CN102066405A - 用于细胞穿透的超荷电蛋白 - Google Patents
用于细胞穿透的超荷电蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102066405A CN102066405A CN2009801237721A CN200980123772A CN102066405A CN 102066405 A CN102066405 A CN 102066405A CN 2009801237721 A CN2009801237721 A CN 2009801237721A CN 200980123772 A CN200980123772 A CN 200980123772A CN 102066405 A CN102066405 A CN 102066405A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- overloading
- electricity
- identifier
- albumen
- certain embodiments
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 327
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 285
- 230000035515 penetration Effects 0.000 title claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 230
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 222
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 222
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 176
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 166
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 86
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 38
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims abstract description 33
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims description 456
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 265
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 251
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 152
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 130
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 116
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 85
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 85
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 85
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 74
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 63
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims description 61
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 54
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 54
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 42
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 36
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 34
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 claims description 33
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 32
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 30
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 30
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 26
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 25
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 19
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 15
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 15
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 13
- 101710146275 Hemagglutinin 2 Proteins 0.000 claims description 11
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 10
- 108091027757 Deoxyribozyme Proteins 0.000 claims description 9
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 claims description 7
- 108700010013 HMGB1 Proteins 0.000 claims description 6
- 101150021904 HMGB1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 102100037907 High mobility group protein B1 Human genes 0.000 claims description 6
- 102000017286 Histone H2A Human genes 0.000 claims description 6
- 108050005231 Histone H2A Proteins 0.000 claims description 6
- 102100026318 Surfeit locus protein 6 Human genes 0.000 claims description 6
- MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N fluorescin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 6
- FDFPSNISSMYYDS-UHFFFAOYSA-N 2-ethyl-N,2-dimethylheptanamide Chemical compound CCCCCC(C)(CC)C(=O)NC FDFPSNISSMYYDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 101100339431 Arabidopsis thaliana HMGB2 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 102100039723 Aurora kinase A-interacting protein Human genes 0.000 claims description 5
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 claims description 5
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 claims description 5
- 102100028073 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 claims description 5
- 101000959551 Homo sapiens Aurora kinase A-interacting protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101001060267 Homo sapiens Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000971351 Homo sapiens KRR1 small subunit processome component homolog Proteins 0.000 claims description 5
- 101000577891 Homo sapiens Myeloid cell nuclear differentiation antigen Proteins 0.000 claims description 5
- 101000972796 Homo sapiens NF-kappa-B-activating protein Proteins 0.000 claims description 5
- 101001015936 Homo sapiens Probable rRNA-processing protein EBP2 Proteins 0.000 claims description 5
- 101000630748 Homo sapiens Surfeit locus protein 6 Proteins 0.000 claims description 5
- 101001004756 Homo sapiens U7 snRNA-associated Sm-like protein LSm11 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100021559 KRR1 small subunit processome component homolog Human genes 0.000 claims description 5
- 102100027994 Myeloid cell nuclear differentiation antigen Human genes 0.000 claims description 5
- 102100022580 NF-kappa-B-activating protein Human genes 0.000 claims description 5
- 101100298837 Parengyodontium album PROK gene Proteins 0.000 claims description 5
- 102100032223 Probable rRNA-processing protein EBP2 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100025970 U7 snRNA-associated Sm-like protein LSm11 Human genes 0.000 claims description 5
- 210000000222 eosinocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 101000669667 Homo sapiens RNA-binding protein with serine-rich domain 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100039323 RNA-binding protein with serine-rich domain 1 Human genes 0.000 claims description 4
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 102100025840 Coiled-coil domain-containing protein 86 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000932708 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 86 Proteins 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N hydrogen cyanide Chemical compound N#C LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 2
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 claims 2
- 102000010638 Kinesin Human genes 0.000 claims 1
- 108010063296 Kinesin Proteins 0.000 claims 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 abstract description 9
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 3
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 abstract 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 abstract 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 abstract 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 88
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 72
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 69
- -1 cation lipid Chemical class 0.000 description 52
- 239000000463 material Substances 0.000 description 44
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 39
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 39
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 35
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 34
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 32
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 31
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 29
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 28
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 28
- 108091064702 1 family Proteins 0.000 description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 27
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 27
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 27
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 27
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 26
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 24
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 24
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 22
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 21
- 238000011160 research Methods 0.000 description 21
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 19
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 18
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 17
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 17
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 17
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 17
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 16
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 16
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 15
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 14
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 14
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 12
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 12
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 12
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 11
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 11
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 11
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 11
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 11
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 11
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 10
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 10
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 10
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 9
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 9
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 9
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 8
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 8
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 8
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 8
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 7
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 102100030335 Midkine Human genes 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 7
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 7
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 7
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 7
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 7
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 6
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 6
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 6
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 5
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 5
- 108010092801 Midkine Proteins 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 5
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- VDXZNPDIRNWWCW-UHFFFAOYSA-N melitten Chemical compound NCC(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NCC(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 5
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 5
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FPHJJCBLRAPJQJ-CRKDRTNXSA-N (2s,3r,4s,5r)-2-amino-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@]1(N)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O FPHJJCBLRAPJQJ-CRKDRTNXSA-N 0.000 description 4
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- 108090001102 Hammerhead ribozyme Proteins 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 4
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 102100028509 Transcription factor IIIA Human genes 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 4
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 4
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 4
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 4
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 4
- 239000004567 concrete Substances 0.000 description 4
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 4
- SDZRWUKZFQQKKV-JHADDHBZSA-N cytochalasin D Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@H]\3[C@]2([C@@H](/C=C/[C@@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)C/C=C/3)OC(C)=O)C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 SDZRWUKZFQQKKV-JHADDHBZSA-N 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 4
- PGRHXDWITVMQBC-UHFFFAOYSA-N dehydroacetic acid Chemical compound CC(=O)C1C(=O)OC(C)=CC1=O PGRHXDWITVMQBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 4
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 235000012204 lemonade/lime carbonate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 4
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 4
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 4
- 201000011296 tyrosinemia Diseases 0.000 description 4
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 4
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 4
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QXYRRCOJHNZVDJ-UHFFFAOYSA-N 4-pyren-1-ylbutanoic acid Chemical compound C1=C2C(CCCC(=O)O)=CC=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 QXYRRCOJHNZVDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 3
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 3
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 description 3
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 3
- 108010019874 Clathrin Proteins 0.000 description 3
- 102000005853 Clathrin Human genes 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 3
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100033342 Lysosomal acid glucosylceramidase Human genes 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 102100039560 Microtubule-associated protein RP/EB family member 1 Human genes 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 3
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 3
- 108010018525 NFATC Transcription Factors Proteins 0.000 description 3
- 102000002673 NFATC Transcription Factors Human genes 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 102000004446 Serum Response Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010042291 Serum Response Factor Proteins 0.000 description 3
- 240000006474 Theobroma bicolor Species 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical compound OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710107943 Trans-activator protein BZLF1 Proteins 0.000 description 3
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 3
- 108091005971 Wild-type GFP Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 3
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 3
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-QMKXCQHVSA-N alpha-L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1CO[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-QMKXCQHVSA-N 0.000 description 3
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 3
- WMGSQTMJHBYJMQ-UHFFFAOYSA-N aluminum;magnesium;silicate Chemical compound [Mg+2].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] WMGSQTMJHBYJMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 3
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 3
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 description 3
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 description 3
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 description 3
- FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L calcium hydrogenphosphate Chemical compound [Ca+2].OP([O-])([O-])=O FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 3
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229960001927 cetylpyridinium chloride Drugs 0.000 description 3
- YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M cetylpyridinium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+]1=CC=CC=C1 YMKDRGPMQRFJGP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930193282 clathrin Natural products 0.000 description 3
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 3
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 229960000598 infliximab Drugs 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 3
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 3
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 229960000988 nystatin Drugs 0.000 description 3
- VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N nystatin A1 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N 0.000 description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 3
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 3
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 3
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- RIFDKYBNWNPCQK-IOSLPCCCSA-N (2r,3s,4r,5r)-2-(hydroxymethyl)-5-(6-imino-3-methylpurin-9-yl)oxolane-3,4-diol Chemical compound C1=2N(C)C=NC(=N)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O RIFDKYBNWNPCQK-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 2
- ALSTYHKOOCGGFT-KTKRTIGZSA-N (9Z)-octadecen-1-ol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCO ALSTYHKOOCGGFT-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N (R)-alpha-Tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 2
- DTOUUUZOYKYHEP-UHFFFAOYSA-N 1,3-bis(2-ethylhexyl)-5-methyl-1,3-diazinan-5-amine Chemical compound CCCCC(CC)CN1CN(CC(CC)CCCC)CC(C)(N)C1 DTOUUUZOYKYHEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940058015 1,3-butylene glycol Drugs 0.000 description 2
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- ZEMPKEQAKRGZGQ-AAKVHIHISA-N 2,3-bis[[(z)-12-hydroxyoctadec-9-enoyl]oxy]propyl (z)-12-hydroxyoctadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCC(O)C\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CC(O)CCCCCC)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CC(O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-AAKVHIHISA-N 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSDLLIBGSJNGJE-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-3,5-dimethylphenol Chemical compound CC1=CC(O)=CC(C)=C1Cl OSDLLIBGSJNGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-1-piperidin-4-ylpyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CC(O)CN1C1CCNCC1 HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDOPAZIWBAHVJB-UHFFFAOYSA-N 5h-pyrrolo[3,2-d]pyrimidine Chemical compound C1=NC=C2NC=CC2=N1 KDOPAZIWBAHVJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BXJHWYVXLGLDMZ-UHFFFAOYSA-N 6-O-methylguanine Chemical compound COC1=NC(N)=NC2=C1NC=N2 BXJHWYVXLGLDMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 2
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 description 2
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 108010001572 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000000806 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Human genes 0.000 description 2
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LVDKZNITIUWNER-UHFFFAOYSA-N Bronopol Chemical compound OCC(Br)(CO)[N+]([O-])=O LVDKZNITIUWNER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004255 Butylated hydroxyanisole Substances 0.000 description 2
- 108050000084 Caveolin Proteins 0.000 description 2
- 102000009193 Caveolin Human genes 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002785 Croscarmellose sodium Polymers 0.000 description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 101710141836 DNA-binding protein HU homolog Proteins 0.000 description 2
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 2
- 239000004287 Dehydroacetic acid Substances 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- 229930183931 Filipin Natural products 0.000 description 2
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 2
- GLZPCOQZEFWAFX-UHFFFAOYSA-N Geraniol Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCO GLZPCOQZEFWAFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700039142 HMGA1a Proteins 0.000 description 2
- 102000049983 HMGA1a Human genes 0.000 description 2
- 102400001369 Heparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 2
- 239000004705 High-molecular-weight polyethylene Substances 0.000 description 2
- 101000738940 Homo sapiens Proline-rich nuclear receptor coactivator 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 2
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 2
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 2
- 101710174628 Modulating protein YmoA Proteins 0.000 description 2
- 229930191564 Monensin Natural products 0.000 description 2
- 101100079042 Mus musculus Myef2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000002808 Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide Human genes 0.000 description 2
- 108010004684 Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide Proteins 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003110 Primojel Polymers 0.000 description 2
- 102100037394 Proline-rich nuclear receptor coactivator 1 Human genes 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 101100177665 Rattus norvegicus Hipk3 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 206010039361 Sacroiliitis Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002334 Spandex Polymers 0.000 description 2
- 102000009822 Sterol Regulatory Element Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010020396 Sterol Regulatory Element Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 2
- 101001023030 Toxoplasma gondii Myosin-D Proteins 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102100040105 Upstream stimulatory factor 1 Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 2
- 102100036976 X-ray repair cross-complementing protein 6 Human genes 0.000 description 2
- 101710124907 X-ray repair cross-complementing protein 6 Proteins 0.000 description 2
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 239000010480 babassu oil Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960001950 benzethonium chloride Drugs 0.000 description 2
- UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M benzethonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 2
- 229960004217 benzyl alcohol Drugs 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 2
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960003168 bronopol Drugs 0.000 description 2
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 2
- 235000019437 butane-1,3-diol Nutrition 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N butyl alcohol Substances CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N butylated hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1.COC1=CC=C(O)C=C1C(C)(C)C CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940043253 butylated hydroxyanisole Drugs 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L calcium stearate Chemical compound [Ca+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000013539 calcium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008116 calcium stearate Substances 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 2
- 229960000800 cetrimonium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 description 2
- 229960005443 chloroxylenol Drugs 0.000 description 2
- ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N chlorpromazine Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001076 chlorpromazine Drugs 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 108010082025 cyan fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N decanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019258 dehydroacetic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940061632 dehydroacetic acid Drugs 0.000 description 2
- 229940109357 desoxyribonuclease Drugs 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 235000019329 dioctyl sodium sulphosuccinate Nutrition 0.000 description 2
- FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxomagnesium;hydrate Chemical compound O.[Mg]=O.[Mg]=O.[Mg]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229960000878 docusate sodium Drugs 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 2
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 2
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 2
- 125000004030 farnesyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- IMQSIXYSKPIGPD-NKYUYKLDSA-N filipin Chemical compound CCCCC[C@H](O)[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](O)C[C@@H](O)C[C@@H](O)C[C@@H](O)C[C@@H](O)C[C@H](O)\C(C)=C\C=C\C=C\C=C\C=C\[C@H](O)[C@@H](C)OC1=O IMQSIXYSKPIGPD-NKYUYKLDSA-N 0.000 description 2
- 229950000152 filipin Drugs 0.000 description 2
- IMQSIXYSKPIGPD-UHFFFAOYSA-N filipin III Natural products CCCCCC(O)C1C(O)CC(O)CC(O)CC(O)CC(O)CC(O)CC(O)C(C)=CC=CC=CC=CC=CC(O)C(C)OC1=O IMQSIXYSKPIGPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 229960000961 floxuridine Drugs 0.000 description 2
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 229940075507 glyceryl monostearate Drugs 0.000 description 2
- 239000003979 granulating agent Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019314 gum ghatti Nutrition 0.000 description 2
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 2
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004867 hexetidine Drugs 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 229960002127 imiglucerase Drugs 0.000 description 2
- 108010039650 imiglucerase Proteins 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000000832 lactitol Substances 0.000 description 2
- VQHSOMBJVWLPSR-JVCRWLNRSA-N lactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O VQHSOMBJVWLPSR-JVCRWLNRSA-N 0.000 description 2
- 235000010448 lactitol Nutrition 0.000 description 2
- 229960003451 lactitol Drugs 0.000 description 2
- 229940070765 laurate Drugs 0.000 description 2
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 2
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 2
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 2
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical group 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 2
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 2
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- XMLQWXUVTXCDDL-UHFFFAOYSA-N oleyl alcohol Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCCCCO XMLQWXUVTXCDDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940055577 oleyl alcohol Drugs 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 2
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229960003975 potassium Drugs 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RWPGFSMJFRPDDP-UHFFFAOYSA-L potassium metabisulfite Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O RWPGFSMJFRPDDP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000010263 potassium metabisulphite Nutrition 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 2
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 150000003856 quaternary ammonium compounds Chemical class 0.000 description 2
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000003352 sequestering agent Substances 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 2
- 229940001607 sodium bisulfite Drugs 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- APSBXTVYXVQYAB-UHFFFAOYSA-M sodium docusate Chemical compound [Na+].CCCCC(CC)COC(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC APSBXTVYXVQYAB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 2
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 2
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000004759 spandex Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000015149 toffees Nutrition 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 2
- MEIRRNXMZYDVDW-MQQKCMAXSA-N (2E,4E)-2,4-hexadien-1-ol Chemical compound C\C=C\C=C\CO MEIRRNXMZYDVDW-MQQKCMAXSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- KQRHTCDQWJLLME-XUXIUFHCSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]propanoyl]amino]-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)N KQRHTCDQWJLLME-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- STGXGJRRAJKJRG-JDJSBBGDSA-N (3r,4r,5r)-5-(hydroxymethyl)-3-methoxyoxolane-2,4-diol Chemical compound CO[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O STGXGJRRAJKJRG-JDJSBBGDSA-N 0.000 description 1
- DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N (R)-camphor Chemical compound C1C[C@@]2(C)C(=O)C[C@@H]1C2(C)C DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N 0.000 description 1
- QMMJWQMCMRUYTG-UHFFFAOYSA-N 1,2,4,5-tetrachloro-3-(trifluoromethyl)benzene Chemical compound FC(F)(F)C1=C(Cl)C(Cl)=CC(Cl)=C1Cl QMMJWQMCMRUYTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-ULQXZJNLSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-tritiopyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C([3H])=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 MXHRCPNRJAMMIM-ULQXZJNLSA-N 0.000 description 1
- OKMWKBLSFKFYGZ-UHFFFAOYSA-N 1-behenoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO OKMWKBLSFKFYGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 1H-benzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC=NC2=C1 HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PWVUXRBUUYZMKM-UHFFFAOYSA-N 2-(2-hydroxyethoxy)ethyl octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCOCCO PWVUXRBUUYZMKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FKOKUHFZNIUSLW-UHFFFAOYSA-N 2-Hydroxypropyl stearate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(C)O FKOKUHFZNIUSLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROGIWVXWXZRRMZ-UHFFFAOYSA-N 2-methylbuta-1,3-diene;styrene Chemical compound CC(=C)C=C.C=CC1=CC=CC=C1 ROGIWVXWXZRRMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZSXEZOLBIJVQK-UHFFFAOYSA-N 2-methylsulfonylbenzoic acid Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O BZSXEZOLBIJVQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEACJMVNYZDSKR-UHFFFAOYSA-N 2-octyldodecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCC(CO)CCCCCCCC LEACJMVNYZDSKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxyethanol Chemical compound OCCOC1=CC=CC=C1 QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 2-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=S)NC(=O)C=C1 GJTBSTBJLVYKAU-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-1h-pyrrole Chemical compound [O-][N+](=O)C=1C=CNC=1 LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-m-cresol Chemical compound CC1=CC(O)=CC=C1Cl CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybenzoate Chemical compound OC1=CC=C(C([O-])=O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100039791 43 kDa receptor-associated protein of the synapse Human genes 0.000 description 1
- ZKBQDFAWXLTYKS-UHFFFAOYSA-N 6-Chloro-1H-purine Chemical compound ClC1=NC=NC2=C1NC=N2 ZKBQDFAWXLTYKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 1
- WYXSYVWAUAUWLD-SHUUEZRQSA-N 6-azauridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=N1 WYXSYVWAUAUWLD-SHUUEZRQSA-N 0.000 description 1
- RYYIULNRIVUMTQ-UHFFFAOYSA-N 6-chloroguanine Chemical compound NC1=NC(Cl)=C2N=CNC2=N1 RYYIULNRIVUMTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026926 60S ribosomal protein L4 Human genes 0.000 description 1
- 101710117426 60S ribosomal protein L4 Proteins 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016954 ADP-Ribosylation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010053971 ADP-Ribosylation Factors Proteins 0.000 description 1
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 1
- 240000006054 Agastache cana Species 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 235000011514 Anogeissus latifolia Nutrition 0.000 description 1
- 244000106483 Anogeissus latifolia Species 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 101100392436 Arabidopsis thaliana GIR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178203 Arabidopsis thaliana HMGB3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100245264 Arabidopsis thaliana PAA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008682 Argonaute Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088141 Argonaute Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100031491 Arylsulfatase B Human genes 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 102000004000 Aurora Kinase A Human genes 0.000 description 1
- 108090000461 Aurora Kinase A Proteins 0.000 description 1
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 description 1
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108010027344 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000018720 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 229930185605 Bisphenol Natural products 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- QFOHBWFCKVYLES-UHFFFAOYSA-N Butylparaben Chemical compound CCCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QFOHBWFCKVYLES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710186200 CCAAT/enhancer-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 241000345998 Calamus manan Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001671553 Calophyllum antillanum Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 239000005632 Capric acid (CAS 334-48-5) Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005747 Carum carvi Nutrition 0.000 description 1
- 240000000467 Carum carvi Species 0.000 description 1
- 102000005483 Cell Cycle Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010031896 Cell Cycle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 1
- PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N Cellulose, microcrystalline Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005944 Cerulean Proteins 0.000 description 1
- 102000006440 Chemokine CCL26 Human genes 0.000 description 1
- 108010083698 Chemokine CCL26 Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 241000579895 Chlorostilbon Species 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000675108 Citrus tangerina Species 0.000 description 1
- MSQIEPPARUZGDJ-JEDNCBNOSA-N ClN[C@@H](CC(C)C)C(=O)O.[Na] Chemical compound ClN[C@@H](CC(C)C)C(=O)O.[Na] MSQIEPPARUZGDJ-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000002734 Collagen Type VI Human genes 0.000 description 1
- 108010043741 Collagen Type VI Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-UUOKFMHZSA-N Crotonoside Chemical compound C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 108091005943 CyPet Proteins 0.000 description 1
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 108091014810 Cyclin L1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036274 Cyclin-L1 Human genes 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 102100039221 Cytoplasmic polyadenylation element-binding protein 3 Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- XMSXQFUHVRWGNA-UHFFFAOYSA-N Decamethylcyclopentasiloxane Chemical compound C[Si]1(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O1 XMSXQFUHVRWGNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- ONKUXPIBXRRIDU-UHFFFAOYSA-N Diethyl decanedioate Chemical compound CCOC(=O)CCCCCCCCC(=O)OCC ONKUXPIBXRRIDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001454374 Drosophila <fruit fly, subgenus> Species 0.000 description 1
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 108091005941 EBFP Proteins 0.000 description 1
- 108091005942 ECFP Proteins 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QZKRHPLGUJDVAR-UHFFFAOYSA-K EDTA trisodium salt Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O QZKRHPLGUJDVAR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032222 Emopamil-binding protein-like Human genes 0.000 description 1
- 208000017701 Endocrine disease Diseases 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100028166 FACT complex subunit SSRP1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003967 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000380 Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 208000001640 Fibromyalgia Diseases 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010003521 G-Box Binding Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010088742 GATA Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009041 GATA Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101001036711 Gallus gallus Heat shock protein beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 240000004859 Gamochaeta purpurea Species 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 239000005792 Geraniol Substances 0.000 description 1
- GLZPCOQZEFWAFX-YFHOEESVSA-N Geraniol Natural products CC(C)=CCC\C(C)=C/CO GLZPCOQZEFWAFX-YFHOEESVSA-N 0.000 description 1
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 1
- 239000001922 Gum ghatti Substances 0.000 description 1
- 101150091750 HMG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019487 Hazelnut oil Nutrition 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108091080980 Hepatitis delta virus ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 108010020382 Hepatocyte Nuclear Factor 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022128 High mobility group protein B2 Human genes 0.000 description 1
- 102100029009 High mobility group protein HMG-I/HMG-Y Human genes 0.000 description 1
- 241000229143 Hippophae Species 0.000 description 1
- 235000003935 Hippophae Nutrition 0.000 description 1
- 101000745755 Homo sapiens Cytoplasmic polyadenylation element-binding protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000697353 Homo sapiens FACT complex subunit SSRP1 Proteins 0.000 description 1
- 101001045751 Homo sapiens Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001045791 Homo sapiens High mobility group protein B2 Proteins 0.000 description 1
- 101000986380 Homo sapiens High mobility group protein HMG-I/HMG-Y Proteins 0.000 description 1
- 101001091385 Homo sapiens Kallikrein-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000866805 Homo sapiens Non-histone chromosomal protein HMG-17 Proteins 0.000 description 1
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 1
- 101000653735 Homo sapiens Transcriptional enhancer factor TEF-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000597045 Homo sapiens Transcriptional enhancer factor TEF-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000597035 Homo sapiens Transcriptional enhancer factor TEF-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000597043 Homo sapiens Transcriptional enhancer factor TEF-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000671637 Homo sapiens Upstream stimulatory factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000671649 Homo sapiens Upstream stimulatory factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 235000010650 Hyssopus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 108091054729 IRF family Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000001019 Inborn Errors Metabolism Diseases 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 102000016854 Interferon Regulatory Factors Human genes 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034866 Kallikrein-6 Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000000072 L-ascorbyl-6-palmitate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011786 L-ascorbyl-6-palmitate Substances 0.000 description 1
- QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N L-ascorbyl-6-palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N 0.000 description 1
- 125000000010 L-asparaginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-L L-tartrate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-L 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 description 1
- 235000008119 Larix laricina Nutrition 0.000 description 1
- 241000218653 Larix laricina Species 0.000 description 1
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 1
- 235000010663 Lavandula angustifolia Nutrition 0.000 description 1
- 244000178870 Lavandula angustifolia Species 0.000 description 1
- 108090000004 Leadzyme Proteins 0.000 description 1
- 235000019501 Lemon oil Nutrition 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- SMEROWZSTRWXGI-UHFFFAOYSA-N Lithocholsaeure Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)CC2 SMEROWZSTRWXGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 241001126308 Mermithidae Species 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- 244000179970 Monarda didyma Species 0.000 description 1
- 235000010672 Monarda didyma Nutrition 0.000 description 1
- GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N Monensin A Natural products O1C(CC)(C2C(CC(O2)C2C(CC(C)C(O)(CO)O2)C)C)CCC1C(O1)(C)CCC21CC(O)C(C)C(C(C)C(OC)C(C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 1
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 1
- 241001508687 Mustela erminea Species 0.000 description 1
- 102100038380 Myogenic factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710099061 Myogenic factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 108010027520 N-Acetylgalactosamine-4-Sulfatase Proteins 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N N-benzoyl-Ferrioxamine B Chemical compound CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MRWXACSTFXYYMV-UHFFFAOYSA-N Nebularine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 102100031346 Non-histone chromosomal protein HMG-17 Human genes 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000219925 Oenothera Species 0.000 description 1
- 235000019502 Orange oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 1
- 240000001090 Papaver somniferum Species 0.000 description 1
- 235000008753 Papaver somniferum Nutrition 0.000 description 1
- 241000212297 Pelvetia Species 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 108090000279 Peptidyltransferases Proteins 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037914 Pituitary-specific positive transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710129981 Pituitary-specific positive transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 229920002701 Polyoxyl 40 Stearate Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HLCFGWHYROZGBI-JJKGCWMISA-M Potassium gluconate Chemical compound [K+].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O HLCFGWHYROZGBI-JJKGCWMISA-M 0.000 description 1
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 1
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 101150042431 SOX gene Proteins 0.000 description 1
- 101100033099 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RBG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000000513 Santalum album Species 0.000 description 1
