CN103282029A - 调节pd1的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了调节PD1基因表达的方法和组合物。

Description

调节PD1的方法和组合物
对联邦政府资助研究下所获发明的权利声明
不适用。
技术领域
本发明属于基因组工程和核酸酶识别领域。
发明背景
已经证实，核酸酶，包括工程化为与靶位点特异性结合的锌指核酸酶和归巢内切核酸酶(例如SceI)，在基因组工程中有用。例如，锌指核酸酶(ZFN)是包含与核酸酶结构域融合的定点工程化锌指的蛋白质。这种ZFN已经成功用于多个不同物种的基因组修饰。见，例如，美国专利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060188987、20060063231；和国际公布WO07/014275，其公开内容通过引用整体并入用于所有目的。这些ZFN可用于在靶核苷酸序列中产生双链断裂(DSB)，这使靶基因座处同源重组的频率增加1000倍以上。另外，通过非同源末端连接(NHEJ)不精确修复定点DSB也可导致基因破坏。产生两个这种DSB导致任意大区域缺失。
已经证实程序性死亡受体(PD1，也称为PDCD1)与响应于慢性抗原调节T细胞活化和T细胞耐受之间的平衡有牵连。HIV1感染期间，已经发现在CD4+T细胞中PD1的表达增加。据认为，与HIV感染情况一样，当在慢性抗原暴露存在下观察到T细胞功能障碍时，PD1上调从某种程度上与T细胞耗竭(定义为关键效应子功能逐渐丧失)相关联。PD1上调可能还与慢性病毒感染期间这些同类细胞中凋亡增加相关(见Petrovas等，(2009)J Immunol.183(2):1120-32)。PD1也可能在肿瘤特异性逃离免疫监视中起作用。已经证明，在慢性骨髓性白血病(CML)和急性骨髓性白血病(AML)中PD1在肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)中高度表达。在黑素瘤浸润T淋巴细胞(TIL)中PD1也上调(见Dotti(2009)Blood 114(8):1457-58)。已经发现肿瘤表达PD1配体(PDL)，当结合CTL中PD1的上调时，PD1配体可为T细胞功能性丧失和CTL不能介导有效抗肿瘤反应的促成因子。
研究人员已经证实，在慢性感染了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的小鼠中，施用抗PD1抗体阻滞PD1-PDL相互作用并且能够恢复一些T细胞功能性(增殖和细胞因子分泌)，并导致病毒载量降低(Barber等(2006)Nature439(9):682-687)。PD1失调也可能在自身免疫性疾病中起作用。PD1(尤其是PD 1.3)的SNP也与全身性红斑狼疮(SLE)风险升高相关。已经证实，SLE患者具有更高频率的PD 1.3 PD1等位基因，并且这些患者显示在其活化CD4+T细胞上PD1表达减少(见Bertsias等，(2009)Arthritis Rheum.60(1):207-18)。
因此，仍需要另外的PD1靶向调节剂，例如可用于研究和治疗应用的PD1靶向核酸酶或转录因子。
发明概述
本发明涉及研发PD1靶向核酸酶，例如工程化大范围核酸酶和锌指核酸酶(ZFN)。
本发明证明对人和啮齿动物PD1有特异性的活性锌指蛋白和包括含这些PD1特异性锌指蛋白的锌指蛋白转录因子(ZFP-TF)或锌指核酸酶(ZFN)的融合蛋白。包含本发明的PD1特异性锌指蛋白的蛋白质可用于研究和治疗目的，包括用于治疗其中PD1表达异常，或其中由于PD1配体过表达而异常利用PD1途径的任何疾病或病症。例如，在慢性传染性疾病和恶性肿瘤中，锌指核酸酶靶向T细胞中的PD1基因座可用于阻滞PD1依赖性免疫抑制。可选地，可使用ZFN依赖性靶向插入野生型序列修补缺陷型PD1基因座，或可使用锌指蛋白转录因子(ZFP TF)调节(例如，上调或下调)缺陷型PD1表达。进一步地，可使用靶向PD1基因座的ZFP TF调节野生型PD1基因。
在本发明的另一方面，融合蛋白包含对人PD1基因有特异性的锌指核酸酶(ZFN)。在某些实施方案中，核酸酶融合蛋白的锌指结构域包含表1所示的非自然生成的识别螺旋和/或与表2所示的靶位点结合。
又一方面，本文提供了能够调节PD1基因表达的ZFP-TF。在某些实施方案中，ZFP-TF的锌指结构域包含表1或5所示的非自然生成的识别螺旋和/或与表2或6所示的靶位点结合。
另一方面，本文提供了调控PD1基因的方法和组合物。在某些实施方案中，所述方法包括将包含工程化为与PD1基因中的靶位点结合的锌指蛋白的融合蛋白(或编码融合蛋白的多核苷酸)引入来自有特征在于由PD1配体过表达引起PD1表达异常和/或PD1途径不良使用的疾病或病症的患者的细胞中。所述方法用于治疗和/或预防慢性感染，例如HIV和HCV。类似地，所述方法和组合物可用于治疗和/或预防癌症和恶性疾病。可治疗和/或预防的癌症的非限制性实例包括肺癌、胰腺癌、肝癌、骨癌、乳腺癌、结直肠癌、白血病、卵巢癌、淋巴瘤、脑癌等。
本文所述的方法和组合物可用作独立治疗，或可与其它抗病毒或抗癌疗法联合使用。这些方法和组合物可与抗病毒或抗癌疗法一起以连续方式提供，或可同时施用。提供的方法和组合物可用于调节患有自身免疫性疾病的患者体内的PD1表达，或者如果该患者携带缺陷型或有害等位基因，可用于通过整合野生型PD1等位基因或特征改变的PD1等位基因治疗此类患者。可构建细胞系以特异性改变所述PD1基因序列以产生可改变PD1基因的调控或功能性的治疗性化合物的筛选系统。
附图简述
图1是示出了通过测量将所指ZFN引入这些细胞中时诱导通过非同源末端连接(NHEJ)插入的突变百分比的基于Cel-1SURVEYORTM核酸酶测定法测定，使用PD1特异性锌指核酸酶对人PBMC中PD1基因的破坏的图。用各自使ZFN 12942与DNA相反链上结合的不同ZFN变体组合并且在与具有12942的靶基因座结合后将形成功能核酸酶的ZFN对处理细胞。以下各图中指出了这一对中第二ZFN的SBS数量。每一对最左边一栏示出了在37℃下孵育的细胞核转染后3天的NHEJ百分比。在所示每一对从左边数第二栏示出了在37℃下孵育的细胞核转染后10天的NHEJ百分比。在所示每一对从右边数第二栏示出了在30℃下孵育的细胞核转染后3天的NHEJ百分比并且在所示每一对最右边一栏示出了在30℃下孵育的细胞核转染后10天的NHEJ百分比。
图2描绘了用靶向外显子1的PD1特异性ZFN对12942和12947处理后，测定CD8+T细胞中PD1基因座的序列的分析结果。用黑体大写字母描绘了插入。用(-)表示缺失。如图可见，由于经NHEJ修复DSB，在ZFN切割位点附近观察到若干插入和缺失。
图3描绘了从具有鼠PD1特异性ZFN的Pmel TCR转基因/Rag1-/-小鼠得到的脾细胞转染后的结果。用抗CD3抗体刺激细胞，然后为PD1染色。图中示出了每一组中的PD1阳性CD3+CD8+细胞百分比和每一组的中值PD1荧光性，并且下面以表格形式表示数据。如图中可见，在接受了PD1特异性ZFN的细胞中，即使在CD3刺激存在下，PD1表达降低。
图4证明在稍后的时间点，PD1表达减少明显。在CD3刺激72h后收获细胞，并且为PD1染色。上部直方图示出了每一组中PD1阳性CD3+CD8+细胞百分比和每一组的中值PD1荧光性。下图示出了PD1/CFSE细胞的频率。该图证明，即使在CD3刺激72h后经PD1特异性ZFN处理的细胞中PD1表达仍减少。
图5描绘了于CD4+T细胞中测试并且使用Cel-I测定法分析的PD1特异性ZFN对的基因组编辑活性的结果。在这些细胞中，对几对观察到高达44%的编辑。
图6描绘了用PD1特异性ZFN对处理成CD4+T细胞后对PD1(-)细胞的纯化。通过如上所述的Cel-I测定法测量编辑或NHEJ百分比，并且对一些PD1特异性ZFN对观察到高达44%的编辑。处理后，经首次暴露于抗CD3/CD8珠刺激细胞以诱导ZFN转基因，然后通过FAC或亲和色谱法再次刺激并进行纯化过程。(i)在首次刺激后，(ii)在第二次刺激之后，但是在任何纯化之前，(iii)CD25+(活化标志)，PD1(-)细胞分选之后，或(iv)在亲和色谱法之后，收集细胞并通过Cel-I测定法(上述)分析PD1编辑。如同所示，使用细胞分选技术，发现多达56%的回收细胞已被修饰。通过Cel-1分析测定，通过亲和色谱法纯化的PD1(-)细胞展示出高达42%的总体PD1修饰。
图7是描绘了在CD8+T细胞中测试的PD1特异性ZFN的结果的图。在这个实验中，将编码PD1特异性ZFN的mRNA转导至CD8+T中并通过Cel I测定法分析PD1修饰百分比。观察到的修饰量与所用mRNA量有关，输入mRNA的量越少，产生的靶标修饰百分比越少。这些结果证明，本文描述的PD1特异性ZFN能够修饰细胞系和原代T细胞中的PD1基因座。
发明详述
本文描述了用于鉴定功能性核酸酶的高通量体内筛选系统的组合物和方法。具体而言，所述测定法使用报告系统监测核酸酶在其靶位点处诱导双链断裂的能力。另外，所述测定法可用于测定核酸酶对细胞生长的影响(毒性)。
工程化核酸酶技术基于对自然生成的DNA结合蛋白的工程化。例如，已经描述了对具有定制DNA结合特异性的归巢内切核酸酶的工程化。Chames等(2005)Nucleic Acids Res 33(20):e178；Arnould等(2006)J.Mol.Biol.355:443-458。另外，还描述了对ZFP的工程化。见，例如，美国专利No.6,534,261、6,607,882、6,824,978、6,979,539、6,933,113、7,163,824和7,013,219。
另外，ZFP已经与核酸酶结构域连接以产生ZFN(一种能够通过其工程化(ZFP)DNA结合结构域识别其预期基因靶标的功能实体)并且核酸酶引起基因在ZFP结合位点附近被切割。见，例如，Kim等(1996)Proc Nat′l Acad Sci USA 93(3):1156-1160。最近，ZFN已用于多种生物的基因组修饰。见，例如，美国专利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060188987、20060063231；和国际公布WO 07/014275。
虽然清楚表征了使ZFP工程化以与特异性DNA序列结合的作用并且精确鉴定了特异性ZFP，但是当并入ZFN时这些相同ZFP可能不以相等亲和力和/或特异性结合。例如，很可能染色体基质可影响活细胞中核酸酶结构域的精确二聚化，从而减少裂解可能，并且指定基因座上精确的染色质结构将差异性影响ZFN结合并裂解其预期靶序列的能力。另外，如有可能，对于体外测定法而言难以模拟用染色质化形式的细胞基因组呈递时设计的DNA结合结构域的搜索参数。因此，必须试验有关生物或细胞系中的许多变体，以鉴定表现出基因修饰最佳特征的ZFN。
此外，因为每个体内系统有其自身的特性，所以必须研发特异性检测测定法以测定ZFN作用。因此，与先前描述的筛选具有不同于自然生成的归巢内切核酸酶的结合特异性的归巢内切核酸酶的体内筛选方法不同，本文描述的方法提供了通过预测核酸酶的体内功能性以及对宿主细胞的毒性把已知与特殊靶位点结合的核酸酶分等级的快速有效途径。
因此，本文描述的方法和组合物提供了鉴定在体内具有生物活性的核酸酶的高效快速方法。除精确预测体内核酸酶功能性外，本文描述的测定法也可用于测定核酸酶毒性，从而允许鉴定最安全且最具功能活性的蛋白质。
总则
除非另外指出，否则本文公开的方法的实践以及组合物的制备和使用采用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA和相关领域中的常规技术，如同在本领域技术范围内一样。在文献中充分解释了这些技术。见，例如，Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989和第3版，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987和定期更新；METHODS IN ENZYMOLOGY系列，Academic Press,San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTUREAND FUNCTION，第3版，Academic Press,San Diego,1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，第304卷，“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编辑)，Academic Press,San Diego,1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第119卷，“ChromatinProtocols”(P.B.Becker编辑)Humana Press,Totowa,1999。
