TW200819137A - Method for preparation of lipid-spacer radical- reactions of functional group-peptide - Google Patents

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Description

200819137 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關一種在液相環境下合成脂質—間隔基一反應官 能基一胜肽之方法，此方法可以高產率製得產物，因此可用於大 量製備及合成。 【先前技術】 微脂體（Liposome)係於1965年由英國劍橋BabrahamInsitute 的Alec Bangham首先發現。微脂體係由磷脂與膽固醇等為膜材包 合成脂質空心微球體，體徑約0.0025至3.5微米，懸浮於水相中， 其中月曰备膜（球皮）主要是由鱗脂分子的麟酸端所構成的脂質雙 層（liposome bilayers)。磷脂分子的磷酸端為親水性，脂質端為 疏水性，由此所形成的脂質層雙面為親水，夾層内為疏水之膜。 水溶性物質可包在球心之溶液，油溶性物質可夾在球皮膜層内， 因此微脂體可包覆水性物質及油性物質作為載體。 根據上述微脂體特性，微脂體於197〇年代後逐漸被認為可攜 π樂物作為載體，特別是運用在抗癌藥物。微脂體是將抗癌藥物 包裹在載體内，靶向到有癌細胞的部位，才釋放出抗癌藥物，直 接作用於腫麵，且不容易進人正常_中，減少對正常細胞的 傷害。微脂體之主要優點可簡述如下。 1·樂物包晨在微脂體内會改變藥物動力學，延長藥物在血液中的 半衰期。微脂體的大小約100奈米，能穿過腫瘤新生血管壁的 漏/同使包袤抗癌樂物的微脂體能大量累積在腫瘤，增進治療 效果。此種微脂體屬於被動式標乾（passive故职如g彡。 5 200819137 2·毋性向的樂物包衷在微脂體内，可以減少不良的副作用。 3.你〇曰體的脂負組成、顆粒大小、結構、製備方法與包裹藥物的 ' 選擇性很大，能夠符合各種不同情況，進行各種應用。 • 4·微脂體是由磷脂質組成，其與細胞膜成分相同，在生物體内能 _ 被分解，所以不具毒性，且不像蛋白質會引起免疫反應，故能 夠多次使用。 為了增加微脂體對目標組織的專一作用，可在微脂體上加入 η 細胞一特定配位體，以促進微脂體與目標細胞的作用，提高癌細 胞吞噬微脂體的能力，達到定點釋放藥物，降低抗癌藥物對一般 組織的非特異毒性，並增進抗癌功效。一般而言，使用單株抗體 或配位體共價鍵結到微脂體上，經細胞表面的受體或抗原辨認， 再進入彳寸疋細胞。此種革巴向性微脂體相較於無革巴向性微脂體的療 效更佳。 ' ^ +例而a，总曲肽（octre〇tide)為體抑素（somatostatin)之 y 頒似物，其具有八個胺基酸殘基的環狀結構。奥曲肽對於生長激 素胰回血糖激素、及胰島素為一種有效的抑制劑。將奥曲肽鍵 結於微脂體上可形成靶向性微脂體，此結構之重要成分是脂質一 • =乙二醇一奥曲肽。陳氏等人於美國專利0552007B2揭示脂質一 卜奥錄的製法，其合成過料用下麻學反應式簡單 ’ 說明。 6 .200819137 NH2~- D— Phe—Cys(Trl)—Phe— D~ Trp— L.y s( MTT)— Thr—Cys(Trt)—Thr(o 丨卜·縮醛一"Siber 醯胺樹脂
-琥珀醯基一PEG
DOPE 裂解 二硫化物形成/〇2 DOPE—PEG—奥曲月太 吳氏等人於歐洲專利Π19667Α2亦揭示脂質一聚乙二醇一奥曲肽 的製法，如下列化學反應式所示。 C>s(Acm) —Phe —D —Trp(Boc) —Lys( Boc)—Thr(tBu)—Cys(Acm)—Thr(tBu)一〇 丨一樹脂
