CN104011065B - 肽纳米粒子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供的发明涉及两亲性肽和包含所述两亲性肽的粒子。本文所述的此类两亲性肽和粒子可用作递送系统(例如用于治疗目的或诊断目的)，或用作细胞穿透运载体或细胞转染试剂。

Description

肽纳米粒子及其用途
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2011年8月23日提交的美国临时申请号61/526,526的优先权，以引用的方式将其内容整体并入本文。
政府支持
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的基金号R01GM090317的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明涉及两亲性肽和包含所述两亲性肽的粒子。
背景技术
纳米粒子可用于药物的稳定化和递送：纳米粒子改善溶解性、延长保存期限、降低副作用并使药物持续暴露，从而延长治疗效果。用于靶向药物递送的基质通常由脂类、聚合物或金属组成，并组装入囊泡、胶束或粒子中。参见Torchilin V.(2006)Adv DrugDeliv.58：1532；Stark W(2011)Angew Chem Int Ed.50：1242；Soussan E等，(2009)ACIE.48：274。决定粒子体内适用性的主要独立变量包括大小、表面电荷和分散性(dispersibility)(主要由疏水效应支配)。Nel A等，(2009)Nat Matter.8：543。与这些经典载体材料相反，仅从氨基酸设计胶体递送系统是非常困难的，这主要是由于短疏水性肽的溶解性问题。
疏水性肽的溶解耗时冗长，因此经常需要精妙的溶剂添加规程[14]。不管如何尝试，许多疏水性肽仍是完全不溶的，从而难以通过Fmoc或Boc保护基团化学作用进行合成：合成期间肽在固相上的沉淀使得产率低下且副产物占优势量。
然而，由于可降解为单个氨基酸，由肽组成的粒子基质是合乎期望的。并且，与其它基质材料(例如聚合物)不同，肽合成的产品可纯化至高达98％，避免了分子多分散性并因此解决了物理化学性质的可重复性。此外，可容易地对肽结构的性质进行调节，例如通过引入氨基酸点突变来进行调节。因此，对于将可通过简单工艺合成和纯化的可降解药物载体工程化仍然存在强烈需求。
发明内容
本文提供的多个方面和实施方式涉及两亲性肽、包含本文所述一个或多个实施方式的两亲性肽的肽粒子、以及本文所述的两亲性肽或肽粒子的用途。可通过控制两亲性肽的氨基酸残基上存在的带电基团的数量(例如，通过(例如用乙酰化)掩蔽(masking)一个或多个带电的氨基)，调整本文所述的两亲性肽的净电荷。因此，本文所述的两亲性肽和肽粒子可用作递送不同类型活性试剂(例如带电或不带电的分子，或极性或非极性分子)的载体(carriers)或运载体(vehicles)。另外，还可通过控制存在于肽粒子中的两个以上实施方式的两亲性肽之比来对本文所述的肽粒子(例如在生理条件下)的溶解性进行调整。举例来说，完全掩蔽(例如完全乙酰化)的两亲性肽通常可形成不溶的肽粒子，而与完全掩蔽(例如完全乙酰化)的两亲性肽形成的粒子相比，由部分掩蔽(例如部分乙酰化)或未掩蔽(例如未乙酰化)的肽形成的粒子通常具有(例如生理条件下的)更高的溶解性。因此，在一些实施方式中，可通过用这些具有不同溶解性的两亲性肽的混合物形成所述肽粒子并相应改变这些两亲性肽在肽粒子中的含量，控制本文所述的肽粒子的(例如生理条件下的)溶解性。
本文所提供的一个方面涉及包含疏水性肽片段和亲水性肽片段的两亲性肽。发明人已经发现，通过对亲水性片段的亲水性进行调节，可控制由两亲性肽自聚集而形成的粒子的类型。
因此，本发明的一方面提供了一种包含疏水性肽片段(peptidyl segment)和亲水性肽片段的两亲性肽，其中，所述疏水性肽片段包含2-10个交替的D-氨基酸和L-氨基酸的序列，所述氨基酸选自于：丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸(Trp)；其中，所述亲水性肽片段包含带电、或不带电但为极性的氨基酸，或以上氨基酸的衍生物。
在本文所述的这一方面和全部其它方面的某些实施方式中，所述疏水性肽片段可包含如下氨基酸序列：(Trp-Leu)m-(Trp)n或者(Leu-Trp)p-(Leu)q，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-20的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然。
在一些实施方式中，所述亲水性肽片段可包含存在于N-末端或氨基酸残基的至少一个电荷。在此类实施方式中，所述至少一个电荷既可以为阳离子电荷也可以为阴离子电荷。在一些实施方式中，所述至少一个阳离子电荷可位于选自于由下列氨基酸残基所组成的组的氨基酸残基中：Lys、Arg、His，以及以上氨基酸残基的任意组合。在一些实施方式中，所述至少一个阴离子电荷可位于选自于由下列氨基酸残基所组成的组的氨基酸残基中：Asp或Glu，以及以上氨基酸残基的任意组合。
在替代的实施方式中，所述亲水性肽片段可包含不带电但为极性的氨基酸。在其它实施方式中，所述亲水性肽片段可包含至少一个电荷和至少一个不带电但为极性的氨基酸。在多个实施方式中，所述至少一个不带电但为极性的氨基酸残基可选自于由下列氨基酸残基所组成的组：Ser、Thr、Asn或Gln，以及以上氨基酸残基的任意组合。
在本文所述的这一方面以及全部其它方面的特定实施方式中，所述亲水性肽片段可包含氨基酸序列(Lys)r，其中r为1-15的整数。在一些实施方式中，r可以为2-5的整数。在一些实施方式中，r可以等于3。
在本文所述的这一方面以及全部其它方面的一些实施方式中，所述疏水性肽片段可包含聚合物。在一些实施方式中，可将与疏水性肽片段的连接调整为共价连接至所述聚合物。在某些实施方式中，所述聚合物可以为生物相容聚合物和/或可生物降解的聚合物。所述聚合物的实例包括但不限于：PEG、PGG、PEO、聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkaboates)、葡聚糖、聚酸酐、PLA-PGA、聚原酸酯、聚富马酸酯、水凝胶、任何本领域认可的生物相容聚合物和/或可生物降解的聚合物，以及以上聚合物的任意组合。
在本文所述的这一方面以及全部其它方面的某些实施方式中，可对所述两亲性肽中的至少一个氨基进行掩蔽(例如通过乙酰化进行掩蔽)。在此类实施方式中，所述至少一个氨基可以为两亲性肽的N-末端氨基。在其它实施方式中，所述至少一个氨基可以位于亲水性肽片段的Lys残基之上。
在本文所述的这一方面以及全部其它方面的一些实施方式中，可对所述亲水性肽片段中的全部氨基进行掩蔽(例如，乙酰化)。在其它实施方式中，可对所述两亲性肽的N-末端氨基和亲水性肽片段中的至少一个氨基进行掩蔽(例如，乙酰化)。在又一实施方式中，可对所述两亲性肽的N-末端氨基和亲水性肽片段中的全部氨基进行掩蔽(例如，乙酰化)。在所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)r的一些实施方式中，对所述两亲性肽的N-末端氨基和亲水性肽片段的至少一个(包括至少2个、至少3个或更多个)Lys残基进行掩蔽(例如通过乙酰化进行掩蔽)。在所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)r的一个实施方式中，对所述两亲性肽的N-末端氨基和亲水性肽片段的全部Lys残基进行掩蔽(例如通过乙酰化进行掩蔽)。
在多个实施方式中，可将所述疏水性肽片段连接至所述亲水性肽片段的C-末端。
在某些实施方式中，Leu为D-Leu。在一些实施方式中，Trp为L-Trp。在一些实施方式中，Lys为L-Lys。在一些实施方式中，m或p可独立地为1-3。在一个实施方式中，m或p为3。在一个实施方式中，n或q为1。因此，一个实施方式的两亲性肽包含如下氨基酸序列：(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)，其中至少一个L-Lys残基被乙酰化。
在一些实施方式中，所述两亲性肽可包含如下氨基酸序列：Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)。在此类实施方式中，至少一个L-Lys残基可被乙酰化。
在其它实施方式中，所述两亲性肽可包含如下氨基酸序列：Ac-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中X不存在或X为NH2。
两亲性肽可具有任意长度的氨基酸序列。在一些实施方式中，两亲性肽的长度可为约5个氨基酸残基至约25个氨基酸残基。
可对两亲性肽的疏水性肽片段或亲水性肽片段进行修饰。例如，疏水性肽片段或亲水性肽片段中至少一者可包含至少一个点突变。在多个实施方式中，至少一个骨架酰胺连接(linkage)可包括酰胺替代连接(amide replacement linkage)。在其它实施方式中，所述两亲性肽可包含至少一个β-氨基酸、γ-氨基酸，或以上氨基酸的任意组合。
在一些实施方式中，所述两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，其中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(AA11-AA12)b-(AA13)d，其中，每次出现的AA11、AA12和AA13分别为独立选定的疏水性氨基酸残基，b为1-20的整数、且d为0或1，只要AA11和AA12具有相反的(即，D-和L-)构型且AA12和AA13具有相反的(即，D-和L-)构型；所述亲水性肽片段包含一个或多个亲水性氨基酸或其衍生物；并且所述两亲性肽被全部或部分掩蔽。
在一些实施方式中，所述两亲性肽包含氨基酸序列(L-Lys)r'-((L-Trp)-(D-Leu))m'-(L-Trp)，其中，r'为3-21的整数、且m'为3-20的整数，并且其中至少一个N-末端氨基或至少一个Lys残基的侧链氨基缀合有氮保护基团或氨基保护基团。
发明人已经发现，本文所述一些实施方式的两亲性肽可具有细胞穿透(cellpenetration)能力。因此，在一些实施方式中，可将本文所述的两亲性肽作为细胞穿透试剂和/或转染试剂。在这些实施方式中，可将两亲性肽设计为带正电。因此，本文提供了包含带正电的两亲性肽的组合物作为细胞穿透试剂或转染试剂的用途，其中所述带正电的两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段。所述带正电的两亲性肽的疏水性肽片段包含如下氨基酸序列：(Trp-Leu)m-(Trp)n或者(Leu-Trp)p-(Leu)q，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-5的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然；同时所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)r，其中r为1-15的整数。另外，在所述带正电的两亲性肽中，所述两亲性肽的至少一个Lys残基或N-末端氨基未被乙酰化。在一些实施方式中，所述带正电的两亲性肽的全部Lys残基和N-末端氨基均未被乙酰化。
在一些实施方式中，所述带正电的两亲性肽可包含如下氨基酸序列：(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中X不存在或X为NH2。
在一些实施方式中，所述组合物可进一步包含待递送进入细胞的核酸分子(例如，DNA或RNA)。
另外，本文所述的两亲性肽可单独使用或作为递送系统的一部分使用，用于将感兴趣的化合物(例如活性试剂)递送至细胞。所述递送系统可以是靶向递送系统。待递送的化合物可包括治疗试剂、诊断试剂以及它们的任意组合。因此，本发明一方面提供了用两亲性肽作为递送系统的方法，所述方法包括将活性试剂与两亲性肽复合(complexing)并将细胞与复合物相接触。在一些实施方式中，所述方法可用于治疗目的或诊断目的。
另一方面，本发明提供了包含本文所述的两亲性肽的粒子。发明人尤其发现，由本文所述的两亲性肽所形成的粒子与C.Dittrich，Ph.D.Thesis， Basel，2007中描述的粒子有所区别。明确地说，由本文所述的两亲性肽制造的粒子与Dittrich(2007)中描述的并不相同。Dittrich(2007)中描述的肽并不包含掩蔽的氨基。就此而言，由这类肽形成的粒子为胶束(例如中空粒子)，而非本文所述的实心粒子。因此，在某些实施方式中，本文所述的肽粒子并非胶束(例如中空粒子)。换言之，在某些实施方式中，本文所述的肽粒子为实心粒子。
在一些实施方式中，本文所述的包含两亲性肽的粒子可进一步包含配体。因此，在一个实施方式中，本文所述的肽粒子包含两亲性肽，所述两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，其中，所述疏水性肽片段包含如下氨基酸序列：(Trp-Leu)m-(Trp)n或者(Leu-Trp)p-(Leu)q，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-5的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然；并且其中所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)r，其中r为1-15的整数；并且其中所述肽粒子进一步在其外表面上包含配体。
在一个实施方式中，所述配体可以是细胞表面受体的配体或者抗体。示例性的细胞表面受体的配体包括但不限于：转铁蛋白、EGF、叶酸(folate)，以及以上配体的任意组合。在某些实施方式中，所述配体可存在于粒子的外表面上。例如，所述配体可吸附于本文所述的粒子的外表面上。在替代的实施方式中，所述配体可共价连接至所述两亲性肽。在一个实施方式中，所述配体共价连接至所述两亲性肽的亲水性肽片段。
本文所述的粒子外表面上存在的配体的厚度部分地依赖于配体分子的大小。在一些实施方式中，所述粒子外表面上存在的配体的厚度范围可为约1nm至约100nm。在一个实施方式中，所述粒子外表面上存在的配体的厚度为约10nm。在一些实施方式中，配体与两亲性肽之比的范围可为约1:10至约1:1,000,000。
可基于待将肽粒子递送至的靶标类型(例如但不限于，细胞、细菌、蛋白和/或核酸)对肽粒子上存在的配体进行选择。例如，为了促进将本文所述的肽粒子递送至细胞，可选择对细胞表面受体具有特异性的配体。因此，使用所述肽粒子作为递送载体或运载体，可将本文所述的一些实施方式的肽粒子用于靶向递送活性试剂。在此类实施方式中，可将所述肽粒子用于将活性试剂递送至细胞，在以其自身递送时所述活性试剂不能穿透细胞。
因此，在本文所述的这一方面和全部其它方面的多个实施方式中，所述肽粒子可包含一种或多种活性试剂。在此类实施方式中，所述活性试剂可分散于所述粒子内部。所述活性试剂可不带有净电荷或带净电荷。在一些实施方式中，所述活性试剂可包含至少一个芳基。活性试剂的实例不受限制地包括：蛋白、肽、抗原、抗体或抗体部分、抗体样分子、酶、核酸、适配子(aptamers)、小分子、抗生素、药物活性试剂、治疗试剂、造影剂(contrastagents)，以及以上试剂的任意组合。在一个实施方式中，所述活性试剂为药物活性试剂或治疗试剂。在一个实施方式中，所述活性试剂为核酸分子，包括但不限于：siRNA、miRNA、shRNA、DNA，以及以上核酸分子的任意组合。在特定的实施方式中，所述活性试剂与所述两亲性肽之比的范围可以是约1:1至约1:100,000、约1:1至约1:10,000、约1:1至约1:1,000、约1:1至约1:100、或约1:1至约1:10。
本文所述的这一方面和全部其它方面的肽粒子可为任意大小。在一些实施方式中，所述肽粒子的大小可为约5nm至约5,000nm。在一些实施方式中，所述肽粒子的大小可以为约30nm至约150nm。
在一些实施方式中，所述肽粒子可包含完全掩蔽(例如完全乙酰化)和部分掩蔽(例如部分乙酰化)的本文所述的两亲性肽的混合物。在这些实施方式中，完全乙酰化的两亲性肽与部分掩蔽的两亲性肽之比的范围可为约95:5至约1:1。在某些实施方式中，所述粒子可进一步包含未掩蔽(例如未乙酰化)的两亲性肽。
因此，本文还提供了混合肽粒子，所述混合肽粒子包含完全乙酰化的两亲性肽和部分乙酰化或未乙酰化的两亲性肽。在特定的实施方式中，所述混合肽粒子包含第一两亲性肽和第二两亲性肽，其中所述第一两亲性肽和第二两亲性肽各自独立地包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，其中所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu)m-(Trp)n或者(Leu-Trp)p-(Leu)q，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-5的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然；同时所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)r，其中r为1-15的整数。另外，所述第一两亲性肽的N-末端氨基和全部Lys残基均被乙酰化；而所述第二两亲性肽的至少N-末端氨基或一个Lys残基未被乙酰化。在一些实施方式中，所述第二两亲性肽的N-末端氨基和Lys残基均未被乙酰化。
在特定的实施方式中，所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽可各自独立地包含如下氨基酸序列：(L-Lys))-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中X不存在或X为NH2。
所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽之比可基于多个因素而变化，所述因素例如但不限于：肽粒子期望的溶解性和/或稳定性、和/或所述肽粒子中将装载的活性试剂的性质。在一些实施方式中，所述第一两亲性肽与所述第二两亲性肽之比的范围可以为约1:1至约1000:1。在其它实施方式中，所述第一两亲性肽与所述第二两亲性肽之比的范围可为约5:1至约100:1。
在一些实施方式中，所述混合肽粒子可进一步包含本文所述的活性试剂。所述活性试剂可以任意量存在于所述混合肽粒子中，例如，所述量取决于肽粒子的装载能力和/或所述第一两亲性肽或所述第二两亲性肽的结合能力。在一些实施方式中，所述活性试剂与所述第二两亲性肽之比的范围可为约1:1000至1:1、或约1:100至约1:10。在一些实施方式中，所述活性试剂与所述第二两亲性肽之比的范围可为约1:10至约1:2。
不希望受理论约束，存在于所述混合肽粒子中的第二两亲性肽可提供用于与阴离子核酸分子结合的阳离子电荷。因此，在一些实施方式中，所述活性试剂可包含核酸分子。
在一些实施方式中，所述混合肽粒子可进一步在其外表面上包含配体。如先前所述，可基于混合肽粒子所结合的靶分子(例如但不限于，细胞、细菌、蛋白、核酸)来确定对配体的选择。配体的非限制性实例可包括细胞表面受体的配体或蛋白(如抗体)。在一些实施方式中，配体可共价连接至第一两亲性肽和第二两亲性肽中的至少一者(例如，第一两亲性肽和第二两亲性肽中至少一者的亲水性肽片段)。
可用本文所述的混合肽粒子封装任何本文所述的活性试剂。在特定的实施方式中，可用混合肽粒子封装核酸分子。因此，本发明进一步的方面提供了一个或多个实施方式的混合肽粒子用于将核酸分子递送至细胞的用途，所述混合肽粒子包含第一两亲性肽和第二两亲性肽。在一些实施方式中，所述核酸分子可包括RNA(例如但不限于，siRNA、miRNA、shRNA)、DNA，或以上核酸分子的任意组合。
本文还提供了用于制造一个以上实施方式的肽粒子或混合肽粒子的组合物或试剂盒。在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可包含本文所述的两亲性肽。所述组合物或试剂盒中提供的两亲性肽可储存于容器中。根据用户对待制备的本文所述的肽粒子或混合肽粒子的选择，在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可包含本文所述的第一两亲性肽和第二两亲性肽。所述两亲性肽可以粉末或冻干粉末提供。在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可进一步包含至少一种试剂，所述试剂例如用于粉末化两亲性肽的复溶、用于粒子组装混合物的乳化、或两者均有，在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可进一步包含本文所述的配体(例如提供于单独的容器中)。在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可进一步包含待封装入肽粒子的活性试剂。所述活性试剂可在单独的容器中提供。
附图说明
图1A-图1B示出了根据本发明的一个或多个实施方式的纯化的CD3ac的表征结果。图1A示出了以轨道阱(orbitrap)质谱仪测量的质谱。图1B示出了测得的CD3ac和合成中间体CD3在280nm处吸收的叠加(overlaid)RP-HPLC洗脱曲线。在两种情况下产物纯度均高于95％。
图2A-图2C示出了根据本发明的一个或多个实施方式的CD3ac肽纳米粒子的SEM图像。图2A-图2B示出了冻干CD3ac珠的SEM图像。图2C示出了冻干过程中破裂的CD3ac珠的SEM图像。图像显示了肽沉淀的实心性质。
图3A-图3B示出了动态光散射(DLS)结果的线性拟合。确定了粒子浓度(图3A)和探测角度(图3B)均不太可能对CD3ac珠在水溶液中的扩散特性产生影响。
图4示出了CD3ac衍生物CD1、CD2、CD3和CD4的一组圆二色性谱。显示的数字与连接至N-末端的赖氨酸残基的数量相等。
图5A-图5B示出了仅有L-氨基酸对于肽纳米粒子的性质的影响。图5A示出了沉淀的LCD3ac的SEM图像。在沉淀的LCD3ac中未能观察到在CD3ac粒子中观察到的球状组装体。图5B示出了CD3(实线)和LCD3(虚线)的圆二色性谱，表明由于亮氨酸的手性而导致二级结构存在差异。LCD3表现出α-螺旋特征。
图6A-图6C示出了与虎红(rose bengal，RB)、5-羧基荧光素(CF)或两者的混合物共组装的CD3ac珠的共聚焦显微图像。图6A示出了与RB共组装的CD3ac珠的共聚焦显微图像。图6B示出了与CF共组装的CD3ac珠的共聚焦显微图像。图6C示出了载有RB和CF的CD3ac珠，表明该肽珠具有同时封装在水溶液中具有高溶解性和低溶解性的化合物的能力。如图6A-图6C所示，观测到含有RB的CD3ac珠为单独的球体，而仅含有CF的珠倾向于聚集。在图6A-图6C中，左上子图：RB的荧光发射；右下子图：CF的荧光发射；右上子图：相差图像；左下子图：两个荧光通道的共定位。一个子图的宽度对应于55μm。
图7A-图7B示出了CD3ac纳米粒子中虎红(RB)的封装效率。图7A示出了RB与CD3ac的共沉淀效率的结果。x轴描述了CD3ac与RB在溶剂交换和组装前的初始溶解浓度比。左侧y轴：沉淀物的摩尔组成(○)。右侧y轴：封装的RB与总RB的摩尔比(△)。举例来说，在RB:CD3ac＝1:4的初始比处，所述珠的约15mol％由RB组成，且约33％的初始溶解的RB被封装入组装体中。图7B示出了含有不同量RB的沉淀部分(▲)和上清液部分(●)的色氨酸吸收，表明CD3ac组装并未被等摩尔浓度的RB负载物(cargo)削弱。
图8A-图8I示出了在AF568标记的转铁蛋白(Tfn-AF568)和Flutax-2以及转铁蛋白(Tfn)存在下组装的CD3ac肽粒子的表征结果。图8A-图8C显示胰蛋白酶处理(trypsination)前肽粒子的红色(图8A)和绿色(图8B)荧光的荧光显微图像。叠加的图像(图8C)示出了Tfn-AF-568(环形)和Flutax-2(均等分布)不同的荧光分布。图8D-图8F示出了相同样品在胰蛋白酶处理6小时后的荧光图像。Tfn-AF-568荧光的特征环消失(图8D)、且Flutax-2的发射强度增长13.5倍(图8E)。图8G-图8H示出了胰蛋白酶处理前后粒子(n＝10)在红色通道(图8G)和绿色通道(图8H)中的平均灰度水平曲线。图8I示出了胰蛋白酶处理前后具有蛋白冠(corona)(例如Tfn-AF568)的CD3ac肽粒子的示意图。
图9A-图9D示出了CD3ac肽纳米粒子内Flutax-2和Tfn-AF568的组成的结果。图9a和9B分别示出了与Tfn-AF568(图9A)和Flutax-2(图9B)自组装的肽粒子的定量组成。x轴描述了初始溶解的Tfn-AF568或Flutax-2与CD3ac(123μM)在溶剂交换和组装前的浓度比。左侧y轴(空心符号)：肽纳米粒子(PNP)的摩尔组成。右侧y轴(实心符号)：封装的Tfn-AF568(或Flutax-2)与总Tfn-AF568(或Flutax-2)的摩尔比。作为图9B中的实例，在Flutax-2:CD3ac＝0.1的初始比处，约7.5mol％的PNP由Flutax-2组成，且约80％的初始溶解的Flutax-2被封装。80％左右的Flutax-2稳定封装率对应于5.25的对数分配系数(partitioncoefficient)。图9C示出与Tfn竞争前后PNP的Tfn-AF568荧光强度分布。粒子在10μg/mLTfn-568存在下组装，并在形成后立即成像。黑色柱对应于所得的荧光光斑的强度分布。由灰色柱表示的分布描述了相同的PNP在1360μg/mL Tfn存在下、在37℃的24小时孵育期后的荧光强度。图9D示出如图9C所示的与Tfn竞争前后PNP的Tfn-AF568荧光强度分布的累计数据曲线。
图10A-图10K示出了粒子直径控制和通过TEM进行的纳米粒子形态表征。图10A-图10C示出了由492μM、246μM和123μM CD3ac组装的肽粒子上的Tfn-AF568荧光。比例尺对应于1μm。图10D示出了3个叠加的荧光强度曲线，每一曲线示出10个粒子的平均结果。结果由平均值±标准差表示。图10E示出了强度曲线的原理示意图，说明了粒子尺寸、冠的荧光和光学显微镜的有限分辨率之间的关系。图10F-图10I示出了在不存在(图10F-图10G)和存在(图10H-图10I)10μg/mL Tfn下组装的CD3ac粒子的负染色TEM图像。含蛋白(例如含Tfn)的样品可由肽粒子周围的中等对比度层(layer of intermediate contrast)得以区分。偶发的孔洞(黑色箭头指出)是由TEM中使用的真空导致的，类似的观测在Hyuk I.等，(2005)NatMatter4：671中已有描述。图10J-图10K表明最终粒子尺寸依赖于组装期间Tfn的存在。在无Tfn-AF568存在下形成粒子导致平均粒子直径为100nm(图10J)，而粒子组装期间存在蛋白使直径降低为51nm(图10K)。蛋白冠的厚度对应于9.0±2.1nm(图10K的插图)。
图11A-图11H示出了Tfn的竞争对于结合至CHO细胞的影响。本文用作为在负载物(例如本文使用的Flutax-2)和冠(例如本文使用的Tfn-AF568)存在下自组装的CD3ac肽纳米粒子的缩略词。图11A-图11C示出了与孵育1小时的CHO细胞的荧光显微图像。绿色通道(Flutax-2)和红色通道(Tfn-568)中荧光光斑的共定位表明在细胞上累积的粒子的同一性。图11D-图11F示出了在17μMTfn存在下与孵育1小时的CHO细胞。PNP缔合显著减少。比例尺对应于10μm。图11G示出了每细胞(例如CHO或TRVb)的平均肽纳米粒子(PNP)数量。阴性对照(NC)值对应于在无存在而具有相同浓度的Tfn-AF568和Flutax-2下孵育的CHO细胞上的假阳性荧光光斑。结果为平均值±s.e.m.，双星号表示P<10-9，Kolmogorov-Smirnov检验。图11H示出了显示与孵育1小时后的CHO细胞的一组图像。上面一行和下面一行分别示出了无Tfn和存在17μM Tfn时孵育的细胞。在白色方框中圈出的区域在图11A-图11F中放大显示。比例尺对应于20μm。
图12A-图12M示出了纳米粒子的内化作用(internalization)的实验结果。图12A-图12D示出了与孵育1小时的CHO细胞的荧光显微图像。图12E示出了将CHO细胞与孵育1小时后，的Flutax-2/Tfn-AF568荧光的分布(G/R)。灰色柱表示载玻片上的G/R，黑色柱对应于细胞周长(cell perimeter)之内得到的G/R。图12F示出了1小时后粒子缔合和内化的示意图。图12G-图12J示出了与孵育6小时的CHO细胞的荧光显微图像，其中粒子向更高G/R值的移动作为粒子内化的表示(surrogate)。图12K显示在较长的孵育期后G/R值的分布显著增加(黑色柱)。相反，在载玻片上的G/R值分布(灰色柱)无法与1小时后的相同亚群的G/R值在统计上有所区别。图12L示出了6小时后粒子缔合和内化的示意图。对于溶酶体腔内的粒子，冠被蛋白水解消化，使得Tfn-AF568荧光减弱而Flutax-2荧光增强。图12M示出表明色移(color shift)的图。上面一行示出了与孵育1小时的CHO细胞，与此相对，下面一行示出相同细胞系与孵育6小时。在白色方框中圈出的区域在图12A-图12D和12G-图12J中放大显示。比例尺对应于20μm。
图13A-图13I示出了与孵育24小时后的负载物的释放。图13A-图13C示出了与67nM Flutax-2和0.09μg/mL Tfn-AF568孵育24小时的CHO细胞的荧光显微图像。图13D-图13G示出了与和CD3ac自组装形成的相同量的Flutax-2和Tfn-AF568孵育24小时的CHO细胞的荧光图像。图13H示出了与细胞系(CHO、TRvb)以及与溶解的未标记的Tfn竞争相关的平均Flutax-2荧光强度。阴性对照(NC)对应于绿色通道中的细胞自发荧光。结果为平均值±s.e.m.，单星号表示P<0.01，双星号表示P<10-9，Kolmogorov-Smirnov检验。比例尺对应于10μm。图13I示出了与Flutax-2孵育24小时后的CHO细胞的图像。两个样品(上面一行和下面一行)均含有66.7nM Flutax-2。上面一行示出了与溶解于细胞培养基中的Flutax-2孵育的细胞培养物，下面一行为与预先自组装为的Flutax-2孵育的相同细胞系。在白色方框中圈出的区域在图13A-图13G中放大显示。比例尺对应于20μm。
图14示出了与Flutax-2和Tfn-AF568组装的肽粒子(例如CD3ac)的一组荧光显微图像。上面一行示出了胰蛋白酶处理前的样品。由于分散的粒子的移动，且在由激发和发射滤器改变引起图像间存在时间延迟，红色和绿色通道并不一致。将相同粒子标示于括号中，并在图8A-图8F中叠加。下面一行示出了与胰蛋白酶孵育6小时后的相同样品。红色冠消失，残存的粒子粘附至盖玻片的表面。
图15A-图15B示出了Tfn-AF568(图15A)和Flutax-2(图15B)的荧光校准曲线。两者均在60％H2O、30％DMSO、10％FBS的溶液中测量。需要用有机溶剂溶解沉淀部分中的纳米粒子，FBS的存在使得标记的被分析物在塑性(plastic)表面的吸附最小化，提供了荧光团浓度和测得的荧光之间的线性关系。