定义
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可交换使用并且指呈线性或环状构象和呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本发明的目的，不得将这些术语视为对聚合物长度的限制。术语可涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸盐部分(例如，磷硫酰骨架)中经修饰的核苷酸。一般而言，特殊核苷酸的类似物具有相同碱基配对特异性，即A的类似物将与T碱基配对。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可交换使用并且指氨基酸残基的聚合物。术语也适用于其中一个或多个氨基酸为相应自然生成的氨基酸的化学类似物或经修饰衍生物的氨基酸聚合物。
“结合”指大分子之间(例如，蛋白质和核酸之间)的序列特异、非共价相互作用。只要总的来说相互作用具序列特异性，并非结合相互作用的所有组分需要具序列特异性(例如，与DNA骨架中的磷酸盐残基接触)。这种相互作用的特征通常在于解离常数(Kd)为10-6M-1或更低。“亲和力”指结合强度：结合亲和力增强与Kd较低相关。
“结合蛋白”是一种能够与另一分子非共价结合的蛋白质。结合蛋白可与(例如)DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)结合。在蛋白质结合蛋白的情况下，其可与自身结合(形成同型二聚体、同型三聚体等)和/或可与一个或多个不同蛋白质分子结合。结合蛋白可具有一种以上的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白质结合活性。
“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是以序列特异性方式通过一种或多种锌指结合DNA的蛋白质或较大蛋白质内的结构域，锌指是通过锌离子配位稳定其结构的结合结构域中的氨基酸序列区域。常常将术语锌指DNA结合蛋白缩写为锌指蛋白或ZFP。
可将锌指结合结构域“工程化”为与预定核苷酸序列结合。工程化锌指蛋白的方法的非限制性实例为设计和选择。设计的锌指蛋白是在自然界中不存在的蛋白质，其设计/组成主要由合理标准产生。设计的合理标准包括应用取代规则和计算机算法处理存储现有ZFP设计和结合数据的信息的数据库中的信息。见，例如，美国专利6,140,081、6,453,242和6,534,261；同样见WO98/53058、WO98/53059、WO 98/53060、WO 02/016536和WO 03/016496。
“所选”锌指蛋白是在自然界中发现的蛋白质，其生成主要由经验工艺引起，例如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂种选择。见例如，US 5,789,538、US 5,925,523、US 6,007,988、US 6,013,453、US6,200,759、WO 95/19431、WO 96/06166、WO 98/53057、WO 98/54311、WO 00/27878、WO 01/60970WO 01/88197和WO 02/099084。
“裂解”指破坏DNA分子的共价骨架。可通过多种方法引起裂解，包括但不限于磷酸二酯键的酶或化学水解。单链裂解和双链裂解均可能，并且由于两个不同单链裂解事件可发生双链裂解。DNA裂解可导致生成平端或交错末端。在某些实施方案中，融合多肽用于靶向双链DNA裂解。
“裂解半结构域”是连同第二多肽(相同或不同)形成具有裂解活性(优选为双链裂解活性)的复合物的多肽序列。术语“第一和第二裂解半结构域”“+和-裂解半结构域”和“右侧和左侧裂解半结构域”可交换用于指二聚化的裂解半结构域对。
“工程化裂解半结构域”是已经修饰以便与另一裂解半结构域(例如，另一工程化裂解半结构域)形成专性杂二聚体的裂解半结构域。同样，见，通过引用整体并入本文的美国专利申请No.10/912,932和11/304,981和美国临时申请No.60/808,486(2006年5月25日提交)。
术语“序列”指可为DNA或RNA；可为直链、环形或支链并且可为单链或双链的任何长度的核苷酸序列。术语“供体序列”指插入基因组中的核苷酸序列。供体序列可具有任何长度，例如长度介于2和10,000个核苷酸(或之间或以上的任何整数值)，优选长度介于约100和1,000个核苷酸(或之间的任何整数)，更优选长度介于约200和500个核苷酸。“染色质”是包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸(主要为DNA)和蛋白质，包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白。大部分真核细胞染色质以核小体的形式存在，其中核小体核心包含与八聚体缔合的约150个碱基对的DNA，八聚体包含每种两个的组蛋白H2A、H2B、H3和H4；并且连接子DNA(长度根据生物体可变)在核小体核心之间延伸。组蛋白H1分子通常与连接子DNA缔合。对于本发明的目的，术语“染色质”意在涵盖所有类型的原核和真核细胞核蛋白。细胞染色质包括染色体和附加体染色质。
“染色体”是包含细胞的整个或部分基因组的染色质复合物。常用其核型表征细胞的基因组，核型是包含细胞基因组的所有染色体的总和。细胞的基因组可包含一条或多条染色体。
“附加体”是复制核酸、核蛋白复合物或包含并非细胞染色体核型的一部分的核酸的其它结构。附加体的实例包括质粒和某些病毒基因组。
“靶位点”或“靶序列”是，倘若存在供结合的足够条件，限定结合分子将与之结合的核酸部分的核酸序列。例如，序列5’-GAATTC-3’是Eco RI限制内切核酸酶的靶位点。
“慢性传染性疾病”是由传染剂引起的疾病，其中传染持续。这种疾病可包括肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HSV-6、HSV-II、CMV和EBV)和HIV/AIDS。非病毒实例可包括慢性真菌疾病，如曲霉病(Aspergillosis)、念珠菌病(Candidiasis)、球孢子菌病(Coccidioidomycosis)，和与隐球菌属(Cryptococcus)相关的疾病和组织胞浆菌病(Histoplasmosis)。慢性细菌传染剂的非限制性实例可为肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)和结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)。术语“癌症”指在器官或体组织中存在细胞无限增殖的任何疾病。因此，术语包括任何类型的癌症或恶性肿瘤，包括但不限于卵巢癌、白血病、肺癌、结直肠癌/结肠癌、CNS癌、黑素瘤、肾细胞癌、浆细胞瘤/骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌等。如本文所使用，除非另外特别指出，术语“肿瘤”指恶性类细胞或组织生长异常并且不包括良性类组织。如本文所使用，术语“抑制(inhibits)或抑制(inhibiting)”指减少生长/复制。
术语“自身免疫性疾病”指受试者对其自身组织产生破坏性免疫反应的任何疾病或病症。自身免疫性病症可影响受试者(例如，人)体内的几乎每个器官系统，包括但不限于神经、胃肠和内分泌系统，以及皮肤和其它结缔组织、眼睛、血液和血管的疾病。自身免疫性疾病的实例包括但不限于桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、全身性红斑狼疮、干燥综合征(Sjogren′s syndrome)、格雷夫斯病(Graves′disease)、硬皮病、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力和糖尿病。
“外源”分子是通常在细胞中不存在，但是通过一种或多种基因、生物化学或其它方法引入细胞中的分子。关于细胞的特殊发育阶段和环境条件确定“在细胞中正常存在”。因此，例如，仅在肌肉胚胎发育期间存在的分子就成人细胞而言是外源分子。类似地，通过热休克诱导的分子就非热休克细胞而言是外源分子。外源分子可包括(例如)功能障碍内源分子的功能形式或正常功能内源分子的功能障碍形式。
除了其它方面，外源分子可为小分子，例如通过组合化学工艺生成的小分子，或大分子例如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、以上分子的任何修饰衍生物或包含一种或多种以上分子的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，可为单链或双链；可为直链、支链或环形；并且可具有任何长度。核酸包括能够形成双链体的核酸以及形成三链体的核酸。见，例如，美国专利No.5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙酰化酶、去乙酰化酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解旋酶。
外源分子可为与内源分子相同类别的分子，例如外源蛋白质或核酸。例如，外源核酸可包含引入细胞中的感染病毒基因组、质粒或附加体，或通常在细胞中不存在的染色体。将外源分子引入细胞的方法为本领域技术人员已知并且包括但不限于脂质介导的转染(例如，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染和病毒载体介导的转染。
相反，“内源”分子是通常在特殊环境条件下在特殊发育阶段存在于特殊细胞中的分子。例如，内源核酸可包含染色体、线粒体、叶绿体或其它细胞器的基因组或自然生成的附加体核酸。另外的内源分子可包括蛋白质，例如转录因子和酶。
“融合”分子是其中两个或更多个亚基分子优选共价连接的分子。亚基分子可为相同化学类型的分子，或可为不同化学类型的分子。第一类融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如，ZFP DNA结合结构域和裂解结构域之间的融合)和融合核酸(例如，编码上文描述的融合蛋白的核酸)。第二类融合分子的实例包括但不限于形成三链体的核酸与多肽之间的融合，和小沟结合分子与核酸之间的融合。
细胞中融合蛋白的表达可由向细胞递送融合蛋白或通过向细胞递送编码融合蛋白的多核苷酸产生，其中转录多核苷酸，并翻译转录物，以生成融合蛋白。反式剪接、多肽裂解和多肽连接也可与蛋白质在细胞中的表达有牵连。在本发明其它地方提出了多核苷酸和多肽递送至细胞的方法。
为了本发明的目的，“基因”包括编码基因产物(见下文)的DNA区域以及调控基因产物生成的所有DNA区域，无论此类调控序列是否与编码和/或转录序列相邻。相应地，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列(例如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区。
“基因表达”指将基因中所含信息转化为基因产物。基因产物可为基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或其它类型的RNA)或通过mRNA翻译生成的蛋白质。基因产物还包括通过例如帽化、聚腺苷酸化、甲基化和编辑等过程修饰的RNA和通过(例如)甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻基化和糖基化修饰的蛋白质。