- 235000008632 Santalum album Nutrition 0.000 description 1
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004598 Small Nuclear Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010003165 Small Nuclear Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- BCKXLBQYZLBQEK-KVVVOXFISA-M Sodium oleate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC([O-])=O BCKXLBQYZLBQEK-KVVVOXFISA-M 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- IYFATESGLOUGBX-YVNJGZBMSA-N Sorbitan monopalmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O IYFATESGLOUGBX-YVNJGZBMSA-N 0.000 description 1
- HVUMOYIDDBPOLL-XWVZOOPGSA-N Sorbitan monostearate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O HVUMOYIDDBPOLL-XWVZOOPGSA-N 0.000 description 1
- 102000016889 Sp1 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010053551 Sp1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 241000269319 Squalius cephalus Species 0.000 description 1
- UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N Stachyose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]2[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O2)O1 UQZIYBXSHAGNOE-USOSMYMVSA-N 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241001494106 Stenotomus chrysops Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710093346 Surfeit locus protein 6 Proteins 0.000 description 1
- NSOXQYCFHDMMGV-UHFFFAOYSA-N Tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine Chemical compound CC(O)CN(CC(C)O)CCN(CC(C)O)CC(C)O NSOXQYCFHDMMGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 241000425037 Toona sinensis Species 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 108010068068 Transcription Factor TFIIIA Proteins 0.000 description 1
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100035148 Transcriptional enhancer factor TEF-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100035146 Transcriptional enhancer factor TEF-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100035147 Transcriptional enhancer factor TEF-5 Human genes 0.000 description 1
- 102000002070 Transferrins Human genes 0.000 description 1
- 108010015865 Transferrins Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006035 Tryptophane Substances 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 102100040103 Upstream stimulatory factor 2 Human genes 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000019498 Walnut oil Nutrition 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- 239000001089 [(2R)-oxolan-2-yl]methanol Substances 0.000 description 1
- FRYDSOYOHWGSMD-UHFFFAOYSA-N [C].O Chemical class [C].O FRYDSOYOHWGSMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003697 abatacept Drugs 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229960004470 agalsidase beta Drugs 0.000 description 1
- 108010056760 agalsidase beta Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 108010054982 alanyl-leucyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 229960002459 alefacept Drugs 0.000 description 1
- 229960003122 alglucerase Drugs 0.000 description 1
- 108010060162 alglucerase Proteins 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001118 alkylidene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 125000005336 allyloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N alpha-D-mannose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N alpha-D-xylose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- PZZYQPZGQPZBDN-UHFFFAOYSA-N aluminium silicate Chemical compound O=[Al]O[Si](=O)O[Al]=O PZZYQPZGQPZBDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000323 aluminium silicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000420 anogeissus latifolia wall. gum Substances 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003005 anticarcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000000305 astragalus gummifer gum Substances 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 229960002756 azacitidine Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N benzyl benzoate Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 SESFRYSPDFLNCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N bisphenol A Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940094199 black currant oil Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 235000021324 borage oil Nutrition 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- NEEHYRZPVYRGPP-IYEMJOQQSA-L calcium gluconate Chemical compound [Ca+2].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O NEEHYRZPVYRGPP-IYEMJOQQSA-L 0.000 description 1
- MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L calcium lactate Chemical compound [Ca+2].CC(O)C([O-])=O.CC(O)C([O-])=O MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001527 calcium lactate Substances 0.000 description 1
- 229960002401 calcium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011086 calcium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229940078480 calcium levulinate Drugs 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- OKRXSXDSNLJCRS-NLOQLBMISA-L calcium;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoate;(2r,3r,4r,5r)-2,3,5,6-tetrahydroxy-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexanoate;hydrate Chemical compound O.[Ca+2].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O.[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O OKRXSXDSNLJCRS-NLOQLBMISA-L 0.000 description 1
- 229960000846 camphor Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002041 carbon nanotube Substances 0.000 description 1
- 229910021393 carbon nanotube Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940096529 carboxypolymethylene Drugs 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000004323 caveolae Anatomy 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 229960002798 cetrimide Drugs 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000010635 coffee oil Substances 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- 150000001896 cresols Chemical class 0.000 description 1
- 229960005168 croscarmellose Drugs 0.000 description 1
- 229960001681 croscarmellose sodium Drugs 0.000 description 1
- 229960000913 crospovidone Drugs 0.000 description 1
- 235000010947 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001767 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- HCAJEUSONLESMK-UHFFFAOYSA-N cyclohexylsulfamic acid Chemical compound OS(=O)(=O)NC1CCCCC1 HCAJEUSONLESMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940086555 cyclomethicone Drugs 0.000 description 1
- JVHIPYJQMFNCEK-UHFFFAOYSA-N cytochalasin Natural products N1C(=O)C2(C(C=CC(C)CC(C)CC=C3)OC(C)=O)C3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 JVHIPYJQMFNCEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMAODHOXRBLOQO-UHFFFAOYSA-N cytochalasin-A Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(=O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 ZMAODHOXRBLOQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 229960000958 deferoxamine Drugs 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 229940031768 diglycol stearate Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- AMTWCFIAVKBGOD-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;methoxy-dimethyl-trimethylsilyloxysilane Chemical compound O=[Si]=O.CO[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C AMTWCFIAVKBGOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QLBHNVFOQLIYTH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [K+].[K+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O QLBHNVFOQLIYTH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- WSDISUOETYTPRL-UHFFFAOYSA-N dmdm hydantoin Chemical compound CC1(C)N(CO)C(=O)N(CO)C1=O WSDISUOETYTPRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 235000021038 drupes Nutrition 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 208000024732 dysthymic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- KUBARPMUNHKBIQ-VTHUDJRQSA-N eliglustat tartrate Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O.C([C@@H](NC(=O)CCCCCCC)[C@H](O)C=1C=C2OCCOC2=CC=1)N1CCCC1.C([C@@H](NC(=O)CCCCCCC)[C@H](O)C=1C=C2OCCOC2=CC=1)N1CCCC1 KUBARPMUNHKBIQ-VTHUDJRQSA-N 0.000 description 1
- 239000010976 emerald Substances 0.000 description 1
- 229910052876 emerald Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 208000030172 endocrine system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 description 1
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- YJGVMLPVUAXIQN-UHFFFAOYSA-N epipodophyllotoxin Natural products COC1=C(OC)C(OC)=CC(C2C3=CC=4OCOC=4C=C3C(O)C3C2C(OC3)=O)=C1 YJGVMLPVUAXIQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 235000010228 ethyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004403 ethyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229940043351 ethyl-p-hydroxybenzoate Drugs 0.000 description 1
- NUVBSKCKDOMJSU-UHFFFAOYSA-N ethylparaben Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 NUVBSKCKDOMJSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010642 eucalyptus oil Substances 0.000 description 1
- 229940044949 eucalyptus oil Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000006126 farnesylation Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 229960002598 fumaric acid Drugs 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000037440 gene silencing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229940113087 geraniol Drugs 0.000 description 1
- 101150117187 glmS gene Proteins 0.000 description 1
- 229950006191 gluconic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- URAYPUMNDPQOKB-UHFFFAOYSA-N glycerine triacetate Natural products CC(=O)OCC(OC(C)=O)COC(C)=O URAYPUMNDPQOKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 229940049654 glyceryl behenate Drugs 0.000 description 1
- 239000001087 glyceryl triacetate Substances 0.000 description 1
- 235000013773 glyceryl triacetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 229920000550 glycopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000578 graft copolymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 1
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 1
- 239000010468 hazelnut oil Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008172 hydrogenated vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 150000001261 hydroxy acids Chemical group 0.000 description 1
- ZCTXEAQXZGPWFG-UHFFFAOYSA-N imidurea Chemical compound O=C1NC(=O)N(CO)C1NC(=O)NCNC(=O)NC1C(=O)NC(=O)N1CO ZCTXEAQXZGPWFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113174 imidurea Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000016245 inborn errors of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000015978 inherited metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 229940102213 injectable suspension Drugs 0.000 description 1
- 239000000976 ink Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229940119170 jojoba wax Drugs 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 1
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 description 1
- 239000001469 lavandula hydrida abrial herb oil Substances 0.000 description 1
- 239000010501 lemon oil Substances 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 229940040145 liniment Drugs 0.000 description 1
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 1
- 239000000944 linseed oil Substances 0.000 description 1
- 235000021388 linseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- SMEROWZSTRWXGI-HVATVPOCSA-N lithocholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 SMEROWZSTRWXGI-HVATVPOCSA-N 0.000 description 1
- 239000001289 litsea cubeba fruit oil Substances 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L magnesium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mg+2] VTHJTEIRLNZDEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000347 magnesium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001862 magnesium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- BEGLCMHJXHIJLR-UHFFFAOYSA-N methylisothiazolinone Chemical compound CN1SC=CC1=O BEGLCMHJXHIJLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 229960005358 monensin Drugs 0.000 description 1
- GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N monensin A Chemical compound C([C@@](O1)(C)[C@H]2CC[C@@](O2)(CC)[C@H]2[C@H](C[C@@H](O2)[C@@H]2[C@H](C[C@@H](C)[C@](O)(CO)O2)C)C)C[C@@]21C[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H]([C@@H](C)[C@@H](OC)[C@H](C)C(O)=O)O2 GAOZTHIDHYLHMS-KEOBGNEYSA-N 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- CQDGTJPVBWZJAZ-UHFFFAOYSA-N monoethyl carbonate Chemical compound CCOC(O)=O CQDGTJPVBWZJAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- RIGXBXPAOGDDIG-UHFFFAOYSA-N n-[(3-chloro-2-hydroxy-5-nitrophenyl)carbamothioyl]benzamide Chemical compound OC1=C(Cl)C=C([N+]([O-])=O)C=C1NC(=S)NC(=O)C1=CC=CC=C1 RIGXBXPAOGDDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N n-heptadecyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCO GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N nebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 231100000344 non-irritating Toxicity 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108020004017 nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 208000030212 nutrition disease Diseases 0.000 description 1
- 208000019180 nutritional disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JPMIIZHYYWMHDT-UHFFFAOYSA-N octhilinone Chemical compound CCCCCCCCN1SC=CC1=O JPMIIZHYYWMHDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002969 oleic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000010502 orange oil Substances 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 108090000629 orphan nuclear receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004164 orphan nuclear receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 1
- 239000003346 palm kernel oil Substances 0.000 description 1
- 235000019865 palm kernel oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 229960005323 phenoxyethanol Drugs 0.000 description 1
- PDTFCHSETJBPTR-UHFFFAOYSA-N phenylmercuric nitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[Hg]C1=CC=CC=C1 PDTFCHSETJBPTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 1
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 description 1
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 1
- YJGVMLPVUAXIQN-XVVDYKMHSA-N podophyllotoxin Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@H](O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 YJGVMLPVUAXIQN-XVVDYKMHSA-N 0.000 description 1
- 229960001237 podophyllotoxin Drugs 0.000 description 1
- YVCVYCSAAZQOJI-UHFFFAOYSA-N podophyllotoxin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2C3=CC=4OCOC=4C=C3C(O)C3C2C(OC3)=O)=C1 YVCVYCSAAZQOJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000002745 poly(ortho ester) Substances 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 1
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000259 polyoxyethylene lauryl ether Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229940099429 polyoxyl 40 stearate Drugs 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229940068984 polyvinyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 235000013809 polyvinylpolypyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000523 polyvinylpolypyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010235 potassium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004300 potassium benzoate Substances 0.000 description 1
- 229940103091 potassium benzoate Drugs 0.000 description 1
- 239000004224 potassium gluconate Substances 0.000 description 1
- 235000013926 potassium gluconate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003189 potassium gluconate Drugs 0.000 description 1
- 229940096992 potassium oleate Drugs 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940093916 potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 description 1
- BHZRJJOHZFYXTO-UHFFFAOYSA-L potassium sulfite Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])=O BHZRJJOHZFYXTO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019252 potassium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- MLICVSDCCDDWMD-KVVVOXFISA-M potassium;(z)-octadec-9-enoate Chemical compound [K+].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC([O-])=O MLICVSDCCDDWMD-KVVVOXFISA-M 0.000 description 1
- LTUDISCZKZHRMJ-UHFFFAOYSA-N potassium;hydrate Chemical compound O.[K] LTUDISCZKZHRMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 229940095574 propionic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229940093625 propylene glycol monostearate Drugs 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 235000012950 rattan cane Nutrition 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003340 retarding agent Substances 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000010668 rosemary oil Substances 0.000 description 1
- 229940058206 rosemary oil Drugs 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000010673 savory oil Substances 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003375 selectivity assay Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 229940083037 simethicone Drugs 0.000 description 1
- 229940074386 skatole Drugs 0.000 description 1
- 239000002893 slag Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 229960003885 sodium benzoate Drugs 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JXKPEJDQGNYQSM-UHFFFAOYSA-M sodium propionate Chemical compound [Na+].CCC([O-])=O JXKPEJDQGNYQSM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010334 sodium propionate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004324 sodium propionate Substances 0.000 description 1
- 229960003212 sodium propionate Drugs 0.000 description 1
- 229920003109 sodium starch glycolate Polymers 0.000 description 1
- 229940079832 sodium starch glycolate Drugs 0.000 description 1
- 239000008109 sodium starch glycolate Substances 0.000 description 1
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- NGSFWBMYFKHRBD-UHFFFAOYSA-N sodium;2-hydroxypropanoic acid Chemical compound [Na+].CC(O)C(O)=O NGSFWBMYFKHRBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N stachyose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)O2)O)O1 UQZIYBXSHAGNOE-XNSRJBNMSA-N 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920003051 synthetic elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000005061 synthetic rubber Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 239000010677 tea tree oil Substances 0.000 description 1
- 229940111630 tea tree oil Drugs 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 1
- BSYVTEYKTMYBMK-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofurfuryl alcohol Chemical compound OCC1CCCO1 BSYVTEYKTMYBMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002769 thiazolinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 239000010496 thistle oil Substances 0.000 description 1
- 102000004217 thyroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000721 thyroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- AOBORMOPSGHCAX-DGHZZKTQSA-N tocofersolan Chemical compound OCCOC(=O)CCC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C AOBORMOPSGHCAX-DGHZZKTQSA-N 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005891 transamination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 1
- 229960002622 triacetin Drugs 0.000 description 1
- 229920000428 triblock copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229940078499 tricalcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 235000019731 tricalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000391 tricalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940117013 triethanolamine oleate Drugs 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 208000014001 urinary system disease Diseases 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 229940005605 valeric acid Drugs 0.000 description 1
- 108090000883 varkud satellite ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000006453 vascular barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000010679 vetiver oil Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000008170 walnut oil Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000010497 wheat germ oil Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 230000003936 working memory Effects 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 description 1
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明揭示用于将超荷电蛋白或超荷电蛋白与治疗剂(例如核酸、肽、小分子)的复合体递送至细胞的组合物、系统和相关方法。超荷正电蛋白可通过静电相互作用与核酸(通常具有净负电荷)缔合。所述系统和方法可涉及改变蛋白质的一级序列以使蛋白质“超荷电”(例如生成超荷正电蛋白)。所述组合物可用于治疗增生性疾病、传染病、心血管疾病、先天性代谢缺陷、遗传性疾病等。
Description
相关申请案交叉参考
本发明根据35 U.S.C.§119(e)主张2008年4月28日申请的美国临时专利申请案第USSN 61/048,370号及2008年10月14日申请的USSN 61/105,287的优先权；所述每个申请案是以引用方式并入本文中。
政府支持
本发明是在美国政府的支持下根据国立卫生研究院/NIGMS所签署的第R01 GM065400号合同来实施。美国政府对本发明拥有一定权利。
背景技术
意欲用于治疗性诊断性或其它应用的药剂的有效性通常高度依赖于其穿透细胞膜或组织来诱导生物活性发生期望变化的能力。尽管许多治疗性药物、诊断性或其它产品候选者(不论是蛋白质、核酸、有机小分子、抑或无机小分子)在体外显示有希望的生物活性，但其很多不能到达或穿透靶细胞而达成期望效果，这通常是因为其生理化学特性导致体内生物分布不足。
具体来说，核酸很有可能可用作有效治疗剂和研究工具。siRNA介导的基因调节的普遍性和序列特异性已提高了使用siRNA作为基因特异性治疗剂的可能性(波姆罗特(Bumcrot)等人，2006，自然化学生物学(Nat.Chem.Biol)，2：711-19；其是以引用方式并入本文中)。短干扰RNA(siRNA)对基因表达的抑制也已成为研究基因和蛋白质功能的有价值的工具(多赛特(Dorsett)等人，2004，自然评论：药物发现(Nat.Rev.DrugDiscov.)，3：318-29；戴克斯霍恩(Dykxhoorn)等人，2003，自然评论：分子细胞生物学(Nat.Rev.Mol Cell.Biol)，4：457-67；巴希尔(Elbashir)等人，2001，自然(Nature)，411：494-98；上述各文献是以引用方式并入本文中)。然而，人们已发现将诸如siRNA等核酸递送至细胞中是不可预知的并且通常无效。将核酸有效地送至细胞的一个障碍是诱导细胞吸收核酸。业内已作出大量工作来鉴别可帮助将核酸递送至细胞的药剂。通常在细胞培养中使用市售阳离子脂质试剂来转染siRNA。然而，基于阳离子脂质的siRNA递送的有效性在不同细胞类型之间差异显著。同样，多种细胞系(包括一些原代神经元、T细胞、成纤维细胞和上皮细胞系)已显示对常用阳离子脂质转染技术具有抗性(卡洛蒂(Carlotti)等人，2004，分子疗法(Mol.Ther.)，9：209-17；马(Ma)等人，2002，神经科学(Neuroscience)，112：1-5；麦克马奈斯(McManus)等人，2002，免疫学杂志(J.Immunol)，169：5754-60；斯特雷特(Strait)等人，2007，美国生理学杂志-肾生理学(Am.J.Physiol.Renal Physiol)，293：F601-06；上述各文献是以引用方式并入本文中)。业内也已使用包括电穿孔(詹奇(Jantsch)等人，2008，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)，331：11-11；其是以引用方式并入本文中)和病毒介导的siRNA递送(布鲁迈尔卡姆(Brummelkamp)等人，2002，癌细胞(Cancer Cell)，2：243-47；斯图尔特(Stewart)等人，2003，RNA，9：493-501；上述各文献是以引用方式并入本文中)在内的替代性转染方法；然而，这些方法可能具有细胞毒性或以不可预知的方式干扰细胞功能，并且用于在个体中递送核酸(例如siRNA)治疗剂的价值有限。
业内近期努力解决核酸递送问题并已获得了多个新核酸递送平台。这些方法包括类脂质(阿肯克(Akinc)等人，2008，自然生物技术(Nat.Biotechnol)，26：561-69；其是以引用方式并入本文中)、阳离子聚合物(塞古拉(Segura)和哈伯尔(Hubbell)，2007，生物偶联化学(Bioconjug.Chem.)，18：736-45；其是以引用方式并入本文中)、无机纳米粒子(索科洛娃(Sokolova)和普尔(Epple)，应用化学国际英文版(Angew Chem.Int.Ed.Engl)，47：1382-95；其是以引用方式并入本文中)、碳纳米管(刘(Liu)等人，2007，应用化学国际英文版，46：2023-27；其是以引用方式并入本文中)、细胞穿透肽(德莎耶丝(Deshayes)等人，2005，细胞和分子生命科学(Cell Mol.Life Sci.)，62：1839-49；和梅亚德(Meade)与道迪(Dowdy)，2008，先进药物输送评论(Adv.Drug Deliv.Rev.)，60：530-36；所述两个文献都是以引用方式并入本文中)和经化学修饰的siRNA(克鲁兹菲尔德(Krutzfeldt)等人，2005，自然，438：685-89；其是以引用方式并入本文中)。这些递送系统中每一者都有益于特定应用；然而，在大多数情形下，仍然存在关于细胞毒性、易制备性、稳定性或普遍性的问题。因此，业内仍特别关注能将核酸(例如siRNA)有效递送至多种细胞系且无显著细胞毒性的易制备试剂。
考虑到目前人们对RNAi疗法和其它核酸基疗法的关注，业内仍然需要可用于将核酸以及其它药剂(例如肽、蛋白质、小分子)以可预知方式有效递送至众多种细胞类型的试剂和系统。
发明内容
本发明提供新颖系统、组合物、制剂和相关方法，其用于使用已经修饰而使蛋白质上的总表面电荷增加或减少(在下文中称作“超荷电”)的蛋白质来将核酸和其它药剂(例如肽、蛋白质、小分子)递送至细胞中。因此，可在体内或在体外使用超荷电来促进超荷电蛋白或与超荷电蛋白缔合在一起而形成复合体的药剂进入细胞中。所述系统和方法可包含使用已经改造而超荷电的蛋白质并且包括所有所述修饰，包括(但不限于)涉及氨基酸序列变化以及使荷电部分附接至蛋白质的修饰。经改造超荷电蛋白的实例阐述于以下专利中：在2007年6月1日申请并且作为WO 2007/143574在2007年12月13日公开的国际PCT专利申请案PCT/US07/70254；和在2006年6月2日申请的美国临时专利申请案U.S.S.N.60/810,364和在2006年8月9日申请的U.S.S.N.60/836,607；每个所述专利标题为“蛋白质表面重建(Protein Surface Remodeling)”并且每个所述专利是以引用方式并入本文中。本文还阐述可用于药物递送的超荷电蛋白的其它实例。本发明也涵盖天然存在的超荷电蛋白的用途，其用于增强一起形成复合体的所缔合药剂的细胞穿透或用于增强天然存在的超荷电蛋白自身的细胞穿透。通常，经改造或天然存在的超荷电蛋白具有正电荷。在某些实施例中，超荷正电蛋白可通过静电相互作用与核酸(其通常具有净负电荷)缔合，由此帮助将核酸递送至细胞中。超荷正电蛋白也可以共价或非共价方式与核酸缔合以通过其它方式来递送。也可使用与欲递送药剂共价键结或以其它方式缔合(例如静电相互作用)的超荷电蛋白将诸如肽或小分子等其它药剂递送至细胞中。在某些实施例中，超荷电蛋白与第二蛋白质序列融合。例如，在某些实施例中，欲递送药剂与超荷正电蛋白以融合蛋白形式一起在单一多肽链中表达。在某些实施例中，融合蛋白在超荷电蛋白与其它蛋白质组份之间具有连接体(例如可裂解连接体)。在某些实施例中，欲递送药剂与超荷电蛋白(例如超荷正电蛋白)通过可裂解连接体(例如可通过蛋白酶或酯酶裂解的连接体、二硫键)彼此缔合。可用于本发明中的超荷电蛋白(例如超荷正电蛋白)通常具有非抗原性、生物可降解性和/或生物相容性。在某些实施例中，超荷正电蛋白不具有生物活性或任何有害生物活性。在某些实施例中，超荷电蛋白具有突变或其它改变(例如翻译后修饰，例如裂解或其它共价修饰)，其可降低或消除所述蛋白在超荷电之前所表现的生物活性。此突变或改变在超荷电蛋白并非因其自身生物活性而是因其在将药剂递送至细胞中的用途而受到关注时尤其令人关注。不期望受限于具体理论，业内认为阴离子细胞表面蛋白聚糖可作为与其作用负荷结合的超荷正电蛋白的肌动蛋白依赖性胞吞作用受体。本发明超荷电蛋白或使用超荷电(例如超荷正电)蛋白的递送系统可包括使用其它医药上可接受的赋形剂，例如聚合物、脂质、碳水化合物、小分子、靶向部分、溶内体性药剂、蛋白质、肽等。例如，超荷电蛋白或超荷电蛋白(例如超荷正电蛋白)与欲递送药剂的复合体可含于微粒、纳米粒子、皮米粒子(picoparticle)、胶束、脂质体或其它药物递送系统中或与其缔合。在其它实施例中，仅使用欲递送药剂和超荷电蛋白来将所述药剂递送至细胞中。在某些实施例中，选择超荷电蛋白来将其自身或所缔合药剂递送至特定细胞或组织类型中。在某些实施例中，将超荷电(例如超荷正电)蛋白或欲递送药剂和所述超荷电蛋白与可破坏溶内体性囊泡或增强内体降解的药剂(例如氯喹(chloroquine)、芘丁酸、基因融合肽、聚乙烯亚胺、血凝素2(HA2)肽、蜂毒肽)组合。由此促进欲递送药剂自内体向胞质溶胶中逸出。
在一些实施例中，本发明系统和方法涉及改变蛋白质的一级序列以使所述蛋白“超荷电”。在其它实施例中，本发明系统和方法涉及使荷电部分附接至蛋白质以使所述蛋白“超荷电”。也就是说，经修饰蛋白质上的总净电荷与未修饰蛋白相比有所增加(更多正电荷或更多负电荷)。在某些实施例中，使蛋白质超荷电(例如超荷正电)以使得可将核酸或其它药剂递送至细胞中。可使任一蛋白质“超荷电”。通常，蛋白质无免疫原性并且天然地或在超荷电后具有可将自身或所缔合药剂转染或递送至细胞中的能力。在某些实施例中，超荷电蛋白的活性与未修饰蛋白大致或实质上相同。在其它实施例中，超荷电蛋白的活性与未修饰蛋白相比显著降低。所述活性可能与如本文所述将其自身或所缔合药剂(例如核酸)递送至细胞中无关。在一些实施例中，使蛋白质超荷电可提高所述蛋白对聚集的抗性、溶解度、再折叠能力和/或在众多种条件下的一般稳定性，以及提高所述蛋白将其自身或所缔合药剂(例如核酸)递送至细胞的能力。在某些实施例中，超荷电蛋白有助于将其自身或所缔合的欲递送药剂靶向特定细胞类型、组织或器官。在某些实施例中，使蛋白质超荷电包括以下步骤：(a)鉴别目标蛋白的表面残基；(b)任选地，鉴别在其它与目标蛋白相关的蛋白质中并非高度保守的特定表面残基(即确定对于所述蛋白的活性或功能并非必需的氨基酸)；(c)确定所鉴别表面残基的亲水性；和(d)用在生理pH下带电荷的氨基酸来替代至少一个或多个所鉴别的带电荷或极性溶剂暴露残基。参见在2007年6月1日申请并作为WO2007/143574在2007年12月13日公开的已公开国际PCT专利申请案PCT/US07/70254；和在2006年6月2日申请的美国临时专利申请案U.S.S.N.60/810,364和在2006年8月9日申请的U.S.S.N.60/836,607；每个所述专利标题为“蛋白质表面重建”；并且每个所述专利是以引用方式并入本文中。本文中阐述制备超荷电蛋白的实例性方法和阐释方法的使用的实例性蛋白质序列。在某些实施例中，为制备带正电的“超荷电”蛋白，使经鉴别用于修饰的残基突变为赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)残基(即在生理pH下带正电的氨基酸)。在某些实施例中，为制备带负电的“超荷电”蛋白，使经鉴别用于修饰的残基突变为天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)残基(即在生理pH下带负电的氨基酸)。每一上述步骤都可使用业内已知的任一技术、电脑软件、算法、方法、范例等来实施。在产生经修饰蛋白后，可测试其活性和/或所寻求的期望特性(例如将核酸或其它药剂递送至细胞中的能力)。在某些实施例中，超荷电蛋白对聚集的易感性较低。在某些实施例中，带正电的“超荷电”蛋白(例如超荷正电绿色荧光蛋白(GFP)，例如+36GFP)可用于将核酸(例如siRNA药剂)递送至细胞(例如哺乳动物细胞、人类细胞)中。在某些实施例中，本发明系统容许将核酸递送至通常对转染具有抗性的细胞(例如神经元细胞、T细胞、成纤维细胞和上皮细胞)中。在某些实施例中，在本发明药物递送系统中鉴别并使用天然存在的超荷电蛋白，而不是改造超荷电蛋白。天然存在的超荷电蛋白的实例包括(但不限于)西科龙(cyclon)(识别号：Q9H6F5)、PNRC1(识别号：Q12796)、RNPS1(识别号：Q15287)、SURF6(识别号：075683)、AR6P(识别号：Q66PJ3)、NKAP(识别号：Q8N5F7)、EBP2(识别号：Q99848)、LSM11(识别号：P83369)、RL4(识别号：P36578)、KRR1(识别号：Q13601)、RY-1(识别号：Q8WVK2)、BriX(识别号：Q8TDN6)、MNDA(识别号：P41218)、H1b(识别号：P16401)、细胞周期蛋白(识别号：Q9UK58)、MDK(识别号：P21741)、肝素结合细胞因子(Midkine)(识别号：P21741)、PROK(识别号：Q9HC23)、FGF5(识别号：P12034)、SFRS(识别号：Q8N9Q2)、AKIP(识别号：Q9NWT8)、CDK(识别号：Q8N726)、β-防御素(识别号：P81534)、防御素3(识别号：P81534)；PAVAC(识别号：P18509)、PACAP(识别号：P18509)、嗜酸性粒细胞活化趋化因子-3(eotaxin-3)(识别号：Q9Y258)、组蛋白H2A(识别号：Q7L7L0)、HMGB1(识别号：P09429)、C-Jun(识别号：P05412)、TERF 1(识别号：P54274)、N-DEK(识别号：P35659)、PIAS 1(识别号：075925)、Ku70(识别号：P12956)、HBEGF(识别号：Q99075)和HGF(识别号：P14210)。
在某些实施例中，在已获得超荷电蛋白后，本发明系统和方法涉及使一或多种核酸或其它药剂与所述超荷电蛋白缔合和使所得复合体与细胞在适合所述细胞吸收作用负荷的条件下接触。核酸可为DNA、RNA和/或其杂合体或衍生物。在某些实施例中，核酸是RNAi因子、RNAi诱导剂、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、反义RNA、核酶、催化性DNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体、载体、质粒、病毒基因组、人工染色体等。在一些实施例中，核酸是单链核酸。在其它实施例中，核酸是双链核酸。在一些实施例中，核酸可包含一或多个可检测标记(例如荧光标签和/或放射性原子)。在某些实施例中，对核酸进行修饰或衍生(例如降低对降解的易感性，提高转染效率)。在某些实施例中，修饰核酸可防止核酸降解。在某些实施例中，修饰核酸可帮助将核酸递送至细胞中。可使用超荷电蛋白递送的其它药剂包括小分子、肽和蛋白质。然后可使所得复合体与其它医药上可接受的赋形剂组合或缔合以形成适合于将药剂递送至细胞、组织、器官或个体的组合物。
可使超荷电蛋白与核酸(或其它药剂)通过非共价相互作用缔合而形成复合体。尽管超荷电蛋白与核酸的共价缔合是可能的，但其对于核酸递送的达成通常并不是必需的。在一些实施例中，通过静电相互作用使超荷电蛋白与核酸缔合。可通过其它非共价相互作用或共价相互作用使超荷电蛋白与核酸缔合。超荷电蛋白可具有至少+5、+10、+15、+20、+25、+30、+35、+40、或+50的净正电荷。在一些实施例中，使超荷正电蛋白与具有总体净负电荷的核酸缔合。所得复合体可具有净负电荷或净正电荷。在某些实施例中，复合体具有净正电荷。例如，+36GFP可与带负电的siRNA缔合。
超荷电蛋白可通过非共价或共价相互作用与除核酸以外的其它药剂缔合。例如，带负电的蛋白质可与超荷正电蛋白通过静电相互作用缔合。对于不带电或不具有足量电荷的药剂来说，可使所述药剂与超荷电蛋白共价缔合以实现将药剂递送至细胞中。例如，可使肽治疗药物与超荷电蛋白融合以将所述肽治疗药物递送至细胞中。在某些实施例中，可通过可裂解连接体接合超荷电蛋白与肽。在另一实例中，可使小分子偶联至超荷电蛋白以递送至细胞中。也可通过非共价相互作用(例如配体-受体相互作用、偶极-偶极相互作用等)使药剂与超荷电蛋白缔合。
本发明提供包含超荷电蛋白和一或多个欲递送药剂的分子的复合体。在一些实施例中，所述复合体中每个超荷电蛋白分子包含多个药剂分子。在一些实施例中，所述复合体中每个超荷电蛋白分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、或更多个药剂(例如核酸)分子。在某些特定实施例中，复合体对应于1个超荷电蛋白分子包含约1-2个核酸分子(例如siRNA)。在其它实施例中，所述复合体中每个药剂分子包含多个蛋白质分子。在一些实施例中，所述复合体中每个药剂分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、或更多个蛋白质分子。在某些实施例中，所述复合体包含约1个药剂分子和约1个超荷正电蛋白分子。在某些实施例中，药剂/超荷电蛋白复合体上的总净电荷为负。在某些实施例中，药剂/超荷电蛋白复合体上的总净电荷为正。在某些实施例中，药剂/超荷电蛋白复合体上的总净电荷为中性。在某些特定实施例中，核酸/超荷电蛋白复合体上的总净电荷为正。
在另一方面中，本发明提供医药组合物，其包含：a)一或多种超荷电蛋白；b)超荷电蛋白与欲递送药剂的一或多种复合体；或c)本发明一或多种a)或一或多种b)与至少一种医药上可接受的赋形剂。复合体在组合物中的量可为可用于在细胞中诱导期望生物反应(例如提高或降低特定基因在细胞中的表达)的量。在某些实施例中，使复合体与用于将药剂的递送引导至特定细胞、细胞类型、组织或器官的靶向部分(例如小分子、蛋白质、肽、碳水化合物等)缔合。
在一些实施例中，超荷电蛋白或包含经改造或天然存在的超荷电蛋白与一或多种核酸(和/或其医药组合物)的复合体可用作治疗剂。在一些实施例中，核酸和/或超荷电蛋白可具有治疗活性。在某些实施例中，核酸具有治疗活性。例如，一些病况(例如癌症、炎症性疾病)与某些mRNA和/或蛋白质的表达有关。与靶向所表现mRNA的RNAi因子缔合的超荷电蛋白可用于治疗所述病况。或者，一些病况与某些mRNA和/或蛋白质的表达不足有关(例如癌症、先天性代谢缺陷)。与驱动缺陷型mRNA和/或蛋白质表达的载体缔合的超荷电蛋白可用于治疗所述病况。
本发明也提供试剂盒，其可用于产生本发明超荷电蛋白或超荷电蛋白/药剂复合体或其组合物，和/或使用所述复合体来将所述超荷电蛋白或药剂转染或递送至细胞中。本发明试剂盒也可包括投与或使用本发明超荷电蛋白或复合体或其医药组合物的说明书。例如，试剂盒可包括向个体开立医药组合物的说明书。试剂盒可包括足够材料用于多个单位剂量的药剂。试剂盒可设计用于治疗性或研究性目的。试剂盒可任选地包括欲递送药剂(例如siRNA、肽、药物)，或药剂可由最终使用者来提供。
本发明也提供将超荷电蛋白或与超荷电蛋白缔合的药剂、或二者引入细胞中的方法。本发明方法包含使超荷电蛋白、或超荷电蛋白和与超荷电蛋白缔合的药剂与细胞在(例如)足以容许所述超荷电蛋白或与超荷电蛋白缔合的药剂穿透至细胞中的条件下接触，由此将超荷电蛋白、或与超荷电蛋白缔合的药剂、或二者引入细胞中。在某些实施例中，足量超荷电蛋白或药剂进入细胞，从而容许一或多种以下检测：细胞中的超荷电蛋白或药剂；细胞生物特性的变化，例如细胞的生长速率、基因表达模式、或活力；或检测超荷电蛋白或药剂的生物效应。在某些实施例中，接触是在体外实施。在某些实施例中，接触是在体内实施，例如在个体(例如人类或其它动物)体内。在一体内实施例中，细胞中存在足量超荷电蛋白、药剂、或二者，从而在个体中产生可检测效应(例如治疗效应)。在一体内实施例中，在细胞中存在足量超荷电蛋白、药剂、或二者，从而使得可对一或多种经穿透细胞或组织进行成像。.在某些实施例中，因细胞穿透而产生所观察或可检测效应。
本发明也提供评估超荷电蛋白的细胞穿透的方法，其包含：任选地，选择超荷电蛋白；提供所述超荷电蛋白；和使所述超荷电蛋白与细胞接触并确定所述超荷电蛋白是否穿透所述细胞，由此对超荷电蛋白的细胞穿透作出评估。
本发明也提供评估超荷电蛋白的细胞穿透的方法，其包含：选择欲超荷电的蛋白质；获得一个含一或多个欲改变残基的集合以产生超荷电蛋白，其中所述残基集合通过本文所述方法来生成(获得包括生成所述残基集合或自另一方接受所述集合中一或多个成员的属性)；提供(例如通过制备或自另一方接受)具有所述变化残基集合的超荷电蛋白；和使所述超荷电蛋白与细胞接触并测定所述超荷电蛋白是否穿透所述细胞，由此评估超荷电蛋白的细胞穿透。所述方法可容许一方形成超荷电蛋白或与其它方共同形成。
附图说明
图1.超荷电绿色荧光蛋白(GFP)。(A)GFP变体的蛋白质序列，其中荧光团形成残基标示为绿色，带负电的残基标示为红色，并且带正电的残基标示为蓝色。(B-D)sfGFP(B)、GFP(+36)(C)和GFP(-30)(D)的表面静电势，颜色自-25kT/e(红色)变至+25kT/e(蓝色)。
图2.GFP变体的分子内特性。(A)纯化GFP变体的染色和UV荧光。每个泳道和管含有0.2μg蛋白质。(B)GFP变体的圆二色谱。(C)GFP变体的热力学稳定性，其是通过胍盐诱导解折叠来测量。
图3.超荷电蛋白的分子间特性。(A)纯化GFP变体(“天然的”)的UV照射样品，将所述样品在100℃下加热1分钟(“沸腾的”)，并且随后使所述样品在25℃下冷却2小时(“冷却的”)。(B)用40％TFE在25℃下诱导GFP变体聚集并通过直角光散射来监测。(C)超荷电GFP可逆附着至带相反电荷的高分子上。样品1：6μgGFP(+36)，存于30μL25mM Tris pH 7.0和100mM NaCl中。样品2：将6μg GFP(-30)添加至样品1中。样品3：将30μg鲑鱼精DNA添加至样品1中。样品4：将20μg大肠杆菌(E.coli)tRNA添加至样品1中。样品5：将1M NaCl添加至样品4中。样品6-8：分别等同与样品1、2和4，只是使用sfGFP来代替GFP(+36)。将所有样品在微量离心机中短暂旋转并在UV光下可视化。
图4.GFP变体的(A)激发光谱和(B)发射光谱。如通过发色团在490nm下的吸光度所定量，各样品含有等量蛋白质。
图5.超荷电表面主要分子间相互作用。超荷电GFP非特异性地可逆附着至带相反电荷的高分子(“蛋白质维可牢(Velcro)”)上。所述相互作用可导致形成沉淀。与变性蛋白的聚集物不同，所述沉淀含有经折叠荧光GFP并且溶于1M盐中。此处显示为：单独的+36GFP；+36GFP与-30GFP混合；+36GFP与tRNA混合；+36GFP与tRNA混合在1MNaCl中；sfGFP(-7)；和sfGFP与-30GFP混合。
图6.超荷正电GFP结合siRNA。在琼脂糖凝胶中GFP-siRNA复合体不与siRNA共移动-将+36GFP与siRNA一起培育，并且对所得复合体实施琼脂糖凝胶电泳。在此分析中测试各种+36GFP∶siRNA比率：0∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶10。在约1∶3的化学计量下，显示+36GFP与siRNA形成稳定复合体。非超荷正电蛋白显示不结合siRNA。测试50∶1比率的sfGFP∶siRNA，但甚至在如此高的过量水平下，sfGFP也不与siRNA缔合。
图7.超荷正电GFP穿透细胞。将海拉(HeLa)细胞与GFP(sf GFP(-7)、-30GFP或+36GFP)一起培育，洗涤，固定，并染色。+36GFP而非sfGFP或-30GFP有效穿透海拉细胞。左侧：对DNA进行DAPI染色以标记细胞。中间：进行GFP染色以标记GFP发生细胞摄取的位置。右侧：在+36GFP出现时显示其定位的影像。
图8.超荷正电GFP将siRNA递送至人类细胞中。显示+36GFP可将siRNA有效递送至海拉细胞中。左图：阳离子脂质体2000和Cy3-siRNA；右图：+36GFP和Cy3-siRNA。显示+36GFP可将siRNA有效递送至海拉细胞中。使用霍克斯特(Hoescht)通道(蓝色)来使DNA可视化，由此标记细胞位置；使用Cy3通道(红色)来使Cy3标记的siRNA可视化；使用GFP通道(绿色)来使GFP可视化；黄色表示siRNA与GFP之间的共定位位点。
图9.将siRNA递送至对传统转染具有抗性的细胞系中：鼠类3T3-L1前脂肪细胞(“3T3L细胞”)。用以下组合中的任一者处理3T3L细胞：阳离子脂质体2000和Cy3-siRNA(左图)；或+36GFP和Cy3-siRNA(右图)。阳离子脂质体对3T3L的转染较弱，但+36GFP可有效转染。使用霍克斯特通道(蓝色)来使DNA可视化，由此标记细胞位置；使用Cy3通道(红色)来使Cy3标记的siRNA可视化；使用GFP通道(绿色)来使GFP可视化。黄色表示siRNA与GFP之间的共定位位点。
图10.将siRNA递送至对传统转染具有抗性的细胞系中：大鼠IMCD细胞。用阳离子脂质体2000与Cy3-siRNA(左图)或+36GFP与Cy3-siRNA(右图)来处理大鼠IMCD细胞。阳离子脂质体对大鼠IMCD细胞转染较弱，但+36GFP可有效转染。使用霍克斯特通道(蓝色)来使DNA可视化，由此标记细胞位置；使用Cy3通道(红色)来使Cy3标记的siRNA可视化；使用GFP通道(绿色)来使GFP可视化。黄色表示siRNA与GFP之间的共定位位点。
图11.将siRNA递送至对传统转染具有抗性的细胞系中：人类ST14A神经元。用阳离子脂质体2000与Cy3-siRNA(左图)或+36GFP与Cy3-siRNA(右图)处理人类ST14A神经元。阳离子脂质体对人类ST14A神经元的转染较弱，但+36GFP可有效转染。使用DAPI通道(蓝色)来使DNA可视化，由此标记细胞位置；使用Cy3通道(红色)来使Cy3标记的siRNA可视化；使用GFP通道(绿色)来使GFP可视化。黄色表示siRNA与GFP之间的共定位位点。
图12.对siRNA转染的流式细胞术分析。左侧：阳离子脂质体。每个柱对应于用不同转染方法实施的实验：阳离子脂质体(蓝色)；和20nM+36GFP(红色)。每个图表对应于用不同细胞类型实施的实验：IMCD细胞、PC 12细胞、海拉细胞、3T3L细胞和尤尔卡特(Jurkat)细胞。X轴代表自Cy3通道获得的测量值，其为siRNA荧光的读数。Y轴代表在流式细胞术实验中的细胞计数。流式细胞术数据表明，使用+36GFP可比使用阳离子脂质体更有效地以siRNA转染细胞。
图13.用+36GFP递送的siRNA可诱导基因敲除。使用约2μM的阳离子脂质体2000(黑色柱)或20nM+36GFP(绿色柱)将50nM GAPDH siRNA转染至五种不同细胞类型(海拉、IMCD、3T3L、PC 12和尤尔卡特细胞系)中。Y轴代表GAPDH蛋白水平，以微管蛋白水平的分数表示。
图14.细胞穿透的机械探针。用多种探针中的一种将海拉细胞处理30分钟并且随后用5nM+36GFP处理。样品包括：(A)无探针；(B)4℃预培育(抑制能量依赖性过程)；(C)100mM蔗糖(抑制网格蛋白介导的胞吞作用)(左图)和25μg/ml制霉菌素(nystatin)(破坏穴样内陷功能)(右图)；(D)25μM松胞菌素(cytochalasin)B(抑制巨胞饮作用)(左图)和5μM莫能菌素(monensin)(抑制内体受体再循环)(右图)。
图15.有助于细胞穿透活性的因素。显示电荷强度可促进细胞穿透活性。具体来说，显示+15GFP或Lys20-50不能穿透细胞。左图：20mM+15GFP和50nM siRNA-Cy3。中图：20nM+36GFP。右图：60nM Lys20-50和50nM siRNA-Cy3。使用霍克斯特通道(蓝色)来使DNA可视化，由此标记细胞位置；使用GFP通道(绿色)来使GFP可视化。
图16.超荷电GFP变体和其穿透细胞的能力。(A)计算GFP变体的表面静电势，颜色自-25kT/e(深红色)变至+25kT/e(深蓝色)。(B)流式细胞术分析显示在用200nM的各种GFP变体独立处理海拉细胞并用含有肝素的PBS洗涤三次以移除细胞表面结合的GFP之后，内化GFP在海拉细胞中的量。(C)流式细胞术分析显示与未处理细胞(黑色)中的背景荧光相比，内化+36GFP(绿色)在海拉、IMCD、3T3-L、PC 12和尤尔卡特细胞中的量。
图17.(A)在37℃下共培育1小时后+36GFP在海拉细胞中的内化。(B)在4℃下培育1小时后抑制+36GFP在海拉细胞中的细胞穿透。仅部分洗涤细胞以使+36GFP保持部分结合在细胞表面上。(C)和(D)+36GFP在(A)中条件下、且分别在小窝蛋白依赖性胞吞作用抑制剂非律平(filipin)与制霉菌素的存在下内化。(E)+36GFP在(A)中条件下、且在网格蛋白依赖性胞吞作用抑制剂氯丙嗪(chlorpromazine)的存在下内化。(F)在胞吞作用20分钟后，阿莱克萨荧光二抗647(Alexa Fluor 647)标记的转铁蛋白(红色)和+36GFP(绿色)的细胞定位。(G)在肌动蛋白聚合抑制剂松胞菌素D存在下对+36GFP在海拉细胞中的内化的抑制。(H)用80mM氯酸钠处理对+36GFP在海拉细胞中的内化的抑制。(I)在37℃下培育1小时后，+36GFP在CHO细胞中的内化。(J)在PDG-CHO细胞中缺少+36GFP内化。在(I)和(J)中细胞核经DAPI(蓝色)染色。
图18.(A)凝胶迁移分析显示通过溴化乙锭染色的未结合siRNA(33)，以测定超荷正电GFP∶siRNA结合的化学计量。在25℃下将10皮摩尔siRNA以不同摩尔比与各种GFP混合10分钟，然后通过非变性PAGE进行分析。每行中的最右侧泳道显示sfGFP与siRNA的100∶1混合物。(B)流式细胞术分析显示在用50nM Cy3-siRNA与200nM的+15、+25或+36GFP的混合物处理海拉细胞，之后用肝素洗涤三次以移除未内化蛋白(参见图22)后，内化siRNA在海拉细胞中的水平。来自经siRNA而非转染试剂处理的海拉细胞的数据显示为黑色。(C)流式细胞术分析显示与经siRNA而非转染试剂处理的细胞(黑色)相比，在与50nM Cy3-siRNA与200nM+36GFP(绿色)或约2μM阳离子脂质体2000(蓝色)的混合物一起培育后，递送至海拉、IMCD、3T3-L、PC12和尤尔卡特细胞中的Cy3标记的siRNA的水平。如上所述在进行流式细胞术之前洗涤细胞。(D)在用200nM+36GFP和50nM Cy3-siRNA处理4小时后24小时，稳定附着细胞系(海拉、IMCD和3T3-L)的荧光显微图像。每一图像是三个通道的叠加：蓝色(DAPI染色)、红色(Cy3-siRNA)和绿色(+36GFP)；黄色表示红色与绿色的共定位。所有三个图像的放大倍数都是40x。
图19.siRNA递送对GAPDH的mRNA和蛋白水平的抑制。(A)在用50nM siRNA和约2μM阳离子脂质体2000或用50nM siRNA和200nM+36GFP处理后48、72或96小时，如通过RT-QPCR所测量，GAPDH的mRNA水平在海拉细胞中的抑制。将所显示抑制水平标准化为β-肌动蛋白mRNA水平；将0％抑制定义为经约2μM阳离子脂质体2000和50nM杂乱阴性对照siRNA处理的细胞中的mRNA水平。(B)在用siRNA和约2μM阳离子脂质体2000或用siRNA和200nM+36GFP处理后48、72和96小时，GAPDH蛋白水平在海拉细胞中的抑制。(C)在用50nM siRNA和约2μM阳离子脂质体2000、200nM+36GFP、或200nM+36GFP-HA2处理后96小时，GAPDH蛋白水平在海拉、IMCD、3T3-L、PC12和尤尔卡特细胞中的抑制。在(B)和(C)中，所显示抑制水平是通过蛋白质印迹(Western blot)来测量并且标准化为β-微管蛋白水平；0％抑制定义为在经约2μM阳离子脂质体2000和杂乱阴性对照siRNA处理的细胞中的蛋白水平。数值和误差柱代表(A)和(B)中三次独立实验以及(C)中五次独立实验的平均值和标准偏差。
图20.与+15和+36GFP相比，各种阳离子合成肽的siRNA转染活性。在用50nMCy3-siRNA与200nM或2μM所示肽或蛋白质的混合物处理4小时后，使用流式细胞术来测量内化Cy3-siRNA在海拉细胞中的水平。
图21.通过阳离子脂质体2000、+36GFP或+36GFP-HA2将质粒DNA转染至海拉、IMCD、3T3-L、PC 12和尤尔卡特细胞中。用800ng pSV-β-半乳糖苷酶质粒和200nM或2μM+36GFP或+36GFP-HA2将细胞处理4小时。在24小时后，使用β-荧光二抗试剂盒(诺维根(Novagen))来测量β-半乳糖苷酶活性。数值和误差柱代表三次独立实验的平均值和标准误差。
图22.用于移除细胞表面结合的超荷电GFP的洗涤方案的有效性。在4℃下用200nM+36GFP将海拉细胞处理(为阻断GFP的细胞摄取，参见正文)1小时。然后用4℃PBS或用存于PBS中的4℃20U/mL硫酸肝素将细胞洗涤三次(每次洗涤1分钟)，然后通过流式细胞术来分析。用PBS洗涤的细胞显示据推测源自细胞表面结合的GFP的显著GFP荧光。相反，用20U/mL存于PBS中的肝素洗涤的细胞所表现的GFP荧光水平等效于未处理细胞。
图23.+36GFP在海拉细胞中的细胞穿透的浓度依赖性。在无血清培养基中用+36GFP将海拉细胞处理4小时。对细胞进行胰蛋白酶处理并在存于DMEM中的10％FBS中将其再次平铺于涂布有基质胶(Matrigel)(BD生物科学(BD Biosciences))的载玻片上。在37℃下保持24小时后，用存于PBS中的4％甲醛固定细胞，用DAPI染色，并使用莱卡(Leica)DMRB倒置显微镜进行成像。所有图像的放大倍数都是20x。
图24.荧光显微术揭示，在使用福金6(Fugene 6)(罗氏(Roche))转染剂的IMCD和3T3-L细胞中无内化Cy3-siRNA。按照制造商方案在无血清培养基中用福金6将细胞处理4小时。对细胞进行胰蛋白酶处理并沉淀。通过抽吸移除含胰蛋白酶培养基并使细胞再悬浮于存于DMEM中的10％FBS中，然后平铺在预涂布有基质胶TM的载玻片上。使细胞附着24小时，用存于PBS中的4％甲醛固定，用DAPI染色，并使用莱卡DMRB倒置显微镜成像。所有图像的放大倍数都是20x。未观察到Cy3荧光(与图18D相比)。
图25.(A)在用50nM siRNA和约2μM阳离子脂质体2000、+36GFP或+36GFP-HA2处理后，对五种哺乳动物细胞系进行MTT细胞毒性分析。在处理后24小时获取数据。数值和误差柱反映三次独立实验的平均值和标准误差。用+36GFP或+36GFP-HA2但不用MTT试剂处理的细胞在所述条件下不表现显著吸光度。(B)在用50nM siRNA和200nM或2μM阳离子聚合物处理后，对海拉细胞进行MTT细胞毒性分析。用氯喹或芘丁酸处理显示细胞毒性(分别为泳道9和10)。
图26.凝胶迁移分析显示未结合线性化pSV-β-半乳糖苷酶质粒DNA(普洛麦格(Promega))以测定+36GFP：质粒DNA结合的化学计量。在每个泳道中，将22fmol通过EcoRI消化线性化的pSV-β-半乳糖苷酶与不同摩尔比的+36GFP合并并在25℃下培育10分钟。在140V下在含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上经50分钟通过电泳来分析样品。
图27.对此工作中所用纯化GFP变体的SDS-PAGE分析。通过用考马斯蓝(Coomassie Blue)染色来使蛋白质可视化。分子量标记物的移动点列示于左侧。应注意，超荷电GFP在SDS-PAGE期间以部分取决于理论净电荷强度而不是仅取决于实际分子量的方式移动。
图28.此研究中所用所有GFP类似物的荧光光谱(每种蛋白10nM，在488nm下激发)。
图29.(A)在用约2μM阳离子脂质体2000和50nM阴性对照siRNA处理后4天的代表性蛋白质印迹数据。(B)在用200nM+36GFP和50nM阴性对照siRNA处理后4天的代表性蛋白质印迹数据。(C)代表性蛋白质印迹数据显示在用50nM GAPDHsiRNA和约2μM阳离子脂质体2000或200nM+36GFP处理后48、72和96小时的GAPDH和β-微管蛋白水平。(D)在用约2μM阳离子脂质体2000和50nM GAPDHsiRNA处理后4天的代表性蛋白质印迹数据。(E)在用200nM+36GFP和50nMGAPDH siRNA处理后4天的代表性蛋白质印迹数据。(F)在用200nM+36GFP-HA2和50nM GAPDH siRNA处理后4天的代表性蛋白质印迹数据。(G)在用约2μM阳离子脂质体2000和50nM阴性对照siRNA、约2μM阳离子脂质体2000和50nM β-肌动蛋白靶向siRNA、200nM+36GFP和50nM β-肌动蛋白靶向siRNA、或200nM+36GFP和50nM阴性对照siRNA处理后4天自海拉细胞获得的代表性蛋白质印迹数据。
图30.荧光显微术揭示，在4℃下处理的海拉细胞中或在经松胞菌素D(10μg/mL)预处理的海拉细胞中，无内化Cy3-siRNA或GFP。图像是在用含有200nM+36GFP和50nM siRNA的溶液处理后1小时的细胞。用配备有滤光片的反向转盘共聚焦显微镜获取图像以检测GFP发射。为促进可视化，用存于PBS中的20U/mL肝素将细胞洗涤两次(每次1分钟)以移除大部分(但并非所有)表面结合GFP-siRNA。
图31.(A)动态光散射(DLS)数据显示通过混合20μM+36GFP与5μM双链RNA20聚体形成的粒子的流体动力学半径(Hr)。(B)上述样品的荧光显微图像。所示图像是亮视野与GFP通道图像的叠加；应注意，较大特征是在样品干燥时缔合在一起的实际上较小的粒子。比例尺＝10μm。
图32.(A)通过蛋白水解酶K消化+36GFP和牛血清白蛋白。在37℃下用0.6单位蛋白水解酶K处理100pmol+36GFP或牛血清白蛋白(BSA)。将样品与SDS蛋白质加样缓冲液混合，加热至90℃并保持10分钟，并在经考马斯蓝染色的4-12％丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE进行分析。(B)+36GFP和BSA在鼠类血清中的稳定性。将存于PBS中的100pmol的每种蛋白与5μL鼠类血清混合至总体积为10μL并在37℃下培育。将样品与SDS蛋白质加样缓冲液混合并在90℃下加热10分钟。通过SDS-PAGE在4-12％丙烯酰胺凝胶上分析所得混合物，并且通过蛋白质印迹来揭示+36GFP和BSA蛋白区带。下部图像是+36GFP-siRNA复合体的5μL样品(论述于C中)并通过蛋白质印迹分析其GFP。(C)与+36GFP在鼠类血清中复合的siRNA的稳定性。将siRNA(10pmol)与sfGFP(40pmol)或+36GFP(40pmol)混合，并在25℃下于4μLPBS中培育10分钟。将所得溶液添加至四体积的小鼠血清中(总计20μL)并在37℃下培育所示时间，用乙醇沉淀，并通过凝胶电泳在15％丙烯酰胺凝胶上进行分析。(D)与+36GFP或sfGFP在鼠类血清中复合的质粒DNA的稳定性。将质粒DNA(0.026pmol)与12.8pmol的+36GFP或sfGFP在4μLPBS中混合10分钟。向此溶液中添加16μL小鼠血清(总计20μL)。在37℃下将样品培育所示时间。通过用酚-氯仿萃取并用乙醇沉淀来分离DNA，然后通过凝胶电泳在1％琼脂糖凝胶上进行分析。
图33.使用(1)mCherry-TAT；(2)mCherry-Arg9；和(3)mCherry-ALAL-+36GFP在海拉、PC12和IMCD细胞系中内化mCherry。
图34.在用50nM mCherry-ALAL-+36GFP处理后4小时海拉、PC12和IMCD细胞的荧光显微图像。每个图像是三种通道的叠加：蓝色(DNA的DAPI染色)、红色(mCherry)和绿色(+36GFP)。黄色表示红色与绿色的共定位。
图35.人类蛋白质将siRNA递送至海拉细胞中。(A)以提高的质量比将人类蛋白质与siRNA混合并通过PAGE和溴化乙锭染色来分析未结合siRNA。区带强度降低表明siRNA与人类蛋白质结合。(B)将人类蛋白质与Cy3标记的siRNA混合并经4小时将其施加至海拉细胞。然后洗涤细胞并通过流式细胞术分析Cy3荧光。峰向右侧迁移表明siRNA发生内化。(C)使用人类蛋白质以siRNA转染海拉细胞，培育3天，并分析所靶向mRNA的降解。比较所靶向GAPDH的mRNA水平与β-肌动蛋白mRNA水平。“对照”表示使用非靶向siRNA。使用阳离子脂质体2000作为阳性对照。
具体实施方式
定义
欲递送药剂：本文所用短语“欲递送药剂”是指可递送至个体、器官、组织、细胞、亚细胞位点和/或细胞外基质位点的任一物质。在一些实施例中，欲递送药剂是生物活性药剂，即其在生物系统和/或有机体中具有活性。例如，在投与有机体时对所述有机体具有生物效应的物质可视为具有生物活性。在特定实施例中，倘若欲递送药剂是生物活性药剂，则所述药剂中分享整体药剂的至少一种生物活性的部分通常称作“生物活性”部分。在一些实施例中，欲递送药剂是治疗剂。本文所用术语“治疗剂”是指在投与个体时具有有益效应的任一药剂。术语“治疗剂”是指在投与个体时具有治疗性、诊断性和/或预防性效应和/或引发期望生物学和/或药理学效应的任一药剂。本文所用术语“治疗剂”可为通过与超荷电蛋白缔合来递送至细胞中的核酸。在某些实施例中，欲递送药剂是核酸。在某些实施例中，欲递送药剂是DNA。在某些实施例中，欲递送药剂是RNA。在某些实施例中，欲递送药剂是肽或蛋白质。在某些实施例中，欲递送药剂是小分子。在一些实施例中，欲递送药剂可用作体内或体外成像剂。在一些所述实施例中，欲递送药剂具有生物活性，并且在其它所述实施例中不具有生物活性。
动物：本文所用术语“动物”是指动物界的任一成员。在一些实施例中，“动物”是指任一发育阶段的人类。在一些实施例中，“动物”是指任一发育阶段的非人动物。在某些实施例中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物或猪)。在一些实施例中，动物包括(但不限于)哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼和虫。在一些实施例中，动物是转基因动物、遗传改造动物、或克隆。
大约：本文所用术语“大约”或“约”在用于一或多个目标数值时是指类似于所述参照数值的数值。在某些实施例中，除非另外说明或上下文中有其它证据(除了所述数字会超过可能数值的100％以外)，否则术语“大约”或“约”是指与所述参照数值在任一方向上(大于或小于)相差25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更小的数值范围。
与……缔合：本文所用术语“与……缔合”、“偶联”、“连接”、“附接”和“栓接”在用于两个或更多个部分时意指所述部分在物理上直接地或通过一或多个用作连接剂的部分彼此缔合或连接，从而形成足够稳定的结构，而使得所述部分在所述结构的使用条件(例如生理条件)下可保持物理缔合。超荷电蛋白通常通过涉及非共价结合(例如静电相互作用)的机制与核酸缔合。在某些实施例中，带正电的超荷电蛋白通过静电相互作用与核酸缔合而形成复合体。在一些实施例中，足够数量的较弱相互作用可为欲在各种不同条件下保持物理缔合的部分提供充分稳定性。在某些实施例中，欲递送药剂与超荷电蛋白共价键结。
生物相容性：本文所用术语“生物相容性”是指对细胞无毒性的物质。在一些实施例中，若在体内将物质添加至细胞中不会诱导炎症和/或其它体内不良效应，则可将所述物质视为“生物相容性”。在一些实施例中，若在体外或在体内将物质添加至细胞中会引起少于或等于约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、或少于约5％的细胞死亡，则可将所述物质视为“生物相容性”。
生物可降解性：本文所用术语“生物可降解性”是指在生理条件下降解的物质。在一些实施例中，生物可降解性物质是通过细胞机构裂解的物质。在一些实施例中，生物可降解性物质是通过化学过程裂解的物质。
生物活性：本文所用短语“生物活性”是指在生物系统和/或有机体中具有活性的任一物质的特征。例如，在投与有机体时对所述有机体具有生物效应的物质可视为具有生物活性。在特定实施例中，倘若核酸具有生物活性，则所述核酸中分享整体核酸的至少一种生物活性的部分通常称作“生物活性”部分。
碳水化合物：术语“碳水化合物”是指糖或糖聚合物。术语“糖”、“多糖”、“碳水化合物”和“寡糖”可互换使用。大多数碳水化合物是具有多个羟基的醛或酮，通常所述分子中每个碳原子上有一个羟基。碳水化合物一般具有分子式CnH2nOn。碳水化合物可为单糖、二糖、三糖、寡糖或多糖。大多数基础碳水化合物是单糖，例如葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖和果糖。二糖是两个接合单糖。实例性二糖包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和乳糖。通常，寡糖包括三至六个单糖单元(例如棉籽糖、水苏糖)，并且多糖包括六个或更多个单糖单元。实例性多糖包括淀粉、糖原和纤维素。碳水化合物可含有经修饰糖单元，例如2’-脱氧核糖，其中移除羟基；2’-氟代核糖，其中用氟替代羟基；或N-乙酰基葡萄糖胺，其为葡萄糖的含氮形式(例如2’-氟代核糖、脱氧核糖和己糖)。碳水化合物可以多种不同形式存在，例如构象异构体、环状形式、非环状形式、立体异构体、互变异构体、端基异构体和同分异构体。
特征性部分：本文所用术语物质的“特征性部分”就最广泛含义来说是与相关完整物质分享一定序列和/或结构一致性和/或至少一种功能性特征的部分。例如，蛋白质或多肽的“特征性部分”是含有共同构成蛋白质或多肽的特征的氨基酸连续区段、或多个氨基酸连续区段的部分。在一些实施例中，每个所述连续区段一般可含有至少2个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少50个、或更多个氨基酸。核酸的“特征性部分”是含有共同构成核酸的特征的核苷酸连续区段、或多个核苷酸连续区段的部分。在一些实施例中，每一所述连续区段一般可含有至少2个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少50个、或更多个核苷酸。在一些实施例中，特征性部分具有生物活性。
保守的：本文所用术语“保守的”分别是指多核苷酸序列或氨基酸序列中的核苷酸或氨基酸残基在所比较的两个或更多个相关序列的相同位置中以未改变形式存在。相对保守的核苷酸或氨基酸是与序列中其它位置出现的核苷酸或氨基酸相比在较相关序列中保守的核苷酸或氨基酸。在一些实施例中，若两个或更多个序列彼此100％一致，则可将其称作“完全保守的”。在一些实施例中，若两个或更多个序列彼此至少70％一致、至少80％一致、至少90％一致、或至少95％一致，则可将其称作“高度保守的”。在一些实施例中，若两个或更多个序列彼此约70％一致、约80％一致、约90％一致、约95％、约98％、或约99％一致，则可将其称作“高度保守的”。在一些实施例中，若两个或更多个序列彼此至少30％一致、至少40％一致、至少50％一致、至少60％一致、至少70％一致、至少80％一致、至少90％一致、或至少95％一致，则可将其称作“保守的”。在一些实施例中，若两个或更多个序列彼此约30％一致、约40％一致、约50％一致、约60％一致、约70％一致、约80％一致、约90％一致、约95％一致、约98％一致、或约99％一致，则可将其称作“保守的”。
表达：本文所用核酸序列的“表达”是指以下事件中的一或多者：(1)自DNA序列(例如通过转录)产生RNA模板；(2)处理RNA转录物(例如剪接、编辑、5’帽形成和/或3’末端处理)；(3)将RNA翻译为多肽或蛋白质；和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
功能性：本文所用“功能性”生物分子是呈表现特征性特性和/或活性的形式的生物分子。
融合蛋白：本文所用“融合蛋白”包括第一蛋白部分(例如超荷电蛋白)，其与第二蛋白部分之间具有肽键。在某些实施例中，融合蛋白是由单一融合基因来编码。
基因：本文所用术语“基因”具有其业内所理解的含义。所属领域技术人员应了解，术语“基因”可包括基因调节序列(例如启动子、增强子等)和/或内含子序列。另外应了解，基因的定义包括不编码蛋白质而是编码诸如RNAi因子、核酶、tRNA等功能性RNA分子的核酸的含义。出于清晰性目的，应注意，本申请案中所用术语“基因”一般是指编码蛋白质的核酸部分；所述术语可任选地涵盖调节序列，如根据所属领域技术人员的知识背景所了解。此定义并不意欲排除术语“基因”对于非蛋白质编码性表达单元的应用，而是意欲澄清，在大多数情形下，本文献中所用此术语是指编码蛋白质的核酸。
基因产物或表达产物：本文所用术语“基因产物”或“表达产物”一般是指自基因转录的RNA(前-和/或后处理)或自所述基因转录的RNA编码的多肽(前-和/或后修饰)。
绿色荧光蛋白：本文所用术语“绿色荧光蛋白”(GFP)是指最初自水母维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)分离的暴露于蓝光下时发出绿色荧光的蛋白质或此一蛋白质的衍生物(例如蛋白质的超荷电形式)。野生型GFP的氨基酸序列如下所述：
MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYGKLTLKFICTT GKLPVPWPTL VTTFSYGVQC FSRYPDHMKQHDFFKSAMPE GYVQERTIFF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLVNRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YIMADKQKNGIKVNFKIRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHYLSTQSALSKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGIT HGMDELYK(SEQIDNO。XX).