HOC—PEG—DSPB 〇 0 + C 丨 LC】C-NH—D—phe-Cys(Acm>—f)h(^-D-Trp(Boc)—Lys(Boc}—Thr(tBu)—Cys(Acmh-Thr(U3u卜ol—樹脂 二硫化物形成/I2 DSPE—PEG—奥曲月太 C. 上迷製備脂質-聚乙二醇—奥曲肽之方法均於固相環境中合成。 固相合成方法之步驟繁瑣，至少需六個步驟，耗時且浪費製備成 本再者，對於固相合成脂質一聚乙二醇一奥曲肽而言，影響產 率的變因很多，可視職之胺基酸殘基數目（數目越多，產^越 ^)、裂解方式、環化條件及純化條件而定。由於脂質與聚乙二醇 ^於IX大分子’對於在最後步驟進行胜肽的㈣及環化會有立體 1題使反應日守間延長及產率降低。此外，固相合成儀受 批次所能合成的最大限量為丨毫莫耳，故無法於 中大置生產脂質-聚乙二醇—奥曲狀。 兄 本發明】提2=::^脂質-聚乙二醇-胜肽的各種缺點， 1、知目環境帽備脂質-_基-反應官能基 7 200819137 =======
【發明内容】 本舍明係提供-種製備脂質—間隔基—反應官能基—胜肽之 方法，其中 胜肽為由3至關胺基_練成且至少—個祕酸絲為離胺 酸（Lys)之胜肽， 反應官能基為-X—⑴―Y—⑴―，其中X為氧或氮原子，γ為 Q-6伸烧基，其又可經i或2個氧或氣原子插入， 間隔基為親水性聚合物， 脂質為以下式（I)所示之磷脂醯乙醇胺羰基： ι^Γ-α)2—(ρί~(Ή2—p〇 广 〇—GH2GH2—NH—G〇— —C〇2—CH2 (I)
Ri與K可相同或相異且個別代表呈直鏈或分支狀之c㈣絲或 。7_30烯基； 该方法特徵為於液相進行反應且包括下列步驟··⑷首先使胜狀 中之月女基酸殘基Lys以保護基予以保護；⑻接著與脂質一間隔 基一反應官能基反應；及（c)最後去除胜肽之胺基酸殘基^^上 之保護基。 本鲞明製備脂質一間隔基一反應官能基—胜肽之方法中，胜 肽表示由3至16個胺基酸殘基組成且至少一個胺基酸殘基為 之胜肽。該等胺基酸殘基係選自丙胺酸（Ala)、半胱胺酸（Cys)、 8 200819137 甘胺酸（Gly)、離胺酸（LyS)、笨丙胺酸（Phe)、蘇胺酸（丁hr)、 色胺酸（Trp)、酪胺酸（Tyr)、及纈胺酸（Vai)所組成組群。 • 該等胺基酸殘基可呈直線狀或環狀排列。較佳為ό至14個胺基酸 .- 殘基組成且有1個胺基酸殘基為Lys之體抑素（somatostatin)類 • · 似物。具體實例可列舉有司格列肽（seglitide)(環[N—甲基一Ala -Tyr—D — Trp — Lys-Va卜Phe])、奥曲肽（octreotide) (D — Phe 一環[Cys - Phe — D — Trp — Lys — Thr - Cys] - Thr(ol))、Tyr3 —奥 〇 曲肽、D—Phe1—奥曲肽、蘭瑞肽（lanre〇tkie) (DpNa丨—環[Cys 一 Tyr—D — Tip — Lys — Val 一 Cys] — Thr(ol))、伐普肽（vapreotide )
(D —Phe— 環[Cys —Tyr — D — Trp —Lys — Val —Cys] —Trp)、D —Phe -環[Cy s — Phe—Gly - Ly s — Thr—Cy s] - Thr(ol)等。 本發明製備脂質一間隔基一反應官能基一胜肽之方法中，在 間隔基上連結有通式為一 X — C〇 一 Y —C〇一之反應官能基，其中 X為氧或氮原子，γ為伸烷基，其又可經丨或2個氧或氮原 子插入。利用反應官能基之羧基端與胜肽產生一C0NH—鍵結，反 U 應官能基另一端X可與間隔基鍵結，因而連結間隔基與胜肽。該 反應官能基係衍生自琥珀酸、琥珀酸酐（SA)、N-羥基琥珀醯亞 胺等化合物之基。 本号X明衣備月曰吳一間隔基一反應官能基一胜狀之方法中，間 隔基之功用是將親水端胜肽與疏水端脂質連接，因此適合使用具 ， 有親水性之長鏈聚合物。該間隔基之具體實例可列舉有衍生自聚 • 乙烯基ϋ比咯啶、聚曱基丙烯酸酯、聚乙基噁唑啉、聚乙烯基曱_、 *丙—醇、聚乙二醇(pEG)等之基。較佳為衍生自聚乙二醇之基且 具有通式一（CH2CH2〇) ，其中m為34至46 ;最佳為衍生自 9 200819137 PEG 600、PEG 2000 或 peg 3000。 