基因表达的“调节”指基因表达水平的改变。表达的调节包括但不限于基因活化和基因抑制。也可为全面调节，即其中基因表达完全灭活或活化至野生型水平或超过野生型水平；或可为部分调节，其中基因表达部分减少，或部分活化至野生型水平的某一分数。“真核”细胞包括但不限于真菌细胞(例如酵母属)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人类细胞(例如，T细胞)。
关于两个或更多个组分(例如序列元件)的并置，术语“操作性连接(operative linkage)”和“操作性连接(operatively linked)”(或“可操作连接”)可交换使用，其中排列所述组分以便两个组分正常作用并且容许至少一种组分可介导对至少一种其它组分发挥作用的可能性。举例而言，如果转录调控序列响应于一种或多种转录调控因子的存在或缺乏控制编码序列的转录水平，可使转录调控序列，例如启动子与编码序列操作性连接。转录调控序列通常与编码序列顺式操作性连接，但是不需要与之直接相邻。例如，即使它们不连续，但是增强子是与编码序列操作性连接的转录调控序列。
至于融合多肽，术语“操作性连接(operatively linked)”可指每个组分在与另一组分的连接中进行与如果它不这样连接时将进行的相同作用的事实。例如，至于其中ZFP DNA结合结构域与裂解结构域融合的融合多肽，如果在融合多肽中，ZFP DNA结合结构域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点，而裂解结构域能够裂解邻近靶位点的DNA，则ZFP DNA结合结构域和裂解结构域操作性连接。类似地，至于其中ZFP DNA结合结构域与活化或抑制结构域融合的融合多肽，如果在融合多肽中，ZFP DNA结合结构域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点，而活化结构域能够上调基因表达或抑制结构域能够下调基因表达，则ZFP DNA结合结构域和活化或抑制结构域操作性连接。
蛋白质、多肽或核酸的“功能片段”是其序列与全长蛋白质、多肽或核酸不同，然而保持与全长蛋白质、多肽或核酸相同的功能的蛋白质、多肽或核酸。功能片段可具有比相应天然分子更多、更少或与之相同数量的残基，和/或可含有一个或多个氨基酸或核苷酸取代。测定核酸功能(例如，编码功能、与另一种核酸杂交的能力)的方法在本领域中众所周知。类似地，测定蛋白质功能的方法众所周知。例如，可通过(例如)滤膜结合、电泳迁移率改变或免疫沉淀测定法测定多肽的DNA结合功能。可通过凝胶电泳测定DNA裂解。见Ausubel等，上文。可(例如)通过免疫共沉淀、双杂交测定法或基因和生物化学互补测定蛋白质与另一种蛋白质相互作用的能力。见，例如，Fields等(1989)Nature340:245-246；美国专利No.5,585,245和PCT WO98/44350。
“载体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”指能够指导目标基因的表达并且可将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物以及整合载体。
“报告基因”或“报告序列”指生成易于测量，优选尽管在常规测定法中没有必要测量的蛋白质产物的任何序列。适合的报告基因包括但不限于编码介导抗生素抗性(例如，氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白质的序列，编码有色或荧光或发光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶)和介导增强细胞生长和/或基因扩增的蛋白质(例如，二氢叶酸还原酶)的序列。表位标签包括(例如)一个或多个拷贝的FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可检测的氨基酸序列。“表达标签”包括编码与所需基因序列可操作连接以便监测目标基因的表达的报告子的序列。
概述
本文描述了靶向PD1基因的锌指蛋白-转录因子(ZFP-TF)和/或核酸酶(例如，ZFN)以及包含这些ZFP-TF和/或核酸酶的组合物和使用这些ZFP-TF和/或核酸酶治疗其中PD1异常或不合需要地表达，或其中由于PD1配体过表达而异常或不合需要地利用PD1途径的疾病或病症，包括例如治疗慢性传染性疾病、癌症和/或自身免疫性疾病的方法。为了治疗患有经调节PD1表达得到改善的疾病或病症的受试者，可在体内或离体将本文所述的ZFP-TF和/或核酸酶引入细胞(例如，从患有此类疾病的患者分离的原代细胞)。ZFP-TF和/或ZFN治疗后，可再将细胞引入患者体内以作为药剂用于慢性传染性疾病或癌症的治疗。类似地，可使用已经用PD1特异性ZFN和/或ZFP-TF处理的干细胞。可使这些细胞融合至患病患者体内以治疗此类医疗状况。
因此本文所述的组合物和方法允许调节PD1基因。可根据需要，使用PD1特异性ZFP TF或ZFN敲除、敲下、上调或下调PD1表达。可用ZFP-TF或一种或多种PD1特异性ZFN下调(例如)患有慢性传染性疾病或癌症的患者体内的PD1表达，并且可上调患者，例如有自身免疫性疾病的患者体内的PD1表达。本发明的方法和组合物还提供了包含编码PD1特异性ZFP TF和/或核酸酶的多核苷酸的治疗剂，其中直接向患者施用多核苷酸。进一步地，本发明提供了方法和组合物，其中可将编码ZFP TF和/或核酸酶的多核苷酸并入载体，例如病毒递送媒介物中，以作为治疗剂向患病患者全身施用。
DNA结合结构域
本文描述了包含与PD1基因中的靶位点特异性结合的DNA结合结构域的组合物。任何DNA结合结构域可用于本文公开的组合物和方法中，包括但不限于锌指DNA结合结构域或来自大范围核酸酶的DNA结合结构域。
在某些实施方案中，DNA结合结构域包含锌指蛋白。优选地，锌指蛋白并非自然生成，因为将其工程化为与所选靶位点结合。见，例如，Beerli等(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美国专利No.6,453,242、6,534,261、6,599,692、6,503,717、6,689,558、7,030,215、6,794,136、7,067,317、7,262,054、7,070,934、7,361,635、7,253,273；和美国专利公布No.2005/0064474、2007/0218528、2005/0267061，全部通过引用整体并入本文。
与自然生成的锌指蛋白相比，工程化锌指结合结构域可具有新型结合特异性。工程化方法包括但不限于合理的设计和各类选择。合理的设计包括(例如)使用包含三联(或四联)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联或四联核苷酸序列与结合特殊三联或四联序列的锌指的一个或多个氨基酸序列相关联。见，例如，通过引用整体并入本文的共有美国专利6,453,242和6,534,261。
在美国专利5,789,538、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,410,248、6,140,466、6,200,759和6,242,568以及WO 98/37186、WO 98/53057、WO 00/27878、WO 01/88197和GB 2,338,237中公开了示例性选择方法，包括噬菌体展示和双杂交系统。另外，例如在共有WO 02/077227中已经描述了锌指结合结构域的结合特异性的增强。
另外，正如这些和其它参考中所公开的，可使用任何适合连接子序列，包括(例如)长度为5个或更多个氨基酸的连接子，将锌指结构域和/或多指锌指蛋白连接在一起。同样，见，美国专利No.6,479,626、6,903,185和7,153,949，例如长度为6个或更多个氨基酸的连接子序列。本文所述的蛋白质可包括蛋白质的单独锌指之间适合连接子的任何组合。另外，例如在共有WO 02/077227中已经描述了锌指结合结构域的结合特异性的增强。
本领域的技术人员已知靶位点的选择；ZFP和设计并构建融合蛋白(和编码融合蛋白的多核苷酸)的方法并且在美国专利No.6,140,0815、789,538、6,453,242、6,534,261、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,200,759、WO 95/19431、WO 96/06166、WO 98/53057、WO 98/54311、WO 00/27878、WO 01/60970、WO 01/88197、WO02/099084、WO 98/53058、WO 98/53059、WO 98/53060、WO 02/016536和WO 03/016496中有详细描述。
另外，正如这些和其它参考中所公开的，可使用任何适合连接子序列，包括(例如)长度为5个或更多个氨基酸的连接子，将锌指结构域和/或多指锌指蛋白连接在一起。同样，见，美国专利No.6,479,626、6,903,185和7,153,949，例如长度为6个或更多个氨基酸的连接子序列。本文所述的蛋白质可包括蛋白质的单独锌指之间适合连接子的任何组合。
可选地，DNA结合结构域可源自核酸酶。例如，已知归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的识别序列，例如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。同样见美国专利No.5,420,032；美国专利6,833,252；Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Dujon等(1989)Gene82:115-118；Perler等(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和新英格兰生物实验室目录。另外，可工程化归巢内切核酸酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性以结合非天然靶位点。见，例如，Chevalier等(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat等(2003)Nucleic Acids Res.31:2952-2962；Ashworth等(2006)Nature441:656-659；Paques等(2007)Current Gene Therapy7:49-66；美国专利公布No.20070117128。
在某些实施方案中，DNA结合结构域是与PD1基因中的靶位点结合(以序列特异性方式)并调节PD1表达的工程化锌指蛋白。ZFP可选择性与突变体PD1等位基因或野生型PD1序列结合。PD1靶位点通常包括至少一个锌指，但是可包括几个锌指(例如，2、3、4、5、6个或更多个指)。通常，ZFP包括至少3指。某些ZFP包括4、5或6指。包括3指的ZFP通常识别包括9或10个核苷酸的靶位点；包括4指的ZFP通常识别包括12-14个核苷酸的靶位点；而具有6指的ZFP可识别包括18-21个核苷酸的靶位点。ZFP也可为包括一个或多个调控结构域的融合蛋白，其中这些调控结构域可为转录活化或抑制结构域。
在一些实施方案中，DNA结合结构域是来自源自植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)的TAL效应子的工程化结构域(见Boch等，(2009)Science2009年10月29日(10.1126/science.117881)和Moscou和Bogdanove，(2009)Science2009年10月29日(10.1126/science.1178817)。同样，见，美国专利申请13/068,735。
融合蛋白
还提供了包含如本文所述的DNA结合蛋白(例如，ZFP)和异源调控(功能)结构域(或其功能片段)的融合蛋白。常见结构域包括(例如)转录因子结构域(活化子、抑制子、辅助活化子、辅助抑制子)、沉默子、致癌基因(例如，myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mos家族成员等)；DNA修复酶及其相关因子和修饰因子；DNA重排酶及其相关因子和修饰因子；染色质相关蛋白及其修饰因子(例如激酶、乙酰化酶和去乙酰化酶)；和DNA修饰酶(例如，甲基转移酶、拓扑异构酶、解旋酶、连接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、内切核酸酶)及其相关因子和修饰因子。关于DNA结合结构域和核酸酶裂解结构域融合的详情，见通过引用整体并入本文的美国专利申请公布No.20050064474、20060188987和2007/0218528。
