CN113024638B - 一种小分子肽及其作为纳米载药载体的制备方法和应用 - Google Patents

一种小分子肽及其作为纳米载药载体的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小分子肽及其作为纳米载药载体的制备方法和应用，该肽的结构式为Ac‑LVVLKKK(pY)‑NH2，可在Hepes溶液中自组装形成球状纳米粒。该肽形成的球状纳米粒可作为载药载体，用以包载难溶性抗肿瘤药物，降低其毒副作用，提高其生物利用度。本发明设计的小分子多肽具备酶响应性及自组装形貌转变的能力，可响应肿瘤微环境中过量表达的碱性磷酸酶，将难溶性抗肿瘤药物运载至肿瘤细胞，在碱性磷酸酶诱导下由球状纳米粒转变成纳米纤维，释放抗肿瘤药物并延长药物在细胞内的滞留时间。本发明公开了该肽的构建、制备方法及应用，为化疗药物纳米载药体系的发展提供新的思路。

Description

一种小分子肽及其作为纳米载药载体的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米载药体系及其制备技术领域，具体涉及一种可作为纳米载药载体的磷酸酶响应性小分子肽。
背景技术
纳米材料具备特有的高渗透长滞留（EPR）效应，能够在肿瘤细胞部位有效富集，因此，作为抗肿瘤药物的载药载体在肿瘤治疗中具有巨大的潜力。尽管一些无机纳米材料以及聚合物材料构建的纳米载药体系在肿瘤的治疗中取得了巨大的进展，但是部分材料生物相容性差，体内降解困难，难以自组装制备，需要特定的制备方法才能包载药物，使其在临床上的应用受到限制。
近年来，小分子肽在构建纳米载药体系的研究引起了广泛关注。多肽本身是构成生物体的重要组成成分之一，生物相容性好，易降解，同时具备多种生物学功能。自组装是肽分子与生俱来的能力，是诸多生命活动得以实现的基础。肽自组装技术在精确结构组装方面具有独特优势，有望为医学问题的解决提供新工具，新方法。因此，肽在肿瘤药物载药体系的研究中具有较大的应用价值。设计一种自组装的小分子肽，自组装形成球状纳米粒用以包载及递送化疗药物，将抗肿瘤药物递送至肿瘤细胞，并在肿瘤微环境中过表达的磷酸酶诱导下，球状纳米粒形貌转变，释放药物，是抗肿瘤药物载体的理想材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种响应于肿瘤细胞微环境中过量表达的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）的纳米载体小分子肽，以及其制备方法及应用。所设计的小分子肽纳米载体可响应于肿瘤细胞微环境中过量表达的ALP酶，将包载的难溶性抗肿瘤药物递送至肿瘤细胞，并在ALP诱导下发生形貌转变，由球状纳米粒转变为纳米纤维，释放药物并延长药物在肿瘤细胞内的滞留时间。其治疗效果明显优于游离药物。
本发明目的是由以下技术方案实现的：
一种小分子肽，结构式为Ac-LVVLKKK(pY)-NH2，可作为纳米载药载体，具有磷酸酶响应性。
本发明还提供了一种小分子肽在纳米载药体系中的应用，所述小分子肽为所述的可作为纳米载药载体的磷酸酶响应性小分子肽，所述小分子肽在Hepes溶液中自组装形成球状纳米粒，用以包载水溶性差的抗肿瘤药物，所述水溶性差的抗肿瘤药物为脂溶性药物。
本发明还提供了一种多肽纳米载药载体，所述多肽纳米载药载体包含所述可作为纳米载药载体的磷酸酶响应性小分子肽。
优选的，所述多肽纳米载药载体响应于肿瘤微环境中过表达的碱性磷酸酶，自组装形貌转变为纳米纤维释药，并延长肿瘤细胞内药物滞留时间，所述碱性磷酸酶的浓度为0.5～5 U/mL。
本发明还提供了一种多肽纳米载药载体的制备方法，用于所述的多肽纳米载药载体，该方法包括如下步骤：将Ac-LVVLKKK(pY)-NH2加入到Hepes溶液中，多肽自组装形成载药球状纳米粒。
优选的，所述Hepes溶液的pH为7.4，Ac-LVVLKKK(pY)-NH2的浓度为0.1~1 mmol/L。
