。
使用已知方法分离干细胞进行转导和分化。例如,通过用结合不必要的细胞,例如CD4+和CD8+(T细胞)、CD45+(panB细胞)、GR-1(粒细胞)和Iad(分化的抗原呈递细胞)的抗体,淘选骨髓细胞,而从骨髓细胞分离干细胞(见Inaba等,J.Exp.Med.176:1693-1702(1992))。
在一些实施方案中也可使用已经修饰的干细胞。例如,已经使其抗细胞凋亡的神经元干细胞可用作治疗组合物,其中干细胞还含有本发明的ZFPTF。例如,通过在干细胞中使用BAX-或BAK-特异性ZFN(见,美国专利申请第12/456,043号)或在半胱天冬酶中破坏的干细胞中,例如再次使用半胱天冬酶-6特异性ZFN敲除BAX和/或BAK,可能出现对细胞凋亡的抗性。可用已知调控HLA的ZFPTF转染这些细胞。
也可向生物直接施用含有治疗性DNA结合蛋白(或编码这些蛋白的核酸)的载体(例如,逆转录病毒、腺病毒、脂质体等)以在体内进行细胞转导。可选地,可施用裸DNA。通过一般用于将分子引入与血液或组织细胞的最终接触的任何途径施用,包括但不限于注射、输注、局部应用和电穿孔。施用此类核酸的适合方法可用并且为领域的技术人员众所周知,并且,虽然可使用一种以上的途径施用特定组合物,但是常常一种特定途径可以提供比另一途径更直接且更有效的反应。
例如,在美国专利第5,928,638号中公开了将DNA引入造血干细胞的方法。用于将转基因引入造血干细胞,例如CD34+细胞的载体包括35型腺病毒。
适合将转基因引入免疫细胞(例如,T细胞)的载体包括非整合慢病毒载体。见,例如,Ory等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11382-11388;Dull等(1998)J.Virol.72:8463-8471;Zuffery等(1998)J.Virol.72:9873-9880;Follenzi等(2000)NatureGenetics25:217-222。
部分由施用的特定组合物以及由用于施用组合物的特定方法决定药学上可接受的载体。相应地,如下所述,存在可用药物组合物的多种适合配方(见,例如,Remington’sPharmaceuticalSciences,第17版,1989)。
如上所述,公开的方法和组合物可用于任何类型的细胞,包括但不限于原核细胞、真菌细胞、古细菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞、脊椎动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞,包括任何类型的T细胞和干细胞。用于蛋白质表达的适合细胞系为本领域的技术人员已知并且包括但不限于COS、CHO(例如,CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如,HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)、perC6、昆虫细胞例如草地贪夜蛾(Sf)和真菌细胞例如酵母属,毕赤酵母和裂殖酵母。也可使用这些细胞系的子代、变体和衍生物。
应用
公开的组合物和方法可用于其中需要调节HLA表达和/或功能性的任何应用,包括但不限于其中HLA调节是所需的治疗和研究应用。
与HLA密切相关的疾病和病况包括阿狄森氏病、强直性脊柱炎、白塞氏病、伯格氏病、乳糜泻、慢性活动性肝炎、格雷夫斯病、幼年型类风湿关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征和红斑狼疮等。另外,HLA基因的调节可与目标细胞的其它遗传修饰结合使用。例如,可将利用嵌合抗原受体对靶细胞诸如CTL的修饰(以改变CTL的特异性)与如本文所述的活体外HLA修饰组合,以开发可用于大多数有此需要的任何患者的细胞治疗。
另外,本发明的材料和方法可用于治疗、预防或改善移植物抗宿主病。当向患者施用同种异体T细胞(例如,骨髓和/或输血)时,移植物抗宿主病(GVHD)是常见并发症。输注的材料中的功能性免疫细胞将受者识别为"外来物"并且激发免疫攻击。通过调节同种异体T细胞中的HLA和/或TCR表达,可将“下架”T细胞(例如,CD19-特异性T细胞)作为“药物”按需施用,因为GVHD的风险下降或被消除并且,另外地,非经典HLA分子的提供减少或消除经修饰的细胞的NK介导的裂解。