实现活化的适合结构域包括HSV VP16活化结构域(见，例如，Hagmann等，J.Virol.71,5952-5962(1997))核激素受体(见，例如，Torchia等，Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-383(1998))；核因子κB的p65亚基(Bitko&Barik，J.Virol.72:5610-5618(1998)和Doyle&Hunt，Neuroreport8:2937-2942(1997))；Liu等，Cancer Gene Ther.5:3-28(1998))，或人工嵌合功能结构域例如VP64(Beerli等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14623-33)和降解决定子(Molinari等，(1999)EMBO J.18,6439-6447)。另外的示例性活化结构域包括Oct 1、Oct-2A、Sp1、AP-2和CTF1(Seipel等，EMBO J.11、4961-4968(1992)以及p300、CBP、PCAF、SRC1 PvALF、AtHD2A和ERF-2。见，例如，Robyr等(2000)Mol.Endocrinol.14:329-347；Collingwood等(1999)J.Mol.Endocrinol.23:255-275；Leo等(2000)Gene245:1-11；Manteuffel-Cymborowska(1999)Acta Biochim.Pol.46:77-89；McKenna等(1999)J.Steroid Biochem.Mol.Biol.69:3-12；Malik等(2000)TrendsBiochem.Sci.25:277-283；和Lemon等(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504。另外的示例性活化结构域包括但不限于OsGAI、HALF-1、C1、AP1、ARF-5、-6、-7和-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1。见，例如，Ogawa等(2000)Gene245:21-29；Okanami等(1996)Genes Cells1:87-99；Goff等(1991)Genes Dev.5:298-309；Cho等(1999)Plant Mol.Biol.40:419-429；Ulmason等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:5844-5849；Sprenger-Haussels等(2000)Plant J.22:1-8；Gong等(1999)Plant Mol.Biol.41:33-44；和Hobo等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:15,348-15,353。
对于本领域的技术人员而言明显的是，在DNA结合结构域和功能结构域之间的融合蛋白(或编码融合蛋白的核酸)的形成中，活化结构域或与活化结构域相互作用的分子适合作为功能结构域。基本上能够为靶基因恢复活化复合物和/或活化活性(例如，组蛋白乙酰化)的任何分子用作融合蛋白的活化结构域。例如，在共有美国专利申请2002/0115215和2003/0082552和共有WO 02/44376中描述了适合在融合分子中用作功能结构域的绝缘子结构域、定位结构域和染色质重塑蛋白，例如含ISWI的结构域和/或甲基结合结构域蛋白。
示例性抑制结构域包括但不限于KRAB A/B、KOX、TGF-β-诱导早期基因(TIEG)、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMT家族成员(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb和MeCP2。见，例如，Bird等(1999)Cell99:451-454；Tyler等(1999)Cell99:443-446；Knoepfler等(1999)Cell 99:447-450；和Robertson等(2000)Nature Genet.25:338-342。另外的示例性抑制结构域包括但不限于ROM2和AtHD2A。见，例如，Chem等(1996)Plant Cell8:305-321；和Wu等(2000)Plant J.22:19-27。
通过本领域技术人员众所周知的克隆和生物化学缀合方法构建融合分子。融合分子包含DNA结合结构域和功能结构域(例如，转录活化或抑制结构域)。融合分子还任选包含核定位信号(例如，来自SV40基质T抗原的核定位信号)和表位标签(例如，FLAG和血凝素)。设计融合蛋白(和编码融合蛋白的核酸)以便将翻译阅读框保存在融合的组分之中。
通过本领域技术人员众所周知的生物化学缀合方法构建，一方面的功能结构域(或其功能片段)的多肽组分和另一方面的非蛋白DNA结合结构域(例如，抗生素、嵌入剂、小沟结合分子、核酸)之间的融合。见，例如，Pierce Chemical Company(Rockford,IL)目录。已经描述了用于在小沟结合剂和多肽之间产生融合的方法和组合物。Mapp等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3930-3935。
在某些实施方案中，锌指蛋白结合的靶位点存在于细胞染色质的可达区域中。可如(例如)共有国际公布WO 01/83732中所述，确定可达区域。如果靶位点不存在于细胞染色质的可达区域中，可如共有WO 01/83793中所述，产生一个或多个可达区域。在另外的实施方案中，不管其靶位点是否在可达区域内，融合分子的DNA结合结构域均能够与细胞染色质结合。例如，此类DNA结合结构域能够与连接子DNA和/或核小体DNA结合。在某些类固醇受体和肝细胞核因子3(HNF3)中发现这类“先锋”DNA结合结构域。Cordingley等(1987)Cell 48:261-270；Pina等(1990)Cell 60:719-731；和Cirillo等(1998)EMBO J.17:244-254。
正如本领域技术已知，融合分子可与药学上可接受的载体一起配制。见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，1985；和共有WO 00/42219。
融合分子的功能组分/结构域可选自一旦融合分子经由其DNA结合结构域与靶序列结合，就能够影响基因转录的多种不同组分。因此，功能组分可包括但不限于各种转录因子结构域，例如活化子、抑制子、辅助活化子、辅助抑制子和沉默子。
例如，在共有美国专利No.6,534,261和美国专利申请公布No.2002/0160940中公开了另外的示例性功能结构域。
也可选择受外源小分子或配体调控的功能结构域。例如，可采用RheoSwitch技术，其中功能结构域仅在外部RheoChemTM配体的存在下呈现其活性构象(见例如US 20090136465)。因此，ZFP可与可调控功能结构域可操作连接，其中所产生的ZFP-TF活性受外部配体控制。在某些实施方案中，融合蛋白包含DNA结合结构域和裂解(核酸酶)结构域。同样地，可使用核酸酶，例如工程化核酸酶实现基因修饰。工程化核酸酶技术基于对自然生成的DNA结合蛋白的工程化。本文所述的方法和组合物广泛适用并且可牵涉任何目标核酸酶。核酸酶的非限制性实例包括大范围核酸酶和锌指核酸酶。核酸酶可包含异源DNA结合和裂解结构域(例如，锌指核酸酶；大范围核酸酶DNA结合结构域和异源裂解结构域)或，可选地，可改变自然生成的核酸酶的DNA结合结构域以与所选靶位点结合(例如，已经工程化为与同源结合位点不同的位点结合的大范围核酸酶)。例如，已经描述了对具有定制DNA结合特异性的归巢内切核酸酶的工程化，见Chames等(2005)Nucleic Acids Res33(20):e178；Arnould等(2006)J.Mol.Biol.355:443-458和Grizot等2009)Nucleic Acids Res7月7日电子出版物。另外，还已描述了ZFP的工程化。见，例如，美国专利No.6,534,261、6,607,882、6,824,978、6,979,539、6,933,113、7,163,824和7,013,219。
在某些实施方案中，核酸酶为大范围核酸酶(归巢内切核酸酶)。自然生成的大范围核酸酶识别15-40个碱基对的裂解位点并且常分为4个家族：LAGLIDADG家族、GIY-YIG家族、His-Cyst盒家族和HNH家族。示例性归巢内切核酸酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。其识别序列是已知的。同样见美国专利No.5,420,032；美国专利6,833,252；Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388；Dujon等(1989)Gene82:115-118；Perler等(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263:163-180；Argast等(1998)J.Mol.Biol.280:345-353和新英格兰生物实验室目录。
来自于主要来自LAGLIDADG家族的自然生成的大范围核酸酶的DNA结合结构域已经用于促进植物、酵母、果蝇属(Drosophila)、哺乳动物细胞和小鼠中的定点基因组修饰，但是已将这个方法限于修饰保护大范围核酸酶识别序列的同源基因(Monet等(1999),Biochem.Biophysics.Res.Common.255:88-93)或已经引入了识别序列的预工程化基因组(Route等(1994)，Mol.Cell.Biol.14:8096-106；Chilton等(2003)，Plant Physiology.133:956-65；Puchta等(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:5055-60；Rong等(2002)，Genes Dev.16:1568-81；Gouble等(2006)，J.Gene Med.8(5):616-622)。相应地，已经尝试工程化大范围核酸酶以在医学或生物技术相关位点表现出新型结合特异性(Porteus等(2005)，Nat.Biotechnol.23:967-73；Sussman等(2004)，J.Mol.Biol.342:31-41；Epinat等(2003)，Nucleic Acids Res.31:2952-62；Chevalier等(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat等(2003)NucleicAcids Res.31:2952-2962；Ashworth等(2006)Nature 441:656-659；Paques等(2007)Current Gene Therapy7:49-66；美国专利公布No.20070117128、20060206949、20060153826、20060078552和20040002092)。另外，还已经使来自大范围核酸酶的自然生成或工程化的DNA结合结构域与来自异源核酸酶(例如，FokI)的裂解结构域可操作连接。
在其它实施方案中，核酸酶为锌指核酸酶(ZFN)。ZFN包含已经工程化为与所选基因中的靶位点结合的锌指蛋白和裂解结构域或裂解半结构域。
