TWI362270B

TWI362270B -

Info

Publication number: TWI362270B
Application number: TW095140210A
Authority: TW
Inventors: Te We Lee; Shu Pei Chiu; Chiu Yu Yu; Tsui Jung Chang; Chih Hsien Chang
Original assignee: Iner Aec Executive Yuan
Priority date: 2006-10-31
Filing date: 2006-10-31
Publication date: 2012-04-21
Also published as: US20080102110A1; JP2008115147A; TW200819137A; US20080139703A1

Description

I36227〇九、發明說明：【發明所屬之技術領域】〜本發明射關職下合姐m隔基—反應官 =基'胜肽之方法，此方法可以高產率製得產物，因此可用於大里製備及合成。【先前技術】微脂體（Liposome)係於1965年由英國劍橋触帥細㈣恤的Alec Bangham首先魏。織體係由翻與咖料為膜材包合成脂質空心微球體，體徑約_25至3 5微米，懸浮於水相中，其中脂賊（球皮）主要是由雜分子的磷轉成的脂質雙層（lip〇_e bilayers)。磷脂分子的磷酸端為親水性，脂質端為疏水性’由輯形成_f層雙面純水，夾相為疏水之膜。水溶性物質可包在球心之溶液，油溶性物f可夾在球皮膜層内，因此微脂體可包覆水性物質及油性物質作為載體。根據上述微脂體特性，微脂體於197〇年代後逐漸被認為可攜帶藥物作為載體，特別是運用在抗癌藥物。微脂體是將抗癌藥物包裹在載體内，靶向到有癌細胞的部位，才釋放出抗癌藥物，直接作用於腫瘤區，且不容易進入正常組織中，減少對正常細胞的傷害。微脂體之主要優點可簡述如下。 L藥物包裹在微脂體内會改變藥物動力學，延長藥物在血液中的半衰期。4月曰體的大小約1〇〇奈米，能穿過腫瘤新生血管壁的漏洞，使包袤抗癌藥物的微脂體能大量累積在腫瘤，增進治療效果。.此種微脂體屬於被動式標歡（passivetargeting)。 1362270 2. 毋性向的藥物包裹在微脂體内，可以減少不良的副作用。 3. 微脂體的脂質組成、顆粒大小、紐，〗、，，。構製備方法與包裹藥物的 ^ 仪大，能夠符合各種不同情況，進行各種應用。 4. 微脂體是她旨質組成，其與細胞膜成分相同，在生物體内能故能被分解’所以不具毒性，且不像蛋白質會引起免疫反應，夠多次使用。為了增加微脂體對目標組織的專—作用，可在微脂體上加入細胞〜特定配位體，以促進微脂體與目標細胞的作用，提高癌細胞吞嗟微脂體的能力，達到定點釋放藥物，降低抗癌藥物對一般組織的非特異毒性’並增進抗癌功效。—般而言，使科株抗體或配位體共價鍵結顺賴上，經細胞表面較體或抗原辨認，再進入特定細胞。此種把向性微㈣相較於餘向性微脂體效更佳。 “ 舉例而言’奥曲肽（OCtreotide)為體抑素（s_〇statin)之類似物1具有人鑛基_基_狀結構。奥曲肽對於生長激素腺南血糖激素 '及胰島素為一種有效的抑制劑。將奥曲狀鍵結於微脂體上可形成熱向性微脂體，此結構之重要成分是脂質一聚乙一醇—奥曲肽。陳氏等人於美國專利奶2⑻观揭示脂質— 聚乙-醇-奥祕的製法’其合成過程可訂列化學反應式簡單說明。 6 1362270 Ί2— O-Phe—Cys〇’rt)—Phe—D-Trp—LyS(MTT>—Thr—Cys(Trt>—Thr(〇l)—缩备一Sitter 醋胺樹脂

二琥珀趄基^ PEG DOPE 'r 二硫化物形成/〇2 DOPE—PEG-奥曲月太吳氏等人於歐洲專利1319667A2亦揭示脂質一聚乙二醇—奥曲肽的製法，如下列化學反應式所示。 O-Phc-CysiAcm—ph 卜〇-Trp(B〇c 卜 Lys(B〇c)_Th帅u)_c州 a⑽卜 TM|Bu)_〇u^脂

