ES2610779T3 - Nanopartículas de péptidos y usos de las mismas - Google Patents

Nanopartículas de péptidos y usos de las mismas Download PDF

Info

Publication number
ES2610779T3
ES2610779T3 ES12756593.5T ES12756593T ES2610779T3 ES 2610779 T3 ES2610779 T3 ES 2610779T3 ES 12756593 T ES12756593 T ES 12756593T ES 2610779 T3 ES2610779 T3 ES 2610779T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
peptide
trp
leu
lys
amphiphilic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12756593.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Christian Dittrich
Gaudenz Danuser
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harvard College
Original Assignee
Harvard College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harvard College filed Critical Harvard College
Application granted granted Critical
Publication of ES2610779T3 publication Critical patent/ES2610779T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4816—Wall or shell material
    • A61K9/4825—Proteins, e.g. gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]

Abstract

Una partícula de péptidos que comprende un péptido anfifílico, comprendiendo el péptido anfifílico un segmento de peptidilo hidrófobo y un segmento de peptidilo hidrófilo, en la que el segmento de peptidilo hidrófobo consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de (Trp- Leu)m-(Trp)n o (Leu-Trp)p-(Leu)q, en las que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L-Leu, m y p son independientemente un número entero de 1 a 5 y n y q son independientemente 0 o 1, a condición de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu, y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa; y en la que el segmento de peptidilo hidrófilo consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos de (Lys)r, en la que r es un número entero de 1 a 15, y en la que la partícula de péptidos comprende adicionalmente en su superficie exterior un ligando para la unión a una célula diana.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Nanoparffculas de peptidos y usos de las mismas Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio a tenor de 35 U.S.C §119(e) de la Solicitud Provisional de los EE.UU. N.° 61/526.526, presentada el 23 de agosto de 2011.
Campo tecnico
La presente invencion se refiere a peptidos anfifflicos y parffculas que comprenden los peptidos anfifflicos. Antecedentes
Las nanoparffculas son utiles en la estabilizacion y la entrega de medicamentos: mejoran la solubilidad, prolongan el peffodo de validez, reducen los efectos secundarios y mantienen la exposicion al farmaco para un efecto terapeutico prolongado. La matriz utilizada para la entrega dirigida de farmacos por lo general se compone de ffpidos, poffmeros o metales y se ensamblan en vesmulas, micelas o parffculas. Vease Torchilin V. (2006) Adv Drug Deliv. 58:1532; Stark W (2011) Angew Chem Int Ed. 50: 1242; Soussan E et al. (2009) ACIE. 48: 274. Las principales variables de parffcula independientes que determinan la aplicabilidad in vivo incluyen el tamano, la carga superficial y la dispersabilidad, que se rige principalmente por el efecto hidrofobo. Nel A et al. (2009) Nat Matter. 8: 543. A diferencia de estos velffculos clasicos, es extremadamente diffcil disenar un sistema de entrega coloidal exclusivamente a partir de aminoacidos, principalmente debido a problemas de solubilidad de los peptidos hidrofobos cortos.
La disolucion de peptidos hidrofobos es tediosa y por tanto a menudo requiere protocolos elaborados de adicion de disolvente [14]. A pesar de todos los esfuerzos, muchos peptidos hidrofobos no son solubles en absoluto y por tanto son diffciles de sintetizar mediante qmmica del grupo de proteccion Fmoc o Boc: la precipitacion del peptido en la fase solida durante la smtesis conduce a pequenos rendimientos y cantidades predominantes de subproductos.
Sin embargo, una matriz de parffculas compuesta de peptidos es deseable, ya que puede degradarse en aminoacidos individuales. Ademas, a diferencia de otros materiales de matriz, por ejemplo, poffmeros, los productos de la smtesis pepffdica pueden purificarse hasta el 98 %, evitando la polidispersidad molecular y, por tanto, problemas con la reproducibilidad de las propiedades fisicoqmmicas. Adicionalmente, las propiedades de la estructura pepffdica pueden modularse facilmente, por ejemplo, mediante la introduccion de mutaciones puntuales de aminoacidos. En consecuencia, todavfa existe una fuerte necesidad de obtener por ingenieffa un vefffculo de farmaco degradable, que pueda sintetizarse y purificarse en un proceso simple.
Dittrich y Meier desvelan la caracterizacion estructural y la encapsulacion de peptidos en nanoparffculas solidas (Macromolecular Bioscience, 10: 2010, 1406-1415). Collins et al. desvelan el autoensamblaje de peptidos en nanoparffculas esfericas para la entrega de los restos hidrofilos al citosol (ACS Nano, 4(5); 2010, 2856-2864). El documento WO2009/109428A2 desvela el autoensamblaje de las nanoparffculas de peptidos para su uso como vacunas.
Resumen
Varios aspectos y realizaciones proporcionados en el presente documento se refieren a peptidos anfifflicos, parffculas de peptidos que comprenden una o mas realizaciones de los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento y usos de los peptidos anfifflicos o las parffculas de peptidos que se describen en el presente documento. Las cargas netas de los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento pueden ajustarse mediante el control del numero de grupos cargados presentes en restos de aminoacidos de los peptidos anfifflicos, por ejemplo, mediante el enmascaramiento de uno o mas grupos amino cargados, por ejemplo, mediante acetilacion. Por tanto, los peptidos anfifflicos y las parffculas de peptidos que se describen en el presente documento pueden utilizarse como excipientes de entrega o vefffculos para diferentes tipos de principios activos, por ejemplo, moleculas cargadas o no cargadas o moleculas polares o no polares. Ademas, las parffculas de peptidos que se describen en el presente documento pueden ajustarse por sus solubilidades, por ejemplo, en una condicion fisiologica, mediante el control de las relaciones de dos o mas realizaciones de los peptidos anfifflicos presentes en las parffculas de peptidos. Por ejemplo, los peptidos anfifflicos totalmente enmascarados (por ejemplo, totalmente acetilados) pueden, en general, formar parffculas de peptidos insolubles, mientras que las parffculas formadas a partir de peptidos parcialmente enmascarados (por ejemplo, parcialmente acetilados) o no enmascarados (por ejemplo, no acetilados) tienen en general una solubilidad mayor que los peptidos anfifflicos totalmente enmascarados (por ejemplo, totalmente acetilados), por ejemplo, en una condicion fisiologica. Por tanto, en algunas realizaciones, la solubilidad de las parffculas de peptidos que se describen en el presente documento, por ejemplo, en una condicion fisiologica, puede controlarse mediante la formacion de las parffculas de peptidos con una mezcla de estos peptidos anfifflicos con solubilidades diferentes y variando sus cantidades en las parffculas de peptidos en consecuencia. Las parffculas de peptidos de la invencion y su uso de acuerdo con la invencion, se definen en las reivindicaciones.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Un aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un peptido anfifflico comprende un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptido hidrofilo. El inventor ha descubierto que mediante la modulacion de la hidrofilia del segmento hidrofilo, se puede controlar el tipo de parffcula formada mediante la autoagregacion de los peptidos anfiffficos.
En consecuencia, un aspecto de la divulgacion proporciona un peptido anfifflico que comprende un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo, en el que el segmento de peptidilo hidrofobo comprende una secuencia de 2 a 10 aminoacidos D y L alternos seleccionados entre alanina, valina, isoleucina, leucina (Leu), fenilalanina, tirosina o triptofano (Trp) y en el que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende aminoacidos cargados o no cargados pero polares o derivados de los mismos.
En ciertas realizaciones de este aspecto y todos los demas aspectos que se describen en el presente documento, el segmento de peptidilo hidrofobo puede comprender una secuencia de aminoacidos de (Trp-Leu)m-(Trp)n o (Leu- Trp)p-(Leu)q, en las que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L-Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 20 y n y q son independientemente 0 o 1, a condicion de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa.
En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofilo puede comprender al menos una carga presente ya sea en el extremo N o un resto de aminoacido. En dichas realizaciones, la al menos una carga puede ser ya sea una carga cationico o una anionica. En algunas realizaciones, la al menos una carga cationica puede estar en un resto de aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en Lys, Arg, His y cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, la al menos una carga anionica puede estar en un resto de aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp o Glu y cualquier combinacion de los mismos.
En realizaciones alternativas, el segmento de peptidilo hidrofilo puede comprender aminoacidos no cargados pero polares. En otras realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofilo puede comprender al menos una carga y al menos un aminoacido no cargado pero polar. En diversas realizaciones, el al menos un resto de aminoacido no cargado pero polar puede seleccionarse entre el grupo que consiste en Ser, Thr, Asn o Gln y cualquier combinacion de los mismos.
En realizaciones particulares de este aspecto y todos los demas aspectos que se describen en el presente documento, el segmento de peptidilo hidrofilo puede comprender una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, en la que r es un numero entero de 1 a 15. En algunas realizaciones, r puede ser un numero entero de 2 a 5. En algunas realizaciones, r puede ser igual a 3.
En algunas realizaciones de este aspecto y todos los demas aspectos que se describen en el presente documento, el segmento de peptidilo hidrofobo puede comprender un poffmero. En algunas realizaciones, el enlazador al segmento de peptidilo hidrofobo puede adaptarse para unirse de forma covalente al poffmero. En ciertas realizaciones, el poffmero puede ser un poffmero biocompatible y/o biodegradable. Los ejemplos del poffmero incluyen, pero no se limitan a, PEG, PGG, PEO, policaprolactona, acido polilactico, acido poliglicolico, polihidroxialcaboatos, dextranos, poliantffdridos, PLA-PGA, poliortoester, polifumarato, hidrogeles, cualesquier poffmeros reconocidos en la tecnica como biocompatibles y/o biodegradables y cualquier combinacion de los mismos.
En ciertas realizaciones de este aspecto y todos los demas aspectos que se describen en el presente documento, al menos un grupo amino en el peptido anfifflico puede enmascararse, por ejemplo, mediante acetilacion. En dichas realizaciones, el al menos un grupo amino puede ser un grupo amino del extremo N del peptido anfifflico. En otras realizaciones, el al menos un grupo amino puede estar en un resto de Lys del segmento de peptidilo hidrofilo.
En algunas realizaciones de este aspecto y todos los demas aspectos que se describen en el presente documento, todos los grupos amino en el segmento de peptidilo hidrofilo pueden enmascararse, por ejemplo, acetilarse. En otras realizaciones, el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico y al menos uno de los grupos amino en el segmento de peptidilo hidrofilo pueden enmascararse, por ejemplo, acetilarse. En otra realizacion mas, el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico y todos los grupos amino en el segmento de peptidilo hidrofilo pueden enmascararse, por ejemplo, acetilarse. En algunas realizaciones en las que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico y al menos uno (incluyendo al menos 2, al menos 3 o mas) de los restos de Lys del segmento de peptidilo hidrofilo estan enmascarados, por ejemplo, acetilados. En una realizacion en la que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico y todos los restos de Lys del segmento de peptidilo hidrofilo estan enmascarados, por ejemplo, acetilados.
En diversas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofobo puede estar unido al extremo C del segmento de peptidilo hidrofilo.
En ciertas realizaciones, Leu es D-Leu. En algunas realizaciones, Trp es L-Trp. En algunas realizaciones, Lys es L- Lys. En algunas realizaciones, m o p pueden ser, independientemente, entre 1 y 3. En una realizacion, m o p es 3.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En una realizacion, n o q es 1. En consecuencia, una realizacion del peptido anfifflico comprende la secuencia de aminoacidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp), en la que al menos uno de los restos de L-Lys esta acetilado.
En algunas realizaciones, el peptido anfifflico puede comprender la secuencia de aminoacidos de Ac-(L-Lys)-(L-Lys)- (L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp). En dichas realizaciones, al menos uno de los restos de L-Lys puede estar acetilado.
En otras realizaciones, el peptido anfifflico puede comprender la secuencia de aminoacidos de Ac-(L-Lys(Ac))-(L-Lys (Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X, en la que X esta ausente o es NH2.
El peptido anfifflico puede tener una secuencia de aminoacidos de cualquier longitud. En algunas realizaciones, el peptido anfifflico puede tener una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 restos de aminoacidos.
El segmento de peptidilo hidrofobo o el segmento de peptidilo hidrofilo del peptido anfifflico pueden modificarse. Por ejemplo, al menos uno de los segmentos de peptidilo hidrofobos o el segmento de peptidilo hidrofilo pueden comprender al menos una mutacion puntual. En diversas realizaciones, al menos un enlace amida de la cadena principal puede incluir un enlace de sustitucion amida. En otras realizaciones, el peptido anfifflico puede comprender al menos un p-aminoacido, Y-aminoacido o cualquier combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones, el peptido anfifflico comprende un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo, en el que el segmento de peptidilo hidrofobo comprende la secuencia de aminoacidos (AA11- AA12)b-(AA13)d, en la que AA11, AA12 y Aa13 son restos de aminoacidos hidrofobos seleccionados independientemente para cada aparicion, b es un numero entero de 1 a 20 y d es 0 o 1, a condicion de que AA11 y AA12 tengan la configuracion opuesta (es decir, D y L) y A12 y A13 tengan la configuracion opuesta (es decir, D y L); el segmento de peptidilo hidrofilo comprende uno o mas aminoacidos hidrofilos o derivados de los mismos; y el peptido anfifflico esta enmascarado parcial o totalmente.
En algunas realizaciones, un peptido anfifflico comprende la secuencia de aminoacidos (L-Lysy-((L-Trp)-(D-Leu))m- (L-Trp), en la que r' es un numero entero de 3-21 y m' es un numero entero de 3-20 y en la que al menos uno del grupo amino del extremo No un grupo amino de cadena lateral de al menos un resto de Lys esta conjugado con un grupo protector de nitrogeno o de amino.
El inventor ha descubierto que algunas realizaciones de los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento pueden tener capacidad de penetracion celular. Por tanto, en algunas realizaciones, los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento pueden utilizarse como agentes de penetracion y/o transfeccion celular. En estas realizaciones, los peptidos anfifflicos pueden disenarse para estar cargados positivamente. En consecuencia, se proporciona en el presente documento un uso de una composicion que comprende un peptido anfifflico cargado positivamente como agente de penetracion celular o agente de transfeccion, en el que el peptido anfifflico cargado positivamente comprende un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo. El segmento de peptidilo hidrofobo del peptido anfifflico cargado positivamente comprende una secuencia de aminoacidos de (Trp-Leu)m-(Trp)n o (Leu-Trp)p-(Leu)q, en los que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L-Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 5 y n y q son, independientemente, 0 o 1, a condicion de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa; mientras que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, en la que r es un numero entero de 1 a 15. Adicionalmente, en el peptido anfifflico cargado positivamente, al menos uno de los restos de Lys o el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico no estan acetilados. En algunas realizaciones, todos los restos de Lys y el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico cargado positivamente no estan acetilados.
En algunas realizaciones, el peptido anfifflico cargado positivamente puede comprender una secuencia de aminoacidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)=X, en la que X esta ausente o es NH2.
En algunas realizaciones, la composicion puede comprender adicionalmente una molecula de acido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que se entrega en una celula.
Adicionalmente, los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento tambien pueden utilizarse, ya sea solos o como parte de un sistema de entrega para entregar un compuesto de interes, por ejemplo, un principio activo, a una celula. El sistema de entrega puede ser un sistema de entrega dirigida. Los compuestos que se entregan pueden incluir agentes terapeuticos, agentes de diagnostico y cualquier combinacion de los mismos. En consecuencia, un aspecto de la divulgacion proporciona un metodo de uso de un peptido anfifflico como sistema de entrega, comprendiendo el metodo formar complejos de un principio activo con un peptido anfifflico y poner en contacto una celula con el complejo. En algunas realizaciones, el metodo puede utilizarse con fines terapeuticos o de diagnostico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En otro aspecto, la divulgacion proporciona partmulas que comprenden un peptido anfifflico que se describe en el presente documento. El inventor ha descubierto, entre otras cosas que las partmulas formadas por los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento difieren de las partmulas descritas en C. Dittrich, Tesis de doctorado, Universidad de Basilea, 2007. Como aclaracion, las partmulas fabricadas a partir de los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento son diferentes de las descritas en Dittrich (2007). Los peptidos que se describen en Dittrich (2007) no comprenden grupos amino enmascarados. Como tales, las partmulas formadas a partir de dichos peptidos son micelas, por ejemplo, partmulas huecas, y no partmulas solidas como se describe en el presente documento. En consecuencia, en ciertas realizaciones, las partmulas de peptidos que se describen en el presente documento no son micelas, por ejemplo, partmulas huecas. Dicho de otra manera, en ciertas realizaciones, las partmulas de peptidos que se describen en el presente documento son partmulas solidas.
En algunas realizaciones, la partmula que comprende un peptido anfifflico que se describe en el presente documento puede comprender ademas un ligando. En consecuencia, en una realizacion, una partmula de peptidos que se describe en el presente documento comprende un peptido anfifflico, el peptido anfifflico comprende un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo, en el que el segmento de peptidilo hidrofobo comprende una secuencia de aminoacidos de (Trp-Leu)m-(Trp)n o (Leu-Trp)p-(Leu)q, en la que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L-Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 5 y n y q son independientemente 0 o 1, a condicion de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu, y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa; y en el que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, en la que r es un numero entero de 1 a 15 y en la que la partmula de peptidos comprende ademas en su superficie exterior un ligando.
En una realizacion, el ligando puede ser un ligando de receptor de superficie celular o un anticuerpo. Los ligandos de receptor de superficie celular de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, transferrina, EGF, acido folico y cualquier combinacion de los mismos. En ciertas realizaciones, el ligando puede estar presente en una superficie exterior de la partmula. Por ejemplo, el ligando puede estar adsorbido en la superficie exterior de la partmula que se describe en el presente documento. En realizaciones alternativas, el ligando puede ser unido covalentemente al peptido anfifflico. En una realizacion, el ligando esta unido covalentemente al segmento de peptidilo hidrofilo del peptido anfifflico.
El espesor del ligando presente en la superficie exterior de la partmula que se describe en el presente documento depende, en parte, del tamano de la molecula de ligando. En algunas realizaciones, el espesor del ligando presente en la superficie exterior de la partmula puede variar de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm. En una realizacion, el espesor del ligando presente en la superficie exterior de la partmula es de aproximadamente 10 nm. En algunas realizaciones, una relacion del ligando a los peptidos anfifflicos puede variar de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:1000000.
El ligando presente en la partmula de peptidos puede seleccionarse basandose en tipos de dianas (por ejemplo, pero no limitadas a, celulas, bacterias, protemas y/o acidos nucleicos) a las que se entregaran las partmulas de peptidos. Por ejemplo, para facilitar la entrega de una partmula de peptidos que se describe en el presente documento a una celula, puede seleccionarse un ligando espedfico para el receptor de la superficie celular. Por tanto, algunas realizaciones de las partmulas de peptidos que se describen en el presente documento pueden utilizarse para la entrega dirigida de un principio activo usando las partmulas de peptidos como excipientes de entrega o vehmulos. En dichas realizaciones, las partmulas de peptidos pueden utilizarse para entregar a una celula un principio activo que es impermeable a las celulas cuando se entrega solo.
En consecuencia, en diversas realizaciones de este aspecto y todos los demas aspectos que se describen en el presente documento, la partmula de peptidos puede comprender uno o mas principios activos. En dichas realizaciones, el principio activo puede dispersarse dentro de la partmula. El principio activo puede no tener ninguna carga neta o una carga neta. En algunas realizaciones, el principio activo puede comprender al menos un grupo aromatico. Los ejemplos del principio activo incluyen, sin limitaciones, protemas, peptidos, antfgenos, anticuerpos o porciones de los mismos, moleculas similares a anticuerpos, enzimas, acidos nucleicos, aptameros, moleculas pequenas, antibioticos, agentes farmaceuticamente activos, agentes terapeuticos, agentes de contraste y cualquier combinacion de los mismos. En una realizacion, el principio activo es un agente farmaceuticamente activo o un agente terapeutico. En una realizacion, el principio activo es una molecula de acido nucleico, incluyendo, pero no limitada a, ARNip, miARN, ARNhc, ADN y cualquier combinacion de los mismos. En realizaciones particulares, la relacion del principio activo a los peptidos anfifflicos puede variar de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:100.000, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10.000, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:1000, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:100 o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10.
La partmula de peptidos de este aspecto y todos los demas aspectos que se describen en el presente documento puede ser de cualquier tamano. En algunas realizaciones, la partmula de peptidos puede tener un tamano de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 5000 nm. En algunas realizaciones, la partmula puede tener un tamano de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 150 nm.
En algunas realizaciones, la partmula de peptidos puede comprender una mezcla de peptidos anfifflicos totalmente enmascarados (por ejemplo, totalmente acetilados) y parcialmente enmascarados (por ejemplo, parcialmente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
acetilados) que se describen en el presente documento. En esas realizaciones, la relacion de los peptidos anfifflicos totalmente acetilado a los parcialmente enmascarados puede variar de aproximadamente 95:5 a aproximadamente 1:1. En ciertas realizaciones, la parffcula puede comprender adicionalmente peptidos anfifflicos no enmascarados (por ejemplo, no acetilados).
En consecuencia, tambien se proporciona en el presente documento una parffcula de peptidos mixta que comprende un peptido anfifflico totalmente acetilado y un peptido anfifflico parcialmente acetilado o no acetilado. En realizaciones espedficas, la parffcula de peptidos mixta comprende un primer peptido anfifflico y un segundo peptido anfifflico, en la que el primer y el segundo peptido anfifflico comprenden cada uno, independientemente, un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo, en la que el segmento de peptidilo hidrofobo comprende una secuencia de aminoacidos de (Trp-Leu)m-(Trp)n o (Leu-Trp)p-(Leu)q, en la que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L-Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 5 y n y q son independientemente 0 o 1, a condicion de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu, y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa; mientras que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, en la que r es un numero entero de 1 a 15. Adicionalmente, el grupo amino del extremo N y todos los restos de Lys de primer peptido anfifflico estan acetilados; mientras que al menos el grupo amino del extremo N o uno de los restos de Lys del segundo peptido anfifflico no estan acetilados. En algunas realizaciones, ningun grupo amino del extremo N ni los restos de Lys del segundo peptido anfifflico estan acetilados.
En realizaciones particulares, el primer y el segundo peptido anfifflico pueden comprender cada uno independientemente una secuencia de aminoacidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L- Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X, en la que X esta ausente o es NH2.
La relacion del primer peptido anfifflico al segundo peptido anfifflico puede variarse basandose en varios factores, por ejemplo, pero no limitados a, la solubilidad y/o estabilidad de la parffcula de peptidos deseable y/o propiedades del principio activo que se va a cargar en la misma. En algunas realizaciones, la relacion del primer peptido anfifflico al segundo peptido anfifflico puede estar en un intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1000:1. En otras realizaciones, la relacion del primer peptido anfifflico al segundo peptido anfifflico puede estar en un intervalo de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 100:1.
En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos mixta puede comprender ademas un principio activo que se describe en el presente documento. El principio activo puede estar presente en la parffcula de peptidos mixta en cualquier cantidad, por ejemplo, dependiendo de la capacidad de carga de la parffcula de peptidos y/o de la capacidad de union del primer o el segundo peptido anfifflico. En algunas realizaciones, la relacion del principio activo al segundo peptido anfifflico puede estar en un intervalo de aproximadamente 1:1000 a 1:1 o de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, la relacion del principio activo al segundo peptido anfifflico puede estar en un intervalo de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:2.
Sin desear quedar ligado a teoffa alguna, la presencia del segundo peptido anfifflico en la parffcula de peptidos mixta puede proporcionar una carga cationica para la union con moleculas de acido nucleico anionicas. Por tanto, en algunas realizaciones, el principio activo puede incluir una molecula de acido nucleico.
En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos mixta puede comprender adicionalmente en su superficie exterior un ligando. Como se ha descrito anteriormente, la seleccion de un ligando puede determinarse basandose en una molecula diana (por ejemplo, pero no limitada a, celulas, bacterias, protemas, acidos nucleicos) a la que se unen las parffculas de peptidos mixtas. Los ejemplos no limitantes de un ligando pueden incluir un ligando de receptor de superficie celular o una protema tal como un anticuerpo. En algunas realizaciones, el ligando puede unirse covalentemente a al menos uno del primer y el segundo peptido anfifflico, por ejemplo, el segmento de peptidilo hidrofilo de al menos uno del primer y el segundo peptido anfifflico.
La parffcula de peptidos mixta que se describe en el presente documento puede utilizarse para encapsular cualquier principio activo que se describe en el presente documento. En una realizacion espedfica, la parffcula de peptidos mixta puede utilizarse para encapsular una molecula de acido nucleico. Por tanto, un aspecto adicional de las invenciones proporciona el uso de una o mas realizaciones de la parffcula de peptidos mixta que comprende un primer peptido anfifflico y un segundo peptido anfifflico para la entrega de una molecula de acido nucleico a una celula. En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico puede incluir ARN (por ejemplo, pero no limitado a ARNip, miARN, ARNhc), ADN o cualesquier combinaciones de los mismos.
Tambien se proporcionan en el presente documento composiciones o kits para la fabricacion de una o mas realizaciones de una parffcula de peptidos o una parffcula de peptidos mixta. En algunas realizaciones, la composicion o kit puede comprender un peptido anfifflico que se describe en el presente documento. El peptido anfifflico proporcionado en la composicion o kit puede almacenarse en un recipiente. Dependiendo de la eleccion de un usuario de que se produzca una parffcula de peptidos o parffcula mixta que se describen en el presente documento, en algunas realizaciones, la composicion o kit puede comprender un primer peptido anfifflico y un segundo peptido anfifflico que se describen en el presente documento. El peptido anfifflico puede proporcionarse en polvo o polvo liofilizado. En algunas realizaciones, la composicion o kit puede comprender adicionalmente al menos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
un reactivo, por ejemplo, para la reconstitucion del peptido anfifflico en polvo, para la emulsion de una mezcla de conjuntos de partfculas o ambos. En algunas realizaciones, la composicion o kit puede comprender adicionalmente un ligando que se describe en el presente documento, por ejemplo, proporcionado en un recipiente separado. En algunas realizaciones, la composicion o kit puede comprender adicionalmente un principio activo que se encapsula en la partfcula de peptidos. El principio activo puede proporcionarse en un recipiente separado.
Breve descripcion de los dibujos
Las Figuras 1A-1B muestran los resultados de caracterizacion de CD3ac purificado de acuerdo con una o mas realizaciones de la invencion. La Figura 1A muestra un espectro de masas medido en un espectrometro de masas Orbitrap. La Figura 1B muestra perfiles de elucion superpuestos de HPLC-FI de CD3ac y el intermedio smtesis CD3 medidos por absorcion a 280 nm. La pureza del producto es superior al 95 % en ambos casos.
Las Figuras 2A-2C muestran imagenes de MEB de nanopartfculas de peptido CD3ac de acuerdo con una o mas realizaciones de la invencion. Las Figuras 2A-2B muestran imagenes de MEB de perlas de CD3ac liofilizado. La Figura 2C muestra una imagen de MEB de una perla de CD3ac, rota en el proceso de liofilizacion. La imagen revela la propiedad solida de los precipitados de peptidos.
Las Figuras 3A-3B muestran ajustes lineales de los resultados de dispersion de luz dinamica (DLS). Se determina que tanto la concentracion de partfculas (Figura 3A) como el angulo de deteccion (Figura 3B) influyen de forma diferente en las propiedades de difusion de las perlas de CD3ac en solucion acuosa.
La Figura 4 muestra un conjunto de espectros de dicrofsmo circular de los derivados de CD3ac CD1, CD2, CD3 y CD4. Los numeros mostrados son iguales al numero de restos de lisina unidos de forma N-terminal.
Las Figuras 5A-5B muestran los efectos de los aminoacidos L unicamente en las propiedades de las nanopartfculas de peptidos. La Figura 5A muestra una imagen de MEB de LCD3ac precipitado. No pudo observarse un ensamblaje esferico como se observa en las partfculas de CD3ac con LCD3ac precipitado. La Figura 5B muestra espectros de dicrofsmo circular de CD3 (lmea recta) y LCD3 (lmea discontinua), lo que indica las diferencias en la estructura secundaria debido a la quiralidad de los aminoacidos de leucina. LCD3 presenta caractensticas alfa-helicoidales.
Las Figuras 6A-6C muestran imagenes de microscopfa confocal de perlas de CD3ac coensambladas con rosa de bengala (RB), 5-carboxifluorescema (CF) o una mezcla de ambos. La Figura 6A muestra imagenes de microscopfa confocal de perlas de CD3ac coensambladas con RB. La Figura 6B muestra imagenes de microscopfa confocal de perlas de CD3ac coensambladas con CF. La Figura 6C muestra perlas de CD3ac cargadas con RB y CF, indicando la capacidad de las perlas de peptido para encapsular simultaneamente compuestos de alta y baja solubilidad en solucion acuosa. Como se muestra en las Figuras 6A-6C, las perlas de CD3ac que contienen Rb se observan como esferas individuales, mientras que las perlas que contienen exclusivamente CF tienden a agregarse. En las Figuras 6A-6C, paneles de la parte superior izquierda: emision de fluorescencia de RB; paneles de la parte inferior derecha: emision de fluorescencia de CF; paneles de la parte superior derecha: imagen de contraste de fase; y paneles de la parte inferior izquierda: co-localizacion de ambos canales fluorescentes. La anchura de un panel corresponde a 55 pm.
Las Figuras 7A-7B muestran la eficiencia de encapsulacion de la rosa de bengala (RB) en nanopartmulas de CD3ac. La Figura 7A muestra los resultados de la eficiencia de coprecipitacion de RB con CD3ac. El eje x describe la relacion de concentracion inicialmente disuelta de CD3ac a RB, antes del cambio del disolvente y el ensamblaje. Eje y izquierdo: composicion molar de precipitado (o). Eje y derecho: relacion molar de RB encapsulada a rB global (A). Como ejemplo, a una relacion inicial de RB:CD3ac = 1:4, aproximadamente el 15% en moles de las perlas consisten en RB y aproximadamente el 33% de la RB inicialmente disuelta se encapsulo en los ensamblajes. La Figura 7B muestra la absorcion de triptofano del sedimento (▲) y fracciones de sobrenadante (•) que contienen diferentes cantidades de RB, lo que indica que el ensamblaje de CD3ac no se ve afectado por concentraciones equimolares de carga de RB.
Las Figuras 8A-8I muestran los resultados de la caracterizacion de las partmulas de peptido CD3ac ensambladas en presencia de transferrina marcada con AF568 (Tfn-AF568) y Flutax-2 y transferrina (Tfn). Las Figuras 8A-8C muestran imagenes de microscopfa de fluorescencia de fluorescencia roja (Figura 8A) y verde (Figura 8B) de partmulas de peptidos antes de la tripsinizacion. La imagen fusionada (Figura 8C) muestra la distribucion de fluorescencia diferencial para Tfn-AF-568 (anillo) y Flutax-2 (distribuido equitativamente). Las Figuras 8D-8F muestran imagenes fluorescentes de la misma muestra despues de la tripsinizacion durante 6 horas. El anillo caractenstico de la fluorescencia de Tfn-AF-568 desaparecio (Figura 8D) y la intensidad de emision de Flutax-2 aumento en un factor de 13,5 (Figura 8E). Las Figuras 8G-8H muestran un perfil de nivel de gris promediado de n = 10 partmulas en el canal rojo (Figura 8G) y verde (Figura 8H) antes y despues de la tripsinizacion. La Figura 8I muestra un diagrama esquematico de partmulas de peptidos CD3ac con una corona de protemas (por ejemplo, Tfn-AF568) antes y despues de la tripsinizacion.
Las Figuras 9A-9D muestran los resultados de composiciones de Flutax-2 y Tfn-AF568 dentro de las nanopartmulas de peptido CD3ac. Las Figuras 9A y 9B muestran la composicion cuantificada de partmulas de peptidos autoensambladas con Tfn-AF568 (Figura 9A) y Flutax-2 (Figura 9B), respectivamente. El eje x describe la relacion de concentracion de Tfn-AF568 o Flutax-2 inicialmente disueltos a CD3ac (123 pM), antes del cambio del disolvente y el ensamblaje. Eje y izquierdo (sfmbolos abiertos): composicion molar de las nanopartmulas de peptidos (PNP, del ingles peptide nanoparticles). Eje y derecho (sfmbolos cerrados): relacion molar de Tfn-AF568 o Flutax-2 encapsulados a Tfn-AF568 o Flutax-2 globales. A modo de ejemplo en la Figura 9B, en una relacion inicial de Flutax-2:CD3ac = 0,1, aproximadamente el 7,5% en moles de un PNP consiste en Flutax-2 y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
aproximadamente el 80 % del Flutax-2 inicialmente disuelto se encapsulo. La eficiencia de encapsulacion uniforme de Flutax-2 de aproximadamente el 80 % corresponde a un coeficiente de particion logantmica de 5,25. La Figura 9C muestra la distribucion de la intensidad de fluorescencia de Tfn-AF568 de las PNP antes y despues de la competencia con Tfn. Las partmulas se ensamblaron en presencia de 10 pg/ml de Tfn-568 y la imagen se formo inmediatamente despues de la formacion. Las barras negras corresponden a la distribucion de intensidad de los puntos de fluorescencia resultantes. La distribucion representada por barras grises describe las intensidades de fluorescencia de las mismas PNP despues de un penodo de incubacion de 24 horas a 37 °C en presencia de 1360 pg/ml de Tfn. La Figura 9D muestra un grafico de datos acumulativos de distribucion de la intensidad de fluorescencia de Tfn-AF568 de las PNP antes y despues de la competencia con Tfn como se muestra en la Figura 9C.
Las Figuras 10A-10K muestran el control del diametro de las partmulas y la caracterizacion de la morfologfa de las nanopartmulas por MEB. Las Figuras 10A-10C muestran la fluorescencia de Tfn-AF568 sobre partmulas de peptidos ensamblados a partir de CD3ac 492 pM, 246 pM y 123 pM. Las barras de escala corresponden a 1 pm. La Figura 10D muestra tres perfiles de intensidad de fluorescencia superpuestos, cada uno de los cuales muestra los resultados promedio de 10 partmulas. Los resultados se representan por la media +/- la desviacion tfpica. La Figura 10E muestra una interpretacion esquematica de perfiles de intensidad que ilustran la relacion del tamano de partmula, la fluorescencia de la corona y la resolucion limitada de la microscopfa optica. Las Figuras 10F-101 muestran imagenes de MEB con tincion negativa de las partmulas de CD3ac ensambladas en ausencia (Figura 10F-10G) y presencia (figuras, 10H-10I) de Tfn 10 pg/ml. Las muestras que contienen protema (por ejemplo, que contienen Tfn) muestras pueden distinguirse por una capa de contraste intermedio alrededor de las partmulas de peptidos. Los agujeros ocasionales (indicados por la flecha negro) fueron el resultado del vacm aplicado en la MEB y se ha descrito una observacion similar en Hyuk I. et al, (2005) Nat Matter 4: 671. Las Figuras 10J-10K muestran que el tamano de partmula final depende de la presencia de Tfn durante el ensamblaje. La formacion de partmulas en ausencia de Tfn-AF568 da como resultado un diametro medio de partmula de 100 nm (Figura 10J) donde la presencia de la protema durante el ensamblaje de las partmulas reduce el diametro a 51 nm (Figura 10K). El espesor de la corona de protema corresponde a 9,0 +/- 2,1 nm (recuadro de la Figura 10K).
Las Figuras 11A-11H muestran efectos de la competencia de Tfn sobre la union de PiVP^”*^568 a las celulas
cho. PNPl?'~AF^6s
1 iyi Flutax-2
se usa en el presente documento como un acronimo para las nanopartmulas de peptido
CD3ac autoensambladas en presencia de carga (por ejemplo, el Flutax-2 utilizado en el presente documento) y corona (por ejemplo, el Tfn-AF568 utilizado en el presente documento). Las Figuras 11A-11C muestran imagenes de microscopia de fluorescencia de celulas CHO incubadas con PiVP^”*^568 durante una hora. La
co-localizacion de puntos fluorescentes en el canal verde (Flutax-2) y el rojo (Tfn-AF568) indica la identidad de las particulas, que se acumulan en las celulas.
Las figuras 11D-11F muestran celulas CHO incubadas con PiVP^”^568 durante una hora en presencia de
Tfn 17 pM. La asociacion de PNP se reduce significativamente. Las barras de escala corresponden a 10 pm. La Figura 11G muestra el recuento promedio de nanopartmulas peptido (PNP) cuenta por celula (por ejemplo, CHO o TRVb). El valor para el control negativo (CN) corresponde a puntos falsos positivos de fluorescencia en las celulas CHO incubadas en ausencia de PiVP^”^568 Per° P°r 1° demas identicas concentraciones de Tfn-
AF568 y Flutax-2. Los resultados son la media +/- e.t.m., el doble asterisco indica P < 10'9, Kolmogorov-Smirnov. La Figura 11H muestra una serie de imagenes que muestran las celulas CHO despues de 1 hora de incubacion Las celulas de la fila superior y las celulas de la fila inferior se incubaron en ausencia y en
con
PAJDTfi>-AF56S rlyrFlutax-2
presencia de Tfn 17 pM, respectivamente. El area perfilada en un cuadrado blanco se aumenta en las Figuras 11A-11F. Las barras de escala corresponden a 20 pM.
Las Figuras 12A-12M muestran resultados experimentales de internalizacion de nanopartmulas. Las Figuras 12A-12D muestran imagenes de microscopia de fluorescencia de celulas CHO incubadas con P^PJt^m^568 durante 1 hora. La Figura 12E muestra distribuciones de fluorescencia de Flutax-2/Tfn-AF568 de
PAJDTfi>-AF56S rnr Flutax-2
(V/R) despues de 1 hora de incubacion de las celulas CHO conPiVP^J1^568
Las barras
grises representan V/R en el portaobjetos de vidrio, las barras negras corresponden a V/R encontrada dentro del penmetro de la celula. La Figura 12F muestra el esquema de asociacion de las partmulas y la internalizacion despues de 1 hora. Las Figuras 12G-12J muestran imagenes de microscopia de fluorescencia de celulas CHO incubadas con PiVP^”^568 durante 6 horas, en las que el desplazamiento de las particulas hacia valores de
V/R mas altos sirve como un sustituto de la internalizacion de las particulas. La Figura 12K muestra que la distribucion de los valores de V/R se incremento significativamente despues de un penodo de incubacion mas largo (barras negras). Por el contrario, la distribucion de los valores de V/R en el portaobjetos de vidrio (barras grises) es estadfsticamente indistinguible de los valores de V/R de la misma subpoblacion despues de 1 hora. La Figura 12L muestra el esquema de asociacion de las particulas y la internalizacion despues de 6 horas. Para las particulas en los compartimentos lisosomicos, la corona se digiere proteolfticamente proporcionando una fluorescencia de Tfn-AF568 disminuida y una fluorescencia de Flutax-2 aumentada. La Figura 12M muestra
La fila superior muestra las celulas CHO incubadas
imagenes que indican el cambio de color dePiVP^J1^568
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
P^Pfhttax^^ durante 1 hora y contrasta con la fila inferior, donde la misma estirpe celular se incubo con PNPftoax*-!6* durante 6 horas. El area perfilada en un cuadrado blanco se aumenta en las Figuras 12A-12D y 12G-12J. Las barras de escala corresponden a 20 pm.
Las Figuras 13A-131 muestran la liberacion de la carga despues de la incubacion con PiVP^”*^568 durante 24
horas. Las Figuras 13A-13C muestran imagenes de microscopfa de fluorescencia de celulas CHO incubadas durante 24 horas con Flutax-2 67 nM y Tfn-AF568 0,09 pg/ml. Las Figuras 13D-13G muestran imagenes de fluorescencia de celulas CHO incubadas durante 24 horas con la misma cantidad de Flutax-2 y Tfn-AF568 autoensambladas con CD3ac para formarPiVP^”*^568 ■ La Figura 13H muestra la intensidad de fluorescencia
promedio de Flutax-2 dependiente de la celula lmea (CHO, TRVb) y la competencia con Tfn disuelto, sin marcar. El control negativo (CN) corresponde a la autofluorescencia celular en el canal verde. Los resultados son la media +/- e.t.m, un solo asterisco indica P < 0,01, el doble asterisco indica P < 10-9, Kolmogorov-Smirnov. Las barras de escala corresponden a 10 pm. La Figura 13I muestra imagenes de celulas CHO despues de 24 horas de incubacion con Flutax-2. Ambas muestras (la fila superior y la inferior) contienen Flutax-2 66,7 nM. La fila superior muestra un cultivo de celulas incubadas con Flutax-2 disuelto en el medio de cultivo celular, la fila inferior de la misma estirpe celular se incubada con Flutax-2 previamente autoensamblada enPiVP^”^568 • El
area perfilada en un cuadrado blanco se aumenta en las Figuras 13A-13G. Las barras de escala corresponden a 20 pm.
