BR112014004014A2

BR112014004014A2 - partículas de peptídeos e seus usos

Info

Publication number: BR112014004014A2
Application number: BR112014004014-1A
Authority: BR
Inventors: Christian Dittrich
Original assignee: President And Fellows Of Harvard College
Priority date: 2011-08-23
Filing date: 2012-08-23
Publication date: 2020-10-27
Also published as: WO2013028843A1; US20130064895A1; JP2014524477A; CA2845886A1; NZ622045A; RU2014110901A; KR20140068087A; IL231005A0; CN104011065A; AU2012298824B2; ES2610779T3; HUE031511T2; SG11201400073SA; ZA201401210B; EP2748182B1; AU2012298824A1; EP2748182A1; CN104011065B; DK2748182T3; MX2014002062A

Abstract

partículas de peptídeos e seus usos. as invenções aqui apresentadas referem-se a peptídeos anfifílicos e partículas que compreendem os peptídeos anfifílicos. tais peptídeos anfifílicos e partículas aqui descritas podem ser utilizadas como um sistema de entrega, por exemplo, para fins terapêuticos ou de diagnóstico, ou como veículos de penetração de células ou agentes de transfecção de células.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “PARTÍCULAS DE PEPTÍDEO E USOS DAS MESMAS”.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. $ 119 (e), do Pedido Provisional U.S. Nº 61/526.526 depositado em 23 de agosto de 2011, cujo conteúdo do qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

APOIO GOVERNAMENTAL

[002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob concessão nº RO0l GM090317 concedida pelo Instituto Nacional de Saúde. O governo tem certos direitos na presente invenção.

CAMPO TÉCNICO

[003] A presente invenção refere-se a peptídeos anfifílicos e partículas que compreendem os peptídeos anfifílicos.

FUNDAMENTO

[004] AS nanopartículas são úteis na estabilização e na distribuição de medicamentos: elas melhoram a solubilidade, prolongam a vida de prateleira, reduzem os efeitos colaterais e mantêm a exposição do medicamento para um efeito terapêutico prolongado. A matriz utilizada para a distribuição de medicamento alvo é geralmente composta de lipídeos, polímeros ou metais e reunida em vesículas, micelas ou partículas. Ver Torchilin V. (2006) Adv Drug

Deliv. 58:1532; Stark W (2011) Angew Chem Int Ed. 50: 1242; Soussan E et al. (2009) ACIE. 48:274. As principais partículas "independentes variáveis que determinam a aplicabilidade in vivo incluem o tamanho, a carga superficial, e dispersibilidade, principalmente regidos pelo efeito hidrófobo. Nel A et al. (2009) Nat Matter. 8:543. Em contraste com estes materiais clássicos de veículo, é extremamente difícil conceber um sistema de distribuição coloidal exclusivamente a partir de aminoácidos, principalmente devido a problemas de solubilidade de peptídeos hidrofóbicos curtos.

[005] A dissolução dos peptídeos hidrofóbicos é tediosa e, portanto, muitas vezes requer protocolos elaborados de adição de solvente [14]. Apesar de todos os esforços, muitos peptídeos hidrofóbicos não são solúveis e consequentemente difíceis de sintetizar por química de proteção do grupo Fmoc ou Boc: precipitação de peptídeo na fase sólida durante a síntese leva a pequenos rendimentos e quantidades dominantes de subprodutos.

[006] No entanto, uma matriz de partícula composta de peptídeos é desejável, por poder degradar-se em aminoácidos individuais. Além disso, ao contrário de outras matrizes de materiais, por exemplo, polímeros, produtos de síntese de peptídeos podem ser purificados até 98%, evitando a polidispersidade molecular e, assim problemas com a reprodutibilidade das propriedades fisicoquímicas. Além disso, as propriedades da estrutura do peptídeo podem ser prontamente moduladas, por exemplo, por introdução de mutações pontuais de aminoácido. Por conseguinte, existe ainda uma forte necessidade para a engenharia de um veículo de medicamento degradável, o que possa ser sintetizado e purificado em um processo simples.

SUMÁRIO

[007] Vários aspectos e modalidades aqui fornecidos referem-se a peptídeos anfifílicos, partículas de peptídeos que compreendem uma ou mais modalidades dos peptídeos anfifílicos aqui descritos, e os usos de peptídeos anfifílicos ou partículas de peptídeo aqui descritas. As cargas líquidas dos peptídeos anfifílicos aqui descritos podem ser ajustadas controlando o número de grupos carregados presentes em resíduos de aminoácidos dos peptídeos anfifílicos, por exemplo, mascarando um ou mais grupos amino carregados, por exemplo, com a acetilação. Portanto, os peptídeos anfifílicos e partículas de peptídeo aqui descritos podem ser utilizados como veículos de distribuição ou veículos para diferentes tipos de agentes ativos, por exemplo, moléculas carregadas ou sem carga, ou moléculas polares ou não-polares. Além disso, as partículas de peptídeo aqui descritas podem ser ajustadas para as suas solubilidades, por exemplo, em uma condição fisiológica,

controlando as proporções de duas ou mais modalidades dos peptídeos anfifílicos presentes nas partículas de peptídeo. Por exemplo, peptídeos anfifílicos completamente mascarados (por exemplo, completamente acetilados) podem geralmente formar partículas de peptídeo insolúveis, enquanto que as partículas formadas a partir de peptídeos não-mascarados (por exemplo, não-acetilados) ou parcialmente mascarados (por exemplo, parcialmente acetilados) têm geralmente uma maior solubilidade do que os peptídeos anfifílicos completamente mascarados (por “exemplo, completamente acetilados), por exemplo, em uma condição fisiológica. Assim, em algumas modalidades, a solubilidade das partículas de peptídeo aqui descritas, por exemplo, em uma condição fisiológica, pode ser controlada através da formação das partículas de peptídeo com uma mistura desses peptídeos anfifílicos com solubilidades diferentes e variando adequadamente suas quantidades nas partículas de peptídeo.

[008] Um aspecto aqui proporcionado refere-se a um peptídeo anfifílico que compreende um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptídeo hidrofílico. O inventor descobriu que através da modulação da hidrofilicidade do segmento hidrofílico, a mesma pode controlar o tipo de partícula formado pela auto-agregação dos peptídeos anfifílicos.

[009] Por conseguinte, um aspecto da invenção proporciona um peptídeo anfifílico que compreende um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptidil hidrofílico, em que o segmento de peptidil hidrofóbico compreende uma sequência de 2 a 10 aminoácidos D e L alternados selecionados entre alanina, valina, isoleucina, leucina (Leu), fenilalanina, tirosina ou triptofano (Trp), e em que Oo segmento de peptidil hidrofílico compreende aminoácidos carregados, ou sem cargas mas polares, ou derivados dos mesmos.

[010] Em certas modalidades deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, o segmento de peptidil hidrofóbico pode compreender uma sequência de aminoácido de (Trp-Leu)nm- (Trp)n ou (Leu-Trp)p- (Leu)a, em que cada Trp é D- Trp ou L-Trp e cada Leu é D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro de 1 a 20, en eqsão independentemente O ou 1, desde que quando Trp é D-Trp, em seguida, Leu é L-Leu, e quando Trp é L-Trp, em seguida, Leu é D-Leu, ou vice-versa.

[011] Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofílico pode compreender pelo menos uma carga presente ou no N-terminal ou um resíduo de aminoácido. Em tais modalidades a pelo menos uma carga pode ser uma carga catiônica ou uma aniônica. Em algumas modalidades, a pelo menos uma carga catinôica pode ser um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em Lys, Arg, His, e quaisquer combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a pelo menos uma carga aniônica pode ser um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em Asp ou Glu, e quaisquer combinações dos mesmos.

[012] Em modalidades alternativas, O segmento de peptidil hidrofílico pode compreender os aminoácidos sem cargas mas polares. Em outras modalidades, o segmento de peptidil hidrofílico pode compreender pelo menos uma carga e pelo menos um aminoácido sem carga mas polar. Em várias modalidades, o pelo menos um resíduo de aminoácido sem carga mas polar pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em Ser, Thr, Asn ou Gln, e quaisquer combinações dos mesmos.

[013] Em modalidades particulares deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, o segmento de peptidil hidrofílico pode compreender uma sequência de aminoácido de (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a

15. Em algumas modalidades, r pode ser um número inteiro de 2a5. Em algumas modalidades, r pode ser igual a 3.

[014] Em algumas modalidades deste aspecto, e todos os outros aspectos aqui descritos, o segmento de peptidil hidrofóbico pode compreender um polímero. Em algumas modalidades, o segmento ligado ao segmento de peptidil hidrofóbico pode ser adaptado para ligar covalentemente ao polímero. Em certas modalidades, o polímero pode ser polímero biocompatível e/ou biodegradável. Exemplos de polímero incluem, mas não limitados a, PEG, PGG, PEO, policaprolactona, ácido polilático, ácido poliglicólico, polihidroxialcaboatos, dextranos, polianidridos, PLA-PGA, poliortoéster, polifumarato, hidrogéis, quaisquer polímeros biocompatíveis e/ou biodegradáveis reconhecidos na técnica, e quaisquer combinações dos mesmos.

[015] Em certas modalidades deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, o pelo menos um grupo amino no peptídeo anfifílico pode ser mascarado, por exemplo, por acetilação. Em tais modalidades, o pelo menos um grupo amino pode ser um grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico. Em outras modalidades, o pelo menos um grupo amino pode estar em um resíduo Lys do segmento de peptidil hidrofílico.

[016] Em algumas modalidades deste aspecto e todos os outros aspectos aqui descritos, todos os grupos amino do segmento de peptidil hidrofílico podem ser mascarados, por exemplo, acetilados. Em outras modalidades, o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico e pelo menos um dos grupos amino no segmento de peptidil hidrofílico podem ser mascarados, por exemplo, acetilados. Em ainda outra modalidade, o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico e todos os grupos amino no segmento de peptidil hidrofílico podem ser mascarados, por exemplo, acetilados. Em algumas modalidades em que o segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de aminoácido de (Lys)r, O grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico e pelo menos um (incluindo, pelo menos 2, pelo menos 3, ou mais) dos resíduos Lys do segmento de peptidil hidrofílico são mascarados, por exemplo, acetilados. Em uma modalidade em que o segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de aminoácido de (Lys)r, O grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico e todos dos resíduos de Lys do segmento de peptidil hidrofílico são mascarados, por exemplo, acetilados.

[017] Em várias modalidades, o segmento de peptidil hidrofóbico pode ser ligado ao C-terminal do segmento de peptidil hidrofílico.

[018] Em certas modalidades, Leu é D-Leu. Em algumas modalidades, Trp é L-Trp. Em algumas modalidades, Lys é L-Lys. Em algumas modalidades, m ou p podem ser, independentemente, entre 1 e 3. Em uma modalidade, m ou p é

3. Em uma modalidade, n ou q é 1. Por conseguinte, uma modalidade do peptídeo anfifílico compreende a sequência de amino ácido de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L- Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp), em que pelo menos um dos resíduos de L-Lys é acetilado.

[019] Em algumas modalidades, o peptídeo anfifílico pode compreender a sequência de aminoácido de Ac- (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp). Em tais modalidades, o pelo menos um dos resíduos de L-Lys pode ser acetilado.

[020] Em outras modalidades, o peptídeo anfifílico pode compreender a sequência de aminoácido de Ac- (L- Lys(AC))-(L- Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Trp)-(D-Leu)- (L-Trp)- (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) -X, em que X está ausente ou NH2.

[021] O peptídeo anfifílico pode ter uma sequência de aminoácido de qualquer comprimento. Em algumas modalidades, o peptídeo anfifílico pode ter um comprimento de cerca de 5 a cerca de 25 resíduos de aminoácidos.

[022] O segmento de peptidil hidrofóbico Ou segmento de peptidil hidrofílico do peptídeo anfifílico pode ser modificado. Por exemplo, o pelo menos um do segmento de peptidil hidrofóbico ou o segmento de peptidil hidrofílico pode compreender pelo menos uma mutação pontual. Em várias modalidades, pelo menos uma ligação amida da estrutura principal pode incluir uma ligação amida de substituição. Em outras modalidades, o peptídeo anfifílico pode compreender o pelo menos um B-aminoácido, y-aminocácido, ou quaisquer combinações dos mesmos.

[023] Em algumas modalidades, o peptídeo anfifílico compreende um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptidil hidrofílico, em que o segmento de peptidil hidrofóbico compreende a sequência de aminoácido (AAN-ARV),-(AAVP)a, em que AAU, AA? e AN são —independentemente de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos selecionados para cada ocorrência, b é um número inteiro de 1 a 20, e d é O ou 1, desde que AN e AAVº têm a configuração oposta (isto é, D e L) e A”? e AV têm a configuração oposta (isto é, De L), o segmento de peptidil hidrofílico compreende um ou mais aminoácidos hidrofílicos ou derivados dos mesmos, e o peptídeo anfifílico é parcialmente ou completamente mascarado.

[024] Em algumas modalidades, um peptídeo anfifílico compreende a sequência de aminoácido (L-Lys)r- ((L-Trp) - (D- Leu) )w-(L-Trp), em que r' é um número inteiro de 3 a 21 e m' é um número inteiro de 3 a 20, e em que pelo menos um dos grupos amino N-terminal ou um grupo amino de cadeia lateral de pelo menos um resíduo de Lys é conjugado com um grupo de proteção de nitrogênio ou amino.

[025] O inventor descobriu que algumas modalidades dos peptídeos anfifílicos aqui descritos podem ter capacidade de penetração celular. Assim, em algumas modalidades, os peptídeos anfifílicos aqui descritos podem ser usados como agentes de penetração celular e/ou transfecção. Nestas modalidades, os peptídeos anfifílicos podem ser concebidos para serem carregados positivamente. Por conseguinte, o uso de uma composição que compreende um peptídeo anfifílico carregado positivamente como um agente de penetração celular ou agente de transfeção é aqui proporcionado, em que o peptídeo anfifílico carregado positivamente compreende um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptidil hidrofílico. O segmento de peptidil hidrofóbico do peptídeo anfifílico carregado positivamente compreende uma sequência de aminoácido de (Trp-Leu)m-(Trp)n ou (Leu-Trp)p- (Leu), em que cada Trp é D-Trp ou L-Trp e cada Leu é D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro de 1 a 5, ene q são independentemente O ou 1, desde que quando Trp é D-Trp, em seguida, Leu é L-Leu, e quando Trp é L-Trp, em seguida, Leu é D-Leu, ou vice-versa; enquanto que oO segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de aminoácido de (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a 15. Além disso, no peptídeo anfifílico carregado positivamente, o pelo menos um dos resíduos de Lys ou o grupo amino N- terminal do peptídeo anfifílico não é acetilado. Em algumas modalidades, todos os resíduos de Lys e oO grupo amino N- terminal do peptídeo anfifílico carregado positivamente não são acetilados.

[026] Em algumas modalidades, o peptídeo anfifílico carregado positivamente pode compreender uma sequência de aminoácido de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)- (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) -X, em que X está ausente ou NH.

[027] Em algumas modalidades, a composição pode compreender ainda uma molécula de ácido nucléico (por exemplo, DNA ou RNA) para ser distribuído a uma célula.

[028] Além disso, os peptídeos anfifílicos aqui descritos podem também ser utilizados, isoladamente ou como parte de um sistema de distribuição, para a distribuição de um composto de interesse, por exemplo, um agente ativo para uma célula. O sistema de distribuição pode ser um sistema de distribuição direcionado. os compostos a serem distribuídos podem incluir agentes terapêuticos, agentes de diagnóstico e quaisquer combinações dos mesmos. Por conseguinte, um aspecto das invenções fornece um método de usar um peptídeo anfifílico como um sistema de distribuição, o método compreendendo a complexação de um agente ativo com um peptídeo anfifílico e o contato de uma célula com o complexo. Em algumas modalidades, o método pode ser utilizado para fins terapêuticos ou de diagnóstico.

[029] Em outro aspecto, a invenção proporciona partículas que compreendem um peptídeo anfifílico aqui descrito. O inventor descobriu inter alia que as partículas formadas pelos peptídeos anfifílicos aqui descritos diferem das partículas descritas em C. Dittrich, Ph.D. Thesis, Universitãt Basel, 2007, Para esclarecer, as partículas fabricadas a partir dos peptídeos anfifílicos aqui descritos são diferentes daquelas descritas em Dittrich (2007). Os peptídeos descritos em Dittrich (2007) não compreendem —. grupos amino mascarados. Como tal, as partículas formadas a partir de tais peptídeos são micelas, por exemplo, partículas ocas, e partículas não-sólidas como aqui descritas. Por conseguinte, em determinadas modalidades, as partículas de peptídeo aqui descritas não são micelas, por exemplo, partículas ocas. Dito de outra forma, em certas modalidades, as partículas de peptídeo aqui descritas são partículas sólidas.

[030] Em algumas modalidades, as partículas que compreendem um peptídeo anfifílico aqui descrito podem ainda compreender um ligando. Por conseguinte, em uma modalidade, uma partícula de peptídeo aqui descrita compreende um peptídeo anfifílico, o peptídeo anfifílico que compreende um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptidil hidrofílico, em que o segmento de peptidil hidrofóbico compreende uma sequência de aminoácido de (Trp-Leu)m- (Trp)n Ou (Leu-Trp)p-(Leu)g, em que cada Trp é D-Trp ou L-Trp e cada Leu é D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro de 1 a 5, en eq são independentemente O ou 1, desde que quando Trp é D-Trp, em seguida, Leu é L- Leu, e quando Trp é L-Trp, em seguida, Leu é D-Leu, Ou vice-versa; e em que o segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de aminoácido de (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a 15, e em quea partícula de peptídeo compreende ainda na sua superfície exterior um ligando.

[031] Em uma modalidade, o ligando pode ser um ligando receptor da superfície da célula ou um anticorpo. Ligandos receptores da superfície das células exemplares incluem, mas não limitados a transferrina, EGF, folato e quaisquer combinações dos mesmos. Em certas modalidades, o ligando pode estar presente em uma superfície exterior da partícula. Por exemplo, o ligando pode ser adsorvido sobre a superfície exterior da partícula aqui descrita. Em modalidades alternativas, Oo ligante pode ser ligado de forma covalente ao peptídeo anfifílico. Em uma modalidade, o ligando é ligado de forma covalente ao segmento de peptidil hidrofílico do peptídeo anfifílico.

[032] A espessura do ligando presente na superfície exterior da partícula aqui descrita depende, em parte, do tamanho da molécula de ligando. Em algumas modalidades, a espessura do ligando presente na superfície exterior da partícula pode variar de cerca de 1 nm a cerca de 100 nm. Em uma modalidade, a espessura do ligando presente na superfície exterior da partícula é de cerca de

10 nm. Em algumas modalidades, uma proporção de ligando para os peptídeos anfifílicos pode variar de cerca de 1:10 a cerca de 1:1.000.000.

[033] O ligando presente na partícula de peptídeo pode ser selecionado com base nos tipos de alvo (por exemplo, mas não limitados a, células, bactérias, proteínas, e/ou ácidos nucléicos) a que as partículas do peptídeo serão distribuídas. Por exemplo, para facilitar a distribuição de uma partícula de peptídeo aqui descrita para uma célula, um ligando específico para o receptor de superfície de célula pode ser selecionado. Assim, algumas modalidades das partículas de peptídeo aqui descritas podem ser utilizadas para a distribuição alvo de um agente ativo usando as partículas do peptídeo como veículos de distribuição ou veículos. Em tais modalidades, as partículas de peptídeo podem ser usadas para distribuir a uma célula um agente ativo que é impermeável à célula quando distribuído por si só.

[034] Por conseguinte, em diversas modalidades deste aspecto, e todos os outros aspectos aqui descritos, a partícula de peptídeo pode compreender um ou mais agentes ativos. Em tais modalidades, oO agente ativo pode ser disperso no interior da partícula. O agente ativo pode ter nenhuma carga líquida ou uma carga líquida. Em algumas modalidades, O agente ativo pode compreender pelo menos um grupo aromático. Exemplos do agente ativo incluem, sem limitações, proteínas, peptídeos, antígenos, anticorpos ou porções dos mesmos, moléculas do tipo anticorpo, enzimas, ácidos nucléicos, aptâmeros, pequenas moléculas, antibióticos, agentes farmaceuticamente ativos, agentes terapêuticos, agentes de contraste, e quaisquer combinações dos mesmos. Em uma modalidade, O agente ativo é um agente farmaceuticamente ativo ou um agente terapêutico. Em uma modalidade, oO agente ativo é uma molécula de ácido nucléico, incluindo, mas não limitado a, SÍiRNA miRNA, ShRNA, DNA e quaisquer combinações dos mesmos. Em modalidades particulares, a proporção do agente ativo para os peptídeos anfifílicos pode variar de cerca de 1:1 a cerca de 1:100.000, a partir de cerca de 1:1 a cerca de 1:10.000, de cerca de 1:1 a cerca de 1:1.000, a partir de cerca de 1:1 a cerca de 1:100, Ou a partir de cerca de 1:1 a cerca de 1:10.

[035] A partícula de peptídeo deste aspecto e de todos os outros aspectos aqui descritos pode ser de qualquer tamanho. Em algumas modalidades, a partícula de peptídeo pode ter um tamanho de cerca de 5 nm a cerca de

5.000 nm. Em algumas modalidades, a partícula pode ter um tamanho de cerca de 30 nm a cerca de 150 nm.

[036] Em algumas modalidades, a partícula de peptídeo pode compreender uma mistura de peptídeos anfifílicos parcialmente mascarados (por exemplo, parcialmente acetilados) e completamente mascarados (por exemplo, completamente acetilados) aqui descritos. Nestas modalidades, a proporção de peptídeos anfifílicos parcialmente mascarados para completamente acetilados pode variar de cerca de 95:5 a cerca de 1:1. Em certas modalidades, a partícula pode ainda compreender peptídeos anfifílicos não-mascarados (por exemplo, não-acetilados).

[037] Por conseguinte, uma partícula de peptídeo mista que compreende um peptídeo anfifílico completamente acetilado e um peptídeo anfifílico não-acetilado Ou parcialmente acetilado é também aqui proporcionada. Em modalidades específicas, a partícula de peptídeo mista compreende um primeiro peptídeo anfifílico e um segundo peptídeo anfifílico, em que o primeiro e o segundo peptídeo anfifílico, cada um, compreende, independentemente, um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptidil hidrofílico, em que o segmento de peptidil hidrofóbico compreende uma sequência de aminoácido de (Trp-Leu)nm-(Trp)n ou (Leu-Trp)p-(Leu)g, em que cada Trp é D-Trp ou L-Trp e cada Leu é D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro de 1 a 5, en e q são independentemente O Ou 1, desde que quando Trp é D-Trp, em seguida, Leu é L-Leu, e quando Trp é L-Trp, em seguida, Leu é D-Leu, ou vice-versa; enquanto que o segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de aminoácido de (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a 15. Além disso, o grupo amino N-terminal e todos os resíduos de Lys do primeiro peptídeo anfifílico são acetilados, enquanto que, pelo menos, o grupo amino N- terminal ou um dos resíduos de Lys do segundo peptídeo anfifílico não é acetilado. Em algumas modalidades, nenhum do grupo amino N-terminal e os resíduos de Lys do segundo peptídeo anfifílico são acetilados.

[038] Em modalidades particulares, o primeiro e segundo peptídeos anfifílicos podem compreender, cada um, independentemente, uma sequência de amincácido de (L-Lys)- (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D- Leu) - (L-Trp)-X, em que X está ausente ou NH.

[039] A proporção do primeiro peptídeo anfifílico para o segundo peptídeo anfifílico pode ser variada em função de um número de fatores, por exemplo, mas não limitados a, solubilidade e/ou estabilidade desejável da partícula de peptídeo, e/ou propriedades do agente ativo a serem carregadas no seu interior. Em algumas modalidades, a proporção do primeiro peptídeo anfifílico para o segundo peptídeo anfifílico pode estar em uma faixa de cerca de 1:1 a cerca de 1000:1. Em outras modalidades, a proporção do primeiro peptídeo anfifílico para o segundo —peptídeo anfifílico pode estar em uma faixa de cerca de 5:1 a cerca de 100:1.

[040] Em algumas modalidades, a partícula de peptídeo mista pode ainda compreender um agente ativo aqui descrito. O agente ativo pode estar presente na partícula de peptídeo misturada em qualquer quantidade, por exemplo, dependendo da capacidade de carregamento da partícula de peptídeo e/ou a capacidade de ligação do primeiro ou segundo peptídeos anfifílicos. Em algumas modalidades, a proporção do agente ativo para o segundo peptídeo anfifílico pode estar em uma faixa de cerca de 1:1000 a 1:1, Ou de cerca de 1:100 à cerca de 1:10. Em algumas modalidades, a proporção do agente ativo para o segundo peptídeo anfifílico pode estar em uma faixa de cerca de 1:10 a cerca de 1:2.

[041] Sem pretender estar limitada pela teoria, a presença do segundo peptídeo anfifílico na partícula de peptídeo misturada pode fornecer uma carga catiônica para a ligação com as moléculas de ácido nucléico aniônicas. Assim, em algumas modalidades, o agente ativo pode incluir uma molécula de ácido nucléico.

[042] Em algumas modalidades, a partícula de peptídeo mista pode compreender ainda, na sua superfície exterior, um ligando. Como descrito anteriormente, a seleção de um ligando pode ser determinada com base em uma molécula alvo (por exemplo, mas não limitada a, células, bactérias, proteínas, ácidos nucléicos), à qual a partícula de peptídeo mista se liga. Exemplos não limitativos de um ligando podem incluir um ligando receptor da superfície da célula ou uma proteína tal como um anticorpo. Em algumas modalidades, o ligando pode estar covalentemente ligado a pelo menos um dentre o primeiro e segundo peptídeos anfifílicos, por exemplo, o segmento de peptidil hidrofílico de pelo menos um dentre o primeiro e segundo peptídeos anfifílicos.

[043] A partícula de peptídeo mista aqui descrita pode ser usada para encapsular qualquer agente ativo aqui descrito. Em uma modalidade específica, a partícula de peptídeo mista pode ser utilizada para encapsular uma molécula de ácido nucléico. Assim, outro aspecto da invenção proporciona o uso de uma ou mais modalidades da partícula de peptídeo mista que compreende um primeiro peptídeo anfifílico e um segundo peptídeo anfifílico para a distribuição de uma molécula de ácido nucléico para uma célula. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico pode incluir RNA (por exemplo, mas não limitado a, SÍiRNA, miRNA, ShRNA), DNA, ou quaisquer combinações dos mesmos.

[044] As composições e os kits para preparar uma ou mais modalidades de uma partícula de peptídeo ou uma partícula de peptídeo mista são também aqui proporcionados.

Em algumas modalidades, a composição ou o kit pode compreender um peptídeo anfifílico aqui descrito. O peptídeo anfifílico fornecido na composição ou kit pode ser armazenado em um recipiente. Dependendo da escolha do usuário de uma partícula de peptídeo ou partícula mista aqui descrita para ser produzida, em algumas modalidades, a composição ou o kit pode compreender um primeiro peptídeo anfifílico e um segundo peptídeo anfifílico aqui descrito. O peptídeo anfifílico pode ser fornecido em pó ou pó liofilizado. Em algumas modalidades, a composição ou o kit pode ainda compreender, pelo menos um reagente, por exemplo, para a reconstituição do peptídeo anfifílico em pó, para emulsificação de uma mistura de montagem de partícula, ou ambas. Em algumas modalidades, a composição ou o kit pode ainda compreender um ligando aqui descrito, por exemplo, fornecido em um recipiente separado. Em algumas modalidades, a composição ou o kit pode ainda compreender um agente ativo a ser encapsulado na partícula de peptídeo. O agente ativo pode ser fornecido em um recipiente separado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[045] As Figuras 1A-1B mostram os resultados de caracterização de CD3ac purificado de acordo com uma ou mais modalidades da invenção. Fig. 1A mostra um espectro de massa medido em um espectrômetro de massa Orbitrap. Fig. 1B mostra um perfil de eluição RP-HPLC sobreposto de CD3ac e sínteses de CD3 intermediária medida pela absorção a 280 nm. A pureza do produto é superior a 95% em ambos os casos.

[046] AS Figuras 2A-2C mostram as imagens SEM de CD3ac de nanopartículas de peptídeo de acordo com uma ou mais modalidades da invenção. As Figuras 2A-2B mostram as imagens SEM de contas CD3ac liofilizadas. Fig. 2C mostra uma imagem SEM de uma conta de CD3ac, quebrada no processo de secagem por congelação. A imagem revela a propriedade sólida dos precipitados de peptídeo.

[047] As Figuras 3A-3B mostran os encaixes lineares dos resultados de espalhamento de luz dinâmico (DLS). É determinado que tanto a concentração de partícula (Fig. 3A) e ângulo de detecção (Fig. 3B) improvavelmente influenciam as propriedades de difusão de contas CD3ac em solução aquosa.

[048] Fig. 4 mostra um conjunto de espectros de dicroísmo circular de derivados CD3ac de CD1l, CD2, CD3 e CD4. Números exibidos igual ao número de resíduos de lisina ligados ao N-terminal.

[049] As Figuras 5A-5B mostram os efeitos dos aminoácidos L exclusivamente sobre as propriedades das nanopartículas de peptídeo. Fig. 5A mostra uma imagem SEM de LCD3ac precipitado. A montagem esférica como observada em partículas CD3ac não podia ser observada com LCD3ac precipitado. Fig. 5B mostra os espectros de dicroísmo circular de CD3 (linha reta) e LCD3 (linha tracejada), indicando as diferenças na estrutura secundária, devido à quiralidade dos aminoácidos leucina. LCD3 exibe as características de alfa-helicoidal.

[050] As Figuras 6A-6C mostram as imagens de microscopia confocal de contas CD3ac co-montadas com rosa de bengala (RB), 5-carbóxi-fluoresceína (CF), ou uma mistura de ambos. Fig. 6A mostra as imagens de microscopia confocal de contas CD3ac co-montadas com RB. Fig. 6B mostra as imagens de microscopia confocal de contas CD3ac co- montadas com CF. Fig. 6C mostra as contas CD3ac carregadas com RB e CF, que indicam a capacidade das contas de peptídeo para encapsular simultaneamente os compostos de elevada e baixa solubilidade em solução aquosa. Como mostrado nas Figuras 6A-6C, contas CD3ac contendo RB são observadas como as esferas individuais, ao passo que as contas que contêm exclusivamente CF tendem a agregar. Nas Figuras 6A-6C, painéis do lado esquerdo superiores: emissão de fluorescência de RB; painéis do lado direito inferiores: emissão de fluorescência de CF; painéis do lado direito Superiores: imagem de contraste de fase; e painéis do lado esquerdo inferiores: co-localização de ambos os canais fluorescentes. A largura de um painel corresponde a 55 um.

[051] As Figuras 7A-7B mostram a eficiência de encapsulação de rosa de bengala (RB) em nanopartículas de

CD3ac. Fig. 7A mostra os resultados de eficiência de co- precipitação de RB com CD3ac. O eixo x descreve a proporção da concentração inicialmente dissolvida de CD3ac para RB, antes da troca de solvente e montagem. Eixo y à esquerda: composição molar de precipitado (0). Eixo y à direita: proporção molar de encapsulado para RB geral (A). Como um exemplo, a uma proporção inicial de RB:CD3ac = 1:4, cerca de 15% em mol das contas consistem em RB e cerca de 33% de RB inicialmente dissolvido foram encapsulados nas montagens. Fig. 7B mostra a absorção de triptofano de pélete (4) e as frações sobrenadantes (e) contendo as quantidades diferentes de RB, indicando que a montagem de CD3ac não é comprometida por concentrações equimolares de carga RB.

[052] As Figuras 8A-8I mostram os resultados da caracterização de partículas de peptídeo CD3ac montadas na presença de transferrina rotulada com AF568 (Tfn-AF568) e Flutax-2 e transferrina (Tfn). As Figuras 8A-8C mostram as imagens de microscopia de fluorescência de fluorescência verde (Fig. 8B) e partículas de peptídeo vermelhas (Fig. 8A) antes de tripsinização. A imagem mesclada (Fig. 8C) mostra a distribuição de fluorescência diferencial para Tfn-AF-568 (anel) e Flutax-2 (igualmente distribuído). As Figuras 8D-8F mostram as imagens fluorescentes da mesma amostra após tripsinização durante 6 horas. O anel característico de fluorescência TÍNn-AF-568 desapareceu (Fig. 8D) e a intensidade da emissão de Flutax-2 aumentada por um fator de 13,5 (Fig. 8E). As Figuras 8G-8H mostram O perfil de nível cinza médio de partículas n= 10 no canal vermelho (Fig. 8G) e verde (Fig. 8H) antes e depois de tripsinização. Fig. 8I mostra um diagrama esquemático de partículas de peptídeo CD3ac com uma coroa de proteína (por exemplo, Tfn-AF568) antes e depois de tripsinização.

[053] As Figuras 9A-9D mostram os resultados de composições de Flutax-2 e Tfn-AF568 dentro das nanopartículas de peptídeo CD3ac. As Figuras 9A e OB mostram a composição quantificada de partículas de peptídeo auto-montadas com Tfn-AF568 (Fig. 9A) e Flutax-2 (Fig. 9B), respectivamente. O eixo x descreve a proporção de concentração de Tfn-AF568 ou Flutax-2 inicialmente dissolvido para CD3ac (123 pM), anterior à troca de solvente e de montagem. Eixo y à esquerda: (símbolos abertos): composição molar de nanopartículas de peptídeo (PNPs). Eixo y à direita (símbolos fechados): proporção molar de encapsulado para Tfn-AF568 ou Flutax-2 geral. Como um exemplo na Fig. 9B, a uma proporção inicial de Flutax- 2:CD3ac= 0,1, a cerca de 7,5% em mol de um PNP consiste em Flutax-2 e cerca de 80% de Flutax-2 inicialmente dissolvido foram encapsulados. A eficiência de encapsulação consistente de Flutax-2 de cerca de 80% corresponde a um coeficiente de partição logarítmico de 5,25. Fig. 9C mostra distribuição de intensidade de fluorescência Tfn-AF568 de PNPs antes e após a competição com Tfn. As partículas foram montadas na presença de 10 vg/ml de Tfn-568 e fotografadas imediatamente após a formação. As barras pretas correspondem à distribuição da intensidade de ponto lacrimal de fluorescência resultante. A distribuição representada por barras cinzentas descreve as intensidades de fluorescência das mesmas PNPs após um período de incubação de 24 horas a 37ºC, na presença de 1360 ug/ml de Tfn. Fig. 9D mostra uma distribuição da intensidade de fluorescência de Tfn-AF568 de gráfico de dados cumulativos de PNPs antes e após a competição com Tfn como mostrado na Fig. 9C.

[054] As Figuras 10A-10K mostram o controle do diâmetro de partícula e caracterização da morfologia de nanopartícula por TEM. As Figuras 10A-10C mostram fluorescência Tfn-AF568 em partículas de peptídeo montadas a partir de 492 uM, 246 UM e 123 1uM de CD3ac. As barras de escala correspondem a 1 pum. Fig. 10D mostra os três perfis de intensidade de fluorescência sobrepostos, cada um dos quais mostra os resultados médios de 10 partículas. Os resultados são representados pelo desvio médio +/- padrão. Fig. 10E mostra uma interpretação sistemática de perfis de intensidade que ilustran a relação do tamanho das partículas, a fluorescência de coroa e a resolução limitada da microscopia de luz. As Figuras 10F-10I mostram as imagens TEM de coloração negativa de partículas de CD3ac montadas na ausência (Figuras 10F-10G) e presença (Figuras 10H-101) de 10 pg/ml de Tfn. As amostras contendo proteína (por exemplo, contendo Tfn) podem ser distinguidas por uma camada de contraste intermediário em torno das partículas de peptídeo. Buracos ocasionais (indicados pela seta preta) foram resultados a partir de vácuo aplicado em TEM e observação similar foi descrita em Hyuk I, et al., (2005) Nat Matter 4:671. As Figuras 10J-10K mostram que o tamanho de partícula final depende da presença de Tfn durante a montagem. A formação de partícula, na ausência de Tfn-AF568 resulta em um diâmetro de partícula médio de 100 nm (Fig. 107), onde a presença de proteína durante a montagem de partícula reduz o diâmetro de 51 nm (Fig. 10K). A espessura da coroa de proteína corresponde a 9,0 +/- 2,1 nm (inserção da Fig. 10K).

[055] As Figuras 11A-11H mostram os efeitos da competição Tfn na ligação PNPÚS às células CHO. PNPEZE é aqui utilizudo como um acrônimo para nanopartículas de peptídeo CD3ac auto-montadas na presença de carga (por exemplo, Flutax-2 utilizado aqui) e coroa (por exemplo, Tfn-AF568 utilizado aqui). As Figuras 11A-11C mostram as imagens de microscopia de fluorescência de células CHO incubadas com PNP/Í/5* durante uma hora. Co- localização dos pontos lacrimais fluorescentes no canal verde (Flutax-2) e vermelho (Tfn-AF568) indica a identidade de partículas, que se acumula nas células. As Figuras 11D- 11F mostram as células CHO incubadas com PNPZ-/5* durante uma hora na presença de 17 1yM de Tfn. Associação de PNP é significativamente reduzida. As barras de escala correspondem a 10 um. Fig. 11G mostra as contas de nanopartícula de peptídeo médias (PNP) por célula (por exemplo, CHO ou TRVb). O valor para o controle negativo (NC) corresponde ao falso ponto lacrimal de fluorescência positiva em células CHO, incubadas na ausência de PNPÍ-/25 mas de outro modo concentrações idênticas de TÍn-AF568 e Flutax-2. Os resultados são média +/- s.e.m., duplo asterisco indica P < 10º, Kolmogorov-Smirnov. Fig. 11H mostra um conjunto de imagens que mostra as células CHO após incubação de 1 hora com PNPZI/"*. A linha superior e a linha inferior mostram as células incubadas na ausência e na presença de 17 u1uM de Tfn, respectivamente. A área delineada em um quadrado branco é ampliada nas Figuras 11A- 11F. As barras de escala correspondem a 20 um.

[056] As Figuras 12A-12M mostram os resultados experimentais de internalização de nanopartículas. As Figuras 12A-12D mostram as imagens de microscopia de fluorescência de células CHO incubadas com PNPÍIEZASS durante 1 hora.

Fig. 12E mostra as distribuições de fluorescência de Flutax-2/Tfn-AF568 de PNPZAE (G/R), após 1 hora de incubação de células CHO com PNPIAS, Barras cinza representam G/R na lâmina de vidro, barras pretas correspondem a G/R encontrado dentro do perímetro celular.

Fig. 12F mostra esquemática de associação de partícula e de internalização após 1 hora.

As Figuras 12G- 12J mostram as imagens de microscopia de fluorescência de células CHO incubadas com PNPÍI-/5* durante 6 horas, em que a mudança de partículas para valores G/R superiores serve como um substituto de internalização de partícula.

Fig. 12K mostra que a distribuição dos valores de G/R é significantemente aumentada após um período de incubação mais longo (barras pretas). Em contraste, a distribuição dos valores de G/R na lâmina de vidro (barras cinza) é estatisticamente indistinguível a partir dos valores de G/R da mesma subpopulação após 1 hora.

Fig. 12L mostra esquemática de associação de partícula e de internalização após 6 horas.

Para as partículas em compartimentos lisossomais, coroa é proteoliticamente digerida rendendo fluorescência de Tfn-AF568 diminuída e fluorescência de Flutax-2 aumentada.