图16A-图16B示出了本发明的一个或多个实施方式的肽纳米粒子。图16A示出了以EGF分子官能化的CD3ac粒子的示意图，可(为了可视化的目的)任选地用Texas Red标记该肽纳米粒子。图16B为显示细胞摄取的EGF官能化的CD3ac粒子的一组荧光图像。
图17A-图17K示出了以一个实施方式的肽纳米粒子处理的细胞(例如HeLa细胞)的实验结果，所述肽纳米粒子封装有诺考达唑(nocodazole，一种可使微管解聚、并可用作抗肿瘤剂的化学试剂)。图17A示出了四种不同实验条件的图示，其中PB1e表示封装有20μM诺考达唑的EGF官能化的CD3ac纳米粒子，实验结果如图17B-图17F所示。图17B示出了一组荧光图像，显示在图17A给出条件下孵育1小时后的细胞的微管结构。细胞内的红色荧光信号表示由细胞摄取的PB1e纳米粒子。图17C示出了一组荧光图像，显示在给定的不同时间段后细胞摄取的PB1e纳米粒子。图17D-图17F示出了在不同给定条件下处理的HeLa细胞的微管结构的荧光图像。图17G示出了四种不同实验条件的图示，其中PB1e表示封装有40μM诺考达唑的EGF官能化的CD3ac纳米粒子，实验结果如图17H-图17K所示。图17H-图17I示出了在给出的不同条件下孵育4小时后的细胞图像。图17I示出了不同条件下的细胞的微管结构(用绿色表示)的荧光图像。细胞内的红色信号表示细胞摄取的PB1e纳米粒子。图17J-图17K示出了在给定的不同条件下孵育24小时后的细胞图像。图17K示出了不同条件下的细胞的微管结构(用绿色表示)的荧光图像。细胞内的红色信号表示细胞摄取的PB1e纳米粒子。
图18A-图18C示出了本发明另一实施方式的肽纳米粒子，其中以抗体对CD3ac纳米粒子进行官能化。图18A示出了以一抗或二抗官能化的CD3ac纳米粒子的示意图。图18B显示以兔抗转铁蛋白IgG官能化的CD3ac纳米粒子可结合至转铁蛋白(以A568标记)，并因此在右图显示为亮点。图18C显示以兔抗转铁蛋白IgG官能化的CD3ac纳米粒子可结合至抗兔IgG(以Alexa555标记)，并因此在右图显示为亮点。
图19A-图19B示出了未乙酰化的肽纳米粒子(CD3)用作体外转染试剂的荧光图像。图19A显示CD3粒子可用于在细胞内部递送寡核苷酸。图19B显示在无CD3粒子时不发生寡核苷酸对细胞的转染。
图20A-图20B示出了在未乙酰化的肽粒子中的寡核苷酸封装效率。图20A为一组时程图像，显示在电泳时寡核苷酸和蛋白在琼脂糖凝胶中的迁移。在图20A中，将含有～21μMCD3肽(H-LK-LK-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2)4+、～5.4μM ssDNA(5'-TTGTGCCGCCTTTGCAGGT GTATC-3')24-、～0.24μM AF488-ssDNA(AF488-5'-TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3')24-、以及～4.14μg/mL Tfn-AF568的混合物加样至上侧泳道，而下侧(对照)泳道加入类似的混合物，但不含CD3肽。在电泳约40min后，过量的ssDNA和Tfn穿过琼脂糖凝胶向正极移动，而在琼脂糖凝胶的加样区形成的肽粒子(由AF488信号和AF568荧光信号共定位证实)因其较大的尺寸而不能在琼脂糖凝胶中迁移。图20B为一组HP-WAX(弱阴离子交换)色谱数据，显示大多数CD3肽和ssDNA被封装入肽粒子(沉淀)，且几乎不残留在上清液中。～1.5min处的峰：CD3肽；～14.5min和～15min处的峰：分别为单独的ssDNA和部分杂交的ssDNA。
图21为显示由HeLa细胞摄取含有核酸的肽粒子的显微荧光图像。在这一实施方式中，由包含CD3肽、CD3ac肽、寡核苷酸(例如ssDNA)和转铁蛋白的混合物形成肽粒子。ssDNA-AF488荧光信号与肽粒子的共定位(由转铁蛋白-AF568荧光表示，其中转铁蛋白在粒子外表面上形成)表明了肽粒子在生理条件下的稳定性以及此类肽粒子将核酸分子或寡核苷酸递送至细胞的能力。
图22A-图22D示出了含有ssDNA的肽粒子在血清(例如～10％血清)中的稳定性的数据和使用该肽粒子进行细胞转染的效率的数据。图22A显示PNP1粒子(含有ssDNA的CD3肽粒子)在水中的稳定性依赖于温度，在更高温度下更多PNP1粒子趋向于解离。图22B显示PNP1粒子在水中的稳定性的时程研究数据，表明PNP1粒子在水中的稳定性依赖于温度，并且在更高温度下(例如，在高于4℃的温度下)PNP1粒子趋向于更快地解离。图22C为一组荧光图像，显示在PNP1粒子或PNP2粒子(含有ssDNA的CD3/CD3ac肽粒子)存在下，在约4℃和约37℃的温度下孵育的HeLa细胞。图22C的上侧子图显示，当细胞与PNP1粒子在约37℃孵育时，在细胞质中检出弥散性的且更强的Tfn-AF568荧光信号，相比之下在约4℃孵育时，在细胞中检出更多的点状Tfn-AF568荧光。然而，如图22C的下侧子图所示，在与PNP2粒子孵育的细胞中并未观测到这一差别。相反，图22C的下侧子图显示，在PNP2粒子存在下，在约4℃和约37℃两个条件孵育的细胞中均观测到点状且相当的Tfn-AF568荧光信号。这些发现表明，PNP1粒子在约37℃在血清(例如～10％血清)中倾向于解离；而PNP2粒子在约37℃至少约30min，在血清(例如～10％血清)中显得更加稳定。图22D为阴性对照细胞(即，在ssDNA存在、而无PNP1粒子或PNP2粒子或相应的肽存在下孵育的HeLa细胞)的荧光图像，表明与在与PNP1粒子或PNP2粒子孵育的细胞中相比，在阴性对照中观测到的AF488-ssDNA的荧光强度低得多。
具体实施方式
本文提供的多个方面和实施方式涉及两亲性肽、包含本文所述一个或多个实施方式的两亲性肽的肽粒子、以及本文所述的两亲性肽或肽粒子的用途。可通过控制两亲性肽的氨基酸残基上存在的带电基团的数量(例如，通过(例如用乙酰化)掩蔽一个或多个带电的氨基)，调整本文所述的两亲性肽的净电荷。因此，本文所述的两亲性肽和肽粒子可用作不同类型活性试剂(例如带电或不带电的分子，或极性或非极性分子)的递送载体或运载体。另外，还可通过控制存在于肽粒子中的两个以上实施方式的两亲性肽之比来对本文所述的肽粒子(例如在生理条件下)的溶解性进行调整。举例来说，完全掩蔽(例如完全乙酰化)的两亲性肽通常可形成不溶的肽粒子，而与完全掩蔽(例如完全乙酰化)的两亲性肽形成的粒子相比，由部分掩蔽(例如部分乙酰化)或未掩蔽(例如未乙酰化)的肽形成的粒子通常具有(例如在生理条件下)更高的溶解性(或更低的稳定性)。因此，在一些实施方式中，可通过用具有不同溶解性的两亲性肽的混合物形成肽粒子并相应改变这些两亲性肽在肽粒子中的含量，控制本文所述的肽粒子的(例如在生理条件下的)溶解性或稳定性。因此，可对本文所述的两亲性肽和肽粒子的verstability和稳定性进行调整以用于多种应用，例如药物递送和/或活性试剂的缓释。
本文所使用的术语“稳定性”或“稳定的”是指在指定条件(例如，生理条件)下，肽粒子在一段时间(例如，至少约30min或更久，包括至少约1小时、至少约3小时、至少约6小时、至少约12小时、至少约24小时或更久)内，维持其初始体积(例如，至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％以上的初始体积)的能力。肽粒子的稳定性部分受控于其在指定条件下的溶解性。在指定条件下肽粒子的溶解性越高，则该指定条件下肽粒子越不稳定。在一个实施方式中，本文所使用的术语“稳定性”或“稳定的”是指肽粒子在指定条件下(例如，在指定温度下在水性介质中)不溶。在一些实施方式中，所述水性介质为水。在一些实施方式中，所述水性介质为生理介质(例如，具有某一盐浓度、pH和/或蛋白/血清浓度的生理介质)。
在一方面，本文提供了包含疏水性肽片段和亲水性肽片段的两亲性肽。发明人尤其发现，通过对两亲性肽中亲水性氨基酸残基的亲水性进行调节，可对所述两亲性肽的两亲性作出调节，从而出乎意料地使得所述肽自组装为固体粒子。可通过将亲水基团缀合至亲水性肽片段的氨基酸、或通过掩蔽亲水性肽片段的亲水基团、或掩蔽两亲性肽的N-末端氨基来对两亲性进行调节。例如，当所述亲水性氨基酸为带电氨基酸时，可通过将分子的带电部分与保护基团相缀合来调节亲水性。因此，在一些实施方式中，两亲性肽中的至少一个氨基与氮保护基团或氨基保护基团相缀合。
在一些实施方式中，所述两亲性肽被完全掩蔽。本文所使用的“完全掩蔽的肽”指的是N-末端氨基和亲水性肽片段中全部侧链氨基均缀合有氮保护基团或氨基保护基团的两亲性肽。
在一些实施方式中，所述两亲性肽被部分掩蔽。本文所使用的“部分掩蔽的肽”是指N-末端氨基或亲水性肽片段中的侧链氨基中的一个或多个未缀合有氮保护基团或氨基保护基团的两亲性肽；然而，所述两亲性肽仍包含至少一个缀合有氮保护基团或氨基保护基团的氨基。
本文所使用的“氮保护基团”或“氨基保护基团”是指封闭(block)或掩蔽NH2基团的部分。示例性的氨基保护基团包括但不限于：氨基甲酸酯保护基团，如2-三甲基硅基乙氧基羰基(Teoc)、1-甲基-1-(4-联苯基)乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、以及苄氧基羰基(Cbz)；酰胺保护基团，如甲酰基、乙酰基，三卤代乙酰基、苯甲酰基以及硝基苯基乙酰基；磺酰胺保护基团，如2-硝基苯磺酰基；以及亚胺和环状酰亚胺保护基团，如苯二甲酰亚胺基(phthalimido)和二硫杂琥珀酰基(dithiasuccinoyl)。进一步的氨基保护基团以及其它典型的保护基团在Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第二章，2d ed.，John Wiley&Sons，NewYork，1991，以及Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach，Ekstein，F.Ed.，IRL Press，N.Y，1991中公开，通过引用的方式将其内容整体并入本文。
在一些实施方式中，氮保护基团或氨基保护基团为酰基或烷基，例如：乙酰基(Acetyl，ethanoyl)、丙酰基、叔丁酰基、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基。
在一些实施方式中，两亲性肽中的N-末端氨基与氮保护基团或氨基保护基团相缀合。
在一些实施方式中，两亲性肽的氨基酸的至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)侧链氨基与氮保护基团或氨基保护基团相缀合。其侧链氨基待缀合的氨基酸可存在于两亲性肽的任何位置。侧链缀合的氨基酸可彼此相邻或彼此不相邻。当存在三个以上的侧链缀合的氨基酸时，所述侧链氨基酸中的一些可与另一侧链缀合的氨基酸相邻存在，而一些侧链缀合的氨基酸不与另一侧链缀合的氨基酸相邻。另外，当存在两个以上的氮保护基团或氨基保护基团时，其可为全部相同、全部不同、或相同与不同的任意组合。
在一些实施方式中，亲水性肽片段中的氨基酸的至少一个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)侧链氨基与氮保护基团或氨基保护基团相缀合。不受限制地，侧链缀合的氨基酸可位于亲水性肽片段的任何位置。例如，由N-末端起算，位于亲水性肽片段的1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位等。
在一些实施方式中，两亲性肽的N-末端氨基和两亲性肽的亲水性肽片段中的至少一个侧链氨基(包括例如，至少一个、至少两个、至少三个或更多个侧链氨基)与氮保护基团或氨基保护基团相缀合。在一些实施方式中，两亲性肽的N-末端氨基和两亲性肽的亲水性肽片段中的至少一个侧链氨基(包括例如，至少一个、至少两个、至少三个或更多个侧链氨基)被乙酰化。
在一些实施方式中，两亲性肽的N-末端氨基和两亲性肽的亲水性肽片段中的全部侧链氨基与氮保护基团或氨基保护基团相缀合。在一些实施方式中，两亲性肽的N-末端氨基和两亲性肽的亲水性肽片段中的全部侧链氨基被乙酰化。
不希望被理论限制，两亲性肽中氮保护基团或氨基保护基团的存在调节了两亲性肽的亲水性。因此，可通过改变两亲性肽中氮保护基团或氨基保护基团的数量来调整两亲性肽的两亲性。
两亲性肽可具有任何长度的氨基酸序列。在一些实施方式中，两亲性肽的长度可为约5个氨基酸残基至约25个氨基酸残基。在一个实施方式中，两亲性肽的长度为约10个氨基酸残基。
疏水性肽片段
本文所使用的术语“疏水性肽片段”指的是具有相对高含量的疏水性氨基酸的肽片段。例如，疏水性肽片段是指这样一种肽片段，其中至少约50％以上(包括至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更高)的氨基酸残基为疏水性氨基酸残基。在一个实施方式中，疏水性肽片段为全部氨基酸均为疏水性氨基酸的肽片段。
因此，在一些实施方式中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(AA11-AA12)b-(AA13)d，其中，每次出现的AA11、AA12和AA13分别为独立选定的疏水性氨基酸残基，b为1-20的整数、且d为0或1，只要AA11和AA12具有相反的(即，D-和L-)构型且AA12和AA13具有相反的构型。例如，若由AA11表示的氨基酸具有D-构型，则由AA12表示的氨基酸具有L-构型且AA13(若存在的话)具有D-构型。或者，若由AA11表示的氨基酸具有L-构型，则由AA12表示的氨基酸具有D-构型且AA13(若存在的话)具有L-构型。
在一些实施方式中，所述疏水性肽片段包含2-10个交替的D-氨基酸和L-氨基酸的序列，所述氨基酸选自于由下列氨基酸所组成的组：丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸(Trp)，以及以上氨基酸的任意组合。
本文所使用的术语“疏水性氨基酸”指的是根据Eisenberg，1984，J.Mol.Biol.179：125-142(1984)的标准化共有疏水性级别(normalized consensushydrophobicity scale)表现出的疏水性高于零的氨基酸。示例性的疏水性氨基酸包括但不限于：Ala、Val、Ile、Leu、Phe、Tyr、Trp、Pro、Met、Gly，以及以上氨基酸的衍生物。
在一些实施方式中，疏水性氨基酸为芳香族氨基酸。本文所使用的术语“芳香族氨基酸”指的是其侧链具有至少一个芳环或杂芳环的疏水性氨基酸。所述芳环或杂芳环可含有一个或多个取代基，如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-NO、-NH2、-NHR、-NRR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NRR等，其中R独立地为(C1-C6)烷基、取代的(C2-C6)烷基、(C2-C6)烯基、取代的(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、取代的(C2-C6)炔基、(C5-C20)芳基、取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代的(C6-C26)烷芳基、5-20元杂芳基、取代的5-20元杂芳基、6-26元烷杂芳基或者取代的6-26元烷杂芳基。示例性的芳香族氨基酸包括但不限于Phe、Tyr和Trp。
在一些实施方式中，疏水性氨基酸为脂肪族氨基酸。本文所使用的术语“脂肪族氨基酸”是指具有脂肪族烃侧链的疏水性氨基酸。示例性的脂肪族氨基酸包括但不限于Ala、Val、Leu和Ile。
在一些实施方式中，疏水性氨基酸为非极性氨基酸。本文所使用的术语“非极性氨基酸”是指带有的侧链在生理pH下不带电的疏水性氨基酸，该氨基酸具有的键中由两个原子共用的电子对通常由两个原子中的每一者均等控制(即，所述侧链是非极性的)。示例性的非极性氨基酸包括但不限于Leu、Val、Ile、Met、Gly和Ala。
本领域技术人员将理解的是，本文所述的氨基酸的分类并不是互斥的。因此，具有的侧链表现出两种以上物理化学性质的氨基酸可归于多个类别中。例如，具有被极性取代基进一步取代的芳香部分的氨基酸侧链，如Tyr，可同时表现出芳香族疏水性和极性或亲水性，因此可包含在芳香族和极性两个类别中。特别是在本文提供的详细公开内容的基础之上，对任何氨基酸的适当分类对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
在一些实施方式中，每次出现的AA11、AA12和AA13独立地选自于由以下氨基酸所组成的组：Pro、Ile、Phe、Val、Leu、Trp、Met、Ala、Gly、Tyr，以及以上氨基酸的任意组合。
不受限制地，全部AA11和AA12可相同或全部不同、或者为相同和不同的任意组合。因此，在一些实施方式中，全部AA11是相同的。在一些实施方式中，全部AA12是相同的。在一些实施方式中，全部AA11是相同的、全部AA12是相同的、且AA11与AA12不同。
在一些实施方式中，AA11、AA12和AA13中至少一者不为Tyr或Leu。
在一些实施方式中，至少一个AA11不为Tyr。
在一些实施方式中，至少一个AA12不为Leu。
在一些实施方式中，AA13不为Try或Leu。
在一些实施方式中，AA11为Tyr。
在一些实施方式中，AA12为Leu。
在一些实施方式中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu)m-(Trp)n或者(Leu-Trp)p-(Leu)q，其中，m和p独立地为3-20的整数、且n和q独立地为0或1。每个Trp可为D-Trp或L-Trp、且每个Leu可为D-Leu或L-Leu。当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu。类似地，当Leu为L-Leu时Trp就为D-Trp、且当Leu为D-Leu时Trp就为L-Trp。
在一些实施方式中，m和p独立地为整数1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方式中，m和p独立地为1-5的整数(例如，整数1、2、3、4或5)。在一些实施方式中，m或p为整数1、2或3。在一个实施方式中，m或p为整数3。
在一个实施方式中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp)。
亲水性肽片段
本文所使用的术语“亲水性肽片段”是指具有相对于烃部分而言具有亲水性的肽片段。在一些实施方式中，所述亲水性肽片段是指相对于本文所述的两亲性肽的疏水性肽片段而言具有亲水性的肽片段。通常，亲水性肽片段包含至少一个亲水性氨基酸。本文所使用的术语“亲水性氨基酸”是指根据Eisenberg，J.Mol.Biol.179：125-142(1984)(以引用的方式将其内容并入本文)的标准化共有疏水性级别表现出的疏水性小于零的氨基酸残基。示例性的亲水性氨基酸包括但不限于：Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Gln，以及以上氨基酸的衍生物。
在一些实施方式中，亲水性氨基酸为带电或不带电的氨基酸。本文所使用的术语“带电氨基酸”是指带有净电荷的氨基酸残基。因此，带电氨基酸可以是阳离子氨基酸或阴离子氨基酸。本文所使用的术语“不带电氨基酸”是指不带有净电荷的氨基酸残基。可以通过掩蔽氨基酸的电荷(例如，通过将保护基团缀合至带电原子上)将带电氨基酸残基修饰为不带电氨基酸。在一个实施方式中，可通过乙酰化将带电氨基酸残基修饰为不带电氨基酸。
在一些实施方式中，亲水性氨基酸为极性氨基酸。本文所使用的术语“极性氨基酸”是指带有的侧链在生理pH值下带电或不带电的亲水性氨基酸，该氨基酸具有的至少一个键中由两个原子共用的电子对通常由其中一个原子更紧密地控制。示例性的极性氨基酸包括但不限于：Asn、Gln、Ser、Thr，以及以上氨基酸的任意组合。
在一些实施方式中，亲水性氨基酸为带电或不带电的极性氨基酸。
在一些实施方式中，亲水性氨基酸为阳离子氨基酸。本文所使用的术语“阳离子氨基酸”是指含有的侧链在正常生理条件下带正电的氨基酸残基。因此，术语“阳离子氨基酸”包括其含有的侧链在正常生理条件下由此带正电的任何天然存在的氨基酸或氨基酸模拟物。一般而言，在其可变侧链中包含氨基的氨基酸残基被认为是阳离子氨基酸。示例性的阳离子氨基酸包括但不限于：赖氨酸、组氨酸、精氨酸、羟基赖氨酸、鸟氨酸，以及以上氨基酸各自的衍生物、类似物和立体异构构型。
在一些实施方式中，亲水性氨基酸为阴离子氨基酸。本文所使用的术语“阴离子氨基酸”是指带负电的亲水性氨基酸。示例性的阴离子氨基酸包括但不限于：Glu、Asp，以及以上氨基酸的衍生物。
在一些实施方式中，亲水性氨基酸为酸性氨基酸。本文所使用的术语“酸性氨基酸”是指带有的侧链pK值小于7的亲水性氨基酸。酸性氨基酸通常由于失去氢离子而具有在生理pH下带负电的侧链。示例性的酸性氨基酸包括但不限于：Glu、Asp，以及以上氨基酸的衍生物。
在一些实施方式中，亲水性氨基酸为碱性氨基酸。本文所使用的术语“碱性氨基酸”是指带有的侧链pK值大于7的亲水性氨基酸。碱性氨基酸通常由于与水合氢离子(hydronium ion)缔合而具有在生理pH下带正电的侧链。示例性的碱性氨基酸包括但不限于：His、Arg、Lys，以及以上氨基酸的衍生物。
在一些实施方式中，亲水性肽片段包含至少一个带电氨基酸、或至少一个不带电的极性氨基酸，或以上氨基酸的组合。在一些实施方式中，所述亲水性肽片段包含至少一个选自于由下列氨基酸所组成的组中的氨基酸：Lys、Arg、His、Asp和Glu，或至少一个选自于由下列氨基酸所组成的组中的氨基酸：Ser、Thr、Asn和Gln，或以上氨基酸的任意组合。在一些实施方式中，所述亲水性肽片段可包含一个选自于由下列氨基酸所组成的组中的氨基酸：Lys、Arg和His。
在一些实施方式中，以氮保护基团或氨基保护基团对所述亲水性肽片段中的至少一个氨基进行掩蔽或缀合。
在一些实施方式中，所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(AA21)f，其中AA21为亲水性氨基酸，每次出现的AA21均独立选择，且f是1-21的整数。
不受限制地，全部AA21可相同、全部不同、或为相同和不同的任意组合。
在一些实施方式中，f为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
在一些实施方式中，所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)r，其中r为1-15的整数。在一些实施方式中，r为整数1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方式中，r为2-5的整数(例如，r为整数2、3、4或5)。在一个实施方式中，r为整数3。
在一些实施方式中，所述亲水性肽片段包含选自于由以下氨基酸序列所组成的组中的氨基酸序列：(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)、(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys(Ac))、(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-(L-Lys)、(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys)、(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))、(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys(Ac))、(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys)、L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))，以及以上氨基酸序列的任意组合，其中，“Ac”指的是Lys氨基酸残基的乙酰化。
在一些实施方式中，所述亲水性肽片段包含亲水性聚合物或者为亲水性聚合物。本文所使用的术语“亲水性聚合物”是指相对于烃部分而言具有亲水性的聚合物。在一些实施方式中，术语“亲水性聚合物”是指相对于本文所述的两亲性肽的疏水性肽片段而言具有亲水性的聚合物。聚合物的亲水性可以通过例如ASTM D570测试来确定。通常而言，亲水性聚合物是水溶性的。示例性的亲水性聚合物包括但不限于：聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(丙二醇)(poly(propylene glycol))、聚(环氧乙烷-共-环氧丙烷)、透明质酸、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、肝素、聚乙烯基(吡咯烷酮)、硫酸软骨素、壳聚糖(chitosan)、葡糖胺聚糖(glucosaminoglucans)、葡聚糖、糊精、硫酸葡聚糖、醋酸纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、纤维素质(cellulosic)、聚(丙二醇)(poly(trimethylene glycol))、聚丁二醇(poly(tetramethylene glycol))、多肽、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰亚胺、聚(乙烯胺)、聚(烯丙基胺)，以及以上聚合物的共混物。
示例性的肽修饰
在一些实施方式中，本文所述的两亲性肽可包含至少一个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个)选自于由下列氨基酸所组成的组的氨基酸：丙氨酸；精氨酸；天冬酰胺；天冬氨酸；半胱氨酸；谷氨酸；谷氨酰胺；甘氨酸；组氨酸；异亮氨酸；亮氨酸；赖氨酸；甲硫氨酸；苯丙氨酸；脯氨酸；丝氨酸；苏氨酸；色氨酸；酪氨酸；缬氨酸；同型半胱氨酸；磷酸丝氨酸；磷酸苏氨酸；磷酸酪氨酸；羟脯氨酸；γ-羧基谷氨酸(γ-carboxyglutamate)；马尿酸(hippuric acid)；八氢吲哚-2-羧酸；抑胃酶氨酸(statine)；1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸；青霉胺(3-巯基-D-缬氨酸)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(citruline)；α-甲基-丙氨酸；对苯甲酰基苯丙氨酸；对氨基苯丙氨酸；对氟苯丙氨酸；苯基甘氨酸；炔丙基甘氨酸；N-甲基甘氨酸(肌氨酸，Sar)；以及叔丁基甘氨酸；二氨基丁酸；7-羟基-四氢异喹啉羧酸；萘基丙氨酸；联苯基丙氨酸；环己基丙氨酸；氨基-异丁酸(AiB)；正缬氨酸；正亮氨酸(Nle)；叔亮氨酸；四氢异喹啉羧酸；哌啶酸(pipecolicacid)；苯基甘氨酸；高苯丙氨酸；环己基甘氨酸；脱氢亮氨酸；2,2-二乙基甘氨酸；1-氨基-1-环戊烷羧酸；1-氨基-1-环己烷羧酸；氨基-苯甲酸；氨基-萘甲酸；γ-氨基丁酸；二氟苯基丙氨酸；哌啶甲酸(nipecotic acid)；N-α-咪唑乙酸(IMA)；噻吩基-丙氨酸；叔丁基甘氨酸；脱氨基-Tyr；氨基戊酸(Ava)；焦谷氨酸(pyroglutaminic acid，<Glu)；α-氨基异丁酸(αAib)；γ-氨基丁酸(γAbu)；α-氨基丁酸(αAbu)；αγ-氨基丁酸(αγAbu)；3-吡啶基丙氨酸(Pal)；异丙基-α-Nε赖氨酸(ILys)；萘基丙氨酸(Napthyalanine，Nal)；α-萘基丙氨酸(α-Nal)；β-萘基丙氨酸(β-Nal)；乙酰基-β-萘基丙氨酸(Ac-β-萘基丙氨酸)；α,β-萘基丙氨酸；Nε-picoloyl-赖氨酸(PicLys)；4-卤代苯基；4-吡咯烷基丙氨酸(4-pyrolidylalanine)；异哌啶羧酸(isonipecotic carboxylic acid，inip)；β-氨基酸；以及以上氨基酸的异构体、类似物和衍生物。本领域技术人员将领会的是，这一定义包括D-氨基酸和L-氨基酸；α-氨基酸、β-氨基酸和γ-氨基酸；化学修饰的氨基酸；天然存在的非成蛋白性(non-proteogenic)氨基酸；稀有氨基酸；以及具有本领域中已知为氨基酸特征的性质的化学合成的化合物。此外，每一实施方式可包括所述基团的任意组合。
此外，本文所使用的术语“氨基酸”包括偏离天然存在的氨基酸的结构的化合物或分子，但所述化合物或分子大致上具有氨基酸的结构，从而可将其用于替换肽中天然存在的氨基酸，替换后所述肽的活性(例如形成聚集体的活性)仍然保留。因此，例如，在一些实施方式中，氨基酸也可以包括具有侧链修饰或取代的氨基酸，并且还可以包括相关的有机酸、酰胺等。不受限制地，氨基酸可以是成蛋白性氨基酸或非成蛋白性氨基酸。本文所使用的术语“成蛋白性”表示该氨基酸可通过公知的代谢通路并入细胞中的蛋白。
在一些实施方式中，两亲性肽包含至少一个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个)化学修饰的氨基酸。本文所使用的术语“化学修饰的氨基酸”是指经一种或多种试剂处理的氨基酸。化学修饰的氨基酸可存在于所述两亲性肽的任何位置。当存在多于一个的化学修饰的氨基酸时，其位置可彼此相邻或不彼此相邻。当存在三个以上的化学修饰的氨基酸时，一些化学修饰的氨基酸可彼此相邻，而一些化学修饰的氨基酸不与另一化学修饰的氨基酸相邻。
在一些实施方式中，亲水性肽片段包含化学修饰的氨基酸。不受限制地，化学修饰的氨基酸可存在于所述亲水性肽片段的任何位置，例如，由N-末端起算，位于亲水性肽片段的1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位等。
在一些实施方式中，疏水性肽片段包含化学修饰的氨基酸。不受限制地，化学修饰的氨基酸可以存在于疏水性肽片段的任何位置，例如，从N-末端起算，位于疏水性肽片段的1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位等。
在一些实施方式中，所述亲水性肽片段和所述疏水性肽片段各自均可包含至少一个化学修饰的氨基酸。当所述亲水性肽片段和所述疏水性肽片段均包含化学修饰的氨基酸时，存在于每一肽片段中的此类化学修饰的氨基酸的数目可相同或不同。
在一些实施方式中，两亲性肽包含至少一个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)β-氨基酸。当存在多于一个的β-氨基酸时，其位置可以彼此相邻或不彼此相邻。当存在三个以上的β-氨基酸时，一些β-氨基酸可以与另一β-氨基酸相邻，而一些β-氨基酸不与另一β-氨基酸相邻。
在一些实施方式中，亲水性肽片段包含β-氨基酸。不受限制地，β-氨基酸可存在于所述亲水性肽片段的任何位置，例如，从N-末端起算，位于亲水性肽片段的1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位等。
在一些实施方式中，疏水性肽片段包含β-氨基酸。不受限制地，β-氨基酸可存在于所述疏水性肽片段的任意位置，例如，从N-末端起算，位于疏水性肽片段的1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位等。