La Figura 14 muestra un conjunto de imagenes de microscopfa de fluorescencia de partfculas de peptidos (por ejemplo, CD3ac) ensambladas con Flutax-2 y Tfn-AF568. La fila superior muestra la muestra antes de la tripsinizacion. El canal rojo y el verde no son congruentes ya que las partfculas dispersas se mueven y hay un retardo de tiempo entre las imagenes provocado por el cambio de filtros de excitacion y emision. Partfculas identicas se establecen entre parentesis y se superponen en las Figuras 8A-8F. La fila inferior muestra la misma muestra despues de 6 horas de incubacion con tripsina. La corona roja desaparece y las partfculas restantes se adhieren a la superficie del cubreobjetos de vidrio.
Las Figuras 15A-15B muestran curvas de calibracion de fluorescencia de Tfn-AF568 (Figura 15A) y Flutax-2 (Figura 15B). Ambos medidos en una solucion de H2O al 60%, DMSO al 30%, FBS al 10%. El disolvente organico se requiere para disolver las nanopartfculas en la fraccion de sedimento y la presencia de FBS minimiza la adsorcion de analitos marcados a superficies de plastico, proporcionando la linealidad entre la concentracion de fluoroforo y la fluorescencia medida.
Las Figuras 16A-16B muestran una nanopartfcula de peptidos de acuerdo con una o mas realizaciones de la invencion. La Figura 16A muestra un diagrama esquematico de una partfcula de CD3ac funcionalizada con moleculas de EGF, que puede estar opcionalmente marcada con Rojo Texas (con fines de visualizacion). La Figura 16B es un conjunto de imagenes fluorescentes que muestran las partfculas CD3ac funcionalizadas con EGF captadas por las celulas.
Las Figuras 17A-17K muestran resultados experimentales de celulas (por ejemplo, celulas HeLa) tratadas con una realizacion de las nanopartfculas de peptido encapsuladas con nocodazol (que es un agente qmmico que puede despolimerizar los microtubulos y utilizarse como un agente antineoplasico). La Figura 17A muestra una representacion esquematica de cuatro condiciones experimentales diferentes, en la que PB1e representa nanopartfculas de CD3ac funcionalizadas con EGF encapsuladas con nocodazol 20 pM y los resultados experimentales se muestran en las Figuras 17B-17F. La Figura 17B muestra un conjunto de imagenes fluorescentes que muestran las estructuras de los microtubulos de las celulas despues de 1 hora de incubacion en las condiciones indicadas en la Figura 17A. Las senales fluorescentes rojas dentro de las celulas indican las nanopartfculas de PBle captadas por las celulas. La Figura 17C muestra un conjunto de imagenes fluorescentes que muestran nanopartfculas de PBle captadas por las celulas despues de diversos penodos de tiempo como se indica. Las Figuras 17D-17F muestran imagenes fluorescentes de estructuras microtubulares de celulas HeLa tratadas en diferentes condiciones como se indica. La Figura 17G muestra una representacion esquematica de cuatro condiciones experimentales diferentes, en la que PBle representa nanopartfculas de CD3ac funcionalizadas con EGF encapsuladas con nocodazol 40 pM y los resultados experimentales se muestran en las Figuras 17H-17K. Las Figuras 17H-17I muestran imagenes de las celulas despues de 4 horas de incubacion en condiciones diferentes como se indica. La Figura 17I muestra imagenes fluorescentes de estructuras microtubulares (indicadas en verde) de las celulas en diferentes condiciones. Las senales rojas dentro de las celulas indican las nanopartfculas de PB1e captadas por las celulas. Las Figuras 17J-17K muestra imagenes de las celulas despues de 24 horas de incubacion en condiciones diferentes como se indica. La Figura 17K muestra imagenes fluorescentes de estructuras microtubulares (indicadas en verde) de las celulas en diferentes condiciones. Las senales rojas dentro de las celulas indican las nanopartfculas de PB1e captadas por las celulas. Las Figuras 18A-18C muestran otra realizacion de las nanopartfculas de peptidos de acuerdo con la invencion, en la que las nanopartfculas de CD3ac estan funcionalizados con un anticuerpo. La Figura 18A muestra representaciones esquematicas de las nanopartfculas de CD3ac funcionalizadas con anticuerpos primarios o secundarios. La Figura 18B muestra que las nanopartfculas de CD3ac funcionalizadas con IgG de conejo anti- transferrina pueden unirse a la transferrina (marcada con A568) y por tanto se muestran como puntos brillantes en la derecha de la figura. La Figura 18C muestra que las nanopartfculas de CD3ac funcionalizados con IgG de conejo anti-transferrina pueden unirse a IgG anti-conejo (marcado con Alexa555) y por tanto se muestran como puntos brillantes en la derecha de la figura.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Las Figuras 19A-19B muestran imagenes fluorescentes de las nanoparffculas de peptido no acetiladas (CD3) para su uso como agente de transfeccion in vitro. La Figura 19A muestra que las parffculas de CD3 pueden usarse para entregar oligonucleotidos dentro de las celulas. La Figura 19B no muestra ninguna transfeccion celular con oligonucleotidos en ausencia de parffculas de CD3.
Las Figuras 20A-20B muestran la eficiencia de encapsulacion de oligonucleotidos en parffculas de peptidos no acetilados. La Figura 20A es un conjunto de imagenes en el transcurso del tiempo que muestran la migracion de oligonucleotidos y protemas a traves de un gel de agarosa durante la electroforesis. En la Figura 20A, la calle superior se cargo con una mezcla que contema peptidos CD3 -21 pm (H-LK-LK-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW- NH2)4+, ADNmc ~5,4 pM (5'-TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3')24', AF488-ADNmc ~0,24 pM (AF488-5'- TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3')24- y Tfn-AF568 ~4,14 ug/ml, mientras que la calle inferior (control) estaba cargada con una mezcla similar, pero sin peptidos CD3. Despues de la electroforesis de aproximadamente 40 min, el exceso de ADNmc y Tfn migraron a traves del gel de agarosa hacia el anodo, mientras que las parffculas de peptidos formadas en la zona de carga del gel de agarosa (como se evidencia por la co-localizacion de la senal de AF488 y la senal de fluorescencia de AF568) no eran capaces de migrar en el gel de agarosa debido a su mayor tamano. La Figura 20B es un conjunto de datos de cromatograffa HP-WAX (intercambio anionico debil) que muestran que la mayoffa de los peptidos CD3 y ADNmc se encapsularon en parffculas de peptidos (sedimento) y un poco permanecio en el sobrenadante. Maximo a ~1,5 min: peptidos CD3; Maximos a ~14,5 min y ~15 min: ADNmc separo y parcialmente hibridado, respectivamente.
La Figura 21 es una imagen microscopica fluorescente que muestra la captacion de parffculas de peptidos que contienen acido nucleico por las celulas HeLa. En esta realizacion, las parffculas de peptidos se forman a partir de una mezcla que comprende peptidos CD3, peptidos CD3ac, oligonucleotidos (por ejemplo, ADNmc) y transferrina. La co-localizacion de la senal de fluorescencia de ADNmc-AF488 con las parffculas de peptidos (como se indica por la fluorescencia de transferrina-AF568, donde la transferrina se forma en la superficie exterior de la parffcula) indica la estabilidad de las parffculas de peptidos en una condicion fisiologica y la capacidad de dichas parffculas de peptidos para entregar moleculas de acidos nucleicos u oligonucleotidos a las celulas.
Las Figuras 22A-22D muestran los datos de estabilidad de las parffculas de peptidos que contienen ADNmc en suero (por ejemplo, suero al ~10 %) y la eficiencia de la transfeccion celular usando las parffculas de peptidos. La Figura 22a muestra que la estabilidad de las parffculas PNP1 (parffculas de peptidos CD3 que contienen ADNmc) en agua depende de la temperatura y mas parffculas PNP1 tienden a disociarse a una temperatura mas alta. La Figura 22B muestra los datos de estabilidad para un estudio en el transcurso del tiempo de las parffculas PNP1 en agua, lo que indica que la estabilidad de las parffculas PNP1 en agua es dependiente de la temperatura y las parffculas PNP1 tienden a disociarse mas rapido a una temperatura superior, por ejemplo, a una temperatura mas alta que 4 °C. La Figura 22C es un conjunto de imagenes fluorescentes que muestra celulas HeLa incubadas en presencia de parffculas PNP1 o parffculas PNP2 (parffculas de peptidos CD3/CD3ac que contienen ADNmc) a temperaturas de aproximadamente 4 °C y aproximadamente 37 °C. Los paneles superiores de la Figura 22C muestran que se detecto una senal de fluorescencia de Tfn-AF568 difusa y mas fuerte en el citosol cuando las celulas se incubaron con las parffculas PNP1 a aproximadamente 37 °C, en comparacion con una fluorescencia de Tfn-AF568 mas punteada detectada en las celulas incubadas a aproximadamente 4 °C. Sin embargo, este contraste no se observo en las celulas incubadas con las parffculas PNP2, como se muestra en los paneles inferiores de la Figura 22C. En lugar de ello, los paneles inferiores de la Figura 22C muestran que se observaron senales de fluorescencia de Tfn-AF568 punteados y comparables tanto en las celulas incubadas a aproximadamente 4°C como a aproximadamente 37 °C, en presencia de las parffculas PNP2. Estos resultados indican que las parffculas PNP1 tienden a disociarse en suero (por ejemplo, suero al ~10 %) a aproximadamente 37 °C; mientras que las parffculas PNP2 parecen ser mas estables en suero (por ejemplo, ~10% de suero) a aproximadamente 37 °C durante al menos aproximadamente 30 minutos. La Figura 22D es una imagen fluorescente de celulas de control negativo (es decir, celulas HeLa incubadas en presencia de ADNmc sin parffculas PNP1 o PNP2 o peptidos correspondientes), indicando que se observa una intensidad de fluorescencia de AF488-ADNmc mucho mas baja en el control negativo que la de las celulas incubadas con las parffculas PNP1 o PNP2.
Descripcion detallada de la invencion
Diversos aspectos y realizaciones proporcionados en el presente documento se refieren a peptidos anfifflicos, parffculas de peptidos que comprenden una o mas realizaciones de los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento y usos de los peptidos anfifflicos o parffculas de peptidos que se describen en el presente documento. Las cargas netas de los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento pueden ajustarse mediante el control del numero de grupos cargados presentes en restos de aminoacidos de los peptidos anfifflicos, por ejemplo, mediante el enmascaramiento de uno o mas grupos amino cargados, por ejemplo, mediante acetilacion. Por tanto, los peptidos anfifflicos y parffculas de peptidos que se describen en el presente documento pueden utilizarse como excipientes de entrega o vetffculos para diferentes tipos de principios activos, por ejemplo, moleculas cargadas o no cargadas o moleculas polares o no polares. Ademas, las parffculas de peptidos que se describen en el presente documento pueden ajustarse por sus solubilidades, por ejemplo, en una condicion fisiologica, mediante el control de las relaciones de dos o mas realizaciones de los peptidos anfifflicos presentes en las parffculas de peptidos. Por ejemplo, los peptidos anfifflicos totalmente enmascarados (por ejemplo, totalmente acetilados) en general pueden formar parffculas de peptidos insolubles, mientras que las parffculas formadas a partir
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
peptidos parcialmente enmascarados (por ejemplo, parcialmente acetilados) o no enmascarados (por ejemplo, no acetilados) en general tienen una solubilidad mayor (o menor estabilidad) que los peptidos anfifflicos completamente enmascarados (por ejemplo, totalmente acetilados), por ejemplo, en una condicion fisiologica. Por tanto, en algunas realizaciones, la solubilidad o la estabilidad de las parffculas de peptidos que se describen en el presente documento, por ejemplo, en una condicion fisiologica, pueden controlarse, por ejemplo, mediante la formacion de parffculas de peptidos con una mezcla de peptidos anfifflicos con solubilidades diferentes y variando sus cantidades en las parffculas de peptidos en consecuencia. En consecuencia, la versatilidad y la estabilidad de los peptidos anfifflicos y parffculas de peptidos que se describen en el presente documento pueden adaptarse para diversas aplicaciones, por ejemplo, la entrega de farmacos y/o la liberacion sostenida de un principio activo.
Por el termino "estabilidad" o "estable" utilizado en el presente documento se entiende una capacidad de una parffcula de peptidos de conservar su volumen original (por ejemplo, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o mas de su volumen original) durante un peffodo de tiempo, por ejemplo, al menos aproximadamente 30 minutos o mas (incluyendo al menos aproximadamente 1 hora, al menos aproximadamente 3 horas, al menos aproximadamente 6 horas, al menos aproximadamente 12 horas, al menos aproximadamente 24 horas o mas), en una condicion especificada, por ejemplo, una condicion fisiologica. La estabilidad de una parffcula de peptidos puede, en parte, estar gobernada por su solubilidad en una condicion especificada. Cuanto mas soluble es una parffcula de peptidos en una condicion especificada, menos estable es la parffcula de peptidos en la condicion especificada. En una realizacion, el termino "estabilidad" o "estable", como se usa en el presente documento, se refiere a una parffcula de peptidos que es insoluble en una condicion especificada, por ejemplo, en un medio acuoso a una temperatura especificada. En algunas realizaciones, el medio acuoso es agua. En algunas realizaciones, el medio acuoso es un medio fisiologico, por ejemplo, con una cierta concentracion de sal, pH y/o concentracion de protema/suero.
En un aspecto, se proporciona en el presente documento un peptido anfifflico que comprende un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptido hidrofilo. El inventor ha descubierto entre otras cosas que, mediante la modulacion de la hidrofilia de un resto de aminoacido hidrofilo de un peptido anfifflico, la anfifilia del peptido anfifflico puede modularse de manera que inesperadamente conduce al autoensamblaje de los peptidos en parffculas solidas. La anfifilia puede modularse mediante la conjugacion de un grupo hidrofilo con un aminoacido en el segmento de peptidilo hidrofilo o enmascarando un grupo hidrofilo en el segmento de peptidilo hidrofilo o enmascarando el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico. Por ejemplo, cuando el aminoacido hidrofilo es un aminoacido cargado, la hidrofilia puede modularse mediante la conjugacion de la parte cargada de la molecula con un grupo protector. En consecuencia, en algunas realizaciones, al menos un grupo amino en el peptido anfifflico se conjuga con un o grupo protector de nitrogeno o de amino.
En algunas realizaciones, el peptido anfifflico esta completamente enmascarado. Como se usa en el presente documento, un peptido totalmente enmascarado se refiere a un peptido anfifflico en el que el grupo amino del extremo N y todos los grupos amino de la cadena lateral en el segmento de peptidilo hidrofilo se conjugan con un grupo protector de nitrogeno o de amino.
En algunas realizaciones, el peptido anfifflico esta enmascarado parcialmente. Como se usa en el presente documento, un peptido parcialmente enmascarado se refiere a un peptido anfifflico en el que uno o mas de los grupos amino del extremo N o los grupos amino de la cadena lateral en el segmento de peptidilo hidrofilo no estan conjugados con un nitrogeno o grupo protector de amino; sin embargo, el peptido anfifflico aun comprende al menos un grupo amino conjugado con un grupo protector de nitrogeno o de amino.
Como se usa en el presente documento, un "grupo protector de nitrogeno" o un "grupo protector de amino" se refiere a restos que bloquean o enmascaran el grupo NH2. Los grupos protectores de amino de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, grupos protectores de carbamato, tales como 2-trimetilsililetoxicarbonilo (Teoc), 1-metil-1-(4- bifenilil)etoxicarbonilo (Bpoc), t-butoxicarbonilo (BOC), aliloxicarbonilo (Alloc), 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) y benciloxicarbonilo (Cbz); grupos protectores de amida, tales como formilo, acetilo, trihaloacetilo, benzoflo y nitrofenilacetilo; grupos protectores de sulfonamidas, tales como 2-nitrobencenosulfonilo; y grupos protectores de imina y dclicos de imida, tales como ftalimido y ditiasuccinoflo. Se describen otros grupos protectores de amino, asf como otros grupos protectores representativos, en Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Capffulo 2, 2a ed., John Wiley & Sons, Nueva York, 1991 y Oligonucleotides And Analogues A Practical Approach, Ekstein, F. Ed., IRL Press, NY, 1991.
En algunas realizaciones, el grupo protector de nitrogeno o de amino es acilo o alquilo, por ejemplo, acetilo, etanoflo, propionilo, t-butanoflo, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexanilo.
En algunas realizaciones, el grupo amino del extremo N de un peptido anfifflico se conjuga con un grupo protector de nitrogeno o de amino.
En algunas realizaciones, al menos un (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas) grupo amino de la cadena lateral de un aminoacido del peptido anfifflico se conjuga con un grupo protector de nitrogeno o de amino. El
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
aminoacido cuyo grupo amino de la cadena lateral ha de conjugarse puede estar presente en cualquier posicion en el peptido anfifflico. Los aminoacidos con la cadena lateral conjugada pueden estar presentes uno junto al otro o no estar uno junto al otro. Cuando tres o mas aminoacidos de cadena lateral conjugada estan presentes algunos de los aminoacidos de cadena lateral pueden estar presentes junto a otro aminoacido de cadena lateral conjugada mientras que algunos de los aminoacidos de cadena lateral conjugada no estan junto a otro aminoacido de cadena lateral conjugada. Ademas, cuando dos o mas grupos protectores de nitrogeno o de amino estan presentes, pueden ser todos iguales o todos diferentes o cualquier combinacion de los mismos y diferentes.
En algunas realizaciones, al menos un (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas) grupo amino de cadena lateral de un aminoacido en el segmento de peptidilo hidrofilo se conjuga con un grupo protector de nitrogeno o de amino. Sin limitaciones, el aminoacido de cadena lateral conjugada puede estar presente en cualquier posicion del segmento de peptidilo hidrofilo. Por ejemplo, leyendo desde el extremo N, en la posicion 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y asf sucesivamente del segmento de peptidilo hidrofilo.
En algunas realizaciones, el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico y al menos un grupo amino de cadena lateral (incluyendo, por ejemplo, al menos uno, al menos dos, al menos tres o mas grupos amino de cadena lateral) en el segmento de peptidilo hidrofilo del peptido anfifflico se conjuga con un grupo protector de nitrogeno o de amino. En algunas realizaciones, el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico y al menos un grupo amino de cadena lateral (incluyendo, por ejemplo, al menos uno, al menos dos, al menos tres o mas grupos amino de cadena lateral) en el segmento de peptidilo hidrofilo del peptido anfifflico esta acetilado.
En algunas realizaciones, el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico y todos los grupos amino de cadena lateral en el segmento de peptidilo hidrofilo del peptido anfifflico se conjugan con un grupo protector de nitrogeno o de amino. En algunas realizaciones, el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico y todos los grupos amino de cadena lateral en el segmento de peptidilo hidrofilo del peptido anfifflico estan acetilados.
Sin desear quedar ligado a teona alguna, la presencia de un grupo protector de nitrogeno o de amino en el peptido anfifflico modula la hidrofilia del peptido anfifflico. Por tanto, la naturaleza anfifflica del peptido anfifflico puede ajustarse mediante la variacion del numero de grupos protectores de nitrogeno o de amino en el peptido anfifflico.
El peptido anfifflico puede tener una secuencia de aminoacidos de cualquier longitud. En algunas realizaciones, el peptido anfifflico puede tener una longitud de aproximadamente 5 a 25 restos de aminoacidos. En una realizacion, el peptido anfifflico tiene una longitud de 10 restos de aminoacidos.
Segmento de peptidilo hidrofobo
Como se usa en el presente documento, la expresion "segmento de peptidilo hidrofobo" se refiere a un segmento de peptidilo que tiene un contenido relativamente alto de aminoacido hidrofobo. Por ejemplo, un segmento de peptidilo hidrofobo se refiere a un segmento de peptidilo, en el que al menos aproximadamente el 50 % o mas (incluyendo al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o mas) de los restos de aminoacidos son restos de aminoacidos hidrofobos. En una realizacion, un segmento de peptidilo hidrofobo es un segmento de peptidilo, en el que todos los aminoacidos son aminoacidos hidrofobos.
En consecuencia, en algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofobo comprende la secuencia de aminoacidos (AA11-AA12)b-(AA13)d, en la que AA11, AA12 y AA13 se seleccionan independientemente entre restos de aminoacidos hidrofobos para cada aparicion, b es un numero entero de 1 a 20 y d es 0 o 1, a condicion de que AA11 y AA12 tengan la configuracion (es decir, D y L) opuesta y A12 y A13 tengan la configuracion opuesta. Por ejemplo, si los aminoacidos representados por AA11 tienen la configuracion D entonces los aminoacidos representados por AA12 tienen la configuracion L y AA13, si esta presente, tiene la configuracion D. Como alternativa, si los aminoacidos representados por AA11 tienen la configuracion L entonces los aminoacidos representados por AA12 tienen la configuracion D y AA13, si esta presente, tiene la configuracion L.
En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofobo comprende una secuencia de 2 a 10 aminoacidos D y L alternos seleccionados entre el grupo que consiste en alanina, valina, isoleucina, leucina (Leu), fenilalanina, tirosina, triptofano (Trp) y cualesquier combinaciones de los mismos.
Como se usa en el presente documento, la expresion "aminoacido hidrofobo" se refiere a un aminoacido que muestra una hidrofobia mayor que cero de acuerdo con la escala de hidrofobia de consenso normalizada de Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179: 125-142 (1984). Los aminoacidos hidrofobos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp, Pro, Met, Gly y sus derivados.
En algunas realizaciones, un aminoacido hidrofobo es un aminoacido aromatico. Como se usa en el presente documento, la expresion "aminoacido aromatico" se refiere a un aminoacido hidrofobo con una cadena lateral que tiene al menos un anillo aromatico o heteroaromatico. El anillo aromatico o heteroaromatico puede contener uno o mas sustituyentes tales como -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO2, -NO, -NH2, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
C(O)OR, -C(O)NH2, -C(O)NHR, -C(O)NRR y similares donde cada R es independientemente alquilo (C1-C6), alquilo (C2-C6) sustituido, alquenilo (C2-C6), alquenilo (C2-C6) sustituido, alquinilo (C2-C6), alquinilo (C2-C6) sustituido, arilo (C5-C20), arilo (C5-C20) sustituido, alcarilo (C6-C26), alcarilo (C6-C26) sustituido, heteroarilo de 5-20 miembros, heteroarilo de 5-20 miembros sustituido, alquilheteroarilo de 6-26 miembros o alquilheteroarilo de 6-26 miembros sustituido. Los aminoacidos aromaticos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, Phe, Tyr y Trp.
En algunas realizaciones, un aminoacido hidrofobo es un aminoacido alifatico. Como se usa en el presente documento, la expresion "aminoacido alifatico" se refiere a un aminoacido hidrofobo que tiene una cadena lateral hidrocarbonada alifatica. Los aminoacidos alifaticos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, Ala, Val, Leu e Ile.
En algunas realizaciones, un aminoacido hidrofobo es un aminoacido no polar. Como se usa en el presente documento, la expresion "aminoacido no polar" se refiere a un aminoacido hidrofobo que tiene una cadena lateral que no esta cargada a pH fisiologico y que tiene enlaces en los que el par de electrones compartido en comun por dos atomos generalmente se sostiene equitativamente por cada uno de los dos atomos (es decir, la cadena lateral no es polar). Los aminoacidos no polares de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, Leu, Val, Ile, Met, Gly y Ala.
Como se apreciara por los expertos en la materia, las categonas de aminoacidos que se describen en el presente documento no son mutuamente excluyentes. Por tanto, las cadenas laterales de aminoacidos que presentan dos o mas propiedades fisicoqmmicas pueden incluirse en multiples categonas. Por ejemplo, las cadenas laterales de aminoacidos que tienen restos aromaticos que estan sustituidos adicionalmente con sustituyentes polares, tales como Tyr, pueden presentar tanto propiedades hidrofobas aromaticas como propiedades polares o hidrofilas y por tanto pueden incluirse tanto en las categonas de aromaticos como en la de polares. La categorizacion apropiada de cualquier aminoacido sera evidente para los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgacion detallada proporcionada en el presente documento.
En algunas realizaciones, para cada aparicion AA11, AA12 y AA13 se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en Pro, Ile, Phe, Val, Leu, Trp, Met, Ala, Gly, Tyr y cualquier combinacion de los mismos.
Sin limitacion, todos los AA11 y AA12 puede ser iguales, todos diferentes o cualquier combinacion de iguales y diferentes. En consecuencia, en algunas realizaciones, todos los AA11 son iguales. En algunas realizaciones, todos los AA12 son iguales. En algunas realizaciones, todos los AA11 son iguales, todos los AA12 son iguales y AA11 es diferente de AA12.
En algunas realizaciones, al menos uno de AA11, AA12 y AA13 no es Tyr o Leu.
En algunas realizaciones, al menos un AA11 no es Tyr.
En algunas realizaciones, al menos uno de AA12 no es Leu.
En algunas realizaciones, AA13 no es Tyr o Leu.
En algunas realizaciones, AA11 es Tyr.
En algunas realizaciones, AA12 es Leu.
En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofobo comprende una secuencia de aminoacidos (Trp-Leu)m- (Trp)n o (Leu-Trp)p-(Leu)q, en la que m y p son independientemente un numero entero de 3 a 20 y n y q son independientemente 0 o 1. Cada Trp puede ser D-Trp o L-Trp y cada Leu puede ser D-Leu o L-Leu. Cuando Trp es D-Trp, entonces Leu es L-Leu y cuando Trp es L-Trp, entonces Leu es D-Leu. De forma similar, cuando Leu es L- Leu, entonces Trp es D-Trp y cuando Leu es D-Leu, entonces Trp es L-Trp.
En alguna realizacion, m y p son independientemente un numero entero de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15. En algunas realizaciones, m y p son independientemente un entero de 1 a 5 (por ejemplo, un numero entero de 1, 2, 3, 4 o 5). En algunas realizaciones, m o p es un numero entero de 1, 2 o 3. En una realizacion, m o p es un numero entero de 3.
En una realizacion, el segmento de peptidilo hidrofobo comprende una secuencia de aminoacidos ((L-Trp)-(D-Leu))3- (L-Trp).
Segmento de peptidilo hidrofilo
Como se usa en el presente documento, la expresion "segmento de peptidilo hidrofilo" se refiere a un segmento de peptidilo que tiene propiedades de hidrofilia relativas a un resto hidrocarbonado. En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofilo se refiere a un segmento de peptidilo que tiene propiedades de hidrofilia en relacion con el segmento de peptidilo hidrofobo de un peptido anfifflico que se describe en el presente documento. En general, el segmento de peptidilo hidrofilo comprende al menos un aminoacido hidrofilo. Como se usa en el presente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
documento, la expresion "aminoacido hidrofilo" se refiere a un resto de aminoacido que muestra una hidrofobia menor que cero de acuerdo con la escala de hidrofobia de consenso normalizada de Eisenberg et al., J. Mol. Biol. 179: 125-142 (1984). Los aminoacidos hidrofilos ejemplo incluyen, pero no se limitan a Lys, Arg, His, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln y derivados de los mismos.
En algunas realizaciones, el aminoacido hidrofilo es un aminoacido cargado o no cargado. Como se usa en el presente documento, la expresion "aminoacido cargado" se refiere a un resto de aminoacido que tiene una carga neta. De acuerdo con ello, un aminoacido cargado puede ser un aminoacido cationico o un aminoacido anionico. Como se usa en el presente documento, la expresion "aminoacido no cargado" se refiere a un resto de aminoacido que no tiene carga neta. Un resto de aminoacido cargado puede modificarse a un aminoacido no cargado, mediante el enmascaramiento de la carga del aminoacido, por ejemplo, mediante la conjugacion de un grupo protector a un atomo que transporta carga. En una realizacion, un resto de aminoacido cargado puede modificarse en un aminoacido no cargado mediante acetilacion.
En algunas realizaciones, el aminoacido hidrofilo es un aminoacido polar. Como se usa en el presente documento, la expresion "aminoacido polar" se refiere a un aminoacido hidrofilo que tiene una cadena lateral que esta cargada o no cargada a pH fisiologico, pero que tiene al menos un enlace en el que el par de electrones compartidos en comun por dos atomos se sostiene mas estrechamente por uno de los atomos. Los aminoacidos polares de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, Asn, Gln, Ser, Thr y cualquier combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones, el aminoacido hidrofilo es un aminoacido polar cargado o no cargado.
En algunas realizaciones, el aminoacido hidrofilo es un aminoacido cationico. Como se usa en el presente documento, la expresion "aminoacido cationico" se refiere a un resto de aminoacido que comprende una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiologicas normales. Por tanto, la expresion "aminoacido cationico" incluye cualquier aminoacido de origen natural o mimetico que tiene por tanto una cadena lateral cargada positivamente en condiciones fisiologicas normales. En general, los restos de aminoacidos que comprenden un grupo amino en su cadena lateral variable se consideran como aminoacidos cationicos. Los aminoacidos cationicos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, lisina, histidina, arginina, hidroxilisina, ornitina y los respectivos derivados, analogos y configuraciones estereoisomericas de los mismos.
En algunas realizaciones, el aminoacido hidrofilo es un aminoacido anionico. Como se usa en el presente documento, la expresion "aminoacido anionico" se refiere a un aminoacido hidrofilo que tiene una carga negativa. Los aminoacidos anionicos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, Glu, Asp y derivados de los mismos.
En algunas realizaciones, el aminoacido hidrofilo es un aminoacido acido. Como se usa en el presente documento, la expresion "aminoacido acido" se refiere a un aminoacido hidrofilo que tiene un valor de pK de la cadena lateral de menos de 7. Los aminoacidos acidos normalmente tienen cadenas laterales cargadas negativamente a pH fisiologico debido a la perdida de un ion hidrogeno. Los aminoacidos acidos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, Glu, Asp y derivados de los mismos.
En algunas realizaciones, el aminoacido hidrofilo es un aminoacido basico. Como se usa en el presente documento; la expresion "aminoacido basico" se refiere a un aminoacido hidrofilo que tiene un valor de pK de la cadena lateral de mas de 7. Los aminoacidos basicos normalmente tienen cadenas laterales cargadas positivamente a pH fisiologico debido a la asociacion con el ion hidronio. Los aminoacidos basicos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, His, Arg, Lys y derivados de los mismos.
En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofilo comprende al menos un aminoacido cargado o al menos un aminoacido polar no cargado o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofilo comprende al menos un aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en Lys, Arg, His, Asp y Glu o al menos un aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en Ser, Thr, Asn y Gln o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofilo puede comprender un aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en Lys, Arg y His.
En algunas realizaciones, al menos un grupo amino en el segmento de peptidilo hidrofilo esta enmascarado o conjugado con un grupo protector de nitrogeno o de amino.
En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofilo comprende la secuencia de aminoacidos (AA21)f, en la que AA21 es un aminoacido hidrofilo seleccionado independientemente para cada caso y f es un numero entero de 1 a 21.
Sin limitaciones, todos los AA21 puede ser iguales, todos diferentes o cualquier combinacion de los mismos y diferentes.
En algunas realizaciones, f es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos (Lys)r, donde r es un numero entero de 1 a 15. En algunas realizaciones, r es un numero entero de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15. En algunas realizaciones, r es un numero entero de 2 a 5 (por ejemplo, r es un numero entero de 2, 3, 4 o 5). En una realizacion, r es un numero entero de 3.
En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys), (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys(Ac)), (L-Lys)-(L-Lys(Ac))-(L-Lys), (L- Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys), (L-Lys)-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac)), (L-Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys(Ac)), (L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L- Lys), L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac)), y cualquier combinacion de los mismos, donde "Ac" se refiere a la acetilacion del resto de aminoacido Lys.
En algunas realizaciones, el segmento de peptido hidrofilo incluye o es un poffmero hidrofilo. Como se usa en el presente documento, la expresion "poffmero hidrofilo" se refiere a un poffmero que tiene propiedades de hidrofilia relativas a un resto hidrocarbonado. En algunas realizaciones, la expresion "poffmero hidrofilo" se refiere a un poffmero que tiene propiedades de hidrofilia en relacion con el segmento de peptidilo hidrofobo de un peptido anfifflico que se describe en el presente documento. La hidrofilia de un poffmero puede determinarse, por ejemplo, mediante el ensayo ASTM D570. En general, los poffmeros hidrofilos son hidrosolubles. Los poffmeros hidrofilos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, poli(etilenglicol), poli(oxido de etileno), poli(propilenglicol), poli(oxido de etileno-co-oxido de propileno), acido hialuronico, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), heparina, polivinil(pirrolidona), sulfato de condroitano, quitosano, glucosaminoglicanos, dextrano, dextrina, sulfato de dextrano, acetato de celulosa, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, celulosicos, poli(trimetilenglicol), poli(tetrametilenglicol), polipeptidos, poliacrilamida, poliacrilamida, poli(etilenamina), poli(alilamina) y mezclas de los mismos.
Modificaciones de peptidos de ejemplo
En algunas realizaciones, un peptido anfifflico que se describe en el presente documento pueden comprender al menos un (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o mas) aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en alanina; arginina; asparragina; acido aspartico; cistema; acido glutamico; glutamina; glicina; histidina; isoleucina; leucina; lisina; metionina; fenilalanina; prolina; serina; treonina; triptofano; tirosina; valina; homocistema; fosfoserina; fosfotreonina; fosfotirosina; hidroxiprolina; Y-carboxiglutamato; acido hipurico; acido octahidroindol-2-carboxflico; estatina; acido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxflico; penicilamina (3-mercapto-D- valina); ornitina (Orn); citrulina; alfa-metil-alanina; para-benzoilfenilalanina; para-aminofenilalanina; p- fluorofenilalanina; fenilglicina; propargilglicina; N-metilglicinas (sarcosina, Sar); y terc-butilglicina; acido diaminobuffrico; acido 7-hidroxi-tetrahidroisoquinolin carboxffico; naftilalanina; bifenilalanina; ciclohexilalanina; acido amino-isobuffrico (Aib); norvalina; norleucina (Nle); terc-leucina; acido tetrahidroisoquinolin carboxflico; acido pipecolico; fenilglicina; homofenilalanina; ciclohexilglicina; dehidroleucina; 2,2-dietilglicina; acido 1-amino-1- ciclopentanocarboxflico; acido 1-amino-1-ciclohexanocarboxflico; acido amino-benzoico; acido amino-naftoico; acido gamma-aminobutmco; difluorofenilalanina; acido nipecotico; Acido N-a-imidazol acetico (IMA); tienil-alanina; t- butilglicina; desamino-Tyr; acido aminovalerico (Ava); acido piroglutammico (<Glu); acido a-aminoisobuffrico (aAib); acido Y-aminobuffrico (YAbu); acido a-aminobuffrico (aAbu); acido aY-aminobuffrico (aYAbu); 3-piridilalanina (Pal); Isopropil-a-NElisina (Ilys); Naftilalanina (Nal); a-naftilalanina (a-Nal); p-naftilalanina (p-Nal); Acetil-p-naftilalanina (Ac- p-naftilalanina); a,p-naftilalanina; Ne-picoloil-lisina (PicLys); 4-halo-fenilo; 4-pirolidilalanina; acido isonipecotico carboxffico (inip); beta-aminoacidos; e isomeros, analogos y derivados de los mismos. Un experto en la materia sabna que esta definicion incluye, los aminoacidos D y L; los alfa-, beta- y gamma-aminoacidos; los aminoacidos qmmicamente modificados; los aminoacidos de origen natural no proteogenicos; los aminoacidos raros; y los compuestos sintetizados qmmicamente que tienen propiedades conocidas en la tecnica por ser caractensticos de un aminoacido. Adicionalmente, cada realizacion puede incluir cualquier combinacion de los grupos.
Ademas, como se usa en el presente documento, el termino "aminoacido" incluye un compuesto o molecula que se aparta de la estructura de los aminoacidos de origen natural, pero que tienen sustancialmente la estructura de un aminoacido, de manera que pueden utilizarse para la sustitucion de los aminoacidos de origen natural dentro de un peptido, despues de lo cual la actividad del peptido, por ejemplo, la actividad de formacion de agregados, aun se conserva. Por tanto, por ejemplo, en algunas realizaciones los aminoacidos pueden tambien incluir aminoacidos que tienen modificaciones o sustituciones de la cadena lateral y tambien incluyen acidos organicos relacionados, amidas o similares. Sin limitacion, un aminoacido puede ser un aminoacido proteogenico o no proteogenico. Como se usa en el presente documento, el termino "proteogenico" indica que el aminoacido puede incorporarse en una protema en una celula a traves de las vfas metabolicas conocidas.
En algunas realizaciones, un peptido anfifflico comprende al menos un (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o mas) aminoacidos modificados qmmicamente. Como se usa en el presente documento, la expresion "aminoacido qmmicamente modificado" se refiere a un aminoacido que se ha tratado con uno o mas reactivos. Un aminoacido modificado qmmicamente puede estar presente en cualquier posicion en el peptido anfifflico. Cuando esta presente mas de un aminoacido modificado qmmicamente, pueden colocarse uno junto al otro o no. Cuando tres o mas aminoacidos modificados qmmicamente estan presentes algunos de los aminoacidos modificados qmmicamente pueden estar presentes uno junto al otro, mientras que algunos de los aminoacidos modificados qmmicamente no estan al lado de otro aminoacido modificado qmmicamente.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofilo comprende un aminoacido modificado qmmicamente. Sin limitaciones, el aminoacido modificado qmmicamente puede estar presente en cualquier posicion del segmento de peptidilo hidrofilo, por ejemplo, leyendo desde el extremo N, en la posicion 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y asf sucesivamente del segmento de peptidilo hidrofilo.
En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofobo comprende un aminoacido modificado qmmicamente. Sin limitaciones, el aminoacido modificado qmmicamente puede estar presente en cualquier posicion del segmento de peptidilo hidrofobo, por ejemplo, leyendo desde el extremo N, en la posicion 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y asf sucesivamente del segmento de peptidilo hidrofobo.
En algunas realizaciones, los segmentos de peptidilo hidrofilos e hidrofobos pueden comprender cada uno al menos un aminoacido modificado qmmicamente. Cuando los segmentos de peptidilo hidrofilos e hidrofobos comprenden un aminoacido modificado qmmicamente, el numero de dichos aminoacidos modificados qmmicamente presentes en cada segmento puede ser igual o diferente.
En algunas realizaciones, el peptido anfifflico comprende al menos un (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas) beta-aminoacido. Cuando mas de un beta-aminoacido estan presentes, pueden colocarse uno junto a otro o no uno junto a otro. Cuando tres o mas beta-aminoacidos estan presentes algunos de los beta-aminoacidos pueden estar presentes junto a otro beta-aminoacido mientras que algunos de los beta-aminoacidos no estan junto a otro beta- aminoacido.
En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofilo comprende un beta-aminoacido. Sin limitaciones, el beta-aminoacido puede estar presente en cualquier posicion del segmento de peptidilo hidrofilo, por ejemplo, leyendo desde el extremo N, en la posicion 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y asf sucesivamente del segmento de peptidilo hidrofilo.
En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofobo comprende un beta-aminoacido. Sin limitaciones, el beta-aminoacido puede estar presente en cualquier posicion del segmento de peptidilo hidrofobo, por ejemplo, leyendo desde el extremo N, en la posicion 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y asf sucesivamente del segmento de peptidilo hidrofobo.
En algunas realizaciones, los segmentos de peptidilo tanto hidrofilos como hidrofobos pueden comprender cada uno al menos un beta-aminoacido. Cuando los segmentos de peptidilo hidrofilos e hidrofobos comprenden un beta- aminoacido, el numero de dichos beta-aminoacidos de cada segmento puede ser el mismo o diferente.