方法和组合物还包括其中干细胞内的一种或多种经典HLA基因已被灭活并且一种或多种非经典HLA分子被激活的干细胞组合物。例如,已将HLA经修饰的造血干细胞引入骨髓去除后的患者。这些改变的HSC可允许患者的再定殖而无因排斥和/或NK介导的细胞裂解产生的丢失。引入的细胞还可具有其它改变来在随后的治疗(例如,化学疗法抗性)过程中帮助治疗基础疾病。
本发明的方法和组合物也用于HLA经修饰的血小板(例如用作治疗剂)的开发。因此,HLA经修饰的血小板可用于治疗血小板减少症诸如特发性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜和药物诱发的血小板减少性紫癜(例如,肝素诱发的血小板减少症)。可用本发明的HLA经修饰的血小板治疗的其它血小板病症包括戈谢病、再生障碍性贫血、奥尼赖病、胎儿母亲异源免疫性血小板减少症、HELLP综合征、癌症以及来自一些化疗治疗剂的副作用。HLA经修饰的血小板还作为“下架”疗法在急诊室情况下用于创伤患者。
本发明的方法可用于异种移植术。具体地,仅通过举例,可将猪的器官用于移植进人中,其中猪类MHC基因已被删除和/或被人HLA基因置换。可开发(从已具有由被注射入它们的mRNA编码的靶向HLA的ZFN以便内源MHC基因被破坏的猪胚胎,或从使用它们的HLA基因已被成功地靶向的细胞的细胞核将体细胞的细胞核转移进猪胚胎)含有这些有用的基因突变的猪的品系,并将可培养这些动物直至最终器官收获。这将在人中阻止对这些器官的排拆和增加成功移植的机会。
本发明的方法和组合物还用于设计和实现体外和体内模型,例如,允许研究这些病症的HLA或其它病症的动物模型。
实施例
实施例1:材料和方法
ZFN
使用如美国专利第20120060230号中所述的已预先验证的2-指和1-指模块的的已建立的档案设计和组装含有5或6个指的HLA-A结合ZFN。可使用的示例性ZFN示于下表1中。该表中的第1栏是ZFP的内部参照名称(编号)并且对应于表2的第1栏中的相同名称。“F”指的是指并且“F”后的数字是指哪个锌指(例如,“F1”指的是指1)。
表1:锌指蛋白
表2中公开了示例性HLA-A结合蛋白的靶位点的序列。表2显示指定的锌指蛋白的靶序列。被ZFP识别螺旋接触的靶位点中的核苷酸以大写字母指示;非接触核苷酸以小写字母指示。
表2:HLA-A锌指靶位点
细胞培养
将HEK293细胞维持在补充有10%热灭活胎牛血清(FBS:Lonza)和2mmol/LL-谷氨酰胺(Glutamax-1:Invitrogen,Carlsbad,CA)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Lonza,Basel,Switzerland)中。将EBV-LCL、721.221和EL-4细胞系维持在补充有10%热灭活的FBS和2mmol/LL-谷氨酰胺的RPMI1640(Lonza)中。这些细胞系的鉴定通过STRDNA指纹分析来确认。对于mHAg是特异的CD8+CTL克隆是:在HLA-A*0301的背景中的识别由PANE1编码的肽RVWDLPGVLK(SEQIDNO:1)的克隆7A7(Brickner等(2006)Blood107(9):3779-3786)和识别来自C19ORF48中的ORF+2/48的HLA-A*0201-限制的CIPPDSLLFPA(SEQIDNO:2,NM_199250.1的可选的开放阅读框架)肽的克隆GAS2B3-5(Tykodi等(2008)ClinCancerRes.14(16):5260-5269)。在51铬释放测定前一天解冻CTL克隆,将其维持在补充有10%人白蛋白血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、20ng/mL的IL-15(PeproTech,RockyHill,NJ)和20IU/mL的IL-2(Chiron,Emeryville,CA)的RPMI1640中。
