KR20130140054A - Pd1을 조절하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명에는 PD1 유전자의 발현을 조절하는 방법 및 조성물이 개시되어 있다.

Description

PD1을 조절하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING PD1}

연방정부의 연구 지원 하에 행해진 본 발명에 대한 권리의 진술

해당 없음.

기술분야

본 발명은 게놈 공학 분야 및 뉴클레아제 확인 분야에 관한 것이다.

표적 부위에 특이적으로 결합하도록 공학적으로 조작된(engineered), SceI 등과 같은 귀소(homing) 엔도뉴클레아제 및 아연 핑거 뉴클레아제를 포함하는 뉴클레아제는 게놈 공학에서 유용한 것으로 밝혀져 있다. 예를 들어, 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease: ZFN)는 뉴클레아제 도메인(domain)에 융합된(fused) 공학적으로 조작된 부위 특이적 아연 핑거를 포함하는 단백질이다. 이러한 ZFN은 각종 상이한 종에서의 게놈 변형을 위하여 성공적으로 이용되어 왔다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 공개 공보 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060188987호; 제20060063231호; 및 국제 특허 공개 공보 제WO 07/014275호를 참조할 수 있고, 이들 문헌의 개시 내용은 모든 목적을 위하여 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 이들 ZFN은 표적 뉴클레오타이드 서열에서 이중가닥 손상(double-strand break: DSB)을 일으키는 데 이용될 수 있고, 이러한 이중가닥 손상은 표적화된 자리에서 동종 재조합의 빈도를 1000배 이상 증가시킨다. 또한, 비상동성 말단 접합(non-homologous end joining: NHEJ)에 의한 부위 특이적 DSB의 부정확한 복구가 또한 유전자 파괴를 일으킬 수 있다. 이러한 두 DSB의 형성은 임의로 큰 영역의 결실을 야기한다.

프로그램화된 사멸 수용체(programmed death receptor: PD1, "PDCD1"이라고도 공지됨)는 만성 항원에 반응하여 T 세포 활성화와 T 세포 내성 간의 균형을 조절하는 데 연루되는 것으로 밝혀졌다. HIV1 감염 동안, PD1의 발현은 CD4+ T 세포에서 증가되는 것으로 판명되었다. PD1 상향 조절은, HIV 감염에서는 흔히 있듯이 T 세포 기능이상이 만성 항원 노출의 존재에서 관찰되는 경우 T 세포 소진(주된 효과기 기능의 점차적인 소실로서 정의됨)에 다소 결부되는 것으로 여겨진다. PD1 상향 조절은 또한 만성 바이러스 감염 동안 이들 동일한 세트의 세포에서 증가된 세포자멸과 연관될 수 있다(문헌[Petrovas et al, (2009) J Immunol. 183(2):1120-32] 참조). PD1은 또한 면역 감시로부터의 종양-특이적 도피에 있어서 역할을 할 수 있다. PD1은 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia: CML)과 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia: AML) 둘 모두에서 종양-특이적 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte: CTL)에서 고도로 발현되는 것으로 입증되었다. PD1은 또한 흑색종 침윤 T 림프구(infiltrating T lymphocyte: TIL)에서 상향 조절된다(문헌[Dotti (2009) Blood 114 (8): 1457-58)] 참조). 종양은, CTL에서 PD1의 상향 조절과 조합될 경우, 효과적인 항종양 반응을 매개하기 위하여 CTL의 무능력 및 T 세포 작용성의 소실의 기여 인자일 수 있는 PD1 리간드(PDL)를 발현하는 것으로 판명되었다.

연구자들은, 림프구성 맥락수막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitis virus: LCMV)에 만성적으로 감염된 마우스에서, 항-PD1 항체의 투여가 PD1-PDL 상호작용을 차단하여 몇몇 T 세포 기능성(증식 및 사이토카인 분비)을 복원하고 바이러스 부하의 감소를 유발할 수 있게 하는 것을 밝힌 바 있다(Barber et al (2006) Nature 439(9): 682-687). PD1의 조절불능은 자가면역 질환에서 역할할 수도 있다. PD1(특히 PD 1.3)의 SNP는 또한 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus: SLE)의 증가된 위험과 연관되어 있었다. SLE 환자는 보다 높은 빈도의 PD 1.3 PD1 대립형질(allele)을 지니고, 이들 환자는 그들의 활성화된 CD4+ T 세포 상에서의 저감된 PD1 발현을 보이는 것이 제시되어 있다(문헌[Bertsias et al, (2009) Arthritis Rheum. 60(1):207-18] 참조).

이와 같이 해서, 연구 및 치료 응용에서 이용될 수 있는 추가의 PD1-표적화된 조절자, 예를 들어, PD1-표적화된 뉴클레아제 또는 전사 인자에 대한 요구가 여전히 남아 있다.

본 발명은 PD1-표적화된 뉴클레아제, 예를 들어, 공학적으로 조작된 메가뉴클레아제 및 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)의 개발에 관한 것이다.

본 발명은 이들 PD1-특이적 아연 핑거 단백질을 포함하는, 아연 핑거 단백질 전사 인자(ZFP-TF) 또는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함하는, 인간 및 설치류 PD1 및 융합 단백질에 대해 특이적인 활성형 아연 핑거 단백질을 설명하고 있다. 본 발명의 PD1 특이적 아연 핑거 단백질을 포함하는 단백질은, PD1가 비정상적으로 발현되거나 또는 PD1 경로가 PD1 리간드의 과발현으로 인해 비정상적으로 이용되는 임의의 질환 또는 장애의 치료를 위한 것으로 비롯하여, 연구 및 치료 목적에 이용될 수 있다. 예를 들어, T 세포 내의 PD1 유전자좌(locus)를 표적화하는 아연 핑거 뉴클레아제는 만성 감염성 질환 및 악성종양의 둘 모두에서 PD1-의존적 면역 억제를 차단하는데 이용될 수 있다. 대안적으로, 결손 PD1 유전자좌는 야생형 서열의 ZFN 의존적 표적화된 삽입을 이용해서 보수될 수 있거나, 또는 아연 핑거 단백질 전사 인자(ZFP TF)는 결손 PD1 발현을 조절(예컨대, 상향 조절 혹은 하향 조절)하는데 이용될 수 있다. 또한, PD1 유전자좌를 표적화하는 ZFP TF는 야생형 PD1 유전자를 조절하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양상에 있어서, 융합 단백질은 인간 PD1 유전자에 특이적인 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 뉴클레아제 융합 단백질의 아연 핑거 도메인은 표 1에 표시된 비천연형(non-naturally occurring) 인식 나선을 포함하고/하거나 표 2에 표시된 표적 부위에 결합된다.

또 다른 양상에서, 본 명세서에는 PD1 유전자의 발현을 조절할 수 있는 ZFP-TF이 제공된다. 소정의 실시형태에 있어서, ZFP-TF의 아연 핑거 도메인은 표 1 또는 표 5에 표시된 비천연형 인식 나선을 포함하고/하거나 표 2 또는 표 6에 표시된 표적 부위에 결합된다.

다른 양상에 있어서, 본 명세서에는 PD1 유전자의 조절을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 소정의 실시형태에 있어서, 상기 방법은 질환 또는 장애를 지닌 환자로부터 세포 내에 PD1 유전자(또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드) 내의 표적 부위에 결합하도록 공학적으로 조작된 아연 핑거 단백질을 포함하는 융합 단백질을 도입하는 단계를 포함하되, 상기 질환 또는 장애는, PD1 리간드의 과발현에 의해 초래된, PD1의 비정상 발현 및/또는 PD1 경로의 바람직하지 않은 이용을 특징으로 한다. 상기 방법은 HIV 및 HCV 등과 같은 만성 장애의 치료 및/또는 예방에서 이용될 수 있다. 마찬가지로, 상기 방법 및 조성물은 암 및 악성 질환의 치료 및/또는 예방에 이용될 수 있다. 치료 및/또는 예방될 수 있는 암의 비제한적인 예는 폐 암종, 췌장암, 간암, 골암, 유방암, 대장암, 백혈병, 난소암, 림프종, 뇌암 등을 포함한다.

본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 독립적인 치료로서 이용될 수 있거나, 또는 기타 항바이러스 또는 항암 요법(anti-viral or anti-cancer therapies)과 병용하여 이용될 수 있다. 이들 방법 및 조성물은 순차적인 방식으로 항바이러스 혹은 항암 요법으로 제공될 수 있거나, 또는 동시에 투여될 수 있다. 제공되는 방법 및 조성물은 또한 자가면역 질환에 걸린 환자에서 PD1 발현을 조절하는데 이용될 수 있거나, 또는 야생형 PD1 대립형질, 또는 이 환자가 결손 혹은 바람직하지 않은 대립 형질을 가지고 있다면 변형된 특성을 지니는 PD1 대립형질에 통합함으로써 이러한 환자를 치료하는데 이용될 수 있다. 세포주는 PD1 유전자의 조절 혹은 기능성을 변경시킬 수 있는 치료적 화합물을 위한 스크리닝(선별) 시스템을 작성하기 위하여 그 PD1 유전자 서열을 특이적을 변경시키도록 구성될 수 있다.

도 1은, 제시된 ZFN이 세포들 내로 도입된 경우 유발되는 비상동성 말단 접합(NHEJ)에 의해 삽입된 변이의 퍼센트를 측정하는 Cel-1 기반 서베이어(SURVEYOR)(상표명) 뉴클레아제 검정(assay)에 의해 측정된 바와 같은, PD1 특이적 아연 핑거 뉴클레아제를 이용한 인간 PBMC 내의 PD1 유전자의 파괴를 나타낸 그래프이다. 세포는 DNA의 반대 가닥 상에 묶여 12942에 의한 표적 유전자좌에 결합 시 기능성 뉴클레아제를 형성하는 상이한 ZFN 변이체와 ZFN 12942를 각각 조합시킨 ZFN 쌍으로 처리하였다. 상기 쌍의 제2의 ZFN에 대한 SBS 개수는 각 그래프 아래쪽에 표시되어 있다. 각 쌍의 가장 좌측 막대는 37℃에서 인큐베이션된 세포에 대한 뉴클레오펙션(nucleofection) 3일 후의 NHEJ 퍼센트를 도시한다. 각 표시된 쌍에 대한 좌측으로부터 두번째 막대는 37℃에서 인큐베이션된 세포에 대한 뉴클레오펙션 10일 후의 NHEJ 퍼센트를 도시한다. 각 표시된 쌍에 대한 우측으로부터의 두번째 막대는 30℃에서 인큐베이션된 세포에 대한 뉴클레오펙션 3일 후의 NHEJ 퍼센트를 도시하고, 각 표시된 쌍의 가장 우측 막대는 30℃에서 인큐베이션된 세포에 대한 뉴클레오펙션 10일 후의 NHEJ 퍼센트를 도시한다.
도 2는 엑손 1을 표적화하는 PD1 특이적 ZFN 쌍 12942 및 12947에 의한 처리 후의 CD8+ T 세포 내의 PD1 유전자좌의 서열을 결정하기 위한 분석 결과를 도시한다. 삽입은 굵은 대문자로 표시되어 있다. 결실은 (-)로 표기되어 있다. 이 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 수개의 삽입 및 결실이 NHEJ를 통한 DSB 복구의 결과로서 ZFN 절단 부위 부근에서 관찰되었다.
도 3은 쥣과 PD1-특이적 ZFN을 이용해서 Pmel TCR 형질전환(transgenic)/Rag1-/- 마우스로부터 유도된 비장세포의 형질주입(transfection)의 결과를 도시한다. 세포는 항-CD3 항체로 자극되고 나서, PD1을 위해 염색하였다. 플롯(plot)은 각 군 내의 퍼센트 PD1 양성 CD3+CD8+ 세포 및 각 군에 대한 중앙 PD1 형광을 도시하며, 데이터는 이하의 표 형식으로 제시되어 있다. 이 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, PD1 발현은 CD3 자극의 존재에서도 PD1-특이적 ZFN을 입수한 세포에서 감소한다.
도 4는 PD1 발현의 저감이 나중 시점에서 명백한 것을 입증한다. 세포는 CD3 자극 후 72시간째에 수확하고 나서 PD1을 위하여 염색하였다. 위쪽 히스토그램은 각 군 내의 퍼센트 PD1 양성 CD3+CD8+ 세포 및 각 군에 대한 중앙 PD1 형광을 도시한다. 아래쪽 도면은 PD1/CFSE 발현 세포의 빈도를 나타낸다. 이 도면은 PD1 발현이 CD3 자극 후 72시간에도 PD1-특이적 ZFN으로 처리된 세포에서 여전히 저감된 것을 입증한다.
도 5는 CD4+ T 세포에서 테스트되고 게놈 편집 활성을 위하여 Cel-I 검정을 이용해서 분석된 PD1 특이적 ZFN 쌍에 대한 결과를 도시한다. 이들 세포에서, 44%까지의 편집이 몇몇 쌍에서 관찰되었다.
도 6은 CD4+ T 세포 내로 PD1 특이적 ZFN 쌍을 이용한 처리 후 PD1 (-) 세포의 정제를 도시하고 있다. 퍼센트 편집 또는 NHEJ는 위에서 설명된 바와 같은 Cel-I 검정에 의해 측정되었고, 44%까지의 편집이 PD1-특이적 ZFN 쌍의 몇몇에서 관찰되었다. 처리 후, 세포를 항-CD3/CD8 비즈에 대한 첫번째 노출로 자극시켜 ZFN 이식유전자(transgene)를 유발시키고 나서, FACs에 의해 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제 절차를 실시하였다. 세포를 수확하여, (i) 첫번째 자극 후, (ii) 두번째 자극 후이지만 임의의 정제 전, (iii) CD25+(활성화의 마커), PD1(-)를 위한 세포 분류 후, 또는 (iv) 친화도 크로마토그래피 후에, Cel-I 검정(위에서 설명됨)에 의해 PD1 편집에 대해서 분석하였다. 도시된 바와 같이, 세포 분류 기술을 이용해서, 회수된 세포의 56%까지가 변형된 것으로 판명되었다. 친화도 크로마토그래피에 의해 정제된 PD1(-) 세포는 Cel-1 분석에 의해 검정된 바와 같이 42%까지의 전반적인 PD1 변형을 표시하였다.
도 7은 CD8+ T 세포에서 테스트된 PD1 특이적 ZFN에 대한 결과를 도시한 그래프이다. 이 실험에서, PD1 특이적 ZFN를 암호화하는 mRNA는 CD8+ T 내로 형질 도입되었고, 퍼센트 PD1 변형은 Cel I 검정에 의해 분석되었다. 관찰된 변형량은 이용된 mRNA량과 관련이 있었고, 보다 적은 양의 입력 mRNA는 보다 적은 퍼센트의 표적 변형으로 되었다. 이들 결과는 본 명세서에 기재된 PD1 특이적 ZFN은 세포주 내 및 1차 T 세포 내의 PD1 유전자좌를 변형시킬 수 있는 것을 입증한다.

