JP6214530B2 - 転写活性化因子様エフェクターの組立て方法 - Google Patents
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Description
本出願は2011年7月15日に出願された米国特許仮出願第61/508,366号、および2012年2月21日に出願された第61/601,409号、および2012年3月13日に出願された第61/610,212号の利益を主張し、上述した各出願の全内容を参照により本明細書に組み込む。
この発明は、米国国立衛生研究所によって裁定された補助金番号DP1 OD006862のもとに政府援助で行われた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
本出願は、EFS−Webを通してASCII形式で提出された配列表を含み、その全体を参照により本明細書に組み込む。2012年7月11日に作成された前記ASCIIコピーは、2953936W.txtと命名され、サイズは459,673バイトである。
キサントモナス属の植物病原性細菌のTALエフェクターは、宿主DNAに結合し、エフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、病害において重要な役割を果たす、または防御を誘発する。特異性は、エフェクター(様々な数の不完全な、通常約33〜35アミノ酸のリピート)に依存する。主にリピートの12位および13位に多形が存在し、本明細書において「リピート可変二残基(diresidue)」(RVD)と称する。TALエフェクターのRVDは、直接的に、線型様式で、1つのヌクレオチドに対して1つのRVDで、多少の縮重を伴い、明らかな前後配列の依存性無しにその標的部位中のヌクレオチドに対応する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド特異性を付与する多形領域は、三残基(triresidue)またはトリプレットとして発現されてよく、例えば、残基11、12および13を包含する。
TALEリピートドメインアレイを組み立てる本明細書に記載の方法の例は、図1に示されており、(1)固体支持体への付着に適したリンカーを有する、単一のN末端TALEリピートドメイン(1マー)をコードしている単一のビオチン化PCR産物を用意するステップと(ここで示す例では、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用するが、他の固体支持体およびその固体支持体に最初のDNA断片を係留する他の方法も利用可能である);(2)(例えば、IIS型制限酵素を使用して)1マーDNAの3’末端に突出を作成するステップと;(3)4個のTALEリピートドメイン(すなわち、予め組み立てられた4マー)を含有する第2の断片をライゲーションして、5マーを形成するステップと;(4)固体支持体へ5マーを付着させるステップと;(5)追加的な予め組み立てられたTALEリピートドメイン(例えば、望ましい最終的なアレイ長に応じて1、2、3または4個のTALEリピートドメインをコードしているDNAの断片(複数可))をライゲーションして、長いアレイを形成するステップと、(6)(例えば、最初のビオチン化DNA産物の5’末端に部位が組み込まれているIIS型制限酵素を使用することにより)TALEリピートをコードしている伸長したDNAを固体支持体から遊離させるステップとを含む。次いで、最終的な断片は、適切な発現プラスミドにライゲーションするように調製できる。
本明細書に開示されている本方法は、手作業で実施することができ、または本明細書に記載の新規な方法にしたがってプログラムされている適合するソフトウェアパッケージ(例えば、Maestro(商標)液体処理ソフトウェア)もしくは本明細書に記載の特定の方法ステップを実施するために設計され実行される新規なソフトウェアパッケージによって制御される実験室自動化ハードウェア(例えば、SciClone G3 Liquid Handling Workstation、Caliper Life Sciences、Hopkinton、MA)により実行することができる。実験室自動化ハードウェアによって実施されるとき、本方法は、本明細書に記載の方法ステップにしたがった標準的なプログラミング技法を使用するコンピュータプログラムによって実行できる。
本発明の改変タンパク質を使用するには、通常、改変タンパク質をコードする核酸からそれを発現させる必要がある。これは、様々な方法で実施できる。例えば、通常、改変TALEリピートタンパク質をコードしている核酸を原核生物もしくは真核生物細胞への形質転換用中間ベクターにクローニングして、複製および/または発現させる。改変TALEタンパク質をコードしている核酸を格納もしくは操作するまたはタンパク質を産生させるための中間ベクターは、通常、原核生物ベクター、例えばプラスミドもしくはシャトルベクターまたは昆虫ベクターである。改変TALEリピートタンパク質をコードしている核酸も、通常、発現ベクターにクローニングされて、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞に施与される。
本発明の方法を使用して設計した改変TALEリピートアレイタンパク質をさらに特徴づけて、選択した用途にとって望ましい特徴を有することを確認できる。例えば、TALEリピートアレイタンパク質は、細菌2ハイブリッド、細菌プロモーター抑制、ファージディスプレイもしくはリボゾームディスプレイシステムを使用してまたは電気泳動移動度シフトアッセイもしくは「EMSA」を使用してアッセイすることができる(Buratowski & Chodosh、Current Protocols in Molecular Biology 12.2.1-12.2.7ページ)。同様に、当技術分野において公知の他の任意のDNA結合アッセイを使用して、選択したタンパク質のDNA結合特性を検証することができる。