正如上面所提到的，可将锌指结合结构域工程化为与所选序列结合。见，例如，Beerli等(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等(2001)NatureBiotechnol.19:656-660；Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416。与自然生成的锌指蛋白相比，工程化锌指结合结构域可具有新型结合特异性。工程化方法包括但不限于合理的设计和各类选择。合理的设计包括(例如)使用包含三联(或四联)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联或四联核苷酸序列与结合特殊三联或四联序列的锌指的一个或多个氨基酸序列相关联。见，例如，通过引用整体并入本文的共有美国专利6,453,242和6,534,261。
在美国专利5,789,538、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,410,248、6,140,466、6,200,759和6,242,568以及WO 98/37186、WO 98/53057、WO 00/27878、WO 01/88197和GB 2,338,237中公开了示例性选择方法，包括噬菌体展示和双杂交系统。另外，例如在共有WO 02/077227中已经描述了锌指结合结构域的结合特异性的增强。
本领域的技术人员已知靶位点的选择；设计并构建融合蛋白(和编码融合蛋白的多核苷酸)的ZFN和方法并且在通过引用整体并入本文的美国专利申请公布No.20050064474和20060188987中有详细描述。
另外，正如这些和其它参考中所公开的，可使用任何适合连接子序列，包括(例如)长度为5个或更多个氨基酸的连接子，将锌指结构域和/或多指锌指蛋白连接在一起。见，例如，美国专利No.6,479,626、6,903,185和7,153,949，例如长度为6个或更多个氨基酸的连接子序列。本文所述的蛋白质可包括蛋白质的单独锌指之间的适合连接子的任何组合。
核酸酶，例如ZFN和/或大范围核酸酶也包含核酸酶(裂解结构域、裂解半结构域)。正如上面所提到的，裂解结构域可与DNA结合结构域异源，例如来自核酸酶的锌指DNA结合结构域和裂解结构域或来自不同核酸酶的大范围核酸酶DNA结合结构域和裂解结构域。可从任何内切核酸酶或外切核酸酶获得异源裂解结构域。从中得到裂解结构域的示例性内切核酸酶包括但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。见，例如，2002-2003目录，New England Biolabs,Beverly,MA；和Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。已知另外的裂解DNA的酶(例如，S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO内切核酸酶；同样见Linn等(编辑)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。这些酶中的一种或多种(或其功能片段)可用作裂解结构域和裂解半结构域的来源。
类似地，裂解半结构域可源自如以上提出的对于裂解活性而言需要二聚化的任何核酸酶或其一部分。一般而言，如果融合蛋白包含裂解半结构域，裂解需要两个融合蛋白。可选地，可使用包含两个裂解半结构域的单个蛋白。两个裂解半结构域可源自相同内切核酸酶(或其功能片段)，或每个裂解半结构域可源自不同内切核酸酶(或其功能片段)。另外，两个融合蛋白的靶位点优选相对彼此布置，以致两个融合蛋白与它们各自的靶位点的结合使彼此的裂解半结构域置于允许裂解半结构域(例如)通过二聚形成功能裂解结构域的空间方位。因此，在某些实施方案中，靶位点的近边被5-8个核苷酸或15-18个核苷酸分开。然而任何整数的核苷酸或核苷酸对可插入两个靶位点之间(例如，2-50个核苷酸对或更多)。一般而言，裂解位点位于靶位点之间。
限制性内切核酸酶(限制酶)存在于许多物种中并且能够与DNA(在识别位点处)序列特异性结合，并在结合位点或附近裂解DNA。某些限制酶(例如，IIS类)在远离识别位点的位点处裂解DNA并且具有可分离的结合和裂解结构域。例如，IIS类酶Fok I催化在一条链上距其识别位点9个核苷酸而在另一条链上距其识别位点13个核苷酸处的DNA双链裂解。见，例如，美国专利5,356,802、5,436,150和5,487,994；以及Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279；Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS类限制酶的裂解结构域(或裂解半结构域)和可能工程化或未工程化的一个或多个锌指结合结构域。
裂解结构域可与结合结构域分离的示例性IIS类限制酶为Fok I。这种特殊的酶呈二聚体时有活性。Bitinaite等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10,570-10,575。相应地，为了本发明的目的，将公开的融合蛋白中所用的Fok I酶部分视为裂解半结构域。因此，对于使用锌指-Fok I融合进行细胞序列的靶向双链裂解和/或靶向置换，可使用两个各包含一个FokI裂解半结构域的融合蛋白重组具催化活性的裂解结构域。可选地，也可使用含有一个锌指结合结构域和两个Fok I裂解半结构域的单个多肽分子。本发明其它地方提供了使用锌指-FokI融合进行靶向裂解和靶向序列改变的参数。
裂解结构域或裂解半结构域可为保持裂解活性，或保持多聚化(例如，二聚化)形成功能裂解结构域的能力的任何蛋白质部分。
在整体并入本文的国际公布WO 07/014275中描述了示例性IIS类限制酶。另外的限制酶也含有可分离的结合和裂解结构域，并且这些涵盖于本发明。见，例如，Roberts等(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。
在某些实施方案中，裂解结构域包含一个或多个最大限度减少或防止同型二聚化的工程化裂解半结构域(也称为二聚结构域突变体)，例如美国专利公布No.20050064474和20060188987以及美国申请No.11/805,850(2007年5月23日提交)中所述，其全部的公开内容通过引用整体并入本文。在Fok I的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538的氨基酸残基全部是影响Fok I裂解半结构域二聚化的靶标。
形成专性杂二聚体的Fok I的示例性工程化裂解半结构域包括一对半结构域，其中第一裂解半结构域包括在Fok I的位置490和538的氨基酸残基处的突变并且第二裂解半结构域包括在氨基酸残基486和499处的突变。
因此，在一个实施方案中，490处的突变用Lys(K)置换Glu(E)；538处的突变用Lys(K)置换Iso(I)；486处的突变用Glu(E)置换Gln(Q)；并且位置499处的突变用Lys(K)置换Iso(I)。具体地说，通过使一个裂解半结构域中的位置490(E→K)和538(I→K)突变以生成命名为“E490K:I538K”的工程化裂解半结构域并且使另一裂解半结构域中的位置486(Q→E)和499(I→L)突变以生成命名为“Q486E:I499L”的工程化裂解半结构域制备本文所述的工程化裂解半结构域。本文所述的工程化裂解半结构域是专性杂二聚体突变体，其中最大限度减少或消除了异常裂解。见，例如，美国临时申请No.60/808,486(2006年5月25日提交)的实施例1，其公开内容通过引用整体并入用于所有目的。
可使用任何适合方法，例如，通过定点诱变野生型裂解半结构域(Fok I)制备本文所述的工程化裂解半结构域，如美国专利公布No.20050064474的实施例5和美国专利公布No.2007/0305346和2008/0131962的实施例38和2010年2月8日提交的美国专利临时申请No.61/337,769和2010年9月23日提交的美国专利临时申请No.61/403,916所述。
可使用本领域已知的方法容易地设计核酸酶表达构建体。见，例如，美国专利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060188987、20060063231；和国际公布WO07/014275。在某些实施方案中，核酸酶的表达受诱导型启动子的控制，例如在棉子糖和/或半乳糖的存在下活化(去抑制)而在葡萄糖的存在下抑制的半乳糖激酶启动子。具体而言，诱导半乳糖激酶启动子并且在碳源连续变化(例如，从葡萄糖变为棉子糖，再变为半乳糖)后表达核酸酶。诱导型启动子的其它非限制性实例包括CUP1、MET15、PHO5和四环素响应启动子。
递送
可通过任何适合方式将本文所述的蛋白质(例如，ZFP)、编码蛋白质的多核苷酸和包含蛋白质和/或多核苷酸的组合物递送至靶细胞。适合细胞包括但不限于真核和原核细胞和/或细胞系。此类细胞或由此类细胞产生的细胞系的非限制性实例包括COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6细胞以及昆虫细胞(例如，草地贪夜蛾(Spodopterafugiperda)(Sf))或真菌细胞(例如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))。在某些实施方案中，细胞系为CHO-K1、MDCK或HEK293细胞系。适合的原代细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和其它血细胞亚类，例如但不限于CD4+T细胞或CD8+T细胞。适合的细胞还包括干细胞，举例而言，例如胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。
例如，在美国专利No.6,453,242、6,503,717、6,534,261、6,599,692、6,607,882、6,689,558、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219和7,163,824中描述了递送如本文所述的包含锌指蛋白的蛋白质的方法，其全部的公开内容通过引用整体并入本文。
也可使用含有编码一种或多种锌指蛋白的序列的载体递送如本文所述的锌指蛋白。可使用任何载体系统，包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等。同样，见，美国专利No.6,534,261、6,607,882、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219和7,163,824，通过引用整体并入本文。此外，显而易见的是，这些载体的任一种可包含一个或多个锌指蛋白编码序列。因此，将一个或多个ZFP引入细胞中时，可在相同载体或不同载体上携带ZFP。当使用多种载体时，每种载体可包含编码一种或多种ZFP的序列。
可使用常规的基于病毒或不基于病毒的转基因方法将编码工程化ZFP的核酸引入细胞(例如，哺乳动物细胞)和靶组织中。此类方法也可用于向体外细胞施用编码ZFP的核酸。在某些实施方案中，施用编码ZFP的核酸作体内或离体基因疗法使用。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、裸露核酸和与递送媒介物，例如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有附加体或整合基因组。对于基因疗法过程的评论，见Anderson，Science256:808-813(1992)；Nabel和Felgner，TIBTECH11:211-217(1993)；Mitani和Caskey，TIBTECH11:162-166(1993)；Dillon，TIBTECH 11:167-175(1993)；Miller，Nature357:455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology6(10):1149-1154(1988)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience8:35-36(1995)；Kremer和Perricaudet，British Medical Bulletin51(1):31-44(1995)；Haddada等，在Current Topics in Microbiology and Immunology中Doerfler和