본 명세서에는 기능성 뉴클레아제를 확인하기 위한 생체내 스크리닝 시스템에서 높은 처리량을 위한 조성물 및 방법이 기재되어 있다. 특히, 검정은 그의 표적 부위에서 이중가닥 손상(double-stranded break)을 유발하기 위한 뉴클레아제의 능력을 모니터링하는 레포터 시스템을 사용한다. 또한, 검정은 세포 성장에 대한 뉴클레아제의 효과(독성)를 결정하는데 이용될 수 있다.

공학적으로 조작된 뉴클레아제 기술은 천연형 DNA-결합 단백질의 공학적 조작에 의거하고 있다. 예를 들어, 맞춤화된 DNA-결합 특이성을 지니는 귀소 엔도뉴클레아제의 스크리닝은 기재되어 있다(문헌[Chames et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(20):e178; Arnould et al. (2006) J. Mol. Biol. 355:443-458] 참조). 또, ZFP의 공학적 조작도 또한 기재되어 있다. 이에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 제6,534,261호; 제6,607,882; 6,824,978호; 제6,979,539호; 제6,933,113호; 제7,163,824호; 및 제7,013,219호를 참조하면 된다.

또한, ZFP는 공학적으로 조작된 (ZFP) DNA 결합 도메인을 통해 의도된 유전자 표적을 인식할 수 있는 ZFN-기능적 실체(functional entity)를 작성하기 위하여 뉴클레아제 도메인에 부착되어 있고, 해당 뉴클레아제는 유전자를 ZFP 결합 부위 부근에서 절단시킨다. 이에 대해서는, 예컨대, 문헌[Kim et al. (1996) Proc Nat'l Acad Sci USA 93(3):1156-1160]을 참조하면 된다. 더욱 최근에, ZFN은 각종 유기체에서 게놈 변형을 위하여 이용되어 왔다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 공개 공보 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060188987호; 제20060063231호; 및 국제 특허 공개 공보 제WO 07/014275호를 참조하면 된다.

ZFP를 특이적 DNA 서열에 결합시키도록 공학적으로 조작할 수 있는 법칙은 잘 특성규명되어 있고, 특이적 ZFP를 정확하게 확인하지만, 이들 동일한 ZFP는 ZFN 내로 혼입될 때 동등한 친화도 및/또는 특이성을 가진 채 결합될 수 있다. 예를 들어, 염색체 기질은 살아있는 세포에서 뉴클레아제 도메인의 정확한 이량체화에 영향을 미치고, 그 결과 절단 잠재성을 저감시키며, 주어진 게놈 유전자좌에 대한 정확한 염색체 구성은 그들의 의도된 표적 서열을 결합하여 절단하는 ZFN의 능력에 상이하게 영향을 미칠 것으로 여겨진다. 또한, 불가능하지 않다면, 설계된 DNA 결합 도메인이 염색질화된 형태로 세포 게놈과 함께 제공되는 경우 종속되도록 시험관내 검정이 검색 파라미터를 모방하는 것은 곤란하다. 그 결과, 관련된 유기체 혹은 세포 계통에서 다수의 변이체를 테스트하여, 유전자 변형을 위한 최적 특성을 표시하는 ZFN을 확인하는 것이 필수이다.

또, 모든 생체내 시스템은 그 자체의 특성을 지니므로, ZFN 작용을 결정하기 위하여 특정 검출 검정을 개발하는 것이 필요하다. 이와 같이 해서, 천연형 귀소 엔도뉴클레아제와는 상이한 결합 특이성을 지니는 귀소 엔도뉴클레아제를 위하여 스크리닝하는 앞서 기재된 생체내 스크리닝 방법과 달리, 본 명세서에 기재된 방법은 숙주 세포에 대한 뉴클레아제의 독성뿐만 아니라 그들의 생체내 기능성을 예측함으로써 특정 표적 부위에 결합하도록 이미 알려진 뉴클레아제를 등급화하는 신속하고도 유효한 방식을 제공한다.

이와 같이 해서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 생체내에서 생물학적으로 활성인 뉴클레아제를 확인하는 고도로 유효하고 신속한 방법을 제공한다. 생체내 뉴클레아제 기능성을 정확하게 예측하는 것에 부가해서, 본 명세서에 기재된 검정은 또한 뉴클레아제 독성을 결정하는데 이용될 수 있고, 이에 따라 가장 안전하고 가장 기능적으로 활성인 단백질의 확인을 가능하게 한다.

일반

방법의 실시뿐만 아니라 본 명세서에 개시된 조성물의 제조와 사용은, 달리 언급되지 않는 한, 분자생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터 계산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 당업계에 내의 관련 분야의 통상적인 기술이 사용된다. 이들 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999]을 참조할 수 있다.

정의

용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호 호환적으로 사용되며, 선형 또는 고리형 입체구조, 단일- 또는 이중-가닥 형태인 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위하여, 이들 용어는 중합체의 길이에 대한 한정으로서 해석되어서는 안 된다. 상기 용어는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체뿐만 아니라, 염기, 당 및/또는 인산염 부분(예를 들어, 포스포로티오에이트 골격)이 변형된 뉴클레오타이드를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기-짝짓기 특이성을 가지며; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 것이다.

용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위하여 상호호환적으로로 사용된다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 대응하는 천연형 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 적용된다.

"결합"은 거대분자 사이(예를 들어, 단백질과 핵산 사이)의 서열-특이적인 비공유적 상호작용을 지칭한다. 상호작용이 전체로서 서열-특이적인 한, 결합 상호작용의 모든 성분들이 서열-특이적(예를 들어, DNA 골격 내의 인산염 잔기와의 접촉)일 필요는 없다. 이런 상호작용은 일반적으로 10^-6M^-1 또는 그 이하의 해리 상수(K_d)를 특징으로 한다. "친화도"(affinity)는 결합 강도를 지칭하는데, 결합 친화도의 증가는 더 낮은 K_d와 상관 관계가 있다.

"결합 단백질"은 다른 분자와 비공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어, DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)와 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, 이것은 자기 자신과 결합(동종이량체, 동종삼합체 등을 형성)할 수 있고/있거나 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자와 결합할 수 있다. 결합 단백질은 한 가지 이상의 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합 활성, RNA-결합 활성 및 단백질-결합 활성을 가진다.

"아연 핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은, 아연 이온의 배위 결합을 통하여 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인 하나 이상의 아연 핑거를 통하여 서열-특이적인 방식으로 DNA와 결합하는, 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 아연 핑거 DNA 결합 단백질이란 용어는 흔히 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로서 약칭된다.

아연 핑거 결합 도메인은 미리 결정된 뉴클레오타이드 서열과 결합하도록 "공학적으로 조작"될 수 있다. 아연 핑거 단백질을 공학적으로 조작하는 방법의 비제한적인 예는 설계 및 선택이다. 설계된 아연 핑거 단백질은, 그 설계/조성이 주로 합리적인 기준에 유래하는 것으로서 자연에서는 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적인 기준은, 치환 규칙 및 기존의 ZFP 설계와 결합 데이터의 정보를 저장하고 있는 데이터베이스의 정보를 처리하기 위한 컴퓨터를 이용한 알고리즘의 적용을 포함한다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제6,140,081호; 제6,453,242호; 제6,534,261호; 및 제WO 98/53058호; 제WO 98/53059호; 제WO 98/53060호; 제WO 02/016536호; 및 제WO 03/016496호를 참조하면 된다.

"선택된" 아연 핑거 단백질은 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 혼성 선택과 같이 주로 실험적 과정의 결과로서 생산되는 것으로 자연에서는 발견되지 않는 단백질이다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,200,759호; 제WO 95/19431호; 제WO 96/06166호; 제WO 98/53057호; 제WO 98/54311호; 제WO 00/27878호; 제WO 01/60970호; 제WO 01/88197호; 및 제WO 02/099084호를 참조하면 된다.

"절단"(cleavage)은 DNA 분자의 공유 골격의 파손을 말한다. 절단은, 포스포다이에스터 결합의 효소적 혹은 화학적 가수분해를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 각종 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단과 이중 가닥 절단 둘 모두가 가능하며, 이중 가닥 절단은 2가지의 별개의 단일 가닥 절단 현상의 결과로써 일어날 수 있다. DNA 절단은 블런트 말단(blunt end) 또는 엇갈린 말단(staggered end) 중 하나의 생성을 초래할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 표적화된 이중 가닥 DNA 절단을 위해 사용된다.

"절단 절반 도메인"(cleavage half-domain)은, 제2폴리펩타이드(동일 또는 상이함)와 함께, 절단 활성(바람직하게는 이중 가닥 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 서열이다. "제1 및 제2 절단 절반 도메인", "+ 및 - 절단 절반 도메인" 및 "우측 및 좌측 절단 절반 도메인"은 이량체화되는 절단 절반 도메인 쌍을 지칭하기 위하여 상호 호환적으로 사용된다.

"공학적으로 조작된 절단 절반 도메인"은 다른 절단 절반 도메인(예를 들어, 공학적으로 조작된 다른 절단 절반 도메인)과 절대 이종이량체(obligate heterodimer)를 형성하도록 변형된 절단 절반 도메인이다. 또한, 이에 대해서는, 미국 특허 출원 제10/912,932호 및 제11/304,981호, 및 미국 특허 가출원 제60/808,486호(출원일: 2006년 5월 25일)를 참조하면 되고, 이들은 그들의 전문이 본 명세서에 참조로 병합된다.

"서열"이란 용어는 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 지칭하며, 이는 DNA 또는 RNA일 수 있고, 선형, 고리형 또는 분지형일 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. "공여체 서열"이란 용어는 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 공여체 서열은 임의의 길이, 예를 들어, 2개 내지 10,000개의 뉴클레오타이드 길이(또는 이들 범위 사이 또는 상기 범위를 초과하는 임의의 정수값), 바람직하게는, 약 100개 내지 1,000개의 뉴클레오타이드(또는 상기 범위 사이의 임의의 정수), 더욱 바람직하게는, 약 200개 내지 500개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. "염색질"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조물이다. 세포 염색질은 핵산, 주로, DNA, 및 히스톤과 비-히스톤 염색체 단백질을 포함하는 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵 세포 염색질은 뉴클레오솜(nucleosome)의 형태로 존재하는데, 여기서 뉴클레오솜 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 각각 2개씩 포함하는 옥타머와 결합된 대략 150개 염기쌍의 DNA를 포함하며; 링커 DNA(유기체에 따라 길이가 가변적)는 뉴클레오솜 코어 사이에서 연장된다. 히스톤 H1의 분자는 일반적으로 링커 DNA에 결합된다. 본 명세서의 목적을 위해, "염색질"은 모든 유형의 세포성 핵단백질(원핵생물과 진핵생물의 양쪽 모두)을 포함하는 것을 의미한다. 세포 염색질은 염색체 염색질과 에피솜(episome) 염색질 둘 모두를 포함한다.

"염색체"는 세포의 게놈의 전체 또는 일부를 포함하는 염색질 복합체이다. 세포의 게놈은 종종 세포의 게놈을 포함하는 모든 염색체의 집합인, 그의 핵형(karyotype)을 특징으로 한다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.

"에피솜"은 세포의 염색체 핵형의 부분이 아닌 핵산을 포함하는 복제성 핵산, 핵단백질 복합체 또는 기타 구조물이다. 에피솜의 예는 플라스미드 및 특정 바이러스 게놈을 포함한다.

"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합 분자가 결합할 핵산의 일부를 규정하는 핵산 서열인데, 단, 결합을 위한 충분 조건이 존재한다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'는 Eco RI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위이다.

"만성 감염 질환"은 감염이 지속되고 있는 감염원에 의해 초래된 질환이다. 이러한 질환은 간염(A형, B형 또는 C형), 포진 바이러스(예컨대, VZV, HSV-1, HSV-6, HSV-II, CMV 및 EBV) 및 HIV/AIDS를 포함할 수 있다. 비바이러스(non-viral) 예는 아스퍼질러스증(Aspergillosis), 칸디다증(Candidiasis), 콕시도이도마이세스증(Coccidioidomycosis) 등과 같은 진균 질환, 크립토코커스(Cryptococcus) 및 히스토플라스마증(Histoplasmosis)과 관련된 질환을 포함할 수 있다. 만성 박테리아 감염원의 비제한적인 예는 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 및 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)일 수 있다. "암"이란 용어는 기관 혹은 신체 조직 내에서 세포의 억제되지 않은 증식이 있는 임의의 질환을 지칭한다. 이와 같이 해서, 이 용어는, 난소암, 백혈병, 폐암, 대장/결장 암, CNS 암, 흑색종, 신장 세포 암종, 형질세포종/골수종, 전립선암, 유방암 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 임의의 유형의 암 또는 악성 종양을 포함한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "종양"이란 용어는, 달리 구체적으로 표시되지 않는 한, 악성 유형의 세포 혹은 조직의 비정상적인 성장을 지칭하며, 양성 유형의 조직을 포함하지 않는다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "억제하다 혹은 억제하는"이란 용어는 성장/복제를 저감시키는 것을 의미한다.

"자가면역 질환"이란 용어는, 대상체가 자체의 조직에 대항하여 파괴적인 면역 반응을 증가시키는 임의의 장애 혹은 질환을 지칭한다. 자가면역 장애는, 신경, 위장 및 내분비 계통뿐만 아닐, 피부 및 기타 연결 조직, 눈, 혈액 및 혈관의 질환을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌, 대상체(예컨대, 인간)에서 거의 모든 기관 계통에 걸릴 수 있다. 자가면역 질환의 예는, 하시모토 갑상선염, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 그레이브즈 병, 강피증(Scleroderma), 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 중증 근무력증 및 당뇨병을 포함할 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다.

"외인성"(exogenous) 분자는 통상적으로 세포에 존재하지 않지만 하나 이상의 유전학적, 생화학적 또는 기타 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포 내에서의 통상의 존재"는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건에 대하여 결정된다. 이와 같이 해서, 예를 들어, 단지 근육의 배아 발달 동안에만 존재하는 분자는 성인 근육 세포에 대해서는 외인성 분자이다. 마찬가지로, 열 충격에 의해 유발된 분자는 열 충격을 받지 않은 세포에 대해서는 외인성 분자이다. 외인성 분자는, 예를 들어, 기능 부전 내인성 분자의 기능성 형태 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 기능 부전성 형태를 포함할 수 있다.