Los beta-aminoacidos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, clorhidrato de L-p-homoprolina; acido (±)-3-(Boc- amino)-4-(4-bifenilil)butmco; acido (±)-3-(Fmoc-amino)-2-fenilpropionico; acido (1S,3R)-(+)-3-(Boc- amino)ciclopentanocarboxflico; acido (2R,3R)-3-(Boc-amino)-2-hidroxi-4-fenilbutmco; acido (2S,3R)-3-(Boc-amino)-2- hidroxi-4-fenilbutmco; acido (R)-2-[(Boc-amino)metil]-3-fenilpropionico; acido (R)-3-(Boc-amino)-2-metilpropionico; acido (R)-3-(Boc-amino)-fenilpropionico; acido (R)-3-(Boc-amino)-4-(2-naftil)butmco; acido (R)-3-(Boc-amino)-5- fenilpentanoico; acido (R)-3-(Fmoc-amino)-4-(2-naftil)butmco; acido (R)-(-)-pirrolidin-3-carboxflico; (R)-Boc-3,4- dimetoxi-p-Phe-OH; (R)-Boc-3-(3-piridil)-p-Ala-OH; (R)-Boc-3-(trifluorometil)-p-Phe-OH; (R)-Boc-3-ciano-p-Phe-OH; (R)-Boc-3-metoxi-p-Phe-OH; (R)-Boc-3-metil-p-Phe-OH; (R)-Boc-4-(4-piridil)-p-Homoala-OH; (R)-Boc-4-
(trifluorometil)-p-HomoPhe-OH; (R)-Boc-4-(trifluorometil)-p-Phe-OH; (R)-Boc-4-bromo-p-Phe-OH; (R)-Boc-4-cloro-p- Homophe-OH; (R)-Boc-4-cloro-p-Phe-OH; (R)-Boc-4-ciano-p-Homophe-OH; (R)-Boc-4-ciano-p-Phe-OH; (R)-Boc-4- fluoro-p-Phe-OH; (R)-Boc-4-metoxi-p-Phe-OH; (R)-Boc-4-metil-p-Phe-OH; (R)-Boc-p-Tyr-OH; (R)-Fmoc-4-(3-piridil)- p-Homoala-OH; (R)-Fmoc-4-fluoro-p-Homophe-OH; acido (S)-(+)-pirrolidin-3-carboxflico; acido (S)-3-(Boc-amino)-2- metilpropionico; acido (S)-3-(Boc-amino)-4-(2-naftil)butmco; acido (S)-3-(Boc-amino)-5-fenilpentanoico; acido (S)-3- (Fmoc-amino)-2-metilpropionico; acido (S)-3-(Fmoc-amino)-4-(2-naftil)butmco; acido (S)-3-(Fmoc-amino)-5-
hexenoico;acido (S)-(Fmoc-amino)-5-fenil-pentanoico; acido (S)-3-(Fmoc-amino)-6-fenil-5-hexenoico; (S)-Boc-2- (trifluorometil)-p-Homophe-OH; (S)-Boc-2-(trifluorometil)-p-Homophe-OH; (S)-Boc-2-(trifluorometil)-p-Phe-OH; (S)- Boc-2-ciano-p-Homophe-OH; (S)-Boc-2-metil-p-Phe-OH; (S)-Boc-3,4-dimetoxi-p-Phe-OH; (S)-Boc-3-
(trifluorometil)Phe-OH-p-Homo-; (S)-Boc-3-(trifluorometil)-p-Phe-OH; (S)-Boc-3-metoxi-p-Phe-OH; (S)-Boc-3-metil-p- Phe-OH; (S)-Boc-4-(4-piridil)-p-Homoala-OH; (S)-Boc-4-(trifluorometil)-p-Phe-OH; (S)-Boc-4-bromo-p-Phe-OH; (S)- Boc-4-cloro-p-Homophe-OH; (S)-Boc-4-cloro-p-Phe-OH; (S)-Boc-4-ciano-p-Homophe-OH; (S)-Boc-4-ciano-p-Phe- OH; (S)-Boc-4-fluoro-p-Phe-OH; (S)-Boc-4-yodo-p-Homophe-OH; (S)-Boc-4-metil-p-Homophe-OH; (S)-Boc-4-metil- p-Phe-OH; (S)-Boc-p-Tyr-OH; (S)-Boc-Y,Y-difenil-p-Homoala-OH; (S)-Fmoc-2-metil-p-Homophe-OH; (S)-Fmoc-3,4- difluoro-p-Homophe-OH; (S)-Fmoc-3-(trifluorometil)-p-Homophe-OH; (S)-Fmoc-3-ciano-p-Homophe-OH; (S)-Fmoc-3- metil-p-Homophe-OH; (S)-Fmoc-Y,Y-difenil-p-Homoala-OH; acido 2-(Boc-aminometil)fenilacetico; acido 3-amino-3-(3- bromofenil)propionico; acido 3-amino-4,4,4-trifluorobutmo; acido 3-aminobutanoico, acido DL-3-aminoisobutmco; DL- p-aminoisobutmco puro; DL-p-homoleucina; DL-p-Homometionina; DL-p-homofenilalanina; DL-p-leucina; DL-p- fenilalanina; Clorhidrato de L-p-homoalanina; clorhidrato de acido L-p-Homoglutamico; Clorhidrato de L-p- homoglutamina; Clorhidrato de L-p-Homohidroxiprolina; Clorhidrato de L-p-Homoisoleucina; Clorhidrato de L-p- homoleucina; Diclorhidrato de L-p-homolisina; Clorhidrato de L-p-Homometionina; clorhidrato de ester aKlico de L-p- Homofenilalanina; Clorhidrato de L-p-homofenilalanina; L-p-homoserina; L-p-Homotreonina; clorhidrato de L-p- homotriptofano; Clorhidrato de L-p-homotirosina; clorhidrato de L-p-leucina; Boc-D-p-Leu-OH; Boc-D-p-Phe-OH;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Boc-p3-Homopro-OH; Boc-p-Glu(OBzl)-OH; Boc-p-HomoArg(Tos)-OH; Boc-p-Homoglu OBzl)-OH; Sal tecnica de Boc-p-Homohyp(Bzl)-OH (diciclohexilamonio); Boc-p-Homolys(Z)-OH; Boc-p-Homoser(Bzl)-OH; Boc-p-Homothr(Bzl)- OH; Boc-p-Homotyr(Bzl)-OH; Boc-p-Ala-oH; Boc-p-Gln-OH; Boc-p-Homoala-OAll; Boc-p-Homoala-OH; Boc-p- Homogln-OH; Boc-p-Homoile-OH; Boc-p-Homoleu-OH; Boc-p-Homomet-OH; Boc-p-Homophe-OH; Boc-p-Homotrp- OH; Boc-p-Homotrp- OMe; Boc-p-Leu-OH; Boc-p-Lys (z)-OH (diciclohexilamonio) sal; Boc-p-Phe-OH; 3- (bencilamino)propionato de etilo; Fmoc-D-p-Homophe-OH; Fmoc-L-p3-homoprolina; Fmoc-p-D-Phe-OH; Fmoc-p-Gln (Trt)-OH; Fmoc-p-Glu(OtBu)-OH; Fmoc-p-homoArg(Pmc)-OH; Fmoc-p-Homogln(Trt)-OH; Fmoc-p-Homoglu(OtBu)- OH; Fmoc-p-Homohyp(tBu)-OH; Fmoc-p-Homolys(Boc)-OH; Fmoc-p-Homoser(tBu)-OH; Fmoc-p-Homothr(tBu)-OH; Fmoc-p-Homotyr(tBu)-OH; Fmoc-p-Ala-OH; Fmoc-p-Gln-OH; Fmoc-p-Homoala-OH; Fmoc-p-Homogln-OH; Fmoc-p- Homoile-OH; Fmoc-p-Homoleu-OH; Fmoc-p-Homomet-OH; Fmoc-p-Homophe-OH; Fmoc-p-Homotrp-OH; Fmoc-p- Leu-OH; Fmoc-p-Phe-OH; N-acetil-DL-p-fenilalanina; Z-D-p-Dab(Boc)-OH; Z-D-p-Dab(Fmoc)-OH puro,; Z-DL-p- Homoalanina; Z-p-D-Homoala-OH; Z-p-Glu(OtBu)-OH, tecnico; Z-p-Homotrp(Boc)-OH; Z-p-Ala-OH puro; Z-p-Ala- ONp puro,; Z-p-Dab(Boc)-OH; Z-p-Dab(Fmoc)-OH; Z-p-Homoala-OH; p-alanina; p-alanina BioXtra,; clorhidrato de ester efflico de p-alanina; clorhidrato de ester mefflico de p-alanina; clorhidrato de acido p-glutamico; clorhidrato del acido cis-2-amino-3-ciclopenteno-1-carbox^lico; acido c/s-3-(Boc-amino)ciclohexanocarboxflico; y acido cis-3-(Fmoc- amino)ciclohexanocarboxflico.
En algunas realizaciones, un peptido anfifflico que se describe en el presente documento puede comprender al menos un (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, l0, 11, 12, 13, 14, 15 o mas) enlace amida modificado, por ejemplo, un enlace amida en la cadena principal reemplazado por un enlace seleccionado entre el grupo que consiste en el enlace pepffdico psi reducido, urea, tiourea, carbamato, sulfonilurea, trifluoroetilamina, acido orto- (aminoalquil)fenilacetico, acido para-(aminoalquil)-fenilacetico, acido meta-(aminoalquil)-fenilacetico, tioamida, tetrazol, ester boronico y grupo oleffnico. El enlace de reemplazo de amida puede estar presente en cualquier posicion en el peptido anfifflico. Cuando dos o mas enlaces de reemplazo de amida estan presentes, pueden estar posicionados uno junto a otro (por ejemplo, a ambos lados de un aminoacido dado) o no (por ejemplo, solo un lado de un aminoacido dado esta unido a traves de un enlace de reemplazo de peptido con el siguiente aminoacido).
En algunas realizaciones, el enlace de reemplazo de amida esta presente en el segmento de peptidilo hidrofilo. Sin limitaciones, el enlace de reemplazo de amida puede estar presente en cualquier posicion del segmento de peptidilo hidrofilo, por ejemplo, leyendo desde el extremo N, en la posicion 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y asf sucesivamente del segmento de peptidilo hidrofilo.
En algunas realizaciones, el enlace de reemplazo de amida esta presente en el segmento de peptidilo hidrofobo. Sin limitaciones, el enlace de reemplazo de amida puede estar presente en cualquier posicion del segmento de peptidilo hidrofobo, por ejemplo, leyendo desde el extremo N, en la posicion 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y asf sucesivamente del segmento de peptidilo hidrofobo.
En algunas realizaciones, los segmentos de peptidos hidrofilos e hidrofobos pueden comprender cada uno al menos un enlace de sustitucion de amida. Cuando los segmentos de peptidilo tanto hidrofilos como hidrofobos comprenden un enlace de reemplazo de amida, el numero de dichos enlaces de reemplazo de amida en cada segmento puede ser igual o diferente.
El extremo C de un peptido anfifflico que se describe en el presente documento puede estar sin modificar o modificado por conjugacion de un grupo protector de carboxilo o un grupo amida. Los grupos protectores de carboxilo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, esteres tales como metilo, etilo, t-butilo, metoximetilo, 2,2,2- tricloroetilo y 2-haloetilo; esteres de bencilo tales como trifenilmetilo, difenilmetilo, p-bromobencilo, o-nitrobencilo y similares; esteres de sililo tales como trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo y similares; amidas; e hidrazidas. Otros grupos protectores de acido carboxflico pueden incluir alfa-aminoacidos opcionalmente protegidos que estan unidos con el resto amino de los alfa-aminoacidos. En algunas realizaciones, el extremo C de un peptido anfifflico se conjuga con NH2, NH-alquilo o N(alquilo)2.
Enlace entre segmentos hidrofilos e hidrofobos
Sin limitaciones, el segmento de peptidilo hidrofilo puede estar unido a o bien el extremo N o el extremo C del segmento de peptidilo hidrofobo. En consecuencia, un peptido anfifflico puede ser (segmento de peptidilo hidrofilo)- enlazador-(segmento de peptidilo hidrofobo) o (segmento de peptidilo hidrofobo)-enlazador-(segmento de peptidilo hidrofilo). En una realizacion, el segmento de peptidilo hidrofilo esta unido al extremo N del segmento de peptidilo hidrofobo. Dicho de otra manera, en una realizacion, el segmento de peptidilo hidrofobo esta unido al extremo C del segmento de peptidilo hidrofilo. El enlace entre los segmentos de peptidos hidrofilos e hidrofobos puede ser un enlace amida, un enlace de reemplazo de amida o un enlazador como se define en el presente documento.
En algunas realizaciones, el enlace entre los segmentos de peptidilo hidrofilos e hidrofobos es un enlace amida (por ejemplo, -NHC(O)-) o un enlace de reemplazo de amida.
En algunas realizaciones, el enlace entre los segmentos de peptidilo hidrofilos e hidrofobos incluye un aminoacido, dos aminoacidos o un peptido que comprende de 3 a 15 aminoacidos. Ha de entenderse que cuando los segmentos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de peptidilo hidrofilos e hidrofobos estan unidos por una cadena de aminoacidos, el enlazador puede comprender una o mas de las modificaciones de peptidos que se describen en el presente documento, por ejemplo, enlace de reemplazo de amida, beta-aminoacidos, D-aminoacidos, aminoacidos qmmicamente modificados, etc.
Peptidos anfifilicos de ejemplo y usos de los mismos
En algunas realizaciones, un peptido anfifflico comprende una secuencia de aminoacidos (L-AA21)r'-((L-AA11)-(D- AA12))b'-(L-AA13), en la que aA21 es un resto de Lys o una sustitucion del mismo; AA11 y AA13 es cada uno independientemente un resto de Trp o una sustitucion del mismo, AA12 es un resto de Leu o una sustitucion del mismo, y en la que f es un numero entero 3 a 21 y b' es un numero entero de 3 a 20 y en la que al menos uno de un grupo amino del extremo No un grupo amino de cadena lateral de al menos un resto AA21 se conjuga con un grupo protector de nitrogeno o de amino.
El termino "sustitucion" cuando se refiere a un peptido, se refiere a un cambio en un aminoacido por una entidad diferente, por ejemplo, otro aminoacido o resto de aminoacido. Las sustituciones pueden ser sustituciones conservativas o no conservativas. En algunas realizaciones, la sustitucion es una sustitucion conservativa. Como se usa en el presente documento, el termino "sustitucion conservativa" se refiere a una sustitucion de aminoacidos en la que el resto de aminoacido sustituto es de carga similar y/o de hidrofobia similares que el resto reemplazado. El resto sustituto puede ser de un tamano similar o de menor tamano o de mayor tamano que el resto reemplazado, a condicion de que el resto sustituto tenga propiedades bioqmmicas similares a las del resto reemplazado. Las sustituciones conservativas de aminoacidos incluyen, pero no se limitan a, sustituciones hechas entre aminoacidos dentro de los siguientes grupos: (i) los aminoacidos no polares pequenos: alanina (Ala), metionina (Met), isoleucina (Ile), leucina (Leu) y valina (Val); (ii) los aminoacidos polares pequenos: glicina (Gly), serina (Ser), treonina (Thr) y cistema (Cys); (iii) los amido aminoacidos: glutamina (Gln) y asparragina (Asn); (iv) los aminoacidos aromaticos: fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) y triptofano (Trp); (v) los aminoacidos basicos: lisina (Lys), arginina (Arg) e histidina (His); y (vi) los aminoacidos acidos: acido glutamico (Glu) y acido aspartico (Asp). Las sustituciones que son de carga neutra y que reemplazan un resto con un resto mas pequeno tambien pueden considerarse como "sustituciones conservativas" incluso si los restos estan en diferentes grupos (por ejemplo, el reemplazo de fenilalanina por la isoleucina mas pequena). La expresion "sustitucion conservativa" tambien abarca el uso de mimeticos de aminoacidos, analogos, variantes o aminoacidos no proteinogenicos o no convencionales. A modo de ejemplo solamente, la valina (Val) puede sustituirse por AdaA o ADAG; la prolina puede sustituirse por acido L-I- tioazolidin-4-carboxflico o acido D-o-L-1-oxazolidin-4-carboxflico (vease Kauer, Patente de los EE.UU. N.° (4.511.390)); y la glicina (Gly) puede sustituirse por Aib, p-Ala o Acp.
En consecuencia, en algunas realizaciones, AA21 puede ser un resto de Lys o una sustitucion conservativa del mismo, por ejemplo, Arg o His. En una realizacion, Aa21 es un resto Lys o un derivado del mismo.
En algunas realizaciones, AA11 y AA13 pueden ser cada uno independientemente un resto de Trp o una sustitucion conservativa del mismo, por ejemplo, Phe o Tyr. En una realizacion, AA11 y AA13 es cada uno independientemente un resto de Trp o un derivado del mismo.
En algunas realizaciones, AA12 puede ser un resto de Leu o una sustitucion conservativa del mismo, por ejemplo, Ala, Met, Ile o Val. En una realizacion, AA12 es un resto de Leu o un derivado del mismo.
En algunas realizaciones, un peptido anfifflico comprende una secuencia de aminoacidos (L-Lys)r-((L-Trp)-(D- Leu))m-(L-Trp), en la que r' es un numero entero de 3-21 y m' es un numero entero de 3-20 y en la que al menos uno de un grupo amino del extremo No un grupo amino de cadena lateral de al menos un resto de Lys se conjuga con un grupo protector de nitrogeno o de amino.
En algunas realizaciones, r' y m' son independientemente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15. En algunas realizaciones, los dos grupos r' y m' son iguales. En una realizacion, tanto r' como m' son 3.
En algunas realizaciones, el peptido anfifflico comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en: Ac-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp)-NH2 (tambien denominada CD3ac el presente documento, en la que la abreviatura "ac" o "Ac" se refiere a la acetilacion de cualquier grupo amino del extremo N de un peptido anfifflico o un grupo amino de un resto Lys en el segmento de peptidilo hidrofilo);
Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp)-NH2;
(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp)-NH2;
(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp)-NH2;
(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-( L-Trp)-NH2;
(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp)-NH2;
(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp)-NH2;
(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp)-NH2;
(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp)-NH2;
Ac-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp)-NH2;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp);
(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp);
(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp);
(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp);
(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp);
(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp);
(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp);
(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp);
Ac-( L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))a-( L-Trp)-NH2;
Ac-( L-Lys)-(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-( L-Trp)-NH2;
Ac-( L-Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-( L-Trp)-NH2;
Ac-( L-Lys)-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-( L-Trp)-NH2;
Ac-( L-Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-( L-Trp)-NH2;
Ac-( L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-( L-Trp)-NH2;
Ac-( L-Lys)-(L-Lys)-( L-Lys(Ac)M(L-Trp)-(D-Leu))3-( L-Trp);
Ac-( L-Lys)-(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-( L-Trp);
Ac-( L-Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-( L-Trp);
Ac-( L-Lys)-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-( L-Trp);
Ac-( L-Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-( L-Trp);
Ac-( L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-( L-Trp);
Ac-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp); y cualquier combinacion de las mismas.
En algunas realizaciones, el segmento de peptidilo hidrofilo del peptido anfifflico puede comprender una cistema. En algunas realizaciones, la cistema puede estar presente en el extremo N del segmento de peptidilo hidrofilo.
El inventor ha descubierto que algunas realizaciones de los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento pueden tener capacidad de penetracion celular. Por tanto, en algunas realizaciones, los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento pueden utilizarse como agentes de penetracion celular y/o de transfeccion. En estas realizaciones, los peptidos anfifflicos pueden disenarse para cargarse positivamente. En consecuencia, se proporciona en el presente documento el uso de una composicion que comprende un peptido anfifflico cargado positivamente como agente de penetracion en las celulas o agente de transfeccion, en el que el peptido anfifflico cargado positiva comprende un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo. El segmento de peptidilo hidrofobo del peptido anfifflico cargado positiva comprende una secuencia de aminoacidos de (Trp-Leu)m-(Trp)n o (Leu-Trp)p-(Leu)q, en la que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L- Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 5 y n y q son, independientemente 0 o 1, a condicion de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa; mientras que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, en la que r es un numero entero de 1 a 15. Ademas, en el peptido anfifflico cargado positivamente, al menos uno de los restos de Lys o el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico no estan acetilados. En algunas realizaciones, todos los restos de Lys y el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico cargado positivamente estan sin acetilar.
En algunas realizaciones, el peptido anfifflico cargado positivamente puede comprender una secuencia de aminoacidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X, en la que X esta ausente o es NH2.
En algunas realizaciones, la composicion puede comprender ademas una molecula de acido nucleico u oligonucleotido (por ejemplo, ADN o ARN) que se entrega en una celula. En algunas realizaciones, la composicion puede comprender ademas una pluralidad (por ejemplo, al menos 2 o mas) de moleculas de acidos nucleicos o de oligonucleotidos (por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo, pero no limitados a, ARNip, ARNhc, miARN). En algunas realizaciones, las moleculas de acidos nucleicos o los oligonucleotidos pueden disenarse para su uso en la intervencion terapeutica, por ejemplo, la terapia genica o la terapia con ARNip.
Sintesis de peptidos
Los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento pueden sintetizarse de acuerdo con los metodos habituales de solucion y qmmica de peptidos en fase solida, o mediante metodos clasicos conocidos en la tecnica. La purificacion de los peptidos es bien conocida en la tecnica y puede ser, por ejemplo, por HPLC. Pueden encontrarse metodos que describen metodos utiles de sintesis y purificacion de peptidos, por ejemplo, en la Publicacion de Solicitud de Patente de los EE.UU. N.° 20060084607.
Los peptidos que se describen en el presente documento pueden construirse por sintesis mediante tecnicas conocidas adecuadas de polimerizacion de peptidos, tales como tecnicas exclusivamente en fase solida, tecnicas parcialmente en fase solida, condensacion de fragmentos o acoplamientos clasicos en solucion. Por ejemplo, los peptidos pueden sintetizarse mediante el metodo en fase solida utilizando metodos convencionales basados en cualquiera de los grupos protectores t-butiloxicarbonilo (BOC) o 9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC). Esta metodologfa se describe por G. B. Fields et al. en Synthetic Peptides: A User’s Guide, W. M. Freeman & Company,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Nueva York, Nueva York, pags. 77-183 (1992) y en el libro de texto "Solid-Phase Synthesis", Stewart & Young, Freemen & Company, San Francisco, 1969, y se ejemplifican mediante la divulgacion de la patente de los EE.UU. N.° 4.105.603, presentada el 8 de agosto de 1979. La smtesis clasica en solucion se describe en detalle en "Methoden der Organischen Chemic (Houben-Weyl): Synthese von Peptiden", E. Wunsch (editor) (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart Alemania Occidental. El metodo de smtesis por condensacion de fragmentos se ejemplifica en la patente de los EE.UU. N.° 3.972.859. Otras smtesis disponibles se ejemplifican en la Patente de los EE.UU. N.° 3.842.067, Patente de los EE.UU. N.° 3.872.925, presentada el 28 de enero 1975, Merrifield B, Protein Science (1996), 5: 1947-1951; The chemical synthesis of proteins; Mutter M, Int J Pept Protein Res Marzo de 1979; 13 (3): 274-7 Studies on the coupling rates in liquid-phase peptide synthesis using competition experiments; and Solid Phase Peptide Synthesis in the series Methods in Enzymology (Fields, G. B. (1997) Solid-Phase Peptide Synthesis. Academic Press, San Diego. n.° 9830).
Los metodos para preparar peptidomimeticos incluyen la modificacion del grupo amino N-terminal, del grupo carboxilo C-terminal y/o el cambio de uno o mas de los enlaces amino en el peptido a un enlace no amino. Dos o mas de dichas modificaciones pueden acoplarse en un inhibidor peptidomimetico. Se describen modificaciones de peptidos para producir peptidomimeticos, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. N.° 5.643.873 y N.° 5.654.276.
Peptidomimeticos
En algunas realizaciones, el peptido anfifflico es un peptidomimetico. Por ejemplo, el segmento peptfdico hidrofilo puede ser un peptidomimetico, el segmento de peptidilo hidrofobo puede ser un peptidomimetico o ambos pueden ser peptidomimeticos.
Los metodos de diseno de peptidomimeticos y de seleccion de peptidomimeticos funcionales son bien conocidos para los expertos en la materia. Un metodo basico de diseno de una molecula que imita una protema o peptido conocido es identificar primero la region o regiones activas de la protema conocida (por ejemplo, en el caso de una interaccion anticuerpo-antfgeno, uno identifica que region o regiones del anticuerpo que permiten la union al antfgeno) y, despues, buscar un mimetico que emule la region activa. Si la region activa de una protema conocida es relativamente pequena, se preve que un mimetico sera mas pequeno (por ejemplo en peso molecular) que la protema, y, correspondientemente, mas facil y mas barato de sintetizar. Un mimetico de este tipo podna utilizarse como sustituto un conveniente para la protema, como un agente para la interaccion con la molecula diana.
Los metodos para preparar peptidomimeticos incluyen la modificacion del grupo amino N-terminal, del grupo carboxilo C-terminal, y/o el cambio de uno o mas de los enlaces amida en el peptido a un enlace no amida o amida modificada. Pueden acoplarse dos o mas de dichas modificaciones en un peptidomimetico. Se describen modificaciones de peptidos para producir peptidomimeticos, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. N.° 5.643.873 y N.° 5.654.276.
Por ejemplo, Reineke et al. (1999, Nature Biotechnology, 17; 271-275) disenaron una molecula que imita un sitio de union de la protema interleucina-10 usando una gran biblioteca de peptidos sinteticos cortos, cada uno de los cuales correspondfa a una seccion corta de la interleucina 10. La union de cada uno de estos peptidos a la diana (en este caso un anticuerpo contra la interleucina 10) se ensayo despues individualmente mediante una tecnica de ensayo, para identificar peptidos potencialmente relevantes. Pueden utilizarse bibliotecas de presentacion de fagos de peptidos y metodo de barrido de alanina.
Otros metodos para disenar peptidomimeticos para un peptido o protema en particular incluyen los que se describen en la patente europea EP1206494, el programa SuperMimic de Andrean Goede et. al. 2006 BMC Bioinformatics, 7:11; y el programa MIMETIC de W. Campbell et. al., 2002, Microbiology and Immunology 46:211-215. El programa SuperMimic esta disenado para identificar compuestos que imitan partes de una protema o posiciones en las protemas que son adecuadas para la insercion de mimeticos. La aplicacion proporciona bibliotecas que contienen componentes basicos de peptidomimeticos por un lado y estructuras de protemas por otro lado. La busqueda de enlazadores peptidomimeticos prometedores para un peptido dado se basa en la superposicion del peptido con varios conformeros del mimetico. Los nuevos elementos o protemas sinteticos pueden importarse y usarse en la busqueda. El programa de ordenador MIMETIC, que genera una serie de peptidos para la interaccion con una secuencia de peptidos diana se reviso por W. Campbell et. al., 2002. Un analisis profundo del tema se revisa en "Peptide Mimetic Design with the Aid of Computational Chemistry1' de James R. Damewood Jr. en Reviews in Computational Chemistry, enero de 2007, volumen 9 de la serie del libro: Reviews in Computational Chemistry, Editores Kenny B. Lipkowitz, Donald B. BoydPrint ISBN: 9780471186397 ISBN: 9780470125861 Publicado por John Wiley & Sons, Inc.; y en T. Tselios, et. al, Amino Acids, 14: 333-341, 1998.
Los metodos para preparar bibliotecas que contienen diversas poblaciones de peptidos, peptoides y peptidomimeticos son bien conocidos en la tecnica y diversas bibliotecas estan disponibles en el mercado (vease, por ejemplo, Ecker y Crooke, Biotechnology 13: 351-360 (1995) y Blondelle et al, Trends Anal Chem. 14:83-92 (1995); vease, tambien, Goodman y Ro, Peptidomimetics for Drug Design, in "Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery" Vol 1 (ed. M. E. Wolff; John Wiley & Sons 1995), paginas 803-861 y Gordon et al, J. Med Chem 37: 1385-1401 (1994). Un experto en la materia entiende que un peptido puede producirse in vitro directamente o puede
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
expresarse a partir de un acido nucleico, que puede producirse in vitro. Los metodos de peptidos sinteticos y qmmica de acidos nucleicos son bien conocidos en la tecnica.
Tambien puede producirse una biblioteca de moleculas de peptidos, por ejemplo, mediante la construccion de una biblioteca de expresion de ADNc a partir de ARNm recogido de un tejido de interes. Los metodos para producir dichas bibliotecas son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Sambrook et. al, Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989). Preferentemente, un peptido codificado por el ADNc se expresa en la superficie de una celula o un virus que contiene el ADNc.
Ligandos y principios activos
Una amplia diversidad de entidades, por ejemplo, ligandos, pueden acoplarse a un peptido anfifflico que se describe en el presente documento o a una parffcula de peptidos que se describe mas adelante. Los ligandos pueden incluir moleculas de origen natural o moleculas recombinantes o sinteticas. En algunas realizaciones, un ligando puede alterar la distribucion, la direccion o la vida util de un peptido anfifflico que se describe en el presente documento o una parffcula de peptidos hecha a partir del mismo. En algunas realizaciones, un ligando puede proporcionar una afinidad mejorada (por ejemplo, un aumento de la fuerza de union) para una diana seleccionada, por ejemplo, molecula, celula o tipo de celula, compartimento, por ejemplo, un compartimento celular o de un organo, tejido, organo o region del cuerpo, como, por ejemplo, en comparacion con una especie que carece de un ligando de este tipo. En algunas realizaciones, un ligando puede proporcionar una especificidad potenciada de un peptido anfifflico que se describe en el presente documento o de una parffcula de peptidos hecha a partir del mismo para una diana seleccionada, por ejemplo, en comparacion con un peptido anfifflico sin un ligando de este tipo. El termino "especificidad" como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad de un peptido anfifflico o de una parffcula de peptidos para unirse preferentemente a una diana seleccionada por sobre cualesquiera otras entidades. Por ejemplo, la presencia de un ligando en un peptido anfifflico y/o una parffcula de peptidos que se describen en el presente documento puede permitir que el peptido anfifflico o la parffcula de peptidos se unan preferentemente a una diana seleccionada por encima de cualquier otra entidad, en comparacion con un peptido anfifflico o parffcula de peptidos sin un ligando de este tipo.
Sin limitacion, un ligando puede seleccionarse entre el grupo que consiste en poffmeros, peptidos, polipeptidos, protemas, peptidomimeticos, glicoprotemas, lectinas, nucleosidos, nucleotidos, acidos nucleicos, monosacaridos, disacaridos, trisacaridos, oligosacaridos, polisacaridos, lipopolisacaridos, vitaminas, ffpidos, esteroides, hormonas, cofactores, receptores, ligandos de receptores y cualquier combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones de este y otros aspectos que se describen en el presente documento, el ligando se selecciona entre el grupo que consiste en polietilenglicol (PEG, por ejemplo, PEG-2K, PEG-5K, PEG-10K, PEG-12K, PEG-15K, PEG-20K, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poli(oxido de etileno) (PEO), poli(propilenglicol) (PPG), poli(oxido de etileno-co-oxido de propileno), acido hialuronico, poli(2-metacrilato de hidroxietilo), heparina, polivinil(pirrolidona), sulfato de condroitano, quitosano, glucosaminoglucanos, dextrano, dextrina, sulfato de dextrano, acetato de celulosa, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, celulosicos, poli(trimetilenglicol), poli(tetrametilenglicol), polipeptidos, poliacrilamida, poliacrilamida, poli(etilenamina), poli(alilamina), copoffmero de estireno-anhffdrido de anhffdrido de acido maleico, poli(L-lactida-co-glicolido), copoffmero de eter de divinilo-anhffdrido maleico, copoffmero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), alcohol polivinffico (PVA), poliuretano, poli(acido 2-etilacfflico), poffmeros de N-isopropilacrilamida, polifosfacina, polietilenimina, espermina, espermidina, poliaminas, pseudopeptido-poliamina, peptidomimetico poliamina, poliamina dendffmero, arginina, amidina, protamina, tirotropina, melanotropina, lectina, protema surfactante A, mucina, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, aptamero, asialofetuina, hialuronano, procolageno, insulina, transferrina, albumina, acridinas, cros- psoraleno, mitomicina C, TPPC4, texafirina, safirina, hidrocarburos aromaticos polidclicos (por ejemplo, fenazina, dihidrofenazina), acidos biliares, colesterol, acido colico, acido adamantano acetico, acido 1-pireno buffrico, dihidrotestosterona, 1,3-bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3- propanodiol, grupo heptadecilo, acido palirfftico, acido miffstico, acido 03-(oleoil)litocffico, acido 03-(oleoil)colenico, dimetoxitritilo o fenoxazina), peptido rGd, marcadores radiomarcados, haptenos, naproxeno, aspirina, dinitrofenilo, HRP, AP, lectinas, vitamina A, vitamina E, vitamina K, vitamina B, acido folico, vitamina B12, riboflavina, biotina, piridoxal, taxol, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlakinolido, latrunculina A, faloidina, Swinholida A, indanocina, mioservina, factor de necrosis tumoral alfa (TNF), interleucina-1 beta, interferon gamma, GalNAc, galactosa, manosa, manosa-6P, grupos de azucares tales como el grupo de GalNAc, grupo de manosa, grupo de galactosa, un aptamero, ligandos de los receptores de integrina, ligandos de receptores de quimiocinas, ligandos de receptores de serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatostatina, peptido bacteriano de penetracion de la pared celular, peptido GALA, peptido EALA, peptido INF-7, peptido Inf HA-2, peptido diINF-7, peptido diINF-3, peptido GLF, peptido-INF3 GALA, peptido INF-5, peptido penetratina, fragmento de Tat 48-60, peptido PVEC, peptido de transportano, peptido LL-37, peptido cecropina P1, peptido a-defensina, peptido beta-defensina, peptido PR-39, peptido indolicidina, peptido rFGF, analogo de rFGF, bactenecina, cecropinas, licotoxinas, paradaxinas, buforina, CPF, peptido similar a la bombinina (BLP), catelicidinas, ceratotoxinas, peptidos de S. clava, peptidos intestinales antimicrobianos de mixina (HFIAP), magaininas, brevininas-2, dermaseptinas, melitinas, pleurocidina, peptidos H2A, peptidos de Xenopus, esculentinas-1, caerinas y cualquier combinacion de los mismos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En algunas realizaciones, un ligando puede incluir un principio activo. Como se usa en el presente documento, un "principio activo" se refiere a una molecula que se va a entregar a una celula. En consecuencia, sin limitacion, un principio activo puede seleccionarse entre el grupo que consiste en pequenas moleculas organicas o inorganicas, monosacaridos, disacaridos, trisacaridos, oligosacaridos, polisacaridos, macromoleculas biologicas, por ejemplo, peptidos, protemas, analogos de peptidos y derivados de los mismos, peptidomimeticos, acidos nucleicos, analogos de acidos nucleicos y derivados, polinucleotidos, oligonucleotidos, enzimas, un extracto hecho de materiales biologicos tales como bacterias, plantas, hongos o celulas de animales o tejidos, composiciones de origen natural o sintetico, partmulas o cualquier combinacion de los mismos. Un principio activo puede tener carga neutra o comprender una carga neta, por ejemplo, el principio activo es anionico o cationico. Ademas, un principio activo puede ser hidrofobo, hidrofilo o anfifflico. En algunas realizaciones, el principio activo comprende al menos un grupo arilo o heteroarilo.
Como se usa en el presente documento, el termino "partmulas" se refiere a una partmula, polvo, copo, etc., que existe inherentemente en una forma relativamente pequena y puede formarse por, por ejemplo, molienda, trituracion, fragmentacion, pulverizacion, atomizacion o subdividiendo de otro modo una forma mas grande del material en una forma relativamente pequena.
Como se usa en el presente documento, la expresion "molecula pequena" puede referirse a compuestos que son "similares al producto natural", sin embargo, la expresion "molecula pequena", no se limita a compuestos "similares al producto natural". Mas bien, una molecula pequena normalmente se caracteriza por que contiene varios enlaces carbono-carbono y tiene un peso molecular de menos de 5000 Dalton (5 kD), preferentemente de menos de 3 kD, mas preferentemente de menos de 2 kD y mucho mas preferentemente de menos de 1 kD. En algunos casos, es mucho mas preferido que una molecula pequena tenga una masa molecular igual o de menos de 700 Dalton.
En algunas realizaciones, el principio activo puede ser un peptido o una protema. Como se usa en el presente documento, el termino "peptido" se utiliza en su sentido mas amplio para referirse a compuestos que contienen dos o mas aminoacidos, equivalentes de acido amino u otros grupos no aminoacidos unidos entre sf por enlaces peptfdicos o enlaces peptfdicos modificados. Los equivalentes de peptidos pueden diferir de peptidos convencionales por el reemplazo de uno o mas aminoacidos por acidos organicos relacionados (tales como PABA), aminoacidos o similares o la sustitucion o modificacion de cadenas laterales o grupos funcionales. Un peptido puede ser de cualquier tamano de largo; sin embargo, en algunas realizaciones, se prefieren peptidos que tienen veinte o un menor numero total de aminoacidos. Ademas, el peptido puede ser lineal o dclico. Las secuencias de peptidos espedficamente citadas en el presente documento se escriben con el extremo amino terminal a la izquierda y el extremo carboxi terminal a la derecha. Ademas, el termino "peptido" incluye en general protemas, que son generalmente polipeptidos. Como se usa en el presente documento, el termino "protema" se utiliza para describir protemas, asf como fragmentos de las mismas. Por tanto, cualquier cadena de aminoacidos que presente una estructura tridimensional esta incluida en el termino "protema" y los fragmentos de protema, en consecuencia, se incluyen.
Un peptidomimetico es una molecula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a un peptido natural.
Como se usa en el presente documento, la expresion "acido nucleico" se refiere a polfmeros (polinucleotidos) u oligomeros (oligonucleotidos) de nucleotido o monomeros de nucleosidos que consisten en bases de origen natural, azucares y enlaces interazucar. La expresion "acido nucleico" incluye tambien polfmeros u oligomeros que comprenden monomeros de origen no natural o porciones de los mismos, que funcionan de manera similar. Dichos acidos nucleicos modificados o sustituidos a menudo se prefieren sobre las formas nativas debido a propiedades tales como, por ejemplo, la captacion celular mejorada y una mayor estabilidad en presencia de nucleasas.
Un acido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. Un acido nucleico monocatenario puede tener regiones de doble cadena y un acido nucleico bicatenario puede tener regiones de cadena simple. Los acidos nucleicos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a genes estructurales, genes que incluyen regiones de control y de terminacion, sistemas auto-replicantes como el ADN viral o plasmfdico, ARNip monocatenarios y bicatenarios y otros reactivos de ARN de interferencia (agentes ARNi o agentes iARN), ARN de corta horquilla (ARNhc), oligonucleotidos antisentido, ribozimas, microARN, mimeticos de microARN, aptameros, antimiros, antagomiros, oligonucleotidos formadores de triplex, activadores de ARN, oligonucleotidos inmunoestimulantes y oligonucleotidos senuelo.
En algunas realizaciones, el principio activo es biologicamente activo o tiene actividad biologica. Como se usa en el presente documento, la expresion "actividad biologica" o "bioactividad" se refiere a la capacidad de un compuesto para influir en una muestra biologica. La actividad biologica puede incluir, sin limitacion, el desencadenamiento de una respuesta estimuladora, inhibidora, reguladora, toxica o letal en un ensayo biologico en los niveles molecular, celular, tisular o de organos. Por ejemplo, una actividad biologica puede referirse a la capacidad de un compuesto de presentar o modular el efecto/actividad de una enzima, bloquear un receptor, estimular un receptor, modular el nivel de expresion de uno o mas genes, modular la proliferacion celular, modular la division celular, modular la morfologfa celular o cualquier combinacion de los mismos. En algunos casos, una actividad biologica puede referirse a la capacidad de un compuesto para producir un efecto toxico en una muestra biologica o puede referirse a una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
capacidad de modificar qmmicamente una molecula o celula diana.
En algunas realizaciones, el principio activo es un agente terapeutico. Como se usa en el presente documento, la expresion "agente terapeutico" se refiere a un agente biologico o qmmico utilizado para el tratamiento, la curacion, la mitigacion o la prevencion de afecciones perjudiciales en un sujeto. La expresion "agente terapeutico" tambien incluye sustancias y agentes para combatir una enfermedad, afeccion o trastorno de un sujeto, e incluye farmacos, diagnosticos e instrumentacion. "Agente terapeutico" tambien incluye cualquier cosa usada en el diagnostico medico o para restablecer, corregir o modificar las funciones fisiologicas. Las expresiones "agente terapeutico" y "agente farmaceuticamente activo" se usan indistintamente en el presente documento.
Un agente terapeutico puede seleccionarse de acuerdo con el objetivo del tratamiento y la accion biologica deseada. Por tanto, un agente terapeutico puede seleccionarse entre cualquier clase adecuada para el objetivo terapeutico. Ademas, el agente terapeutico puede seleccionarse o disponerse para proporcionar actividad terapeutica durante un penodo de tiempo.