Fig. 12M mostra as imagens que indicam a mudança de cor de PNPII/5*. A linha superior mostra as células CHO incubadas com PNPÍI/S* durante 1 hora e contrasta da linha inferior, em que a mesma linhagem celular foi incubada com PNPÍI/** durante 6 horas. A área delineada em um quadrado branco é ampliada nas Figuras 12A- 12D€E 12G-12J. As barras de escala correspondem a 20 um.

[057] As Figuras 13A-13I mostram a liberação de carga após a incubação com PNPÍI/5** durante 24 horas. As Figuras 13A-13C mostram as imagens de microscopia de fluorescência de células CHO incubadas durante 24 horas com 67 nM de Flutax-2 e 0,09 pg/ml de Tfn-AF568. As Figuras 13D-13G mostram as imagens de fluorescência de células CHO incubadas durante 24 horas com à mesma quantidade de Flutax-2 e Tfn-AF568 auto-montados com CD3ac para formar PNPRZS . Fig. 13H mostra a intensidade de fluorescência de Flutax-2 média dependente da linhagem celular (CHO, TRVb) e a competição com Tfn não-rotulado dissolvido. O controle negativo (NC) corresponde à autofluorescência celular no canal verde. Os resultados são média +/- s.e.m., único asterisco indica P < 0,01, duplo asterisco indica P < 10º, Kolmogorov-Smirnov. As barras de escala correspondem a 10 pm. Fig. 131 mostra as imagens de células CHO após 24 horas de incubação com Flutax-2. Ambas as amostras (linhas superior e inferior) contêm 66,7 nM de Flutax-2. A linha superior mostra uma cultura de célula incubada com Flutax-2 dissolvida no meio de cultura de célula, a linha inferior da mesma linhagem de célula incubada com Flutax-2 anteriormente auto-montada em PNPÍÍ-**. A área delineada em um quadrado branco é ampliada nas Figuras 13A-13G. As barras de escala correspondem a 20 um.

[058] Fig. 14 mostra um conjunto de imagens de microscopia de fluorescência de partículas de peptídeo (por exemplo, CD3ac) montado com Flutax-2 e Tfn-AF568. A linha superior mostra a amostra antes de tripsinização. Canais vermelho e verde não são congruentes, como as partículas dispersas movidas e existe um atraso de tempo entre as imagens causadas pela mudança de filtros de excitação e de emissão. Partículas idênticas são definidas em parênteses e são sobrepostas nas Figuras 8A-8F. A linha inferior mostra à mesma amostra após 6 horas de incubação com tripsina. A coroa vermelha desaparece e as partículas restantes aderem à superfície da cobertura de lâmina de vidro.

[059] As Figuras 15A-15B mostram as curvas de calibração de fluorescência de TÊn-AF56G8 (Fig. 15A) e Flutax-2 (Fig. 15B). Ambos medidos em uma solução de 60% de H20, 30% de DMSO, 10% de FBS. O solvente orgânico é necessário para dissolver as nanopartículas na fração de pélete e a presença de FBS minimiza a adsorção de analitos rotulados para superfícies de plástico, proporcionando linearidade entre a concentração de fluoróforo e fluorescência medida.

[060] As Figuras 16A-16B mostram uma nanopartícula de peptídeo de acordo com uma ou mais modalidades da invenção. Fig. 16A mostra um diagrama esquemático de uma partícula CD3ac funcionalizada com as moléculas de EGF, que pode ser opcionalmente rotulada com Texas Red (para efeitos de visualização). Fig. 16B é um conjunto de imagens fluorescentes que mostra as partículas CD3ac funcionalizadas por EGF absorvidas pelas células.

[061] As Figuras 17A-17K mostram resultados experimentais de células (por exemplo, células HeLa) tratados com uma modalidade das nanopartículas de peptídeo encapsuladas com nocodazol (que é um agente químico que pode despolimerizar os microtúbulos e ser utilizado como um agente anti-neoplásico). Fig. 17A mostra uma representação esquemática de quatro condições experimentais diferentes, em que PBle representa as nanopartículas CD3ac funcionalizadas por EGF encapsuladas com 20 HUM de nocodazol, e os resultados experimentais são mostrados nas Figuras 17B-17F. Fig. 17B mostra um conjunto de imagens fluorescentes que mostra as estruturas de microtúbulo de células após 1 hora de incubação sob as condições indicadas na Fig. 17A. Os sinais fluorescentes vermelhos no interior das células indicam as nanopartículas PBle absorvidas pelas células. Fig. 17C mostra um conjunto de imagens fluorescentes que mostra as nanopartículas PBle absorvidas pelas células, após vários períodos de tempo, tal como indicado. As Figuras 17D-17F mostram as imagens fluorescentes de estruturas microtubulares de células HeLa tratadas sob diferentes condições, como indicado. Fig. 17G mostra uma representação esquemática de quatro condições experimentais diferentes, em que PBle representa as nanopartículas CD3ac funcionalizadas por EGF encapsuladas com 40 UM de nocodazol, e os resultados experimentais são "mostrados nas Figuras 17H-17K. As Figuras 17H-17I mostram as imagens de células após 4 horas de incubação sob condições diferentes, tal como indicado. Fig. 17I mostra as imagens fluorescentes de estruturas microtubulares (indicadas pelo verde) de células sob condições diferentes. Os sinais vermelhos no interior das células indicam as nanopartículas PBle absorvidas pelas células. As Figuras 173I-17K mostram as imagens de células após 24 horas de incubação sob condições diferentes, tal como indicado. Fig. 17K mostra as imagens fluorescentes de estruturas microtubulares (indicadas pelo verde) de células sob condições diferentes. Os sinais vermelhos no interior das células indicam as nanopartículas PBle absorvidas pelas células.

[062] As Figuras 18A-18C mostram uma outra modalidade das nanopartículas de peptídeos de acordo com a invenção, em que as nanopartículas CD3ac são funcionalizadas com um anticorpo. Fig. 18A mostra as representações esquemáticas de nanopartículas CD3ac funcionalizadas com os anticorpos primários ou secundários. Fig. 18B mostra que as nanopartículas CD3ac funcionalizadas com IgG de antitransferrina de coelho podem ligar-se à transferrina (rotuladas com A568), e, assim como manchas brilhantes sobre a direita da figura. Fig. 18C mostra que as nanopartículas CD3ac funcionalizadas com IgG de antitransferrina de coelho podem ligar-se a Ige de anticoelho (rotuladas com Alexa555), e, assim como manchas brilhantes sobre a direita da figura.

[063] As Figuras 19A-19B mostram as imagens fluorescentes das nanopartículas de peptídeo não-acetilado (CD3) para uso como um agente de transfecção in vitro. Fig. 19A mostra que as partículas de CD3 pode ser usado para fornecer oligonucleotídeos para dentro das células. Fig. 19B mostra nenhuma transfecção das células com os oligonucleotídeos na ausência de partículas de CD3.

[064] AS Figuras 20A-20B mostram a eficiência de encapsulamento de oligonucleotídeos em partículas de peptídeo não-acetilado. Fig. 20A é um conjunto de imagens do curso de tempo que mostra a migração de oligonucleotídeos e proteínas através de um gel de agarose durante a eletroforese. Na Fig. 20A, a linha superior foi carregada com uma mistura contendo -21 pM de peptídeos CD3 (H-LK-LK-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2) **, -5,4 UM de ssDNA (5' - TTITGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3')24-, -0,24 pM de AF488-ssDNA (AF488-5' -TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3')24-, e -4,14 ug/mL de Tfn-AF568, enquanto que a linha inferior (controle) foi carregada com uma mistura similar, mas sem peptídeos CD3. Após cerca de 40 min de eletroforese, ssSDNA em excesso e Tfn migraram através do gel de agarose para o anodo, enquanto que as partículas de peptídeo formadas na zona de carregamento de gel de agarose (como evidenciado pela co- localização do sinal AF488 e sinal de fluorescência AF568) não foram capazes de migrar no gel de agarose, devido ao seu tamanho maior. Fig. 20B é um conjunto de HP-WAX (troca aniônica fraca) dos dados de cromatografia que mostram que uma maioria dos peptídeos de CD3 e SsSDNA foram encapsulados em partículas de peptídeo (pélete), e manteve-se pouco em sobrenadante. Pico a -1,5 min: peptídeos CD3; picos a -14,5 min e -15 min: sSsDNA separado e parcialmente hibridizado, respectivamente.

[Lo65] Fig. 21 é uma imagem de fluorescência microscópica que mostra a captação de partículas de peptídeo contendo ácido nucléico por células HeLa. Nesta modalidade, as partículas de peptídeo foram formadas a partir de uma mistura que compreende os peptídeos CD3, peptídeos CD3ac, oligonucleotídeos (por exemplo, SSDNA) e trasferrina. A co-localização do sinal de fluorescência de SSDNA-AF488 com as partículas de peptídeo (como indicado por fluorescência de transferrina-AF568, onde as formas de transferrina na superfície exterior da partícula) indica a estabilidade das partículas do peptídeo a uma condição fisiológica e a capacidade de tais partículas de peptídeo para distribuir as moléculas de ácido nucléico Ou oligonucleotídeos para células.

[066] As Figuras 22A-22D mostram os dados para estabilidade de partículas de peptídeo contendo SSDNA no soro (por exemplo, -10% de soro) e a eficiência de transfecção de células utilizando as partículas de peptídeo. Fig. 22A mostra que a estabilidade de partículas de PNPl1 (partículas de peptídeo CD3 contendo sSDNA) em água é dependente da temperatura e mais partículas PNP1 tendem a dissociar-se a uma temperatura mais elevada. Fig. 22B mostra os dados de estabilidade para um estudo de tempo- curso das partículas PNPl em água, Oo que indica que a estabilidade das partículas PNPl em água é dependente da temperatura e as partículas PNPl1 tendem a dissociar-se mais rapidamente a temperatura mais elevada, por exemplo, a uma temperatura mais elevada do que 4ºC. Fig. 22C é um conjunto de imagens fluorescentes que mostra as células de HeLa incubadas na presença de partículas PNPl ou partículas PNP2 (partículas de peptídeo CD3/CD3ac contendo SSDNA) a temperaturas de cerca 4ºC e cerca de 37ºC. Os painéis superiores da Fig. 22C mostram que o sinal de fluorescência Tfn-AF568 difunde mais forte e difuso foi detectado no citosol quando as células foram incubadas com as partículas PNPl, a cerca de 37ºC, como comparadas a fluorescência Tfn- AF568 mais pontuada, detectada em células incubadas a cerca de 4ºC. No entanto, este contraste não foi observado em células incubadas com as partículas PNP2, como mostra nos painéis inferiores da Fig. 22C. Em vez disso, os painéis inferiores da Fig. 22C mostran que os sinais de fluorescência Tfn-AF568 pontuados e comparáveis foram observados em ambas as células incubadas a cerca de 4ºC e cerca de 37ºC, na presença das partículas de PNP2. Estes resultados indicam que as partículas de PNPl tendem a dissociar-se em soro (por exemplo, -10% de soro) a cerca de 37ºC, enquanto que as partículas PNP2 parecem ser mais estáveis no soro (por exemplo, -10% de soro) a cerca de 37ºC durante, pelo menos, cerca de 30 minutos. Fig. 22D é uma imagem fluorescente de células de controle negativo (isto é, células HeLa incubadas na presença de sSDNA sem partículas PNPl ou PNP2 ou peptídeos correspondentes), que indica que a intensidade de fluorescência muito mais baixa de AF488-ssDNA é observada no controle negativo do que nas células incubadas com as partículas de PNP1 ou PNP2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[067] Vários aspectos e modalidades aqui fornecidos referem-se a peptídeos anfifílicos, partículas de peptídeo que compreendem uma ou mais modalidades dos peptídeos anfifílicos aqui descritos, e os usos dos peptídeos anfifílicos ou partículas de peptídeo aqui descritas.

As cargas líquidas dos peptídeos anfifílicos aqui descritos podem ser ajustadas controlando o número de grupos carregados presentes em resíduos de aminoácido dos peptídeos anfifílicos, como por exemplo, mascarando um Ou mais grupos amino carregados, por exemplo, com a acetilação.

Portanto, os peptídeos anfifílicos e partículas de peptídeo aqui descritos podem ser utilizados como veículos de distribuição ou veículos para diferentes tipos de agentes ativos, por exemplo, as moléculas carregadas ou não-carregadas, ou as moléculas polares ou não-polares.

Além disso, as partículas de peptídeo aqui descritas podem ser ajustadas para as suas solubilidades, por exemplo, a uma condição fisiológica, controlando as proporções de duas ou mais modalidades dos peptídeos anfifílicos presentes nas partículas de peptídeo.

Por exemplo, os peptídeos anfifílicos completamente mascarados (por exemplo, completamente acetilados) podem geralmente formar as partículas de peptídeo insolúveis, enquanto que as partículas formadas a partir de peptídeos parcialmente mascarados (por exemplo, parcialmente acetilados) ou não-

mascarados (por exemplo, não-acetilados) têm geralmente uma maior solubilidade (ou menor estabilidade) do que os peptídeos anfifílicos (por exemplo, completamente acetilados) completamente mascarados, por exemplo, a uma condição fisiológica. Assim, em algumas modalidades, a solubilidade ou a estabilidade das partículas de peptídeo aqui descritas, por exemplo, a uma condição fisiológica, podem ser controladas, por exemplo, através da formação de partículas de peptídeo com uma mistura de peptídeos anfifílicos com solubilidades diferentes e variando adequadamente as suas quantidades nas partículas de peptídeo. Por conseguinte, a versabilidade e estabilidade de peptídeos anfifílicos e partículas de peptídeo aqui descrito podem ser adaptadas para uma variedade de aplicações, por exemplo, a distribuição de medicamento e/ou liberação sustentada de um agente ativo.

[068] Pelo termo "estabilidade" ou "estável" aqui utilizado significa uma capacidade de uma partícula de peptídeo reter o seu volume original (por exemplo, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou mais do seu volume original) durante um período de tempo, por exemplo, pelo menos cerca de 30 minutos ou mais (incluindo, pelo menos cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 3 horas, pelo menos cerca de 6 horas, pelo menos cerca de 12 horas, pelo menos cerca de 24 horas, ou mais), sob uma condição especificada, por exemplo, uma condição fisiológica. Estabilidade de uma partícula de peptídeo pode ser, em parte, regulada pela sua solubilidade sob uma condição especificada. O mais solúvel é uma partícula de peptídeo sob uma condição especificada, menos estável é a partícula de peptídeo sob a condição especificada. Em uma modalidade, o termo "estabilidade" ou "estável", tal como aqui utilizado refere-se a uma partícula de peptídeo que é insolúvel sob uma condição especificada, por exemplo, em um meio aquoso à uma temperatura especificada. Em algumas modalidades, o meio aquoso é água. Em algumas modalidades, o meio aquoso é um meio fisiológico, por exemplo, com certa concentração de sal, pH e/ou concentração de proteína/soro.

[069] Em um aspecto, um peptídeo anfifílico que compreende um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptídeo hidrofílico é aqui proporcionado. O inventor descobriu inter alia, que através da modulação da hidrofilicidade de um resíduo de aminoácido hidrofílico de um peptídeo anfifílico, a anfifilicidade do peptídeo anfifílico pode ser modulada de tal modo que, inesperadamente leva a automontagem dos peptídeos em partículas sólidas. A anfifilicidade pode ser modulada através da conjugação de um grupo hidrofílico a um aminoácido no segmento de peptidil hidrofílico, Ou mascarando um grupo hidrofílico no segmento de peptidil hidrofílico, ou mascarando o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico. Por exemplo, quando o aminoácido hidrofílico é um aminoácido com carga, a hidrofilicidade pode ser modulada através da conjugação da parte carregada da molécula com um grupo de proteção. Por conseguinte, em algumas modalidades, o pelo menos um grupo amino no peptídeo anfifílico é conjugado com um grupo de proteção de nitrogênio ou amino.

[070] Em algumas modalidades, o peptídeo anfifílico é completamente mascarado. Tal como aqui utilizado, um peptídeo completamente mascarado refere-se a um peptídeo anfifílico em que o grupo amino N-terminal e todos os grupos amino da cadeia lateral do segmento de peptidil hidrofílico são conjugados com um grupo de proteção de nitrogênio ou amino.

[071] Em algumas modalidades, o peptídeo anfifílico é parcialmente mascarado. Tal como aqui utilizado, um peptídeo parcialmente mascarado refere-se a um peptídeo anfifílico em que um ou mais do grupo amino N- terminal ou grupos amino de cadeia lateral do segmento de peptidil hidrofílico não estão conjugados com um grupo de proteção de nitrogênio ou amino, no entanto, o peptídeo anfifílico ainda compreende pelo menos um grupo amino conjugado com um grupo de proteção de nitrogênio ou amino.

[072] Tal como aqui utilizado, um "grupo de proteção de nitrogênio" ou um "grupo de proteção de amino" refere-se a porções que bloqueiam ou mascaram o grupo NH. Grupos de proteção de amino exemplares incluem, mas não limitados a, grupos de proteção de carbamato, tais como 2- trimetilsililetoxicarbonil (Teoc), l-metil-1-(4-bifenilil) etoxicarbonil (Bpoc), t-butoxicarbonil (BOC), aliloxicarbonil (Aloc), 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) 1 e benziloxicarbonil(Cbz); grupos de proteção de amida, tais como formila, acetila, trihaloacetila, benzoíla, e nitrofenilacetila; grupos de proteção de sulfonamida, tais como 2-nitrobenzenossulfonila, e grupos de proteção de imina e imida cíclica, tais como ftalimido e ditiassuccinoíla. Outros grupos de proteção de amino, bem como outros grupos de proteção representativos, são descritos em Greene e Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 2, 2a ed., John Wiley & Sons, New York, 1991, e Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach, Ekstein, F. Ed., IRL Press, N.Y., 1991, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[073] Em algumas modalidades, O grupo de proteção de nitrogênio ou amino é acila ou alquila, por exemplo, acetila, etanoíla, propionila, t-butanoíla, metila, etila,

propila, butila, pentila, ou hexanila.

[074] Em algumas modalidades, o grupo amino N- terminal de um peptídeo anfifílico é conjugado com um grupo de proteção de nitrogênio ou amino.

[075] Em algumas modalidades, o pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) grupo amino de cadeia lateral de um amino ácido do peptídeo anfifílico é conjugado com um grupo de proteção de nitrogênio Ou amino. O aminoácido cujo grupo amino de cadeia lateral deve ser conjugado pode estar presente em qualquer posição no peptídeo anfifílico. Os aminoácidos conjugados de cadeia lateral podem estar presentes próximos uns dos outros ou não próximos uns dos outros. Quando três ou mais aminoácidos conjugados de cadeia lateral estão presentes em alguns dos aminoácidos conjugados de cadeia lateral podem estar presentes próximos do outro aminoácido conjugado de cadeia lateral enquanto que em alguns dos aminoácidos conjugados de cadeia lateral não estão próximos a outro aminoácido conjugado de cadeia lateral. Além disso, quando dois ou mais grupos de proteção de nitrogênio ou amino estão presentes, os mesmos podem ter a mesma, toda, diferente ou qualquer combinação dos mesmos e diferentes.

[076] Em algumas modalidades, o pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais) grupo amino de cadeia lateral de um aminoácido no segmento de peptidil hidrofílico é conjugado com um grupo de proteção de nitrogênio ou amino. Sem limitações, O amincácido conjugado de cadeia lateral pode estar presente em qualquer posição do segmento de peptidil hidrofílico. Por exemplo, a leitura a partir do N-terminal, na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e assim por diante do segmento de peptidil hidrofílico.

[077] Em algumas modalidades, o grupo amino N- terminal do peptídeo anfifílico e pelo menos um grupo amino de cadeia lateral (incluindo, por exemplo, o pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três ou mais grupos amino de cadeia lateral) no segmento de peptidil hidrofílico do peptídeo anfifílico é conjugado com um grupo de proteção de nitrogênio ou amino. Em algumas modalidades, o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico e pelo menos um grupo amino de cadeia lateral (incluindo, por exemplo, o pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três ou mais grupos amino de cadeia lateral) no segmento de peptidil hidrofílico do peptídeo anfifílico é acetilado.

[078] Em algumas modalidades, o grupo amino N- terminal do peptídeo anfifílico e todos os grupos amino de cadeia lateral no segmento de peptidil hidrofílico do peptídeo anfifílico são conjugados com um grupo de proteção de nitrogênio ou amino. Em algumas modalidades, o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico e todos os grupos amino de cadeia lateral no segmento de peptidil hidrofílico do peptídeo anfifílico são acetilados.

[079] Sem “pretender ficar limitado por uma presença de teoria de um grupo de poteção de nitrogênio ou amino no peptídeo anfifílico para modular a hidrofilicidade do peptídeo anfifílico. Assim, a natureza anfifílica do peptídeo anfifílico pode ser ajustada variando o número de grupos de poteção de nitrogênio ou amino no peptídeo anfifílico.

[080] O peptídeo anfifílico pode ter uma sequência de amincácido de qualquer comprimento. Em algumas modalidades, o peptídeo anfifílico pode ter um comprimento de cerca de 5 a cerca de 25 resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade, o peptídeo anfifílico tem um comprimento de cerca de 10 resíduos de aminoácidos.

Segmento de peptidil hidrofóbico

[081] Tal como aqui utilizado, o termo "segmento de peptidil hidrofóbico" refere-se a um segmento de peptidila possuindo um teor relativamente elevado de aminoácido hidrofóbico. Por exemplo, um segmento de peptidil hidrofóbico refere-se a um segmento de peptidila, em que pelo menos cerca de 50% ou mais (incluindo, pelo menos, cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou mais) dos resíduos de aminoácido são resíduos de aminoácido hidrofóbico. Em uma modalidade, um segmento de peptidil hidrofóbico é um segmento de peptidila, em que todos os aminoácidos são aminoácidos hidrofóbicos.

[082] Assim, em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofóbico compreende a sequência de aminoácido (AALNL-AAL2),- (AAU)a, em que AAUXL, AA? e AA são independentemente selecionados de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos para cada ocorrência, b é um número inteiro de 1 a 20, e d é O ou 1, desde que AANU e AAV têm à configuração oposta (isto é, D e L) e A” e AU têm à configuração oposta. Por exemplo, se os aminoácidos representados por AAU têm a configuração D, em seguida, os aminoácidos representados por AA” têm a configuração L e AA“, se presente, tem a configuração D. Alternativamente, se os aminoácidos representados por AAU têm à configuração L, em seguida, os aminoácidos representados por AA”? têm a configuração D e AA”?, se presente, tem a configuração L.

[083] Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofóbico compreende uma sequência de 2 a 10 aminoácidos D e L alternados selecionados a partir do grupo que consiste em alanina, valina, isoleucina, leucina (Leu), fenilalanina, tirosina, triptofano (Trp) e quaisquer combinações dos mesmos.

[084] Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido hidrofóbico" refere-se a um amincácido que exibe uma hidrofobicidade superior a zero de acordo com a escala de hidrofobicidade de consenso normalizada de Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142 (1984). Aminoácidos hidrofóbicos exemplares incluem, mas não limitados a, Ala, Val, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp, Pro, Met, Gly e derivados dos mesmos.

[085] Em algumas modalidades, um aminoácido hidrofóbico é um aminoácido aromático. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido aromático" refere-se a um aminoácido hidrofóbico com uma cadeia lateral que tem pelo menos um anel aromático ou heteroaromático. O anel aromático ou heteroaromático pode conter um ou mais substituintes tais como, -OH, -SH, -CN, -F, -CI, -Br, -L, - NO2, -NO, -NHo, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(0)OH, -C(O)JOR, - C(O)NHo, -C(O)NHR, -C(O)NRR e similares, onde cada R é independentemente (C1-C6) alquila, (C2-C6)alquila substituída, (C2-C6) alquenila, (C2-C6) alquenila substituída, (C2-C6)alquinila, (C2-C6)alquinila substituída, (C5-C20)arila, (C5-C20)arila substituída, (C6- C26)alcarila, (C6-C26) alcarila substituída, (C6- C26)alcarilo, heteroarila de 5-20 membros, heteroarila de 5-20 membros substituídos, alqg-heteroarila de 6-26 membros ou alqg-heteroarila de 6-26 membros substituídos. Aminoácidos aromáticos exemplares incluem, mas não limitados a, Phe, Tyr e Trp.

[086] Em algumas modalidades, um aminoácido hidrofóbico é um aminoácido alifático. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido alifático" refere-se a um aminoácido —“hidrofóbico com uma cadeia lateral de —hidrocarboneto alifático. Aminoácidos alifáticos exemplares incluem, mas não limitados a, Ala, Val, Leu e Ile.

[087] Em algumas modalidades, um aminoácido hidrofóbico é um aminoácido não-polar. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido não-polar" refere-se a um aminoácido hidrofóbico com uma cadeia lateral que é sem carga a um pH fisiológico e que tem ligações em que o par de elétrons compartilhado em comum pelos dois átomos é geralmente igualmente mantido por cada um dos dois átomos (isto é, a cadeia lateral não é polar). Aminoácidos não- polares exemplares incluem, mas não limitados a, Leu, Val, Tle, Met, Gly e Ala.

[088] Como será apreciado por aqueles versados na técnica, as categorias de amincácidos aqui descritas não são mutuamente exclusivas. Assim, os aminoácidos que têm cadeias laterais que exibem duas ou mais propriedades físico-químicas podem ser incluídos em várias categorias. Por exemplo, as cadeias laterais de aminoácidos que têm porções aromáticas que são ainda substituídas com substituintes polares, tais como Tyr, podem exibir ambas as propriedades hidrofóbicas aromáticas e propriedades hidrofílicas ou polares, e podem, por conseguinte, ser incluídas em ambas as categorias aromáticas e polares. A categorização apropriada de qualquer aminoácido será evidente para os versados na técnica, especialmente à luz da descrição detalhada aqui fornecida.

[089] Em algumas modalidades, para cada ocorrência AAU, AA e AAV são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em Pro, Ile, Phe, Val, Leu, Trp, Met, Ala, Gly, Tyr, e quaisquer combinações dos mesmos.

[090] Sem limitação, todos os AA!!! e AALI2 podem ser os mesmos, todos diferentes, ou quaisquer combinações dos mesmos e diferentes. Por conseguinte, em algumas modalidades, todos de AA! são iguais. Em algumas modalidades, todos de aAAW” são iguais. Em algumas modalidades, todos AA! são iguais, todos de AAW são iguais, e AA! é diferente de AA,

[091] Em algumas modalidades, o pelo menos um de AAV, AA! e AAºV não é Tyr ou Leu.

[092] Em algumas modalidades, o pelo menos um AAU não é Tyr.

[093] Em algumas modalidades, o pelo menos um de ANAM? não é Leu.

[094] Em algumas modalidades, AA!U não é Tyr ou Leu.

[095] Em algumas modalidades, AA! é Tyr.

[096] Em algumas modalidades, AA“? é Leu,

[097] Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofóbico compreende uma sequência de aminoácido (Trp-Leu)n-(Trp)n Ou (Leu-Trp)p-(Leu)g, em que m e p são —independentemente um número inteiro de 3 a 20, ene q são independentemente O ou 1. Cada Trp pode ser D-Trp ou L-Trp, e cada Leu pode ser D-Leu ou L-Leu. Quando Trp é D-Trp, em seguida, Leu é L-Leu, e quando Trp é L-Trp, em seguida, Leu é D-Leu. Do mesmo modo, quando Leu é L-Leu, em seguida, Trp é D-Trp, e quando Leu é D-Leu, em seguida, Trp é L-Trp.

[098] Em algumas modalidade, m e Pp são independentemente um número inteiro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15. Em algumas modalidades, m e p são independentemente um número inteiro de 1 a 5 (por exemplo, um número inteiro de 1, 2, 3, 4, ou 5). Em algumas modalidades, m ou p representa um número inteiro de 1, 2, ou 3. Em uma modalidade, m ou p representa um número inteiro de 3.

[099] Em uma modalidade, Oo segmento de peptidil hidrofóbico compreende uma sequência de aminoácido ((L- Trp) - (D-Leu) )3- (L-Trp) .

Segmento de peptidil hidrofílico

[100] Conforme aqui utilizado, o termo "segmento de peptidil hidrofílico" refere-se a um segmento "de peptidila possuindo propriedades de hidrofilicidade relativas a uma porção de hidrocarboneto. Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofílico refere-se a um segmento de peptidila possuindo propriedades de hidrofilicidade relativas ao segmento de peptidil hidrofóbico de um peptídeo anfifílico aqui descrito. Em geral, o segmento de peptidil hidrofílico compreende pelo menos um aminoácido hidrofílico. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido hidrofílico" refere-se a um resíduo de aminoácido que exibe uma hidrofobicidade menor que zero de acordo com a escala de hidrofobicidade de consenso normalizada de Eisenberg et al., J. Mol. Biol. 179:125-142 (1984), o conteúdo do qual é aqui incorporado por referência. Aminoácidos hidrofílicos exemplares incluem, mas não limitados a, Lys, Arg, His, ASp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, e derivados dos mesmos.

[101] Em algumas modalidades, o aminoácido hidrofílico é um amincácido com carga ou sem carga. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido com carga" refere- se a um resíduo de aminoácido que tem uma carga líquida.

Por conseguinte, um aminoácido carregado pode ser um aminoácido catiônico ou um aminoácido aniônico. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido sem carga" refere-se a um resíduo de amincácido que não possui carga líquida. Um resíduo de aminoácido com carga pode ser modificado para um amincácido sem carga por mascarar a carga do aminoácido,

por exemplo, através da conjugação de um grupo de protecção a um átomo de transporte de carga. Em uma modalidade, um resíduo de aminoácido com carga pode ser modificado para um aminoácido sem carga por acetilação.

[102] Em algumas modalidades, o aminoácido hidrofílico é um aminoácido polar. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido polar" refere-se a um aminoácido hidrofílico tendo uma cadeia lateral que está carregada ou sem carga a pH fisiológico, mas o qual tem pelo menos uma ligação em que o par de elétrons compartilhado em comum pelos dois átomos é mantido mais intimamente por um dos átomos. Aminoácidos polares exemplares incluem, mas não limitados a, Asn, Gln, Ser, Tre, e quaisquer combinações dos mesmos.

[103] Em algumas modalidades, o aminoácido hidrofílico é um aminoácido polar com carga ou sem carga.

[104] Em algumas modalidades, o aminoácido hidrofílico é um aminoácido catiônico. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido catiônico" refere-se a um resíduo de aminoácido que compreende uma cadeia lateral de carga positiva em condições fisiológicas normais. Assim, o termo "aminoácido catiônico" inclui qualquer aminoácido de ocorrência natural ou mimética, por conseguinte, tendo uma cadeia lateral carregada positivamente em condições fisiológicas normais. Geralmente, os resíduos de aminoácidos que compreendem um grupo amino na sua cadeia lateral variável são considerados como . aminoácidos catiônicos. Aminoácidos catiônicos exemplares incluem, mas não limitados a, lisina, histidina, arginina, hidroxilisina, ornitina, e os respectivos derivados, análogos, e configurações estereoisoméricas dos mesmos.

[105] Em alguns casos, o aminoácido hidrofílico é um aminoácido aniônico. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido aniônico" refere-se a um aminoácido hidrofílico tendo uma carga negativa. Aminoácidos aniônicos exemplares incluem, mas não limitados a, Glu, Asp, e derivados dos mesmos.

[106] Em algumas modalidades, o aminoácido hidrofílico é um aminoácido acídico. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido acídico" refere-se a um aminoácido hidrofílico com um valor PK de cadeia lateral de menos de 7. Aminoácidos acídicos têm, tipicamente, cadeias laterais com carga negativa a pH fisiológico, devido à perda de um íon de hidrogênio. Amincácidos acídicos exemplares incluem, mas não limitados a, Glu, Asp, e os derivados dos mesmos.

[107] Em alguns casos, o aminoácido hidrofílico é um aminoácido básico. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido básico" refere-se a um aminoácido hidrofílico com um valor pK de cadeia lateral de mais de 7. Aminoácidos básicos normalmente têm cadeias laterais com carga positiva em pH fisiológico, devido à associação com o íon de hidrônio. Aminoácidos básicos exemplares incluem, mas não limitados a, His, Arg, Lys, e os derivados dos mesmos.

[108] Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofílico compreende pelo menos um aminoácido com carga, ou pelo menos um aminoácido polar sem carga, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofílico compreende pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em Lys, Arg, His, Asp e Glu, ou pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em Ser, Thr, Asn, e Gln, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofílico pode compreender um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em Lys, Arg, e His.

[109] Em algumas modalidades, o pelo menos um grupo amino no segmento de peptidil hidrofílico é mascarado ou conjugado com um grupo de proteção amino ou nitrogênio.

[110] Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofílico compreende a sequência de aminoácido (AA?!) £, em que AA?! é um aminoácido hidrofílico selecionado independentemente para cada Ocorrência e f é um número inteiro de 1 a 21.

[111] Sem limitações, todos AAZ podem ser os mesmos, todos diferentes, ou qualquer combinação dos mesmos e diferentes.

[112] Em algumas modalidades, £f é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, Ou 15.

[113] Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de aminoácido (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a 15. Em algumas modalidades, r é um número inteiro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15. Em algumas modalidades, r é um número inteiro de 2 a 5 (por exemplo, r é um número inteiro de 2, 3, 4, ou 5). Em uma modalidade, r é um número inteiro de 3.

[114] Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de amincácido selecionada a partir do grupo que consiste em (L-Lys) - (L- Lys) - (L-Lys), (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Lys(AC)), (L-Lys) - (L- Lys(Ac))-(L-Lys), (L-Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys), (L-Lys)-(L- Lys (AC) ) - (L-Lys(AC)), (L-Lys(AC))-(L-Lys)-(L-Lys(Ac)), (L- Lys (Ac) ) - (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys), L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))-(L-Lys (Ac)), e quaisquer combinações dos mesmos, em que "Ac" refere-se a acetilação do resíduo de aminoácido Lys.

[115] Em algumas modalidades, o segmento de peptídeo hidrofílico inclui ou é um polímero hidrofílico. Tal como aqui utilizado, o termo "polímero hidrofílico" refere-se a um polímero com propriedades de hidrofilicidade relativas a uma porção de hidrocarboneto. Em algumas modalidades, o termo "polímero hidrofílico" refere-se a um polímero com propriedades de hidrofilicidade relativas ao segmento de peptidil hidrofóbico de um peptídeo anfifílico aqui descrito. A hidrofilicidade de um polímero pode ser determinada por, por exemplo, o teste de ASTM D570. Geralmente, os polímeros hidrofílicos são solúveis em água. Polímeros — hidrofílicos exemplares incluem, mas não limitados a, poli(etileno glicol), poli(óxido de etileno), poli(propileno glicol), poli(óxido de etileno-óxido de co- propileno), ácido hialurônico, poli(metacrilato de 2- hidroxietil), heparina, polivinil(pirrolidona), sulfato de condroitan, quitosano, glucosaminoglucans, dextrano, dextrina, sulfato de dextrano, acetato de celulose, carboximetil celulose, hidroxietil celulose, celulósicos, poli (trimetileno glicol), poli (tetrametileno glicol), polipeptídeos, poliacrilamida, poliacrilimida, poli(etileno amina), poli(alil amina) e misturas dos mesmos.

Modificações de peptídeo exemplares

[116] Em algumas modalidades, um peptídeo anfifílico aqui descrito pode compreender pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, Ou mais) aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em alanina; argnina; asparagina; ácido aspártico; cisteína; ácido glutâmico; glutamina; glicina;

histidina; isoleucina; leucina; lisina; metionina; fenilalanina; prolina; serina; treonina; triptofano; tirosina; valina; homocisteína; fosfoserina; fosfotreonina; fosfotirosina; hidroxiprolina; vy-carboxiglutamato; ácido hipúrico; ácido octahidroindol-2-carboxílico; estatina; ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-3-carboxílico; penicilamina (3-mercapto-D-valina); ornitina (Orn) ; citrulina; alfa-metil-alanina; para-benzoilfenilalanina; para-aminofenilalanina; p-fluorofenilalanina; fenilglicina;

propargilglicina; N-metilglicins (sarcosina, SAR); e terc- butilglicina; ácido diaminobutírico; ácido 7T-hidróxi- tetrahidroisoquinolina carboxílico; naftilalanina; bifenilalanina; ciclohexilalanina; ácido amino-isobutírico (Aib); norvalina; norleucina (Nle); terc-leucina; ácido tetrahidroisoquinolina carboxílico; ácido — pipecólico; fenilglicina; homofenilalanina; ciclohexilglicina; dehidroleucina; 2,2-dietilglicina; ácido 1-amino-1- ciclopentanocarboxílico; ácido 1-amino-1- ciclohexanocarboxílico; ácido amino-benzóico; ácido amino-

naftóico; ácido gama-aminobutírico; difluorofenilalanina; ácido nipecótico; ácido N-a-imidazol acético (IMA); tienil- alanina; t-butilglicina; desamino-Tyr; ácido aminovalérico (Ava) ; ácido piroglutamínico (<GluU); ácido a- aminoisobutírico (aAib); ácido y-aminobutírico (vyAbu);

ácido a-aminobutírico (aAbu) ; ácido ay-

aminobutírico(ayAbu); 3-piridilalanina (Pal); isopropil-a- Nºlisina (ILys); naptilalanina (Nal); a-naptilalanina (o- Nal); f-naptilalanina (B-Nal); Acetil-fB-naptilalanina (Ac- B-naptilalanina); a-fB-naptilalanina; Ni-picoloil-lisina (PicLys); 4-halo-fenila; 4-pirrolidilalanina; ácido carboxílico isonipecótico (inip); beta-aminoácidos; e isômeros, análogos e derivados dos mesmos. Um versado na técnica saberia que esta definição inclui aminoácidos D e L; aminoácidos alfa, beta e gama; aminoácidos quimicamente modificados; aminoácidos não-proteogênicos de ocorrência natural; aminoácidos raros; e compostos quimicamente sintetizados que possuem propriedades conhecidas na técnica por serem características de um aminoácido. Além disso, cada modalidade pode incluir qualquer combinação dos grupos.

[117] Além disso, tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido" inclui um composto ou molécula que se afasta a partir da estrutura dos aminoácidos de ocorrência natural, mas que tem substancialmente a estrutura de um aminoácido, de tal forma que os mesmos podem ser utilizados para a substituição dos aminoácidos de ocorrência natural dentro de um peptídeo, após O que a atividade de peptídeo, por exemplo, a atividade de formação de agregados, ainda é mantida. Assim, por exemplo, em algumas modalidades de aminoácidos podem também incluir os aminoácidos de modificações ou substituições de cadeia lateral, e também incluem ácidos orgânicos relacionados, amidas ou similares. Sem limitação, um aminoácido pode ser um aminoácido proteogênico ou não-proteogênico. Tal como aqui utilizado, o termo "proteogênico" indica que O aminoácido pode ser incorporado em uma proteína em uma célula através de vias metabólicas bem conhecidas.

[118] Em algumas modalidades, um peptídeo anfifílico compreende pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, Ou mais) quimicamente modificado de aminoácidos. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido quimicamente modificado" refere-se a um aminoácido que tenha sido tratado com um ou mais reagentes. Um aminoácido quimicamente modificado pode estar presente em qualquer posição no peptídeo anfifílico. Quando mais do que um aminoácido quimicamente modificado está presente, os mesmos podem ser posicionados ao lado ou não ao lado uns dos outros. Quando três ou mais aminoácidos quimicamente “modificados estão presentes alguns dos aminoácidos quimicamente modificados podem estar presentes ao lado uns dos outros, enquanto alguns dos aminoácidos quimicamente modificados não estão ao lado do outro aminoácido quimicamente modificado.