외인성 분자는, 특히, 소분자, 예컨대, 조합 화학 공정에 의해 만들어진 소분자, 또는 거대 분자, 예컨대, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자들의 임의 변형 유도체, 또는 상기 분자들 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 이는 단일- 또는 이중 가닥일 수 있고; 선형, 분지형 또는 고리형일 수 있으며; 임의의 길이를 가질 수 있다. 핵산은 듀플렉스를 형성할 수 있는 것뿐만 아니라 트리플렉스(triplex)-형성 핵산을 포함한다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제5,176,996호 및 제5,422,251호를 참조하면 된다. 단백질은, DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제(integrase), 리콤비나제(recombinase), 리가제, 토포아이소머라제(topoisomerase), 자이라제(gyrase) 및 헬리카제(helicase)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.

외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어, 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염성 바이러스 게놈, 세포 내로 도입된 플라스미드 혹은 에피솜, 또는 세포 내에 보통은 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 지질-매개 전달(즉, 중성 지질 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공, 직접 주입, 세포 융합, 유전자총(particle bombardment), 인산칼슘 공침, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개형 전달을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.

이에 대해서, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하의 특정 성장 단계에서 특정 세포 내에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아, 엽록체 혹은 다른 세포 소기관의 게놈, 또는 천연형 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 내인성 분자는 단백질, 예를 들어, 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.

"융합" 분자는 2개 이상의 서브단위 분자가, 바람직하게는 공유적으로 연결된 분자이다. 서브단위 분자는 동일한 화학적 유형의 분자일 수 있거나, 또는 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다. 첫 번째 유형의 융합 분자의 예는, 융합 단백질(예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인 사이의 융합체) 및 융합 핵산(예를 들어, 상기에서 기술된 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 두 번째 유형의 융합 분자의 예는, 트리플렉스-형성 핵산과 폴리펩타이드 사이의 융합체, 및 소홈 결합제(minor groove binder)와 핵산 간의 융합체를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

세포 내에서 융합 단백질의 발현은, 해당 융합 단백질을 해당 세포에 전달함으로써, 또는 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 전달함으로써 일어날 수 있고, 여기서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 전사되고, 해당 전사체가 번역되어 융합 단백질이 생성된다. 트랜스-스플라이싱(trans-splicing), 폴리펩타이드 절단 및 폴리펩타이드 결찰이 또한 세포 내 단백질의 발현에 연루될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 세포에 전달하는 방법은 본 명세서의 어느 곳에선가 제시되어 있다.

"유전자"는, 본 명세서의 목적을 위해, 유전자 산물(하기 참조)을 암호화하는 DNA 영역뿐만 아니라, 유전자 산물의 생성을 조절하는 모든 DNA 영역을, 이러한 조절 서열이 암호화 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하는지 여부에 상관없이 포함한다. 따라서, 유전자는, 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 예컨대, 리보솜 결합 자리 및 내부 리보솜 도입 자리, 인핸서, 사일런서(silencer), 격리자(insulator), 경계 성분, 복제 원점, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역을 포함하지만, 이들로 반드시 제한되는 것은 아니다.

"유전자 발현"은 유전자에 포함된 정보가 유전자 산물로 전환되는 것을 지칭한다. 유전자 산물은 유전자의 직접 전사 산물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 다른 임의의 유형의 RNA), 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 산물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글라이코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.

유전자 발현의 "조절"은 유전자의 발현 수준의 변화를 지칭한다. 발현의 조절은, 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 조절은 또한 완전할 수 있으며, 즉, 유전자 발현은 전체적으로 비활성화되거나 또는 야생형 수준 혹은 그 이상으로 활성화되거나; 또는 부분적일 수 있으며, 즉, 유전자 발현은 야생형 수준의 일부 부분에 비해서 부분적으로 감소되거나 부분적으로 활성화된다. "진핵" 세포는 진균 세포(효모 등), 식물 세포, 동물 세포, 포유동물세포 및 인간 세포(예컨대, T-세포)를 포함할 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다.

용어 "작동적 연결"(operative linkage) 및 "작동적으로 연결된"(operatively linked)(또는 "작동가능하게 연결된")은 2개 이상의 성분(예를 들어, 서열 구성요소)의 병렬 배치에 관하여 상호호환적으로 사용되며, 여기서 상기 성분들은 해당 성분들이 둘다 정상적으로 작용하고 적어도 하나의 성분이 적어도 하나의 다른 성분에 의해 발휘되는 기능을 매개할 수 있도록 배열된다. 예로써, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 응하여 암호화 서열의 전사 수준을 제어한다면, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로 암호화 서열과 시스(cis) 형태로 작동적으로 연결되지만, 그것에 직접적으로 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서(enhancer)는, 서로 근접하지 않더라도, 암호화 서열에 작동적으로 연결되는 전사 조절 서열이다.

융합 폴리펩타이드에 관하여, "작동적으로 연결된"이란 용어는, 각 성분이 마치 다른 성분에 연결되지 않은 것처럼 그대로 다른 성분에 연결된 것과 동일한 기능을 수행한다는 사실을 지칭할 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드에 관하여, 융합 폴리펩타이드 내에서 ZFP DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있는 한편 절단 도메인이 표적 부위의 근처에서 DNA를 절단할 수 있다고 한다면, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인은 작동적으로 연결된 상태에 있다. 마찬가지로, ZFP DNA-결합 도메인이 활성화 혹은 억제 도메인에 융합되어 있는 융합 폴리펩타이드에 관하여, 융합 폴리펩타이드 내에서, ZFP DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있는 한편 활성화 도메인이 유전자 발현을 상승 조절할 수 있거나 억제 도메인이 유전자 발현을 하향 조절할 수 있다고 한다면, ZFP DNA-결합 도메인과 활성화 또는 억제 도메인은 작동적 연결 상태에 있다.

단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 서열이 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일하지는 않지만 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산이다. 기능적 단편은 그에 상응하는 천연 분자보다 많거나, 적거나 또는 그와 동일한 수의 잔기를 보유할 수 있고/있거나, 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능(예를 들어, 암호화 기능, 다른 핵산에 혼성화하는 능력)을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 마찬가지로, 단백질의 기능을 결정하는 방법도 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 DNA-결합 기능은, 예를 들어, 필터-결합, 전기영동 이동도-변화, 또는 면역침전 분석법에 의해 결정될 수 있다. DNA 절단은 젤 전기영동에 의해 검정될 수 있다. 이에 대해서는, 문헌[Ausubel et al., 상기와 동일]을 참조하면 된다. 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은, 예를 들어, 유전학적 및 생화학적 둘 모두의, 공동-면역침전, 2-혼성 검정법 또는 상보성 분석법에 의해 측정할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Fields et al. (1989) Nature 340:245-246]; 미국특허 제5,585,245호; 및 국제 특허 출원 공개 제WO 98/44350호를 참조할 수 있다.

"벡터"는 유전자 서열을 표적 세포로 전이시킬 수 있다. 전형적으로, "벡터 작제물"(vector construct), "발현 벡터" 및 "유전자 전달 벡터"(gene transfer vector)는 관심 대상 유전자의 발현을 지시할 수 있고 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 의미한다. 이와 같이 해서, 이 용어는 클로닝, 및 발현 비히클뿐만 아니라 통합 벡터(integrating vector)를 포함한다.

"리포터 유전자" 또는 "리포터 서열"이란, 바람직하게는 반드시 통상의 검정을 필요로 하지 않지만, 용이하게 측정되는 단백질 산물을 생산하는 임의의 서열을 지칭한다. 적절한 리포터 유전자는, 항생제 내성(예컨대, 암피실린 내성, 네오마이신 내성, G418 내성, 퓨로마이신 내성)을 매개하는 단백질을 암호화하는 서열, 착색되거나 형광 또는 발광 단백질(예컨대, 녹색 형광 단백질, 증대된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시페라제)을 암호화하는 서열, 및 증대된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭(예컨대, 다이하이드로폴레이트 리덕타제)를 매개하는 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 에피토프 태그는, 예를 들어, FLAG, His, myc, Tap, HA의 하나 이상의 복제물, 또는 임의의 검출가능한 아미노산 서열을 포함한다. "발현 태그"는 관심 대상 유전자의 발현을 모니터링하기 위하여 목적으로 하는 유전자 서열에 작동적으로 연결될 수 있는 리포터를 암호화는 서열을 포함한다.

개요

본 명세서에서는, PD1 유전자에 표적화된 아연 핑거 단백질-전사 인자(ZFP-TF) 및/또는 뉴클레아제(예컨대, ZFN)뿐만 아니라, PD1가 비정상적으로 혹은 바람직하지 않게 발현되거나 또는 PD1 경로가, 예를 들어, 만성 감염성 질환, 암, 및/또는 자가면역 질환의 치료를 포함하는, PD1 리간드의 과발현으로 인해 비정상적으로 혹은 바람직하지 않게 이용되는 질환 또는 장애의 치료를 위하여 이들 ZFP-TF 및/또는 뉴클레아제를 포함하는 조성물 및 이를 이용하는 방법이 기재되어 있다. PD1 발현의 조절에 의해 개선되는 질환 또는 장애를 가진 대상체의 치료를 위하여, 본 명세서에 기재된 ZFP-TF 및/또는 뉴클레아제는 생체내 혹은 생체외에서 세포(예컨대, 이러한 질환에 걸린 환자로부터 단리된 1차 세포(primary cell)) 내로 도입될 수 있다. ZFP-TF 및/또는 ZFN 처리 후, 세포는 만성 감염성 질환 혹은 암의 치료에서 약제로서 이용하기 위하여 환자 내로 도입될 수 있다. 마찬가지로, PD1-특이적 ZFN 및/또는 ZFP-TF로 처리된 줄기 세포가 이용될 수 있다. 이들 세포는 이러한 질병의 치료를 위하여 병에 걸린 환자 내로 주입될 수 있다.

이와 같이 해서 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 PD1 유전자의 조절을 허용한다. PD1 발현은 필요에 따라서 PD1-특이적 ZFP TF 또는 ZFN을 이용해서 넉 아웃되거나 넉 다운 되거나 상향조절되거나 하향조절될 수 있다. PD1 발현은, 예를 들어, 만성 감염성 질환 혹은 암에 걸린 환자에서 ZFP-TF 또는 하나 이상의 PD1-특이적 ZFN에 의해서 하향조절될 수 있고, 또한 환자, 예를 들어, 자가면역 질환 환자에서 상향조절될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 PD1-특이적 ZFP TF 및/또는 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 치료제를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 환자에게 직접 투여된다. 또, 본 발명은 ZFP TF 및/또는 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 병에 걸린 환자에게 치료제로서 전신 투여를 위한 바이러스 전달 비히클 등과 같은 벡터 내로 혼입될 수 있는 방법 및 조성물을 제공한다.

DNA-결합 도메인

본 명세서에는 PD1 유전자 내의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함하는 조성물이 기재되어 있다. 메가뉴클레아제로부터의 아연 핑거 DNA-결합 도메인 또는 DNA-결합 도메인을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌, 임의의 DNA-결합 도메인이 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에 이용될 수 있다.

소정의 실시형태에 있어서, DNA 결합 도메인은 아연 핑거 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 아연 핑거 단백질은 선택의 표적 부위에 결합되도록 공학적으로 조작되는 점에서 비천연형이다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416]; 미국 특허 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,503,717호; 제6,689,558호; 제7,030,215호; 제6,794,136호; 제7,067,317호; 제7,262,054호; 제7,070,934호; 제7,361,635호; 제7,253,273호; 및 미국 특허 공개 공보 제2005/0064474호; 제2007/0218528호; 제2005/0267061호를 참조하면 되고, 이들 모두는 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 병합된다.

공학적으로 조작된 아연 핑거 결합 도메인은, 천연형 아연 핑거 단백질과 비교해서 신규한 결합 특이성을 지닐 수 있다. 공학적 조작 방법은 적절한 설계 및 각종 선택을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 적절한 설계는, 예를 들어, 삼중자(triplet)(또는 사중자(quadruplet)) 뉴클레오타이드 서열 및 개별의 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 이용하는 것을 포함하되, 여기서, 각 삼중자 혹은 사중자 뉴클레오타이드 서열은 특정 삼중자 혹은 사중자 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 이에 대해서는, 예를 들어, 공유된 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조하면 된다.

파지 표시 및 2-혼성 시스템을 포함하는 예시적인 선택 방법은, 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호뿐만 아니라; 제WO　98/37186호; 제WO　98/53057호; 제WO　00/27878호; 제WO　01/88197호 및 제GB 2,338,237호에 개시되어 있다. 또한, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증대는, 예를 들어, 제WO　02/077227호에 기재되어 있다.

또한, 이들 및 기타 문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다수-핑거화된 아연 핑거 단백질은, 예를 들어, 길이가 5개 이상인 아미노산의 링커를 포함하는 임의의 적절한 링커 서열을 이용해서 함께 연결될 수 있다. 이에 대해서는, 또한 길이가 6개 이상인 아미노산인 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조할 수 있다. 본 명세서에 기재된 단백질은 단백질의 개별의 아연 핑거 사이에 적절한 링커들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 또, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증대는, 예를 들어, 공유된 제WO　02/077227호에 기재되어 있다.

표적 부위; ZFP의 선택 및 융합 단백질(이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 구축을 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 미국 특허 제6,140,0815호; 제789,538호; 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,200,759호; 제WO　95/19431호; 제WO　96/06166호; 제WO　98/53057호; 제WO　98/54311호; 제WO　00/27878호; 제WO　01/60970호; 제WO　01/88197호; 제WO　02/099084호; 제WO　98/53058호; 제WO　98/53059호; 제WO　98/53060호; 제WO　02/016536호; 및 제WO　03/016496에 상세히 기재되어 있다.

또한, 이들 및 기타 문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다수 핑거화된 아연 핑거 단백질은, 예를 들어, 길이가 5개 이상인 아미노산의 링커를 포함하는, 임의의 적절한 링커 서열을 이용해서 함께 결합된다. 또, 예시적인 링커 서열인 길이가 6개 이상인 아미노산에 대해서는, 미국 특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조하면 된다. 본 명세서에 기재된 단백질은 개별의 아연 핑거와 단백질 사이에 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

대안적으로, DNA-결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII 등과 같은 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 인식 서열은 공지되어 있다. 이에 대해서는 또한 미국 특허 제5,420,032; 미국 특허 제6,833,252호; 문헌[Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353] 및 뉴 잉글랜드의 바이오랩스사의 카탈로그를 참조하면 된다. 또한, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비천연 표적 부위에 결합하도록 공학적으로 조작될 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 공보 제20070117128호를 참조하면 된다.