在一些实施方式中，所述亲水性肽片段和所述疏水性肽片段各自均可包含至少一个β-氨基酸。当所述亲水性肽片段和所述疏水性肽片段均包含β-氨基酸时，每一肽片段中此类β-氨基酸的数目可相同或不同。
示例性的β-氨基酸包括但不限于：L-β-高脯氨酸盐酸盐；(±)-3-(Boc-氨基)-4-(4-联苯基)丁酸；(±)-3-(Fmoc-氨基)-2-苯基丙酸；(1S,3R)-(+)-3-(Boc-氨基)环戊烷羧酸；(2R,3R)-3-(Boc-氨基)-2-羟基-4-苯基丁酸；(2S,3R)-3-(Boc-氨基)-2-羟基-4-苯基丁酸；(R)-2-[(Boc-氨基)甲基]-3-苯基丙酸；(R)-3-(Boc-氨基)-2-甲基丙酸；(R)-3-(Boc-氨基)-2-苯基丙酸；(R)-3-(Boc-氨基)-4-(2-萘基)丁酸；(R)-3-(Boc-氨基)-5-苯基戊酸；(R)-3-(Fmoc-氨基)-4-(2-萘基)丁酸；(R)-(-)-吡咯烷-3-羧酸；(R)-Boc-3,4-二甲氧基-β-Phe-OH；(R)-Boc-3-(3-吡啶基)-β-Ala-OH；(R)-Boc-3-(三氟甲基)-β-Phe-OH；(R)-Boc-3-氰基-β-Phe-OH；(R)-Boc-3-甲氧基-β-Phe-OH；(R)-Boc-3-甲基-β-Phe-OH；(R)-Boc-4-(4-吡啶基)-β-Homoala-OH；(R)-Boc-4-(三氟甲基)-β-Homophe-OH；(R)-Boc-4-(三氟甲基)-β-Phe-OH；(R)-Boc-4-溴-β-Phe-OH；(R)-Boc-4-氯-β-Homophe-OH；(R)-Boc-4-氯-β-Phe-OH；(R)-Boc-4-氰基-β-Homophe-OH；(R)-Boc-4-氰基-β-Phe-OH；(R)-Boc-4-氟-β-Phe-OH；(R)-Boc-4-甲氧基-β-Phe-OH；(R)-Boc-4-甲基-β-Phe-OH；(R)-Boc-β-Tyr-OH；(R)-Fmoc-4-(3-吡啶基)-β-Homoala-OH；(R)-Fmoc-4-氟-β-Homophe-OH；(S)-(+)-吡咯烷-3-羧酸；(S)-3-(Boc-氨基)-2-甲基丙酸；(S)-3-(Boc-氨基)-4-(2-萘基)丁酸；(S)-3-(Boc-氨基)-5-苯基戊酸；(S)-3-(Fmoc-氨基)-2-甲基丙酸；(S)-3-(Fmoc-氨基)-4-(2-萘基)丁酸；(S)-3-(Fmoc-氨基)-5-己烯酸；(S)-3-(Fmoc-氨基)-5-苯基-戊酸；(S)-3-(Fmoc-氨基)-6-苯基-5-己烯酸；(S)-Boc-2-(三氟甲基)-β-Homophe-OH；(S)-Boc-2-(三氟甲基)-β-Homophe-OH；(S)-Boc-2-(三氟甲基)-β-Phe-OH；(S)-Boc-2-氰基-β-Homophe-OH；(S)-Boc-2-甲基-β-Phe-OH；(S)-Boc-3,4-二甲氧基-β-Phe-OH；(S)-Boc-3-(三氟甲基)-β-Homophe-OH；(S)-Boc-3-(三氟甲基)-β-Phe-OH；(S)-Boc-3-甲氧基-β-Phe-OH；(S)-Boc-3-甲基-β-Phe-OH；(S)-Boc-4-(4-吡啶基)-β-Homoala-OH；(S)-Boc-4-(三氟甲基)-β-Phe-OH；(S)-Boc-4-溴-β-Phe-OH；(S)-Boc-4-氯-β-Homophe-OH；(S)-Boc-4-氯-β-Phe-OH；(S)-Boc-4-氰基-β-Homophe-OH；(S)-Boc-4-氰基-β-Phe-OH；(S)-Boc-4-氟-β-Phe-OH；(S)-Boc-4-碘-β-Homophe-OH；(S)-Boc-4-甲基-β-Homophe-OH；(S)-Boc-4-甲基-β-Phe-OH；(S)-Boc-β-Tyr-OH；(S)-Boc-γ,γ-二苯基-β-Homoala-OH；(S)-Fmoc-2-甲基-β-Homophe-OH；(S)-Fmoc-3,4-二氟-β-Homophe-OH；(S)-Fmoc-3-(三氟甲基)-β-Homophe-OH；(S)-Fmoc-3-氰基-β-Homophe-OH；(S)-Fmoc-3-甲基-β-Homophe-OH；(S)-Fmoc-γ,γ-二苯基-β-Homoala-OH；2-(Boc-氨基甲基)苯基乙酸；3-氨基-3-(3-溴苯基)丙酸；3-氨基-4,4,4-三氟丁酸；3-氨基丁酸；DL-3-氨基异丁酸；DL-β-氨基异丁酸(特纯，puriss)；DL-β-高亮氨酸；DL-β-高甲硫氨酸；DL-β-高苯丙氨酸；DL-β-亮氨酸；DL-β-苯丙氨酸；L-β-高丙氨酸盐酸盐；L-β-高谷氨酸盐酸盐；L-β-高谷氨酰胺盐酸盐；L-β-高羟脯氨酸盐酸盐；L-β-高异亮氨酸盐酸盐；L-β-高亮氨酸盐酸盐；L-β-高赖氨酸二盐酸盐；L-β-高甲硫氨酸盐酸盐；L-β-高苯丙氨酸烯丙基酯盐酸盐；L-β-高苯丙氨酸盐酸盐；L-β-高丝氨酸；L-β-高苏氨酸；L-β-高色氨酸盐酸盐；L-β-高酪氨酸盐酸盐；L-β-亮氨酸盐酸盐；Boc-D-β-Leu-OH；Boc-D-β-Phe-OH；Boc-β3-Homopro-OH；Boc-β-Glu(OBzl)-OH；Boc-β-Homoarg(Tos)-OH；Boc-β-Homoglu(OBzl)-OH；Boc-β-Homohyp(Bzl)-OH(二环己基铵)盐(工业纯，technical)；Boc-β-Homolys(Z)-OH；Boc-β-Homoser(Bzl)-OH；Boc-β-Homothr(Bzl)-OH；Boc-β-Homotyr(Bzl)-OH；Boc-β-Ala-OH；Boc-β-Gln-OH；Boc-β-Homoala-OAll；Boc-β-Homoala-OH；Boc-β-Homogln-OH；Boc-β-Homoile-OH；Boc-β-Homoleu-OH；Boc-β-Homomet-OH；Boc-β-Homophe-OH；Boc-β-Homotrp-OH；Boc-β-Homotrp-OMe；Boc-β-Leu-OH；Boc-β-Lys(Z)-OH(二环己基铵)盐；Boc-β-Phe-OH；3-(苄基氨基)丙酸乙酯；Fmoc-D-β-Homophe-OH；Fmoc-L-β3-高脯氨酸；Fmoc-β-D-Phe-OH；Fmoc-β-Gln(Trt)-OH；Fmoc-β-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-β-Homoarg(Pmc)-OH；Fmoc-β-Homogln(Trt)-OH；Fmoc-β-Homoglu(OtBu)-OH；Fmoc-β-Homohyp(tBu)-OH；Fmoc-β-Homolys(Boc)-OH；Fmoc-β-Homoser(tBu)-OH；Fmoc-β-Homothr(tBu)-OH；Fmoc-β-Homotyr(tBu)-OH；Fmoc-β-Ala-OH；Fmoc-β-Gln-OH；Fmoc-β-Homoala-OH；Fmoc-β-Homogln-OH；Fmoc-β-Homoile-OH；Fmoc-β-Homoleu-OH；Fmoc-β-Homomet-OH；Fmoc-β-Homophe-OH；Fmoc-β-Homotrp-OH；Fmoc-β-Leu-OH；Fmoc-β-Phe-OH；N-乙酰基-DL-β-苯丙氨酸；Z-D-β-Dab(Boc)-OH；Z-D-β-Dab(Fmoc)-OH(纯，purum)；Z-DL-β-高丙氨酸；Z-β-D-Homoala-OH；Z-β-Glu(OtBu)-OH(工业纯)；Z-β-Homotrp(Boc)-OH；Z-β-Ala-OH(纯)；Z-β-Ala-ONp(纯)；Z-β-Dab(Boc)-OH；Z-β-Dab(Fmoc)-OH；Z-β-Homoala-OH；β-丙氨酸；β-丙氨酸(BioXtra)；β-丙氨酸乙酯盐酸盐；β-丙氨酸甲酯盐酸盐；β-谷氨酸盐酸盐；顺-2-氨基-3-环戊烯-1-羧酸盐酸盐；顺-3-(Boc-氨基)环己烷羧酸；以及顺-3-(Fmoc-氨基)环己烷羧酸。
在一些实施方式中，本文所述的两亲性肽可包含至少一个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个)修饰的酰胺连接，例如，骨架中的酰胺键被选自于由以下连接所组成的组中的连接替代：还原的psi肽键、脲(urea)、硫脲、氨基甲酸酯、磺酰脲、三氟乙胺、邻-(氨基烷基)-苯乙酸、对-(氨基烷基)-苯乙酸、间-(氨基烷基)-苯乙酸、硫代酰胺、四唑、硼酸酯(boronic ester)、以及烯基(olefinic)基团。酰胺替代连接可存在于两亲性肽的任何位置。当存在两个以上酰胺替代连接时，其位置可以彼此相邻(例如，在指定氨基酸的两侧)或不彼此相邻(例如，给定氨基酸仅有一侧通过肽替代连接而连接至下一氨基酸)。
在一些实施方式中，酰胺替代连接存在于亲水性肽片段中。不受限制地，所述酰胺替代连接可存在于所述亲水性肽片段的任意位置，例如，从N-末端起算，位于亲水性肽片段的1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位等。
在一些实施方式中，酰胺替代连接存在于疏水性肽片段中。不受限制地，所述酰胺替代连接可存在于所述疏水性肽片段的任意位置，例如，从N-末端起算，位于疏水性肽片段的1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、10位等。
在一些实施方式中，所述亲水性肽片段和所述疏水性肽片段各自均可包含至少一个酰胺替代连接。当所述亲水性肽片段和所述疏水性肽片段均包含酰胺替代连接时，每一肽片段中此类酰胺替代连接的数目可相同或不同。
本文所述的两亲性肽的C-末端可不进行修饰或通过缀合羧基保护基团或酰胺基进行修饰。示例性的羧基保护基团包括但不限于：酯，如甲基、乙基、叔丁基、甲氧基甲基、2,2,2-三氯乙基、2-卤代乙基；苄酯，如三苯甲基、二苯甲基、对溴苄基、邻硝基苄基等；硅基酯(silyl esters)，如三甲基硅基、三乙基硅基、叔丁基二甲基硅基等；酰胺；以及酰肼(hydrazides)。其它羧酸保护基团可包括任选地保护α-氨基酸的基团，其与所述α-氨基酸的氨基部分相连。在一些实施方式中，两亲性肽的C-末端缀合有NH2、NH-烷基或N(烷基)2。
亲水性肽片段和疏水性肽片段之间的连接
不受限制地，亲水性肽片段可连接至疏水性肽片段的N-末端或C-末端。因此，两亲性肽可以是(亲水性肽片段)-接头-(疏水性肽片段)或(疏水性肽片段)-接头-(亲水性肽片段)。在一个实施方式中，亲水性肽片段连接至疏水性肽片段的N-末端。换句话说，在一个实施方式中，疏水性肽片段连接至亲水性肽片段的C-末端。亲水性肽片段和疏水性肽片段之间的连接可为酰胺连接、酰胺替代连接、或本文所定义的接头。
在一些实施方式中，亲水性肽片段和疏水性肽片段之间的连接为酰胺连接(例如，-NHC(O)-)或酰胺替代连接。
在一些实施方式中，亲水性肽片段和疏水性肽片段之间的连接部分包括1个氨基酸、2个氨基酸，或包含3-15个氨基酸的肽。应当理解的是，当亲水性肽片段和疏水性肽片段由氨基酸链相连时，所述接头可包含一个或多个本文所述的肽修饰，例如，酰胺替代连接、β-氨基酸、D-氨基酸、化学修饰的氨基酸等。
示例性的两亲性肽及其用途
在一些实施方式中，所述两亲性肽包含氨基酸序列(L-AA21)f'-((L-AA11)-(D-AA12))b'-(L-AA13)，其中，AA21为Lys残基或其替换物(substitution)；AA11和AA13各自独立地为Trp残基或其替换物；AA12为Leu残基或其替换物，并且其中f'为3-21的整数、b'为3-20的整数，且其中N-末端氨基或至少一个AA21残基的侧链氨基中的至少一个缀合有氮保护基团或氨基保护基团。
当涉及肽时，术语“替换(substitution)”是指氨基酸改变为不同实体，例如另一氨基酸或氨基酸部分。替换可以是保守替换或非保守替换。在一些实施方式中，替换是保守替换。本文所使用的术语“保守替换”是指一种氨基酸替换，其中被替换的氨基酸残基与用于替换的残基具有相似电荷和/或相似的疏水性。被替换的残基与用于替换的残基相比可具有类似尺寸，或者更小尺寸或更大尺寸，只要该被替换的残基与用于替换的残基具有相似的生化特性。氨基酸的保守替换包括但不限于在下组中的氨基酸间进行的替换：(i)小的非极性氨基酸：丙氨酸(Ala)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)和缬氨酸(Val)；(ii)小的极性氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和半胱氨酸(Cys)；(ⅲ)酰胺氨基酸(amido amino acids)：谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn)；(iv)芳香族氨基酸：苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)；(v)碱性氨基酸：赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和组氨酸(His)；以及(vi)酸性氨基酸：谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)。即使残基属于不同的组(例如，以较小的异亮氨酸替代苯丙氨酸)，电中性的替换和以较小残基替代残基的替换也可以被认为是“保守替换”。术语“保守替换”还包括使用氨基酸模拟物、类似物、变体、或者非成蛋白性氨基酸或非标准氨基酸。仅作为示例而言，AdaA或AdaG可替换缬氨酸(Val)；L-I-噻唑烷-4-羧酸，或者D-1-恶唑烷-4-羧酸或L-1-恶唑烷-4-羧酸(参见Kauer，美国专利号4,511,390)可替换脯氨酸；Aib、β-Ala或Acp可替换甘氨酸(Gly)。
因此，在一些实施方式中，AA21可以为Lys残基或其保守替换物，例如，Arg或His。在一个实施方式中，AA21为Lys残基或其衍生物。
在一些实施方式中，AA11和AA13可各自独立地为Trp残基或其保守替换物，例如，Phe或Tyr。在一个实施方式中，AA11和AA13各自独立地为Trp残基或其衍生物。
在一些实施方式中，AA12可以为Leu残基或其保守替换物，例如，Ala、Met、Ile或Val。在一个实施方式中，AA12为Leu残基或其衍生物。
在一些实施方式中，所述两亲性肽包含氨基酸序列(L-Lys)r'-((L-Trp)-(D-Leu))m'-(L-Trp)，其中r'为3-21的整数，且m'为3-20的整数，并且其中N-末端氨基或至少一个Lys残基的侧链氨基中至少一个缀合有氮保护基团或氨基保护基团。
在一些实施方式中，r'和m'独立地为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方式中，r'和m'二者相同。在一个实施方式中，r'和m'二者均为3。
在一些实施方式中，所述两亲性肽包含选自于由下列氨基酸序列所组成的组中的氨基酸序列：Ac-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)-NH2(本文中也称为CD3ac，其中缩写“ac”或“Ac”指的是两亲性肽的N-末端氨基或亲水性肽片段中Lys残基的氨基的乙酰化)；
Ac-(L—Lys)-(L—Lys)-(L—Lys)-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
(L—Lys)-(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-(L—Lys)-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
(L-Lys)-(L—Lys(Ac))-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
(L—Lys(Ac))-(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-((L—Trp)-D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
(L—Lys(Ac))-(L—Lys(Ac))-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
Ac-(L—Lys(Ac))-(L—Lys(Ac))-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
Ac-(L—Lys)-(L—Lys)-(L—Lys)-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)；
(L—Lys)-(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)；
(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)；
(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-(L—Lys)-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)；
(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)；
(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-D—Leu))3-(L—Trp)；
(L—Lys(Ac))-(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)；
(L—Lys(Ac))-(L—Lys(Ac))-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)；
Ac-(L—Lys)-(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
Ac-(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-((L—Trp)-D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
Ac-(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-(L—Lys)-(L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
Ac—(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-L—Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
Ac-(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
Ac-(L—Lys(Ac))-(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)-NH2；
Ac-(L—Lys)-(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)；
Ac—(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)；
Ac-(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-(L—Lys)-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)；
Ac-(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)；
Ac—(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-(L—Lys(Ac))-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)；
Ac—(L—Lys(Ac))-(L—Lys(Ac))-(L—Lys)-((L—Trp)-(D—Leu))3-(L—Trp)；
Ac-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-((L-Tip)-(D-Leu))3-(L-Tip)；；以及以上氨基酸序列的任意组合。
在一些实施方式中，两亲性肽的亲水性肽片段可包含半胱氨酸。在一些实施方式中，所述半胱氨酸可存在于所述亲水性肽片段的N-末端。
发明人已经发现，本文所述一些实施方式的两亲性肽可具有细胞穿透能力。因此，在一些实施方式中，可将本文所述的两亲性肽用作细胞穿透试剂和/或转染试剂。在这些实施方式中，可将两亲性肽设计为带正电。因此，本文提供了包含带正电的两亲性肽的组合物作为细胞穿透试剂或转染试剂的用途，其中所述带正电的两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段。所述带正电的两亲性肽的疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu)m-(Trp)n或(Leu-Trp)p-(Leu)q，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-5的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然；同时，亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)r，其中r为1-15的整数。另外，在所述带正电的两亲性肽中，两亲性肽的N-末端氨基或Lys残基中的至少一个未被乙酰化。在一些实施方式中，带正电的两亲性肽的N-末端氨基和全部Lys残基均未被乙酰化。
在一些实施方式中，带正电的两亲性肽可包含氨基酸序列(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中X不存在或X为NH2。
在一些实施方式中，所述组合物可进一步包含待递送至细胞中的核酸分子或寡核苷酸(例如，DNA或RNA)。在一些实施方式中，所述组合物可进一步包含多种(例如，至少2种或更多种)核酸分子或寡核苷酸(例如，DNA或RNA，包括但不限于siRNA、shRNA、miRNA)。在一些实施方式中，所述核酸分子或寡核苷酸可设计用于治疗性干预(例如，基因治疗或siRNA治疗)。
肽合成
可根据溶液相肽化学和固相肽化学的常用方法，或通过本领域已知的经典方法，合成本文所述的两亲性肽。肽的纯化是本领域公知的，并可以是例如HPLC。有用的肽合成方法和纯化方法的记载可以在例如美国专利申请公开号20060084607中得到，以引用的方式将其内容并入本文。
可以通过合适的已知的肽聚合技术合成构建本文所述的肽，所述技术如全固相技术、部分固相技术、片段缩合或经典溶液偶联。例如，可以通过固相方法使用基于叔丁氧基羰基(BOC)或9-芴基甲氧基-羰基(FMOC)保护基团的标准方法合成本发明的肽。这一方法在G.B.Fields等，Synthetic Peptides：A User's Guide，W.M.Freeman&Company，New York，N.Y.，77-183页(1992)和教科书“Solid-Phase Synthesis”，Stewart&Young，Freemen&Company，San Francisco，1969中有描述，并且在美国专利号4,105,603(1979年8月8日公告)的公开中得以例证。经典的溶液合成在“Methoden der Organischen Chemic(Houben-Weyl)：Synthese von Peptiden”，E.Wunsch(编)(1974)Georg Thieme Verlag，StuttgartWest Germany中详细描述。合成的片段缩合方法在美国专利号3,972,859中例证。其它可行合成方法在如下文献中例证：美国专利号3,842,067、美国专利号3,872,925(1975年1月18日公告)；Merrifield B，Protein Science (1996)，5：1947-1951；The chemicalsynthesis of proteins；Mutter M，Int J Pept Protein Res1979Mar；13(3)：274-7Studies on the coupling rates in liquid-phase peptide synthesis usingcompetition experiments；以及Solid Phase Peptide Synthesis in the seriesMethods in Enzymology(Fields，G.B.(1997)Solid-Phase Peptide Synthesis.AcademicPress，San Diego.#9830)。以引用的方式将全部以上公开的内容并入本文。
制备肽模拟物的方法包括修饰N-末端氨基、C-末端羧基，和/或将肽中的一个或多个氨基连接改变为非氨基连接。可将两种以上的此类修饰在一种肽模拟物抑制剂中结合。对肽进行修饰以产生肽模拟物在例如美国专利号5,643,873和5,654,276中得以描述，以引用的方式将两者的内容并入本文。
肽模拟物
在一些实施方式中，两亲性肽为肽模拟物。例如，亲水性肽片段可为肽模拟物、疏水性肽片段可为肽模拟物、或两者均可为肽模拟物。
设计肽模拟物和筛选功能性肽模拟物的方法是本领域技术人员公知的。设计模拟已知的蛋白或肽的分子的一个基本方法是，首先识别已知蛋白的活性区域(例如，在抗体-抗原相互作用的情况下，识别允许结合至该抗原的抗体区域)，然后搜索模仿所述活性区域的模拟物。若已知蛋白的活性区域相对较小，预期模拟物将会比蛋白小(例如，以分子量计)，并且相应地更容易和更便宜地合成。这样的模拟物可用作蛋白便利的替代物，作为与靶分子相互作用的试剂。
用于制备肽模拟物的方法包括修饰N-末端氨基、C-末端羧基，和/或将肽中的一个或多个酰胺连接改变为非酰胺连接或修饰的酰胺连接。可将两种以上的此类修饰在一种肽模拟物中结合。对肽进行修饰以制备肽模拟物在例如美国专利号5,643,873和5,654,276中有描述，以引用的方式将两者的内容并入本文。
例如，Reineke等(1999，Nature Biotechnology，17；271-275，以引用的方式将其内容并入本文)使用短合成肽的大文库，其中每一合成肽对应于白细胞介素10的一段短的部分，设计了模拟白细胞介素-10蛋白的结合位点的模拟分子。随后通过分析技术对这些肽中的每一种与靶标(在这种情况下为抗白介素-10抗体)的结合进行单独测试，以识别潜在的相关肽。可使用肽的噬菌体展示文库和丙氨酸扫描法。
其它用于设计针对特定肽或蛋白的肽模拟物的方法包括记载于欧洲专利EP1206494；the SuperMimic program，Andrean Goede等，2006BMC Bioinformatics，7：11；以及MIMETIC program，W.Campbell等，2002，Microbiology and Immunology46：211-215中的方法。SuperMimic program被设计用于识别模拟蛋白的一部分的化合物、或蛋白中适于插入模拟物的位置。该申请一方面提供了含有肽模拟物构建模块的文库、另一方面提供了含有蛋白结构的文库。基于肽与数种构象模拟物的叠合寻找对于指定的肽而言有希望的肽模拟物连接物。可引入新的合成元素或蛋白并用于搜索。由W.Campbell等，2002教导的MIMETIC计算机程序产生与靶肽序列相互作用的一系列肽。这一主题的深入讨论在下列文献中进行探讨：“Peptide Mimetic Design with the Aid of ComputationalChemistry”，James R.Damewood Jr，Reviews in Computational Chemistry Reviews inComputational Chemistry，Jan2007，Volume9Book Series：Reviews in ComputationalChemistry，编者：Kenny B.Lipkowitz，Donald B.BoydPrint ISBN：9780471186397ISBN：9780470125861，John Wiley&Sons，Inc.出版；以及T.Tselios等，Amino Acids，14：333-341，1998。以引用的方式将所有本段中所述的参考文献的内容并入本文。
用于制备含有不同类群的肽、拟肽(peptoids)和肽模拟物的文库的方法是本领域公知的，且各种文库是可商购的(参见例如，Ecker和Crooke，Biotechnology13：351-360(1995)，以及Blondelle等，Trends Anal.Chem.14:83-92(1995)，以及其中引用的参考文献，以引用的方式将上述每一文献并入本文；还参见，Goodman和Ro，Peptidomimetics forDrug Design，“Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery”Vol.1(M.E.Wolff编；John Wiley&Sons1995)，803-861页，以及Gordon等，J.Med.Chem.37：1385-1401(1994)，以引用的方式将每一文献并入本文)。本领域技术人员理解的是，肽可在体外直接生成，或可由可在体外生成的核酸表达而来。合成肽和核酸的化学方法是本领域公知的。以引用的方式将所有本段中所述的参考文献的内容并入本文。
也可通过例如由收集自感兴趣组织的mRNA构建cDNA表达文库，从而制造肽分子文库。制造此类文库的方法是本领域公知的(参见例如，Sambrook等，Molecular Cloning：Alaboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)，通过引用的方式将其并入本文)。优选地，由cDNA编码的肽在含有所述cDNA的细胞或病毒的表面表达。
配体和活性试剂
可将各种各样的实体(例如配体)偶联至本文所述的两亲性肽或后述的肽粒子。配体可包括天然存在的分子、或者重组的分子或合成的分子。在一些实施方式中，配体可改变本文所述的两亲性肽或由其制得的肽粒子的分布、靶向或寿命。在一些实施方式中，例如与缺少此类配体的种类相比，配体可为选定的靶标(例如，分子、细胞或细胞类型、区室(例如，细胞区室或器官区室)、组织、器官或身体区域)提供增强的亲和力(例如，增加的结合强度)。在一些实施方式中，例如与缺少此类配体的两亲性肽相比，配体可为本文所述的两亲性肽或由其制得的肽粒子提供对于选定靶标的增强的特异性。本文所使用的术语“特异性”指的是与任何其它实体相比，两亲性肽或肽粒子优先结合至所选择的靶标的能力。例如，与不含此类配体的两亲性肽或肽粒子相比，本文所述的两亲性肽和/或肽粒子上配体的存在可以使得与任何其它实体相比，所述两亲性肽或肽粒子优先结合至所选择的靶标。
非限制性地，配体可选自于由下列配体所组成的组：聚合物、肽、多肽、蛋白、肽模拟物、糖蛋白、凝集素、核苷、核苷酸、核酸、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、脂多糖、维生素、脂质、类固醇、激素、辅因子、受体、受体的配体，以及以上配体的任意组合。