至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％同源的蛋白质也可视作绿色荧光蛋白。在某些实施例中，绿色荧光蛋白是超荷电蛋白。在某些实施例中，绿色荧光蛋白是超荷正电蛋白(例如+15GFP、+25GFP和+36GFP，如本文所述)。在某些实施例中，GFP可经修饰而包括多组氨酸标签以便于纯化蛋白质。在某些实施例中，GFP可与另一蛋白质或肽(例如血凝素2(HA2)肽)融合。在某些实施例中，GFP可以生物或化学方式进一步修饰(例如翻译后修饰、蛋白酶解等)。
同源性：本文所用术语“同源性”是指聚合分子之间(例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间)的总体相关性。在一些实施例中，若聚合分子的序列至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％一致，则可将其视作彼此“同源”。在一些实施例中，若聚合分子的序列至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％类似，则可将其视作彼此“同源”。术语“同源”必然是指至少两个序列(核苷酸序列或氨基酸序列)之间的比较。根据本发明，若两个核苷酸序列所编码多肽中有至少一个至少约20个氨基酸的区段至少约50％一致、至少约60％一致、至少约70％一致、至少约80％一致、或至少约90％一致，则可将其视作同源。在一些实施例中，同源核苷酸序列的特征在于能编码具有至少4-5个特别指定氨基酸的区段。对于欲确定同源性的核苷酸序列来说，一定要考虑这些氨基酸相对于彼此的一致性和近似间隔二者。对于长度少于60个核苷酸的核苷酸序列，通过编码具有至少4-5个特别指定氨基酸的区段的能力来确定同源性。根据本发明，若两个蛋白质序列中有至少一个至少约20个氨基酸的区段至少约50％一致、至少约60％一致、至少约70％一致、至少约80％一致、或至少约90％一致，则可将所述蛋白质视作同源。
亲水性：本文所用“亲水性”物质是可溶于极性分散介质中的物质。在一些实施例中，亲水性物质可与极性分散介质瞬时结合。在一些实施例中，亲水性物质通过氢键与极性分散介质瞬时结合。在一些实施例中，极性分散介质是水。在一些实施例中，亲水性物质可为粒子型。在一些实施例中，亲水性物质可为非离子型。在一些实施例中，物质相对于另一种物质具有亲水性，这是因为其在水、极性分散介质、或亲水性分散介质中的溶解度高于所述另一物质。在一些实施例中，物质相对于另一种物质具有亲水性，这是因为其在油、非极性分散介质、或疏水性分散介质中的溶解度低于所述另一物质。
疏水性：本文所用“疏水性”物质是可溶于非极性分散介质中的物质。在一些实施例中，疏水性物质受极性分散介质排斥。在一些实施例中，极性分散介质是水。在一些实施例中，疏水性物质是非极性的。在一些实施例中，物质相对于另一种物质具有疏水性，这是因为其在油、非极性分散介质、或疏水性分散介质中的溶解度高于所述另一物质。在一些实施例中，物质相对于另一种物质具有疏水性，这是因为其在水、极性分散介质、或亲水性分散介质中的溶解度低于所述另一物质。
一致性：本文所用术语“一致性”是指聚合分子之间(例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间)的总体相关性。例如，出于优化对比目的，可通过比对两个核酸序列来实施两个序列的一致性百分比的计算(例如可将间隙引入第一和第二核酸序列中的一者或二者中以供优化比对，并且出于对比目的可忽视不一致序列)。在某些实施例中，出于比较目的，所比对序列的长度为参照序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或100％。然后比较对应核苷酸位置处的核苷酸。若第一序列中的位置与第二序列中的对应位置由相同核苷酸占据，则所述分子在所述位置一致。两个序列之间的一致性百分比是所述序列共有的一致性位置数量的函数，其中考虑为优化比对两个序列而需要引入的间隙数量和各间隙的长度。序列的比较和两个序列之间一致性百分比的确定可使用数学算法来完成。例如，两个核苷酸序列之间的一致性百分比可使用诸如以下等阐述于以下文献中的方法来测定：计算分子生物学(ComputationalMolecular Biology)，来斯科A.M.(Lesk，A.M.)编辑，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing：Informatics and Genome Projects)，史密斯D.W.(Smith，D.W.)编辑，学术出版社，纽约，1993；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，冯海因切G.(von Heinje，G.)，学术出版社，1987；序列数据的电脑分析(Computer Analysis ofSequence Data)，部分I，格里芬A.M.(Griffin，A.M.)和格里芬H.G.编辑，休马纳出版社(Humana Press)，新泽西，1994；和序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，格里布斯考M.(Gribskov，M.)和德弗鲁J.(Devereux，J.)编辑，M斯托克顿出版社(M Stockton Press)，纽约，1991；上述各文献是以引用方式并入本文中。例如，两个核苷酸序列之间的一致性百分比可使用迈尔斯(Meyers)和米勒(Miller)(CABIOS，1989，4：11-17)的算法来确定，此算法已纳入比对程序(2.0版)中，其使用PAM120加权残数表，间隙长度罚分为12并且间隙罚分为4。或者，两个核苷酸序列之间的一致性百分比可使用GCG软件包中的间隙程序使用NWSgapdna.CMP矩阵来确定。常用于确定不同序列之间的一致性百分比的方法包括(但不限于)以下文献中揭示的方法：卡里略H.(Carillo，H.)和利普曼D.(Lipman，D.)，SIAM应用数学杂志(SIAM J Applied Math)，48：1073(1988)；其是以引用方式并入本文中。.确定一致性的技术编纂在公众可获取的电脑程序中。确定两个序列之间的同源性的实例性电脑程序包括(但不限于)GCG程序包(德弗鲁J.等人，核酸研究(NucleicAcids Research)，12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(奥特斯楚S.F.(Altschul，S.F.)等人，分子生物学杂志(J.Molec.Biol.)，215：403-410(1990))。
抑制基因的表达：本文所用短语“抑制基因的表达”意指引起基因的表达产物的量降低。表达产物可为自基因转录的RNA(例如mRNA)或自基因所转录mRNA翻译的多肽。通常mRNA水平的降低会导致自其所翻译的多肽的水平降低。表达水平可使用用于测量mRNA或蛋白质的标准技术来测定。
在体外：本文所用术语“在体外”是指发生在人工环境中(例如在试管或反应器中、在细胞培养中、在皮氏培养皿(Petri dish)中等)，而不是发生在有机体(例如动物、植物或微生物)内的事件。
在体内：本文所用术语“在体内”是指发生在有机体(例如动物、植物或微生物)内的事件。
经分离：本文所用术语“经分离”是指已发生以下事件的物质或实体：(1)与至少一些在最初产生时其所缔合的组份分离(在自然界或在实验环境中)，和/或(2)由人工产生、制备和/或制造。经分离物质和/或实体可与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、或更多其最初所缔合的其它组份分离。在一些实施例中，经分离药剂的纯度大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或大于约99％。若本文所用物质实质上不含其它组份，则其是“纯净的”。
微小RNA(miRNA)：本文所用术语“微小RNA”或“miRNA”是指长约21个核苷酸(nt)至23nt的RNAi因子。miRNA的长度可介于18nt-26nt之间。通常，miRNA是单链的。然而，在一些实施例中，miRNA可为至少部分双链。在某些实施例中，miRNA可包含RNA双螺旋(在本文中称作“双螺旋区”)并且可任选地另外包含一至三个单链悬突。在一些实施例中，RNAi因子包含长度介于15bp至29bp的双螺旋区并且任选地另外包含一个或两个单链悬突。miRNA可自两个杂交在一起的RNA分子来形成，或可替代地自包括自杂交部分的单一RNA分子来生成。一般来说，miRNA分子的游离5’末端具有磷酸基，并且游离3’末端具有羟基。miRNA的双螺旋部分通常(但不一定)包含一或多个由一或多个不成对核苷酸组成的凸起。miRNA中的一条链包括与靶RNA杂交的部分。在某些实施例中，miRNA中的一条链并非与靶RNA中的区域精确互补，其意指miRNA与靶RNA的杂交具有一或多处失配。在一些实施例中，miRNA中的一条链与靶RNA中的区域精确互补，其意指miRNA与靶RNA的杂交没有失配。通常，人们认为miRNA可通过抑制靶转录物的翻译来介导对基因表达的抑制。然而，在一些实施例中，miRNA可通过引起靶转录物的降解来介导对基因表达的抑制。
核酸：本文所用术语“核酸”就其最广泛含义来说是指被纳入或可纳入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是通过磷酸二酯键被纳入或可纳入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”是指个别核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施例中，“核酸”是指包含个别核酸残基的寡核苷酸链。本文所用术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，其是指核苷酸聚合物(例如至少两个核苷酸的链)。在一些实施例中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即具有非磷酸二酯骨架的类似物。例如，可认为业内已知的在骨架中具有肽键来代替磷酸二酯键的所谓“肽核酸”在本发明范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有互为简并形式和/或编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可包括内含子。核酸可自天然来源来纯化，可使用重组表达系统来产生并任选地加以纯化，可以化学方式合成等。若适宜(例如在化学合成分子情形下)，核酸可包含核苷类似物，例如具有经化学修饰碱基或糖、骨架修饰等的类似物。除非另外说明，否则以5’至3’方向来表示核酸序列。本文所用术语“核酸片段”是指作为较长核酸序列中的一部分的核酸序列。在多个实施例中，核酸片段包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、或更多个残基。在一些实施例中，核酸是或包含天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-侧氧基腺苷、8-侧氧基鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)；嵌入碱基；经修饰糖(例如2’-氟代核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰磷酸基(例如硫代磷酸基和5’-N-亚磷酰胺键)。在一些实施例中，本发明具体来说涉及“未修饰核酸”，其意指未经化学修饰从而可促进或达成递送的核酸(例如多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。
聚合物：本文所用术语“聚合物”是指包含至少两个彼此缔合的重复结构单元(即“单体”)的任一物质。在一些实施例中，单体彼此共价缔合。在一些实施例中，单体彼此非共价缔合。聚合物可为均聚物或包含两种或更多种单体的共聚物。在序列方面，共聚物可为无规共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物，或包含无规序列、嵌段序列和/或接枝序列的组合。在一些实施例中，嵌段共聚物是二嵌段共聚物。在一些实施例中，嵌段共聚物是三嵌段共聚物。在一些实施例中，聚合物可为直链或具支链聚合物。在一些实施例中，本发明聚合物包含本文所述任一聚合物的掺和物、混合物和/或加合物。通常，本发明聚合物是有机聚合物。在一些实施例中，聚合物具有亲水性。在一些实施例中，聚合物具有疏水性。在一些实施例中，聚合物经一或多个部分和/或官能团修饰。
蛋白质：本文所用术语“蛋白质”是指多肽(即至少两个通过肽键彼此连接的氨基酸的链)。蛋白质可包括非氨基酸部分(例如可为糖蛋白)和/或可以其它方式经处理或修饰。所属领域技术人员可了解，“蛋白质”可为细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或可为其功能性部分。所属领域技术人员另外可了解，蛋白质有时可包括不止一条(例如)通过一或多个二硫键连接或通过其它方式缔合的多肽链。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸、或二者，并且可含有业内已知多种氨基酸修饰或类似物中的任一者。可用修饰包括(例如)添加化学实体，例如碳水化合物基团、磷酸基、法尼基、异法尼基、脂肪酸基、酰胺基、末端乙酰基、偶联用连接体；官能化；或其它修饰(例如α酰胺化)等。在一优选实施例中，修饰肽来获得更稳定的肽(例如体内半衰期更长)。这些修饰可包括肽的环化、纳入D-氨基酸等。所述修饰应该都不显著干扰所述肽的期望生物活性。在某些实施例中，修饰肽以获得生物活性更强的肽。在一些实施例中，多肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸、氨基酸类似物和其组合。术语“肽”通常用于表示长度小于约100个氨基酸的多肽。
RNA干扰(RNAi)：本文所用术语“RNA干扰”或“RNAi”是指由RNA介导的对基因表达的序列特异性抑制和/或靶RNA水平的降低，所述RNA包含与靶RNA实质上互补的部分。通常，实质上互补部分中至少一部分在RNA的双链区域内。在一些实施例中，RNAi可通过选择性细胞内降解RNA来进行。在一些实施例中，RNAi可通过翻译阻遏来进行。
RNAi因子：本文所用术语“RNAi因子”或“RNAi”是指任选地包括一或多个核苷酸类似物或修饰的RNA，其具有可通过RNAi机制介导对基因表达的抑制的分子结构特征。在一些实施例中，RNAi因子通过使转录物降解来介导对基因表达的抑制。在一些实施例中，RNAi因子通过抑制靶转录物的翻译来介导对基因表达的抑制。一般来说，RNAi因子包括与靶RNA实质上互补的部分。在一些实施例中，RNAi因子至少部分为双链。在一些实施例中，RNAi因子为单链。在一些实施例中，实例性RNAi因子可包括siRNA、shRNA和/或miRNA。在一些实施例中，RNAi因子可全部由天然RNA核苷酸(即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶)组成。在一些实施例中，RNAi因子可包括一或多种非天然RNA核苷酸(例如核苷酸类似物、DNA核苷酸等)。可通过引入非天然RNA核酸残基来使RNAi因子对细胞降解的抗性强于RNA。在一些实施例中，术语“RNAi因子”可指可诱导RNAi效应(例如降解靶RNA和/或抑制翻译)的任一RNA、RNA衍生物和/或编码RNA的核酸。在一些实施例中，RNAi因子可包含可用作戴斯酶(Dicer)底物的钝头末端(即无悬突)dsRNA。例如，此一RNAi因子可包含长度≥25个碱基对的钝头末端dsRNA，其可任选地经化学修饰以消除免疫应答。
RNAi诱导剂：本文所用术语“RNAi诱导剂”涵盖可递送RNAi因子、调节和/或修饰RNAi因子活性的任一实体。在一些实施例中，RNAi诱导剂可包括载体(但不包括未经人工修饰的天然存在的分子)，其在细胞内的存在可产生RNAi并使RNAi诱导剂所靶向转录物的表达降低。在一些实施例中，RNAi诱导剂是RNAi诱导载体。在一些实施例中，RNAi诱导剂是包含RNAi因子和一或多种医药上可接受的赋形剂和/或载剂的组合物。在一些实施例中，RNAi诱导剂是“RNAi诱导载体”，其是指在细胞内的存在可导致产生一或多种自杂交或彼此杂交而形成RNAi因子的RNA(例如siRNA、shRNA和/或miRNA)的载体。在各实施例中，此术语涵盖质粒(例如DNA载体(其序列可包含源自病毒的序列元件))、或病毒(但不包括未经人工修饰的天然存在的病毒或质粒)，其在细胞内的存在可导致产生一或多种自杂交或彼此杂交而形成RNAi因子的RNA。一般来说，载体包含可操作连接至表达信号的核酸，从而使得可在细胞中存在所述载体时转录一或多种杂交或自杂交而形成RNAi因子的RNA。因此，载体为细胞内合成一或多种RNA或其前体提供模板。出于诱导RNAi的目的，可认为病毒基因组在细胞中的存在(例如在病毒包膜与细胞膜融合后)足以表明所述病毒在所述细胞中的存在。另外，出于诱导RNAi的目的，若载体是被引入细胞中、进入细胞中、或自亲代细胞继承，则不论其随后在细胞内是否经修饰或处理都可认为所述载体存在于细胞内。若RNAi诱导载体在细胞内的存在可导致产生一或多种彼此杂交或自杂交而形成靶向转录物的RNAi因子的RNA，即若所述载体在细胞内的存在导致产生一或多种靶向转录物的RNAi因子，则可认为所述载体靶向转录物。
短干扰RNA(siRNA)：本文所用术语“短干扰RNA”或“siRNA”是指包含长约19个碱基对(bp)并且任选地另外包含一至三个单链悬突的RNA双螺旋(在本文中称作“双螺旋区”)的RNAi因子。在一些实施例中，RNAi因子包含长度介于15bp至29bp范围内并且任选地另外包含一个或两个单链悬突的双螺旋区。siRNA可自两个杂交在一起的RNA分子来形成，或可替代地自包括自杂交部分的单一RNA分子来生成。一般来说，siRNA分子的游离5’末端具有磷酸基，并且游离3’末端具有羟基。siRNA的双螺旋部分可(但通常并不)包含一或多个由一或多个不成对核苷酸组成的凸起。siRNA中的一条链包括与靶转录物杂交的部分。在某些实施例中，siRNA中的一条链与靶转录物中的区域精确互补，其意指siRNA与靶转录物的杂交无单一失配。在一些实施例中，siRNA与靶转录物的靶向部分之间可存在一或多处失配。在未达成完全互补的一些实施例中，任一失配一般定位于siRNA末端或附近。在一些实施例中，siRNA通过引发靶转录物的降解来介导对基因表达的抑制。
短发夹RNA(shRNA)：本文所用术语“短发夹RNA”或“shRNA”是指包含RNA的RNAi因子，所述RNA具有至少两个互补部分，其经杂交或能杂交而形成长至足以介导RNAi(通常至少长约19bp)的双链(双螺旋)结构；和至少一个单链部分，其长度通常介于约1个核苷酸(nt)与约10nt范围内并形成环。在一些实施例中，shRNA包含长度介于15bp至29bp范围内的双螺旋部分和至少一个长度通常介于1nt与约10nt范围内并形成环的单链部分。双螺旋部分可(但通常并不)包含一或多个由一或多个不成对核苷酸组成的凸起。在一些实施例中，siRNA通过引发靶转录物的降解来介导对基因表达的抑制。人们认为可通过保守的细胞RNAi机构将shRNA处理为siRNA。因此，shRNA可为siRNA的前体。无论如何，与siRNA类似，siRNA一般能抑制靶RNA的表达。
小分子：一般来说，“小分子”是指在实验室中制备的或在自然界中发现的实质上非肽的非寡聚有机化合物。本文所用小分子可指“类天然产物”化合物，然而，术语“小分子”并不限于“类天然产物”化合物。相反，小分子的特征通常在于其含有若干个碳-碳键，并且分子量小于1500g/mol、小于1250g/mol、小于1000g/mol、小于750g/mol、小于500g/mol、或小于250g/mol，但出于本发明目的，此特征并不欲具有限制性。在某些其它实施例中，采用类天然产物小分子。
相似性：本文所用术语“相似性”是指聚合分子之间(例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间)的总体相关性。聚合分子彼此的相似性百分比的计算可以与一致性百分比相同的方式来实施，只是如业内所理解，相似性百分比的计算要考虑到保守取代。
稳定的：本文所用术语“稳定的”在用于蛋白质时是指蛋白质稳定性的任一方面。稳定的修饰蛋白与初始未修饰蛋白相比具有以下特征中的任何一或多者：溶解度更高、对聚集的抗性更强、对变性的抗性更强、对解折叠的抗性更强、对不正确或不期望折叠的抗性更强、复性能力更强、热稳定性更高、在各种环境下(例如pH、盐浓度、存在去污剂、存在变性剂等)的稳定性更高和在非水性环境下的稳定性更高。在某些实施例中，稳定的修饰蛋白表现上述特征中的至少二者。在某些实施例中，稳定的修饰蛋白表现上述特征中的至少三者。所述特征可容许活性蛋白以较高水平产生。例如，与蛋白的未修饰形式相比，经修饰蛋白可以较高水平过表达而不聚集。所述特征亦可容许蛋白质用作治疗剂或研究工具。
个体：本文所用术语“个体”或“患者”是指可出于(例如)实验性、诊断性、预防性和/或治疗性目的投与本发明组合物的任一有机体。典型个体包括动物(例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人类)和/或植物。
实质上：本文所用术语“实质上”是指定性地表示完全或接近完全的范围或程度的目标特征或特性的状况。生物领域技术人员应了解，生物和化学现象很少(如果有)完成和/或进行至完全或达成或避免绝对性结果。因此，本文所用术语“实质上”涵盖许多生物和化学现象中固有的缺少完全性的潜在含义。
患有：“患有”疾病、病症和/或病况的个体已诊断出具有或表现出疾病、病症和/或病况的一或多个症状。
超荷电：本文所用术语“超荷电”是指导致蛋白质中总净电荷增加或减少的任一蛋白质修饰。修饰包括(但不限于)改变氨基酸序列或添加荷电部分(例如羧酸基团、磷酸基、硫酸基、氨基)。超荷电也是指药剂与天然存在的或经修饰荷电蛋白缔合而形成电荷相对于所述单独药剂增加或减少的复合体。
超荷电复合体：本文所定义“超荷电复合体”是指一或多种与经改造或天然存在的超荷电蛋白缔合的药剂组合其共同具有相对于所述单独药剂增加或减少的电荷。
对……易感：“对疾病、病症和/或病况易感”的个体尚未诊断出具有和/或可不表现疾病、病症和/或病况的症状。在一些实施例中，对疾病、病症和/或病况(例如癌症)易感的个体可具有以下特征中的一或多者：(1)与疾病、病症和/或病况的出现相关的遗传突变；(2)与疾病、病症和/或病况的出现相关的遗传多态性；(3)与疾病、病症和/或病况相关的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性提高和/或降低；(4)与疾病、病症和/或病况的出现相关的习惯和/或生活方式；(5)疾病、病症和/或病况的家族史；和(6)暴露于与疾病、病症和/或病况相关的微生物和/或经其感染。在一些实施例中，对疾病、病症和/或病况易感的个体可出现疾病、病症和/或病况。在一些实施例中，对疾病、病症和/或病况易感的个体不会出现疾病、病症和/或病况。
靶向剂或靶向部分：本文所用术语“靶向剂”或“靶向部分”是指与细胞、组织和/或器官的相关组份结合的任一物质。此一组份称作“靶”或“标记物”。靶向剂或靶向部分可为多肽、糖蛋白、核酸、小分子、碳水化合物、脂质等。在一些实施例中，靶向剂或靶向部分是抗体或其特征性部分。在一些实施例中，靶向剂或靶向部分是受体或其特征性部分。在一些实施例中，靶向剂或靶向部分是配体或其特征性部分。在一些实施例中，靶向剂或靶向部分是与细胞类型特异性标记物结合的核酸靶向剂(例如适体)。在一些实施例中，靶向剂或靶向部分是有机小分子。在一些实施例中，靶向剂或靶向部分是无机小分子。
靶基因：本文所用术语“靶基因”是指表达可由RNAi或其它药剂改变的任一基因。
靶转录物：本文所用术语“靶转录物”是指自靶基因转录的任一mRNA。
治疗有效量：本文所用术语“治疗有效量”意指欲递送药剂(例如核酸、药物、治疗剂、诊断性药剂、预防性药剂等)在投与患有疾病、病症和/或病况或对其易感的个体时足以治疗所述疾病、病症和/或病况、改良其症状、对其进行诊断、对其进行预防和/或延迟其发作的量。
治疗：本文所用术语“治疗”是指部分或完全缓和、改善、改良、减轻特定疾病、病症和/或病况的一或多种症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重性和/或降低其发病率。例如，“治疗”癌症可意指抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。出于降低出现疾病、病症和/或病况相关病状的风险的目的，可对不表现所述疾病、病症和/或病况的体征的个体和/或对仅表现所述疾病、病症和/或病况的早期体征的个体实施治疗。在一些实施例中，治疗包含将与治疗活性核酸缔合的超荷电蛋白递送至有需要的个体。
未修饰的：本文所用“未修饰的”是指在超荷电或在复合体中与经改造或天然存在的超荷电蛋白缔合之前的蛋白质或药剂。
载体：本文所用“载体”是指可运输其已连接核酸的另一核酸分子。在一些实施例中，载体可在宿主细胞(例如真核和/或原核细胞)中使其所连接核酸达成染色体外复制和/或表达。能引导可操作连接的基因表达的载体在本文中称作“表达载体”。
本发明提供通过使蛋白质自身超荷电或通过缔合蛋白质或其它药剂(例如肽、蛋白质、小分子)与超荷电蛋白来促进将蛋白质或其它药剂递送至细胞的组合物、制剂、系统和相关方法。所述系统和方法一般包含使用超荷电蛋白。在一些实施例中，将超荷电蛋白自身递送至细胞细胞内部以(例如)引起对其所穿透细胞的生物效应而获得治疗益处。也可使用超荷电蛋白质来递送其它药剂。例如，可使超荷正电蛋白与具有负电荷的药剂(例如核酸(其通常具有净负电荷)或带负电的肽或蛋白质)通过静电相互作用缔合而形成复合体。可使超荷负电蛋白与具有正电荷的药剂缔合。也可使欲递送药剂与超荷电蛋白通过共价键或其它非共价相互作用缔合。在一些实施例中，所述组合物、制剂、系统和方法涉及改变蛋白质的一级序列以使所述蛋白质“超荷电”(例如生成超荷正电蛋白)。在某些实施例中，本发明系统使用天然存在的蛋白质来形成复合体。在某些实施例中，本发明复合体包含超荷电蛋白和一或多种欲递送药剂(例如核酸、蛋白质、肽、小分子)。在细胞摄取的一个实例中，已发现超荷电蛋白可被细胞胞吞。将超荷电蛋白或与欲递送药剂混合形成蛋白质/药剂复合体的超荷电蛋白有效转染至细胞中。机制研究表明，这些复合体的胞吞作用涉及硫酸化细胞表面蛋白聚糖但不涉及网格蛋白或小窝蛋白。在一些实施例中，超荷电蛋白或包含超荷电蛋白和一或多种欲递送药剂的复合体可用作治疗剂、诊断性药剂、或研究工具。在一些实施例中，药剂和/或超荷电蛋白可具有治疗活性。在一些实施例中，使用超荷电蛋白或复合体来调节细胞中基因的表达。在一些实施例中，使用超荷电蛋白或复合体来调节细胞中的生物途径(例如信号转导途径、代谢途径)。在一些实施例中，使用超荷电蛋白或复合体来抑制细胞中酶的活性。在一些实施例中，将本发明超荷电蛋白或复合体和/或其医药组合物投与有需要的个体。在一些实施例中，在可将药剂有效转染至细胞(例如人类细胞、哺乳动物细胞、T细胞、神经元、干细胞、祖细胞、血细胞、成纤维细胞、上皮细胞等)中的条件下使本发明超荷电蛋白或复合体和/或其组合物与细胞接触。在一些实施例中，将超荷电蛋白或复合体递送至细胞涉及将超荷电蛋白或包含与治疗剂缔合的超荷电蛋白的复合体投与有需要的个体。
超荷电蛋白
超荷电蛋白可通过将蛋白质表面上的非保守氨基酸改变为极性更强或带有更多电荷的氨基酸残基来产生。欲改变的氨基酸残基可为疏水性残基、亲水性残基、带电荷残基、或其组合。超荷电蛋白也可通过使荷电部分附接至蛋白质上以使所述蛋白质超荷电来产生。超荷电蛋白通常对聚集具有抗性，再折叠能力提高，可抵抗错误折叠，溶解度提高，并且一般在众多种条件下(包括变性条件，例如加热或存在去污剂)更稳定。
可使用本发明系统修饰任一蛋白质来产生超荷电蛋白。可修饰天然以及非天然蛋白质(例如改造蛋白质)。可修饰蛋白质的实例包括受体、膜结合蛋白、跨膜蛋白、酶、转录因子、细胞外蛋白、治疗性蛋白、细胞因子、信使蛋白、DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、信号转导中所涉及蛋白、结构蛋白、细胞质蛋白、核蛋白、疏水性蛋白、亲水性蛋白等。欲修饰蛋白可源自任一种植物、动物和/或微生物。在某些实施例中，蛋白质是哺乳动物蛋白。在某些实施例中，蛋白质是人类蛋白质。在某些实施例中，蛋白质源自研究中常用的有机体。例如，欲修饰蛋白可来自灵长类动物(例如猿、猴子)、啮齿动物(例如兔、仓鼠、沙鼠)、猪、狗、猫、鱼(例如斑马鱼(Danio rerio))、线虫(例如秀丽隐杆线虫(C.elegans))、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae))、或细菌(例如大肠杆菌)。在某些实施例中，蛋白质无免疫原性。在某些实施例中，蛋白质无抗原性。在某些实施例中，蛋白质不具有固有生物活性或已经修饰而不具有生物活性。在某些实施例中，蛋白质是基于其靶向能力来选择。在某些实施例中，蛋白质是绿色荧光蛋白。
在一些实施例中，欲修饰蛋白质是结构已通过(例如)NMR或X射线晶体学进行表征的蛋白质。在一些实施例中，欲修饰蛋白质是结构与生化活性(例如酶促活性、蛋白质间相互作用等)有关和/或相关的蛋白质。在一些实施例中，所述信息引导对欲修饰或不修饰氨基酸残基的选择(例如，从而可维持生物功能或可降低或消除生物活性)。在某些实施例中，降低或消除蛋白质的固有生物活性以降低有害和/或不期望效应的风险。
在一些实施例中，欲修饰蛋白质是可用于将核酸或其它药剂递送至细胞的蛋白质。在一些实施例中，欲修饰蛋白质是成像剂、标记剂、诊断剂、预防剂、或治疗剂。在一些实施例中，欲修饰蛋白质是可用于将药剂(例如核酸)递送至特定细胞的蛋白质。在一些实施例中，欲修饰蛋白质是具有期望生物活性的蛋白质。在一些实施例中，欲修饰蛋白质是具有期望靶向活性的蛋白质。在一些实施例中，鉴别目标蛋白的非保守表面残基并且用在生理pH下是亲水性、极性和/或带电荷的残基替代至少一些所述残基。在一些实施例中，鉴别目标蛋白的非保守表面残基并且用在生理pH下带正电的残基来替代至少一些所述残基。
使用业内已知的任何方法来鉴别欲修饰蛋白质的表面残基。在某些实施例中，通过对蛋白质进行电脑建模来鉴别表面残基。在某些实施例中，已知和/或已确定蛋白质的三维结构，并且通过使蛋白质结构可视化来鉴别表面残基。在一些实施例中，使用电脑软件来预测表面残基。在某些特定实施例中，使用每个侧链原子的平均相邻原子数(Average Neighbor Atoms per Sidechain Atom)(AvNAPSA)值来预测表面暴露。AvNAPSA是表面暴露的自动化量度，其已作为电脑程序来实践。低AvNAPSA数值表示表面暴露残基，而高数值表示位于蛋白质内部的残基。在某些实施例中，使用软件来预测蛋白质的二级结构和/或三级结构，并且基于此预测来鉴别表面残基。在一些实施例中，对表面残基的预测是基于残基的疏水性和亲水性以及其在蛋白质一级序列中的聚簇。除了基于电脑的方法，蛋白质的表面残基也可使用各种生化技术来鉴别，例如蛋白酶裂解、表面修饰等。
任选地，随后确定表面残基中的保守残基或对蛋白质的功能具有重要意义的残基。在不需要保留蛋白质的潜在生物活性时，确定保守残基的步骤是可选的。对保守残基的鉴别可使用业内已知的任一方法来确定。在某些实施例中，保守残基是通过比对目标蛋白与相关蛋白的一级序列来鉴别的。所述相关蛋白可来自相同蛋白质家族。例如，若蛋白质是免疫球蛋白，则可使用其它免疫球蛋白序列。相关蛋白也可为来自不同物种的相同蛋白。例如，保守残基可通过比对来自不同物种的相同蛋白的序列来鉴别。在另一实例中，可比对具有类似功能或生物活性的蛋白质。优选地，使用2、3、4、5、6、7、8、9或10个不同序列来确定蛋白质中的保守氨基酸。在某些实施例中，若超过50％、超过60％、超过70％、超过75％、超过80％、超过90％、或超过95％的序列在特定位置具有相同氨基酸，则可将所述残基视为保守残基。在其它实施例中，若超过50％、超过60％、超过70％、超过75％、超过80％、超过90％、或超过95％的序列在特定位置具有相同或相似氨基酸(例如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；甘氨酸和丙氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；或天冬氨酸和谷氨酸)，则可将所述残基视作保守残基。许多软件包可用于比对和比较本文所述蛋白质序列。如所属领域技术人员可了解，可首先确定保守残基或可首先确定表面残基。顺序没有影响。在某些实施例中，电脑软件包可同时确定表面残基和保守残基。也可通过诱变蛋白质来鉴别蛋白质中的重要残基。例如，可使用蛋白质的丙氨酸扫描来确定蛋白质中的重要氨基酸残基。在一些实施例中，可使用定点诱变。在某些实施例中，保留蛋白质的原始生物活性并不重要，并且因此不实施鉴别保守残基并在超荷电蛋白保留其的步骤。
将每个表面残基鉴别为疏水性或亲水性。在某些实施例中，评定残基的疏水性分数。例如，可评定每个表面残基的辛醇/水logP值。还可使用其它疏水性参数。氨基酸的所述量表已论述于以下文献中：扎尼(Janin)，1979，自然，277：491；沃尔芬登(Wolfenden)等人，1981，生物化学(Biochemistry)，20：849；凯特(Kyte)等人，1982，分子生物学杂志，157：105；罗斯(Rose)等人，1985，科学，229：834；科尼特(Cornette)等人，1987，分子生物学杂志，195：659；查顿(Charton)和查顿，1982，理论生物学杂志(J.Theor.Biol)，99：629；每篇所述文献都是以引用方式并入。本发明方法中可使用这些疏水性参数中的任一者来确定欲修饰残基。在某些实施例中，鉴别亲水性或带电荷残基进行修饰。
然后选择至少一个所鉴别表面残基进行修饰。在某些实施例中，选择疏水性残基进行修饰。在其它实施例中，选择亲水性和/或带电荷残基进行修饰。在某些实施例中，选择不止一个残基进行修饰。在某些实施例中，选择1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个所鉴别残基进行修饰。在某些实施例中，选择超过10个、超过15个、超过20个、或超过25个残基进行修饰。如所属领域技术人员可了解，蛋白质越大，需要修饰的残基越多。同样，蛋白质疏水性越强或越容易聚集或沉淀，需要修饰的残基越多。在某些实施例中，产生并测试多个蛋白质变体(各自具有不同修饰)以确定在将核酸递送至细胞、稳定性、生物相容性和/或生物活性方面最佳的变体。
在某些实施例中，使所选择进行修饰的残基突变为亲水性更强的残基(包括带电荷残基)。通常，使残基突变为亲水性更强的天然氨基酸。在某些实施例中，使残基突变为在生理pH下带电荷的氨基酸。例如，可使残基变为精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸或赖氨酸。在某些实施例中，使所有欲修饰残基都变为相同的不同残基。例如，使所有所选择残基都变为赖氨酸残基。在其它实施例中，使所选择残基变为不同残基；然而，所有最终残基在生理pH下都可带正电或带负电。在某些实施例中，为产生带负电的蛋白质，使所有欲突变残基都转化为谷氨酸和/或天冬氨酸残基。在某些实施例中，为产生带正电的蛋白质，使所有欲突变残基都转化为赖氨酸残基。例如，所有所选择欲修饰残基为天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸和/或精氨酸，并且使所述残基突变为天冬氨酸或谷氨酸残基。在另一实例中，所有所选择欲修饰残基为天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和/或谷氨酰胺，且使所述残基突变为赖氨酸。此方法使得可最大程度地改变蛋白质上的净电荷。
在一些实施例中，对蛋白质的修饰可使经修饰蛋白质上的净电荷与未修饰蛋白保持相同。在一些实施例中，可修饰蛋白质以减少蛋白质上的总净电荷同时增加表面上的带电荷残基总数。在某些实施例中，使理论净电荷增加至少+1、至少+2、至少+3、至少+4、至少+5、至少+10、至少+15、至少+20、至少+25、至少+30、至少+35、或至少+40。在某些实施例中，使理论净电荷减少至少-1、至少-2、至少-3、至少-4、至少-5、至少-10、至少-15、至少-20、至少-25、至少-30、至少-35、或至少-40。在某些实施例中，使所选氨基酸变为非离子型极性残基(例如半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺)。
在某些实施例中，使突变为带电荷氨基酸残基的氨基酸残基彼此相隔至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、或至少25个氨基酸残基。在某些实施例中，使突变为带正电的氨基酸残基(例如赖氨酸)的氨基酸残基彼此相隔至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、或至少25个氨基酸残基。通常，这些插入序列是基于所超荷电蛋白质的原始氨基酸。在某些实施例中，在超荷电蛋白的一行中仅容许有两个带电荷氨基酸。在某些实施例中，在超荷电蛋白的一行中仅容许有三个或更少带电荷氨基酸。在某些实施例中，在超荷电蛋白的一行中仅容许有四个或更少带电荷氨基酸。在某些实施例中，在超荷电蛋白的一行中仅容许有五个或更少带电荷氨基酸。
在某些实施例中，表面暴露的环、螺旋、转角或其它二级结构可仅含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个带电荷残基。通常认为使带电荷残基分布遍及蛋白质可使蛋白质更稳定。在某些实施例中，在一级序列中每15-20个氨基酸仅有1、2、3、4或5个残基突变为带电荷氨基酸(例如赖氨酸)。在某些实施例中，在一级序列中每10个氨基酸平均仅有1、2、3、4或5个残基突变为带电荷氨基酸(例如赖氨酸)。在某些实施例中，在一级序列中每15个氨基酸平均仅有1、2、3、4或5个残基突变为带电荷氨基酸(例如赖氨酸)。在某些实施例中，在一级序列中每20个氨基酸平均仅有1、2、3、4或5个残基突变为带电荷氨基酸(例如赖氨酸)。在某些实施例中，在一级序列中每25个氨基酸平均仅有1、2、3、4或5个残基突变为带电荷氨基酸(例如赖氨酸)。在某些实施例中，在一级序列中每30个氨基酸平均仅有1、2、3、4或5个残基突变为带电荷氨基酸(例如赖氨酸)。
在某些实施例中，超荷电蛋白中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的突变带电荷氨基酸残基是溶剂暴露的。在某些实施例中，超荷电蛋白中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的突变带电荷氨基酸残基位于蛋白质表面上。在某些实施例中，少于5％、少于10％、少于20％、少于30％、少于40％、少于50％的突变带电荷氨基酸残基不是溶剂暴露的。在某些实施例中，少于5％、少于10％、少于20％、少于30％、少于40％、少于50％的突变带电荷氨基酸残基是内部氨基酸残基。
在一些实施例中，使用一或多种预定标准来选择进行修饰的氨基酸。例如，为生成超荷正电蛋白，可使用AvNAPSA值来鉴别AvNAPSA值低于某一阈值的天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和/或谷氨酰胺残基，并且所述残基中的一或多者(例如所有)可变为赖氨酸。在一些实施例中，为生成超荷正电蛋白，使用AvNAPSA来鉴别AvNAPSA低于某一阈值的天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和/或谷氨酰胺残基，并且所述残基中的一或多者(例如所有)变为精氨酸。在一些实施例中，为生成超荷负电蛋白，使用AvNAPSA来鉴别AvNAPSA值低于某一阈值的天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸和/或精氨酸残基，并且所述残基中的一或多者(例如所有)变为天冬氨酸残基。在一些实施例中，为生成超荷负电蛋白，使用AvNAPSA来鉴别AvNAPSA值低于某一阈值的天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸和/或精氨酸残基，并且所述残基中的一或多者(例如所有)变为谷氨酸残基。在一些实施例中，某一阈值为40或更低。在一些实施例中，某一阈值为35或更低。在一些实施例中，某一阈值为30或更低。在一些实施例中，某一阈值为25或更低。在一些实施例中，某一阈值为20或更低。在一些实施例中，某一阈值为19或更低、18或更低、17或更低、16或更低、15或更低、14或更低、13或更低、12或更低、11或更低、10或更低、9或更低、8或更低、7或更低、6或更低、5或更低、4或更低、3或更低、2或更低、或1或更低。在一些实施例中，某一阈值为0。
在一些实施例中，通过相邻残基数来鉴别溶剂暴露残基。一般来说，相邻残基较多的残基的溶剂暴露性低于相邻残基较少的残基。在一些实施例中，溶剂暴露残基是通过半球暴露来鉴别，其考虑氨基酸侧链的方向(哈默尔瑞克(Hamelryck)，2005，蛋白质(Proteins)，59：8-48；其是以引用方式并入本文中)。在一些实施例中，溶剂暴露残基是通过计算各残基的溶剂暴露的表面面积、可及表面面积和/或溶剂排斥表面来鉴别。例如，参见李(Lee)等人，分子生物学杂志.55(3)：379-400，1971；理查德(Richmond)，分子生物学杂志.178：63-89，1984；上述各文献是以引用方式并入本文中。
蛋白质中的期望修饰或突变可使用任一业内已知技术来完成。用于将所述改变引入蛋白质序列中的重组DNA技术为业内所熟知。在某些实施例中，通过定点诱变编码蛋白质的多核苷酸来达成修饰。引入突变的其它技术论述于以下文献中：分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，桑布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和曼尼阿迪斯(Maniatis)编辑(冷泉港实验室出版社：1989)；论文酶学方法(Methods in Enzymology)(学术出版社公司，纽约)；奥苏伯尔(Ausubel)等人，当前分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)(约翰威利父子公司(JohnWiley&Sons，Inc.)，纽约，1999)；上述各文献是以引用方式并入本文中。表达并测试经修饰蛋白。在某些实施例中，制备一系列变体，并测试每个变体来确定其生物活性和其稳定性。所选择用于后续应用的变体可为最稳定者、活性最强者、或具有活性与稳定性的最大总体组合者。在制备第一组变体后，可根据自第一组变体了解到的信息制备另一组变体。通常使用业内已知的重组技术来产生并过表达变体。