소정의 실시형태에 있어서, DNA 결합 도메인은 PD1 유전자 내의 표적 부위에 (서열-특이적 방식으로) 결합되고 PD1의 발현을 조절하는 공학적으로 조작된 아연 핑거 단백질이다. ZFP는 돌연변이 PD1 대립형질 또는 야생형 PD1 서열에 선택적으로 결합할 수 있다. PD1 표적 부위는 전형적으로 적어도 하나의 아연 핑거를 포함하지만, 복수의 아연 핑거(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 핑거)를 포함할 수 있다. 통상, ZFP는 적어도 3개의 핑거를 포함한다. ZFP 중 어떤 것은 4, 5 혹은 6개의 핑거를 포함한다. 3개의 핑거를 포함하는 ZFP는 전형적으로 9 또는 10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적 부위를 인식하고; 4개의 핑거를 포함하는 ZFP는 전형적으로 12 내지 14개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적 부위를 인식하는 한편; 6개의 핑거를 포함하는 ZFP는 18 내지 21개의 뉴클레오타이드를 포함하는 표적 부위를 인식할 수 있다. ZFP는 또한 하나 이상의 조절 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 여기서 이들 조절 도메인은 전사 활성화 혹은 억제 도메인일 수 있다.

몇몇 실시형태에 있어서, DNA 결합 도메인은 식물 병원균인 산토모나스(Xanthomonas)로부터 유도된 TAL 효과기로부터 공학적으로 조작된 도메인이다(문헌[Boch et al, (2009) Science 29 Oct 2009 (10.1126/science.117881) 및 Moscou and Bogdanove, (2009) Science 29 Oct 2009 (10.1126/science.1178817)] 참조). 이에 대해서는 또한 미국 특허 출원 제13/068,735호를 참조하면 된다.

융합 단백질

본 명세서에 기재된 바와 같은 DNA-결합 단백질(예컨대, ZFP) 및 비상동 조절(기능성) 도메인(또는 그의 기능성 단편)을 포함하는 융합 단백질이 또한 제공된다. 공통 도메인은, 예를 들어, 전사 인자 도메인(활성자, 억제자, 공동-활성자, 공동-억제자), 사일런서, 온코신(예컨대, myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos 패밀리 구성원 등); DNA 복구 효소 및 그들의 연관된 인자 및 조절자; DNA 재배열 효소 및 그들의 연관된 인자 및 조절자; 염색질 연관된 단백질 및 그들의 조절자(예컨대, 키나제, 아세틸라제 및 데아세틸라제); 및 DNA 변형 효소(예컨대, 메틸전이효소, 토포아이소머라제, 헬리카제, 리가제, 키나제, 포스파타제, 폴리머라제, 엔도뉴클레아제) 및 그들의 연관된 인자 및 조절자를 포함한다. DNA-결합 도메인과 뉴클레아제 절단 도메인의 융합에 관한 상세는 미국 특허 출원 공개 공보 제20050064474호; 제20060188987호 및 제2007/0218528호를 참조하면 되고, 이들 문헌은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 병합된다.

활성화를 달성하기 위한 적절한 도메인은 HSV VP16 활성화 도메인(예컨대, 문헌[Hagmann et al., J. Virol. 71, 5952-5962 (1997)] 참조) 핵 호르몬 수용체(예컨대, 문헌[Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998)] 참조); 핵 인자 카파 B의 p65 서브유닛(Bitko & Barik, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) 및 Doyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)); Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)), 또는 VP64 등과 같은 인공 키메릭 기능성 도메인(Beerli et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14623-33), 및 데그론(degron)(Molinari et al., (1999) EMBO J. 18, 6439-6447)을 포함한다. 추가의 예시적인 활성화 도메인은 Oct 1, Oct-2A, Sp1, AP-2 및 CTF1(Seipel et al., EMBO J. 11, 4961-4968 (1992))뿐만 아니라 p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, AtHD2A 및 ERF-2를 포함한다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Robyr et al. (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood et al. (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275; Leo et al. (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKenna et al. (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik et al. (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; 및 Lemon et al. (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504]을 참조하면 된다. 추가의 예시적인 활성화 도메인은, OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5, -6, -7 및 -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP 및 TRAB1을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Ogawa et al. (2000) Gene 245:21-29; Okanami et al. (1996) Genes Cells 1:87-99; Goff et al. (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho et al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429; Ulmason et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels et al. (2000) Plant J. 22:1-8; Gong et al. (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; 및 Hobo et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15, 348-15, 353]을 참조하면 된다.

당업자에게는, DNA-결합 도메인과 기능성 도메인 사이에 융합 단백질 (또는 이를 암호화하는 핵산)의 형성 시, 활성화 도메인 또는 활성화 도메인과 상호작용하는 분자는 기능성 도메인으로서 적합하다는 것은 명확할 것이다. 본질적으로 활성화 복합체를 보충하고/하거나 표적 유전자에 대한 활성(예를 들어, 히스톤 아세틸화 등)을 활성화시킬 수 있는 임의의 분자는 융합 단백질의 활성화 도메인으로서 유용하다. 기능성 도메인으로서 이용하기에 적합한 인슐레이터 도메인, 국소 도메인 및 염색질 리모델링 단백질, 예컨대, ISWI-함유-도메인 및/또는 메틸 결합 도메인 단백질은, 예를 들어, 공유된 미국 특허 출원 공개 제2002/0115215호 및 제2003/0082552호 및 공유된 제WO 02/44376호에 기재되어 있다.

예시적인 억제 도메인은, KRAB A/B, KOX, TGF-베타-유도성 초기 발현 유전자(TGF-beta-inducible early gene: TIEG), v-erbA, SID, MBD2, MBD3, DNMT 패밀리의 구성원(예컨대, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb 및 MeCP2를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; 및 Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342]을 참조하면 된다. 추가의 예시적인 억제 도메인은 ROM2 및 AtHD2A를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Chem et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; 및 Wu et al. (2000) Plant J. 22:19-27]을 참조하면 된다.

융합 분자는 당업자에게 잘 알려진 클로닝 및 생화학적 컨쥬게이션 방법에 의해 구축된다. 융합 분자는 DNA-결합 도메인 및 기능성 도메인(예컨대, 전사 활성화 또는 억제 도메인)을 포함한다. 융합 분자는 또한 선택적으로 핵 국소화 신호(예를 들어, SV40 배지 T-항원으로부터의 것 등) 및 에피토프 태그(예를 들어, FLAG 및 헤마글루티닌 등)를 포함한다. 융합 단백질(및 이를 암호화하는 핵산)은 전사 판독 프레임이 융합의 성분들 중에서 보존되도록 설계된다.

한쪽에서는 기능성 도메인(또는 그의 기능성 단편)과 다른 쪽에서는 비-단백질 DNA-결합 도메인(예컨대, 항생제, 인터칼레이터(intercalator), 소홈 결합제, 핵산)의 폴리펩타이드 성분 간의 융합은 당업자에게 공지된 생화학적 컨쥬게이션 방법에 의해 구축된다. 이에 대해서는, 예를 들어, 피어스 케미컬 캄퍼니(Pierce Chemical Company)(Rockford, IL)의 카탈로그를 참조하면 된다. 소홈 결합제와 폴리펩타이드 간에 융합체를 형성하는 방법 및 조성물은 문헌[Mapp et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935]에 기재되어 있다.

소정의 실시형태에 있어서, 아연 핑거 단백질에 의해 결합된 표적 부위는 세포 염색질의 접근가능한 영역에 존재한다. 접근가능한 영역은, 예를 들어, 공유된 국제 특허 공개 공보 제WO 01/83732호에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 표적 부위가 세포 염색질의 접근가능한 영역에 존재하지 않는다면, 하나 이상의 접근가능한 영역은 공유된 제WO 01/83793호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. 추가적인 실시형태에 있어서, 융합 분자의 DNA-결합 도메인은 그의 표적 부위가 접근가능한 영역에 있든지 혹은 없든지 관계없이 세포 염색질에 결합할 수 있다. 예를 들어, 이러한 DNA-결합 도메인은 링커 DNA 및/또는 뉴클레오솜 DNA에 결합할 수 있다. 이 유형의 "파이오니어" DNA 결합 도메인의 예는 소정의 스테로이드 수용체 및 간세포 핵 인자 3(HNF3)에서 발견된다(문헌[Cordingley et al. (1987) Cell 48:261-270; Pina et al. (1990) Cell 60:719-731; 및 Cirillo et al. (1998) EMBO J. 17:244-254] 참조).

융합 분자는 당업자에게 공지된 바와 같이, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 조제될 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985]; 및 공유된 제WO 00/42219호를 참조하면 된다.

융합 분자의 기능성 성분/도메인은 융합 분자가 일단 그의 DNA 결합 도메인을 통해서 표적 서열에 결합하면 유전자의 전사에 영향을 줄 수 있는 각종 상이한 성분들 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 그러므로, 기능성 성분은 각종 전사 인자 도메인, 예컨대, 활성자, 억제자, 공동 활성자, 공동 억제자 및 사일런서를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

추가의 예시적인 기능성 도메인은, 예를 들어, 공유된 미국 특허 제6,534,261호 및 미국 특허 출원 공개 공보 제2002/0160940호에 개시되어 있다.

외인성 소분자 혹은 리간드에 의해 조절되는 기능성 도메인이 선택될 수 있다. 예를 들어, 기능성 도메인이 단지 외부의 레오켐(RheoChem)(상표명) 리간드의 존재 하에 그의 활성 입체형태를 취하는 레오스위치(RheoSwitch)(등록상표) 테크놀로지가 이용될 수 있다(예를 들어 미국 특허 공개 공보 제20090136465 참조). 이와 같이 해서, ZFP는 ZFP-TF의 얻어지는 활성이 외부 리간드에 의해 제어되는 조절가능한 기능성 도메인에 작동적으로 연결될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 융합 단백질은 DNA-결합 결합 도메인 및 절단(뉴클레아제) 도메인을 포함한다. 이와 같이, 유전자 변형은 뉴클레아제, 예를 들어, 공학적으로 조작된 뉴클레아제를 이용해서 달성될 수 있다. 공학적으로 조작된 뉴클레아제 기술은 천연형 DNA-결합 단백질의 공학적 조작에 의거하고 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 광범위하게 적용가능하고, 관심 대상인 임의의 뉴클레아제를 포함할 수 있다. 뉴클레아제의 비제한적인 예는 메가뉴클레아제 및 아연 핑거 뉴클레아제를 포함한다. 뉴클레아제는 비상동성 DNA-결합 및 절단 도메인(예컨대, 아연 핑거 뉴클레아제; 비상동성 절단 도메인을 지니는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인)을 포함할 수 있거나, 또는 대안적으로, 천연형 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 선택된 표적 부위(예컨대, 동족 결합 부위와는 다른 부위에 결합되도록 공학적으로 조작된 메가뉴클레아제)에 결합하도록 변경될 수 있다. 예를 들어, 맞춤화된 DNA-결합 특이성을 지니는 귀소 엔도뉴클레아제의 공학적 조작은 이미 기술되어 있는 바, 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Chames et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(20):e178; Arnould et al. (2006) J. Mol. Biol. 355:443-458; 및 Grizot et al (2009) Nucleic Acids Res July 7 e publication]을 참조하면 된다. 또한, ZFP의 공학적 조작도 기재되어 있다. 이에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 제6,534,261호; 제6,607,882호; 제6,824,978호; 제6,979,539호; 제6,933,113호; 제7,163,824호; 및 제7,013,219호를 참조하면 된다.

소정의 실시형태에 있어서, 뉴클레아제는 메가뉴클레아제(귀소 엔도뉴클레아제)이다. 천연형 메가뉴클레아제는 15 내지 40개의 염기쌍 절단 부위를 인식하고 통상 이하의 4개 패밀리로 그룹화된다: LAGLIDADG 패밀리, GIY-YIG 패밀리, His-Cyst 박스 패밀리 및 HNH 패밀리. 예시적인 귀소 엔도뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함한다. 이들의 인식 서열은 공지되어 있다. 이에 대해서는, 미국 특허 제5,420,032호; 미국 특허 제6,833,252호; 문헌[Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353] 및 뉴잉글런드 바이오랩스사(New England Biolabs)의 카탈로그를 참조하면 된다.

천연형 메가뉴클레아제로부터, 주로 LAGLIDADG 패밀리로부터의 DNA-결합 도메인은, 식물, 효모, 초파리, 포유동물세포 및 마우스에서 부위-특이적 게놈 변형을 촉진시키는데 이용되어 왔지만, 이 접근법은 메가뉴클레아제 인식 서열을 보존하는 상동성 유전자의 변형으로(Monet et al. (1999), Biochem. Biophysics. Res. Common. 255: 88-93) 또는 인자 서열이 도입되어 있는 미리 공학적으로 조작된 게놈으로(Route et al. (1994), Mol. Cell. Biol. 14: 8096-106; Chilton et al. (2003), Plant Physiology. 133: 956-65; Puchta et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5055-60; Rong et al. (2002), Genes Dev. 16: 1568-81; Gouble et al. (2006), J. Gene Med. 8(5):616-622) 제한되었다. 따라서, 의학적으로 혹은 생명공학적으로 관련된 부위에서 신규한 결합 특이성을 발현하도록 메가뉴클레아제를 공학적으로 조작하는 시도가 행해졌다(Porteus et al. (2005), Nat. Biotechnol. 23: 967-73; Sussman et al. (2004), J. Mol. Biol. 342: 31-41; Epinat et al. (2003), Nucleic Acids Res. 31: 2952-62; Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; 미국 특허 공개 공보 제20070117128호; 제20060206949호; 제20060153826호; 제20060078552호; 및 제20040002092호). 또한, 메가뉴클레아제로부터의 천연형 또는 공학적으로 조작된 DNA-결합 도메인은 또한 비상동성 뉴클레아제(예컨대, FokI)로부터 절단 도메인과 함께 작동적으로 연결되어 있다.

다른 실시형태에 있어서, 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)이다. ZFN는 선택 유전자 내의 표적 부위 및 절단 도메인 또는 절단 절반 도메인에 결합하도록 공학적으로 조작된 아연 핑거 단백질을 포함한다.