[119] Em algumas modalidades, oO segmento de peptidil hidrofílico compreende um aminoácido quimicamente modificado. Sem limitações, o aminoácido quimicamente modificado pode estar presente em qualquer posição do segmento de peptidil hidrofílico, por exemplo, a leitura a partir de N-terminal, na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 0e assim por diante do segmento de peptidil hidrofílico.

[120] Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofóbico compreende um aminoácido quimicamente modificado. Sem limitações, oO aminoácido quimicamente modificado pode estar presente em qualquer posição do segmento de peptidil hidrofóbico, por exemplo, a leitura a partir de N-terminal, na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e assim por diante do segmento de peptidil hidrofóbico.

[121] Em algumas modalidades, tanto os segmentos de peptidil hidrofílicos e hidrofóbicos podem compreender, pelo menos, um aminoácido quimicamente modificado. Quando ambos os segmentos de peptidil hidrofílicos e hidrofóbicos compreendem um aminoácido quimicamente modificado, o número de tais aminoácidos quimicamente modificados presentes em cada segmento pode ser o mesmo ou diferente.

[122] Em algumas modalidades, o peptídeo anfifílico compreende pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Ou mais) beta-aminoácido. Quando mais do que um dos beta-aminoácidos estão presentes, os mesmos podem ser posicionados ao lado ou não uns dos outros. Quando três ou mais beta-amincácidos estão presentes alguns dos beta-aminoácido podem estar presentes ao lado do outro beta-aminoácido, enquanto alguns dos beta-amincácido não estão ao lado de outro beta-aminoácido.

[123] Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofílico compreende um beta-amincácido. Sem limitações, o beta-aminoácido pode estar presente em qualquer posição do segmento de peptidil hidrofílico, por exemplo, a leitura a partir de N-terminal, na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e assim por diante do segmento de peptidil hidrofílico.

[124] Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofóbico compreende um beta-amincácido. Sem limitações, o beta-amincácido pode estar presente em qualquer posição do segmento de peptidil hidrofóbico, por exemplo, a leitura a partir de N-terminal, na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e assim por diante do segmento de peptidil hidrofóbico.

[125] Em algumas modalidades, ambos os segmentos de peptidil hidrofílicos e hidrofóbicos podem compreender pelo menos um beta-amincácido. Quando ambos os segmentos de peptidil hidrofílicos e hidrofóbicos compreendem um beta- amincácido, o número de tais beta-amincácidos em cada segmento pode ser o mesmo ou diferente.

[126] Os beta-aminoácidos exemplares incluem, mas não limitados a, cloridrato de L-B-homoprolina; ácido (+)-

3- (Boc-amino) -4- (4-bifenilil)-butírico; ácido (+)-3-(Fmoc- amino) -2-fenilpropiônico; ácido (18, 3R) - (+) -3- (Boc- amino) ciclopentanocarboxílico; ácido (2R, 3R) -3- (Boc- amino) -2-hidróxi-4-fenilbutírico; ácido (28, 3R)-3-(Boc-

amino)-2-4-fenilbutírico; ácido (R)-2-[(Boc-amino)metil]-3- fenilpropiônico; ácido (R)-3-(Boc-amino) -2-metilpropiônico; ácido (R)-3-(Boc-amino)-2-fenilpropiônico; ácido (R)-3- (Boc-amino) -4- (2-naftil)butírico; ácido (R)-3-(Boc-amino)- 5-fenilpentanóico; ácido (R)-3-(Fmoc-amino)-4-(2-naftil)-

butírico; ácido (R)-(-)-pirrolidina-3-carboxílico; (R)- Boc-3 , 4-dimetóxi-B-Phe-OH; (R) -Boc-3- (3-piridil)-g-Ala-

OH; (R)-Boc-3-(trifluorometil)-g-Phe-OH; (R)-Boc-3-ciano- B-Phe-OH; (R) -Boc-3-metóxi-B-Phe-OH; (R) -Boc-3-metil-fB- Phe-OH; (R) -Boc-4- (4-piridil)-fg-Homoala-OH; (R) -Boc-4-

(trifluorometil)-g-Homofe-OH; (R)-Boc-4- (trifluorometil)-g- Phe-OH; (R) -Boc-4-bromo-B-Phe-OH; (R) -Boc-4-cloro-B- Homofe-OH; (R) -Boc-4-cloro-B-Phe-OH; (R) -Boc-4-ciano-fB- Homofe-OH; (R) -Boc-4-ciano-B-Phe-OH; (R) -Boc-4-flúor-B- Phe-OH; (R) -Boc-4-metói-B-Phe-OH; (R) -Boc-4-metil-fB-Phe-

OH; (R)-Boc-B-Tyr-OH; (R)-Fmoc-4-(3-piridil)-g-Homoala-OH; (R) -Fmoc-4-flúor-fB-Homofe-OH; ácido (S)-(+)-pirrolidina-3- carboxílico; ácido (S) -3- (Boc-amino) -2-metilpropiônico; ácido (S)-3-(Boc-amino)-4-(2-naftil)-butírico; ácido (S)-3- (Boc-amino) -5-fenilpentanóico; ácido (S)-3-(Fmoc-amino)-2-

metilpropiônico; ácido (S) -3- (Fnoc-amino) -4- (2-

naftil)butírico; ácido (S) -3- (Fnoc-amino) -5-hexenóico; ácido (S)-3-(Fmoc-amino)-5-fenil-pentanóico; ácido (S)-3- (Fmoc-amino) -6-fenil-5-hexenóico; ácido (S) -Boc-2- (trifluorometil)-B-Homofe-OH; (S) -Boc-2- (trifluorometil)-g- Homofe-OH; (S)-Boc-2-(trifluorometil)-B-Phe-OH; (S)-Boc-2- ciano-fB-Homofe-OH; (S)-Boc-2-metil-fB-Phe-OH; (S) -Boc-3,4- dimetóxi-gB-Phe-OH; (S) -Boc-3- (trifluorometil) -B-Homofe-OH; (S) -Boc-3- (trifluorometil)-B-Phe-OH; (S) -Boc-3-metóxi-B- Phe-OH; (S)-Boc-3-metil-B-Phe-OH; (S) -Boc-4- (4-piridil)-g- Homoala-OH; (S)-Boc-4-(trifluorometil)-fg-Phe-OH; (S) -Boc- 4-bromo-B-Phe-OH; (S)-Boc-4-cloro-B-Homofe-OH; (S)-Boc-4- cloro-B-Phe-OH; (S) -Boc-4-ciano-B-Homofe-OH; (S) -Boc-4- ciano-B-Phe-OH; (S)-Boc-4-flúor-B-Phe-OH; (S)-Boc-4-iodo- B-Homofe-OH; (S)-Boc-4-metil-B-Homofe-OH; (S)-Boc-4-metil- B-Phe-OH; (S)-Boc-B-Tyr-OH; (S) -Boc-y,y-difenil-g-Homoala- OH; (S)-Fmoc-2-metil-g-Homofe-OH; (S) -Fmoc-3,4-diflúor-g- Homofe-OH; (S) -Fmnoc-3- (trifluorometil) -g-Homofe-OH; (S)- Fmoc-3-ciano-B-Homofe-OH; (S) -Fmnoc-3-metil-B-Homofe-OH; (S) -Fmoc-y, y-difenil-g-Homoala-OH; ácido 2- (Boc- aminometil)fenilacético; ácido 3-amino-3-(3- bromofenil)propriônico; ácido 3-Amino-4,4,4- trifluorobutírico; ácido 3-aminobutanóico; ácido DL-3- Aminoisobutírico; ácido DL-B-aminoisobutírico puríssimo; DL-fB-homoleucina; DL-fg-Homometionina; DL-f- homofenilalanina; DL-fB-Leucina; DL-fB-fenilalanina;

cloridrato de L-B-homoalanina; cloridrato de ácido L-f- Homoglutâmico; cloridrato de L-B-homoglutamina; cloridrato de L-B-homohidroxiprolina; cloridrato de L-b- Homoisoleucina; cloridrato de L-B-homoleucina; dicloridrato de L-fB-homolisina; cloridrato de L-B-Homometionina; cloridrato de éster de alil L-fB-homofenilalanina; cloridrato de L-g-homofenilalanina; L-B-Homosserina; L-bp- Homotreonina; cloridrato de L-B-homotriptofano; cloridrato de L-f-homotirosina; cloridrato de L-B-Leucina; Boc-D-f-

Leu-OH; Boc-D-B-Phe-OH; Boc-B?-Homopro-OH; Boc-fB-Glu(OBzl)- OH; Boc-B-Homoarg(Tos)-OH; Boc-B-Homoglu(OBzl)-OH; sal de Boc-B-Homohyp (Bzl) -OH (diciclohexilamônio) técnico; Boc-f- Homolys(Z)-OH; Boc-f-Homoser(Bzl)-OH; Boc-B-Homothr(Bz1l)-

OH; Boc-B-Homotyr(Bzl)-OH; Boc-fB-Ala-OH; Boc-fB-Gln-OH; Boc-

B-Homoala-OAll; Boc-fB-Homoala-OH; Boc-B-Homogln-OH; Boc-B- Homoile-OH; Boc-fB-Homoleu-OH; Boc-fB-Homomet -OH; Boc-B- Homofe-OH; Boc-B-Homotrp-OH; Boc-B-Homotrp-OMe; Boc-fB-Leu- OH; sal de Boc-fB-Lys(Z)-OH (diciclohexilamônio); Boc-B- Phe-OH; Etil 3- (benzilamino)propionato; Fmoc-D-B-Homofe-OH;

Fmoc-L-Bi-homoprolina; Fmoc-B-D-Phe-OH; Fmoc-B-Gln(Trt)-OH; Fmoc-fB-Glu(OtBu) -OH; Fmoc-B-Homoarg (Pmc) -OH; Fmoc-fB- Homogln(Trt)-OH; Fmoc-B-Homoglu(OtBu) -OH; Fmoc-fbB- Homohyp (tBu) -OH, Fmoc-gB-Homolys (Boc) -OH; Fmoc-f- Homoser (tBu) -OH; Fmoc-B-Homothr (tBu) -OH; Fmoc-fb-

Homotyr(tBu)-OH; Fmoc-B-Ala-OH; Fmoc-B-Gln-OH; Fmoc-bg-

Homoala-OH; Fmoc-fB-Homogln-OH; Fmoc-fg-Homoíla-OH; Fmoc-B- Homoleu-OH; Fmoc-fB-Homomet-OH; Fmoc-fB-Homofe-OH; Fmoc-fg- Homotrp-OH; Fmoc-B-Leu-OH; Fmoc-fB-Phe-OH; N-acetil-DL-f- fenilalanina; Z-D-B-Dab(Boc)-OH; Z-D-B-Dab(Fmoc)-OH purum; Z-DL-B-homoalanina; Z-B-D-Homoala-OH; Z-B-Glu (OtBu) -OH técnico; Z-B-Homotrp(Boc)-OH; Z-B-Ala-OH purum; Z-B-Ala-ONp purum; Z-fB-Dab(Boc)-OH; Z-B-Dab(Fmoc)-OH; Z-B-Homoala-OH; B-alanina; B-alanina BioXtra; cloridrato de éster etílico de BfB-alanina; cloridrato de metil éster de p-alanina; cloridrato de ácido B-glutâmico; cloridrato de ácido cis-2- amino-3-ciclopenteno-l-carboxílico; ácido cis-3- (Boc-amino) ciclohexanocarboxílico; e ácido cis-3- (Fmoc- amino) ciclohexanocarboxílico.

[127] Em algumas modalidades, um peptídeo anfifílico aqui descrito pode compreender pelo menos uma (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais) ligação amida modificada, por exemplo, uma ligação amida na estrutura principal substituída por uma ligação selecionada dentre o grupo que consiste em ligação de peptídeo psi reduzida, uréia, tiouréia, carbamato, sulfonil uréia, trifluoroetilamina, ácido orto- (aminoalquil)-fenilacético, ácido para- (aninoalquil)- fenilacético, ácido meta- (aminoalquil)-fenilacético, tioamida, tetrazol, éster borônico, e um grupo olefínico. A ligação de substituição de amida pode estar presente em qualquer posição no peptídeo anfifílico. Quando duas ou mais ligações de substituição de amida estão presentes, as mesmas podem ser posicionadas ao lado (por exemplo, em ambos os lados de um determinado aminoácido) ou não ao lado da outra (por exemplo, apenas um dos lados de um determinado aminoácido está ligado por meio de uma ligação de substituição de peptídeo para o próximo aminoácido).

[128] Em algumas modalidades, a ligação de substituição de amida está presente no segmento de peptidil hidrofílico. Sem limitações, a ligação de substituição de amida pode estar presente em qualquer posição do segmento de peptidil hidrofílico, por exemplo, a leitura a partir de N-terminal, na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e assim por diante do segmento de peptidil hidrofílico.

[129] Em algumas modalidades, a ligação de substituição de amida está presente no segmento de peptidil hidrofóbico. Sem limitações, a ligação de substituição de amida pode estar presente em qualquer posição do segmento de peptidil hidrofóbico, por exemplo, a leitura a partir de N-terminal, na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e assim por diante do segmento de peptidil hidrofóbico.

[130] Em algumas modalidades, ambos os segmentos de peptidil hidrofílicos e hidrofóbicos podem compreender, cada um, a pelo menos uma ligação de substituição de amida.

Quando ambos os segmentos de peptidil hidrofílicos e hidrofóbicos compreendem uma ligação de substituição de amida, o número de tais ligações de substituição de amida em cada segmento pode ser o mesmo ou diferente.

[131] O C-terminal de um peptídeo anfifílico aqui descrito pode ser não-modificado ou modificado por conjugação de um grupo de proteção carboxila ou um grupo amida. Os grupos de proteção carboxila exemplares incluem, mas não limitados a, ésteres, tais como metila, etila, t- butila, metoximetila, 2,2,2-tricloroetila e 2-haloetila; ésteres de benzila, tais como, trifenilmetila, difenilmetila, p- bromobenzila, o-nitrobenzila e Similares; ésteres de silila, tais como, trimetilsilila, trietilsilila, t- butildimetilsilila e similares; amidas; e hidrazidas. Outros grupos de proteção de ácido carboxílico podem incluir opcionalmente alfa-aminoácidos protegidos, os quais são ligados com a porção amino de alfa-amincácidos.

Em algumas modalidades, o C-terminal de um peptídeo anfifílico é conjugado com NH;, NH-alquila, ou N(alquila)z.

Ligação entre segmentos hidrofílicos e hidrofóbicos

[132] Sem limitações, o segmento de peptidil hidrofílico pode estar ligado quer ao N-terminal ou o C- terminal do segmento de peptidil hidrofóbico. Deste modo, um peptídeo anfifílico pode ser (segmento de peptidil hidrofílico) -ligante- (segmento de peptidil hidrofóbico) ou (segmento de peptidil hidrofóbico) - ligante- (segmento de peptidil hidrofílico). Em uma modalidade, o segmento de peptidil hidrofílico está ligado ao N-terminal do segmento de peptidil hidrofóbico. Dito de outra forma, em uma modalidade, o segmento de peptidil hidrofóbico está ligado ao C-terminal do segmento de peptidil hidrofílico. A ligação entre os segmentos de peptidil hidrofílicos e hidrofóbicos pode ser uma ligação amida, uma ligação de substituição de amida, ou um ligante, tal como aqui definido.

[133] Em algumas modalidades, a ligação entre os segmentos de peptidil hidrofílicos e hidrofóbicos é uma ligação amida (por exemplo, -NHC(0)-) ou uma ligação de Substituição de amida.

[134] Em algumas modalidades, a ligação entre os segmentos de peptidil hidrofílicos e hidrofóbicos inclui um aminoácido, dois aminoácidos, ou um peptídeo que compreende de 3 a 15 aminoácidos. É para ser compreendido que, quando os segmentos de peptidil hidrofílicos e hidrofóbicos estão ligados por uma cadeia de aminoácidos, o ligante pode compreender uma ou mais das modificações de peptídeo aqui descritas, por exemplo, ligação de substituição de amida, ácidos beta-aminoácidos, D-amincácidos ácidos, aminoácidos quimicamente modificados, etc.

Peptídeos anfifílicos exemplares e usos dos mesmos

[135] Em algumas modalidades, um peptídeo anfifílico compreende uma sequência de amincácido (L- AR?) 1 ((L-AAH) - (D-AAI) ).-(L-AAH), em que AN é um resíduo de Lys ou uma substituição do mesmo; AA!!! e AAÚU são, cada um, independentemente, um resíduo de Trp ou uma substituição do mesmo, AA”? é um resíduo de Leu ou uma substituição do mesmo, e em que f£f' é um número inteiro a partir de 3-21 e b' é um número inteiro a partir de 3-20, e em que pelo menos um do grupo amino N-terminal ou um grupo amino de cadeia lateral de pelo menos um resíduo AN! é conjugado com um grupo de proteção de nitrogênio ou amino.

[136] O termo "substituição" quando se refere a um peptídeo, refere-se a uma mudança em um aminoácido por uma entidade diferente, por exemplo, outra porção de aminoácidos ou aminoácido. As substituições podem ser substituições conservadoras ou não-conservadoras. Em algumas modalidades, a substituição é uma substituição conservadora. Tal como aqui utilizado, o termo "substituição conservadora" refere-se a uma substituição de aminoácido em que o resíduo de aminoácido substituído é de carga similar, e/ou hidrofobicidade similar, como o resíduo substituído. O resíduo substituído pode ser de tamanho similar como, ou de tamanho menor ou maior do que o resíduo substituído, desde que o resíduo substituído tem propriedades bioquímicas similares às do resíduo substituído. As substituições de aminoácidos conservadoras incluem, mas não são limitadas, as substituições feitas entre os aminoácidos dentro dos seguintes grupos: (i) os pequenos aminoácidos não-polares: alanina (Ala), metionina (Met), isoleucina (Ile), leucina (Leu), e valina (Val); (ii) os pequenos aminoácidos polares: glicina (Gly), serina (Ser), treonina (Thr) e cisteína (Cis); (iii) os aminoácidos de amido: glutamina (Gln) e a asparagina (Asn); (iv) os aminoácidos aromáticos: fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) e triptofano (Trp); (v) os aminoácidos básicos: lisina (Lys), arginina (Arg) e histidina (His); e (vi) os aminoácidos acídicos: ácido de glutamina (Glu) e ácido aspártico (Asp). As substituições que são de carga neutra e que substituem um resíduo com um resíduo menor também podem ser consideradas como "substituições conservadoras", mesmo que os resíduos estejam em grupos diferentes (por exemplo, substituição de fenilalanina com a isoleucina menor). O termo "substituição conservadora" também inclui o uso de aminoácidos miméticos, análogos, variantes, ou aminoácidos não-proteinogênicos ou não- padrão.

A título de exemplo apenas, AdaA ou AdaG pode ser substituído por valina (Val); ácido L-I-tioazolidina-4- carboxílico ou ácido D ou L l-oxazolidina-4-carboxílico (ver, Kauer, Patente U.S.

Nº (4.511.390)) pode ser substituído por prolina; e Aib, f-Ala, ou Acp pode ser substituído por glicina (Gly).

[137] Deste modo, em algumas modalidades, AAZ pode ser um resíduo de Lys, ou uma substituição conservadora do mesmo, por exemplo, Arg ou His. Em uma modalidade, AA? é um resíduo de Lys ou um derivado do mesmo.

[138] Em algumas modalidades, AAU e AAVS podem ser, cada um, independentemente um resíduo de Trp, ou uma substituição conservadora do mesmo, por exemplo, Phe ou Tyr. Em uma modalidade, AAU e AASP são, cada um, independentemente um resíduo de Trp, ou um derivado do mesmo.

[139] Em algumas modalidades, AAY? pode ser um resíduo de Leu, ou uma substituição conservadora do mesmo, por exemplo, Ala, Met, Ile, ou Val. Em uma modalidade, AA? é um resíduo de Leu, ou um derivado do mesmo.

[140] Em algumas modalidades, um peptídeo anfifílico compreende uma sequência de aminoácido (L- Lys) r'- ((L-Trp) - (D-Leu) )n- (L-Trp), em que r' é um inteiro a partir de 3-21 e m' é um número inteiro a partir de 3-20, e em que pelo menos um do grupo amino N-terminal ou um grupo amino de cadeia lateral de pelo menos um resíduo de Lys é conjugado com um grupo de proteção de nitrogênio ou amino.

[141] Em algumas modalidades, rº e m são independentemente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15. Em algumas modalidades, ambos de r' e m' são os mesmos. Em uma modalidade, ambos os r' em' são 3.

[142] Em algumas modalidades, o peptídeo anfifílico compreende a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em: Ac-(L-Lys(Ac))-(L- Lys(Ac))-(L-Lys(AC))-((L-Trp)-(D-Leu));- (L-Trp) -NH2 (também referido como CD3ac aqui, em que a abreviação "ac" ou "Ac" refere-se a acetilação de qualquer grupo amino N-terminal de um peptídeo anfifílico ou um grupo amino de um resíduo de Lys no segmento de peptidil hidrofílico); Ac- (L-Lys) -(L- Lys)-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3- (L-Trp) -NHo; (L-Lys) - (L- Lys) - (L-Lys (Ac) ) - ( (L-Trp) - (D-Leu) )3- (L-Trp) -NHa; (L-Lys)- (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys) - ((L-Trp) - (D-Leu) ) 3- (L-Trp) -NHo; (L- Lys (Ac) ) - (L-Lys) - (L-Lys) - ((L-Trp) - (D-Leu) );- (L-Trp) -NHo; (L-Lys) (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys (Ac) ) - ( (L-Trp) - (D-Leu) )3- (L-Trp) - NH; (L-Lys(AC))-(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L- Trp) -NH2; (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys) - ( (L-Trp) - (D- Leu) )3- (L-Trp) -NH>o; (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys (AC) ) - ((L-Trp) - (D-Leu) )3- (L-Trp) -NHo; Ac-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))- (L-Lys (Ac) ) - ((L-Trp) - (D-Leu) ):3- (L-Trp) -NHo; —Ac- (L-Lys) - (L- Lys)-(L-Lys)-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp); (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Lys (Ac) )- ((L-Trp) - (D-Leu) )3- (L-Trp) ; (L-Lys) - (L- Lys (Ac) ) - (L-Lys) - ((L-Trp) - (D-Leu) );- (L-Trp); (L-Lys(Ac))- (L-Lys) - (L-Lys) - ((L-Trp) - (D-Leu) )3- (L-Trp) ; (L-Lys) - (L- Lys (Ac) ) - (L-Lys (Ac) ) - ((L-Trp) - (D-Leu) ) 3- (L-Trp) ; (L- Lys(Ac))-(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp);

(L-Lys (AC) ) - (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys) - ((L-Trp) - (D-Leu) ) ;- (L-Trp); (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys(AC)) -( (L-Trp) - (D-Leu) )3- (L- Trp); Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-((L-Trp)-(D-Leu))3;-(L- Trp) -NHa; Ac- (L-Lys) - (L-Lys (AC) ) - (L-Lys) -( (L-Trp) - (D- Leu))3-(L-Trp)-NH; ACc- (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys) - (L-Lys) - ((L- Trp) - (D-Leu) ) 3- (L-Trp) -NHo; AC- (L-Lys) - (L-Lys (Ac) ) - (L- Lys (Ac) ) - ((L-Trp) - (D-Leu) )3- (L-Trp) -NHo; Ac- (L-Lys (Ac) ) - (L- Lys) - (L-Lys (Ac) ) - ((L-Trp) - (D-Leu) ) 3- (L-Trp) -NHo; ACc- (L- Lys (Ac) ) - (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys) - ((L-Trp) - (D-Leu) ) ;- (L-Trp)- NH; Ac-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys(ACc))-( (L-Trp) - (D-Leu) )3- (L- Trp); Ac-(L-Lys)-(L-Lys(Ac))-(L-Lys)-( (L-Trp) - (D-Leu) ) ;- (L- Trp); Ac-(L-Lys(AC))-(L-Lys)-(L-Lys)-( (L-Trp) - (D-Leu) ) ;- (L- Trp); Ac- (L-Lys) - (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys(AC)) -( (L-Trp) - (D- Leu) )3- (L-Trp); AC- (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys) - (L-Lys (AC) ) - ((L- Trp)-(D-Leu))3-(L-Trp); AcCc-(L-Lys(Ac))-(L-Lys(Ac))- (L-Lys)- ((L-Trp) - (D-Leu) ):- (L-Trp); Ac-(L-Lys(Ac))- (L-Lys (Ac) ) - (L- Lys (Ac) ) - ((L-Trp) - (D-Leu) ) ;- (L-Trp); e quaisquer combinações dos mesmos.

[143] Em algumas modalidades, o segmento de peptidil hidrofílico do peptídeo anfifílico pode ' compreender uma cisteína. Em algumas modalidades, a cisteína pode estar presente no N-terminal do segmento de peptidil hidrofílico.

[144] O inventor descobriu que algumas modalidades dos peptídeos anfifílicos aqui descritos podem ter capacidade de penetração celular.

Assim, em algumas modalidades, os peptídeos anfifílicos aqui descritos podem ser usados como a penetração celular e/ou agentes de transfecção.

Nestas modalidades, os peptídeos anfifílicos podem ser concebidos para serem carregados positivamente.

Por conseguinte, o uso de uma composição que compreende um peptídeo anfifílico carregado positivamente como um agente de penetração celular ou agente de transfecção é aqui proporcionado, em que o peptídeo anfifílico carregado positivamente compreende um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptidil hidrofílico.

O segmento de peptidil hidrofóbico do peptídeo anfifílico carregado “positivamente compreende uma sequência de aminoácido de (Trp-Leu)m-(Trp)n ou (Leu-Trp)p- (Leu), em que cada Trp é D-Trp ou L-Trp, e cada Leu é um D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro a partir de 1 a 5, eneqgsão independentemente 0 ou 1, desde que quando

Trp é D-Trp, em seguida, Leu é L-Leu, e quando Trp é L-Trp,

em seguida, Leu é D-Leu, Ou vice-versa; enquanto que o segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de aminoácido de (Lys)r, em que r é um número inteiro a partir de 1 a 15. Além disso, no peptídeo anfifílico carregado positivamente, o pelo menos um dos resíduos de Lys ou o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico não é acetilado.

Em algumas modalidades, todos dos resíduos de

Lys e o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico carregado positivamente não estão acetilados.

[145] Em algumas modalidades, o peptídeo anfifílico carregado positivamente pode compreender uma sequência de aminoácido de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)- (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) -X, em que X está ausente ou NH.

[146] Em algumas modalidades, a composição pode compreender ainda uma molécula de ácido nucléico ou oligonucleotídeo (por exemploy DNA ou RNA) para ser distribuído a uma célula. Em algumas modalidades, a composição pode ainda compreender uma pluralidade (por exemplo, pelo menos 2 ou mais) de moléculas de ácido nucléico ou oligonucleotídeos (por exemplo, DNA ou RNA, incluindo, mas não limitado a, SiRNA, ShRNA, miRNA). Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucléico ou oligonucleotídeos podem ser concebidas para uso em intervenções terapêuticas, por exemplo, a terapia genética Ou terapia de siRNA. As sínteses de peptídeo

[147] Os peptídeos anfifílicos aqui descritos podem ser sintetizados de acordo com os métodos usuais de solução e química de peptídeo de fase sólida, ou por meio de métodos clássicos conhecidos na técnica. Purificação de peptídeos é bem conhecida na técnica e pode ser, por exemplo, HPLC. Métodos descrevem as sínteses de peptídeo úteis e métodos de purificação podem ser encontrados, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente U.S. Nº 20060084607, o conteúdo da qual é aqui incorporado por referência.

[148] Os peptídeos aqui descritos podem ser sinteticamente construídos por técnicas de polimerização de peptídeos conhecidos adequados, tais como técnicas exclusivamente de fase sólida, técnicas de fase sólida parciais, condensação de fragmento ou ligações de solução clássica. Por exemplo, os peptídeos da invenção podem ser sintetizados pelo método de fase sólida, utilizando métodos padrão com base em ambos os grupos de proteção t- butiloxicarbonila (BOC) ou 9-fluorenilmetoxicarbonila (FMOC). Esta metodologia é descrita por G.B. Fields et al. in Synthetic Peptides: A User's Guide, W.M. Freeman & Company, New York, N.Y., pp. 77-183 (1992) e no livro "Solid-Phase Synthesis", Stewart & Young, Freemen & Company, San Francisco, 1969, e são exemplificados pela descrição da Patente U.S. Nº 4.105.603, concedida em 08 de agosto de 1979. Sínteses em solução clássica estão descritas em detalhe em "Methoden der Organischen Chemic (Houben-Weyl): Synthese von Peptiden", E. Wunsch (editor) (1974) Georg Thieme Verlag, Stuttgart West Germany. O método de condensação de fragmento "de sínteses é exemplificado na Patente U.S. Nº 3.972.859, Outras sínteses disponíveis são exemplificadas na Patente U.S. Nº

3.842.067, Patente U.S. Nº 3.872.925, concedida em 28 de janeiro de 1975, Merrifield B, Protein Science (1996), 5: 1947-1951; The Chemical synthesis of proteins; Mutter M, Int J Pept Protein Res. 1979 Mar, 13 (3): 274-7 Studies on the coupling rates in liquid-phase peptide synthesis using competition experiments; e Solid Phase Peptide Synthesis in the series Methods in Enzymology (Fields, G.B. (1997) Solid-Phase Peptide Synthesis. Academic Press, San Diego +H 9830). Conteúdo de todas as descrições anteriores está aqui incorporado por referência.

[149] Os métodos para a preparação de miméticos de peptídeo incluem a modificação do grupo amino N-terminal, o grupo carboxila C-terminal, e/ou alterando uma ou mais das ligações de amino no peptídeo a uma ligação de não-amino. Duas ou mais de tais modificações podem ser acopladas em um inibidor peptídeo mimético. Modificações de peptídeos para produzir os miméticos de peptídeo são descritas, por exemplo, na Patente U.S. Nº 5.643.873 e Nº 5.654.276, O conteúdo de ambos os quais é aqui incorporado por referência. Peptídeos miméticos

[150] Em algumas modalidades, o peptídeo anfifílico é um peptídeo mimético. Por exemplo, o segmento de peptídeo hidrofílico pode ser peptídeo mimético, o segmento de peptidil hidrofóbico pode ser um peptídeo mimético, ou ambos podem ser peptídeos miméticos.

[151] os métodos de concepção de peptídeos miméticos e triagem de peptídeos miméticos funcionais são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Um método básico de conceber uma molécula que mimetiza uma proteína conhecida ou peptídeo é primeiro para identificar as regiões ativas da proteína conhecida (por exemplo, no caso de uma interação anticorpo-antígeno, uma identifica quais regiões do anticorpo que permitem a ligação ao antígeno), e em seguida, procura um mimético que emula a região ativa. Se a região ativa de uma proteína conhecida é relativamente pequena, é antecipado que um mimético será menor (por exemplo, no peso molecular) do que a proteína, e, correspondentemente mais fácil e mais econômico de sintetizar. Tal mimético pode ser utilizado como um substituto conveniente para a proteína, tal como um agente para a interação com a molécula alvo.

[152] Os métodos para a preparação de peptídeos miméticos incluem a modificação do grupo amino N-terminal, o grupo carboxila C-terminal, e/ou alteram uma ou mais ligações amida no peptídeo para uma ligação amida modificada ou não-amida. Duas ou mais de tais modificações podem ser acopladas em um peptídeo mimético. Modificações de peptídeos para produzir peptídeos miméticos são descritas, por exemplo, na Patente U.S. Nº 5.643.873 e Nº

5.654.276, O conteúdo de ambos os quais é aqui incorporado por referência.

[153] Por exemplo, Reineke et al. (1999, Nature Biotechnology, 17; 271-275, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência) nomeou uma molécula mímica que imita um local de aglutinação da proteína interleucina-10 com uma grande biblioteca de peptídeos sintéticos curtos, cada um dos quais corresponde a uma seção curta de interleucina 10. A aglutinação de cada um desses peptídeos para o alvo (neste caso, um anticorpo contra a interleucina-10) foi, em seguida, testada individualmente por uma técnica de ensaio, para identificar os peptídeos potencialmente relevantes. Bibliotecas de apresentação de fago de peptídeos e método de varrimento de alanina podem ser utilizados.

[154] Outros métodos para a concepção de peptídeos miméticos a um peptídeo ou proteína particular incluem aqueles descritos na Patente Européia EP1206494, O programa SuperMimic por Andrean Goede et. al. 2006 BMC Bioinformatics, 7:11, e programa MIMETIC por W. Campbell et. al., 2002, Microbiology and Immunology 46:211-215. O programa “SuperMimic é concebido para identificar os compostos que imitam as partes de uma proteína, Ou as posições nas proteínas que são adequadas para a inserção de miméticos. O pedido fornece bibliotecas que contêm os blocos de construção peptidomiméticos por um lado e as estruturas de proteína por outro. A procura de ligantes peptidomiméticos promissores para um determinado peptídeo é com base na superposição do peptídeo com vários conforme o mimético. Novos elementos sintéticos ou proteínas podem ser importados e utilizados para a pesquisa. O programa de computador MIMÉTICO, que gera uma série de peptídeos para a interação com uma sequência de peptídeo alvo é ensinado por W. Campbell et. al., 2002. Em discussão profunda do tema é analisado em "Peptide Mimetic Design with the Aid of Computational Chemistry", by James R. Damewood Jr. in Reviews in Computacional Chemistry Reviews in Computational Chemistry, Jan 2007, Volume 9 Book Series: Reviews in Computacional Chemistry, Editor(s): Kenny B. Lipkowitz, Donald B. BoydPrint ISBN: 9780471186397 ISBN: 9780470125861 Publicado por John Wiley & Sons, Inc., and in T. Tselios, et. al., Amino Acids, 14: 333-341, 1998. Conteúdo de todas as referências descritas neste parágrafo é aqui incorporado por referência.

[155] Os métodos para preparar as bibliotecas contendo populações diversas de peptídeos, peptóides e peptidomiméticos são bem conhecidos na técnica e várias bibliotecas estão disponíveis comercialmente (ver, por exemplo, Ecker and Crooke, Biotechnology 13:351-360 (1995), and Blondelle et al., Trends Anal. Chem. 14:83-92 (1995), e as referências aqui citadas, cada uma das quais é aqui incorporada por referência, ver, também, Goodman and Ro, Peptidomimetics for Drug Design, em "Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery" Vol. 1 (ed. M.E. Wolff; John Wiley & Sons, 1995), páginas 803-861, e Gordon et al., 0. Med. Chem. 37:1385-1401 (1994), cada um dos quais é aqui incorporado por referência). Um versado na técnica entende que um peptídeo pode ser produzido in vitro diretamente ou pode ser expresso a partir de um ácido nucléico, o qual pode ser produzido in vitro. Os métodos de peptídeo sintético e a química dos ácidos nucléicos são bem conhecidos na técnica. Conteúdo de todas as referências descritas neste parágrafo é aqui incorporado — por referência.

[156] A biblioteca de moléculas de peptídeo também pode ser produzida, por exemplo, através da construção de uma biblioteca de expressão de cDNA a partir de mRNA recolhido a partir de um tecido de interesse. Os métodos para produzir essas bibliotecas são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et. al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989), que é aqui incorporado por referência). De preferência, um peptídeo codificado pelo cDNA é expresso na superfície de uma célula ou um vírus que contém o cDNA. Ligandos e agentes ativos

[157] Uma ampla variedade de entidades, por exemplo, ligandos, pode ser acoplada a um peptídeo anfifílico aqui descrito ou uma partícula de peptídeo descrito mais tarde. Os ligandos podem incluir moléculas de ocorrência natural, ou moléculas recombinantes ou sintéticas. Em algumas modalidades, um ligando pode alterar a distribuição, a segmentação ou tempo de vida de um peptídeo anfifílico aqui descrito ou uma partícula de peptídeo feita do mesmo. Em algumas modalidades, um ligante pode proporcionar uma afinidade melhorada (por exemplo, a força de aglutinação aumentada) para um alvo selecionado, por exemplo, molécula, célula ou tipo de célula, compartimento, por exemplo, um compartimento celular ou de órgão, tecido, órgão ou região do corpo, como por exemplo, em relação a uma espécie ausente, tal como um ligando. Em algumas modalidades, um ligante pode proporcionar uma especificidade aumentada de um peptídeo anfifílico aqui descrito ou uma partícula de peptídeo feita do mesmo para um alvo selecionado, como por exemplo, em comparação com um peptídeo —anfifílico sem um tal ligando. O termo "especificidade" como aqui utilizado, refere-se à capacidade de um peptídeo anfifílico ou uma partícula de peptídeo para ligar, de preferência, a um alvo selecionado para todas as outras entidades. Por exemplo, a presença de um ligando de um peptídeo anfifílico e/ou uma partícula de peptídeo aqui descrita pode permitir que oO peptídeo anfifílico ou partícula de peptídeo se ligue, de preferência, a um alvo selecionado para todas as outras entidades, em comparação com um peptídeo anfifílico Ou partícula de peptídeo sem um tal ligando.

[158] sem limitação, um ligando pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em polímeros, peptídeos, polipeptídeos, proteínas, peptidomiméticos, glicoproteínas, lectinas, nucleosídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos, monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, lipopolissacarídeos, vitaminas, lipídeos, esteróides, hormônios, co-fatores, receptores, ligandos de receptor, e quaisquer combinações dos mesmos.

[159] Em algumas modalidades desta e outros aspectos aqui descritos, o ligando é selecionado a partir do grupo que consiste em polietileno glicol (PEG, por exemplo, PEG- 2K, PEG-5K, PEG-10K, PEG-12K, PEG-15K, PEG- 20K, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poli(óxido de etileno) (PEO), poli (propileno glicol) (PPG), poli(óxido de etileno-óxido de co-propileno), ácido hialurônico, poli(2-metacrilato de hidroxietila), heparina, polivinil (pirrolidona), sulfato de chondroitan, quitosano, glucosaminoglucans, dextrano,

dextrina, sulfato de dextrano, acetato de celulose, carboximetil celulose, hidroxietil celulose, celulósicos, poli (trimetileno glicol), poli (tetrametileno glicol), polipeptídeos, poliacrilamida, poliacrilimida, poli(etileno amina), poli(alil amina), copolímero de anidrido de ácido estireno-maléico, copolímero de poli (L-lactídeo-co- glicolied), copolímero de anidrido divinil éter-maléico, copolímero de N- (2-hidroxipropil) metacrilamida (HMPA), álcool polivinílico (PVA), poliuretano, poli(ácido 2- etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida, polifosfazina, polietilenoimina, espermina, espermidina, poliamina, pseudopeptídeo-poliamina, poliamina peptidomimética, dendrímero de poliamina, arginina, amidina, protamina, tirotropina, melanotropina, lectina, proteína de tensoativo A, mucina, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, um aptâmero, asialofetuina, hialuronano, procolágeno, insulina, transferrina, albumina, acridinas, psoraleno cruzado, mitomicina C, TPPC4, texafirina, safirina, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (por exemplo, fenazina, dihidrofenazina), ácidos biliares, colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido l-pireno butírico, dihidrotestosterona, 1,3-Bis-O- (hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3- propanodiol, grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido 03-(oleoil)litocólico, ácido 03- (oleocil) colênico, dimetoxitritila, ou fenoxazina), peptídeos RGD, marcadores radio-rotulados, haptenos, naproxeno, aspirina, dinitrofenila, HRP, AP, lectinas, vitamina A, vitamina E,

vitamina K, vitamina B, ácido fólico, vitamina B1l2, riboflavina, biotina, piridoxal, taxon, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlaquinolídeo, latrunculina A, faloidina,y swinholide A, indanocina, mioservin, fator de necrose de tumor alfa (TNFalfa), beta interleucina-l, interferon gama, GalNAC, galactose, manose, manose-6P, agrupamentos de açúcares, tais como agrupamento de GalNAC, agrupamento de manose, agrupamento de galactose,

um aptâmero, ligandos de receptores de integrina, ligandos de receptores de quimiocina, ligandos de receptores de serotonina, PSMA, endotelina, GCPITI, somatostatina, parede celular bacteriana permeando peptídeo, peptídeo GALA, peptídeo EALA, peptídeo INF-7, peptídeo Inf HA-2, peptídeo diINF-7, peptídeo diINF-3, peptídeo GLF, peptídeo GALA- INF3, peptídeo INF-5, peptídeo de penetratin, fragmento Tat

48-60, peptídeo PVEC, peptídeo de transportan, peptídeo LL- 37, peptídeo cecropin Pl, peptídeo a-defensina, peptídeo B- defensina, peptídeo PR-39, peptídeo de indolicidina, peptídeo de RFGF, RFGF analógico, bactenecina, cecropinas, licotoxinas, paradaxinas, buforin, CPF, peptídeo “como bombinin (BLP), catelicidinas, ceratotoxinas, peptídeos 5.