载有OKT3的人工抗原呈递细胞(aAPC)对原代T细胞的激活
通过在补充有2mmol/LL-谷氨酰胺和10%FBS以及50IU/mL的IL-2的RPMI1640(始于aAPC添加后第二天,每隔一天添加的)中以1:1(T细胞:γ-辐照的(100Gy)aAPC)的比率用加载至aAPC(克隆#4:通常经修饰稳定地共表达CD19、CD64、CD86、CD137L和与EGFP17同步表达的白细胞介素IL-15的膜结合的突变蛋白的K562细胞(见,O'Connor等(2012)SciRep2:249;Manuri等(2010)HumGeneTher21(4):427-437))上的OKT3(eBioscience,SanDiego,CA)刺激PBMC,来通过体外交联CD3激活T细胞(CARneg)以使其持续增殖。每14天再添加载有OKT3的aAPC一次以持续T细胞增殖。
经遗传修饰的CD19-特异性CAR+T细胞的产生和在CD19+aAPC上的增殖
我们制造临床级CAR+T细胞的方法经改造适合于产生CD19-特异性T细胞。(见,例如,Singh等(2008)CancerRes.68(8):2961-2971)。使用NucleofectorII装置(Lonza)将编码SB转座子CD19RCD28和SB极度活跃的转座酶SB11的DNA质粒同时电转移(人T细胞细胞核转染溶液,程序U-014)进来源于PBMC的T细胞。通过在50IU/mL的IL-2(始于aAPC添加后第二天,每隔一天添加)存在的情况下,在电穿孔当天添加以及每隔14天再添加(以1:2的T细胞:aAPC比率)γ-辐照的(100Gy)aAPC(无OKT3加载的克隆#4)来选择性地在数目上扩增一组CAR+T细胞。
信使RNA的体外转录
如先前Torikai等(2012)Blood119(24):5697-5705中所述制备体外转录的mRNA种类。简言之,用XhoI线性化编码ZFN-L和ZFN-R的DNA模板质粒。在按照制造商的说明书体外转录(RiboMAXTM大规模RNA产生系统-T7,Promega,Madison,WI)和加帽(ARCA帽类似物,Ambion,Austin,TX)后,使用polyA加尾试剂盒(Ambion)添加多聚腺嘌呤酸。在1%变性琼脂糖凝胶上利用3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)缓冲液验证mRNA种类的完整性,并通过分光光度计(BioRad,Hercules,CA)在OD260测定浓度。将mRNA装入小瓶并于-80℃贮存以用于一次性使用。
编码ZFN的DNA质粒和mRNA种类的电穿孔
为了修饰HEK293细胞,使用制造商的方案通过核转染法(Lonza)引入编码靶向HLA-A的ZFN的表达载体。在初始刺激后6天或在用γ-辐照的aAPC再刺激后2至3天收获T细胞。将500万个T细胞与2.5至10μg的每一种ZFN-L和ZFN-RmRNA种类于100μL的人T细胞细胞核转染溶液(Lonza)预混合,随后使用NucleofectorII设备利用程序T-20在电击杯中进行电穿孔。在电穿孔后,立即将细胞置于预先加温的补充有2mmol/LL-谷氨酰胺和10%FBS的RPMI1640中,并在37℃和5%CO2下培养4-6小时,在该点上添加50IU/mL的IL-2以进一步培养。在“冷激”实验中,在于37℃-5%CO2培养箱中培养过夜后,将T细胞转移至30℃、5%CO2培养箱中,并培养3天,随后在进行分析之前返回37℃、5%CO2培养箱。
缺少HLA-A的表达的细胞的富集
在用补充有2%FBS和2mMEDTA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞后,在4℃用缀合有PE的单克隆抗体(mAb)特异性抗-HLA-A2(BDBiosciences,SanJose,CA)标记细胞,进行15分钟,随后洗涤,然后并用抗-PE微珠(MiltenyiBiotec,Auburn,CA)标记10分钟。洗涤后,将标记的细胞通过LD柱(MiltenyiBiotec),收集流过级分,并进行培养。将T细胞在γ-辐照的加载有OKT3的aAPC上繁殖,并且将CAR+T细胞在CD19+aAPC(未加载OKT3的)上于补充有2mmol/LL-谷氨酰胺和10%FBS及50IU/mL的IL-2的RPMI1640(每隔一天添加)中繁殖。