在本文所述的这一方面以及其它方面的一些实施方式中，所述配体选自于由下列配体所组成的组：聚乙二醇(PEG，例如PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚(环氧乙烷)(PEO)、聚(丙二醇)(PPG)、聚(环氧乙烷-共-环氧丙烷)、透明质酸、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、肝素、聚乙烯基(吡咯烷酮)、硫酸软骨素、壳聚糖、葡糖胺聚糖、葡聚糖、糊精、硫酸葡聚糖、醋酸纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、纤维素质、聚(丙二醇)、聚丁二醇、多肽、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰亚胺、聚(乙烯胺)、聚(烯丙基胺)、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物、聚膦嗪(polyphosphazine)、聚乙烯亚胺、精胺(spermine)、亚精胺(spermidine)、聚胺、伪肽-聚胺、肽模拟物聚胺、树状聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、促甲状腺素、促黑素、凝集素、表面活性蛋白A、粘蛋白、转铁蛋白、二膦酸盐/酯、聚谷氨酸盐/酯、聚天冬氨酸盐/酯、适配子、去唾液酸胎球蛋白(asialofetuin)、透明质酸(hyaluronan)、前胶原(procollagen)、胰岛素、转铁蛋白、白蛋白、吖啶、交联补骨脂素(cross-psoralen)、丝裂霉素C、TPPC4、替沙林(texaphyrin)、Sapphyrin、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、胆汁酸(bile acids)、胆固醇、胆酸(cholic acid)、金刚烷乙酸(adamantane acetic acid)、1-芘丁酸、二氢睾酮(dihydrotestosterone)、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶氧己基基团(geranyloxyhexyl group)、十六烷基甘油、冰片(borneol)、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧三苯甲基(dimethoxytrityl)、或吩噁嗪、RGD肽、放射性标记物、半抗原、萘普生(naproxen)、阿司匹林、二硝基苯基、HRP、AP、凝集素、维生素A、维生素E、维生素K、维生素B、叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛(pyridoxal)、taxon、长春新碱、长春碱、细胞松弛素(cytochalasin)、诺考达唑、japlakinolide、拉春库林A(latrunculin A)、鬼笔环肽(phalloidin)、swinholide A、indanocine、myoservin、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-1β、γ干扰素、GalNAc、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6P、糖簇(cluster)(如GalNAc簇、甘露糖簇、半乳糖簇)、适配子、整联蛋白受体配体、趋化因子受体配体、血清素受体配体、PSMA、内皮素、GCPII、生长抑素(somatostatin)、细菌细胞壁穿透肽、GALA肽、EALA肽、INF-7肽、InfHA-2肽、diINF-7肽、diINF-3肽、GLF肽、GALA-INF3肽、INF-5肽、穿膜肽(penetratinpeptide)、Tat片段48-60、PVEC肽、细胞穿透肽(transportan peptide)、LL-37肽、天蚕素(cecropin)P1肽、α-防卫素肽、β-防卫素肽、PR-39肽、indolicidin肽、RFGF肽、RFGF类似物、bactenecin、天蚕素、lycotoxins、paradaxins、buforin、CPF、类铃蟾抗菌肽(bombinin-like peptide，BLP)、组织蛋白酶抑制素(cathelicidins)、ceratotoxins、S.clava肽、八目鳗(hagfish)肠道抗菌肽(HFIAP)、magainines、brevinins-2、dermaseptins、蜂毒肽(melittins)、pleurocidin、H2A肽、爪蟾肽(Xenopus peptides)、esculentinis-1、caerins，以及以上配体的任意组合。
在一些实施方式中，配体可包含活性试剂。本文所使用的术语“活性试剂”指的是待递送至细胞的分子。相应地，不受限制地，活性试剂可选自于由以下活性试剂所组成的组：有机或无机小分子、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、生物大分子，例如，肽、蛋白、肽类似物及它们的衍生物、肽模拟物、核酸、核酸类似物及衍生物、多核苷酸、寡核苷酸、酶、由生物材料(如细菌、植物、真菌、或动物细胞或组织)制备而得的提取物、天然存在的或合成的组合物、颗粒物(particulate)，或它们的任意组合。活性试剂可为电中性的或包含净电荷，例如，活性试剂为阴离子型或阳离子型。此外，活性试剂可为疏水性的、亲水性的或两亲性的。在一些实施方式中，活性试剂包含至少一个芳基或杂芳基基团。
本文所使用的术语“颗粒物”是指粒子、粉末、薄片(flake)等，其本身以相对较小的形式存在，并可以由例如研磨、切丝(shredding)、破碎(fragmenting)、粉碎(pulverizing)、雾化(atomizing)或其它方式将较大的材料分割至相对较小的形式。
本文所使用的术语“小分子”可以指“类天然产物(natural product-like)”的化合物，然而术语“小分子”并不限于“类天然产物”化合物。特别地，小分子的典型特征在于其包含数个碳-碳键，分子量低于5000道尔顿(5kD)、优选低于3kD、更优选低于2kD、并最优选低于1kD。在某些情况下非常优选的是，小分子的分子量等于或低于700道尔顿。
在一些实施方式中，所述活性试剂可以是肽或蛋白质。本文所使用的术语“肽”以其最广义使用，是指包含两个以上氨基酸、氨基酸等同物或其它非氨基基团(彼此间通过肽键或改性(modified)肽键相连接)的化合物。肽等同物可在如下方面与常规肽不同：通过以有关的有机酸(如PABA)、氨基酸等替换一个或多个氨基酸、或对侧链或官能团进行取代或修饰。肽可以是任意尺寸的；然而，在某些实施方式中，优选具有20个以下总氨基酸的肽。另外，所述肽可以是链状或环状的。本文中具体列举的肽序列以氨基末端在左侧、羧基末端在右侧的方式书写。并且，术语“肽”广义上包括通常是多肽的蛋白质。本文所使用的术语“蛋白质”用于描述蛋白质及其片段。因此，任何显示出三维结构的氨基酸链都包含于术语“蛋白质”中，且蛋白质片段也相应地包含在内。
肽模拟物是能折叠至限定的类似于天然肽的三维结构的分子。
本文所使用的术语“核酸”是指核苷酸或核苷单体的多聚物(多核苷酸)或寡聚物(寡核苷酸)(由天然存在的碱基、糖和内糖键(intersugar linkages)组成)。术语“核酸”还包括具有相似功能的、包含非天然存在的单体或其部分的多聚物或寡聚物。与天然形式的核酸相比，这种改性或取代核酸由于其特性(例如增强细胞摄取和提高核酸酶存在时的稳定性)而通常更优选。
核酸可以是单链核酸或双链核酸。单链核酸可以具有双链区域、且双链核酸可以具有单链区域。示例性的核酸包括但不仅限于：结构基因、包括控制和终止区域的基因、自我复制体系(如病毒DNA或质粒DNA)、单链和双链siRNA以及其它RNA干扰剂(RNAi试剂或iRNA试剂)、短发卡RNA(shRNA)、反义寡核苷酸、核酶、microRNA、microRNA模拟物、适配子(aptamers)、antimirs、antagomirs、三链形成(triplex-forming)寡核苷酸、RNA激活剂、免疫刺激寡核苷酸、以及诱饵寡核苷酸(decoy oligonucleotides)。
在一些实施方式中，所述活性试剂是生物活性化合物或具有生物活性。本文所使用的术语“生物活性(biological activity或bioactivity)”是指化合物能对生物样品产生作用的能力。生物活性可不受限制地包括在生物分析中，在分子水平、细胞水平、组织水平或器官水平上诱发刺激、抑制、调节、毒性或致死响应。例如，生物活性可以指化合物的以下能力：显示出或调节酶的效果/活性、阻断受体、刺激受体、调节一个或多个基因的表达水平、调节细胞增殖、调节细胞分裂、调节细胞形态、或上述能力的任意组合。在某些情况下，生物活性可以指化合物在生物样品中产生毒性效应的能力、或者指化合物对靶分子或靶细胞进行化学修饰的能力。
在一些实施方式中，所述活性试剂是治疗试剂。本文所使用的术语“治疗试剂”是指用于治疗、治愈、缓和、或预防受试者中的有害状况的生物制剂或化学试剂。术语“治疗试剂”还包括用于对抗受试者的疾病、状况、或障碍的物质和试剂，并包括药物、诊断和仪器。“治疗试剂”还包括在医疗诊断中、或在恢复、矫正、或修饰生理机能中使用的任何事物。术语“治疗试剂”和“药物活性试剂”在本文中可互换使用。
根据所需的治疗目的和所希望的生物作用选择所述治疗试剂。因此，所述治疗试剂可选自适于治疗目的的任一类。另外，可选择或设置所述治疗试剂以在一段时间内提供治疗活性。
示例性的药物活性化合物包括但不仅限于：在Harrison’s Principles ofInternal Medicine，13th Edition，Eds.T.R.Harrison McGraw-Hill N.Y.，NY；PhysiciansDesk Reference，50th Edition，1997，Oradell New Jersey，Medical Economics Co.；Pharmacological Basis of Therapeutics，8th Edition，Goodman and Gilman，1990；United States Pharmacopeia，The National Formulary，USP XII NF XVII，1990；Goodman与Oilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics现行版；以及TheMerck Index现行版中有所描述的药物活性化合物，将以上所有文献的全部内容整体引入本文。
示例性的药物活性试剂包括但不限于，类固醇和非类固醇抗炎剂、抗再狭窄药物、抗微生物剂、血管生成因子、钙通道阻断剂、血栓溶解剂、抗高血压剂、抗凝血剂、抗心律失常剂、强心苷(cardiac glycoside)等。
在一些实施方式中、所述治疗试剂选自于由下列治疗试剂所组成的组：水杨酸及其衍生物(阿司匹林)、对氨基苯酚及其衍生物(对乙酰氨基酚)、芳基丙酸(布洛芬)、皮质类固醇、组胺受体拮抗剂和缓激肽受体拮抗剂、白三烯受体拮抗剂、前列腺素受体拮抗剂、血小板活化因子受体拮抗剂、磺酰胺类(sulfonamides)、甲氧苄啶磺胺甲噁唑(trimethoprim-sulfamethoxazole)、喹诺酮类、青霉素类、头孢菌素、碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、酸性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、血管生成转化生长因子α和β、肿瘤坏死因子、血管生成素(angiopoietin)、血小板衍生生长因子、二氢吡啶(如硝苯地平、苯并硫氮杂类如地尔硫(dilitazem)、和苯烷基胺如维拉帕米)、尿激酶型纤溶酶原激活物、尿激酶、链激酶、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、螺内酯(spironolactone)、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、利尿剂(diuretics)、噻嗪类(thiazides)、抗肾上腺素剂、可乐定、普萘洛尔(propanolol)、血管紧张素转换酶抑制剂、卡托普利、血管紧张素受体拮抗剂、氯沙坦、钙通道拮抗剂、心痛定(nifedine)、肝素、华法林、水蛭素、蜱抗凝血肽和低分子量肝素如依诺肝素、利多卡因、普鲁卡因胺、恩卡尼(encainide)、氟卡尼(flecanide)、β肾上腺素受体阻断剂、普萘洛尔、胺碘酮、维拉帕米、地尔硫氯化镍、强心苷、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂、硝基血管舒张剂(nitrovasodilators)、降血脂剂(hypolipidemic agents)(例如烟酸、普罗布考等)、胆汁酸结合树脂(例如考来烯胺(cholestyramine)，以及纤维酸(fibric acid)衍生物例如氯贝丁酯)、HMG CoA还原酶抑制剂、HMG CoA合酶抑制剂、角鲨烯合酶抑制剂、角鲨烯环氧酶抑制剂、他汀类药物(例如洛伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀等)、抗精神病药、SSRI类药物、抗癫痫药物、避孕药、全身及局部镇痛药(慢性疼痛、骨骼生长/重塑因子(成骨细胞/破骨细胞招募和刺激因子)、神经递质(L-DOPA、多巴胺、神经肽)、肺气肿药物、TGF-β)、雷帕霉素、纳洛酮、紫杉醇、两性霉素、地塞米松、氟他胺、万古霉素、苯巴比妥、西咪替丁、阿替洛尔、氨基糖苷类、激素(如促甲状腺素释放激素、对硝基苯基β-纤维五糖苷和促黄体生成激素释放激素)、长春新碱、阿米洛利、地高辛、吗啡、普鲁卡因胺、奎尼丁、奎宁、雷尼替丁、氨苯蝶啶、甲氧苄啶、万古霉素、氨基糖苷类、青霉素，以及以上治疗试剂的药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述活性试剂为siRNA、短发夹RNA(shRNA)、反义寡核苷酸、核酶、microRNA、microRNA模拟物、适配子、antimir、antagomir、三链形成寡核苷酸、RNA激活剂、免疫刺激寡核苷酸、诱饵寡核苷酸、质粒或DNA载体。
在一些实施方式中，所述治疗试剂是放射性材料。合适的放射性材料包括例如90钇、192铱、198金、125碘、137铯、60钴、55钴、56钴、57钴、57镁、55铁、32磷、90锶、81铷、206铋、67镓、77溴、129铯、73硒、72硒、72砷、103钯、123铅、111铟、52铁、167铥、57镍、62锌、62铜、201铊和123碘。不希望受理论限制，包含放射性材料的粒子可用于对如肿瘤、动静脉畸形等疾病组织进行治疗。
在某些实施方式中，所述活性试剂为显像剂。本文所使用的术语“显像剂”是指满足如下条件的分子中的元素或官能团：允许对状况、病理障碍和/或疾病的存在和/或进展进行检测、成像和/或监控。所述显像剂可为回波物质(echogenic substance)(液体或气体)、非金属同位素、光学报告子、硼中子吸收剂、顺磁性金属离子、铁磁性金属、发射γ射线的放射性同位素、发射正电子的放射性同位素、或x射线吸收剂。不希望受理论限制，显像剂允许对包含该显像剂的组合物进行追踪。
合适的光学报告子包括但不仅限于：荧光报告子和化学发光基团。许多荧光报告子染料是本领域已知的。典型地，荧光团(fluorophore)是芳香化合物或芳香杂环化合物，其可以是芘、蒽、萘、吖啶、二苯乙烯(stilbene)、吲哚、苯并吲哚、噁唑(oxazole)、噻唑、苯并噻唑、青色素(cyanine)、羰花青(carbocyanine)、水杨酸盐/酯、邻氨基苯甲酸盐/酯、香豆素、荧光素(fluorescein)、罗丹明(rhodamine)或其它类似化合物。合适的荧光报告子包括呫吨染料(xanthene dyes)，如荧光素或罗丹明染料，包括但不仅限于：染料(Invitrogen Corp.；Carlsbad，Calif)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、OregonGreenTM、罗丹明、德克萨斯红(Texas red)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、5-羧基荧光素(FAM)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、四氯荧光素(TET)、6-羧基罗丹明(R6G)、N,N,N,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)。合适的荧光报告子还包括在α位或β位上具有氨基的萘胺染料。例如，包括1-二甲氨基-萘基-5-磺酸盐/酯、1-苯胺基-8-萘磺酸盐/酯、2-p-甲苯胺基-6-萘磺酸盐/酯、以及5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)在内的萘胺化合物。其它荧光报告子染料包括香豆素，如3-苯基-7-异氰酸香豆素；吖啶，如9-异硫氰酸酯吖啶和吖啶橙；N-(p(2-苯并噁唑基)苯基)顺丁烯二酰亚胺；青色素，如Cy2、吲哚二羰花青3(Cy3)、吲哚二羰花青5(Cy5)、吲哚二羰花青5.5(Cy5.5)、3-(ε-羧基-戊基)-3’乙基-5,5’-二甲基氧杂羰花青(CyA)；1H,5H,11H,15H-占吨并[2,3,4-ij:5,6,7-i’j’]二喹嗪-18-ium；9-[2(或4)-[[[6-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-6-氧代己基]氨基]磺酰基]-4(或2)-磺苯基]-2,3,6,7,12,13,16,17八氢-内盐(1H,5H,11H,15H-Xantheno[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']diquinolizin-18-ium，9-[2(or4)-[[[6-[2,5-dioxo-l-pyrrolidinyl)oxy]-6-oxohexyl]amino]sulfonyl]-4(or2)-sulfophenyl]-2,3,6,7,12,13,16,17octahydro-inner salt)(TR或德克萨斯红)；BODIPYTM染料；苯并噁二唑；二苯乙烯；芘等。这些荧光化合物的许多适合类型都能够获取且能使用。
适于用作显像剂的荧光蛋白的例子包括但不仅限于：绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白(例如，DsRed)、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白，以及它们的变体(参见，例如，美国专利No.6,403,374、No.6,800,733以及No.7,157,566)。GFP变体的具体例子包括但不仅限于：增强型GFP(EGFP)、去稳定EGFP、在Doan等，Mol.Microbiol，55:1767-1781(2005)中描述的GFP变体、在Crameri等，Nat.Biotechnol.，14:315319(1996)中描述的GFP变体、在Rizzo等，Nat.Biotechnol，22:445(2004)和Tsien，Annu.Rev.Biochem.，67:509(1998)中描述的天蓝色荧光蛋白、以及在Nagal等，Nat.Biotechnol.，2087-90(2002)中描述的黄色荧光蛋白。DsRed变体在例如Shaner等，Nat.Biotechnol.，22:1567-1572(2004)中有所描述，并包括mStrawberry、mCherry、mOrange、mBanana、mHoneydew和mTangerine。另外的DsRed变体在例如Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，101:16745-16749(2004)中有所描述，并包括mRaspberry和mPlum。DsRed变体的其它例子包括在Fischer等，FEBS Lett.，577:227-232(2004)中描述的mRFPmars以及在Fischer等，FEBS Lett，580:2495-2502(2006)中描述的mRFPruby。
合适的回波气体包括但不仅限于：六氟化硫或全氟化碳气体，如全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟环丁烷、全氟戊烷或全氟己烷。
合适的非金属同位素包括但不仅限于：11C、14C、13N、18F、123I、124I、和125I。合适的放射性同位素包括但不仅限于：99mTc、95Tc、111In、62Cu、64Cu、Ga、68Ga和153Gd。合适的顺磁性金属离子包括但不仅限于：Gd(III)、Dy(III)、Fe(III)和Mn(II)。合适的X射线吸收剂包括但不仅限于：Re、Sm、Ho、Lu、Pm、Y、Bi、Pd、Gd、La、Au、Au、Yb、Dy、Cu、Rh、Ag和Ir。在某些实施方式中，放射性核素结合至螯合剂或螯合剂接头(附着至聚集体)。适合直接缀合使用的放射性核素不受限制地包括18F、124I、125I、131I及它们的混合物。适合与螯合剂共同使用的放射性核素不受限制地包括47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi及它们的混合物。合适的螯合剂包括但不仅限于：DOTA、BAD、TETA、DTPA、EDTA、NTA、HDTA、它们的膦酸盐/酯类似物(phosphonate analog)及它们的混合物。本领域技术人员将通晓用于将放射性核素、螯合剂和螯合剂接头附着于粒子上的方法。
可检测的响应通常是指通过观测的方式或利用仪器的方式可检测的信号变化或信号出现。在某些情况下，所述可检测的响应是荧光或荧光变化，例如荧光强度、荧光激发或发射波长分布、荧光寿命和/或荧光偏振的变化。本领域技术人员将领会的是，受试者或样品中标记的程度和/或位置可与标准或对照(例如，健康组织或器官)相比较。在某些其它情况下，所述可检测的响应是放射性的(即，辐射)，包括由放射性物质(如放射性核素)发射的γ射线、α粒子、β粒子、核子、电子、正电子和中微子。
本领域已知的用于体内检测荧光(例如来自于荧光团或荧光蛋白的荧光)的具体装置或方法包括但不仅限于：体内近红外荧光(参见，例如，Frangioni，Curr.Opin.Chem.Biol，7:626-634(2003))、MaestroTM体内荧光成像系统(CambridgeResearch&Instrumentation，Inc.；Woburn，Mass.)、使用飞点扫描装置(flying-spotscanner)进行的体内荧光成像(参见，例如，Ramanujam等，IEEE Transactions onBiomedical Engineering，48:1034-1041(2001))等。其它用于检测光学响应的方法或装置不受限制地包括目视检查、CCD摄像机、摄影机、成像胶片(photographic film)、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜(epifluorescencemicroscopes)、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪(fluorescence microplatereaders)、或使用光电倍增管进行信号放大。
任何本领域已知用于检测受试者中放射性核素的放射性发射的装置或方法都适于在本发明中使用。例如，如单光子发射计算机断层扫描(SPECT，使用旋转γ照相机检测发射单光子γ射线的放射性核素)和放射性核素闪烁扫描术(使用闪烁γ照相机获得放射性核素在组织、器官或身体系统中的影像或系列连续影像)的方法可用于检测经放射性同位素标记的聚集体发射的辐射。正电子发射断层扫描(PET)是另一种适于用于检测受试者中的辐射的技术。
在一些实施方式中，配体为细胞表面受体的配体。本文所使用的“细胞表面受体的配体”是指能结合至细胞外表面的分子。举例来说，细胞表面受体的配体包括，例如，细胞表面受体结合肽、细胞表面受体结合糖肽、细胞表面受体结合蛋白、细胞表面受体结合糖蛋白、细胞表面受体结合有机化合物、以及细胞表面受体结合药物。
细胞表面受体的配体包括但不限于：细胞因子、生长因子、激素、抗体和血管生成因子。
在一些实施方式中，细胞表面受体的配体为转铁蛋白或EGF。
为选定靶标提供增强的亲和力的配体在本文中也称为靶向配体。本文所使用的术语“靶向配体”是指结合至靶分子或与靶分子相互作用的分子。通常，所述相互作用或结合的性质为非共价的，例如，通过氢键、静电相互作用或范德华相互作用，然而，结合也可以是共价的。
本文所使用的术语“内涵体裂解性(endosomolytic)配体”是指具有内涵体裂解性质的分子。内涵体裂解性配体促进本发明的组合物或其组分由细胞区室(如内涵体(endosome)、溶酶体、内质网(ER)、高尔基体、微管、过氧化物酶体、或细胞内其它囊泡体)裂解和/或运输至细胞的细胞质中。一些示例性的内涵体裂解性配体包括但不限于：咪唑、多聚或寡聚咪唑、直链或支链的聚乙烯亚胺(PEI)、直链和支链的聚胺(例如精胺)、阳离子直链和支链的聚胺、聚羧酸盐/酯、聚阳离子、掩蔽的寡聚或多聚阳离子或阴离子、缩醛、聚缩醛、缩酮/聚缩酮、原酸酯、具有掩蔽或未掩蔽的阳离子或阴离子电荷的直链或支链的聚合物、具有掩蔽或未掩蔽的阳离子或阴离子电荷的树状聚合物(dendrimers)、聚阴离子肽、聚阴离子肽模拟物、pH敏感的肽、天然和合成的融合脂质、天然和合成的阳离子脂质。
本文所使用的术语“PK调节配体”和“PK调节剂”是指可调节本发明的组合物的药代动力学(pharmacokinetics)的分子。一些示例性的PK调节剂包括但不限于：亲脂性分子、胆汁酸、甾醇、磷脂类似物、肽、蛋白结合剂、维生素、脂肪酸、吩噁嗪、阿司匹林、萘普生、布洛芬、舒洛芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、PEG、生物素、以及转甲状腺素蛋白结合配体(例如，四碘甲腺乙酸、2,4,6-三碘苯酚和氟芬那酸(flufenamic acid))。
在一些实施方式中，两亲性肽包含至少一个(例如，1个、2个、3个、4个、5个或更多个)配体缀合物。当存在两个以上配体时，配体可全部具有相同性质、全部具有不同性质、或者一些配体具有相同的性质而其它配体具有不同性质。例如，配体可具有靶向性、具有内涵体裂解活性或具有PK调节性。因此，所述两个以上配体可以是相同配体、不同配体、相同类型的配体(例如，靶向配体、内涵体裂解性配体、PK调节剂)、不同类型的配体，或以上配体的任意组合。在一些实施方式中，全部配体具有不同性质。
在一些实施方式中，两亲性肽包含亲水性聚合物，所述亲水性聚合物选自于由以下聚合物所组成的组：聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(丙二醇)、聚(环氧乙烷-共-环氧丙烷)、透明质酸、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、肝素、聚乙烯基(吡咯烷酮)、硫酸软骨素、壳聚糖、葡糖胺聚糖、葡聚糖、糊精、硫酸葡聚糖、醋酸纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、纤维素质、聚(丙二醇)、聚丁二醇、多肽、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰亚胺、聚(乙烯胺)、聚(烯丙基胺)，以及以上聚合物的共混物，并且其中所述亲水性聚合物与疏水性肽片段共价相连。
连接至肽
可使用本领域技术人员已知的各种方法中的任一种将分子(例如配体)缀合至肽。可共价地或非共价地将所述分子偶联或缀合至所述肽。所述分子与所述肽之间的共价连接可以通过接头介导。所述分子与所述肽之间的非共价连接可基于离子相互作用、范德华相互作用、偶极-偶极相互作用、氢键、静电相互作用和/或形状识别相互作用(shaperecognition interactions)。
不受限制地，可将配体偶联至肽的各种位置，例如，N-末端、C-末端和/或内部位置(例如，氨基酸侧链)。当存在两个以上配体时，所述配体可位于肽的相对端(例如，N-末端和C-末端)。
通常，所述配体位于最远离疏水性肽片段的末端(例如，由末端计的1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位或10位)。不希望受理论束缚，这使得该配体位于由两亲性肽自聚集而形成的粒子的表面上或表面附近。
在一些实施方式中，配体位于亲水性肽片段不与疏水性肽片段连接的末端。例如，若亲水性肽片段的N-末端连接至所述疏水性肽片段，则该配体位于由所述亲水性肽片段的C-末端计的1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位或10位。或者，若亲水性肽片段的C-末端连接至所述疏水性肽片段，则该配体位于由所述亲水性肽片段的N-末端计的1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位或10位。
在一些实施方式中，配体经接头附着至肽。当单体在合成过程中并入肽中时，配体可存在于所述单体上。在一些实施方式中，可在“前体”单体已并入肽后，通过偶联至所述“前体”单体将配体并入。例如，可将具有例如以氨基结束的(amino-terminated)接头的单体(即，不具有相缔合的配体)，例如单体-接头-NH2并入肽中。在随后的操作中，即，在所述前体单体并入肽之后，可通过使所述配体的亲电基团与所述前体单体的栓系(tether)的末端亲核基团相偶联，从而随后将具有亲电基团(例如五氟苯酯或醛基)的配体附着于该前体单体。在另一个非限制性实例中，可将具有亲电基团的配体附着至N-末端、C-末端或内部的侧链氨基。在另一实例中，当肽包含半胱氨酸时，可通过二硫化物接头将包含巯基的配体连接至所述肽。
接头
本文所使用的术语“接头”是指连接化合物的两个部分的有机部分。接头通常包含直接的键或原子(如氧或硫)、单元(如NH、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH、SS)、或原子链(如取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的C5-C12杂芳基、取代或未取代的C5-C12杂环基(heterocyclyl)、取代或未取代的C3-C12环烷基，其中一个或多个亚甲基可由O、S、S(O)、SO2、NH、C(O)中断或终止)。
在一些实施方式中，接头为支链接头(branched linker)。支链接头的分支点(branchpoint)可以至少是三价的，但也可以是四价、五价或六价的原子或呈现此类多化合价的基团。在一些实施方式中，所述分支点是-N、-N(R)-C、-O-C、-S-C、-SS-C、-C(O)N(R)-C、-OC(O)N(R)-C、-N(R)C(O)-C或-N(R)C(O)O-C、其中每一情况下R独立地为H或任选取代的烷基。在一些实施方式中，所述分支点为甘油或其衍生物。