Clava, peptídeos antimicrobianos intestinais mixinídeos de enguia de casulo (HFIAPsS), magainines, brevinins-2, dermaseptins, melittins, pleurocidin, peptídeos HA, peptídeos de Xenopus, esculentinis-l1, caerins, e quaisquer combinações dos mesmos.

[160] Em algumas modalidades, um ligando pode incluir um agente ativo. Tal como aqui utilizado, um "agente ativo" refere-se a uma molécula que é para ser distribuída a uma célula. Consequentemente, sem limitação, um agente ativo pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em moléculas orgânicas ou inorgânicas pequenas, monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, macromoléculas biológicas, por exemplo, peptídeos, proteínas, peptídeos análogos e derivados dos mesmos, peptidomiméticos, nucléicos ácidos, análogos de ácidos nucléicos e derivados, polinucleotídeos, oligonucleotídeos, enzimas, um extrato feito de materiais biológicos, tais como bactérias, plantas, fungos, ou células ou tecidos animais, que ocorrem naturalmente ou sintéticos, composições, partículas, Ou quaisquer combinações dos mesmos. Um agente ativo pode ser de carga neutra ou compreender uma carga líquida, por exemplo, o agente ativo é aniônico ou catiônico. Além disso, um agente ativo pode ser hidrofóbico, hidrofílico, ou anfifílico. Em algumas modalidades, o agente ativo compreende pelo menos um grupo arila ou heteroarila.

[161] Conforme aqui utilizado, o termo "partículas" refere-se a uma partícula, pó, flocos, etc., que inerentemente, existe em uma forma relativamente pequena e pode ser formado por, por exemplo, moagem, trituração, fragmentação, pulverização, atomização, ou de outro modo subdividindo uma forma maior do material para uma forma relativamente pequena.

[162] Conforme aqui utilizado, o termo "molécula pequena" pode referir-se a compostos que são "do tipo produto natural", no entanto, o termo "molécula pequena" não se limita a compostos "do tipo produtos naturais". Pelo contrário, uma molécula pequena é tipicamente caracterizada por conter várias ligações carbono-carbono, e ter um peso molecular inferior a 5.000 Daltons (5 kDa) , de preferência, inferior a 3 kD, ainda mais de preferência, inferior a 2 KkD, e mais de preferência, inferior a 1 kD. Em alguns casos, é altamente preferível que uma molécula pequena tenha uma massa molecular igual ou inferior a 700 Daltons.

[163] Em algumas modalidades, o agente ativo pode ser um peptídeo ou uma proteína. Tal como aqui utilizado, o termo "peptídeo" é utilizado no seu sentido mais amplo para se referir a compostos que contêm dois ou mais aminoácidos, aminoácidos equivalentes ou outros grupos não-amino ligados Uns aos outros por ligações de peptídeo ou ligações de peptídeo modificadas. Equivalentes de peptídeo podem diferir a partir de peptídeos convencionais através da substituição de um ou mais aminoácidos com ácidos orgânicos relacionados (tais como, PABA), aminoácidos ou similares, ou a substituição ou modificação de cadeias laterais ou grupos funcionais. Um peptídeo pode ser de qualquer tamanho, desde, no entanto, em algumas modalidades, os peptídeos possuindo vinte ou menos aminoácidos no total são preferidos. Adicionalmente, o peptídeo pode ser linear ou cíclico. As sequências de peptídeo especificamente aqui citadas são escritas com o terminal amino à esquerda e o terminal carbóxi à direita. Além disso, o termo "peptídeo" inclui proteínas, em geral, que são geralmente polipeptídeos. Tal como aqui utilizado, o termo "proteína" é utilizado para descrever as proteínas, assim como os fragmentos dos mesmos. Assim, qualquer cadeia de aminoácidos que exibe uma estrutura tridimensional é incluída no termo "proteína", e fragmentos de proteína são, portanto, incorpados.

[164] Um peptidomimético é uma molécula capaz de se dobrar em uma estrutura tridimensional definida similar a um peptídeo natural.

[165] Conforme aqui utilizado, o termo "ácido nucléico" refere-se a polímeros (polinucleotídeos) ou oligômeros (oligonucleotídeos) de nucleotídeos ou monômeros de nucleosídeos consistindo em bases de ocorrência natural, açúcares e ligações de interaçúcar. O termo "ácido nucléico" também inclui polímeros ou oligômeros que compreendem os monômeros de ocorrência não-natural, ou porções dos mesmos, os quais funcionam de forma similar. Tais ácidos nucléicos modificados ou substituídos são muitas vezes preferidos em relação às formas nativas devido a propriedades, tais como, por exemplo, absorção celular intensificada e estabilidade aumentada na presença de nucleases.

[166] Um ácido nucléico pode ser de filamento único ou filamento duplo. Um ácido nucléico de filamento único pode ter regiões de filamento duplo e um ácido nucléico de filamento duplo pode ter regiões de filamento único. Ácidos nucléicos exemplares “incluem, mas não limitados a, genes estruturais, genes incluindo regiões de controle e terminação, e sistemas de auto-replicantes, tais como o DNA viral ou plasmídeo, sSiRNAs de filamento único e de filamento duplo e outros reagentes de interferência de RNA (agentes RNAi Ou agentes iRNA), RNAs de hairpin curto (ShRNA), oligonucleotídeos de anti-sentido, ribozimas, microRNAs, mMicroRNA mimético, aptâmeros, antimirs, antagomirs, oligonucleotídeos formadores de triplex, ativadores de RNA, oligonucleotídeos imuno-estimulante, e oligonucleotídeo chamariz.

[167] Em algumas modalidades, o agente ativo é biologicamente ativo ou tem atividade biológica. Tal como aqui utilizado, o termo "atividade biológica" ou "bioatividade" refere-se à capacidade de um composto para afetar uma amostra biológica. A atividade biológica pode incluir, sem limitação, a elicitação de uma resposta estimuladora, inibidora, reguladora, tóxica ou letal em um ensaio biológico aos níveis moleculares, celulares, de tecido ou órgão. Por exemplo, uma atividade biológica pode referir-se a capacidade de um composto para apresentar ou modular o efeito/atividade de uma enzima, bloquear um receptor, estimular um receptor, modular o nível de expressão de um ou mais genes, modular a proliferação de células, modular a divisão de célula, modular a morfologia de célula, ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns casos, a atividade biológica pode referir-se a capacidade de um composto para produzir um efeito tóxico em uma amostra biológica, ou pode referir-se a uma capacidade para modificar a química de uma molécula alvo ou célula.

[168] Em algumas modalidades, o agente ativo é um agente terapêutico. Tal como aqui utilizado, o termo "agente terapêutico" refere-se a um agente biológico ou químico utilizado para o tratamento, cura, mitigação, ou prevenção de condições deletérias em um indivíduo. O termo "agente terapêutico" também inclui substâncias e agentes para combater uma doença, condição, ou desordem de um indivíduo, e inclui medicamentos, diagnósticos, e instrumentação. "Agente terapêutico" também inclui qualquer coisa usada no diagnóstico médico, ou na restauração, corrição, ou modificação das funções fisiológicas. Os termos "agente terapêutico" e "agente farmaceuticamente ativo" são aqui utilizados indiferentemente.

[169] Um agente terapêutico pode ser selecionado de acordo com o tratamento objetivo e ação biológica desejada. Assim, um agente terapêutico pode ser selecionado a partir de qualquer classe adequada para o objetivo terapêutico. Além disso, o agente terapêutico pode ser selecionado ou disposto de modo a proporcionar uma atividade terapêutica durante um período de tempo.

[170] os compostos ativos farmaceuticamente exemplares incluem, mas não limitados a, aqueles encontrados em Harrison's Principles of Internal Medicine, 13º Edition, Eds. T.R. Harrison McGraw-Hill N.Y., NY; Physicians Desk Reference, 50th Edition, 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co.; Pharmacological Basis of Therapeutics, 8º Edition, Goodman and Gilman, 1990; United States Pharmacopeia, The National Formulary, USP XII NF XVII, 1990; edição atual de Goodman and Oilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics; e edição atual de The Merck Index, o conteúdo completo de todos os quais é aqui incorporado na sua totalidade.

[171] os agentes ativos farmaceuticamente exemplares incluem, mas não limitados a, esteróides e agentes anti-inflamatórios de não-esteróides, medicamentos anti-restenóticas, agentes antimicrobianos, fatores angiogênicos, bloqueadores dos canais de cálcio, agentes trombolíticos, agentes anti-hipertensivos, anticoagulantes, agentes anti-arrítmicos, glicosídeos cardíacos, e similares.

[172] Em algumas modalidades, o agente terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido salicílico e derivados (aspirina), para-aminofenol e derivados (acetaminofeno), ácidos arilpropiônicos (ibuprofeno), corticosteróides, antagonistas de receptor de histamina e antagonistas de receptor de bradicinina, antagonistas de receptor de leucotrieno, antagonistas de receptor de prostaglandina, antagonistas de receptor do factor de ativação de plaquetas, sulfonamidas, trimetoprim- sulfametoxazol, quinolonas, penicilinas, cefalosporina, factor de crescimento de fibroblasto básico (FGF), fator de crescimento de fibroblasto acídico, fator de crescimento endotelial vascular, fatores alfa e beta de crescimento de transformação angiogênico, fator de necrose tumoral, angiopoietina, fator de crescimento derivado de plaquetas, dihidropiridinas (por exemplo, nifedipina, benzotiazepinas,

tais como dilitazem, e fenilalquilaminas, tal como verapamil), ativador de plasminogênio de uroquinase, uroquinase, estreptoquinase, inibidores de enzima conversora de angiotensina (ACE), espironolactona, ativador de plasminogênio de teciduo (tPA), diuréticos, tiazidas, agentes anti-adrenérgicos, clonidina, propanolol, inibidores da enzima de conversão de angiotensina, captopril, antagonistas de receptor de angiotensina, losartan, antagonistas de canal de cálcio, nifedina, heparina, varfarina, hirudina, peptídeo anticoagulante tick, e heparinas de baixo peso molecular, tais como enoxaparina, lidocaína, procainamida, encainida, flecanida, bloqueadores beta-adrenérgicos, propranolol, amiodarona, verpamil, diltiazem, cloreto de níquel, glicosídeos cardíacos, inibidores de enzima conversora de angiotensina, antagonistas receptores de angiotensina, nitro vasodilatadores, agentes hipolipidêmicos (por exemplo, ácido nicotínico, probucol, etc.), as resinas de aglutinação de ácido biliar (por exemplo, colestiramina, e derivados de ácido fíbrico, por exemplo, clofibrato), inibidores redutase de HMG CoA, inibidores sintase de HMG CoA, inibidores sintase de esqualeno, inibidores epoxidase de esqualeno, estatinas (por "exemplo, lovastatina, cerivastatina, fluvastatina, pravastatina, simvastatina, etc.), antipsicóticos, SSRIs, medicamentos anticonvulsantes, anticoncepcionais, analgésicos sistêmicos e locais (dor crônica, fatores de crescimento ósseo/remodelação (recrutamento de osteoblastos/osteoclastos e fatores estimulantes), neurotransmissores (L-DOPA, dopamina, neuropeptídeos), medicamentos de enfisema, TGF-beta), rapamicina, naloxona, paclitaxel, anfotericina, dexametasona, flutamida, vancomicina, fenobarbital, cimetidina, atenolol, aminoglicosídeos, hormônios (por exemplo, hormônio de liberação de tirotropina, hormônio de liberação de hormônio luteinizante p-nitrofenil beta-celopentaosídeo), vincristina, amilorida, digoxina, morfina, procainamida, quinidina, quinina, ranitidina, triamtereno, trimetoprim, vancomicina, aminoglicosídeos, e penicilina, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[173] Em algumas modalidades, o agente ativo é um SiRNA, um RNA de hairpin curto (shRNA), um oligonucleotídeo de anti-sentido, uma ribozima, um mMicroRNA, um microRNA mímico, um aptâmero, uma antimir, um antagomir, um oligonucleotídeo formador de triplex, um ativador de RNA, um oligonucleotídeo imunoestimulador, um oligonucleotídeo chamariz, um plasmídeo, ou um vetor de DNA.

[174] Em algumas modalidades, o agente terapêutico é um material radioativo. Materiais radioativos adequados incluem, por exemplo, de “ítrio, 12irídio, *º%ouro, !?Fiodo,

Bicésio, cobalto, cobalto, cobalto, cobalto, magnésio, sSferro, 32fósforo, Pestrôncio, srubídio, ?ºbismuto, gálio, ”bromo, césio, ”gelênio, 7ºselênio, 7?arsênico, *“paládio, “".º!chumbo, !iíndio, 5ºferro, !*Otúlio, níquel, Sºzinco, “cobre, 2ºtálio e 13iodo. Sem pretender estar limitado pela teoria, as partículas que compreendem um material radioativo podem ser usadas para tratar o tecido doente, tais como os tumores, malformações arteriovenosas, e similares.

[175] Em algumas modalidades, o agente ativo é um agente de imagem. Tal como aqui utilizado, Oo termo "agente de imagem" refere-se a um elemento ou grupo funcional em uma molécula que permite a detecção, imagem e/ou monitoramento da presença e/ou progressão de uma condição, desordem patológica, e/ou doença. O agente de imagem pode ser uma substância ecogênica (ou líquido ou gás), isótopo não-metálico, um repórter óptico, um absorverdor de neutron de boro, um íon de metal paramagnético, um metal ferromagnético, um radioisótopo emissor de gama, um radioisótopo emissor de pósitrons, ou um absorvedor de raios-x. Sem pretender estar limitado pela teoria, um agente de imagem possibilita a identificação de uma composição que compreende tal como um agente de imagem.

[176] Repórteres ópticos adequados incluem, mas não limitados a, grupos de repórteres fluorescentes e quimioluminescentes.

Uma grande variedade de corantes de repórteres fluorescentes é conhecida na técnica.

Tipicamente, o fluoróforo é um composto aromático Ou heteroaromático e pode ser um pireno, antraceno, naftaleno,

acridina, estilbeno, indol, benzindol, oxazol, tiazol, benzotiazol, cianina, carbocianina, salicilato, antranilato, cumarina, fluoresceína, rodamina ou Outros compostos similares.

Repórteres fluorescentes adequados incluem os corantes de xanteno, tais como os corantes de fluoresceína ou rodamina, incluindo, mas não limitados a, corantes Alexa Fluorº (InvitrogenCorp.; Carlsbad, Calif), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC), Oregon GreenTM, rodamina, Texas vermelho, isotiocianato de tetrarhodamina (TRITC), 5-carboxifluoresceína (FAM), 2'7'-

dimetóxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), tetraclorofluoresceína (TET), 6-carboxirodamina (REG), N,

N, N, N'- tetramefil-6-carboxirodamina (TAMRA), 6-carbóxi- X-rodamina (ROX). Repórteres fluorescentes adequados também incluem os corantes de naftilamina que têm um grupo amino na posição alfa ou beta.

Por exemplo, Os compostos de naftilamino incluem 1-dimetilamino-naftil-5-sulfonato, sulfonato de 1l-anilino-8-naftaleno, sulfonato de 2-p- toluidinil-6-naftaleno, e ácido 5- (2' -aminoetil) aminonaftaleno-1-sulfônico (EDANS) . Outros corantes repórteres fluorescentes incluem cumarinas, tais como 3-

fenil-7-isocianatocumarina; acridinas, tais como 9- isotiocianatoacridina e acridina laranja; N- (p(2- benzoxazolil)fenil)maleimida; cianinas, tais como Cy2, indodicarbocianina 3 (Cy3), indodicarbocianine 5 (Cy5), indodicarbocianina 5.5 (Cy5.5), 3- (-carbóxi-pentil)-3'etil- 5, 5'!-dimetiloxacarbocianina (CyA); sal interno de 1H, 5H, 11H, 15H-Xanteno[2,3,4-1j:5,6,7-i'j']diquinolizin-18-io, 9- [2(ou 4) - [[[6- [2, 5S-dioxo-l1-pirrolidinil)óxi] -6- oxohexil] amino] sulfonil] -4 (ou 2) -sulfofeni1]- 2,3,6,7,12,13,16,17 Octahidro (TR ou Texas vermelho); corantes BODIPYTM; benzoxadiazóis; estilbenos; pirenos; e similares. Muitas formas adequadas destes compostos fluorescentes estão disponíveis e podem ser utilizadas.

[177] Os exemplos de proteínas fluorescentes adequadas para uso como agentes de imagem incluem, mas não limitados a, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente vermelha (por exemplo, DsRed), proteína fluorescente amarela, proteína fluorescente ciano, proteína fluorescente azul, e as variantes dos mesmos (ver, por exemplo, Patentes U.S. Números 6.403.374, 6.800.733, e

7.157.566). Os exemplos específicos de variantes de GFP incluem, mas não limitados a, GFP intensificado (EGFP), EGFP desestabilizado, as variantes de GFP descritas em Doan et al, Mol. Microbiol, 55:1767-1781 (2005), a variante de GFP descrita em Crameri et al, Nat. Biotechnol., 14:315319

(1996), as proteínas fluorescentes cerúleos descritas em Rizzo et al, Nat. Biotechnol, 22:445 (2004) e Tsien, Annu. Rev. Biochem., 67:509 (1998), e a proteína fluorescente amarela descrita em Nagal et al, Nat. Biotechnol., 20:87-90 (2002). As variantes DsRed são descritas em, por exemplo, Shaner et al, Nat. Biotechnol., 22:1567-1572 (2004), e incluem mMorango, mCereja, Morango, mBanana, mMelada e mTangerina. Variantes DsRed adicionais são descritas em, por exemplo, Wang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101:16745-16749 (2004) e incluem mFramboesa e mAmeixa. Outros exemplos de variantes DsRed incluem mRFPmars descritos em Fisher et al, FEBS Lett., 577:227-232 (2004) e mMRFPruby descrito em Fisher et al, FEBS Lett, 580:2495-2502 (2006).

[178] Gases ecogênicos adequados incluem, mas não limitados a, um hexafluoreto de enxofre ou gases de perfluorocarbono, tais como perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropano, perfluorobutano, perfluorociclobutano, perfluropentano, ou perfluorohexano.

[179] Isótopos não-metálicos adequados incluem, mas não limitados a, UC, 4C, 13N, 16F, 123T, 124T, e 15, Radioisótopos adequados incluem, mas não limitados a, ºmTe, %STc, In, 82Cu, “Cu, Ca, “Ga, e !ºGd., Íons de metal paramagnéticos adequados incluem, mas não limitados a, GA(IIT), Dy(III), Fe(III), e MnN(II). Absorvedores de raios-

X adequados incluem, mas não limitados a, Re, Sm, Ho, Lu, Pm, Y, Bi, Pd, Gd, La, Au, Au, Yb, Dy, Cu, Rh, Ag, Ir. Em algumas modalidades, o radionuclídeo está ligado a um agente de quelação ou agente de quelação-ligante ligado ao agregado. Os radionuclídeos adequados para conjugação direta incluem, sem limitação, 18F, 1247, 1257, UDIT, e misturas dos mesmos. Os radionuclídeos adequados para uso com um agente de quelação incluem, sem limitação, “Sc, Cu, CU, Sr, 86Y, 8, %Y, 25Rh, NiAg, 42iIn, V'mSn, 1ºPm, Sm, *6Ho, *”Lu, **Re, *ººRe, ?UAt, 2VBi, e misturas dos mesmos. Agentes de quelação adequados incluem, mas não limitados a, DOTA, BAD, TETA, DTPA, EDTA, NTA, HDTA, OS seus análogos de fosfonato, e misturas dos mesmos. Um versado na técnica estará familiarizado com métodos para ligar radionuclídeos, agentes de quelação, e agente de quelação-ligantes para as partículas.

[180] Uma resposta detectável geralmente refere-se a uma mudança em, ou de ocorrência, de um sinal que é detectável por observação ou instrumentalmente. Em certos casos, a resposta detectável é fluorescência ou uma alteração na fluorescência, por exemplo, uma alteração na intensidade de fluorescência, excitação de fluorescência ou distribuição de comprimento de onda de emissão, tempo de vida de fluorescência, e/ou polarização de fluorescência. Um versado na técnica irá apreciar que O grau e/ou localização de rotulação em um indivíduo ou amostra pode ser comparado com um padrão ou controle (por exemplo, o tecido saudável ou órgão). Em certos outros casos, a resposta detectável é a radioatividade (isto é, radiação), incluindo as partículas alfa, partículas beta, núcleos, elétrons, positrons, neutrinos, e raios gama emitidos por uma substância radioativa, tal como um radionuclídeo.

[181] Dispositivos específicos ou métodos conhecidos na técnica para a detecção in vivo de fluorescência, por exemplo, a partir de fluoróforos ou proteínas fluorescentes, incluem, mas não limitados a, fluorescência infravermelho próximo de in vivo (ver, por exemplo, Frangioni, Curr. Opin. Chem. Biol, 7:626-634 (2003)), o sistema de imagem de fluorescência in vivo MaestroTM (Cambridge Research & TInstrumentation, Inc.; Woburn, Mass.), imagem de fluorescência in vivo usando um scanner de vôo local (ver, por exemplo, Ramanujam et al, IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 48:1034-1041 (2001), e similares. Outros métodos ou dispositivos para detecção de uma resposta óptica incluem, sem limitação, a inspeção visual, câmeras de CCD, câmeras de vídeo, filme fotográfico, dispositivos de varredura a laser, fluorômetros, fotodiodos, contadores quânticos, microscópios de epifluorescência, microscópios de varredura, citômetros de fluxo, leitores de microplacas de fluorescência, ou amplificação de sinal utilizando tubos fotomultiplicadores.

[182] Qualquer dispositivo ou método conhecido na técnica para a detecção das emissões radioativas de radionuclídeos em um indivíduo é adequado para uso na presente invenção. Por exemplo, métodos tal como Tomografia Computadorizada de Emissão de Fóton Único (SPECT), que detecta a radiação a partir de um único fóton gama emitindo radionuclídeo “usando uma câmera gama rotativa, e cintilografia de radionuclídeo, que obtêm uma imagem ou uma série de imagens sequenciais da distribuição de um radionuclídeo em tecidos, órgãos, ou sistemas do corpo utilizando uma câmara de cintilação gama, pode ser utilizado para detectar a radiação emitida a partir de um agregado radio-rotulado. Tomografia por emissão de pósitron (PET) é outra técnica adequada para a detecção de radiação em um indivíduo.

[183] Em algumas modalidades, o ligando é um ligando receptor de superfície da célula. Tal como aqui utilizado, um "ligando de receptor de superfície da célula" refere-se a uma molécula que pode ligar-se à superfície exterior de uma célula. Ligando receptor de superfície da célula exemplar inclui, por exemplo, um peptídeo de aglutinação de receptor de superfície da célula, um glicopeptídeo de aglutinação de receptor de superfície da célula, uma proteína de aglutinação de receptor de superfície da célula, uma glicoproteína de aglutinação de receptor de superfície da célula, um composto orgânico de aglutinação de receptor de superfície da célula, e um medicamento de aglutinação de receptor de superfície da célula.

[184] Ligandos de receptor de superfície da célula incluem, mas não limitados a, citocinas, fatores de crescimento, hormônios, anticorpos, e fatores angiogênicos.

[185] Em algumas modalidades, o ligando receptor de superfície da célula é a transferrina ou EGF.

[186] Ligandos fornecendo afinidade melhorada para um alvo selecionado são também denominados direcionando os ligantes aqui. Tal como aqui utilizado, o termo "ligando de direcionamento" refere-se a uma molécula que se liga a ou interage com uma molécula alvo. Tipicamente, a natureza da interação ou aglutinação é não-covalente, por exemplo, por hidrogênio, interações eletrostática, ou de van der Waals, no entanto, a aglutinação pode também ser covalente.

[187] Conforme aqui utilizado, o termo "ligando endosomolítico" refere-se a moléculas que possuem propriedades endosomolíticas. Ligandos endosomolíticos promovem a lise de e/ou o transporte da composição da invenção, ou seus componentes, a partir dos compartimentos celulares, tais como o endossoma, lisossoma, retículo endoplasmático (ER), aparelhos de Golgi, microtúbulos, peroxissoma, ou outros corpos vesiculares dentro da célula, para o citoplasma da célula. Alguns ligandos endosomolíticos exemplares incluem, mas não limitados a, imidazóis, poli ou oligoimidazóis, polietilenoiminas lineares ou ramificadas (PEIS), poliaminas lineares e ramificadas, por exemplo, espermina, poliaminas lineares catiônicas e ramificadas, policarboxilatos, policátions, oligo mascarado ou poli cátions ou ânions, acetais, poliacetais, cetais/policetais, ortoésteres, polímeros lineares ou ramificados com cargas aniônicas ou catiônicas não-mascaradas, peptídeos polianiônicos, peptidomiméticos polianiônicos, peptídeos “sensíveis ao pH, lipídeos fusogênicos naturais e sintéticos, lipídeos catiônicos sintéticos e naturais.

[188] Conforme aqui utilizados, os termos "ligando modulando PK" e "modulador PK" referem-se a moléculas que podem modular as farmacocinéticas da composição da invenção. Alguns moduladores PK exemplares incluem, mas não estão limitados a, moléculas lipofílicas, ácidos biliares, esteróis, análogos de fosfolipídeos, peptídeos, agentes de aglutinação de proteína, vitaminas, ácidos graxos, fenoxazina, aspirina, naproxeno, ibuprofeno, suprofeno, cetoprofeno, (8) - (+) -pranoprofeno, carprofeno, PEGs, biotina, e ligandos de aglutinação de transtiretia (por exemplo, ácido tetraiidotiroacético, ácido 2, 4, 6- triiodofenol e flufenâmico).

[189] Em algumas modalidades, um peptídeo anfifílico compreende pelo menos um (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais) conjugado de ligando. Quando dois ou mais ligandos estiverem presentes, os ligandos podem ter as mesmas propriedades, todos têm propriedades diferentes ou alguns ligandos têm as mesmas propriedades, enquanto outros possuem propriedades diferentes. Por exemplo, um ligando pode ter propriedades de segmentação, tem atividade endosomolítica ou tem propriedades de modulação de PK. Deste modo, os dois ou mais ligandos podem ser os mesmos ligandos, diferentes ligandos, mesmo tipo de ligando (por exemplo, ligando de direcionamento, ligando endosomolítico, modulador de PK), diferentes tipos de ligandos, ou quaisquer combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, todos os ligandos têm propriedades diferentes.

[190] Em algumas modalidades, o peptídeo anfifílico compreende um polímero hidrofílico selecionado dentre o grupo que consiste em poli(etileno glicol), poli(óxido de etileno), poli(propileno glicol), poli(óxido de etileno-óxido de co-propileno), ácido hialurônico, poli (metacrilato de 2-hidroxietila), heparina, polivinil (pirrolidona), sulfato de condroitan, quitosano, glucosaminoglucans, dextrano, dextrina, sulfato de dextrano, acetato de celulose, carboximetil celulose, hidroxietil celulose, celulósicos, poli ((trimetileno glicol), poli (tetrametilenoglicol), polipeptídeos, poliacrilamida, poliacrilimida, poli (etileno amina), poli(alilamina) e misturas dos mesmos, e em que o polímero hidrofílico é ligado de forma covalente com o segmento de peptidil hidrofóbico. Vinculando a peptídeos

[191] Uma molécula (por exemplo, um ligando) pode ser conjugada a um peptídeo utilizando qualquer uma de uma variedade de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. A molécula pode ser acoplada ou conjugada com o peptídeo de forma covalente ou não-covalente. A ligação covalente entre a molécula e o peptídeo pode ser mediada por um ligante. A ligação não-covalente entre a molécula e o peptídeo pode ser baseada em interações iônicas, interações de van der Waals, interações dipolo-dipolo, ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas, e/ou interações de reconhecimento de modelagem.

[192] Sem limitações, os ligandos podem ser acoplados a um peptídeo em vários lugares, por exemplo, N- terminal, C- terminal, e/ou em uma posição interna (por exemplo, a cadeia lateral de um aminoácido). Quando dois ou mais ligandos estão presentes, o ligando pode estar nas extremidades opostas de um peptídeo (por exemplo, N-

terminal e C-terminal).

[193] Em geral, o ligando está localizado na extremidade terminal (por exemplo, na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, Ou 10, contando a partir da extremidade) que está mais afastada do segmento de peptidil hidrofóbico. Sem pretender estar limitado pela teoria, isto permite que O ligando esteja na posição sobre ou perto da superfície de uma partícula formada por auto-agregação de peptídeos anfifílicos.

[194] Em algumas modalidades, um ligando está localizado no terminal de segmento de peptidil hidrofílico que não está ligado com o segmento de peptidil hidrofóbico. Por exemplo, se o N-terminal do segmento de peptidil hidrofílico está ligado ao segmento de peptidil hidrofóbico, em seguida, o ligante está localizado na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, contando a partir do C-terminal do segmento de peptidil hidrofílico. Alternativamente, se o C-terminal do segmento de peptidil hidrofílico está ligado ao segmento de peptidil hidrofóbico, em seguida, o ligando está localizado na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, contando a partir de N-terminal do segmento de peptidil hidrofílico.

[195] Em algumas modalidades, o ligando está ligado ao peptídeo através de um ligante. O ligando pode estar presente em um monômero quando o referido monômero é incorporado em um peptídeo durante a síntese. Em algumas modalidades, o ligando pode ser incorporado por meio de acoplamento a um monômero "precursor", depois do referido monômero "precursor" ser incorporado no peptídeo. Por exemplo, um monômero que possui, por exemplo, um ligante terminado por amino (isto é, não tendo qualquer ligando associado), por exemplo, monômero-ligante-NH; podem ser incorporados em peptídeos. Em uma operação subsequente, isto é, após a incorporação do monômero precursor no peptídeo, um ligando tendo um grupo eletrofílico, por exemplo, um éster de pentafluorofenila ou grupo aldeído, pode ser subsequentemente ligado ao monômero precursor por acoplamento do grupo eletrofílico do ligando com o grupo nucleofílico terminal do tirante do monômero precursor. Em outro exemplo não-limitativo, um ligando que possui um grupo eletrofílico pode ser ligado a um N-terminal, C- terminal ou um grupo amino de cadeia lateral interna. Em outro exemplo, um tiol que compreende o ligando pode ser ligado a um peptídeo através de um ligante de dissulfureto quando o peptídeo compreende uma cisteína.

Ligantes

[196] Conforme aqui utilizado, o termo "ligante" significa uma porção orgânica que liga duas partes de um composto. Os ligantes tipicamente compreendem uma ligação direta ou um átomo, tal como oxigênio ou enxofre, uma unidade tal como NH, C(O0), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH, SS, ou uma cadeia de átomos, tal como C1-Cs alquila substituída ou não-substituída, C2-Ck alquenila substituída ou não- substituída, C2-C6 alquinila substituída ou não- substituída, Cs«.-Ci7 arila substituída ou não-substituída, Cs-C12 heteroarila substituída ou não-substituída, Cs-Ci heterociclila substituída ou não-substituída, C3-C12 cicloalquila substituída ou não-substituída, em que um ou mais metilenos podem ser interrompidos ou terminados por O, S, S(0), SO2, NH, C(O).

[197] Em algumas modalidades, o ligante é um ligante ramificado. O ponto de ramificação do ligante ramificado pode ser, pelo menos trivalente, mas pode ser um átomo tetravalente, pentavalente Ou hexavalente, ou um grupo que apresenta essas múltiplas valências. Em algumas modalidades, o ponto de ramificação é -N, -N(R)-C, -O-C, - S-C, -SS-C, -C(O)N(R)C-, -OC(O)N(R)C-, -N(R)C(O0)-C, ou - NIR)C(0)O-C, em que R é, independentemente, para cada ocorrência H ou alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, O ponto de ramificação é o glicerol ou o derivado do mesmo.

[198] Em algumas modalidades, ligante compreende um grupo de ligação clivável. Tal como aqui utilizado, um "grupo de ligação clivável" é uma porção química que é suficientemente estável para fora da célula, mas que após a entrada em uma célula-alvo é clivada para liberar as duas partes, o ligante é mantido junto. Em uma modalidade preferida, o grupo de ligação clivável é clivado pelo menos 10 vezes ou mais, de preferência, pelo menos 100 vezes mais rápida na célula-alvo, ou sob uma primeira condição de referência (que pode, por exemplo, ser selecionada para imitar ou representar as condições intracelulares) do que no sangue ou no soro de um indivíduo, ou sob uma segunda condição de referência (que pode, por exemplo, ser selecionada para imitar ou representar as condições encontradas no sangue ou no soro).

[199] Grupos de ligação cliváveis são suscetíveis a agentes de clivagem, por exemplo, o pH, o potencial redox ou a presença de moléculas de degradação. Geralmente, agentes de clivagem são mais prevalentes ou encontrados em níveis mais elevados ou atividades no interior das células do que no soro ou no sangue. Exemplos de tais agentes de degradação incluem: agentes redox que são selecionados para substratos particulares ou que não têm especificidade para o substrato, incluindo, por exemplo, enzimas oxidativas ou redutoras ou agentes redutores, tais como mercaptanos, presentes em células, que podem degradar um grupo de ligação clivável por redox por redução; esterases; amidases; endossomas ou agentes que podem criar um ambiente acídico, por exemplo, aqueles que resultam em um pH de cinco ou menos; enzimas que podem hidrolisar ou degradar um grupo de ligação clivável ácido atuando como um ácido geral, peptidases (que podem ser substrato específico) e proteases, e fosfatases.

[200] Um ligante pode incluir um grupo de ligação clivável que é clivável por uma enzima particular. O tipo de grupo de ligação clivável incorporado em um ligante pode depender da célula a ser alvejada. Por exemplo, para segmentação do fígado, grupos de ligação cliváveis podem incluir um grupo éster. As células do fígado são ricas em esterases e, por conseguinte, o ligante será clivado de forma mais eficiente em células do fígado do que em tipos de células que não são ricas em esterase. Outros tipos de células ricas em estearases incluem células do pulmão, do córtex renal, e testículos.

[201] Os ligantes que contêm ligações de peptídeo podem ser utilizados quando o direcionamento dos tipos de células ricas em peptidases, tais como as células do fígado e sinoviócitos.

[202] Em algumas modalidades, o grupo de ligação clivável é clivado, pelo menos, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, Ou 100 vezes mais rápido na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar condições intracelulares), em comparação com sangue ou soro (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar as condições extracelulares). Em algumas modalidades, o grupo de ligação clivável é clivado por menos do que 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% no sangue (ou em condições in vitro selecionadas para imitar as condições extracelulares) em comparação com a célula (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar as condições intracelulares).

[203] Exemplos de grupos de ligação cliváveis incluem, mas não limitados a, grupos de ligação cliváveis redox (por exemplo, -S-S- e -C(R);-S-S-, em que R é H ou C1-Cs alquila e pelo menos um R é C1-Cs alquila, tal como CH; ou CHxCH;), grupos de ligação cliváveis à base de fosfato (por exemplo, -O-P(0O)(OR)-O-, -O-P(S)(OR)-O-, -O- P(S) (SR) -O-, -S-P(0) (OR) -O-, -O-P(O) (OR) -S-, -S-P(O) (OR) -S- 1 -O-P(S) (ORk) -S-, -S-P(S) (OR) -O-, -O-P(O) (R) -O-, -O- P(S) (R)-O-, -S-P(O) (R)-O-, -S-P(S) (R)-O-, -S-P(O) (R)-S-, - O-P(S) (R)-S-, -O-P(O0) (OH)-O-, -O-P(S) (OH) -O-, -O-P(S)(SH)- O-, -S-P(O) (OH) -O-, -O-P(O) (OH) -S-, -S-P(O) (OH) -S-, -O- P(S) (OH) -S-, -S-P(S) (OH)-O-, -O-P(O) (H) -O-, -O-P(S) (H)-O-, -S-P(O) (H) -O-, -S-P(S) (H)-O-, -S-P(O) (H)-S-, e -O-P(S) (H)- S-, em que R é C-Cw alquila linear ou ramificada opcionalmente substituída); grupos de ligação de ácido cliváveis (por exemplo, hidrazonas, ésteres, e ésteres de aminoácidos, -C=NN- e -OC(0)-); grupos de ligação cliváveis à base de éster (por exemplo, -C(0)O-); grupos de ligação cliváveis à base de peptídeos (por exemplo, grupos de ligação que são clivados por enzimas, tais como as peptidases e proteases em células, por exemplo, - NHCHRAC (O) NHCHREC (0) -, onde Rà e RP são os grupos R dos dois aminoácidos adjacentes). Um grupo de ligação clivável à base de peptídeo compreende dois ou mais aminoácidos. Em algumas modalidades, a ligação clivável à base de peptídeo compreende a sequência de aminoácido que é o substrato para uma peptidase ou uma protease encontrada nas células.

[204] Em algumas modalidades, um grupo de ligação clivável de ácido é clivável em um meio acídico com um pH de cerca de 6,5 ou inferior (por exemplo, cerca de 6,0, 5,5, 5,0, Ou inferior), ou por agentes, tais como as enzimas que podem atuar como um ácido geral.

[205] Em adição a ligações covalentes, duas partes de um composto podem ser ligadas juntas por um par de aglutinação de afinidade. O termo "par de aglutinação de afinidade" ou "par de aglutinação" refere-se às primeira e segunda moléculas que se ligam especificamente umas às outras. Um membro do par de aglutinação é conjugado com a primeira parte a ser ligada, enquanto que o segundo membro é conjugado com a segunda parte a ser ligada. Tal como aqui utilizado, o termo "aglutinação específica" refere-se à aglutinação do primeiro membro do par de aglutinação com o segundo membro do par de aglutinação com uma maior afinidade e especificidade do que outras moléculas.