可进一步修饰超荷电蛋白。可使用所属领域技术人员已知的技术来修饰包括超荷电蛋白在内的蛋白质。例如，可以化学方式或生物方式来修饰超荷电蛋白。可在一级序列中添加、删除或改变一或多个氨基酸。例如，可将多组氨酸标签或其它标签添加至超荷电蛋白以帮助蛋白质纯化。可将其它肽或蛋白质添加至超荷电蛋白上以改变蛋白质的生物、生化和/或生物物理特性。例如，可将溶内体性肽添加至超荷电蛋白的一级序列中，或可将靶向肽添加至超荷电蛋白的一级序列中。超荷电蛋白的其它修饰包括(但不限于)翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化、酰基化、脂质化、法尼基化、乙酰化、蛋白酶解等)。在某些实施例中，可修饰超荷电蛋白以降低其免疫原性。在某些实施例中，可修饰超荷电蛋白以增强其将核酸递送至细胞中的能力。在某些实施例中，超荷电蛋白可与聚合物偶联。例如，可通过将蛋白质偶联至聚乙二醇(PEG)聚合物来使蛋白质聚乙二醇化。所属领域技术人员可设想多种修饰超荷电蛋白而不背离本发明范围的方式。本文所述方法容许通过在欲超荷电的蛋白质的蛋白质序列中作出改变来使蛋白质超荷电。可使用其它方法来产生超荷电蛋白而不修饰蛋白质序列。例如，可将改变电荷的部分附接至蛋白质(例如通过化学或酶促反应)以提供表面电荷从而达成超荷电。在某些实施例中，使用肖(Shaw)等人，蛋白质科学(Protein Science)17：1446，2008中所述修饰蛋白质的方法来使蛋白质超荷电。
国际PCT专利申请案(PCT/US07/70254，在2007年6月1日申请并且作为WO2007/143574在2007年12月13日公开，标题为“蛋白质表面重建”；其是以引用方式并入本文中)和美国临时专利申请案(在2006年6月2日申请的U.S.S.N.60/810,364和在2006年8月9日申请的U.S.S.N.60/836,607；两个申请案的标题都是“蛋白质表面重建”；并且所述两个文献都是以引用方式并入本文中)阐述若干种不同蛋白质的变体的设计和产生。已显示这些变体更稳定并且可保留其荧光性。例如，来自维多利亚多管发光水母的绿色荧光蛋白(GFP)阐述于基因库(GenBank)中(登录号P42212)，其是以引用方式并入本文中。此野生型GFP的氨基酸序列如下所述：
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(SEQ IDNO：1)
野生型GFP的理论净电荷为-7。已产生理论净电荷为-29、-30、-25、+15、+25、+36、+48和+49的变体。甚至在将+36GFP加热至95℃后，变体蛋白仍然100％可溶并且所述蛋白的荧光性保持≥70％。已发现+15、+25和+36GFP尤其可用于将核酸转染至细胞中。具体来说，已发现+36GFP具有高细胞穿透性并且能将核酸有效递送至多种哺乳动物细胞中，包括对使用其它转染方法具有抗性的细胞系。因此，人们认为GFP或其它净电荷为至少+25、至少+30、至少+35、或至少+40的蛋白质尤其可用于将核酸转染至细胞中。
已产生GFP变体的氨基酸序列包括：
GFP-NEG7
MGHHHHHHGGASKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(SEQ ID NO：2)
GFP-NEG25
MGHHHHHHGGASKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDDHYLSTESALSKDPNEDRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK(SEQ ID NO：3)
GFP-NEG29
MGHHHHHHGGASKGEELFDGEVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDDHYLSTESALSKDPNEDRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK(SEQ ID NO：4)
GFP-NEG30
MGHHHHHHGGASKGEELFDGVVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPTLVTTLTYGVQCFSDYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDDHYLSTESALSKDPNEDRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK(SEQ ID NO：5)
GFP-POS15
MGHHHHHHGGASKGERLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKKDGTYKTRAEVKFEGRTLVNRIELKGRDFKEKGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKRKNGIKANFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSALSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(SEQ ID NO：6)
GFP-POS25
MGHHHHHHGGASKGERLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGTYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHNVYITADKRKNGIKANFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSALSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(SEQ ID NO：XX
GFP-POS36
MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK(SEQ ID NO：7)
GFP-POS42
MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK(SEQ ID NO：8)
GFP-POS48
MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK(SEQ ID NO：9)
GFP-POS49
MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLKEFVTAAGIKIGRKERYK(SEQ ID NO：10)
为促进超荷电蛋白或所递送药剂(例如核酸)自内体逸出，可使超荷电蛋白与已知可增强内体降解或内体溶解的蛋白质、肽或其它实体融合或缔合。在某些实施例中，所述肽是血凝素2(HA2)肽，已知其可增强内体降解。在某些特定实施例中，使HA2肽与超荷电GFP(例如+36GFP)融合。在某些特定实施例中，所融合蛋白具有以下序列：
+36GFP-HA2
MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYKGSAGSAAGSGEFGLFGAIAGFIENGWEGMIDG(SEQ IDNO：XX)
在某些实施例中，溶内体性肽是蜂毒肽(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ，SEQ ID NO：XX)(迈尔(Meyer)等人，JACS 130(11)：3272-3273，2008；其是以引用方式并入本文中)。在某些实施例中，通过一个、两个、三个、四个或五个氨基酸的取代、缺失和/或添加来修饰蜂毒肽。在某些实施例中，蜂毒肽具有以下序列：CIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO：XX)。在某些特定实施例中，使蜂毒肽与超荷电GFP(例如+36GFP)融合。
在某些实施例中，溶内体性肽是穿透肽(RQIKIWFQNRRMKWKK-酰胺，SEQ IDNO：XX)、牛PrP(1-30)肽(MVKSKIGSWILVLFVAMWSDVGLCKKRPKP-酰胺，SEQID NO：XX)、MPGΔNLs肽(其由于K-＞S取代而缺少功能性核定位序列)(GALFLGWLGAAGSTMGAPKSKRKV，SEQ ID NO：XX)、TP-10肽(AGYLLGKINLKALAALAKKIL-酰胺，SEQ ID NO：XX)和/或EB1肽(LIRLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK-酰胺，SEQ ID NO：XX)(伦德伯格(Lundberg)等人，2007，美国实验生物学学会联合会杂志(FASEB J.)21：2664；其是以引用方式并入本文中)。在某些实施例中，通过一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失和/或添加来修饰穿透肽、PrP(1-30)、MPG、TP-10和/或EB1肽。在某些特定实施例中，使PrP(1-30)、MPG、TP-10和/或EB1肽与超荷电GFP(例如+36GFP)融合。
也可使其它肽或蛋白质与超荷电蛋白融合。例如，可使靶向肽与超荷电蛋白融合以选择性地将超荷电蛋白或缔合药剂(例如核酸)递送至特定细胞类型中。也可使用增强核酸转染的肽或蛋白质。在某些实施例中，与超荷电蛋白融合的肽是肽类激素。在某些实施例中，与超荷电蛋白融合的肽是肽类配体。
如所属领域技术人员可了解，也可认为本发明范围包括同源蛋白。例如，根据本发明可采用包括如下区段的任一蛋白质：其具有约20个、约30个、约40个、约50个、或约100个氨基酸并且与上述任一序列约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、或约100％一致。或者或另外，根据本发明可采用添加和缺失变体。在某些实施例中，根据本发明可采用具有如上述任一序列中所示突变残基的任一GFP。在某些实施例中，欲根据本发明采用的蛋白质序列包括2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或更多个如上述任一序列中所示的突变。
可超荷电并且可用于(例如)递送药剂(例如核酸)的其它蛋白质包括其它GFP型荧光蛋白。在某些实施例中，超荷电蛋白是蓝色荧光蛋白的超荷电形式。在某些实施例中，超荷电蛋白是青色荧光蛋白的超荷电形式。在某些实施例中，超荷电蛋白是黄色荧光蛋白的超荷电形式。实例性荧光蛋白包括(但不限于)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、AcGFP、TurboGFP、Emerald、Azami Green、ZsGreen、EBFP、Sapphire、T-Sapphire、ECFP、mCFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl、Midori-Ishi Cyan、mTFP1(Teal)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、Topaz、Venus、mCitrine、YPet、PhiYFP、ZsYellowl、mBanana、Kusabira Orange、mOrange、dTomato、dTomato-Tandem、DsRed、DsRed2、DsRed-Express(T1)、DsRed-单体、mTangerine、mStrawberry、AsRed2、mRFP1、JRed、mCherry、HcRedl、mRaspberry、HcRedl、HcRed-Tandem、mPlum和AQ 143。
可超荷电并且可用于(例如)递送药剂(例如核酸)的其它蛋白质包括组蛋白组份或组蛋白样蛋白。在某些实施例中，组蛋白组份是组蛋白连接体H1。在某些实施例中，组蛋白组份是核心组蛋白H2A。在某些实施例中，组蛋白组份是核心组蛋白H2B。在某些实施例中，组蛋白组份是核心组蛋白H3。在某些实施例中，组蛋白组份是核心组蛋白H4。在某些实施例中，所述蛋白质是古细菌组蛋白样蛋白HPhA。在某些实施例中，所述蛋白是细菌组蛋白样蛋白TmHU。
可超荷电并且可用于(例如)递送药剂(例如核酸)的其它蛋白质包括高迁移率蛋白(HMG)。在某些实施例中，所述蛋白质是HMG1。在某些实施例中，所述蛋白质是HMG17。在某些实施例中，所述蛋白质是HMG1-2。
可超荷电并且可用于(例如)递送药剂(例如核酸)的其它蛋白质包括抗癌药，例如抗细胞凋亡剂、细胞周期调节剂等。
可超荷电并且可用于(例如)递送药剂(例如核酸)的其它蛋白质是酶，包括(但不限于)淀粉酶、果胶酶、水解酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、脂肪酶、植酸酶等。在一些实施例中，可超荷电并且可用于(例如)递送药剂(例如核酸)的蛋白质是溶酶体酶，包括(但不限于)阿糖脑苷酶、伊米苷酶(imiglucerase)、阿加糖酶β(agalsidasebeta)、α-1-艾杜糖醛酸酶、酸性α-葡萄糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶等(王(Wang)等人，2008，NBT，26：901-08；其是以引用方式并入本文中)。
可超荷电并且可用于(例如)递送药剂(例如核酸)的其它蛋白质展示于表1中。表1中所列示的一些蛋白质包括一系列可经修饰以使所述蛋白质超荷电的残基。所述残基的一致性是通过下载目标蛋白的PDB文档以计算方式来确定。通过追溯avNapsa值来对pdb文档中的残基进行分类，并且建议使前15个ASP、GLU、ASN或GLN残基突变为LYS。
按照惯例，PDB文档根据氨基酸在野生型蛋白质中的顺序对其进行编号。然而，PDB文档不能含有全长野生型蛋白质。输入蛋白质序列是PDB中所包括的氨基酸序列。建议突变提供氨基酸在全长野生型蛋白质中的编号以及在输入蛋白质序列中的编号。建议突变是以以下模式来提供：野生型残基链：残基在野生型蛋白质链中的编号(残基在输入链中的编号)建议残基。野生型残基是指野生型蛋白质中的氨基酸属性。链是指具有指定突变的肽链的名称。残基在野生型蛋白质中的编号是指氨基酸在全长野生型蛋白质中的具有指定突变的指定蛋白质链中的编号。残基在输入链中的编号是指氨基酸在所分析PDB包括的指定蛋白质链中的编号。
表1.可超荷电的实例性蛋白质
表2.可超荷电的实例性转录因子
根据其调节功能来分类：
I.组成型活性-在所有时间于所有细胞中存在-通用转录因子、Sp1、NF1、CCAAT
II.条件型活性-需要活化
II.A发育型(细胞特异性)-表达受到严密控制，但在表达后就不需要额外活化-GATA、HNF、PIT-1、MyoD、Myf5、Hox、翼状螺旋
II.B信号依赖型-活化需要外部信号
II.B.1细胞外配体依赖型-核受体
II.B.2细胞内配体依赖型-由细胞内小分子来活化-SREBP、p53、孤儿核受体
II.B.3细胞膜受体依赖型-第二信使信号转导级联引起转录因子磷酸化
II.B.3.a驻留核因子-不论活化状态如何都驻留在细胞核中-CREB、AP-1、Mef2
II.B.3.b潜在细胞质因子-驻留在细胞质中的无活性形式，但在
活化后易位至核中-STAT、R-SMAD、NF-kB、Notch、TUBBY、NFAT
基于序列相似性并且由此基于其DNA结合结构域的三级结构来分类：
1超类：碱性结构域(碱性螺旋-环-螺旋)
1.1类别：亮氨酸拉链因子(bZIP)
1.1.1家族：AP-1(样)组份；包括(c-Fos/c-Jun)
1.1.2家族：CREB
1.1.3家族：C/EBP样因子
1.1.4家族：bZIP/PAR
1.1.5家族：植物G-盒结合因子
1.1.6家族：仅ZIP
1.2类别：螺旋-环-螺旋因子(bHLH)
1.2.1家族：遍在(A类)因子
1.2.2家族：肌性转录因子(MyoD)
1.2.3家族：无刚毛鳞甲(Achaete-Scute)
1.2.4家族：Tal/Twist/Atonal/Hen
1.3类别：螺旋-环-螺旋/亮氨酸拉链因子(bHLH-ZIP)
1.3.1家族：遍在bHLH-ZIP因子；包括USF(USF1、USF2)；SREBP(SREBP)
1.3.2家族：细胞周期控制因子；包括c-Myc
1.4类别：NF-1
1.4.1家族：NF-1(A、B、C、X)
1.5类别：RF-X
1.5.1家族：RF-X(1、2、3、4、5、ANK)
1.6类别：bHSH
2超类：锌配位DNA-结合结构域
2.1类别：核受体型Cys4锌指
2.1.1家族：类固醇激素受体
2.1.2家族：甲状腺激素受体样因子
2.2类别：多种Cys4锌指
2.2.1家族：GATA因子
2.3类别：Cys2His2锌指结构域
2.3.1家族：遍在因子，包括TFIIIA、Sp1
2.3.2家族：发育/细胞周期调节剂；包括Krüppel
2.3.4家族：具有NF-6B样结合特性的大量因子
2.4类别：Cys6半胱氨酸-锌簇
2.5类别：具有交替组成的锌指
3超类：螺旋-转角-螺旋
3.1类别：同源结构域
3.1.1家族：仅同源结构域；包括Ubx
3.1.2家族：POU结构域因子；包括Oct
3.1.3家族：具有LIM区的同源结构域
3.1.4家族：具有锌指基元的同源结构域
3.2类别：配对盒
3.2.1家族：具有同源结构域的配对盒
3.2.2家族：仅配对结构域
3.3类别：叉头/翼状螺旋
3.3.1家族：发育调节剂；包括叉头
3.3.2家族：组织特异性调节剂
3.3.3家族：细胞周期控制因子
3.3.0家族：其它调节剂
3.4类别：热激因子
3.4.1家族：HSF
3.5类别：色氨酸簇
3.5.1家族：Myb
3.5.2家族：Ets型
3.5.3家族：干扰素调节因子
3.6类别：TEA(转录促进因子)结构域
3.6.1家族：TEA(TEAD1、TEAD2、TEAD3、TEAD4)
4超类：具有小沟接触的β-支架因子
4.1类别：RHR(Rel同源区)
4.1.1家族：Rel/锚蛋白；NF-κB
4.1.2家族：仅锚蛋白
4.1.3家族：NFAT(活化T细胞的核因子)(NFATC1、NFATC2、NFATC3)
4.2类别：STAT
4.2.1家族：STAT
4.3类别：p53
4.3.1家族：p53
4.4类别：MADS盒
4.4.1家族：分化调节剂；包括(Mef2)
4.4.2家族：外部信号的反应因子，SRF(血清反应因子)(SRF)
4.5类别：β-桶α-螺旋转录因子
4.6类别：TATA结合蛋白
4.6.1家族：TBP
4.7.1家族：SOX基因，SRY
4.7.2家族：TCF-1(TCF1)
4.7.3家族：HMG2相关，SSRP1
4.7.5家族：MATA
4.8类别：异聚CCAAT因子
4.8.1家族：异聚CCAAT因子
4.9类别：粒状头
4.9.1家族：粒状头
4.10类别：冷激结构域因子
4.10.1家族：csd
4.11类别：鲁特(Runt)
4.11.1家族：鲁特
0超类：其它转录因子
0.1类别：铜拳蛋白(Copper fist protein)
0.2类别：HMGI(Y)(HMGA1)
0.2.1家族：HMGI(Y)
0.3类别：袋状结构域
0.4类别：ElA样因子
0.5类别：AP2/EREBP相关因子
0.5.1家族：AP2
0.5.2家族：EREBP
0.5.3超家族：AP2/B3
0.5.3.1家族：ARF
0.5.3.2家族：ABI
0.5.3.3家族：RAV
在某些实施例中，对特定蛋白实施表1中所建议的突变亚类以产生超荷电蛋白。在某些实施例中，实施至少两种突变。在某些实施例中，实施至少三种突变。在某些实施例中，实施至少四种突变。在某些实施例中，实施至少五种突变。在某些实施例中，实施至少十种突变。在某些实施例中，实施至少十五种突变。在某些实施例中，实施至少二十种突变。在某些实施例中，实施所建议所有突变以产生超荷正电蛋白。在某些实施例中，不实施所建议突变而是将一或多个荷电部分添加至蛋白质中以产生超荷正电蛋白。
在某些实施例中，超荷电蛋白是天然存在的超荷电蛋白。在某些实施例中，天然存在的超荷电蛋白上的理论净电荷为至少+1、至少+2、至少+3、至少+4、至少+5、至少+10、至少+15、至少+20、至少+25、至少+30、至少+35、或至少+40。在某些实施例中，超荷电蛋白的电荷∶分子量比率为至少约0.8。在某些实施例中，超荷电蛋白的电荷∶分子量比率为至少约1.0。在某些实施例中，超荷电蛋白的电荷∶分子量比率为至少约1.2。在某些实施例中，超荷电蛋白的电荷∶分子量比率为至少约1.4。在某些实施例中，超荷电蛋白的电荷∶分子量比率为至少约1.5。在某些实施例中，超荷电蛋白的电荷∶分子量比率为至少约1.6。在某些实施例中，超荷电蛋白的电荷∶分子量比率为至少约1.7。在某些实施例中，超荷电蛋白的电荷∶分子量比率为至少约1.8。在某些实施例中，超荷电蛋白的电荷∶分子量比率为至少约1.9。在某些实施例中，超荷电蛋白的电荷∶分子量比率为至少约2.0。在某些实施例中，超荷电蛋白的电荷∶分子量比率为至少约2.5。在某些实施例中，超荷电蛋白的电荷∶分子量比率为至少约3.0。在某些实施例中，蛋白质的分子量介于约4kDa至约100kDa范围内。在某些实施例中，蛋白质的分子量介于约10kDa至约45kDa范围内。在某些实施例中，蛋白质的分子量介于约5kDa至约50kDa范围内。在某些实施例中，蛋白质的分子量介于约10kDa至约60kDa范围内。在某些实施例中，天然存在的超荷电蛋白是组蛋白相关蛋白。在某些实施例中，天然存在的超荷电蛋白是核糖体相关蛋白。天然存在的超荷电蛋白的实例包括(但不限于)西科龙(识别号：Q9H6F5)、PNRC1(识别号：Q12796)、RNPSl(识别号：Q15287)SURF6(识别号：075683)、AR6P(识别号；Q66PJ3)、NKAP(识别号：Q8N5F7)、EBP2(识别号：Q99848)、LSM11(识别号：P83369)、RL4(识别号：P36578)、KRR1(识别号：Q13601)、RY-1(识别号：Q8WVK2)、BriX(识别号：Q8TDN6)、MNDA(识别号：P41218)、H1b(识别号：P16401)、细胞周期蛋白(识别号：Q9UK58)、MDK(识别号：P21741)、肝素结合细胞因子(识别号：P21741)、PROK(识别号：Q9HC23)、FGF5(识别号：P12034)、SFRS(识别号：Q8N9Q2)、AKIP(识别号：Q9NWT8)、CDK(识别号：Q8N726)、β-防御素(识别号：P81534)、防御素3(识别号：P81534)、PA VAC(识别号：P18509)、PACAP(识别号：P18509)、嗜酸性粒细胞活化趋化因子-3(识别号：Q9Y258)、组蛋白H2A(识别号：Q7L7L0)、HMGB1(识别号：P09429)、C-Jun(识别号：P05412)、TERF 1(识别号：P54274)、N-DEK(识别号：P35659)、PIAS 1(识别号：075925)、Ku70(识别号：P12956)、HBEGF(识别号：Q99075)、和HGF(识别号：P14210)。在某些实施例中，本发明中所用超荷电蛋白是U4/U6.U5三snRNP相关蛋白3(识别号：Q8WVK2)、β-防御素(识别号：P81534)、蛋白SFRS121P1(识别号：Q8N9Q2)、肝素结合细胞因子(midkine)(识别号：P21741)、C-C基元趋化因子26(识别号：Q9Y258)、过食基因座蛋白6(surfeit locus protein 6)(识别号：075683)、极光激酶A相互作用蛋白(识别号：Q9NWT8)、NF-κ-B活化蛋白(识别号：Q8N5F7)、组蛋白H1.5(识别号：P16401)、组蛋白H2A 3型(识别号：Q7L7L0)、60S核糖体蛋白L4(识别号：P36578)、具有富丝氨酸结构域1的RNA结合蛋白的亚型1(识别号：Q15287-1)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A的亚型4(识别号：Q8N726-1)、前动力蛋白-2的亚型1(识别号：Q9HC23-1)、ADP核糖基化因子样蛋白6相互作用蛋白4的亚型1(识别号：Q66PJ3-1)、成纤维细胞生长因子5的长亚型(识别号：P12034-1)、或细胞周期蛋白-L1的亚型1(识别号：Q9UK58-1)。以下列表中包括可用于本发明中的来自人类蛋白质组的其它可能的天然存在超荷电蛋白。所列示蛋白质的电荷∶分子量比率大于0.8。
核酸
本发明提供在体内或体外将核酸递送至细胞中的系统和方法。所述系统和方法通常涉及使一或多种核酸与超荷电蛋白缔合以形成复合体，和将所述复合体递送至一或多种细胞中。在一些实施例中，核酸可具有治疗活性。在一些实施例中，将复合体递送至细胞中涉及将包含与核酸缔合的超荷电蛋白的复合体投与有需要的个体。在一些实施例中，核酸自身可能不能进入细胞内部，但在与超荷电蛋白复合时能进入细胞内部。在一些实施例中，采用超荷电蛋白以使得核酸可进入细胞中。本发明核酸自身可具有治疗活性或可引导具有治疗活性的RNA和/或蛋白质的表达。核酸的治疗活性更详细地论述于下文中。
术语“核酸”就其最广泛含义来说包括纳入或可纳入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。用于本发明中的实例性核酸包括(但不限于)以下中的一或多种：DNA、RNA、其杂合体、RNAi诱导剂、RNAi因子、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶、催化性DNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体、载体等，如下文更详细地阐述。
用于本发明中的核酸可根据任一可用技术来制备，所述技术包括(但不限于)化学合成、酶促合成、酶促或化学裂解较长前体等。合成RNA的方法为业内已知(例如，参见基特M.J.(Gait，M.J.)(编辑)，寡核苷酸合成：实践方法(Oligonucleotidesynthesis：a practical approach)，牛津[牛津郡]，华盛顿，DC：IRL出版社，1984；和赫德维因P.(Herdewijn，P.)(编辑)寡核苷酸合成：方法和应用(Oligonucleotidesynthesis：methods and applications)，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，288版(克利夫顿N.J.(Clifton，N.J.))，托托瓦N.J.(Totowa，N.J.)：休马纳出版社，2005；所述个文献都是以引用方式并入本文中)。
核酸可包含天然存在的核苷、经修饰核苷、一或多个核苷之间插入烃连接体(例如亚烷基)或聚醚连接体(例如PEG连接体)的天然存在的核苷、一或多个核苷之间插入烃或PEG连接体的经修饰核苷、或其组合。在一些实施例中，核苷酸或经修饰核苷酸可经烃连接体或聚醚连接体替代，前提是所述取代不会显著降低核酸的功能。
所属领域技术人员应了解，本发明核酸可包含全部属于天然存在的核酸中可发现的类型的核苷酸，或可代替地包括一或多个核苷酸类似物或具有在其它方面与天然存在的核酸中的核苷酸不同的结构。美国专利第6,403,779号、第6,399,754号、第6,225,460号、第6，127,533号、第6,031,086号、第6,005,087号、第5,977,089号(每一专利以引用方式并入本文中)和其中的参考文献揭示众多种可使用的特定核苷酸类似物和修饰形式。参见克鲁克S.(Crooke，S.)(编辑)，反义药物技术：原理、策略和应用(Antisense Drug Technology：Principles，Strategies，and Applications)(第1版)，马赛尔德克尔(Marcel Dekker)；ISBN：0824705661；第1版(2001；其是以引用方式并入本文中)和其中的参考文献。例如，2’-修饰包括卤基、烷氧基和烯丙氧基。在一些实施例中，2’-OH基团经选自以下的基团替代：H、OR、R、卤基、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN，其中R为C1-C6烷基、烯基、或炔基，并且卤基是F、Cl、Br或I。经修饰键的实例包括硫代磷酸键和5’-N-亚磷酰胺键。
本发明可采用包含多种不同核苷酸类似物、经修饰骨架或非天然存在的核苷间键的核酸。本发明核酸可包括天然核苷(即腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷、和脱氧胞苷)或经修饰核苷。经修饰核苷酸的实例包括碱修饰核苷(例如阿糖胞苷、肌苷、异鸟苷、水粉蕈素、假尿苷、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-硫代胸苷、3-脱氮-5-氮杂胞苷、2’-脱氧尿苷、3-硝基吡咯、4-甲基吲哚、4-硫代尿苷、4-硫代胸苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、2-硫代尿苷、5-溴胞苷、5-碘尿苷、肌苷、6-氮杂尿苷、6-氯嘌呤、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氮杂腺苷、8-叠氮腺苷、苯并咪唑、M1-甲基腺苷、吡咯并-嘧啶、2-氨基-6-氯嘌呤、3-甲基腺苷、5-丙炔基胞苷、5-丙炔基尿苷、5-溴尿苷、5-氟尿苷、5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-侧氧基腺苷、8-侧氧基鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、和2-硫代胞苷)、化学或生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)、经修饰糖(例如2’-氟代核糖、2’-氨基核糖、2’-叠氮核糖、2’-O-甲基核糖、L-对映异构核苷阿拉伯糖、和己糖)、经修饰磷酸基(例如硫代磷酸键和5’-N-亚磷酰胺键)和其组合。用于化学合成核酸的天然和经修饰核苷酸单体易于获得。在一些情形中，包含所述修饰的核酸相对于仅包含天然存在的核苷酸的核酸表现改良的特性。在一些实施例中，使用本文所述核酸修饰形式来降低和/或阻止核酸酶(例如外切核酸酶、内切核酸酶等)的消化。例如，可通过在一条或两条链的3’末端包括核苷酸类似物以降低消化来稳定核酸的结构。
经修饰核酸不需要沿整个分子长度一致地修饰。在核酸中的不同位置处可存在不同核苷酸修饰和/或骨架结构。所属领域技术人员可了解，核苷酸类似物或其它修饰可定位于核酸中的任一位置，从而使得不显著影响核酸的功能。在一个实例中，修饰可定位于核酸靶向部分中的任一位置，从而使得不显著影响核酸靶向部分特异性结合靶的能力。经修饰区可位于一条或两条链的5’末端和/或3’末端。例如，已采用在任何一条或两条链的5’和/或3’末端中有约1个至约5个残基是核苷酸类似物和/或具有骨架修饰的经修饰核酸靶向部分。修饰可为5’或3’末端修饰。一个或两个核酸链可包含至少50％未经修饰核苷酸、至少80％未经修饰核苷酸、至少90％未经修饰核苷酸或100％未经修饰核苷酸。
本发明核酸可包含(例如)对糖、核苷或核苷间键的修饰，例如美国专利公开案第2003/0175950号、第2004/0192626号、第2004/0092470号、第2005/0020525号、和第2005/0032733号中所述的修饰；上述各公开案是以引用方式并入本文中。本发明涵盖使用具有其中所述任何一或多种修饰的任一核酸。例如，已报导多种末端偶联物(例如脂质，例如胆固醇、石胆酸、月桂酸；或长具支链烷基链)可改良细胞摄取。类似物和修饰可使用(例如)业内已知任一适宜分析方法来测试，从而(例如)选择所述可改良因RNAi因子等所致靶基因沉默者。在一些实施例中，本发明核酸可包含一或多个非天然核苷键。在一些实施例中，使一或多个位于核酸靶向部分中3’末端、5’末端或3’末端与5’末端二者的内部核苷酸倒转以获得诸如3’-3’键或5’-5’键等键。
在一些实施例中，本发明核酸并非合成核酸，而是已自天然环境分离的天然存在的实体。
RNAi因子
RNA干扰
在一些实施例中，可与超荷电蛋白缔合的核酸包括介导RNA干扰(RNAi)的药剂。RNAi是抑制特定基因表达的机制。RNAi通常在翻译水平上抑制基因表达，但也可通过在转录水平上抑制基因表达来起作用。RNAi靶包括任何可能存于细胞中的RNA，包括(但不限于)细胞转录物、病原体转录物(例如来自病毒、细菌、真菌等)、转座子、载体等。
RNAi途径是通过戴斯酶来介导的，其将长双链RNA(dsRNA)分子裂解为具有20-25个碱基对的短片段，任选地在一个或两个末端上具有少量不成对悬突碱基。然后将各片段的两条链中的一条(称作引导链)纳入RNA诱导的沉默复合体(RISC)中并与互补序列配对。另一链在在RISC活化期间降解。此识别事件研究最充分的结果是转录后基因沉默。此在引导链与靶转录物特异性配对并通过阿戈蛋白(argonaute)(RISC复合体的催化性组份)诱导靶转录物降解时发生。另一结果是对基因的基因外改变(例如组蛋白修饰和DNA甲基化)，其影响基因的转录程度。
将长双链RNA(例如大于30bp)引入哺乳动物细胞中因活化干扰素反应而引起对翻译的系统性非特异性抑制。突破发生在发现可通过使用可外源性递送(巴希尔等人，2001，自然，411：494；其是以引用方式并入本文中)或自RNA聚合酶II或III启动子内源性表达的合成短RNA(例如19-25bp)来克服此障碍时。
RNAi现象更详细地论述于(例如)以下参考文献中(每个参考文献以引用方式并入本文中)：巴希尔等人，2001，基因与发育(Genes Dev.)，15：188；法尔(Fire)等人，1998，自然，391：806；塔伯勒(Tabara)等人，1999，细胞，99：123；哈蒙德(Hammond)等人，自然，2000，404：293；赛摩(Zamore)等人，2000，细胞，101：25；查克拉波尔迪(Chakraborty)，2007，药靶研究最新进展(Curr.Drug Targets)，8：469；和莫里斯(Morris)与罗西(Rossi)，2006，基因疗法(Gene Ther.)，13：553。
本文所用术语“RNAi因子”是指任选地包括一或多个核苷酸类似物或修饰的RNA，其分子结构特征可介导通过RNAi机制对基因表达的抑制。一般来说，RNAi因子包括与靶RNA实质上互补的部分。在一些实施例中，RNAi因子至少部分为双链。在一些实施例中，RNAi因子为单链。在一些实施例中，实例性RNAi因子可包括短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和/或微小RNA(miRNA)。在一些实施例中，术语“RNAi因子”可是指任一RNA、RNA衍生物和/或编码诱导RNAi效应(例如降解靶RNA和/或抑制翻译)的RNA的核酸。
本文所用术语“RNAi诱导剂”涵盖递送RNAi因子、调节和/或修饰RNAi因子活性的任一实体。在一些实施例中，RNAi诱导剂可包括载体(但不包括未经人工修饰的天然存在的分子)，其在细胞中的存在可引发RNAi并导致所述RNAi诱导剂所靶向的转录物的表达降低。在一些实施例中，RNAi诱导剂是“RNAi诱导载体”，其是指在细胞中的存在可导致产生一或多种自杂交或彼此杂交而形成RNAi因子(例如siRNA、shRNA和/或miRNA)的RNA的载体。在各实施例中，此术语涵盖质粒(例如DNA载体(其序列可包含源自病毒的序列元件))或病毒(但不包括未经人工修饰的天然存在的病毒或质粒)，其在细胞内的存在可导致产生一或多种自杂交或彼此杂交而形成RNAi因子的RNA。一般来说，载体包含与表达信号可操作连接的核酸，从而使得当载体存于细胞内时可转录一或多种杂交或自杂交而形成RNAi因子的RNA。因此所述载体为细胞内合成所述RNA或其前体提供模板。在一些实施例中，RNAi诱导剂是包含RNAi因子和一或多种医药上可接受的赋形剂和/或载剂的组合物。出于本发明目的，可将本文所述任何部分或完全双链短RNA(其中一条链结合靶转录物并降低其表达(即降低转录物水平和/或降低所述转录物编码的多肽的合成))视作RNAi诱导剂，不论其是通过引发降解、抑制翻译、抑或通过其它方式来起作用。此外，可在体内处理(即在细胞或有机体内)而生成此一RNAi诱导剂的任何前体RNA结构可用于本发明中。
本发明RNAi因子可靶向转录物的任一部分。在一些实施例中，靶转录物定位在基因的编码序列内。在一些实施例中，靶转录物定位在非编码序列内。在一些实施例中，靶转录物定位在外显子内。在一些实施例中，靶转录物定位在内含子内。在一些实施例中，靶转录物定位在基因的5’非翻译区(UTR)或3’UTR内。在一些实施例中，靶转录物定位在增强子区域内。在一些实施例中，靶转录物定位在启动子内。
对于任一特定基因靶来说，RNAi因子和/或RNAi诱导剂的设计通常遵循某些准则。一般来说，期望回避靶转录物中可与其它转录物共有的不期望降解的部分。在一些实施例中，RNAi因子和/或RNAi诱导实体靶向转录物和/或其中高度保守的部分。在一些实施例中，RNAi因子和/或RNAi诱导实体靶向转录物和/或其中并非高度保守的部分。
siRNA和shRNA
本文所用“siRNA”是指包含长约19个碱基对(bp)并且任选地另外包含一个或两个单链悬突的RNA双螺旋(在本文中称作“双螺旋区”)的RNAi因子。在一些实施例中，siRNA包含长度介于15bp至29bp范围内并且任选地另外包含一个或两个单链悬突的双螺旋区。siRNA通常是自两个杂交在一起的RNA分子(即两条链)来形成。siRNA中的一条链包括与靶转录物杂交的部分。在一些实施例中，siRNA通过引起靶转录物降解来介导对基因表达的抑制。
本文所用“shRNA”是指RNAi因子，其所包含RNA具有至少两个杂交或能杂交而形成长至足以介导RNAi(通常长至少约19bp)的双链(双螺旋)结构的互补部分，和至少一个长度通常介于约1个核苷酸(nt)与约10nt之间并形成环的单链部分。在一些实施例中，shRNA包含长度介于15bp至29bp范围内的双螺旋部分和至少一个长度通常介于约1nt与约10nt范围内并形成环的单链部分。在一些实施例中，单链部分长度为约1nt、约2nt、约3nt、约4nt、约5nt、约6nt、约7nt、约8nt、约9nt、或约10nt。在一些实施例中，通过细胞RNAi机构(例如通过戴斯酶)将shRNA处理为siRNA。因此，在一些实施例中，shRNA可为siRNA的前体。无论如何，与siRNA类似，siRNA一般能抑制靶RNA的表达。本文所用术语“短RNAi因子”指siRNA与shRNA的总称。
如上文所提及，短RNAi因子通常包括长度介于约15nt与约29nt之间(例如长约19nt)并且可任选地具有一或多个自由或成环末端的碱基配对区(“双螺旋区”)。在一些实施例中，短RNAi因子具有长度为约15nt、约16nt、约17nt、约18nt、约19nt、约20nt、约21nt、约22nt、约23nt、约24nt、约25nt、约26nt、约27nt、约28nt、或约29nt的双螺旋区。然而，并不要求所投与药剂具有此结构。例如，RNAi诱导剂可包含能在体内处理为短RNAi因子结构的任一结构。在一些实施例中，将RNAi诱导剂递送至细胞中，其中其在经历一或多个处理步骤后变为功能性短RNAi因子。在所述情形中，所属领域技术人员可了解，期望RNAi诱导剂包括对其处理是必需的和/或有帮助的序列。
在阐述RNAi诱导剂和/或短RNAi因子时，方便的是指具有两条链的因子。一般来说，RNAi诱导剂和/或短RNAi因子中一条链的双螺旋部分的序列与此区域中的靶转录物实质上互补。RNAi诱导剂和/或短RNAi因子中另一条链的双螺旋部分的序列通常与靶转录物中所靶向的部分实质上一致。包含与靶互补的部分的链称作“反义链”，而另一链通常称作“有义链”。反义链中与靶互补的部分可称作“抑制区”。
RNAi诱导剂和/或短RNAi因子通常包括一区域(“双螺旋区”)，其中一条链含有长度介于15nt至29nt之间并且与靶转录物中的一部分(“靶部分”)充分互补的抑制区，从而使得可在体内形成此链与靶转录物之间的杂合体(“核心区”)。人们认为核心区不包括悬突。
在一些实施例中，短RNAi因子具有长度为约15nt、约16nt、约17nt、约18nt、约19nt、约20nt、约21nt、约22nt、约23nt、约24nt、约25nt、约26nt、约27nt、约28nt、或约29nt的抑制区。在一些实施例中，短RNAi因子的抑制区长约19nt。在一些实施例中，短RNAi因子中一条链与其靶转录物杂交产生长度为约15nt、约16nt、约17nt、约18nt、约19nt、约20nt、约21nt、约22nt、约23nt、约24nt、约25nt、约26nt、约27nt、约28nt、或约29nt的核心区。在一些实施例中，短RNAi因子中的一条链与其靶转录物杂交产生长约19nt的核心区。
靶转录物经常在双螺旋区的中心附近裂解。在一些实施例中，靶转录物在siRNA与靶转录物之间形成的双螺旋的第一碱基对下游11nt或12nt处裂解(例如，参见巴希尔等人，2001，基因与发育，15：188；其是以引用方式并入本文中)。
在一些实施例中，siRNA在双螺旋区的一个或两个末端包含3’悬突。在一些实施例中，shRNA在其自由末端处包含3’悬突。在一些实施例中，siRNA包含单核苷酸3’悬突。在一些实施例中，siRNA包含2nt的3’悬突。在一些实施例中，siRNA包含1nt的3’悬突。悬突若存在，可能不一定与靶转录物互补。在3’末端具有2nt-3nt悬突的siRNA相对于具有钝头末端的siRNA通常可有效降低靶转录物水平。
可使任何期望序列(例如UU)简单地附加在反义和/或有义核心区的3’末端以生成3’悬突。一般来说，采用含有一或多种嘧啶(通常为U、T或dT)的悬突。在合成RNAi诱导剂时，在悬突中使用T而非U可能更便捷。使用dT而非T可使稳定性增强。
在一些实施例中，短RNAi因子的抑制区与靶转录物中的一区域100％互补。然而，在一些实施例中，短RNAi因子的抑制区与靶转录物中一区域小于100％互补。抑制区只需要与靶转录物充分互补，从而使得在(例如)细胞中和/或支持RNAi的体外系统(例如果蝇属(Drosophila)提取物系统)中的生理条件下可发生杂交。
所属领域技术人员可了解，短RNAi因子双螺旋可容忍失配和/或凸起，尤其是双螺旋中心区域内的失配，同时仍可引起有效剪接。所属领域技术人员还应了解，可期望在短RNAi因子/靶转录物核心区的中心部分中避免失配(例如，参见巴希尔等人，EMBOJ.20：6877，2001)。例如，siRNA中反义链的3’核苷酸通常对靶识别的特异性无显著作用，并且对靶裂解可能较不重要。