在一些实施方式中，接头包含可断裂的(cleavable)连接基团。本文所使用的“可断裂的连接基团”是指这样的化学部分：其在细胞外足够稳定，但一旦进入靶细胞便断裂以释放用接头保持连接的两部分。在优选的实施方式中，可断裂的连接基团在靶细胞中或在第一参照条件(例如可选择该条件来模拟或代表细胞内的条件)下的断裂，比在受试者血液或血清中或在第二参照条件(例如可选择该条件来模拟或代表血液或血清中的条件)下的断裂快至少10倍以上，优选快至少100倍以上。
可断裂的连接基团易受断裂剂(例如，pH值、氧化还原电势或降解分子的存在)影响。通常，断裂剂在细胞内比在血清或血液中更普遍或者水平或活性更高。此类降解剂的实例包括：选择用于特定底物或不具底物特异性的氧化还原剂，包括例如氧化或还原酶，或者存在于细胞中、可通过还原降解可氧化还原断裂的连接基团的还原剂，如硫醇；酯酶；酰胺酶；可产生酸性环境的内涵体或试剂(例如，导致pH为5或更低的内涵体或试剂)；能够作为广义酸水解或降解可酸断裂的连接基团的酶，肽酶(可具有底物特异性)和蛋白酶、以及磷酸酶。
接头可以包含可由特定的酶断裂的可断裂的连接基团。并入接头的可断裂的连接基团的类型可以取决于靶细胞。例如，对于肝靶向目的，可断裂的连接基团可包含酯基。肝细胞中富含酯酶，因此，所述接头在肝细胞中将比在酯酶不丰富的细胞类型中更有效地断裂。其它酯酶丰富的细胞类型包括肺细胞、肾皮质细胞和睾丸细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型(如肝细胞和滑膜细胞)时，可使用含有肽键的接头。
在一些实施方式中，与在血液或血清中(或选定的模拟细胞外条件的体外条件下)的断裂相比，可断裂的连接基团在细胞中(或选定的模拟细胞内条件的体外条件下)的断裂至少快1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、或100倍。在一些实施方式中，与在细胞中(或选定的模拟细胞内条件的体外条件下)的断裂相比，可断裂的连接基团在血液中(或选定的模拟细胞外条件的体外条件下)的断裂低于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、或1％。
示例性的可断裂的连接基团包括但不限于：可氧化还原断裂的连接基团(例如，-S—S-和-C(R)2-S—S-，其中R为H或C1-C6烷基且至少一个R为C1-C6烷基，例如CH3或CH2CH3)；基于磷酸酯的可断裂的连接基团(例如，
-O-P(O)(OR)-O-，-O-P(S)(OR)-O-，-O-P(S)(SR)-O-，-S-P(O)(OR)-O-，-O-P(O)(OR)-S-，-S-P(O)(OR)-S-，-O-P(S)(ORk)-S-，-S-P(S)(OR)-O-，-O-P(O)(R)-O-，-O-P(S)(R)-O-，-S-P(O)(R)-O-，-S-P(S)(R)-O-，-S-P(O)(R)-S-，-O-P(S)(R)-S-，.-O-P(O)(OH)-O-，-O-P(S)(OH)-O-，-O-P(S)(SH)-O-，-S-P(O)(OH)-O-，-O-P(O)(OH)-S-，-S-P(O)(OH)-S-，-O-P(S)(OH)-S-，-S-P(S)(OH)-O-，-O-P(O)(H)-O-，-O-P(S)(H)-O-，-S-P(O)(H)-O-，-S-P(S)(H)-O-，-S-P(O)(H)-S-和-O-P(S)(H)-S-，
其中R为任选取代的直链或支链的C1-C10烷基)；可酸断裂的连接基团(例如，腙、酯和氨基酸酯、-C＝NN-、和-OC(O)-)；基于酯的可断裂的连接基团(例如，-C(O)O-)；基于肽的可断裂的连接基团(例如，由细胞中的酶如肽酶和蛋白酶断裂的连接基团，例如，-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基团)。基于肽的可断裂的连接基团包含两个以上的氨基酸。在一些实施方式中，基于肽的可断裂连接包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列为细胞中的肽酶或蛋白酶的底物。
在一些实施方式中，可酸断裂的连接基团可在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境下断裂，或可由可作为广义酸的试剂(如酶)断裂。
除了共价连接以外，化合物的两个部分可通过亲和结合对连接在一起。术语“亲和结合对”或“结合对”是指特异性地彼此结合的第一分子和第二分子。结合对的第一成员与待连接的第一部分缀合，而第二成员与待连接的第二部分缀合。本文所使用的术语“特异性结合”是指结合对的第一成员与结合对的第二成员以相对于其它分子而言更大的亲和性和特异性相互结合。
示例性的结合对包括任何半抗原(haptenic)化合物或抗原化合物以及相应的抗体或其结合部分或片段(例如，地高辛(digoxigenin)和抗地高辛；小鼠免疫球蛋白和羊抗鼠免疫球蛋白)以及非免疫结合对(如生物素-亲和素、生物素-链霉亲和素、激素(例如，甲状腺素和皮质醇)-激素结合蛋白、受体-受体激动剂、受体-受体拮抗剂(例如，乙酰胆碱受体-乙酰胆碱或其类似物)、IgG-蛋白A、凝集素-碳水化合物、酶-酶辅因子、酶-酶抑制剂、以及能够形成核酸双链体的互补寡核苷酸对)等。结合对还可包括带负电的第一分子和带正电的第二分子。
使用结合对缀合的一个实例是生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素缀合。在这一方法中，分子或肽中的一者被生物素化，另一者缀合有亲和素或链霉亲和素。许多商购试剂盒也可用于对分子(例如蛋白)进行生物素化。
使用结合对缀合的另一实例是生物素-夹心法。参见，例如Davis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：8155-60(2006)。将待缀合在一起的两个分子生物素化，然后使用四价链霉亲和素作为接头将其缀合在一起。
使用结合对缀合的又一实例是双链核酸缀合。在这一方法中，待连接的第一部分缀合有双链核酸的第一链，而待连接的第二部分缀合有双链核酸的第二链。核酸可不受限制地包括：包含核苷酸、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物、经修饰的核苷酸、以及包含骨架修饰、分支点和非核苷酸残基、基团或桥接(bridges)的核苷酸的确定序列片段和序列。
肽粒子
发明人还发现，本文所述的两亲性肽发生自聚集，形成超分子(supramolecular)聚集体。因此，在另一方面，本发明提供了包含本文所述的两亲性肽的肽粒子。在一些实施方式中，所述肽粒子包含多个本文所述的两亲性肽。例如，肽粒子可包含至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约20个、至少约25个、至少约50个、至少约75个、至少约100个、至少约150个、至少约200个、至少约250个、至少约500个、至少约750个、至少约1000个、至少约2500个、至少约5,000个、至少约10,000个或更多个本文所述的两亲性肽。存在于肽粒子中的多个两亲性肽可包含本文所述的一个实施方式的两亲性肽，或本文所述的至少两个不同的实施方式的两亲性肽。
术语“粒子”包括球体(spheres)；纳米棒(nanorods)；以及棱柱(prisms)。本文所述的肽粒子不同于胶束、脂质体和其它包含明显外壳(例如，脂质层)的粒子，所述外壳作为形成壁的材料，包裹处于外壳内部的封装的介质。本文所描述的粒子是实心粒子。所述粒子可以是例如单分散或多分散的，并且给定分散度的粒子直径的偏差可能发生变化。然而，由于可获得均一大小的两亲性肽，本文所述的粒子通常是单分散的。因此，在一些实施方式中，本文所述的粒子的直径在平均直径的±2.5％以内、±5％以内、±10％以内、±15％以内、±20％以内、±25％以内、±30％以内、或±35％以内。
在一些实施方式中，本文所述的肽粒子是纳米粒子。本文所使用的术语“纳米粒子”是指其大小处于10-9米或十亿分之一米的数量级、并低于10-6米或百万分之一米的粒子。
通常，肽粒子具有约5nm至约5000nm的平均直径。在一些实施方式中，所述粒子具有约50nm至约2500nm的平均直径。在一些实施方式中，所述粒子具有约100nm至约2000nm的平均直径。在一些实施方式中，所述粒子具有约150nm至约1700nm的平均直径。在一些实施方式中，所述粒子具有约200nm至约1500nm的平均直径。在一些实施方式中，所述粒子具有约260nm的平均直径。在一个实施方式中，所述粒子具有约30nm至约150nm的平均直径。不希望受理论束缚，可通过改变用于制造肽粒子的溶液中两亲性肽的浓度来对粒子大小进行调节。
在一些实施方式中，本文所述的肽粒子包含完全掩蔽的两亲性肽和部分掩蔽或未掩蔽的两亲性肽的混合物。本文所使用的“未掩蔽的肽”指的是其N-末端氨基和亲水性肽片段的侧链氨基均未缀合氮保护基团或氨基保护基团的两亲性肽。
通过改变完全掩蔽的肽与部分掩蔽或未掩蔽的肽之比，可改变肽粒子的净电荷。不希望受理论束缚，完全掩蔽的肽的比例的提高可增加粒子的稳定性，而部分掩蔽和/或未掩蔽的肽的比例的提高可增加携带阴离子电荷的分子(例如，核酸，如DNA或RNA，包括siRNA)的负载和穿透细胞膜的更强的能力。
在一些实施方式中，肽粒子可包含完全掩蔽的两亲性肽(例如，完全乙酰化的两亲性肽)。本文所使用的术语“完全乙酰化的两亲性肽”是指其N-末端氨基和亲水性肽片段中的侧链氨基全部被乙酰化的两亲性肽。
在一些实施方式中，肽粒子可以包含完全掩蔽(例如，完全乙酰化)及部分掩蔽(例如，部分乙酰化)的肽的混合物。本文所使用的术语“部分乙酰化的两亲性肽”指的是其N-末端氨基和亲水性肽片段中的侧链氨基的至少一个但并非全部被乙酰化的两亲性肽。在一些实施方式中，部分乙酰化的两亲性肽可以具有乙酰化的两亲性肽的N-末端氨基，但亲水性肽片段中的侧链氨基均未被乙酰化。在一些实施方式中，部分乙酰化的两亲性肽可以具有至少一个(包括至少两个或更多个)乙酰化的亲水性肽片段中的侧链氨基，但两亲性肽的N-末端氨基未被乙酰化。在一些实施方式中，部分乙酰化的两亲性肽的两亲性肽的N-末端氨基和至少一个(包括至少两个或更多个)但并非全部的亲水性肽片段中的侧链氨基被乙酰化。
在一些实施方式中，肽粒子可包含完全掩蔽(例如，完全乙酰化)和未掩蔽(例如，未乙酰化)的两亲性肽的混合物。本文所使用的术语“未乙酰化的两亲性肽”指的是其N-末端氨基和亲水性肽片段中的侧链氨基均未被乙酰化的两亲性肽。在一些实施方式中，肽粒子可以包含完全掩蔽(例如，完全乙酰化)、部分掩蔽(例如，部分乙酰化)和未掩蔽(例如，未乙酰化)的两亲性肽的混合物。
在一些实施方式中，所述肽粒子不包含完全掩蔽的两亲性肽，例如，所述粒子包含部分掩蔽的两亲性肽或部分掩蔽的肽的混合物。在一些实施方式中，肽粒子包含部分掩蔽与未掩蔽的肽的混合物。
不受限制地，肽粒子中完全掩蔽的肽与部分掩蔽或未掩蔽的肽之比的范围可为约100:1至约1:100。在一些实施方式中，肽粒子中完全掩蔽的肽与部分掩蔽或未掩蔽的肽之比的范围为约95:5至约1:1。
本文所述的粒子可以用于药物递送。因此，本文所述的粒子中可包含各种治疗试剂。因此，在一些实施方式中，本文所述的肽粒子可包含本文所述的活性试剂。活性试剂可共价连接至肽粒子的组分(例如两亲性肽)。在一些实施方式中，本文所述的肽粒子中的活性试剂并不共价连接至粒子的组分。不受限制地，活性试剂可被吸收/吸附于粒子的表面、封装在粒子内或(均匀地或非均匀地)分布于整个粒子。
通常，活性试剂与两亲性肽可以任何比例存在于本文所述的肽粒子中。因此，在一些实施方式中，活性试剂与两亲性肽之比的范围为约100:1至约1:100,000。在一些实施方式中，活性试剂与两亲性肽之比的范围为约1:1至约1:100,000。在一些实施方式中，活性试剂与两亲性肽之比的范围为约1:1至约1:10,000。在一些实施方式中，活性试剂与两亲性肽之比的范围为约1:1至约1:1000。在一些实施方式中，活性试剂与两亲性肽之比的范围为约1:1至约1:100。在一些实施方式中，活性试剂与两亲性肽之比的范围为约1:1至约1:10。在一些实施方式中，活性试剂与两亲性肽之比的范围为约50:1至约1:500。在一些实施方式中，活性试剂与两亲性肽之比的范围为约10:1至约1:25。
在一些实施方式中，所述肽粒子可包含配体。不受限制地，配体可以共价连接至粒子的组分(例如，两亲性肽)。在一些实施方式中，配体并不共价连接至粒子的组分，例如，配体被吸收/吸附于粒子的表面、配体被封装在粒子内或配体(均匀地或非均匀地)分布于整个粒子。在一些实施方式中，配体为靶向配体。
在一些实施方式中，配体在肽粒子表面上形成层，例如，配体形成环绕粒子的冠。当配体在粒子表面上形成层时，该层的厚度范围可为约1nm至约100nm。在一些实施方式中，所述层的厚度为约10nm。
通常，配体与两亲性肽可以任何比例存在于粒子中。因此，在一些实施方式中，配体与两亲性肽之比的范围为约1000:1至约1:1,000,000。在一些实施方式中，配体与两亲性肽之比的范围为约1:10至约1:1,000,000。在一些实施方式中，配体与两亲性肽之比的范围为约500:1至约1:500。在一些实施方式中，配体与两亲性肽之比的范围为约100:1至约1:250。在一些实施方式中，配体与两亲性肽之比的范围为约1:10至约1:1000。
在一些实施方式中，肽粒子可以同时包含活性试剂(例如，治疗试剂)和配体。在一些实施方式中，肽粒子可包含分布在粒子内部的活性试剂(例如，治疗试剂)和位于粒子外表面上的配体。
不受限制地，可制造不同类型的肽粒子，例如(1)仅由两亲性肽形成的粒子；(2)由两亲性肽形成的粒子，其中感兴趣的分子(例如，活性试剂或配体)吸收/吸附至两亲性肽的核上或在两亲性肽的核上形成包衣；(3)由感兴趣的分子(例如，活性试剂或配体)所形成的核形成的粒子，所述感兴趣的分子上覆有两亲性肽层；(4)由两亲性肽形成的粒子，其中感兴趣的分子(例如，活性试剂或配体)共价连接至两亲性肽；(5)由感兴趣的分子(例如，活性试剂或配体)和两亲性肽的混合物形成的粒子；以及(6)如此形成的粒子：包含感兴趣的分子(例如，活性试剂或配体)与两亲性肽的通常为均质的混合物，或以上粒子类型的任意组合。例如，肽粒子可以由两亲性肽形成，其中感兴趣的第一分子(例如，活性试剂或配体)吸收/吸附至两亲性肽的核上或在两亲性肽的核上形成包衣，其中，所述两亲性肽的核进一步包含感兴趣的第二分子(例如，活性试剂)。在此类实施方式中，感兴趣的第二分子可以与感兴趣的第一分子相同或不同。
在一些实施方式中，肽粒子可进一步包含聚合物，例如，生物相容聚合物。本文所使用的术语“生物相容”指的是在接触体液或组织时显示出基本没有细胞毒性或免疫原性。本文所使用的术语“聚合物”是指低聚物、共低聚物、高聚物和共高聚物，例如，无规嵌段、多嵌段、星型、接枝、梯度共聚物，以及以上聚合物的组合。
术语“生物相容聚合物”是指当在受试者体内使用时非毒性、化学惰性、以及大致上非免疫原性的聚合物以及大致上不溶于血液的聚合物。所述生物相容聚合物可以是不可生物降解的、或优选为可生物降解的。当原位使用时，所述生物相容聚合物还优选是非炎性的。
可生物降解聚合物在本领域中已有公开。合适的可生物降解聚合物的例子包括但不仅限于：线性链状(linear-chain)聚合物例如聚丙交酯、聚乙交酯、聚己内酯、聚乳酸和聚乙醇酸共聚物、聚酸酐、聚ε-己内酯、聚酰胺、聚氨酯(polyurethanes)、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚二氧环己酮、聚缩醛(polyacetal)、聚缩酮(polyketals)、聚碳酸酯、聚原碳酸酯(polyorthocarbonates)、聚二氢吡喃、聚磷腈、聚羟基丁酸酯、聚羟基戊酸酯、聚亚烷基草酸酯、聚亚烷基琥珀酸酯、聚苹果酸、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚羟基纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯、壳多糖(chitin)、壳聚糖(chitosan)、聚乳酸和聚乙醇酸共聚物、聚甘油癸二酸酯(PGS)，以及共聚物、三元共聚物，以及包含上文一种或多种聚合物的共聚物。其它可生物降解聚合物包括例如，明胶、胶原、丝(silk)、壳聚糖、藻酸盐/酯、纤维素、聚核酸等。
合适的不可生物降解的生物相容聚合物包括，例如醋酸纤维素(包括双醋酸纤维素)、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚酰胺、尼龙、聚碳酸酯、聚硫化物、聚砜、水凝胶(例如，丙烯酸水凝胶(acrylics))、聚丙烯腈、聚乙酸乙烯酯、醋酸丁酸纤维素、硝化纤维素、氨酯/碳酸酯共聚物、苯乙烯/马来酸共聚物、聚乙烯亚胺、泊洛沙姆(poloxamers)(例如Pluronic，如泊洛沙姆407和泊洛沙姆188)、透明质酸酶、肝素、琼脂糖、普鲁兰多糖(Pullulan)，以及包含上述一种或多种聚合物的共聚物，例如乙烯/乙烯醇共聚物(EVOH)。
肽粒子还可包含额外的部分，所述部分可延长粒子的体内寿命。例如，所述肽粒子可包含延长粒子在血液中的体内寿命的官能部分。一种示例性的用于延长体内寿命的部分为聚乙二醇。相应地，除两亲性肽外，所述肽粒子可进一步包含聚乙二醇。
肽粒子的其它实施方式
在一个实施方式中，本文所述的肽粒子包含本文所述的特定实施方式的两亲性肽。存在于这一实施方式的肽粒子中的所述两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，其中所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu)m-(Trp)n或者(Leu-Trp)p-(Leu)q，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-5的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然；并且其中亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)r，其中，r为1-15的整数，并且其中所述肽粒子进一步在其外表面上包含本文所述的配体。
在一些实施方式中，所述肽粒子可包含前述“示例性的两亲性肽”部分中所述的一个或多个实施方式的两亲性肽。在一个实施方式中，所述肽粒子可包含具有如下氨基酸序列的两亲性肽：(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中X不存在或X为NH2。如前所述，在一些实施方式中，所述亲水性肽片段的至少一个Lys残基或所述两亲性肽的N-末端氨基被乙酰化。在一些实施方式中，所述亲水性肽片段的全部Lys残基均被乙酰化。在一些实施方式中，所述两亲性肽的N-末端氨基和所述亲水性肽片段的全部Lys残基均被乙酰化。
可以基于肽粒子将要结合和/或相互作用的靶分子的类型(例如但不限于：细胞、细菌、蛋白和/或核酸)对存在于肽粒子外表面上的配体进行选择。例如，为了促进将本文所述的肽粒子递送至细胞，可选择对细胞表面受体具有特异性的配体，从而促进细胞摄取所述肽粒子(例如，通过内吞作用摄取)。因此，使用肽粒子作为递送载体或运载体，可将本文所述的一些实施方式的肽粒子用于靶向递送任何本文所述的活性试剂。在一个实施方式中，可将所述肽粒子用于将活性试剂递送至细胞，在以其自身递送时所述活性试剂不能穿透细胞。
如前所述，在一些实施方式中，所述肽粒子可包含本文所述的完全掩蔽(例如，完全乙酰化)和部分掩蔽(例如，部分乙酰化)的两亲性肽的混合物。在这些实施方式中，完全乙酰化的两亲性肽与部分掩蔽的两亲性肽之比的范围可以为约95:5至约1:1。在某些实施方式中，所述粒子可进一步包含未掩蔽(例如，未乙酰化)的两亲性肽。
因此，本文还提供了包含完全乙酰化的两亲性肽和部分乙酰化或未乙酰化的两亲性肽的混合肽粒子。在特定实施方式中，所述混合肽粒子包含第一两亲性肽和第二两亲性肽，其中，所述第一两亲性肽和第二两亲性肽各自独立地包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，其中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu)m-(Trp)n或(Leu-Trp)p-(Leu)q，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-5的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然；同时所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)r，其中r为1-15的整数。另外，所述第一两亲性肽的N-末端氨基和全部Lys残基均被乙酰化；而所述第二两亲性肽的至少N-末端氨基或一个Lys残基未被乙酰化。在一些实施方式中，所述第二两亲性肽的N-末端氨基和Lys残基均未被乙酰化。
在一些实施方式中，混合肽粒子可包含多个(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或更多个)第一两亲性肽和多个(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或更多个)第二两亲性肽。
在特定实施方式中，所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽可选自于前述“示例性的两亲性肽”部分中所述的任何一个或多个实施方式的两亲性肽。在一些实施方式中，所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽可各自独立地包含氨基酸序列(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中X不存在或X为NH2。
第一两亲性肽与第二两亲性肽之比可基于多种因素而变化，所述因素例如但不限于，所述肽粒子期望的溶解性和/或稳定性、和/或待装载于所述肽粒子中的活性试剂的性质。在一些实施方式中，第一两亲性肽与第二两亲性肽之比的范围可以为约1:1000至约1000:1。在一些实施方式中，第一两亲性肽与第二两亲性肽之比的范围可以为约1:1至约1000:1。在一些实施方式中，第一两亲性肽与第二两亲性肽之比的范围可以为约2:1至约500:1。在一些实施方式中，第一两亲性肽与第二两亲性肽之比的范围可以为约3:1至约200:1。在其它实施方式中，第一两亲性肽与第二两亲性肽之比的范围可以为约5:1至约100:1。
在一些实施方式中，所述混合肽粒子可进一步包含本文所述的活性试剂。所述活性试剂可以任何量存在于所述混合肽粒子中，例如，取决于肽粒子的负载能力和/或所述第一两亲性肽或第二两亲性肽的结合能力。在一些实施方式中，所述活性试剂与所述第二两亲性肽之比的范围可以为约1:1000至1:1。在一些实施方式中，所述活性试剂与所述第二两亲性肽之比的范围可以为约1:100至约1:10。在一些实施方式中，所述活性试剂与所述第二两亲性肽之比的范围可以为约1:50至约1:5。在一些实施方式中，所述活性试剂与所述第二两亲性肽之比的范围可以为约1:10至约1:2。
在一些实施方式中，所述混合肽粒子可进一步在其外表面上包含本文所述的配体。如前所述，可基于混合肽粒子结合的靶分子(例如但不限于，细胞、细菌、蛋白，核酸)确定对配体的选择。配体的非限制性实例可包括细胞表面受体的配体或蛋白(如抗体)。在一些实施方式中，配体可共价连接至所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽中的至少一者，例如，连接至所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽中的至少一者的亲水性肽片段。
本文所述的混合肽粒子可用于封装任何本文所述的活性试剂。不希望受理论约束，混合肽粒子中第二两亲性肽的存在可以提供用于与阴离子核酸分子相结合的阳离子电荷。因此，在一些实施方式中，所述活性试剂可以包含核酸分子。
本文提供的另一方面针对包含本文所述的第一两亲性肽和第二两亲性肽的一个或多个实施方式的混合肽粒子在将核酸分子递送至细胞中的用途。因此，在一些实施方式中，用于将核酸分子递送至细胞的混合肽粒子包含第一两亲性肽、第二两亲性肽和核酸分子。在一些实施方式中，混合肽粒子可包含多种(例如，至少两种以上)核酸分子或寡核苷酸(例如，DNA或RNA，包括但不限于：siRNA、shRNA、miRNA或以上核酸的任意组合)。在一些实施方式中，所述核酸分子或寡核苷酸可被设计为用于治疗性干预，例如，基因治疗或siRNA治疗。
肽粒子组装
本文所述的肽粒子可通过一步法进行组装。例如，可通过添加水而方便地由溶解的两亲性肽组装肽粒子：当三元混合物(肽、有机溶剂、H2O)进入两相区(肽、H2O)，乳液自发形成。由于乳化过程类似于乌佐效应(ouzo effect)，随着有机溶剂被移除，两亲性肽液滴硬化为固体粒子。中性分子和带电分子有效迁移至分散相中，并在粒子形成期间得以捕获(trapped)。
通常，使用本文所述的方法，可以在约15分钟内组装包含活性试剂和配体的肽粒子。另外，该系统允许对粒子大小进行直接调节，并以非常高的密度封装(entrap)活性试剂。
不希望受理论约束，系统和形成过程的简单性源于肽粒子的全部相关组分间的协同相互作用：两亲性肽不仅是基质材料，而且由于其对于其它组分(如配体和/或活性试剂)具有高亲和力，从而取代了封装途径。活性试剂封装的过程最可能类似于两相液体萃取，其中所述活性试剂由水相中逸出，并在肽液滴中积累。此外，肽在温和有机溶剂中的溶解性允许全部相关组分的同时(concurrent)溶解和自组装。配体在肽乳化过程中的存在可导致配体冠的形成。另外，由于配体的表面活性，配体的存在可允许对粒子大小进行直接调节，并因此对肽乳化物进行初步稳定。
药物组合物
为了向受试者给药，可以药学上可接受的组合物的形式来提供本文所述的肽粒子和活性试剂-两亲性肽复合物。这些药学上可接受的组合物包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂共同配制而成的粒子或活性试剂-两亲性肽复合物。如下详述，本文所述的药物组合物可被具体配制用于以固体或液体形式给药，包括适宜于下列给药的形式：(1)口服给药，例如顿服药(drenches，水性或非水性的溶液或悬浮液)、灌服药(gavage)、锭剂(lozenge)、糖衣剂(dragee)、胶囊剂、丸剂、片剂(例如，目标是用于口含吸收、舌下吸收和全身吸收的片剂)、大丸剂(boluse)、散剂、颗粒剂、应用于舌部的膏剂；(2)胃肠道外给药，例如，作为如无菌溶液或悬浮液或缓释制剂经皮下注射(subcutaneous)、肌内注射(intramuscular)、静脉注射(intravenous)或硬膜外注射(epidural injection)给药；(3)局部施用，例如，作为霜剂、软膏剂、或控释贴剂或喷雾剂施用于皮肤；(4)阴道内给药或直肠内给药，例如作为阴道栓剂(pessary)、霜剂或泡沫剂；(5)舌下给药(sublingually)；(6)眼部给药(ocularly)；(7)经皮给药(transdermally)；(8)经粘膜给药(transmucosally)；或(9)鼻部给药(nasally)。此外，可使用药物递送系统将化合物注射入或植入患者体内。参见例如，Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24：199-236(1984)；Lewis编著，“Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals”(Plenum Press，New York，1981)；美国专利No.3,773,919；以及美国专利No.353,270,960，以引用的方式将上述文献内容全部并入本文。
本文所使用的术语“药学上可接受的”是指在健全的(sound)医学判断范围内，适合用于与人类和动物组织相接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或者其它问题或并发症(complication)，具有合理的收益/风险比的化合物、材料、组合物和/或剂型。
本文所使用的术语“药学上可接受的载体”意味着参与将主题化合物从生物体的一个器官或部分搬运或转运至生物体的另一器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或运载体(vehicle)，如液态或固态的填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(manufacturingaid，如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂包封材料。从与制剂的其它成分相容以及对患者无害的意义上来说，各载体必须是“可接受的”。一些可作为药学上可接受的载体的材料的实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍胶(tragacanth)粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原(pyrogen-free)的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)填充剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；(24)C2-C12醇，如乙醇；以及(25)其它可用于药物制剂中的无毒相容物质。湿润剂、着色剂、隔离剂(release agent)、包衣剂、甜味剂、增香剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。本文所使用的术语如“赋形剂”、“载体”或“药学上可接受的载体”等可互换使用。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将组合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将组合物放置入受试者体内。给药途径包括局部和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者整个身体相比将更多治疗剂递送至特定位点；而全身给药导致将所述治疗剂递送至受试者的基本整个身体。
可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。
示例性的给药模式包括但不仅限于：注射、输液、滴注、吸入或摄食。“注射”不受限制地包括：静脉注射和输液、肌内注射和输液、动脉内注射和输液、鞘内注射和输液、室内注射和输液、囊内注射和输液、眼内注射和输液、心内注射和输液、真皮内注射和输液、腹膜内注射和输液、经气管注射和输液、皮下注射和输液、表皮下注射和输液、关节内注射和输液、囊下注射和输液、蛛网膜下注射和输液、脊髓内注射和输液、脑脊髓内注射和输液以及胸骨内注射和输液。在本文描述的方面的某些实施方式中，通过静脉内输液或注射给药。