本务明製備脂質一間隔基一反應官能基—胜肽之方法中，弋 (I)所示_脂醯乙醇胺羰基之&與R2可相同或相異且個別代表 〇7-3〇烷基或Cw◦烯基，較佳為C]2 24烷基或Q2 24烯基，該烷基^ 稀基可呈直鏈或分支狀。具體實例可列舉有月桂基、肉堇S、 棕櫚基、硬脂基、油基、二十二烧_9_稀基（emcyl)等。較佳 脂基及油基。 土 本發明製備脂質—間隔基一反應官能基一胜肽之方法中，步 2 (a)及（c)所述之保護基種類及該保護基於胺基酸殘基上連 、、、口人去除之方法為胜肽合成之傳統技藝，可由熟習該領域人士根 據欲被保護之胺基酸絲及其祕肽鏈巾所在位置而決定。本發 明方法中欲保護胜肽上胺基酸絲Lys所使用的保護基之二 例可列舉有第三丁氧絲（B〇e)、2-氯苯甲氧絲（2、αζ)、二 芴辱甲氧絲（Fmoc)、稀丙氧幾基（A1〇c)、冰4二甲基Jr —氧亞％己小基)乙基（Dde)、〗_(】，_金剛烷基)小甲基_乙'羰美
J (Adpoc)等。 手厌土 ^本發明製備脂質一間隔基—反應官能基—胜肽之方法中，步 4 (a) (b)及（C)均於液相環境進行反應。步驟（a)及〆 係將胜狀與脂質—間隔基—反應官能基分別溶於非質子溶劑中進 =，該非質子溶劑具體實例可列舉有N，N_:f基甲酸胺⑴^)、 n，n_—甲基⑽胺、四氫π夫喃（)、二甲基亞 較一」甲 本發明製備脂質-間隔基—反應官能基—胜肽之方法中，可 200819137 根據反應官能基部分之雜數及胜肽部分之絲數決定脂質—間 隔基-反應官能基與胜肽之用量_。梅轉反應官能基部
η 二处胜肽.卩刀為4 · 1至1 : 4之比例以進行反應，更佳維持反應 官能基部分：胜肽部分為丨·· 2之比例。 本考X明衣備脂質一間隔基—反應官能基一胜肽之方法中，各 步驟均在溫度介於15至5(TC之間進行，較佳於2G至坑之間: 步驟⑷及㈦需個別進行反應12至36小時，較佳為2〇至曰28 本毛明衣備脂質-職基—反應官能基—胜肽之方法中， 胜肽之胺基g_基呈直雜湖，可以赠況紐肽部分進 化步驟，此胜肽環化方式為熟習技藝人士所知，可於步驟⑷、、 (b)及（c)任一步驟期間或任一步驟之後進行。 本發明製備脂質—間隔基—反應官能基—胜肽之方法所 之產物可作為靶向性微脂體配方之主要成分。 ϋ 【實施方式】 為了能徹底瞭解本發明，將於下列 組成結構。然而’眾所周知的組成或製程步驟並‘二Γ驟或 么/τ I 即中 圍界定發明範疇。 本發明說嘴愤狀簡觸寫說明如下： PEG ··聚乙二醇 DSPE :二硬脂醯基甘油磷脂醯乙醇胺 DOPE ··二油醯基甘油磷脂醯乙醇胺 200819137
Boc :第三丁氧羰基 SA:琥珀酸酐 DSPC :二硬脂基磷脂醯膽鹼 實例 1 : D —Phe —環[Cys —Phe —D —Trp —Lys(Boc) —Thr — Cys] 一 Thr(ol)合成 取100毫克奥曲肽置入圓底燒瓶内，加入5毫升N，N-二甲基 . 曱醯胺溶解。待奥曲肽完全溶解後，加入20微升（Boc) 2〇。混 (Λ 合物在室溫下反應24小時後，以真空系統將溶劑抽乾，得到粗產 物 D — Phe —環[Cys — Phe — D — Trp — Lys(Boc) — Thr — Cys]— Thr(ol)。最後，以默克公司所製 Hibar250_10LichrosorbRP-18 (7 微米）管柱’沖提液為〇·1%三說醋酸/咏〇，分析時間為4〇分鐘 (80%〜10%)，進行高效能液相層析儀純化粗產物。結果滯留時 間為29.4分鐘，並收集主波峰之溶液以冷凍乾燥得到白色固體粉 末（72毫克，產率70%)，檢測質譜得[M + H] + = 1119Da。 實例 2 : DSPE —PEG —SA 合成 〇 取15克DSpE與3.9克羰基二咪唾混合後溶於7〇毫升甲苯 中，再加人2克三乙胺，在l〇(TC下反應1小時。將4(^pEG(平 均分子量2_)練15毫升甲苯後，逐滴加入上述溶液中繼續 • 反應。反應結束後去除溶劑，將所得固體產物溶於5〇〇毫升丙酮 . 巾’而不’容H]體以過;i|方式去除。將濾液抽乾，所得固體產物利