流式细胞术
使用以下抗体:藻红蛋白(PE)抗HLA-A2(克隆BB7.2)、FITC抗-CD4(克隆RPA-T4)、FITC抗-CD8(克隆HIT8a)、PE和APC抗-CD3(克隆SK7)、PE抗-CD56(克隆B159)、PE抗HLA-DR(克隆G46-6)、PE-小鼠IgG2bγ、PE小鼠IgG2aκ、FITC非特异性小鼠IgG1、第二试剂链霉抗生物素蛋白-PE(全部来自BDBiosciences)、缀合有生物素的抗-HLA-A3(克隆4i153)、APC抗-HLA-G(克隆MEMG19)、PE抗HLAI类(克隆W6/32,来自Abcam,Cambridge,MA)和PE抗-HLA-E(克隆3D12,Biolegend,SanDiego,CA)。缀合有Alexa488的抗-CD19RCD28CAR抗体(克隆号136-20-1)产生于我们的实验室中。我们将添加碘化丙啶(Sigma-Aldrich)以将死亡细胞排除分析。使用CellQuest3.3版(BDBiosciences)在FACSCalibur(BDBiosciences)上获得数据,利用FlowJo7.6.1版(TreeStar,Inc.Ashland,OR)分析所述数据。
SurveyorTM核酸酶测定
通过如Guschin等(2010)MethodsMolBiol649:247-256中所述的SurveyorTM核酸酶测定确定ZFN转染的细胞中的HLA-A基因序列的修饰水平。简言之,来自经ZFN修饰的细胞的基因组DNA经历利用被设计用来扩增HLA-A2和HLA-A3基因座内的ZFN靶区域的寡核苷酸引物的PCR。在变性和重退火后,将Surveyor内切核酸酶(Cel-1)(Transgenomic,Omaha,NE)用于裂解异源双链体DNA产物以在聚丙烯酰胺凝胶上显现快速移动的条带,所述条带被解释为突变事件的证据。通过光密度测定法定量百分比靶修饰。用于扩增靶基因座的PCR引物是:
HLA-A3正向:5’-GGGGCCGGAGTATTGGGACCA-3’;(SEQIDNO:7)
HLA-A3反向:5’-CCGTCGTAGGCGTCCTGCCG-3’(SEQIDNO:8)
HLA-A2正向:5’-GGGTCCGGAGTATTGGGACGG-3’(SEQIDNO:9)
HLA-A2反向:5’-TTGCCGTCGTAGGCGTACTGGTG-3’(SEQIDNO:10)
HLA-A2和HLA-A3序列获自IMGT/HLA数据库,例如IMGT/HLA登录号:HLA-A2:HLA00005、HLA-A3:HLA00037。
51铬释放测定(CRA)
用0.1mCi的51Cr标记靶细胞2小时。在用冰冷的补充有10%FBS的RPMI1640洗涤3次后,稀释标记的细胞,随后以103个靶细胞于每孔100μL中分配在96孔v型底板中。在肽滴定测定中,在室温下以肽的10倍系列稀释物孵育靶细胞,进行30分钟。以指定的效应子对靶的比率添加CTL。在于37℃、5%CO2中孵育4小时后,收集50μL的无细胞上清液,随后在TopCount仪(PerkinElmer,Shelton,CT)上进行计数。以一式三份进行所有测定。在一些测定中,用600IU/mL的干扰素-γ(IFN-γ;R&Dsystems,Minneapolis,MN)和10ng/mL的组织坏死因子-α(TNF-α;R&Dsystems)处理亲代HEK293细胞系和以HLA-A修饰的HEK293克隆48小时,随后进行测定。如下计算百分比特异性裂解:((实验cpm–自发cpm)/(最大cpm-自发cpm))×100。
NK细胞分离和非经典HLA在721.221细胞上的强制表达