本文所使用的术语“受试者”是指人或动物。通常，所述动物为脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物(game animal)。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(如，家猫)、犬科物种(如，狗、狐狸、狼)、鸟类物种(如，鸡、鸸鹋(emu)、鸵鸟)和鱼类(如，鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。患者或受试者包括前面所述的任何子集，例如，一个或多个组或物种(如人类、灵长类动物或啮齿动物)的上述所有。在本文描述的方面的特定的实施方式中，受试者是哺乳动物，例如，灵长类动物、如人类。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。受试者可以为雄性或雌性。
优选地，受试者是哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不仅限于这些实例。除人以外的哺乳动物可有利地用作代表与自身免疫病或炎症相关的障碍的动物模型的受试者。此外，本文描述的方法和组合物可用于治疗家畜和/或宠物。
试剂盒
本文所提供的另一方面涉及包含肽粒子的试剂盒、包含肽粒子的制剂、或者用于制造肽粒子的组分或用于制造包含本文所述的肽粒子的制剂的组分。
在一些实施方式中，本文提供了用于制造一个或多个实施方式的肽粒子或混合肽粒子的组合物或试剂盒。在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可包含本文所述的两亲性肽。所述组合物或试剂盒中供应的两亲性肽可提供于容器中。根据用户对待制备的本文所述的肽粒子或混合粒子的选择，所述组合物或试剂盒可包含本文所述的第一两亲性肽和第二两亲性肽。所述两亲性肽可以粉末或冻干粉末提供。在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可进一步包含至少一种试剂(例如用于粉末化两亲性肽的复溶、用于粒子组装混合物的乳化、或两者兼有)。在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可进一步包含本文所述的配体(例如提供于单独的容器中)。在一些实施方式中，所述组合物或试剂盒可进一步包含待封装入肽粒子的活性试剂。所述活性试剂可在单独的容器中提供。
除了上述组分以外，所述试剂盒还可包含信息资料(informational material)。所述信息资料可为说明性资料、指导性资料、销售资料或其它与本文描述的方法和/或将所述聚集体用于本文描述的方法有关的资料。例如，所述信息资料描述将所述粒子给予受试者的方法。所述试剂盒还可包含递送装置。
在一个实施方式中，所述信息资料可包含以合适的方式给予所述制剂的说明书，所述方式例如以合适的剂量、剂型或给药方式给予所述制剂(例如，本文描述的剂量、剂型或给药方式)。在另一个实施方式中，所述信息资料可包含鉴定合适受试者的说明书，所述受试者例如为人，又例如为成人。所述试剂盒的信息资料并不受限于其形式。在许多情况下，所述信息资料(例如，说明书)可以印刷品的形式(例如，印刷文本、附图、和/或照片，例如，标签或印张)提供。然而，所述信息资料还可以其它形式提供，如盲文、计算机可读资料、录像或录音。在另一个实施方式中，所述试剂盒的信息资料为链接或联系信息，例如，实际地址、电子邮件地址、超链接、网站或电话号码，在这些信息资料中，试剂盒的使用者可获得大量关于本文描述的方法中的制剂和/或其使用的信息。当然，所述信息资料也可以任何组合形式提供。
在某些实施方式中，所述制剂的单一组分可以提供于一个容器中。或者，可期望在两个以上的容器中分别提供所述制剂的组分，例如，一个容器用于提供两亲性肽制剂、至少另一个容器用于提供载体化合物。可将不同组分例如根据随试剂盒提供的说明书进行组合。所述组分可根据本文描述的方法组合，例如，以制备和给予药物组合物。
除了制剂以外，所述试剂盒的组合物还可包含其它成分，如溶剂或缓冲剂、稳定剂或防腐剂、和/或用于对本文描述的状况或障碍进行治疗的第二试剂。或者，所述其它成分可包含于所述试剂盒中，但位于与制剂不同的组合物或容器中。在这些实施方式中，所述试剂盒可包含用于对制剂和其它成分进行混合的说明书、或用于将寡核苷酸与其它成分共同使用的说明书。
所述制剂可以任何形式提供，例如，液体形式、干燥形式或冻干形式。优选所述制剂基本上纯净和/或无菌。当以液体溶液形式提供所述试剂时，所述液体溶液优选是水溶液，其中优选无菌水溶液。当以干燥形式提供所述制剂时，通常通过加入合适的溶剂进行复水。所述溶剂(例如，无菌水或缓冲剂)可任选地在试剂盒中提供。
在某些实施方式中，所述试剂盒包含分开的用于所述制剂和信息资料的容器、分隔器或区室。例如，所述制剂可置于瓶、小瓶(vial)、或注射器中；所述信息资料可置于塑料套筒或包中。在其它实施方式中，将试剂盒的各个要素置于单一、未分隔的容器中。例如，所述制剂置于已贴有标签形式的信息资料的瓶、小瓶或注射器中。
在某些实施方式中，所述试剂盒包含多个(例如，一组)单独的容器，所述容器各自包含一个或多个单位剂型的所述制剂。例如，所述试剂盒包含多个注射器、安瓿瓶、箔包装或泡罩包装，其各自包含一单位剂型的所述制剂。所述试剂盒的容器可以是气密和/或防水的。
可通过以下编号的段落对本文所述的各个方面的实施方式进行说明。
1.一种包含两亲性肽的肽粒子，所述两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，
其中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu)m-(Trp)n或(Leu-Trp)p-(Leu)q，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-5的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然；以及
其中，所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)r，其中r为1-15的整数，并且
其中，所述肽粒子进一步在其外表面上包含配体。
2.如段1所述的肽粒子，其中，r为2-5的整数。
3.如段1或2所述的肽粒子，其中，r为整数3。
4.如段1-3中任一项所述的肽粒子，其中，所述亲水性肽片段的至少一个Lys残基或所述两亲性肽的N-末端氨基被乙酰化。
5.如段1-4中任一项所述的肽粒子，其中，所述亲水性肽片段的全部Lys残基被乙酰化。
6.如段1-5中任一项所述的肽粒子，其中，所述两亲性肽的N-末端氨基被乙酰化。
7.如段1-6中任一项所述的肽粒子，其中，所述疏水性肽片段连接至所述亲水性肽片段的C-末端。
8.如段1-7中任一项所述的肽粒子，其中，Leu为D-Leu。
9.如段1-8中任一项所述的肽粒子，其中，Trp为L-Trp。
10.如段1-9中任一项所述的肽粒子，其中，Lys为L-Lys。
11.如段1-10中任一项所述的肽粒子，其中，m或p为1-3。
12.如段1-11中任一项所述的肽粒子，其中，m或p为3。
13.如段1-12中任一项所述的肽粒子，其中，n或q为1。
14.如段1-13中任一项所述的肽粒子，其中，所述两亲性肽包含氨基酸序列(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中，X不存在或X为NH2。
15.如段14所述的肽粒子，其中，至少一个L-Lys残基被乙酰化。
16.如段14或15所述的肽粒子，其中，所述两亲性肽的N-末端氨基被乙酰化。
17.如段1-16中任一项所述的肽粒子，其中，所述两亲性肽的长度为约5个至约25个氨基酸残基。
18.如段1-17中任一项所述的肽粒子，其中，所述两亲性肽的至少一个骨架酰胺连接是酰胺替代连接。
19.如段1-18中任一项所述的肽粒子，其中，所述两亲性肽包含β-氨基酸、γ-氨基酸，或以上氨基酸的组合。
20.如段1-19中任一项所述的肽粒子，其中，所述疏水性肽片段或所述亲水性肽片段中的至少一者包含至少一个点突变。
21.如段1-20中任一项所述的肽粒子，其中，所述配体包括细胞表面受体的配体或抗体。
22.如段21所述的肽粒子，其中，所述细胞表面受体的配体包括转铁蛋白、EGF、叶酸，或以上配体的任意组合。
23.如段1-22中任一项所述的肽粒子，其中，存在于所述肽粒子外表面上的所述配体的厚度为约1nm至约100nm。
24.如段23所述的肽粒子，其中，存在于所述肽粒子外表面上的所述配体的厚度为约10nm。
25.如段1-24中任一项所述的肽粒子，其中，所述配体共价连接至所述两亲性肽。
26.如段1-25中任一项所述的肽粒子，其中，所述配体共价连接至所述两亲性肽的所述亲水性肽片段。
27.如段1-26中任一项所述的肽粒子，其中，所述配体与所述两亲性肽之比的范围为约1:10至约1:1,000,000。
28.如段1-27中任一项所述的肽粒子，其中，所述粒子的大小为约5nm至约5,000nm。
29.如段28所述的肽粒子，其中，所述粒子的大小为约30nm至约150nm。
30.如段1-29中任一项所述的肽粒子，其中，所述肽粒子包含完全乙酰化的如段1-29中任一项所述的两亲性肽和部分乙酰化的如段1-29中任一项所述的两亲性肽的混合物。
31.如段30所述的肽粒子，其中，所述完全乙酰化的两亲性肽与所述部分乙酰化的两亲性肽之比的范围为约95:5至约1:1。
32.如段30-31中任一项所述的肽粒子，其中，所述肽粒子进一步包含未乙酰化的两亲性肽。
33.如段1-32中任一项所述的肽粒子，所述肽粒子进一步包含活性试剂。
34.如段33所述的肽粒子，其中，所述活性试剂分散于所述粒子内。
35.如段33-34中任一项所述的肽粒子，其中，所述活性试剂不带有净电荷。
36.如段33-34中任一项所述的肽粒子，其中，所述活性试剂带有净电荷。
37.如段33-36中任一项所述的肽粒子，其中，所述活性试剂选自于由以下试剂所组成的组：蛋白、肽、抗原、抗体或抗体部分、抗体样分子、酶、核酸、适配子、小分子、抗生素、药物活性试剂、治疗试剂、造影剂，以及以上试剂的任意组合。
38.如段33-37中任一项所述的肽粒子，其中，所述活性试剂为药物活性试剂或治疗试剂。
39.如段33-38中任一项所述的肽粒子，其中，所述活性试剂为核酸分子。
40.如段39所述的肽粒子，其中，所述核酸分子包括siRNA、miRNA、shRNA，或以上核酸分子的任意组合。
41.如段39所述的肽粒子，其中，所述核酸分子为DNA。
42.如段33-41中任一项所述的肽粒子，其中，所述活性试剂与所述两亲性肽之比的范围为约1:1至约1:10,000。
43.如段42所述的肽粒子，其中，所述活性试剂与所述两亲性肽之比的范围为约1:1至约1:100、或约1:1至约1:10。
44.如段33-43中任一项所述的肽粒子在靶向递送活性试剂中的用途。
45.如段44所述的用途，其中，所述活性试剂在以其自身递送至细胞时不能穿透细胞。
46.包含带正电的两亲性肽的组合物作为细胞穿透试剂或转染试剂的用途，其中，所述带正电的两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，
其中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu)m-(Trp)n或(Leu-Trp)p-(Leu)q，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-5的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然；以及
其中，所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)r，其中r为1-15的整数，并且
其中，所述两亲性肽的至少一个Lys残基或N-末端氨基未被乙酰化。
47.如段46所述的用途，其中，所述两亲性肽的全部Lys残基和N-末端氨基均未被乙酰化。
48.如段46或47所述的用途，其中，r为2-5的整数。
49.如46-48中任一项所述的用途，其中，r为整数3。
50.如段46-49中任一项所述的用途，其中，所述疏水性肽片段连接至所述亲水性肽片段的C-末端。
51.如段46-50中任一项所述的用途，其中，Leu为D-Leu。
52.如段46-51中任一项所述的用途，其中，Trp为L-Trp。
53.如段46-52中任一项所述的用途，其中，Lys为L-Lys。
54.如段46-53中任一项所述的用途，其中，m或p为1-3。
55.如段46-54中任一项所述的用途，其中，m或p为3。
56.如段46-55中任一项所述的用途，其中，n或q为1。
57.如段46-56中任一项所述的用途，其中，所述两亲性肽的长度为约5个至约25个氨基酸残基。
58.如段46-57中任一项所述的用途，其中，所述两亲性肽的至少一个骨架酰胺连接是酰胺替代连接。
59.如段46-58中任一项所述的用途，其中，所述两亲性肽包含β-氨基酸、γ-氨基酸，或以上氨基酸的组合。
60.如段46-59中任一项所述的用途，其中，所述疏水性肽片段或所述亲水性肽片段中的至少一者包含至少一个点突变。
61.如段46-60中任一项所述的用途，其中，所述粒子的大小为约5nm至约5,000nm。
62.如段61所述的用途，其中，所述粒子的大小为约30nm至约150nm。
63.如段46-62中任一项所述的用途，其中，所述两亲性肽包含氨基酸序列(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中，X不存在或X为NH2。
64.如段46-63中任一项所述的用途，其中，所述组合物进一步包含待递送至细胞中的核酸分子。
65.一种包含第一两亲性肽和第二两亲性肽的肽粒子，所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽各自独立地包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，
其中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu)m-(Trp)n或(Leu-Trp)p-(Leu)q，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-5的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然；以及
其中，所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)r，其中r为1-15的整数，并且
其中，所述第一两亲性肽的N-末端氨基和全部Lys残基均被乙酰化；以及
其中，所述第二两亲性肽的至少N-末端氨基或一个Lys残基未被乙酰化。
66.如段65所述的肽粒子，其中，所述第二两亲性肽的N-末端氨基和Lys残基均未被乙酰化。
67.如段65或66所述的肽粒子，所述肽粒子进一步包含活性试剂。
68.如段67所述的肽粒子，其中，所述活性试剂包含核酸分子。
69.如段65-68中任一项所述的肽粒子，其中，所述活性试剂与所述第二两亲性肽之比的范围为约1:1000至1:1、或约1:100至约1:10。
70.如段69所述的肽粒子，其中，所述活性试剂与所述第二两亲性肽之比的范围为约1:10至约1:2。
71.如段65-70中任一项所述的肽粒子，其中，所述第一两亲性肽与所述第二两亲性肽之比的范围为约1:1至约1000:1、或约5:1至约100:1。
72.如段65-71中任一项所述的肽粒子，所述肽粒子进一步在其外表面上包含配体。
73.如段72所述的肽粒子，其中，所述配体包括细胞表面受体的配体或抗体。
74.如段73所述的肽粒子，其中，所述细胞表面受体的配体包括转铁蛋白、EGF、叶酸，或以上配体的任意组合。
75.如段65-74中任一项所述的肽粒子，其中，存在于所述肽粒子外表面上的所述配体的厚度为约1nm至约100nm。
76.如段75所述的肽粒子，其中，存在于所述肽粒子外表面上的所述配体的厚度为约10nm。
77.如段65-76中任一项所述的肽粒子，其中，所述配体共价连接至所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽中的至少一者。
78.如段65-77中任一项所述的肽粒子，其中，所述配体共价连接至所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽中至少一者的所述亲水性肽片段。
79.如段65-78中任一项所述的肽粒子，其中，所述配体与所述两亲性肽之比的范围为约1:10至约1:1,000,000。
80.如段65-79中任一项所述的肽粒子，其中，r为2-5的整数。
81.如段65-80中任一项所述的肽粒子，其中，r为整数3。
82.如段65-81中任一项所述的肽粒子，其中，所述疏水性肽片段连接至所述亲水性肽片段的C-末端。
83.如段65-82中任一项所述的肽粒子，其中，Leu为D-Leu。
84.如段65-83中任一项所述的肽粒子，其中，Trp为L-Trp。
85.如段65-84中任一项所述的肽粒子，其中，Lys为L-Lys。
86.如段65-85中任一项所述的肽粒子，其中，m或p为1-3。
87.如段65-86中任一项所述的肽粒子，其中，m或p为3。
88.如段65-87中任一项所述的肽粒子，其中，n或q为1。
89.如段65-88中任一项所述的肽粒子，其中，所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽的长度各自独立地为约5个至约25个氨基酸残基。
90.如段65-89中任一项所述的肽粒子，其中，所述第一两亲性肽或所述第二两亲性肽中的至少一个骨架酰胺连接是酰胺替代连接。
91.如段65-90中任一项所述的肽粒子，其中，所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽中的至少一者包含β-氨基酸、γ-氨基酸，或以上氨基酸的组合。
92.如段65-91中任一项所述的肽粒子，其中，所述疏水性肽片段或所述亲水性肽片段中的至少一者包含至少一个点突变。
93.如段65-92中任一项所述的肽粒子，其中，所述肽粒子的大小为约5nm至约5,000nm。
94.如段93所述的肽粒子，其中，所述肽粒子的大小为约30nm至约150nm。
95.如段65-94中任一项所述的肽粒子，其中，所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽各自独立地包含氨基酸序列(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中，X不存在或X为NH2。
96.如段65-95中任一项所述的肽粒子在将核酸分子递送至细胞中的用途。
97.如段96所述的用途，其中，所述核酸分子包括siRNA、miRNA、shRNA，或以上核酸分子的任意组合。
98.如段96所述的用途，其中，所述核酸分子包括DNA。
99.一种包含疏水性肽片段和亲水性肽片段的两亲性肽，
其中，所述疏水性肽片段包含2-10个交替的D-氨基酸和L-氨基酸的序列，所述氨基酸选自于：丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸(Trp)，并且
其中，所述亲水性肽片段包含带电、或不带电但为极性的氨基酸，或以上氨基酸的衍生物。
100.如段99所述的两亲性肽，其中，所述疏水性肽片段包含氨基酸序列(Trp-Leu)m-(Trp)n或(Leu-Trp)p-(Leu)q，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-20的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然。
101.如段99或100所述的两亲性肽，其中，所述亲水性肽片段在N-末端或氨基酸残基上包含至少一个电荷。
102.如段101所述的两亲性肽，其中，所述至少一个电荷可以是阳离子电荷或阴离子电荷。
103.如段99或100所述的两亲性肽，其中，所述亲水性肽片段包含不带电但为极性的氨基酸。
104.如段99-103中任一项所述的两亲性肽，其中，所述亲水性肽片段包含至少一个电荷和至少一个不带电但为极性的氨基酸。
105.如段99-104中任一项所述的两亲性肽，其中，聚合物共价连接至所述疏水性肽片段。
106.如段99-105中任一项所述的两亲性肽，其中，所述两亲性肽中的至少一个氨基被乙酰化。
107.如段102所述的两亲性肽，其中，所述至少一个阳离子电荷位于选自于由下列氨基酸残基所组成的组的氨基酸残基中：Lys、Arg、His，以及以上氨基酸残基的任意组合。
108.如段102所述的两亲性肽，其中，所述至少一个阴离子电荷位于选自于由下列氨基酸残基所组成的组的氨基酸残基中：Asp或Glu，以及以上氨基酸残基的任意组合。
109.如段103所述的两亲性肽，其中，所述至少一个不带电但为极性的氨基酸残基选自于由下列氨基酸残基所组成的组：Ser、Thr、Asn或Gln，以及以上氨基酸残基的任意组合。
110.如段105所述的两亲性肽，其中，所述聚合物选自于由以下聚合物所组成的组：PEG、PGG、PEO、聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚羟基链烷酸酯、葡聚糖、聚酸酐、PLA-PGA、聚原酸酯、聚富马酸酯、水凝胶、任何本领域认可的生物相容聚合物和/或可生物降解的聚合物，以及以上聚合物的任意组合。
111.如段99-110中任一项所述的两亲性肽，其中，所述亲水性肽片段包含氨基酸序列(Lys)r，其中r为1-15的整数。
112.如段111所述的两亲性肽，其中，r为3。
113.如段99-112中任一项所述的两亲性肽，其中，所述至少一个氨基为所述两亲性肽的N-末端氨基。
114.如段99-113中任一项所述的两亲性肽，其中，所述至少一个氨基位于所述亲水性肽片段的Lys残基上。
115.如段99-114中任一项所述的两亲性肽，其中，所述亲水性肽片段中的全部氨基均被乙酰化。
116.如段99-115中任一项所述的两亲性肽，其中，所述两亲性肽的N-末端氨基和所述亲水性肽片段中的至少一个氨基被乙酰化。
117.如段99-116中任一项所述的两亲性肽，其中，所述两亲性肽的N-末端氨基和所述亲水性肽片段中的全部氨基均被乙酰化。
118.如段99-117中任一项所述的两亲性肽，其中，所述疏水性肽片段连接至所述亲水性肽片段的C-末端。
119.如段99-118中任一项所述的两亲性肽，其中，Leu为D-Leu。
120.如段99-119中任一项所述的两亲性肽，其中，Trp为L-Trp。
121.如段99-120中任一项所述的两亲性肽，其中，Lys为L-Lys。
122.如段99-121中任一项所述的两亲性肽，其中，m或p为1-3。
123.如段122所述的两亲性肽，其中，m或p为3。
124.如段99-123中任一项所述的两亲性肽，其中，n或q为1。
125.如段99-124中任一项所述的两亲性肽，其中，所述两亲性肽包含氨基酸序列(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)，其中，至少一个L-Lys残基被乙酰化。
126.如段99-125中任一项所述的两亲性肽，其中，所述两亲性肽包含氨基酸序列Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)。
127.如段126所述的两亲性肽，其中，至少一个L-Lys残基被乙酰化。
128.如段99-127中任一项所述的两亲性肽，其中，所述两亲性肽包含氨基酸序列Ac-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中，X不存在或X为NH2。
129.如段99-128中任一项所述的两亲性肽，其中，所述两亲性肽的长度为约5个至约25个氨基酸残基。
130.如段99-129中任一项所述的两亲性肽，其中，至少一个骨架酰胺连接是酰胺替代连接。
131.如段99-130中任一项所述的两亲性肽，其中，所述两亲性肽包含至少一个β-氨基酸、γ-氨基酸，或以上氨基酸的任意组合。
132.如段99-131中任一项所述的两亲性肽，其中，所述疏水性肽片段或所述亲水性肽片段中的至少一者包含至少一个点突变。
133.包含如段99-132中任一项所述的一种或多种两亲性肽的粒子。
134.如段133所述的粒子，所述粒子进一步包含配体。
135.如段133或134所述的粒子，其中，所述配体为细胞表面受体的配体或抗体。
136.如段135所述的粒子，其中，所述细胞表面受体的配体为转铁蛋白、EGF或叶酸。
137.如段133-136中任一项所述的粒子，其中，所述配体存在于所述粒子的外表面上。
138.如段133-137中任一项所述的粒子，其中，所述配体吸附在所述粒子的外表面上。
139.如段137或138所述的粒子，其中，存在于所述粒子外表面上的所述配体的厚度为约1nm至约100nm。
140.如段139所述的粒子，其中，存在于所述粒子外表面上的所述配体的厚度为约10nm。
141.如段133-140中任一项所述的粒子，其中，所述配体共价连接至所述两亲性肽。
142.如段133-141中任一项所述的粒子，其中，所述配体共价连接至所述两亲性肽的所述亲水性肽片段。
143.如段133-142中任一项所述的粒子，所述粒子进一步包含活性试剂。
144.如段143所述的粒子，其中，所述活性试剂分散于所述粒子内。
145.如段143-144中任一项所述的粒子，其中，所述活性试剂不带有净电荷。
146.如段143-144中任一项所述的粒子，其中，所述活性试剂带有净电荷。
147.如段143-146中任一项所述的粒子，其中，所述活性试剂包含至少一个芳基。
148.如段143-147中任一项所述的粒子，其中，所述活性试剂选自于由以下试剂所组成的组：蛋白、肽、抗原、抗体或抗体部分、抗体样分子、酶、核酸、适配子、小分子、抗生素、药物活性试剂、治疗试剂、造影剂，以及以上试剂的任意组合。
149.如段143-148中任一项所述的粒子，其中，所述活性试剂为药物活性试剂。
150.如段143-149中任一项所述的粒子，其中，所述活性试剂为核酸分子。
151.如段150所述的粒子，其中，所述核酸分子为siRNA、miRNA或shRNA。
152.如段150所述的粒子，其中，所述核酸分子为DNA。
153.如段143-152中任一项所述的粒子，其中，所述活性试剂与所述两亲性肽之比的范围为1:1至1:100,000。
154.如段153所述的粒子，其中，所述活性试剂与所述两亲性肽之比的范围为1:1至约1:1,000。
155.如段134-154中任一项所述的粒子，其中，所述配体与所述两亲性肽之比的范围为约1:10至约1:1,000,000。
156.如段133-155中任一项所述的粒子，其中，所述粒子的大小为约5nm至约5,000nm。
157.如段156所述的粒子，其中，所述粒子的大小为约30nm至约150nm。
158.如段133-157中任一项所述的粒子，其中，所述粒子包含完全乙酰化和部分乙酰化的如段99-132中任一项所述的两亲性肽的混合物。
159.如段158所述的粒子，其中，所述完全乙酰化的两亲性肽与所述部分乙酰化的两亲性肽之比的范围为约95:5至约1:1。
160.如段133-159中任一项所述的粒子，其中，所述粒子进一步包含未乙酰化的两亲性肽。
161.一种使用两亲性肽化合物作为递送系统的方法。
162.如段161所述的方法，其中，所述递送系统为靶向递送系统。
163.如段161或162所述的方法，其中，所述递送系统用于治疗目的或诊断目的。
164.肽组合物分别作为细胞穿透肽或转染试剂的用途。
一些选定的定义
除非另有说明或在上下文中有所暗示，下列术语和短语包括下文提供的含义。除非另有明确说明或从上下文中可明显看出，下列术语和短语不排除在其所属领域已具有的含义。提供所述定义以辅助描述本文描述的方面的具体实施方式，而由于本发明的范围仅受权利要求所限，因此并不意味着限制所请求保护的发明。另外，除非上下文另有要求，单数术语涵盖复数，并且复数术语涵盖单数。
本文所使用的术语“包含/包括(comprising或comprises)”表示对本发明必要的组合物、方法及其各自的组成部分，并且无论是否必要都仍然对未指定的要素保持开放。并且，术语“包含/包括”包括“基本上由…组成”和“由…组成”。
本文所使用的术语“基本上由…组成”涉及给定的实施方式所需的那些元素。该术语允许存在实质上不影响本发明实施方式的基础和新颖性或起作用的特征的额外成分。
术语“由…组成”涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，排除没有在实施方式描述中详述的任何要素。
除了在操作实施例中或另有指示的地方，本文所用的表示成分的量或反应条件的全部数值在所有情况下都应该被理解为被术语“约”修饰。与百分比相连使用的术语“约”可意味着±1％。
除非文中明确地另有所指，单数术语“一(a/an)”和“该/所述(the)”涵盖复数的所指物。相似地，除非文中明确地另有所指，单词“或(or)”意在涵盖“和(and)”。
尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可被用于本文公开的实践或测试中，合适的方法和材料在下文有所描述。术语“包含/包括(comprises)”意思是“含有(includes)”。缩写“e.g.”源自拉丁文的例如(exempli gratia)，并且在本文中用于表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如(for example)”同义。
术语“统计学显著(statistically significant)”或“显著地(significantly)”表示统计显著性，并且通常意味着参比水平以上或以下两个标准差(2SD)。这个术语表示统计证明存在差异。它被定义为当无效假设实际上是真时作出否决该无效假设的决定的可能性。通常利用p值来作出决定。
术语“纳米球”是指长径比(aspect ratio)至多3:1的粒子。术语“长径比”是指对象的最长轴与对象的最短轴的比值，其中所述轴并非必须相互垂直。
术语粒子的“最长维度(dimension)”是指粒子的最长直接路径。术语“直接路径”指的是包含于所述粒子之内、在所述粒子表面上的两点之间的最短路径。例如，螺旋状粒子的最长维度相当于将螺旋拉伸为直线时所述螺旋的长度。
术语“纳米棒”是指最长维度至多200nm、且长径比为3:1至20:1的粒子。
术语“纳米棱柱”是指至少有两个通过共同边相连的非平行面的粒子。
粒子的“长度”是指所述粒子的最长维度。
粒子的“宽度”是指所述粒子的平均宽度；且粒子的“直径”是指所述粒子的平均直径。
多个粒子的“平均”维度是指所述多个粒子的该维度的平均值。例如，多个纳米球的“平均直径”是指所述多个纳米球直径的平均值，其中单个纳米球的直径是该纳米球直径的平均值。
本文所使用的术语“药学上可接受的盐”是指传统的化合物的无毒盐类或季铵盐类(例如，来自无毒有机酸或无机酸)。这些盐类可在给药运载体或剂型制造过程中原位制备、或通过单独将处于其游离碱或酸形式的纯化化合物与合适的有机酸/无机酸或有机碱/无机碱反应并在后续纯化时分离所形成的盐而制备。传统的无毒盐类包括由例如以下无机酸衍生的盐：硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由例如以下有机酸制备而来的盐：乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲基苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、异硫羰酸(isothionic)等。参见例如：Berge等，“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.66:1-19(1977)，以引用的方式将其内容整体并入本文。