Figure BDA00003355769300281
(编辑)(1995)；和Yu等，Gene Therapy1:13-26(1994)。
核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪法、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸偶联物、裸露DNA、人工病毒粒子和试剂增强的DNA摄取。使用(例如)Sonitron2000系统(Rich-Mar)的声孔效应也可用于递送核酸。
另外的示例性核酸递送系统包括Amaxa
Figure BDA00003355769300291
Biosystems(Cologne,Germany)、Maxcyte,Inc.(Rockville,Maryland)、BTX MolecularDelivery Systems(Holliston,MA)和Copernicus Therapeutics Inc.提供的核酸递送系统(见例如US6008336)。例如，在US 5,049,386、US4,946,787和US 4,897,355中描述了脂质转染并且脂质转染试剂在市场上有售(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。适合多核苷酸的有效受体-识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括Felgner，WO 91/17424,WO 91/16024。可向细胞(离体施用)或靶组织(体内施用)递送。
脂质:核酸复合物，包括靶向脂质体(例如免疫脂质复合物)的制备为本领域技术人员众所周知(见，例如，Crystal，Science270:404-410(1995)；Blaese等，Cancer Gene Ther.2:291-297(1995)；Behr等，Bioconjugate Chem.5:382-389(1994)；Remy等，Bioconjugate Chem.5:647-654(1994)；Gao等，Gene Therapy2:710-722(1995)；Ahmad等，Cancer Res.52:4817-4820(1992)；美国专利No.4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。
另外的递送方法包括使用将待递送的核酸包装至EnGeneIC递送媒介物(EDV)中。特别地，使用双特异性抗体将这些EDV递送至靶组织，其中所述抗体的一条臂对靶组织有特异性而另一条臂对EDV有特异性。抗体将EDV带到靶细胞表面，然后通过胞吞作用将EDV带到细胞中。一旦进入细胞，就释放内容物(见MacDiarmid等(2009)Nature Biotechnology第27卷(7)第643页)。
使用基于RNA或DNA病毒的系统递送编码工程化ZFP的核酸利用高度发展过程将病毒靶向体内特异性细胞并且将病毒有效载荷运输至细胞核。可向患者(体内)直接施用病毒载体或可使用病毒载体处理体外细胞并向患者(离体)施用经修饰细胞。常规的基于病毒的ZFP递送系统包括但不限于用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘和单纯疱疹病毒。可能用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒转基因方法在宿主基因组中整合，往往导致插入的转基因长期表达。另外，已经在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
可通过并入外来包膜蛋白，扩展潜在目标群体的靶细胞来改变逆转录病毒的向性。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。逆转录病毒转基因系统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体由具有高达6-10kb外来序列的包装能力的顺式作用长末端重复序列构成。最小顺式作用LTR对复制和包装载体有效，然后可将其用于将治疗基因整合至靶细胞中以提供永久转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病毒(MuLV)、长臂猿白血病毒(GaLV)、猿猴免疫缺损病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的逆转录病毒载体(见，例如，Buchscher等，J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等，J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommerfelt等，Virol.176:58-59(1990)；Wilson等，J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等，J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。
在优选瞬时表达的应用中，可使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中非常高效地转导而不需要细胞分裂。用此类载体，已经获得高滴度和高表达水平。在相对简单的系统中可大量生成这种载体。例如，在核酸和肽的体外生成和体内和离体基因治疗过程中，也使用腺相关病毒(“AAV”)载体用靶核酸转导细胞(见，例如，West等，Virology160:38-47(1987)；美国专利No.4,797,368；WO 93/24641；Kotin，Human Gene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka，J.Clin.Invest.94:1351(1994)。在许多出版物中描述了重组AAV载体的构建体，包括美国专利No.5,173,414；Tratschin等，Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等，Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat和Muzyczka，PNAS 81:6466-6470(1984)；和Samulski等，J.Virol.63:03822-3828(1989)。
至少6种病毒载体方法目前可用于临床试验中的基因转移，其利用牵涉由插入辅助细胞系的基因补充缺陷型载体的方法生成转导剂。
pLASN和MFG-S是已经用于临时试验的逆转录病毒载体的实例(Dunbar等，Blood85:3048-305(1995)；Kohn等，Nat.Med.1:1017-102(1995)；Malech等，PNAS 94:2212133-12138(1997))。PA317/pLASN是用于基因疗法试验的首例治疗载体。(Blaese等，Science270:475-480(1995))。已经对MFG-S包装载体观察到50%或更高的转导效率。(Ellem等，Immunol Immunother.44(1):10-20(1997)；Dranoff等，Hum.Gene Ther.1:111-2(1997)。
重组腺相关病毒载体(rAAV)是基于缺陷型和非病原性细小病毒2型腺相关病毒的有前景的替代基因递送系统。所有载体源自仅保留了在转基因表达盒两侧的AAV 145 bp反向末端重复序列的质粒。因整合至转导细胞基因组中而产生的有效基因转移和稳定的转基因递送是这种载体系统的主要特征。(Wagner等，Lancet 351:9117 1702-3(1998)，Kearns等，Gene Ther.9:748-55(1996))。根据本发明也可使用其它AAV血清型，包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6和AAV8。
复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad)可在高滴度下生成并易于感染许多不同细胞类型。工程化大多数腺病毒载体，以致转基因置换AdE1a、E1b和/或E3基因；随后复制缺陷型载体在以反式作用提供缺失基因功能的人293细胞中增殖。Ad载体可转导多种类型的体内组织，包括非分裂、分化细胞，例如在肝脏、肾脏和肌肉中发现的细胞。常规的Ad载体具有大承载能力。Ad载体用于临床试验的实例牵涉经肌肉内注射进行抗肿瘤免疫接种的多核苷酸疗法(Sterman等，Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998))。腺病毒载体用于临床试验中进行基因转移的另外的实例包括Rosenecker等，Infection24:1 5-10(1996)；Sterman等，Hum.Gene Ther.9:7 1083-1089(1998)；Welsh等，Hum.Gene Ther.2:205-18(1995)；Alvarez等，Hum.Gene Ther.5:597-613(1997)；Topf等，Gene Ther.5:507-513(1998)；Sterman等，Hum.GeneTher.7:1083-1089(1998)。
包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。此类细胞包括包装腺病毒的293细胞和包装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。通常由将核酸载体包装至病毒颗粒中的生产细胞系产生基因疗法中所用的病毒载体。载体通常含有包装和随后整合至宿主中所需的最小病毒序列(若适用)，编码待表达蛋白质的表达盒置换的其它病毒序列。由包装细胞系以反式作用提供缺少的病毒功能。例如，基因疗法中所用的AAV载体通常仅具有来自AAV基因组，包装并整合至宿主基因组中所需的反向末端重复(ITR)序列。病毒DNA包装在含有编码其它AAV基因(即，rep和cap)，但是缺乏ITR序列的辅助质粒的细胞系中。也用作为辅助因子的腺病毒感染细胞系。辅助病毒促进AAV载体的复制和来自复制质粒的AAV基因的表达。由于缺乏ITR序列，未包装足够量的辅助质粒。例如，可通过对比AAV更敏感的腺病毒进行热处理减少腺病毒污染。
在许多基因治疗应用中，期望以高度特异性将基因治疗载体递送至特殊细胞类型中。相应地，可通过在病毒外表面上使配体表达呈与病毒外壳蛋白的融合蛋白，将病毒载体修饰为对指定细胞类型有特异性。选择对已知在目标细胞类型上存在的受体有亲和力的配体。例如，Han等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995)，报道了可修饰莫洛尼鼠白血病病毒以表达与gp70融合的人调蛋白(heregulin)，并且重组病毒感染表达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。可将这种原理扩展至其它病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体而病毒表达包含细胞表面受体的配体的融合蛋白。例如，可工程化丝状噬菌体以展示对实际上任何所选细胞受体有特异性结合亲和力的抗体片段(例如，FAB或Fv)。虽然以上描述主要适用于病毒载体，但是相同原理可应用于非病毒载体。可将此类载体工程化为含有促进特异性靶细胞摄取的特异性摄取序列。
可通过向个别患者施用，通常通过如下所述的全身施用(例如，静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下或颅内输注)或局部应用在体内递送基因治疗载体。可选地，可将载体递送至离体细胞，例如从个别患者外移植的细胞(例如，淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检)或万能供体造血干细胞，接着再将细胞植入患者体内，通常在选择已经并入载体的细胞后。