[206] Pares de aglutinação exemplares incluem qualquer composto haptênico ou antigênico em combinação com um anticorpo ou porção de aglutinação correspondente ou fragmento do mesmo (por exemplo, digoxigenina e anti digoxigenina; imunoglobulina de camundongo e imunoglobulina de anticamundongo de cabra) e pares de aglutinação não- imunológicos (por —exemplo, biotina-avidina, biotina- estreptavidina, hormônio [por exemplo, proteína de aglutinação de cortisol-hormônio e tiroxina, agonista de receptor-receptor, antagonista de receptor-receptor (por exemplo, receptor de acetilcolina-acetilcolina Ou um análogo do mesmo), IgG-proteína A, lectina-carbohidrato, cofator de enzima-enzima, inibidor de enzima-enzima, e os pares de oligonucleotídeo complementares capazes de formar os duplexos de ácido nucléico), e similares. O par de aglutinação pode também incluir uma primeira molécula que é carregada negativamente, e uma segunda molécula que é carregada positivamente.

[207] Um exemplo do uso de conjugação do par de aglutinação é a conjugação de biotina-avidina ou biotina- estreptavidina. Nesta abordagem, um de molécula ou o peptídeo é biotinilado e o outro é conjugado com avidina ou estreptavidina. Muitos kits comerciais também estão disponíveis para as moléculas de biotinilação, tais como as proteínas.

[208] Outro exemplo do uso de conjugação do par de aglutinação é o método de biotina-sanduíche. Ver, por exemplo, exemplo Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:8155-60 (2006). As duas moléculas a serem conjugadas juntas são biotiniladas e, em seguida, conjugadas juntas utilizando estreptavidina tetravalente como um ligante.

[209] Ainda outro exemplo do uso de conjugação do par de aglutinação é a conjugação de ácido nucléico de filamento duplo. Nesta abordagem, a primeira parte a ser ligada é conjugada e está ligada com um primeiro filamento do ácido nucléico de filamento duplo e a segunda parte a ser ligada é conjugada com o segundo filamento do ácido nucléico de filamento duplo. Os ácidos nucléicos podem incluir, sem limitação, os segmentos de sequência definida e sequências que compreendem os nucleotídeos, ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos, análogos de nucleotídeos, nucleotídeos modificados e os nucleotídeos que compreendem as modificações de estrutura principal, pontos de ramificação e resíduos de não-nucleotídeos, grupos ou pontes.

Partículas de peptídeo

[210] O inventor também descobriu que os peptídeos anfifílicos aqui descritos sofrem de autoagregação para formar os agregados supramoleculares. Assim, em outro aspecto, a invenção fornece as partículas de peptídeos que compreendem um peptídeo anfifílico aqui descrito. Em algumas “modalidades, as partículas de peptídeo que compreendem uma pluralidade de peptídeos anfifílicos aqui descritos. Por exemplo, uma partícula de peptídeo pode compreender, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, pelo menos cerca de 7, pelo menos cerca de 8, pelo menos cerca de 9, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 750, pelo menos cerca de 1000, pelo menos cerca de 2500, pelo menos cerca de 5000, pelo menos cerca de 10.000 ou mais peptídeos anfifílicos aqui descritos. A pluralidade de peptídeos anfifílicos presente em uma partícula de peptídeo pode compreender uma modalidade de um peptídeo anfifílico aqui descrito, ou pelo menos duas modalidades diferentes de um peptídeo anfifílico aqui descrito.

[211] o termo "partícula" inclui esferas; nanobastões; e prismas. As partículas de peptídeo aqui descritas diferem de micelas, lipossomas, e outras partículas que compreendem um invólucro distinto (por exemplo, uma camada de lipídeo), que serve como um material de formação de parede, cercando os meios encapsulados localizados no interior do invólucro. As partículas descritas aqui são partículas sólidas. As partículas podem ser, por exemplo, monodispersas ou polidispersas e a variação no diâmetro das partículas de uma determinada dispersão pode variar. No entanto, os peptídeos anfifílicos de um tamanho uniforme podem ser obtidos, as partículas aqui descritas são geralmente monodispersas. Por conseguinte, em algumas modalidades, o diâmetro de uma partícula aqui descrita está dentro de + 2,5%, dentro de + 5%, dentro de + 10%, dentro de + 15%, dentro de + 20%, dentro de + 25%, dentro de + 30%, ou dentro de + 35% do diâmetro médio.

[212] Em algumas modalidades, uma partícula de peptídeo aqui descrita é uma nanopartícula. Tal como aqui utilizado, o termo "nanopartícula" refere-se a partículas que estão na ordem de 10º? ou um bilionésimo de um metro e abaixo de 10-º ou 1 milésimo de um metro de altura.

[213] Em geral, as partículas de peptídeo têm um diâmetro médio de cerca de 5 nm a cerca de 5000 nm. Em algumas modalidades, as partículas possuem um diâmetro médio de cerca de 50 nm a cerca de 2500 nm. Em algumas modalidades, as partículas têm um diâmetro médio de cerca de 100 nm a cerca de 2000 nm. Em algumas modalidades, as partículas têm um diâmetro médio de cerca de 150 nm a cerca de 1700 nm. Em algumas modalidades, as partículas têm um diâmetro médio de cerca de 200 nm a cerca de 1500 nm. Em algumas modalidades, as partículas têm um diâmetro médio de cerca de 260 nm. Em uma modalidade, as partículas têm um diâmetro médio de cerca de 30 nm a cerca de 150 nm. Sem pretender estar ligado por uma teoria, o tamanho de partícula pode ser modulado alterando a concentração do peptídeo anfifílico na solução usada para fabricar as partículas de peptídeo.

[214] Em algumas modalidades, uma partícula de peptídeo aqui descrita compreende uma mistura de peptídeos anfifílicos completamente mascarados e peptídeos anfifílicos parcialmente ou não-mascarados. Tal como aqui utilizado um "peptídeo não-mascarado" refere-se a um peptídeo anfifílico em que nenhum do grupo amino N-terminal e os grupos amino de cadeia lateral no segmento de peptidil hidrofílico é conjugado com um grupo de proteção de nitrogênio ou amino.

[215] AO alterar a relação de peptídeos não- mascarados ou completamente mascarados para parcialmente mascarados, carga líquida da partícula de peptídeo pode ser variada. Sem pretender estar ligado por uma teoria, as relações mais elevadas de peptídeos completamente mascarados podem aumentar a estabilidade das partículas, enquanto que as relações mais elevadas de peptídeos não-

mascarados e/ou parcialmente podem aumentar a carga de moléculas que transporta as cargas aniônicos (por exemplo, ácidos nucléicos, tais como, DNA ou RNA incluindo sSiRNA) e uma maior capacidade para penetrar uma membrana celular.

[216] Em algumas modalidades, a partícula de peptídeo pode compreender um peptídeo anfifílico completamente mascarado (por exemplo, um peptídeo anfifílico completamente acetilado). O termo "peptídeo anfifílico completamente acetilado" como aqui utilizado refere-se a um peptídeo anfifílico em que todo o grupo amino N-terminal e os grupos amino de cadeia lateral no segmento de peptidil hidrofílico é acetilado.

[217] Em algumas modalidades, a partícula de peptídeo pode compreender uma mistura de peptídeos parcialmente mascarados (por exemplo, parcialmente acetilados) e completamente mascarados (por “exemplo, completamente acetilados). Tal como aqui utilizado, o termo "peptídeo anfifílico parcialmente acetilado" refere-se a um peptídeo anfifílico em que pelo menos um do grupo amino N- terminal e os grupos amino de cadeia lateral no segmento de peptidil hidrofílico é acetilado, mas não todos dos mesmos. Em algumas modalidades, um peptídeo anfifílico parcialmente acetilado pode ter o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico acetilado, mas não qualquer um dos grupos amino de cadeia lateral no segmento de peptidil hidrofílico. Em algumas modalidades, um peptídeo anfifílico parcialmente acetilado pode ter pelo menos um (incluindo, pelo menos, dois ou mais) dos grupos amino de cadeia lateral no segmento de peptidil hidrofílico acetilado, mas não o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico. Em algumas modalidades, um peptídeo anfifílico parcialmente acetilado pode ter tanto o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico e pelo menos um (incluindo, pelo menos, dois ou mais), mas não todos, dos grupos amino de cadeia lateral no segmento de peptidil hidrofílico acetilado.

[218] Em algumas modalidades, as partículas de peptídeo podem compreender uma mistura de peptídeos anfifílicos completamente mascarados (por exemplo, completamente acetilados) e não-mascarados (por exemplo, não-acetilados). Tal como aqui utilizado, o termo "peptídeo anfifílico não- acetilado" refere-se a um peptídeo anfifílico em que nenhum do grupo amino N-terminal e os grupos amino de cadeia lateral no segmento de peptidil hidrofílico é acetilado. Em algumas modalidades, as partículas de peptídeo podem compreender uma mistura de peptídeos anfifílicos completamente mascarados (por exemplo, completamente acetilados), parcialmente mascarados (por exemplo, parcialmente acetilados) e não-mascarados (por exemplo, não- acetilados).

[219] Em algumas modalidades, a partícula de peptídeo não compreende um peptídeo anfifílico completamente mascarado, por exemplo, a partícula compreende peptídeos anfifílicos parcialmente mascarados ou uma mistura de peptídeos parcialmente mascarados. Em algumas modalidades, a partícula de peptídeo compreende uma mistura de peptídeos parcialmente mascarados e não- mascarados.

[220] Sem limitações, a relação de peptídeos completamente mascarados para parcialmente mascarados ou não-mascarados na partícula de peptídeo pode variar de cerca de 100:1 a cerca de 1:100. Em algumas modalidades, a relação de peptídeos completamente mascarados para parcialmente mascarados ou não-mascarados na partícula de peptídeo varia de cerca de 95:5 a cerca de 1:1.

[221] As partículas aqui descritas podem ser utilizadas para a distribuição da medicamento. Assim, uma ampla variedade de agentes terapêuticos pode ser incluída nas partículas aqui descritas. Por conseguinte, em algumas modalidades, uma partícula de peptídeo aqui descrita pode compreender um agente ativo aqui descrito. Um agente ativo pode ser ligado de forma covalente com um componente, por exemplo, peptídeo anfifílico, da partícula de peptídeo. Em algumas modalidades, o agente ativo na partícula de peptídeo aqui descrito não está ligado covalentemente a um componente da partícula. Sem limitações, oO agente ativo pode ser absorvido/adsorvido na superfície da partícula, encapsulado na partícula, ou distribuído (homogeneamente ou não-homogeneamente) em toda a partícula.

[222] Em geral, qualquer relação de agente ativo a peptídeos anfifílicos pode estar presente na partícula de peptídeo aqui descrita. Por conseguinte, em algumas modalidades, a relação do agente ativo para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de 100:1 a cerca de 1:100.000. Em algumas modalidades, a relação do agente ativo para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de 1:1 à cerca de 1:100.000. Em algumas modalidades, a relação do agente ativo para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de l:1 a cerca de 1:10.000. Em algumas modalidades, a relação do agente ativo para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de 1:1 a cerca de 1:1000. Em algumas modalidades, a relação do agente ativo para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de 1:1 à cerca de 1:100. Em algumas modalidades, a relação do agente ativo para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de 1:1 a cerca de 1:10. Em algumas modalidades, a relação do agente ativo para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de 50:1 a cerca de 1:500. Em algumas modalidades, a relação do agente ativo para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de 10:1 a cerca de 1:25.

[223] Em algumas modalidades, a partícula de peptídeo pode compreender um ligando. Sem limitações, um ligando pode ser ligado covalentemente a um componente, por exemplo, peptídeo anfifílico, das partículas. Em algumas modalidades, um ligando não está ligado covalentemente a um componente da partícula, por exemplo, o ligando é absorvido/adsorvido na superfície da partícula, o ligando é encapsulado na partícula, ou o ligando é distribuído (homogeneamente ou não-homogeneamente) em toda a partícula. Em algumas modalidades, o ligando é um ligando alvo.

[224] Em algumas modalidades, o ligante forma uma camada sobre a superfície da partícula de peptídeo, por exemplo, o ligante forma uma coroa em torno da partícula. Quando o ligante forma uma camada sobre a superfície da partícula, a espessura da camada pode variar de cerca de 1 nm a cerca de 100 nm. Em algumas modalidades, a espessura da camada é de cerca de 10 nm.

[225] Em geral, qualquer relação de um ligando para os peptídeos anfifílicos pode estar presente na partícula. Por conseguinte, em algumas modalidades, a relação do ligando para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de 1000:1 a cerca de 1:1.000.000. Em algumas modalidades, a relação do ligando para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de 1:10 a cerca de 1:1.000.000. Em algumas modalidades, a relação do ligando para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de 500:1 a cerca de 1:500. Em algumas modalidades, a relação do ligando para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de 100:1 à cerca de 1:250. Em algumas modalidades, a relação do ligando para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de 1:10 a cerca de 1:1000.

[226] Em algumas modalidades, uma partícula de peptídeo pode compreender tanto um agente ativo (por exemplo, um agente terapêutico) e um ligando. Em algumas modalidades, uma partícula de peptídeo pode compreender um agente ativo (por “exemplo, um agente terapêutico) distribuído dentro da partícula e um ligando sobre a superfície exterior da partícula.

[227] Sem limitações, os diferentes tipos de partículas de peptídeo podem ser fabricados, por exemplo, (1) as partículas formadas a partir de apenas peptídeos anfifílicos; (2) as partículas formadas a partir dos peptídeos anfifílicos para que uma molécula de interesse, por exemplo, um agente ativo ou um ligando, absorve/adsorve ou forma um revestimento sobre um núcleo de peptídeos anfifílicos; (3) as partículas formadas a partir de um núcleo formado por uma molécula de interesse, por exemplo, um agente ativo ou um ligando, o qual é revestido com uma camada de peptídeos anfifílicos; (4) as partículas formadas a partir de peptídeos anfifílicos para que uma molécula de interesse, por exemplo, um agente ativo ou um ligando, seja ligado covalentemente; (5) as partículas formadas a partir de uma mistura de uma molécula de interesse (por exemplo, um agente ativo ou um ligando) e peptídeos anfifílicos; e (6) as partículas formadas, de modo a compreender uma mistura geralmente homogênea de uma molécula de interesse, por exemplo, um agente ativo ou um ligando com os peptídeos anfifílicos, ou quaisquer combinações dos mesmos. Por exemplo, uma partícula de peptídeo pode ser formada a partir dos peptídeos anfifílicos a que uma primeira molécula de interesse, por exemplo, um agente ativo ou um ligando, absorve/adsorve ou forma um revestimento sobre um núcleo de peptídeos anfifílicos, em que o núcleo de peptídeos anfifílicos ainda compreende uma segunda molécula de interesse,&S por exemplo, um agente ativo. Nestas modalidades, a segunda molécula de interesse pode ser a mesma como ou diferente a partir da primeira molécula de interesse.

[228] Em algumas modalidades, uma partícula de peptídeo pode ainda compreender um polímero, por exemplo, um polímero biocompatível. Tal como aqui utilizado, o termo "biocompatível" significa exposição de essencialmente nenhuma citotoxicidade ou imunogenicidade, enquanto em contato com fluidos ou tecidos corporais. Tal como aqui utilizado, o termo "polímero" refere-se a oligômeros, co- oligômeros, polímeros e co-polímeros, por exemplo, em blocos ao acaso, em multiblocos, estrela, enxertados,

copolímeros de gradiente e combinação dos mesmos.

[229] O termo "polímero biocompatível" refere-se a polímeros que são não-tóxicos, inertes quimicamente, e substancialmente não- imunogênicos quando utilizados internamente em um indivíduo, e que são substancialmente insolúveis no sangue. O polímero biocompatível pode ser ou não-biodegradável ou, de preferência, biodegradável. De preferência, o polímero biocompatível é também não- inflamatório quando empregado in situ.

[230] Os polímeros biodegradáveis são descritos na técnica. Exemplos de polímeros biodegradáveis adequados incluem, mas não limitados a, polímeros de cadeia linear, tais como polilactídeos, poliglicólidos, policaprolactonas, copolímeros de ácido poliláctico e ácido poliglicólico, polianidridos, poliepsilon caprolactona, poliamidas, poliuretanos, poliesteramidas, poliortoésteres, polidioxanonas, poliacetais, policetais, policarbonatos, poliortocarbonatos, polidihidropiranos, polifosfazenos, polihidroxibutiratos, polihidroxivaleratos, oxalatos de polialquileno, succinatos de polialquileno, poli(ácido málico), poli (aminoácidos), polivinilpirrolidona, polietileno glicol, polihidroxicelulose, metacrilato de polimetila, quitina, quitosano, copolímeros de ácido poliláctico e ácido poliglicólico, poli(sebacato de glicerol) (PGS), e copolímeros, terpolímeros, e copolímeros incluindo um ou mais dos anteriores. Outros polímeros biodegradáveis incluem, por exemplo, gelatina, colágeno, seda, quitosano, alginato, celulose, ácidos polinucléicos, etc.

[231] os polímeros biocompatíveis não- biodegradáveis adequados incluem, a título de exemplo, os acetatos de celulose (incluindo o diacetato de celulose), polietileno, polipropileno, polibutileno, terftalato de polietileno (PET), cloreto de polivinila, poliestireno, poliamidas, náilon, policarbonatos, polissulfetos, polissulfonas, hidrogéis (por exemplo, acrílicos), poliacrilonitrila, polivinilacetato, butirato de acetato de celulose, nitrocelulose, copolímeros de uretano/carbonato, copolímeros de estireno/ácido maléico, poli (etilenoimina), poloxômeros (por exemplo, Plurônico, tal como Poloxâmeros 407 e 188), Hialuron, heparina, agarose, Pullulan, e copolímeros incluindo um ou mais dos anteriores, tais como os copolímeros de etileno/álcool vinílico (EVOH).

[232] As partículas de peptídeo também podem compreender as porções adicionais que podem prolongar o tempo de vida das partículas in vivo. Por exemplo, as partículas de peptídeo podem compreender as porções funcionais que melhoram o tempo de vida in vivo das partículas no sangue. Uma porção exemplar para aumentar o tempo de vida in vivo é o polietileno glicol. Por conseguinte, as partículas de peptídeo podem compreender polietileno glicol, para além do peptídeo anfifílico.

Modalidades adicionais das partículas de peptídeo

[233] Em uma modalidade, uma partícula de peptídeo aqui descrita compreende modalidades particulares de um peptídeo anfifílico aqui descrito. O peptídeo anfifílico presente nesta modalidade da partícula de peptídeo compreende um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptidil hidrofílico, em que o segmento de peptidil hidrofóbico compreende uma sequência de aminoácido de (Trp-Leu)m- (Trp)n Ou (Leu-Trp)p-(Leu)g, em que cada Trp é D-Trp ou L-Trp e cada Leu é D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro de 1 a 5, en eq são independentemente O ou 1, desde que quando Trp é D-Trp, em seguida, Leu é L-Leu, e quando Trp é L-Trp, em seguida, Leu é D- Leu, Ou vice-versa; e em que O segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de aminoácido de (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a 15, eemquea partícula de peptídeo compreende ainda, na sua superfície exterior um ligando aqui descrito.

[234] Em algumas modalidades, as partículas de peptídeo podem compreender uma ou mais modalidades de um peptídeo anfifílico descrito anteriormente na seção "Peptídeos anfifílicos exemplares". Em uma modalidade, a partícula de peptídeo pode compreender um peptídeo anfifílico com uma sequência de aminoácido de (L-Lys)-(L- Lys) - (L-Lys) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D- Leu) - (L-Trp)-X, em que X está ausente ou NHo. Conforme descrito anteriormente, em algumas modalidades, o pelo menos um dos resíduos de Lys do segmento de peptidil hidrofílico ou o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico é acetilado. Em algumas modalidades, todos os resíduos de Lys do segmento de peptidil hidrofílico estão acetilados. Em algumas modalidades, O grupo amino N- terminal do peptídeo anfifílico e todos dos resíduos de Lys do segmento de peptidil hidrofílico estão acetilados.

[235] O ligando presente na superfície exterior da partícula de peptídeo pode ser selecionado com base nos tipos de moléculas alvo (por exemplo, mas não limitados a, células, bactérias, proteínas e/ou ácidos nucléicos) para que a partícula de peptídeo irá se ligar e/ou interagir. Por exemplo, para facilitar a distribuição de uma partícula de peptídeo aqui descrita para uma célula, um ligando específico para o receptor da superfície de célula pode ser selecionado, facilitando assim, a absorção da partícula de peptídeo pela célula, por exemplo, através de endocitose. Assim, algumas modalidades das partículas de peptídeo aqui descritas podem ser utilizadas para a distribuição direcionada de um agente ativo aqui descrito usando as partículas de peptídeo como veículos de distribuição ou veículos. Em uma modalidade, as partículas de peptídeo podem ser usadas para distribuir a uma célula um agente ativo que é impermeável à célula quando distribuído por ele mesmo.

[236] Conforme descrito anteriormente, em algumas modalidades, a partícula de peptídeo pode compreender uma mistura de peptídeos anfifílicos completamente mascarados (por exemplo, completamente acetilados) e parcialmente mascarados (por exemplo, parcialmente acetilados) aqui descritos. Nestas modalidades, a relação dos peptídeos anfifílicos completamente acetilados para os parcialmente mascarados pode variar de cerca de 95:5 a cerca de 1:1. Em certas modalidades, a partícula pode ainda compreender peptídeos anfifílicos não-mascarados (por exemplo, não- acetilados).

[237] Deste modo, uma partícula de peptídeo mista que compreende um peptídeo anfifílico completamente acetilado e um peptídeo anfifílico parcialmente acetilado ou não-acetilado é também aqui proporcionada. Em modalidades específicas, a partícula de peptídeo mista compreende um primeiro peptídeo anfifílico e um segundo peptídeo anfifílico, em que o primeiro e o segundo peptídeo anfifílico compreende, cada um independentemente, um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptidil hidrofílico, em que o segmento de peptidil hidrofóbico compreende uma sequência de aminoácido de (Trp-Leu)nm- (Trp)n ou (Leu-Trp)p-(Leu)a, em que cada Trp é D-Trp ou L-Trp e cada Leu é D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro de 1 a 5, ene q são independentemente 0 ou 1, desde que quando Trp é D-Trp, em seguida, Leu é L-Leu, e quando Trp é L-Trp, em seguida, Leu é D-Leu, ou vice-versa; enquanto que o segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de aminoácido de (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a 15. Além disso, o grupo amino N-terminal e todos dos resíduos de Lys do primeiro peptídeo anfifílico são acetilados, enquanto que pelo menos, o grupo amino N- terminal ou um dos resíduos de Lys do segundo peptídeo anfifílico não é acetilado. Em algumas modalidades, nenhum do grupo amino N-terminal e os resíduos de Lys do segundo peptídeo anfifílico são acetilados.

[238] Em algumas modalidades, a partícula de peptídeo mista pode compreender uma pluralidade (por exemplo, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou mais) dos primeiros peptídeos anfifílicos e uma pluralidade (por exemplo, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou mais) dos segundos peptídeos anfifílicos.

1239] Em modalidades particulares, os primeiros peptídeos anfifílicos e os segundo peptídeos anfifílicos podem ser selecionados a partir de qualquer uma ou mais modalidades de um peptídeo anfifílico descrito anteriormente na seção "Peptídeos anfifílicos exemplares". Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo peptídeo anfifílico podem compreender, cada um independentemente, uma sequência de aminoácido de (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Lys) - (L- Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) -X, em que X está ausente ou NH.

[240] A relação do primeiro peptídeo anfifílico para o segundo peptídeo anfifílico pode ser variada em função de um número de fatores, por exemplo, mas não limitada a, solubilidade e/ou estabilidade desejável da partícula de peptídeo, e/ou propriedades do agente ativo a serem carregadas no mesmo. Em algumas modalidades, a relação do primeiro peptídeo anfifílico para o segundo peptídeo anfifílico pode estar em uma faixa de cerca de 1:1000 a cerca de 1000:1. Em algumas modalidades, a relação do primeiro peptídeo anfifílico para o segundo peptídeo anfifílico pode estar em uma faixa de cerca de 1:1 à cerca de 1000:1. Em algumas modalidades, a relação do primeiro peptídeo anfifílico para o segundo peptídeo anfifílico pode estar em uma faixa de cerca de 2:1 a cerca de 500:1. Em algumas “modalidades, a relação do primeiro peptídeo anfifílico para o segundo peptídeo anfifílico pode estar em uma faixa de cerca de 3:1 a cerca de 200:1. Em outras modalidades, a relação do primeiro peptídeo anfifílico para o segundo peptídeo anfifílico pode estar em uma faixa de cerca de 5:1 a cerca de 100:1.

[241] Em algumas modalidades, a partícula de peptídeo mista pode ainda compreender um agente ativo aqui descrito. O agente ativo pode estar presente na partícula de peptídeo mista em qualquer quantidade, por exemplo, dependendo da capacidade de carregamento da partícula de peptídeo e/ou a capacidade de aglutinação do primeiro ou do segundo peptídeo anfifílico. Em algumas modalidades, a relação do agente ativo para o segundo peptídeo anfifílico pode estar em uma faixa de cerca de 1:1000 a 1:1. Em algumas modalidades, a relação do agente ativo para o segundo peptídeo anfifílico pode ser ou cerca de 1:100 a cerca de 1:10. Em algumas modalidades, a relação do agente ativo para o segundo peptídeo anfifílico pode estar em uma faixa de cerca de 1:50 a cerca de 1:5. Em algumas modalidades, a relação do agente ativo para o segundo peptídeo anfifílico pode estar em uma faixa de cerca de 1:10 à cerca de 1:2.

[242] Em algumas modalidades, a partícula de peptídeo mista pode ainda compreender, na sua superfície exterior — um ligando aqui descrito. Como descrito anteriormente, a seleção de um ligando pode ser determinada com base em uma molécula alvo (por exemplo, mas não são limitada a, células, bactérias, proteínas, ácidos nucléicos), à qual a partícula de peptídeo mista se liga. Exemplos não-limitativos de um ligando podem incluir um ligando receptor da superfície da célula ou uma proteína, tal como um anticorpo. Em algumas modalidades, o ligando pode estar covalentemente ligado a pelo menos um do primeiro e do segundo peptídeo anfifílico, por exemplo, O segmento de peptidil hidrofílico de pelo menos um do primeiro e o segundo peptídeo anfifílico.

[243] A partícula de peptídeo mista aqui descrita pode ser utilizada para encapsular qualquer agente ativo aqui descrito. Sem pretender estar limitado pela teoria, a presença do segundo peptídeo anfifílico na partícula de peptídeo mista pode fornecer uma carga catiônica para aglutinar com moléculas de ácido nucléico aniônicas. Assim, em algumas modalidades, O agente ativo pode incluir uma molécula de ácido nucléico.

[244] Outro aspecto aqui fornecido aqui é direcionado à utilização de uma ou mais modalidades da partícula de peptídeo mista que compreende um primeiro peptídeo anfifílico e um segundo peptídeo anfifílico aqui descritos para a distribuição de uma molécula de ácido nucléico para uma célula. Por conseguinte, em algumas modalidades, a partícula de peptídeo mista para uso na distribuição de uma molécula de ácido nucléico a uma célula compreende um primeiro peptídeo anfifílico, um segundo peptídeo anfifílica, e uma molécula de ácido nucléico. Em algumas modalidades, a partícula de peptídeo mista pode compreender uma pluralidade (por exemplo, pelo menos 2 ou mais) de moléculas de ácido nucléico ou oligonucleotídeos (por exemplo, DNA ou RNA incluindo, mas não limitado a, SiRNA, ShRNA, mMiARN, ou quaisquer combinações dos mesmos). Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucléico ou oligonucleotídeos podem ser concebidos para uso em intervenções terapêuticas, por exemplo, terapia de gene ou terapia de SiRNA. Montagem de partícula de peptídeo

[245] As partículas de peptídeo aqui descritas podem ser montadas por um procedimento de uma só etapa. Por exemplo, partículas de peptídeo podem ser convenientemente montadas a partir de peptídeo anfifilico dissolvido por adição de água: uma emulsão formada espontaneamente como uma mistura ternária (peptídeo, solvente orgânico, H2O0) é trazida para a região de duas fases (peptídeo, HO). Enquanto o processo de emulsificação é similar ao efeito ouzo, gotículas de peptídeo anfifílico endurecem para partículas sólidas como o solvente orgânico é removido. Moléculas neutras, bem como carregadas migram de forma eficiente para a fase dispersa e ficam presas durante a formação de partícula.

[246] Em geral, as partículas de peptídeo que compreendem um agente ativo e um ligando podem ser montadas em cerca de 15 minutos, utilizando o procedimento descrito no presente documento. Além disso, o sistema permite o ajustamento simples do tamanho de partícula e aprisiona os agentes ativos de densidade muito elevada.

[247] Sem desejar estar limitado por uma teoria, a simplicidade do sistema e formação de protocolo originam na interação conjunta de todos os componentes envolvidos de uma partícula de peptídeo: peptídeos anfifílicos não são apenas material da matriz, mas substituem as rotinas de encapsulação devido a sua elevada afinidade para outros componentes, tais como um ligando e/ou um agente ativo. O processo de encapsulação do agente ativo mais provavelmente se assemelha a uma extração líquida de duas fases, em que O agente ativo escapa para a fase aquosa e se acumula em gotículas de peptídeos. Além disso, a solubilidade do peptídeo em solventes orgânicos leves permite a dissolução simultânea e automontagem "* de todos os componentes envolvidos. A presença de um ligando durante a emulsificação dos peptídeos pode resultar na formação de uma coroa de ligando. Além disso, a presença do ligando pode permitir o ajustamento simples do tamanho da partícula, devido a sua atividade superficial e, portanto, no início de estabilização da emulsão de peptídeo.

Composições Farmacêuticas

[248] Para a administração a um indivíduo, as partículas de peptídeo e agente ativo - complexos de peptídeo anfifílicos aqui descritos podem ser fornecidos em composições farmaceuticamente aceitáveis.

Estas composições

—farmaceuticamente aceitáveis compreendem uma partícula ou um agente ativo - complexo de peptídeo anfifílico formulado junto com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis (aditivos) e/ou diluentes.

Tal como descrito em detalhe abaixo, as composições farmacêuticas aqui descritas podem ser especialmente formuladas para a administração em forma sólida ou líquida, incluindo as adaptadas para o seguinte:

(1) administração oral, por exemplo, remédios líquidos (soluções ou suspensões aquosas ou não-aquosas), gavagem, pastilhas, drágeas, cápsulas, pílulas, comprimidos (por exemplo, aqueles destinados para administração bucal, sublingual, e absorção sistêmica), bolus, pós, grânulos, pastas para aplicação à língua; (2) administração parenteral, por exemplo, por injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou epidural como, por exemplo,

uma solução estéril ou suspensão, ou uma formulação de liberação prolongada; (3) aplicação tópica, por exemplo, como um creme, pomada, ou um emplastro de distribuição controlada ou pulverização aplicada à pele; (4) por via intravaginal ou intra-retal, por exemplo, como um pessário,

creme ou espuma; (5) por via sublingual; (6) por via ocular; (7) por via transdérmica; (8) por via transmucosa, ou (9) por via nasal. Além disso, os compostos podem ser implantados em um paciente ou injetados usando um sistema de distribuição de medicamento. Ver, por exemplo, Urquhart, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, ed. "Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, New York, 1981); Patente U.S. Nº 3.773.919; e Patente U.S. Nº 35 3.270.960, O conteúdo de todos os quais é aqui incorporado por referência.

[249] Conforme aqui utilizado, o termo "farmaceuticamente aceitável" refere-se a aqueles compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do bom julgamento médico, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, Ou outro problema ou complicação, comensurável com uma relação de benefício/risco razoável.

[250] Conforme aqui utilizado, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" significa um material farmaceuticamente aceitável, composição ou veículo, tal como um enchimento líquido ou sólido, diluente, excipiente, auxiliar de fabricação (por exemplo, lubrificante, talco, magnésio, cálcio ou estearato de zinco, ou ácido esteárico), ou material de encapsulamento solvente,

envolvido em carregar ou transportar o composto em epígrafe a partir de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão, ou porção do corpo.

Cada veículo deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não-prejudicial para o paciente.

Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose, e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, etilcelulose, celulose microcristalina e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio e talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositório; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de sésamo, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tal como propileno glicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol (PEG); (12) ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes de tampão, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirogênio; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções tamponadas de pH, (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (22) agentes de volume, tais como polipeptídeos e aminoácidos; (23) componente de soro, tais como albumina do soro, HDL e LDL; (22) álcools C2-C12, tal como o etanol; e (23) outras substâncias compatíveis não-tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas. Os agentes umedecedores, agentes de coloração, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, agentes aromatizantes, agentes perfumantes, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na formulação. Os termos, tais como "excipiente", "veículo", "veículo farmaceuticamente aceitável" ou similares são aqui utilizados alternadamente.

[251] Conforme aqui utilizado, o termo "administrar" refere-se à colocação de uma composição em um indivíduo por um método ou via que resulta, pelo menos, na localização parcial da composição em um local desejado, de tal modo que O efeito desejado é produzido. Vias de administração incluem tanto a administração local e sistêmica. Geralmente, a administração local resulta em mais do agente terapêutico a ser distribuído para um local específico em relação a todo o corpo do indivíduo, ao passo que, os resultados da administração sistêmica na distribuição do agente terapêutico para essencialmente a totalidade do corpo do indivíduo.

[252] A administração a um indivíduo pode ser por qualquer via adequada conhecida na técnica, incluindo, mas não são limitada a, vias oral ou parenteral, incluindo administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, vias aéreas (aerossol), pulmonar, nasal, retal, e tópica (incluindo bucal e sublingual).

[253] Modos exemplares de administração incluem, mas não limitados a, injeção, infusão, instilação, inalação, ou ingestão. "Injeção" inclui, sem limitação, injeção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, Ssubcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intra-espinal, intracérebro espinal, e intra-esternal e infusão. Em algumas modalidades dos aspectos aqui descritos, a administração é por infusão intravenosa ou por injeção.

[254] Conforme aqui utilizado, um "indivíduo" significa um ser humano ou animal. Normalmente, o animal é um vertebrado, tal como um primata, roedor, animal doméstico ou de caça. Primatas incluem chimpanzés, macacos cinomólogos, macacos-aranha, e macacos, por exemplo, Rhesus. Roedores incluem camundongos, ratos, marmotas, furões, coelhos, e hamsters. Os animais domésticos e de caça incluem vacas, cavalos, porcos, veados, bisontes, búfalos, espécies de felinos, por exemplo, gato doméstico,

espécies caninas, por exemplo, cão, raposa, lobo, espécies de aves, por exemplo, frango, emu, avestruz, e peixes, por exemplo, a truta, o peixe-gato e salmão. Paciente Ou indivíduo inclui qualquer subconjunto dos precedentes, por exemplo, todos os acima, mas excluindo um ou mais grupos ou espécies, tais como seres humanos, primatas ou roedores. Em certas modalidades dos aspectos aqui descritos, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um primata, por exemplo, um ser humano. Os termos "paciente" e "indivíduo" são aqui utilizados indiferentemente. Os termos "paciente" e "indivíduo" são aqui utilizados indiferentemente. Um indivíduo pode ser masculino ou feminino.

[255] De preferência, o indivíduo é um mamífero. O mamífero pode ser um ser humano, primata não-humano, camundongo, rato, cão, gato, cavalo, ou vaca, mas não é limitado a estes exemplos. Mamíferos diferentes dos seres humanos podem ser vantajosamente utilizados como indivíduos que representam modelos animais de desordens associadas com a doença auto-imune ou inflamação. Além disso, os métodos e composições aqui descritos podem ser utilizados para tratar animais domésticos e/ou animais de estimação. Kits

[256] Outro aspecto proporcionado aqui refere-se a um kit que compreende uma partícula de peptídeo, uma formulação que compreende uma partícula de peptídeo, ou componentes para fabricar uma partícula de peptídeo ou uma formulação que compreende uma partícula de peptídeo aqui descrita.

[257] Em algumas modalidades, as composições Ou kits para preparar uma ou mais modalidades de uma partícula de peptídeo ou uma partícula de peptídeo mista são aqui fornecidos. Em algumas modalidades, a composição ou o kit pode compreender um peptídeo anfifílico aqui descrito. O peptídeo anfifílico fornecido na composição ou kit pode ser fornecido em um recipiente. Dependendo de uma escolha do usuário de uma partícula de peptídeo ou partícula mista aqui descrita para ser produzida, em algumas modalidades, a composição ou o kit pode compreender um primeiro peptídeo anfifílico e um segundo peptídeo anfifílico aqui descrito. O peptídeo anfifílico pode ser fornecido em pó ou pó liofilizado. Em algumas modalidades, a composição ou kit pode ainda compreender, pelo menos, um reagente, por exemplo, para a reconstituição do peptídeo anfifílico em pó, por emulsificação de uma mistura de montagem de partícula, ou ambos. Em algumas modalidades, a composição ou o kit pode ainda compreender um ligando aqui descrito, por exemplo, fornecido em um recipiente separado. Em algumas modalidades, a composição ou o kit pode ainda compreender um agente ativo a ser encapsulado na partícula de peptídeo. O agente ativo pode ser fornecido em um recipiente separado.

[258] Em adição aos componentes acima mencionados, o kit pode incluir o material de informação. O material de informação pode ser descritivo, de instrução, de marketing ou outro material que se relaciona com os métodos aqui descritos e/ou o uso de agregados para os métodos descritos neste documento. Por exemplo, o material de informação descreve os métodos para administrar as partículas a um indivíduo. O kit pode também incluir um dispositivo de distribuição.

[259] Em uma modalidade, o material de informação pode incluir as instruções para administrar a formulação em um modo adequado, por exemplo, em uma dose adequada, forma de dosagem, ou o modo de administração (por exemplo, uma dose, forma de dosagem, ou modo de administração descrito aqui). Em outra modalidade, o material de informação pode incluir as instruções para identificar um indivíduo adequado, por exemplo, um ser humano, por exemplo, um ser humano adulto. O material de informação dos kits não é limitado na sua forma. Em muitos casos, o material de informação, por exemplo, instruções, é fornecido no material impresso, por exemplo, um texto impresso, desenho e/ou fotografia, por exemplo, uma etiqueta ou uma folha impressa. No entanto, o material de informação também pode ser fornecido em outros formatos, tais como o Braille,

material legível por computador, gravação de vídeo, ou gravação de áudio. Em outra modalidade, oO material de informação do kit é um link ou informações de contato, por exemplo, um endereço físico, endereço de e-mail, hiperlink, site, ou número de telefone, onde um usuário do kit pode obter informação substantiva sobre a formulação e/ou seu uso nos métodos aqui descritos. Claro que, o material de informação pode também ser fornecido em qualquer combinação de formatos.

[260] Em algumas modalidades, os componentes individuais da formulação podem ser fornecidos em um recipiente. Alternativamente, pode ser desejável para proporcionar os componentes da formulação em separado em dois ou mais recipientes, por exemplo, um recipiente para a preparação de peptídeo anfifílico, e pelo menos uma outra por um composto veículo. Os diferentes componentes podem ser combinados, por exemplo, de acordo com as instruções fornecidas com o Kit. Os componentes podem ser combinados de acordo com um método aqui descrito, por exemplo, para preparar e administrar uma composição farmacêutica.

[261] Em adição à formulação, a composição do kit pode incluir outros ingredientes, tal como um solvente ou tampão, um estabilizador ou um conservante, e/ou um segundo agente para o tratamento de uma condição ou desordem aqui descrita. Em alternativa, os outros ingredientes podem ser incluídos no kit, mas em diferentes composições ou recipientes diferentes da formulação. Em tais modalidades, Oo Kit pode incluir instruções para a mistura da formulação e dos outros componentes, ou para o uso do oligonucleotídeo junto com os outros ingredientes.