위에서 언급된 바와 같이, 아연 핑거 결합 도메인은 선택 서열에 결합하도록 공학적으로 조작될 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416]을 참조하면 된다. 공학적으로 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 천연형 아연 핑거 단백질과 비교해서 신규한 결합 특이성을 지닐 수 있다. 공학적 조작 방법은, 적절한 설계 및 각종 유형의 선택을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 적절한 설계는, 예를 들어, 삼중자(또는 사중자) 뉴클레오타이드 서열 및 개별의 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 이용하는 것을 포함하되, 여기서, 각 삼중자 혹은 사중자 뉴클레오타이드 서열은 특정 삼중자 혹은 사중자 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 이에 대해서는, 예를 들어, 공유된 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참조하면 되고, 이들 문헌은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 병합된다.

파지 표시 및 2-혼성 시스템을 포함하는 예시적인 선택 방법은, 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호뿐만 아니라; 제WO　98/37186호; 제WO　98/53057호; 제WO　00/27878호; 제WO　01/88197호; 및 제GB 2,338,237호에도 개시되어 있다. 또한, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증대는 예를 들어 공유된 제WO　02/077227호에 기재되어 있다.

표적 부위; ZFN의 선택과, 융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 구성 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 또한 미국 특허 출원 공개 공보 제20050064474호 및 제20060188987호에 상세히 기재되어 있으며, 이들 문헌은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 병합된다.

또, 이들 및 기타 문헌에 개시된 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다수-핑거화된 아연 핑거 단백질은, 예를 들어, 길이가 5개 이상인 아미노산의 링커를 비롯하여 임의의 적절한 링커 서열을 이용해서 함께 연결될 수 있다. 길이가 6개 이상인 아미노산인 예시적인 링커 서열에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참조하면 된다. 본 명세서에 기재된 단백질은 단백질의 개별적인 아연 핑거 간의 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다

ZFN 및/또는 메가뉴클레아제 등과 같은 뉴클레아제는 또한 뉴클레아제(절단 도메인, 절단 절반 도메인)를 포함한다. 위에서 언급된 바와 같이, 절단 도메인은 상이한 뉴클레아제로부터의 뉴클레아제 혹은 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인으로부터 DNA-결합 도메인, 예를 들어, 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인에 대해서 상동성일 수 있다. 상동성 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 혹은 엑소뉴클레아제로부터 얻어질 수 있다. 절단 도메인이 유도될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는, 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 이에 대해서는, 예를 들어, 매사추세츠주의 비벌리시에 소재한 뉴 잉글런드 바이오랩스사의 2002-2003 카탈로그; 및 문헌[Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조하면 된다. DNA를 절단하는 추가의 효소는 공지되어 있다(예컨대, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장의 DNase I; 미구균(micrococcal) 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한 문헌[Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993] 참조). 이들 효소(또는 그의 기능성 단편)들 중 하나 이상이 절단 도메인 및 절단 절반 도메인의 공급원으로서 이용될 수 있다.

마찬가지로, 절단 절반 도메인은 절단 활성을 위하여 이량체화를 필요로 하는, 전술한 바와 같은, 임의의 뉴클레아제 혹은 그의 부분으로부터 유도될 수 있다. 일반적으로, 두 융합 단백질은 해당 융합 단백질들이 절단 절반 도메인을 포함한다면 절단을 필요로 한다. 대안적으로, 2개의 절단 절반 도메인을 포함하는 단일의 단백질이 이용될 수 있다. 2개의 절단 절반 도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 그의 기능성 단편)로부터 유도될 수 있거나, 또는 각각의 절단 절반 도메인은 상이한 엔도뉴클레아제(또는 그의 기능성 단편)로부터 유도될 수 있다. 또한, 두 융합 단백질에 대한 표적 부위는, 바람직하게는, 두 융합 단백질의 그들의 각각의 표적 부위에 대한 결합이 서로에 대한 공간적 배향에서 절단 절반 도메인을 위치시켜 해당 절단 절반 도메인이 예컨대 이량체화에 의해서 기능성 절단 도메인을 형성할 수 있도록, 서로에 대해서 배치된다. 이와 같이 해서, 소정의 실시형태에 있어서, 표적 부위의 근방 에지는 5 내지 8개의 뉴클레오타이드에 의해 혹은 15 내지 18개의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 그러나, 임의의 정수개의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍(예컨대, 2 내지 50개의 뉴클레오타이드 쌍 혹은 그 이상)이 두 표적 부위 사이에 개재되어 있을 수 있다. 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위들 사이에 놓인다.

제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 종으로 존재하며, (인식 부위에서) DNA에 대한 서열-특이적 결합 및 결합 부위에서 혹은 그 근방에서 DNA를 절단할 수 있다. 소정의 제한 효소(예컨대, IIS형)는 인식 부위로부터 떨어진 부위에서 DNA를 절단하고, 분리가능한 결합 도메인과 절단 도메인을 지닌다. 예를 들어, IIS형 효소 Fok　I은 하나의 가닥 상의 그의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오타이드와 다른 가닥 상의 그의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오타이드에서, DNA의 이중가닥 절단을 촉매한다. 이에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호뿐만 아니라; 문헌[Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31, 978-31, 982]을 참조하면 된다. 이와 같이 해서, 일 실시형태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 IIS형 제한 효소로부터의 절단 도메인(또는 절단 절반 도메인) 및 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함하며, 이들은 공학적으로 조작되어 있을 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.

절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 IIS형 제한 효소는 Fok　I이다. 이 특정 효소는 이량체로서 활성적이다(문헌[Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575] 참조). 따라서, 본 발명의 목적을 위하여, 개시된 융합 단백질에 이용된 Fok　I 효소의 부분은 절단 절반 도메인인 것으로 간주된다. 이와 같이 해서, 아연 핑거-Fok　I 융합을 이용해서 세포 서열의 표적화된 이중가닥 절단 및/또는 표적화된 재배치를 위하여, 두 융합 단백질(각각 FokI 절단 절반 도메인을 포함함)이 촉매 활성 절단 도메인을 재구성하는데 이용될 수 있다. 대안적으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 Fok　I 절단 절반 도메인을 포함하는 단일 폴리펩타이드 분자도 이용될 수 있다. 아연 핑거-Fok　I 융합을 이용하는 표적화된 절단 및 표적화된 서열 변경용의 파라미터는 본 발명의 어느 것에선가 제공되어 있다.

절단 도메인 또는 절단 절반 도메인은 절단 활성을 유지하거나 기능성 절단 도메인을 형성하기 위하여 다량체화(예컨대, 이량체화)되는 능력을 유지하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.

예시적인 IIS형 제한 효소는 국제 특허 공개 공보 제WO 07/014275호에 기재되어 있고, 이는 그의 전문이 본 명세서에 병합된다. 추가의 제한 효소는 또한 분리가능한 결합 도메인과 절단 도메인을 포함하며, 이들은 본 발명에 의해 상정된다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420]을 참조하면 된다.

소정의 실시형태에 있어서, 절단 도메인은, 예를 들어, 미국 특허 공개 공보 제20050064474호 및 제20060188987에, 그리고 미국 특허 출원 제11/805,850호(출원일: 2007년 5월 23일)에 기재된 바와 같이(이들 모든 문헌의 개시 내용은 참조로 그들의 전문이 본 명세서에 병합됨), 동종이량체화(homodimerization)를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 공학적으로 조작된 절단 절반 도메인("이량체화 도메인 변이"라고도 지칭됨)을 포함한다. Fok I의 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 및 538번 위치에서의 아미노산잔기는 Fok I 절단 절반 도메인의 이량체화에 영향을 주는 모든 표적이다.

절대적인 이종이량체를 형성하는 Fok I의 예시적인 공학적으로 조작된 절단 절반 도메인은 1쌍을 포함하는데, 그 중, 제1절단 절반 도메인이 Fok I의 490 및 538번 위치에서 아미노산 잔기에 돌연변이를 포함하고, 제2절단 절반 도메인은 아미노산 잔기 486 및 499번 위치에 돌연변이를 포함한다.

이와 같이 해서, 일 실시형태에 있어서, 490번 위치에서의 돌연변이는 Glu (E)를 Lys (K)로 대체하고; 538번 위치에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 교체하며; 486번 위치에서의 돌연변이는 Gln (Q)를 Glu (E)로 대체하고; 499번 위치에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 대체한다. 구체적으로는, 본 명세서에 기재된 공학적으로 조작된 절단 절반 도메인은, 한쪽 절단 절반 도메인에서 490(E→K)번 위치 및 538(I→K)번 위치를 돌연변이시켜 공학적으로 조작된 절단 절반 도메인 설계된 "E490K:I538K"를 생성하고, 다른 쪽 절단 절반 도메인에서 486(Q→E)번 위치 및 499(I→L)번 위치를 돌연변이시켜 공학적으로 조작된 절단 절반 도메인 설계된 "Q486E:I499L"를 생성함으로써 제조되었다. 본 명세서에 기재된 공학적으로 조작된 절단 절반 도메인은 비정상적 절단이 최소화되거나 무효로 되는 절대적 이종이량체 돌연변이체이다. 이에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 가출원 제60/808,486호(출원일: 2006년 5월 25일)의 실시예 1을 참조하면 되고, 이 문헌의 개시내용은 모든 목적을 위하여 참조로 그의 전문이 병합된다.

본 명세서에 기재된 공학적으로 조작된 절단 절반 도메인은, 임의의 적절한 방법을 이용해서, 예를 들어, 미국 특허 공개 공보 제20050064474호의 실시예 5 및 미국 특허 공개 공보 제2007/0305346호의 실시예 38, 제2008/0131962호, 그리고 미국 특허 가출원 제61/337,769호(출원일: 2010년 2월 8일) 및 제61/403,916호(출원일: 2010년 9월 23일)에 기재된 바와 같은 야생형 절단 절반 도메인(Fok I)의 부위 지향적 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.

뉴클레아제 발현 작제물은 당업계에 공지된 방법을 이용해서 용이하게 설계될 수 있다. 이에 대해서는, 예컨대, 미국 특허 공개 공보 제20030232410호; 제20050208489호; 제20050026157호; 제20050064474호; 제20060188987호; 제20060063231호; 및 국제 특허 공개 공보 제WO 07/014275호를 참조하면 된다. 소정의 실시형태에 있어서, 뉴클레아제의 발현은, 유도성 프로모터, 예를 들어, 라피노스의 존재 하에 활성화되고(탈억제되고)/되거나 글루코스의 존재 하에 억제되는 갈락토키나제 프로모터의 제어 하에 있다. 특히, 갈락토키나제 프로모터는 유도되고, 뉴클레아제(들)는 탄소원의 연속적인 변화 시(예컨대, 글루코스에서 라피노스로 이어서 갈락토스로) 발현되었다. 유도성 프로모터의 기타 비제한적인 예는 CUP1, MET15, PHO5 및 tet-반응성 프로모터를 포함한다.

전달

단백질(예컨대, ZFP), 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 본 명세서에 기재된 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 임의의 적절한 수단에 의해 표적 세포에 전달될 수 있다. 적절한 세포는 진핵 세포 및 원핵 세포 및/또는 세포주를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 세포 또는 이러한 세포로부터 생성된 세포주의 비제한적인 예는 COS, CHO(예컨대, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(예컨대, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) 및 perC6 세포뿐만 아니라, 스포돕테라 푸기퍼다(Spodoptera fugiperda)(Sf) 등과 같은 곤충 세포, 또는 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia) 및 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 등과 같은 진균 세포를 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 세포주는 CHO-K1, MDCK 또는 HEK293 세포주이다. 적절한 1차 세포는 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC), 및 기타 혈액 세포 서브세트, 예컨대, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 등(그러나 이들로 제한되는 것은 아님)을 포함한다. 적절하나 세포는 또한 예로써 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 간층직 줄기 세포(mesenchymal stem cell) 등과 같은 줄기 세포를 포함한다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 아연 핑거 단백질을 포함하는 단백질을 전달하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제6,453,242호; 제6,503,717호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,607,882호; 제6,689,558호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호에 기재되어 있고, 이들 모든 문헌의 개시내용은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 병합된다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 아연 핑거 단백질은 또한 아연 핑거 단백질(들) 중 하나 이상을 암호화하는 서열을 포함하는 벡터를 이용해서 전달될 수 있다. 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 포진바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 등을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 임의의 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 이에 대해서는 또한 미국 특허 제6,534,261호; 제6,607,882호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호를 참조하면 되고, 이들 문헌은 그들의 전문이 참조로 본 명세서에 병합된다. 또한, 이들 벡터의 어느 것이라도 하나 이상의 아연 핑거 단백질-암호화 서열을 포함할 수 있음은 명백할 것이다. 이와 같이 해서, 하나 이상의 ZFP가 세포 내에 도입될 경우, ZFP는 동일한 벡터 상에 혹은 상이한 벡터 상에 담지될 수 있다. 다수의 벡터가 이용될 경우, 각 벡터는 하나 혹은 다수의 ZFP를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.

종래의 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법은 세포(예컨대, 포유동물세포) 및 표적 조직에서 공학적으로 조작된 ZFP를 암호화하는 핵산을 도입하는데 이용될 수 있다. 이러한 방법은 또한 세포에 시험관내에서 ZFP를 암호화하는 핵산을 투여하는데 이용될 수도 있다. 소정의 실시형태에 있어서, ZFP를 암호화하는 핵산은 생체내 혹은 생체외 유전자 요법 용도를 위하여 투여된다. 비바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드(naked) 핵산, 및 리포솜 혹은 폴록사머 등과 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 바이러스 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이들은 세포에 전달 후 에피솜 혹은 통합 게놈을 지닌다. 유전자 요법 절차의 검토를 위하여, 문헌[Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and

(eds.) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)]을 참조하면 된다.

핵산의 비바이러스 전달 방법은 전기천공, 리포펙션, 마이크로주입, 바이오리스틱(biolistic), 비로솜(virosome), 리포솜, 면역리포솜, 다양이온(polycation) 혹은 지질:핵산 컨쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온(artificial virion), 및 DNA의 제제-증대 흡수를 포함한다. 예컨대, 소니트론 2000 시스템(Sonitron 2000 system)(Rich-Mar)을 이용하는 소노포레이션(sonoporation)이 또한 핵산의 전달을 위해 이용될 수 있다.