_ 用陽離子交換樹脂將產物置換為Na+型式，即可得到DspE__pEG . —OH。接著，將克琥珀醯亞胺溶於100毫升含有17克吡啶
之曱苯溶液中，並與DSPE-PEG-0H繼續反應，加人毫升 乙醚後（約反應溶液總體積5倍量）得到的固體產物即為DSpE 12 200819137 -PEG —SA。其後’利用氣仿平衡過的石夕膠管柱（础⑶呂。丨⑼ 胃 ⑶1麵，粒徑為63至200微米’1.5x30么v分），沖提液為氣仿/ • 情= 4/1分離產物。以上述TLC法確定產物位置及純度，收 祕絲部分，以顧乾驗除去_。錄鎌測質譜得[M + , H]h=2892Da，以及核磁共振儀（Wnmr)分析結果如下。 1H NMR (300MHz, CDC13) - δ0·78〜1·40 (66H，二烷基 Η) δ2·33 (4H，brt，CO-CH2) δ3·64 (160H，brs，PEG-H) δ3·85〜4·50 (9H，m，甘油-Η 及 〇-CH2_CHrN) 實例3 : DSPE—PEG—奥曲肽合成 取 100 毫克 DSPE-PEG-SA 與 34·6 毫克 D — phHf[Cys 一 Phe — D — Trp — Lys(B〇c) — Thr — Cys] — Th_混合後溶解在 6 耄升凡斗二曱基曱醯胺中。待固體完全溶解後，加入毫克N_ 羥基苯并三唑與6·4毫克二環己基碳醯亞胺一同反應24小時，其 U 後將溶劑抽去。加入5毫升95%三氟乙酸溶液去除D — Phe—環 [Cys Phe - D - Trp - Lys(Boc) - Thr - Cys 卜 Thr(ol)上的保護基
Boc，反應3〇分鐘後去除溶劑。加入過量氯仿靜置使溶液產生沉 澱，以42號濾紙過濾，取濾液濃縮後再加入過量氣仿，重複上述 步驟數次後，將濾液以減壓濃縮機濃縮即可得化合物dspe—peg •一奥曲肽，其為淡褐色固體（122毫克，產率91%)。以高效能 - 液相層析儀分析產物，除了沖提液使用0.1%三氟醋酸/Ch3CN 外，其餘分析條件皆與實例丨相同。結果滯留時間為14·5分鐘， 檢測質譜得[M + H] + = 3893Da，以及核磁共振儀（iHnmr)分析 13 200819137 結果如下。 4 NMR (300MHz，CDC13) δ0·84〜1·40 (66H，二烧基 Η) δ3·64 (〗60H，brs，PEG-H) δ3·85〜4.50 (9H，m，甘油-Η 及 〇-CH2_CH2-N) δ8·04 (4H，笨曱基） 實例4 :用薄膜水合法合成包裹小紅莓藥物（doxorubicin)之革巴向 Ο u 性微脂體（奥曲肽一微脂體一小紅莓）
分別秤取DSPC (70莫耳）/膽固醇/DSPE DSPE-PEG 2000-奥曲肽（3 : 2 : 0.094 : 0.206 莫耳比），DSPC (7〇 莫耳）/膽固醇/DSPE —PEG 2000—奥曲肽（3 : 2 : 〇·2〇6 莫耳比）’ DSPC (70莫耳）/膽固醇/DSPE —PEG 2000—奥曲 狀（3 · 2 · 〇·3莫耳比）於250毫升圓底燒瓶内，再個別加入8毫 升氯仿並使其均勻溶解。利用旋轉減壓濃縮儀於6(TC下真空抽除 有機溶液，待氣仿完全抽除後，可於瓶壁上形成脂㈣膜。抽乾 後入5毫升25〇mM硫酸銨溶液（pH5·0，530m0s)至已形 貝相的圓底燒瓶内。於6(rc水浴中震盪減至瓶壁上脂質 :料分散於魏銨雜巾，即可得形層細旨體（多層囊泡， 與解、# j乡層微脂體鮮㈣液態11及6叱水浴進行反覆冷康 …欠後，再以高壓濾獏擠出系統（Lipex Biomembrane，溫 口举垃t拿大）進行過濾擠壓得到單—脂層微脂體。 小红蕃t則、紅每藥物包裹。依每1微莫耳磷脂質加入14〇克 貯存、、夜11触例，將事綠製濃度為1G毫桃升之小紅莓藥物 (峨）加入微脂體懸浮液中，並於6(TC與H)〇rpm下反 200819137 應％分鐘。反應完成後，將懸浮液立刻置於冰水浴中冷卻。再將 包裹小紅賴物讀脂龍浮_過Sephadex⑽凝膠過渡管 柱’並以0.9%氣化鈉為沖提液，藉以移除未被包裹之小紅每藥 物收7K通過答柱之摄月曰體懸浮液，再利用超高速離心機於 OOxg下離心90分鐘。移除大部分上清液，留下少量上清液， 將沉殿之㈣體再均勻餅。以α22餘絲縣微脂體懸浮