El compuesto de ejemplo farmaceuticamente activo incluye, pero no se limita a, los que se encuentran en Harrison’s Principles of Internal Medicine, 13a Edicion, Eds de Harrison. T. R. Harrison McGraw-Hill NY, NY; Physicians Desk Reference, 50a edicion, 1997, Oradell Nueva Jersey, Medical Economics Co.; Pharmacological Basis of Therapeutics, 8a Edicion, Goodman y Gilman, 1990; Farmacopea de los Estados Unidos, el Formulario Nacional, USP XII NF XVII, 1990; edicion actual de The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman y Gilman; y la edicion actual de The Merck Index.
Los agentes de ejemplo farmaceuticamente activos incluyen, pero no se limitan a, esteroides y agentes antinflamatorios no esteroideos, farmacos antireestenoticos, agentes antimicrobianos, factores angiogenicos, bloqueantes del canal de calcio, agentes trombolfticos, agentes antihipertensivos, anticoagulantes, agentes antiarntmicos, glucosidos cardfacos y similares.
En algunas realizaciones, el agente terapeutico se selecciona entre el grupo que consiste en acido salidlico y derivados (aspirina), para-aminofenol y derivados (acetaminofeno), acidos arilpropionicos (ibuprofeno), corticoesteroides, antagonistas del receptor de la histamina y antagonistas del receptor de la bradicinina, antagonistas de los receptores de leucotrienos, antagonistas de receptor de prostaglandina, antagonistas del receptor de factor de activacion de plaquetas, sulfonamidas, trimetoprim-sulfametoxazol, quinolonas, penicilinas, cefalosporina, factor basico de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor acido de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento transformante angiogenico alfa y beta, factor de necrosis tumoral, angiopoyetina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, dihidropiridinas (por ejemplo, nifedipino, benzotiazepinas tales como dilitazem y fenilalquilaminas tales como verapamilo), activador del plasminogeno urocinasa, urocinasa, estreptocinasa, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), espironolactona, activador del plasminogeno tisular (tPA), diureticos, tiazidas, agentes antiadrenergicos, clonidina, propanolol, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, captopril, antagonistas de los receptores de angiotensina, losartan, antagonistas de los canales de calcio, nifedipino, heparina, warfarina, hirudina, peptido anticoagulante de garrapata y heparinas de bajo peso molecular tales como enoxaparina, lidocama, procainamida, encainida, flecainida, bloqueantes beta adrenergicos, propranolol, amiodarona, verapamilo, diltiazem, cloruro de mquel, glucosidos cardfacos, inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina, antagonistas de los receptores de angiotensina, nitrovasodilatadores, agentes hipolipemiantes (por ejemplo, acido nicotmico, probucol, etc.), resinas de union a acidos biliares (por ejemplo, derivados de colestiramina y de acido ffbrico, por ejemplo, clofibrato), inhibidores de la HMG CoA reductasa, inhibidores de la HMG CoA sintasa, inhibidores de la escualeno sintasa, inhibidores de la escualeno epoxidasa, estatinas (por ejemplo, lovastatina, cerivastatina, fluvastatina, pravastatina, simvastatina, etc.), antipsicoticos, ISRS, anticonvulsivantes, anticonceptivos, analgesicos sistemicos y locales (dolor cronico, factores de crecimiento/remodelacion oseo (reclutamiento de los osteoblastos/osteoclastos y factores estimulantes), neurotransmisores (L-DOPA, dopamina, neuropeptidos), farmacos para el enfisema, TGF-beta), rapamicina, naloxona, paclitaxel, anfotericina, dexametasona, flutamida, vancomicina, fenobarbital, cimetidina, atenolol, aminoglucosidos, hormonas (por ejemplo, hormona liberadora de tirotropina, p-nitrofenil beta- cellopentaosido y hormona liberadora de hormona luteinizante), vincristina, amilorida, digoxina, morfina, procamamida, quinidina, quinina, ranitidina, triamtereno, trimetoprim, sales de vancomicina, aminoglucosidos y penicilina y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
En algunas realizaciones, el principio activo es un ARNip, un ARN de horquilla corta (ARNhc), un oligonucleotido antisentido, una ribozima, un microARN, un mimetico de microARN, un aptamero, un antimiro, un antagomiro, un oligonucleotido formador de triplex, una ARN activador, un oligonucleotido inmunoestimulante, un oligonucleotido senuelo, un plasmido o un vector de ADN.
En algunas realizaciones, el agente terapeutico es un material radiactivo. Los materiales radiactivos adecuados incluyen, por ejemplo, de 90itrio, 192iridio, 198oro, 125yodo, 137cesio, 60cobalto, 55cobalto, 56cobalto, 57cobalto, 57magnesio, 55hierro, 32fosforo, 90estroncio, 81 rubidio, 206bismuto, 67galio, 77bromo, 129cesio, 73selenio, 72selenio, 72arsenico, 103paladio, 123plomo, 111 Indio, 52hierro, 167talio, 57mquel, 62cinc, 62cobre, 2otalio y 123yodo. Sin desear quedar ligado a teona alguna, pueden usarse partfculas que comprenden un material radiactivo para tratar el tejido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
enfermo tal como tumores, malformaciones arteriovenosas y similares.
En algunas realizaciones, el principio activo es un agente formador de imagenes. Como se usa en el presente documento, la expresion "agente formador de imagenes" se refiere a un elemento o grupo funcional en una molecula que permite la deteccion, la formacion de imagenes y/o el seguimiento de la presencia y/o la progresion de una afeccion o afecciones, trastorno o trastornos patologicos y/o enfermedad o enfermedades. El agente de formacion de imagenes puede ser una sustancia ecogenica (ya sea lfquido o gas), isotopo no metalico, un indicador optico, un absorbente de neutrones de boro, un ion metalico paramagnetico, un metal ferromagnetico, un radioisotopo que emite radiacion gamma, un radioisotopo emisor de positrones o un absorbente de rayos x. Sin desear quedar ligado a una teona alguna, un agente de formacion de imagenes permite el seguimiento de una composicion que comprende un agente de formacion de imagenes de este tipo.
Los indicadores opticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, indicadores fluorescentes y grupos quimioluminiscentes. Se conoce en la tecnica una amplia diversidad de colorantes indicadores fluorescentes. Normalmente, el fluoroforo es un compuesto aromatico o heteroaromatico y puede ser un pireno, antraceno, naftaleno, acridina, estilbeno, indol, benzoindol, oxazol, tiazol, benzotiazol, cianina, carbocianina, salicilato, antranilato, cumarina, fluorescema, rodamina u otro compuesto similar. Los indicadores fluorescentes adecuados incluyen colorantes de xanteno, tales como los colorantes fluorescema o rodamina, incluyendo, pero no limitados a, colorantes Alexa Fluor™ (InvitrogenCorp; Carlsbad, CA), fluorescema, isotiocianato de fluorescema (FITC), Verde de Oregon-TM, rodamina, Rojo Texas, isotiocianato de tetrarrodamina (TRITC), 5-carboxifluorescema (FAM), 2'7'- dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluorescema (JOE), tetraclorofluorescema (TET), 6-carboxirodamina (R6G), N,N,N,N'- tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX). Los indicadores fluorescentes adecuados incluyen tambien los colorantes de naftilamina que tienen un grupo amino en la posicion alfa o beta. Por ejemplo, los compuestos de naftilamino incluyen 1-dimetilamino-naftil-5-sulfonato, sulfonato de 1-anilino-8-naftaleno, sulfonato de 2-p-toluidinil-6-naftaleno y acido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfonico (EDANS). Otros colorantes indicadores fluorescentes incluyen cumarinas, tales como 3-fenil-7-isocianatocumarina; acudinas, tales como 9- isotiocianatoacridina y naranja de acridina; N-(p(2-benzoxazolil)fenil)maleimida; cianinas, tales como Cy2, indodicarbocianina 3 (Cy3), indodicarbocianina 5 (Cy5), indodicarbocianina 5.5 (Cy5.5), 3-(-carboxi-pentil)-3'etil-5,5'- dimetiloxacarbocianina (CyA); 1H,5H,11H,15H-Xanteno[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']diquinolizin-18-io, 9-[2(o 4)-[[[6-[2,5-dioxo-1- pirrolidinil)oxi]-6-oxohexil]amino]sulfonil]-4(o 2)-sulfofenil]-2,3,6,7,12,13,16,17octahidro-sal interna (TR o Rojo Texas); Colorantes BODIPYTM; benzoxadiazoles; estilbenos; pirenos; y similares. Muchas formas adecuadas de estos compuestos fluorescentes estan disponibles y pueden utilizarse.
Los ejemplos de protemas fluorescentes adecuadas para uso como agentes de formacion de imagenes incluyen, pero no se limitan a, la protema fluorescente verde, protema fluorescente roja (por ejemplo, DsRed), protema fluorescente amarilla, protema fluorescente cian, protema fluorescente azul y variantes de las mismas (veanse, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. N.° 6.403. 374. 6.800.733 y 7.157.566). Los ejemplos espedficos de variantes de GFP incluyen, pero no se limitan a, GFP potenciada (EGFP), EGFP desestabilizada, las variantes de GFP descritas en Doan et al, Mol. Microbiol, 55: 1767-1781 (2005), la variante de GFP descrita en Crameri et al, Nat. Biotechnol., 14: 315319 (1996), las protemas fluorescentes ceruleas que se describen en Rizzo et al, Nat. Biotechnol, 22: 445 (2004) y Tsien, Annu. Rev. Biochem., 67: 509 (1998) y la protema fluorescente amarilla descrita en Nagal et al, Nat. Biotechnol., 20: 87-90 (2002). Se describen variantes de DsRed en, por ejemplo, Shaner et al, Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572 (2004) e incluyen mStrawberry, mCherry, Morange, mBanana, mHoneydew y mTangerine. Se describen variantes adicionales DsRed en, por ejemplo, Wang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 101: 16745-16749 (2004) e incluyen mRaspberry y mPlum. Otros ejemplos de variantes de DsRed incluyen mRFPmars descritas en Fischer et al, FEBS Lett, 577: 227-232 (2004) y mRF-Pruby descrita en Fischer et al, fEbS Lett, 580: 2495-2502 (2006).
Los gases ecogenicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, un hexafluoruro de azufre o gas de perfluorocarbono, tal como perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropano, perfluorobutano, perfluorociclobutano, perfluropentano o perfluorohexano.
Los isotopos no metalicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, 11C, 14C, 13N, 18F, 123I, 124I y 125I. Los radioisotopos adecuados incluyen, pero no se limitan a, 99mTc, 95Tc, 111In, 62Cu, 64Cu, Ga, 68, Ga y 153Gd. Los iones metalicos paramagneticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, Gd(III), Dy(III), Fe(III) y Mn(II). Los absorbentes de rayos X adecuados incluyen, pero no se limitan a, Re, Sm, Ho, Lu, Pm, Y, Bi, Pd, Gd, La, Au, Au, Yb, Dy, Cu, Rh, Ag y Ir. En algunas realizaciones, el radionuclido se une a un agente quelante o agente quelante-enlazador unido al agregado. Los radionuclidos adecuados para la conjugacion directa incluyen, sin limitacion, 18F, 124I, 125I, 131I y mezclas de los mismos. Los radionuclidos adecuados para su uso con un agente quelante incluyen, sin limitacion, 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y 87Y 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi y mezclas de los mismos. Los agentes quelantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, DOTA, BAD, TETA, DTPA, EDTA, NTA, HDTA, sus analogos de fosfonato y mezclas de los mismos. Un experto en la materia estara familiarizado con los metodos para la fijacion de radionuclidos, agentes quelantes y agentes quelantes-enlazadores a las partmulas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Una respuesta detectable se refiere generalmente a un cambio en, o en la aparicion de, una senal que es detectable, ya sea por observacion o instrumentalmente. En ciertos casos, la respuesta detectable es fluorescencia o un cambio en la fluorescencia, por ejemplo, un cambio en la intensidad de la fluorescencia, la excitacion de la fluorescencia o la distribucion de la longitud de onda de emision, la duracion de la fluorescencia y/o la polarizacion de la fluorescencia. Un experto en la materia apreciara que el grado y/o ubicacion del marcador en un sujeto o muestra puede compararse con un patron o control (por ejemplo, tejido u organo sano). En algunos otros casos, la respuesta detectable es la radiactividad (es decir, radiacion), que incluye parffculas alfa, parffculas beta, nucleones, electrones, positrones, neutrinos y gamma rayos emitidos por una sustancia radiactiva tal como un radionuclido.
Los dispositivos espedficos o metodos conocidos en la tecnica para la deteccion in vivo de la fluorescencia, por ejemplo, de fluoroforos o protemas fluorescentes, incluyen, pero no se limitan a, fluorescencia in vivo cercana al infrarrojo (vease, por ejemplo, Frangioni, Curr. Opin. Chem Biol., 7: 626-634 (2003)), el sistema de formacion de imagenes por fluorescencia in vivo MaestroTM (Cambridge Research & Instrumentation, Inc.; Woburn, Massachussets), formacion de imagenes por fluorescencia in vivo utilizando un explorador de punto movil in situ (vease, por ejemplo, Ramanujam et al, IEEE Transactions on Biomedical Engineering., 48: 1034-1041 (2001) y similares. Otros metodos o dispositivos para la deteccion de una respuesta optica incluyen, sin limitacion, la inspeccion visual, camaras CCD, camaras de video, peffcula fotografica, dispositivos de exploracion laser, fluorometros, fotodiodos, contadores cuanticos, microscopios de epifluorescencia, microscopios de barrido, citometros de flujo, lectores de microplacas de fluorescencia o amplificacion de la senal utilizando tubos fotomultiplicadores.
Cualquier dispositivo o metodo conocido en la tecnica para detectar las emisiones radiactivas de radionuclidos en un sujeto es adecuado para su uso en la presente invencion. Por ejemplo, metodos tales como la Tomograffa Computarizada por emision de fotones individuales (SPECT), que detecta la radiacion de un solo foton de radionuclido emisor-gamma utilizando una camara gamma de rotacion, y centellograffa de radionuclidos, obteniendo una imagen o serie de imagenes secuenciales de la distribucion de un radionuclido en los tejidos, organos o sistemas del cuerpo utilizando una camara de centelleo gamma, puede utilizarse para detectar la radiacion emitida desde un agregado radiomarcado. La tomograffa por emision de positrones (PET) es otra tecnica adecuada para la deteccion de la radiacion en un sujeto.
En algunas realizaciones, el ligando es un ligando receptor de la superficie celular. Como se usa en el presente documento, un "ligando de receptor de la superficie celular" se refiere a una molecula que puede unirse a la superficie exterior de una celula. Un ligando de receptor de superficie celular de ejemplo incluye, por ejemplo, un peptido que se une a un receptor de la superficie celular, un glucopeptido que se une a un receptor de la superficie celular, una protema que se une a un receptor de la superficie celular, una glucoprotema que se une a un receptor de la superficie celular, un compuesto organico que se une a un receptor de la superficie celular y un farmaco que se une a un receptor de la superficie celular.
Los ligandos de un receptor de la superficie celular incluyen, pero no se limitan a, citocinas, factores de crecimiento, hormonas, anticuerpos y factores angiogenicos.
En algunas realizaciones, el ligando de un receptor de la superficie celular es transferrina o EGF.
Los ligandos que proporcionan una afinidad potenciada para una diana seleccionada tambien se denominan ligandos dirigidos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, la expresion "ligando dirigido" se refiere a una molecula que se une o interactua con una molecula diana. Normalmente, la naturaleza de la interaccion o union es no covalente, por ejemplo, mediante interacciones de hidrogeno, electrostaticas o de van der Waals, sin embargo, la union tambien puede ser covalente.
Como se usa en el presente documento, la expresion "ligando endosomofftico" se refiere a moleculas que tienen propiedades endosomoffticas. Los ligandos endosomoffticos promueven la lisis de y/o el transporte de la composicion de la invencion o sus componentes, de los compartimientos celulares tales como el endosoma, lisosomas, reffculo endoplasmatico (RE), aparato de Golgi, microtubulos, peroxisomas u otros cuerpos vesiculares dentro de la celula, al citoplasma de la celula. Algunos ligandos endosomoffticos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, imidazoles, poli u oligoimidazoles, polietileniminas lineales o ramificadas (PEI), poliaminas lineales y ramificadas, por ejemplo, la espermina, poliaminas lineales y ramificadas cationicas, policarboxilatos, policationes, oligo o poli cationes o aniones enmascarados, acetales, poliacetales, cetales/policetales, ortoesteres, poffmeros lineales o ramificados con cargas cationicas o anionicas enmascarados o sin enmascarar, dendnmeros con tensioactivos cationicos enmascarados o sin enmascarar o cargas anionicas, peptidos polianionicos, peptidomimeticos polianionicos, peptidos sensibles al pH, ffpidos fusogenicos naturales y sinteticos, ffpidos cationicos naturales y sinteticas.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "modulacion FC del ligando" y "moduladores FC" se refieren a moleculas que pueden modular la farmacocinetica de la composicion de la invencion. Algunos moduladores FC de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, moleculas lipofilas, acidos biliares, esteroles, analogos de fosfoffpidos, peptidos, agentes de union a protemas, vitaminas, acidos grasos, fenoxazina, aspirina, naproxeno,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
ibuprofeno, suprofeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, PEG, biotina y ligandos de union a transtiretia (por ejemplo, acido tetraiidotiroacetico, 2, 4, 6-triyodofenol y acido flufenamico).
En algunas realizaciones, un peptido anfifflico comprende al menos un (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o mas) ligando conjugado. Cuando dos o mas ligandos estan presentes, los ligandos pueden tener todos las mismas propiedades, tener todos diferentes propiedades o algunos ligandos tienen las mismas propiedades mientras que otros tienen propiedades diferentes. Por ejemplo, un ligando puede tener propiedades de direccion, tener una actividad endosomofftica o tener propiedades de modulacion de la FC. En consecuencia, los dos o mas ligandos pueden ser el mismo ligando, diferentes ligandos, el mismo tipo de ligando (por ejemplo, ligando de direccion, ligando endosomofftico, modulador de FC), diferentes tipos de ligando o cualquier combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, todos los ligandos tienen diferentes propiedades.
En algunas realizaciones, el peptido anfifflico comprende un poffmero hidrofilo seleccionado entre el grupo que consiste en poli(etilenglicol), poli(oxido de etileno), poli(propilenglicol), poli(oxido de etileno-co-oxido de propileno), acido hialuronico, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), heparina, polivinil(pirrolidona), sulfato de condroitano, quitosano, glucosaminoglicanos, dextrano, dextrina, sulfato de dextrano, acetato de celulosa, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, celulosicos, poli(trimetilenglicol), poli(tetrametilenglicol), polipeptidos, poliacrilamida, poliacrilamida, polietilenamina), poli(alil amina) y mezclas de los mismos y en el que el poffmero hidrofilo esta unido covalentemente con el segmento de peptidilo hidrofobo.
Union a peptidos
Una molecula (por ejemplo, un ligando) puede conjugarse con un peptido usando cualquiera de diversos metodos conocidos por los expertos en la materia. La molecula puede ser acoplarse o conjugarse con el peptido de manera covalente o no covalente. El enlace covalente entre la molecula y el peptido puede estar mediada por un enlazador. El enlace no covalente entre la molecula y el peptido puede estar basado en interacciones ionicas, interacciones de van der Waals, interacciones dipolo-dipolo, enlaces de hidrogeno, interacciones electrostaticas y/o interacciones de reconocimiento de forma.
Sin limitaciones, los ligandos pueden acoplarse a un peptido en diversos sitios, por ejemplo, el extremo N, el extremo C y/o en una posicion interna (por ejemplo, cadena lateral de un aminoacido). Cuando dos o mas ligandos estan presentes, el ligando puede estar en extremos opuestos de un peptido (por ejemplo, extremo N y extremo C).
Generalmente, el ligando se encuentra en el extremo terminal (por ejemplo, en la posicion 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 a contar desde el extremo) que esta mas lejos del segmento de peptidilo hidrofobo. Sin desear quedar ligado a teona alguna, esto permite que el ligando este en la posicion o cerca de la superficie de una parffcula formada por autoagregacion de los peptidos anfiffficos.
En algunas realizaciones, un ligando se encuentra en el extremo del segmento de peptidilo hidrofilo que no esta unido con el segmento de peptidilo hidrofobo. Por ejemplo, si el extremo N del segmento de peptidilo hidrofilo esta unido al segmento de peptidilo hidrofobo, entonces, el ligando se encuentra en la posicion 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 contando desde extremo C del segmento de peptidilo hidrofilo. Como alternativa, si el extremo C del segmento de peptidilo hidrofilo esta unido al segmento de peptidilo hidrofobo, entonces, el ligando se encuentra en la posicion 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 contando a partir del extremo N del segmento de peptidilo hidrofilo.
En algunas realizaciones, el ligando se une el peptido a traves de un enlazador. El ligando puede estar presente en un monomero cuando dicho monomero se incorpora en un peptido durante la smtesis. En algunas realizaciones, el ligando puede incorporarse a traves del acoplamiento a un monomero "precursor" despues de que dicho monomero "precursor" se ha incorporado en el peptido. Por ejemplo, un monomero que tiene, por ejemplo, un enlazador terminado en amino (es decir, que no tiene ningun ligando asociado) puede incorporarse en el peptido, por ejemplo, monomero-enlazador-NH2. En una operacion posterior, es decir, despues de la incorporacion del monomero precursor en el peptido, un ligando que tiene un grupo electrofilo, por ejemplo, un ester de pentafluorofenilo o grupo aldetffdo, puede posteriormente unirse al monomero precursor mediante el acoplamiento del grupo electrofilo del ligando con el grupo nucleofilo terminal de la cadena del monomero precursor. En otro ejemplo no limitante, un ligando que tiene un grupo electrofilo puede conectarse a un extremo N, extremo C o un grupo amino de cadena lateral interior. En otro ejemplo, un ligando que comprende tiol puede unirse a un peptido mediante un enlazador disulfuro cuando el peptido comprende una cistema.
Enlazadores
Como se usa en el presente documento, el termino "enlazador" significa un resto organico que conecta dos partes de un compuesto. Los enlazadores comprenden normalmente un enlace directo o un atomo tal como oxfgeno o azufre, una unidad tal como NH, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH, SS o una cadena de atomos, tales como alquilo C1-C6 sustituido o sin sustituir, alquenilo C2-C6 sustituido o sin sustituir, alquinilo C2-C6 sustituido o sin sustituir, arilo C6-C12 sustituido o sin sustituir, heteroarilo C5-C12 sustituido o sin sustituir, heterociclilo C5-C12 sustituido o sin sustituir, cicloalquilo C3-C12sustituido o sin sustituir, en el que uno o mas metilenos pueden interrumpirse o estar
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
terminados en O, S, S(O), SO2, NH, C(O).
En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador ramificado. El punto de ramificacion del enlazador ramificado puede ser al menos trivalente, pero puede ser un atomo tetravalente, pentavalente o hexavalente o un grupo que presente dichos multiples valencias. En algunas realizaciones, el punto de ramificacion es -N, -N(R)-C, -O-C, -S-C, - SS-C, -C(O)N(R)-C, -OC(O)N(R)-C, -N(R)C(O)-C o -N(R)C(O)OC; en los que R es independientemente para cada aparicion H o alquilo opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, el punto de ramificacion es glicerol o un derivado del mismo.
En algunas realizaciones, el enlazador comprende un grupo de union escindible. Como se usa en el presente documento, un "grupo de union escindible" es un resto qmmico que es suficientemente estable fuera de la celula, pero que tras la entrada en una celula diana se escinde para liberar las dos partes del enlazador que esta manteniendo juntas. En una realizacion preferida, el grupo de union escindible se escinde al menos 10 veces o mas, preferentemente al menos 100 veces mas rapido en la celula diana o en una primera condicion de referencia (que, por ejemplo, puede seleccionarse para imitar o representar las condiciones intracelulares) que en la sangre o suero de un sujeto, o en una segunda condicion de referencia (que, por ejemplo, puede seleccionarse para imitar o representar condiciones que se encuentran en la sangre o suero).
Los grupos de union escindibles son susceptibles a los agentes de escision, por ejemplo, pH, potencial redox o la presencia de moleculas de degradacion. Generalmente, los agentes de escision son mas frecuentes o se encuentran a niveles o actividades mas altos dentro de las celulas que en el suero o la sangre. Los ejemplos de dichos agentes de degradacion incluyen: agentes redox que se seleccionan para sustratos particulares o que no tienen especificidad por el sustrato, incluyendo, por ejemplo, enzimas oxidantes o reductoras o agentes reductores tales como mercaptanos, presentes en las celulas, que pueden degradar un grupo de union escindible por redox mediante reduccion; esterasas; amidasas; endosomas o agentes que pueden crear un ambiente acido, por ejemplo, los que dan como resultado un pH de cinco o inferior; enzimas que pueden hidrolizar o degradar un grupo de union escindible por acido actuando como un acido general, peptidasas (que puede ser el sustrato espedfico) y proteasas, y fosfatasas.
Un enlazador puede incluir un grupo de union escindible que es escindible por una enzima particular. El tipo de grupo de union escindible incorporado en un enlazador puede depender de la celula a la que se dirige. Por ejemplo, para la direccion al hngado, los grupos de union escindibles pueden incluir un grupo ester. Las celulas del hngado son ricas en esterasas y por tanto el enlazador se escinde de manera mas eficiente en las celulas hepaticas que en tipos de celulas que no sean ricas en esterasas. Otros tipos de celulas ricas en esterasas incluyen las celulas de los pulmones, la corteza renal y los testfculos.
Los enlazadores que contienen enlaces peptfdicos pueden utilizarse cuando se dirigen a tipos de celulas ricas en peptidasas, tales como las celulas del hngado y los sinoviocitos.
En algunas realizaciones, el grupo de union escindible se escinde al menos 1,25, 1,5, 1,75, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50 o 100 veces mas rapido en la celula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones intracelulares) en comparacion con la sangre o el suero (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones extracelulares). En algunas realizaciones, el grupo de union escindible se escinde menos del 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % en la sangre (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones extracelulares) en comparacion con las condiciones en la celula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar las condiciones intracelulares).
Los grupos de union escindibles de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, grupos de union escindibles por redox (por ejemplo, -SS- y -C(R)2-S-S-, en los que R es H o alquilo C1-C6 y al menos un R es alquilo C1-C6 tal como CH3 o CH2CH3); grupos de union escindibles a base de fosfato (por ejemplo -O-P(O)(OR)-O-, -O-P(S)(OR)-O-, -O- P(S)(SR)-O-, -S-P(O)(OR)-O-, -OP(O)(OR)-S-, -S-P(O)(OR)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(OR)-O-, -O-P(O)(R)-O-, - O-P(S)(R)-O-, -S-P(O)(R)-O-, -SP(S)(R)-O-, -S-P(O)(R)-S-, -O-P(S)(R)-S-, -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O- P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -OP(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-,-O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O- P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -SP(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S- y -O-P(S)(H)-S-, en los que R es alquilo C1-C10 lineal o ramificado opcionalmente sustituido); grupos de union escindibles por acido (por ejemplo, hidrazonas, esteres y esteres de aminoacidos, -C=NN y -OC(O)-); grupos de union escindibles a base de esteres (por ejemplo, -C(O)O-); grupos de union escindibles a base de peptidos, (por ejemplo, grupos que se escinden por enzimas como peptidasas y proteasas en las celulas, por ejemplo, -NHCHRaC(O)NHCHrbC(O)-, donde RA y RB son los grupos R de los dos aminoacidos adyacentes). Un grupo de union escindible a base de peptidos comprende dos o mas aminoacidos. En algunas realizaciones, el enlace de escision a base de peptidos comprende la secuencia de aminoacidos que es el sustrato para una peptidasa o una proteasa que se encuentra en las celulas.
En algunas realizaciones, un grupo de union escindible por acido es escindible en un ambiente acido con un pH de aproximadamente 6,5 o inferior (por ejemplo, aproximadamente 6,0, 5,5, 5,0 o menor) o por agentes tales como enzimas que pueden actuar como un acido general.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ademas de enlaces covalentes, dos partes de un compuesto pueden estar unidas entre sf por un par de union por afinidad. La expresion "par de union por afinidad" o "par de union" se refiere a primeras y segundas moleculas que se unen espedficamente entre sr Un miembro del par de union se conjuga con la primera parte que se va a unir mientras que el segundo miembro se conjuga con la segunda parte que se va a unir. Como se usa en el presente documento, la expresion "union espedfica" se refiere a la union del primer miembro del par de union al segundo miembro del par de union con mayor afinidad y especificidad que a otras moleculas.
Los pares de union de ejemplo incluyen cualquier compuesto haptenico o antigenico en combinacion con un anticuerpo correspondiente o porcion o fragmento de union del mismo (por ejemplo, digoxigenina y anti- digoxigenina, inmunoglobulina de raton e inmunoglobulina de cabra anti-raton) y pares de union no inmunologicos (por ejemplo, biotina-avidina, biotina-estreptavidina, hormona [por ejemplo, tiroxina y protema de union a hormona cortisol, receptor-agonista del receptor, receptor-antagonista del receptor (por ejemplo, receptor de acetilcolina- acetilcolina o un analogo del mismo), IgG-protema A, lectina-carbohidrato, enzima-cofactor de la enzima, enzima- inhibidor de la enzima y pares de oligonucleotidos complementarios capaces de formar acidos nucleicos bicatenarios) y similares. El par de union tambien puede incluir una primera molecula que esta cargada negativamente y una segunda molecula que esta cargada positivamente.
Un ejemplo del uso de la conjugacion del par de union es la conjugacion de biotina-avidina o biotina-estreptavidina. En este enfoque, una de las moleculas o el peptido estan biotinilados y el otro esta conjugado con avidina o estreptavidina. Muchos kits comerciales tambien estan disponibles para moleculas de biotinilacion, tales como las protemas.
Otro ejemplo del uso de la conjugacion del par de union es el metodo de biotina-sandwich. Vease, por ejemplo, Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 103: 8155-60 (2006). Las dos moleculas que se van a conjugan juntas se biotinilan y despues se conjugan entre sf utilizando estreptavidina tetravalente como enlazador.
Otro ejemplo mas del uso de la conjugacion del par de union es la conjugacion de acido nucleico bicatenario. En este enfoque, la primera parte que se va a unir se conjuga con una primera cadena del acido nucleico bicatenario y la segunda parte que se va a unir se conjuga con la segunda cadena del acido nucleico bicatenario. Los acidos nucleicos pueden incluir, sin limitacion, segmentos de secuencia definidos y secuencias que comprenden nucleotidos, ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, analogos de nucleotidos, nucleotidos modificados y nucleotidos que comprenden modificaciones de la cadena principal, puntos de union y restos no nucleoffdicos, grupos o puentes.
Partculas de peptido
El inventor tambien ha descubierto que los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento se someten a la auto-agregacion para formar agregados supramoleculares. Por tanto, en otro aspecto, la invencion proporciona parffculas de peptidos que comprenden un peptido anfifflico que se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos comprende una pluralidad de peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento. Por ejemplo, una parffcula de peptidos puede comprender al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 75, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 750, al menos aproximadamente 1000, al menos aproximadamente 2500, al menos aproximadamente 5000, al menos aproximadamente 10000 o mas peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento. La pluralidad de peptidos anfifflicos presentes en una parffcula de peptidos puede comprender una realizacion de un peptido anfifflico que se describe en el presente documento o al menos dos realizaciones diferentes de un peptido anfifflico que se describe en el presente documento.
El termino "parffcula" incluye esferas; nanobastones; y prismas. Las parffculas de peptidos que se describen en el presente documento difieren de micelas, liposomas y otras parffculas que comprenden una cubierta distinta (por ejemplo, una capa de ffpidos), que sirve como material de formacion de la pared, que rodea los medios encapsulados situados dentro de la cubierta. Las parffculas que se describen en el presente documento son parffculas solidas. Las parffculas pueden ser, por ejemplo, monodispersas o polidispersas y la variacion en el diametro de las parffculas de una dispersion dada puede variar. Sin embargo, puesto que pueden obtenerse peptidos anfifflicos de un tamano uniforme, las parffculas que se describen en el presente documento generalmente son monodispersas. En consecuencia, en algunas realizaciones, el diametro de una parffcula se describe en el presente documento esta dentro de ± el 2,5 %, dentro de ± el 5 %, dentro de ± el 10 %, dentro de ± el 15 %, dentro de ± el 20 %, dentro de ± el 25 %, dentro de ± el 30 % o dentro de ± el 35 % del diametro medio.
En algunas realizaciones, una parffcula de peptidos que se describe en el presente documento es una nanoparffcula. Como se usa en el presente documento, el termino "nanoparffculas" se refiere a parffculas que son del orden de 10'9 o una mil millonesima parte de un metro y por debajo de 10'6 o 1 millonesima parte de un metro de tamano.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En general, las parffculas de peptidos tienen un diametro medio de aproximadamente 5nm a aproximadamente 5000 nm. En algunas realizaciones, las parffculas tienen un diametro medio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 2500 nm. En algunas realizaciones, las parffculas tienen un diametro medio de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 2000 nm. En algunas realizaciones, las parffculas tienen un diametro medio de aproximadamente 150 nm a aproximadamente 1700 nm. En algunas realizaciones, las parffculas tienen un diametro medio de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1500 nm. En algunas realizaciones, las parffculas tienen un diametro medio de aproximadamente 260 nm. En una realizacion, las parffculas tienen un diametro medio de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 150 nm. Sin desear quedar ligado a teoffa alguna, el tamano de parffcula puede modularse cambiando la concentracion del peptido anfifflico en la solucion utilizada para la fabricacion de las parffculas de peptidos.
En algunas realizaciones, una parffcula de peptidos que se describe en el presente documento comprende una mezcla de peptidos anfifflicos totalmente enmascarados y peptidos anfifflicos parcialmente o no enmascarados. Como se usa en el presente documento un "peptido no enmascarado" se refiere a un peptido anfifflico en el que ninguno del grupo amino del extremo N y los grupos amino de la cadena lateral en el segmento de peptidilo hidrofilo se conjuga con un grupo protector de nitrogeno o de amino.
Cambiando la relacion de peptidos totalmente enmascarados a parcialmente enmascarados o no enmascarados, la carga neta de la parffcula de peptidos puede variarse. Sin desear quedar ligado a teona alguna, relaciones mas altas de peptidos totalmente enmascarados pueden aumentar la estabilidad de las parffculas, mientras que relaciones mas altas de peptidos parcialmente y/o no enmascarados pueden aumentar la carga de las moleculas que llevan cargas anionicas (por ejemplo, acidos nucleicos, tales como ADN o ARN incluyendo ARNip) y una mayor capacidad para penetrar una membrana celular.
En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos puede comprender un peptido anfifflico totalmente enmascarado (por ejemplo, un peptido anfifflico totalmente acetilado). La expresion "peptido anfifflico totalmente acetilado" como se usa en el presente documento, se refiere a un peptido anfifflico en el que se acetilan todos, el grupo amino del extremo N y los grupos amino de la cadena lateral, en el segmento de peptidilo hidrofilo.
En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos puede comprender una mezcla de peptidos totalmente enmascarados (por ejemplo, totalmente acetilados) y parcialmente enmascarados (por ejemplo, parcialmente acetilados). Como se usa en el presente documento, la expresion "peptido anfifflico parcialmente acetilado" se refiere a un peptido anfifflico en el que al menos uno del grupo amino del extremo N y los grupos amino de la cadena lateral en el segmento de peptidilo hidrofilo se acetila, pero no todos ellos. En algunas realizaciones un peptido anfifflico parcialmente acetilado puede tener el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico acetilado, pero no cualquiera de los grupos amino de la cadena lateral en el segmento de peptidilo hidrofilo. En algunas realizaciones, un peptido anfifflico parcialmente acetilado puede tener al menos uno (incluyendo al menos dos o mas) de los grupos amino de la cadena lateral en el segmento de peptidilo hidrofilo acetilado, pero no el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico. En algunas realizaciones, un peptido anfifflico parcialmente acetilado puede tener tanto el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico y al menos uno (incluyendo al menos dos o mas), pero no todos, de los grupos amino de la cadena lateral en el peptidilo hidrofilo segmento acetilado.
En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos puede comprender una mezcla de peptidos anfifflicos totalmente enmascarados (por ejemplo, totalmente acetilados) y no enmascarados (por ejemplo, no acetilados). Como se usa en el presente documento, la expresion "peptido anfifflico no acetilado" se refiere a un peptido anfifflico en el que no se acetila ninguno entre el grupo amino del extremo N y los grupos amino de la cadena lateral en el segmento de peptidilo hidrofilo. En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos puede comprender una mezcla de peptidos anfifflicos totalmente enmascarados (por ejemplo, completamente acetilados), parcialmente enmascarados (por ejemplo, parcialmente acetilados) y no enmascarados (por ejemplo, no acetilados).
En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos no comprende un peptido anfifflico completamente enmascarado, por ejemplo, la parffcula comprende peptidos anfifflicos parcialmente enmascarados o una mezcla de peptidos parcialmente enmascarados. En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos comprende una mezcla de peptidos parcialmente enmascaradas y no enmascaradas.
Sin limitaciones, la relacion de peptidos totalmente enmascarados a parcialmente enmascarados o peptidos no enmascarados en la parffcula de peptidos puede variar de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 1:100. En algunas realizaciones, la relacion de peptidos totalmente enmascarados a parcialmente enmascarados o peptidos no enmascarados en las parffculas de peptidos vaffa de aproximadamente 95:5 a aproximadamente 1:1.
Las parffculas que se describen en el presente documento pueden utilizarse para la administracion de farmacos. Por tanto, puede incluirse una amplia diversidad de agentes terapeuticos en las parffculas que se describen en el presente documento. En consecuencia, en algunas realizaciones, una parffcula de peptidos que se describe en el presente documento puede comprender un principio activo que se describe en el presente documento. Un principio activo puede estar unido covalentemente con un componente, por ejemplo, un peptido anfifflico, de la parffcula de peptidos. En algunas realizaciones, el principio activo en la parffcula de peptidos que se describe en el presente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
documento no esta unido covalentemente a un componente de la parffcula. Sin limitaciones, el principio activo puede estar absorbido/adsorbido en la superficie de la parffcula, encapsulado en la parffcula o distribuido (homogenea o no homogenea) a traves de la parffcula.
En general, cualquier relacion de principio activo a peptidos anfifflicos puede estar presente en la parffcula de peptidos que se describe en el presente documento. En consecuencia, en algunas realizaciones, la relacion del principio activo a los peptidos anfifflicos vana de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 1:100.000. En algunas realizaciones, la relacion del principio activo a los peptidos anfifflicos vana de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:100.000. En algunas realizaciones, la relacion del principio activo a los peptidos anfifflicos vana de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10.000. En algunas realizaciones, la relacion del principio activo a los peptidos anfifflicos vana de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:1000. En algunas realizaciones, la relacion del principio activo a los peptidos anfifflicos vana de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:100. En algunas realizaciones, la relacion del principio activo a los peptidos anfifflicos vana de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, la relacion del principio activo a los peptidos anfifflicos vana de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 1:500. En algunas realizaciones, la relacion del principio activo a los peptidos anfifflicos vana de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:25.
En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos puede comprender un ligando. Sin limitaciones, un ligando puede estar unido covalentemente con un componente, por ejemplo, un peptido anfifflico, de las parffculas. En algunas realizaciones, un ligando no esta unido covalentemente a un componente de la parffcula, por ejemplo, el ligando se absorbe/adsorbe en la superficie de la parffcula, el ligando se encapsula en la parffcula o el ligando se distribuye (homogenea o no homogeneamente) en toda de la parffcula. En algunas realizaciones, el ligando es un ligando de direccion.
En algunas realizaciones, el ligando forma una capa en la superficie de la parffcula de peptidos, por ejemplo, el ligando forma una corona alrededor de la parffcula. Cuando el ligando forma una capa en la superficie de la parffcula, el espesor de la capa puede variar de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm. En algunas realizaciones, el espesor de la capa es de aproximadamente 10 nm.
En general, cualquier relacion de un ligando a los peptidos anfifflicos puede estar presente en la parffcula. En consecuencia, en algunas realizaciones, la relacion del ligando a los peptidos anfifflicos vana de aproximadamente 1000:1 a aproximadamente 1:1.000.000. En algunas realizaciones, la relacion del ligando a los peptidos anfifflicos vana de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:1.000.000. En algunas realizaciones, la relacion del ligando a los peptidos anfifflicos vana de aproximadamente 500:1 a aproximadamente 1:500. En algunas realizaciones, la relacion del ligando a los peptidos anfifflicos vana de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 1:250. En algunas realizaciones, la relacion del ligando a los peptidos anfifflicos vana de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:1000.