按照制造商的方法,利用CD56微珠(MiltenyiBiotec)和LS柱(MiltenyiBiotec)从PBMC分离NK细胞。利用AmaxaNucleofectorII装置(程序:A-016)将编码SB转座子HLA-E(登录号005516)和/或HLA-G(登录号NM_002127)的DNA质粒与SB11转座酶共电穿至亲代HLAI类low721.221细胞中。在利用缀合有荧光的mAb[PE抗-HLA-E、APC抗-HLA-G和PE抗-HLA-G(克隆87G,Biolegend)]和顺磁性珠粒[抗PE微珠和抗APC微珠(目录号130-048-801、130-090-855(MiltenyiBiotec)]分选HLA-E和/或HLA-G阳性细胞后,通过有限稀释衍生显示稳定且均一地表达引入的HLA分子的HLA-E+和HLAG+克隆。通过4小时的CRA评估721.221克隆的NK细胞杀伤,通过单因素ANOVA,随后GraphPadPrism软件(5版,GraphPadSoftware,LaJolla,CA)中的Tukey多重比较来计算数据的统计显著性。
hESC的培养和分化
如先前所述(Soldner等(2009)Cell136(5):964-977),在丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养层上于hESC培养基[补充有15%FBS、5%KnockOutTM血清替代品(Invitrogen)、1mM谷氨酰胺(Invitrogen)、1%非必需氨基酸(Invitrogen)、0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma,St.Louis,MO)和4ng/mlFGF2(R&Dsystems)的DMEM/F12(Invitrogen)]中维持hESC品系WIBR3(WhiteheadInstituteCenterforHumanStemCellResearch,Cambridge,MA)22。如先前所述(Hockemeyer等(2008)CellStemCell3(3):346-353),将靶向hESC分化成成纤维细胞样细胞。简言之,通过在非贴壁悬浮培养皿(Corning,Corning,NY)中于补充有15%胎牛血清的DMEM培养基中形成拟胚体(EB)(进行5天)来诱导分化。随后将EB涂板在贴壁组织培养皿上,按照原代成纤维细胞方案,使用胰蛋白酶处理至少4代,随后开始实验。
ZFN-介导的hESC的基因组编辑
在电穿孔之前,将HESC在Rho相关蛋白激酶(ROCK)-抑制剂(Stemolecule;Stemgent,Cambridge,MA)中培养24小时。使用0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液(Invitrogen)收获细胞,随后重悬浮于PBS中。用35μg编码侧翼连接有与HLA-A24的假定的ZFN结合区同源的5’和3’臂的磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子控制下的嘌令霉素抗性基因的供体质粒和7.5μg每一种编码ZFN的质粒,或35μg供体质粒和10μg的每一种编码ZFN的mRNA对1000万个细胞进行电穿孔(GenePulserXcellSystem,Bio-Rad:250V,500μF,0.4cm电击杯)。随后将细胞涂板于在补充有ROCK抑制剂的hESC培养基中的DR4MEF滋养层上,进行前24小时。在电穿孔后72小时开始嘌呤霉素选择(0.5μg/ml)。在电穿孔后10至14天挑拣单个抗嘌呤霉素的集落,并进行扩增。正确靶向和基因破坏通过基因组基因座的Southern印迹分析和测序来确认。
实施例2:靶向多个内源HLA-A基因的锌指核酸酶的设计和验证
ZFN被设计来裂解内源性人HLA-A基因的基因组编码序列内的预定位点(见,例如,美国专利公布2012/0060230的表2)。这些ZFN在人细胞中的表达应当通过引入的双链断裂的易错修复(从而导致靶向HLA基因座的阅读框架的破坏)来消除HLA-A分子的表达。为了评价这些ZFN破坏HLA-A表达的能力,我们最初使用共表达HLA-A*03:01(HLA-A3)和HLA-A*02:01(HLA-A2)的人胚胎肾细胞系HEK293。在如实施例1中所述用编码的ZFN的表达质粒转染HEK293细胞后,我们使用等位基因特异性PCR和Surveyor核酸酶测定来定量预期的ZFN靶位点上的基因修饰的水平。