用于诊断、研究或基因疗法的离体细胞转染(例如，通过将转染细胞再输注至宿主生物体内)为本领域的技术人员众所周知。在一个优选的实施方案中，从受试生物体分离细胞，用ZFP核酸(基因或cDNA)转染，并再输注回受试生物(例如，患者)体内。适合离体转染的各种细胞类型为本领域的技术人员众所周知(见，例如，Freshney等，Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique(1994年第3版))和本文引用的讨论如何从患者体内分离并培养细胞的参考)。
适合的细胞包括但不限于真核和原核细胞和/或细胞系。此类细胞或由此类细胞产生的细胞系的非限制性实例包括COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6细胞以及昆虫细胞(例如，草地贪夜蛾(Sf))或真菌细胞(例如酵母属、毕赤酵母属和裂殖酵母属)。在某些实施方案中，细胞系为CHO-K1、MDCK或HEK293细胞系。另外，可分离原代细胞并且在离体用ZFN处理后用于再引入待治疗的受试者体内。适合的原代细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和其它血细胞亚类，例如但不限于CD4+T细胞或CD8+T细胞。适合的细胞还包括干细胞，举例而言，例如胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。
在一个实施方案中，将干细胞用于离体手术中进行细胞转染和基因治疗。使用干细胞的优点在于，它们可在体外分化为其它细胞类型，或可引入哺乳动物(例如细胞供体)中，在那里它们将植入骨髓。已知使用细胞因子，例如GM-CSF、IFN-γ和TNF-α，使体外CD34+细胞分化为临床上重要的免疫细胞类型的方法(见Inaba等，J.Exp.Med.176:1693-1702(1992))。
使用已知方法分离细胞进行转导和分化。例如，通过淘选具有结合有害细胞的抗体的骨髓细胞，例如CD4+和CD8+(T 细胞)、CD45+(panB细胞)、GR-1(粒细胞)和Iad(分化抗原呈递细胞)，从骨髓中分离干细胞(见Inaba等，J.Exp.Med.176:1693-1702(1992))。
在一些实施方案中也使用已经修饰的干细胞。例如，可使用已经使其对细胞凋亡有抗性的干细胞作为治疗组合物，其中干细胞也含有本发明的ZFP TF。例如，可使用BAX-或BAK-特异性ZFN(见，美国专利申请no.12/456,043)敲除干细胞中的BAX和/或BAK，或(例如)再次使用半胱天冬酶-6特异性ZFN敲除半胱天冬酶中破坏的BAX和/或BAK产生对细胞凋亡的抗性。可用已知调控突变或野生型PD1的ZFP TF转染这些细胞。
也可向生物体直接施用含有治疗性ZFP核酸的载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、脂质体等)以转导体内细胞。可选地，可施用裸露DNA。可通过常用于将分子引入与血液或组织细胞的最终接触的任何途径施用，包括但不限于注射、输注、局部应用和电穿孔。施用此类核酸的适合方法可用并且为本领域的技术人员众所周知，并且，虽然可使用一种以上的途径施用特殊组合物，但是一种特殊途径往往可提供比另一种途径更直接且更有效的反应。
例如，在美国专利No.5,928,638中公开了将DNA引入造血干细胞中的方法。对于将转基因引入造血干细胞(例如，CD34+细胞)中有用的载体包括35型腺病毒。
适于将转基因引入免疫细胞(例如，T细胞)中的载体包括非整合慢病毒载体。见，例如，Ory等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11382-11388；Dull等(1998)J.Virol.72:8463-8471；Zuffery等(1998)J.Virol.72:9873-9880；Follenzi等(2000)Nature Genetics25:217-222。
部分由施用的特殊组合物，以及用于施用所述组合物的特殊方法确定药学上可接受的载体。相应地，如下所述，存在多种多样的可用药物组合物的适合制剂(见，例如，Remington’s PharmaceuticalSciences，第17版，1989)。
应用
公开的组合物和方法可用于需要调节一个或多个PD1基因的表达的任何应用中。具体而言，需要调节PD1等位基因时可使用这些方法和组合物，包括但不限于治疗和研究应用。所述方法和组合物可用于治疗慢性传染性疾病，例如HIV/AIDS和HCV。另外，所述方法和组合物可用于治疗癌症，例如黑素瘤、卵巢癌、结直肠癌/结肠癌、肾细胞癌、浆细胞瘤/骨髓瘤、乳腺癌和肺癌。
抑制PD1的ZFP TF或ZFN可用作治疗剂的疾病和病状包括但不限于慢性传染性疾病和癌症。活化PD1基因作为治疗处理有用的疾病和病状包括自身免疫性疾病，例如全身性红斑狼疮(SLE)。编码ZFP TF或ZFN的多核苷酸本身可用作治疗剂，或可并入载体中递送。
包含抑制PD1等位基因的ZFP-TF和/或PD1特异性ZFN的方法和组合物也可连同设计用于治疗慢性传染性疾病或癌症的其它治疗剂一起使用。这些ZFP或ZFN(或编码这些ZFP或ZFN的多核苷酸)可同时施用(例如，在相同药物组合物中)或可按任何顺序依次施用。可治疗任何类型的癌症，包括但不限于肺癌、胰腺癌、肝癌、骨癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤、脑癌等。类似地，设计用于活化PD1等位基因的ZFP TF可与设计用于治疗自身免疫性疾病的其它治疗剂一起使用。
用于治疗的方法和组合物还包括细胞组合物，其中已经使用PD1特异性ZFN将从患者分离的细胞内突变拷贝的PD1等位基因修饰为野生型PD1等位基因。然后再将这些体外修饰细胞引入患者体内。另外，还预想了包含经修饰干细胞的方法和组合物。例如，其中已经使用PD1特异性ZFN将干细胞内突变拷贝的PD1等位基因修饰为野生型PD1等位基因的干细胞组合物。在其它实施方案中，提供了干细胞组合物，其中已经使用PD1特异性ZFN修饰干细胞内的野生型PD1等位基因。这些组合物可连同其它治疗剂一起使用。这些组合物可同时施用(例如，在相同药物组合物中)或可按任何顺序依次施用。
本发明的方法和组合物对体外和体内模型，例如慢性感染、癌症或自身免疫的动物模型的设计和实现也有用，从而允许对这些病症的研究并进一步发现有用的治疗剂。
下列实施例涉及其中核酸酶包含ZFN的本发明的示例性实施方案。应了解，这仅仅是为了举例说明并且可使用其它核酸酶，例如具有工程化DNA结合结构域和/或自然生成的工程化归巢内切核酸酶(大范围核酸酶)DNA结合结构域和异源裂解结构域融合的归巢内切核酸酶(大范围核酸酶)。
实施例
实施例1：鉴定具持久生物活性的PD1特异性ZFN
使ZFN装配在人PD1基因上并通过Miller等(2007)Nat.Biotechnol.25:778-785和美国专利公布No.20050064474和国际专利公布WO2005/014791中所述的ELISA和CEL1测定法测试。
表1中公开了ZFP的特定实例。这个表中的第一栏为ZFP的内部引用名称(数字)。表2列出了PD1上的靶结合位点。“F”指指并且“F”后面的数字指哪个锌指(例如，“F1”指第1指)。
表1：人PD1靶向锌指蛋白
Figure BDA00003355769300371
Figure BDA00003355769300381
Figure BDA00003355769300391
表2：人PD1基因中的ZFN靶位点
SBS# 靶位点
12942 ccAGGGCGCCTGTGGGAtctgcatgcct(SEQ ID NO:56)
12946 caGTCGTCTGGGCGGTGctacaactggg(SEQ ID NO:57)
12947 caGTCGTCTGGGCGGTGctacaactggg(SEQ ID NO:57)
12934 gaACACAGGCACGGctgaggggtcctcc(SEQ ID NO:58)
12971 ctGTGGACTATGGGGAGCTGgatttcca(SEQ ID NO:59)
12972 ctGTGGACTATGGGGAGCTGgatttcca(SEQ ID NO:59)
18759 caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQ ID NO:60)
22237 ccAGGGCGCCTGTGGGAtctgcatgcct(SEQ ID NO:56)
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25041 caGTCGTCTGGGCGGTGct(SEQ ID NO:60)
对如上所述经核转染的细胞样品进行初始体外活性测定。简言之，通过使用生产商指定的AmaxaTM核转染试剂盒进行转染，将编码ZFP-FokI融合蛋白的质粒引入K562细胞中。为了转染，使两百万个K562细胞与不同量的每种锌指核酸酶表达质粒和100μL AmaxaTM溶液V混合。于Amaxa Nucleofector IITM中，使用程序T-16转染细胞。转染后立即将细胞分到两个不同的烧瓶中并且使其在30℃或37℃下，于5%CO2中，在补充了10%FBS的RPMI培养基(Invitrogen)中生长4天。
对于这种初始体外筛选，鉴定两个前导ZFN对并提交细化以便设法提高其效率。这些对分别靶向PD1基因的外显子1和5。在基本上如上所述的时程实验中再次测试细化(改良)蛋白。以下表3中总结了结果。
表3：PD1 NHEJ
Figure BDA00003355769300411
如表3所示，用对外显子5设计的ZFN处理细胞引起从群体中丢失更大比例的基因组编辑细胞，而用对外显子1设计的ZFN处理的细胞中的基因组编辑信号更加稳定。
为测定PD1基因座处的ZFN活性，基本上按照生产商的说明(Trangenomic SURVEYORTM)进行基于Cel-1的SURVEYORTM核酸酶测定。收获细胞并且根据生产商的指示(Epicentre
Figure BDA00003355769300412
)使用QuickextractTM试剂盒制备染色体DNA。使用AccuprimeTM高保真DNA聚合酶(Invitrogen)PCR扩增PD1基因座的适当区域。加热PCR反应至94℃，并逐渐冷却至室温。约200ng的退火DNA与0.33μL Cel-I酶混合并且在42℃下孵育20min。于1 XTris-硼酸盐-EDTA缓冲液中，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应产物。
还测试了在30℃或37℃下保存了3或10天的原代PBMC样品中的构建体(见表4)。简言之，由AllCells获得PBMC并且于RPMI+10% FBS+1% L-谷氨酰胺(30mg/mL)+IL-2(1ng/mL，Sigma)中培养并且根据生产商的方法(Dynal)用抗CD3/CD28珠活化。按1mL体积中3E5个细胞/mL将细胞接种于24孔板中。
构建体含有所述目标ZFN对的腺病毒载体(见美国专利公布20080159996)并于2天后按10、30或100的MOI添加(基于感染滴度计算MOI)。
暴露于病毒后3或10天收获细胞并且使用如国际专利公布WO07/014275中所述进行的基于Cel-I的SURVEYORTM核酸酶测定法测定基因修饰效率。同样，见，Oleykowski等(1998)Nucleic Acids Res.26:4597-4602；Qui等(2004)BioTechniques36:702-707；Yeung等(2005)BioTechniques 38:749-758。
对于表4中所示的ZFN对，每个ZFN与ZFN 12942联合测试。通过上述基于Cel-1的SURVEYORTM核酸酶测定法测量，按照NHEJ活性百分比测量活性。
还测试了另外的PD1特异性ZFN对在如上所述的原代PBMC中的活性，并且将结果示于表4中。在表4所示的数据中，PD1特异性单体12942总是与表4中所列的第二ZFN配对以形成活性对(即ZFN12942与ZFN 12947-25041的每一个配对)。同样，见，图1(样品如表4所示)。
表4：PD1 ZFN的活性
Figure BDA00003355769300421
Figure BDA00003355769300431