0 II ,H〇C—PEG-DSPE

.X ' 11 卜 PhhkTrPtBoc^—LysiBoO—ThrUBuJ—CysiAcmJ—ThrOBu) —樹脂较解 —碗化物形成/丨2 DSPU—PEG—舆曲月太上述衣備脂質~聚乙二醇—奥曲肽之方法均於固相環境中合成。固相合成方法之步驟繁續，至少需六個步驟，耗時錄費製備成本^者，對於固相合成脂質—聚乙二醇—奥曲肽而言，影響產率的變因很多’可視胜肽之胺基酸殘基數目（數目越多，產率越 ^)、裂解方式、環化條件及純化條件而定。由於脂質與聚乙二醇立於I大分子’對於在最後步驟進行職㈣解及環化會有立體早礙，問題’使反應時間延長及產率降低。此外，固相合成儀受 =每批次所能合成的最大限量為丨毫莫耳，故紐於 .中大量生產蹄—聚乙二醇—奥曲肽。 ^ 本2對Γ娜境中合成脂質—聚乙二醇—胜肽的各種缺點， '逐提供-種於液相環境中製備脂質_間隔基—反應官能基 1362270 —胜狀=法。本發明方法係於非質子溶劑中進行合成反應，具有步驟解及產率高等優點，因此可祕大量合成且節省許多成本0 【發明内容】本發明係提供一種製備脂質-間隔基-反應官能基-胜肽之方法，其中胜肽為由3至16個胺基酸殘基組成且至少一個胺基酸殘基為離胺酸（Lys)之胜肽，反應官能基為-Χ-CO—γ —c〇一，其中χ為氧或氮原子，丫為 Cm伸烷基，其又可經1或2個氧或氮原子插入，間隔基為親水性聚合物，脂質為以下式（I)所示之填脂酿乙醇胺羰基：

Ri—C02—〒H—CHr-PO 厂〇—ch2CH2—NH—CO— —C〇2—CH2 (I) &與R2可相同或相異且個別代表呈直鏈或分支狀之Cwo烷基或 C7_30稀基；該方法特徵為於液相進行反應且包括下列步驟：（a)首先使胜肽中之胺基酸殘基Lys以保護基予以保護；（b)接著與脂質—間隔基反應g能基反應’及（C)最後去除胜肽之胺基酸殘基Lys上之保護基。本發明製備脂質一間隔基一反應官能基—胜肽之方法中，月生肽表示由3至16個胺基酸殘基組成且至少一個胺基酸殘基為Lys 之胜肽。該等胺基酸殘基係選自丙胺酸（Ala)、半胱胺酸（CyS)、 1362270 \ 甘胺酸（G丨>〇、離胺酸（Lys)、苯丙胺酸（Phe)、蘇胺酸（Thr)、色胺酸（Trp)、酪胺酸（Tyr)、及纈胺酸（vd)所組成組群。 ' 該等胺基酸殘基可呈直線狀或環狀排列。較佳為6至14個胺基酸 - 殘基組成且有1個胺基酸殘基為Lys之體抑素（somatostatin)類似物。具體實例可列舉有司格列肽（seglitide)(環[N—甲基一Aia