在一些实施例中，具有表现一或多处失配的双螺旋区的短RNAi因子的失配通常总共不超过6个。在一些实施例中，短RNAi因子在其双螺旋区中总共具有1、2、3、4、5、或6处失配。在一些实施例中，双螺旋区具有长至少5nt(例如6nt、7nt或更长)的完全互补区段。在一些实施例中，双螺旋区内不超过20％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，双螺旋区内不超过15％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，双螺旋区内不超过10％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，双螺旋区内不超过5％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，双螺旋区内没有核苷酸出现失配。双螺旋区可包括两个由失配区间隔的完全互补区段。在一些实施例中，存在多处失配区域。
在一些实施例中，表现一或多处失配的核心区(例如通过短RNAi因子的一条链与靶转录物杂交来形成)通常总共具有不超过6处失配。在一些实施例中，核心区总共具有1、2、3、4、5、或6处失配。在一些实施例中，核心区包含长至少5nt(例如6nt、7nt或更长)的完全互补区段。在一些实施例中，核心区内不超过20％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，核心区内不超过15％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，核心区内不超过10％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，核心区内不超过5％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，核心区内没有核苷酸出现失配。核心区可包括两个由失配区间隔的完全互补区段。在一些实施例中，存在多个失配区域。
在一些实施例中，短RNAi因子中的一条或两条链可包括一或多个形成“凸起”的“额外”核苷酸。可存在一或多个凸起(例如长5nt-10nt)。
在一些实施例中，可使用大量可用算法中的一或多种来设计和/或预测短RNAi因子。在一些实例中，可采用以下资源来设计和/或预测RNAi因子：在以下网站发现的算法：Alnylum Online、Dharmacon Online、OligoEngine Online、Molecula Online、Ambion Online、BioPredsi Online、RNAi Web Online、Chang Bioscience Online、InvitrogenOnline、LentiWeb Online GenScript Online、Protocol Online；雷诺兹(Reynolds)等人，2004，自然生物技术，22：326；内藤(Naito)等人，2006，核酸研究，34：W448；李(Li)等人，2007，RNA，13：1765；耀(Yiu)等人，2005，生物信息学(Bioinformatics)，21：144；和Jia等人，2006，BMC生物信息学，7：271；上述各文献是以引用方式并入本文中。
微小RNA
微小RNA(miRNA)是基因组中编码的长约21-23个核苷酸的非编码RNA，其尤其在发育期间帮助调节基因表达(例如，参见巴泰尔(Bartel)，2004，细胞，116：281；诺维纳(Novina)和夏普(Sharp)，2004，自然，430：161；和美国专利公开案第2005/0059005号；也综述于以下文献中：王和李，2007，生物科学新领域(Front.Biosci.)，12：3975；和赵(Zhao)，2007，生物化学趋势(Trends Biochem.Sci.)，32：189；每个所述文献是以引用方式并入本文中)。RNA干扰现象的概括定义包括miRNA内源诱导的基因沉默效应以及由外来dsRNA引发的沉默。成熟miRNA在结构上类似于自外源dsRNA产生的siRNA，但在达到成熟以前，miRNA首先进行广泛的转录后修饰。miRNA通常由远远较长的RNA编码基因表达为称作初级miRNA的初级转录物，其在细胞核中通过微处理复合体处理为称作前miRNA的70个核苷酸的茎环结构。此复合体是由称作卓莎酶(Drosha)的RNA酶III与dsRNA结合蛋白帕沙酶(Pasha)组成。戴斯酶结合并裂解此前miRNA的dsRNA部分而产生可整合至RISC复合体中的成熟miRNA分子；因此，miRNA与siRNA在其初始处理下游共有相同细胞机构(格雷戈里(Gregory)等人，2006，分子生物学方法，342：33；其是以引用方式并入本文中)。一般来说，miRNA与其靶转录物并非完全互补。
在一些实施例中，miRNA的长度可介于18nt-26nt范围内。通常，miRNA为单链。然而，在一些实施例中，miRNA可至少部分为双链。在某些实施例中，miRNA可包含RNA双螺旋(在本文中称作“双螺旋区”)并且可任选地另外包含一个或两个单链悬突。在一些实施例中，RNAi因子包含长度介于15bp至29bp范围内的双螺旋区并且任选地另外包含一个至三个单链悬突。miRNA可自两个杂交在一起的RNA分子形成，或可替代地自包括自杂交部分的单一RNA分子生成。miRNA的双螺旋部分通常(但不一定)包含一或多个由一或多个不成对核苷酸组成的凸起。miRNA中的一条链包括与靶RNA杂交的部分。在某些实施例中，miRNA中的一条链与靶RNA中的区域并非精确互补，其意指miRNA与靶RNA的杂交具有一或多处失配。在一些实施例中，miRNA中的一条链与靶RNA中的区域精确互补，其意指miRNA与靶RNA的杂交没有失配。通常，人们认为miRNA可通过抑制靶转录物的翻译来介导对基因表达的抑制。然而，在一些实施例中，miRNA可通过引起靶转录物的降解来介导对基因表达的抑制。
在一些实施例中，miRNA具有长度为约15nt、约16nt、约17nt、约18nt、约19nt、约20nt、约21nt、约22nt、约23nt、约24nt、约25nt、约26nt、约27nt、约28nt、或约29nt的双螺旋区。在一些实施例中，miRNA具有长度为约15nt、约16nt、约17nt、约18nt、约19nt、约20nt、约21nt、约22nt、约23nt、约24nt、约25nt、约26nt、约27nt、约28nt、或约29nt的抑制区。
在一些实施例中，miRNA具有在双螺旋区中表现一或多处失配的双螺旋区。在一些实施例中，miRNA具有在双螺旋区中总共表现1、2、3、4、5、6、7、8、或9处失配的双螺旋区。在一些实施例中，双螺旋区具有长1、2、3、4、5、6、7、8、或9nt的完全互补区段。双螺旋区可包括两个由失配区间隔的完全互补区段。在一些实施例中，存在多个失配区域。在一些实施例中，在双螺旋区内有约50％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，在双螺旋区内有约40％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，在双螺旋区内有约30％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，在双螺旋区内有约20％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，在双螺旋区内有约10％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，在双螺旋区内有约5％的核苷酸出现失配。
在一些实施例中，核心区(例如通过miRNA中的一条链与靶转录物杂交来形成)总共具有1、2、3、4、5、6、7、8、或9处失配。在一些实施例中，核心区包含长1、2、3、4、5、6、7、8、或9nt的完全互补区段。核心区可包括两个由失配区间隔的完全互补区段。在一些实施例中，存在多个失配区域。在一些实施例中，存在多个失配区域。在一些实施例中，在核心区内有约50％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，在核心区内有约40％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，在核心区内有约30％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，在核心区内有约20％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，在核心区内有约10％的核苷酸出现失配。在一些实施例中，在核心区内有约5％的核苷酸出现失配。
在一些实施例中，miRNA中的一条或两条链可包括一或多个形成“凸起”的“额外”核苷酸。可存在一或多个凸起(例如长5nt-10nt)。
在一些实施例中，可使用大量可用算法中的一或多种来设计和/或预测短RNAi因子。在一些实例中，可采用以下资源来设计和/或预测RNAi因子：以下网站中的算法：PicTar Online、Protocol Online、EMBL Online；雷默斯米尔(Rehmsmeier)等人，2004，RNA，10：1507；金(Kim)等人，2006，BMC生物信息学，7：411；路易斯(Lewis)等人，2003，细胞，115：787；和克里克(Krek)等人，2005，自然遗传(Nat.Genet.)，37：495；上述各文献是以引用方式并入本文中。
反义RNA
在一些实施例中，可与超荷电蛋白缔合的核酸包括反义RNA。反义RNA通常是不同长度的RNA链，其与靶转录物结合并阻断其翻译(例如通过降解mRNA和/或通过在空间上阻断翻译过程中的关键步骤)。
反义RNA表现许多与上述RNAi因子相同的特征。例如，反义RNA对靶转录物表现充分互补性以使得所述反义RNA可与所述靶转录物杂交。只要仍可进行与靶的杂交，其容忍失配，如上文关于RNAi因子所述。一般来说，反义RNA长于短RNAi因子，并且只要仍可进行杂交，其可具有任一长度。在一些实施例中，反义RNA为约20nt、约30nt、约40nt、约50nt、约75nt、约100nt、约150nt、约200nt、约250nt、约500nt、或更长。在一些实施例中，反义RNA包含与靶转录物杂交的抑制区，其为约20nt、约30nt、约40nt、约50nt、约75nt、约100nt、约150nt、约200nt、约250nt、约500nt、或更长。
核酶
在一些实施例中，可与超荷电蛋白缔合的核酸包括核酶。核酶(来自核糖核酸酶；也称作RNA酶或催化性RNA)是可催化化学反应的RNA分子。多种天然核酶催化器自有磷酸二酯键中一者的水解，或催化另一RNA中键的水解，但也已发现其可催化核糖体的氨基转移酶活性。
在一些实施例中，用于基因敲除应用的核酶具有催化性结构域，其两侧具有与靶转录物互补的序列。基因沉默机制一般涉及核酶与靶转录物通过华生-克里克碱基配对(Watson-Crick base pairing)结合，之后通过转酯作用裂解靶转录物的磷酸二酯骨架(库里克(Kurreck)，2003，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)，270：1628；孙(Sun)等人，2000，药理学评论(Pharmacol.Rev.)，52：325；唐德纳(Doudna)和切克(Cech)，2002，自然，418：222；古德柴尔德(Goodchild)，2000，分子治疗学新见(Curr.Opin.Mol.Ther.)，2：272；米基恩奇(Michienzi)和罗西，2001，酶学方法，341：581；上述各文献是以引用方式并入本文中)。在破坏靶转录物后，核酶解离并且随后可对其它底物重复裂解。在一些实施例中，欲与超荷电蛋白缔合的核酶是锤头状核酶。锤头状核酶首先自类病毒RNA分离，所述类病毒RNA在其复制过程的一部分中发生位点特异性自身裂解。
在一些实施例中，核酶是天然存在的核酶，包括(但不限于)肽基转移酶23S rRNA、RNA酶P、I类和II类内含子、GIR1分支核酶、引导酶(leadzyme)、发夹状核酶、锤头状核酶、HDV核酶、哺乳动物CPEB3核酶、VS核酶、glmS核酶和CoTC核酶。
在一些实施例中，核酶为人工核酶。例如，已产生具有良好酶促活性的人工制造的自我裂解型RNA。唐(Tang)和布里克(Breaker)(1997，美国科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)，97：5784；其是以引用方式并入本文中)通过体外选择源自随机序列RNA的RNA来分离自我裂解型RNA。所产生的一些合成核酶具有新颖结构，其中一些与天然存在的锤头状核酶类似。
在一些实施例中，用于发现人工核酶的技术涉及达尔文进化论(Darwinianevolution)。此方法利用RNA作为催化剂和信息聚合物的双重性质，由此使得研究者可使用聚合酶来产生众多种RNA催化剂。用逆转录酶对核酶进行逆转录来使其突变为各种cDNA并通过诱变PCR来扩增。这些实验中的选择参数通常不同。在一个实例中，选择连接酶核酶的方法可能涉及使用与底物共价连接的生物素标签。若候选核酶具有期望连接酶活性，则可使用抗生蛋白链菌素基质来回收活性分子。
脱氧核酶
在一些实施例中，可与超荷电蛋白缔合的核酸包括催化性DNA(“脱氧核酶”)。脱氧核酶通常通过华生-克里克碱基配对结合RNA底物，并且位点特异性地裂解靶转录物，这与核酶类似。由于尚未得知DNA酶的天然实例，业内已通过体外进化产生脱氧核酶分子。已确定两种不同的催化性基元，其具有不同的裂解位点特异性。已产生具有不同裂解位点特异性的脱氧核酶，从而使得研究者可靶向所有可能的二核苷酸序列。
适体
在一些实施例中，可与超荷电蛋白缔合的核酸包括适体。适体是结合特定靶分子的寡核酸分子。适体可通过重复进行多轮体外选择(例如通过指数式富集法对配体进行系统性进化，“SELEX”)来改造，从而可结合各种分子靶，例如小分子、蛋白质、核酸、细胞、组织和/或有机体。适体通常因所述适体的三维结构而与其靶结合。适体一般不通过传统华生-克里克碱基配对来与其靶结合。
第一种由美国食品药物管理局(FDA)批准的治疗老年性黄斑退化症(AMD)的基于适体的药物称作
(OSI制药公司(OSI Pharmaceuticals))。另外，ARC 1779(亚克(Archemix)，剑桥，MA)是温韦伯氏因子(von Willebrand Factor)(vWF)的有效选择性首创拮抗剂，并且是在经诊断患有急性冠状动脉综合症(ACS)且正在进行经皮冠状动脉介入性干预(PCI)的患者中进行评估。
一般来说，未修饰适体通常自血流中快速清除，其半衰期为数分钟至数小时。此可能是由于核酸酶降解和通过肾脏自体内清除所致，肾脏清除是由于适体往往具有较低分子量而发生。未修饰适体可尤其适合于治疗暂时性病况(例如凝血)和/或治疗可能进行局部递送的器官(例如眼、皮肤等)。在诸如体内诊断性成像等应用中可能期望快速清除。例如，腱糖蛋白结合适体(Schering AG)可用于癌症成像。在一些实施例中，期望具有延长半衰期的适体。某些修饰(例如2’-氟取代嘧啶、聚乙二醇(PEG)键等)可延长适体的半衰期。
诱导三螺旋形成的RNA
在一些实施例中，可与超荷电蛋白缔合的核酸包括诱导三螺旋形成的RNA。在一些实施例中，内源靶基因表达可通过以下方式来降低：靶向与靶基因的调节区(即靶基因的启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列以形成三螺旋结构，所述结构阻止靶基因在体内靶肌细胞中转录(一般参见埃莱尼(Helene)，1991，抗癌药物设计(Anticancer Drug Des.)6：569；埃莱尼等人，1992，安(Ann)，纽约科学院学报(N.Y.Acad.Sci.)660：27；和马希尔(Maher)，1992，生物分析(Bioassays)14：807)。
载体
在一些实施例中，可与超荷电蛋白缔合的核酸包括载体。本文所用“载体”是指可运输其所连接的核酸的另一核酸分子。在一些实施例中，载体可在诸如真核和/或原核细胞等宿主细胞中使其所连接核酸达成染色体外复制和/或表达。实例性载体包括质粒、粘粒、病毒、病毒基因组、人工染色体、细菌人工染色体和/或酵母人工染色体。在某些实施例中，载体包括诸如启动子、增强子、核糖体结合位点等元件。
在一些实施例中，载体能引导可操作连接基因的表达(“表达载体”)。在一些实施例中，可操作连接基因的表达可导致产生功能性核酸(例如RNAi因子、反义RNA、适体、核酶等)。在一些实施例中，可操作连接基因的表达可导致产生蛋白质(例如治疗性、诊断性和/或预防性蛋白)。在一些实施例中，治疗性蛋白是蛋白质基药物(例如抗体基药物、肽基药物等)。在一些实施例中，预防性蛋白可为蛋白质抗原和/或抗体。在一些实施例中，诊断性蛋白可为在通过超荷电蛋白递送至细胞之前表现某些特征，但在递送后表现可检测的不同特征的蛋白质。
在一些实施例中，载体是病毒载体。在一些实施例中，载体源自细菌。在一些实施例中，载体源自真菌。在一些实施例中，载体源自真核生物。在一些实施例中，载体源自原核生物。在一些实施例中，可通过超荷电蛋白将载体递送至细胞中，其中其随后在体内进行复制。在一些实施例中，可通过超荷电蛋白将载体递送至细胞中，其中其随后在体内进行转录。
经标记核酸
在一些实施例中，本发明核酸经可检测标记来标记。可用于本发明中的适宜标记包括(但不限于)荧光标记、化学发光标记、磷光标记和/或放射性标记。在一些实施例中，核酸包含至少一个附接至至少一个荧光部分(例如荧光素、罗丹明(rhodamine)、香豆素、酞菁-3、酞菁-5、阿莱克萨荧光二抗、和戴莱特荧光二抗(DyLight Fluor)等)的核苷酸。本发明中可采用任何可与核酸缔合的荧光部分。在一些实施例中，核酸包含至少一个放射性核苷酸(例如含有32P或35S的核苷酸)。在一些实施例中，核酸包含至少一个附接至至少一个放射性部分的核苷酸。
由所递送核酸靶向的细胞核酸
在一些实施例中，欲使用超荷电蛋白递送至细胞中的核酸(例如siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶等)可用于靶向欲降解的细胞核酸。可靶向任何细胞核酸以供降解。可经靶向以供降解的实例性细胞核酸包括(但不限于)GAPDH、β-肌动蛋白、β-微管蛋白和c-myc。
肽和蛋白质
本发明提供在体内或体外将蛋白质或肽递送至细胞中的系统和方法。所述系统和方法通常涉及使一或多种肽或蛋白质与超荷电蛋白缔合以形成复合体，和将所述复合体递送至一或多种细胞中。在一些实施例中，蛋白质或肽可具有治疗活性。在一些实施例中，将复合体递送至细胞中涉及将包含与肽或蛋白质缔合的超荷电蛋白的复合体投与有需要的个体。在一些实施例中，肽或蛋白质自身可能不能进入细胞内部，但在与超荷电蛋白复合时能进入细胞内部。在一些实施例中，使用超荷电蛋白来使肽或蛋白质可进入细胞中。本发明肽或蛋白质自身可具有治疗活性。
小分子
本发明提供用于在体内或体外将小分子递送至细胞中的系统和方法。所述系统和方法通常涉及使一或多种小分子与超荷电蛋白缔合以形成复合体，和将所述复合体递送至一或多种细胞中。在一些实施例中，小分子可具有治疗活性。优选但并非必需的，药物是已由有关政府机构或监察机构认定可安全有效地用于人类或动物者。在某些实施例中，小分子是由美国食品药物管理局批准可用于人类或其它动物的药物。例如，批准用于人类应用的药物由FDA列示于21C.F.R.§§330.5、331至361和440至460中，其是以引用方式并入本文中；兽医应用药物由FDA列示于21C.F.R.§§500至589中，其是以引用方式并入本文中。对于在本发明中的使用，所列示所有药物都认为是可接受的。在一些实施例中，将复合体递送至细胞中涉及将包含与小分子缔合的超荷电蛋白的复合体投与有需要的个体。在一些实施例中，小分子自身可能不能进入细胞内部，但在与超荷电蛋白复合时能进入细胞内部。在一些实施例中，采用超荷电蛋白以使得小分子可进入细胞中。
复合体的形成
本发明提供复合体，其包含与一或多种欲递送药剂缔合的超荷电蛋白。在一些实施例中，通过非共价相互作用使超荷电蛋白与一或多种欲递送药剂缔合。在一些实施例中，通过静电相互作用使超荷电蛋白与一或多种核酸缔合.在某些实施例中，超荷电蛋白具有总体净正电荷，并且诸如核酸等欲递送药剂具有总体净负电荷。
在某些实施例中，通过共价相互作用使超荷电蛋白与一或多种欲递送药剂缔合。例如，可使超荷电蛋白与欲递送肽或蛋白质融合。共价相互作用可为直接或间接作用。在一些实施例中，所述共价相互作用是由一或多种连接体来介导的。在一些实施例中，连接体是可裂解连接体。在某些实施例中，可裂解连接体包含酰胺、酯或二硫键。例如，连接体可为可由细胞酶裂解的氨基酸序列。在某些实施例中，酶是蛋白酶。在其它实施例中，酶是酯酶。在一些实施例中，酶是在某些细胞类型中的表达高于其它细胞类型者。例如，酶可为在肿瘤细胞中的表达高于非肿瘤细胞者。实例性连接体和裂解所述连接体的酶展示于表3中。
表3.可裂解连接体
1X表示超荷电蛋白和/或欲递送药剂
*是指所观察到的裂解位点
在一个特定实例中，可通过可裂解连接体(例如ALAL(SEQ ID NO：XX))使+36GFP与欲递送药剂缔合以生成+36GFP-(GGS)4-ALAL-(GGS)4-X(其中X是欲递送药剂)。
在某些实施例中，欲递送药剂是核酸。在一些实施例中，复合体是通过将超荷电蛋白与核酸一起培育来形成。在一些实施例中，复合体的形成是在缓冲溶液中实施。在一些实施例中，复合体的形成是在pH 7或约pH 7下实施。在一些实施例中，复合体的形成是在约pH 5、约pH 6、约pH 7、约pH 8、或约pH 9下实施。复合体的形成通常是在对超荷电蛋白和/或核酸的功能无负面影响的pH下实施。
在一些实施例中，复合体的形成是在室温下实施。在一些实施例中，复合体的形成是在37℃或约37℃下实施。在一些实施例中，复合体的形成是在4℃以下、约4℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约37℃、约40℃、或40℃以上温度下实施。复合体的形成通常是在对超荷电蛋白和/或核酸的功能无负面影响的温度下实施。
在一些实施例中，复合体的形成是在无血清培养基中实施。在一些实施例中，复合体的形成是在CO2(例如约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、或更高)的存在下实施。
在一些实施例中，复合体的形成是使用约100nm的核酸浓度来实施。在一些实施例中，复合体的形成是使用以下核酸浓度来实施：约25nM、约50nM、约75nM、约90nM、约100nM、约110nM、约125nM、约150nM、约175nM、或约200nM。在一些实施例中，复合体的形成是使用约40nM的超荷电蛋白浓度来实施。在一些实施例中，复合体的形成是使用以下超荷电蛋白浓度来实施：约10nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约60nM、约70nM、约80nM、约90nM、或约100nM。
在一些实施例中，复合体的形成是在核酸过量的条件下实施。在一些实施例中，复合体的形成是以以下核酸：超荷电蛋白比率来实施：约20∶1、约10∶1、约9∶1、约8∶1、约7∶1、约6∶1、约5∶1、约4∶1、约3∶1、约2∶1、或约1∶1。在一些实施例中，复合体的形成是以约3∶1的核酸∶超荷电蛋白比率来实施。在一些实施例中，复合体的形成是以以下超荷电蛋白∶核酸比率来实施：约20∶1、约10∶1、约9∶1、约8∶1、约7∶1、约6∶1、约5∶1、约4∶1、约3∶1、约2∶1、或约1∶1。
在一些实施例中，复合体的形成是通过混合超荷电蛋白与核酸并摇动混合物(例如通过倒转)来实施。在一些实施例中，复合体的形成是通过混合超荷电蛋白与核酸并使混合物静置来实施。在一些实施例中，复合体的形成是在医药上可接受的载剂或赋形剂存在下实施。在一些实施例中，进一步使复合体与医药上可接受的载剂或赋形剂合并。实例性赋形剂或载剂包括水、溶剂、脂质、蛋白质、肽、溶内体性药剂(例如氯喹、芘丁酸)、小分子、碳水化合物、缓冲液、天然聚合物、合成聚合物(例如PLGA、聚氨基甲酸酯、聚酯、聚己酸内酯、聚磷腈)、医药药剂等。
在一些实施例中，包含超荷电蛋白和核酸的复合体在凝胶电泳分析中可比单独的超荷电蛋白或单独的核酸移动更慢。
应用
本发明提供超荷电蛋白或包含与欲递送药剂缔合的天然存在的或经改造超荷电蛋白的复合体，以及使用所述复合体的方法。可使用本发明系统递送任何药剂。在递送核酸的情形下，由于核酸一般具有净负电荷，故与核酸缔合的超荷电蛋白通常是超荷正电蛋白。本发明超荷电蛋白或复合体可用于治疗或预防可受益于(例如)将药剂递送至细胞的任一疾病。出于研究目的，本发明超荷电蛋白或复合体也可用于转染或处理细胞。
在一些实施例中，出于研究目的，本发明超荷电蛋白或复合体可用于在研究背景下将核酸有效递送至细胞中。在一些实施例中，超荷电蛋白可用作研究工具来用核酸有效转化细胞。在一些实施例中，出于研究RNAi机制的目的，超荷电蛋白可用作研究工具来将RNAi因子有效引入细胞中。在一些实施例中，超荷电蛋白可用作研究工具来使细胞中的基因沉默。在某些实施例中，出于研究肽或蛋白质的生物活性的目的，超荷电蛋白可用于将肽或蛋白质递送至细胞中。在某些实施例中，出于研究肽或蛋白质的生物活性的目的，可将超荷电蛋白引入细胞中。在某些实施例中，出于研究小分子的生物活性的目的，超荷电蛋白可用于将小分子递送至细胞中。
在一些实施例中，本发明超荷电蛋白或复合体可用于治疗性目的。在一些实施例中，本发明超荷电蛋白或复合体可用于治疗多种疾病、病症和/或病况中的任一种，包括(但不限于)以下中的一或多者：自身免疫病症(例如糖尿病、狼疮、多发性硬化、干癣、类风湿性关节炎)；炎症性病症(例如关节炎、骨盆腔炎症)；传染病(例如病毒感染(例如HIV、HCV、RSV)、细菌感染、真菌感染、脓毒症)；神经障碍(例如阿兹海默氏症(Alzheimer’s disease)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease)；孤独症；杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy))；心血管病症(例如动脉粥样硬化、高胆固醇血症、血栓形成、凝血功能异常、血管生成性病症(例如黄斑变性)；增生性病症(例如癌症、良性肿瘤)；呼吸性病症(例如慢性阻塞性肺病)；消化性病症(例如炎症性肠病、溃疡)；肌肉骨骼病症(例如纤维肌痛、关节炎)；内分泌病症、代谢性病症、和营养性病症(例如糖尿病、骨质疏松症)；泌尿病症(例如肾病)；心理障碍(例如抑郁症、精神分裂症)；皮肤病(例如伤口、湿疹)；血液和淋巴病症(例如贫血、血友病)；等。
本发明超荷电蛋白或复合体可在临床环境中使用。例如，可使超荷电蛋白与可用于治疗性应用的核酸缔合。所述核酸可包括用于降低一或多种靶转录物的水平的功能性RNA(例如siRNA、shRNA、微小RNA、反义RNA、核酶等)。在一些实施例中，疾病、病症和/或病况可与一或多种特定mRNA和/或蛋白质的异常高水平相关。在一个特定实例中，多种形式的乳癌与表皮生长因子受体(EGFR)的表达增加有关。超荷电蛋白可用于将靶向EGFRmRNA的RNAi因子递送至细胞(例如乳癌肿瘤细胞)。肿瘤细胞可有效吸收超荷电蛋白，从而达成RNAi因子的递送。在递送后，RNAi因子可有效降低EGFR mRNA的水平，由此降低EGFR蛋白的水平。所述方法可有效治疗乳癌(例如与EGFR的升高水平相关的乳癌)。所属领域技术人员应了解，可使用类似方法来治疗与一或多种特定mRNA和/或蛋白质的升高水平相关的任一疾病、病症和/或病况。
在一些实施例中，疾病、病症和/或病况可能与一或多种特定mRNA和/或蛋白质的异常低水平相关。在一个特定实例中，酪氨酸血症是身体不能有效分解氨基酸酪氨酸的病症。有三种类型的酪氨酸血症，每种都是由不同的酶缺陷引发的。超荷电蛋白可用于通过递送驱动缺陷酶表达的载体来治疗酪氨酸血症。在将载体递送至细胞后，细胞机构可引导缺陷酶的表达，由此治疗患者的酪氨酸血症。所属领域技术人员应了解，可使用类似方法来治疗与一或多种特定mRNA和/或蛋白质的异常低水平相关的任一疾病、病症和/或病况。
如实例2和3中所述，甚至在使用对使用习用阳离子脂质基转染方法的核酸转染具有抗性的细胞系时，基于超荷电蛋白向细胞递送核酸也是成功的。因此，在一些实施例中，采用超荷电蛋白将核酸递送至对其它核酸递送方法(例如基于阳离子脂质的转化方法，例如使用阳离子脂质体)具有抗性的细胞中。此外，本发明者已令人惊讶地显示，可以较低纳摩尔(nM)浓度(例如1nm至100nm)使用超荷正电蛋白来将核酸递送至细胞中。在一些实施例中，可以以下浓度使用超荷电蛋白来将核酸有效递送至细胞中：约1nm、约5nm、约10nm、约25nm、约50nm、约75nm、约100nm、或高于约100nm。
在一些实施例中，超荷电蛋白可为治疗剂。例如，超荷电蛋白可为蛋白质药物(例如阿巴他塞(abatacept)、阿达木单抗(adalimumab)、阿来法塞(alefacept)、促红细胞生成素、依那西普(etanercept)、人类生长激素、英夫利昔单抗(infliximab)、胰岛素、曲妥珠单抗(trastuzumab)、干扰素等)的超荷电变体。在一些实施例中，超荷电蛋白可为治疗剂，并且缔合核酸可用于将治疗性蛋白的递送靶向靶位点。例如，超荷电蛋白可为蛋白质药物(例如阿巴他塞、阿达木单抗、阿来法塞、促红细胞生成素、依那西普、人类生长激素、英夫利昔单抗、胰岛素、曲妥珠单抗、干扰素等)的超荷电变体，并且缔合核酸可为可将治疗性蛋白有效靶向靶器官、组织和/或细胞的适体。超荷电蛋白也可为成像剂、诊断性、或其它检测剂。
在一些实施例中，超荷电蛋白与欲递送药剂(若存在)中的一者或两者可具有可检测品质。例如，超荷电蛋白与药剂中的一者或两者可包含至少一个荧光部分。在一些实施例中，超荷电蛋白具有固有荧光品质(例如GFP)。在一些实施例中，超荷电蛋白与欲递送药剂中的一者或两者可与至少一个荧光部分缔合(例如偶联至荧光团、荧光染料等)。或者或另外，超荷电蛋白与欲递送药剂中的一者或两者可包含至少一个放射性部分(例如蛋白质可包含35S；核酸可包含32P；等)。所述可检测部分可用于检测和/或监测将超荷电蛋白或复合体递送至靶位点。
在一些实施例中，超荷电蛋白或与超荷电蛋白缔合的药剂包括可检测标记。这些分子可用于检测、成像、疾病分期、诊断或患者选择。适宜标记包括荧光标记、化学发光标记、酶标记、比色标记、磷光标记、基于密度的标记(例如基于电子密度的标记)和一般对比剂和/或放射性标记。
医药组合物
本发明提供超荷电蛋白和包含与至少一种欲递送药剂缔合的超荷电蛋白的复合体。因此，本发明提供医药组合物，其包含一或多种超荷电蛋白或一或多种所述复合体、和一或多种医药上可接受的赋形剂。医药组合物可任选地包含一或多种额外治疗活性物质。根据一些实施例，提供将包含一或多种超荷电蛋白或一或多种包含与至少一种欲递送药剂缔合的超荷电蛋白的复合体的医药组合物投与有需要的个体。在一些实施例中，将组合物投与人类。出于本发明目的，短语“活性成份”一般是指如本文所述的超荷电蛋白或包含超荷电蛋白和至少一种欲递送药剂的复合体。
尽管对本文所提供医药组合物的说明在原则上涉及适合投与人类的医药组合物，但所属领域技术人员应理解，所述组合物一般适合投于所有种类的动物。业内充分理解对适合投与人类的医药组合物进行修饰以使所述组合物适合投与各种动物，并且具有一般技能的兽医学药理学家仅使用普通实验(若进行实验)即可设计和/或实施所述修饰。意欲投与医药组合物的个体包括(但不限于)人类和/或其它灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业相关鸟类，例如鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
本文所述医药组合物的调配物可通过药理学领域已知或今后将研发的任何方法来制备。一般来说，所述制备性方法包括以下步骤：使活性成份与赋形剂和/或一或多种其它配合成份缔合，且随后若需要和/或期望使产物成型和/或包装为期望的单剂量单位或多剂量单位。
本发明医药组合物可以散装、单一单位剂量和/或多个单一单位剂量形式来制备、包装和/或出售。本文所用“单位剂量”包含预定量活性成份的医药组合物的离散量。活性成份的量一般等于将投与个体的活性成份的剂量和/或此一剂量的方便分数(例如，此一剂量的一半或三分之一)。
本发明医药组合物中活性成份、医药上可接受的赋形剂和/或任何额外成份的相对量可随所治疗个体的属性、个头和/或病况而变，并且进一步随组合物的投与路径而变。例如，组合物可包含介于0.1％与100％(w/w)之间的活性成份。
医药调配物可另外包含医药上可接受的赋形剂，本文所用赋形剂包括适合于期望特定剂型的任何或所有溶剂、分散介质、稀释剂、或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂和诸如此类。雷明顿(Remington)：药学理论与实践(The Science and Practice of Pharmacy)，第21版，A.R.真纳罗(A.R.Gennaro)(利平科特(Lippincott)，威廉姆斯和威肯出版社(Williams&Wilkins)，巴尔的摩，MD，2006；其是以引用方式并入本文中)揭示用于调配医药组合物的各种赋形剂和其已知制备技术。除非任何习用赋形剂介质与物质或其衍生物不相容(例如因产生任何不期望生物学效应或以其它有害方式与医药组合物中的任何其它组份相互作用)，否则其使用涵盖于本发明范畴内。
在一些实施例中，医药上可接受的赋形剂至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％纯。在一些实施例中，赋形剂批准用于人类和兽医学应用。在一些实施例中，赋形剂是由美国食品药物管理局批准。在一些实施例中，赋形剂是医药级。在一些实施例中，赋形剂满足以下中的标准：美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典。
用于制造医药组合物的医药上可接受的赋形剂包括(但不限于)惰性稀释剂、分散和/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。所述赋形剂可任选地包括于医药调配物中。根据调配者的判断，组合物中可存在诸如以下等赋形剂：可可脂和栓剂蜡、着色剂、涂布剂、甜味剂、矫味剂和/或芳香剂。
实例性稀释剂包括(但不限于)碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或其组合。
实例性造粒剂和/或分散剂包括(但不限于)马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、淀粉羟乙酸钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维素和木质产物、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯基吡咯烷酮)(交聚维酮)、羧甲基淀粉钠(淀粉羟乙酸钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、预胶化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝(Veegum)、十二烷基硫酸钠、季铵化合物等和/或其组合。
实例性表面活性剂和/或乳化剂包括(但不限于)天然乳化剂(例如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、藻酸钠、黄蓍胶、牛二型胶原(chondrux)、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡、和卵磷脂)、胶质粘土(例如膨润土[硅酸铝]和
[硅酸镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如硬脂醇、鲸蜡醇、油醇、单硬脂酸三醋汀酯、二硬脂酸乙二醇酯、单硬脂酸甘油酯、和单硬脂酸丙二醇酯、聚乙烯醇)、卡波姆(carbomer)(例如羧聚乙烯、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物、和羧乙烯聚合物)、角叉菜胶、纤维质衍生物(例如羧甲基纤维素钠、粉状纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯[
20]、聚氧乙烯脱水山梨醇[
60]、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯[
80]、脱水山梨醇单棕榈酸酯[
40]、脱水山梨醇单硬脂酸酯[
60]、脱水山梨醇三硬脂酸酯[
65]、单油酸甘油酯、脱水山梨醇单油酸酯[80])、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯单硬脂酸酯[45]、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基化蓖麻油、聚甲醛硬脂酸酯、和
)、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸聚乙二醇酯(例如
)、聚氧乙烯醚(例如聚氧乙烯月桂基醚[30])、聚(乙烯基吡咯烷酮)、单月桂酸二乙二醇酯、油酸三乙醇胺酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、十二烷基硫酸钠、
F 68、
188、西曲溴铵(cetrimonium bromide)、西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)、苯扎氯铵(benzalkoniumchloride)、多库酯钠(docusate sodium)等和/或其组合。
实例性粘合剂包括(但不限于)淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、拉克替醇(lactitol)、甘露醇)；天然和合成树胶(例如阿拉伯胶、藻酸钠、鹿角菜提取物、潘瓦胶(panwar gum)、印度胶(ghattigum)、伊萨博(isapol)壳粘液、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、纤维素乙酸酯、聚(乙烯基吡咯烷酮)、硅酸镁铝
和落叶松阿拉伯半乳聚糖)；藻酸盐；聚氧化乙烯；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇；等；和其组合。
实例性防腐剂可包括(但不限于)抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇类防腐剂、酸性防腐剂和/或其它防腐剂。实例性抗氧化剂包括(但不限于)α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠和/或亚硫酸钠。实例性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、一水合柠檬酸、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。实例性抗微生物防腐剂包括(但不限于)苯扎氯铵、苄索氯铵(benzethonium chloride)、苯甲醇、溴硝丙二醇(bronopol)、十六烷基三甲基溴化铵(cetrimide)、西吡氯铵、氯己定(chlorhexidine)、三氯叔丁醇、氯甲酚、氯二甲酚(chloroxylenol)、甲酚(cresol)、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪脲(imidurea)、酚、苯氧乙醇、苯乙基醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞(thimerosal)。实例性抗真菌防腐剂包括(但不限于)对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。实例性醇类防腐剂包括(但不限于)乙醇、聚乙二醇、酚、酚类化合物、双酚、三氯叔丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙基醇。实例性酸性防腐剂包括(但不限于)维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其它防腐剂包括(但不限于)生育酚、乙酸生育酚酯、迪特肟去铁胺(deteroxime mesylate)、十六烷基三甲基溴化铵、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、乙二胺、十二烷基硫酸钠(SLS)、月桂基醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、Glydant
对羟基苯甲酸甲酯、
115、
II、NeoloneTM、KathonTM和/或
实例性缓冲剂包括(但不限于)柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、D-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、戊酮酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、磷酸氢钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、乙醇等和/或其组合。
实例性润滑剂包括(但不限于)硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石粉、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、十二烷基硫酸钠等，和其组合。
实例性油包括(但不限于)杏仁油、苦杏仁油、鳄梨油、巴巴苏油、香柠檬油、黑加仑籽油、琉璃苣油、杜松油、甘菊油、芸苔油、藏茴香油、巴西棕榈油、蓖麻油、肉桂油、可可脂、椰子油、鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉叶油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、尨牛儿油、葫芦油、葡萄籽油、榛子油、海索油、肉豆蔻酸异丙酯、荷荷巴油、夏威夷核果油、杂薰衣草油、薰衣草油、柠檬油、山苍子油、澳大利亚果油、锦葵油、芒果籽油、白芒花籽油、貂油、肉豆蔻油、橄榄油、橙油、大西洋胄胸鲷油、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀木香油、萨斯葵纳(sasquana)油、香薄荷油、沙棘油、芝麻油、乳木果脂、硅油、大豆油、葵花籽油、茶树油、蓟草油、椿花油、香根油、胡桃油、和麦芽油。实例性油包括(但不限于)硬脂酸丁酯、辛酸三甘油酯、癸酸三甘油酯、环甲硅油、癸二酸二乙酯、二甲硅油360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油和/或其组合。