En algunas realizaciones, una parffcula de peptidos puede comprender tanto un principio activo (por ejemplo, un agente terapeutico) como un ligando. En algunas realizaciones, una parffcula de peptidos puede comprender un principio activo (por ejemplo, un agente terapeutico) distribuido dentro de la parffcula y un ligando en la superficie exterior de la parffcula.
Sin limitaciones, pueden fabricarse diferentes tipos de parffculas de peptidos, por ejemplo, (1) parffculas formadas a partir de peptidos anfifflicos solamente; (2) parffculas formadas a partir de los peptidos anfifflicos a las que una molecula de interes, por ejemplo, un principio activo o un ligando, se absorbe/adsorbe o forma un recubrimiento sobre un nucleo de peptidos anfifflicos; (3) parffculas formadas a partir de un nucleo formado por una molecula de interes, por ejemplo, un principio activo o un ligando, que se recubre con una capa de peptidos anfifflicos; (4) parffculas formadas a partir de peptidos anfifflicos a los que una molecula de interes, por ejemplo, un principio activo o un ligando, se une de forma covalente; (5) parffculas formadas a partir de una mezcla de una molecula de interes (por ejemplo, un principio activo o un ligando) y peptidos anfifflicos; y (6) parffculas formadas de manera que comprendan una mezcla generalmente homogenea de una molecula de interes, por ejemplo, un principio activo o un ligando con peptidos anfifflicos o cualquier combinacion de los mismos. Por ejemplo, una parffcula de peptidos puede formarse a partir de los peptidos anfifflicos en los que una primera molecula de interes, por ejemplo, un principio activo o un ligando, se absorbe/adsorbe o forma un revestimiento sobre un nucleo de peptidos anfifflicos, en los que el nucleo de los peptidos anfifflicos comprende ademas una segunda molecula de interes, por ejemplo, un principio activo. En estas realizaciones, la segunda molecula de interes puede ser igual o diferente de la primera molecula de interes.
En algunas realizaciones, una parffcula de peptidos puede comprender adicionalmente un poffmero, por ejemplo, un poffmero biocompatible. Como se usa en el presente documento, el termino "biocompatible" significa la exposicion de esencialmente ninguna citotoxicidad o inmunogenicidad mientras esta en contacto con fluidos o tejidos corporales. Como se usa en el presente documento, el termino "poffmero" se refiere a oligomeros, co-oligomeros, poffmeros y copoffmeros, por ejemplo, de bloques al azar, de bloques multiples, estrella, injertados, copoffmeros de gradiente y combinacion de los mismos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La expresion "poffmero biocompatible" se refiere a poffmeros que son no toxicos, qmmicamente inertes y sustancialmente no inmunogenos cuando se utilizan internamente en un sujeto y que son sustancialmente insolubles en la sangre. El poffmero biocompatible puede ya sea no biodegradable o, preferentemente, biodegradable. Preferentemente, el poffmero biocompatible es tambien no inflamatoria cuando se emplea in situ.
Se desvelan poffmeros biodegradables en la tecnica. Los ejemplos de poffmeros biodegradables adecuados incluyen, pero no se limitan a, poffmeros de cadena lineal tales como polilactidos, poliglicolidos, policaprolactonas, copoffmeros de acido polilactico y acido poliglicolico, polianfffdridos, poliepsilon caprolactona, poliamidas, poliuretanos, poliesteramidas, poliortoesteres, polidioxanonas, poliacetales, policetales, policarbonatos, poliortocarbonatos, polidihidropiranos, polifosfacenos, polihidroxibutiratos, polihidroxivaleratos, oxalatos de polialquileno, succinatos de polialquileno, poli(acido malico), poli(aminoacidos), polivinilpirrolidona, polietilenglicol, polihidroxicelulosa, metacrilato de polimetilo, quitina, quitosano, copoffmeros de acido polilactico y acido poliglicolico, poli(sebacato de glicerol) (PGS) y copoffmeros, terpoffmeros y copoffmeros que incluyen uno o mas de los anteriores. Otros poffmeros biodegradables incluyen, por ejemplo, gelatina, colageno, seda, quitosano, alginato, celulosa, acidos poli-nucleicos, etc.
Los poffmeros biocompatibles adecuados no biodegradables incluyen, a modo de ejemplo, acetatos de celulosa (incluyendo diacetato de celulosa), polietileno, polipropileno, polibutileno, tereftalato de polietileno (PET), cloruro de polivinilo, poliestireno, poliamidas, nailon, policarbonatos, polisulfuros, polisulfonas, hidrogeles (por ejemplo, acrfficos), poliacrilonitrilo, polivinilacetato, butirato de acetato de celulosa, nitrocelulosa, copoffmeros de uretano/carbonato, copoffmeros de estireno/acido maleico, poli(etilenimina), poloxameros (por ejemplo Pluronic tal como Poloxameros 407 y 188), acido hialuronico, heparina, agarosa, pululano y copoffmeros que incluyen uno o mas de los anteriores, tales como copoffmeros de etileno/alcohol vinffico (EVOH).
Las partfculas de peptidos tambien pueden comprender restos adicionales que pueden ampliar la vida util de las partfculas in vivo. Por ejemplo, las partfculas de peptidos pueden comprender restos funcionales que potencian la vida util in vivo de las partfculas en la sangre. Un resto a modo de ejemplo para aumentar la vida util in vivo es el polietilenglicol. En consecuencia, las partfculas de peptidos pueden comprender polietilenglicol ademas del peptido anfifflico.
Realizaciones adicionales de las particulas de peptido
En una realizacion, una partfcula de peptidos que se describe en el presente documento comprende realizaciones particulares de un peptido anfifflico que se describe en el presente documento. El peptido anfifflico presente en esta realizacion de la parffcula de peptidos comprende un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo, en el que el segmento de peptidilo hidrofobo comprende una secuencia de aminoacidos de (Trp-Leu)m- (Trp)n o (Leu-Trp)p-(Leu)q, en las que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L-Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 5 y n y q son independientemente 0 o 1, siempre que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu, y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa; y en el que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos de(Lys)r, en el que r es un numero entero de 1 a 15 y en el que la parffcula de peptidos comprende ademas en su superficie exterior un ligando que se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos puede comprender una o mas realizaciones de un peptido anfifflico descrito anteriormente en la seccion "peptidos anfifflicos de ejemplo". En una realizacion, la parffcula de peptidos puede comprender un peptido anfifflico con una secuencia de aminoacidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L- Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X, en la que X esta ausente o es NH2. Como se ha descrito anteriormente, en algunas realizaciones, al menos uno de los restos de Lys del segmento de peptidilo hidrofilo o el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico estan acetilados. En algunas realizaciones, todos los restos de Lys del segmento de peptidilo hidrofilos estan acetilados. En algunas realizaciones, el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico y todos los restos de Lys del segmento de peptidilo hidrofilo estan acetilados.
El ligando presente en la superficie exterior de la parffcula de peptidos puede seleccionarse basandose en los tipos de moleculas diana (por ejemplo, pero no limitados a, celulas, bacterias, protemas y/o acidos nucleicos) a las que se unira y/o con las que interactuara la parffcula de peptidos. Por ejemplo, para facilitar la entrega de una parffcula de peptidos que se describe en el presente documento a una celula, puede seleccionarse un ligando especffico para el receptor de superficie celular, facilitando asf la absorcion de la parffcula de peptidos por la celula, por ejemplo, a traves de endocitosis. Por tanto, algunas realizaciones de las parffculas de peptidos que se describen en el presente documento pueden utilizarse para la administracion dirigida de cualquier principio activo que se describe en el presente documento usando las parffculas de peptidos como excipientes de entrega o velffculos. En una realizacion, las parffculas de peptidos pueden utilizarse para entregar a una celula un principio activo que es impermeable a las celulas cuando se entrega solo.
Como se ha descrito anteriormente, en algunas realizaciones, la parffcula de peptidos puede comprender una mezcla de peptidos anfifflicos totalmente enmascarados (por ejemplo, totalmente acetilados) y parcialmente enmascarados (por ejemplo, parcialmente acetilados) que se describen en el presente documento. En aquellas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
realizaciones, la relacion de peptidos anfifflicos totalmente acetilados a los parcialmente enmascarados puede variar de aproximadamente 95:5 a aproximadamente 1:1. En ciertas realizaciones, la parffcula puede comprender ademas peptidos anfifflicos no enmascarados (por ejemplo, no acetilados).
En consecuencia, tambien se proporciona en el presente documento una parffcula de peptidos mixta que comprende un peptido anfifflico totalmente acetilado y un peptido anfifflico parcialmente acetilado o no acetilado. En realizaciones espedficas, las parffculas de peptidos mixtas comprenden un primer peptido anfifflico y un segundo peptido anfifflico, en la que el primer y el segundo peptido anfifflico comprenden cada uno, independientemente, un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo, en los que el segmento de peptidilo hidrofobo comprende una secuencia de aminoacidos de (Trp-Leu)m-(Trp)n o (Leu-Trp)p-(Leu)q, en la que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L-Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 5 y n y q son independientemente 0 o 1, a condicion de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa; mientras que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, en la que r es un numero entero de 1 a 15. Ademas, el grupo amino del extremo N y todos los restos de Lys del primer peptido anfifflico estan acetilados; mientras que al menos el grupo amino del extremo N o uno de los restos de Lys del segundo peptido anfifflico no estan acetilados. En algunas realizaciones, ninguno de los grupo amino del extremo N ni los restos de Lys del segundo peptido anfifflico estan acetilados.
En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos mixta puede comprender una pluralidad (por ejemplo, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o mas) de los primeros peptidos anfifflicos y una pluralidad (por ejemplo, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o mas) de los segundos peptidos anfifflicos.
En realizaciones particulares, el primer peptido o peptidos anfifflicos y el segundo peptido o peptidos anfifflicos pueden seleccionarse entre una cualquiera o mas realizaciones de un peptido anfifflico descrito anteriormente en la seccion "peptidos anfifflicos de ejemplo". En algunas realizaciones, el primer y el segundo peptido anfifflico pueden comprender cada uno independientemente una secuencia de aminoacidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D- Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X, en el que X esta ausente o es NH2.
La relacion del primer peptido anfifflico al segundo peptido anfifflico puede variarse basandose en una serie de factores, por ejemplo, pero no limitados a, la solubilidad y/o estabilidad de la parffcula de peptidos deseable y/o las propiedades del principio activo que se va a cargar en la misma. En algunas realizaciones, la relacion del primer peptido anfifflico al segundo peptido anfifflico puede estar en un intervalo de aproximadamente 1:1000 a aproximadamente 1000:1. En algunas realizaciones, la relacion del primer peptido anfifflico al segundo peptido anfifflico puede estar en un intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1000:1. En algunas realizaciones, la relacion del primer peptido anfifflico al segundo peptido anfifflico puede estar en un intervalo de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 500:1. En algunas realizaciones, la relacion del primer peptido anfifflico al segundo peptido anfifflico puede estar en un intervalo de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 200:1. En otras realizaciones, la relacion del primer peptido anfifflico al segundo peptido anfifflico puede estar en un intervalo de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 100:1.
En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos mixta puede comprender ademas un principio activo que se describe en el presente documento. El principio activo puede estar presente en la parffcula de peptidos mezclado en cualquier cantidad, por ejemplo, dependiendo de la capacidad de carga de la parffcula de peptidos y/o de la capacidad de union del primer o el segundo peptido anfifflico. En algunas realizaciones, la relacion del principio activo a los segundos peptidos anfifflicos puede estar en un intervalo de aproximadamente 1:1000 a 1:1: En algunas realizaciones, la relacion del principio activo a los segundos peptidos anfifflicos puede ser o aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, la relacion del principio activo al segundo peptido anfifflico puede estar en un intervalo de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:5. En algunas realizaciones, la relacion del principio activo al segundo peptido anfifflico puede estar en un intervalo de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:2.
En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos mixta puede comprender, ademas, en su superficie exterior un ligando que se describe en el presente documento. Como se ha descrito anteriormente, la seleccion de un ligando puede determinarse basandose en una molecula diana (por ejemplo, pero no limitada a, celulas, bacterias, protemas, acidos nucleicos) a la que se une la parffcula de peptidos mixta. Los ejemplos no limitantes de un ligando pueden incluir un ligando de receptor de superficie celular o una protema tal como un anticuerpo. En algunas realizaciones, el ligando puede estar unido covalentemente a al menos uno del primer y el segundo peptido anfifflico, por ejemplo, el segmento de peptidilo hidrofilo de al menos uno del primer y el segundo peptido anfifflico.
La parffcula de peptidos mixta que se describe en el presente documento puede utilizarse para encapsular cualquier principio activo que se describe en el presente documento. Sin desear quedar ligado a teoffa alguna, la presencia del segundo peptido anfifflico en la parffcula de peptidos mixta puede proporcionar una carga cationica para la union con moleculas de acido nucleico anionicas. Por tanto, en algunas realizaciones, el principio activo puede incluir una molecula de acido nucleico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Un aspecto adicional proporcionado en el presente documento se refiere al uso de una o mas realizaciones de la parffcula de peptidos mixta que comprende un primer peptido anfifflico y un segundo peptido anfifflico que se describen en el presente documento para la entrega de una molecula de acido nucleico a una celula. En consecuencia, en algunas realizaciones, la parffcula de peptidos mixta para su uso en la entrega de una molecula de acido nucleico a una celula comprende un primer peptido anfifflico, un segundo peptido anfifflico y una molecula de acido nucleico. En algunas realizaciones, la parffcula de peptidos mixta puede comprender una pluralidad (por ejemplo, al menos 2 o mas) de moleculas de acido nucleico u oligonucleotidos (por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo, pero no limitados a, ARNip, ARNhc, ARNmi o cualquier combinacion de los mismos). En algunas realizaciones, las moleculas de acidos nucleicos o los oligonucleotidos pueden disenarse para su uso en la intervencion terapeutica, por ejemplo, la terapia genica o la terapia con ARNip.
Ensamblaje de partfculas de peptidos
Las partfculas de peptidos que se describen en el presente documento pueden ensamblarse mediante un procedimiento en una sola etapa. Por ejemplo, las partfculas de peptidos pueden ensamblarse oportunamente a partir de peptido anfifflico disuelto por adicion de agua: una emulsion formada espontaneamente como una mezcla ternaria (peptido, disolvente organico, H2O) se lleva a la region de dos fases (peptido, H2O). Mientras que el proceso de emulsion se asemeja al efecto ouzo, las gotas de peptidos anfifflicos se endurecen a partfculas solidas a medida que se elimina el disolvente organico. Moleculas neutras asf como cargadas migran eficientemente en la fase dispersa y quedan atrapadas durante la formacion de las partfculas.
En general, las partfculas de peptidos que comprenden un principio activo y un ligando pueden ensamblarse en aproximadamente 15 minutos usando el procedimiento que se describe en el presente documento. Ademas, el sistema permite el ajuste sencillo del tamano de parffcula y atrapa principios activos en muy alta densidad.
Sin desear quedar ligado a teoffa alguna, la simplicidad del sistema y el protocolo de formacion se originan en la interaccion concertada de todos los componentes implicados de una parffcula de peptidos: los peptidos anfifflicos no solo son material de la matriz, sino que reemplazan rutinas de encapsulacion debido a su alta afinidad por otros componentes tales como un ligando y/o un principio activo. El proceso de encapsulacion del principio activo se asemeja muy probablemente a una extraccion ffquida de dos fases en la que el principio activo se escapa de la fase acuosa y se acumula en gotitas de peptidos. Adicionalmente, la solubilidad del peptido en disolventes organicos suaves permite la disolucion y el auto-ensamblaje simultaneos de todos los componentes implicados. La presencia de un ligando durante la emulsion de los peptidos puede dar como resultado la formacion de una corona de ligandos. Adicionalmente, la presencia del ligando puede permitir el ajuste sencillo del tamano de parffcula debido a su tensioactividad y, por tanto, la estabilizacion temprana de la emulsion de peptidos.
Composiciones farmaceuticas
Para la administracion a un sujeto, pueden proporcionarse parffculas de peptidos y principio activo - complejos de peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento en composiciones farmaceuticamente aceptables. Estas composiciones farmaceuticamente aceptables comprenden una parffcula o un principio activo - complejo de peptido anfifflico formulados junto con uno o mas velffculos farmaceuticamente aceptables (aditivos) y/o diluyentes. Como se describe en detalle a continuacion, las composiciones farmaceuticas que se describen en el presente documento pueden formularse especialmente para la administracion en forma solida o ffquida, incluyendo las adaptadas para lo siguiente: (1) administracion oral, por ejemplo, pociones(soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), sondas, pastillas para chupar, grageas, capsulas, pffdoras, comprimidos (por ejemplo, los que tienen por objeto la administracion bucal, sublingual y la absorcion sistemica), bolos, polvos, granulos, pastas para su aplicacion a la lengua; (2) administracion parenteral, por ejemplo, por inyeccion subcutanea, intramuscular, intravenosa o epidural en forma de, por ejemplo, una solucion o suspension esteril o una formulacion de liberacion sostenida; (3) aplicacion topica, por ejemplo, en forma de una crema, pomada o un parche de liberacion controlada o pulverizacion aplicada a la piel; (4) por via intravaginal o intrarrectal, por ejemplo, en forma de un pesario, crema o espuma; (5) por via sublingual; (6) por via ocular; (7) por via transdermica; (8) por via transmucosa; o (9) por via nasal. Adicionalmente, los compuestos pueden implantarse o inyectarse en un paciente mediante un sistema de entrega de farmacos. Vease, por ejemplo, Urquhart, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, ed. "Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, Nueva York, 1981); Patente de los EE.UU. N.° 3.773.919; y Patente de los Estados Unidos. N° 35 3.270; 960.
Como se usa en el presente documento, la expresion "farmaceuticamente aceptable" se refiere a los compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificacion que son, dentro del alcance del criterio medico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritacion, respuesta alergica, u otro problema o complicacion, acordes con una relacion beneficio/riesgo razonable.
Como se usa en el presente documento, la expresion "velffculo farmaceuticamente aceptable" significa un material, composicion o velffculo farmaceuticamente aceptable, tal como una carga ffquida o solida, diluyente, excipiente, coadyuvante (por ejemplo, lubricante, talco, magnesio, calcio o estearato de cinc o acido esterico) o material de encapsulacion disolvente, involucrados en llevar o transportar el compuesto objeto desde un organo o parte del
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
cuerpo, a otro organo o parte del cuerpo. Cada vehnculo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulacion y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehnculos farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) azucares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidon de mafz y almidon de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina y acetato de celulosa; (4) goma tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, lauril sulfato de sodio y talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de cartamo, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de mafz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol (PEG); (12) esteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tales como hidroxido de magnesio e hidroxido de aluminio; (15) acido algmico; (16) agua apirogena; (17) solucion salina isotonica; (18) solucion de Ringer; (19) alcohol etflico; (20) soluciones tamponantes del pH; (21) poliesteres, policarbonatos y/o poliantndridos; (22) agentes formadores de volumen, tales como polipeptidos y aminoacidos (23) componente de suero, tal como albumina serica, HDL y LDL; (22) alcoholes C2-C12, tales como etanol; y (23) otras sustancias compatibles no toxicas empleadas en formulaciones farmaceuticas. Tambien pueden estar presentes en la formulacion agentes humectantes, agentes colorantes, agentes de liberacion, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes perfumantes, conservantes y antioxidantes. Los terminos tales como "excipiente", "vetnculo", "vetnculo farmaceuticamente aceptable" o similares se usan indistintamente en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el termino "administrat' se refiere a la colocacion de una composicion en un sujeto mediante un metodo o via que da como resultado al menos la localizacion parcial de la composicion en un sitio deseado de manera que se produzca el efecto deseado. Las vfas de administracion incluyen tanto la administracion local como la sistemica. En general, la administracion local da como resultado la entrega de mas cantidad del agente terapeutico en una ubicacion espedfica en comparacion con el cuerpo entero del sujeto, mientras que la administracion sistemica da como resultado la entrega del agente terapeutico a esencialmente todo el cuerpo del sujeto.
La administracion a un sujeto puede ser por cualquier via apropiada conocida en la tecnica incluyendo, pero no limitada a, las vfas oral o parenteral, incluyendo la administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, transdermica, vfas respiratorias (aerosol), pulmonar, nasal, rectal y topica (incluyendo la administracion bucal y sublingual).
Los modos de administracion de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, inyeccion, infusion, instilacion, inhalacion o ingestion. "Inyeccion" incluye, sin limitacion, la inyeccion e infusion intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardfaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intraarticular, sub capsular, subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal e intraesternal. En algunas realizaciones de los aspectos que se describen en el presente documento, la administracion es mediante infusion intravenosa o inyeccion.
Como se usa en el presente documento, un "sujeto" se refiere a un ser humano o animal. Por lo general, el animal es un vertebrado tal como un primate, roedor, animal domestico o animal de caza. Los primates incluyen chimpances, macaco de Java, monos arana y macacos, por ejemplo, macaco de la Indica. Los roedores incluyen ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hamsteres. Los animales domesticos y de caza incluyen vacas, caballos, cerdos, ciervos, bisontes, bufalos, felinos, por ejemplo, gato domestico, especies caninas, por ejemplo, perros, zorros, lobos, especies de aves, por ejemplo, pollo, emu, avestruz y peces, por ejemplo, trucha, siluros y salmon. El paciente o sujeto incluye cualquier subconjunto de los anteriores, por ejemplo, todos los anteriores, pero excluyendo uno o mas grupos o especies tales como los seres humanos, primates y roedores. En ciertas realizaciones de los aspectos que se describen en el presente documento, el sujeto es un mairnfero, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un ser humano. Los terminos, "paciente" y "sujeto" se usan indistintamente en el presente documento. Los terminos, "paciente" y "sujeto" se usan indistintamente en el presente documento. Un sujeto puede ser hombre o mujer.
Preferentemente, el sujeto es un mamnfero. El mamnfero puede ser un ser humano, primate no humano, raton, rata, perro, gato, caballo o vaca, pero no se limitan a estos ejemplos. Pueden utilizarse ventajosamente mamfferos distintos de seres humanos como sujetos que representan modelos animales de trastornos asociados a la enfermedad autoinmune o inflamacion. Ademas, los metodos y composiciones que se describen en el presente documento pueden usarse para tratar a los animales y/o mascotas domesticados.
Kits
Un aspecto adicional proporcionado en el presente documento se refiere a un kit que comprende una partfcula de peptidos, una formulacion que comprende una partfcula de peptidos o componentes para la fabricacion de una partfcula de peptidos o una formulacion que comprende una partfcula de peptidos que se describe en el presente documento.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En algunas realizaciones, las composiciones o kits para la fabricacion de una o mas realizaciones de una parffcula de peptidos o una parffcula de peptidos mixta se proporcionan en el presente documento. En algunas realizaciones, la composicion o kit puede comprender un peptido anfifflico que se describe en el presente documento. El peptido anfifflico suministrado en la composicion o kit puede proporcionarse en un recipiente. Dependiendo de la eleccion de un usuario de una parffcula de peptidos o parffcula mixta descritas en el presente documento para que se produzca, en algunas realizaciones, la composicion o kit puede comprender un primer peptido anfifflico y un segundo peptido anfifflico que se describe en el presente documento. El peptido anfifflico puede proporcionarse en polvo o polvo liofilizado. En algunas realizaciones, la composicion o kit puede comprender ademas al menos un reactivo, por ejemplo, para la reconstitucion del peptido anfifflico en polvo, para la emulsion de una mezcla de un conjunto de parffculas o ambos. En algunas realizaciones, la composicion o kit puede comprender adicionalmente un ligando que se describe en el presente documento, por ejemplo, proporcionado en un contenedor separado. En algunas realizaciones, la composicion o kit puede comprender adicionalmente un principio activo para encapsular en la parffcula de peptidos. El principio activo puede proporcionarse en un recipiente separado.
Ademas de los componentes anteriormente mencionados, el kit puede incluir material informativo. El material informativo puede ser descriptivo, de instruccion, de marketing u otro material que se relaciona con los metodos que se describen en el presente documento y/o el uso de los agregados de los metodos que se describen en el presente documento. Por ejemplo, el material informativo describe los metodos para la administracion de la parffcula a un sujeto. El kit tambien puede incluir un dispositivo de administracion.
En una realizacion, el material informativo puede incluir instrucciones para administrar la formulacion de una manera adecuada, por ejemplo, en una dosis, forma de dosificacion o modo de administracion (por ejemplo, una dosis, forma de dosificacion o modo de administracion que se describen en el presente documento) adecuados. En otra realizacion, el material informativo puede incluir instrucciones para identificar un sujeto adecuado, por ejemplo, un ser humano, por ejemplo, un ser humano adulto. El material informativo de los kits no esta limitado en su forma. En muchos casos, el material informativo, por ejemplo, instrucciones, se proporciona en materia impresa, por ejemplo, un texto, dibujo y/o fotograffa impresos, por ejemplo, una etiqueta u hoja impresa. Sin embargo, el material informativo tambien puede proporcionarse en otros formatos, tales como Braille, material de lectura informatica, grabacion de video o grabacion de audio. En otra realizacion, el material informativo del kit es un enlace o informacion de contacto, por ejemplo, una direccion ffsica, direccion de correo electronico, hipervmculo, sitio web o numero de telefono, donde un usuario del kit puede obtener informacion sustancial acerca de la formulacion y/o su uso en los metodos que se describen en el presente documento. Por supuesto, el material informativo tambien puede proporcionarse en cualquier combinacion de formatos.
En algunas realizaciones los componentes individuales de la formulacion pueden proporcionarse en un recipiente. Como alternativa, puede ser deseable proporcionar los componentes de la formulacion por separado en dos o mas recipientes, por ejemplo, un recipiente para una preparacion de peptidos anfifflico y al menos otro para un compuesto velffculo. Los diferentes componentes pueden combinarse, por ejemplo, de acuerdo con las instrucciones proporcionadas con el kit. Los componentes pueden combinarse de acuerdo con un metodo que se describe en el presente documento, por ejemplo, para preparar y administrar una composicion farmaceutica.
Ademas de la formulacion, la composicion del kit puede incluir otros ingredientes, tales como un disolvente o
tampon, un estabilizante o un conservante y/o un segundo agente para tratar una afeccion o trastorno que se
describe en el presente documento. Como alternativa, los otros ingredientes pueden incluirse en el kit, pero en
diferentes composiciones o contenedores que la formulacion. En dichas realizaciones, el kit puede incluir
instrucciones para mezclar la formulacion y los otros ingredientes o para el uso del oligonucleotido junto con los otros ingredientes.
La formulacion puede proporcionarse en cualquier forma, por ejemplo, en forma ffquida, seca o liofilizada. Se prefiere que la formulacion sea sustancialmente pura y/o esteril. Cuando se proporciona la formulacion en una solucion ffquida, la solucion ffquida preferentemente es una solucion acuosa, prefiriendose una solucion acuosa esteril. Cuando la formulacion se proporciona como una forma seca, la reconstitucion generalmente es mediante la adicion de un disolvente adecuado. El disolvente, por ejemplo, agua esteril o tampon, puede proporcionarse opcionalmente en el kit.
En algunas realizaciones, el kit contiene recipientes separados, separadores o compartimentos para la formulacion y el material informativo. Por ejemplo, la formulacion puede estar contenida en un frasco, vial o jeringuilla y el material informativo puede estar contenido en una funda o paquete de plastico. En otras realizaciones, los elementos separados del kit estan contenidos dentro de un unico contenedor, sin dividir. Por ejemplo, la formulacion esta contenida en un frasco, vial o jeringa a los que se ha unido el material informativo en forma de una etiqueta.
En algunas realizaciones, el kit incluye una pluralidad, por ejemplo, un envase, de recipientes individuales, conteniendo cada uno una o mas formas de dosificacion unitarias de la formulacion. Por ejemplo, el kit incluye una pluralidad de jeringuillas, ampollas, paquetes de aluminio o envases bffster, conteniendo cada uno una dosis unitaria individual de la formulacion. Los recipientes de los kits pueden ser hermeticos y/o impermeables.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Las realizaciones de los diversos aspectos que se describen en el presente documento pueden ilustrarse mediante los siguientes parrafos numerados.
1. Una partfcula de peptidos que comprende un peptido anfifflico, comprendiendo el peptido anfifflico un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo,
en la que el segmento de peptidilo hidrofobo comprende una secuencia de aminoacidos de (Trp-Leu)m-(Trp)n o (Leu-Trp)p-(Leu)q, en la que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L-Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 5 y n y q son independientemente 0 o 1, a condicion de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa; y en la que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, en la que r es un numero entero de 1 a l5, y
en la que la partfcula de peptidos comprende adicionalmente en su superficie exterior un ligando.
2. La partfcula de peptidos del parrafo 1, en la que r es un numero entero de 2 a 5.
3. La partfcula de peptidos del parrafo 1 o 2, en la que r es un numero entero de 3.
4. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-3, en la que al menos un resto Lys del segmento de peptidilo hidrofilo o el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico estan acetilados.
5. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-4, en la que todos los restos de Lys del segmento de peptidilo hidrofilo estan acetilados.
6. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-5, en la que el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico esta acetilado.
7. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-6, en la que el segmento de peptidilo hidrofobo esta unido al extremo C del segmento de peptidilo hidrofilo.
8. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-7, en la que Leu es D-Leu.
9. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-8, en la que Trp es L-Trp.
10. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-9, en la que Lys es L-Lys.
11. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-10, en la que mo p es entre 1 y 3.
12. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-11, en la que mo p es 3.
13. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-12, en la que no q es 1.
14. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-13, en la que el peptido anfifflico comprende la secuencia de aminoacidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Tip)-(D-Leu)-(L-Trp)-X, en la que X esta ausente o es NH2.
15. La partfcula de peptidos del parrafo 14, en la que al menos uno de los restos de L-Lys esta acetilado.
16. La partfcula de peptidos del parrafo 14 o 15, en la que el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico esta acetilado.
17. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-16, en la que el peptido anfifflico tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 restos de aminoacidos.
18. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-17, en la que al menos una cadena principal de amida del peptido anfifflico es un enlace de reemplazo de amida.
19. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-18, en la que el peptido anfifflico comprende un p- aminoacido, un Y-aminoacido o una combinacion de los mismos.
20. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-19, en la que al menos uno del segmento de peptidilo hidrofobo o el segmento de peptidilo hidrofilo comprende al menos una mutacion puntual.
21. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-20, en la que el ligando incluye un ligando de receptor de superficie celular o un anticuerpo.
22. La partfcula de peptidos del parrafo 21, en la que el ligando de receptor de superficie celular incluye transferrina, EGF, acido folico o cualquier combinacion de los mismos.
23. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-22, en la que el espesor del ligando presente en la superficie exterior de la partfcula de peptidos vana de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm.
24. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 23, en la que el espesor del ligando presente en la superficie exterior de la partfcula de peptidos es de aproximadamente 10 nm.
25. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-24, en la que el ligando esta unido covalentemente al peptido anfifflico.
26. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-25, en la que el ligando esta unido covalentemente al segmento de peptidilo hidrofilo del peptido anfifflico.
27. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-26, en la que una relacion del ligando al peptido anfifflico vana de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:1000000.
28. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-27, en la que la partfcula tiene un tamano de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 5000 nm.
29. La partfcula de peptidos del parrafo 28, en la que la partfcula tiene un tamano de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 150 nm.
30. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-29, en la que la partfcula de peptidos comprende una mezcla de un peptido anfifflico completamente acetilado de cualquiera de los parrafos 1-29 y un peptido anfifflico parcialmente acetilado de cualquiera de los parrafos 1-29.
31. La partfcula de peptidos del parrafo 30, en la que la relacion del peptido anfifflico totalmente acetilado al parcialmente acetilado vana de aproximadamente 95:5 a aproximadamente 1:1.
32. La partfcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 30-31, en la que la partfcula de peptidos comprende
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
adicionalmente un peptido anfifflico no acetilado.
33. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 1-32, que comprende adicionalmente un principio activo.
34. La parffcula de peptidos del parrafo 33, en la que el principio activo se dispersa dentro de la parffcula.
35. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 33-34, en la que el principio activo no tiene carga neta.
36. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 33-34, en la que el principio activo tiene una carga neta.
37. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 33-36, en la que el principio activo se selecciona entre el grupo que consiste en protemas, peptidos, anffgenos, anticuerpos o porciones de los mismos, moleculas similares a anticuerpos, enzimas, acidos nucleicos, aptameros, moleculas pequenas, antibioticos, agentes farmaceuticamente activos, agentes terapeuticos, agentes de contraste y cualquier combinacion de los mismos.
38. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 33-37, en la que el principio activo es un agente farmaceuticamente activo o un agente terapeutico.
39. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 33-38, en la que el principio activo es una molecula de acido nucleico.
40. La parffcula de peptidos del parrafo 39, en la que la molecula de acido nucleico incluye ARNip, ARNmi, ARNhc o cualquier combinacion de los mismos.
41. La parffcula de peptidos del parrafo 39, en la que la molecula de acido nucleico es ADN.
42. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 33-41, en la que una relacion del principio activo al peptido anfifflico vaffa de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10.000.
43. La parffcula de peptidos del parrafo 42, en la que la relacion del principio activo al peptido anfifflico vana de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:100 o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10.
44. Uso de la parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 33-43 para la administracion dirigida de un principio activo.
45. Uso del parrafo 44, en el que el principio activo es impermeable a las celulas cuando se entrega a una celula por sf solo.
46. Uso de una composicion que comprende un peptido anfifflico cargado positivamente como agente de penetracion en las celulas o agente de transfeccion, en el que el peptido anfifflico cargado positivamente comprende un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo,
en el que el segmento de peptidilo hidrofobo comprende una secuencia de aminoacidos de (Trp-Leu)m-(Trp)n o (Leu-Trp)p-(Leu)q, en las que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L-Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 5 y n y q son independientemente 0 o 1, a condicion de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa; en el que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, en la que r es un numero entero de 1 a 15; y
en el que al menos uno de los restos de Lys o el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico no estan acetilados.
47. El uso del parrafo 46, en el que todos los restos de Lys y el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico no estan acetilados.
48. El uso del parrafo 46 o 47, en el que r es un numero entero de 2 a 5.
49. El uso de cualquiera de los parrafos 46-48, en el que r es un numero entero 3.
50. El uso de cualquiera de los parrafos 46-49, en el que el segmento de peptidilo hidrofobo esta unido al extremo C del segmento de peptidilo hidrofilo.
51. El uso de cualquiera de los parrafos 46-50, en el que Leu es D-Leu.
52. El uso de cualquiera de los parrafos 46-51, en el que Trp es L-Trp.
53. El uso de cualquiera de los parrafos 46-52, en el que Lys es L-Lys.
54. El uso de cualquiera de los parrafos 46-53, en el que m o p esta entre 1 y 3.
55. El uso de cualquiera de los parrafos 46-54, en el que m o p es 3.
56. El uso de cualquiera de los parrafos 46-55, en el que n o q es 1.
57. El uso de cualquiera de los parrafos 46-56, en el que el peptido anfifflico tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 restos de aminoacidos.
58. El uso de cualquiera de los parrafos 46-57, en el que al menos un enlace de amida de la cadena principal del peptido anfifflico es un enlace de reemplazo de amida.
59. El uso de cualquiera de los parrafos 46-58, en el que el peptido anfifflico comprende un p-aminoacido, un y- aminoacido o una combinacion de los mismos.
60. El uso de cualquiera de los parrafos 46-59, en el que al menos uno del segmento de peptidilo hidrofobo o el segmento de peptidilo hidrofilo comprende al menos una mutacion puntual.
61. El uso de cualquiera de los parrafos 46-60, en el que la parffcula tiene un tamano de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 5.000 nm.
62. El uso del parrafo 61, en el que la parffcula tiene un tamano de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 150 nm.
63. El uso de cualquiera de los parrafos 46-62, en el que el peptido anfifflico comprende la secuencia de aminoacidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X, en la que X esta ausente o es NH2.
64. El uso de cualquiera de los parrafos 46-63, en el que la composicion comprende adicionalmente una molecula de acido nucleico que se entrega en una celula.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
65. Una parffcula de peptidos que comprende un primer peptido anfifflico y un segundo peptido anfifflico, comprendiendo el primer y el segundo peptido anfifflico cada uno independientemente un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo,
en la que el segmento de peptidilo hidrofobo comprende una secuencia de aminoacidos de (Trp-Leu)m-(Trp)n o (Leu-Trp)p-(Leu)q, en la que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L-Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 5 y n y q son independientemente 0 o 1, a condicion de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu, y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa; y en la que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, en la que r es un numero entero de 1 a 15, y
en la que el grupo amino del extremo N y todos los restos de Lys del primer peptido anfifflico estan acetilados; y en la que al menos el grupo amino del extremo N o uno de los restos de Lys del segundo peptido anfifflico no estan acetilados.
66. La parffcula de peptidos del parrafo 65, en la que ninguno del grupo amino del extremo N y los restos de Lys del segundo peptido anfifflico estan acetilados.
67. La parffcula de peptidos del parrafo 65 o 66, que comprende adicionalmente un principio activo.
68. La parffcula de peptidos del parrafo 67, en la que el principio activo incluye una molecula de acido nucleico.
69. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-68, en la que la relacion del principio activo al segundo peptido anfifflico esta en un intervalo de aproximadamente 1:1000 a 1:1 o de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:10.
70. La parffcula de peptidos del parrafo 69, en la que la relacion del principio activo al segundo peptido anfifflico esta en un intervalo de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:2.
71. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-70, en la que la relacion del primer peptido anfifflico al segundo peptido anfifflico esta en un intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1000:1 o de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 100:1.
72. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-71, que comprende adicionalmente en su superficie exterior un ligando.
73. La parffcula de peptidos del parrafo 72, en la que el ligando incluye un ligando de receptor de superficie celular o un anticuerpo.
74. La parffcula de peptidos del parrafo 73, en la que el ligando de receptor de superficie celular incluye transferrina, EGF, acido folico o cualquier combinacion de los mismos.
75. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-74, en la que el espesor del ligando presente en la superficie exterior de la parffcula de peptidos vaffa de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm.
76. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 75, en la que el espesor del ligando presente en la superficie exterior de la parffcula de peptidos es de aproximadamente 10 nm.
77. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-76, en la que el ligando esta unido covalentemente a al menos uno del primer y el segundo peptido anfifflico.
78. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-77, en la que el ligando esta unido covalentemente al segmento de peptidilo hidrofilo de al menos uno del primero y el segundo peptido anfifflico.
79. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-78, en la que una relacion del ligando al peptido anfifflico vaffa de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:1000000.
80. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-79, en la que r es un numero entero de 2 a 5.
81. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-80, en la que r es un entero de 3.
82. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-81, en la que el segmento de peptidilo hidrofobo esta unido al extremo C del segmento de peptidilo hidrofilo.
83. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-82, en la que es Leu D-Leu.
84. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-83, en la que Trp es L-Trp.
85. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-84, en la que Lys es L-Lys.
86. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-85, en la que m o p es entre 1 y 3.
87. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-86, en la que m o p es 3.
88. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-87, en la que n o q es 1.
89. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-88, en la que el primer y el segundo peptido anfifflico tienen cada uno independientemente una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 restos de aminoacidos.
90. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-89, en la que al menos un enlace de amida de la cadena principal del primer o del segundo peptido anfifflico es un enlace de reemplazo de amida.
91. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-90, en la que al menos uno del primer y del segundo peptido anfifflico comprende un p-aminoacido, un Y-aminoacido o una combinacion de los mismos.
92. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-91, en la que al menos uno del segmento de peptidilo hidrofobo o el segmento de peptidilo hidrofilo comprende al menos una mutacion puntual.
93. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-92, en la que la parffcula de peptidos tiene un tamano de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 5.000 nm.
94. La parffcula de peptidos del parrafo 93, en la que la parffcula de peptidos tiene un tamano de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 150 nm.
95. La parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-94, en la que el primer y el segundo peptido anfifflico comprenden cada uno independientemente la secuencia de aminoacidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L- Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X, en la que X esta ausente o es NH2.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
96. Uso de la parffcula de peptidos de cualquiera de los parrafos 65-95 para la entrega de una molecula de acido nucleico a una celula.
97. El uso del parrafo 96, en el que la molecula de acido nucleico incluye ARNip, ARNmi, ARNhc o cualquier combinacion de los mismos.
98. El uso del parrafo 96, en el que la molecula de acido nucleico incluye ADN.
99. Un peptido anfifflico que comprende un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo, en el que el segmento de peptidilo hidrofobo comprende una secuencia de 2 a 10 aminoacidos D y L alternos seleccionados entre alanina, valina, isoleucina, leucina (Leu), fenilalanina, tirosina o triptofano (Trp) y
en el que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende aminoacidos cargados o no cargados pero polares o derivados de los mismos.