优选的，所述Ac-LVVLKKK(pY)-NH2的浓度为0.5 mmol/L。
优选的，多肽纳米载药载体的制备方法，包括以下步骤：
称量0.59 mg浓度为0.5 mmol/L的肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2，加入pH7.4的Hepes缓冲液1 mL，超声10 min，室温静置24 h后，得多肽纳米载药载体。
本发明提供的Ac-LVVLKKK(pY)-NH2多肽在Hepes溶液中自组装形成球状纳米粒，通过其修饰的磷酸化的酪氨酸（pY）基团，响应肿瘤微环境中过量表达的ALP酶，释放药物。同时，在ALP酶的诱导下完成形变，由球状纳米粒形变成为高长径比纳米纤维，释放药物并延长药物在肿瘤细胞内滞留时间。
该肽形成的球状纳米粒可作为载药载体，用以包载难溶性抗肿瘤药物，提高其生物利用度。
本发明技术方案带来的有益技术效果是：
第一，所设计的小分子肽能够使用固相合成技术合成，成本低廉，纯化方便；第二，设计合成的多肽采用成熟的自组装模型，具备良好的自组装形成球状纳米粒的能力；第三，通过修饰pY基团，响应肿瘤微环境中过量表达ALP酶，利用EPR效应运载药物至肿瘤细胞，并在ALP酶诱导下自组装形变的功能，释放药物，具备良好的生物适应性。
制备得到的载药载体与现有技术最大的区别是：可响应肿瘤微环境中过表达的ALP酶；从原料的选取方面，本发明选用了多肽在Hepes缓冲溶液中，控制pH为7.4时自组装形成的球状纳米粒作为性质稳定的载药载体，并通过修饰酶响应性基元，使其具备相应的生物学功能，为纳米载药体系的发展提供了新的思路。
本发明提出的多肽分子自组装形成球状纳米粒，可通过响应于ALP酶，发生自组装形变，释放药物并延长药物在肿瘤细胞内的滞留时间，是一种理想的纳米载药体系，为抗肿瘤药物的递送方式提供了新的思路。
肿瘤部位上调的酶含量是肿瘤微环境中重要的内源性刺激源，如ALP酶。因此，我们基于小分子肽的设计构建了酶响应性小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2。通过响应于ALP酶，运载抗肿瘤药物至肿瘤细胞后实现酶诱导形变，释放药物，增加抗肿瘤药物的胞内滞留时间，增强抗肿瘤药物疗效，提高其生物利用度。
附图说明
图 1是小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2的分子结构式；
图 2是小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2的HPLC色谱图；
图 3是小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2在Hepes（pH 7.4）溶液中放置24 h后，通过透射电子显微镜观察到的自组装形貌图；
图 4是0.1 mmol/L小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2在加入抗肿瘤药物多柔比星（DOX）后，室温放置24 h后，通过透射电子显微镜观察到的自组装形貌图；
图 5是0.5 mmol/L小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2在加入抗肿瘤药物多柔比星（DOX）后，室温放置24 h后，通过透射电子显微镜观察到的自组装形貌图；
图 6是1 mmol/L小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2在加入抗肿瘤药物多柔比星（DOX）后，室温放置24 h后，通过透射电子显微镜观察到的自组装形貌图；
图 7是载药（DOX）小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2在加入0.5 U/mL碱性磷酸酶，37℃放置24 h后，通过透射电子显微镜观察到的自组装形貌图；