Tyr D - Trp — Lys — Val — Phe])、奥曲肽（octreotide ) ( D — Phe —環[Cys — Phe — D — Tip - Lys - Thr — Cys] — Thr(ol))、Tyr3 —奥 •曲肽、D—Phe —奥曲肽、蘭瑞肽（lanreotide) (DpNal —環[Cys —Tyr·—D—Trp —Lys —Val —Cys] —Thr(0丨)）、伐普狀（vapre〇tide) (D Phe —環[Cys —Tyr—D —Trp —Lys —Val —Cys] —Trp)、D -Phe -環[Cy s - Phe - Gly ~ Ly s — Thr - Cy s 卜 Thr(ol)等。本發明製備脂質一間隔基一反應官能基—胜肽之方法中，在間隔基上連結有通式為—X —C〇 —γ —C〇 —之反應官能基，其中 X為氧或氮原子，Y為CN6伸烷基，其又可經丨或2個氧或氮原子插入。利用反應官能基之羧基端與胜肽產生一c〇NH—鍵結，反馨應、官^基另-端X可與間隔基鍵結，因而連結間隔基與胜肽。該反應官能基係衍生自琥賴、琥赠酐（SA)、N_減號綱亞胺等化合物之基。 - 本發明製備脂質—間隔基—反應官能基〜胜肽之方法中，間隔基之功収將親水輕肽與疏水端崎連接，因此適合使用具有親水性之長魏合物。關之㈣詞可瓣有衍生自聚乙稀基鱗咬、聚甲基丙稀酸酿、聚乙基。惡峻琳、聚乙稀基甲鱗、聚丙二醇、聚乙二醇(PEG)等之基。較佳為衍生自聚乙二醇之基且具有通式-(Ch2ch2〇) ，其中m為34至46;最佳為衍生自 1362270 PEG 600、PEG 2000 或 PEG 3000。本發明製備脂質一間隔基一反應官能基—胜肽之方法中，式 (I)所示碟脂醯乙醇胺羰基之h與R2可相同或相異且個別代表烷基或Cwo烯基，較佳為Q2—24烷基或C|2 24烯基，該烷基及烯基可呈直鏈或分支狀。具體實例可列舉有月桂基、肉笪蔻基、才示櫊基硬月曰基、油基、二十二烧_9_浠基（eruCy丨）等。較佳為硬脂基及油基。本發明製備脂質一間隔基—反應官能基—胜肽之方法中，步驟（a)及（c)所述之保護基種類及該保護基於胺基酸殘基上連去除之方法為胜肽合成之傳統技藝，可由熟習該領域人士根據欲被保護之胺基酸殘基及其於胜肽鏈中所在位置而決定。本發月方法中欲保護胜肽上胺基酸殘基Lys所使用的保護基之具體實例可列舉有第三丁氧幾基（B〇c)、2_氯苯甲氧幾基（2_服）、七芴基甲氧羰基（Fmoc)、烯丙氧羰基（Ak)C)、】_(4,4_二甲基_2,6_ -氧亞王农己小基)乙基（Dde)、1-(1，-金剛烧基)小甲基-乙氧隸基 (Adpoc)等。隹本發明製備脂質一間隔基一反應官能基一胜肽之方法中，步 / ( ) (b)及（c)均於液相環境進行反應。步驟（a)及（b) ，系將胜肽與肖日質—間隔基—反應官能基分別溶於非質子溶劑中進行°亥非貝子溶劑具體實例可列舉有Ν,Ν-二甲基甲醯胺（DMF)、 =Ν-—甲基乙醯胺、四氫呋喃、二甲基亞砜、、甲基碟酸三胺（HMPA)、乙腈（ACN)等。較佳為N，N-二曱基甲酿胺及四氫17夫喃。本發明製備脂質一間隔基—反應官能基 —胜肽之方法中，可 1362270 根據反應官能基部分之羧基數及胜肽部分之胺基數決定脂質—間隔基一反應官能基與胜肽之用量比例。較佳維持反應官能基部分：胜肽部分為4 : 1至1 ·· 4之比例以進行反應，更佳維持反應官能基部分：胜肽部分為1 : 2之比例。本發明製備脂質一間隔基一反應官能基一胜肽之方法中，各步驟均在溫度介於15至5(TC之間進行，較佳於2G至之間。步驟（a)及⑻需個別進行反應12至36小時，較佳為2〇至28

小時。本發明製備脂質-間隔基—反應官能基—胜肽之方法中，若胜肽之胺基酸殘基呈直線狀排列，可以視情況將胜肽部分進行二化步驟，此胜肽環化方式為熟習技藝人士所知，可於步驟（a)长 (b)及（c)任一步驟期間或任一步驟之後進行。胜肽之方法所製得本發明製備脂質-間隔基—反應官能基— 之產物可作為革巴向性微脂體配方之主要成分。【實施方式】或以避免造縣發日财必要之_。本發日猶根…，節中為了能徹底瞭解本發明，將於下列實例胸組成結構。然而，眾所周知的組成或製程步驟並未描述;J驟圍界定發明範疇。本發明說明書中使用之簡稱縮寫說明如下： PEG :聚乙二醇據申請專利範 DSPE .二硬脂醯基甘油磷脂醯乙醇胺 DOPE :二油醯基甘油磷脂醯乙醇胺 1362270

Boc :第三丁氧羰基 SA :琥珀酸酐 DSPC :二硬脂基磷脂醯膽驗貫例 1 : D —Phe—環[Cys —Phe —D —Trp —Lys(Boc) —Thr—Cys] —Thr(ol)合成取丨〇〇毫克奥曲肽置入圓底燒瓶内，加入5毫升N，N_二甲基甲醯胺溶解。待奥曲肽完全溶解後，加入2〇微升（B〇c) 2〇。混合物在室溫下反應24小時後，以真空系統將溶劑抽乾，得到粗產物 D — Phe —環[Cys — Phe — D — Trp — Lys(Boc) - Thr — Cys]—