100. El peptido anfifflico del parrafo 99, en el que el segmento de peptidilo hidrofobo comprende una secuencia de aminoacidos de (Trp-Leu)m-(Trp)n o(Leu-Trp)p-(Leu)q, en la que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D- Leu o L-Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 20 y n y q son independientemente 0 o 1, a condicion de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L- Leu y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa.
101. El peptido anfifflico del parrafo 99 o 100, en el que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende al menos una carga presente ya sea en el extremo N o en un resto de aminoacido.
102. El peptido anfifflico del parrafo 101, en el que la al menos una carga es ya sea una carga cationica o una carga anionica.
103. El peptido anfifflico del parrafo 99 o 100, en el que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende aminoacidos no cargados pero polares.
104. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99 a 103, en el que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende al menos una carga y al menos un aminoacido no cargado pero polar.
105. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99 a 104, en el que al segmento de peptidilo hidrofobo esta unido covalentemente un poffmero.
106. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-105, en el que al menos un grupo amino en el peptido anfifflico esta acetilado.
107. El peptido anfifflico del parrafo 102, en el que la al menos una carga cationica esta en un resto de aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en Lys, Arg, His y cualquier combinacion de los mismos.
108. El peptido anfifflico del parrafo 102, en el que la al menos una carga anionica esta en un resto de aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en Asp o Glu y cualquier combinacion de los mismos.
109. El peptido anfifflico del parrafo 103, en el que al menos un resto de aminoacido no cargado pero polar se selecciona entre el grupo que consiste en Ser, Thr, Asn o Gln y cualquier combinacion de los mismos.
110. El peptido anfifflico del parrafo 105, en el que el poffmero se selecciona entre el grupo que consiste en PEG, PGG, pEo, policaprolactona, acido polilactico, acido poliglicolico, polihidroxialcaboatos, dextranos, polianhffdridos, PLA-PGA, poliortoester, polifumarato, hidrogeles, cualquier poffmero biocompatible y/o biodegradable reconocido en la tecnica y cualquier combinacion de los mismos.
111. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99 a 110, en el que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, en la que r es un numero entero de 1 a 15.
112. El peptido anfifflico del parrafo 111, donde r es 3.
113. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-112, en el que el al menos un grupo amino es un grupo amino del extremo N del peptido anfifflico.
114. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-113, en el que el al menos un grupo amino esta en un resto de Lys del segmento de peptidilo hidrofilo.
115. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-114, en el que todos los grupos amino en el segmento de peptidilo hidrofilo estan acetilados.
116. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-115, en el que el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico y al menos uno de los grupos amino en el segmento de peptidilo hidrofilo estan acetilados.
117. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-116, en el que el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico y todos los grupos amino en el segmento de peptidilo hidrofilo estan acetilados.
118. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-117 en el que el segmento de peptidilo hidrofobo esta unido al extremo C del segmento de peptidilo hidrofilo.
119. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-118, en el que Leu es D-Leu.
120. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-119, en el que Trp es L-Trp.
121. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-120, en el que Lys es L-Lys.
122. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-121, en el que m o p esta entre 1 y 3.
123. El peptido anfifflico del parrafo 122, en el que m o p es 3.
124. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-123, en el que n o q es 1.
125. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-124, en el que el peptido anfifflico comprende la secuencia de aminoacidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp), en la que al menos uno de los restos de L-Lys esta acetilado.
126. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-125, en el que el peptido anfifflico comprende la secuencia de aminoacidos de Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp).
127. El peptido anfifflico del parrafo 126, en el que al menos uno de los restos de L-Lys esta acetilado.
128. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-127, en el que el peptido anfifflico comprende la secuencia de aminoacidos de Ac-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Leu)-(L-Trp)-X, en el que X esta ausente o es NH2.
129. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-128, en el que el peptido anfifflico tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 restos de aminoacidos.
130. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-129, en el que al menos un enlace amida de la cadena principal es un enlace de reemplazo de amida.
131. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-130, en el que el peptido anfifflico comprende al menos un p-aminoacido, Y-aminoacido o cualquier combinacion de los mismos.
132. El peptido anfifflico de cualquiera de los parrafos 99-131, en el que al menos uno del segmento de peptidilo hidrofobo o el segmento de peptidilo hidrofilo comprende al menos una mutacion puntual.
133. Una parffcula que comprende uno o mas peptidos anfifflicos de cualquiera de los parrafos 99-132.
134. La parffcula del parrafo 133, que comprende adicionalmente un ligando.
135. La parffcula del parrafo 133 o 134, en la que el ligando es un ligando de receptor de superficie celular o un anticuerpo.
136. La parffcula del parrafo 135, en la que el ligando de receptor de superficie celular es transferrina o EGF o folato.
137. Las parffculas de cualquiera de los parrafos 133-136, en las que el ligando esta presente sobre una superficie exterior de la parffcula.
138. La parffcula de cualquiera de los parrafos 133-137, en la que el ligando se adsorbe en la superficie exterior de la parffcula.
139. La parffcula del parrafo 137 o 138, en la que un espesor del ligando presente en la superficie exterior de la parffcula vaffa de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm.
140. La parffcula del parrafo 139, en la que el espesor del ligando presente en la superficie exterior de la parffcula es de aproximadamente 10 nm.
141. La parffcula de cualquiera de los parrafos 133-140, en la que el ligando esta unido covalentemente al peptido anfifflico.
142. La parffcula de cualquiera de los parrafos 133-141, en la que el ligando esta unido covalentemente al segmento de peptidilo hidrofilo del peptido anfifflico.
143. La parffcula de cualquiera de los parrafos 133-142, que comprende adicionalmente un principio activo.
144. La parffcula del parrafo 143, en la que el principio activo se dispersa dentro de la parffcula.
145. La parffcula de cualquiera de los parrafos 143-144, en la que el principio activo no tiene carga neta.
146. La parffcula de cualquiera de los parrafos 143-144, en la que el principio activo tiene una carga neta.
147. La parffcula de cualquiera de los parrafos 143-146, en la que el principio activo comprende al menos un grupo aromatico.
148. La parffcula de cualquiera de los parrafos 143-147, en la que el principio activo se selecciona entre el grupo que consiste en protemas, peptidos, anffgenos, anticuerpos o porciones de los mismos, moleculas similares a anticuerpos, enzimas, acidos nucleicos, aptameros, moleculas pequenas, antibioticos, agentes farmaceuticamente activos, agentes terapeuticos, agentes de contraste y cualquier combinacion de los mismos.
149. La parffcula de cualquiera de los parrafos 143-148, en la que el principio activo es un agente farmaceuticamente activo.
150. La parffcula de cualquiera de los parrafos 143-149, en la que el principio activo es una molecula de acido nucleico.
151. La parffcula del parrafo 150, en la que la molecula de acido nucleico es ARNip, miARN o ARNhc.
152. La parffcula del parrafo 150, en la que la molecula de acido nucleico es ADN.
153. La parffcula de cualquiera de los parrafos 143-152, en la que una relacion del principio activo a los peptidos anfifflicos vaffa de 1:1 a 1:100.000.
154. La parffcula del parrafo 153, en la que la relacion del principio activo a los peptidos anfifflicos vaffa de 1:1 a aproximadamente 1:1000.
155. La parffcula de cualquiera de los parrafos 134-154, en la que una relacion del ligando a los peptidos anfifflicos vaffa de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:1000000.
156. La parffcula de cualquiera de los parrafos 133-155, en la que la parffcula tiene un tamano de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 5000 nm.
157. La parffcula del parrafo 156, en la que la parffcula tiene un tamano de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 150 nm.
158. La parffcula de cualquiera de los parrafos 133-157, en la que la parffcula comprende una mezcla de peptidos anfifflicos totalmente acetilados y parcialmente acetilados de cualquiera de los parrafos 99-132.
159. La parffcula del parrafo 158, en la que la relacion de los peptidos anfifflicos totalmente acetilado a los parcialmente acetilados vaffa de aproximadamente 95:5 a aproximadamente 1:1.
160. La parffcula de cualquiera de los parrafos 133-159, en la que la parffcula comprende adicionalmente peptidos anfifflicos no acetilados.
161. Un metodo de uso de un compuesto peptido anfifflico como sistema de entrega.
162. El metodo del parrafo 161, en el que el sistema de entrega es un sistema de entrega dirigida.
163. El metodo del parrafo 161 o 162, en el que el sistema de entrega es con fines terapeuticos o de diagnostico.
164. Uso de composiciones de peptidos como peptido de penetracion celular o agente de transfeccion, respectivamente.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Algunas definiciones seleccionadas
A menos que se contrario o que quede impUcito a partir del contexto, los siguientes terminos y frases incluyen los significados que se indican a continuacion. A menos que se indique expresamente lo contrario o que sea evidente a partir del contexto, los terminos y frases a continuacion no excluyen el sentido que el termino o la frase han adquirido en la tecnica a la que pertenece. Las definiciones se proporcionan para ayudar en la descripcion de realizaciones particulares de los aspectos que se describen en el presente documento y no tienen por objeto a limitar la invencion reivindicada, ya que el alcance de la invencion esta limitado solo por las reivindicaciones. Adicionalmente, a menos que se requiera otra cosa por el contexto, los terminos singulares incluiran pluralidades y los terminos en plural incluiran el singular.
Como se usa en el presente documento, la expresion "que comprende" o "comprende" se usa en referencia a composiciones, metodos y componente o componentes respectivos de los mismos, que son esenciales para la invencion y que, sin embargo, estan abiertos a la inclusion de elementos no especificados, ya sean esenciales o no. Adicionalmente, la expresion "que comprende" o "comprende" incluye "que consiste esencialmente en" y "que consiste en".
Como se usa en el presente documento, la expresion "que consiste esencialmente en" se refiere a los elementos necesarios para una realizacion determinada. La expresion permite la presencia de elementos adicionales que no afectan materialmente a la caractenstica o caractensticas basicas y nuevas o funcionales de dicha realizacion de la invencion.
El termino "que consiste en" se refiere a composiciones, metodos y componentes respectivos de los mismos como se describen en el presente documento, que excluyen cualquier elemento no descrito en esa descripcion de la realizacion.
Aparte de en los ejemplos operativos o donde se indique lo contrario, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reaccion utilizadas en el presente documento deben entenderse como modificados en todos los casos por el termino "aproximadamente". El termino "aproximadamente", cuando se usa en relacion con los porcentajes puede significar ± el 1 %.
Los terminos singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De forma similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Aunque pueden usarse metodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento en la practica o el ensayo de la presente divulgacion, se describen a continuacion metodos y materiales adecuados. El termino "comprende" significa "que incluye". La abreviatura "p. ej." deriva del Latin Exempli gratia y se utiliza en el presente documento para indicar un ejemplo no limitante. De este modo, la abreviatura "p. ej." es sinonimo de la expresion "por ejemplo".
La expresion "estadfsticamente significativo" o "significativamente" se refiere a la significacion estadfstica y generalmente significa una desviacion tfpica de dos (2DT) por encima o por debajo de un nivel de referencia. El termino se refiere a la evidencia estadfstica de que hay una diferencia. Se define como la probabilidad de tomar la decision de rechazar la hipotesis nula cuando la hipotesis nula es realmente verdadera. La decision se toma a menudo usando el valor p.
El termino "nanoesferas" significa una partfcula que tiene una relacion de aspecto de como maximo 3:1. La expresion "relacion de aspecto" se refiere a la relacion entre el eje mas largo de un objeto con respecto al eje mas corto del objeto, donde los ejes no son necesariamente perpendiculares.
La expresion "dimension mas larga" de una partfcula significa el camino directo mas largo de la partfcula. La expresion "camino directo" significa el camino mas corto contenido dentro de la partfcula entre dos puntos en la superficie de la partfcula. Por ejemplo, una partfcula helicoidal tendna una dimension mas larga correspondiente a la longitud de la helice si se estirase en una lmea recta.
El termino "nanobaston" significa una partfcula que tiene una dimension mas larga de como maximo 200 nm y que tiene una relacion de aspecto de 3:1 a 20:1.
El termino "nanoprisma" significa una partfcula que tiene al menos dos caras no paralelas conectadas por un borde comun.
La "longitud" de una partfcula significa la dimension mas larga de la partfcula.
La "anchura" de una partfcula significa la media de las anchuras de la partfcula; y el "diametro" de una partfcula es el promedio de los diametros de la partfcula.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La dimension "promedio" de una pluralidad de partfculas significa el promedio de esa dimension para la pluralidad. Por ejemplo, el "diametro promedio" de una pluralidad de nanoesferas significa el promedio de los diametros de las nanoesferas, donde un diametro de una sola nanoesfera es el promedio de los diametros de esa nanoesfera.
Como se usa en el presente documento, la expresion "sales farmaceuticamente aceptables" se refiere a las sales no toxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario de un compuesto, por ejemplo, de acidos organicos o inorganicos no toxicos. Estas sales pueden prepararse in situ en el vetuculo de administracion o en el proceso de fabricacion de las formas de dosificacion o haciendo reaccionar por separado un compuesto purificado en su forma de base libre o de acido con un acido o una base organicos o inorganicos adecuados y aislando la sal formada de este modo durante la posterior purificacion. Las sales no toxicas convencionales incluyen las derivadas de acidos inorganicos tales como acido sulfurico, sulfamico, fosforico, mtrico y similares; y las sales preparadas a partir de acidos organicos tales como acetico, propionico, succmico, glicolico, estearico, lactico, malico, tartarico, cftrico, ascorbico, palmftico, maleico, hidroximaleico, fenilacetico, glutamico, benzoico, salidlico, sulfamlico, 2- acetoxibenzoico, fumarico, toluenosulfonico, metanosulfonico, etanodisulfonico, oxalico, isotionico y similares. Vease, por ejemplo, Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19 (1977).
En algunas realizaciones de los aspectos que se describen en el presente documento, las sales representativas incluyen las sales de bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, succinato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato y laurilsulfonato y similares.
Como se usa en el presente documento, una relacion puede ser una relacion en moles o una relacion en peso o una relacion molar.
Como se usa en el presente documento, un "peptido de penetracion celular" o "peptido que penetra la celula" se define como un peptido que tiene permeabilidad de membrana y es capaz de atravesar membranas biologicas o una barrera fisiologica. Los peptidos que penetran las celulas (CpP, del ingles cell penetrating peptides) tambien se denominan peptidos permeables a las celulas, dominios de transduccion de protemas (PTD, del ingles protein transduction domains) o secuencias de translocacion de membrana (MTS, del ingles membrane-translocation sequences). Los CPP tienen la capacidad de translocarse in vitro y/o in vivo a traves de las membranas celulares de mairnferos y entrar en las celulas y dirigir un compuesto conjugado de interes, tal como un farmaco o un marcador, a un destino celular deseado, por ejemplo en el citoplasma (citosol, retfculo endoplasmico, aparato de Golgi, etc.) o en el nucleo. En consecuencia, el CPP puede dirigir o facilitar la penetracion de un compuesto de interes a traves de una membrana fosfolipfdica, mitocondrial, endosomica o nuclear. El CPP tambien puede dirigir un compuesto de interes desde fuera de la celula a traves de la membrana plasmatica y dentro del citoplasma o a una ubicacion deseada dentro de la celula, por ejemplo, el nucleo, los ribosomas, las mitocondrias, el retfculo endoplasmatico, un lisosoma o un peroxisoma. Como alternativa o ademas, el CPP puede dirigir un compuesto de interes a traves de las barreras hematoencefalica, transmucosa, hematorretiniana, cutanea, gastrointestinal y/o pulmonar.
La penetracion a traves de una membrana biologica o una barrera fisiologica puede determinarse mediante diversos procesos, por ejemplo mediante un ensayo de penetracion celular que tiene una primera etapa de incubacion para el CPP conjugado con un marcador en presencia de celulas de cultivo, seguida de una etapa de fijacion y despues la revelacion de la presencia del peptido marcado dentro de la celula. En otra realizacion, la etapa de revelacion puede hacerse con una incubacion del CPP en presencia de anticuerpos marcados y dirigidos contra el CPP, seguido de la deteccion en el citoplasma o en la proximidad inmediata del nucleo de la celula o incluso dentro de ella, de la reaccion inmunologica entre la secuencia de aminoacidos del CPP y los anticuerpos marcados. La revelacion tambien puede hacerse mediante el marcado de una secuencia de aminoacidos en el CPP y la deteccion de la presencia del marcaje en los compartimentos celulares. Los ensayos de penetracion celular son bien conocidos por los expertos en la materia. Sin embargo, por ejemplo se describe un ensayo de penetracion celular en la solicitud de patente mencionada anteriormente N.° WO 97/02840.
Como se usa en el presente documento, la expresion "agente de transfeccion" o "reactivo de transfeccion" se refiere a un compuesto que se une o se compleja con un compuesto y mejora su entrada en las celulas. En general, la expresion agente de transfeccion se utiliza para compuestos que potencian la entrega de acidos nucleicos en una celula.
En la medida en que no se ha indicado, se entendera por los expertos ordinarios en la tecnica que una cualquiera de las diversas realizaciones descritas e ilustradas en el presente documento pueden modificarse adicionalmente para incorporar caractensticas mostradas en cualquiera de las otras realizaciones que se desvelan en el presente documento.
Los siguientes ejemplos ilustran algunas realizaciones y aspectos de la invencion. Los siguientes ejemplos no limitan en modo alguno la invencion.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ejemplos
Materiales y metodos de ejemplo (para los Ejemplos 1-2)
Materiales de ejemplo: Todos los productos qmmicos y reactivos incluyendo la rosa de bengala (RB) (Aldrich 330000, 95 %) y la 5-carboxi-fluorescema (CF) (Sigma-Aldrich C0537, 99 %) se obtuvieron de Sigma-Aldrich y se utilizaron sin purificacion adicional a menos que se indique lo contrario a continuacion. Se adquirieron aminoacidos protegidos con Fmoc y reactivos de acoplamiento de IRIS Biotech y Novabiochem. Se adquirieron placas de cristalizacion de 24 pocillos de Hampton Research (Plate Cryschem).
S^ntesis de peptidos: Todos los peptidos se sintetizaron en fase solida utilizando la qmmica del grupo de proteccion Fmoc. Las etapas individuales de la smtesis se enumeran en la Tabla 1. Se utilizo resina Rink Amide AM (200 mg, carga: 0,4 mmol/g-0,8 mmol/g) como fase solida en una jeringuilla de 10 ml. Todas las reacciones se realizaron en dimetilformamida (DMF) previamente tratada con oxido de aluminio para reducir la abundancia de aminas libres. Los Fmoc-aminoacidos se disolvieron en DMF (0,5 M) antes de la smtesis. Los grupos de proteccion Fmoc se partieron dos veces para cada etapa de acoplamiento utilizando piperidina en DMF (40%). Se utilizo (1-),3-oxido de 1- [bis(dimetilamino)metilen]-5-cloro-,hexafluorofosfato de IH-benzotriazolio (HCTU) como un agente de acoplamiento y se disolvio N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) en 1 -metil-2-pirrolidinona (NMP) como base. Todos los acoplamientos se ejecutaron con 4 equivalentes (eq) de aminoacido, HCTU (4 eq) y DIPEA (12 eq) en relacion con la capacidad de carga de la resina. Despues de cada etapa de acoplamiento, el grupo amino terminal sin reaccionar se protegio por acetilacion con una solucion de anhfdrido acetico (5 eq) y DIPEA en DMF (5 eq).
__________Tabla 1: Etapas automatizadas de la smtesis de peptidos en fase solida del lote de Fmoc__________
[Etapa]________________Disolvente/reactivo________________Repeticion ^min)0_____Descripcion
1
Piperidina al 40 %/DMF 1 5 desproteccion de Fmoc
2
Piperidina al 40 %/DMF 1 10 desproteccion de Fmoc
3
DMF 5 1 Lavado
4
Aminoacido protegido con 4 eq de Fmoc, 4 eq de HCTU, 12 eq de DIPEA 1 60 Acoplamiento (a)
5
DMF 2 1 Lavado
6
5 eq de anhfdrido acetico, 5 eq de DIPEA 1 20 Proteccion terminal(b)
7
DMF 3 1 Lavado
(a)En DMF Alox/NMP; (b) En DMF Alox; en la que DMF Alox es DMF previamente tratada con oxido de aluminio
Se aplico el mismo protocolo en una smtesis aumentada a escala utilizando resina Rink Amide AM (5 g) donde la reaccion se realizo en un reactor de vidrio de 500 ml en fase solida usando 3 eq de aminoacidos y reactivos de acoplamiento. El pH se mantuvo constante a 9 a lo largo de la reaccion y la resina se probo para determinar grupos amino libres usando un ensayo de Kaiser y trinitrobencenosulfonato (TNBS) despues de cada etapa de acoplamiento y escision. No hubo necesidad de usar NMP como cosolvente.
Los rendimientos globales en general oscilan entre el 10 % y el 15 % una pureza del ~95 %, que es tfpica para la smtesis de peptidos en fase solida.
Despues de la smtesis, la resina de peptidos se lavo con DMF, alcohol isopropflico, DMF, diclorometano y eter dietflico antes de que se secara durante la noche en una lmea de vacfo. La escision del peptido de la resina y la eliminacion de grupos de proteccion se realizo con TFA fno (95 %), trietilsilano (2,5 %) y H2O (2,5 %). La mezcla de escision enfriada con hielo se anadio a la resina y se incubo durante 2 h-3 h a temperatura ambiente. El coctel de escision filtrado se precipito y se lavo con eter diisopropflico fno (40 ml). El solido de color blanco se seco durante la noche en una lmea de vacm.
Purificacion de peptidos: Todos los peptidos se purificaron en una HPLC Shimadzu Prominence con los parametros enumerados en la Tabla 2. Los peptidos en bruto se molieron y se disolvieron en una mezcla de DMF y acetonitrilo (4 ml, 1:1) y se diluyeron con H2O (TFA al 0,1 %) hasta un volumen final de 20 ml. La gelificacion del producto en bruto se elimina en estas condiciones de disolvente. La muestra posteriormente se filtro a traves de un filtro de jeringa PTFE de 0,45 pm y se bombeo en una columna de Merck LiChrospher 100, RP-18e (5 pm, 250-10) a un caudal de 4 ml/min y se eluyo con un gradiente lineal de agua (TFA al 0,1 %) a acetonitrilo (MeCN). A la elucion de la muestra le siguio la absorcion a 280 nm y se recogio de acuerdo con los volumenes de fraccion fija de 5 ml. La presencia del peptido producto se clasifico por espectrometna de masas (Figura 1A) y se cuantifico en desarrollos de HPLC analftica (Figura 1B). Las fracciones que conteman mas del 80 % de producto (A280) se aplicaron a una segunda etapa de purificacion en el mismo material de cromatograffa realizada con acido acetico (2 %) en la fase acuosa. Las fracciones que conteman mas del 95 % del producto se combinaron, se neutralizaron con amomaco y se liofilizaron.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tabla 2: Parametros de la purificacion por HPLC
Caracteristica
Preparativa Analftica
Disolvente A
H2O bidestilada, TFA al 0,1 % o AcOH alH2O bidestilada, TFA al 0,1 % 2 %
Disolvente B
MeCN MeCN
Columna
LiChrospher 100, RP-18e (5 pm), 25010 LiChrospher 100, RP-18e (5 pm), 2504,6
Gradiente
5 % de B ^95 % de B, 120 min 20 % de B ^70 % de B, 30 min
Inyectado Volumen
De acuerdo con las necesidades 25 pl
Caudal
5 ml/min 1,5 ml/min
Deteccion
A280 A280
Fraccionamiento
A > 500 mUA -
Tamano de la fraccion
5 ml -
Modificaciones posteriores a la purificacion: La acetilacion de aminas primarias en el extremo N y las lisinas se realizo en peptido purificado disuelto en DMF mediante la aplicacion de un exceso de 40 veces de antndrido acetico y DIPEA. Se controlo que la reaccion se completara mediante espectrometna de masas antes de que la mezcla de reaccion se volviera a purificar de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.
Formacion de perlas y co-ensamblaje: Se disolvieron CD3ac y Rosa de Bengala (RB) en H2O:oxido de etileno en una relacion de 1:1 y se mezclaron para producir concentraciones finales de RB 61,5 x 10-6 M, 184,5 x 10-6 M, 307,5 x 10-6 M, 615 x 10-6 M y 922,5 x 1o-6 M. La concentracion de CD3ac se mantuvo constante a 615 x 10-6 M. El intercambio de disolvente a H2O se realizo mediante contraevaporacion en placas de cristalizacion por gota posada de 24 pocillos; se aplicaron 50 pl de solucion premezclada de CD3ac y RB a un pocillo de gota posada y de contraevaporaron cuatro veces contra 1 ml de H2O durante 16 h. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Precipitaron esferas de CD3ac despues de aproximadamente 30 min y el sedimento durante el proximo 5 h.
Con el fin de cuantificar la cantidad de RB encapsulada, el sedimento de perlas se resuspendio despues del equilibrio de disolvente y se normalizo con H2O a un volumen final de 100 pl. Posteriormente, todas las muestras se centrifugaron durante 30 min a 20 000 g, antes de que se separaran 80 ml de sobrenadante. La fraccion del sedimento restante se diluyo 1:1 con 20 pl de DMSO para disolver los ensamblajes de peptidos. La concentracion de RB en las fracciones de sedimento y sobrenadantes se determino mediante mediciones de absorcion y se corrigio para RB en los 20 pl restantes de la fraccion de sedimento.
Estimacion del volumen de las perlas y Coeficiente de Particion: Con el fin de estimar la densidad de los precipitados de CD3ac, se prepararon perlas (concentracion de partida de CD3ac 307,5 x 10-6 M) lo suficientemente grandes como para exceder el lfmite de difraccion de la luz visible. Una baja concentracion de RB (10 x 10-6 M) se coprecipito para permitir una estimacion del diametro de la perla por microscopfa de fluorescencia confocal (1,35 pm) y facilitar el recuento en un hemocitometro (Hausser Scientific). Se contaron un promedio de 72 perlas en un volumen de celulas observado de 250.000 pm3 que es igual a una fraccion de volumen de perla de 3,71 x 10-4 Una solucion de 50 pl de CD3ac 307,5 x 10-6 M por tanto contiene un volumen de perla total de 18,6 nl y la densidad de CD3ac puede determinarse (pcD3ac ~1,35 g/cm3)El coeficiente de particion logantmica de RB en una solucion acuosa de perlas de CD3ac se calculo de acuerdo con
iogPCD3ac/Hto=log(^—^-) (1)
Espectroscopia de ultravioleta visible: Las mediciones de absorcion se realizaron en un Nanodrop 1000 (Thermo Scientific). Se obtuvieron los coeficientes de extincion de CD3ac en H2O:etanol:DMSO 1:1:2 (21.780 M-1cm-1, 280 nm) y Rosa de Bengala en H2O:DMSO 1:1 (11.639 M-1cm-1, 562 nm). Se utilizo DMSO para disolver los precipitados CD3ac despues del ensamblaje y para reducir la evaporacion del disolvente durante el tiempo de preparacion ya que las cantidades de volumen de muestra medidas eran de solo 4 pl. En caso necesario, la muestra se diluyo adicionalmente con H2O:EtOH:DMSO 1:1:2 para producir intensidades de absorcion en el intervalo lineal del instrumento. Las concentraciones de RB se determinaron mediante el peso antes del coensamblaje. Despues de la coprecipitacion de CD3ac y RB, las fracciones de sedimento y sobrenadante se diluyeron 1:1 con DMSO (CD3ac ensamblado se disuelve en una solucion de H2O:DMSO 1:1).
Dicmsmo circular (CD): Se realizaron experimentos de CD en un Applied Photophysics Chirascan en cubetas QS (1 mm de etapa). Se ajustaron concentraciones de la muestra para proporcionar valores de dmodo entre 300 V y 500 V en el intervalo de longitud de onda medido. Se realizaron medidas de blanco con agua inmediatamente antes de las mediciones de las muestras. Cada espectro se promedio a partir de tres barridos en intervalos de longitud de onda de 1 nm, cada una de dos preparaciones de muestras independientes. Todos los espectros se alisaron aplicando el algoritmo de segundo orden de Savitzky Golay. Los datos de CD se indican en unidades molares (deg cm2 dmol-1), que se muestran como grados de elipticidad molar.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Microscop^a Electronica de Barrido: Se realizo la microscopfa electronica de barrido (MEB) en un Hitachi S-4800. Los soportes de muestra de MEB se enfriaron a -196 °C antes de que una gota de la suspension de perlas se aplicara directamente a la superficie del metal fno. La muestra congelada en el plato se liofilizo posteriormente, se sometio a bombardeo ionico con platino y se analizo.
Dispersion de luz dinamica: La dispersion de luz dinamica se midio en un sistema de goniometro basado en la plataforma ALV/CGS-8F equipado con un correlador ALV/-5000/E y un laser de iones de argon con una longitud de onda de 633 nm (35 mW) en angulos de dispersion entre 30 ° y 150°. Un correlador ALV-5000/E calcula la funcion de autocorrelacion de intensidad de fotones g2(t). Todos los experimentos se realizaron a T = 293 K y se evaluaron mediante un ajuste cumulante de segundo orden (teniendo en cuenta la forma esferica de las partfculas previamente determinada mediante MEB). Se determinaron polidispersidades mediante el algoritmo de Contin en todos los angulos y nunca excedieron de 0,11. Se realizaron mediciones dependientes del angulo en etapas de 10 ° de 30 ° a 150 ° Con el fin de evitar la influencia de la dispersion multiple, se realizaron experimentos dependientes de la concentracion. Tanto para la dependencia angular como para la dependencia de la concentracion, se calculo un radio hidrodinamico a partir de la formula de Stokes
kBT
6mjD
(2)
en la que rh es el radio hidrodinamico de partfculas esfericas, D es la constante de difusion, ke es la constante de Boltzmann, T es la temperatura absoluta y n es la viscosidad del agua. Un grafico de 1/rh en funcion del angulo (concentracion) se represento graficamente y el radio hidrodinamico (rh0) se calculo mediante la extrapolacion de las dos mediciones de la concentracion y del angulo a cero.
Espectrometria de masas: La espectrometna de masas se realizo en un LTQ-Orbitrap (Thermo Scientific). Se cargaron 5 pl de una solucion de CD3ac (10 x 10-6 M, H2O:MeCN 2:1) en una columna capilar de 100 pm rellenada previamente con Magic C18 AQ (diametro de partfcula de 3 pm). El peptido se eluyo en un gradiente de 30 min de H2O (acido formico al 4 %) a MeCN. El Orbitrap se ajusto en modo positivo y a una resolucion de 10.000.
Microscop^a confocal: se obtuvieron imagenes de microscopfa confocal en un microscopio invertido motorizado Nikon Ti equipado con opticas DIC, de fase y de epifluorescencia, un disco giratorio confocal Yokagawa CSU-10 con lmeas de laser a 488 nm, 568 nm y 647 nm. Se uso una camara CCD enfriada ORCA-AG Hamamatsu para la formacion de imagenes confocal y se utilizo una Hamamatsu ORCA-R2 para la imagen de campo amplio. Se codisolvio CD3ac (615 x 10-6 M) con (a) RB (10 x 10-6 M), (b) CF (10 x 10-6 M) y (c) RB y CF (ambos 10 x 10-6 M) en un volumen de 50 pl de EtOH al 50 % cada uno y ser contraevaporaron contra el agua. La suspension resultante se normalizo con H2O hasta un volumen total de 50 pl por muestra y posteriormente se aplico al microscopio confocal.
Ejemplo 1: Nanoparticulas de peptido CD3ac solido -caracterizacion estructural
Los peptidos hidrofobos convencionales son generalmente diffciles de sintetizar y purificar y tambien son generalmente diffciles de disolver y tienden a precipitar a estructuras amorfas en solucion acuosa. De acuerdo con diversos aspectos y realizaciones que se describen en el presente documento, un peptido disenado CD3ac de novo que consta de diez aminoacidos:
Ac-(LK(Ac))3-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2,
donde LK(Ac) = L-lisina acetilada; LW = L-triptofano; DL = D-leucina, demuestra propiedades diferentes de otros materiales peptfdicos: CD3ac se disuelve facilmente en la mayoria de los disolventes organicos (EtOH, iPrOH, DMSO, DMF, MeCN) y precipita en esferas en forma de perlas estructuradas de manera uniforme tras el intercambio de disolvente a agua (Figura 2A).
El peptido CD3ac (masa 1652,910 g/mol; pureza > 95 %, A280) puede considerarse anfifflico ya que su secuencia se divide en dos secciones: un bloque hidrofobo que consiste en L-triptofano y D-leucina alternos y uno hidrofilo que consiste en tres L-lisinas acetiladas. Los terminos "hidrofilo" e "hidrofobo" como se usan en el presente documento no son absolutos sino que describen la polaridad relativa dentro de la secuencia de aminoacidos, por ejemplo, de CD3ac. Aunque el peptido CD3ac es hidrofobo, puede sintetizarse con un alto rendimiento y se purifica con los procedimientos convencionales en material de cromatograffa C18 de fase inversa (vease la seccion de Materiales y Metodos descrita anteriormente), en comparacion con peptidos hidrofobos convencionales.
CD3ac es capaz de precipitar en agregados esfericos en el intervalo del tamano coloidal y puede hacerlo de una forma robusta y reproducible. El intercambio de disolvente se realizo mediante dialisis o, con el fin de reducir el consumo de material, por contraevaporacion contra el agua en placas de cristalizacion de 24 pocillos. La distribucion de tamanos de la suspension de perlas de peptido resultante se midio por microscopfa electronica de barrido (MEB, Figuras 2A-2C) y dispersion dinamica de luz dependiente de la concentracion y del angulo (DLS, Figuras 3A-3B). Ambos metodos revelan un radio de partfcula de aproximadamente 260 nm. El radio de la esfera puede estar
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
influenciado por la concentracion de CD3ac inicialmente disuelta (antes del intercambio de disolvente) y se encuentra en el intervalo de tamano entre aproximadamente 200 nm y aproximadamente 1500 nm que corresponde a las concentraciones iniciales CD3ac entre 61,5 x 10-6 M a 923 x 10-6 M. Los datos de DLS mostrados en las Figuras 3A-3B se refieren a parffculas de CD3ac formadas a partir de CD3ac inicialmente disuelto a 123 x 10-6 M. Las parffculas de peptidos (perlas) obtenidas tienen una baja polidispersidad sin necesidad de procedimientos de dimensionamiento tales como ultrasonidos o extrusion, que se aplican habitualmente para lograr una distribucion de tamanos estrecha en, por ejemplo, suspensiones de ffpidos.
La estructura secundaria puede desempenar, en parte, un papel crucial en el ensamblaje de las perlas de CD3ac. Sin desear quedar ligado a teona alguna, debido a la dispersion de la luz, puede ser diffcil obtener datos de dicrofsmo circular cuantificables de suspensiones coloidales que contienen parffculas de mas de 50 nm de diametro. Por tanto, se sintetizaron cuatro derivados estructurales de CD3ac (CD1, CD2, CD3 y CD4), que no estan acetilados y por tanto estan cargadas y son hidrosolubles (vease la Tabla 3).
Tabla 3: Secuencias de aminoacidos y peso molecular de los peptidos de ejemplo sintetizados y derivados de los
mismos
[Nombre]
Secuencia PM (Da)
CD1
H-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2 1228,680
CD2
H-LK-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2 1356,775
CD3
H-LK-LK-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2 1484,870
CD4
H-LK-LK-LK-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2 1612,965
CD3ac
Ac-LK(Ac)-LK(Ac)-LK(Ac)-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2 1652,910
LCD3
H-LK-LK-LK-LW-LL-LW-LL-LW-LL-LW-NH2 1484,870
LCD3ac
Ac-LK(Ac)-LK(Ac)-LK(Ac)- LW-LL- LW-LL- LW-LL- LW- NH2 1652,910
La figura 4 muestra espectros de dicrofsmo circular de CD1 a CD4 en agua. Por lo general, los peptidos de poli-L- lisina cargados adoptan una estructura secundaria de enrollamiento al azar y presentan elipticidades negativas entre 180 nm y 210 nm; lo presentado en el presente documento demuestra que peptidos con secuencias de oligo-lisina mas cortas muestran mayores elipticidades en este intervalo de longitudes de onda. Ademas, un espectro ffpico de enrollamiento al azar tiene poca o ninguna influencia sobre las elipticidades por encima de los 210 nm; Por tanto, el intervalo de longitud de onda entre 210 nm y 260 nm puede asignarse casi en su totalidad a la influencia de la secuencia alternante de L-Trp y D-Leu. Por ejemplo, la intensidad y la posicion del pico a 223 nm se mantiene casi sin cambios a medida que el numero de restos de lisina unidos se vana, lo que indica que la estructura secundaria de las unidades repetitivas de LW-DL se ve poco afectada o no se ve afectada en absoluto por la longitud de oligo- lisinas unidas N-terminalmente - posiblemente incluso no se vea afectada por la presencia de multiples cargas cationicas en los restos de lisina unidos.
Los espectros de dicrofsmo circular de CD4-CD1 sirven para que puedan extrapolarse teoricamente a un CD0 imaginario, que no contendna ninguna lisina, para obtener un espectro con maximos a aproximadamente 196 nm y 223 nm. Espectros similares no se han observado en peptidos hidrofobos sinteticos anteriores, pero se han notificado previamente en estudios estructurales de gramicidina A, un peptido antibiotico de 15 aminoacidos derivado de la bacteria que vive en el suelo Bacillus brevis [16, 17].
El motivo de estructura secundaria de la gramicidina es una helice amplia raramente observada en la naturaleza y versatil en terminos de pendiente helicoidal, quiralidad y configuracion dimerica (estructura cuaternaria) [17c, 18], dependientes de la constante dielectrica de su medio ambiente [19]. Mientras la gramicidina A contiene un motivo de alternancia de L-Trp y D-Leu, el CD3ac presentado en el presente documento es distinto de la gramicidina en varios aspectos, por ejemplo, secuencia de peptidos y longitud, modificaciones significativas del formilo y la etanolamina unidos terminalmente presentes en la gramicidina. Por ejemplo, la secuencia de la gramicidina es hidrofoba en toda su longitud, pero el CD3ac presentado en el presente documento es anfifflico debido a la adicion N-terminal de al menos una L-lisina (por ejemplo, 1 L-lisina, 2 L-lisinas o 3 L-lisinas) y la acetilacion de al menos un grupo amino del peptido anfifflico.
Sin desear quedar ligado a teona alguna, una secuencia repetitiva de LW-DL puede conducir a un conjunto de angulos fi y psi claramente diferentes de los observados en helices alfa, laminas beta y enrollamientos al azar aislados, y muy probablemente esten gobernados por el impedimento esterico; pueden observarse ocasionalmente enlaces de hidrogeno intramoleculares estables en peptidos relativamente cortos [20]. Si bien este tipo de estructuras secundarias y enlaces de hidrogeno intramoleculares pueden existir en CD3ac, el CD3ac es muy probablemente demasiado corta para plegarse sobre sf mismo.
La importancia de la estructura secundaria en relacion con el ensamblaje en forma de esferas se demostro mediante LCD3ac, un peptido de constitucion identica (secuencia de aminoacidos), pero enteramente compuesto de L- aminoacidos. LCD3ac precipita a la estructura amorfa en el intervalo de tamano de micrometros (Figura 5A) y el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
espectro de dicrofsmo circular de LCD3 cargado tiene caractensticas a-helicoidales dominantes (Figura 5B). Los datos combinados de MEB y dicrofsmo circular indican que la caractenstica de la precipitacion esferica depende, al menos en parte, de la presencia de D-Leu y la estructura secundaria espedfica inducida por la misma.
Ejemplo 2: Nanoparticulas de peptido solido CD3ac - Encapsulacion de la carga
CD3ac es el primer peptido sintetizado por qmmica Fmoc que forma partfculas solidas en el intervalo de tamanos nano y micrometricos y es una promesa para las aplicaciones de entrega de farmacos. Aunque las esferas CD3ac precipitadas, en algunas realizaciones, por lo general no se adhieren entre sf y no tienen afinidad observable por las superficies de vidrio o plastico, pueden encapsular moleculas de carga durante su formacion. Se codisolvio CD3ac con 5-carboxifluorescema (CF) 1o x 10'6 M, 4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'-tetrayodofluorescema (RB) 10 x 10'6 M y una mezcla equimolar de ambos colorantes, respectivamente. El experimento se realizo a pH 5, donde RB esta cargada pero la CF esta en gran medida protonada presentando baja solubilidad en solucion acuosa. El volumen de disolvente se volvio a ajustar a 50 pl despues de la contra-evaporacion, por lo que el contraste de fluorescencia entre el fondo y las perlas de peptido puede determinar al menos cualitativamente la acumulacion de carga dentro de las esferas.