图 8是载药（DOX）小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2在加入2.5 U/mL碱性磷酸酶，37℃放置24 h后，通过透射电子显微镜观察到的自组装形貌图；
图 9是载药（DOX）小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2在加入5 U/mL碱性磷酸酶，37℃放置24 h后，通过透射电子显微镜观察到的自组装形貌图；
图 10是小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2的Zeta电位图；
图 11是小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2在加入抗肿瘤药物多柔比星（DOX）后的Zeta电位图；
图 12是小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2在加入碱性磷酸酶，37℃放置6 h后的HPLC色谱图；
图 13是载药（DOX）小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2在加入和不加入碱性磷酸酶后的药物释放行为。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但并不是对本发明请求保护范围的限制。
如图1-9所示，首先对本发明所选用的主要实验仪器的规格、型号做简要说明，下述实验仪器均可通过商业渠道购买获得：
旋转蒸发仪（Rotavapor R-210型，BUCHI公司）
微波辅助多肽合成仪（Liberty Blue型，CEM公司）
高速冷冻离心机（CF16RXII 型，HITACHI公司）
超声波清洗器（KQ-200KDE型，昆山市超声仪器有限公司）
洁净工作台（SR-DJ-2F型，苏净安泰公司）
pH计（HI8424 and HI1330型，HANNA公司）
冷冻干燥机 （Alpha1-2LD plus型，Martin Christ公司）
电子天平（AL204型，METTLER TOLEDO）
移液器（Reserch plus型，Eppendorf公司）
细胞培养箱（HERACELL 150i型，Thermo公司）
酶标仪 Spectra Max M2e Molecular Devices
激光共聚焦显微镜（A1-si型，Nikon公司）
透射电子显微镜（JEM-2100 UHR型，JEOL公司）
冷场发射扫描电子显微镜（SU8010型，日本HITACHI公司）
台式冷冻离心机（5810R型，Eppendorf公司）
超净工作台（Airtech型，江苏安泰）
一次性细胞培养瓶（25cm²，康宁公司，costar型）
一次性移液管（5mL，准确度0.1mL，康宁公司，costar型）
一次性细胞培养板（货号3599，康宁公司，costar型）
一次性细胞培养板（货号3548，康宁公司，costar型）
液氮容器（YDS-30-125型，东亚液氮容器）
实施例1：Ac-LVVLKKK(pY)-NH2多肽的制备
步骤1：蒸馏N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和哌啶（Piperidine）溶剂
将购买的DMF溶液在60℃条件下减压蒸馏，得到纯的DMF溶剂；将购买的哌啶中加入少量CaH2加热回流1-2小时，接收沸点温度（106℃）的馏分，得到纯的哌啶溶剂。
步骤2：氨基酸、树脂、活化剂、盖帽剂、去保护剂的配制
多肽固相合成仪上计算出制备0.25mmol/L Ac-LVVLKKK(pY)-NH2所需氨基酸和其他试剂的用量：
Leu（亮氨酸）：0.78 g溶于11 mL DMF中；
Lys（赖氨酸）：1.50 g溶于16 mL DMF中；
Tyr(PO3H2)（磷酸化的酪氨酸）：2.67 g溶于28 mL DMF中
Val（缬氨酸）：0.75 g溶于11 mL DMF中；
树脂（载量为0.6 mmol/g）：0.417 g；