Thr(d)。最後’以默克公司所製 Hibar25〇_1〇L丨chiOsmtRp_18 (7 微米）管柱，沖提液為0.〗％三氟醋酸/氏〇，分析時間為4〇分鐘 (80%〜〗0%)，進行高效能液相層析儀純化粗產物。結果滯留時間為29.4分鐘，並收集主波峰之溶液以冷凍乾燥得到白色固體粉末（72耄克，產率7〇%)，檢測質譜得[m+h广=丨丨丨9Da。實例 2 : DSPE—PEG —SA 合成取克DSPE與3.9克幾基二咪唾混合後溶於7〇毫升甲苯中，再加入2克二乙胺，在i〇〇°c下反應j小時。將⑽克舰（平均分子量2_)溶於15毫升甲笨後，加人上述溶液帽續

反應。反顏錢去除溶劑，將所得_產物溶於毫升丙嗣中而不/合固體以過濾方式去除。將滤液抽乾，所得固體產物利用陽離子交換樹脂將產物置換為Na+型式，即可得到DspE_pEG

-OH。接著，將U克琥_亞胺溶於1〇〇毫升含有】7克嫉之甲苯溶液中，並與DSPE —PEG —〇H繼續反應，加入毫升乙謎後（約反應溶液麵積5倍量）得到的固物即為DspE 12

Claims

(案號第〇95丨4〇2丨〇號專利案之說明書修正) 十、申請專利範圍： 1.種製備脂質一間隔基一反應官能基一胜肽之方法，其中胜肽為由3至16個選自丙胺酸（Aia)、半胱胺酸（Cys)、甘胺酸（Gly)、離胺酸（LyS)、苯丙胺酸（phe)、蘇胺酸 (Thr)、色胺酸（Τφ)、酿胺酸（Tyr)、及類胺酸所組成組群之胺基酸殘基組成且至少一個胺基酸殘基為離胺酸（Lys)之胜肽，反應官能基為衍生自琥珀酸、琥珀酸酐、或N—羥基琥珀醯亞胺之基，間隔基為係衍生自聚乙二醇之基且具有通式—（CH2CH2〇) ^ —，其中m為34至46，脂質為以下式（I)所示之填脂醯乙醇胺羰基： Ri—COj-CH—CHj—P〇3—〇—CH2CH2—NH-CO— R2—C〇2—CH2 (I) Ri與R2可相同或相異且個別代表呈直鏈或分支狀之c㈣烧基或C7_3〇稀基；該方法特徵為於液相進行反應且包括下列步驟：（a)首先於非質子溶劑中使胜肽中所含之胺基酸殘基Lys以保護基予以保護；⑻接f於非質子溶針與糾—間隔基—反應官能基反應，及（c)最後去除胜肽之胺基酸殘基Lys上之保護基。如申請專職圍第1項之方法’其巾該胜肽係選自司格列狀 (seglitide )、奥曲肽（octreotide )、Tyr3 —奥曲肽、D—丨—奥曲肽、蘭瑞肽（lanreotide)及伐普肽（vapreotide)所組成組群之至少一種。如申4專利範圍第1項之方法，其令該聚乙二醇為PEG6〇〇、 1362270 (案號第095140210號專利案之說明書修正） PEG 2000 或 PEG 3000。 4.如申請專利範圍第i項之方法，其中式⑴中之心與^個別為直鏈或分支狀C!2—24院基或c12 24稀基。 5·如申請專利範圍第4項之方法，其中式⑴中之汉丨與^係選；自月桂基、肉妓基、棕櫚基、硬脂基、油基、及二十二炫冬 . 烯基（erncyl)所組成組群之至少—種。 6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該步驟（a)巾保護胜狀上祕_基W所制的顧基親自第三丁氧絲、2_氯苯 f氧幾基、9-¾基曱氧縣、烯丙氧絲、二？基-之6-二氧亞環己小基)乙基、及W1，·金剛烧基H-甲基_乙氧縣所組成組群之至少一種。 7. 如申請專利範圍第！項之方法，其中該非質子溶劑係選自耶_ 三曱基曱醯胺、N，N-二甲基乙酿胺、四氣咬喃、二甲基亞諷、六甲基麟酸三胺、及乙腈所組成組群之至少一種。 8. 如申請專利範圍第i項之方法，其中該脂質―辦高基一反應官 • 能基與該胜肽之用量比例為反應官能基部分：胜肽部分=4 : j 至 1 : 4。 9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中各步至50°C之間。輝之反應溫度介於15 10. 如申請專利範圍第1項之方法，其令該步進行反應12至36小時。驟（a)及（b)分別 11·如申請專利範圍第1項之方法，於該步驟f 邱、（b)及（c) 任-步驟期間或任-步驟之後，進一步將胜肽部分進反應。、 1362270 (案號第095丨402丨0號專利案之說明書修正） 12. —種靶向性微脂體，其係由申請專利範圍第1項之方法所得之脂質一間隔基一反應官能基一胜狀作為主要成分。 20