Tanto la CF como la RB son captadas por las perlas de CD3ac, mas bien con independencia del estado de carga del colorante (Figuras 6A-6C). Sin embargo, las perlas cargadas con CF se agregan en ensamblajes con forma de uva, (Figura 6B), mientras que las esferas cargadas con RB no se adhieren entre sf (Figura 6A), muy probablemente debido a la visualizacion de RB cargada sobre o cerca de la superficie de la perla.
Tanto un colorante hidrofobo tal como CF como un colorante relativamente hidrofilo tal como RB pueden encapsularse en perlas de CD3ac. Sin desear quedar ligado a teona alguna, las moleculas hospedadoras pueden preasociarse a CD3ac en una fase temprana (en solucion) y ensamblarse despues de la retirada de etanol. El grado de preasociacion y por tanto la eficiencia del coensamblaje, dependera de la afinidad de los compuestos de hospedadores y de los huespedes; en el caso de derivados xanteno tales como CF y RB, la interaccion de estructuras de anillo deslocalizadas podna contribuir a su preasociacion con CD3ac.
Para analizar la composicion molar de las perlas de CD3ac cargadas, se cuantifico el contenido de colorante las perlas de CD3ac cargadas con RB. RB es facilmente disponible y soluble en etanol asf como en agua. Sin desear quedar ligado a teona alguna, la solubilidad en agua es obligatoria para evitar la precipitacion de carga fuera de las perlas de peptido en el intercambio de disolvente. Ademas, la absorcion de luz de RB no se inactiva fuertemente en mezclas de agua y DMSO, lo que permite la cuantificacion conveniente y precisa mediante densidad optica.
En pocas palabras, CD3ac y RB se codisolvieron a diferentes relaciones de concentracion en EtOH al 50 %. Se aplicaron 50 pl de cada uno a placas de cristalizacion de 24 pocillos y se contraevaporaron cuatro veces contra 1 ml de H2O durante 16 h. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Las esferas CD3ac generalmente precipitan despues de aproximadamente 30 min, dependiendo de la concentracion de RB. Despues de equilibrar el disolvente, el sedimento de perlas formado se resuspendio y se normalizo con H2O a un volumen final de 100 pl. Las muestras se centrifugaron durante 30 min a 20.000 g, antes de que se separaron 80 pl de sobrenadante. Posteriormente, la fraccion de sedimento restante se diluyo 1:1 con 20 pl de DMSO para disolver los ensamblajes de peptidos. Contrariamente al etanol, el uso de DMSO ayuda a reducir la evaporacion de la muestra y produce valores de absorcion estables durante al menos 5 min (el volumen de la muestra para un experimento de UV-Vis es de 4 pl, vease la seccion Materiales y Metodo de ejemplo que se ha descrito anteriormente).
Los datos de cuantificacion de co-ensamblaje se resumen en la Figura 7A. La concentracion de CD3ac se mantuvo constante a 615 x 10'6 M en los experimentos que se describen en el presente documento. La relacion molar disuelta inicialmente de colorante a peptido se proporciona como [RB]i/[CD3ac]i. Por ejemplo, a [RB]i/[CD3ac]i = 1 como condicion de partida experimental, despues de la formacion de perlas, aproximadamente un tercio de la composicion molar de la esfera (nRBp/nCD3acp) es RB (drculos abiertos como se muestra en la Figura. 7A) y aproximadamente el 25 % de colorante disuelto inicialmente se cargo en perlas de CD3ac (nRBp/nRBi, triangulos abiertos como se muestra en la Figura 7A). Como se muestra en la Figura 7B, la absorcion de fracciones de sedimento y de sobrenadante a 280 nm (absorcion maxima de triptofanos) indica que CD3ac precipita casi cuantitativamente en presencia de un amplio intervalo de concentraciones de RB (la relacion molar de RB a CD3ac [RB]i/[CD3ac]i en los experimentos que se describen en el presente documento abarca 1,5 ordenes de magnitud). La adicion de concentraciones mayores de RB puede conducir a mas moleculas de colorante coensambladas dentro de las perlas de CD3ac; sin embargo, la relacion de RB inicialmente disuelta y coensamblada no es linealmente proporcional y la eficiencia del coensamblaje (nRBp/nRBi) alcanzara un lfmite de saturacion.
La eficiencia de encapsulacion de RB en perlas de CD3ac puede ascender hasta al menos aproximadamente el 30 % p/p o al menos aproximadamente el 40 % en moles o mayor en relaciones de concentracion analizadas, lo que corresponde a un aumento de aproximadamente 900 veces la concentracion de RB o un coeficiente de particion logantmica de RB en CD3ac/H2O de 2,95. Similares o incluso mayores eficiencias se contemplan para moleculas de carga hidrofoba; sin embargo, la cuantificacion exacta de los compuestos insolubles en agua puede ser propensa a artefactos debido a la precipitacion de carga fuera de las perlas de peptido en el intercambio de disolvente.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La capacidad de CD3ac de preasociarse de manera eficiente y coprecipitar RB es notable, al menos en parte debido a que RB esta doblemente cargada y es hidrosoluble. De hecho, su solubilidad en agua es aproximadamente cinco veces mayor que en etanol. Como se presenta en el presente documento, el ensamblaje de perlas de CD3ac no se inhibe por la presencia de concentraciones equimolares de RB y se contempla que, sin quedar ligado a teona alguna, el peptido y el colorante interaction principalmente sobre interacciones aromaticas que conducen a una union mas bien inespedfica (en comparacion con, por ejemplo, avidina/biotina). Esta funcionalidad puede complementar las propiedades de encapsulacion de nanopartfculas lipfdicas solidas, as^ como sistemas vesiculares.
En el presente documento se presenta una secuencia altamente hidrofoba de 10 aminoacidos sintetizados y purificados con altos rendimientos y cantidades preparativas. El peptido (CD3ac) puede ensamblarse en perlas de forma uniforme, de baja polidispersidad de tamano en ausencia de cualquier estrategia de moldes. Las mediciones de dicndsmo circular de derivados cargados de CD3ac indican una relacion estructural con gramicidina D,L- helicoidal y el papel esencial de D-Leu con respecto a su estructura secundaria espedfica. LCD3, que contiene exclusivamente los aminoacidos L, presenta caractensticas a-helicoidales y precipita de forma amorfa en su estado acetilado. CD3ac puede encapsular ambos compuestos hidrofilos e hidrofobos con eficiencias superiores a las estrategias de encapsulacion existentes [15], por ejemplo, dando como resultado coeficientes de reparto logantmicos de al menos 2,95 y la eficiencia de encapsulacion no esta limitada por la concentracion de las especies hidrofilas en solucion, a menos que alcance un lfmite de saturacion.
De acuerdo con diversos aspectos y realizaciones que se describen en el presente documento, el estado de las partfculas de peptido solidas junto con una encapsulacion de carga altamente eficiente puede utilizarse para disminuir la degradacion de productos farmaceuticos sensibles y caros y puede aplicarse para entregar altas cargas utiles en las celulas. Un sistema de entrega de farmaco de este tipo puede atrapar y acumular moleculas huespedes (por ejemplo, principios activos) en un procedimiento practico de una etapa. Por tanto, en el presente documento se presenta un sistema de entrega de farmacos no polimerico basado en componentes basicos de aminoacidos naturales y la srntesis mediante qrnmica Fmoc, que pueden aumentar la actual batena de herramientas de las especies coloidales y supone una promesa para aplicaciones medicas.
Ejemplo 3. Nanoparticulas de CD3ac con una corona de proternas para la entrega de farmacos a las celulas
Como se describe en los Ejemplos 1 y 2, las nanopartfculas de peptidos CD3ac pueden ensamblarse a partir de CD3ac disuelto por adicion de agua: se forma una emulsion espontaneamente segun la mezcla ternaria (CD3ac, disolvente organico, H2O) se lleva la region de dos fases (CD3ac, H2O). El proceso de emulsion se asemeja al efecto ouzo (8), sin embargo, las gotitas de CD3ac se endurecen a partfculas solidas segun se elimina el disolvente organico. Los ejemplos 1 y 2 demuestran que las moleculas aromaticas con carga neutra, asf como las cargadas, pueden migrar a la fase dispersa y quedar atrapadas durante la formacion de partfculas (5).
En el Ejemplo 3, en el presente documento se presenta un nuevo sistema de entrega de farmacos que consiste en la matriz de peptido CD3ac, la carga atrapada (Flutax-2) y una corona de transferrina, opcionalmente marcada con Alexa Fluor 568 (Tfn-AF568) con fines de visualizacion. Para evaluar la disposicion espacial de los reactivos en partfculas de CD3ac autoensambladas, se disolvieron peptidos CD3ac junto con Flutax-2 y Tfn-AF568 en EtOH al 50 % y el contenido de EtOH se redujo en etapas como se muestra en los Materiales y Metodos de ejemplo mas adelante. Las Figuras 8A-8I muestran imagenes de fluorescencia de las nanopartfculas transportadoras de farmaco de peptido CD3ac resultantes. En esta realizacion, las nanopartfculas CD3ac teman aproximadamente 3 pm de diametro, el tamano disenado para ser lo suficientemente grande para distinguir la distribucion de la fluorescencia entre el nucleo y la superficie por microscopfa optica convencional. Sin desear quedar ligado, pueden producirse nanopartfculas de peptido CD3ac mas pequenas o mas grandes. Tfn-AF568 muestra un anillo luminoso de fluorescencia en la periferia de la partfcula mientras que la fluorescencia de Flutax-2 se distribuye por igual en toda la partfcula (Figuras 8A-8C). La eficacia de captura se midio determinando el coeficiente de reparto de Flutax-2 entre las partfculas de peptido y agua (Figuras 9A-9D). El coeficiente de particion de Flutax-2 entre las partfculas de peptido y agua se determino que era 5,25, es decir, en las condiciones experimentales aplicadas, mas del 80 % del Flutax-2 codisuelto escapa a la fase acuosa y queda atrapado en las partfculas. Dicho valor de coeficiente de reparto es notablemente alto para un compuesto hidrosoluble.
Las proternas son generalmente tensioactivas y pueden adsorberse sobre las interfaces solido-lfquido. En consecuencia, se busco determinar si las partfculas en contacto con soluciones de proternas pueden quedar cubiertas con una capa de proternas que se denomina "corona de proterna" (10). Como tal, se evaluo si el borde pronunciado de la fluorescencia roja representa una corona que consiste en Tfn-AF568. Para evaluar esto, las partfculas que se describen en el presente documento se incubaron durante 6 horas en 50 pg/ml de tripsina. El borde desaparecio, mientras que la distribucion espacial de la carga de Flutax-2 permanecio inalterada (Figuras 8D- 8F). La cuantificacion de los perfiles de nivel de gris indica que la intensidad del borde de Tfn-AF568 se redujo 3 veces despues de la incubacion con tripsina (Figura 8G). Al mismo tiempo, la eliminacion de la corona de Tfn-AF568 dio lugar a un aumento de la fluorescencia verde de Flutax-2 hasta un factor de 13 (Fig. 8H), originando la superposicion espectral de Tfn-AF568-absorcion y Flutax-2-emision. Juntos, estos experimentos indican que el autoensamblaje de CD3ac, Flutax-2 y Tfn-AF568 conduce a la formacion de partfculas con Flutax-2 atrapado y una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
corona de Tfn-AF568 adsorbido en la superficie. La tripsinizacion de las partmulas autoensambladas pueden dar como resultado la degradacion proteolftica de Tfn-Af568 seguida de desorcion superficial de los fragmentos (Figura 8I).
Las partmulas para la entrega de farmacos estan generalmente entre 8 nm y 200 nm de diametro ya que este intervalo de tamano es menos probable que se elimine por el rinon y el fugado (4). Ademas, la endocitosis mediada por receptor, un posible mecanismo para la captacion de partmulas que contienen farmaco dirigidas, es dependiente del tamano y es mas eficiente para partmulas mas pequenas de aproximadamente 150 nm (11). Con el fin de reducir el tamano de partmula CD3ac, se disolvieron concentraciones de peptido mas bajas antes de la emulsion: Las Figuras 10A-10C muestran imagenes de microscopfa de fluorescencia de partmulas de peptidos preparadas a partir de CD3ac 492 jM, 246 |jM y 123 jM, ensambladas en presencia de 10 jg/ml de Tfn-AF568. Las diferencias de tamano resultantes se resumen en la Figura 10D mediante perfiles de intensidad de fluorescencia asociada a partmulas. El anillo caractenstico, todavfa visible a 492 mm, no puede observarse en partmulas mas pequenas debido al lfmite de difraccion de la luz visible, aunque la microscopfa optica confirma la presencia de Tfn-AF568 en partmulas menores de 300 nm (Figura 10E). Para confirmar la formacion de corona de Tfn-AF568 sobre las nanopartmulas (d <100 nm), se aplico microscopfa electronica de transmision (MET).
PNP Com'm
Brevemente, se utiliza Cacsa en el presente documento como un acronimo para las nanoparticulas de peptido CD3ac autoensambladas en presencia de carga (por ejemplo, Flutax-2 utilizado en el presente documento) y corona (por ejemplo, Tfn-AF568 utilizado en el presente documento). Las Figuras 10F-10I muestran imagenes de MET de particulas PNP en diversas configuraciones: PNPfmbx-2 (Figuras 10 F-10G) y PNPj^^f*6* (Figuras 10H-10I).
Ambas muestras se tineron con acetato de uranilo, apartando las particulas brillantes y el fondo oscuro. Se detectaron PNPFiutax-2 en gran numero y uniformemente distribuidas en la pelicula de carbono (Figura 10F). Por el contrario, solo pudieron detectarse algunas particulas en la muestra dePNPj^^**6*’ en su iu9aL se agruparon
(Figura 10H), lo que indica el proceso de deshumectacion y la evaporacion de agua residual durante la preparacion de la muestra y, por tanto, la afinidad diferencial para el soporte de carbono hidrofobo. El aumento mayor (Figura 10I) muestra un borde de contraste intermedio en la interfaz de las nanoparticulas. Su espesor medio de 9,85 nm (desviacion tfpica = 2,1, n = 99) esta de acuerdo con el diametro de protema esperado (12). Aunque ambas muestras se prepararon mediante el mismo protocolo, el diametro medio de PNPFiutax-2 (100 nm, Figura 10J) era dos veces el de PNPpfc^f*6* nm’ s'n inciuir ia corona, Figura 10K). Sin desear quedar ligado a teoria alguna, el
tamano medio de las particulas de peptido depende no solo en parte de la concentracion de peptido, sino tambien en parte de la presencia de moleculas tensioactivas que estabilizan la emulsion en una fase temprana en el proceso de separacion de fases (8). Por tanto, estos analisis de microscopfa electronica indican que los diametros de particulas de peptidos pueden controlarse hasta unos diez nanometros, por ejemplo, mediante la modulacion de diferentes parametros de procesamiento, por ejemplo, pero no limitados a, la concentracion de peptido y/o la concentracion y/o los tipos de moleculas tensioactivas. Junto con las imagenes de microscopfa de fluorescencia de las Figuras 8A-8F, las imagenes de MET indican la presencia de una corona de Tfn-AF568 en las PNP.
Ejemplo 4. Entrega de Flutax-2 en celulas CHO mediante nanoparticulas de CD3ac con una corona de proteina
La union selectiva a receptores de transferrina (TfR) depende de la funcionalidad de la corona de protema: su funcion puede verse comprometida por la desnaturalizacion de protemas, el impedimento esterico (aglomeracion) o la orientacion desfavorable relativa a la superficie de las PNP. La acumulacion de PNP en las superficies celulares puede atribuirse a las interacciones espedficas receptor-corona y/o a asociaciones no espedficas. Por ejemplo, las fuerzas electrostaticas (Coulomb) y electrodinamicas (Van der Waals) pueden contribuir a la asociacion inespedfica (13-15). Con el fin de ensayar la funcionalidad de la corona detectada en la mediacion de la union espedfica, el numero de PNP asociadas a la superficie celular se relaciono con la densidad de TfR disponibles utilizando dos protocolos experimentales independientes: a) union a PNP por Tfn en solucion; y b) comparacion de union a PNP entre las celulas de ovario de hamster chino (CHO) que expresan TfR y celulas TRVb, que derivan de tejido de ovario de hamster chino que carece de TfR endogena pero expresa TfR2 (16). Las Figuras 11A-11H muestran imagenes de microscopia de celulas CHO incubadas durante una hora conPiV/>^1,^'_^568 Se detecto acumulacion
significativa de las PNP dentro del penmetro de celulas proyectada (Las Figuras 11A-C), que podna bloquearse por incubacion de celulas CHO con Tfn 17 pM sin marcar (Figuras 11D-11F). Esto indica que las interacciones de las PNP con la superficie de la celula dependen del TfR libremente valente. La Figura 11G muestra que la menor densidad de TfR en TRVB conduce a una tasa de asociacion significativamente reducida dePNPj^^**6*
incubacion de TRVB con Tfn 17 pM sin marcar bloquea la union dePNP^^^6*l° que indica que en estas celulas PNPpfaia^568interactuan mayoritariamente traves del receptor de baja abundancia TfR2. La aplicacion del exceso
de Tfn no solo podna competir con las PNP por TfR sino que tambien puede intercambiar el Tfn-AF568 fluorescente en la corona de partfculas por Tfn no fluorescente. Para evaluar esta posibilidad, la distribucion de intensidad de fluorescencia de pNTfn-AF568 incubada a 37 °C en presencia y ausencia de Tfn 17 jM despues de 24 horas se compararon y habfa diferencias insignificantes (Figuras 9C-9D). Esto indica que la tasa de union mediada por TfR de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
las PNP a la superficie celular es mucho mas rapida que el intercambio de protemas en la superficie de PNP. Junto con los resultados presentados en las Figuras 11A-11H, se demuestra que las PNP se unen a TfR espedficamente a traves de la corona de Tfn-AF568.
Mientras que PNPpj^f*6*Puec^e ur|irse a las celulas a traves de interacciones con TfR, Tfn podria disociarse de la
corona de PNP antes de que la internalizacion tenga lugar y/o la diferencia de tamano entre protemas Tfn individuales y una NP puede afectar a la captacion celular. Por tanto, despues se busco determinar si las partmulas pueden ser internalizadas por las celulas. La distincion entre las PNP asociadas e internalizadas no puede deberse directamente a la forma plana de las celulas de superficie adherente y a una resolucion z limitada de la microscopfa optica. Como se ha mostrado anteriormente, la eliminacion de Tfn-AF568 de la superficie de la partmula puede detectarse por un cambio pronunciado de verde a rojo en la relacion de fluorescencia (V/R). Como tal, se midio la distribucion de V/R para distinguir entre las PNP asociadas e internalizados en las celulas, como se muestra en las Figuras 12A-12M, respectivamente. Las celulas CHO se fijaron y se tomaron imagenes despues de 1 hora (Figs.12A-12E) y despues de 6 horas (Figs.12G-12K) de incubacion conpjVP^,^^568-Despues de 1 hora, la
distribucion de V/R mostro un pico estrecho aproximadamente a 1,5 para ambas PNP dentro (Figura 12E, barras negras) y fuera (Figura 12E, barras grises) del penmetro de la celula. Como se muestra en la Figura 12K, despues de 6 horas, la poblacion de PNP dentro del penmetro de las celulas (barras negras) muestra un cambio significativo hacia valores mas altos de V/R, mientras que la distribucion de V/R de las PNP fuera del penmetro de las celulas (barras grises) se mantuvo confinada en torno a 1,5. Sin desear quedar ligado a teona alguna, se contempla que tras la incubacion durante 1 hora, la mayona de las PNP aun no han llegado a un compartimento lisosomico y las que se han internalizado todavfa tienen una corona intacta que contiene Tfn-AF568; despues de seis horas, la mayona de las PNP habfan sido transportadas en los lisosomas y sus coronas de protemas se hadan digerido proteolfticamente. Los productos de degradacion mas pequenos pueden disociarse de la superficie de la partmula debido a las fuerzas mas debiles de Van der Waals (17). En analogfa a un aumento en V/R despues de la eliminacion de la corona por la tripsina (Figura 8H), la digestion proteolftica de la corona de PNP en los lisosomas puede producir un aumento en los valores de V/R de las PNP internalizadas. Esto se corrobora por los valores sin cambios de V/R de las PNP detectados en la superficie de vidrio. Los cambios en V/R pueden usarse en el presente documento como un indicador cualitativo de las PNP internalizadas (debido a la cinetica de digestion relativamente lenta) para demostrar que las PNP con una corona de Tfn-AF568 pueden entrar o ser captadas por las celulas, por ejemplo, por endocitosis mediada por clatrina a traves de TfR (18).
Para evaluar si la union y la internalizacion de las PNP puede dar como resultado la importacion selectiva de carga de molecula pequena, se analizo la liberacion de Flutax-2 encapsulado en las celulas 24 horas despues de la adicion de PNPp£^26&en 'as c®^as (Figuras 13A-131). El Flutax-2 es un derivado modificado con Verde de Oregon (OG)
de paclitaxel (19), un inhibidor mitotico aplicado en la terapia del cancer (20). A diferencia de su forma no marcada, Flutax-2 se esta cargado y es hidrosoluble a la concentracion aplicada y, por consiguiente no penetra las membranas celulares. Por tanto, se utilizo un compuesto modelo para investigar la eficiencia y la especificidad de la entrega de moleculas pequenas por las PNP al citosol. Se incubaron celulas CHO durante 24 horas con Flutax-2 0,67 pM, ya sea disuelto en medios (Figuras 13A-13C) o atrapado en PNPj^^f*6* (Figuras 13D-13G). La emision
de Flutax-2 en el citosol se promedio para cuantificar la cantidad de compuesto entregado a las celulas. La permeacion directa de Flutax-2 disuelto a traves de las membranas celulares no se pudo detectar ya que la fluorescencia resultante no supero el nivel de autofluorescencia (Figuras 13B y 131). Porotro lado, la incubacion con PNPffc^^6*di° como resultado una fuerte serial de fluorescencia verde difusa (Figuras 13E y 13G.), lo que indica
la entrega de Flutax-2 al citosol. La entrega se redujo significativamente por la competencia de las interacciones PNP-celula con Tfn 17 pM disuelto y sin marcar en medio de cultivo celular (Figura 13H). Asimismo, la tasa general de entrega fue significativamente menor para las celulas TRVb, que expresan solamente TfR2 (Figura 13H).
En el presente documento se presenta un sistema de entrega dirigido de farmacos que consiste en una matriz de peptido CD3ac, Flutax-2 impermeable a las membranas celulares como carga y Tfn-AF568 como un ligando espedfico de receptores de la superficie celular, de acuerdo con una o mas realizaciones que se describen en el presente documento. Los tres componentes pueden autoensamblarse para formar partmulas cargadas con farmaco y funcionalizadas mediante la aplicacion de un procedimiento de una sola etapa (por ejemplo, una solo etapa de aproximadamente 15 minutos). Sin desear quedar ligado, la simplicidad del sistema y el protocolo de formacion se origina en la interaccion concertada de todos los componentes implicados: CD3ac no solo es un material de la matriz, sino que reemplaza rutinas de encapsulacion debido a su alta afinidad por moleculas aromaticas pequenas. El proceso de captacion de carga mas probable se asemeja a una extraccion de ftquido de dos fases donde Flutax-2 escapa de la fase acuosa y se acumula en las gotitas de peptidos, probablemente debido a la alta afinidad entre sistemas de anillo deslocalizados de triptofanos y Flutax-2. Adicionalmente, la solubilidad del peptido en disolventes organicos suaves permite la disolucion simultanea y el autoensamblaje de todos los componentes implicados. La presencia de Tfn-AF568 durante la emulsion de CD3ac da como resultado la formacion de una corona de protemas, que dirige PNP contra TfR. Adicionalmente, la presencia de la protema en la superficie de las partmulas puede permitir la modulacion del tamano de partmula debido a su actividad de superficie y por tanto estabilizacion en fase temprana de la emulsion de peptidos. Tras la internalizacion de las PNP en compartimentos lisosomicos, la digestion proteolftica en una escala de tiempo de unas pocas horas puede retirar la corona y a su vez liberar la carga atrapada
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
en el citosol en una escala de tiempo de dfas. La relacion de fluorescencia de los colorantes verde encapsulado (por ejemplo, Flutax-2 utilizado en el presente documento) y rojo adherente a superficies (por ejemplo, Tfn-AF568) puede cambiar a un valor mas alto (por ejemplo, por un factor de 13) al retirar la corona y este cambio puede permitir una descripcion cualitativa de captacion celular de partfculas. La union de PNP a TfR y el intervalo de tamano de las partfculas indican captacion de partfculas, por ejemplo, a traves de endocitosis mediada por clatrina. Sin desear quedar ligado a teona alguna, la liberacion de carga puede volver a la degradacion proteolftica de las PNP en el lisosoma. Es probable la estructura de los productos de degradacion de CD3ac cargado penetren las membranas lipfdicas y puedan conducir a la rotura de los lisosomas (21).
Materiales y metodos de ejemplo (para los Ejemplos 3-4)
Soluciones madre: La smtesis y purificacion de CD3ac se describio en "Materiales y Metodos de ejemplo para los Ejemplos 1-2" (Vease, por ejemplo, Dittrich y Meier (2010) Macromolecular Bioscience 10: 1406). Brevemente, el peptido se sintetizo sobre una fase solida utilizando la qmmica del grupo de proteccion Fmoc y se purifico en material de cromatograffa C18 de fase inversa (RP) aplicando un gradiente de acetonitrilo y agua. La pureza se determino por integracion de los picos de los perfiles de elucion de RP-HPLC a A280 y supera el 95 %. Se prepararon soluciones madre de CD3ac disolviendo el peptido en EtOH:H2O (1:1 v/v). La concentracion se determino por absorcion (Thermo Scientific Nanodrop 2000) a 280 nm en una mezcla de EtOH:H2O:DMSO 1:1:2 teniendo en cuenta £280 = 21780. La concentracion de peptido se ajusto a 742 pM con EtOH:H2O (1:1 v/v) y partes alfcuotas de 200 pl se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior. Se disolvio Tfn-AF568 (Invitrogen, T-23365) a una concentracion de 500 pg/ml y se almaceno a +4 °C. Se disolvio Flutax-2 (Invitrogen, P22310) a una concentracion de 40 pM en H2O:EtOH (1:1) y se almaceno a -80 °C.
Ensamblaje de partculas, conduccion y formacion de corona: Las PNP se ensamblaron mediante la mezcla de soluciones madre de CD3ac, Tfn-AF568 y Flutax-2 para proporcionar concentraciones finales de CD3ac 123 pM, Flutax-2 6 pM y Tfn-AF568 10 pg/ml en H2O:EtOH (1:1, v/v). La emulsion se indujo mediante una primera etapa de dilucion (1:1, H2O) seguida de un penodo de equilibrio de 15 minutos antes de que el contenido de etanol se redujese adicionalmente al 25% en la segunda etapa de dilucion (1:1, H2O). Se aplicaron alfcuotas de 50 pl de la suspension resultante a placas de cristalizacion por gota posada de 24 pocillos (Hampton Research, Cryschem) y se contraevaporaron 3 veces contra 1 ml de H2O durante seis horas.
Experimentos en celulas cultivadas: Se cultivaron estirpes celulares CHO en F12:DMEM 1:1 (Cellgro, 10-090) mas suero bovino fetal al 10 % (Gibco). Se sembraron 2 x 104 celulas en 0,5 ml de medio en cubreobjetos de vidrio (VWR, 89015-724) en placas de 24 pocillos (Falcon, 353047) y se incubaron durante 16 horas. Las celulas se lavaron una vez con pBs y se incubaron durante 30 minutos adicionales en medio F12 de Ham (Cellgro, 10-080) antes de que se aplicaran 50 pl de solucion de nanopartfculas (NP) (como se preparo anteriormente) en 250 pl de F12. La concentracion de CD3ac utilizada en la incubacion de celulas corresponde, por tanto, a 8,3 pg/ml, ignorando el peso del Flutax-2 y el Tfn-AF568 asociados. En ensayos de competencia, las celulas se preincubaron durante 30 min en medio F12 que contema Tfn 17 pM (Sigma, T1283) antes de que se anadiera una solucion de 50 pl de PNP en 250 pl de F12 que contema Tfn 17 pM. Las muestras se fijaron con paraformaldefndo al 3 % (Sigma, P6148) en PBS, se montaron sobre portaobjetos de vidrio usando medio de montaje fluorescente (Dako, S3023) y se analizaron a las 24 horas.
Fluorimetria: Se realizaron experimentos de fluorescencia en un lector de placas BMG FLUOstar Omega en placas negras de 384 pocillos (MP100-1, Matrical). Se midieron series de dilucion de Tfn-AF568 y Flutax-2 en H2O:DMSO:FBS 6:3:1 (V:V:V) y los puntos de datos se ajustaron de forma lineal.
Tabla 4: Parametros de ejemplo determinados a partir de la regresion lineal de datos
Tfn-AF568 Flutax-2
Valor Error tfpico Valor Error tfpico
Intercepcion
4501,69 234,76 4809,00 85,56
Pendiente
1,011 x 106 5750,49 5,573 x 1010 2,515 x 108
R2
0,99977 0,99986
Para determinar las eficiencias de encapsulacion de Flutax-2, las PNP se ensamblaron con el procedimiento descrito anteriormente en presencia de una concentracion fija de Tfn-AF568 (10 pg/ml) y diversas cantidades de Flutax-2 (1,6 pM, 4 pM, 8 pM, 12,5 pM y 16 pM). Despues del ensamblaje en placas de cristalizacion (vease anteriormente) las muestras de PNP se normalizaron con H2O a 100 pl y se centrifugaron durante 1 hora a 16.000 g antes de que se separaran 80 pl de la fraccion de sedimento. Ambas fracciones se normalizaron a 133,3 pl en H2O:DMSO:FBS 6:3:1 (v:vv) antes de que se aplicaran 120 pl a la placa de pocillos y se midiera la intensidad de fluorescencia.
Microscop^a electronica de transmision: Se prepararon muestras de PNP como se ha descrito anteriormente. Se suspendieron 5 pl de PNP en suspension en H2O a una red de cobre recubierta con pelfcula de carbon (malla cuadrada 400, Electron Microscopy Science) y se secaron. La muestra se tino con 10 pl de acetato de uranilo 1 %
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
durante un minuto. El exceso de tinte se retiro con un papel de filtro y posteriormente se aplico a un Tecnai G2 Spirit BioTWIN.
Microscop^a: Las celulas fijadas se analizaron en un microscopio invertido Nikon Ti equipado con una lente objetivo 60x Plan Apo NA 1.4. La fluorescencia de DAPI se excito con un filtro 360/40 y se recogio con un filtro de emision 460/50. La fluorescencia del verde Oregon se excito con un filtro 360/40 y se recogio con un filtro de emision 480/40. La fluorescencia de AF568 se excito con un filtro 545/30 y se recogio con un filtro de emision 620/60. Las imagenes se adquirieron con camara CCD enfriada ORCA R2 Hamamatsu controlada con el software MetaMorph 7. La radiacion gamma, el brillo y el contraste se ajustaron en las imagenes mostradas (de forma identica para los conjuntos de imagenes comparados) utilizando el software ImageJ. Se recogieron secciones opticas de la serie z con un tamano de etapa de 0,25 micrometros que van del portaobjetos de vidrio a la PNP mas alta detectable utilizando un motor de enfoque Prior Proscan II. Las muestras observadas despues de 1 hora y 6 horas de incubacion con PNP son proyecciones de apilamiento maximo (fusionadas) de canales de AF568 y Verde de Oregon (OG). Las muestras observadas despues de 24 horas se obtuvieron por proyeccion promedio de fluorescencia de Verde de Oregon y proyeccion maxima de apilamientos de AF-568. La proyeccion promedio de OG se utilizo para cuantificar las diferencias de fluorescencia de Flutax-2 en el citosol. Los petfmetros de las celulas se segmentaron manualmente en imagenes de DIC. Los puntos de maxima fluorescencia se extrajeron mediante ImageJ (v. 1.43u) utilizando una tolerancia de ruido de 50 en la clase publica MaximumFinder.
Ejemplo 5. Entrega de nocodazol en celulas HeLa con una o mas realizaciones de nanoparticulas de CD3ac
La Figura 16A muestra una realizacion de las nanopartfculas de CD3ac, en la que EGF (opcionalmente marcado con rojo Texas con fines de visualizacion) es un ligando de direccion a celulas. Dichas nanopartfculas de CD3ac con EGF como ligando pueden ser captadas por las celulas, como se muestra en la Figura 16B. Para producir perlas de CD3ac encapsuladas con nocodazol, en algunas realizaciones, se disolvieron CD3ac 21 jM, EGF 2 jg/ml (marcado con rojo Texas con fines de visualizacion) y nocodazol 20-40 jM en un disolvente organico (Figura 17A o 17G). El intercambio de disolvente con agua puede dar como resultado la formacion de una emulsion y, por tanto, nanopartfculas solidas de CD3ac que contienen nocodazol y EGF. En algunas realizaciones, al menos una parte de EGF se encapsulo en perlas de CD3ac. Ademas, el EGF puede adsorberse en la superficie exterior de las perlas de CD3ac, dando como resultado perlas de CD3ac funcionalizadas con EGF.
Despues de la incubacion de las celulas HeLa en medios que conteman dichas partfculas de CD3ac encapsuladas con dos concentraciones diferentes de nocodazol (20 jM o 40 jM), las imagenes microscopicas fluorescentes (Figura 17B-17F y 17H-17K) muestran que las partfculas de CD3ac funcionalizadas con EGF fueron captadas por las celulas HeLa y los microtubulos en esas celulas HeLa tratadas con partfculas de CD3ac funcionalizadas con EGF estaban en gran parte despolimerizadas. Sin embargo, las celulas HeLa tratadas con el sobrenadante de suspensiones de CD3ac preincubadas y centrifugadas todavfa conteman microtubulos intactos. Esto indica que el nocodazol puede ser entregado en las celulas por las partfculas de CD3ac funcionalizadas con EGF.
Sin desear quedar ligado a teona alguna, la union y la captacion de la perla por las celulas pueden producirse a traves de la interaccion del EGF adsorbido en la superficie de las partfculas de CD3ac con el EGFR presente en las celulas HeLa.
Ejemplo G. Nanoparticula de CD3ac que dirige con IgG
Las nanopartfculas de CD3ac que dirigen con IgG pueden prepararse en un procedimiento de una sola etapa como se describe en el presente documento. La Figura 18A muestra que los anticuerpos IgG (por ejemplo, pero no limitados a, IgG anti-transferrina o IgG anti-conejo) pueden ser captados por la nanoparticula de CD3ac. Ademas, como se muestra en la Figura 18B, la incubacion de las nanopartfculas de CD3ac funcionalizadas con IgG anti- transferrina con transferrina A-546 genero senales de fluorescencia (indicada mediante puntos blancos), lo que indica que la IgG esta presente en la superficie de las nanopartfculas de CD3ac y permite la union de la IgG con transferrina A-546. De forma similar, la incubacion de las nanopartfculas de CD3ac funcionalizadas con IgG anti- transferrina con un anticuerpo secundario (por ejemplo, puede utilizarse IgG anti-conejo si la IgG anti-transferrina se genera en conejos) tambien dio como resultado la union de la IgG presente en la superficie de la nanoparticula de CD3ac con los anticuerpos secundarios (indicada por mediante puntos blancos en la Figura 18C). La orientacion de la IgG en la superficie de contacto de las nanopartfculas es probablemente isotropica ("aleatoria"), por ejemplo, el sitio de union al antfgeno y/o el eprtopo para los anticuerpos secundarios estan expuestos y son accesibles.
Ejemplo 7. Entrega de moleculas de acido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) por partfculas de peptidos (por ejemplo, partfculas de peptido CD3 o partfculas de peptidos mixtas que comprenden peptidos CD3ac y CD3)
La transfeccion de ADN/ARNip puede establecerse mediante una partfcula de peptidos que es i) esta cargada y ii) es estable. Aunque las partfculas de CD3ac (secuencia peptfdica mostrada en la Tabla 3) son insolubles en agua, por lo general no estan cargadas y por tanto es poco probable que se unan a moleculas de acido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo, pero no limitado a, ARNip). El peptido CD3 (secuencia peptfdica mostrada en la Tabla 3) contiene 4 aminas primarias (lisinas 3 + 1 extremo N) que pueden estarya sea cargadas o acetiladas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Para evaluar la eficacia de la transfeccion celular usando peptidos CD3, se incubaron celulas HeLa con una mezcla de peptidos CD3 (con una secuencia pepffdica mostrada en la Tabla 3) y moleculas de acido nucleico anionicas (por ejemplo, ADN monocatenario), ambos disueltos en el medio de cultivo celular en una relacion molar de aproximadamente 3,7:1 (CD3:ADNmc). Con el fin de visualizar facilmente la presencia de ADNmc dentro de una celula, una porcion del ADNmc anadido al medio de cultivo celular se marco con un marcador detectable (por ejemplo, Alexa Fluor 488; AF488). Como se muestra en las Figuras 19A-19B, la presencia de peptidos CD3 en el medio de cultivo celular conduce a un aumento de la fluorescencia en el citosol (Figura 19A), en comparacion con el control (Figura 19B). Por tanto, una mezcla de peptidos anfifflicos cargados positivamente que se describen en el presente documento (por ejemplo, peptidos CD3) y moleculas de acido nucleico anionicas (por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo, pero no limitado a, ARNip) puede aumentar la eficiencia de la transfeccion celular con moleculas de acido nucleico, en comparacion con la transfeccion celular en ausencia de peptidos anfifflicos cargados positivamente que se describen en el presente documento (por ejemplo, peptidos CD3). Sin desear quedar ligado a teoffa alguna, debido a la estructura anfifflica y a los grupos de cabeza cationica de los peptidos que se describen en el presente documento (por ejemplo, peptidos CD3), algunas realizaciones de los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento (por ejemplo, peptidos CD3) pueden utilizarse como peptidos de penetracion celular o agentes de transfeccion celular.
A continuacion se busco determinar si los peptidos anfifflicos no acetilados (por ejemplo, peptidos CD3) pueden autoensamblarse en presencia de moleculas de acido nucleico para formar arffculos de peptidos que contengan acido nucleico. Con este fin, una mezcla de peptidos CD3, ADNmc y transferrina se sometio a electroforesis en agarosa (ya que cualesquiera parffculas de peptidos formadas seffan demasiado grandes para migrar a traves del gel de agarosa). Algo del ADNmc de la mezcla se marco para la visualizacion de su movimiento en el gel de agarosa, mientras que se anadio transferrina marcada (por ejemplo, AF568-Tfn) a la mezcla de peptido-acido nucleico para controlar la presencia de parffculas de peptidos. (Como se ha descrito anteriormente en los Ejemplos 3-6, generalmente se forma un ligando (por ejemplo, transferrina) anadido a una mezcla de peptidos en la superficie exterior de las parffculas de peptidos.) Como se muestra en la Figura 20A, la co-localizacion de la senal de Tfn- AF568 y la senal de ADNmc-AF488 en la zona de carga de la agarosa despues de la electroforesis durante aproximadamente 40 minutos indica que se formaron parffculas de peptidos a partir de la mezcla que comprende peptidos CD3 y moleculas de acido nucleico (por ejemplo, AF488-ADNmc) y, por tanto, no fueron capaces de migrar en el gel de agarosa a lo largo del tiempo, mientras que otras moleculas de protema en exceso (por ejemplo, ADNmc y Tfn) migraron hacia el anodo.
La eficiencia de la coprecipitacion de peptidos anfifflicos no acetilados (por ejemplo, peptidos CD3) y moleculas de acido nucleico (por ejemplo, ADNmc) tambien se evaluo y se cuantifico, por ejemplo, mediante un metodo de cromatograffa HP-WAX (intercambio anionico debil). Por ejemplo, se coprecipitaron peptidos CD3 y ADNmc para formar parffculas de peptidos que conteman ADNmc antes de la centrifugacion y la separacion del sobrenadante y el sedimento, ambos de los cuales se sometieron despues a una maquina de cromatograffa HP-WAX. Como se muestra en la Figura 20B, la mayoffa de los peptidos CD3 y ADNmc se detectaron en el sedimento de las parffculas de peptidos, en comparacion con las cantidades en el sobrenadante, lo que indica que la formacion de parffculas de peptidos que contienen ADNmc mediante el metodo de coprecipitacion es altamente eficiente.