추가의 예시적인 핵산 전달 시스템은 아막사(Amaxa)(등록상표) 바이오시스템즈(독일의 쾰른시에 소재), 막스사이트사(Maxcyte, Inc.)(매릴랜드주의 로크빌시에 소재), BTX 분자 전달 시스템(매사추세츠주의 홀리스톤시에 소재) 및 Copernicus Therapeutics Inc.(예를 들어 제US6008336호 참조)에 의해 제공된 것들을 포함한다. 리포펙션은 예컨대 미국 특허 제5,049,386호, 미국 특허 제4,946,787호 및 미국 특허 제4,897,355호에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다(예컨대, 트랜스펙탐(Transfectam)(상표명) 및 리포펙틴(Lipofectin)(상표명)). 폴리뉴클레오타이드의 유효한 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, 제WO 91/17424호, 제WO 91/16024호의 것들을 포함한다. 전달은 세포(세포외 투여) 또는 표적 조직(세포내 투여)에 행해질 수 있다.

면역지질 복합체 등과 같은 표적화된 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 당업계 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호 및 제4,946,787호 참조).

추가의 전달 방법은 EnGeneIC 전달 비히클(EnGeneIC delivery vehicle: EDV)들 내로 전달될 핵산을 포장하는 용도를 포함한다. 이들 EDV들은 항체의 하나의 아암(arm)이 표적 조직에 대해서 특이성을 지니고 다른 쪽 아암이 EDV에 대해서 특이성을 지니는 이특이적 항체를 이용해서 표적 조직에 특이적으로 전달된다. 항체는 EDV를 표적 세포 표면으로 가져간 후 EDV를 세포내섭취(endocytosis)에 의해 세포 내로 주입한다. 일단 세포 내에서, 내용물은 방출된다(문헌[MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology vol 27(7) p. 643] 참조).

공학적으로 조작된 ZFP를 암호화하는 핵산을 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 용도는, 체내 특정 세포로 바이러스를 표적화하여 핵에 대한 바이러스 탑재를 트래피킹(trafficking)하는 고도로 진화된 프로세스를 이용한다. 바이러스 벡터들은 환자(생체내)에 직접 투여될 수 있거나, 또는 이들은 세포를 시험관내에서 치료하는데 이용될 수 있고, 변형된 세포는 환자(생체외)에게 투여된다. ZFP의 전달을 위한 종래의 바이러스 기반 시스템은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 백시니어(vaccinia) 및 유전자 전달을 위한 단순포진 바이러스 벡터를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 숙주 게놈의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-연관 바이러스 유전자 전달 방법에 의해 가능하며, 흔히 삽입된 이식유전자의 장기 발현을 초래한다. 또한, 높은 형질도입 효율은 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다.

레트로바이러스의 주성(tropism)은 외래 엔빌로프 단백질을 혼입시키고 표적 세포의 잠재적인 표적 모집단을 팽창(expand)시킴으로써 변화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 비분할 세포에 형질도입하거나 감염될 수 있고 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 좌우된다. 레트로바이러스 벡터는 6 내지 10kb까지의 외래 서열에 대한 패키징 용량을 지니는 시스-작용성 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소 시스-작용성 LTR은 벡터의 복제 및 패키징을 위해 충분하며, 이어서 영구적인 이식유전자 발현을 제공하기 위하여 표적 세포 내로 치료 유전자를 통합시키는데 이용된다. 광범위하게 이용되는 레트로바이러스 벡터는 쥣과 백혈병 바이러스(murine leukemia virus: MuLV), 긴필 원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus: GaLV), 유인원의 면역결힙 바이러스(Simian Immunodeficiency virus: SIV), 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus: HIV), 및 이들의 조합물에 의거한 것들을 포함한다(예컨대, 문헌[Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700] 참조).

과도적 발현이 바람직한 응용에 있어서, 아데노바이러스 기반 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효능이 가능하며, 세포 분할을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터에 의하면, 높은 역가 및 높은 수준의 발현이 얻어진다. 이 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus : "AAV") 벡터는, 또한 예컨대, 핵산 및 펩타이드의 시험관내 생산에서 그리고 생체내 및 생체외 유전자 요법 절차를 위하여, 표적 핵산을 이용해서 세포에 형질도입하는데 이용된다(예컨대, 문헌[West et al., Virology 160:38-47 (1987)]; 미국 특허 제4,797,368호; 제WO 93/24641호; 문헌[Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)] 참조). 재조합 AAV 벡터의 구축은 미국 특허 제5,173,414호; 문헌[Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)]을 포함하여 많은 간행물에 기재되어 있다.

적어도 6개의 바이러스 벡터 접근법이 임상 시험에서 유전자 전달을 위하여 현재 이용가능하며, 이는 형질도입제를 생성하기 위하여 헬퍼 세포주 내로 삽입된 유전자에 의한 결손 벡터의 상보성과 연루된 접근법을 이용한다.

pLASN 및 MFG-S는 이상 시험에서 이용되던 레트로바이러스 벡터의 예이다(Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN은 유전자 요법 시험에서 이용되던 제1치료 벡터였다(Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). 50% 이상의 형질도입 효율이 MFG-S 패키징된 벡터에 대해서 관찰되었다(Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).

재조합 아데노-연관 바이러스(recombinant adeno-associated virus vector: rAAV)는 결합 및 비병원성 파보바이러스 아데노-연관 제2형 바이러스에 의거해서 유망한 대안적인 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 이식유전자 발현 카세트에 인접한(flanking) AAV 145 bp 역전된 말단 반복부만을 보유하는 플라스미드로부터 유도된다. 형질도입된 세포의 게놈 내로의 통합으로 인해 효과적인 유전자 전달 및 안정적인 이식유전자 전달은 이 벡터 시스템에 대한 주된 특징이다(Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 및 AAV8을 포함하는 기타 AAV 혈청형(serotype)이 또한 본 발명에 따라서 이용될 수 있다.

복제-결손 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad)는 높은 역가에서 생성될 수 있고, 많은 상이한 세포 유형을 용이하게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는, 이식유전자가 Ad E1a, E1b, 및/또는 E3 유전자를 대체하고; 이어서 상기 복제 결합 벡터는 트랜스로 결손된 유전자 기능을 공급하는 인간 293 세포에서 전파되도록 공학적으로 조작되어 있다. Ad 벡터는, 간, 신장 및 근육에서 발견되는 것 등과 같은 비분할, 분화된 세포를 포함하는, 다수의 유형의 조직을 생체내에서 형질도입할 수 있다. 종래의 Ad 벡터는 커다란 담지 용량을 지닌다. 임상 시험에서의 Ad 벡터의 이용예는 근육내 주사를 이용한 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오타이드 요법과 연루되었다(Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). 임상 시험에서 유전자 전달을 위하여 아데노바이러스 벡터를 이용하는 추가의 예는 문헌[Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)]을 포함한다.

패키징 세포는 숙주 세포에 감염될 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 이용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징하는 Ψ2 세포 혹은 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 이용되는 바이러스 벡터는 통상 바이러스 입자 내로 핵산 벡터를 패키징하는 프로듀서(producer) 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 후속의 숙주 내로의 통합(적용가능하다면)을 위해 요구되는 최소 바이러스 서열을 포함하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 암호화하는 발현 카세트에 의해 교체된다. 결손 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에 이용되는 AAV 벡터는 전형적으로 단지 패키징 및 숙주 게놈 내로의 통합을 필요로 하는 AAV 게놈으로부터 역전된 말단 반복(inverted terminal repeat: ITR) 서열을 지닌다. 바이러스 DNA는 세포주에 패키징되고, 이는 다른 AAV 유전자, 즉, rep 및 cap을 암호화하지만 ITR 서열을 결여하는 헬퍼 플라스미드를 포함한다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현 및 AAV 벡터의 복제를 촉진시킨다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 상당한 양으로 패키징되지는 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예컨대, 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 저감될 수 있다.

많은 유전자 요법 응용에 있어서, 유전자 요법 벡터는 특정 조직 유형에 대해서 높은 정도의 특이성으로 전달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는 바이러스의 외표면 상에 바이러스 코트 단백질을 지니는 융합 단백질로서 리간드를 발현시킴으로써 주어진 세포에 대해 특이성을 지니도록 변형될 수 있다. 리간드는 관심 대상 세포 유형 상에 존재하는 것으로 알려진 수용체에 대해서 친화도를 지니도록 선택된다. 예를 들어, 문헌[Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)]은, 몰로니(Moloney) 쥣과 백혈병 바이러스가 gp70에 융합된 인간 헤레굴린(heregulin)을 발현시키도록 변형될 수 있고, 재조합 바이러스는 인간 상피 성장 인자 수용체를 발현하는 소정의 인간 유방암 세포를 감염시키는 것을 보고하였다. 이 원리는 다른 바이러스-표적 세포쌍으로 확대될 수 있고, 여기서 표적 세포는 수용체를 발현하고, 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현한다. 예를 들어, 사상 파지(filamentous phage)는 사실상 임의의 선택된 세포 수용체에 대한 특이적 결합 친화도를 지니는 항체 단편(예컨대, FAB 또는 Fv)을 표시하도록 공학적으로 조작될 수 있다. 상기 설명은 주로 바이러스 벡터에 적용되지만, 동일한 원리는 비바이러스성 벡터에 적용될 수 있다. 이러한 벡터는 특이적 표적 세포에 의한 흡수를 촉진하는 특이적 흡수 서열을 포함하도록 공학적으로 조작될 수 있다.

유전자 요법 벡터는, 이하에 설명되는 바와 같이, 전형적으로 전신 투여(예컨대, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 혹은 두개내 주입) 또는 국소 도포에 의해, 개별의 환자에게 투여에 의해 생체내로 전달될 수 있다. 대안적으로, 벡터는, 개별의 환자로부터 체외이식된 세포(예컨대, 림프구, 골수 천자액, 조직 생검) 또는 범용 공여체 조혈 줄기 세포 등과 같은 세포에 생체외로 전달되고 나서, 통상 벡터가 혼입된 세포를 선택한 후, 세포의 환자 내로의 재이식을 행한다.

진단, 연구를 위한 혹은 유전자 요법을 위한, (예컨대, 숙주 유기체 내로 형질주입된 세포의 재주입을 통해서) 생체외 세포 형질주입은 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 세포는 대상 유기체로부터 단리되고, ZFP 핵산(유전자 또는 cDNA)으로 형질주입되고, 대상 유기체(예컨대, 환자) 내로 다시 재주입된다. 생체외 형질주입에 적합한 각종 세포 유형은 당업자에게 잘 알려져 있다(예컨대, 문헌[Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)] 및 환자로부터 세포를 단리시켜 배양하는 방법에 대한 논의를 위하여 본 명세서에서 인용된 문헌 참조).

적절한 세포는 진핵 세포 및 원핵 세포 및/또는 세포주를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 세포 또는 이러한 세포로부터 생성된 세포주의 비제한적인 예는 COS, CHO(예컨대, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(예컨대, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) 및 perC6 세포뿐만 아니라, 스포돕테라 푸기퍼다(Sf) 등과 같은 곤충 세포, 또는 사카로마이세스, 피키아 및 시조사카로마이세스 등과 같은 진균 세포를 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 세포주는 CHO-K1, MDCK 또는 HEK293 세포주이다. 또한, 1차 세포는 ZFN에 의한 치료 후 치료될 대상체 내로 재도입을 위하여 단리되어 생체외에서 이용될 수 있다. 적절한 1차 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 및 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 등(이들로 제한되는 것은 아님)과 같은 기타 혈액 세포 서브세트를 포함한다. 적절한 세포는 또한 예로써 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 간층직 줄기 세포 등과 같은 줄기 세포를 포함한다.

일 실시형태에 있어서, 줄기 세포는 세포 형질주입 및 유전자 요법을 위하여 생체외 절차에서 이용된다. 줄기 세포들을 이용하는 이점은, 이들이 다른 세포 유형으로 시험관내에서 분화될 수 있거나, 또는 이들이 골수에 이식되게 될 포유동물(세포의 공여체 등) 내로 도입될 수 있다. GM-CSF, IFN-γ 및 TNF-α등과 같은 사이토카인을 이용해서 임상적으로 중요한 면역 세포 내로 CD34+ 세포를 시험관내에서 분화시키는 방법은 공지되어 있다(문헌[Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)] 참조).

줄기 세포는 공지된 방법을 이용해서 형질도입 및 분화를 위하여 단리된다. 예를 들어, 줄기 세포는 CD4+ 및 CD8+(T 세포), CD45+(panB 세포), GR-1(과립구), 및 Iad(분화된 항원 제시 세포) 등과 같은 원치 않는 세포에 결합하는 항체로 골수 세포를 패닝(panning)함으로써 골수 세포로부터 단리된다(문헌[Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)] 참조).

변형된 줄기 세포가 또한 몇몇 실시형태에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 세포자멸에 대해 내성이 있는 줄기 세포는, 해당 줄기 세포가 본 발명의 ZFP TF를 함유하는 치료적 조성물로서 이용될 수 있다. 세포자멸에 대한 내성은. 예를 들어, 줄기 세포 내 BAX- 또는 BAK-특이적 ZFN(미국 특허 출원 제12/456,043호) 또는 예를 들어, 재차 카스파제-6 특이적 ZFN을 이용해서 카스파제 내에서 파괴된 것들을 이용하여 BAX 및/또는 BAK를 넉 아웃시킴으로써 발생할 수 있다. 이들 세포는 쥣과 혹은 야생형 PD1를 조절하는 것으로 알려진 ZFP TF로 형질주입될 수 있다.

치료적 ZFP 핵산을 함유하는 벡터(예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포솜 등)는 또한 생체내에서 세포의 형질도입을 위하여 유기체에 직접 투여될 수 있다. 대안적으로, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 도포 및 전기천공을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 혈액 혹은 조직 세포와의 궁극적인 접촉부 내로 분자를 도입시키기 위하여 통상 이용되는 경로들 중 어느 하나에 의해서 행한다. 이러한 핵산을 투여하는 적절한 방법이 이용가능하며 당업자에게 잘 알려져 있고, 하나 이상의 경로가 특정 조성물을 투여하는데 이용될 수 있지만, 특정 경로가 흔히 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있다.

조혈 줄기 세포 내로 DNA를 도입하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,928,638호에 개시되어 있다. 조혈 줄기 세포, 예컨대, CD34⁺ 세포 내로 이식유전자를 도입하는 데 유용한 벡터는 아데노바이러스 35형을 포함한다.

면역 세포(예컨대, T-세포) 내로의 이식유전자의 도입에 적합한 벡터는 비삽입성 레트로바이러스 벡터(non-integrating lentivirus vector)를 포함한다. 이에 대해서는, 예를 들어, 문헌[Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222]을 참조하면 된다.