[262] A formulação pode ser fornecida em qualquer forma, por exemplo, forma líquida, seca ou liofilizada. É preferível que a formulação seja substancialmente pura e/ou estéril. Quando a formulação é fornecida em uma solução líquida, a solução líquida é, de preferência, uma solução aquosa, com uma solução aquosa estéril sendo preferida. Quando a formulação é fornecida como uma forma seca, em geral, a reconstituição é pela adição de um solvente adequado. O solvente, por exemplo, água estéril ou tampão, pode opcionalmente ser fornecido no kit.

[263] Em algumas modalidades, o kit contém recipientes separados, divisórias ou compartimentos para a formulação e material de informação. Por exemplo, a formulação pode ser contida em uma garrafa, frasco, ou seringa, e o material de informação pode ser contido dentro de uma capa de plástico ou uma embalagem. Em outras modalidades, os elementos separados do kit estão contidos dentro de um recipiente único, não-dividido. Por exemplo, a formulação está contida em uma garrafa, frasco ou seringa, que tem ligado a si o material de informação sob a forma de um rótulo.

[264] Em algumas modalidades, o kit inclui uma pluralidade, por exemplo, uma embalagem, de recipientes individuais, cada um contendo uma ou mais formas de dosagem unitária da formulação. Por exemplo, o kit inclui uma pluralidade de seringas, ampolas, embalagens de folha, ou embalagens de blister, cada uma contendo uma única dose unitária da formulação. Os recipientes dos kits podem ser estanques ao ar e/ou à prova de água.

[265] Modalidades dos vários aspectos aqui descritos podem ser ilustradas pelos seguintes parágrafos numerados.

1. Uma partícula de peptídeo que compreende “um peptídeo anfifílico, o peptídeo anfifílico que compreende um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptidil hidrofílico, em que o segmento de peptidil hidrofóbico compreende uma sequência de aminoácido de (Trp-Leu)n- (Trp)n ou (Leu- Trp)p- (Leu)a, em que cada Trp é D-Trp ou L-Trp e cada Leu é D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro de 1 a 5, eneq são independentemente O ou 1, desde que quando Trp é D-Trp, em seguida, Leu é L-Leu, e quando Trp é L-Trp, em seguida, Leu é D-Leu, ou vice-versa; e em que o segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de aminoácido de (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a 15, e em que a partícula de peptídeo ainda compreende, na sua superfície exterior um ligando.

2. A partícula de peptídeo de parágrafo 1, em que r é um número inteiro de 2 a 5,

3. A partícula de peptídeo de parágrafo 1 ou 2, em que r é um número inteiro de 3.

4. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-3, em que pelo menos um resíduo de Lys do segmento de peptidil hidrofílico ou o grupo amino N- terminal do peptídeo anfifílico é acetilado.

5. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-4, em que todos os resíduos de Lys do segmento de peptidil hidrofílico estão acetilados.

6. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-5, em que o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico é acetilado.

7. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-6, em que o segmento de peptidil hidrofóbico está ligado ao C-terminal do segmento de peptidil hidrofílico.

8. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-7, em que Leu é D-Leu.

9. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-8, em que Trp é L-Trp.

10. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-9, em que Lys é L-Lys.

11. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-10, em que m ou p está entre 1 e 3.

12. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-11, em que m ou p é 3.

13. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-12, en que nougél.

14. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-13, em que Oo peptídeo anfifílico compreende a sequência de aminoácido de (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) -X, em que X está ausente ou NH.

15. A partícula de peptídeo de parágrafo 14, em que pelo menos um dos resíduos de L-Lys é acetilado.

16. A partícula de peptídeo de parágrafo 14 ou 15, em que o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico é acetilado.

17. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-16, em que o peptídeo anfifílico tem um comprimento de cerca de 5 a cerca de 25 resíduos de aminoácidos.

18. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-17, em que pelo menos uma ligação amida de estrutura principal do peptídeo anfifílico é uma ligação de substituição de amida.

19. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-18, em que O peptídeo anfifílico compreende um BfB-amincácidoy um 7y-amincácido, Ou uma combinação dos mesmos.

20. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-19, em que pelo menos um do segmento de peptidil hidrófobo ou o segmento de peptidil hidrofílico compreende pelo menos um ponto de mutação.

21. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-20, em que o ligando inclui um ligando receptor da superfície da célula ou um anticorpo.

22. A partícula de peptídeo de parágrafo 21, em que O ligando receptor da superfície da célula inclui àa transferrina, EGF, folato, ou quaisquer combinações dos mesmos.

23. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-22, em que a espessura do ligando presente na superfície exterior da partícula de peptídeo varia de cerca de 1 nm à cerca de 100 nm.

24. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-23, em que a espessura do ligando presente na superfície exterior da partícula de peptídeo é de cerca de 10 nm.

25. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-24, em que o ligando é ligado covalentemente ao peptídeo anfifílico.

26. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-25, em que o ligando é ligado covalentemente ao segmento de peptidil hidrofílico do peptídeo anfifílico.

27. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-26, em que uma relação do ligando para o peptídeo anfifílico varia de cerca de 1:10 à cerca de 1:1.000.000.

28. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-27, em que a partícula tem um tamanho de cerca de 5 nm a cerca de 5000 nm.

29. A partícula de peptídeo de parágrafo 28, em que a partícula tem um tamanho de cerca de 30 nm à cerca de 150 nm.

30. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-29, em que o peptídeo de partícula compreende uma mistura de um peptídeo anfifílico completamente acetilado, de qualquer um dos parágrafos 1-29, e um peptídeo anfifílico parcialmente acetilado de qualquer um dos parágrafos 1-29.

31. A partícula de peptídeo do parágrafo 30, em que a relação do peptídeo anfifílico completamente acetilado para o parcialmente acetilado varia de cerca de 95:5 a cerca de 1:1.

32. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 30-31, em que a partícula de peptídeo ainda compreende um peptídeo anfifílico não-acetilado.

33. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-32, que ainda compreende um agente ativo.

34. A partícula de peptídeo de parágrafo 33, em que O agente ativo é disperso no interior da partícula.

35. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 33-34, em que o agente ativo não possui carga líquida.

36. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 33-34, em que oO agente ativo tem uma carga líquida.

37. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 33-36, em que O agente ativo é selecionado a partir do grupo que consiste em proteínas, peptídeos, antígenos, anticorpos ou porções dos mesmos, as moléculas similares a anticorpos, enzimas, ácidos nucléicos, aptâmeros, pequenas — moléculas, antibióticos, agentes farmaceuticamente ativos, agentes terapêuticos, agentes de contraste, e quaisquer combinações dos mesmos.

38. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 33-37, em que oO agente ativo é um agente farmaceuticamente ativo ou um agente terapêutico.

39. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 33-38, em que O agente ativo é uma molécula de ácido nucléico.

40. A partícula de peptídeo de parágrafo 39, em que a molécula de ácido nucléico inclui sSiRNA, mikRNA, ShRNA, ou quaisquer combinações dos mesmos.

41. A partícula de peptídeo de parágrafo 39, em que a molécula de ácido nucléico é DNA.

42. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 33-41, em que a relação do agente ativo para o peptídeo anfifílico varia de cerca de 1:1 a cerca de 1:10.000.

43. A partícula de peptídeo de parágrafo 42, em que a relação do agente ativo para o peptídeo anfifílico varia de cerca de 1:1 a cerca de 1:100, ou de cerca de 1:1 à cerca de 1:10.

44. Uso da partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 33-43 para a distribuição direcionada de um agente ativo.

45. Uso do parágrafo 44, em que o agente ativo é impermeável a célula quando o mesmo é distribuído a uma célula por si só.

46. Uso de uma composição que compreende um peptídeo anfifílico carregado positivamente como um agente de penetração celular ou agente de transfecção, em que o peptídeo anfifílico carregado positivamente compreende um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptidil hidrofílico, em que Oo segmento de peptidil hidrofóbico compreende uma sequência de aminoácido de (Trp-Leu)m-(Trp)n Ou (Leu- Trp)p- (Leu)a, em que cada Trp é D-Trp ou L-Trp e cada Leu é D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro de 1 a 5, e ne q são independentemente O ou 1, desde que quando Trp é D-Trp, em seguida, Leu é L-Leu, e quando Trp é L-Trp, em seguida, Leu é D-Leu, ou vice-versa; em que o segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de aminoácido de (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a 15; e em que pelo menos um dos resíduos de Lys ou oO grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico não é acetilado.

47. Uso do parágrafo 46, em que todos dos resíduos de Lys e o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico não estão acetilados.

48. Uso do parágrafo 46 ou 47, em que r é um número inteiro de 2 a 5.

49. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-48, em que r é um número inteiro de 3.

50. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-49, em que O segmento de peptidil hidrofóbico está ligado ao C-terminal do segmento de peptidil hidrofílico.

51. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-50, em que Leué D-Leu.

52. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-51, em que Trp é L-Trp.

53. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-52, em que Lys é L-Lys. 54, Uso de qualquer um dos parágrafos 46-53, em que m ou p está entre 1 e 3.

55. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-54, em que m ou p é 3.

56. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-55, em que n Oouqgqél.

57. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-56, em que O peptídeo anfifílico tem um comprimento de cerca de 5 a cerca de 25 resíduos de aminoácido.

58. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-57, em que pelo menos uma ligação amida de estrutura principal do peptídeo anfifílico é uma ligação de substituição de amida.

59. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-58, em que O peptídeo anfifílico compreende B-aminoácido, um aminoácido, ou uma combinação dos mesmos.

60. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-59, em que pelo menos um do segmento de peptidil hidrófobo ou o segmento de peptidil hidrofílico compreende, pelo menos, a mutação de ponto.

61. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-60, em que a partícula tem um tamanho de cerca de 5 nm a cerca de 5000 nm.

62. Uso do parágrafo 61, em que a partícula tem um tamanho de cerca de 30 nm à cerca de 150 nm.

63. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-62, em que o peptídeo anfifílico compreende a sequência de aminoácido de (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L- Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) -X, em que X está ausente ou NH2.

64. Uso de qualquer um dos parágrafos 46-63, em que a composição ainda compreende uma molécula de ácido nucléico a ser distribuída a uma célula.

65. Uma partícula de peptídeo que compreende “um primeiro peptídeo anfifílico e um segundo —"peptídeo anfifílico, o primeiro e o segundo peptídeo anfifílico cada um compreendendo independentemente, um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptidil hidrofílico, em que o segmento de peptidil hidrofóbico compreende uma sequência de amincácido de (Trp-Leu)nm- (Trp)n ou (Leu- Trp)p- (Leu)g, em que cada Trp é D-Trp ou L-Trp e cada Leu é D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro de 1 a 5, en eq são independentemente O ou 1, desde que quando Trp é D-Trp, em seguida, Leu é L-Leu, e quando Trp é L-Trp, em seguida, Leu é D-Leu, Ou vice-versa; e em que O segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de aminoácido de (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a 15, e em que Oo grupo amino N-terminal e todos dos resíduos de Lys do primeiro peptídeo anfifílico são acetilados; e em que pelo menos o grupo amino N-terminal ou um dos resíduos de Lys do segundo peptídeo anfifílico não é acetilado.

66. A partícula de peptídeo do parágrafo 65, em que nenhum do grupo amino N-terminal e os resíduos de Lys do segundo peptídeo anfifílico são acetilados.

67. A partícula de peptídeo do parágrafo 65 ou 66, ainda compreende um agente ativo.

68. A partícula de peptídeo do parágrafo 67, em que O agente ativo inclui uma molécula de ácido nucléico.

69. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-68, em que a relação do agente ativo para o segundo peptídeo anfifílico está em uma faixa de cerca de 1:1000 a 1:1, Ou de cerca de 1:100 a cerca de 1:10.

70. A partícula de peptídeo do parágrafo 69, em que a relação do agente ativo para O segundo peptídeo anfifílico está em uma faixa de cerca de 1:10 a cerca de 1:2.

71. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-70, em que a relação do primeiro peptídeo anfifílico para o segundo peptídeo anfifílico está em uma faixa de cerca de 1:1 a cerca de 1000:1, Ou cerca de 5:1 a cerca de 100:1.

72. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-71, ainda compreende na sua superfície exterior um ligando.

73. A partícula de peptídeo do parágrafo 72, em que o ligando inclui um ligando receptor da superfície da célula ou um anticorpo.

74. A partícula de peptídeo do parágrafo 73, em que o ligando receptor de superfície da célula inclui à transferrina, EGF, folato, ou quaisquer combinações dos mesmos.

75. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-74, em que a espessura do ligando presente na Superfície exterior da partícula de peptídeo varia de cerca de 1 nm a cerca de 100 nm.

76. A partícula de peptídeo de qualquer um do parágrafo 75, em que a espessura do ligando presente na superfície exterior da partícula de peptídeo é de cerca de 10 nm.

77. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-76, em que o ligando é ligado covalentemente a pelo menos um do primeiro e do segundo peptídeo anfifílico.

78. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-77, em que o ligando é ligado covalentemente ao segmento de peptidil hidrofílico de pelo menos um do primeiro e do segundo peptídeo anfifílico.

79. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-78, em que uma relação do ligando para o peptídeo anfifílico varia de cerca de 1:10 a cerca de 1:1.000.000.

80. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-79, em que r é um número inteiro de 2 a 5.

81. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-80, em que r é um número inteiro de 3.

82. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-81, em que o segmento de peptidil hidrofóbico está ligado ao C-terminal do segmento de peptidil hidrofílico.

83. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-82, em que Leu é D-Leu.

84. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-83, em que Trp é L-Trp.

85. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-84, em que Lys é L-Lys.

86. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-85, em que m ou p está entre 1 e 3.

87. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-86, em que m ou p é 3.

88. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-87, en que nouqgqél.

89. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-88, em que O primeiro e Oo segundo peptídeo anfifílico, cada um independentemente, tem um comprimento de cerca de 5 a cerca de 25 resíduos de aminoácidos.

90. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-89, em que pelo menos, uma ligação amida de estrutura principal do primeiro ou do segundo peptídeo anfifílico é uma ligação de substituição amida.

91. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-90, em que pelo menos um do primeiro e do segundo peptídeo anfifílico compreende um fB-amincoácido, um y-aminoácido, ou uma combinação dos mesmos.

92. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-91, em que pelo menos um do segmento de peptidil hidrófobo ou o segmento de peptidil hidrofílico compreende, pelo menos, um ponto de mutação.

93. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-92, em que a partícula de peptídeo tem um tamanho de cerca de 5 nm a cerca de 5.000 nm.

94. A partícula de peptídeo do parágrafo 93, em que a partícula de peptídeo tem um tamanho de cerca de 30 nm a cerca de 150 nm.

95. A partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-94, em que O primeiro e o segundo peptídeo anfifílico, cada um compreende independentemente, a sequência de aminoácido de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)- (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) -X, em que X está ausente ou NH.

96. Uso da partícula de peptídeo de qualquer um dos parágrafos 65-95 para a distribuição de uma molécula de ácido nucléico para uma célula.

97. Uso do parágrafo 96, em que a molécula de ácido nucléico inclui SiRNA, MiRNA, ShRNA, ou quaisquer combinações dos mesmos.

98. Uso do parágrafo 96, em que a molécula de ácido nucléico inclui DNA.

99. Um peptídeo anfifílico que compreende um segmento de peptidil hidrofóbico e um segmento de peptidil hidrofílico,

em que O segmento de peptidil hidrofóbico compreende uma sequência de 2 a 10 aminoácidos D e L alternados selecionados entre alanina, valina, isoleucina, leucina (Leu), fenilalanina, tirosina ou triptofano (Trp), e em que O segmento de peptidil hidrofílico compreende aminoácidos carregados, ou sem cargas, mas polares, ou derivados dos mesmos.

100. O peptídeo anfifílico do parágrafo 99, em que o segmento de peptidil hidrofóbico compreende uma sequência de aminoácido de (Trp-Leu)nm-(Trp)n Ou (Leu-Trp)p-(Leu)a, em que cada Trp é D-Trp ou L-Trp e cada Leu é D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro de 1 a 20, e n e q são independentemente O ou 1, desde que quando Trp é D-Trp, em seguida, Leu é L-Leu, e quando Trp é L-Trp, em seguida, Leu é D-Leu, ou vice-versa.

101. O peptídeo anfifílico do parágrafo 99 ou 100, em que o segmento de peptidil hidrofílico compreende pelo menos uma carga presente ou no N-terminal ou um resíduo de aminoácido.

102. O peptídeo anfifílico do parágrafo 101, em que pelo menos uma carga é catiônica ou uma carga aniônica.

103. O peptídeo anfifílico do parágrafo 99 ou 100, em que o segmento de peptidil hidrofílico compreende os aminoácidos sem cargas mas polares.

104. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99 a 103, em que o segmento de peptidil hidrofílico compreende pelo menos uma carga e pelo menos um aminoácido sem carga mas polar.

105. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99 a 104, em que um polímero do segmento de peptidil hidrofóbico está ligado de forma covalente.

106. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-105, em que pelo menos um grupo amino no peptídeo anfifílico é acetilado.

107. O peptídeo anfifílico do parágrafo 102, em que pelo menos uma carga catiônica é um resíduo de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em Lys, Arg, His, e quaisquer combinações dos mesmos.

108. O peptídeo anfifílico do parágrafo 102, em que pelo menos uma carga aniônica é um resíduo de amincácido selecionado a partir do grupo consistindo em Asp ou Glu, e quaisquer combinações dos mesmos.

109. O peptídeo anfifílico do parágrafo 103, em que pelo menos um resíduo de aminoácido sem carga mas polar é selecionado a partir do grupo que consiste em Ser, Thr, Asn ou Gln, e quaisquer combinações dos mesmos.

110. O peptídeo anfifílico do parágrafo 105, em que Oo polímero é selecionado a partir do grupo que consiste em PEG, PGG, PEO, policaprolactona, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polihidroxialcaboatos, dextranos, polianidridos, PLA-PGA, poliortoéster, polifumarato, hidrogéis, quaisquer polímeros biodegradáveis e/ou biocompatíveis “reconhecidos na técnica, e quaisquer combinações dos mesmos.

111. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99 a 110, em que o segmento de peptidil hidrofílico compreende uma sequência de aminoácido de (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a 15.

112. O peptídeo anfifílico do parágrafo 111, em que r é 3.

113. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-112, em que pelo menos um grupo amino é um grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico.

114. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-113, em que pelo menos um grupo amino é um resíduo de Lys do segmento de peptidil hidrofílico.

115. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-114, em que todos dos grupos amino no segmento de peptidil hidrofílico estão acetilados.

116. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-115, em que o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico e pelo menos um dos grupos amino no segmento de peptidil hidrofílico estão acetilados.

117. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-116, em que o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico e todos dos grupos amino do segmento de peptidil hidrofílico estão acetilados.

118. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos —99-117, em que o segmento de peptidil hidrofóbico está ligado ao C-terminal do segmento de peptidil hidrofílico.

119. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-118, em que Leu é D-Leu.

120. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-119, em que Trp é L-Trp.

121. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-120, em que Lys é L-Lys.

122. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-121, em que m ou p está entre 1 e 3.

123. O peptídeo anfifílico do parágrafo 122, em que m ou p és3.

124. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-123, em que n ou qêél.

125. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-124, em que Oo peptídeo anfifílico compreende a sequência de aminoácido de (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Lys) - (L- Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp), em que pelo menos um dos resíduos de L-Lys é acetilado.

126. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-125, em que o peptídeo anfifílico compreende a sequência de aminoácido de ACc- (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Lys) - (L- Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) .

127. O peptídeo anfifílico do parágrafo 126, em que pelo menos um dos resíduos de L-Lys é acetilado.

128. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-127, em que o peptídeo anfifílico compreende a sequência de aminoácido de Ac- (L-Lys (Ac) ) - (L-Lys (Ac) ) - (L- Lys(ACc))-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)- (L-Trp)-X, em que X está ausente ou NH2.

129. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-128, em que oO peptídeo anfifílico tem um comprimento de cerca de 5 a cerca de 25 resíduos de aminoácidos.

130. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-129, em que pelo menos uma ligação amida de estrutura principal é uma ligação de substituição de amida.

131. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-130, em que O peptídeo anfifílico compreende pelo menos um fB-amincácido, 7y-amincácido, Ou quaisquer combinações dos mesmos.

132. O peptídeo anfifílico de qualquer um dos parágrafos 99-131, em que pelo menos um do segmento de peptidil hidrófobo ou o segmento de peptidil hidrofílico compreende pelo menos um ponto de mutação.

133. Uma partícula que compreende um ou mais peptídeos anfifílicos de qualquer um dos parágrafos 99-132.

134. A partícula do parágrafo 133, que ainda compreende um ligando.

135. A partícula do parágrafo 133 ou 134, em que O ligando é um ligando receptor da Superfície da célula ou um anticorpo.

136. A partícula do parágrafo 135, em que O ligando receptor da superfície da célula é a transferrina ou EGF ou folato.

137. As partículas de qualquer um dos parágrafos 133- 136, em que o ligando está presente sobre uma superfície exterior da partícula.

138. A partícula de qualquer um dos parágrafos 133- 137, em que o ligando é adsorvido sobre a superfície exterior da partícula.

139. A partícula do parágrafo 137 ou 138, em que uma espessura do ligando presente na Superfície exterior da partícula varia de cerca de 1 nm à cerca de 100 nm.

140. A partícula do parágrafo 139, em que a espessura do ligando presente na superfície exterior da partícula é de cerca de 10 nm.

141. A partícula de qualquer um dos parágrafos 133- 140, em que O ligando é ligado covalentemente ao peptídeo anfifílico.

142. A partícula de qualquer um dos parágrafos 133- 141, em que o ligando é ligado covalentemente ao segmento de peptidil hidrofílico do peptídeo anfifílico.

143. A partícula de qualquer um dos parágrafos 133- 142, ainda compreende um agente ativo.

144. A partícula do parágrafo 143, em que O agente ativo é disperso no interior da partícula.

145. A partícula de qualquer um dos parágrafos 143- 144, em que Oo agente ativo não possui carga líquida.

146. A partícula de qualquer um dos parágrafos 143- 144, em que O agente ativo tem uma carga líquida.

147. A partícula de qualquer um dos parágrafos 143- 146, em que O agente ativo compreende pelo menos um grupo aromático.

148. A partícula de qualquer um dos parágrafos 143- 147, em que o agente ativo é selecionado dentre o grupo que consiste em proteínas, peptídeos, antígenos, anticorpos ou porções dos mesmos, moléculas similares a anticorpos, enzimas, ácidos nucléicos, aptâmeros, pequenas moléculas, antibióticos, agentes farmaceuticamente ativos, agentes terapêuticos, agentes de contraste, e quaisquer combinações dos mesmos.

149. A partícula de qualquer um dos parágrafos 143- 148, em que O agente ativo é um agente farmaceuticamente ativo.

150. A partícula de qualquer um dos parágrafos 143- 149, em que o agente ativo é uma molécula de ácido nucléico.

151. A partícula do parágrafo 150, em que a molécula de ácido nucléico é sSiRNA, miRNA ou shRNA.

152. A partícula do parágrafo 150, em que a molécula de ácido nucléico é DNA.

153. A partícula de qualquer um dos parágrafos 143- 152, em que a relação do agente ativo para os peptídeos anfifílicos varia de 1:1 a 1:100.000.

154. A partícula do parágrafo 153, em que a relação do agente ativo para os peptídeos anfifílicos varia entre 1:1 a cerca de 1:1.000.

155. A partícula de qualquer um dos parágrafos 134- 154, em que a relação do ligando para os peptídeos anfifílicos varia de cerca de 1:10 a cerca de 1:1.000.000.

156. A partícula de qualquer um dos parágrafos 133- 155, em que a partícula tem um tamanho de cerca de 5 nm a cerca de 5.000 nm.

157. A partícula do parágrafo 156, em que a partícula tem um tamanho de cerca de 30 nm a cerca de 150 nm.

158. A partícula de qualquer um dos parágrafos 133- 157, em que a partícula compreende uma mistura de peptídeos anfifílicos completamente acetilados e parcialmente acetilados de qualquer um dos parágrafos 99-132.

159. A partícula do parágrafo 158, em que a relação dos peptídeos anfifílicos completamente acetilados para os parcialmente acetilados varia de cerca de 95:5 a cerca de 1:1.

160. A partícula de qualquer um dos parágrafos 133- 159, em que a partícula ainda compreende peptídeos anfifílicos não-acetilados.

161. Um método de utilização de um composto de peptídeo anfifílico como um sistema de distribuição.

162. O método do parágrafo 161, em que o sistema de distribuição é um sistema de distribuição alvo.

163. O método do parágrafo 161 ou 162, em que oO sistema de distribuição é para fins terapêuticos ou de diagnóstico.

164. Uso de composições de peptídeo como o peptídeo de penetração de célula ou agente de transfecção, respectivamente.

Algumas definições selecionadas

[266] A menos que indicado de outra forma, ou implícito a partir do contexto, os seguintes termos e frases incluem os significados indicados abaixo. A menos que especificado de outra forma, ou resultado do contexto, os termos e frases abaixo não excluem o sentido que o termo ou frase adquiriu na técnica a que se refere. As definições são fornecidas para ajudar a descrever as modalidades particulares dos aspectos aqui descritos, e não se destinam a limitar a invenção reivindicada, por causa do escopo da invenção é limitado apenas pelas reivindicações. Além disso, salvo de outra forma requerido pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular.

[267] Conforme aqui utilizado o termo "que compreende" ou "compreende" é utilizado em referência às composições, métodos e respectivos componentes dos mesmos, que são essenciais para a invenção, ainda permite a inclusão de elementos não-especificados, quer essencial ou não. Além disso, o termo "que compreende" ou "compreende" inclui "consistindo essencialmente em" e "consistindo em".

[268] Conforme aqui utilizado, o termo "consistindo essencialmente em" refere-se aos elementos necessários para uma determinada modalidade. O termo permite a presença de elementos adicionais que não afetam materialmente as características básicas e novas ou funcionais da modalidade da invenção.

[269] o termo "consistindo em” refere-se a composições, métodos, e respectivos componentes dos mesmos,

como aqui descritos, que são exclusivos de qualquer elemento não-recitado naquela descrição da modalidade.

[270] Exceto nos exemplos operativos, ou onde indicado de outra forma, todos os números que expressam as quantidades de ingredientes ou condições de reação aqui utilizadas devem ser entendidos como modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". O termo "cerca de", quando utilizado em conexão com percentagens pode significar + 1%.

[271] Os termos singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referentes plurais a menos que O contexto indique claramente de outra forma. Da mesma forma, a palavra "ou" destina-se a incluir "e" a menos que Oo contexto indique claramente de outra forma.

[272] Embora métodos e materiais similares Ou equivalentes aos quais são descritos possam ser utilizados na prática ou testes da presente descrição, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. O termo "compreende" significa "inclui". A abreviatura "por exemplo" é derivada a partir de Latin exempli gratia, e é aqui utilizada para indicar um exemplo não-limitativo. Assim, a abreviatura "e.g." é sinônimo do termo "por exemplo",

[273] O termo "estatisticamente significativo" ou "significativamente" refere-se à significância estatística e, geralmente, significa um desvio padrão de dois (2SD)

acima ou abaixo de um nível de referência. O termo refere- se a evidência estatística de que existe uma diferença. O mesmo é definido como a probabilidade de tomar uma decisão de rejeitar a hipótese nula quando a hipótese nula é realmente verdade. A decisão é muitas vezes feita com o valor p.

[274] O termo "nanosfera" significa uma partícula com uma relação de aspecto no máximo de 3:1. O termo "relação de aspecto" significa a relação maior do eixo de um objeto para o eixo mais curto do objeto, onde os eixos não são necessariamente perpendiculares.

[275] O termo "dimensão mais longa" de uma partícula significa que o caminho mais longo direto da partícula. O termo "caminho direto" significa que o caminho mais curto contido dentro da partícula entre dois pontos na superfície da partícula. Por exemplo, uma partícula helicoidal que tem uma dimensão maior que corresponde ao comprimento da hélice se fosse esticado em uma linha reta.

[276] O termo "nanorod" significa uma partícula com uma dimensão mais longa de, no máximo de 200 nm, e com uma relação de aspecto de 3:1 a 20:1.

[277] O termo "nanoprisma" significa uma partícula que tem pelo menos duas faces não-paralelas ligadas por uma aresta comum.

[278] O "comprimento" de uma partícula significa a dimensão maior da partícula.

[279] A "largura" de uma partícula significa a média das larguras da partícula, e o "diâmetro" de uma partícula significa a média dos diâmetros de partícula.

[280] A dimensão "média" de uma pluralidade de partículas significa a média dessa dimensão para a pluralidade. Por exemplo, o "diâmetro médio" de uma pluralidade de nanoesferas significa a média dos diâmetros das nanoesferas, em que um diâmetro de uma única nanoesfera é a média dos diâmetros daquela nanosfera.

[281] Conforme aqui utilizado, o termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se aos sais não- tóxicos convencionais ou sais de amônio quaternários de um composto, por exemplo, a partir de ácidos inorgânicos ou orgânicos não-tóxicos. Estes sais podem ser preparados in situ no veículo de administração ou o processo de fabricação da forma de dosagem, ou por reação em separado de um composto purificado na sua forma de base livre ou ácida com um ácido ou base orgânica ou inorgânica adequada, e isolando o sal assim formado durante a subsequente purificação. Os sais não-tóxicos convencionais incluem aqueles derivados a partir de ácidos inorgânicos, tais como ácido sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico, e similares, e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos, tais como acético, propiônico, succínico,

glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, maléico, hidroximaléico, fenilacético, glutâmico, benzóico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzóico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, etano dissulfônico, oxálico, isotiônico, e similares. Ver, por exemplo, Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19 (1977), O conteúdo do qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[282] Em algumas modalidades dos aspectos aqui descritos, os sais representativos incluem os sais de bromidrato, cloridrato, sulfato, bissulfato, fosfato, nitrato, acetato, succinato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartarato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, e laurilsulfonato e similares.

[283] Conforme aqui utilizado, uma relação pode ser uma relação molar ou a relação em peso ou relação molar.

[284] Conforme aqui utilizado, um "peptídeo de penetração de célula" ou "peptídeo de penetração de célula" é definido como o peptídeo que possui a permeabilidade da membrana e é capaz de atravessar a membrana biológica ou uma barreira fisiológica. Peptídeos de penetração de célula

(CPPs) também são chamados de peptídeos permeáveis a célula, domínios de transdução de proteína (PTD) Ou sequências de translocação de membrana (MTS). CPPs têm a capacidade de translocar in vitro e/ou in vivo, as membranas das células de mamíferos e de entrar nas células, e direcionar um composto conjugado de interesse, tal como uma medicamento ou um marcador, para um destino celular desejado, por exemplo, para o citoplasma (citosol, retículo endoplasmático, aparelho de Golgi, etc.) ou o núcleo. Por conseguinte, o CPP pode direcionar ou facilitar a penetração de um composto de interesse através de um fosfolipídeo, mitocondrial, membrana nuclear ou endossomal. O CPP pode também direcionar um composto de interesse a partir do exterior da célula através da membrana do plasma, e para O citoplasma ou para um local desejado dentro da célula, por exemplo, o núcleo, o ribossoma, a mitocôndria, o retículo endoplasmático, um lisossoma, ou um peroxissoma. Alternativamente ou em adição, o CPP pode direcionar um composto de interesse através das barreiras de sangue- cérebro, trans-mucosa, hemato-retinal, pele, gastrointestinal e/ou pulmonares.

[285] A penetração através de uma membrana biológica ou uma barreira fisiológica pode ser determinada por vários processos, por exemplo, por um teste de penetração celular que tem uma primeira etapa de incubação para o CPP conjugado com um marcador na presença de células de cultura, seguido por uma etapa de fixação e, em seguida, a revelação da presença do peptídeo marcado no interior da célula. Em outra modalidade, a etapa de revelação pode ser feita con uma incubação de CPP na presença de anticorpos rotulados e direcionados contra o CPP, seguido por detecção no citoplasma ou na proximidade imediata do núcleo da célula, ou mesmo no seu interior, da reação imunológica entre a sequência de aminoácido de CPPs e os anticorpos rotulados. Revelação também pode ser feita marcando uma sequência de aminoácido no CPP e detectar a presença da marcação nos compartimentos celulares. Os testes de penetração de células são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. No entanto, por exemplo, foi descrito um teste de penetração celular no pedido de patente acima mencionado Nº WO 97/02840.

[286] Conforme aqui utilizado, o termo "agente de transfecção" ou "reagente de transfecção" refere-se a um composto que se liga a ou complexos com um composto e aumenta a sua entrada nas células. Geralmente, o termo agente de transfecção é usado para os compostos que aumentan a distribuição de ácidos nucléicos para uma célula.

[287] Para a extensão não já indicada, deve ser entendido por aqueles versados na técnica que qualquer uma das várias modalidades aqui descritas e ilustradas podem ser ainda modificadas para incorporar as características mostradas em qualquer uma das outras modalidades aqui descrita.

[288] Os exemplos a seguir ilustram algumas modalidades e aspectos da invenção. Será evidente para aqueles versados na técnica relevante que várias modificações, adições, substituições, e similares podem ser realizadas sem alterar o espírito ou escopo da invenção, e tais modificações e variações estão abrangidas dentro do escopo da invenção tal como definido nas reivindicações que se seguem. Os seguintes exemplos não limitam de qualquer forma a invenção.

EXEMPLOS Materiais exemplares e Métodos (para os Exemplos 1-2)

[289] Materiais exemplares: Todos os produtos químicos e reagentes, incluindo rosa de bengala (RB) (Aldrich 330000, 95%) e 5-carbóxi-fluoresceína (CF) (Sigma- Aldrich CO0537, 99%) foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich e utilizados sem purificação adicional a menos que indicado de outra forma a seguir. Aminoácidos protegidos com Fmoc e reagentes de acoplamento foram adquiridos a partir de IRIS Biotech e Novabiochem. Placas de cristalização de 24 cavidades foram adquiridas a partir de Hampton Research (Placa Cryschem).

[290] Sínteses de Peptídeo: Todos os peptídeos foram sintetizados em fase sólida utilizando a química do grupo de proteção de Fmoc.

As etapas individuais da síntese estão listadas na Tabela 1. Resina AM de Amida Rink (200 mg, carregando: 0,4 mmoles/g - 0,8 mmol/g) foi usada como fase sólida em uma seringa de 10 mL.

Todas as reações foram realizadas em dimetilformamida (DMF) anteriormente tratadas com óxido de alumínio para reduzir a abundância de aminas livres.

Aminoácidos de Fmoc foram dissolvidos em DMF (0,5 M) antes da síntese.

Os grupos de proteção de Fmoc foram fendidos duas vezes para cada etapa de acoplamento utilizando piperidina em DMF (40%). lH-benzotriazólio 1- [bis (dimetilamino)metileno] -5cloro, hexafluorofosfato(1-), 3-óxido (HCTU) foi utilizado como um agente de acoplamento e N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) dissolvida em 1-metil-2- pirrolidinona (NMP) como uma base.

Todos os acoplamentos foram realizados com 4 equivalentes (eq) de aminoácido, HCTU (4 eq) e DIPEA (12 eq) em relação à capacidade de carga da resina.

Depois de cada etapa de acoplamento, o grupo amino terminal não-reagido foi capeado por acetilação com uma solução de anidrido acético (5 eq) e DIPEA em DMF (5 eq). Tabela 1: Etapas automatizadas das sínteses de peptídeo de fase sólida de Fome de batelada

“IEtapal Solvente/Reagente Repetição Tempo Descrição (min) TT 40% del 5 Desproteção Piperidina/DMF de Fmoc 2 40% de 1 10 Desproteção Piperidina/DMF de Fmoc 3 DMF 5 1 Lavagem 4 4 eq de aminoácido 1 60 Acoplamento(a) protegido de Fmoc, 4 eq de HCTU, 12 eq de DIPEA DMF 2 1 Lavagem 6 5 eq de anidrido 1 20 Capeamento acético, 5 eq de final (D

DIPEA 7 DMF 3 1 Lavagem “MEM DMF de Alox/NMP; (Em DMF de Alox; em que DMF de AlOX é DMF anteriormente tratada com óxido de alumínio

[291] O mesmo protocolo foi aplicado em uma síntese ampliada utilizando resina AM de Amida Rink (5 g), onde a reação foi realizada em 500 ml do reator de vidro de 5 fase sólida utilizando 3 eq de aminoácidos e reagentes de acoplamento. O pH foi mantido constante a 9 ao longo da reação e a resina foi sondada para os grupos amino livres utilizando um teste de Kaiser e sulfonato de trinitrobenzeno (TNBS) após cada etapa de clivagem e acoplamento. Não houve necessidade para NMP como um co- solvente.

[292] Rendimentos totais variam geralmente entre 10% e 15% em -95% de pureza, que é típico para as sínteses de peptídeo de fase sólida.

[293] Após as sínteses, a resina de peptídeo foi lavada com DMF, álcool isopropílico, DMF, diclorometano e éter dietílico antes da mesma ter sido seca durante a noite em uma linha de vácuo. Clivagem do peptídeo a partir da resina e a remoção dos grupos de proteção foram realizadas com TFA frio (95%), trietilsilano (2,5%) e HO (2,5%). A mistura de clivagem-arrefecida em gelo foi adicionada à resina e incubada durante 2h-3h à temperatura ambiente. O coquetel de clivagem filtrado foi precipitado e lavado com éter diisopropílico frio (40 ml). O sólido branco foi seco durante a noite em uma linha de vácuo.

[294] Purificação de peptídeo: Todos os peptídeos foram purificados em uma HPLC de Proeminência Shimadzu com os parâmetros listados na Tabela 2. Os peptídeos brutos foram triturados e dissolvidos em uma mistura de DMF e acetonitrila (4 ml, 1:1), e diluídos com H2O (0,1% de TFA) a um volume final de 20 mL. A gelificação do produto bruto é eliminada sob estas condições do solvente. A amostra foi subsequentemente filtrada através de um filtro de seringa de 0,45 um de PTFE e bombeada sobre um Merck LiChrospher 100, coluna de RP-18e (5 um, 250-10), a uma taxa de fluxo de 4 ml/min e eluída com um gradiente linear de água (0,1% de TFA) para acetonitrila (MeCN). Amostra de eluição foi seguida pela absorção a 280 nm e coletada de acordo com os volumes de fração fixos de 5 mL.

A presença do peptídeo de produto foi quantificada por espectrometria de massa (Fig. 1A) e quantificada em ensaios de HPLC analíticos (Fig. 1B). As frações que continham mais do que 80% do produto (A>s0) foram aplicadas a uma segunda etapa de purificação sobre o mesmo material de cromatografia realizado com ácido acético (2%) em fase aquosa.

As frações que continham mais do que 95% do produto foram combinadas, neutralizadas com amônia e liofilizadas.

Tabela 2: Parâmetros de purificação por HPLC “Característica Preparativo — — Amalítico |. Solvente A — HO de bidist, 0,1% HO de bidist, 0,1% de TFA ou 2% de ACOH de TFA

Solvente B MeCN MeCN

Coluna LiChrospher 100, RP- LiChrospher 100, RP- 18e (5 um), 250-10 18e (5 um), 250-4,6

Gradiente 5% de B 3 95% de B, 20% de B 3 70% de 120 min B, 30 min

Volume injetado De acordo com as 25 uL exigências Taxa de fluxo 5 mL/min 1,5 de mL/min Detecção Az80 Az80 Divisão A > 500 MAU 7 Tamanho da 5 mL - fração a

[295] Modificação de pós-purificação: Acetilação de aminas primárias no N-terminal e nas lisinas foi realizada em peptídeo purificado dissolvido em DMF pela aplicação de um excesso de 40 vezes de anidrido acético e DIPEA. Completude da reacção foi controlada por espectrometria de massa antes da mistura de reação ser novamente purificada de acordo com o procedimento descrito anteriormente.