为在分子水平上测定ZFN驱动的NHEJ活性的局部作用，用外显子1特异性ZFN对12942和12947处理CD8+细胞。简言之，从AllCells购买CD8+细胞并且于RPMI+10% FBS+1% L-谷氨酰胺(30mg/mL)+IL-2(30μg/mL，Sigma)中培养并使其静置4-24h。
构建含有如上所述的目标ZFN对的质粒并且1e6细胞/核转染与生产商指定的AmaxaTM核转染试剂盒一起使用。根据生产商的方法(Dynal)核转染后12-24h，用抗CD3/CD28珠活化细胞。
核转染后3或10天收获细胞并且使用如国际专利公布WO07/014275所述进行的基于Cel-1的SURVEYORTM核酸酶测定法测定基因修饰效率。同样，见，Oleykowski等(1998)Nucleic Acids res.26:4597-4602；Qui等(2004)BioTechniques36:702-707；Yeung等(2005)BioTechniques38:749-758。
克隆PCR产物并转染至大肠杆菌(E.coli)中。使抗生素抗性亚克隆长大，分离质粒，然后进行序列分析以观测由于NHEJ已经发生的任何序列改变(见图2)。如图中可见，在ZFN裂解位点附近观察到多个插入和缺失。
还在如美国公布No.20090111119中所述的酵母系统中测试了这些ZFN。
实施例2：小鼠内PD1特异性ZFN的离体活性
为测试体内除去PD1的概念，如上所述制备小鼠PD1特异性ZFN，然后在离体测试。以下表5和6中示出了锌指结构域的序列特征，及其结合特异性。
表5：鼠PD1特异性锌指设计
Figure BDA00003355769300441
表6：鼠PD1特异性锌指设计的结合特异性
SBS# 靶位点
14534 gtGCTGCAGTTGAGCTGgcaatcagggt(SEQ ID NO:75)
14534-FokI KK gtGCTGCAGTTGAGCTGgcaatcagggt(SEQ ID NO:75)
14536 ccCAAGTGAATGACCAGGGTacctgccg(SEQ ID NO:76)
14536-FokI EL ccCAAGTGAATGACCAGGGTacctgccg(SEQ ID NO:76)
14545 caGCTGCCCAACAGGCAtgacttccaca(SEQ ID NO:77)
14545-FokI KK caGCTGCCCAACAGGCAtgacttccaca(SEQ ID NO:77)
14546 atGATCTGGAAGCGGGCatcctggacgg(SEQ ID NO:78)
14546-FokI EL atGATCTGGAAGCGGGCatcctggacgg(SEQ ID NO:78)
第1天，将从Pmel TCR转基因/Rag1-/-小鼠收获的脾细胞加工为单细胞悬液并且再悬浮于完全培养基(RPMI-1640、10%胎牛血清、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、50μg/ml硫酸庆大霉素、50μM 2-巯基乙醇)中，25μl Invitrogen小鼠T-活化剂CD3/CD28 Dynabeads/106个细胞。按2×106个细胞/ml(2ml/孔)将细胞接种于24孔板中。第3天，收获细胞，使用磁铁从珠中分离细胞并计数。按照与AmaxaTM核转染试剂盒一起提供的方法进行脾细胞的转染。简言之，将1×10e7个活细胞再悬浮于100μl的Amaxa核转染剂溶液中并且用4μg含ZFN对14546和14545的质粒，或4μg含ZFN对14546 FokI EL和14545-Fok I KK的突变型PD1 Fok1质粒，2.5μg的Amaxa pmax GFP载体或无DNA对照，使用Amaxa核转染剂(程序X-01)转染。转染后，在30℃下于2ml充分补充的Amaxa小鼠T细胞核转染剂培养基中培养细胞。第二天，去除1ml的Amaxa小鼠T细胞核转染剂培养基并且替换为1ml补充了10U/ml IL-2的完整培养基。2天后，收获细胞并计数。将2百万个来自每一组的细胞接种于24孔板上涂有抗CD3的孔中。第二天，收获细胞并且用抗PD1 PE、抗CD3 PE-Cy7和抗CD8 APC染色。在BD FACSCalibur上分析细胞。图中显示每一组中的PD1阳性CD3+CD8+细胞%和每一组的中值PD1荧光性(见图3)。数据显示，在接受了PD1特异性ZFN的细胞中，即使在CD3刺激存在下，PD1表达降低。
为验证在稍后的时间点，PD1表达减少明显，还在CD3刺激后72h，而非如上所述的CD3刺激后24h收获细胞。收获细胞并且用抗PD1 PE、抗CD3 PE-Cy7和抗CD8APC染色。在BD FACSCalibur上分析细胞。图4中呈现了数据。上部直方图示出了每一组中PD1阳性CD3+CD8+细胞%和每一组的中值PD1荧光性。下图示出了PD1/CFSE表达细胞的频率。重要的是，突变型PD1 Fok1和野生型PD1 Fok1显示出比对照组更高的PD1阴性CFSE二聚(分裂细胞)频率，并且证明，即使在抗CD3刺激后72h经PD1特异性ZFN处理的细胞中PD1表达仍减少。
实施例3：TIL中人PD1特异性ZFN的活性
在肿瘤存在下，测试人肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中的人PD1特异性ZFN并且基本上如上所述并使用本领域已知的方法测定(见例如Yoshino等，(1992)Cancer Research 52:775-781)。使用如上所述的抗CD3抗体活化PD1特异性ZFN，然后用表达PD1特异性ZFN的Ad5/F35腺病毒转导细胞。用IL2使细胞展开，然后用抗CD3抗体或肿瘤再次刺激细胞并且在刺激24h后测定。结果示于以下表7中。
表7：TIL中的PD1表达和活力
Figure BDA00003355769300461
表7中的数据证明，当用抗CD3抗体刺激细胞时，通过PD1特异性ZFN的作用，降低PD1表达，导致细胞活力增强。当用肿瘤处理转导细胞时，观察到相同的现象-ZFN介导的PD1减少导致TIL活力增强。同样，数据显示，转导TIL中PD1表达降低导致肿瘤细胞活力降低。
实施例4：PD1编辑的原代人T细胞的纯化
如以上实施例1中所述，测试CD4+T细胞中已经进一步详细阐述的PD1特异性ZFN对。如图5中所见，对一些对观察到高达44%的编辑。在这个实验中，‘阳性对照’指先前在不同实验条件下进行的在CD8+T细胞中使用25025/12942 ZFN对切割。
选择一个前导对，25029/12942，进一步用于分离PD1修饰细胞。简言之，在这些实验中，用编码PD1特异性ZFN的mRNA处理CD4+T细胞，在“30℃”条件下培养，然后如以上实施例1中所述，经首次暴露于刺激ZFN转基因强烈表达并促进PD1基因座处裂解的抗CD3/CD8珠(Dynal)刺激(见美国专利公布No.20080311095)。在这首次刺激后，再次刺激细胞并通过FAC或亲和色谱法进行纯化过程。
简言之，用CCR5特异性ZFN(见美国专利公布20080159996)或PD1特异性ZFN处理CD4+T细胞。(i)在首次刺激后，(ii)在第二次刺激之后，但是在任何纯化之前，(iii)使用标准方法对CD25+(活化标志)，PD1(-)进行细胞分选之后，或(iv)在使用用抗PD1抗体或抗CD25抗体制备的基质进行亲和色谱法之后，收集细胞并通过Cel-I测定法(上述)分析PD1编辑。
如图6所示，使用细胞分选技术(分离对CD25呈阳性，但是对PD1呈阴性的细胞)，通过Cel-I测定法测定，发现多达56%的回收细胞已被修饰。通过Cel-1分析测定，通过亲和色谱技术(使细胞通过使用抗PD1抗体、抗CD25抗体或二者制备的亲和基质)纯化的PD1(-)细胞展示出高达42%的总体PC1修饰。
还通过测序分析了已经通过细胞分选纯化的细胞的PD1基因座，并且在以下表8中呈现了结果。如从表中可见，通过Cel-I分析预测的靶标修饰百分比(‘%NHEJ’)与通过测序分析发现的靶标修饰百分比相似。在这个表中，‘样品’标记与图6中所示的相对应。
表8：CD25+细胞中的PD1修饰百分比
Figure BDA00003355769300481
*：‘修饰数量’指测序组中观察到的被修饰的序列数量。例如，在样品4中，分析的87个序列中有54个被修饰。
还测试了CD8+T细胞中的PD1特异性ZFN。在这个实验中，使用Ribomax大规模RNA生成T7试剂盒(Promega)，接着使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)，根据生产商的方法生成编码PD1特异性ZFN的mRNA。使用如上所述的Amaxa核转染递送系统，使用不同量的mRNA转导细胞，并通过Cel I测定法分析PD1修饰百分比。
如图7所示，描述为‘%NHEJ’的观察到的修饰量与所用mRNA量相关，输入mRNA的量越少，产生的靶标修饰百分比越少。
这些结果证明，本文描述的PD1特异性ZFN能够修饰细胞系和原代T细胞中的PD1基因座。
本文提到的所有专利、专利申请和出版物据此通过引用整体并入。
虽然为了清楚的理解，已经通过举例说明和实施例的方式相当详细地提供了公开内容，但是对于本领域的技术人员而言显而易见的是，在不背离公开内容的精神或范围的前提下，可实践各种变化和修改。相应地，不得将前述说明和实施例解释为限制。

Claims (15)

1.一种与PD1基因中的靶位点结合的锌指蛋白，其中所述靶位点选自SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78。
2.一种融合蛋白，其包含根据权利要求1所述的锌指蛋白和功能结构域。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述功能结构域包括转录调控结构域。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述转录调控结构域为活化结构域或抑制结构域。
5.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述功能结构域包括裂解结构域或裂解半结构域。
6.一种多核苷酸，其包含根据权利要求1所述的锌指蛋白或根据权利要求2-5中任一项所述的融合蛋白。
7.一种调节PD1基因在细胞中的表达的方法，所述方法包括
在以便调节PD1基因表达的条件下，将至少一种根据权利要求6所述的多核苷酸引入所述细胞中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述调节包括活化，通过裂解PD1基因抑制或灭活。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在裂解所述PD1基因后经非同源末端连接(NHEJ)进行灭活。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述调节包括通过裂解灭活并且进一步地，其中所述方法包括将两侧是与所述PD1基因有同源性的序列的外源序列引入所述细胞中，其中通过同源重组将所述外源序列整合至所述PD1基因中。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述细胞为原代细胞或干细胞。
12.根据权利要求14所述的方法，其中所述原代细胞为外周血单核细胞(PBMC)、CD4+T细胞或CD8+T细胞，或所述干细胞为胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞或间充质干细胞。
13.一种治疗有特征在于PD1基因表达或调控异常的疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括
根据权利要求8-12中任一项所述的方法调节所述受试者体内所述PD1基因的表达，以便治疗所述疾病或病症。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述疾病或病症为癌症、病毒感染或自身免疫性疾病。
15.根据权利要求13或14所述的方法，进一步包括向所述受试者施用另外的抗病毒或抗癌疗法。
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