用于经口和非经肠投与的液体剂型包括(但不限于)医药上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除活性成份外，液体剂型可包含业内常用的惰性稀释剂(例如水或其它溶剂)、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐脂肪酸酯和其混合物。除惰性稀释剂以外，口服组合物还可包括佐剂，例如润湿剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。在某些实施例中，对于非经肠投与，使组合物与增溶剂混合，例如
醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合。
可根据已知技术使用适宜分散剂、润湿剂和/或悬浮剂来调配可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂可为存于无毒性非经肠可接受稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如存于1，3-丁二醇中的溶液。可用的可接受媒剂和溶剂尤其为水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。通常使用无菌不挥发油作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可采用任何温和的不挥发油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。诸如油酸等脂肪酸可用于制备注射剂。
可注射调配物可通过(例如)使用细菌截留滤器过滤和/或通过纳入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述组合物可在使用前溶于或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。
为延长活性成份的效应，通常期望减缓来自皮下或肌内注射的活性成份的吸收。此可通过使用水溶性较低的结晶或非晶形材料的液体悬浮液来达成。则药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又可取决于晶体大小和结晶形式。或者，非经肠投与药物形式的延迟吸收可通过使药物溶解或悬浮于油性媒剂中来达成。可通过在生物可降解聚合物(例如，聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成药物的微囊基质来制备可注射储积形式。根据药物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质可控制药物释放速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可注射储积调配物是通过将药物包埋至与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
直肠或阴道投与用组合物通常为栓剂，其可通过将组合物与在环境温度下为固体但在体温下为液体的适宜非刺激性赋形剂(例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，并且因此所述栓剂可在直肠或阴道腔内融化并释放活性成份。
经口投与用固体剂型包括胶囊、锭剂、丸剂、粉剂和颗粒。在所述固体剂型中，使活性成份与至少一种医药上可接受的惰性赋形剂混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或填充剂或膨胀剂(例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸)、粘合剂(例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶)、保湿剂(例如甘油)、崩解剂(例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠)、溶液迟延剂(例如石蜡)、吸收促进剂(例如季铵化合物)、润湿剂(例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯)、吸收剂(例如高岭土和膨润土)和润滑剂(例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、聚乙二醇固体、十二烷基硫酸钠)和其混合物。在胶囊、锭剂和丸剂情形下，剂型可包含缓冲剂。
在使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇和诸如此类等赋形剂的软质和硬质填充明胶胶囊中可采用相似类型的固体组合物作为填充剂。可用包膜和外壳(例如肠溶包膜和医药调配领域熟知的其它包膜)来制备锭剂、糖衣锭剂、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型。其可任选地包含遮光剂并且可具有仅或优先在某部分肠道中任选地以延迟方式释放活性成份的组成。可用包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。在使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇和诸如此类等赋形剂的软质和硬质填充明胶胶囊中可采用相似类型的固体组合物作为填充剂。
局部或经皮投与组合物的剂型可包括软膏剂、糊剂、乳霜、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。通常，可在无菌条件下使活性成份与医药上可接受的赋形剂和/或任一所需防腐剂和/或可能需要的缓冲剂混合。此外，本发明涵盖使用透皮贴剂，其通常具有将化合物受控递送至身体的额外优点。所述剂型可通过(例如)使化合物溶于和/或分散于适宜介质中来制备。或者或另外，可通过提供速率控制膜和/或通过使化合物分散于聚合物基质和/或凝胶中来控制速率。
用于递送本文所述真皮内医药组合物的适宜装置包括短针装置，例如以下专利中所述装置；美国专利第4,886,499号、第5,190,521号、第5,328,483号、第5,527,288号、第4,270,537号、第5,015,235号、第5,141,496号、和第5,417,662号。真皮内组合物可通过限制针刺入皮肤的有效穿透长度的装置(例如PCT公开案WO 99/34850中所述装置)和其功能等效物来投与。通过液体喷射注射器和/或通过刺穿角质层并产生到达真皮的射流的针来将液体组合物递送至真皮的喷射注射装置是适宜的。喷射注射装置阐述于(例如)以下专利中：美国专利第5,480,381号、第5,599,302号、第5,334,144号、第5,993,412号、第5,649,912号、第5,569,189号、第5,704,911号、第5,383,851号、第5,893,397号、第5,466,220号、第5,339,163号、第5,312,335号、第5,503,627号、第5,064,413号、第5,520,639号、第4,596,556号、第4,790,824号、第4,941,880号、第4,940,460号、和PCT公开案WO 97/37705和WO 97/13537。使用压缩气体来加速呈粉剂形式的疫苗穿过皮肤外层到达真皮的粉剂/粒子发射递送装置是适宜的。或者或另外，可在真皮内投与的传统芒图氏(mantoux)方法中使用习用注射器。
适合局部投与的调配物包括(但不限于)液体和/或半液体制剂，例如搽剂、洗剂、水包油和/或油包水乳液(例如乳霜、软膏剂和/或糊剂)和/或溶液和/或悬浮液。可局部投与的调配物可包含(例如)约1％至约10％(w/w)活性成份，但活性成份的浓度可高至所述活性成份在溶剂中的溶解度限值。局部投与用调配物可另外包含一或多种本文所述额外成份。
医药组合物可以适合通过口前腔经肺投与的调配物形式来制备、包装和/或出售。此一调配物可包含干粒子，其包含活性成份并且直径在约0.5nm至约7nm或约1nm至约6nm范围内。所述组合物方便地呈干粉形式，其用于使用包含干粉储存器(可将推进剂流引导至所述储存器中以分散粉剂)的装置来投与，和/或使用自推进溶剂/粉剂分散容器(例如在密封容器中包含溶于和/或悬浮于低沸点推进剂中的活性成份的装置)来投与。所述粉剂包含粒子，其中至少98重量％的粒子的直径大于0.5nm并且至少95数量％的粒子的直径小于7nm。或者，至少95重量％的粒子的直径大于1nm并且至少90数量％的粒子的直径小于6nm。干粉组合物可包括固体精细粉剂稀释剂(例如糖)并且可方便地以单位剂型来提供。
低沸点推进剂一般包括液体推进剂，其沸点在大气压下低于65°F。推进剂一般可占组合物的50％至99.9％(w/w)，并且活性成份可占组合物的0.1％至20％(w/w)。推进剂可另外包含额外成份，例如液体非离子型和/或固体阴离子型表面活性剂和/或固体稀释剂(其粒径可具有与包含活性成份的粒子相同的数量级)。
经调配用于经肺递送的医药组合物可以溶液和/或悬浮液的微滴形式来提供活性成份。所述调配物可以水性和/或稀醇溶液和/或悬浮液形式来制备、包装和/或出售，其任选地无菌，包含活性成份，并且可方便地使用任何喷雾和/或雾化装置来投与。所述调配物可另外包含一或多种额外成份，包括(但不限于)矫味剂(例如糖精钠)、挥发性油、缓冲剂、表面活性剂和/或防腐剂(例如羟苯甲酯)。通过此投与路径提供的微滴的平均直径可在约0.1nm至约200nm范围内。
本文所述可用于经肺递送的调配物可用于鼻内递送医药组合物。适合鼻内投与的另一调配物是包含活性成份并且平均粒径为约0.2μm至500μm的粗粉。此一调配物是以服用嗅剂的方式来投与，即通过鼻道自紧靠鼻子放置的粉剂容器中快速吸入。
适合经鼻投与的调配物可包含(例如)大约少至0.1％(w/w)并且多至100％(w/w)的活性成份，并且可包含一或多种本文所述额外成份。医药组合物可以适合经颊投与的调配物形式来制备、包装和/或出售。所述调配物可呈例如使用习用方法制备的锭剂和/或菱形锭剂形式，并且可包含(例如)0.1％至20％(w/w)活性成份，其余部分包含经口可溶解和/或可降解组合物并且任选地包含一或多种本文所述额外成份。或者，适合经颊投与的调配物可包含含有活性成份的粉剂和/或气溶胶化和/或雾化溶液和/或悬浮液。所述粉末化、气溶胶化和/或气溶胶化调配物在分散时的平均粒径和/或滴径在约0.1nm至约200nm范围内，并且可另外包含本文所述任何额外成份中的一或多者。
医药组合物可以适合经眼投与的调配物形式来制备、包装和/或出售。所述调配物可呈(例如)眼滴剂形式，其包括(例如)活性成份存于水性或油性液体赋形剂中的0.1/1.0％(w/w)溶液和/或悬浮液。所述滴剂可另外包含缓冲剂、盐和/或本文所述任何额外成份中的一或多者。可使用的其它可经眼投与的调配物包括以微晶形式和/或以脂质体制剂形式包含活性成份的调配物。耳滴剂和/或眼滴剂意欲涵盖在本发明范畴内。
在医药药剂的调配和/或制造中的一般考虑因素可参见(例如)雷明顿：药学理论与实践，第21版，利平科特，威廉姆斯和威肯出版社，2005(以引用方式并入本文中)。
投与
本发明提供包含将本发明超荷电蛋白或复合体投与有需要的个体的方法。可使用可有效预防、治疗、诊断疾病、病症和/或病况(例如与工作记忆缺陷有关的疾病、病症和/或病况)或使其成像的任一量和任一投与路径将超荷电蛋白或复合体或其医药组合物、成像组合物、诊断性组合物或预防性组合物投与个体。所需确切量可随个体而变，其取决于个体的物种、年龄和一般状况、疾病严重度、具体组合物、其投与模式、其活性模式和诸如此类。通常将本发明组合物调配为便于投与和均匀给药的剂量单位形式。然而，应理解，本发明组合物的总日剂量应由主治医生在合理的医学判断范围内来决定。对任一特定患者的具体治疗有效剂量水平、预防有效剂量水平或适宜成像剂量水平可取决于多种因素，包括所治疗病症和所述病症的严重度；所用具体化合物的活性；所用具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所用具体化合物的投与时间、投与路径和排泄速率；治疗持续时间；与所用具体化合物组合或同时使用的药物；和医药界熟知的类似因素。
可将超荷电蛋白或包含与至少一种欲递送药剂缔合的超荷电蛋白的复合体和/或其医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物投与动物，例如哺乳动物(例如人类、家畜、猫、狗、小鼠、大鼠等)。在一些实施例中，将超荷电蛋白或复合体和/或其医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物投与人类。
可通过任何路径来投与本发明超荷电蛋白或包含与至少一种欲递送药剂缔合的超荷电蛋白的复合体和/或其医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物。在一些实施例中，超荷电蛋白或复合体和/或其医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物是通过多种路径中的一或多种来投与，包括经口、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、皮下、心室内、经皮、真皮内、经直肠、阴道内、腹膜内、局部(例如通过粉剂、软膏剂、乳霜、凝胶、洗剂和/或滴剂)、经粘膜、经鼻、经颊、肠内、经玻璃体、瘤内、舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；以经口喷雾剂、经鼻喷雾剂和/或气溶胶形式和/或通过门静脉导管。在一些实施例中，通过全身性静脉内注射来投与超荷电蛋白或复合体和/或其医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物。在具体实施例中，可以静脉内和/或经口方式投与超荷电蛋白或复合体和/或其医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物。在具体实施例中，可以容许超荷电蛋白或复合体穿过血脑屏障、脉管屏障或其它上皮屏障的方式来投与超荷电蛋白或复合体和/或其医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物。
然而，本发明涵盖通过任一适宜路径来递送超荷电蛋白或复合体和/或其医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物，其中考虑到药物递送科学的可能进展。
一般来说，最适宜投与路径可取决于多种因素，包括超荷电蛋白或包含与至少一种欲递送药剂缔合的超荷电蛋白的复合体的性质(例如其在胃肠道、血流等环境中的稳定性)、患者状况(例如患者是否能容忍特定投与途径)等。本发明涵盖通过任何适宜途径来递送医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物，其中考虑到药物递送科学的可能进展。
在某些实施例中，本发明组合物可每天一或多次以足以递送以下量的剂量水平来投与：每天约0.0001mg/kg个体体重至约100mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、or约1mg/kg至约25mg/kg，从而获得期望的治疗性、诊断性、预防性或成像效应。可一天三次、一天两次、一天一次、每隔一天、每隔三天、每周、每两周、每三周、或每四周递送期望剂量。在某些实施例中，可使用多次投与(例如两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次、或更多次投与)来递送期望剂量。
超荷电蛋白或包含与至少一种欲递送药剂缔合的超荷电蛋白的复合体可与一或多种其它治疗剂、预防剂、诊断剂或成像剂组合使用。“与……组合”并不意欲暗示所述药剂必须同时投与和/或调配后一起递送，但这些递送方法在本发明范畴内。组合物可与一或多种其它期望治疗性性程序或医疗程序同时施用、在其之前施用、或在其之后施用。一般来说，每种药剂可以针对所述药剂确定的剂量和/或时间表来投与。在一些实施例中，本发明涵盖可将医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物与可改良其生物利用度、降低和/或改变其代谢、抑制其排泄和/或改变其在体内的分布的药剂组合递送。
另外应了解，组合使用的治疗活性、预防活性、诊断活性或成像活性剂可在单一组合物中一起投与，或可在不同组合物中分开投与。一般来说，预期组合使用的药剂的使用水平可不超过其在单独使用时的水平。在一些实施例中，组合使用时的水平可低于单独使用时的水平。
在组合方案中使用的特定疗法(治疗剂或程序)组合应考虑期望治疗剂和/或程序的相容性以及欲达到的期望治疗效果。还应了解，所用疗法可对同一种病症达成期望效果(例如，可用于治疗癌症的本发明组合物可与化学治疗剂同时投与)，或其可达成不同的效果(例如，控制任何不良效果)。
试剂盒
本发明提供多种用于方便和/或有效地实施本发明方法的试剂盒。试剂盒通常可包含足量和/或足够数量的组份以使得使用者可对个体实施多次治疗和/或实施多次实验。
在一些实施例中，试剂盒包含以下中的一或多者：(i)本文所述超荷电蛋白；(ii)欲递送药剂；(iii)形成包含与至少一种药剂缔合的超荷电蛋白的复合体的说明书。
在一些实施例中，试剂盒包含以下中的一或多者：(i)本文所述超荷电蛋白；(ii)核酸；(iii)形成包含与至少一种核酸缔合的超荷电蛋白的复合体的说明书。
在一些实施例中，试剂盒包含以下中的一或多者：(i)本文所述超荷电蛋白；(ii)肽或蛋白质；(iii)形成包含与至少一种欲递送肽或蛋白质缔合的超荷电蛋白的复合体的说明书。
在一些实施例中，试剂盒包含以下中的一或多者：(i)本文所述超荷电蛋白；(ii)小分子；(iii)形成包含与至少一种小分子缔合的超荷电蛋白的复合体的说明书。
在一些实施例中，试剂盒包含以下中的一或多者：(i)本文所述超荷电蛋白或包含与至少一种欲递送药剂缔合的超荷电蛋白的复合体；(ii)至少一种医药上可接受的赋形剂；(iii)用于将医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物投与个体的注射器、针、敷料器等；和(iv)制备医药组合物和将所述组合物投与个体的说明书。
在一些实施例中，试剂盒包含以下中的一或多者：(i)本文所述医药组合物，其包含超荷电蛋白或包含与至少一种欲递送药剂缔合的超荷电蛋白的复合体；(ii)用于将医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物投与个体的注射器、针、敷料器等；和(iii)将医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物投与个体的说明书。
在一些实施例中，试剂盒包含一或多个可用于修饰目标蛋白以产生超荷电蛋白的组件。这些试剂盒通常包括产生超荷电蛋白所需的所有或大多数试剂。在某些实施例中，此一试剂盒包括电脑软件来帮助研究者设计本发明超荷电蛋白。在某些实施例中，此一试剂盒包括实施定点诱变所需的试剂。
在一些实施例中，试剂盒可包括其它组件或试剂。例如，试剂盒可包含缓冲剂、试剂、引物、寡核苷酸、核苷酸、酶、缓冲剂、细胞、培养基、平板、管、说明书、载体等。在一些实施例中，试剂盒可包含使用说明书。
在一些实施例中，试剂盒包括多个单位剂量的医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物，所述组合物包含超荷电蛋白或包含超荷电蛋白与至少一种欲递送药剂的复合体。可以(例如)数字、字母和/或其它标记形式和/或用日历插件来提供记忆帮助，从而指明治疗方案中可投与剂量的天数/时间。可以与医药组合物、预防性组合物、诊断性组合物或成像组合物的剂量类似或不同的形式包括安慰剂剂量或钙膳食补充剂，以提供每天进行投药的试剂盒。
试剂盒可包含一或多个器皿或容器，从而使得可分开容纳某些个别组份或试剂。试剂盒可包含将个别容器包封在相对封闭的环境中以供市场销售的构件(例如塑料盒，其中可包封说明书、诸如泡沫聚苯乙烯等包装材料等)。通常在实验室中包装试剂盒各组件以便于使用。
阅读以下实例后可进一步了解本发明的这些和其它方面，所述实例意欲阐释本发明的某些特定实施例，但并不欲限制其范围，本发明范围是由随附权利要求书来界定的。
实例
实例1：使蛋白质超荷电可赋预超常的恢复能力
材料和方法
设计程序和超荷电蛋白质序列
自已公开的结构数据来鉴别AvNAPSA＜150的溶剂暴露残基(下文中显示为灰色)(韦伯(Weber)等人，1989，科学，243：85；迪尔(Dirr)等人，1994，分子生物学杂志，243：72；帕德拉克(Pedelacq)等人，2006，自然生物技术，24：79；上述各文献是以引用方式并入本文中)，其中AvNAPSA是每个侧链原子平均相邻原子数(在
内)。对于超荷负电，是带电荷的或高极性溶剂暴露残基(DERKNQ)突变为Asp或Glu；或对于超荷正电，使其突变为Lys或Arg。绿色荧光蛋白(GFP)变体中的其它欲突变表面暴露位置是基于GFP同系物之间所述位置的序列可变性来选择。
蛋白质表达和纯化
针对大肠杆菌密码子使用而优化的合成基因购自DNA 2.0，将其克隆至pET表达载体(诺维根)中，并在15℃下在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中过表达5-10小时。通过离心收获细胞并通过超声波处理来使其裂解。通过Ni-NTA琼脂糖色谱(Qiagen)来纯化蛋白质，缓冲液更换为100mM NaCl、50mM磷酸钾(pH 7.5)，并通过超滤(密理博(Millipore))来浓缩。在自然条件下纯化所有GFP变体。
表面静电势计算(图1B-D)
-30和+48超荷电GFP变体的模型是基于超折叠GFP的晶体结构(帕德拉克等人，2006，自然生物技术，24：79；其是以引用方式并入本文中)。静电势是使用APBS来计算(拜克(Baker)等人，2001，美国科学院学报，美国，98：10037；其是以引用方式并入本文中)并用PyMol(德拉诺(Delano)，2002，PyMOL分子图形系统(The PyMOLMolecular Graphics System)，www.pymol.org；其是以引用方式并入本文中)使用-25kT/e(红色)至+25kT/e(蓝色)的量表来显示。
蛋白质染色和UV诱导荧光(图2A)
通过电泳在10％变性聚丙烯酰胺凝胶中分析0.2μg的每种GFP变体并用考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)染料进行染色。将0.2μg存于含有100mM NaCl的25mMTris pH 8.0中的相同蛋白质样品置于0.2mL埃彭道夫管(Eppendorftube)中并在UV光(360nm)下拍照。
热变性和聚集(图3A)
在25mM Tris pH 8.0、100mM NaCl和10mM β-巯基乙醇(BME)中将纯化GFP变体稀释至2mg/mL，随后在UV照射下(“天然的”)拍照。将样品加热至100℃并保持1分钟，随后在UV照射下(“沸腾的”)再次拍照。最后，在室温下使样品冷却2小时并在UV照射下(“冷却的”)再次拍照。
化学诱导聚集(图3B)
添加2，2，2-三氟乙醇(TFE)以产生含有1.5mg/mL蛋白质、25mM Tris pH 7.0、10mM BME和40％TFE的溶液。在25℃下通过直角光散射监测聚集。
尺寸排除色谱(表4)
通过在Superdex 75凝胶过滤柱上分析20-50μg蛋白质来测定GFP变体的多聚态。缓冲液为100mM NaCl、50mM磷酸钾，pH 7.5。通过与一组在相同条件下单独分析的分子量已知的单体蛋白标准品对比来确定分子量。
表4.计算的和通过实验确定的蛋白质特性。
名称MW(kD)长度(aa)n荷正电n荷负电n荷电Q净pl ΔG(kcal/mol)a天然MW(kD)b煮沸后的可溶性％c
GFP(-30) 27.8 248 19 49 68 -30 4.8 10.2 n.d. 98
GFP(-25) 27.8 248 21 46 67 -25 5.0 n.d. n.d. n.d.
sfGFP 27.8 248 27 34 61 -7 6.6 11.2 n.d. 4
GFP(+36) 28.5 248 56 20 76 +36 10.4 8.8 n.d. 97
GFP(+48) 28.6 248 63 15 78 +48 10.8 7.1 n.d. n.d.
n荷正电，带正电的氨基酸数(每个单体)
n荷负电，带负电的氨基酸数
n荷电，带电荷氨基酸的总数
Q净，在中性pH下的理论净电荷
pI，等电点计算值
n.d.，未测定
a通过胍盐变性来测量(图2C)。
b通过尺寸排除色谱来测量。
c在100℃下保持5min，冷却至25℃，并短暂离心后保留在上清液中的蛋白质百分比。
超荷电GFP
绿色荧光蛋白(GFP)称作“超折叠GFP”(sfGFP)的变体的折叠效率和对变性剂的抗性已高度优化(帕德拉克等人，2006，自然生物技术，24：79；其是以引用方式并入本文中)。超折叠GFP的净电荷为-7，与野生型GFP类似。通过在简单算法的引导下计算氨基酸的溶剂暴露(参见材料和方法)，从而设计GFP的超荷电变体。超荷电GFP的理论净电荷为+36并且是通过使其29个溶剂暴露性最强的残基突变为带正电的氨基酸来产生(图1)。编码sfGFP或超荷电GFP(“GFP(+36)”)的基因表达产生强绿色荧光细菌。在蛋白质纯化后，测量GFP(+36)的荧光特性并且发现所述特性与sfGFP极其类似。
设计并纯化其它净电荷为+48、-25和-30的超荷电GFP，并且还发现其都表现sfGFP样荧光(图2A)。所有超荷电GFP变体都显示与sfGFP类似的圆二色谱，表明所述蛋白质具有类似的二级结构含量(图2B)。尽管存在多至36处突变，但超荷电GFP变体的热力学稳定性仅稍低于sfGFP(1.0-4.1kcal/mol，图2C和表4)。
尽管sfGFP是长期GFP优化的产物(吉尔普曼(Giepmans)等人，2006，科学，312：217；其是以引用方式并入本文中)，但其仍对由热或化学解折叠引起的聚集易感。将sfGFP加热至100℃可诱导其定量沉淀和荧光不可逆的损失(图3A)。相反，超荷电GFP(+36)和GFP(-30)在加热至100℃时仍然可溶，并且在冷却后可恢复大部分荧光(图3A)。40％2，2，2-三氟乙醇(TFE)在25℃下于数分钟内可诱导sfGFP完全聚集，而+36和-30超荷电GFP变体在相同条件下于数小时内不会发生显著聚集或荧光损失(图3B)。
超荷电GFP变体显示对带有相反电荷的高荷电高分子具有强可逆亲合力(图3C)。在以1∶1化学计量混合在一起时，GFP(+36)与GFP(-30)立即形成绿色荧光共沉淀，从而表明折叠蛋白发生缔合。GFP(+36)可以类似方式与高浓度的RNA或DNA共沉淀。添加NaCl足以溶解所述复合体，这与其形成的静电基础一致。相反，sfGFP不受添加GFP(-30)、RNA或DNA的影响(图3C)。
结论
总之，可通过用带同性电荷的氨基酸简单地替代具有不同结构和功能的单体和多聚蛋白质溶剂中暴露性最强的残基来使其“超荷电”。超荷电显著改变蛋白质的分子间特性，从而赋予其显著聚集抗性和以折叠形式与带相反电荷的高分子(例如“分子维可牢”)缔合的能力。
与这些显著分子间效应相反，本文所研究七种超荷电蛋白的分子内特性(包括折叠、荧光、配体结合和酶促催化)在很大程度上保持完整。因此，超荷电可为降低蛋白质的聚集倾向并改良溶解度而不消除其功能的有用方法。这些原理在新生蛋白设计工作中尤其有用，其中包括聚集在内的不可预知的蛋白质操作特性仍然是大问题。
这些观察结果也可阐明天然蛋白质的适度净电荷分布(纳伊特(Knight)等人，2004，美国科学院学报，美国，101：8390；吉特林(Gitlin)等人，2006，应用化学国际英文版，45：3022；上述各文献是以引用方式并入本文中)：蛋白质数据库(PDB)中84％的多肽的净电荷在(例如)±10范围内。上述结果与以下假说存在争议：高净电荷可产生足够静电排斥从而强迫发生解折叠。实际上，GFP(+48)的净正电荷高于当前PDB中的任一多肽，但其仍保留折叠和发荧光的能力。相反，这些发现表明，非特异性分子间附着可能不利于过多高荷电天然蛋白质的进化。几乎所有具有极高净电荷的天然蛋白质(例如结合RNA的核糖体蛋白L3(+36)和L15(+44)或结合钙阳离子的肌集钙蛋白(-80))都可与带相反电荷的物质缔合，这是其基本细胞功能的一部分。
实例2：超荷电蛋白可用于将核酸有效递送至细胞中
图5显示，超荷电GFP可非特异性并且可逆地缔合带相反电荷的高分子(“蛋白质维可牢”)。所述相互作用可导致形成沉淀。与变性蛋白的聚集物不同，这些沉淀含有折叠的荧光GFP并且溶于1M盐中。图中展示：单独的+36GFP；与-30GFP混合的+36GFP；与tRNA混合的+36GFP；与tRNA在1M NaCl中混合的+36GFP；超折叠GFP(“sfGFP”；-7GFP)；和与-30GFP混合的sfGFP。
图6显示，超荷正电GFP结合siRNA。通过以不同比率混合+36GFP与siRNA(经30分钟，在25℃下)并在3％琼脂糖凝胶上运行所述混合物来测定两种组份之间的结合化学计量(库马尔(Kumar)等人，2007，自然，449：39；其是以引用方式并入本文中)。所测试+36GFP∶siRNA的比率为0∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶10。+36GFP/siRNA复合体在琼脂糖凝胶中不与siRNA共移动。显示+36GFP可以约1∶3的化学计量的与siRNA形成稳定复合体，表明一个超荷电GFP可结合约三个siRNA分子。此特性使得可使用少量超荷正电GFP将siRNA有效递送至细胞中。此外，因为递送试剂具有荧光性，并且因此可通过荧光显微术来观察，所以可使用此光谱技术来评价siRNA递送。相反，非超荷正电蛋白不结合siRNA。还测试50∶1比率的sfGFP∶siRNA，但甚至再次高过量水平下，sfGFP也不与siRNA缔合。
图7显示，超荷正电GFP穿透细胞。将海拉细胞与1nM GFP一起培育3小时，洗涤，固定并染色。在此实验中测试三种GFP变体：sfGFP(-7)、-30GFP和+36GFP。显示+36GFP而非sfGFP或-30GFP可在数分钟内有效穿透海拉细胞。所显示位置最初在细胞膜处，之后刺入并进入细胞内。显示+36GFP可在海拉细胞中稳定保持≥5天。结果展示于图7中。左侧是DNA的DAPI染色以标记细胞位置。中间是GFP染色以显示GFP发生细胞摄取的位置。右侧是在其出现时显示定位的影像。
为证实超荷正电GFP在siRNA递送中的实用性，在海拉细胞中使用常用的市售阳离子脂质转染试剂阳离子脂质体2000TM(英杰(Invitrogen))来比较siRNA转染效率与基于超荷正电GFP的siRNA转染。
一般来说，在总体积为1mL的细胞培养条件中，在10％血清/培养基中将细胞平铺至约80％铺满。移除血清/培养基溶液，并用PBS和500μL无血清培养基将细胞洗涤两次。在单独容器中，添加500μL无血清培养基，向其中添加1μL50μMsiRNA溶液(总浓度为100nM)和1.66μL15μMsc(+36)GFP(总浓度为40nM)。通过倒转混合内含物并将其培育5分钟。此后，将混合物添加至含有500μL无血清培养基的孔中以达成50nM siRNA和20nM scGFP的终浓度。将此溶液在37℃培育器(5％CO2)中放置4小时，移出，并用PBS洗涤两次。然后用1mL 10％FBS/培养基处理细胞。将细胞培育4天，之后收获测定基因敲除。
图8显示，超荷正电GFP能将siRNA递送至人类细胞中。具体来说，显示+36GFP可将siRNA递送至海拉细胞中。+36GFP递送以远高于阳离子脂质体的转染效率更大量的siRNA。用以下物质处理海拉细胞：约2μM阳离子脂质体2000和50nM(125pmol)Cy3-siRNA(左图)或30nM+36GFP和50nM(125pmol)Cy3-siRNA(右图)。与阳离子脂质体不同，特别是在添加诸如青霉素和链霉素等抗生素后，+36GFP不引发细胞毒性。
为证实超荷电蛋白在核酸递送中的广泛实用性，在多种细胞中重复实施此实验，包括对基于阳离子脂质的siRNA转染具有抗性的细胞。图9-11显示，超荷正电GFP能将siRNA递送至对传统转染方法具有抗性的细胞系中。图9显示，超荷正电GFP能将siRNA递送至3T3-L1前脂肪细胞(“3T3L细胞”)中。用以下物质处理3T3L细胞：约2μM阳离子脂质体2000和50nM(125pmol)Cy3-siRNA(左图)或30nM+36GFP和50nM(125pmol)Cy3-siRNA(右图)。阳离子脂质体对鼠类3T3-L1前脂肪细胞的转染较差，但+36GFP可有效转染。使用霍克斯特通道(蓝色)来使DNA可视化，由此标记细胞位置；使用Cy3通道(红色)来使Cy3标记的siRNA可视化；使用GFP通道(绿色)来使GFP可视化。黄色表示siRNA与GFP之间的共定位位点。与阳离子脂质体不同，特别是在添加诸如青霉素和链霉素等抗生素后，+36GFP不引发细胞毒性。
图10显示，超荷正电GFP能将siRNA递送至大鼠IMCD细胞中。用以下物质处理大鼠IMCD细胞：约2μM阳离子脂质体2000和50nM(125pmol)Cy3-siRNA(左图)或20nM+36GFP和50nM(125pmol)Cy3-siRNA(右图)。阳离子脂质体对大鼠IMCD细胞转染较弱，但+36GFP可有效转染。使用霍克斯特通道(蓝色)来使DNA可视化，由此标记细胞位置；使用Cy3通道(红色)来使Cy3标记的siRNA可视化；使用GFP通道(绿色)来使GFP可视化。黄色表示siRNA与GFP之间的共定位位点。与阳离子脂质体不同，特别是在添加诸如青霉素和链霉素等抗生素后，+36GFP不引发细胞毒性。
图11显示，超荷正电GFP能将siRNA递送至人类ST14A神经元中。用以下物质处理人类ST14A神经元：约2μM阳离子脂质体2000和50nM(125pmol)Cy3-siRNA；或50nM+36GFP和50nM(125pmol)Cy3-siRNA。阳离子脂质体对人类ST14A神经元的转染较弱，但+36GFP可有效转染。使用DAPI通道(蓝色)来使DNA可视化，由此标记细胞位置；使用Cy3通道(红色)来使Cy3标记的siRNA可视化；使用GFP通道(绿色)来使GFP可视化。黄色表示siRNA与GFP之间的共定位位点。在两种对传统转染方法具有抗性的其它细胞类型(即尤尔卡特细胞和PC 12细胞)中观察到与图9-11中所示类似的结果。与阳离子脂质体不同，特别是在添加诸如青霉素和链霉素等抗生素后，+36GFP不引发细胞毒性。
图13展示对siRNA转染实验的流式细胞术分析。每个柱对应于通过不同转染方法实施的实验：阳离子脂质体(蓝色)；和20nM+36GFP(红色)。每个图表对应于用不同细胞类型实施的实验：IMCD细胞、PC 12细胞、海拉细胞、3T3L细胞、和尤尔卡特细胞。X轴代表自Cy3通道获得的测量值，其是siRNA荧光的读数。Y轴代表流式细胞术实验中的细胞计数。流式细胞术数据表明，使用+36GFP可比阳离子脂质体更有效地以siRNA转染细胞。
为证实+36GFP递送的siRNA抑制基因表达的有效性，通过蛋白质印迹来检查GAPDH的细胞水平。如图13中所示，+36GFP可将siRNA有效递送至细胞中并以与阳离子脂质体相当的水平来抑制GAPDH。使用约2μM阳离子脂质体2000(黑色柱)或20nM+36GFP(绿色柱)将50nM GAPDH siRNA转染至五种不同细胞类型(海拉、IMCD、3T3L、PC 12和尤尔卡特细胞系)中。Y轴代表GAPDH蛋白水平，以微管蛋白水平的分数表示。
图14展示各种细胞穿透用机械探针对超荷正电GFP介导的siRNA转染的效应。用多种探针中的一种将海拉细胞处理30分钟并且随后用5nM+36GFP处理。然后用肝素+探针进行洗涤并在PBS+探针中成像。样品包括：无探针；4℃预培育(抑制能量依赖性过程)；100mM蔗糖(抑制网格蛋白介导的胞吞作用)；25μg/ml制霉菌素(破坏穴样内陷功能)；25μM松胞菌素B(抑制巨胞饮作用)；和5μM莫能菌素(抑制内体受体再循环)。在4℃下进行的实验显示，+36GFP的细胞穿透涉及能量消耗。用蔗糖和制霉菌素进行的实验显示，+36GFP的细胞摄取不涉及网格蛋白介导的胞吞作用或穴样内陷胞吞作用。用松胞菌素B和莫能菌素进行的实验显示，+36GFP的细胞摄取不涉及巨胞饮作用，但可能涉及早期内体。
图15展示有助于细胞穿透活性的各种因素。显示电荷密度可有助于细胞穿透活性。例如，显示60nM Arg6不能转染siRNA。显示电荷强度可有助于细胞穿透活性。例如，显示+15GFP不能穿透细胞或转染siRNA。还显示“蛋白样”特征可有助于细胞穿透活性。例如，显示60nM Lys20-50不能转染siRNA。本发明显示，在一些实施例中，电荷密度不足以使蛋白质穿透细胞。本发明显示，在一些情况下，电荷强度可能是必需的但不足以使蛋白质穿透细胞。本发明进一步显示，一些蛋白样特征可有助于细胞穿透。
实例3：超荷电绿色荧光蛋白的哺乳动物细胞穿透、siRNA转染和DNA转染
业内文献最近阐述通过对非保守的溶剂暴露残基进行广泛诱变来对蛋白质进行表面重建而不消除其结构或功能(劳伦斯MS(Lawrence MS)、菲利普斯KJ(PhillipsKJ)、刘DR(2007)，使蛋白质超荷电可赋予超常的恢复能力(Supercharging proteins canimpart unusual resilience)，美国化学学会期刊(J.Am.Chem.Soc.)129：10110-10112；在2007年6月1日申请并且作为WO 2007/143574在2007年12月13日公开的国际PCT专利申请案PCT/US07/70254；在2006年6月2日申请的美国临时专利申请案U.S.S.N.60/810,364和在2006年8月9日申请的U.S.S.N.60/836,607；上述各文献是以引用方式并入本文中)。在替代残基都带正电或都带负电时，所得“超荷电”蛋白可保留其活性，同时获得罕见特性，例如对聚集的较强抗性和结合带相反电荷的高分子的能力。例如，已报导具有+36理论净电荷的绿色荧光蛋白(+36GFP)具有高聚集抗性，甚至在煮沸并冷却后也可保留荧光性，并且可与DNA和RNA通过静电相互作用可逆地复合。
先前已阐述多种能穿透哺乳动物细胞的阳离子肽，包括源自HIV Tat的肽(弗兰克尔AD(Frankel AD)、帕伯CO(Pabo CO)(1988)，来自人免疫缺陷病毒的tat蛋白的细胞摄取(Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus)，细胞55：1189-1193；格林M(Green M)、列文斯坦PM(Loewenstein PM)(1988)，化学合成的人免疫缺陷病毒tat反式激活蛋白的自主功能结构域(Autonomous functional domains ofchemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein)，细胞55：1179-1188；上述各文献是以引用方式并入本文中)和来自触角控制基因同源结构域的穿透肽(索伦PE(Thoren PE)、佩尔松D(Persson D)、卡尔森M(Karlsson M)、诺登B(Norden B)(2000)，触角控制基因穿透肽异位穿过脂双层-第一次直接观察(Theantennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers-the first directobservation)，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett)482：265-268；其是以引用方式并入本文中)。斯切帕兹(Schepartz)和合作者最近已显示，含有包埋在II型聚脯氨酸螺旋中的最小阳离子基元的小折叠蛋白可有效穿透真核细胞(丹尼尔斯DS(DanielsDS)、斯切帕兹A(2007)，基于最小阳离子PPII基元的固有细胞穿透性微型蛋白质(Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif)，美国化学学会期刊，129：14578-14579；史密斯BA、丹尼尔斯DS、科普林AE(Coplin AE)、乔丹GE(Jordan GE)、麦格雷戈LM(McGregor LM)等人，(2008)，通过α-螺旋精氨酸显示最小阳离子细胞穿透型微型蛋白(Minimally cationic cell-permeable miniatureproteins via alpha-helical arginine display).美国化学学会期刊130：2948-2949；上述各文献是以引用方式并入本文中)。雷恩斯(Raines)与合作者最近用表面暴露的聚精氨酸贴片改造蛋白质，从而赋予其穿透细胞的能力(福克斯SM(Fuchs SM)、雷恩斯RT(2007)赋予细胞穿透性的精氨酸移植(Arginine grafting to endow cell permeability)，ACS化学生物学(ACS Chem Biol)2：167-170；福克斯SM、路特考斯基TJ(Rutkoski TJ)、宫VM(Kung VM)、格罗谢尔RT(Groeschl RT)、雷恩斯RT(2007)，通过精氨酸移植来增强细胞毒素的效能(Increasing the potency ofa cytotoxin with an arginine graft)，蛋白质改造的设计与选择(Protein Eng Des Sel)20：505-509；上述各文献是以引用方式并入本文中)。根据这些研究，假设诸如+36GFP等超荷正电蛋白可以导致细胞穿透的方式缔合带负电的细胞膜组份。
在本发明实例中，阐述净电荷为+15、+25和+36的超荷正电GFP变体的细胞穿透特征。我们发现，+36GFP可通过硫酸化肽聚糖介导的肌动蛋白依赖性胞吞作用有效进入细胞。在与siRNA预混合时，+36GFP将siRNA有效递送至各种细胞系中并且不产生细胞毒性，所述细胞系包括若干种已知对阳离子脂质介导的转染具有抗性的细胞系。使用+36GFP递送至细胞中的siRNA能在五分之四的所测试哺乳动物细胞系中实现基因沉默。对比+36GFP与若干种具有相当或更高电荷强度和电荷密度的合成肽的siRNA转染能力表明，所观察到的siRNA递送模式可能需要+36GFP的蛋白样特征，此特征在阳离子肽中不存在。在与衍生自血凝素的溶内体性肽融合时，+36GFP也能以容许质粒基基因表达的方式将质粒DNA转染至若干种抵抗阳离子脂质介导的转染的细胞系中。
结果
超荷电GFP的哺乳动物细胞穿透.