如图1中所示,约10%的HLA-A3基因座的和~6%的HLA-A2基因座的修饰是经修饰的HLA-A靶向ZFN。
实施例3:HLA-AnegHEK293细胞的分离和功能验证
为了评估破坏HLA-A表达的影响,我们使用有限稀释来从经ZFN修饰的HEK293细胞库获得单细胞克隆。测序显示在HLA-A2、HLA-A3或这两个等位基因中的预期的ZFN结合位点内具有小的插入或缺失的克隆,所述插入或缺失导致移码,从而导致翻译的提前终止。由于HEK293细胞中的HLA-A表达的稳定状态水平低于造血细胞诸如EBV转化的类成淋巴细胞系(EBV-LCL),因此我们将HEK293细胞暴露于已知提高HLA水平的促炎细胞因子。见,例如,Johnson(2003)JImmunol.170(4):1894-1902。
干扰素-γ(IFN-γ)和组织坏死因子-α(TNF-α)的添加增加亲代HEK293细胞中的HLA-A2和HLA-A3表达(图2A,上图框)。相反地,具有HLA-A2和/或HLA-A3的突变的经ZFN处理的HEK293克隆即使在被IFN-γ和TNF-α诱导后也不表达这些蛋白(图2A,底下3个图框)。因此,使用对于HLA-A2或HLA-A3是特异的mAb的流式细胞术确定细胞表面上HLA-A表达的等位基因特异性丢失。
随后,我们问经ZFN修饰的克隆上的HLA-A表达的丢失是否可避免T细胞识别,并使用HLA-A3和HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)克隆来测试该设想。如所预期的,HLA-A3-限制性CD8+CTL克隆7A7显示强劲的载有同源肽(RVWDLPGVLK,SEQIDNO:1,NP_001103685)的系列稀释物的HLA-A3+亲代HEK293细胞的特异性裂解,对于1ng/mL的脉冲同源肽观察到50%的最大裂解(图2B,顶图框)。已失去HLA-A2等位基因的表达但在HLA-A3上为野生型的HEK293克隆8.18也被该HLA-A3限制性CTL克隆裂解。相反地,当用相同肽脉冲时,已被编辑来消除HLA-A3表达的HEK293克隆18.1未被HLA-A3限制性CTL克隆7A7裂解,HLA-A2/A3双敲除的HEK293克隆83也不被其裂解(图2B,顶图框)。我们还评价HLA-A2限制性CTL克隆GAS2B3-5的催化活性,并且当利用亲代HEK293细胞或HLA-A2野生型克隆18.1速递时,观察到强劲的杀伤活性,然而经ZFN修饰的HLA-A2negHEK293克隆8.18和HLA-A2/A3双敲除克隆83免于裂解(图2B,底图框)。
这些数据表明利用ZFN的处理完全消除HLA-A表达,从而导致免受HLA-A限制性CTL介导的杀伤,即使在上调内源HLA-A表达的促炎症条件下亦如此。
实施例4:针对HLAnull细胞的NK细胞介导的裂解可被HLA-E和/或HLA-G的强制表达阻止
我们设想我们在此概述的与基于抗体的细胞分选组合的使用ZFN靶向HLAI类基因的方法,可最终用于消除HLA-A、HLA-B和HLA-C表达的表达。可通过KIR与其配体之间的相互作用的丢失来根除无经典HLA(尤其是已知为杀伤抑制性受体(KIP)的主要配体的HLA-B或HLA-C)表达的细胞。Parham等(2005)NatRevImmunol.5(3):201-214。为了测试NK细胞介导的细胞毒性是否可降低,我们将非经典HLA-E或HLA-G分子(已显示所述分子降低NK细胞介导的细胞毒性(Borrego等(1998)JExpMed.187(5):813-818;Riteau等(2001)IntImmunol.13(2):193-201;Rouas-Freiss等(1997)ProcNatlAcadSciUSA.94(10):5249-5254;Braud等(1998)Nature391(6669):795-799)并且多态性远少于经典HLA分子)引入HLAI类低细胞系721.221(图3A),并评价它们对被NK细胞杀伤的易感性。
从PBMC直接分离的NK细胞的流式细胞术分析显示超过94%的纯化(CD56posCD3neg群体)(图4A)并且经遗传修饰的721.221克隆中的HLA-E和/或HLA-G表达高于90%(图4B)。我们证明721.221上的HLA-E和/或HLA-G的强制表达显著地使这些靶细胞免于NK细胞介导的裂解(图4C)。