약제학적으로 허용가능한 담체는 투여 중인 특정 조성물에 의해서뿐만 아니라 해당 조성물을 투여하는데 이용되는 특정 방업에 의해서 결정된다. 따라서, 이하에 기재된 바와 같이 이용가능한 약제학적 조성물의 광범위한 적절한 제형이 있다(이에 대해서는 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989]을 참조하면 된다).

응용

개시된 조성물 및 방법은 하나 이상의 PD1 유전자의 발현을 조절하길 원하는 임의의 응용을 위하여 이용될 수 있다. 특히, 이들 방법 및 조성물은, 치료 및 연구 응용을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌, PD1 대립형질의 조절이 요망될 경우 이용될 수 있다. 상기 방법 및 조성물은 HIV/AIDS 및 HCV 등과 같은 만성 감염성 질환을 치료하는데 이용될 수 있다. 또한, 상기 방법 및 조성물은 흑색종, 난소암, 대장/결장암, 신장 세포 암종, 형질세포종/골수종, 유방암 및 폐암 등과 같은 암을 치료하는데 이용될 수 있다.

PD1 억제 ZFP TF 또는 ZFN이 치료제로서 이용될 수 있는 질환 및 병태는, 만성 감염 질환 및 암을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. PD1 유전자를 활성화시키는 것이 치료학적 치료로서 유용할 수 있는 질환 및 병태는 전신 홍반성 루푸스(SLE) 등과 같은 자가면역 질환을 포함한다. ZFP TF 또는 ZFN을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 그 자체가 치료제로서 이용될 수 있거나, 또는 전달용의 벡터 내에 혼입될 수 있다.

PD1 대립형질을 나타내는 ZFP-TF, 및/또는 PD1 특이적 ZFN을 포함하는 방법 및 조성물은 또한 만성 감염성 질환 혹은 암을 치료하도록 설계된 다른 치료제와 함께 이용될 수 있다. 이들 ZFP 혹은 ZFN(또는 이들 ZFP 혹은 ZFN을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)은 (예컨대 동일 약제학적 조성물에서) 동시에 투여될 수 있거나, 또는 임의의 수순으로 순차 투여될 수 있다. 폐암종, 췌장암, 간암, 골암, 유방암, 대장암, 난소암, 백혈병, 림프종, 뇌암 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 임의의 유형의 암은 치료될 수 있다. 마찬가지로, PD1 대립형질을 활성화하도록 설계된 ZFP TF는 자가면역 질환을 치료하도록 설계된 다른 치료제와 함께 이용될 수 있다.

치료용 방법 및 조성물은 또한 환자로부터 단리된 세포 내의 PD1 대립형질의 돌연변이 복제물이 PD1-특이적 ZFN을 이용해서 야생형 PD1 대립형질로 변형되어 있는 세포 조성물을 포함한다. 이들 생체외 변형된 세포는 이어서 환자 내로 재도입된다. 부가적으로, 변형된 줄기 세포를 포함하는 방법 및 조성물이 또한 상정된다. 예를 들어, 줄기 세포 내에서의 PD1 대립형질의 돌연변이 복제물이 PD1-특이적 ZFN을 이용해서 야생형 PD1 대립형질로 변형되어 있는 줄기 세포 조성물이 제공된다. 다른 실시형태에 있어서는, 줄기 세포 내에서의 야생형 PD1 대립형질이 PD1-특이적 ZFN을 이용해서 변형되어 있는 줄기 세포 조성물이 제공된다. 이들 조성물은 다른 치료제와 함께 이용될 수 있다. 이들 조성물은 (예컨대 동일 약제학적 조성물에서) 동시에 투여될 수 있거나, 또는 임의의 수순으로 순차 투여될 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물은, 또한 시험관내 모델 및 생체내 모델, 예를 들어, 만성 감염, 암 혹은 자가면역의 동물 모델의 설계 및 이식에 유용하며, 이는 이들 장애의 연구 및 유용한 치료제의 추가의 개발을 허용한다.

이하의 실시예는 뉴클레아제가 ZFN을 포함하는 본 발명의 예시적인 실시형태에 관한 것이다. 이것은 단지 예시의 목적일 뿐, 예를 들어, 공학적으로 조작된 DNA-결합 도메인을 지니는 귀소 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제) 및/또는 공학적으로 조작된 귀소 엔도뉴클레아제(메가뉴클레아제) DNA-결합 도메인과 비상동성 절단 도메인의 자연적으로 생기는 융합체와 같은 다른 뉴클레아제가 이용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

실시예

실시예 1: 지속적으로 생물학적으로 활성인 PD1-특이적 ZFN의 확인

ZFN을 인간 PD1 유전자에 대해서 조립하고(assemble), 문헌[Miller et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:778-785]과 미국 특허 공개 공보 제20050064474호 및 국제 특허 공개 공보 제WO2005/014791호에 기재된 바와 같은 ELISA 검정 및 CEL1 검정에 의해 테스트하였다.

ZFP의 구체예는 표 1에 개시되어 있다. 이 표에서 첫번째 열은 ZFP에 대한 내부 기준 명칭(번호)이다. 표 2는 PD1 상의 표적 결합 부위들을 열거하고 있다. "F"는 핑거를 지칭하고, "F" 뒤에 있는 숫자는 그의 아연 핑거를 지칭한다(예컨대, "F1"은 핑거 1을 지칭한다).

초기 시험관내 활성 검정은 위에서 기재된 바와 같이 뉴클레오펙션된 세포 샘플에 대해서 수행하였다. 요약하면, ZFP-FokI 융합체를 암호화하는 플라스미드는 제조사에 의해 규정된 바와 같이 아막사(Amaxa)(등록상표) 뉴클레오펙션 키트를 이용해서 형질주입에 의해 K562 세포 내로 도입하였다. 형질주입을 위하여, 2백만개의 K562 세포를 다양한 양의 각 아연-핑거 뉴클레아제 발현 플라스미드 및 아막사(Amaxa)(등록상표) 용액 V 100㎕와 혼합하였다. 세포를 프로그램 T-16을 이용해서 아막사 뉴클레오펙터 II(Amaxa Nucleofector II)(상표명)에 형질주입하였다. 형질주입 직후, 세포를 두 상이한 플라스크 내로 나누어 넣고, 4일 동안 30℃ 또는 37℃에서 5% CO₂ 중 10% FBS로 보충된 RPMI 배지(Invitrogen)로 보충하였다.

이 초기 시험관내 스크린으로부터, 2개의 리드 ZFN 쌍이 확인되었고, 그들의 효능을 향상시키고자 시도하기 위하여 동화(elaboration)를 실시하였다. 이들은 각각 PD1 유전자의 표적 엑손 1과 5의 쌍을 이루었다. 이 동화된(향상된) 단백질은 본질적으로 위에서 기재된 바와 같이 경시적 실험에서 재차 테스트되었다. 그 결과는 이하의 표 3에 요약되어 있다.

표 3에 표시된 바와 같이, 엑손 5에 대하여 ZFN을 이용한 세포의 처리는 모집단으로부터 보다 큰 비율의 게놈-편집된 세포의 소실을 초래하는 한편, 엑손 1에 대하여 설계된 ZFN을 이용한 세포 내의 게놈-편집된 신호는 훨씬 더 안정적이다.

PD1 유전자좌에서 ZFN 활성을 결정하기 위하여, Cel-1 기반 서베이어(SURVEYOR)(상표명) 뉴클레아제 검정은 본질적으로 제조사의 지시(트랜스게노믹(Trangenomic) 서베이어(SURVEYOR)(상표명))에 따라서 수행하였다. 세포를 수확하고 염색체 DNA는 제조사의 지시(에피센터(Epicentre)(등록상표))에 따라서 퀵익스트랙트(Quickextract)(등록상표) 키트를 이용해서 제조하였다. PD1 유전자좌의 적절한 영역은 아큐프라임(Accuprime)(등록상표) 고신뢰 DNA 폴리머라제(Invitrogen)를 이용하여 PCR 증폭을 행하였다. PCR 반응물은 94℃로 가열하고 실온까지 점차적으로 냉각시켰다. 대략 200ng의 어닐링된 DNA를 0.33㎕ Cel-I 효소와 혼합하고, 42℃에서 20분 동안 인큐베이팅하였다. 반응 생성물은 1X Tris-보레이트-EDTA 완충액 중에서의 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분석하였다.

작제물은 또한 3일 또는 10일 동안 30℃ 또는 37℃에서 유지된 1차 PBMC 샘플에서 테스트되었다(표 4 참조). 요약하면, PBMC는 올셀즈사(AllCells)로부터 얻었고 RPMI + 10% FBS + 1% L-글루타민(30 ㎎/㎖) + IL-2(1ng/㎖, Sigma) 중에서 배양시키고 나서 제조사의 프로토콜(Dynal)에 따라서 항-CD3/CD28 비즈로 활성화시켰다. 세포는 24웰 플레이트에 1㎖ 부피 중 3E5 세포/㎖로 파종(seed)하였다.

아데노바이러스 벡터는 기재(미국 특허 공개 공보 제20080159996호 참조)된 바와 같은 관심 대상의 ZFN 쌍을 포함하여 구성되었고 10, 30 또는 100의 MOI에서 2일 후에 첨가되었다(MOI는 감염성 역가에 의거해서 계산되었다).

세포는 바이러스에 노출 후 3 내지 10일째에 수확하고, 유전자 변형 효율은 국제 특허 출원 공개 제WO 07/014275호에 기재된 바와 같이 수행되는, Cel-I 기반 서베이어(SURVEYOR)(상표명) 뉴클레아제 검정을 이용해서 결정되었다. 또한, 이에 대해서는, 문헌[Oleykowski et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26:4597-4602; Qui et al. (2004) BioTechniques 36:702-707; Yeung et al. (2005) BioTechniques 38:749-758]을 참조하면 된다.

표 4에 도시된 ZFN 쌍에 대해서, 각각 ZFN을 ZFN 12942과 조합하여 테스트하였다. 활성은 위에서 기재된 Cel-1 기반 서베이어(SURVEYOR)(상표명) 뉴클레아제 검정에 의해 측정된 바와 같이 퍼센트 NHEJ 활성에 의해 측정한다.

PD1 특이적 ZFN의 추가의 쌍은 또한 위에서 기재된 바와 같이 1차 PBMC에서 활성에 대해서 테스트하였고, 결과는 표 4에 표시되어 있다. 표 4에 표시된 데이터에 있어서, PD1-특이적 모노머 12942는 항상 표 4에 열거된 제2ZFN과 쌍을 이루어 활성 쌍을 형성하였다(즉, ZFN 12942는 ZFN 12947 내지 25041의 각각과 쌍을 이루었다). 또, 이에 대해서는 도 1을 참조할 수 있다(샘플은 표 4에 표시된 바와 같다).

분자 수준에서 ZFN 기동 NHEJ 활성의 국소 효과를 검정하기 위하여, CD8+ 세포는 엑손1 특이적 ZFN 쌍 12942 및 12947로 처리하였다. 요약하면, CD8+ 세포는 올셀즈사(AllCells)로부터 구입하였고, RPMI + 10% FBS + 1% L-글루타민(30 ㎎/㎖) + IL-2(30 ㎍/㎖, Sigma)에서 배양하였으며, 4 내지 24시간 동안 정치시켰다.

위에서 기재된 바와 같이 관심 대상인 ZFN 쌍을 함유하는 플라스미드를 작제하고, 1e6 세포/뉴클레오펙션은 제조사에 의해 규정된 바와 같이 아막사(Amaxa)(등록상표) 뉴클레오펙션 키트를 이용하였다. 세포는 제조사의 프로토콜(Dynal)에 따라서 항-CD3/CD28 비즈로 뉴클레오펙션 후 12 내지 24시간 활성화시켰다.

세포는 뉴클레오펙션 후 3 또는 10일에 수확하였고, 유전자 변형 효율은, 국제 특허 공개 공보 제WO 07/014275호에 기재된 바와 같이 수행된, Cel-1 기반 서베이어(SURVEYOR)(상표명) 뉴클레아제 검정을 이용해서 결정하였다. 이에 대해서는, 또한 예를 들어, 문헌[Oleykowski et al. (1998) Nucleic Acids res. 26:4597-4602; Qui et al. (2004) BioTechniques 36:702-707; Yeung et al. (2005) BioTechniques 38:749-758]을 참조하면 된다.

PCR 산물을 클로닝하고, 대장균(E. coli) 내에 형질주입하였다. 항생제 내성 서브클론을 성장시키고, 플라스미드를 단리하고 나서 서열 분석을 행하여, NHEJ의 결과로서 생긴 임의의 서열 변형을 관찰하였다(도 2 참조). 상기 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 각종 삽입 및 결실이 ZFN 절단 부위 근방에서 관찰되었다.

이들 ZFN은 또한 미국 특허 공개 공보 제20090111119호에 기재된 바와 같은 효모 시스템에서 테스트되었다.

실시예 2: 마우스에서의 PD1-특이적 ZFN의 생체외 활성.

PD1를 생체내에서 결실시키는 개념을 테스트하기 위하여, 마우스 PD1-특이적 ZFN은 위에서 기재된 바와 같이 제작하고, 생체외에서 테스트하였다. 아연 핑거 도메인들의 서열 특성뿐만 아니라 그들의 결합 특이성은 표 5 및 표 6에서 이하에 표시되어 있다.