[296] Formação de grânulo e Co-montagem: CD3ac e rosa de bengala (RB) foram dissolvidos em H;0: EtOH em uma relação de 1:1 e misturado para se obter as concentrações RB finais de 61,5 x 10 -º M, 184,5 x 10º M, 307,5 x 10º M, 615 x 10º M e 922,5 x 10º M. A concentração de CD3ac foi mantida constante a 615 x 10º M. Troca de solvente para HO foi realizada por contra-evaporação em placas de cristalização de gota em repouso de 24 cavidades; 50 ul de solução de pré-mistura de CD3ac e RB foram aplicados a uma cavidade de gota em repouso e contra-evaporados quatro vezes contra 1 mL de HO durante 16 h. Todos os experimentos foram realizados em triplicado. Esferas de CD3ac precipitam após cerca de 30 min e sedimentam durante as próximas 5 h.

[297] A fim de quantificar a quantidade de RB encapsulado, o pélete de grânulo foi ressuspenso após o equilíbrio do solvente e normalizado com HO para um volume final de 100 ul. Posteriormente, todas as amostras foram centrifugadas durante 30 min a 20.000 g, antes 80 mL de sobrenadante foram separados. A fração de pélete restante foi diluída a 1:1 com 20 1puL de DMSO para dissolver as montagens de peptídeos. A concentração de RB em pélete e frações de sobrenadante foram determinadas por meios de absorção e corrigidas para RB nos 20 uL restantes da fração de pélete.

[298] Estimativa do volume de grânulo e Coeficiente de partição: A fim de estimar a densidade de precipitados de CD3ac, grânulos (307,5 x 10º M de CD3ac de concentração inicial) foram preparados grandes o suficiente para ultrapassar o limite de difração da luz visível. Uma concentração baixa de RB (10 x 10º M) foi co-precipitada para permitir uma estimativa do diâmetro do grânulo por microscopia de fluorescência confocal (1,35 um) e facilitar a contagem em um hemacitômetro (Hausser Scientific). Uma média de 72 grânulos foi contada em um volume de célula observado de 250.000 um? que é igual a uma fração de volume de grânulo de 3,71 x 10%. Uma solução de 50 uL de 307,5 x 10-* M de CD3ac contém, portanto, um volume de grânulo total de 18,6 nL e a densidade de CD3ac pode ser determinada (pcr3ac & 1,35 g/cmº). O coeficiente de partição logarítmico de RB em uma solução aquosa de grânulos de CD3ac foi calculado de acordo com los Pensassio = los (1)

[299] Espectroscopia visível ultravioleta: Medições de absorção foram realizadas em um Nanodrop 1000 (Thermo Scientific). Coeficientes de extinção de CD3ac em H20: etanol: DMSO a 1:1:2 (21.780 M º.cm!, 280 nm) e rosa de bengala em HO: DMSO a 1:1 (11.639 M1 .cm!, 562 nm) foram obtidos. DMSO foi utilizado para dissolver os precipitados de CD3ac após a montagen e reduzir a evaporação do solvente durante o tempo de preparação como as quantidades de volume de amostra medidas para apenas 4 QunL. Se necessário, a amostra foi ainda diluída com H2O: EtoH: DMSO a 1:1:2 para se obter as intensidades de absorção no intervalo linear do instrumento. Concentrações de RB foram determinadas por pesagem antes de co-montagem. Após a co-precipitação de CD3ac e RB, os péletes e as frações de sobrenadante foram diluídos a 1:1 com DMSO (CD3ac montado dissolve em uma solução de HO: DMSO a 1:1).

[300] Dicroísmo Circular (CD): Experimentos CD foram realizados em um Photophysics Chirascan Aplicado em cuvetes de QS (1 mm de comprimento de caminho). As concentrações das amostras foram ajustadas para se obter os valores dinodo entre 300 V e 500 V na faixa de comprimento de onda medida. As medições em branco foram realizadas com água imediatamente antes das medições da amostra. Cada espectro foi medido a partir de três varreduras em intervalos de comprimento de onda de 1 nm, cada uma das duas preparações de amostras independentes. Todos os espectros foram aplicados de modo suave a 2º ordem do algoritmo de Savitzky Golay. Os dados de CD são apresentados em unidades molares (deg cm? dmol-!1), mostrados como o grau de elipticidade molar.

[301] Microscopia de Elétron de Varredura: Microscopia eletrônica de varredura (SEM) foi realizada em um Hitachi S-4800. Suportes de amostra de SEM foram arrefecidos a -196ºC antes de uma gota da suspensão de grânulo ser diretamente aplicada à superfície de metal frio. A amostra congelada na placa foi subsequentemente liofilizada, atomizada com platina e analisada.

[302] Espalhamento de luz dinâmico: Espalhamento de luz dinâmico foi medido em uma plataforma ALV/CGS-8F baseada em um sistema goniômetro equipado com um correlator ALV/-5000/E e um laser de íon de argônio com um comprimento de onda de 633 nm (35 mW) em ângulos de espalhamento entre 30º e 150º.

Um correlator ALV-5000/E calcula a função de autocorrelação de intensidade de fóton g2(t). Todos os experimentos foram realizados em T = 293 K e avaliados por segundo a fim de ajuste cumulante (considerando forma de partícula esférica previamente determinada por SEM). Polidispersibilidades foram determinadas pelo algoritmo contin em todos os ângulos e nunca excederam 0,11. Medições dependentes angulares foram realizadas em etapas de 10º a partir de 30º a 150º.

A fim de evitar a influência de espalhamento múltiplo, experimentos dependentes da concentração foram realizados.

Para tanto dependência angular e concentração, um raio hidrodinâmico foi calculado a partir da fórmula de Stokes nº (2)

em que mn é o raio hidrodinâmico de partículas esféricas, D é a constante de difusão, ks é a constante de Boltzmann, T é a temperatura absoluta e nm é a viscosidade da água.

Um gráfico de 1/rn versus o ângulo (concentração) foi plotado e o raio hidrodinâmico (rn) foi calculado por extrapolação tanto na concentração e nas medições de ângulo para zero.

[303] Espectrometria de Massa: Espectrometria de massa foi realizada em um LTQ-Orbitrap (Thermo Scientific). ul de uma solução de CD3ac (10 x 10º M, HO: MeCN a 2:1) 5 foram carregados em uma coluna capilar de 100 um embalada com Magic C18 AQ (3 pum de diâmetro de partícula). O peptídeo foi eluído em um gradiente de 30 min a partir de HO (4% de ácido fórmico) para MeCN. O Orbitrap foi definido para o modo positivo e uma resolução de 10.000.

[304] Microscopia confocal: Imagens de microscopia confocal foram obtidas em um microscópio invertido motorizado Nikon Ti equipado com DIC, ópticas de fase e epi-fluorescência, um disco giratório confocal Yokagawa CSU-10 com 488 nm, 568 nm e 647 nm de linhas de laser. Um Hamamatsu ORCA-AG arrefecido com a câmera CCD foi usado para confocal, e um Hamamatsu ORCA-R2 foi usado para imagens de campo amplo. CD3ac (615 x 10% M) foi codissolvido com (a) RB (10 x 10º M), (b) CF (10 x 10º M) e (c) RB e CF (ambos 10 x 10º M) em um volume de 50 nuL de 50% de EtoH cada, e contraevaporado contra água. A suspensão resultante foi normalizada com H2O para um volume total de 50 1uL por amostra e, subsequentemente, aplicada ao microscópio confocal.

Exemplo 1: Nanopartículas CD3ac de Peptídeo Sólido -

Caracterização Estrutural

[305] Peptídeos hidrofóbicos convencionais são geralmente difíceis de obter sintetizados e purificados, e os mesmos também são geralmente difíceis de dissolver e tendem a precipitar para estruturas amorfas em solução aquosa. De acordo com vários aspectos e modalidades aqui descritas, a de novo concebido CD3ac de peptídeo que consiste em dez aminoácidos: ACc- (LK(AC) ) ;-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH?, onde LK(Ac)= L-lisina acetilada; LW= L-triptofano; DL= D-leucina, demonstram as propriedades diferentes de outros materiais peptídicos: CD3ac dissolve facilmente na maioria dos solventes orgânicos (EtOH, iPrOH, DMSO, DMF, MeCN) e precipitados para grânulos estruturados uniformemente como esferas sobre troca de solvente para água (Fig. 2A).

[306] O peptídeo de CD3ac (massa 1652,910 g/mol ; pureza >95%, A280) pode ser considerado anfifílico como a sua sequência é dividida em duas seções: um bloco hidrofóbico que consiste em alternar L-triptofano e D- leucina, e um hidrofílico consistindo em três L-lisinas acetiladas. Os termos "hidrofílico" e "hidrofóbico" como são aqui utilizados não são absolutos, mas descrevem a polaridade relativa dentro da sequência de aminoácido, por exemplo, de CD3ac. Embora o peptídeo de CD3ac seja hidrofóbico, o mesmo pode ser sintetizado em alto rendimento e purificado com procedimentos padrão em material de cromatografia C18 de fase reversa (ver a Seção de Materiais e Métodos descrita anteriormente), em comparação com peptídeos hidrofóbicos convencionais.

[307] CD3ac é capaz de precipitar a agregados esféricos na faixa de tamanho coloidal, e o mesmo pode fazê-lo em uma forma robusta e reprodutível. A troca do solvente foi realizada por diálise ou, a fim de reduzir o consumo de material, por contraevaporação contra água em placas de cristalização de 24 cavidades. à distribuição do tamanho da suspensão de grânulo de peptídeo resultante foi medida por microscopia de elétron de varredura (SEM, Figuras 2A-2C), e espalhamento de luz dinâmico dependente de ângulo e concentração (DLS, Figuras 3A-3B). ambos os métodos revelam um raio de partícula de cerca de 260 nm. Raio de esfera pode ser influenciado pela concentração de CD3ac inicialmente dissolvida (antes da troca de solvente) e situa-se na faixa de tamanho entre cerca de 200 nm e cerca de 1500 nm, que corresponde a concentrações iniciais de CD3ac entre 61,5 x 10º Ma 923 x 10º M. Os dados de DLS mostrados nas Figuras 3A-3B referem-se a partículas de CD3ac formadas a partir de CD3ac inicialmente dissolvido em 123 x 10º M. As partículas de peptídeo obtidas (grânulos) têm polidispersão baixa sem a necessidade de dimensionar os procedimentos, tal como a sonicação ou extrusão, que são normalmente aplicados para conseguir uma estreita distribuição de tamanho em, por exemplo, suspensões de lipídeos.

[308] A estrutura secundária pode desempenhar, em parte, um papel crucial na montagem de grânulos de CD3ac. Sem desejar estar limitado pela teoria, devido ao espalhamento da luz, que pode ser difícil para obter dados de dicroismo circular quantificáveis de suspensões coloidais contendo as partículas maiores do que 50 nm em diâmetro. Assim, quatro derivados estruturais de CD3ac (CDI, CD2, CD3 e CD4), que não estão acetilados, e portanto, são carregados e solúveis em água (ver Tabela 3) foram sintetizados.

[309] Tabela 3: Sequências de aminoácido e peso molecular dos peptídeos sintetizados exemplares e derivados dos mesmos CD3ac AC-LK(ACc) -LK(Ac) - LK(Ac) - LW-DL-LW-DL-LW- 1652,910 poem

LCD3ac | AC-LK(AcC) -LK(Ac) - LK (Ac) -LW-LL-LW-LL-LW- 1652,910

[310] Fig. 4 mostra os espectros de dicroísmo circulares de CDl a CD4 em água. Geralmente, os peptídeos de poli-L-lisina carregados adaptam uma estrutura secundária de enrolamento aleatório e apresentam elipticidades negativas entre 180 nm e 210 nm; aqui apresentadas mostram que os peptídeos com as sequências de oligo-lisina mais curtas mostram aumento das elipticidades nesta faixa de comprimento de onda. Além disso, um espectro de enrolamento típico aleatório típico tem pouca ou nenhuma influência nas elipticidades acima de 210 nm, assim, a faixa de comprimento de onda entre 210 nm e 260 nm pode ser atribuída quase inteiramente para a influência da sequência alternada de L-Trp e D-Leu. Por exemplo, a intensidade e a posição do pico a 223 nm, permanecem praticamente inalteradas como o número de resíduos de lisina ligados é variado, o que indica que a estrutura secundária de unidades de repetição de LW-DL é pouca ou não-afetada pelo comprimento de oligo-lisina ligado ao N-terminal - possivelmente nem influenciada pela presença de várias cargas catiônicas nos resíduos de lisina ligados.

[311] Os espectros de dicroísmo circulares das séries de CD4-CDl podem ser teoricamente extrapolados para um CDO imaginário, que não contém qualquer lisina, para se obter um espectro com máximos a cerca de 196 nm e 223 nm. Espectros similares não foram observados em peptídeos hidrofóbicos sintéticos anteriores, mas foram relatados anteriormente em estudos estruturais de gramicidíina A, um peptídeo de antibiótico de 15 aminoácidos derivado a partir da bactéria viva no solo Bacillus brevis [16, 17].

[312] O motivo da estrutura secundária de gramicidina é uma hélice de largura raramente observada na natureza e versátil em termos de passo helicoidal, lateralidade e configuração dimérica (estrutura quaternária) [17c, 18], dependendo da constante dielétrica do seu meio ambiente [19]. Enquanto gramicidina A contém um motivo alternado de L-Trp e D-Leu, CD3ac apresentada aqui é distinta da gramicidina em vários aspectos, por exemplo, a sequência de peptídeo e comprimento, as modificações significativas de formila terminalmente ligada e etanolamina presente em gramicidina. Por exemplo, a sequência de gramicidina é hidrofóbica em toda a sua extensão, mas CD3ac aqui apresentado é anfifílico, devido à adição de N-terminal de pelo menos uma L-lisina (por exemplo, 1 L-lisina,y 2 L-lisinas, ou 3 L-lisinas) e acetilação de, pelo menos, um grupo amino do peptídeo anfifílico.

[313] Sem pretender estar limitado pela teoria,

uma sequência repetida de LW-DL pode levar a uma montagem de ângulos phi e psi distintos diferentes daqueles observados em alfa-hélices isoladas, beta-folhas e bobinas aleatórias, e ser mais provável governada por impedimento estérico; ligações de hidrogênio intramoleculares estáveis podem ser ocasionalmente observadas em peptídeos relativamente curtos [20]. Embora tais estruturas secundárias e ligações de hidrogênio intramoleculares possam existir em CD3ac, CD3ac é mais provável muito de ser curto para dobrar sobre si mesmo.

[314] A importância da estrutura secundária em relação a montagem do tipo de grânulo que foi demonstrada por LCD3ac, um peptídeo de constituição idêntica (sequência de aminoácido), mas inteiramente composto de L-aminoácidos.

LCD3ac precipita para estrutura amorfa na faixa de tamanho dos micrômetros (Fig. 5A) e oO espectro de dicroísmo circular de LCD3 carregado tem características a- helicoidal dominantes (Fig. 5B). Os dados combinados de SEM e dicroísmo circular indicam que a característica de precipitação esférica depende, pelo menos em parte, da presença de D-Leu e a estrutura secundária específica induzida pela mesma.

Exemplo 2: Nanopartículas CD3ac de Peptídeo Sólido - Encapsulação de Carga

[315] CD3ac é O primeiro peptídeo sintetizado através da química de Fmoc que forma as partículas sólidas na faixa de tamanho de micrômetro e nano e mantém a promessa para aplicações de distribuição de medicamento. Embora as esferas de CD3ac precipitadas, em algumas modalidades, em geral, não aderem umas às outras e não têm afinidade observável às superfícies de vidro ou de plástico, as mesmas podem encapsular as moléculas de carga durante a sua formação. CD3ac foi codissolvido com x 10-6 M de 5S-carboxifluoresceína (CF), 10 x 10-6 M 10 de 4,5,6,7-tetracloro-2',4',5'!,7'-tetraiodofluoresceína (RB) e uma mistura equimolar de dois corantes, respectivamente. O experimento foi realizado em pH 5, onde RB é carregado, mas CF é em grande parte protonado exibindo baixa solubilidade em solução aquosa. O volume do solvente foi reajustado a 50 1|pL após contra- evaporação, de modo que oO contraste de fluorescência entre o fundo e os grânulos de peptídeo pode, pelo menos qualitativamente, determinar a acumulação de carga no interior das esferas.

[316] CF bem como RB são realizados por grânulos de CD3ac, bastante independentes do estado de carga do corante (Figuras 6A-6C). No entanto, os grânulos carregados com CF agregam as montagens do tipo uva (Fig. 6B), enquanto as esferas carregadas con RB não aderem umas às outras (Fig. 6A), provavelmente devido à exibição de RB carregado sobre ou perto da superfície de grânulo.

[317] Corante hidrofóbico, tal como CF e corante relativamente hidrofílico, tal como RB podem ser ambos encapsulados por grânulos de CD3ac. Sem pretender estar limitado pela teoria, as moléculas hóspedes podem pré- associar com CD3ac cedo (em solução) e montar sobre a remoção de etanol. O grau de pré-associação, e assim, a eficiência de co-montagem, irão depender da afinidade de compostos hóspedes e hospedeiros, no caso de derivados de xanteno, tais como CF e RB, a interação das estruturas em anel deslocalizadas poderia contribuir para a sua pré- associação com CD3ac.

[318] Para analisar a composição molar de grânulos de CD3ac carregados, o teor de corante de grânulos de CD3ac carregados con RB foi quantificado. RB é prontamente disponível e solúvel em etanol, bem como água. Sem pretender estar limitado pela teoria, a solubilidade em água é obrigatória para evitar a precipitação de carga fora dos grânulos de peptídeo mediante permuta de solvente. Além disso, a absorção de luz de RB não é fortemente resfriada bruscamente em misturas de água e DMSO, O que permite a quantificação precisa e conveniente por densidade óptica.

[319] Em resumo, CD3ac e RB foram co-dissolvidos em várias relações de concentração em 50% de EtOH. 50 uL, cada, foram aplicados a placas de cristalização de 24 cavidades e contra-evaporados contra quatro vezes de 1 ml de HO durante 16 h. Todos os experimentos foram realizados em triplicado. Esferas de CD3ac geralmente precipitam após cerca de 30 minutos, dependendo da concentração de RB. Após equilíbrio do solvente, o pélete de grânulo formado foi ressuspenso e normalizado com HO para um volume final de 100 UuL. As amostras foram centrifugadas durante 30 min a

20.000 g, antes de 80 ul de sobrenadante serem separados. Subsequentemente, a fração de pélete restante foi diluída a 1:1 com 20 ul de DMSO para dissolver as montagens de peptídeo. Contrariamente ao etanol, o uso de DMSO ajuda a reduzir a evaporação da amostra e rende os valores de absorção estáveis durante pelo menos 5 minutos (o volume de amostra para um experimento de UV-Vis é 4 ul, ver a Seção de Materiais e Métodos exemplares descrita anteriormente).

[320] Os dados de quantificação de co-montagem são resumidos na Fig. 7A. A concentração de CD3ac foi mantida constante a 615 x 10 º M nos experimentos aqui descritos. A relação molar inicialmente dissolvida de corante para peptídeo é determinada como [RB]i;/[CD3ac]i. Por exemplo, em [IRB]i/[CD3ac];i = 1 como a condição inicial experimental, após a formação do grânulo, cerca de um terço da composição molar da esfera (nRBÕ,/nCD3acr) é RB (círculos abertos como mostrado na Fig. 7A) e cerca de 25% de corante inicialmente dissolvido foram carregados em grânulos de CD3ac (NRBp/NRB;i, triângulos abertos como mostrado na Fig. 7A). Como mostrado na Fig. 7B, a absorção de pélete e as frações de sobrenadante a 280 nm (absorção máxima de triptofanos) indicam que CD3ac precipita quase quantitativamente na presença de uma ampla faixa de concentração de RB (a relação molar de RB para CD3ac [RB] i/ [CD3ac]i nos experimentos descritos aqui abrange 1,5 ordem de grandeza). A adição de concentrações de RB mais elevadas pode levar a mais moléculas de corante co-montadas dentro dos grânulos de CD3ac, no entanto, a relação de RB co-montado e inicialmente dissolvido não é linearmente proporcional, e a eficiência de co-montagem (nRBp/nRBi) atingirá um limite de saturação.

[321] A eficiência da encapsulação de RB em grânulos de CD3ac pode atingir, pelo menos, cerca de 30% em P/p ou pelo menos cerca de 40% em mol ou mais, em relações de concentração analisadas, o que corresponde a um aumento de cerca de 900 vezes da concentração de RB ou um coeficiente de partição logarítmica de RB em CD3ac/H»O de 2,95. Eficiências “similares ou ainda maiores são contempladas para as moléculas de carga hidrofóbicas, no entanto, a quantificação precisa de compostos insolúveis em água pode ser propensa a artefatos devido à precipitação de carga fora dos grânulos de peptídeo sobre troca de solvente.

[322] A capacidade de CD3ac para eficientemente RB pré- associado e co-precipitado é notável, pelo menos em parte, porque RB é duplamente carregado e solúvel em água.

Na verdade, a sua solubilidade em água é de cerca de cinco vezes mais elevada do que em etanol. Tal como aqui apresentado, a montagem de grânulo de CD3ac não é inibida pela presença de concentrações equimolares de RB, e está contemplada que, para não ser limitado pela teoria, o peptídeo e corante interagem principalmente em interações aromáticas que conduzen a bastante aglutinação não- específica (em comparação com por exemplo, avidina/biotina). Esta funcionalidade pode completar as propriedades de encapsulação de nanopartículas de lipídeos sólidos, bem como sistemas vesiculares.

[323] Aqui apresentada é uma sequência altamente hidrofóbica de 10 aminoácidos sintetizados e purificados com rendimentos elevados e quantidades preparativas. O peptídeo (CD3ac) pode montar em grânulos em forma de maneira uniforme de polidispersão de tamanho baixo na ausência de quaisquer estratégias de modelagem. Medições de dicroísmo circular de derivados carregados de CD3ac indicam uma relação estrutural com a D,L-helicoidal gramicidina e o papel essencial de D-Leu no que diz respeito a sua estrutura secundária específica. LCD3, que contém exclusivamente L-aminoácidos, exibe características a- helicoidais e precipitados de forma amorfa no seu estado acetilado. CD3ac pode encapsular os compostos hidrofílicos e hidrofóbicos com eficiência superior de estratégias de encapsulação existentes [15], por exemplo, resultando em coeficientes de partição logarítmicos de pelo menos 2,95, e a eficiência de encapsulação não é limitada pela concentração das espécies hidrófilas em solução, a menos que a mesma atinja um limite de saturação.

[324] De acordo com vários aspectos e modalidades aqui descritos, o estado de partícula de peptídeo sólido em conjunto com uma encapsulação de carga altamente eficiente pode ser utilizado para diminuir a degradação de fármacos sensíveis e de custo intensivo e aplicado para distribuir as cargas elevadas nas células. Este sistema de distribuição de medicamento de peptídeo pode reter e acumular as moléculas hóspedes (por exemplo, agentes ativos) em um procedimento de uma etapa conveniente. Portanto, aqui apresentado é O sistema de distribuição de medicamento não-polimérico com base em blocos de construção de aminoácido natural e de sínteses por química de Fmoc, Oo que pode aumentar a caixa de ferramenta atual de espécies coloidais e é uma promessa para aplicações médicas.

Exemplo 3. Nanopartículas de CD3ac com uma coroa de proteína para a distribuição da medicamento em células

[325] Conforme descrito nos Exemplos 1 e 2, nanopartículas de peptídeo de CD3ac podem ser montadas a partir de CD3ac dissolvido por adição de água: uma emulsão forma espontaneamente como a mistura ternária (CD3ac, solvente orgânico, HO) é trazida para a região de duas fases (CD3ac, HO). O processo de emulsificação é similar ao efeito ouzo (8), no entanto, as gotas de CD3ac endurecem para partículas sólidas como oO solvente orgânico é removido. Exemplos 1 e 2 demonstram que as moléculas aromáticas, bem como as neutras carregadas podem migrar para a fase dispersa e permanecerem presas durante a formação das partículas (5).

[326] No Exemplo 3, é aqui apresentado um novo sistema de distribuição de medicamento que consiste na matriz de peptídeo de CD3ac, carga encapsulada (Flutax-2) e uma coroa de transferrina, opcionalmente rotulada com Alexa Fluor 568 (TFN-AF568) para efeitos de visualização. Para avaliar o arranjo espacial dos reagentes em partículas de CD3ac automontadas, peptídeos de CD3ac foram dissolvidos juntamente com Flutax-2 e Tfn-AF568 em 50% de EtOH e o teor de EtOH foi reduzido em etapas, como mostrado nos Materiais e Métodos exemplares mais tarde. As Figuras 8A-8I mostram as imagens de fluorescência das nanopartículas de veículo de medicamento de peptídeo de CD3ac resultantes. Nesta modaliodade, as nanopartículas de CD3ac foram cerca de 3 jm em diâmetro, o tamanho concebido para ser suficientemente grande para distinguir a distribuição da fluorescência no núcleo e na superfície por meio de microscopia de luz convencional. Sem pretender estar limitado, as nanopartículas de peptídeo CD3ac menores ou maiores podem ser produzidas. Tfn-AF568 mostra um anel luminoso de fluorescência na periferia de partícula enquanto que fluorescência de Flutax-2 é distribuída uniformemente em toda a partícula (Figuras 8A-8C). A eficácia de aprisionamento foi medida por determinação do coeficiente de partição de Flutax-2 entre as partículas de peptídeo e água (Figuras 9A-9D). O coeficiente de partição de Flutax-2 entre as partículas de peptídeo e a água foi determinado como sendo de 5,25, isto é, sob as condições experimentais aplicadas, mais de 80% de Flutax-2 co-dissolvido escapam da fase aquosa e permanecem aprisionados em partículas. Tal valor do coeficiente de partição é extremamente alto para um composto solúvel em água.

[327] As proteínas são geralmente de superfície ativa e podem ser adsorvidas por interfaces sólidas- líquidas. Deste modo, procurou-se determinar se as partículas em contato com as soluções de proteínas podem ficar cobertas com uma camada de proteínas conhecida como "coroa de proteína" (10). Como tal, foi avaliado se o aro pronunciado de fluorescência vermelha representa uma corona consistindo em Tfn-AF568. Para avaliar isto, as partículas aqui descritas foram incubadas durante 6 horas em 50 vug/mL de tripsina. O aro desapareceu enquanto que a distribuição espacial da carga de Flutax-2 permaneceu inalterada (Figuras 8E-8F). Quantificação dos perfis de nível cinzento indicou que a intensidade do aro de Tfn-AF568 foi reduzida em 3 vezes, depois de incubação com tripsina (Fig. 8G). Ao mesmo tempo, a remoção da coroa de TfÍn-AF568 resultou em um aumento de fluorescência verde de Flutax-2 até um fator de 13 (Fig. 8H), originando na sobreposição espectral de absorção de Tfn-AF568 e emissão de Flutax-2. Em conjunto, estes experimentos indicam que a automontagem de CD3ac, Flutax-2 e Tfn-AF568 conduz à formação de partículas com Flutax-2 retido e uma coroa de TÍn-AF568 adsorvida na superfície. Tripsinização das partículas automontadas pode resultar na degradação proteolítica de Tfn-Af568 seguida por dessorção de superfície dos fragmentos (Fig. 8).

[328] As partículas para distribuição de medicamento são geralmente entre 8 nm e 200 nm em diâmetro como esta faixa de tamanho é menos suscetível de ser apagada pelo rim e fígado (4). Além disso, a endocitose mediada pelo receptor, um possível mecanismo para a captação de partículas contendo a medicamento alvo, é dependente do tamanho e mais eficiente para as partículas menores do que cerca de 150 nm (11). A fim de reduzir o tamanho de partícula de CD3ac, as concentrações de peptídeo mais baixas foram dissolvidas antes da emulsificação: Figuras 10A-10C mostram as imagens de microscopia de fluorescência de partículas de peptídeo preparadas a partir de 492 UM, 246 uM e 123 mM de CD3ac, reunidas na presença ug/ml de Tfn-AF5S68. As diferenças de tamanho resultantes estão resumidas na Fig. 10D por perfis de intensidade de fluorescência associada à partícula. O anel característico, ainda visível em 492 4ÀpM, não pode ser observado em 10 partículas menores, devido ao limite de difração da luz visível, apesar que a microscopia de luz confirma a presença de Tfn-AF568 em partículas menores do que 300 nm (Fig. 10E). Para confirmar a formação de corona de Tfn- AF568 em nanopartículas (d < 100 nm), microscopia de elétron de transmissão (TEM) foi aplicada.

[329] Por razões de brevidade, PNPÉSSSº é aqui utilizado como um acrônimo para nanopartículas de peptídeo de CD3ac automontadas na presença de carga (por exemplo, Flutax-2 utilizado aqui) e a coroa (por exemplo, Tfn-AF568 utilizado aqui). As Figuras 10F-10I mostram as imagens TEM de partículas de PNP em várias configurações: PNPrha-2 (Figuras 10F-10G) e PNPÍIAS (Figuras 10H-101). Ambas as amostras foram coradas com acetato de uranila, estabelecendo partículas além de brilhantes e de fundo escuro.

PNPrwã2 foi detectado em grandes números, e é distribuído uniformemente sobre o filme de carbono (Fig. 10F). Em contrapartida, apenas algumas partículas podem ser detectadas na amostra de PNPII-/%, em vez disso, as mesmas são agrupadas juntas (Fig. 10H), indicando que O processo de umedecimento e evaporação de água residual durante a preparação da amostra e, assim, a afinidade diferencial para o suporte de carvão hidrofóbico.

Ampliação maior (Fig. 101) mostra um aro de contraste intermediário na interface de nanopartícula.

A sua espessura média de 9,85 nm (st. dev.= 2,1, n= 99) está de acordo com o diâmetro da proteína previsto (12). Embora ambas as amostras foram preparadas pelo mesmo protocolo, o diâmetro médio de PNPrwã2 (100 nm, Fig. 107) era duas vezes maior do que o PNPÍÍZASS* (51 nm, com exclusão de corona, Fig. 10K). Sem pretender estar limitado pela teoria, o tamanho médio de partículas de peptídeo não depende apenas em parte da concentração de peptídeo, mas também, em parte da presença de moléculas de superfície ativa que estabilizam a emulsão no início do processo de separação de fase (8). Assim, estas análises microscópicas de elétron indicam que os diâmetros de partícula de peptídeo podem ser controlados até alguns dez nanômetros, por exemplo, através da modulação de parâmetros de processamento diferentes, por exemplo, mas não limitado a, concentração de peptídeo e/ou concentração e/ou tipos de moléculas de superfície ativa. Juntamente com as imagens de microscopia de fluorescência das Figuras 8A-8F, as imagens de TEM indicam a presença de uma coroa de Tfn-AF568 em PNPs.

Exemplo 4. Distribuição de Flutax-2 em células CHO por nanopartículas de CD3ac com uma coroa de proteína

[330] Aglutinação seletiva a receptores de transferrina (TfR) depende da funcionalidade da coroa de proteína: a sua função pode ser comprometida pela desnaturação da proteína, o impedimento estérico (aglomeração) ou orientação desfavorável em relação à superfície de PNPs. Acumulação de PNPs nas superfícies das células pode ser atribuída a interações de coroa-receptor específicas e/ou associações não-específicas. Por exemplo, as forças eletrostática (Coulomb) e eletrodinâmica (Van der Waals) podem contribuir para a associação não-específica (13-15). A fim de testar a funcionalidade da coroa detectada na mediação da aglutinação específica, o número de PNPs associados à superfície de célula foi correlacionado com a densidade de TfR disponível utilizando dois protocolos experimentais independentes: a) aglutinação de PNP por Tfn em solução, e Db) comparação da aglutinação de PNP entre TfR expressando as células de ovário de hamster chinês (CHO) e células TRVb, que são derivadas a partir de tecido de ovário de hamster chinês que não tem TfR endógeno mas expressa TFR2 (16). As Figuras 11A-11H mostram as imagens de microscopia de células de CHO incubadas durante uma hora com PNPZ/5*. uma acúmulo significativo de PNPs foi detectado dentro do perímetro celular projetado (Figuras 11A-C) que pode ser bloqueado através da incubação de células de CHO com 17 ypM de Tfn não-rotulado (Figuras —11D-11F). Isto indica que as interações de PNP com a superfície da célula dependerão de TER livremente valente.

Fig. 11G mostra que a menor densidade de TfR em TRVb leva a uma taxa de associação reduzida significativamente de PNPZI/5*º.

Incubação de TRVb com 17 uM de aglutinação de blocos de Tfn não-rotulado de PNPRÇ, indica que nestas células PNPÍ/* interagem principalmente através do receptor baixo abundante de TfR2. Aplicação de excesso de Tfn pode não só competir com os PNPs para TfR mas também pode trocar o Tfn- AFSG68B fluorescente na corona de partícula com Tfn não- fluorescente.

Para avaliar esta possibilidade, a distribuição da intensidade de fluorescência de PNPVAFSSS incubado a 37ºC na presença e na ausência de 17 pM de Tfn após 24 horas foi comparada e não houve diferenças insignificantes (Figuras 9C-9D). Isto indica que a taxa de aglutinação mediada de TfR de PNPs para a superfície da célula é muito mais rápida do que a troca de proteína na superfície da PNP. Juntamente com os resultados apresentados nas Figuras 11A-11H, PNPs são mostrados para ligar a TfR especificamente através da coroa de Tfn-AF568.

[1331] Enquanto PNPÍ-A5* pode se ligar a células através de interações com TfR, Tfn pode dissociar-se a partir da coroa de PNP antes da internalização ocorrer, e/ou a diferença de tamanho entre as proteínas de Tfn individuais e uma NP pode afetar a captação celular. Assim, procurou-se verificar de maneira mais próxima se as partículas podem ser internalizadas pelas células. Distinção entre PNPs associados e internalizados pode ser não simples, devido à forma plana das células aderentes à superfície e uma z-resolução limitada de microscopia de luz. Como mostrado anteriormente, a remoção de Tfn-AF568 a partir da superfície de partícula pode ser detectada por uma mudança acentuada de verde para a relação de fluorescência vermelha (G/R). Como tal, a distribuição de G/R foi medida para distinguir entre PNPs associados e internalizados em células, como mostrados nas Figuras 12A- 12M, respectivamente. As células de CHO foram fixadas e fotografadas após 1 hora (Figuras 12A-12E) e depois de 6 horas (Figuras 12G-12K) de incubação com PNPZ/*. após 1 hora, a distribuição de G/R mostrou um pico apertado em torno de 1,5 para ambos os PNPs dentro (Fig. 12E, barras pretas) e fora (Fig. 12E, barras cinzas) do perímetro celular.

Como mostrado na Fig. 12K, após 6 horas, a população de PNPs dentro do perímetro celular (barras pretas) exibiu um deslocamento significativo para os valores G/R superiores, enquanto que a distribuição de G/R de PNPs do lado de fora do perímetro da célula (barras cinzas) manteve-se confinado a cerca de 1,5. Sem pretender estar limitado pela teoria, é contemplado que, após incubação durante 1 hora, à maior parte de PNPs ainda não atingiu um compartimento lisossomal e aqueles que foram internalizados ainda têm uma coroa intacta contendo Tfn- AF568; depois de seis horas, a maioria de PNPs foi transportada para os lisossonos e as suas coroas de proteína foram proteoliticamente digeridas.

Os produtos de degradação menores podem dissociar-se a partir da superfície de partícula, devido às forças mais fracas de Van der Waals (17). Em analogia a um aumento em G/R, após a remoção da coroa por tripsina (Fig. 8H), a digestão proteolítica da coroa de PNP nos lisossomos pode produzir um aumento dos valores de G/R de PNPs internalizados.

Isto é corroborado pelos valores de G/R inalterados de PNPs detectados na superfície de vidro.

Alterações em G/R podem ser aqui utilizadas como um indicador qualitativo de PNPs internalizados (porque a cinética da digestão relativamente lenta) para demonstrar que os PNPs com uma coroa de Tfn-

AF568 pode entrar ou ser feito pelas células, por exemplo, pela endocitose mediada por clatrina através de TfR (18).

[332] Para avaliar se a ligação e internalização de PNPs pode resultar na importação seletiva de carga de molécula pequena, a liberação de Flutax-2 encapsulado em células foi analisada 24 horas após adição de PNPLIASS dentro das células (Figuras 13A-131T). Flutax-2 é um derivado modificado de Oregon Green (OG) de paclitaxel (19), um inibidor mitótico aplicado na terapia de câncer (20). Ao contrário de sua forma não-rotulada, Flutax-2 é carregado e solúvel em água na concentração aplicada e consequentemente, não permea com as membranas celulares. Assim, foi utilizado um composto modelo para investigar a eficiência e especificidade da distribuição da molécula pequena por PNPs para o citosol. As células de CHO foram incubadas durante 24 horas com 0,67 pM de Flutax-2, ou dissolvidas em meios (Figuras 13A-13C) ou encapsuladas em PNPXIAS (Figuras 13D-13G). Emissão de Flutax-2 no citosol foi medida para quantificar a quantidade de composto distribuído nas células. Permeação direta de Flutax-2 dissolvido por meio de membranas de células não pode ser detectada como a fluorescência resultante que não excedeu o nível de autofluorescência (Figuras 13B e 131). Por outro lado, a incubação com PNPÍI/S resultou em um forte sinal de fluorescência verde difuso (Figuras 13E e 13G), que indica a distribuição de Flutax-2 para oO citosol. A distribuição foi significativamente reduzida pela competição das interações de células de PNP com 17 pM dissolvidos e Tfn não-rotuado em meio de cultura de células (Fig. 13H). Além disso, a taxa global de distribuição foi significativamente menor para as células de TRVb, que expressam apenas TfR2 (Fig. 13H).

[333] Aqui apresentado é um sistema de distribuição de medicamento alvo consistindo em matriz de peptídeo de CD3ac, Flutax-2 impermeável à membrana da célula como carga e Tfn-AF568 como um ligando receptor da superfície de célula específica, de acordo com uma ou mais modalidades aqui descritas. Todos os três componentes podem se automontar para formar as partículas funcionalizadas e carregadas de medicamentos através da aplicação de um procedimento de uma etapa (por exemplo, uma única etapa de cerca de 15 minutos). Sem pretender estar limitado, a simplicidade do sistema e protocolo de formação originam na interação conjunta de todos os componentes envolvidos: CD3ac não é apenas material da matriz, mas substitui as rotinas de encapsulação devido a sua elevada afinidade para as moléculas aromáticas pequenas. O processo de absorção de carga provavelmente se assemelha a uma extração líquida de duas fases, onde Flutax-2 escapa da fase aquosa e se acumula em gotículas de peptídeo, provavelmente devido à elevada afinidade entre os sistemas de anel deslocalizados de triptofanos e Flutax-2. Além disso, a solubilidade do peptídeo em solventes orgânicos leves permite para a dissolução simultâãnca e automontagem de todos os componentes envolvidos.

A presença de Tfn-AF568 durante a emulsificação de CD3ac resulta na formação de uma coroa de proteína, PNPs alvo contra TfR.