这为预先阻止受者NK细胞对施用的HLAneg异体移植细胞的消除,从而通过避免免疫原性转基因的引入而使得完全HLAI类敲除能够可行地用于人应用提供了解决务法。
实施例5:使用“肇事逃逸(Hit-and-Run)”策略破坏原代T细胞中的HLA-A基因
为了将我们的结果扩展至临床相关原代细胞,我们评价人T细胞中的HLA-A特异性ZFN的活性。由于ZFN只需要短暂表达来实现所需靶基因的稳定破坏,因此我们从体外转录的mRNA瞬时表达ZFN。编码ZFN的mRNA至来自HLA-A2纯合供体的PBMC(HLA-A2是高加索人中最常见的HLA-A等位基因,见,例如,Mori等(1997)Transplantation64(7):1017-1027)中的电转移使~19%的这些T细胞成为HLA-A2阴性(图5A,顶图框)。我们先前已证明在转染后瞬时降低孵育温度可增强ZFN活性。见,美国专利公布第2011/0129898号。
将电穿孔的原代T细胞经历瞬间低温使HLA-A2阴性细胞的比例以mRNA剂量依赖性方式提高达到57%(图5A,底图框)。
实施例6:在原代T细胞中实现临床相关水平的HLA-A破坏
为了靶向HLA的ZFN的临床应用,我们评价"高保真"强制异二聚化FokI结构域EL/KK(其被设计来通过阻止同二聚化33以减少潜在的脱靶裂解事件)的用途。编码ZFN-L和ZFN-R的EL/KKZFN变体的mRNA的使用导致HLA-AnegT细胞的显著增加,从而在达到52%的T细胞群体中消除HLA-A表达,尽管使用有限剂量的mRNA(2.5μg每一种ZFN)(图5B)。
单轮利用涂覆有抗体的顺磁性珠粒进行的HLA-A阳性T细胞耗竭容易地使HLA-A2negT细胞级分增加至超过95%的群体而不影响CD4或CD8表达(图6A)。通过Surveyor核酸酶测定(图6B)和直接DNA测序(图6C)分析该HLA-A2neg群体显示几乎100%的精确地在被ZFN靶向的区域内的HLA-A2等位基因的编辑。
这些数据一起显示ZFN驱动的基因组编辑可快速地产生HLA-阴性原代T细胞群。
实施例7:HLA-A基因在经遗传修饰以重定向特异性的T细胞中的分配
为了证明HLA编辑的潜在效用,我们随后聚焦于在HLA表达消除后被广泛用于异体移植背景中的特定类的细胞;即细胞毒性T细胞经遗传修饰以表达不依赖于HLA识别34将特异性重新导向肿瘤相关抗原的‘通用’嵌合抗原受体(CAR)。事实上,我们和其它研究人员目前输入患者特异性CAR+T细胞以研究性治疗CD19+恶性肿瘤。(见,例如,Kalos等(2011)SciTranslMed3(95):95ra73;Porter等(2011)NEnglJMed365(8):725-733)。最近,我们已公布:,当将ZFN用于消除内源αβTCR表达时,CAR+T细胞保留对CD19的重定向特异性(Torikai等(2012)Blood119(24):5697-5705和Provasi等,(2012)NatMed18(5):807-15)。事实上,此类TCR编辑的T细胞显示增强的体内效力和安全性(GVHD)。
为了增强我们产生“下架”T细胞疗法的能力,我们调查ZFN是否可从先前工程化以表达CD19-特异性CAR的原代T细胞消除HLA-A表达。通过来源于白花酢浆草(SB)转座子/转座酶体系的DNA质粒的同时电转移遗传修饰的,随后在CD19+aAPC上进行选择性繁殖的PBMC克隆#439导致CD19-特异性CAR(命名为CD19RCD28)在超过90%的T细胞中表达。这些SB和aAPC平台已被我们改造来在4个临床试验(IND#14193、14577、14739和15180)中用于人应用。
随后用编码HLA-AZFN的强制异二聚变体的体外转录的mRNA对CAR+T细胞进行电穿孔。ZFN治疗成功地破坏~22%的CAR+T细胞中的HLA-A2表达而无需选择,并且可通过HLA-阳性细胞的阴性选择容易地将该群体富集成~99%HLA-A2neg细胞(图6A)。已显示自在CD19+aAPC上连续共培养50天后,这些细胞维持它们的新表型,~94%的CAR+T细胞保持HLA-A2neg。重要的是,这些HLA-A2negT细胞逃避了HLA-A2限制性CTL的攻击(图6B),并且维持它们的抗肿瘤活性,如通过CD19+肿瘤靶的CAR依赖性裂解证明的(图6C)。