U 液，得到最後產品（奥曲肽—微脂體―小紅莓）。進行微脂體内 小紅莓藥物之濃度測定及粒徑分析： 1·利用Ν4 Plus粒徑分析儀，測得微脂體平均粒徑為75至95奈 米之常態分佈。 2.利用螢光光譜儀（JASC0，FP62〇〇)於475奈綠發光及· 奈米發射光下測定，包覆於微脂體内之小紅每藥物濃度為2毫 克/毫升。 實例5 :靶向性微脂體細胞活性實驗 此實驗為分析細胞對奥曲肽—微脂體—小紅每 革巴向性微脂體藥物之攝人（uptake)情形。實驗需培養適量子代細 胞予以進行。首先將AR42J細胞以5咖細胞/凹槽培養在6_凹槽 培養皿上，經過-晚的時間進行細胞黏附。待細胞黏附後，配製 不同組別藥物，分別為控制組（以1毫升/凹槽hbss處理）、自 由型小紅莓、微脂體—小紅莓（自行合成）、及奥曲肽—微脂體 -攸莓，以濃度為i毫升/凹槽加人細胞中，分別進行2及4小 才市物攝入反應。待反應日守間結束後，即以冰鱗酸緩衝鹽液（卿） 沖洗細胞以終止義反應。接著_ 5%忙絲硫酸鈉（sds) 溶液作用丨G分鐘，將細胞溶解，使已被攝人藥物釋出。待釋出之 200819137 t .物充份混合均勾後，取、毫升置於抛棄式比色槽中，利用 =母樂物可產生自發性螢光特性，在475奈米激發光與夺 .^射光下進行光譜分析。此外，同時將已溶解細胞進行蛋白質 •里化分湘以標準化細驗。最後將攝人藥物濃度與標準化之細 胞數作比對得到細胞攝入藥物分子數並進行實驗組別比較。 表1顯示AR42J細胞對不同配方藥物攝入情形，其中控制組 • *於以HBSS處理，故無小紅莓的攝入，顯示只有小紅莓存在下 才有小紅莓的攝入。自由型小紅莓在細胞中的攝入情形最高，細 胞2小時的攝入情形為96·43χ1〇9分子/細胞，4小時的攝入情形為 11〇·83χ1〇9分子/細胞。具有微脂體特性的微脂體一小紅莓（自行 合成），細胞2小時與4小時的攝入情形分別為丨·89χ1〇9分子/細 胞與2·46χ1〇9分子/細胞。靶向性治療腫瘤藥物奥曲肽—微脂體— 小紅莓則依據不同配方在2小時與4小時有不同的攝入：奥曲肽 一微脂體一小紅莓分別為1·97χ109分子/細胞與3·ΐ4χΐ〇9分子/細 胞；4%奥曲肽一微脂體一小紅莓為2·26χ1〇9分子/細胞與3·43χ1〇9 q 分子/細胞；6%奥曲肽一微脂體一小紅莓為2·98χ1〇9分子/細胞與 5·35χ109分子/細胞。 类1 :比較在小紅莓藥愈攝入情形 小紅莓藥物配方 細胞的小紅莓藥物系7^7^ 分子/細胞）（n = 3) 2小時 4小時 控制組 0 0 自由型小紅莓 96.43+5.75 11〇.83土0.62 微脂體一小紅莓（自行合成） 1·89±〇.〇7 2.46±0.03 奥曲肽一微脂體一小紅莓 1.97±0.14 3.1410.17 16 200819137 3.43±0.14 5.38 土 0.38 奥曲肽一微脂體一小紅莓_4% 2.26±0.29 奥曲肽一微脂體一小紅莓—6% 2.98±0.32 【圖式簡單說明】 益0 【主要元件符號說明】 無0
U 17

Claims (1)

  1. 200819137 十、申請專利範圍： 1· 種衣備脂質一間隔基一反應官能基一胜狀之方法，其中 胜肽為由3至16個胺基酸殘基組成且包含至少一個胺基酸殘 基為離胺酸（Lys)之胜肽， 反應官能基為一X一CO—Y—CO—，其中X為氧或氮原子，Y 為Cw伸烷基，其又可經1或2個氧或氮原子插入， 間隔基為親水性聚合物， 脂質為以下式（I)所示之磷脂醯乙醇胺羰基： Ri—C02—CH—CH2—P〇3—0—CH2CH2—NH—CO— R2—C02—CH2 / λ Ri與&可相同或相異且個別代表呈直鏈或分支狀之C7 3Q烷基 或C7-3G細基； 该方法特徵為於液相進行反應且包括下列步驟：（a)首先使 胜狀中所含之胺基酸殘基Lys以保護基予以保護；（b)接著 與脂質一間隔基一反應官能基反應；及（c)最後去除胜肽之 胺基酸殘基Lys上之保護基。 