在本文所述的方面的某些实施方式中，代表性的盐类包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)和十二烷基磺酸盐等。
本文使用的比可以为摩尔比(mole ratio/molar ratio)或重量比。
本文所使用的“细胞穿透肽”(“cell penetration peptide”或“cellpenetrating peptide”)定义为具有膜穿透性、并能够穿过生物膜或生理屏障的肽。细胞穿透肽(CPP)也被称为细胞透过性肽(cell-permeable peptides)、蛋白转导结构域(PTD)或膜易位序列(membrane-translocation sequence，MTS)。CPP具有在体外和/或体内在哺乳动物细胞膜易位并进入细胞、并导引缀合的感兴趣的化合物(如药物或标记物)到达期望的细胞目的地(例如进入细胞质(胞质液(cytosol)、内质网、高尔基体等)或细胞核)的能力。因此，CPP可导引或促进感兴趣的化合物穿越磷脂膜、线粒体膜、内涵体膜或核膜。CPP还可以导引感兴趣的化合物由细胞外经由质膜进入细胞质或到达细胞内的期望位置(例如，细胞核、核糖体、线粒体、内质网、溶酶体或过氧化物酶体)。替代地或另外地，CPP可以导引感兴趣的化合物跨越血-脑屏障、跨粘膜(trans-mucosal)屏障、血-视网膜(hematoretinal)屏障、皮肤屏障、胃肠道屏障和/或肺屏障。
可用多种方法确定对生物膜或生理屏障的穿越，例如细胞穿透测试，所述测试具有在培养细胞存在下将CPP缀合至标记物的第一孵育步骤、其后的固定(fixating)步骤、以及随后显示(revelation)细胞中标记的肽的存在。在另一个实施方式中，可以在标记的直接针对CPP的抗体的存在下孵育CPP，并随后在细胞质中或紧邻细胞核、或者甚至在细胞核内检测CPP的氨基酸序列与标记的抗体之间的免疫反应，从而完成所述显示步骤。也可以通过标记CPP中的氨基酸序列、并检测在细胞区室中该标记的存在而完成所述显示。细胞穿透测试是本领域技术人员公知的。然而，例如在前述的专利申请号WO97/02840中描述了细胞穿透测试。
本文所使用的术语“转染试剂(transfection agent/transfection reagent)”是指能结合至化合物或与化合物复合、并促进所述化合物进入细胞的化合物。通常，转染试剂这一术语用于促进将核酸递送至细胞中的化合物。
对于没有指出的范围，本领域普通技术人员将会理解的是，本文描述和阐明的各种实施方式中的任何一项都能被进一步修改，以将本文公开的任何其它实施方式中的特征并入。
下列实施例阐明了本发明的一些实施方式和一些方面。对本领域技术人员来说显而易见的是，可以在不改变本发明的精神或范围的情况下进行各种修改、增加、替换等，这些修改和变化都包含在所附权利要求书中限定的本发明的范围之内。本发明在任何情况下都不局限于下述实施例。
实施例
示例性的材料和方法(实施例1-2)
示例性的材料：除非后文另有说明，所有化学品和试剂，包括虎红(RB)(Aldrich330000，95％)和5-羧基荧光素(CF)(Sigma-Aldrich C0537，99％)获自Sigma-Aldrich，且未加进一步纯化即使用。Fmoc-保护的氨基酸和偶联试剂由IRIS Biotech及Novabiochem处购买。24孔结晶板由Hampton Research(Cryschem Plate)处购买。
肽合成：使用Fmoc保护基团化学作用于固相上合成了全部的肽。合成的各个步骤列于表1中。在10mL注射器中将Rink Amide AM树脂(200mg，负载：0.4mmol/g-0.8mmol/g)用作固相。所有反应均在预先以氧化铝处理以减少游离胺丰度的二甲基甲酰胺(DMF)中实施。在合成前将Fmoc-氨基酸溶解于DMF(0.5M)中。对于每一偶联步骤，使用DMF中的哌啶(40％)使Fmoc保护基团断裂两次。将1H-苯并三氮唑1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5氯-,六氟磷酸酯(1-),3-氧化物(1H-benzotriazolium1-[bis(dimethylamino)methylene]-5chloro-,hexafluorophosphate(1-),3-oxide)(HCTU)用作偶联剂，将N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮(1-methyl-2-pyrrolidinone，NMP)中作为碱。相对于树脂负载能力，使用4当量(eq)的氨基酸、HCTU(4eq)和DIPEA(12eq)进行全部偶联。每一偶联步骤后，使用乙酸酐(5eq)和DMF中的DIPEA(5eq)的溶液，通过乙酰化将未反应的末端氨基封端(capped)。
表1：批量(batch)Fmoc固相肽合成的自动化步骤
(a)在DMF Alox/NMP中；(b)在DMF Alox中，其中DMF Alox是预先以氧化铝处理的DMF
在使用Rink Amide AM树脂(5克)的按比例放大的合成中应用了同样的方案，其中，反应在500ml的固相玻璃反应器中进行，使用3eq的氨基酸和偶联剂。在反应期间使pH值恒定保持为9，并在每一偶联和断裂步骤后使用Kaiser和三硝基苯磺酸酯测试(TNBS)探测树脂中的游离氨基。无需使用NMP作为助溶剂(cosolvent)。
总产率范围通常为10％-15％，纯度为～95％，这对于固相肽合成而言是典型的结果。
在合成后，以DMF、异丙醇、DMF、二氯甲烷和二乙醚洗涤肽树脂，之后将该肽树脂在真空管路(vacuum line)上干燥过夜。以冷TFA(95％)、三乙基硅烷(2.5％)和H2O(2.5％)使肽由树脂断开，并除去保护基团。将用冰冷却的断开的混合物加至树脂，并在室温下孵育2h-3h。经过滤的断开的混合物在冷的二异丙醚中沉淀并用冷的二异丙醚(40mL)洗涤。使白色固体在真空管路上干燥过夜。
肽纯化：使用表2中所列的参数，用Shimadzu Prominence HPLC对全部肽进行纯化。将粗肽(crude peptides)研磨并溶解于DMF和乙腈的混合物(4mL，1:1)中，并用H2O(0.1％TFA)稀释至20mL的终体积。在这些溶剂条件下消除粗产物的凝胶化。随后以0.45μmPTFE注射滤器过滤样品，以4mL/min的流速泵入Merck LiChrospher100，RP-18e柱(5μm，250-10)，并以线性梯度的水(0.1％TFA)至乙腈(MeCN)洗脱。在280nm检测样品洗脱液的吸收并按照5mL的固定分数体积(fixed fraction volume)收集。产物肽的存在通过质谱法进行定性(图1A)并通过进行HPLC分析而定量(图1B)。将含有多于80％的产物(A280)的部分(fractions)应用于第二纯化步骤，所述第二纯化步骤使用同样的色谱材料在水相中以乙酸(2％)进行。合并含有多于95％的产物的部分，以氨水中和并冻干。
表2：HPLC纯化的参数
纯化后修饰：通过使用40倍过量的乙酸酐和DIPEA对溶于DMF的纯化的肽进行N-末端和赖氨酸的伯胺的乙酰化。在根据前述的程序对反应混合物进行再纯化之前，通过质谱法控制该反应的完成度。
珠形成和共组装：将CD3ac和虎红(RB)溶解于比例为1:1的H2O:EtOH中并混合，获得的RB终浓度为61.5×10-6M、184.5×10-6M、307.5×10-6M、615×10-6M和922.5×10-6M。CD3ac的浓度保持恒定为615×10-6M。在24孔坐滴结晶板中通过反蒸发(counter-evaporation)进行与H2O的溶剂交换；将50μl预混合的CD3ac和RB的溶液加入坐滴孔中并在16h内对1mL H2O反蒸发4次。全部实验进行三次重复。CD3ac球体在ca.30min后沉淀并在其后的5h沉积。
为了对封装的RB的量进行定量，在溶剂平衡后对珠沉淀进行重悬，并用H2O标准化至100μL的最终体积。随后将全部样品在20 000g离心30min，随后分离80μL上清液。以20μLDMSO对剩余的沉淀部分进行1:1稀释，以溶解肽组装体。通过吸收测量确定RB在沉淀部分和上清液部分中的浓度，并校正在剩余的20μL沉淀部分中的RB。
估算珠体积和分配系数：为了估计CD3ac沉淀的密度，制备了足够大从而超出可见光衍射极限(diffraction limit)的珠(307.5×10-6M的CD3ac起始浓度)。将低浓度的RB(10×10-6M)共沉淀，从而允许通过共聚焦荧光显微镜估算珠的直径(1.35μm)并便于用血细胞计数器(Hausser Scientific)计数。在所观测的250,000μm3细胞体积中的平均计数为72个珠，相当于3.71×10-4的珠体积分数(volume fraction)。50μL307.5×10-6MCD3ac溶液因此包含18.6nL的总珠体积，并且可确定CD3ac的密度(ρCD3ac≈1.35g/cm3)。RB在CD3ac珠水溶液中的对数分配系数根据下式计算：
紫外-可见光谱：以NanoDrop1000(Thermo Scientific)进行吸收测量。获得了CD3ac在H2O:乙醇:DMSO＝1:1:2中的消光系数(21,780M-1·cm-1，280nm)和虎红在H2O:DMSO＝1:1中的消光系数(11,639M-1·cm-1，562nm)。将DMSO用于在组装后溶解沉淀的CD3ac并在制备期间内降低溶剂蒸发，这是由于被测样品的体积量仅有4μL。若需要的话，用H2O:EtOH:DMSO＝1:1:2进一步稀释样品，从而在仪器的线性范围内获得吸收强度。在共组装前通过称重确定RB浓度。在CD3ac和RB共沉淀后，以DMSO对沉淀部分和上清液部分进行1:1稀释(组装的CD3ac溶于H2O:DMSO＝1:1的溶液中)。
圆二色性(CD)：用QS比色皿(1mm光程)在Applied Photophysics Chirascan上进行了CD实验。对样品浓度进行了调整，以在测量波长范围内在300V-500V间产生倍增值(dynode values)。在样品测定之前立即用水进行空白测定。每一光谱为波长间隔为1nm的三次扫描的平均值，各使用两个独立制备的样品。所有光谱以二阶Savitzky Golay算法进行平滑。CD数据以摩尔单位(deg·cm2·dmol-1)记录，以度摩尔椭圆率(degrees molarellipticity)示出。
扫描电子显微镜：在Hitachi S-4800上进行扫描电子显微镜(SEM)分析。将SEM样品支架冷却至-196℃，随后将珠悬浮液滴直接加至冷的金属表面。随后使板上的冷冻样品冻干、用铂溅射并分析。
动态光散射：使用配有ALV/-5000/E相关器和波长633nm的氩离子激光器(35mW)的基于测角仪系统的ALV/CGS-8F平台，以30°-150°的散射角进行动态光散射测量。ALV-5000/E相关器计算光子强度自相关函数g2(t)。全部实验均在T＝293K下进行，并通过二阶累积量拟合进行估算(考虑先前由SEM确定的球状粒子形状)。通过contin算法确定全部角度下的多分散性，且其从未超过0.11。以10°的步长(steps)进行30°至150°的角度依赖测量(angular dependent measurements)。为了避免多重散射的影响，进行了浓度依赖性的实验。对于角度依赖性和浓度依赖性两者而言，由Stokes公式计算流体力学半径(hydrodynamic radius)
其中rh为球状粒子的流体力学半径，D为扩散常数，kB为Boltzmann常数，T为绝对温度且η为水的粘度。以1/rh对角度(浓度)作图并通过将浓度和角度的测量均外推至零而计算流体力学半径(rh0)。
质谱：在LTQ-Orbitrap(Thermo Scientific)上进行质谱测量。将5μLCD3ac溶液(10×10-6M，H2O:MeCN＝2:1)装入填有Magic C18AQ(3μm粒径)的100μm毛细管柱中。在30min内以由H2O(4％甲酸)至MeCN的梯度对肽进行洗脱。轨道阱设置为正模式和10,000的分辨率。
共聚焦显微镜：以配有DIC、相差和落射荧光光学元件、具有488nm、568nm和647nm激光的Yokagawa CSU-10转盘式共聚焦的Nikon Ti电动倒置显微镜获取共聚焦显微图像。Hamamatsu ORCA-AG制冷CCD相机用于共聚焦、Hamamatsu ORCA-R2用于宽视场成像。CD3ac(615×10-6M)分别与(a)RB(10×10-6M)、(b)CF(10×10-6M)和(c)RB和CF(两者均为10×10- 6M)共溶于50μL体积的50％EtOH中，并对水反蒸发。将所得悬浮液用H2O标准化为每样品50μL的总体积，并随后应用至共聚焦显微镜。
实施例1：固体肽CD3ac纳米粒子-结构表征
通常难以对传统的疏水性肽进行合成和纯化，并且它们在水溶液中一般也难以溶解并趋向于沉淀为无定形结构。根据本文所述的各个方面和实施方式，全新(de novo)设计的CD3ac肽由10个氨基酸组成：
Ac-(LK(Ac))3-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2，
其中，LK(Ac)＝乙酰化的L-赖氨酸；LW＝L-色氨酸；DL＝D-亮氨酸，表现出与其它肽类物质不同的性质：CD3ac易溶于多数有机溶剂(EtOH、iPrOH、DMSO、DMF、MeCN)，并在溶剂交换至水时沉淀为均匀结构化的珠状球体(图2A)。
CD3ac肽(分子量1652.910g/mol；纯度>95％，A280)可被认为是两亲性的，这是由于其序列被分成两个部分：疏水性嵌段(由交替的L-色氨酸和D-亮氨酸组成)；和亲水性嵌段(由三个乙酰化的L-赖氨酸组成)。本文所使用的术语“亲水性”和“疏水性”不是绝对的，但描述了在氨基酸序列(例如CD3ac的氨基酸序列)内的相对极性。尽管CD3ac肽是疏水性的，然而与传统的疏水性肽相比，CD3ac可以以高产率合成，并在反相C18色谱材料上以标准方法纯化(参见前述的“材料和方法”部分)。
CD3ac能够沉淀为胶体尺寸范围内的球状聚集体，并且可以以稳定且可重现的方式实现所述沉淀。溶剂交换通过透析或(为了降低材料消耗)通过在24孔结晶板中对水反蒸发而进行。所产生的肽珠悬浮液的尺寸分布通过扫描电子显微镜(SEM，图2A-图2C)以及浓度依赖性和角度依赖性的动态光散射(DLS，图3A-图3B)测定。两种方法均显示粒子半径为约260nm。球体的半径可受到最初溶解的CD3ac(溶剂交换前)的浓度的影响，其尺寸范围为约200nm至约1500nm，对应于CD3ac初始浓度为61.5×10-6M至923×10-6M。图3A-图3B中所示的DLS数据表示由初始溶解的123×10-6M的CD3ac形成的CD3ac粒子。所获得的肽粒子(珠)无需尺寸调节(sizing)工序(如声波处理或挤出)，具有低的多分散性，而所述尺寸调节工序是普遍用于(例如在脂质悬浮液中)实现窄的尺寸分布的工序。
在CD3ac珠组装中，二级结构可在某种程度上发挥关键作用。不希望受理论约束，由于光散射，可能难以获得含有直径大于50nm的粒子的胶体悬浮液的定量圆二色性数据。因此，合成了CD3ac的四种结构衍生物(CD1、CD2、CD3和CD4)，这些结构衍生物是未乙酰化的，并因此带电且为水溶性的(参见表3)。
表3：示例性合成的肽及其衍生物的氨基酸序列和分子量
[名称] [序列] MW(Da)
CD1 1228.680
CD2 1356.775
CD3 1484.870
CD4 1612.965
CD3ac 1652.910
LCD3 1484.870
LCD3ac 1652.910
图4示出了CD1-CD4在水中的圆二色性谱。通常，带电的多聚-L-赖氨酸肽采取无规卷曲的二级结构，并在180nm-210nm间表现出负椭圆率；本文中的内容表明具有较短的寡聚赖氨酸序列的肽在这一波长范围内显出增加的椭圆率。另外，典型的无规卷曲光谱在210nm以上对椭圆率影响极小甚至无影响；因此，210nm-260nm的波长范围可几乎完全归于L-Trp和D-Leu的交替序列的影响。例如，随着连接的赖氨酸残基数目变化，在223nm处的峰位置和强度几乎保持不变，这说明N-末端连接的寡聚赖氨酸的长度对LW-DL重复单元的二级结构影响极小或没有影响，甚至可能所连接的赖氨酸上存在的多个阳离子电荷也无影响。
可从理论上将CD4-CD1系列的圆二色性谱外推至假想的CD0(不包含任何赖氨酸)，从而获得在约196nm和223nm处具有极大值的光谱。在先前合成的疏水性肽中未曾观察到类似的光谱，但在对短杆菌肽A(gramicidin A，来自土壤生活细菌短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)的15个氨基酸的抗生素肽)的先前的结构研究中曾有报道[16，17]。
短杆菌肽的二级结构基序为宽螺旋，这一结构在自然界中很少观测到，并且依赖于其环境的介电常数[19]，在螺距、手性和二聚体结构(四级结构)方面是通用的[17c，18]。虽然短杆菌肽A含有L-Trp和D-Leu的交替基序，然而本文所述的CD3ac与短杆菌肽在各方面均有所不同，例如，肽序列和长度、短杆菌肽中存在的末端附着的甲酰基和乙醇胺的明显修饰。例如，短杆菌肽序列在其全长上均为疏水性，而本文所述的CD3ac为两亲性的，这是由于在其N-末端添加了至少一个L-赖氨酸(例如，1个L-赖氨酸、2个L-赖氨酸或3个L-赖氨酸)且所述两亲性肽中至少一个氨基被乙酰化。
不希望受理论束缚，LW-DL的重复序列可导致一组与在分离的α-螺旋、β-折叠和无规卷曲中观察到的角具有显著区别的phi-角和psi-角，并最可能受到空间位阻制约；稳定的分子内氢键可以偶尔在较短的肽中观察到[20]。尽管此类二级结构和分子内氢键可存在于CD3ac中，然而CD3ac更可能过短而无法折叠至自身。
关于珠状组装体中二级结构的重要性在LCD3ac中得以体现，LCD3ac为构成(氨基酸序列)相同、但完全由L-氨基酸组成的肽。LCD3ac沉淀为微米尺度范围的无定形结构(图5A)，并且带电的LCD3的圆二色性谱主要为α-螺旋特性(图5B)。SEM和圆二色性数据结合表明，球体沉淀特征至少部分取决于D—Leu的存在以及由其诱导的特定二级结构。
实施例2：固体肽CD3ac纳米粒子-负载物封装
CD3ac是通过Fmoc化学合成的第一个肽，其形成在纳米和微米尺寸范围内的固体粒子，并有希望用于药物递送应用。尽管在一些实施方式中，沉淀的CD3ac球体一般并不彼此粘附、且对于玻璃或塑料表面不具有可观察到的亲和性，然而它们可以在其形成过程中封装负载物分子。将CD3ac分别与10×10-6M5-羧基荧光素(CF)、10×10-6M4,5，6，7-四氯-2′，4′，5′，7′-四碘荧光素(RB)以及两种染料的等摩尔混合物共溶。实验在pH5进行，在这一pH下，RB带电，而CF很大程度上被质子化并在水溶液中表现出低溶解度。在反蒸发后将溶剂体积重新调整为50μL，使得背景和肽珠间的荧光对比度能够至少定性地确定球体中的负载物积累。
CF和RB被CD3ac珠摄取，而不依赖于染料的带电状态(图6A-图6C)。然而，载有CF的珠聚集为葡萄状组装体(图6B)，而载有RB的球体彼此并不粘附(图6A)，这极有可能是由于带电的RB位于珠的表面上或接近珠的表面。
疏水性染料(如CF)和相对亲水性的染料(如RB)均可被CD3ac珠封装。不希望受理论束缚，客体(guest)分子可预先与CD3ac(在溶液中)预缔合并在移除乙醇时组装。预缔合的程度(以及由此的共组装效率)将取决于主体(host)化合物和客体化合物的亲和力；在氧杂葸衍生物(如CF和RB)的情况下，离域(delocalized)环结构的相互作用可能有助于其与CD3ac进行预缔合。
为了分析负载的CD3ac珠的摩尔组成，对载有RB的CD3ac珠的染料含量进行定量。RB容易获得，并可溶于乙醇和水。尽管不希望被理论所束缚，然而在水中的溶解度是强制性的，以避免在溶剂交换时负载物沉淀在肽珠之外。另外，RB的光吸收在水与DMSO的混合物中不强烈淬灭，从而能够通过光密度进行便利和精确的定量。
简言之，将CD3ac和RB以各种浓度比共溶于50％EtOH中。向24孔结晶板各自添加50μL，并在16h内对1mL水反蒸发四次。全部实验均进行三次重复。根据RB的浓度，CD3ac球体通常在约30min后沉淀。在溶剂平衡后，将所形成的珠沉淀重悬，并以H2O标准化为100μL的终体积。样品在20,000g离心30min，随后分离80μL上清液。随后，用20μL DMSO对剩余的沉淀部分进行1:1稀释以溶解肽组装体。与乙醇相反，使用DMSO有助于减少样品的蒸发并在至少5min内得到稳定的吸收值(用于UV-Vis的样品体积为4μL，参见前述的“示例性的材料和方法”部分)。
共组装的定量数据汇总于图7A中。在本文所述的实验中，CD3ac的浓度保持恒定为615×10-6M。染料与肽的初始溶解摩尔比表示为[RB]i/[CD3ac]i。例如，以[RB]i/[CD3ac]i＝1时作为实验起始条件，在珠形成后，球体的摩尔组成(nRBp/nCD3acp)的约三分之一为RB(如图7A所示的空心圆)并且约25％的初始溶解的染料被装载到CD3ac珠中(nRBp/nRBi，如图7A所示的空心三角形)。如图7B所示，沉淀部分和上清液部分在280nm处的吸收(色氨酸的最大吸收)表明在宽浓度范围的RB存在下(在本文所述的实验中，RB与CD3ac的摩尔比[RB]i/[CD3ac]i跨越了1.5个数量级)CD3ac几乎定量地沉淀。尽管较高的RB浓度可导致更多染料分子共组装于CD3ac珠之内，然而，初始溶解的RB与共组装的RB间的关系并非成线性比例，并且共组装的效率(nRBp/nRBi)将达到饱和上限。
在分析的浓度比中，RB在CD3ac珠中的封装效率可达至少约30％w/w或至少约40mol％或更高，对应于RB浓度升高约900倍或RB在CD3ac/H2O中的对数分配系数为2.95。预期对于疏水性负载物分子具有类似或甚至更高的封装效率；然而由于在溶剂交换时负载物沉淀于肽珠之外，对不溶于水的化合物的准确定量可能容易出现假象。
CD3ac有效地预缔合和共沉淀RB的能力是显著的，这至少部分是因为RB不仅带电且是水溶性的。事实上，RB在水中的溶解度比在乙醇中高出约5倍。如本文所述，CD3ac的珠组装并不被等摩尔浓度的RB的存在所抑制，并且可以预期的是，不受理论约束地，肽和染料的相互作用主要为导致非特异性结合(相对于例如亲和素/生物素而言)的芳族相互作用。这个功能可以补充固体脂质纳米粒子以及囊泡系统的封装性能。
本文提供了以高产率和高制备量合成和纯化的10个氨基酸的高疏水性序列。肽(CD3ac)可在无任何模板策略存在下组装为低尺寸多分散度的形状均匀的珠。CD3ac的带电衍生物的圆二色性测量表明了与D,L-螺旋短杆菌肽的结构相关性，以及D-Leu在其特定二级结构方面起到的关键作用。仅包含L-氨基酸的LCD3显示出α-螺旋的特点并以其乙酰化状态无定形地沉淀。CD3ac可以封装亲水性化合物和疏水性化合物，其效率超出了现有的封装策略[15]，例如，产生至少2.95的对数分配系数，并且除非达到饱和上限，封装效率不受亲水性物质在溶液中的浓度限制。
在本文所述的各个方面和实施方式中，可将伴以高效负载物封装的固体肽粒子用于降低敏感且成本密集的药品的降解，并用于将高有效负载(payloads)递送进入细胞。此类肽药物递送系统可通过便利的一步法封装并累积客体分子(例如活性试剂)。因此，本文提出了基于天然氨基酸构成模块(building blocks)且通过Fmoc化学合成的非聚合物药物递送系统，该系统可扩增现有的胶体种类工具箱，并为医疗应用带来希望。实施例3：用于将药物递送入细胞的具有蛋白冠的CD3ac纳米粒子
如在实施例1和2中所述，可通过添加水而由溶解的CD3ac组装CD3ac肽纳米粒子：使三元混合物(CD3ac、有机溶剂、H2O)进入两相区(CD3ac、H2O)从而自发形成乳液。乳化过程类似于ouzo效应(8)，然而，随着有机溶剂移除，CD3ac液滴硬化为固体粒子。实施例1和实施例2表明，中性芳香分子以及带电芳香分子可迁移至分散相并在粒子形成期间得以捕获(5)。
在实施例3中，本文提供了一种新的药物递送系统，该系统由CD3ac肽基质、封装的负载物(Flutax-2)和转铁蛋白冠(任选地由Alexa Fluor568标记(Tfn-AF568)以用于可视化目的)组成。为了评估自组装的CD3ac粒子中试剂的空间排列，将CD3ac肽与Flutax-2和Tfn-AF568溶于50％EtOH中，并如后述的“示例性的材料和方法”所述的步骤降低EtOH含量。图8A-图8I显示了所得的CD3ac肽药物载体纳米粒子的荧光图像。在本实施例中，CD3ac纳米粒子的直径为约3μm，将该尺寸设计得足够大，从而能够通过常规的光学显微镜分辨核中和表面上的荧光分布。不希望被束缚，可生产更小或更大的CD3ac肽纳米粒子。Tfn-AF568在粒子边缘示出荧光亮环，而Flutax-2荧光均匀分布于整个粒子之中(图8A-图8C)。通过测定Flutax-2在肽粒子与水之间的分配系数而测定封装效率(图9A-图9D)。测得Flutax-2在肽粒子与水之间的分配系数为5.25，即，在所应用的实验条件下，超过80％的共溶的Flutax-2逸出水相并被封装于粒子之中。该分配系数值对于水溶性化合物而言是非常高的。
蛋白通常是表面活性的，并可吸附于固-液界面之上。因此，曾试图确定与蛋白溶液接触的粒子是否可被称为“蛋白冠”的蛋白层所覆盖(10)。就此，对明显的红色荧光边缘是否代表由Tfn-AF568组成的冠进行评估。为了对此进行评估，将本文所述的粒子在50μg/mL的胰蛋白酶中孵育6小时。所述边缘消失，而Flutax-2负载物的空间分布保持不变(图8D-图8F)。灰度水平定量曲线表明，Tfn-AF568边缘的强度在胰蛋白酶孵育后降低了3倍(图8G)。同时，除去Tfn-AF568冠导致Flutax-2的绿色荧光增加了多达13倍(图8H)，这是由于Tfn-AF568吸收和Flutax-2发射的光谱重叠所导致。总之，这些实验表明CD3ac、Flutax-2和Tfn-AF568的自组装使得形成了具有封装的Flutax-2和表面吸附的Tfn-AF568冠的粒子。对自组装粒子的胰蛋白酶处理可导致Tfn-Af568的蛋白水解降解继以片段的表面解吸(图8I)。
用于药物递送的粒子通常直径为8nm-200nm，这是因为该尺寸范围不太可能被肾脏和肝脏清除(4)。此外，受体介导的内吞作用(含有靶向药物的粒子被摄取的可能机制)是尺寸依赖性的，并且对于小于约150nm的粒子而言更为高效(11)。为了降低CD3ac粒子尺寸，在乳化前溶解更低浓度的肽：图10A-图10C示出了492μM、246μM和123μM CD3ac在10μg/mLTfn-AF568存在下组装而制备的肽粒子的荧光显微图像。所得到的尺寸差异总结于图10D中，由粒子相关的荧光的强度曲线表示。由于可见光的衍射极限，在492μM下仍然可见的特征环在更小的粒子上观察不到，尽管光学显微镜证实Tfn-AF568在小于300nm的粒子上仍然存在(图10E)。为了确认纳米粒子(d<100nm)上Tfn-AF568冠的形成，使用了透射电子显微镜(TEM)。
为了简便起见，本文使用作为在负载物(例如本文所使用的Flutax-2)和冠(例如本文所使用的Tfn-AF568)存在下自组装的CD3ac肽纳米粒子的缩略词。图10F-图10I示出了PNP粒子在多种配置下的TEM图像：PNPFlutax-2(图10F-图10G)和(图10H-图10I)。两种样品均以醋酸铀(uranyl acetate)染色，使明亮的粒子和黑暗背景得以区分。大量检测到PNPFlutax-2，其均匀地分布在碳膜上(图10F)。相比之下，在样品中仅能检测到极少粒子；相反，这些粒子聚集在一起(图10H)，表明了在样品制备过程中的脱湿步骤和残留的水蒸发，并因此对于疏水性碳支持物显示出亲和力差异。更高的放大倍数(图10I)示出了纳米粒子界面上中等对比度的边缘。边缘平均厚度为9.85nm(st.dev.＝2.1，n＝99)，与预期的蛋白直径相符(12)。尽管这两个样品使用相同规程制备，然而PNPFlutax-2(100nm，图10J)的平均直径为(51nm，不包括冠，图10K)的两倍。不希望受理论束缚，肽粒子的平均大小不仅部分取决于肽的浓度，而且也部分地取决于在早期相分离过程中是否存在稳定乳液的表面活性分子(8)。因此，这些电子显微镜分析表明，可将肽粒子的直径控制为低至数十纳米，例如，通过调节不同的加工参数(例如但不限于，肽浓度和/或表面活性分子的浓度和/或类型)来进行。结合图8A-图8F的荧光显微图像，TEM图像表明PNP上存在Tfn-AF568冠。实施例4.通过具有蛋白冠的CD3ac纳米粒子将Flutax-2递送入CHO细胞
与转铁蛋白受体(TfR)的选择性结合依赖于蛋白冠的功能：其功能可以因蛋白变性、空间位阻(拥挤度)、或相对于PNP表面的不利取向而受损。PNP在细胞表面的累积可归因于特异性的冠-受体相互作用和/或非特异性缔合。例如，静电(库仑)力和电动(范德华)力可导致非特异性缔合(13-15)。为了测试所检测的冠在介导特异性结合中的功能，使用两个独立的实验方案将细胞表面缔合的PNP数量与可用的TfR的密度相关联：a)在溶液中Tfn与PNP的结合；以及b)对表达TFR的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和TRVb细胞的PNP结合进行比较，TRVb细胞源自于缺乏内源性TfR、但表达TfR2的中国仓鼠卵巢组织(16)。图11A-图11H示出了与孵育一小时的CHO细胞的显微图像。在投影的细胞周长内检测到显著的PNP聚集(图11A-图11C)，所述聚集可通过将CHO细胞与17μM未标记的Tfn孵育而阻断(图11D-图11F)。这表明PNP与细胞表面的相互作用依赖于自由价的TfR。图11G表明，在TRVb中TfR的较低密度导致缔合率显著降低。TRVb与17μM未标记的Tfn孵育阻断了的结合，表明在这些细胞中更多地与低丰度的TfR2受体相互作用。使用过量的Tfn不仅可能与PNP竞争TfR，而且可能以非荧光性的Tfn交换粒子冠中的荧光性Tfn-AF568。为了评估这种可能性，对在存在17μM Tfn和不存在17μM Tfn两种情况下37℃培养24小时后的PNPTfn-AF568的荧光强度分布进行比较，发现差异不显著(图9C-图9D)。这表明，TfR介导PNP与细胞表面的结合比PNP表面的蛋白交换快得多。结合图11A-图11H中示出的结果，显示PNP通过Tfn-AF568冠特异性结合至TfR。
尽管可通过与TfR的相互作用与细胞结合，然而Tfn可在发生内化之前由PNP冠解离，和/或单个Tfn蛋白和NP之间的尺寸差异可能影响细胞摄取。因此，接下来试图确定粒子是否可被细胞内化。由于表面粘附细胞的扁平形状和光学显微镜的z轴分辨率的限制，因此缔合的PNP和内化的PNP之间的区别可能并不直观。如前所示，由粒子表面除去Tfn-AF568可通过绿色荧光与红色荧光比(G/R)的显著转变进行检测。就此，如图12A-图12M中分别所示的，对G/R分布进行测定以区分缔合的PNP和内化入细胞的PNP。对CHO细胞进行固定并在与孵育1小时后(图12A-图12E)和6小时后(图12G-图12K)成像。在1小时后，对于细胞周长以内(图12E，黑色柱)和以外(图12E，灰色柱)的PNP，G/R分布均在紧靠约1.5处示出峰。如图12K所示，6小时后，细胞周长内的PNP群(黑色柱)显示出朝向更高G/R值的显著位移，而细胞周长外的PNP(灰色柱)的G/R分布仍保持局限在1.5左右。不希望受理论束缚，可以预期的是，孵育1小时后，大部分PNP还未抵达溶酶体区室，已被内化的PNP仍具有完整的含Tfn-AF568的冠；6小时后，多数PNP已被运送至溶酶体，并且其蛋白冠已被蛋白水解消化。较小的降解产物可由于较弱的范德华力而自粒子表面解离(17)。类似于在以胰蛋白酶除去冠后的G/R增加(图8H)，溶酶体中PNP冠的蛋白水解消化可以使得内化的PNP的G/R值增加。这也由在玻璃表面上检测到PNP的G/R值不变而证实。在本文中G/R值的变化可用作内化的PNP的定性指示物(由于相对较慢的消化动力学)，以表明具有Tfn-AF568冠的PNP可进入细胞或由细胞摄取，例如，通过网格蛋白(clathrin)介导的经由TfR的内吞作用(18)。