1일째에, Pmel TCR 형질전환/Rag1-/- 마우스로부터 수확한 비장세포를 단일 세포 현탁액 내에서 처리하고, 인비트로젠사(Invitrogen)의 마우스 T-활성자 CD3/CD28 Dynabeads/10⁶ 세포 25㎕를 구비한 완전 배지(RPMI-1640, 10% 소태아 혈청, 0.1mM 비필수 아미노산, 1mM 피루브산나트륨, 2mM L-글루타민, 50 ㎍/㎖ 젠타마이신 설페이트, 50 μM 2-머캅토에탄올) 중에 재현탁시켰다. 세포를 24웰에 2×10⁶ 세포/㎖(2㎖/웰)에서 평판배양하였다(plated). 3일째에, 세포를 수확하고, 자석을 이용해서 비즈로부터 분리하고 계수하였다. 비장세포의 형질주입은 아막사(Amaxa)(등록상표) 뉴클레오펙션 키트에 구비된 프로토콜에 따라서 수행하였다. 요약하면, 1×10e⁷ 살아있는 세포를 아막사 뉴클레오펙터 용액(Amaxa Nucleofector Solution) 100㎕ 중에 재현탁시키고, 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector)(프로그램 X-01)를 이용해서, ZFN 쌍 14546 및 14545를 포함하는 플라스미드 4㎍ 또는 ZFN 쌍 14546-FokI EL 및 14545-Fok I KK를 포함하는 쥣과 PD1 Fok1 플라스미드 4㎍, 아막사(Amaxa) pmax GFP 벡터 2.5㎍, 또는 DNA 없는 대조군으로 형질주입하였다. 세포를 형질주입 후 30℃에서 완전 보충된 아막사(Amaxa) 마우스 T 세포 뉴클레오펙터 배지 2㎖ 중에 배양시켰다. 그 다음날, 아막사(Amaxa) 마우스 T 세포 뉴클레오펙터 배지 1㎖를 제거하고, 10 U/㎖ IL-2로 보충된 완전 배지 1㎖로 교체하였다. 2일 후, 세포를 수확하고 계수하였다. 각 군으로부터의 세포 2백만개의 세포를 24웰 플레이트 상의 항-CD3 코팅된 웰에서 평판배양하였다. 그 다음날, 세포를 수확하고, 항-PD1 PE; 항-CD3 PE-Cy7 및 항-CD8 APC로 염색하였다. 세포를 BD FACSCalibur 상에서 분석하였다. 플롯은 각 군 내의 % PD1 양성 CD3+CD8+ 세포 및 각 군에 대한 중앙 PD1 형광을 나타낸다(도 3 참조). 데이터는, 항-CD3 자극의 존재에서도, PD1 발현이 PD1-특이적 ZFN을 공급받은 세포에서 감소되는 것을 나타낸다.

PD1 발현의 저감이 나중 시점에서 명백한 것을 검증하기 위하여, 세포는 또한 위에서 기재된 바와 같이 24시간에서보다 오히려 항-CD3 자극 후 72시간째에 수확하였다. 세포를 수확하고, 항-PD1 PE; 항-CD3 PE-Cy7, 및 항-CD8 APC로 염색하였다. 세포를 BD FACSCalibur로 분석하였다. 이 데이터는 표 4에 제시되어 있다. 위쪽의 히스토그램은 각 군에서 % PD1 양성 CD3+CD8+ 세포 및 각 군에 대한 중앙 PD1 형광을 나타낸다. 아래쪽 도면은 PD1/CFSE 발현 세포의 주기를 나타낸다. 중요하게는, 쥣과 PD1 Fok1 및 야생형 PD1 Fok1은 대조군보다 높은 빈도의 PD1^neg CFSE^dim(세포를 분할)을 나타내어, PD1 발현이 항-CD3 자극 후 72시간째에도 PD1-특이적 ZFN으로 처리된 세포에서 여전히 감소되는 것을 입증한다.

실시예 3: TIL에서의 인간 PD1-특이적 ZFN의 활성

인간 PD1-특이적 ZFN은 종양의 존재 하에 인간 종양 침윤 림프구(TIL)에서 테스트하고 본질적으로 당업계에 공지된 방법을 이용해서 위에 기재된 바와 같이 검정하였다(예컨대, 문헌[Yoshino et al, (1992) Cancer Research 52: 775-781] 참조). PD1-특이적 ZFN은 위에서 기재된 바와 같이 항-CD3 항체를 이용해서 활성화시키고 나서, 세포는 PD1-특이적 ZFN을 발현하는 Ad5/F35 아데노바이러스로 형질도입하였다. 세포는 IL2로 팽창시키고 나서 항-CD3 항체 혹은 종양으로 재차 자극시키고, 자극 후 24시간에 검정하였다. 그 결과는 하기 표 7에 표시되어 있다.

표 7의 데이터는, 세포가 항-CD3 항체에 의해 자극될 경우, PD1 특이적 ZFN의 작용을 통해서, PD1 발현이 저감되어, 증가된 세포 생존율을 초래하는 것을 입증하고 있다. 형질도입된 세포가 종양과 함께 처리되면, 동일한 현상이 관찰되었는데, 즉, ZFN 매개된 PD1의 감소는 TIL 생존율의 증가를 초래한다. 또한, 데이터는 형질도입 TIL에서의 PD1 발현의 감소가 종양 세포 생존율의 감소를 초래하는 것을 나타낸다.

실시예 4: PD1 편집된 1차 인간 T 세포의 정제

더욱 동화된 PD1 특이적 ZFN 쌍은 실시예 1에서 위에서 설명된 바와 같은 CD4+ T 세포에서 테스트하였다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 44%까지의 편집이 몇몇 쌍에서 관찰되었다. 이 실험에서, '양성 대조군'은 상이한 실험 조건 하에서 이미 수행된 CD8+ T 세포 내의 25025/12942 ZFN 쌍을 이용한 절단을 나타낸다.

하나의 리드 쌍(lead pair)인 25029/12942가 PD1 변형된 세포를 단리하는데 더욱 이용하기 위하여 선택되었다. 요약하면, 이들 실험에서, CD4+ T 세포는 PD1 특이적 ZFN을 암호화하는 mRNA로 처리되고,"30도" 조건 하에 배양된 후, 실시예 1에서 위에 기재된 바와 같은 항-CD3/CD8 비드(Dynal)에 대한 첫번째 노출로 자극시킨 바, 이것은 ZFN 이식유전자의 강력한 발현을 자극하여 PD1 유전자좌에서의 절단을 촉진시킨다(미국 특허 공개 공보 제20080311095호 참조). 이 첫번째 자극(즉, 제1자극) 후, 세포를 재차 자극시키고, FAC에 의해 혹은 친화도 크로마토그래피에 의해 정제 절차를 실시하였다.

요약하면, CD4+ T 세포는 CCR5-특이적 ZFN(미국 특허 공개 공보 제20080159996호 참조) 또는 PD1-특이적 ZFN에 의해 처리하였다. 세포를 회수하고, (i) 첫번째 자극 후, (ii) 두번째 자극(즉, 제2자극) 후이지만 임의의 정제 전, (iii) 표준 방법론을 이용한 CD25+(활성화의 마커), PD1(-)를 위한 세포 분류 후, 또는 (iv) 항-PD1 항체 또는 항-CD25 항체로 이루어진 매트릭스를 이용하는 친화도 크로마토그래피 후에, Cel-I 검정(위에서 기재됨)에 의해 PD1 편집을 위하여 분석하였다.

도 6에 도시된 바와 같이, 세포 분류 기술(여기서 PD1에 대해 음성이지만 CD25에 대해서는 양성인 세포가 단리되었음)을 이용해서, 회수된 세포의 56%까지가 Cel-I 검정에 의해 검정된 바와 같이 변형된 것으로 판명되었다. 친화도 크로마토그래피 기술(여기서 세포는 항-PD1 항체 혹은 항-CD25 항체 중 하나 또는 이들 둘 모두를 이용해서 친화도 매트릭스가 실시되었음)에 의해 정제된 PD1(-) 세포는 Cel-1 분석에 의해 검정된 바와 같이 42%까지의 전반적인 PC1 변형을 표시하였다.

세포 분류에 의해 정제된 세포들은 또한 그들의 PD1 유전자좌에서 서열결정에 의해 분석되었고, 그 결과는 표 8에서 이하에 제시되어 있다. 해당 표로부터 알 수 있는 바와 같이, Cel-I 분석에 의해 예측되는 퍼센트 표적 변형('%NHEJ')은 서열 결정 분석에 의해 확인된 것과 유사하다. 이 표에서, '샘플' 표지는 도 6에 표시된 것에 대응한다.

PD1 특이적 ZFN이 또한 CD8+ T 세포에서 테스트되었다. 이 실험에서, PD1 특이적 ZFN을 암호화하는 mRNA는, 리보맥스 대규모 RNA 프로덕션T7 키트(Ribomax Large Scale RNA ProductionT7 kit)(Promega)에 이어서 RNeasy 미니(Qiagen)를 이용해서, 이들 둘 모두 제조사의 프로토콜에 따라서, 생성되었다. 다양한 양의 mRNA가 상기 기재된 바와 같은 아막사(Amaxa) 뉴클레오펙션 전달 시스템을 이용해서 세포에 형질도입하는데 이용되었고, 퍼센트 PD1 변형은 Cel I 검정에 의해 분석되었다.

도 7에 도시된 바와 같이, 관찰된 변형량은, '% NHEJ'로서 기재된 바와 같이, 이용된 mRNA의 양과 관련되어, 보다 적은 양의 입력 mRNA는 보다 적은 퍼센트의 표적 변형을 초래한다.

이들 결과는 본 명세서에 기재된 PD1 특이적 ZFN이 세포주 내 및 1차 T 세포 내의 PD1 유전자좌를 변형시킬 수 있다는 것을 입증한다.

본 명세서에서 언급한 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 본 명세서에 그들의 전문이 참조로 포함된다.

본 발명은 이해의 명확함의 목적을 위해 예증 및 예시의 방법으로 일부 상세하게 제공되었지만, 본 명세서의 정신 또는 범주로부터 벗어나는 일 없이 다양한 변화 및 변형이 실시될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 앞서 설명한 설명 및 실시예는 제한으로서 해석되어서는 안 된다.

SEQUENCE LISTING <110> SANGAMO BIOSCIENCES, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING PD1 <130> 8325-0057.60 <140> PCT/US2011/061201 <141> 2011-11-17 <150> 12/927,557 <151> 2010-11-17 <160> 110 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Gln Ser Gly His Leu Ser Arg 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Arg Ser Asp Ser Leu Ser Val 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 His Asn Asp Ser Arg Lys Asn 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Arg Ser Asp Asp Leu Thr Arg 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Arg Ser Asp 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<212> DNA <213> Mus musculus <400> 78 atgatctgga agcgggcatc ctggacgg 28 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Meganuclease motif sequence <400> 79 Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly 1 5 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Gln Ser Ala Asn Arg Thr Thr 1 5 <210> 81 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 ggctgctcca ggcatgcaga tcccacaggc gccctggcca gtcgtctggg cggtgctaca 60 actgggctgg cggcc 75 <210> 82 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 ggctgctcca ggcatgcaga tcccacaggc gccctggccc agtcgtctgg gcggtgctac 60 aactgggctg gcggc 75 <210> 83 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 ggctgctcca ggcatgcaga tcccacaggc gccctgggcc agtcgtctgg gcggtgctac 60 aactgggctg gcggc 75 <210> 84 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 ggctgctcca ggcatgcaga tcccacaggc gccctggcca agtcgtctgg gcggtgctac 60 aactgggctg gcggc 75 <210> 85 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 ggctgctcca ggcatgcaga tcccacaggc gccctgggcc agtcgtctgg gcggtgctac 60 aactgggctg gcggc 75 <210> 86 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 ggctgctcca ggcatgcaga tcccacaggc gccctggcca agtcgtctgg gcggtgctac 60 aactgggctg gcggc 75 <210> 87 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 ggctgctcca ggcatgcaga tcccacaggc gccctggcca ggccagtcgt ctgggcggtg 60 ctacaactgg gctgg 75 <210> 88 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 ggctgctcca ggcatgcaga tcccacaggc gccctggcca gccagtcgtc tgggcggtgc 60 tacaactggg ctggc 75 <210> 89 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 ggctgctcca ggcatgcaga tcccacaggc gccctggcca ggccagtcgt ctgggcggtg 60 ctacaactgg gctgg 75 <210> 90 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 ggctgctcca ggcatgcaga tcccacaggc gccctgggcc cagtcgtctg ggcggtgcta 60 caactgggct ggcgg 75 <210> 91 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 ggctgctcca ggcatgcaga tcccacaggc gccctggcca agtcgtctgg gcggtgctac 60 aactgggctg gcggc 75 <210> 92 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 ggctgctcca ggcatgcaga 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ggcatgcagt cgtctgggcg gtgctacaac tgggctggcg gcc 53 <210> 108 <211> 62 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 ggctgctcca ggcatgcaga tcccacaggc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60 cc 62 <210> 109 <211> 74 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 ggctgctcca ggcatgcaga tcccacaggc gccctgccag tcgtctgggc ggtgctacaa 60 ctgggctggc ggcc 74 <210> 110 <211> 59 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 ggctgctcca ggcatgcaga tccagtcgtc tgggcggtgc tacaactggg ctggcggcc 59

Claims (15)

1. PD1 유전자의 표적 부위에 결합하는 아연 핑거 단백질로서, 상기 표적 부위는 서열번호 60, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77 및 서열번호 78로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 아연 핑거 단백질.
2. 제1항에 따른 아연 핑거 단백질 및 기능성 도메인(functional domain)을 포함하는 융합 단백질.
3. 제2항에 있어서, 상기 기능성 도메인은 전사 조절 도메인을 포함하는 것인 융합 단백질.
4. 제3항에 있어서, 상기 전사 조절 도메인은 활성화 도메인(activation domain) 또는 억제 도메인(repression domain)인 것인 융합 단백질.
5. 제2항에 있어서, 상기 기능성 도메인은 절단 도메인(cleavage domain) 또는 절단 절반 도메인(cleavage half-domain)을 포함하는 것인 융합 단백질.
6. 제1항에 따른 아연 핑거 단백질 또는 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
7. 세포 내의 PD1 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 PD1 유전자의 발현이 조절되도록 하는 조건 하에서, 제6항에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 조절은 상기 PD1 유전자의 절단에 의한 활성화, 억제 또는 비활성화를 포함하는 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, 비활성화는 상기 PD1 유전자의 절단 후 비상동성 말단 접합(non-homologous end joining: NHEJ)을 통해 일어나는 것인 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 조절은 절단에 의한 비활성화를 포함하며, 상기 방법은 상기 PD1 유전자에 대해서 상동성을 지니는 서열에 의해 인접한(flanked) 외인성 서열(exogenous sequence)을 상기 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 외인성 서열은 상동성 재조합에 의해 상기 PD1 유전자 내로 통합되는 것인 방법.
11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 1차 세포(primary cell) 또는 줄기 세포인 것인 방법.
12. 제14항에 있어서, 상기 1차 세포는 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC), CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포이거나, 또는 상기 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 또는 간층직 줄기 세포(mesenchymal stem cell)인 것인 방법.
13. PD1 유전자의 비정상 발현(aberrant expression) 또는 조절을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 지니는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 질환 또는 장애가 치료되도록 상기 대상체에서 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따른 PD1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암, 바이러스 감염 또는 자가면역 질환인 것인 방법.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 대상체에 추가의 항바이러스 또는 항암 요법(anti-viral or anti-cancer therapies)을 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.

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