活化剂：二异丙基碳二亚胺（DIC）：19 mL；
活化碱： 17-(Acetyloxy)-3-Methoxy-20-oxo-pregna-3,5-diene-6-carboxaldehyde（Oxyma，CAS No.：57361-81-6）10 mL；
盖帽剂：乙酸酐：2 mL；8mL DMF（20%乙酸酐/DMF）；
裂解剂：三氟乙酸（TFA）：23.5 mL；三异丙基硅烷（TIS）： 0.25 mL；H2O：0.625 mL；1,2-乙二硫醇（EDT）0.625 mL；
脱保护液：哌啶：53 mL；DMF：212 mL(20%哌啶/DMF)。
步骤3、多肽的固相合成、纯化
将步骤2中的准备好的药品加入到微波固相合成仪指定容器内，开始从C端到N端合成Ac-LVVLKKK(pY)-NH2，仪器自动合成。多肽合成完毕后，将产品管内的产品倒入圆底烧瓶中，加入裂解剂，室温搅拌4 h，真空抽滤后收集滤液，TFA洗涤树脂3次，合并滤液和洗涤液，将其倒入蒸馏瓶中蒸馏(除去残存的TFA)，蒸馏后的产品倒入10 mL 离心管中，加入冷乙醚，离心15 min，转速为8000 rpm/min，重复10次以上，制备型反相高效液相纯化，最后将产品放入高压冻干机内冻干，冻干后放入冰箱内保存。本发明合成的多肽的纯度为95%。如图1、图2所示。
实施例2：Ac-LVVLKKK(pY)-NH2载药载体的制备
称量0.59 mg肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2，加入Hepes缓冲液（pH7.4）1 mL，获得浓度为0.5 mmol/L的肽溶液，超声10 min，室温静置24 h后，透射电子显微镜（TEM）观测结果显示，此时已自组装形成球状纳米粒结构，同时存在部分纳米纤维（图3）。
实施例3：Ac-LVVLKKK(pY)-NH2载药载体包载DOX之后自组装形貌的改变
具体检测方法如下：
在Hepes缓冲液中的载药肽加入DOX之后自组装形貌的检测（TEM）：
配制浓度分别为0.1 mmol/L 、0.5 mmol/L、1 mmol/L的Ac-LVVLKKK(pY)-NH2肽溶液各1 mL，并分别加入0.02 mL的DOX，使DOX终浓度为0.12 mg/mL。超声10 min，室温放置24h，使用TEM观测。结果显示，Ac-LVVLKKK(pY)-NH2肽溶液，在加入DOX后，纳米纤维结构消失，最终自组装成为包载药物的球状纳米粒，如图4、图5、图6所示。
实施例4：载药肽纳米粒在加入ALP酶后自组装形貌的改变
取浓度为0.5 mmol/L的Ac-LVVLKKK(pY)-NH2的载药肽溶液3 mL，平均分为3份，分别加入0.005 mL、0.025 mL、0.050 mL的ALP酶溶液，使加入ALP酶的终浓度分别为0.5 U/mL、2.5 U/mL 、5 U/mL，充分混匀，在37 ℃下孵育24 h后，使用TEM观测。结果显示，包载DOX的肽纳米粒，在ALP酶的诱导下，载药肽发生形变，由球状纳米粒转变成纳米纤维结构，结果如图7、图8、图9所示。
实施例5：小分子肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2在包载DOX前后Zeta电位变化
具体实施方法如下：
配置浓度为0.5 mmol/L的Ac-LVVLKKK(pY)-NH2肽溶液1.5 mL，为样品1，常温放置24 h；配置浓度为0.5 mmol/L的Ac-LVVLKKK(pY)-NH2肽溶液1.5 mL，加入肽质量1/5的DOX，超声30 min后放置24 h，为样品2。处理完毕后分别测量Zeta电位。包载脂溶性模型药物DOX后，载药肽纳米粒的Zeta电位增大，易于吸附到的肿瘤细胞的细胞膜，有利于增强药物的细胞摄入，如图10、图11。
实施例6：使用高效液相（HPLC）考察ALP酶诱导肽自组装形变的机理。
具体实施方法如下：