Além disso, a presença da proteína na superfície da partícula pode permitir a modulação do tamanho da partícula devido a sua atividade superficial e, portanto, no início de estabilização da emulsão de peptídeo.

Após a internalização de PNPs em compartimentos lisossomais, digestão proteolítica em uma escala de tempo de algumas horas pode remover a coroa, e por sua vez a liberação da carga retida no citosol, em uma escala de tempo de dias.

A proporção de fluorescência de verde encapsulada (por exemplo, Flutax-2 utilizado aqui) e corantes vermelhos aderentes a superfície (por exemplo, Tfn-AF568) podem mudar para um valor mais elevado (por exemplo, por um fator de 13) como a coroa é removida e esta mudança pode permitir uma descrição qualitativa de captação de partícula celular.

Aglutinação de PNP para TfR e faixa de tamanho das partículas indicam a absorção de partícula, por exemplo, através de endocitose mediada por clatrina.

Sem pretender estar limitado pela teoria, a liberação de carga pode voltar para a degradação proteolítica de PNPs no lisossoma. A estrutura dos produtos de degradação de CD3ac carregados é suscetível de penetrar nas membranas de lipídeo e que pode levar à ruptura de lisossomas (21). Materiais e métodos exemplares (para os Exemplos 3-4)

[334] As soluções estoque: Sínteses e purificação de CD3ac foram descritas em Materiais e Métodos exemplares para os Exemplos 1-2 (Ver, por exemplo, Dittrich and Meier (2010) Macromolecular Bioscience 10: 1406). Resumidamente, O peptídeo foi sintetizado em uma fase sólida utilizando a química do grupo de proteção de Fmoc e purificado em material de cromatografia de fase inversa de C18 (RP) aplicando um gradiente de acetonitrila e água. A pureza foi determinada por integração de pico de perfis de eluição de RP-HPLC a A? e ultrapassa os 95%. Soluções estoque de CD3ac foram preparadas por dissolução do peptídeo em EtOH:H20O (1:1, v/v). A concentração foi determinada por absorção (Thermo Scientific Nanodrop 2000) a 280 nm em uma mistura de EtOH: HO: DMSO a 1:1:2, considerando c280=

21780. A concentração de peptídeo foi ajustada a 742 pM com EtoH : HO (1:11 v/v ), e alíquotas de 200 pl foram armazenadas a -80ºC até uso adicional. TfÊn-AF568 (Invitrogen, T-23365) foi dissolvido a uma concentração de 500 pg/ml e armazenado a +4ºC. Flutax-2 (Invitrogen, P22310) foi dissolvido a uma concentração de 40 1yM em H2O:

EtOH (1:1) e armazenado a -80ºC.

[335] Montagem de partícula, carregamento e formação de coroa: PNPs foram montados misturando as soluções estoque de CD3ac, TfÍn-AF568 e Flutax-2 para se obter as concentrações finais de 123 pM de CD3ac, 6 pM de Flutax-2 e 10 pg/ml de Tfn-AF568 em HO: EtOH (1:1, v/v). A emulsificação foi induzida por uma primeira etpa de diluição (1:1, HO) seguida por um período de equilíbrio de 15 minutos antes do teor de etanol ser reduzido para 25% pela segunda etapa de diluição (1:1, HO). Alíquotas de 50 uL da suspensão resultante foram aplicadas a placas de cristalização de gota em repouso de 24 cavidades (Hampton Research, Cryschem) e contraevaporadas 3 vezes contra 1 ml de HO durante seis horas.

[336] Experimentos de célula culturada: As linhagens de células de CHO foram cultivadas em F12: DMEM a 1:1 (Cellgro, 10-090) mais 10% de soro bovino fetal (Gibco). 2 x 10º células em 0,5 ml de meio foram semeadas em vidros cobertos (VWR, 89015-724) em placas de 24 cavidades (Falcon, 353047) e incubadas durante 16 horas. As células foram lavadas 1x com PBS e incubadas durante 30 min adicionais em meio F12 de Ham (Cellgro, 10-080) antes de 50 pl de solução (NP) de nanopartícula (como preparado anteriormente), 250 pL de Fl12 foram aplicados. A concentração de CD3ac utilizada na incubação de células corresponde portanto a 8,3 ug/ml, ignorando o peso do Flutax-2 associado e Tfn-AF568. Em ensaios de competição, as células foram pré-incubadas durante 30 min em meio F12 contendo 17 uM de Tfn (Sigma, T1283) antes de uma solução de 50 nl de PNP, 250 ul de F12 contendo 17 pM de Tfn foram adicionados. As amostras foram fixadas com 3% de paraformaldeído (Sigma, P6148) em PBS, montadas em lâminas de vidro, utilizando o meio de montagem de fluorescência (Dako, 83023) e analisadas dentro de 24 horas.

[337] Fluorimetria: Experimentos de fluorescência foram realizados em um leitor de placa de BMG FLUOstar Omega nas placas de 384 cavidades pretas (MP100-1l, Matricial). Séries de diluição de TfÍn-AF568 e Flutax-2 foram medidas em H2O0: DMSO: FBS a 6:3:1 (V:V:V) e os pontos de dados foram ajustados de forma linear.

Tabela 4: Parâmetros exemplares determinados a partir da regressão de dados linear o E ee Valor Erro Valor Erro Std qEErF

NR

[338] Para determinar as eficiências de encapsulação de Flutax-2, PNPs foram montados com o procedimento descrito acima na presença de uma concentração fixa de Tfn-AF568 (10 pg/ml) e várias quantidades de Flutax-2 (1,6 1pM, 4 pM, 8 uM, 12,5 pM e 16 pM). Após a montagem em placas de cristalização (ver acima), as amostras de PNP foram normalizadas com H;O para 100 uL e centrifugadas durante 1 hora a 16.000 g antes de 80 uL serem separados a partir da fração do pélete. Ambas as frações foram normalizadas para 133,3 1uL em HO : DMSO : FBS a 6:3:1 (v:v:v) antes de 120 pL serem aplicados para a placa de cavidade e a intensidade da fluorescência ser medida. 1339] Microscopia de elétron de transmissão: Amostras de PNP foram preparadas como descritas acima. 5 pL de PNPs suspensos em HO foram aplicados a uma grelha de cobre revestida de filme de carbono (400 mesh quadrado, Electron Microscopy Sciences) e secos. A amostra foi corada com 10 1uL a 1% de acetato de uranila durante um minuto. O corante em excesso foi removido com um papel de filtro e, subsequentemente, aplicado a um Tecnai G? Sprit Bio TWIN.

[340] Microscopia: As células fixadas foram analisadas em um microscópio invertido Nikon Ti equipado com lentes objetivas de 60x Plano Apo NA 1.4. A fluorescência DAPI foi animada com um filtro de 360/40 e coletada com um filtro de emissão de 460/50. A fluorescência Oregon Verde foi animada com um 360/40 e coletada com um filtro de emissão de 480/40. A fluorescência AF568 foi animada com um 545/30 e coletada com um filtro de emissão de 620/60. As imagens foram adquiridas com uma câmera CCD refrigerada Hamamatsu ORCA R2 controlada com software de MetaMorph 7. Gama, brilho e contraste foram ajustados com imagens exibidas (de forma idêntica para conjuntos de imagens em comparação), utilizando software de ImageJ.

As seções ópticas em séries 3 foram coletadas com um tamanho de etapa de 0,25 micron que vão desde a lâmina de vidro para o mais alto PNP detectável através de um motor de foco Proscan II anterior.

AS amostras observadas após 1 hora e 6 horas de incubação de PNP são (incorporadas) nas projeções de pilha máximas de AF568 e canais de Oregon Verde (GO). As amostras observadas após 24 horas foram obtidas pela projeção média de fluorescência de Oregon Verde e de projeção máxima de pilhas de AF-568. A projeção média de OG foi utilizada para quantificar as diferenças na fluorescência de Flutax-2 no citosol.

Perímetros celulares foram segmentados manualmente em imagens de DIC.

Ponto de fluorescência máximo foi extraído por ImageJ (v. 1.43u) usando uma tolerância de ruído de 50 na classe pública de MaximumFinder.

Exemplo 5. Distribuição de nocodazol em células HeLa com uma ou mais modalidades de nanopartículas de CD3ac

[341] Fig. 16A mostra uma modalidade das nanopartículas de CD3ac, em que oO EGF (opcionalmente rotulado com vermelho Texas para efeitos de visualização) é um ligando de direcionamento celular. Tais nanopartículas de CD3ac com EGF como um ligando podem ser absorvidas pelas células, como mostrado na Fig. 16B. Para produzir os grânulos de CD3ac encapsulados com nocodazol, em algumas modalidades, 21 uM de CD3ac, 2 ug/mL de EGF (rotulado com vermelho Texas para efeitos de visualização) e 20-40 uM de nocodazol foram dissolvidos em um solvente orgânico (Fig. 17A Ou 17G). A troca do solvente com água pode resultar na formação de uma emulsão e, portanto, as nanopartículas sólidas de CD3ac contendo nocodazol e EGF. Em algumas modalidades, a pelo menos uma porção de EGF foi encapsulada em grânulos de CD3ac. Adicionalmente, o EGF pode adsorver na superfície exterior dos grânulos de CD3ac, resultando em EGF funcionalizado com grânulos de CD3ac.

[342] Após a incubação de células de HeLa em meios contendo tais partículas de CD3ac encapsuladas com duas concentrações diferentes de nocodazol (20 UM ou 40 UM), imagens microscópicas fluorescentes (Figuras 17B-17F, e 17H-17k) mostram as partículas de CD3ac funcionalizadas com EGF que foram captadas pelas células de HeLa, e os microtúbulos nessas células de HeLa tratados com partículas de CD3ac funcionalizadas com EGF foran largamente despolimerizados. No entanto, as células de HeLa tratadas com o sobrenadante de suspensões de CD3ac pré-incubadas e centrifugadas ainda contêm microtúbulos intactos. Isto indica que nocodazol pode ser distribuído nas células pelas partículas de CD3ac funcionalizadas com EGF.

[343] Sem pretender estar limitado pela teoria, a aglutinação do grânulo e absorção pelas células podem ocorrer por meio da interação de EGF adsorvido sobre a superfície das partículas de CD3ac com EGFR presente nas células de HeLa.

Exemplo 6. Nanopartículas de CD3ac visando com IgG

[344] As nanopartículas de CD3ac direcionando com Ige podem ser preparadas em um procedimento de uma só etapa, tal como aqui descrito. Fig. 18A mostra que os anticorpos IgG (por exemplo, mas não limitados a, IgG de antitransferrina, ou IgG de anticoelho) podem ser feitos pelas nanopartículas de CD3ac. Além disso, como mostrado na Fig. 18B, a incubação das nanopartículas de CD3ac funcionalizadas com IgG de antitransferrina com sinais de fluorescência gerados com transferrina A-546 (indicados por pontos brancos), indicando que o IgG está presente na superfície das nanopartículas de CD3ac e permite a aglutinação de IgG com transferrina A-546. Similarmente, a incubação das nanopartículas de CD3ac funcionalizadas de antitransferrina de IgG com um anticorpo secundário (por exemplo, IgG de anticoelho pode ser usado se o IgG de antitransferrina for produzido em coelhos) também resultou em aglutinação do IgG presente na superfície de nanopartícula de CD3ac com os anticorpos secundários (indicados por pontos brancos na Fig. 18C). A orientação de IgG na interface das nanopartículas é provável isotrópica ("aleatória"), por exemplo, o local de aglutinação de antígeno e/ou o epítopo para os anticorpos secundários estão expostos e acessíveis.

Exemplo 7. Distribuição de moléculas de ácido nucléico (por exemplo, DNA ou RNA) por partículas de peptídeo (por exemplo, particulas de peptídeo CD3 ou partículas de peptídeo mistas que compreendem peptídeos CD3ac e CD3).

[345] Transfecção de DNA/SiRNA pode ser estabelecida por uma partícula de peptídeo que é |i) carregada e ii) estável. Enquanto as partículas de CD3ac (sequência de peptídeo mostrada na Tabela 3) são insolúveis em água, as mesmas não são geralmente carregadas e, por conseguinte, ligam-se pouco provável a moléculas de ácido nucléico (por exemplo, DNA ou RNA, incluindo, mas não limitado a, SiRNA). Peptídeo de CD3 (sequência de peptídeo mostrada na Tabela 3) contém 4 aminas primárias (3 lisinas + 1 N-terminal) que pode ser, quer carregado ou acetilado.

[346] Para avaliar a eficiência da transfecção de células usando peptídeos de CD3, as células de HeLa foram incubadas com uma mistura de peptídeos de CD3 (com uma sequência de peptídeo mostrada na Tabela 3) e as moléculas de ácido nucléico aniônicas (por exemplo, DNA de filamento único), ambos dissolvidas em meio de cultura de célula a uma relação molar de cerca de 3,7: 1 (CD3 : SSDNA). A fim de visualizar facilmente a presença de ssDNA dentro de uma célula, uma porção de sSDNA adicionada para o meio de cultura celular foi rotulada com um marcador detectável (por exemplo, Alexa Fluor 488; AF488). Como mostrado nas Figuras 19A-19B, a presença de peptídeos de CD3 nos meios de cultura de células leva a uma fluorescência aumentada no citosol (Fig. 19A), em comparação com o controle (Fig. 19B). Assim, uma mistura de peptídeos anfifílicos carregados “positivamente aqui descrita (por exemplo, peptídeos de CD3) e moléculas de ácido nucléico aniônicas (por exemplo, DNA ou RNA, incluindo, mas não limitado a, SiRNA) podem aumentar a eficiência de transfecção de células com moléculas de ácido nucléico, conforme em comparação com a transfecção de células na ausência dos peptídeos anfifílicos carregados positivamente aqui descritos (por exemplo, peptídeos de CD3). Sem pretender estar limitado pela teoria, devido à estrutura anfifílica e grupos de cabeça catiônicos dos peptídeos aqui descritos (por exemplo, peptídeos de CD3), algumas modalidades dos peptídeos anfifílicos aqui descritos (por “exemplo,

peptídeos de CD3) podem ser utilizadas como peptídeos de penetração de célula ou agentes de transfecção de células.

[347] Procurou-se determinar de forma próxima se os peptídeos anfifílicos não-acetilados (por exemplo, peptídeos de CD3) podem ser automontados na presença de moléculas de ácido nucléico para formar ácido mnucléico contendo artigos de peptídeo. Para este fim, uma mistura de peptídeos de CD3, sSSDNA, e transferrina foi submetida a eletroforese em agarose (como quaisquer partículas de peptídeo formadas seriam tão grandes para migrar através do gel de agarose). Alguns ssDNA na mistura foram rotulados para a visualização do seu movimento em gel de agarose, enquanto a transferrina rotulada (por exemplo, AF568-Tfn) foi adicionada na mistura de ácido nucléico-peptídeo para monitorar a presença de partículas de peptídeo. (Tal como descrito anteriormente nos Exemplos 3-6, um ligando (por exemplo, transferrina) adicionado a uma mistura de peptídeo em geral se forma na superfície exterior das partículas de peptídeo). Como mostrado na Fig. 20A, a co-localização do sinal de Tfn-AF568 e do sinal de SSDNA-AF488 na zona de carga de agarose, após a eletroforese durante cerca de 40 minutos indica que as partículas de peptídeo foram formadas a partir da mistura que compreende os peptídeos de CD3 e as moléculas de ácido nucléico (por exemplo, AF488-ssDNA), e assim, não foram capazes de migrar para o gel de agarose ao longo do tempo, enquanto que outras moléculas de proteína em excesso (por exemplo, sSSsDNA e Tfn) migraram para O ânodo.

[348] A eficácia da co-precipitação dos peptídeos anfifílicos não-acetilados (por exemplo, peptídeos de CD3) e moléculas de ácido nucléico (por exemplo, SSDNA) também foi avaliada e quantificada, por exemplo, por um método de cromatografia de HP-WAX (troca aniônica fraca). Por exemplo, os peptídeos de CD3 e SSDNA foram co-precipitados de modo a formar as partículas de peptídeo contendo ssDNA antes da centrifugação e separação do sobrenadante e pélete, ambos dos quais foram, em seguida, submetidos a uma máquina de cromatografia de HP-WAX. Como mostrado na Fig. 20B, a maioria dos peptídeos de CD3 e SSDNA foi detectada no pélete das partículas de peptídeo, em comparação com as quantidades no sobrenadante, indicando que a formação de partículas de peptídeo contendo ssDNA pelo método de co- precipitação é altamente eficiente.

[349] Deve notar-se que uma mistura de peptídeos de CD3 e moléculas de ácido nucléico pode automontar para formar as partículas estáveis em água pura, no entanto, as mesmas não são geralmente estáveis e dissolvem-se, em resposta ao aumento da força de sal e temperaturas mais elevadas.

[350] sem limitações, existem dois métodos exemplares para diminuir a solubilidade de ácido nucléico contendo nanopartículas de peptídeo (por exemplo, DNA ou RNA incluindo sSsiRNA). Por exemplo, a primeira abordagem pode acarretar uma mistura de peptídeos completamente acetilados (por exemplo, CD3ac com uma sequência de peptídeo “como mostrada na Tabela 3) e peptídeos parcialmente e/ou não- acetilados (por exemplo, CD3 com uma sequência de peptídeo como mostrado na Tabela 3) durante a montagem da partícula.

Embora CD3 seja solúvel em água, O mesmo pode co-precipitar com CD3ac.

Assim, uma nanopartícula de peptídeo de carga líquida pode ser facilmente modulada, por exemplo, através do controle da concentração ou relação molar de peptídeos parcialmente e/ou não-acetilados (por exemplo, CD3) e peptídeos completamente acetilados (por exemplo, CD3ac). A título de exemplo apenas, mais CD3ac pode aumentar a estabilidade da partícula, enquanto mais CD3 pode produzir capacidades de carga mais elevadas para SiRNA/DNA, bem como um potencial maior para penetrar as membranas celulares, devido as suas cargas líquidas.

Um versado na técnica pode determinar a relação ótima de CD3 para CD3ac em nanopartículas de peptídeo misturadas para aplicações particulares, por exemplo, distribuição de SsSiÍiRNA ou DNA, Em algumas modalidades, os peptídeos parcialmente e/ou não-acetilados (por exemplo, CD3) podem estar presentes entre 5% em mol e

50% em mol em nanopartículas de peptídeo misturadas. Em algumas modalidades, os peptídeos completamente acetilados (por exemplo, CD3ac) podem estar presentes entre 50% em mol e 95% em mól em nanopartículas de peptídeo misturadas. Em várias modalidades, as relações de concentração ou molares dos peptídeos parcialmente e/ou não-acetilados (por exemplo, CD3) para peptídeos completamente acetilados (por exemplo, CD3ac) podem variar de cerca de 1:100 a cerca de 50:1, ou de cerca 1:50 a cerca de 10:1, ou de cerca de 1:20 a cerca de 1:1.

[351] Deste modo, em algumas modalidades, uma mistura de peptídeos anfifílicos completamente acetilados (por exemplo, peptídeos de CD3ac), peptídeos parcialmente acetilados ou anfifílicos não-acetilados (por exemplo, peptídeos de CD3) e moléculas de ácido nucléico pode ser preparada para formar as partículas de peptídeo estáveis que contêm as moléculas de ácido nucléico (por exemplo, DNA ou RNA, incluindo Oo SiRNA). Por exemplo, para demonstrar a formação de partículas de peptídeo que contêm ácido nucléico estável em condições fisiológicas, os peptídeos de CD3ac foram adicionados a uma mistura de peptídeos de CD3 e DNA de filamento único (SSDNA) a uma relação molar de cerca de 11:1,8:1 (CD3ac: CD3: SSDNA). Determinou-se que a presença dos peptídeos de CD3ac estabiliza as partículas de peptídeo contendo SSDNA em condições fisiológicas. Todos os três componentes co-precipitados para formar as partículas de peptídeos contendo sSDNA que eram estáveis a força de sal correspondente.

[352] Em algumas modalidades, um ligando (por exemplo, transferrina) pode também ser adicionado à mistura que compreende os peptídeos anfifílicos completamente acetilados (por exemplo, peptídeos de CD3ac), peptídeos anfifílicos parcialmente acetilados ou não-acetilados (por exemplo, peptídeos de CD3), e moléculas de ácido nucléico (por exemplo, DNA ou RNA, incluindo o sSiRNA) para formar partículas de peptídeo estáveis contendo ácido nucléico contra a proteína à qual se liga os ligandos (ver, por exemplo, Exemplos 3-6 para algumas modalidades das partículas de peptídeo aqui descritas para uso na distribuição alvo de um agente ativo). Por exemplo, transferrina (Tfn rotulado com AF568 para facilidade de visualização de imagem) foi adicionado à mistura para formar as partículas de peptídeo estáveis contendo ácido nucléico contra receptores de transferrina presentes na superfície da célula. Como discutido no Exemplo 3, O ligando (por exemplo, Tfn) está geralmente presente na superfície exterior das partículas de peptídeo.

[353] Para determinar a eficiência da distribuição de partículas de peptídeo contendo ácido nucléico para as células, as células de HeLla foram incubadas com as partículas de peptídeo contendo ácido nucléico (por exemplo, formadas a partir de uma mistura de peptídeos de CD3ac, peptídeos de CD3 e SSDNA como descritos acima). Como discutido anteriormente, alguns SSDNA na mistura foram rotulados com um marcador detectável (por exemplo, AF488) para facilidade de visualização por imagem. Além disso, TÍn-AF568 foi adicionado para formar as partículas de peptídeo contendo ácido nucléico como um meio para visualizar as partículas de peptídeo formadas. Como mostrado na Fig. 21, Oo sinal de fluorescência Tfn-AF568 a partir de partículas de peptídeos formadas co-localizadas com o sinal de fluorescência AF488-ssDNA no citosol, indicando que as partículas de peptídeo contendo sSSDNA é estável em condições fisiológicas e distribuídas nas células (por exemplo, células de HeLa).

[354] Procurou-se determinar de um modo próximo o efeito de cargas líquidas de artigos de peptídeos que contêm nucléicos ácido na sua estabilidade em uma condição fisiológica, por exemplo, no soro. Como mostrado na Tabela 5 abaixo, as partículas de peptídeos estáveis são geralmente formadas quando a relação de cargas catiônicas para cargas aniônicas de partículas de peptídeos contendo o ácido nucléico é próximo de zero (por exemplo, entre cerca de 5 e cerca de O, ou entre cerca de 3 e cerca 0). A relação de carga pode ser ajustada por relações molares de moléculas de ácido nucléico aniônicas (por exemplo, SSDNA), e peptídeos anfifílicos catiônicos aqui descritos (por exemplo, peptídeos anfifílicos parcialmente acetilados ou não-acetilados, tal como CD3) em uma mistura de montagem de peptídeos. Sem pretender estar limitado pela teoria, uma carga líquida negativa de partículas de peptídeo (por exemplo, uma relação de cargas catiônicas para cargas aniônicas menos do que 1) pode ajudar a evitar a agregação de partícula.

[355] Sem pretender estar limitado pela teoria, enquanto as cargas líquidas de artigos de peptídeo que contêm ácido nucléico podem influenciar a estabilidade das partículas em condições fisiológicas, a quantidade de peptídeos anfifílicos completamente acetilados (por exemplo, peptídeos de CD3ac) em relação aos peptídeos anfifílicos não-acetilados (por exemplo, peptídeos de CD3) podem também contribuir para a estabilidade das partículas. Por exemplo, como discutido anteriormente, uma mistura de peptídeos anfifílicos não-acetilados (por exemplo, peptídeos de CD3) e moléculas de ácido nucléico podem automontar para formar as partículas, no entanto, os mesmos não são geralmente estáveis e se dissolvem, em resposta a forças de sal crescentes e de temperaturas maiores. Em contraste, as partículas de peptídeo formadas a partir de peptídeos anfifílicos completamente acetilados (por exemplo, peptídeos de CD3ac) são mais estáveis. Por conseguinte, o aumento da relação molar de peptídeos anfifílicos completamente acetilados (por exemplo, CD3ac) para peptídeos anfifílicos não-acetilados (por exemplo, CD3) pode aumentar a estabilidade das partículas de peptídeo resultantes a uma condição fisiológica, por exemplo, no soro, o que está de acordo com os dados apresentados na Tabela 5.

Tabela 5. Efeitos das relações de carga (ou relações molares) em uma mistura de peptídeo sobre a estabilidade de partículas de peptídeo resultantes em soro Relação de Relação molar Composição de mistura carga Estabilidade (SSDNA: CD3ac: da montagem de peptídeo (cátion: em soro CD3) ânion) CD3 1,23e-04 M Menos CD3ac 1,23e-04 M 1:200:200 33,065 estável SSDNA 6,20e-07 M | 9a a 23e-os nr BEE === naYTãn ne e OOMAD | CD3ac 1,23e-04 M 1:200:20 3,306 estável SSDNA 6,20e-07 M CD3 1,236-06 M = — 1:200:2 0,331 estável CD3ac 1,23e-04 M

[emo eres |

[356] A segunda "abordagem para diminuir a solubilidade de nanopartículas de peptídeo contendo DNA/SiRNA pode envolver as sínteses de costume de um único peptídeo com um grau de acetilação, por exemplo, variando de acetilação de pelo menos um grupo amino no segmento de peptidil hidrofílico do peptídeo anfifílico aqui descrito para completar a acetilação de todos os grupos amino no segmento de peptidil hidrofílico do peptídeo anfifílico aqui descrito. A título de exemplo apenas, um peptídeo anfifílico pode ser sintetizado personalizado com um grau de acetilação entre CD3 e CD3ac. Por exemplo, um peptídeo anfifílico pode ser sintetizado personalizado com, pelo menos, um grupo carregado ou não-acetilado, por exemplo, no N-terminal, incluindo pelo menos um de dois grupos carregados ou não-acetilados ou, pelo menos, três grupos carregados ou não-acetilados. Em uma modalidade, o peptídeo anfifílico pode ser concebido para ser catiônico (por exemplo, para a distribuição de DNA ou sSiRNA) através de cargas de modulação em relação a ou no seu N-terminal (por exemplo, com a acetilação) para se obter o carácter anfifílico da molécula. Por exemplo, o pelo menos um grupo amino (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais grupos amino, dependendo do número de grupos amino presentes no segmento de peptidil hidrofílico) do segmento de peptidil hidrofílico do peptídeo anfifílico descrito pode permanecer não- acetilado, e pelo menos um grupo amino (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais grupos amino, dependendo do número de grupos amino presentes no segmento de peptidil hidrofílico) do segmento de peptidil hidrofílico do peptídeo anfifílico descrito pode ser acetilado.

Em certas modalidades, tal peptídeo anfifílico pode compreender uma sequência de aminoácido de H-LK(Ac)-LK(Ac)-LK(Ac)-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW- NH.

Em algumas modalidades, o peptídeo anfifílico pode compreender uma sequência de aminoácido de H-LK-LK(Ac)- LK(AcC) - LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH>2. Em modalidades alternativas, o peptídeo anfifílico pode compreender uma sequência de aminoácido de H-LK-LK-LK(Ac)-LW-DL-LW-DL-LW- DL-LW-NHo.

A relação de grupos amino acetilados para grupos amino não-acetilados em um peptídeo anfifílico pode controlar as propriedades catiônicas e aniônicas dos peptídeos anfifílicos aqui descritos.

Em algumas modalidades, a relação de grupos amino acetilados para grupos amino não-acetilados em um peptídeo anfifílico pode ser menor do que 1, de cerca de 1, ou maior do que 1. Exemplo 8. Estabilidade das partículas de peptídeo que contêm ácido nucléico (por exemplo, partículas de peptídeo CD3 ou partículas de peptídeos mistas que compreendem os peptídeos CD3ac e CD3)

[357] A estabilidade de partículas de peptídeo CD3 que contêm ácido nucléico foi caracterizada em água pura. Abaixo encontra-se uma formulação de partícula de peptídeo CD3 exemplar que ainda compreende as moléculas de ácido nucléico (por exemplo, SSDNA) e um ligando (por exemplo, transferrina, Tfn): Formulação de partícula de peptídeo 1 (CD3 + SSDNA + Tfn) 21 pM de CD3 (H-LK-LK-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH2) + 5,4 uM (5º -TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3')24- 0,24 UM (AF488-5'*-TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3" 2 4,14 ug/mL de Tfn-AF568

[358] Para avaliar a estabilidade de partículas de peptídeo formada a partir de uma formulação 1 (PNP1) em água, uma amostra das partículas de peptídeo PNP1l foi agitada em um tubo eppendorf contendo água durante cerca de 15 minutos ou a cerca da temperatura ambiente ou a cerca de 37ºC. A amostra foi, em seguida, centrifugada para girar para baixo as partículas do peptídeo e o sobrenadante foi coletado para análises adicionais. A concentração de Tfn- AF568 no sobrenadante foi medida e quantificada por intensidade de fluorescência. Como mostrado na Fig. 22A, uma concentração mais elevada de Tfn-AF568 foi detectada no sobrenadante a partir da amostra de PNPl agitada a uma temperatura de cerca de 37ºC a cerca da temperatura ambiente, o que indica que a estabilidade das partículas de PNPl em água é mais dependente da temperatura e mais partículas de PNP1 tendem a dissociar-se a uma temperatura mais elevada, liberando assim, uma maior quantidade de Tfn- AF568 para o sobrenadante.

[359] Também foi realizado um estudo no tempo do curso da estabilidade de PNPl em água. As amostras das partículas de PNPl foram agitadas em tubos de eppendorf contendo água a uma temperatura de cerca de 4ºC ou cerca de 37º. A cada ponto de tempo predeterminado (como indicado na Fig. 22B), uma amostra de PNPl foi, em seguida, centrifugada para girar para baixo as partículas de peptídeo e o sobrenadante foi coletado para análises adicionais. A concentração de Tfn-AF568 no sobrenadante foi medida e quantificada por intensidade de fluorescência. Similar à Fig. 22A, Fig. 22B mostra que a estabilidade de partículas de PNP1 em água é dependente da temperatura e as partículas de PNP1 tendem a dissociar-se mais rapidamente a temperaturas mais elevadas, por exemplo, a uma temperatura superior a 4ºC.

[360] Procurou-se determinar de um modo próximo comparar a estabilidade das partículas de PNP1 e partículas de peptídeos formadas a partir da formulação 2 (PNP2), como mostrado abaixo, em meios de cultura de células, por exemplo, contendo cerca de 10% de soro.

Formulação de partícula de peptídeo 2 (CD3ac + CD3 + SSDNA + Tfn) 123 pM de CD3ac (AC-LK(Ac)-LK(Ac)-LK(Ac)-LW-DL-LW-DL- LW-DL-LW-NH>2) 21 pM de CD3 (H-LK-LK-LK-LW-DL-LW-DL-LW-DL-LW-NH>2) + 5,4 UM (5º -TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3"')24- 0,24 UM (AF488-5*-TTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATC-3"*)21- 4,14 ug/mL de Tfn-AF568

[361] As células de HeLa foram incubadas ou com partículas de PNPl ou PNP2 durante cerca de 30 minutos, a temperaturas de cerca de 4ºC e 37ºC. Como as células de HeLa realizam geralmente endocitose mediada por clatrina a cerca de 37ºC, mas não a cerca de 4ºC, qualquer Tfn-AF 568 dissolvido nos meios será internalizado pelas células. Assim, após a incubação, as células foram fixadas com paraformaldeído para imagem e detecção de intensidade de fluorescência. Como mostrado nos painéis superiores da Fig. 22C, um sinal de fluorescência TÍn-AF568 difuso e mais forte foi detectado no citosol quando as células foram incubadas com as partículas de PNPl a cerca de 37ºC, em comparação com a fluorescência Tfn-AF568 mais pontuada, detectada nas células incubadas a cerca de 4ºC. No entanto, este contraste não foi observado em células incubadas com as partículas de PNP2, como mostrado nos painéis inferiores da Fig. 22C. Em vez disso, os sinais de fluorescência Tfn-

AF568 comparáveis e pontuados foram observados em ambas as células incubadas a cerca de 4ºC e cerca de 37ºC, na presença das partículas de PNP2. Estes resultados indicam que as partículas de PNP1 tendem a dissociar-se em cerca de 37ºC, liberando assim, para o meio de cultura Tfn-AF568, O qual é, em seguida internalizado pelas células, enquanto que as partículas de PNP2 parecem ser mais estáveis no soro (por exemplo, cerca de 10% de soro) a cerca de 37ºC durante, pelo menos cerca de 30 minutos, assim retendo mais de Tfn-AF568 nas partículas de PNP2 e/ou na superfície das partículas de PNP2.

[362] A comparação das células na Fig. 22C com Oo controle negativo (isto é, as células incubadas na presença de SSDNA sem peptídeos de CD3 ou CD3ac) mostrado na Fig.

22D, a intensidade de fluorescência de AF488-ssDNA no controle negativo é significativamente menor do que nas células incubadas com as partículas de PNPl ou PNP2 contendo sSSDNA. Isto indica que as partículas de PNPl ou PNP2 podem ser utilizadas para facilitar a transfecção de células, e distribuir uma molécula de ácido nucléico (por exemplo, DNA ou RNA) para uma célula. É notado que fluorescência AF488-ssDNA foi também detectada em células incubadas na presença de partículas de PNP1 ou PNP2 à cerca de 4ºC. Sem pretender estar limitado pela teoria, enquanto a transfecção de células na presença de partículas de PNP1 ou PNP2 a cerca de 4ºC não deve ser TFR dependente de (receptor de transferrina), que é provavelmente causado por transporte passivo através da membrana celular na presença de peptídeos de CD3, como discutido no Exemplo 7. Referências (para Exemplos 1-2)

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[363] Conteúdo de todas as patentes e outras publicações aqui identificadas é aqui expressamente incorporado por referência para todos os fins. Estas publicações são fornecidas somente para sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada a este respeito deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm direito a antecipar tal descrição em virtude da invenção anterior ou por qualquer outro motivo. Todas as declarações quanto à data ou representação quanto aos conteúdos desses documentos são com base nas informações “disponíveis para os requerentes, e não constituem qualquer admissão quanto à exatidão das datas ou conteúdos desses documentos.

Claims

| 1/6 REIVINDICAÇÕES

1. Partícula de peptídeo caracterizada pelo fato de compreender um peptídeo anfifílico, o peptídeo anfifílico compreendendo um segmento de peptídeo hidrofóbico e um segmento de peptídeo hidrofílico, em que o segmento de peptídeo hidrofóbico compreende uma sequência de aminoácidos de (Trp-Leu)m-(Trp)n Ou (Leu- Trp)p- (Leu)a, em que cada Trp é um D-Trp ou L-Trp e cada Leu é um D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro de 1 a 5, e ne q são independentemente O Ou 1, desde que quando Trp é D-Trp então Leu é L-Leu, e quando Trp é L-Trp, então Leu é D-Leu, ou vice-versa; e em que O segmento de peptídeo hidrofílico compreende uma sequência de aminoácidos de (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a 15, e em que à partícula de peptídeo compreende ainda, na sua superfície exterior um ligante.

2. Partícula de peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um resíduo Lys do segmento de peptídeo hidrofílico ou o grupo amino N- terminal do peptídeo anfifílico é acetilado.

3. Partícula de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, caracterizada pelo fato de que o peptídeo anfifílico compreende a sequência de aminoácidos de (L-Lys)-(L-Lys)-(L-Lys)-(L-Trp)-(D-Leu)-(L-Trp)-(D-Leu)-

(L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) -X, em que X é ausente ou NH.

4. Partícula de peptídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos resíduos de L-Lys é acetilado, e/ou o grupo amino N- terminal do peptídeo anfifílico é acetilado.

5. Partícula de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o ligante inclui um ligante de receptor da superfície celular ou um anticorpo.

6. Partícula de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a partícula de peptídeo compreende uma mistura de um peptídeo anfifílico totalmente acetilado de qualquer das reivindicações 1 a 5, e um peptídeo anfifílico parcialmente acetilado de qualquer das reivindicações 1 a 5, e, opcionalmente, um peptídeo anfifílico não-acetilado de qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

7. Partícula de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de compreender ainda um agente ativo.

8. Uso da partícula de peptídeo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de ser para entrega direcionada de um agente ativo.

9. Uso de uma composição caracterizada pelo fato de compreender um peptídeo anfifílico carregado positivamente como um agente de penetração celular ou agente de transfecção, em que oO peptídeo anfifílico carregado positivamente compreende um segmento de peptídeo hidrofóbico e um segmento de peptídeo hidrofílico, em que Oo segmento de peptídeo hidrofóbico compreende uma sequência de aminoácidos de (Trp-Leu)nm-(Trp)n Ou (Leu- Trp)p- (Leu)a, em que cada Trp é D-Trp ou L-Trp e cada Leu é D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro de 1 à 5, en e q são independentemente O ou 1, desde que quando Trp é D-Trp, então Leu é L-Leu, e quando Trp é L-Trp, então Leu é D-Leu, ou vice-versa; em que O segmento de peptídeo hidrofílico compreende uma sequência de aminoácidos de (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a 15; e em que pelo menos um dos resíduos de Lys Ou o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico não é acetilado.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que todos os resíduos de Lys e o grupo amino N-terminal do peptídeo anfifílico não são acetilados.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo anfifílico compreende a sequência de aminoácido de (L-Lys)- (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D- Leu) - (L-Trp)-X, em que X é ausente ou NH.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda uma molécula de ácido nucleico a ser entregue a uma célula.

13. Partícula de peptídeo caracterizada pelo fato de compreender um primeiro peptídeo anfifílico e um segundo peptídeo anfifílico, o primeiro e o segundo peptídeo anfifílico compreendendo cada um, independentemente, um segmento de peptídeo hidrofóbico e um segmento hidrófilo de peptidil, em que o segmento de peptídeo hidrofóbico compreende uma sequência de aminoácidos de (Trp-Leu)m-(Trp)n ou (Leu- Trp)p- (Leu)a, em que cada Trp é D-Trp ou L-Trp e cada Leu é D-Leu ou L-Leu, m e p são independentemente um número inteiro de 1 a 5, en e q são independentemente O ou 1, desde que quando Trp é D-Trp, então Leu é L-Leu, e quando Trp é L Trp, então Leu é D-Leu, ou vice-versa; e em que o segmento de peptídeo hidrofílico compreende uma sequência de aminoácidos de (Lys)r, em que r é um número inteiro de 1 a 15, e em que Oo grupo amino N-terminal e todos os resíduos de Lys do primeiro peptídeo anfifílico são acetilados; e em que pelo menos o grupo amino N-terminal ou um dos resíduos Lys do segundo peptídeo anfifílico não é acetilado.

14. Partícula de peptídeo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que nenhum grupo amino N-terminal e os resíduos de Lys do segundo peptídeo anfifílico são acetilados.

15. Partícula de peptídeo, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de compreender ainda um agente ativo.

16. Partícula de peptídeo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o agente ativo compreende uma molécula de ácido nucleico.

17. Partícula de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizada pelo fato de compreender ainda na sua superfície exterior um ligante.

18. Partícula de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo peptídeo anfifílico compreendem cada, independentemente, a sequência de aminoácidos de (L- Lys) - (L-Lys) - (L-Lys) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) - (D-Leu) - (L- Trp) - (D-Leu) - (L-Trp) -X, em que X é ausente ou NH.

19. Uso da partícula de peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado pelo fato de que é para a entrega de uma molécula de ácido nucleico a uma célula.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico inclui siRNA, miRkNA, SHhRNA, DNA, ou quaisquer combinações dos mesmos.