Hay que senalar que una mezcla de peptidos CD3 y moleculas de acido nucleico puede autoensamblarse para formar parffculas estables en agua pura; sin embargo, generalmente no son estables y se disuelven, en respuesta al aumento de las fuerzas salinas y las temperaturas mas altas.
Sin limitaciones, existen dos metodos de ejemplo para disminuir la solubilidad de nanoparffculas de peptidos que contienen acido nucleico (por ejemplo, ADN o aRn, incluyendo ARNip). Por ejemplo, el primer enfoque puede implicar una mezcla de peptidos completamente acetilados (por ejemplo, CD3ac con una secuencia pepffdica como se muestra en la Tabla 3) y peptidos parcialmente y/o no acetilados (por ejemplo, CD3 con una secuencia pepffdica como se muestra en la Tabla 3) durante el ensamblaje de parffculas. A pesar de que CD3 es hidrosoluble, puede coprecipitar con CD3ac. Por tanto, la carga neta de una nanoparffcula de peptidos puede modularse facilmente, por ejemplo, mediante el control de la relacion de concentracion o molar de peptidos parcialmente y/o no acetilados (por ejemplo, CD3) y peptidos totalmente acetilados (por ejemplo, CD3ac). A modo de ejemplo solamente, mas CD3ac puede aumentar la estabilidad de las parffculas mientras que mas CD3 puede proporcionar mayores capacidades de carga para ARNip/ADN, asf como un mayor potencial para penetrar las membranas celulares debido a sus cargas netas. Un experto en la materia puede determinar la relacion optima de CD3 a CD3ac en nanoparffculas de peptidos mixtas para aplicaciones particulares, por ejemplo, entrega de ARNsi o ADN. En algunas realizaciones, los peptidos parcialmente y/o no acetilados (por ejemplo, CD3) pueden estar presentes entre el 5 % molar y el 50 % molar en nanoparffculas de peptidos mixtos. En algunas realizaciones, los peptidos totalmente acetilados (por ejemplo, CD3ac) pueden estar presentes entre el 50 % molar y el 95 % molar en nanoparffculas de peptidos mixtas. En diversas realizaciones, las relaciones de concentracion o molares de los peptidos parcialmente y/o no acetilados (por ejemplo, CD3) a peptidos completamente acetilados (por ejemplo, CD3ac) pueden variar de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 50:1; o de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 10:1 o de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:1.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En consecuencia, en algunas realizaciones, puede prepararse una mezcla de peptidos anfifflicos totalmente acetilados (por ejemplo, peptidos CD3ac), peptidos anfifflicos parcialmente acetilados o no acetilados (por ejemplo, peptidos CD3) y moleculas de acidos nucleicos para formar parffculas de peptidos estables que contengan moleculas de acido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo ARNip). Por ejemplo, para demostrar la formacion de parffculas de peptidos que conteman acido nucleico estables en condiciones fisiologicas, se anadieron peptidos CD3ac a una mezcla de peptidos CD3 y de ADN monocatenario (ADNmc) en una relacion molar de aproximadamente 11:1,8:1 (CD3ac:CD3:ADNmc). Se determino que la presencia de peptidos CD3ac estabiliza las parffculas de peptidos que contienen ADNmc en condiciones fisiologicas. Los tres componentes coprecipitaron para formar parffculas de peptidos que conteman ADNmc que eran estables a la fuerza salina correspondiente.
En algunas realizaciones, tambien puede anadirse un ligando (por ejemplo, transferrina) a la mezcla que comprende peptidos anfifflicos totalmente acetilados (por ejemplo, peptidos CD3ac), peptidos anfifflicos parcialmente acetilados o no acetilados (por ejemplo, peptidos cD3) y moleculas de acido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo ARNip) para formar parffculas de peptidos que contienen acido nucleico estables frente a la protema a la que se une el ligando (veanse, por ejemplo, los Ejemplos 3-6 para algunas realizaciones de las parffculas de peptidos que se describen en el presente documento para su uso en la entrega dirigida de un principio activo). Por ejemplo, se anadio transferrina (Tfn marcada con AF568 para la facilidad de visualizacion mediante formacion de imagenes) a la mezcla para formar parffculas de peptidos estables que conteman acido nucleico frente a receptores de transferrina presentes en la superficie celular. Como se ha analizado en el ejemplo 3, el ligando (por ejemplo, Tfn) esta generalmente presente en la superficie exterior de las parffculas de peptidos.
Para determinar la eficiencia de la entrega de parffculas de peptidos que contienen acido nucleico en celulas, se incubaron celulas HeLa con parffculas de peptidos que conteman acido nucleico (por ejemplo, formadas a partir de una mezcla de peptidos CD3ac, peptidos CD3 y ADNmc como se ha descrito anteriormente). Como se ha analizado anteriormente, algunos ADNmc en la mezcla se marcaron con un marcador detectable (por ejemplo, AF488) para la facilidad de visualizacion mediante formacion de imagenes. Ademas, se anadio Tfn-AF568 para formar parffculas de peptidos que conteman acido nucleico como un medio para visualizar las parffculas de peptidos formadas. Como se muestra en la Figura 21, la senal de fluorescencia de Tfn-AF568 de las parffculas de peptidos formadas se colocalizo con la senal de fluorescencia de AF488-ADNmc en el citosol, lo que indica que las parffculas de peptidos que contienen ADNmc son estables en condiciones fisiologicas y se entregan en las celulas (por ejemplo, celulas HeLa) .
A continuacion se busco determinar el efecto de las cargas netas de arffculos de peptidos que contienen acidos nucleicos sobre su estabilidad en una condicion fisiologica, por ejemplo, en suero. Como se muestra en la Tabla 5 a continuacion, se forman parffculas de peptidos estables generalmente cuando la relacion de cargas cationicas a cargas anionicas de las parffculas de peptidos que contienen acido nucleico es cercana a cero (por ejemplo, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 0 o entre aproximadamente 3 y aproximadamente 0). La relacion de carga puede ajustarse mediante relaciones molares de moleculas de acido nucleico anionicas (por ejemplo, ADNmc) y peptidos anfifflicos cationicos que se describen en el presente documento (por ejemplo, peptidos anfifflicos parcialmente acetilados o no acetilados, tales como CD3) en una mezcla de ensamblaje de peptidos. Sin desear quedar ligado a teoffa alguna, una carga neta negativa de las parffculas de peptidos (por ejemplo, una relacion de cargas cationicas a cargas anionicas menor de 1) puede ayudar a prevenir la agregacion de parffculas.
Sin desear quedar ligado a teoffa alguna, mientras que las cargas netas de los arffculos de peptidos que contienen acido nucleico pueden influir en la estabilidad de las parffculas en condiciones fisiologicas, la cantidad de peptidos anfifflicos totalmente acetilados (por ejemplo, peptidos CD3ac) respecto a los peptidos anfifflicos no acetilados (por ejemplo, peptidos CD3) tambien puede contribuir a la estabilidad de las parffculas. Por ejemplo, como se ha analizado anteriormente, una mezcla de peptidos anfifflicos no acetilados (por ejemplo, peptidos CD3) y moleculas de acido nucleico puede autoensamblarse para formar parffculas; sin embargo, generalmente no son estables y se disuelven, en respuesta al aumento de las fuerzas salinas y las temperaturas mas altas. Por el contrario, las parffculas de peptidos formadas a partir de peptidos anfifflicos totalmente acetilados (por ejemplo, peptidos CD3ac) son mas estables. En consecuencia, el aumento de la relacion molar de los peptidos anfifflicos totalmente acetilados (por ejemplo, CD3ac) a los peptidos anfifflicos no acetilados (por ejemplo, cD3) puede aumentar la estabilidad de las parffculas de peptidos resultantes en una condicion fisiologica, por ejemplo, en suero, los que esta de acuerdo con los datos mostrados en la Tabla 5.
Tabla 5. Efectos de las relaciones de carga (o relaciones molares) en una mezcla de peptidos sobre la _________________estabilidad de las particulas de peptido resultantes en suero_________________
Composicion de la mezcla de ensamblaje de peptidos
Relacion molar (ADNmc:CD3ac:CD3) Relacion de cargas (cati6n:ani6n) Estabilidad en suero
CD3 1,23e-04 M CD3ac 1,23e-04 M ADNmc 6,20e-07 M
1:200:200 33,065 Menos estable
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CD3 1,23e-05 M CD3ac 1,23e-04 M ADNmc 6,20e-07 M
1:200:20 3,306 Estable
CD3 1,23e-06 M CD3ac 1,23e-04 M ADNmc 6,20e-07 M
1:200:2 0,331 Estable
El segundo enfoque para disminuir la solubilidad de las nanoparffculas de peptidos que contienen ADN/ARNip puede implicar la smtesis a medida de un unico peptido con un grado de acetilacion, por ejemplo, que vaffa de la acetilacion de al menos un grupo amino en el segmento de peptidilo hidrofilo del peptido anfifflico se describe en el presente documento a la acetilacion completa de todos los grupos amino en el segmento de peptidilo hidrofilo del peptido anfifflico que se describe en el presente documento. A modo de ejemplo solamente, un peptido anfifflico puede sintetizarse a medida con un grado de acetilacion entre CD3 y CD3ac. Por ejemplo, un peptido anfifflico puede sintetizarse a medida con al menos un grupo cargado o no acetilado, por ejemplo, en el extremo N, que incluye al menos dos grupos cargados o no acetilados o al menos tres grupos cargados o no acetilados. En una realizacion, el peptido anfifflico puede disenarse para que sea cationico (por ejemplo, para la entrega de ARNip o ADN) mediante la modulacion de las cargas hacia o en su extremo N (por ejemplo, con acetilacion) para proporcionar el caracter anfifflico de la molecula. Por ejemplo, al menos un grupo amino (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o mas grupos amino, dependiendo del numero de grupos amino presentes en el segmento de peptidilo hidrofilo) del segmento de peptidilo hidrofilo del peptido anfifflico descrito puede permanecer no acetilado y al menos un grupo amino (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o mas grupos amino, dependiendo del numero de grupos amino presentes en el segmento de peptidilo hidrofilo) del segmento de peptidilo hidrofilo del anfifflico peptido descrito puede ser acetilado. En ciertas realizaciones, dicho peptido anfifflico puede comprender una secuencia de aminoacidos de H-LK(Ac)- LK(Ac)-LK(Ac)-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2. En algunas realizaciones, el peptido anfifflico puede comprender una secuencia de aminoacidos de H-LK-LK(Ac)-LK(Ac)-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2. En realizaciones alternativas, el peptido anfifflico puede comprender una secuencia de aminoacidos de H-LK-LK-LK(Ac)-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW- NH2. La relacion de grupos amino acetilados a grupos amino no acetilados en un peptido anfifflico puede controlar las propiedades cationicas y anionicas de los peptidos anfifflicos que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, la relacion de grupos amino acetilados a grupos amino no acetilados en un peptido anfifflico puede ser inferior a 1, aproximadamente 1 o superior a 1.
Ejemplo 8. Estabilidad de partculas de peptidos que contienen acido nucleico (por ejemplo, particulas de peptido CD3 o particulas de peptidos mixtas que comprenden peptidos CD3ac y CD3)
La estabilidad de las particulas de peptido CD3 que contienen acido nucleico se caracterizo en agua pura. A continuacion se muestra una formulacion de parffculas de peptido CD3 de ejemplo que comprende adicionalmente moleculas de acido nucleico (por ejemplo, ADNmc) y un ligando (por ejemplo, transferrina, Tfn):
Formulacion de parffcula de peptidos 1 (CD3 + ADNmc + Tfn)
CD3 (H-LK-LK-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2)4+ 21 pM
(5'-TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3’)24- 5,4 pM
(AF488-5’-TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3’)24‘ 0,24 pM
Tfn-AF568 4,14 ug/ml
Para evaluar la estabilidad de las parffculas de peptidos formadas a partir de la formulacion 1 (PNP1) en agua, una muestra de las parffculas de peptidos PNP1 se agito en un tubo eppendorf que contema agua durante aproximadamente 15 minutos ya sea a aproximadamente temperatura ambiente o a aproximadamente 37 °C. Despues, la muestra de PNP1 se centrifugo para precipitar las parffculas de peptidos y el sobrenadante se recogio para su posterior analisis. La concentracion de Tfn-AF568 en el sobrenadante se midio y se cuantifico por su intensidad de fluorescencia. Como se muestra en la Figura 22A, se detecto una mayor concentracion de Tfn-AF568 en el sobrenadante de la muestra de PNP1 agitada a una temperatura de aproximadamente 37 °C que a aproximadamente a temperatura ambiente, lo que indica que la estabilidad de las parffculas PNP1 en agua es dependiente de la temperatura y mas parffculas PNP1 tienden a disociarse a una temperatura superior, liberando de este modo una mayor cantidad de Tfn-AF568 al sobrenadante.
Tambien se realizo un estudio de la estabilidad de PNP1 en agua en el transcurso del tiempo. Se agitaron muestras de las parffculas PNP1 en tubos eppendorf que conteman agua a una temperatura de ya sea aproximadamente 4 °C o aproximadamente 37 °C. En cada punto temporal predeterminado (como se indica en la Figura 22B), se centrifugo una muestra de PNP1 para sedimentar las parffculas de peptidos y el sobrenadante se recogio para su posterior analisis. La concentracion de Tfn-AF568 en el sobrenadante se midio y se cuantifico mediante intensidad de fluorescencia. De forma similar a la Figura 22A, la Figura 22B muestra que la estabilidad de las parffculas PNP1 en agua es dependiente de la temperatura y las parffculas PNP1 tienden a disociarse mas rapido a una temperatura superior, por ejemplo, a una temperatura superior a 4 °C.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
A continuacion se busco comparar la estabilidad de partfculas PNP1 y partfculas de peptidos formadas a partir de la formulacion 2 (PNP2), como se muestra a continuacion, en medios de cultivo celular, por ejemplo, que conteman aproximadamente suero al 10 %.
Formulacion de particula de peptidos 2 (CD3ac + CD3 + ADNmc + Tfn)
CD3ac (Ac-LK(Ac)-LK(Ac)-LK(Ac)-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2) 123 pM CD3 (H-LK-LK-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2)4+ 21 pM (5’-TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3’)24' 5,4 pM (AF488-5’-TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3’)24‘ 0,24 pM Tfn-AF568 4,14 ug/ml
Se incubaron celulas HeLa con partfculas ya sea PNP1 o PNP2 durante aproximadamente 30 minutos a temperaturas de aproximadamente 4 °C y 37 °C. Como las celulas HeLa, en general, realizan la endocitosis mediada por clatrina a aproximadamente 37 °C, pero no a aproximadamente 4 °C, cualquier Tfn-AF 568 disuelto en los medios sera internalizado por las celulas. Por tanto, despues de la incubacion, las celulas se fijaron con paraformaldetndo para la formacion de imagenes y la deteccion de la intensidad de fluorescencia. Como se muestra en los paneles superiores de la Figura 22C, se detecto una senal de fluorescencia de Tfn-AF568 difusa y mas fuerte en el citosol cuando las celulas se incubaron con las partfculas PNP1 a aproximadamente 37 °C, en comparacion con la fluorescencia de Tfn-AF568 mas punteada detectada en las celulas incubadas a aproximadamente 4 °C. Sin embargo, este contraste no se observo en las celulas incubadas con las partfculas PNP2, como se muestra en los paneles inferiores de la Figura 22C. En su lugar, se observaron senales de fluorescencia Tfn-AF568 punteadas y comparables tanto en las celulas incubadas a aproximadamente 4 °C como a aproximadamente 37 °C, en presencia de las partfculas PNP2. Estos resultados indican que las partfculas PNP1 tienden a disociarse a aproximadamente 37 °C, liberando de este modo Tfn-AF568 al medio de cultivo, que despues es internalizado por las celulas; mientras que las partfculas PNP2 parecen ser mas estables en suero (por ejemplo, aproximadamente suero al 10%) a aproximadamente 37 °C durante al menos aproximadamente 30 minutos, conservando de este modo la mayor parte del Tfn-AF568 en las partfculas PNP2 y/o en la superficie de las partfculas PNP2.
La comparacion de las celulas de la Figura 22C con el control negativo (es decir, las celulas incubadas en presencia de ADNmc sin peptidos CD3 o CD3ac) se muestra en la Figura 22D, la intensidad de fluorescencia de AF488- ADNmc en el control negativo es significativamente menor que en las celulas incubadas con partfculas PNP1 o PNP2 que conteman ADNmc. Esto indica que las partfculas PNP1 o PNP2 pueden utilizarse para facilitar la transfeccion celular y entregar una molecula de acido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) a una celula. Se observa que tambien se detecto fluorescencia de AF488-ADNmc en las celulas incubadas en presencia de partfculas PNP1 o PNP2 a aproximadamente 4 °C. Sin desear quedar ligado a teona alguna, aunque es poco probable que la transfeccion celular en presencia de partfculas PNP1 o PNP2 a aproximadamente 4 °C sea dependiente de TfR (receptor de transferrina), probablemente es provocada por el transporte pasivo a traves de la membrana celular en presencia de peptidos CD3 como se ha analizado en el Ejemplo 7.
Referencias (para los Ejemplos 1-2)
[1] H. Goesmann, C. Feldmann, Angew. Chem., Int. Ed., 2010, 49, 1362.
[2] [2a] Y. Kakizawa, R. Nishio, T. Hirano, Y. Koshi, M. Nukiwa, M. Koiwa, J. Michizoe, N. Ida, J. Control Release 142, 8; [2b] K. Kita-Tokarczyk, J. Grumelard, T. Haefele, W. Meier, Polymer 2005, 46, 3540; [2c] L. Zhang, J. M. Chan, F. X. Gu, J.-W. Rhee, A. Z. Wang, A. F. Radovic-Moreno, F. Alexis, R. Langer, O. C. Farokhzad, ACS Nan
2008, 2, 1696; [2d] A. Blanazs, S. P. Armes, A. J. Ryan, Macromol. Rapid Commun. 2009, 30, 267; [2e] T. Smart, H. Lomas, M. Massignani, M. V. Flores-Merino, L. R. Perez, G. Battaglia, Nano Today 2008, 3, 38.
[3] J. N. Israelachvili, Intermolecular and Surface Forces: With Applications to Colloidal and Biological Systems, American Chemical Society, 1985, pag. 296.
[4] [4a] S. Rai, R. Paliwal, P. N. Gupta, K. Khatri, A. K. Goyal, B. Vaidya, S. P. Vyas, Curr. Nanosci. 2008, 4, 30; [4b] Y. Liu, K. Li, J. Pan, B. Liu, S.-S. Feng, Biomaterials 2009, 31, 330.
[5] D. Nishit, M. Samir, Adv. Funct. Mater. 2009, 9999, NA-NA.
[6] C. Lo Presti, H. Lomas, M. Massignani, T. Smart, G. Battaglia, J. Mater. Chem. 2009,19, 3576.
[7] U. K. Slotta, S. Rammensee, S. Gorb, T. Scheibel, Angew. Chem., Int. Ed. 2008, 47, 4592.
[8] S. Raman, G. Machaidze, A. Lustig, U. Aebi, P. Burkhard, Nanomedicine 2006, 2, 95.
[9] [9a] M. Nigen, C. Gaillard, T. Croguennec, M.-N. Madec, S. Bouhallab, Biophys. Chem. 2009, 146, 30; [9b] M. Nigen, T. Croguennec, D. Renard, S. Bouhallab, Biochemistry 2007, 46, 1248.
[10] T. E. Rajapaksa, M. Stover-Hamer, X. Fernandez, H. A. Eckelhoefer, D. D. Lo, T. E. Rajapaksa, J. Control Release 2009.
[11] [11a] Q. Sun, S. Cai, B. R. Peterson, Q. Sun, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 10064. [11b] S. Yang, D. J. Coles, A. Esposito, D. J. Mitchell, I. Toth, R. F. Minchin, S. Yang, J. Controlled Release 2009, 135, 159.
[12] M. G. Ryadnov, A. Bella, S. Timson, D. N. Woolfson, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 13240.
[13] [13a] L. Aulisa, H. Dong, J. D. Hartgerink, Biomacromolecules 2009, 10, 2694; [13b] K. J. Channon, G. L. Devlin, C. E. MacPhee, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 12520; [13c] J. Ryu, C. B. Park, Angew. Chem., Int. Ed.
2009, 48, 4820, S4820/4821-S4820/ 4826; [13d] H. Dong, S. E. Paramonov, J. D. Hartgerink, J. Am.Chem. Soc.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
2008, 130, 13691; [13e] Y. Zimenkov, S. N. Dublin, R. Ni, R. S. Tu, V. Breedveld, R. P. Apkarian, V. P. Conticello, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 6770.
[14] Vydac,
http://www:nestgrp.com/pdf/Vapp/AN9802.pdf 2010.
[15] [15a] H. M. Redhead, S. S. Davis, L. Illum, J. Controlled Release 2001, 70,353; [15b] W. Lin, M. C. Garnett, S. S. Davis, E. Schacht, P. Ferruti, L. Illum, J. Controlled Release 2001,71,117.
[16] W. R. Veatch, E. T. Fossel, E. R. Blout, Biochemistry 1974, 13, 5249.
[17] [17a] D. A. Kelkar, A. Chattopadhyay, Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 2007, 1768, 2011; [17b] R. D. Hotchkiss, R. Dubos, J. Biol. Chem. 1940, 132, 791; [17c] R. D. Hotchkiss, R. Dubos, J. Biol. Chem. 1940, 132, 793. [18] [18a] D. W. Urry, D. F. Mayers, J. Haider, Biochemistry 1972, 11, 487; [18b] Y. Chen, A. Tucker, B. A. Wallace, J. Mol. Biol. 1996, 264, 757; [18c] D. A. Doyle, B. A. Wallace, J. Mol. Biol. 1997, 266, 963.
[19] [19a] F. Heitz, A. Heitz, Y. Trudelle, Biophys. Chem. 1986, 24, 149; [19b] S. V. Sychev, N. A. Nevskaya, S. Iordanov, E. N. Shepel, A. I. Miroshnikov, V. T. Ivanov, Bioorg. Chem. 1980, 9, 121.
[20] L. Eidenschink, B. L. Kier, K. N. L. Huggins, N. H. Andersen, Proteins: Struct., Funct., Bioinf. 2009, 75, 308. Referencias (para los Ejemplos 3-4)
(1) Multifunctional nanocarriers. Adv Drug Deliv 58, 1532-1555 (2006).
(2) Stark. Nanoparticles in Biological Systems. Angew Chem Int Ed, n-a, doi: 10.1002/anie.200906684 (2011).
(3) Soussan, E., Cassel, S., Blanzat, M. y Rico-Lattes, I. Drug delivery by soft matter: matrix and vesicular carriers. ACIE 48, 274-288, doi:10.1002/anie.200802453 (2009).
(4) Nel, A. E. et al. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. Nat Mater 8, 543557, doi: 10.1038/nmat2442 (2009).
(5) Dittrich, C. y Meier, W. Solid Peptide Nanoparticles: Structural Characterization and Quantification of Cargo Encapsulation. Macromolecular Bioscience 10, 1406-1415, doi: 10.1002/mabi.201000221 (2010).
(6) Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. J Am 85, 2149-2154, doi: 10.1021/ja00897a025 (1963).
(7) Nilsson, B. L., Soellner, M. B. y Raines, R. T. Chemical synthesis of proteins. Annu Rev Bioph Biom 34, 91118, doi: 10.1146/annurev.biophys.34.040204.144700 (2005).
(8) Sitnikova, N. L., Sprik, R., Wegdam, G. y Eiser, E. Spontaneously formed trans-anethol/water/alcohol emulsions: mechanism of formation and stability. LAGMUIR 21, 7083-7089, doi: 10.1021/la0468161 (2005).
(9) Ashley, C. E. et al. The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particlesupported lipid bilayers. Nature, doi: 10.1038/nmat2992 (2011).
(10) Monopoli, M. P. et al. Physical-Chemical Aspects of Protein Corona: Relevance to in Vitro and in Vivo Biological Impacts of Nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 133, 2525-2534, doi: 10.1021/ja107583h (2011).
(11) Ehrlich, M. et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. CEL 118, 591-605, doi: 10.1016/j.cell.2004.08.017 (2004).
(12) MacGillivray, R. T. A. et al. Two High-Resolution Crystal Structures of the Recombinant N-Lobe of Human Transferrin Reveal a Structural Change Implicated in Iron Release. Biochemistry 37, 7919-7928, doi: 10.1021/bi980355j (1998).
(13) Min, Y., Akbulut, M., Kristiansen, K., Golan, Y. y Israelachvili, J. The role of interparticle and external forces in nanoparticle assembly. Nat. Mater. 7, 527-538, doi: 10.1038/nmat2206 (2008).
(14) Fleck, C. C. y Netz, R. R. Electrostatic colloid-membrane binding. Europhys. Lett. 67, 314-320, doi: 10.1209/epl/i2004-10068-x (2004).
(15) Dagastine, R. R. et al. Dynamic Forces Between Two Deformable Oil Droplets in Water. Science (Washington, DC, United States) 313, 210-213, doi: 10.1126/science.1125527 (2006).
(16) McGraw, T. E., Greenfield, L. y Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. JCB 105, 207-214, doi: 10.2307/1612534 (1987).
(17) Parhi, P., Golas, A., Bamthip, N., Noh, H. y Vogler, E. A. Volumetric interpretation of protein adsorption: Capacity scaling with adsorbate molecular weight and adsorbent surface energy. Biomaterials 30, 6814-6824, doi: 10.1016/j.biomaterials.2009.09.005 (2009).
(18) Harding, C., Heuser, J. y Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. JCB 97, 329-339, doi: 10.2307/1610388 (1983).
(19) Lillo, M. P., Canadas, O., Dale, R. E. y Acuna, A. U. Location and properties of the taxol binding center in microtubules: a picosecond laser study with fluorescent taxoids. Biochemist 41, 12436-12449 (2002).
(20) Jordan, M. A. y Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Can 4, 253-265, doi: 10.1038/nrc1317 (2004).
(21) Stewart, K. M., Horton, K. L. y Kelley, S. O. Cell-penetrating peptides as delivery vehicles for biology and medicine. Org Biomol Chem 6, 2242-2255, doi: 10.1039/b719950c (2008).
(22) Hyuk, I. S., Jeong, U. y Xia, Y. Polymer hollow particles with controllable holes in their surfaces. Nat. Mater. 4, 671-675, doi: 10.1038/nmat1448 (2005).
Estas publicaciones se proporcionan unicamente para su divulgacion antes de la fecha de presentacion de la presente solicitud. Nada a este respecto debe interpretarse como una admision de que los inventores no tienen derecho a anteceder dicha divulgacion en virtud de la invencion anterior o por cualquier otra razon. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o representacion en cuanto al contenido de estos documentos se basan en la
informacion disponible para los solicitantes y no constituyen admision alguna en cuanto a la exactitud de las fechas o contenidos de estos documentos.

Claims (18)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Una parffcula de peptidos que comprende un peptido anfifflico, comprendiendo el peptido anfifflico un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo,
    en la que el segmento de peptidilo hidrofobo consiste esencialmente en una secuencia de aminoacidos de (Trp- Leu)m-(Trp)n o (Leu-Trp)p-(Leu)q, en las que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L-Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 5 y n y q son independientemente 0 o 1, a condicion de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu, y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa; y en la que el segmento de peptidilo hidrofilo consiste esencialmente en una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, en la que r es un numero entero de 1 a 15, y
    en la que la parffcula de peptidos comprende adicionalmente en su superficie exterior un ligando para la union a una celula diana.
  2. 2. La parffcula de peptidos de la reivindicacion 1, en la que al menos un resto de Lys del segmento de peptidilo hidrofilo o el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico estan acetilados.
  3. 3. La parffcula de peptidos de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que el peptido anfifflico comprende la secuencia de aminoacidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X, en donde X esta ausente o es NH2; opcionalmente
    en la que al menos uno de los restos de L-Lys esta acetilado y/o el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico esta acetilado.
  4. 4. La parffcula de peptidos de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el ligando incluye un ligando de receptor de superficie celular o un anticuerpo.
  5. 5. La parffcula de peptidos de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la parffcula de peptidos comprende una mezcla de un peptido anfifflico totalmente acetilado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un peptido anfifflico parcialmente acetilado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y opcionalmente un peptido anfifflico no acetilado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
  6. 6. La parffcula de peptidos de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende adicionalmente un principio activo.
  7. 7. La parffcula de peptidos de la reivindicacion 6 para su uso en un metodo de tratamiento de un sujeto mediante terapia, en donde el metodo comprende la administracion de la parffcula de peptidos al sujeto.
  8. 8. La parffcula de peptidos de la reivindicacion 6 para su uso en un metodo de tratamiento de un tejido enfermo en un sujeto, en donde el metodo comprende la administracion de la parffcula de peptidos al sujeto y en donde la parffcula de peptidos comprende un principio activo que comprende un material radiactivo.
  9. 9. La parffcula de peptidos para el uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde el tejido enfermo es un tumor o una malformacion arteriovenosa.
  10. 10. Uso in vitro de la parffcula de peptidos de la reivindicacion 6 para el suministro dirigido de un principio activo.
  11. 11. Uso in vitro de una composicion que comprende un peptido anfifflico cargado positivamente como agente de penetracion celular o agente de transfeccion, en el que el peptido anfifflico cargado positivamente comprende un segmento de peptidilo hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo,
    en el que el segmento de peptidilo hidrofobo comprende un secuencia de aminoacidos de (Trp-Leu)m-(Trp)n o (Leu- Trp)p-(Leu)q, en las que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L-Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 5 y n y q son independientemente 0 o 1, a condicion de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa;
    en el que el segmento de peptidilo hidrofilo comprende una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, en la que r es un numero entero de 1 a 15; y
    en el que al menos uno de los restos de Lys o el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico no estan acetilados; opcionalmente
    en el que todos los restos de Lys y el grupo amino del extremo N del peptido anfifflico no estan acetilados.
  12. 12. El uso in vitro de la reivindicacion 11, en el que el peptido anfifflico comprende la secuencia de aminoacidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X, en la que X esta ausente o es NH2.
  13. 13. El uso in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en el que la composicion comprende adicionalmente una molecula de acido nucleico que hay que suministrar a una celula.
  14. 14. Una parffcula de peptidos que comprende un primer peptido anfifflico y un segundo peptido anfifflico, comprendiendo el primer y el segundo peptidos anfifflicos cada uno, independientemente, un segmento de peptidilo
    5
    10
    15
    20
    25
    hidrofobo y un segmento de peptidilo hidrofilo,
    en la que el segmento de peptidilo hidrofobo consiste esencialmente en una secuencia de aminoacidos de (Trp- Leu)m-(Trp)n o (Leu-Trp)p-(Leu)q, en las que cada Trp es D-Trp o L-Trp y cada Leu es D-Leu o L-Leu, m y p son independientemente un numero entero de 1 a 5 y n y q son independientemente 0 o 1, a condicion de que cuando Trp es D-Trp entonces Leu es L-Leu y cuando Trp es L-Trp entonces Leu es D-Leu o viceversa; y en la que el segmento de peptidilo hidrofilo consiste esencialmente en una secuencia de aminoacidos de (Lys)r, en la que r es un numero entero de 1 a 15, y
    en la que el grupo amino del extremo N y todos los restos de Lys del primer peptido anfifflico estan acetilados; y en la que al menos el grupo amino del extremo N o uno de los restos de Lys del segundo peptido anfifflico no estan acetilados; opcionalmente en la que ninguno de entre el grupo amino del extremo N y los restos de Lys del segundo peptido anfifflico esta acetilado.
  15. 15. La parffcula de peptidos de la reivindicacion 14, que comprende adicionalmente un principio activo; opcionalmente
    en la que el principio activo incluye una molecula de acido nucleico.
  16. 16. La parffcula de peptidos de cualquiera de las reivindicaciones 14-15, que comprende adicionalmente en su superficie exterior un ligando.
  17. 17. La parffcula de peptidos de cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en la que el primer y el segundo peptidos anfifflicos comprenden cada uno independientemente la secuencia de aminoacidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L- Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-X, en la que X esta ausente o es NH2.
  18. 18. Uso in vitro de la parffcula de peptidos de cualquiera de las reivindicaciones 14-17 para el suministro de una molecula de acido nucleico a una celula; opcionalmente en el que la molecula de acido nucleico incluye ARNip, ARNmi, ARNhc, ADN o cualquier combinacion de los mismos.
ES12756593.5T 2011-08-23 2012-08-23 Nanopartículas de péptidos y usos de las mismas Active ES2610779T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161526526P 2011-08-23 2011-08-23
US201161526526P 2011-08-23
PCT/US2012/052027 WO2013028843A1 (en) 2011-08-23 2012-08-23 Peptide nanoparticles and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2610779T3 true ES2610779T3 (es) 2017-05-03

Family

ID=46826904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12756593.5T Active ES2610779T3 (es) 2011-08-23 2012-08-23 Nanopartículas de péptidos y usos de las mismas

Country Status (19)

Country Link
US (1) US8828928B2 (es)
EP (1) EP2748182B1 (es)
JP (1) JP2014524477A (es)
KR (1) KR20140068087A (es)
CN (1) CN104011065B (es)
AU (1) AU2012298824B2 (es)
BR (1) BR112014004014A2 (es)
CA (1) CA2845886A1 (es)
CL (1) CL2014000418A1 (es)
DK (1) DK2748182T3 (es)
ES (1) ES2610779T3 (es)
HU (1) HUE031511T2 (es)
IL (1) IL231005A0 (es)
MX (1) MX2014002062A (es)
PT (1) PT2748182T (es)
RU (1) RU2014110901A (es)
SG (1) SG11201400073SA (es)
WO (1) WO2013028843A1 (es)
ZA (1) ZA201401210B (es)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8153435B1 (en) 2005-03-30 2012-04-10 Tracer Detection Technology Corp. Methods and articles for identifying objects using encapsulated perfluorocarbon tracers
US11286489B2 (en) * 2016-02-11 2022-03-29 The Curators Of The University Of Missouri POSH inhibitor complex biomolecules and amphiphile micelles
EP3432908A4 (en) 2016-03-21 2020-07-29 Rhode Island Council on Postsecondary Education PEPTIDES SENSITIVE TO PH
CN116908452A (zh) * 2016-12-16 2023-10-20 布里格姆及妇女医院股份有限公司 用于疾病的早期检测的蛋白质冠传感器阵列的系统和方法
CN106832003B (zh) * 2017-02-15 2021-01-05 中国药科大学 一种酸敏性多肽及其应用
KR20200140291A (ko) * 2018-04-06 2020-12-15 애마 세러퓨틱스 인코포레이티드 치료제의 제어된 방출을 위한 조성물
CN114516819B (zh) * 2022-02-25 2024-02-27 顺毅宜昌化工有限公司 一种n,n’-二乙酰基肼的制备方法
WO2023244536A2 (en) * 2022-06-13 2023-12-21 Neubase Therapeutics, Inc. Oligonucleotide analogue formulations
CN116004221B (zh) * 2022-12-15 2023-12-19 湖南卓润生物科技有限公司 环肽的新应用、吖啶标记复合物与制备方法、检测试剂盒

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3270960A (en) 1964-09-11 1966-09-06 Sperry Rand Corp Fluid sensor
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3872925A (en) 1973-04-24 1975-03-25 Gearhart Owen Industries Through-tubing bridge plug
US3842067A (en) 1973-07-27 1974-10-15 American Home Prod Synthesis of(des-asn5)-srif and intermediates
JPS5726506B2 (es) 1974-03-08 1982-06-04
US4105603A (en) 1977-03-28 1978-08-08 The Salk Institute For Biological Studies Peptides which effect release of hormones
US4511390A (en) 1983-06-10 1985-04-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Aralkylcarbamoyl peptide alcohols
US5643873A (en) 1992-05-06 1997-07-01 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind selectins including endothelial leukocyte adhesion molecule 1
US5625048A (en) 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
US5654276A (en) 1995-06-07 1997-08-05 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor
FR2736642B1 (fr) 1995-07-10 1997-09-12 Pasteur Institut Immunovecteurs, notamment anticorps et fragments d'anticorps utilisables pour le transport intracellulaire et intranucleaire de principes biologiquement actifs notamment d'haptenes, de proteines et d'acides nucleiques
US6124128A (en) 1996-08-16 2000-09-26 The Regents Of The University Of California Long wavelength engineered fluorescent proteins
JP2003510672A (ja) 1999-08-02 2003-03-18 シンテム ソシエテ アノニム 分子疑似体を作製するためのコンピュータによる設計方法
CA2439400A1 (en) 2001-02-26 2002-09-06 The Regents Of The University Of California Non-oligomerizing tandem fluorescent proteins
US20060084607A1 (en) 2004-07-06 2006-04-20 Lisa Spirio Purified amphiphilic peptide compositions and uses thereof
CA2713879C (en) * 2008-02-01 2020-01-07 Alpha-O Peptides Ag Self-assembling peptide nanoparticles useful as vaccines
AU2009243187C1 (en) * 2008-04-28 2015-12-24 President And Fellows Of Harvard College Supercharged proteins for cell penetration

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013028843A1 (en) 2013-02-28
US20130064895A1 (en) 2013-03-14
JP2014524477A (ja) 2014-09-22
CA2845886A1 (en) 2013-02-28
NZ622045A (en) 2016-02-26
RU2014110901A (ru) 2015-09-27
KR20140068087A (ko) 2014-06-05
BR112014004014A2 (pt) 2020-10-27
IL231005A0 (en) 2014-03-31
CN104011065A (zh) 2014-08-27
AU2012298824B2 (en) 2017-06-01
HUE031511T2 (en) 2017-07-28
SG11201400073SA (en) 2014-03-28
ZA201401210B (en) 2015-12-23
EP2748182B1 (en) 2016-10-19
AU2012298824A1 (en) 2014-03-20
EP2748182A1 (en) 2014-07-02
CN104011065B (zh) 2017-06-30
DK2748182T3 (en) 2017-02-06
MX2014002062A (es) 2014-05-28
PT2748182T (pt) 2017-01-20
CL2014000418A1 (es) 2014-07-25
US8828928B2 (en) 2014-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2610779T3 (es) Nanopartículas de péptidos y usos de las mismas
Xu et al. Smart and hyper-fast responsive polyprodrug nanoplatform for targeted cancer therapy
JP6807831B2 (ja) 細胞膜透過性ペプチド、並びにこの作製方法及び使用方法
Das et al. Low molecular weight self-assembling peptide-based materials for cell culture, antimicrobial, anti-inflammatory, wound healing, anticancer, drug delivery, bioimaging and 3D bioprinting applications
Zhang et al. A pH-responsive α-helical cell penetrating peptide-mediated liposomal delivery system
Luo et al. Thermoresponsive elastin-b-collagen-like peptide bioconjugate nanovesicles for targeted drug delivery to collagen-containing matrices
Lee et al. Super pH-sensitive multifunctional polymeric micelle for tumor pHe specific TAT exposure and multidrug resistance
US7169814B2 (en) Guanidinium transport reagents and conjugates
US20150218252A1 (en) Self-assembling peptides, peptide nanostructures and uses thereof
KR101475447B1 (ko) 자기-조립 블록 코폴리머의 베시클 그리고 그것의 제조 및 사용 방법
Zhang et al. Stepwise dual targeting and dual responsive polymer micelles for mitochondrion therapy
US20100098748A1 (en) Arg-Gly-Asp (RGD) Sequence Containing Cyclic Peptide and Its Active Targeting Liposomes
Du et al. pH-triggered surface charge reversed nanoparticle with active targeting to enhance the antitumor activity of doxorubicin
Zhou et al. A linear polyethylenimine (LPEI) drug conjugate with reversible charge to overcome multidrug resistance in cancer cells
CA3091442A1 (en) Polyplex delivery system for proteins, nucleic acids and protein/nucleic acid complexes
TW201807025A (zh) 主動標靶型高分子衍生物、包含該高分子衍生物之組合物、及其等之用途
JP7068711B2 (ja) 細胞質送達ペプチド
JP2018024590A (ja) 標的認識型組成物及びその用途
Navarro Barreda Macro-and nanoscale self-assembled amino acid derivatives as reduction-sensitive and photoactive materials
WO2023149528A1 (ja) 新規ブロックコポリマーを含む高分子ミセル
ES2373641T3 (es) Un nuevo compuesto farmacéutico y métodos para fabricarlo y usarlo.
Hu et al. Stimulus-responsive peptide hydrogels: a safe and least invasive administration approach for tumor treatment
NZ622045B2 (en) Peptide nanoparticles and uses thereof
US20230210994A1 (en) Cell-penetrating conjugate systems
Fogueri Novel smart polymer based in situ gels