先前已生成并表征“超折叠GFP”(sfGFP)的一系列经表面重建的变体(帕德拉克JD、卡邦托斯S(Cabantous S)、托恩T(Tran T)、特维里格TC(Terwilliger TC)、沃尔多GS(Waldo GS)(2006)，超折叠绿色荧光蛋白的改造和表征(Engineering andcharacterization ofa superfolder green fluorescent protein)，自然生物技术(Nat Biotechnol)24：79-88；其是以引用方式并入本文中)，其理论净电荷介于-30至+48范围内并保留荧光性(劳伦斯MS、菲利普斯KJ、刘DR(2007)使蛋白质超荷电可赋予超常的恢复能力.美国化学学会期刊129：10110-10112；其是以引用方式并入本文中)。对这些超荷电GFP穿透哺乳动物细胞的能力的评估需要移除表面结合的未内化GFP的方法。因此确认，已知可自细胞移除表面结合的阳离子蛋白的洗涤条件(帕德拉克JD、卡邦托斯S、托恩T、特维里格TC、沃尔多GS(2006)超折叠绿色荧光蛋白的改造和表征.自然生物技术24：79-88)也可有效移除细胞表面结合的超荷正电GFP。用+36GFP在4℃下处理海拉细胞，此温度使得+36GFP可结合至细胞外侧但阻断内化(见下文)。在4℃下用PBS或用含肝素PBS将细胞洗涤三次并通过流式细胞术分析GFP荧光。发现用PBS洗涤的细胞具有大量GFP(推测为表面结合)，而用含肝素PBS洗涤的细胞表现的GFP荧光强度与未处理细胞非常类似(图22)。这些发现确认，用肝素洗涤三次可有效移除表面结合的超荷正电GFP。
随后在37℃下将海拉细胞与10-500nM sfGFP(理论净电荷为-7)、-30GFP、+15GFP、+25GFP、或+36GFP一起培育4小时(图16A)。在培育后，用含肝素PBS将细胞洗涤三次并通过流式细胞术来分析。在用sfGFP或-30GFP处理的细胞中未观察到可检测内化蛋白。然而，发现用+25GFP或+36GFP处理的海拉细胞可含有大量内化GFP。相反，用+15GFP处理的细胞含有仅为十分之一的内化GFP，表明正电荷强度是有效细胞穿透的重要决定因素(图16B)。我们发现，+36GFP甚至在低至10nM的浓度下也可容易地穿透海拉细胞(图23)。
为测试+36GFP的细胞穿透的普遍性，使用四种其它哺乳动物细胞类型来重复实施这些实验：髓质内层收集管(IMCD)细胞、3T3-L前脂肪细胞、大鼠嗜铬细胞瘤PC 12细胞和尤尔卡特T细胞。流式细胞术分析揭示，200nM+36GFP可有效穿透所有五种所测试细胞(图16C)。通过荧光显微术来确认+36GFP在稳定附着的海拉、IMCD和3T3-L细胞系中的内化(见下文)。实时成像显示，+36GFP与海拉细胞的细胞膜快速结合并且在数分钟内内化为穿刺灶，其向细胞内侧移动并合并为较大灶，这与通过胞吞作用进行摄取一致。
+36GFP细胞穿透的机械探针
为阐释+36GFP进入细胞的机制，于多种条件下在海拉细胞中重复细胞穿透实验，每种所述条件都可阻断胞吞作用途径中的不同组份(佩恩CK(Payne CK)、琼斯SA(Jones SA)、陈C(Chen C)、庄X(Zhuang X)(2007)，细胞表面蛋白聚糖和蛋白聚糖结合配体的内化与运输(Internalization and trafficking of cell surface proteoglycans andproteoglycan-binding ligands)，运输(Traffic)8：389-401；维尔德霍恩S(Veldhoen S)、劳费尔SD(Laufer SD)、托尔姆普A(Trampe A)、莱斯托T(Restle T)(2006)，小干扰RNA通过非共价连接细胞穿透肽的细胞递送：摄取和生物效应的定量分析(Cellulardelivery of small interfering RNA by a non-covalently attached cell-penetrating peptide：quantitative analysis of uptake and biological effect)，核酸研究34：6561-6573；上述各文献是以引用方式并入本文中)。在+36GFP处理之前和期间使海拉细胞冷却至4℃时未观察到+36GFP穿透细胞(图17B)。此结果说明，+36GFP的摄取需要能量依赖性过程，这与胞吞作用一致(德莎耶丝S、莫里斯MC、迪维塔G(Divita G)、海茨F(Heitz F)(2005)，细胞穿透肽：治疗学中用于细胞内递送的工具(Cell-penetratingpeptides：tools for intracellular delivery of therapeutics)，细胞和分子生命科学，62：1839-1849；其是以引用方式并入本文中)。随后评估5μg/mL非律平或25μg/mL制霉菌素的效应，其是已知可抑制小窝蛋白依赖性胞吞作用的小分子。两种抑制剂都未显著改变+36GFP内化(分别参见图17C和17D)。类似地，用氯丙嗪(网格蛋白介导的胞吞作用的已知抑制剂)处理对+36GFP细胞穿透几乎无影响(图17E)。另外，用50nM+36GFP和10μg/mL荧光标记的转铁蛋白(已知可以网格蛋白依赖性方式内化的蛋白质)同时处理海拉细胞(霍普金斯CR(Hopkins CR)、特罗布里奇IS(Trowbridge IS)(1983)，人类A431癌细胞中转铁蛋白和转铁蛋白受体的内化与处理(Internalization and processing of transferrin and the transferrin receptor in humancarcinoma A431cells)，细胞生物学杂志(J Cell Biol)97：508-521；其是以引用方式并入本文中)几乎不导致GFP/转铁蛋白共定位(图17F)。然而，用松胞菌素D(肌动蛋白聚合抑制剂)处理显著降低+36GFP细胞穿透(图17G)。总之，这些结果与通过能量依赖性内吞途径进行+36GFP摄取的模型一致，其需要肌动蛋白聚合，并且不需要网格蛋白或小窝蛋白。
根据对阳离子肽的细胞摄取机制的先前研究(佩恩CK、琼斯SA、陈C、庄X(2007)细胞表面蛋白聚糖和蛋白聚糖结合配体的内化与运输，运输8：389-401；福克斯SM、雷恩斯RT(2004)聚精氨酸进入哺乳动物细胞的途径(Pathway for polyarginine entry intomammalian cells).生物化学43：2438-2444；上述各文献是以引用方式并入本文中)，假设阴离子细胞表面蛋白聚糖可用作受体来介导+36GFP内化。为探查此假说，用80mM氯酸钠(ATP硫酸化酶抑制剂，此酶是生物合成硫酸化蛋白聚糖所需的酶)预处理海拉细胞(巴尤尔勒PA(Baeuerle PA)、胡特纳WB(Huttner WB)(1986)，氯酸盐-完整细胞中蛋白质硫酸化的有效抑制剂(Chlorate-a potent inhibitor of protein sulfationin intact cells)，生物化学生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Commun)141：870-877；其是以引用方式并入本文中)。这些条件完全阻断+36GFP穿透(图17H)。在蛋白聚糖在+36GFP摄取中的作用的进一步探查中，比较在野生型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞与蛋白聚糖缺陷型CHO细胞(PGD-CHO)(缺少木糖基转移酶，此酶是糖胺聚糖合成所需的酶)中的内化。野生型CHO细胞(图17I)而非PGD-CHO细胞(图17J)可有效内化+36GFP。这些发现表明，+36GFP穿透哺乳动物细胞需要与硫酸化细胞表面肽聚糖结合。
+36GFP结合siRNA并将siRNA递送至多种哺乳动物细胞系中
已观察到超荷正电蛋白与DNA和tRNA形成复合体的能力(劳伦斯等人，(2007)使蛋白质超荷电可赋予超常的恢复能力.美国化学学会期刊129：10110-10112；其是以引用方式并入本文中)。根据这些结果，评估+15、+25和+36GFP在体外以各种化学计量比率结合siRNA的能力。使用凝胶迁移分析(库马尔P、吴H(Wu H)、麦克布莱德JL(McBrideJL)、荣格KE(Jung KE)、金MH等人，(2007)，将小干扰RNA经血管递送至中枢神经系统(Transvascular delivery of small interfering RNA to the centralnervous system).自然，448：39-43；其是以引用方式并入本文中)，观察+25和+36GFP与siRNA以约2∶1的化学计量结合，同时与单一siRNA分子复合平均需要五个以上+15GFP蛋白(图18A)。相反，在分析条件下100当量的sfGFP未以可检测程度结合siRNA。随后，检验+15、+25和+36GFP将所结合siRNA递送至海拉细胞中的能力。将Cy3偶联的GAPDH siRNA(安宾(Ambion))与200nM+36GFP短暂混合，并在无血清培养基中将所得混合物添加至细胞并保持4小时.用含肝素PBS将细胞洗涤三次并通过流式细胞术来分析Cy3-siRNA摄取。观察到，相对于单独用siRNA处理，+25和+36GFP分别将100倍和1000倍的siRNA递送至海拉细胞中(图3B)，并且相对于常用阳离子脂质转染试剂阳离子脂质体2000递送约20倍的siRNA(图18C)。相反，+15GFP未将siRNA有效转染至海拉细胞中(图18B)。
除海拉细胞以外，+36GFP能在IMCD细胞、3T3-L前脂肪细胞、大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和尤尔卡特T细胞中有效递送siRNA，所述四种细胞系对使用阳离子脂质体2000进行siRNA转染具有抗性(卡洛蒂F、巴祖因M(Bazuine M)、可卡雷恩T(Kekarainen T)、赛潘J(Seppen J)、伯格诺内科(Pognonec)等人，(2004)，有效转导静止成熟3TL-L1脂细胞的慢病毒载体(Lentiviral vectors efficiently transduce quiescentmature 3TL-L1 adipocytes)，分子疗法9：209-217；马H、朱J(Zhu J)、马龙斯基M(Maronski M)、考特鲍尔PT(Kotzbauer PT)、李VM、迪希特MA(Dichter MA)等人，(2002)用于高效脂转染初代神经元和神经元细胞系的非经典核定位信号肽(Non-classical nuclear localization signal peptides for high efficiency lipofection of primaryneurons and neuronal cell lines).神经科学112：1-5；麦克马奈斯MT、海恩斯BB(HainesBB)、狄龙CP(Dillon CP)、怀特赫斯特CE(Whitehurst CE)、范帕里斯L(van Parijs L)等人，(2002)，在T淋巴细胞中小干扰RNA介导的基因沉默(Small interferingRNA-mediated gene silencing in T lymphocytes)，免疫学杂志(J Immunol)169：5754-5760；斯特雷特KA、斯区科莱特PK(Stricklett PK)、可罕JL(Kohan JL)、米勒MB、可罕DE(2007)，大鼠髓质内层收集管中内皮缩血管肽-1的钙调节(Calciumregulation of endothelin-1synthesis in rat inner medullary collecting duct)，美国生理学杂志-肾生理学293：F601-606；上述各文献是以引用方式并入本文中)。用阳离子脂质体2000和Cy3-siRNA处理可在海拉细胞中有效递送siRNA，但不能将siRNA大量递送至IMCD、3T3-L、PC12或尤尔卡特细胞中(图18C)。用福金6(罗氏)(不同阳离子脂质转染剂)和Cy3-siRNA处理IMCD或3T3-L细胞也不会在这些细胞中导致大量siRNA递送(图24)。相反，用+36GFP和Cy3-siRNA处理在所有五种所测试细胞系中达成较高siRNA水平(图18C)。与阳离子脂质体2000相比，+36GFP在所有情形下达成20倍至200倍高的Cy3信号水平。基于三次肝素洗涤移除未内化+36GFP的有效性(图22)，可将所述较高Cy3水平归因于较高水平的内化Cy3-siRNA而非细胞表面结合的+36GFP/Cy3-siRNA复合体。与此解释一致，对此研究中所用附着细胞系(海拉、IMCD和3T3-L)实施的荧光显微术揭示，Cy3-siRNA和+36GFP在推测将成为核内体的穿刺灶处内化(图18D)。这些结果共同表明，+36GFP可将siRNA有效递送至多种哺乳动物细胞系中，包括若干种常用阳离子脂质转染试剂转染较差的细胞系。
在松胞菌素D存在下或在4℃下用含有200nM+36GFP和50nM Cy3-siRNA的预混合溶液处理海拉细胞时，未观察到内化GFP或Cy3siRNA(图30)。这些数据证实，siRNA的递送机制依赖于胞吞作用和肌动蛋白聚合，这与本发明者在不存在siRNA时对+36GFP实施的机制研究一致。
+36GFP-siRNA复合体的大小和细胞毒性.
通过动态光散射(DLS)使用与转染所用相同的化学计量比率来分析+36GFP-siRNA复合体。自含有20μM+36GFP和5μM siRNA的混合物观察到大多呈单分散的粒子群，其流体动力学半径(Hr)为880.6±62.2nm(图31A)，这与显微观察数据一致(图31B)。这些观察结果证实，+36GFP在与siRNA混合时可能形成较大粒子，先前研究者使用阳离子递送试剂时曾观察到此现象(德莎耶丝等人，2005，细胞和分子生命科学，62：1839-49；和梅亚德与道迪，2008，先进药物输送评论，60：530-36；所述两个文献都是以引用方式并入本文中)。
为评价+36GFP-siRNA复合体的细胞毒性，在用0.2至2μM+36GFP和50nMsiRNA处理后24小时对所有五种细胞系实施MTT分析。这些分析揭示，对海拉、IMCD、3T3-L、PC 12或尤尔卡特细胞并无非常明显的细胞毒性(图25A)。
用+36GFP递送的siRNA使基因沉默
尽管上述结果证实了+36GFP将siRNA递送至多种哺乳动物细胞中的能力，但并未确认此siRNA可用于基因沉默。基于细胞内+36GFP的穿刺定位(图18D)，预期基因沉默可能需要+36GFP转染的siRNA至少部分自内体逸出。为评估用+36GFP递送的siRNA的基因抑制活性，用含有50nM GAPDH靶向siRNA和约2μM阳离子脂质体2000或200nM+36GFP的溶液处理海拉、IMCD、3T3-L、PC 12和尤尔卡特细胞。使细胞在siRNA转染溶液中暴露4小时，然后生长最多4天。
在海拉细胞中，观察到的GAPDHmRNA和蛋白水平的降低表明，阳离子脂质体2000与+36GFP二者可以相似动力学有效介导siRNA诱导的对GAPDH表达的抑制。用阳离子脂质体2000或+36GFP递送的GAPDH靶向siRNA在72小时后导致GAPDHmRNA水平降低约85％(图19A)。类似地，在用阳离子脂质体2000或用+36GFP递送siRNA后96小时，在海拉细胞中观察到GAPDH蛋白水平降低约75％(图19B)。类似地，对于约2μM阳离子脂质体2000或200nM+36GFP，用这两种转染剂递送β-肌动蛋白靶向siRNA可使海拉细胞中的β-肌动蛋白水平降低70-78％(图19B)。
与海拉细胞中的基因抑制效率不同，用阳离子脂质体2000和50nM siRNA处理IMCD、3T3-L、PC12和尤尔卡特细胞未实现GAPDH蛋白水平的显著降低(图19C)，这与这些细胞系对阳离子脂质介导的转染的抗性一致(图18C)。然而，在IMCD、3T3-L和PC12细胞中用200nM+36GFP和50nM siRNA处理导致GAPDH蛋白水平的44-60％抑制(图19C)。尽管+36GFP可有效递送siRNA(图18C)，但在尤尔卡特细胞中未观察到siRNA介导的对GAPDH表达的显著抑制(图19C)。
据推测，增强+36GFP递送的siRNA自内体逸出可提高基因沉默的有效性。在以化学方式破坏内吞囊泡的尝试中，用200nM+36GFP和50nM siRNA与氯喹(已知具有溶内体活性的小分子)(巴彻P(Erbacher P)、罗克AC、孟西尼M(Monsigny M)、密道克斯P(Midoux P)(1996)，氯喹在通过DNA/乳糖化聚赖氨酸复合体将基因转移至人类肝细胞瘤细胞系中的假定作用(Putative role of chloroquine in gene transfer into ahuman hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes)，实验细胞研究(ExpCell Res)225，186-194；其是以引用方式并入本文中)或芘丁酸盐(已显示其可促进内化聚精氨酸的胞质溶胶分布)(竹内T(Takeuchi T)、小菅M(Kosuge M)、中田A(Tadokoro A)、杉浦Y(Sugiura Y)、内西M(Nishi M)等人，(2006)通过芘丁酸盐介导的使用细胞穿透肽进行的直接快速细胞质递送(Direct and rapid cytosolic delivery usingcell-penetrating peptides mediated by pyrenebutyrate).ACS化学生物学1：299-303；其是以引用方式并入本文中)一起处理细胞。已证实将这些试剂添加至含有+36GFP和siRNA的混合物中会在所测试细胞系中产生细胞毒性。另外，生成并纯化+36GFP与血凝素2(HA2)肽的C末端融合物，已报导其可增强内体降解(伦德伯格P、El-安道劳斯S(El-Andaloussi S)、萨特鲁T(Sutlu T)、约翰松(Johansson H)、兰热尔U(LangelU)(2007)，短干扰RNA使用内体溶性细胞穿透肽的递送(Delivery of short interferingRNA using endosomolytic cell-penetrating peptides).美国实验生物学学会联合会杂志21：2664-2671；其是以引用方式并入本文中)。正如+36GFP的情形一般，HA2融合变体在所测试五种细胞系中表现低细胞毒性(图25A)。尽管用+36GFP-HA2融合物递送siRNA在海拉、IMCD、3T3-L和PC 12细胞中导致GAPDH蛋白水平降低，但抑制程度与使用+36GFP时相当(图19C)。
总之，这些结果表明，+36GFP和+36GFP-HA2能在多种哺乳动物细胞中递送siRNA并实现基因沉默，包括一些在用siRNA和基于阳离子脂质的转染剂处理时不表现基因沉默的细胞系。
+36GFP的稳定性和与+36GFP复合的RNA和DNA的稳定性
除了在不同哺乳动物细胞类型之间的普遍性和较低细胞毒性外，siRNA递送剂可抵抗快速降解。用蛋白水解酶K(广谱强蛋白酶)处理+36GFP揭示，+36GFP与牛血清白蛋白相比表现显著蛋白酶抗性。在蛋白水解酶K消化1小时后全部BSA都已裂解，而在1小时后68％的+36GFP保持未裂解，并且在6小时后48％保持未裂解(图32A)。还在37℃下用鼠类血清处理+36GFP(图32B)。在6小时后，未观察到显著降解，表明其可能的体内血清稳定性。与其相比，在将牛血清白蛋白于小鼠血清中培育相同时间时，在3小时后观察到71％降解，并且截至4小时时完全降解。
评价+36GFP保护siRNA和质粒DNA免受降解的能力。用鼠类血清在37℃下处理与+36GFP预复合的siRNA或siRNA。在3小时后，在缺少+36GFP的样品中仅5.9％的siRNA保持完整，而在与+36GFP预复合的样品中34％的siRNA保持完整(图32C)。类似地，在37℃下保持30分钟后质粒DNA几乎完全被鼠类血清降解，而在30分钟后基本上所有与+36GFP预复合的质粒DNA都保持完整，并且在1小时后84％的质粒DNA保持完整(图32D)。这些结果共同表明，+36GFP能显著抑制血清介导的siRNA和质粒DNA降解。
比较+36GFP与合成阳离子肽
为探查超荷正电GFP中赋予其将siRNA递送至细胞中的能力的特征，比较200nM+36GFP与一组200nM或2μM合成阳离子肽的siRNA转染能力。此阳离子肽组是由聚(L)-Lys(每个多肽含有平均约30个Lys残基的混合物)、聚(D)-Lys、Arg9和含有与+36GFP相同的理论净电荷和Lys∶Arg比率的合成+36肽((KKR)11RRK)组成。对经这些合成聚阳离子处理的海拉细胞的MTT分析显示，在所用浓度下细胞毒性较低，这与超荷正电GFP一致(图25B)。如通过流式细胞术所分析，所测试四种合成肽都未将可检测量的Cy3-siRNA递送至海拉细胞中，甚至在使用+36GFP实现有效siRNA递送或+15GFP实现可检测siRNA递送所需浓度的10倍浓度时也是如此(图20)。
结合+15GFP相对于+25和+36GFP表现较低细胞穿透和siRNA结合活性的观察结果(图18A和18B)，这些结果表明，尽管GFP必须带有足够正电荷以获得进入细胞和有效转染siRNA的能力，但正电荷强度和电荷密度并不足以赋予转染活性。相反，我们的发现表明，达成所观察到的全部细胞穿透与siRNA转染活性可能需要+36GFP的蛋白类特征，例如大小、球形形状或稳定性。
+36GFP介导的质粒DNA的转染
与siRNA的情形类似，通过凝胶迁移分析观察到，+36GFP与质粒DNA形成复合体(图26)。为测试+36GFP是否可以支持质粒基基因表达的方式将质粒DNA递送至细胞中，用与阳离子脂质体2000、+36GFP或+36GFP与血凝素2(HA2)肽的C末端融合物预混合的β-半乳糖苷酶表达质粒处理海拉、IMCD、3T3-L、PC12和尤尔卡特细胞，已报导所述融合物可促进内体降解(伦德伯格等人，2007，美国实验生物学学会联合会杂志，21：2664-71；其是以引用方式并入本文中)。在24小时后，使用基于荧光底物的分析来分析细胞的β-半乳糖苷酶活性。
与先前结果(图18和19)一致，阳离子脂质体2000处理在海拉细胞中产生显著β-半乳糖苷酶活性，但在PC 12细胞中仅产生中等β-半乳糖苷酶活性，并且在所测试的其它三种细胞系的任一种中未产生可检测活性(图21)。相反，由2μM+36GFP-HA2介导的质粒转染在海拉、IMCD和3T3-L细胞中产生显著β-半乳糖苷酶活性，并且在PC12细胞产生中等活性(图21)。引人注意的是，用质粒DNA和2μM+36GFP处理未产生可检测的β-半乳糖苷酶活性(图21)，表明尽管血凝素衍生肽缺少对siRNA介导基因沉默的效应，但其可促进DNA转染或质粒基表达效率(图19C)。
这些结果共同表明，+36GFP-HA2能以容许质粒基基因表达的方式将质粒DNA递送至哺乳动物细胞中，包括若干种对阳离子脂质介导的转染具有抗性的细胞系。+36GFP-HA2介导质粒DNA转染所需浓度高于+36GFP或+36GFP-HA2诱导有效siRNA转染所需量。
结论
本发明者已阐述了三种净电荷为+15、+25和+36的超荷正电GFP变体的细胞穿透、siRNA递送、siRNA介导基因沉默和质粒DNA转染特性的特征。本发明者发现，+36GFP具有高细胞穿透性并且能以低细胞毒性将siRNA有效递送至多种哺乳动物细胞系中，包括对基于阳离子脂质的转染具有抗性的细胞系。
机制研究揭示，+36GFP通过不依赖网格蛋白和小窝蛋白的胞吞作用途径进入细胞，其需要硫酸化细胞表面蛋白聚糖和肌动蛋白聚合。此递送途径不同于先前所述的真核细胞的核酸递送策略，所述先前策略依赖于细胞特异性靶向以定位其核酸载荷(宋(Song)等人，2005，自然生物技术，23：709-17；库马尔等人，2007，自然，448：39-43；和卡多佐(Cardoso)等人，2007，基因医学杂志(J.Gene Med.)，9：170-83；所有所述文献都是以引用方式并入本文中)。对于在细胞培养中的应用和甚至在某些体内应用中，可期望通用的非细胞类型特异性的核酸递送方法。
在所测试五种细胞系的四种中，+36GFP介导的siRNA递送诱导显著的基因表达抑制。此外，在同样的四种细胞系中，+36GFP-血凝素肽融合物可以容许质粒基基因表达的方式介导质粒DNA转染。当前所证实的转染长21个碱基对的RNA以及长度超过5,000bp的质粒DNA的能力表明，+36GFP和其衍生物可用作通用核酸递送载体。
许多传统递送方法依赖于共价连接的转染剂-核酸偶联物，例如碳纳米管-siRNA(刘等人，2007，应用化学国际英文版，46：2023-27；其是以引用方式并入本文中)、纳米粒子-siRNA(罗西(Rosi)等人，2006，科学，312：1027-30；其是以引用方式并入本文中)、TAT肽-siRNA(费舍尔(Fisher)等人，2002，生物化学杂志(J.Biol Chem.)，277：22980-84；其是以引用方式并入本文中)、胆固醇-siRNA(斯沃特查克(Soutschek)等人，2004，自然，432：173-78；其是以引用方式并入本文中)和动态多偶联物-siRNA(洛兹玛(Rozema)等人，2007，美国科学院学报，美国，104：12982-87；其是以引用方式并入本文中)。使用+36GFP仅需要将蛋白质与核酸混合在一起。此外，本文所述试剂是直接自细菌细胞纯化并且不与化学共转染剂(例如外源钙或氯喹)一起使用。
本发明者先前报导，+36GFP的热稳定性几乎与sfGFP相同，但与后者不同的是在煮沸和冷却后能再折叠(劳伦斯等人，2007，美国化学学会期刊，129：10110-12；其是以引用方式并入本文中)。本发明者现已证实，+36GFP表现对蛋白酶解的抗性、在鼠类血清中的稳定性和在鼠类血清中对所复合siRNA的显著保护性。因此，本发明涵盖以下认知：这些系统可用于体内核酸递送(例如递送至人类、哺乳动物、非人类或非哺乳动物细胞)。
因此，本发明首次阐述使用蛋白质表面重建方法来将核酸有效递送至哺乳动物细胞中。此惊人的重要效能(德莎耶丝等人，2007，分子生物学方法，386：299-308；和伦德伯格等人，2007，美国实验生物学学会联合会杂志，21：2664-71；所述两个文献都是以引用方式并入本文中)与以下特性互补：低细胞毒性、在哺乳动物血清中的稳定性、在不同哺乳动物细胞类型(包括若干种抵抗传统转染方法的细胞类型)之间的普遍性、转染较小RNA和较大DNA质粒二者的能力、直接自大肠杆菌细胞制备、和通过与目标未修饰核酸混合来使用的简便性。因此，本发明涵盖以下认知：超荷电蛋白代表一类对哺乳动物细胞中的一般核酸递送问题的新解决方案。
材料和方法
细胞培养
在含有10％胎牛血清(FBS，购自西格玛(Sigma))、2mM谷氨酰胺、5I.U.青霉素和5μg/mL链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modification ofEagle’s medium)(DMEM，购自西格玛)中培养海拉、IMCD、PC 12和3T3-L细胞。在含有10％FBS、2mM谷氨酰胺、5I.U.青霉素和5μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基(西格玛)中培养尤尔卡特细胞。所有细胞都是在37℃和5％CO2下培养。PC12细胞购自ATCC。
超荷电GFP蛋白的表达和纯化
使用先前报导方法的变化形式来纯化超荷电GFP变体(蛋白质序列列示于下文中)。简单地说，使GFP在BL21(DE3)大肠杆菌中过表达。通过在存于PBS中的2MNaCl中进行超声波处理来溶解细胞，发现此可增加分离GFP的总产率，并且如先前所述进行纯化(劳伦斯MS，菲利普斯KJ，刘DR(2007)使蛋白质超荷电可赋予超常的恢复能力.美国化学学会期刊129：10110-10112；其是以引用方式并入本文中)。通过在488nm下的吸光度来量化纯化GFP，其中假定消光系数为8.33x 104M-1cm-1(帕德拉克JD、卡邦托斯S、托恩T、特维里格TC、沃尔多GS(2006)超折叠绿色荧光蛋白的改造和表征.自然生物技术24：79-88；其是以引用方式并入本文中)。通过SDS PAGE和考马斯蓝染色来评估蛋白质纯度(图27)。此工作中所用GFP变体的荧光发射光谱是相似的(图28)。
超荷电GFP变体的蛋白质序列
-30GFP：
MGHHHHHHGGASKGEELFDGVVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPTLVTTLTYGVQCFSDYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDDHYLSTESALSKDPNEDRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK(SEQ ID NO：XX)
+15GFP：
MGHHHHHHGGASKGERLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKKDGTYKTRAEVKFEGRTLVNRIELKGRDFKEKGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKRKNGIKANFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSALSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(SEQ ID NO：XX)
+25GFP：
MGHHHHHHGGASKGERLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGTYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHNVYITADKRKNGIKANFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSALSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(SEQ ID NO：XX)
+36GFP：
MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK(SEQ ID NO：XX)
+36GFP-HA2：
MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYKGSAGSAAGSGEFGLFGAIAGFIENGWEGMIDG(SEQIDNO：XX)
凝胶迁移分析
凝胶迁移分析是基于库马尔等人的方法(库马尔P、吴H、麦克布莱德JL、荣格KE、金MH等人，(2007)将小干扰RNA经血管递送至中枢神经系统.自然，448：39-43；其是以引用方式并入本文中)。在25℃下将siRNA(10pmol)或质粒DNA(22fmol)与指定量的GFP变体在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中混合10分钟。通过非变性电泳使用15％丙烯酰胺凝胶来分析所得溶液的siRNA或使用1％琼脂糖凝胶来分析其质粒DNA，用溴化乙锭将其染色，并用UV光进行可视化。
基于阳离子脂质的和基于GFP的转染
根据制造商的协议来实施使用阳离子脂质体2000(英杰)和福金6(罗氏)的转染。尽管制造商并未提供这些试剂的分子量，但阳离子脂质体2000在转染期间的工作浓度为2μg/mL，并且基于此阳离子脂质的假定分子量≤1,000Da，估计此浓度对应于≥约2μM。
以80,000细胞/孔的密度将细胞平铺在12孔组织培养板上。在37℃下保持12小时后，用4℃(PBS)洗涤细胞，并且对于海拉、IMCD、3T3-L和PC 12细胞，在4℃下用500μL无血清DMEM更换培养基。
将尤尔卡特细胞自培养板孔转移至单独1.5mL管中，通过离心来沉淀，并在4℃下使其悬浮于500μL无血清RPMI 1640中。
在500μL4℃DMEM(对于海拉、IMCD、3T3-L和PC12细胞)或4℃RPMI 1640(对于尤尔卡特细胞)中混合GFP与siRNA或质粒DNA的溶液。在25℃下保持5min后，将此溶液添加至细胞中并轻微摇动以混合。在37℃下保持4小时后，自细胞移除溶液并更换为含有10％FBS的37℃培养基。GAPDH靶向Cy3标记的siRNA和未标记的siRNA购自安宾。质粒转染是使用pSV-β-半乳糖苷酶(普洛麦格)来实施。遵照制造商协议使用β-荧光分析试剂盒(诺维根)来测量β-半乳糖苷酶活性。
固定细胞成像
在用GFP和Cy3-siRNA处理后4小时，对细胞进行胰蛋白酶处理并再次平铺于涂布有基质胶的载玻片上含有10％FBS的培养基(BD生物科学)中。在37℃下保持24小时后，用存于PBS中的4％甲醛固定细胞，用DAPI染色(如果指出)，并且用配备有用于GFP和Cy3发射的滤光片的莱卡DMRB倒置显微镜成像。使用OpenLab软件(英普洛(Improvision))来制备图像。将GFP和Cy3的曝光时间分别固定在350msec和500msec。
活细胞成像
对于使用小分子抑制剂的实验，将细胞平铺在玻璃底组织培养板(MatTek，50mm未涂布塑料皿，具有1.5号玻璃厚度和14mm玻璃直径)上并在37℃下与抑制剂一起培育1小时，随后在37℃下用50nM+36GFP和抑制剂另外处理1小时。用含有抑制剂和20U/mL肝素的PBS将所得细胞洗涤三次以移除表面缔合的GFP，但是用50nM+36GFP在4℃下处理的细胞仅用含有20U/mL肝素的PBS洗涤一次以移除结合至载玻片上的GFP，但仍容许周边可见一些细胞表面结合的GFP。
使用具有油浸物镜(数值孔径1.45，60X，奥林巴斯(Olympus))呈落射荧光配置的倒置显微镜(奥林巴斯IX70)使细胞成像。用488nm谱线氩离子激光(麦-格公司(Melles-Griot))来激发GFP，并且用633nm氦-氖激光(麦-格公司)来激发阿莱克萨荧光二抗647。通过650nm远程二色镜(克鲁玛(Chroma))在光谱上分离长波长和短波长发射，并且在CCD照相机(CoolSnap HQ)上成像。使用665nm长通滤光片来检测阿莱克萨荧光二抗647，并使用535/20nm带通滤光片来检测GFP。在37℃下进行成像。
RT-QPCR
在转染后48、72或96小时用PBS洗涤细胞并遵照制造商协议使用雷柏试剂盒(Ribopure kit)(安宾)提取总RNA。用1μLDNA酶I(安宾)处理样品并在37℃下培育30分钟。遵照制造商协议用DNA酶I钝化剂(安宾)来使DNA酶I失活。遵照制造商协议使用逆转录试剂盒(Retroscript kit)(安宾)自800ng RNA生成互补DNA。QPCR反应含有1x IQ SYBR绿色基质混合物(拜耳雷德(BioRad))、3nM ROX参照染料(斯托塔根(Stratagene))、2.5μL逆转录反应混合物和200nM正向和反向引物二者：
正向GAPDH 5’-CAACTCACTCAAGATTGTCAGCAA-3’(SEQ ID NO：XX)
反向GAPDH 5’-GGGATGGACTGTGGTCATGA-3’(SEQ ID NO：XX)
正向β-肌动蛋白5’-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3’(SEQ IDNO：XX)
反向β-肌动蛋白5’-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3’(SEQ IDNO：XX)
在斯托塔根MX3000p QPCR系统中遵照以下程序实施QPCR反应：在95℃下保持15分钟，然后进行40个(在95℃下保持30秒，在55℃下保持1分钟，并且在72℃下保持30秒)的循环。在所述72℃步骤期间对扩增进行量化。通过使样品在95℃下保持1分钟，在55℃下保持30秒，并在95℃下保持30秒，并在自55℃加热至95℃期间监测荧光来获得解离曲线。使用MxPro v3.0软件(斯托塔根)来测定循环阈值并通过ΔΔCt方法进行分析。
蛋白质印迹
在转染后96小时用4℃PBS将细胞洗涤一次。用200μL含有蛋白酶抑制剂混合剂(罗氏)的RIPA缓冲液(波士顿生物产品(Boston Bioproducts))经5分钟裂解细胞。通过SDS-PAGE在4-12％丙烯酰胺凝胶(英杰)上分析所得细胞裂解产物。
通过电印迹将凝胶上的蛋白质转移至在甲醇中预先浸泡的PVDF膜(密理博)上。在5％乳状物中将膜封阻1小时，并且在4℃下与第一抗体一起在5％乳状物中培育过夜。所有抗体都购自德硕(Abeam)。用PBS将膜洗涤三次并用第二抗体(阿莱克萨荧光二抗680山羊抗兔兔IgG(英杰)或阿莱克萨荧光二抗800兔抗小鼠IgG(洛克兰德(Rockland)))在封阻缓冲液(Li-COR生物科学(Li-COR Biosciences))中处理30分钟。用50mM Tris(pH 7.4，含有150mM NaCl和0.05％Tween-20)将膜洗涤三次并使用奥德赛(Odyssey)红外成像系统(Li-COR生物科学)来成像。使用奥德赛成像软件2.0版来分析图像。代表性数据展示于图29中。将所显示GAPDH抑制水平标准化为β-微管蛋白水平；将0％抑制定义为在经约2μM阳离子脂质体2000和50nM阴性对照siRNA处理的细胞中的蛋白水平。
流式细胞术
用存于PBS中的20U/mL肝素(西格玛)将细胞洗涤三次以移除未内化GFP。对附着细胞进行胰蛋白酶处理，使其再悬浮于1mL含有1％FBS和75U/mL DNA酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))的PBS中。在25℃下在BD LSRII仪器中实施流式细胞术。在PBS使用滤光片来分析细胞的GFP(FITC)和Cy3发射。每个样品至少分析至少104个细胞。
合成阳离子肽
(Arg)9和(KKR)11(RRK)购自齐氏科技公司(Chi Scientific)并且是以≥95％的纯度来使用。聚(L)-Lys和聚(D)-Lys购自西格玛。聚(L)-Lys是分子量范围为1,000-5,000Da的混合物，并且分子量中值为3,000Da。聚(D)-Lys是分子量范围为1,000-5,000Da的混合物，并且分子量中值为2,500Da。所有合成肽的原液是以20μM的浓度在PBS中制备。
+36GFP-siRNA粒径表征
使用Protein Solution DynaPro仪器在25℃下使用存于PBS中的20μM+36GFP和5μM siRNA来实施动态光散射。在这些实验中使用纯化20-bp RNA双螺旋(5’GCAUGCCAUUACCUGGCCAU 3’，来自IDT；SEQ ID NO：XX)。对数据进行建模以拟合各向同性球体。使用莱卡DMRB倒置显微镜对通过DLS(20μM+36GFP和5μM siRNA，存于PBS中)分析的5μL溶液进行成像。
稳定性分析
为评价siRNA在鼠类血清中的稳定性，将siRNA(10pmol)与sfGFP(40pmol)混合，与+36GFP(40pmol)混合，或在25℃下于PBS中单独培育10分钟。将所得溶液添加至四体积的小鼠血清中(总计20μL)并在37℃下培育所示时间。将15μL所得溶液在水中稀释至总体积为100μL。添加100μLTRI试剂(安宾)和30μL氯仿。在剧烈混合并以1,000G离心15分钟中，回收水性层，通过添加15μL3M乙酸钠(pH 5.5)和二体积的95％乙醇使siRNA沉淀。使siRNA再悬浮于10mM Tris pH 7.5中并通过凝胶电泳在15％丙烯酰胺凝胶上分析。同时通过用5μL培育物实施抗GFP蛋白质印迹来测量+36GFP在与siRNA复合时的血清稳定性。
为评价与+36GFP复合的质粒DNA在鼠类血清中的稳定性，将质粒DNA(0.0257pmol)与2.57pmol、100当量或12.84pmol、500当量sfGFP或+36GFP在4μLPBS中混合10分钟。向此溶液中添加16μL小鼠血清(总计20μL)并在37℃下培育所示时间。通过酚-氯仿提取来分离DNA并通过凝胶电泳在1％琼脂糖凝胶上分析，用溴化乙锭染色，并用UV光进行可视化。
为评价蛋白质在鼠类血清中的稳定性，将存于2μLPBS中的100pmol每种蛋白与8μL鼠类血清(西格玛)混合并在37℃下培育。将样品与SDS蛋白质加样缓冲液混合并加热至90℃保持10分钟。通过SDS-PAGE在4-12％丙烯酰胺凝胶(英杰)上分析所得混合物并通过蛋白质印迹进行成像。
为评价在蛋白水解酶K存在下的稳定性，在37℃下用0.6单位蛋白水解酶K(新英格兰生物科学(New England Biosciences))处理100pmol+36GFP或BSA。将样品与SDS蛋白质加样缓冲液混合，加热至90℃并保持10分钟，并且通过SDS-PAGE在4-12％丙烯酰胺凝胶(英杰)上进行分析。
实例4：超荷电蛋白是有效蛋白质递送试剂
将荧光蛋白mCherry与+36GFP(通过具有氨基酸序列ALAL的可裂解连接体，SEQ ID NO：XX)、TAT和Arg9中的每一者融合以生成三种mCherry融合蛋白。测试这些融合物将mCherry递送至海拉、IMCD和PC12细胞中的能力。
为评价+36GFP将蛋白质递送至细胞中的效能，用(1)mCherry-TAT、(2)mCherry-R9、或(3)mCherry-+36GFP处理海拉、PC 12和3T3-L细胞。在DMEM中用50nM、500nM、1μM或2μM材料将细胞处理4小时，之后用肝素洗涤并实施FACS。
mCherry-ALAL-+36GFP穿透细胞的有效性远高于mCherry-TAT或mCherry Arg9(图33)。图34通过荧光显微术展示这三种融合物的内化。数据显示，+36GFP是非常有效的一般蛋白质递送试剂(图34)。
实例5：寻找(mining)基因组以获得天然超荷电蛋白
本发明涵盖以下认知：可寻找基因组(例如人类基因组)以鉴别可用于递送各种因子(例如核酸、蛋白质等)的天然超荷电蛋白。表达并纯化十种人类蛋白质(即C-Jun(蛋白质登录号：P05412)、TERF 1(P54274)、防御素3(P81534)、嗜酸性粒细胞活化趋化因子(Q9Y258)、N-DEK(P35659)、PIAS 1(075925)、Ku70(P12956)、肝素结合细胞因子(P21741)、HBEGF(Q99075)、HGF(P14210)、SFRS12-IP1(Q8N9Q2)、西科龙(Q9H6F5))，并且其中有四种(即HBEGF、N-DEK、C-jun和2HGF)表现出结合siRNA并将siRNA递送至细胞(即培养海拉细胞)中的能力。
通过凝胶迁移分析来分析人类蛋白质与siRNA的结合。凝胶迁移分析是基于库马尔等人的方法(库马尔P、吴H、麦克布莱德JL、荣格KE、金MH等人，(2007)将小干扰RNA经血管递送至中枢神经系统.自然，448：39-43；其是以引用方式并入本文中)。在25℃下将安宾阴性对照siRNA(约150ng)与指定量的人类蛋白质在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中混合10分钟。通过非变性电泳使用用于siRNA的15％丙烯酰胺凝胶分析所得溶液的未结合siRNA，用溴化乙锭染色，并用UV光进行可视化(图35A)。
分析人类蛋白质的到达海拉细胞的siRNA递送。以80,000细胞/孔的密度将细胞平铺在12孔组织培养板上。在37℃下保持12小时后，用4℃(PBS)将细胞洗涤三次并在4℃下用500μL无血清DMEM来更换。在500μL4℃DMEM中混合人类蛋白质与安宾阴性对照Cy3标记的siRNA的溶液。在25℃下保持5min后，将此溶液添加至细胞中并轻微摇动以混合。人类蛋白质的最终浓度为1微摩尔并且siRNA为50微摩尔。在37℃下保持4小时后，自细胞移除溶液并用含有10％FBS的37℃培养基来更换。然后通过固定细胞成像和流式细胞术来分析细胞的siRNA递送。蛋白质-siRNA复合体的内化展示于图35B中。
使用人类蛋白质以安宾Cy3标记的siRNA来转染海拉细胞，将其培育3天，随后分析靶向mRNA的降解(图35C)。比较靶向GAPDH mRNA水平与β-肌动蛋白mRNA水平。“对照”表示使用非靶向siRNA。使用阳离子脂质体2000作为阳性对照。
实例6：芘丁酸盐改良基因沉默的一致性
本发明者已发现，溶内体性药剂芘丁酸盐(二木(Futaki)等人，2006，ACS化学生物学，1：299；其是以引用方式并入本文中)可提高基因沉默效应并降低批次之间的可变性。不期望受限于任一具体理论，所述可变性可能是由于可变的离子内体逸出效率引起的。因此，本发明者已研发出改良基因沉默的效率、一致性和重现性的方法。
以下方案采用+36GFP和芘丁酸(PBA)，但可容易地普遍化为任何超荷电蛋白和任何溶内体性药剂(例如氯喹、HA2、蜂毒)。
使海拉细胞在12孔板中生长至约80％铺满。移除DMEM/10％FBS并用PBS将细胞洗涤3次。向各孔中添加1mL含有50μM PBA的PBS溶液。在37℃下将细胞在此溶液中培育5分钟。在小塑料管中，将200fmolGAPDH抑制性siRNA(2μL100μMsiRNA溶液)与800fmol+36GFP预混合并在25℃下将其培育5分钟。将占总体积四分之一(1/4)的siRNA/+36GFP复合体添加至含有1mL存于PBS中的50μMPBA的各孔中。轻微摇动组织培养盘以使各孔中的溶液均质化，从而获得含有50μM siRNA与200μM+36GFP的溶液。在37℃和所述条件下将细胞培育3小时。移除50μM PBA/PBS溶液并用PBS将细胞洗涤三次，之后添加1mL存于10％FBS中的DMEM。在所述条件下将细胞培育4天，并通过蛋白质印迹来量化GAPDH表达的敲除。
在50μM PBA/PBS中培育3小时后观察到约20％细胞毒性。在将海拉细胞于50μMPBA/PBS中培育≥4小时时，观察到远远较高的细胞毒性(约80％)。PBA的细胞毒性可随细胞类型而变。
等效内容和范围
所属领域技术人员仅使用常规实验即可了解或能够确定本文所阐述具体实施例的许多等效内容。本发明的范围并不意欲受限于上述说明，而是如随附权利要求书中所阐述。
所属领域技术人员仅使用常规实验即可了解或能确定本文所述本发明具体实施例的许多等效内容。本发明的范围并不意欲受限于上述说明，而是如随附权利要求书中所阐述。
除非上下文中表示相反含义或另有说明，否则在权利要求书中诸如“一”和“所述”等冠词可意指一个或不止一个。除非上下文中表示相反含义或另有说明，否则在一个群组中的一或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明被视为涵盖一个、一个以上、或所有群组成员都存在于、用于、或以其它方式涉及给定产物或过程的情况。本发明包括恰好只有一个群组成员存在于、用于、或以其它方式涉及给定产物或过程的实施例。本发明包括一个以上、或所有群组成员都存在于、用于、或以其它方式涉及给定产物或过程的实施例。此外，应理解本发明涵盖所有变化、组合和排列，其中将一或多个限制、要素、条款、说明性术语等自一或多个所列示权利要求引入另一权利要求中。例如，可将依赖于一个权利要求的任何另一权利要求修改为包括在依赖于相同基础权利要求的任何另一权利要求中发现的一或多个限制。此外，如果权利要求阐述组合物，应理解除非另有说明或除非所属领域技术人员确定会出现矛盾或不一致，否则本发明包括出于本文所述任一目的使用所述组合物的方法，并且本发明包括根据本文所揭示任一制备方法或业内已知其它方法制备所述组合物的方法，。
如果以列表形式展示要素，例如以马库西(Markush)群组格式展示，应理解其也揭示每个要素亚组并且可自所述群组中移除任何要素。同样应理解，一般来说，如果提及本发明或本发明各方面包含特定要素、特征等，那么本发明某些实施例或本发明某些方面是由所述要素、特征等组成或基本由其组成。出于简单性目的，本文中不再以这些表达具体描述所述实施例。还应注意，术语“包含”意欲是开放式的并且容许包括其它要素或步骤。
如果给定范围，则包括端点。此外，应理解，除非上下文和所属领域技术人员的理解中另有说明或另外明确表明，除非上下文明确表示其它含义，否则表示为范围的值在本发明不同实施例中可假定为所述范围内的任一具体值或子范围，精确到所述范围下限最小整数的十分之一。
另外，应理解，可自任何一或多项权利要求中明确排除在先前技术范围内的任何本发明特定实施例。由于认定所述实施例是所属领域技术人员已知的，因此即使本文中没有明确表示排除，也可将其排除。出于任何原因，不论是否涉及在先前技术中的存在，可自任何一或多项权利要求排除本发明组合物的任一特定实施例(例如任何超荷电蛋白；任何核酸；任何制造方法；任何使用方法等)。
Claims (93)
1.一种超荷电蛋白制剂，其中所述超荷电蛋白的总体净负电荷或净正电荷大于其相应未修饰蛋白且数量充足，并且所述超荷电蛋白经调配用于穿透至细胞中。
2.如权利要求1所述的制剂，其中所述制剂是医药上可接受的制剂。
3.一种将超荷电蛋白、或与超荷电蛋白缔合的药剂、或二者引入细胞中的方法，其包含：
使所述超荷电蛋白、或超荷电蛋白和与所述超荷电蛋白缔合的药剂与所述细胞在足以容许所述超荷电蛋白、或所述与超荷电蛋白缔合的药剂穿透至所述细胞中的条件下接触，由此将超荷电蛋白、或与超荷电蛋白缔合的药剂、或二者引入细胞中。
4.如权利要求3所述的方法，其进一步通过以下方式中的一或多者来确认所述超荷电蛋白或与所述超荷电蛋白缔合的药剂已经穿透所述细胞：检测标记、检测所述细胞中的生物学变化、或在投与所述超荷电蛋白、或与超荷电蛋白缔合的药剂的个体中检测诸如病症治疗等反应。
5.一种复合体，其包含：
超荷电蛋白，其中所述超荷电蛋白的总净电荷大于其相应未修饰蛋白；和
一或多种核因子。
6.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白具有总体净正电荷。
7.如权利要求6所述的复合体，其中所述总体净正电荷为约+5。
8.如权利要求6所述的复合体，其中所述总体净正电荷为约+10。
9.如权利要求6所述的复合体，其中所述总体净正电荷为约+15。
10.如权利要求6所述的复合体，其中所述总体净正电荷为约+20。
11.如权利要求6所述的复合体，其中所述总体净正电荷为约+25。
12.如权利要求6所述的复合体，其中所述总体净正电荷为约+30。
13.如权利要求6所述的复合体，其中所述总体净正电荷为约+35。
14.如权利要求6所述的复合体，其中所述总体净正电荷为约+40。
15.如权利要求6所述的复合体，其中所述目标超荷电蛋白在生理pH下所带正电荷多于其相应未修饰蛋白。
16.如权利要求6所述的复合体，其中所述目标超荷电蛋白在生理pH下所带正电荷比其相应未修饰蛋白多至少+5。
17.如权利要求6所述的复合体，其中所述目标超荷电蛋白在生理pH下所带正电荷比其相应未修饰蛋白多至少+10。
18.如权利要求6所述的复合体，其中所述目标超荷电蛋白在生理pH下所带正电荷比其相应未修饰蛋白多至少+5。
19.如权利要求6所述的复合体，其中所述目标超荷电蛋白在生理pH下所带正电荷比其相应未修饰蛋白多至少+5。
20.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白是荧光蛋白。
21.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。
22.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白是超荷正电GFP。
23.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白是具有以下序列的超荷正电GFP(+36GFP)：
MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK(SEQ ID NO：XX)。
24.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白包含如SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列。
25.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白包含所述如SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列中约20个氨基酸的区段。
26.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白包含所述如SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列中约30个氨基酸的区段。
27.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白包含所述如SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列中约40个氨基酸的区段。
28.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白包含所述如SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列中约50个氨基酸的区段。
29.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白包含所述如SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列中约100个氨基酸的区段。
30.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白包含与所述SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列约40％一致的氨基酸序列。
31.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白包含与所述SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列约50％一致的氨基酸序列。
32.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白包含与所述SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列约60％一致的氨基酸序列。
33.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白包含与所述SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列约70％一致的氨基酸序列。
34.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白包含与所述SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列约80％一致的氨基酸序列。
35.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白包含与所述SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列约90％一致的氨基酸序列。
36.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白包含与所述SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列约95％一致的氨基酸序列。
37.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白是绿色荧光蛋白与血凝素2(HA2)肽的融合蛋白。
38.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白是绿色荧光蛋白与血凝素2(HA2)肽的融合蛋白，其具有以下序列：
MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYKGSAGSAAGSGEFGLFGAIAGFIENGWEGMIDG(SEQ ID NO：XX)。
39.如权利要求5所述的复合体，其中所述核酸包含RNA。
40.如权利要求5所述的复合体，其中所述核酸包含DNA。
41.如权利要求5所述的复合体，其中所述核酸包含RNAi因子。
42.如权利要求41所述的复合体，其中所述RNAi因子选自由以下组成的群组：短干扰RNA、短发夹RNA、微小RNA和其组合。
43.如权利要求5所述的复合体，其中所述核酸包含RNAi诱导实体。
44.如权利要求5所述的复合体，其中所述核酸包含反义RNA。
45.如权利要求5所述的复合体，其中所述核酸包含核酶或脱氧核酶。
46.如权利要求5所述的复合体，其中所述核酸包含诱导三螺旋形成的RNA。
47.如权利要求5所述的复合体，其中所述核酸包含RNA适体。
48.如权利要求5所述的复合体，其中所述核酸包含载体。
49.如权利要求5所述的复合体，其中所述核酸包含驱动mRNA表达的载体。
50.如权利要求5所述的复合体，其中所述核酸包含驱动蛋白质表达的载体。
51.如权利要求5所述的复合体，其中超荷电蛋白与核酸的比率为约1∶1。
52.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白与核酸的比率为约1∶2。
53.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白与核酸的比率为约1∶3。
54.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白与核酸的比率为约1∶4。
55.如权利要求5所述的复合体，其中所述超荷电蛋白与核酸的比率为约1∶5。
56.一种复合体，其包含：
超荷电蛋白，其中所述超荷电蛋白的总净电荷大于其相应未修饰蛋白；和一或多种肽或蛋白。
57.一种复合体，其包含：
超荷电蛋白，其中所述超荷电蛋白的总净电荷大于其相应未修饰蛋白；和
一或多种小分子。
58.一种复合体，其包含：