总的来说,这些数据表明CAR重定向的肿瘤特异性T细胞可通过ZFN遗传修饰来消除HLA-A表达。此类HLA-Aneg细胞具有举能来使"下架"肿瘤特异性T细胞可从一个供体预先制备的并按需要输注至多个受者中。
实施例8:hESC中的HLA-A基因的破坏
为了拓宽异体移植物用于治疗应用(包括组织再生)的应用,我们寻求产生能够逃避T细胞识别的hESC。按照定义,所有hESC对于潜在受者是异基因的,并且当分化时将上调HLAs40的表达。为了测试ZFN用于产生HLA-AneghESC的用途,我们利用编码ZFN靶向HLA-A基因座的mRNA或DNA质粒遗传修饰HLA-A2+/A24+hESC品系WIBR3。为了促进HLA-AneghESC的产生,我们共递送编码侧翼连接有围绕ZFN靶位点的同源物的区域的嘌呤霉素抗性基因的供体DNA质粒以通过同源介导的修复来介导靶向整合。通过ZFN靶区域的PCR测序和通过使用位于供体同源臂外的探针的靶向区域的Southern印迹分析来筛选抗嘌呤霉素的克隆的HLA-A等位基因的修饰。这些克隆在两个HLA-A等位基因中的ZFN靶区域中都含有突变,并且与未经修饰的亲代hESC细胞一起分化成成纤维细胞样细胞。通过利用IFN-γ和TNF-α的处理来诱导HLA表达,并且通过分别用识别HLA-A2和HLA-A24的抗体进行流式细胞术来进行分析。
虽然亲代细胞系显示两个HLA等位基因的强表达,但所有3个敲除品系不存在两个HLA-A等位基因的细胞表面表达(图7)。这些数据表明针对hESC的HLA-A敲除法的可携带性-这可以是细胞移植后保持所必需的步骤。
本文提到的所有专利、专利申请和出版物据此通过引用整体并入。
虽然为了理解清楚的目的,已经通过举例说明和实施例的方式相当详细地提供了公开内容,但是对于本领域的技术人员显而易见的是,在不背离公开内容的精神或范围的前提下,可实践各种变化和修改。相应地,不得将前面的描述和实施例视为限制。
Claims (12)
1.一种分离的天然杀伤(NK)细胞,其包含一种或多种非经典I类人白细胞抗原(HLA)蛋白并且进一步地其中所述细胞内的至少一种经典内源HLA基因被锌指核酸酶灭活。
2.根据权利要求1所述的NK细胞,其中所述非经典I类HLA蛋白选自由以下组成的组:HLA-E、HLA-F、HLA-G及其组合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的NK细胞,其中所述非经典I类HLA蛋白由内源基因表达。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的NK细胞,其中所述非经典I类HLA蛋白由外源基因表达。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的NK细胞,其中所述锌指核酸酶包含含有如表1的单行中显示的识别螺旋区的锌指蛋白。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的NK细胞,其中所述细胞包含一个或多个另外的基因组修饰。
7.一种细胞,其为权利要求5或权利要求6的细胞的后代。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞的碎片。
9.一种药物组合物,其包含权利要求1至8中任一项的NK细胞。
10.一种减少细胞的天然杀伤(NK)细胞裂解的方法,所述方法包括提供根据权利要求1至9中任一项的细胞,其中所述细胞的NK介导的细胞裂解减少。
11.一种治疗有需要的受试者的HLA相关病症的方法,所述方法包括向所述受试者施用权利要求1至9中任一项的NK细胞。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述HLA相关病症是移植物抗宿主病(GVHD)。
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