样品1配置浓度为0.5 mmol/L的Ac-LVVLKKK(pY)-NH2肽溶液1.5 mL，常温放置24h；样品2配置浓度为0.5 mmol/L的Ac-LVVLKKK(pY)-NH2肽溶液1.5 mL，放置24h后，加入终浓度为1.5 U/mL的碱性磷酸酶0.023 mL，放置于37℃ 6 h。样品进样前使用0.22 μm的滤头过滤。可观测到肽载体在加入ALP酶后，随着洗脱时间的增长，在底物峰右侧出现新的产物峰。说明此时在ALP酶诱导下，部分肽分子中磷酸化的酪氨酸（pY）去磷酸化，生成的产物肽疏水性增强（图2、图12），一级结构改变，诱导肽自组装形貌发生改变。
实施例7：包埋DOX的多肽载药载体的药物释放曲线
具体实施方法如下：
通过透析法测量Ac-LVVLKKK(pY)-NH2包封DOX的体外药物释放。将浓度为0.5mmol/L的肽溶液3 mL，加入肽质量1/5的DOX，超声30 min后，放置24 h。按体积平均分为两组后，向其中1组加入终浓度为1.5 U/mL的碱性磷酸酶0.023 mL，分别转移到透析袋（MWCO1000Da）中。通过紫外-可见分光光度计考察载药肽在加入和不加入ALP的条件下，载药肽的药物释放行为。将透析袋浸入25 mL Hepes溶液中。分别在0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、14、18、24、28、32 h，取出样品的透析液，并在每次取样后加入相同体积新鲜的Hepes溶液。通过紫外-可见分光光度计测量样品在480 nm处的吸光度，并计算累积释放的DOX的量。计算公式如下：DOX累积释放量(%)=(Ct / C all)×100%。其中Ct为t时刻纳米粒子释放DOX的总量，Call为自组装肽中负载DOX的量。结果如图13所示。
序列表
<110> 潍坊医学院
<120> 一种小分子肽及其作为纳米载药载体的制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 多肽
<400> 1
Leu Val Val Leu Lys Lys Lys Tyr
1 5

Claims (8)

1.一种小分子肽，其特征在于，结构式为Ac-LVVLKKK(pY)-NH2，可作为纳米载药载体，具有磷酸酶响应性，其中，pY为磷酸化的酪氨酸基团。
2.一种小分子肽在制备纳米载药载体中的应用，其特征在于，所述小分子肽为权利要求1所述的可制备为纳米载药载体的磷酸酶响应性小分子肽，所述小分子肽在Hepes溶液中自组装形成球状纳米粒，用以包载水溶性差的抗肿瘤药物，所述水溶性差的抗肿瘤药物为脂溶性药物。
3.一种多肽纳米载药载体，其特征在于，所述多肽纳米载药载体包含权利要求1所述的可作为纳米载药载体的磷酸酶响应性小分子肽。
4.根据权利要求3所述的多肽纳米载药载体，其特征在于，所述多肽纳米载药载体响应于肿瘤微环境中过表达的碱性磷酸酶，自组装形貌转变为纳米纤维释药，并延长肿瘤细胞内药物滞留时间；所述碱性磷酸酶的浓度为0.5~5 U/mL。
5.一种多肽纳米载药载体的制备方法，其特征在于，用于制备权利要求3所述的多肽纳米载药载体，该方法包括如下步骤：将Ac-LVVLKKK(pY)-NH2加入到Hepes溶液中，多肽自组装形成载药球状纳米粒。
6.根据权利要求5所述的多肽纳米载药载体的制备方法，其特征在于：所述Hepes溶液的pH为7.4，Ac-LVVLKKK(pY)-NH2的浓度为0.1~1mmol/L。
7.根据权利要求6所述的多肽纳米载药载体的制备方法，其特征在于，所述Ac-LVVLKKK(pY)-NH2的浓度为0.5mmol/L。
8.根据权利要求5所述的多肽纳米载药载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：称量0.59 mg浓度为0.5 mmol/L的肽Ac-LVVLKKK(pY)-NH2，加入pH7.4的Hepes缓冲液1 mL，超声10 min，室温静置24 h后，得多肽纳米载药载体。
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