2·如申請專利範圍第1項之方法，其中該胜肽之胺基酸殘基係選 自丙胺酸（Ala)、半胱胺酸（Cys)、甘胺酸（Giy)、離胺酸 (Lys)、苯丙胺酸（Phe)、蘇胺酸（Thr)、色胺酸（丁叩）、 絡胺酸（Tyr)、及綠胺酸（Vd)所組成組群之至少一種。 3·如申請專利範圍第1項之方法，其中該胜肽之胺基酸殘基呈直 線狀或環狀排列。 4. 如申睛專利範圍第1項之方法，其中該胜肽為由6至14個胺 基酸殘基組成且有1個胺基酸殘基為Lys 之胜肽。 5. 如巾睛專利範’ 4項之方法，其中該胜肽係選自司格列狀 .200819137 (seglitide)、奥曲肽（octreotide)、Tyr3 —奥曲肽、D—Phe1—奥 • 曲肽、蘭瑞肽（lanre〇tide)及伐普肽（vapreotide)所組成組群之 ^ 至少一種。 . 6· 如申請專利範圍第1項之方法，其中該反應官能基係衍生自琥 珀酸、琥珀酸酐、或N-羥基琥珀醯亞胺之基。 7· 如申請專利範圍第1項之方法，其中該間隔基係衍生自選自聚 乙烯基吡咯啶、聚甲基丙烯酸酯、聚乙基噁唑啉、聚乙烯基曱醚、 聚丙二醇、及聚乙二醇所組成組群之至少一種化合物之基。 (x 8· 如申請專利範圍第7項之方法，其中該間隔基係衍生自聚乙二 醇之基且具有通式一（CH2CH20) m—，其中m為34至46。 9· 如申請專利範圍第8項之方法，其中該聚乙二醇為PEG 600、 PEG 2000 或 peg 3000。 10·如申請專利範圍第1項之方法，其中式（〇中之&與112個別 為直鏈或分支狀C丨2_24烷基或C丨2_24烯基。 H·如申請專利範圍第9項之方法，其中式⑴中之R々R2係選 I 自月桂基、肉苴蔻基、棕櫚基、硬脂基、油基、及二十二烷_9_ 烯基（erucyl)所組成組群之至少一種。 1Z如申請專利範圍第1項之方法，其中該步驟（a)中保護胜肽 • 上胺基酸殘基Lys所使用的保護基係選自第三丁氧羰基、2_氯苯 甲氧羰基、9巧基曱氧羰基、烯丙氧羰基、H4,4_二曱基_2,6_二 • 乳亞壞己，1，基)乙基、及叩，-金剛烧基)小甲基-乙氧縣所組成 組群之至少一種。 13·如申請專利範圍第】項之方法，其中該步驟（a)及⑻係於 非質子溶劑中進行。 19 200819137 14·如申請專利範圍第13項之方法，其中該非質子溶劑係選自 Ν，Ν-二曱基曱醯胺、ν，ν_二曱基乙醯胺、四氫呋喃、二曱基亞砜、 六曱基磷酸三胺、及乙腈所組成組群之至少一種。 15·如申請專利範圍第1項之方法，其中該脂質—間隔基一反應官 能基與該胜肽之用量比例為反應官能基部分：胜肽部分=4 : 1 至 1 : 4。 16·如申請專利範圍第1項之方法，其中各步驟之反應溫度介於15 至50°C之間。 17.如申請專利範圍第1項之方法，其中該步驟（a)及（b)分別 進行反應12至36小時。 18·如申請專利範圍第1項之方法，於該步驟（a)、（b)及（c) 任一步驟期間或任一步驟之後，進一步將胜肽部分進行環化反 應。 19· 一種靶向性微脂體，其係由申請專利範圍第丨項之方法所得之 脂質一間隔基一反應官能基一胜肽作為主要成分。
    20 200819137 七、 指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：無。 (二） 本代表圖之元件符號簡單說明： 八、 本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 200819137 明專利說明書π 5。