为了评估PNP的结合和内化能否导致小分子负载物的选择性输入，对将添加入细胞24小时后，封装的Flutax-2向细胞中的释放进行了分析(图13A-图13I)。Flutax-2是Oregon Green(OG)修饰的紫杉醇衍生物(19)，一种在癌症治疗中使用的有丝分裂抑制剂(20)。不同于其未标记形式，在施用浓度下Flutax-2带电并且是水溶性的，并因此不能穿透细胞膜。因此，可将其用作研究通过PNP向胞质液中递送小分子的效率和特异性的模型化合物。CHO细胞与溶解于介质中(图13A-图13C)或封装于中(图13D-图13G)的0.67μM Flutax-2孵育24小时。将胞质液中的Flutax-2发射进行平均，从而对递送入细胞的化合物的量进行定量。由于所产生的荧光并未超出自发荧光的水平，因此检测不到溶解的Flutax-2直接穿透通过细胞膜(图13B和图13I)。另一方面，与孵育产生了强的弥散的绿色荧光信号(图13E和图13G)，表明将Flutax-2递送至胞质液。17μM溶解于细胞培养基中的未标记Tfn与PNP-细胞相互作用的竞争显著降低了该递送(图13H)。并且，总递送率对于仅表达TfR2的TRVb细胞而言显著降低(图13H)。
根据本文所述的一个或多个实施方式，本文提供了一种靶向药物递送系统，所述系统由CD3ac肽基质、作为负载物的不能穿透细胞膜的Flutax-2和作为特异性的细胞表面受体的配体的Tfn-AF568组成。可通过应用一步法(例如，约15分钟的单个步骤)使得全部三种组分自组装，从而形成载药的功能性粒子。不希望被束缚，系统和形成方案的简单性源于全部相关组分的协同相互作用：CD3ac不仅是基质材料，而且由于其对于小的芳族分子具有高亲和力，从而替代了常规封装途径。负载物摄取的过程很可能类似于两相液体萃取，其中Flutax-2由水相中逸出，并在肽液滴中积累，这可能是由色氨酸和Flutax-2的离域环系统之间的高亲和性所致。另外，肽在温和有机溶剂中的溶解度允许全部相关组分的同时溶解和自组装。在CD3ac乳化过程中Tfn-AF568的存在导致形成蛋白冠，将PNP靶向于TfR。另外，由于其表面活性，粒子表面上蛋白的存在可允许对粒子尺寸进行调节并由此实现肽乳液的初步稳定。在PNP内化入溶酶体区室后，在几小时的时间尺度内的蛋白水解消化可除去冠，并由此在数天的时间尺度内使封装的负载物释放进入胞质液。随着冠被除去，封装的绿色染料(例如，本文所使用的Flutax-2)与表面附着的红色染料(例如，Tfn-AF568)的荧光比可位移至更高的值(例如，13倍)，这一位移可允许对细胞的粒子摄取进行定性描述。PNP与TfR的结合和粒子的尺寸范围表明了粒子的摄取，例如，通过网格蛋白介导的内吞作用摄取。不希望受理论束缚，负载物释放可以追溯至PNP在溶酶体中的蛋白水解降解。带电的CD3ac降解产物的结构可能穿透脂质膜，并可导致溶酶体的破坏(21)。
示例性的材料和方法(实施例3-4)
储液：CD3ac的合成和纯化在针对实施例1-2的“示例性的材料和方法”中描述(参见，例如，Dittrich和Meier(2010)Macromolecular Bioscience10：1406)。简要来说，使用Fmoc保护基团化学在固相上合成肽、并使用梯度的乙腈和水在C18反相(RP)色谱材料上纯化。纯度通过RP-HPLC洗脱曲线的A280峰积分测定，其超过95％。通过在EtOH:H2O(1:1v/v)中溶解肽制得CD3ac储液。在EtOH:H2O:DMSO＝1:1:2的混合物中通过280nm处的吸收(ThermoScientific NanoDrop2000)测定浓度，ε280＝21780。以EtOH:H2O(1:1v/v)将肽浓度调整为742μM，并以200μL的等份在-80℃下保存备用。将Tfn-AF568(Invitrogen，T-23365)溶解为500μg/mL的浓度并在+4℃保存。将Flutax-2(Invitrogen，P22310)在H2O:EtOH(1:1)中溶解至40μM的浓度，并在-80℃保存。
粒子组装、装载和冠形成：通过将CD3ac、Tfn-AF568和Flutax-2储液混合以组装PNP，在H2O:EtOH(1:1，v/v)中产生123μM CD3ac、6μMFlutax-2和10μg/mL Tfn-AF568的终浓度。通过第一稀释步骤(1:1，H2O)继以15min的平衡期进行乳化，随后通过第二稀释步骤(1:1，H2O)将乙醇含量进一步减少至25％。将所得悬浮液的50μL等份加样至24孔坐滴结晶板(Hampton Research，Cryschem)，并在6小时内对1mL H2O反蒸发3次。
细胞培养实验：在添加10％胎牛血清(Gibco)的F12:DMEM＝1:1(Cellgro，10-090)中培养CHO细胞系。在24孔板(Falcon，353047)中的盖玻片(VWR，89015-724)上接种0.5mL培养基中的2×104个细胞，并培养16小时。以PBS洗涤细胞1次并在Ham’s F12培养基(Cellgro，10-080)中再培养30min，随后加入在250μL F12中的50μL纳米粒子(NP)溶液(如前文制备)。因此，细胞孵育中使用的CD3ac的浓度对应于8.3μg/mL，忽略缔合的Flutax-2与和Tfn-AF568的重量。在竞争分析中，在含有17μM Tfn(Sigma，T1283)的F12培养基中将细胞预孵育30min，随后加入含有17μMTfn的250μL F12中的50μL PNP溶液。样品在PBS中以3％多聚甲醛(Sigma，P6148)固定，使用荧光封固剂(fluorescent mounting medium，Dako，S3023)将其封于载玻片上，并在24小时内进行分析。
荧光测定：荧光实验使用BMG FLUOstar Omega酶标仪在黑色384孔板(MP100-1，Matrical)上进行。在H2O:DMSO:FBS＝6:3:1(V:V:V)中对Tfn-AF568和Flutax-2系列稀释液进行测量，并对数据点进行线性拟合。
表4：由数据线性回归确定的示例性参数
为了测定Flutax-2的封装效率，遵循前述方案在固定浓度的Tfn-AF568(10μg/mL)和变化量的Flutax-2(1.6μM、4μM、8μM、12.5μM和16μM)存在下组装PNP。在结晶板中组装后(见上文)，以H2O将PNP样品标准化至100μL，并以16,000g离心1小时，随后将80μL上清液部分与沉淀部分分离。将两个部分均在H2O:DMSO:FBS＝6:3:1(v:v:v)中标准化至133.3μL，随后将120μL加至多孔板中并测定荧光强度。
透射电子显微镜：按前述方法制备PNP样品。将5μL悬浮在水中的PNP加至碳膜包被的铜网(400方孔网，Electron Microscopy Sciences)上并干燥。在1分钟内使用10μL1％醋酸铀对样品进行染色。使用滤纸除去多余的染色剂，随后施加至Tecnai G2SpiritBioTWIN。
显微镜分析：使用配有60×Plan Apo NA1.4物镜镜头的Nikon Ti倒置显微镜对固定的细胞进行分析。DAPI荧光以360/40滤光片激发并使用460/50发射滤光片收集。OregonGreen荧光以360/40激发并使用480/40发射滤光片收集。AF568荧光以545/30激发并使用620/60发射滤光片收集。利用以MetaMorph7软件控制的Hamamatsu ORCA R2制冷CCD相机获取图像。使用ImageJ软件对显示的图像的伽玛值、亮度和对比度进行调整(对于所比较的图像组而言是相同的)。使用Prior Proscan II聚焦马达，以0.25微米的步长收集由载玻片至最高可检测的PNP的z-系列光学截面。1小时和6小时的PNP孵育后观察到的样品(叠加)为AF568和Oregon Green(OG)通道的最大栈投影(maximum stack-projections)。通过OregonGreen荧光的平均投影和AF-568栈的最大投影，获得24小时后观察到的样品。使用OG的平均投影对胞质液中Flutax-2荧光的差异进行定量。在DIC图像中手动圈出细胞周长。通过ImageJ(v.1.43u)在public class Maximum Finder中使用噪声耐量50来提取荧光点的最大值。
实施例5.用一个或多个实施方式的CD3ac纳米粒子将诺考达唑递送入HeLa细胞
图16A示出了CD3ac纳米粒子的一个实施方式，其中，EGF(为了可视化目的，任选地以Texas red标记)是靶向细胞的配体。如图16B所示，此类具有配体EGF的CD3ac纳米粒子能够被细胞摄取。为了制备封装有诺考达唑的CD3ac珠，在一些实施方式中，将21μM CD3ac、2μg/mL EGF(为了可视化目的，以Texas Red标记)和20-40μM诺考达唑溶解于有机溶剂中(图17A或图17G)。以水进行的溶剂交换可使得形成乳液并从而形成含有诺考达唑和EGF的CD3ac固体纳米粒子。在一些实施方式中，EGF的至少一部分被封装入CD3ac珠中。另外，EGF可以吸附在CD3ac珠的外表面上，从而形成EGF官能化的CD3ac珠。
在含有封装有两种不同浓度诺考达唑(20μM或40μM)的此类CD3ac粒子的培养基中孵育HeLa细胞后，荧光显微图像(图17B-图17F和图17H-图17K)显示EGF官能化的CD3ac粒子被HeLa细胞摄取，并且在以EGF官能化的CD3ac粒子处理过的HeLa细胞中的微管在很大程度上解聚。然而，以预孵育并离心的CD3ac悬浮液的上清液处理的HeLa细胞仍含有完整的微管。这表明，诺考达唑可由EGF官能化的CD3ac粒子递送至细胞中。
不希望受理论束缚，由细胞结合并摄取珠的过程可通过吸附在CD3ac粒子表面上的EGF与存在于HeLa细胞表面上的EGFR的相互作用而发生。
实施例6.靶向IgG的CD3ac纳米粒子
靶向IgG的CD3ac纳米粒子可以遵循如本文所述的一步法制备。图18A显示了IgG抗体(例如但不限于，抗转铁蛋白IgG或抗兔IgG)可由CD3ac纳米粒子携带(taken up)。另外，如图18B所示，抗转铁蛋白IgG官能化的CD3ac纳米粒子与转铁蛋白A-546的孵育产生了荧光信号(由白点表示)，表明IgG存在于CD3ac纳米粒子表面，并使得IgG可与转铁蛋白A-546结合。类似地，抗转铁蛋白IgG官能化的CD3ac纳米粒子与二抗(例如，如果抗转铁蛋白IgG是在兔中产生的话，可使用抗兔IgG)的孵育也使得存在于CD3ac纳米粒子表面上的IgG与所述二抗结合(在图18C中由白点表示)。IgG在纳米粒子界面处的取向可能是各向同性(“随机”)的，例如，对于二抗的抗原结合位点和/或表位是暴露的和可接触的。
实施例7.通过肽粒子(例如，CD3肽粒子或者包含CD3ac肽和CD3肽的混合肽粒子)递送核酸分子(例如，DNA或RNA)
可通过i)带电以及ii)稳定的肽粒子完成DNA/siRNA转染。尽管CD3ac粒子(表3中所示的肽序列)不溶于水，然而其通常不带电，因此不太可能结合至核酸分子(例如，DNA或RNA，包括但不限于siRNA)。CD3肽(表3中所示的肽序列)包含4个可带电或被乙酰化的伯胺(3个赖氨酸+1个N-末端)。
为了评价使用CD3肽的细胞转染效率，将Hela细胞与CD3肽(具有表3中所示的肽序列)和阴离子型的核酸分子(例如，单链DNA)的混合物孵育，所述CD3肽和核酸分子两者以约3.7:1(CD3:ssDNA)的摩尔比溶解在细胞培养基中。为了容易地对细胞中存在的ssDNA进行可视化，以可检测的标记(例如，Alexa Fluor488；AF488)对加入细胞培养基中的一部分ssDNA进行标记。如图19A-图19B所示，CD3肽在细胞培养基中的存在导致与对照相比(图19B)，荧光在胞质液中增加(图19A)。因此，与无本文所述的带正电的两亲性肽(例如，CD3肽)存在时的细胞转染相比，本文所述的带正电的两亲性肽(例如，CD3肽)和阴离子型的核酸分子(例如，DNA或RNA，包括但不限于siRNA)的混合物可提高核酸分子转染细胞的效率。不希望受理论约束，由于本文所述的肽(例如，CD3肽)具有两亲性结构和阳离子头基(headgroup)，因此可将本文所述的一些实施方式的两亲性肽(例如，CD3肽)用作细胞穿透肽或细胞转染试剂。
接下来致力于确定在核酸分子存在下未乙酰化的两亲性肽(例如，CD3肽)是否能够自组装而形成含有核酸的肽粒子。为此，在琼脂糖中对CD3肽、ssDNA和转铁蛋白的混合物进行电泳(因为任何形成的肽粒子将过大而无法迁移通过琼脂糖凝胶)。对混合物中的一些ssDNA进行标记以将其在琼脂糖凝胶中的运动可视化，同时将标记的转铁蛋白(例如，AF568-Tfn)加入肽-核酸混合物中以监测肽粒子的存在。(如先前在实施例3-实施例6中所述，加入肽混合物中的配体(例如，转铁蛋白)通常在肽粒子的外表面上形成)。如图20A所示，在电泳约40min后，位于琼脂糖凝胶加样区的Tfn-AF568信号与ssDNA-AF488信号的共定位表明肽粒子由包含CD3肽和核酸分子(例如，AF488-ssDNA)的混合物形成，并因而无法在一段时间后迁移入琼脂糖凝胶中，而其它过量的蛋白分子(例如，ssDNA和Tfn)则向阳极迁移。
也对未乙酰化的两亲性肽(例如，CD3肽)与核酸分子(例如，ssDNA)的共沉淀效率进行了评估和定量，例如，通过HP-WAX(弱阴离子交换)色谱法进行。例如，将CD3肽和ssDNA共沉淀以形成含有ssDNA的肽粒子，随后离心分离上清液和沉淀，随后将两者应用至HP-WAX色谱仪。如图20B所示，与上清液中的量相比，大多数CD3肽和ssDNA均在肽粒子沉淀中检出，表明通过共沉淀方法形成含有ssDNA的肽粒子是高效的。
应当注意的是，CD3肽和核酸分子的混合物可以在纯水中自组装形成稳定粒子，然而，所述粒子响应于增加的盐强度和较高的温度，一般不稳定并溶解。
不受限制地，存在两种降低含有核酸(例如，DNA或RNA，包括siRNA)的肽纳米粒子的溶解度的示例性方法。例如，第一种方法在粒子组装中可引入完全乙酰化的肽(例如，具有如表3中示出的肽序列的CD3ac)和部分乙酰化和/或未乙酰化的肽(例如，具有如表3中示出的肽序列的CD3)的混合物。尽管CD3可溶于水，其仍可以与CD3ac共沉淀。因此，可容易地对肽纳米粒子的净电荷进行调节，例如，通过控制部分乙酰化和/或未乙酰化的肽(例如，CD3)和完全乙酰化的肽(例如，CD3ac)的浓度比或摩尔比来调节。通过仅作为示例的方式，更多的CD3ac可增加粒子稳定性，而更多的CD3(由于其带有净电荷)可产生更高的siRNA/DNA负载能力以及更高的穿透细胞膜的潜能。本领域技术人员能够确定混合肽纳米粒子中CD3与CD3ac的最佳比例，以用于特定应用，例如，siRNA或DNA递送。在一些实施方式中，混合肽纳米粒子中存在的部分乙酰化和/或未乙酰化的肽(例如，CD3)的范围可以为5mole％至50mole％。在一些实施方式中，混合肽纳米粒子中存在的完全乙酰化的肽(例如，CD3ac)的范围可以为50mole％至95mole％。在各种实施方式中，所述部分乙酰化和/或未乙酰化的肽(例如，CD3)与完全乙酰化的肽(例如，CD3ac)的浓度比或摩尔比的范围可以为约1:100至约50:1、或约1:50至约10:1、或约1:20至约1:1。
因此，在一些实施方式中，可将完全乙酰化的两亲性肽(例如，CD3ac肽)、部分乙酰化或未乙酰化的两亲性肽(例如，CD3肽)和核酸分子的混合物制成稳定的、含有核酸分子(例如，DNA或RNA，包括siRNA)的肽粒子。例如，为证明在生理条件下形成了稳定的含有核酸的肽粒子，以约11:1.8:1(CD3ac:CD3:ssDNA)的摩尔比将CD3ac肽加至CD3肽和单链DNA(ssDNA)的混合物中。确定了CD3ac肽的存在在生理条件下稳定了含有ssDNA的肽粒子。全部三种组分共沉淀所形成的含有ssDNA的肽粒子在相应的盐强度下稳定。
在一些实施方式中，也可将配体(例如，转铁蛋白)加入含有完全乙酰化的两亲性肽(例如，CD3ac肽)、部分乙酰化或未乙酰化的两亲性肽(例如，CD3肽)和核酸分子(例如，DNA或RNA，包括siRNA)的混合物中，从而形成含有核酸的稳定肽粒子，该肽粒子针对所述配体结合的蛋白(参见例如实施例3-实施例6，关于本文所述的一些实施方式的肽粒子在靶向递送活性试剂中的用途)。例如，将转铁蛋白(以AF568标记的Tfn，便于通过成像可视化)加入混合物中，以形成针对存在于细胞表面上的转铁蛋白受体的含有核酸的稳定肽粒子。如实施例3中所讨论的，所述配体(例如，Tfn)通常存在于所述肽粒子的外表面上。
为了确定含有核酸的肽粒子进入细胞的递送效率，将HeLa细胞与含有核酸的肽粒子(例如，由如前所述的CD3ac肽、CD3肽和ssDNA的混合物所形成的肽粒子)孵育。如前面所讨论的，为了便于通过成像可视化，以可检测的标记物(例如，AF488)标记所述混合物中的一些ssDNA。另外，加入Tfn-AF568以形成含有核酸的肽粒子，作为对形成的肽粒子进行可视化的手段。如图21所示，来自所形成的肽粒子的Tfn-AF568荧光信号与AF488-ssDNA荧光信号在胞质液中共定位，表明该含有ssDNA的肽粒子在生理条件下是稳定的且被递送至细胞(例如，Hela细胞)中。
接下来致力于确定含有核酸的肽粒子的净电荷对于其生理条件下(例如，在血清中)稳定性的影响。如以下表5中所示，通常在含有核酸的肽粒子的阳离子电荷与阴离子电荷的比接近于零(例如，约5至约0，或约3至约0)时形成稳定的肽粒子。所述电荷比可以通过阴离子核酸分子(例如，ssDNA)和本文所述的阳离子两亲性肽(例如，部分乙酰化或未乙酰化的两亲性肽，例如CD3)之间的摩尔比进行调整。不希望受理论约束，肽粒子的负的净电荷(例如，阳离子电荷与阴离子电荷的比小于1)可有助于防止粒子聚集。
不希望受理论约束，尽管含有核酸的肽粒子的净电荷可影响粒子在生理条件下的稳定性，然而完全乙酰化的两亲性肽(例如，CD3ac肽)相对于未乙酰化的两亲性肽(例如，CD3肽)的量也可有助于粒子的稳定性。例如，如前所讨论的，未乙酰化的两亲性肽(例如，CD3肽)和核酸分子的混合物可以自组装形成粒子；但是所述粒子响应于升高的盐强度和较高的温度通常不稳定并溶解。与此相反，由完全乙酰化的两亲性肽(例如，CD3ac肽)形成的肽粒子更为稳定。因此，提高完全乙酰化的两亲性肽(例如，CD3ac)与未乙酰化的两亲性肽(例如，CD3)的摩尔比，可提高所得到的肽粒子在生理条件下(例如，在血清中)的稳定性，这与表5中所示的数据相符。
表5.肽混合物中电荷比(或摩尔比)对所产生的肽粒子在血清中的稳定性的影响
降低含有DNA/siRNA的肽纳米粒子溶解性的第二种方法可以涉及定制合成可变乙酰化程度的单个肽，所述乙酰化程度例如从本文所述的两亲性肽中亲水性肽片段中的至少一个氨基被乙酰化直至本文所述的两亲性肽中亲水性肽片段中的全部氨基均被乙酰化而变化。通过仅作为示例的方式，可定制合成乙酰化程度在CD3至CD3ac之间的两亲性肽。例如，可定制合成(例如在N-末端)具有至少一个带电或未乙酰化的基团(包括至少两个带电或未乙酰化的基团或至少三个带电或未乙酰化的基团)的两亲性肽。在一个实施方式中，通过调节朝向(toward)其N-末端或位于其N-末端的电荷(例如乙酰化)来得到分子的两亲性质，可将两亲性肽设计为阳离子型(例如，用于siRNA或DNA递送)。例如，本文所述的两亲性肽的亲水性肽片段的至少一个氨基(例如，1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基，取决于亲水性肽片段中存在的氨基数目)可以保持未乙酰化；并且本文所述的两亲性肽的亲水性肽片段的至少一个氨基(例如，1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基，取决于亲水性肽片段中存在的氨基数目)可被乙酰化。在某些实施方式中，此类两亲性肽可包含如下氨基酸序列：H-LK(Ac)-LK(Ac)-LK(Ac)-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2。在一些实施方式中，所述两亲性肽可包含如下氨基酸序列：H-LK-LK(Ac)-LK(Ac)-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2。在替代的实施方式中，所述两亲性肽可包含如下氨基酸序列：H-LK-LK-LK(Ac)-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2。两亲性肽中乙酰化的氨基与未乙酰化的氨基之比可控制本文所述的两亲性肽的阳离子性和阴离子性。在一些实施方式中，两亲性肽中的乙酰化的氨基与未乙酰化的氨基的比可小于1、约为1或大于1。
实施例8.含有核酸的肽粒子(例如，CD3肽粒子或者包含CD3ac肽和CD3肽的混合肽粒子)的稳定性
在纯水中对含有核酸的CD3肽粒子的稳定性进行了表征。以下为示例性的CD3肽粒子制剂，其进一步包含核酸分子(例如，ssDNA)和配体(例如，转铁蛋白，Tfn)：
肽粒子配方1(CD3+ssDNA+Tfn)
21μM CD3(H-LK-LK-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2)4+
5.4μM(5‘-TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3‘)24-
0.24μM(AF488-5‘-TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3‘)24-
4.14μg/mL Tfn-AF565
为了评价由配方1形成的肽粒子(PNP1)在水中的稳定性，在约室温或在约37℃将肽粒子PNP1样品在含有水的Eppendorf管中振荡15min。随后将所述PNP1样品离心以沉降肽粒子，并收集上清液用于进一步分析。通过荧光强度测量并定量上清液中的Tfn-AF568浓度。如图22A所示，与在约室温相比，由在约37℃的温度下振荡的PNP1样品获得的上清液中检出了更高浓度的Tfn-AF568，这表明PNP1粒子在水中的稳定性是温度依赖性的，较多的PNP1粒子在较高温度下趋于解离，从而将更大量的Tfn-AF568释放入上清液。
还进行了PNP1在水中稳定性的时程研究。在约4℃或约37℃的温度下，在含有水的Eppendorf管中振荡PNP1粒子样品。在每个预先确定的时间点(如图22B中所示)，对PNP1样品进行离心以沉降肽粒子，并收集上清液用于进一步分析。通过荧光强度测量并定量上清液中的Tfn-AF568浓度。类似于图22A，图22B示出了PNP1粒子在水中的稳定性具有温度依赖性，并且PNP1粒子在较高温度下(例如，在高于4℃的温度下)趋于更快解离。
接下来致力于比较PNP1粒子和由如下所示的配方2形成的肽粒子(PNP2)在细胞培养基(例如，含有约10％血清)中的稳定性。
肽粒子配方2(CD3ac+CD3+ssDNA+Tfn)
123μMCD3ac(Ac-LK(Ac)-LK(Ac)-LK(Ac)-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2)
21μMCD3(H-LK-LK-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2)4+
5.4μM(5‘-TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3‘)24-
0.24μM(AF488-5‘-TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3‘)24-
4.14μg/mL Tfn-AF568
在约4℃和37℃的温度下，将HeLa细胞与PNP1粒子或PNP2粒子孵育约30分钟。由于HeLa细胞通常在约37℃(而不会在约4℃)进行网格蛋白介导的内吞作用，因此溶解在培养基中的任何Tfn-AF568都将被细胞内化。因此，在孵育后，用低聚甲醛固定细胞以用于成像，并检测荧光强度。如图22C的上侧子图所示，当细胞在约37℃与PNP1孵育时，在胞质液中检测到弥漫性且更强的Tfn-AF568荧光信号；相比之下，在约4℃孵育的细胞中检测到更多点状Tfn-AF568荧光。然而，如图22C的下侧子图所示，在与PNP2粒子孵育的细胞中并未观察到这一对比。相反，在PNP2粒子存在下，在约4℃和约37℃孵育的细胞中均观测到了点状且可比的Tfn-AF568荧光信号。这些结果表明，PNP1粒子在约37℃趋于解离，从而向培养基中释放Tfn-AF568，Tfn-AF568随后由细胞内化；而PNP2粒子在约37℃、在约30min内在血清(例如，约10％血清)中显得更加稳定，从而使大部分Tfn-AF568保留在PNP2粒子中和/或PNP2粒子的表面上。
将图22C中的细胞与图22D中所示的阴性对照(即，在ssDNA存在而不含CD3或CD3ac肽时孵育的细胞)进行比较，阴性对照中AF488-ssDNA的荧光强度显著低于与含有ssDNA的PNP1粒子或PNP2粒子孵育的细胞的荧光强度。这表明PNP1粒子或PNP2粒子可用于促进细胞转染，并将核酸分子(例如DNA或RNA)递送入细胞。应当指出的是，在约4℃，在PNP1粒子或PNP2粒子存在下孵育的细胞中也检出了AF488-ssDNA荧光。不希望受理论约束，尽管在约4℃时在PNP1粒子或PNP2粒子存在下的细胞转染不太可能是TfR(转铁蛋白受体)依赖性的，然而其可能是在如实施例7中所讨论的CD3肽的存在下，由穿过细胞膜的被动转运而致。
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为了所有目的，在本文中标明的所有专利与其它出版物以引用的方式明确并入本文。这些出版物仅仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请人可得的信息，并且不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。

Claims (19)

1.一种包含两亲性肽的肽粒子，所述两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，
其中，所述疏水性肽片段基本上由氨基酸序列(Trp-Leu)m-(Trp)n或(Leu-Trp)p-(Leu)q组成，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-5的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然；以及
其中，所述亲水性肽片段基本上由氨基酸序列(Lys)r组成，其中r为1-15的整数，并且
其中，所述肽粒子进一步包含用于结合并进入靶细胞的配体，所述配体吸附于所述肽粒子的外表面上形成冠。
2.如权利要求1所述的肽粒子，其中，所述亲水性肽片段的至少一个Lys残基或所述两亲性肽的N-末端氨基被乙酰化。
3.如权利要求1或2所述的肽粒子，其中，所述两亲性肽包含氨基酸序列(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中，X不存在或X为NH2。
4.如权利要求3所述的肽粒子，其中，至少一个L-Lys残基被乙酰化、和/或所述两亲性肽的N-末端氨基被乙酰化。
5.如权利要求1-4中任一项所述的肽粒子，其中，所述配体包括细胞表面受体的配体或抗体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的肽粒子，其中，所述肽粒子包含完全乙酰化的如权利要求1-5中任一项所述的两亲性肽和部分乙酰化的如权利要求1-5中任一项所述的两亲性肽的混合物；并任选地包含未乙酰化的如权利要求1-5中任一项所述的两亲性肽。
7.如权利要求1-6中任一项所述的肽粒子，所述肽粒子进一步包含活性试剂。
8.如权利要求7所述的肽粒子在靶向递送活性试剂中的用途。
9.包含带正电的两亲性肽的组合物作为细胞穿透试剂或转染试剂的用途，其中，所述带正电的两亲性肽包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，
其中，所述疏水性肽片段基本上由氨基酸序列(Trp-Leu)m-(Trp)n或(Leu-Trp)p-(Leu)q组成，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-5的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然；以及
其中，所述亲水性肽片段基本上由氨基酸序列(Lys)r组成，其中r为1-15的整数，并且
其中，所述两亲性肽的至少一个Lys残基或N-末端氨基未被乙酰化，
其中，所述组合物进一步包含核酸分子。
10.如权利要求9所述的用途，其中，所述两亲性肽的全部Lys残基和N-末端氨基均未被乙酰化。
11.如权利要求9或10所述的用途，其中，所述两亲性肽基本上由氨基酸序列(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X组成，其中，X不存在或X为NH2。
12.一种包含第一两亲性肽和第二两亲性肽的肽粒子，所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽各自独立地包含疏水性肽片段和亲水性肽片段，
其中，所述疏水性肽片段基本上由氨基酸序列(Trp-Leu)m-(Trp)n或(Leu-Trp)p-(Leu)q组成，其中，每个Trp为D-Trp或L-Trp、且每个Leu为D-Leu或L-Leu，m和p独立地为1-5的整数、且n和q独立地为0或1，只要当Trp为D-Trp时Leu就为L-Leu、且当Trp为L-Trp时Leu就为D-Leu，或反之亦然；以及
其中，所述亲水性肽片段基本上由氨基酸序列(Lys)r组成，其中r为1-15的整数，并且
其中，所述第一两亲性肽的N-末端氨基和全部Lys残基均被乙酰化；以及
其中，所述第二两亲性肽的至少N-末端氨基或一个Lys残基未被乙酰化。
13.如权利要求12所述的肽粒子，其中，所述第二两亲性肽的N-末端氨基和Lys残基均未被乙酰化。
14.如权利要求12或13所述的肽粒子，所述肽粒子进一步包含活性试剂。
15.如权利要求14所述的肽粒子，其中，所述活性试剂包含核酸分子。
16.如权利要求12-15中任一项所述的肽粒子，所述肽粒子进一步在其外表面上包含配体。
17.如权利要求12-16中任一项所述的肽粒子，其中，所述第一两亲性肽和所述第二两亲性肽各自独立地包含氨基酸序列(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X，其中，X不存在或X为NH2。
18.如权利要求12-17中任一项所述的肽粒子在将核酸分子递送至细胞中的用途。
19.如权利要求18所述的用途，其中，所述核酸分子包括siRNA、miRNA、shRNA、DNA，或以上核酸分子的任意组合。
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