多くの場合、専用設計のTALEリピートアレイDNA結合ドメインを作製する目的は、ある機能を実施するのに使用可能なTALEリピートアレイタンパク質を得ることにある。TALEリピートアレイDNA結合ドメインを単独で使用して、例えば遺伝子上の特異的部位に結合させて、それにより他のDNA結合ドメインの結合を遮断することができる。しかし、いくつかの実施形態において、TALEリピートアレイタンパク質は、TALEリピートアレイDNA結合ドメインおよびいくつかの望ましい特異的機能(例えば、遺伝子活性化)または酵素活性を有する追加的なドメイン、すなわち、「機能的ドメイン」を含有するキメラTALEタンパク質の構築に使用される。
様々なアッセイを使用して、改変TALEリピートタンパク質による遺伝子発現調節のレベルを決定できる、例えば米国特許第6,453,242号を参照のこと。個々の改変TALEリピートタンパク質の活性は、様々なin vitroおよびin vivoアッセイを使用して、例えば、免疫測定法(例えば、抗体を用いるELISAおよび免疫組織化学的アッセイ)、ハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、RNaseプロテクション、ノーザン、in situハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドアレイ実験)、比色アッセイ、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、腫瘍成長アッセイ、表現型アッセイ、などを使用して、例えば、タンパク質もしくはmRNAレベル、産物レベル、酵素活性、腫瘍成長;レポーター遺伝子の転写活性化もしくは抑制;二次メッセンジャーレベル(例えば、cGMP、cAMP、IP3、DAG、Ca2+);サイトカインおよびホルモン産生レベル;ならびに血管新生を測定することにより、評価できる。
同様に、遺伝子治療適用において、本発明の改変タンパク質を使用して、遺伝子発現を調節するまたは遺伝子配列を変更することができる。類似の方法が、合成ジンクフィンガータンパク質について記載されている、例えば米国特許第6,511,808号、米国特許第6,013,453号、米国特許第6,007,988号、米国特許第6,503,717号、米国特許出願第2002/0164575号および米国特許出願第2002/0160940号を参照のこと。
本発明の改変TALEリピートアレイタンパク質などのポリペプチド化合物を投与するのに重要な因子は、ポリペプチドが、細胞の原形質膜または核などの細胞内区画の膜を横断できるということを確認することである。細胞膜は脂質−タンパク質二重層から構成され、小さい、非イオン性親油性化合物を自由に透過させるが、極性化合物、高分子および治療的または診断用薬剤を本質的に透過しない。しかし、改変TALEリピートアレイタンパク質などのポリペプチドを、細胞膜を通って移行させる能力を有する、タンパク質およびリポソームなど他の化合物が記載されている。
治療適用の場合、ジンクフィンガータンパク質について記載されたのと類似の方法で、患者に投与すべき改変TALEリピートアレイタンパク質の用量が算出される、例えば米国特許第6,511,808号、米国特許第6,492,117号、米国特許第6,453,242号、米国特許出願第2002/0164575号および米国特許出願第2002/0160940号を参照のこと。本開示において、用量は、患者において経時的に有益な治療応答をもたらすのに十分であるべきである。加えて、特定の用量計画は、実験設定における(例えば、機能的ゲノム学研究、および細胞または動物モデルにおける)表現型変化を決定するのに有用な場合がある。用量は、利用される特定の改変TALEリピートアレイタンパク質の有効性、特異性およびKD、標的細胞の核容積および患者の状態、ならびに治療される患者の体重または表面積によって決定されることになる。特定の患者への特定の化合物またはベクターの投与に付随する任意の有害副作用の存在、性質および程度によっても、用量サイズは決定されることになる。
本発明の改変TALEリピートアレイタンパク質を投与するのに適切な医薬組成物は、ジンクフィンガータンパク質について記載されたように決定できる、例えば米国特許第6,511,808号、米国特許第6,492,117号、米国特許第6,453,242号、米国特許出願第2002/0164575号および米国特許出願第2002/0160940号を参照のこと。遺伝子発現の変調のためおよび治療または予防適用(例えば、癌、虚血、糖尿病性網膜症、黄斑変性、慢性関節リウマチ、乾癬、HIV感染、鎌状赤血球性貧血、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、神経変性疾患、血管系疾患、嚢胞性線維症、脳卒中など)のために、改変TALEリピートアレイタンパク質、および改変TALEリピートアレイタンパク質をコードしている発現ベクターを患者に直接投与することができる。TALEリピートアレイタンパク質に媒介される遺伝子治療によって阻害できる微生物の例には、病原性細菌、例えば、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌およびコノコッキ(conococci)、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス菌中毒、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症およびライム病細菌;感染性真菌、例えば、アスペルギルス属、カンジダ属;胞子虫(例えば、マラリア原虫)、根足虫(例えば、エントアメーバ属)および鞭毛虫(トリパノソーマ属、リーシュマニア属、トリコモナス属、ジアルジア属など)などの原生動物;ウイルス性疾患、例えば、肝炎(A、BまたはC)、ヘルペスウイルス(例えば、VZV、HSV−1、HSV−6、HSV−II、CMVおよびEBV)、HIV、エボラ、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コモウイルス、RSウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ロータウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、牛痘ウイルス、HTLVウイルス、デング熱ウイルス、乳頭腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスなどがある。
例えば、2つの部位で切断しその間の配列を欠失させることによって、単一部位での切断とそれに続く非相同な末端の結合によって、および/またはある部位で切断して1もしくは2または数ヌクレオチドを取り除くまたは置きかえることによって、本明細書に記載の方法を使用して改変されたTALEヌクレアーゼを使用してゲノム配列に変異を誘導できる。いくつかの実施形態において、TALEヌクレアーゼを使用して、動物、植物、菌類または細菌ゲノムに変異を誘導する。標的した切断を使用して、(例えば、機能的ゲノム学または標的検証のために)遺伝子ノックアウトを形成することも、(例えば、細胞工学またはタンパク質過剰発現のために)標的化したゲノムへの配列挿入(すなわち、遺伝子ノックイン)を促進することもできる。挿入は、相同組換えによる染色体配列の置きかえによって、または標的した組み込みによって可能であり、染色体中の対象領域と相同な配列に隣接している新規な配列(すなわち、対象領域に存在しない配列)を使用して、相同組換えにより予め定められた目的部位に新規な配列を挿入する。外生的なDNAも、隣接する相同性配列を必要とせずにTALEヌクレアーゼ誘導二本鎖切断部に挿入できる(Orlandoら、2010、Nucl. Acids Res.、1-15、doi:10.1093/nar/gkq512参照のこと)。
改変TALEリピートアレイタンパク質を使用して、例えば耐病性の増大、構造的多糖、貯蔵多糖、風味、タンパク質ならびに脂肪酸の修飾、果実の成熟、収量、色、栄養学的特徴、保存能力の改善などの形質について植物を加工できる。特に、油の産生の強化(例えば、脂肪種子において産生される脂肪酸の修飾)に対する作物種の加工は対象のものである。
改変TALEリピートアレイタンパク質には、表現型の結果および遺伝子発現の機能を決定するためのアッセイ用途もある。集中的な大量配列決定の取り組みと一体化した最近の分析技術の進歩により、これまで利用可能であった分子標的よりはるかに多くの標的を同定し、特徴づける機会が形成された。遺伝子およびその機能に関するこの新たな情報は、基本的な生物学的理解を向上させ、治療的介入用として多くの新規標的を提示することになる。いくつかの場合において、分析ツールが新たなデータの生成に対応できていない。一例は、包括的な差次的遺伝子発現の測定における最近の進歩によって提供される。遺伝子発現マイクロアレイ、差次的cDNAクローニング頻度、サブトラクティブハイブリダイゼーションおよびディファレンシャルディスプレイ法に代表されるこれらの方法は、異なる組織においてまたは特定の刺激に応答して上方もしくは下方制御される遺伝子を非常に迅速に同定することができる。そのような方法は、例えば、形質転換、腫瘍進行、炎症反応、神経障害などの生物学的プロセスを調査するためにますます使用されている。差次的に発現している遺伝子の多くは、所与の生理現象と相関するが、差次的に発現している個々の遺伝子と現象との間の原因となる関係を実証することは、労働集約的である。今日まで、差次的に発現している遺伝子に対して機能を決定する簡易な方法は、差動的な遺伝子発現を観察する能力に対応できていない。
改変TALEリピートアレイタンパク質のさらなる用途は、動物モデルにおいて遺伝子発現を操作することである。細胞系と同様に、トランスジェニックマウスまたはゼブラフィッシュなどのトランスジェニック動物への異種遺伝子の導入またはそれらにおける内在性遺伝子のノックアウトは、かなり直接的な方法である。したがって、動物における改変TALEリピートアレイタンパク質のトランスジェニックなまたは一過性の発現は、容易に実施できる。
[実施例]
1、2、3または4個のTALEリピートドメインをコードしているDNAプラスミドのアーカイブ(約850個の異なるプラスミド)を形成して、任意の望ましい長さの複数のTALEアレイをコードする核酸を組み立てた。1、2、3または4個のTALEリピートドメインを含む合成アレイをpUC57−ΔBsaI主鎖にクローニングすることによって、プラスミドを形成した(図3)。TALEリピートは、α、βγδε、βγδ、βγ’、βγ、δε’およびβの配置のものであり、表1に示したヌクレオチドに結合するための超可変トリプレット残基を各位置に含んだ。TALEリピート型のポリペプチドおよびヌクレオチド配列は、それぞれ図4Aおよび図4Bに示される。長い正確なリピート配列による組換え媒介変異の可能性を減らすために、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列を4つの型の中で少し変化させた。
実施例1で説明した通り、TALEリピートは、DNAプラスミド(約850個の異なるプラスミド)のアーカイブを使用して組み立てられる。標的配列に結合するように設計された16個のTALEリピートをin vitroで組み立てることによって、16マーTALEリピートアレイを形成した。最初のステップにおいて、NNNトリプレット(G)を含むα−型TALEリピートを保有するプラスミドを、ビオチン化フォワードプライマー ビオチン−TCTAGAGAAGACAAGAACCTGACC(配列番号42)とリバースプライマーGGATCCGGTCTCTTAAGGCCGTGG(配列番号43)とを使用するPCRによって増幅した。QIA Quick PCR精製キット(QIAGEN)を使用して増幅した断片(50μl)を精製し、0.1×溶出緩衝液(QIA Quick PCR精製キットに提供される)40μlに溶出し、NEB Buffer4中でBsaI HF(New England Biolabs(NEB))を用いて、50℃で15分間消化した(溶出液40μl、NEBuffer4 5μl、BsaI HF 5μl)。QIA Quick PCR精製キットを使用して消化した断片を精製し、0.1×溶出緩衝液(50μl)に溶出した。
本明細書に記載の方法によって形成されるTALEリピートドメインの有効性を実証するために、(実施例1で説明した通り)TALEリピートアレイを構築し、TALEヌクレアーゼ発現ベクターにクローニングして、図6および表3に示されるeGFPコード配列に標的にされたTALEヌクレアーゼモノマーをコードしているプラスミドを産生した。TALEヌクレアーゼモノマーの核酸およびポリペプチド配列は、図11A〜18Bに示される。
実施例1に記載の組立て方法が自動化されて、Sciclone(商標)G3液体処理ワークステーション(Caliper Life Sciences、Hopkinton、MA)を96ウェルプレートで使用して実施された。ライゲーションおよびビーズに連結する前の核酸の消化ならびに組み立てられたTALEリピートアレイを磁気ビーズから遊離させた後のステップを除いて、全てのステップが自動化された。再懸濁および混合動作の回数を僅かに変形して手作業で行う場合、自動化されたステップを基本的に実施した。2つの17マーの組立ての結果が、図9に示される。予想されるサイズ(17マーに相当する)の主要な産物が見られる。不完全にライゲーションした産物の持ち越しによって産生したと思われる、少量の余分な13マー、9マーおよび5マー産物も見られる。類似の結果が図10に見られ、N末端1マーサブアレイからの16マー(1)、3つの4マーサブアレイ(4A、4B、4C)、およびC末端3マーサブアレイ(3D)の組立ての結果を示している。
アミノ酸およびDNA配列が少し異なる4つの別個のTALEリピート主鎖が反復様式で存在する構造を使用して、TALEリピートアレイを形成した。アレイ中の最初のアミノ末端TALEリピートを、αユニットと指定した。これの後に、β、γおよびδユニットが続き、次いで5’末端のIIS型制限部位(クローニングに必要な、αユニット上の固有の突出を作成可能にするために必要である)の位置が異なることを除いてαユニットと基本的に同一であるεユニットが続いた。次いで、εユニットの後に、さらにまたβ、γ、δおよびεユニットのリピートが続いた。クローニングに必要な3’末端の作成に関連する制約により、少し修飾したDNA配列が、カルボキシ末端γまたはεユニットで終わるTALEリピートアレイに必要とされた。これらのバリアントユニットを、γ*およびε*と指定した。
ヒト細胞において、ゲノム編集に対するTALENsの強力さを大規模試験するために、実施例5に記載の方法を使用して、EGFPレポーター遺伝子の全体に点在する異なる部位に標的にされた48個のTALEN対をコードしている一連のプラスミドを構築した。TALEN対の各モノマーは、同数のリピート(8.5〜19.5個の範囲)を含有し、これらの対は、各TALENモノマーによって結合される「半部位」の間に固定長の「スペーサー」配列(16bp)を保有する部位に標的にされた(表6)。
1.半部位の最初のヌクレオチドのちょうど5’のヌクレオチドは、チミンであるべきである。
2.半部位の最初のヌクレオチドは、チミンであるべきでない。
3.半部位の2番目のヌクレオチドは、アデノシンであるべきでない。
4.標的半部位の最も3’のヌクレオチドは、チミンであるべきである。
5.標的半部位内の各ヌクレオチドの組成は、天然に存在する結合部位で観察されるパーセンテージ組成と、標準偏差の2倍を超えて異なるべきでない。天然に存在する全てのTALE結合部位のパーセンテージ組成は:A=31±16%、C=37±13%、G=9±8%、T=22±10%である。したがって、潜在的TALE結合部位のヌクレオチド組成は:A=0%〜63%、C=11%〜63%、G=0%〜25%およびT=2%〜42%であるべきである。
染色体的に組み込まれたレポーター遺伝子を用いてTALENプラットフォームの強さを確立し、次に、この高い成功率がヒト細胞中の内在性遺伝子でも観察できるかどうかを決定した。これを試験するために、実施例5に記載の組立て法を使用して、96個の異なるヒト遺伝子へと標的にされるTALEN対を改変した:78個の遺伝子はヒト癌に関係し(VogelsteinおよびKinzler、2004、Nat. Med.、10:789-799)、18個の遺伝子は遺伝子発現のエピジェネティックな調節に関与する(表7)。各遺伝子について、タンパク質コード配列のアミノ末端近くで切断するようにTALEN対を設計した。但しいくつかの場合、反復の配列の存在により、隣接する下流のエキソンまたはイントロン中の別の部位が標的された(表7)。EGFP TALENsを用いた結果から、16、17、18、19または21bpのスペーサー配列を持つ部位を切断する、14.5、15.5または16.5個のリピートからなるTALENsを構築した。標的部位の全ては、各半部位の5’末端にTを有した。
(1)書式で提示される情報を含むヘッダ:遺伝子標的_左または右モノマー_5’→3’に示される標的DNA部位_TALEリピートモノマー、および表4に示されるコードで使用される0.5リピートプラスミド。
(2)NheI部位からBamHI部位の間にある、活性に必要なTALEのN末端部分、TALEリピートアレイ、C末端0.5TALEリピートドメイン、および活性に必要なC末端の63個のアミノ酸、をコードしているDNA配列。この配列は、以下に示すプラスミド「ベクター配列」中に存在し、NheIおよびBamHI部位に隣接する下線を引いたXに取って代わる、
(3)翻訳開始点(NheI部位の少しだけ3’側に位置し、N末端FLAGエピトープタグを含む)から、(TALEリピートアレイからFokI切断ドメインまでのリンカーとして機能する)Gly−Ser配列(BamHI部位によってコードされる)までの間に示される、活性に必要なTALEのN末端部分、TALEリピートアレイ、C末端0.5TALEリピートドメイン、および活性に必要なC末端の63個のアミノ酸のアミノ酸配列。
本発明のいくつかの実施形態について記載してきた。しかし、本発明の精神と範囲から逸脱することなく様々な修正を作製できることは理解されよう。したがって、他の実施形態は、以下の請求項の範囲にある。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
[1]
(a)1個もしくは複数の転写活性化因子様エフェクター(TALE)リピートドメインおよび/または1個もしくは複数のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分を含む第1の組をコードしている配列を含む第1の核酸を用意するステップと;
(b)第1の核酸を第1の酵素と接触させ、第1の酵素が第1のライゲーション可能な末端を形成するステップと;
(c)1個もしくは複数のTALEリピートドメインおよび/または1個もしくは複数のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分を含む第2の組をコードしている配列を含む第2の核酸を用意するステップと;
(d)第2の核酸を第2の酵素と接触させ、第2の酵素が第2のライゲーション可能な末端を形成し、第1および第2のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと;
(e)第1および第2のライゲーション可能な末端を介して第1の核酸と第2の核酸とをライゲーションして第1のライゲーションされた核酸を作製し、第1のライゲーションされた核酸が固体支持体に連結され、第1のライゲーションされた核酸が前記第1および第2の組を含むポリペプチドをコードするステップとを含む方法。
[2]
第1の組が、ポリペプチド中で第2の組に対してN末端側にある、上記[1]に記載の方法。
[3]
第2の組が、ポリペプチド中で第1の組に対してN末端側にある、上記[1]に記載の方法。
[4]
第1および第2の酵素が第1および第2の制限エンドヌクレアーゼであり、第1の制限エンドヌクレアーゼが第1の核酸中の部位で切断して第1の切断末端を形成し、第2の制限エンドヌクレアーゼが第2の核酸中の部位で切断して第2の切断末端を形成し、第1および第2のライゲーション可能な末端が第1および第2の切断末端である、上記[1]に記載の方法。
[5]
第1のライゲーションされた核酸が、第1の制限エンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含まない、上記[4]に記載の方法。
[6]
(f)第1のライゲーションされた核酸を第3の酵素と接触させ、第3の酵素が第3のライゲーション可能な末端を形成するステップと;
(g)1個もしくは複数のTALEリピートドメインおよび/または1個もしくは複数のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分を含む第3の組をコードしている配列を含む第3の核酸を用意するステップと;
(h)第3の核酸を第4の酵素と接触させ、第4の酵素が第4のライゲーション可能な末端を形成し、第3および第4のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと;
(i)第3および第4のライゲーション可能な末端を介して第1のライゲーションされた核酸と第3の核酸とをライゲーションして、固体支持体に連結された第2のライゲーションされた核酸を作製し、第2のライゲーションされた核酸が前記第1、第2および第3の組を含むポリペプチドをコードするステップと
をさらに含む、上記[1]または[4]に記載の方法。
[7]
第3および第4の酵素が、第3および第4の制限エンドヌクレアーゼであり、第3の制限エンドヌクレアーゼが第1のライゲーションされた核酸中の部位で切断して第3の切断末端を形成し、第4の制限エンドヌクレアーゼが第3の核酸中の部位で切断して第4の切断末端を形成し、第3および第4のライゲーション可能な末端が第3および第4の切断末端である、上記[6]に記載の方法。
[8]
ライゲーションされた核酸が、第1のエンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含まず、第1および第3の制限エンドヌクレアーゼが同一である、上記[7]に記載の方法。
[9]
第2および第4の制限エンドヌクレアーゼが同一である、上記[7]または[8]に記載の方法。
[10]
(j)第2のライゲーションされた核酸を第5の酵素と接触させ、第5の酵素が第5のライゲーション可能な末端を形成するステップと;
(k)1個もしくは複数のTALEリピートドメインおよび/または1個もしくは複数のTALEリピートドメインのうち1個もしくは複数の部分を含む第4の組をコードしている配列を含む第4の核酸を用意するステップと;
(l)第4の核酸を第6の酵素と接触させ、第6の酵素が第6のライゲーション可能な末端を形成し、第5および第6のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと;
(m)第5および第6のライゲーション可能な末端を介して第2のライゲーションされた核酸と第4の核酸とをライゲーションして、固体支持体に連結された第3のライゲーションされた核酸を作製し、第3のライゲーションされた核酸が前記第1、第2、第3および第4の組を含むポリペプチドをコードするステップと
をさらに含む、上記[6]または[7]に記載の方法。
[11]
第5および第6の酵素が第5および第6の制限エンドヌクレアーゼであり、第5の制限エンドヌクレアーゼが第2のライゲーションされた核酸中の部位で切断して第5の切断末端を形成し、第6の制限エンドヌクレアーゼが第4の核酸中の部位で切断して第6の切断末端を形成し、第5および第6のライゲーション可能な末端が第5および第6の切断末端である、上記[10]に記載の方法。
[12]
第2のライゲーションされた核酸が、第1のエンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含まず、第1、第3および第5の制限エンドヌクレアーゼが同一である、上記[11]に記載の方法。
[13]
第2、第4および第6の制限エンドヌクレアーゼが同一である、上記[11]または[12]に記載の方法。
[14]
第2の組が、1〜4個のTALEリピートドメインを含む、上記[1]に記載の方法。
[15]
第1および第2のライゲーション可能な末端がそれぞれ、1〜10ヌクレオチドの突出を含む、上記[1]から[14]のいずれか一項に記載の方法。
[16]
第1の酵素がIIS型制限エンドヌクレアーゼである、上記[1]から[14]のいずれかに記載の方法。
[17]
第1のライゲーションされた核酸を前記固体支持体から分離し、第1のライゲーションされた核酸をベクターに挿入することをさらに含む、上記[1]から[5]のいずれか一項に記載の方法。
[18]
第2のライゲーションされた核酸を固体支持体から分離し、第2のライゲーションされた核酸をベクターに挿入することをさらに含む、上記[6]から[9]のいずれか一項に記載の方法。
[19]
第3のライゲーションされた核酸を固体支持体から分離し、第3のライゲーションされた核酸をベクターに挿入することをさらに含む、上記[10]から[13]のいずれか一項に記載の方法。
[20]
ベクターが発現ベクターである、上記[17]から[19]のいずれか一項に記載の方法。
[21]
発現ベクターが、エフェクタードメインをコードしている配列を含み、ベクターがポリペプチドとエフェクタードメインとの融合タンパク質をコードしている配列を含むように第1、第2または第3のライゲーションした核酸がベクターに挿入される、上記[20]に記載の方法。
[22]
エフェクタードメインがヌクレアーゼドメインである、上記[21]に記載の方法。
[23]
細胞に発現ベクターを挿入することをさらに含む、上記[20]から[22]のいずれか一項に記載の方法。
[24]
ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現させることをさらに含む、上記[23]に記載の方法。
[25]
ポリペプチドまたは融合タンパク質を精製することをさらに含む、上記[24]に記載の方法。
[26]
表7に開示されている標的ヌクレオチド配列に結合する転写活性化因子様エフェクター(TALE)ドメインを含むポリペプチド。
[27]
標的ヌクレオチド配列が半部位である、上記[26]に記載のポリペプチド。
[28]
ヌクレアーゼドメインを含む、上記[26]に記載のポリペプチド。
[29]
実施例7に開示されているアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[30]
上記[26]から[29]のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
[31]
上記[30]に記載の核酸を含むベクター。
[32]
上記[30]に記載の核酸または上記[31]に記載のベクターを含む細胞。
[33]
1、2、3および4個のTALEリピートドメインまたはその部分をコードしている配列を含む核酸のライブラリ。
Claims (26)
- (a)配列番号58〜62からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む第1の核酸を用意するステップと;
(b)第1の核酸を第1の酵素と接触させ、第1の酵素が第1のライゲーション可能な末端を形成するステップと;
(c)βユニット、γユニット、δユニットおよびεユニットを含む第2の核酸を用意するステップであって、ここで、βユニットは、配列番号63〜67からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、γユニットは、配列番号68〜72からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、δユニットは、配列番号73〜77からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、εユニットは、配列番号78〜82からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、ステップと;
(d)第2の核酸を第2の酵素と接触させ、第2の酵素が第2のライゲーション可能な末端を形成し、第1および第2のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと;
(e)第1および第2のライゲーション可能な末端を介して第1の核酸と第2の核酸とをライゲーションして第1のライゲーションされた核酸を作製し、第1のライゲーションされた核酸が固体支持体に連結される、ステップと、
を含む方法。 - 第1および第2の酵素が第1および第2の制限エンドヌクレアーゼであり、第1の制限エンドヌクレアーゼが第1の核酸中の部位で切断して第1の切断末端を形成し、第2の制限エンドヌクレアーゼが第2の核酸中の部位で切断して第2の切断末端を形成し、第1および第2のライゲーション可能な末端が第1および第2の切断末端である、請求項1に記載の方法。
- 第1のライゲーションされた核酸が、第1の制限エンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含まない、請求項2に記載の方法。
- (f)第1のライゲーションされた核酸を第3の酵素と接触させ、第3の酵素が第3のライゲーション可能な末端を形成するステップと;
(g)βユニット、γユニット、δユニットおよびεユニットを含む第3の核酸を用意するステップであって、ここで、βユニットは、配列番号63〜67からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、γユニットは、配列番号68〜72からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、δユニットは、配列番号73〜77からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、εユニットは、配列番号78〜82からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、ステップと;
(h)第3の核酸を第4の酵素と接触させ、第4の酵素が第4のライゲーション可能な末端を形成し、第3および第4のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと;
(i)第3および第4のライゲーション可能な末端を介して第1のライゲーションされた核酸と第3の核酸とをライゲーションして、固体支持体に連結された第2のライゲーションされた核酸を作製するステップと
(j)任意選択で、ステップ(f)〜(i)を繰り返すステップであって、ステップ(i)において作製される第2のライゲーションされた核酸は、繰り返す方法の間、ステップ(f)において第1の核酸として処理される、ステップと、
をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。 - 第3および第4の酵素が、第3および第4の制限エンドヌクレアーゼであり、第3の制限エンドヌクレアーゼが第1のライゲーションされた核酸中の部位で切断して第3の切断末端を形成し、第4の制限エンドヌクレアーゼが第3の核酸中の部位で切断して第4の切断末端を形成し、第3および第4のライゲーション可能な末端が第3および第4の切断末端である、請求項4に記載の方法。
- ライゲーションされた核酸が、第1のエンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含まず、第1および第3の制限エンドヌクレアーゼが同一である、請求項5に記載の方法。
- 第2および第4の制限エンドヌクレアーゼが同一である、請求項5または6に記載の方法。
- (k)第2のライゲーションされた核酸を第5の酵素と接触させ、第5の酵素が第5の
ライゲーション可能な末端を形成するステップと;
(l)第4の核酸を用意するステップであって、第4の核酸は、以下の核酸:
i.βユニットを含む核酸、
ii.βユニットおよびγ’ユニットを含む核酸、または
iii.βユニット、γユニットおよびδユニットを含む核酸
のうちの1つから選択され、ここで、βユニットは、配列番号63〜67からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、γユニットは、配列番号68〜72からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、γ’ユニットは、配列番号83〜87からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、δユニットは、配列番号73〜77からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、ステップと;
(m)第4の核酸を第6の酵素と接触させ、第6の酵素が第6のライゲーション可能な末端を形成し、第5および第6のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと;
(n)第5および第6のライゲーション可能な末端を介して第2のライゲーションされた核酸と第4の核酸とをライゲーションして、固体支持体に連結された第3のライゲーションされた核酸を作製するステップと
をさらに含む、請求項4または5に記載の方法。 - 第5および第6の酵素が第5および第6の制限エンドヌクレアーゼであり、第5の制限エンドヌクレアーゼが第2のライゲーションされた核酸中の部位で切断して第5の切断末端を形成し、第6の制限エンドヌクレアーゼが第4の核酸中の部位で切断して第6の切断末端を形成し、第5および第6のライゲーション可能な末端が第5および第6の切断末端である、請求項8に記載の方法。
- 第2のライゲーションされた核酸が、第1のエンドヌクレアーゼに認識される制限部位を含まず、第1、第3および第5の制限エンドヌクレアーゼが同一である、請求項9に記載の方法。
- 第2、第4および第6の制限エンドヌクレアーゼが同一である、請求項9または10に記載の方法。
- 第1および第2のライゲーション可能な末端がそれぞれ、1〜10ヌクレオチドの突出を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の酵素がIIS型制限エンドヌクレアーゼである、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のライゲーションされた核酸を前記固体支持体から分離し、第1のライゲーションされた核酸をベクターに挿入することをさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 第2のライゲーションされた核酸を固体支持体から分離し、第2のライゲーションされた核酸をベクターに挿入することをさらに含む、請求項4から7のいずれか一項に記載の方法。
- 第3のライゲーションされた核酸を固体支持体から分離し、第3のライゲーションされた核酸をベクターに挿入することをさらに含む、請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。
- ベクターが発現ベクターである、請求項14から16のいずれか一項に記載の方法。
- 発現ベクターが、エフェクタードメインをコードしている配列を含み、ベクターがポリペプチドとエフェクタードメインとの融合タンパク質をコードしている配列を含むように第1、第2または第3のライゲーションした核酸がベクターに挿入される、請求項17に記載の方法。
- エフェクタードメインがヌクレアーゼドメインである、請求項18に記載の方法。
- 細胞に発現ベクターを挿入することをさらに含む、請求項17から19のいずれか一項に記載の方法。
- ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現させることをさらに含む、請求項20に記載の方法。
- ポリペプチドまたは融合タンパク質を精製することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- (k)第2のライゲーションされた核酸を第5の酵素と接触させ、第5の酵素が第5のライゲーション可能な末端を形成するステップと;
(l)βユニットおよびγユニットを含む第4の核酸を用意するステップであって、ここで、βユニットは、配列番号63〜67からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、γユニットは、配列番号68〜72からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、ステップと;
(m)第4の核酸を第6の酵素と接触させ、第6の酵素が第6のライゲーション可能な末端を形成し、第5および第6のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと;
(n)第5および第6のライゲーション可能な末端を介して第2のライゲーションされた核酸と第4の核酸とをライゲーションして、固体支持体に連結された第3のライゲーションされた核酸を作製するステップと
をさらに含む、請求項4または5に記載の方法。 - (o)第3のライゲーションされた核酸を第7の酵素と接触させ、第7の酵素が第7のライゲーション可能な末端を形成するステップと;
(p)δユニットおよびε’ユニットを含む第5の核酸を用意するステップであって、ここで、δユニットは、配列番号73〜77からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有し、ε’ユニットは、配列番号88〜92からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、ステップと;
(q)第5の核酸を第8の酵素と接触させ、第8の酵素が第8のライゲーション可能な末端を形成し、第7および第8のライゲーション可能な末端が対合可能であるステップと;
(r)第7および第8のライゲーション可能な末端を介して第3のライゲーションされた核酸と第5の核酸とをライゲーションして、固体支持体に連結された第4のライゲーションされた核酸を作製するステップと
をさらに含む、請求項23に記載の方法。 - 第4のライゲーションされた核酸を前記固体支持体から分離し、第4のライゲーションされた核酸をベクターに挿入することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
- ベクターが発現ベクターである、請求項25に記載の方法。
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