3 m W 1U — 丄二二 (本說明書格式、順序及粗體字’請勿任意更動’※記號部分請勿填寫） ※申請案號(2006,01) ※申請日期： PC分類：以1U〇〇6』1) 一、 發明名稱··（中文/英文） A^ikf//>^ (2006.01) 製備脂質一間隔基一反應官能基—胜肽之方法 二、 申請人：（共1人） 姓名或名稱：（中文/英文） 行政院原子能委員會核能研究所 Institute of Nuclear Energy Research Atomic Energy Council, Executive Yuan 代表人：（中文/英文）林立夫 LIN,LI-FU 住居所或營業所地址··（中文/英文） 桃園縣龍潭鄉佳安村文化路1000號 NO. 1000, WENHUA ROAD, JIAAN VILLAGE, LONGTAN TOWNSHIP, TAOYUAN COUNTY, TAIWAN, R.O.C. 國籍：（中文/英文）中華民國R〇C 三、發明人··（共5人） 姓名：（中文/英文） 1.李德偉 LEE，TE-WEI 2·邱淑珮 CHIU, SHU-ΡΈΙ 3. 游佳瑜 YU，CHIU-YU 4. 張翠容 CHANQ TSUI-JUNG 5. 張志賢 CHANG, CHIH-HSIEN 國籍··（中文/英文）卜5 :中華民國/R.O.C.
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TWI397428B (zh) * 2009-12-29 2013-06-01 Ind Tech Res Inst 標的第四介白素受體之傳輸系統
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE2512T1 (de) * 1979-11-27 1983-03-15 Sandoz Ag Polypeptide, verfahren zu ihrer herstellung, pharmazeutische zusammensetzungen, die diese polypeptide enthalten, und ihre verwendung.
DE69124274T2 (de) * 1990-02-27 1997-08-14 Agency Ind Science Techn Oligopeptide, sie enthaltende pharmazeutische und Futterzusammensetzung und Benützung von Oligopeptiden
WO1997031624A1 (en) * 1996-02-27 1997-09-04 Purdue Research Foundation Liposomal delivery system
AU2620000A (en) * 1999-01-21 2000-08-07 Georgetown University Ligand-peg post-coating stabilized lipoplex and polyplex for targeted gene delivery
AU4267700A (en) * 2000-01-13 2001-07-19 Academia Sinica Application of somatostatin analogs to specific delivery of anti-tumor drugs into tumor cells
JP2004510751A (ja) * 2000-10-05 2004-04-08 アレス　トレーディング　ソシエテ　アノニム 位置選択的液相ペグ化
US20030229013A1 (en) * 2001-12-07 2003-12-11 Shih-Kwang Wu Solid phase method for synthesis peptide-spacer-lipid conjugates, conjugates synthesized thereby and targeted liposomes containing the same

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