选自由以下组成的群组的蛋白质：西科龙(cyclon)(识别号：Q9H6F5)、PNRCl(识别号：Q12796)、RNPS1(识别号：Q15287)、SURF6(识别号：075683)、AR6P(识别号：Q66PJ3)、NKAP(识别号：Q8N5F7)、EBP2(识别号：Q99848)、LSM11(识别号：P83369)、RL4(识别号：P36578)、KRR1(识别号：Q13601)、RY-1(识别号：Q8WVK2)、BriX(识别号：Q8TDN6)、MNDA(识别号：P41218)、H1b(识别号：P16401)、细胞周期蛋白(识别号：Q9UK58)、MDK(识别号：P21741)、PROK(识别号：Q9HC23)、FGF5(识别号：P12034)、SFRS(识别号：Q8N9Q2)、AKIP(识别号：Q9NWT8)、CDK(识别号：Q8N726)、β-防御素(识别号：P81534)、PAVAC(识别号：P18509)、嗜酸性粒细胞活化趋化因子-3(识别号：Q9Y258)、组蛋白H2A(识别号：Q7L7L0)和HMGB1(识别号：P09429)；和一或多种多核苷酸。
59.一种复合体，其包含：
选自由以下组成的群组的蛋白质：西科龙(识别号：Q9H6F5)、PNRCl(识别号：Q12796)、RNPS1(识别号：Q15287)、SURF6(识别号：075683)、AR6P(识别号：Q66PJ3)、NKAP(识别号：Q8N5F7)、EBP2(识别号：Q99848)、LSM11(识别号：P83369)、RL4(识别号：P36578)、KRR1(识别号：Q13601)、RY-1(识别号：Q8WVK2)、BriX(识别号：Q8TDN6)、MNDA(识别号：P41218)、H1b(识别号：P16401)、细胞周期蛋白(识别号：Q9UK58)、MDK(识别号：P21741)、PROK(识别号：Q9HC23)、FGF5(识别号：P12034)、SFRS(识别号：Q8N9Q2)、AKIP(识别号：Q9NWT8)、CDK(识别号：Q8N726)、β-防御素(识别号：P81534)、PAVAC(识别号：P18509)、嗜酸性粒细胞活化趋化因子-3(识别号：Q9Y258)、组蛋白H2A(识别号：Q7L7L0)和HMGB1(识别号：P09429)；和一或多种肽或蛋白质。
60.一种复合体，其包含：
选自由以下组成的群组的蛋白质：西科龙(识别号：Q9H6F5)、PNRCl(识别号：Q12796)、RNPS1(识别号：Q15287)、SURF6(识别号：075683)、AR6P(识别号：Q66PJ3)、NKAP(识别号：Q8N5F7)、EBP2(识别号：Q99848)、LSM11(识别号：P83369)、RL4(识别号：P36578)、KRR1(识别号：Q13601)、RY-1(识别号：Q8WVK2)、BriX(识别号：Q8TDN6)、MNDA(识别号：P41218)、H1b(识别号：P16401)、细胞周期蛋白(识别号：Q9UK58)、MDK(识别号：P21741)、PROK(识别号：Q9HC23)、FGF5(识别号：P12034)、SFRS(识别号：Q8N9Q2)、AKIP(识别号：Q9NWT8)、CDK(识别号：Q8N726)、β-防御素(识别号：P81534)、PAVAC(识别号：P18509)、嗜酸性粒细胞活化趋化因子-3(识别号：Q9Y258)、组蛋白H2A(识别号：Q7L7L0)和HMGB1(识别号：P09429)；和一或多种小分子。
61.一种超荷电蛋白，其中所述超荷电蛋白的总净电荷大于其相应未修饰蛋白，其中所述超荷电蛋白包含至少5个带正电但在所述相应未修饰蛋白中不带正电的氨基酸残基，并且其中所述带正电的氨基酸残基的每一者之间间隔至少1个氨基酸残基。
62.如权利要求61所述的超荷电蛋白，其中所述超荷电蛋白包含至少10个带正电但在所述相应未修饰蛋白中不带正电的氨基酸残基。
63.如权利要求61所述的超荷电蛋白，其中所述超荷电蛋白包含至少15个带正电但在所述相应未修饰蛋白中不带正电的氨基酸残基。
64.如权利要求61所述的超荷电蛋白，其中所述超荷电蛋白包含至少20个带正电但在所述相应未修饰蛋白中不带正电的氨基酸残基。
65.如权利要求61所述的超荷电蛋白，其中所述超荷电蛋白包含至少25个带正电但在所述相应未修饰蛋白中不带正电的氨基酸残基。
66.如权利要求61所述的超荷电蛋白，其中所述带正电的氨基酸残基的每一者之间间隔至少2个氨基酸残基。
67.如权利要求61所述的超荷电蛋白，其中所述带正电的氨基酸残基的每一者之间间隔至少3个氨基酸残基。
68.如权利要求61所述的超荷电蛋白，其中所述带正电的氨基酸残基的每一者之间间隔至少5个氨基酸残基。
69.如权利要求61所述的超荷电蛋白，其中所述带正电的氨基酸残基的每一者之间间隔至少10个氨基酸残基。
70.一种超荷电蛋白，其中所述超荷电蛋白的总净电荷大于其相应未修饰蛋白，其中所述超荷电蛋白包含至少5个带正电的氨基酸残基，其中所述至少5个带正电的氨基酸残基与存于所述相应未修饰蛋白中的相应氨基酸残基不同，并且其中所述带正电的氨基酸残基的每一者之间间隔至少1个氨基酸残基。
71.如权利要求61或70所述的超荷电蛋白，其中所述至少5个带正电的氨基酸残基的最远氨基末端与最远羧基末端之间的距离为约10个氨基酸。
72.一种超荷电蛋白，其中所述超荷电蛋白的总净电荷大于其相应未修饰蛋白，其中所述超荷电蛋白包含至少5个带正电的氨基酸残基，其中所述至少5个带正电的氨基酸残基与存于所述相应未修饰蛋白中的相应氨基酸残基不同，并且其中所述至少5个带正电的氨基酸残基中的至少60％定位于所述蛋白质的表面。
73.如权利要求72所述的超荷电蛋白，其中所述至少5个带正电的氨基酸残基中的至少70％定位于所述蛋白质的表面。
74.如权利要求72所述的超荷电蛋白，其中所述至少5个带正电的氨基酸残基中的至少80％定位于所述蛋白质的表面。
75.如权利要求72所述的超荷电蛋白，其中所述至少5个带正电的氨基酸残基中的至少90％定位于所述蛋白质的表面。
76.如权利要求72所述的超荷电蛋白，其中所述至少5个带正电的氨基酸残基中的至少95％定位于所述蛋白质的表面。
77.一种超荷电蛋白，其中至少5个天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺氨基酸残基与所述相应未修饰蛋白中的相应氨基酸残基不同，其中所述相应未修饰蛋白中具有最高AvNAPSA分数的所述至少5个天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺氨基酸残基突变为赖氨酸，并且其中所述至少5个氨基酸残基带正电荷。
78.一种医药组合物，其包含
如权利要求5至60中任一权利要求所述的复合体；和
医药上可接受的赋形剂。
79.一种方法，其包含以下步骤：
提供易患、患有或表现一或多种疾病、病症或病况症状的个体；
将如权利要求1至77中任一权利要求所述的超荷电蛋白或复合体或如权利要求78所述的医药组合物投与所述个体，从而改良至少一种症状。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述投与步骤是在足以使所述超荷电蛋白或复合体穿透所述个体的细胞的条件下实施。
81.如权利要求79所述的方法，其中所述疾病、病症或病况与mRNA、蛋白质或其组合的异常升高水平有关。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述复合体包含可降低所述mRNA或蛋白质的异常升高水平的核酸。
83.如权利要求79所述的方法，其中所述疾病、病症或病况与mRNA、蛋白质或其组合的表达有关。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述复合体包含可降低所述mRNA或蛋白质的表达水平的核酸。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述核酸选自由以下组成的群组：RNAi因子、RNAi诱导实体、反义RNA、核酶和其组合。
86.如权利要求79所述的方法，其中所述疾病、病症或病况与mRNA或蛋白质的异常低水平有关。
87.如权利要求79所述的方法，其中所述复合体包含可提高所述mRNA或蛋白质的异常升高水平的核酸。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述核酸包含表达载体。
89.如权利要求79所述的方法，其中所述投与步骤包含选自由以下组成的群组的投与路径：经口、静脉内、肌内、动脉内、皮下、心室内、局部、吸入和经粘膜递送。
90.一种试剂盒，其用于实施如权利要求79至89中任一权利要求所述的方法。
91.一种试剂盒，其包含如权利要求5至60中任一权利要求所述的复合体或如权利要求78所述的医药组合物。
92.一种评估超荷电蛋白的细胞穿透的方法，其包含：
任选地选择超荷电蛋白；
提供所述超荷电蛋白；
使所述超荷电蛋白与细胞接触；和
测定所述超荷电蛋白是否穿透所述细胞，由此评估超荷电蛋白的细胞穿透。
93.一种评估超荷电蛋白的细胞穿透的方法，其包含：
选择欲超荷电的蛋白质；
获得一个含一个或多个欲改变残基的集合以产生超荷电蛋白；
提供具有所述经改变残基集合的超荷电蛋白；
使所述超荷电蛋白与细胞接触；和
测定所述超荷电蛋白是否穿透所述细胞，由此评估超荷电蛋白的细胞穿透。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4837008P | 2008-04-28 | 2008-04-28 | |
| US61/048,370 | 2008-04-28 | ||
| US10528708P | 2008-10-14 | 2008-10-14 | |
| US61/105,287 | 2008-10-14 | ||
| PCT/US2009/041984 WO2009134808A2 (en) | 2008-04-28 | 2009-04-28 | Supercharged proteins for cell penetration |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102066405A true CN102066405A (zh) | 2011-05-18 |
| CN102066405B CN102066405B (zh) | 2015-09-30 |
Family
ID=41255735
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200980123772.1A Expired - Fee Related CN102066405B (zh) | 2008-04-28 | 2009-04-28 | 用于细胞穿透的超荷电蛋白 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110112040A1 (zh) |
| EP (1) | EP2297182A4 (zh) |
| JP (2) | JP2011523353A (zh) |
| CN (1) | CN102066405B (zh) |
| AU (1) | AU2009243187C1 (zh) |
| CA (1) | CA2725601A1 (zh) |
| WO (1) | WO2009134808A2 (zh) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103031337A (zh) * | 2012-09-28 | 2013-04-10 | 北京吉利奥生物科技发展有限公司 | 一种小核酸分子快递技术 |
| CN104011065A (zh) * | 2011-08-23 | 2014-08-27 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 肽纳米粒子及其用途 |
| CN104127868A (zh) * | 2014-05-06 | 2014-11-05 | 卢戌 | 一种肿瘤疫苗及其应用 |
| CN105219877A (zh) * | 2015-11-06 | 2016-01-06 | 林进 | Ccdc59的激动剂在制备骨性关节炎药物中的应用 |
| CN105745221A (zh) * | 2013-09-06 | 2016-07-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 用于功能性核酸酶的投递系统 |
| CN106459174A (zh) * | 2015-02-18 | 2017-02-22 | 麻省理工学院 | 水溶性跨膜蛋白及其制备和使用方法 |
| US11001817B2 (en) | 2014-10-31 | 2021-05-11 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery of cargo proteins via ARRDC1-mediated microvesicles (ARMMs) |
| CN114452266A (zh) * | 2022-02-09 | 2022-05-10 | 山东大学 | 一种基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统及其制备方法和应用 |
| TWI772324B (zh) * | 2016-09-12 | 2022-08-01 | 日商廣津生物化學股份有限公司 | 基於線蟲嗅覺的對氣味物質之趨性行動之評價方法、以及用於該評價方法的培養皿及行動評價系統 |
Families Citing this family (64)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HUE035793T2 (en) * | 2005-08-05 | 2018-05-28 | Araim Pharmaceuticals Inc | Cell protection peptides and their applications |
| AU2007256780B2 (en) | 2006-06-02 | 2013-08-29 | President And Fellows Of Harvard College | Protein surface remodeling |
| JP5936112B2 (ja) | 2009-02-11 | 2016-06-15 | アルブミディクス アクティーゼルスカブ | アルブミン変異体及び複合体 |
| JP2012525146A (ja) | 2009-04-28 | 2012-10-22 | プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ | 細胞透過のための過剰に荷電されたタンパク質 |
| EP2493921B1 (en) | 2009-10-30 | 2018-09-26 | Albumedix Ltd | Albumin variants |
| KR20130070576A (ko) | 2010-04-09 | 2013-06-27 | 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 | 알부민 유도체 및 변이체 |
| EP3578205A1 (en) | 2010-08-06 | 2019-12-11 | ModernaTX, Inc. | A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof |
| WO2012045082A2 (en) | 2010-10-01 | 2012-04-05 | Jason Schrum | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| EP2643459B1 (en) | 2010-11-24 | 2017-09-27 | Takara Bio USA, Inc. | Inducible expression system transcription modulators comprising a distributed protein transduction domain and methods for using the same |
| JP2014506458A (ja) * | 2011-01-26 | 2014-03-17 | クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | タンパク質形質導入の向上 |
| AU2012236099A1 (en) | 2011-03-31 | 2013-10-03 | Moderna Therapeutics, Inc. | Delivery and formulation of engineered nucleic acids |
| US9297013B2 (en) * | 2011-06-08 | 2016-03-29 | University Of Cincinnati | pRNA multivalent junction domain for use in stable multivalent RNA nanoparticles |
| JP6214530B2 (ja) | 2011-07-15 | 2017-10-18 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | 転写活性化因子様エフェクターの組立て方法 |
| JP6113160B2 (ja) | 2011-07-19 | 2017-04-12 | ヴィヴォスクリプト，インコーポレイテッド | 軟骨損傷を修復するために遺伝子改変を伴わずに細胞を再プログラミングするための組成物および方法 |
| AU2012333134B2 (en) | 2011-07-22 | 2017-05-25 | John Paul Guilinger | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
| US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| EP3682905B1 (en) | 2011-10-03 | 2021-12-01 | ModernaTX, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
| US20140315817A1 (en) | 2011-11-18 | 2014-10-23 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Variant serum albumin with improved half-life and other properties |
| DK2791160T3 (da) | 2011-12-16 | 2022-05-30 | Modernatx Inc | Modificerede mrna-sammensætninger |
| EP2797634A4 (en) * | 2011-12-29 | 2015-08-05 | Moderna Therapeutics Inc | MODIFIED mRNA ENCODING POLYPEPTIDES PENETRATING IN CELLS |
| PL2825556T3 (pl) | 2012-03-16 | 2018-10-31 | Albumedix A/S | Warianty albuminy |
| US9714274B2 (en) * | 2012-03-23 | 2017-07-25 | Suzhou Kunpeng Biotech Co., Ltd. | Fusion proteins of superfolder green fluorescent protein and use thereof |
| US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
| US9878056B2 (en) | 2012-04-02 | 2018-01-30 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides |
| DE18200782T1 (de) | 2012-04-02 | 2021-10-21 | Modernatx, Inc. | Modifizierte polynukleotide zur herstellung von proteinen im zusammenhang mit erkrankungen beim menschen |
| US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
| US9890364B2 (en) | 2012-05-29 | 2018-02-13 | The General Hospital Corporation | TAL-Tet1 fusion proteins and methods of use thereof |
| EP2906602B1 (en) | 2012-10-12 | 2019-01-16 | The General Hospital Corporation | Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins |
| GB2512156A (en) | 2012-11-08 | 2014-09-24 | Novozymes Biopharma Dk As | Albumin variants |
| HRP20220607T1 (hr) | 2012-11-26 | 2022-06-24 | Modernatx, Inc. | Terminalno modificirana rna |
| CA2900338A1 (en) | 2013-02-07 | 2014-08-14 | The General Hospital Corporation | Tale transcriptional activators |
| US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
| US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
| US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
| US9388430B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| WO2015048744A2 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
| EP3052521A1 (en) | 2013-10-03 | 2016-08-10 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
| WO2015070083A1 (en) | 2013-11-07 | 2015-05-14 | Editas Medicine,Inc. | CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS |
| US9068179B1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-30 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting presenilin point mutations |
| AU2015298571B2 (en) | 2014-07-30 | 2020-09-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
| EP3212165B1 (en) | 2014-10-30 | 2024-02-28 | President and Fellows of Harvard College | Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids |
| EP3337816B1 (en) | 2015-08-20 | 2024-02-14 | Albumedix Ltd | Albumin variants and conjugates |
| WO2017070632A2 (en) | 2015-10-23 | 2017-04-27 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
| WO2017120213A1 (en) * | 2016-01-05 | 2017-07-13 | Colorado State University Research Foundation | Compositions comprising resurfaced cell-penetrating nanobodies and methods of use thereof |
| CA3032699A1 (en) | 2016-08-03 | 2018-02-08 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| WO2018031683A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| EP3526320A1 (en) | 2016-10-14 | 2019-08-21 | President and Fellows of Harvard College | Aav delivery of nucleobase editors |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| JP6797375B2 (ja) * | 2016-12-26 | 2020-12-09 | 学校法人 久留米大学 | 生体標本作製器具および生体標本作製方法 |
| EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| JP2020510439A (ja) | 2017-03-10 | 2020-04-09 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | シトシンからグアニンへの塩基編集因子 |
| KR102687373B1 (ko) | 2017-03-23 | 2024-07-23 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제 |
| WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| EP3658573A1 (en) | 2017-07-28 | 2020-06-03 | President and Fellows of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (pace) |
| WO2019139645A2 (en) | 2017-08-30 | 2019-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| CA3074593A1 (en) | 2017-09-08 | 2019-03-14 | The University Of Bristol | Protein delivery to membranes |
| CN111757937A (zh) | 2017-10-16 | 2020-10-09 | 布罗德研究所股份有限公司 | 腺苷碱基编辑器的用途 |
| GB201902992D0 (en) | 2019-03-06 | 2019-04-17 | Cytoseek Ltd | Product and method |
| WO2020191249A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
| US20210023236A1 (en) * | 2019-07-26 | 2021-01-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Multi-targeted, tunable, sustained delivery of payloads to charged avascular tissues |
| MX2022014008A (es) | 2020-05-08 | 2023-02-09 | Broad Inst Inc | Métodos y composiciones para la edición simultánea de ambas cadenas de una secuencia de nucleótidos de doble cadena objetivo. |
| WO2022226537A2 (en) * | 2021-04-22 | 2022-10-27 | The General Hospital Corporation | Supercharged biovesicles and methods of use thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070105182A1 (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-10 | Raines Ronald T | Cell-permeable green fluorescent protein |
| WO2007143574A1 (en) * | 2006-06-02 | 2007-12-13 | President And Fellows Of Harvard College | Protein surface remodeling |
Family Cites Families (55)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4270537A (en) * | 1979-11-19 | 1981-06-02 | Romaine Richard A | Automatic hypodermic syringe |
| US4596556A (en) * | 1985-03-25 | 1986-06-24 | Bioject, Inc. | Hypodermic injection apparatus |
| US4902505A (en) * | 1986-07-30 | 1990-02-20 | Alkermes | Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier |
| CA1283827C (en) * | 1986-12-18 | 1991-05-07 | Giorgio Cirelli | Appliance for injection of liquid formulations |
| GB8704027D0 (en) * | 1987-02-20 | 1987-03-25 | Owen Mumford Ltd | Syringe needle combination |
| US4941880A (en) * | 1987-06-19 | 1990-07-17 | Bioject, Inc. | Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly |
| US4790824A (en) * | 1987-06-19 | 1988-12-13 | Bioject, Inc. | Non-invasive hypodermic injection device |
| US4940460A (en) * | 1987-06-19 | 1990-07-10 | Bioject, Inc. | Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly |
| US5339163A (en) * | 1988-03-16 | 1994-08-16 | Canon Kabushiki Kaisha | Automatic exposure control device using plural image plane detection areas |
| FR2638359A1 (fr) * | 1988-11-03 | 1990-05-04 | Tino Dalto | Guide de seringue avec reglage de la profondeur de penetration de l'aiguille dans la peau |
| US5064413A (en) * | 1989-11-09 | 1991-11-12 | Bioject, Inc. | Needleless hypodermic injection device |
| US5312335A (en) * | 1989-11-09 | 1994-05-17 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
| US6399754B1 (en) * | 1991-12-24 | 2002-06-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides |
| US6005087A (en) * | 1995-06-06 | 1999-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified oligonucleotides |
| US5190521A (en) * | 1990-08-22 | 1993-03-02 | Tecnol Medical Products, Inc. | Apparatus and method for raising a skin wheal and anesthetizing skin |
| US5527288A (en) * | 1990-12-13 | 1996-06-18 | Elan Medical Technologies Limited | Intradermal drug delivery device and method for intradermal delivery of drugs |
| GB9118204D0 (en) * | 1991-08-23 | 1991-10-09 | Weston Terence E | Needle-less injector |
| SE9102652D0 (sv) * | 1991-09-13 | 1991-09-13 | Kabi Pharmacia Ab | Injection needle arrangement |
| US5328483A (en) * | 1992-02-27 | 1994-07-12 | Jacoby Richard M | Intradermal injection device with medication and needle guard |
| US5383851A (en) * | 1992-07-24 | 1995-01-24 | Bioject Inc. | Needleless hypodermic injection device |
| US5569189A (en) * | 1992-09-28 | 1996-10-29 | Equidyne Systems, Inc. | hypodermic jet injector |
| US5334144A (en) * | 1992-10-30 | 1994-08-02 | Becton, Dickinson And Company | Single use disposable needleless injector |
| US5798340A (en) * | 1993-09-17 | 1998-08-25 | Gilead Sciences, Inc. | Nucleotide analogs |
| WO1995024176A1 (en) * | 1994-03-07 | 1995-09-14 | Bioject, Inc. | Ampule filling device |
| US5466220A (en) * | 1994-03-08 | 1995-11-14 | Bioject, Inc. | Drug vial mixing and transfer device |
| US5596091A (en) * | 1994-03-18 | 1997-01-21 | The Regents Of The University Of California | Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides |
| US5599302A (en) * | 1995-01-09 | 1997-02-04 | Medi-Ject Corporation | Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring |
| US5893397A (en) * | 1996-01-12 | 1999-04-13 | Bioject Inc. | Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus |
| US5922695A (en) * | 1996-07-26 | 1999-07-13 | Gilead Sciences, Inc. | Antiviral phosphonomethyoxy nucleotide analogs having increased oral bioavarilability |
| US6127533A (en) * | 1997-02-14 | 2000-10-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-aminooxy-modified oligonucleotides |
| US5993412A (en) * | 1997-05-19 | 1999-11-30 | Bioject, Inc. | Injection apparatus |
| US6897297B1 (en) * | 1997-12-03 | 2005-05-24 | Curis, Inc. | Hydrophobically-modified protein compositions and methods |
| US6403779B1 (en) * | 1999-01-08 | 2002-06-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Regioselective synthesis of 2′-O-modified nucleosides |
| US20030236214A1 (en) * | 1999-06-09 | 2003-12-25 | Wolff Jon A. | Charge reversal of polyion complexes and treatment of peripheral occlusive disease |
| US20050032733A1 (en) * | 2001-05-18 | 2005-02-10 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SiNA) |
| US8202979B2 (en) * | 2002-02-20 | 2012-06-19 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid |
| US20050020525A1 (en) * | 2002-02-20 | 2005-01-27 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA) |
| NZ521564A (en) * | 2000-04-12 | 2004-06-25 | Implyx Ltd | Compositions for drug delivery |
| CA2409391C (en) * | 2000-06-05 | 2009-03-17 | Scimed Life Systems, Inc. | Methods and devices for the treatment of urinary incontinence |
| US7160541B2 (en) * | 2000-09-01 | 2007-01-09 | The Center For Blood Research, Inc. | Modified polypeptides stabilized in a desired conformation and methods for producing same |
| US20040102606A1 (en) * | 2001-04-24 | 2004-05-27 | Danuta Balicki | Histone H2A -derived peptides useful in gene delivery |
| US20030175950A1 (en) * | 2001-05-29 | 2003-09-18 | Mcswiggen James A. | RNA interference mediated inhibition of HIV gene expression using short interfering RNA |
| EP2385123B1 (en) * | 2001-09-28 | 2018-04-25 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Microrna molecules |
| US20030134352A1 (en) * | 2002-01-04 | 2003-07-17 | Freimuth Paul I. | Facilitating protein folding and solubility by use of peptide extensions |
| AU2003210552A1 (en) * | 2002-01-16 | 2003-09-02 | Genencor International, Inc. | Multiply-substituted protease variants |
| US7271241B2 (en) * | 2002-04-24 | 2007-09-18 | Los Alamos National Security, Llc | Directed evolution methods for improving polypeptide folding and solubility and superfolder fluorescent proteins generated thereby |
| US9637528B2 (en) * | 2002-04-24 | 2017-05-02 | Los Alamos National Security, Llc | Method of generating ploynucleotides encoding enhanced folding variants |
| AU2003276131A1 (en) * | 2002-06-18 | 2003-12-31 | Epigenesis Pharmaceuticals, Inc. | A dry powder oligonucleotide formulation, preparation and its uses |
| JP3996028B2 (ja) * | 2002-09-30 | 2007-10-24 | 株式会社日本触媒 | 蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法 |
| WO2004063342A2 (en) * | 2003-01-09 | 2004-07-29 | Invitrogen Corporation | Cellular delivery and activation polypeptide-nucleic acid complexes |
| WO2004065363A2 (en) * | 2003-01-21 | 2004-08-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Computational design of a water-soluble analog of a protein, such as phospholamban and potassium channel kcsa |
| US20040162235A1 (en) * | 2003-02-18 | 2004-08-19 | Trubetskoy Vladimir S. | Delivery of siRNA to cells using polyampholytes |
| US7417131B2 (en) * | 2005-11-04 | 2008-08-26 | Evrogen Joint Stock Company | Modified green fluorescent proteins and methods for using same |
| WO2008054544A2 (en) * | 2006-05-22 | 2008-05-08 | Immune Disease Institute, Inc. | Method for delivery across the blood brain barrier |
| JP2012525146A (ja) * | 2009-04-28 | 2012-10-22 | プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ | 細胞透過のための過剰に荷電されたタンパク質 |
-
2009
- 2009-04-28 AU AU2009243187A patent/AU2009243187C1/en not_active Ceased
- 2009-04-28 EP EP09739610A patent/EP2297182A4/en not_active Withdrawn
- 2009-04-28 CA CA2725601A patent/CA2725601A1/en not_active Abandoned
- 2009-04-28 JP JP2011507588A patent/JP2011523353A/ja active Pending
- 2009-04-28 US US12/989,829 patent/US20110112040A1/en not_active Abandoned
- 2009-04-28 WO PCT/US2009/041984 patent/WO2009134808A2/en active Application Filing
- 2009-04-28 CN CN200980123772.1A patent/CN102066405B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-06-03 JP JP2014114885A patent/JP2014159484A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070105182A1 (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-10 | Raines Ronald T | Cell-permeable green fluorescent protein |
| WO2007143574A1 (en) * | 2006-06-02 | 2007-12-13 | President And Fellows Of Harvard College | Protein surface remodeling |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104011065A (zh) * | 2011-08-23 | 2014-08-27 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 肽纳米粒子及其用途 |
| CN104011065B (zh) * | 2011-08-23 | 2017-06-30 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 肽纳米粒子及其用途 |
| CN103031337A (zh) * | 2012-09-28 | 2013-04-10 | 北京吉利奥生物科技发展有限公司 | 一种小核酸分子快递技术 |
| CN105745221A (zh) * | 2013-09-06 | 2016-07-06 | 哈佛大学的校长及成员们 | 用于功能性核酸酶的投递系统 |
| CN104127868A (zh) * | 2014-05-06 | 2014-11-05 | 卢戌 | 一种肿瘤疫苗及其应用 |
| CN104127868B (zh) * | 2014-05-06 | 2016-03-02 | 卢戌 | 一种肿瘤疫苗及其应用 |
| US11001817B2 (en) | 2014-10-31 | 2021-05-11 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery of cargo proteins via ARRDC1-mediated microvesicles (ARMMs) |
| US11827910B2 (en) | 2014-10-31 | 2023-11-28 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery of CAS9 via ARRDC1-mediated microvesicles (ARMMs) |
| CN106459174A (zh) * | 2015-02-18 | 2017-02-22 | 麻省理工学院 | 水溶性跨膜蛋白及其制备和使用方法 |
| CN106459174B (zh) * | 2015-02-18 | 2021-08-27 | 麻省理工学院 | 水溶性跨膜蛋白及其制备和使用方法 |
| CN105219877B (zh) * | 2015-11-06 | 2018-09-25 | 中国医学科学院北京协和医院 | Ccdc59的激动剂在制备骨性关节炎药物中的应用 |
| CN105219877A (zh) * | 2015-11-06 | 2016-01-06 | 林进 | Ccdc59的激动剂在制备骨性关节炎药物中的应用 |
| TWI772324B (zh) * | 2016-09-12 | 2022-08-01 | 日商廣津生物化學股份有限公司 | 基於線蟲嗅覺的對氣味物質之趨性行動之評價方法、以及用於該評價方法的培養皿及行動評價系統 |
| CN114452266A (zh) * | 2022-02-09 | 2022-05-10 | 山东大学 | 一种基于重组核糖体蛋白的核酸药物递送系统及其制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2009243187C1 (en) | 2015-12-24 |
| JP2014159484A (ja) | 2014-09-04 |
| EP2297182A4 (en) | 2012-08-15 |
| EP2297182A2 (en) | 2011-03-23 |
| AU2009243187B2 (en) | 2015-09-17 |
| US20110112040A1 (en) | 2011-05-12 |
| CN102066405B (zh) | 2015-09-30 |
| WO2009134808A3 (en) | 2010-06-10 |
| JP2011523353A (ja) | 2011-08-11 |
| AU2009243187A1 (en) | 2009-11-05 |
| CA2725601A1 (en) | 2009-11-05 |
| AU2009243187B9 (en) | 2015-11-12 |
| WO2009134808A2 (en) | 2009-11-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102066405B (zh) | 用于细胞穿透的超荷电蛋白 | |
| JP7177047B2 (ja) | ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するための合理的に設計された合成ペプチドシャトル剤、その使用、それに関連する方法およびキット | |
| JP2011523353A5 (zh) | ||
| JP2016008217A (ja) | 細胞透過のための過剰に荷電されたタンパク質 | |
| EP3280739B1 (en) | Polypeptide-based shuttle agents for improving the transduction efficiency of polypeptide cargos to the cytosol of target eukaryotic cells, uses thereof, methods and kits relating to same | |
| US9982267B2 (en) | Rationally-designed synthetic peptide shuttle agents for delivering polypeptide cargos from an extracellular space to the cytosol and/or nucleus of a target eukaryotic cell, uses thereof, methods and kits relating to same | |
| CN113498417B (zh) | 多肽、其制备方法和用途 | |
| WO2011157713A4 (en) | Cell-penetrating peptides and uses therof | |
| KR20160050070A (ko) | 기능성 뉴클레아제의 전달 시스템 | |
| CN101605557A (zh) | 内切糖苷酶EndoS用于治疗免疫球蛋白G介导的疾病的用途 | |
| ES2327986T3 (es) | Liberacion intranuclear de compuestos dirigida por la proteina de choque termico de 70 kd. | |
| CN100564517C (zh) | 一种蝎抗神经胶质瘤肽及其制备方法和应用 | |
| EP2995626B1 (en) | Bifunctional fusion proteins to inhibit angiogenesis in tumour microenvironment and to activate adaptive immune responses and the genes and uses thereof | |
| CA2848656A1 (en) | Systems and methods of delivery of bioactive agents using bacterial toxin-derived transport sequences | |
| KR101559974B1 (ko) | ｓｉＲＮＡ 전달을 위한 재조합 단백질 및 이를 포함하는 조성물 | |
| US20200270307A1 (en) | Rationally-designed synthetic peptide shuttle agents for delivering polypeptide cargos from an extracellular space to the cytosol and/or nucleus of a target eukaryotic cell, uses thereof, methods and kits relating to same | |
| CN101309934B (zh) | 修饰的伴侣蛋白10 | |
| JP7542830B2 (ja) | 分子の細胞内送達のための複合体 | |
| CN101987873A (zh) | P53融合蛋白及应用 | |
| CN103254315A (zh) | 一种重组tat-manf融合蛋白及其应用 | |
| CN102596222B (zh) | 作为肿瘤生长的抑制剂的皮抑菌肽b2 | |
| JPS6150923A (ja) | ヒト癌壊死因子 | |
| CN101838330A (zh) | 一种杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150930 Termination date: 20180428 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |