CN103789840A - 一种tale聚体库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种TALE聚体库的构建方法，该方法通过TALE单体扩增、构建酶切连接产物、酶切连接产物扩增、BP反应后建立TALE聚体库。利用TALE聚体库，可以组装识别20-25bpTales模块，扩大识别区域。本发明的方法准确率高，灵活性和高通量，可以准确地高通量构建载体，大大节约成本。该方法可以扩大识别区域，准确地高通量构建载体，大大节约成本。
Description
技术领域
本发明属于生物学领域中的构建方法，特别是涉及一种TALE聚体库的构建方法。
背景技术
TALEN(Transcription Activator-Like（TAL）Effector Nucleases)靶向基因敲除技术是一项崭新的分子生物学工具，是基因功能研究领域的一项重大技术突破。该技术利用TAL序列模块，构建针对任意核酸靶序列的重组核酸酶，可以实现在特异的位点打断目标基因，从而敲除该基因。
TALE蛋白N端和C端分别是核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)和转录激活结构域(Activation domain,AD),而中部则是介导其与DNA特异识别与结合的结构域。TALE蛋白的中部包含一段很长的、串联排列的重复序列，其序列重复的部分由长度为33～35个氨基酸残基的重复单位(或称重复单元)构成,在每个重复单位中,+12和+13位的氨基酸残基是实现靶向识别特异DNA碱基的关键位点,随靶点核苷酸序列的不同而异，被称作重复可变双残基(Repeatvariable di-residue，RVD)；其他位置的氨基酸残基则相对固定。不同的RVD能够相对特异地分别识别A、T、C、G4种碱基中的一种，其中分别与这4种碱基相对应的最常见的5种RVD分别是NI(Asn Ile)、NG(Asn Gly)、HD(His Asp)、NN(Asn Asn)和NH(Asn His)。这5种常见的可变区能分别特异性结合4种不同的碱基（NG识别T,HD识别C,NI识别A,NN和NH识别G）。
由于TALE由大量重复的序列构成，然而，为了保证TALE蛋白识别DNA序列的特异性，人工构建的TALE蛋白DNA结合结构域通常需要含有10个以上的重复单元，总长度大于1000bp。因此，TALE串联重复序列的构建难度较大，成为TALE应用中的主要瓶颈。目前，构建TALE串联重复序列及TALE蛋白DNA结合结构域的主要方法包括人工合成全长的TALE序列，以及基于Golden Gate的载体克隆技术等两种方法。但是上述两种方法构建载体比较慢，不利于高通量的TALE相关载体构建，不利于大规模的基因编辑。因此建立TALE重复区的高效组装技术平台非常重要。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题是，建立TALE重复区的高效组装技术。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种TALE聚体库的构建方法，包括如下步骤：
（1）TALE单体扩增：分别以pTALE-NI，pTALE-NG，pTALE-NH，pTALE-HD为模板，使用引物对TALE-Fn/TALE-Rn进行扩增，分别得到第一类至第十五类单体的混合物和第十六类单体N16，其中，所述n为1至16；
（2）构建酶切连接产物：分别将所述第一类至第十五类单体进行进行酶切和连接，得到第一至第八酶切连接产物；
（3）酶切连接产物和第十六类单体N16扩增：分别以所述第一至第八酶切连接产物和第十六类单体N16为模板，使用引物对attB1-F/attB1-R进行扩增，分别得到第一类至第六类五聚体混合物、三聚体混合物、二聚体混合物和N16扩增产物；
（4）TALE聚体克隆：分别将所述第一类、第二类、第三类、第四类、第五类、第六类五聚体混合物以及三聚体、二聚体混合物和第十六类单体N16扩增产物，与pDonr221载体（Kana+）进行BP反应，将BP反应产物进行转化并进行测序；
（5）TALE聚体库构建：根据确定的五聚体、三聚体、二聚体和单体序列信息，得到第一类至第五类五聚体库、三聚体库、二聚体库和单体库。
优选的，所述TALE单体扩增包括如下步骤：
分别以pTALE-NI，pTALE-NG，pTALE-NH，pTALE-HD为模板，
使用引物对TALE-F1/TALE-R1，进行扩增，得到第一类单体的混合物，即NI1，NG1，NH1和HD1；
使用TALE-F2/TALE-R2引物对进行扩增，得到第二类单体的混合物，即NI2，NG2，NH2和HD2；
使用TALE-F3/TALE-R3引物对进行扩增，得到第三类单体的混合物，即NI3，NG3，NH3和HD3；
使用TALE-F4/TALE-R4引物对进行扩增，得到第四类单体的混合物，即NI4，NG4，NH4和HD4；
使用TALE-F5/TALE-R5引物对进行扩增，得到第五类单体的混合物，即NI5，NG5，NH5和HD5；
使用TALE-F6/TALE-R1引物对进行扩增，得到第六类单体的混合物，即NI6，NG6，NH6和HD6；
使用TALE-F5/TALE-R7引物对进行扩增，得到第七类单体的混合物，即NI7，NG7，NH7和HD7；
使用TALE-F8/TALE-R1引物对进行扩增，得到第八类单体的混合物，即NI8，NG8，NH8和HD8；
使用TALE-F5/TALE-R9引物对进行扩增，得到第九类单体的混合物，即NI9，NG9，NH9和HD9；
使用TALE-F10/TALE-R1引物对进行扩增，得到第十类单体的混合物，即NI10，NG10，NH10和HD10；
使用TALE-F5/TALE-R11引物对进行扩增，得到第十一类单体的混合物，即NI11，NG11，NH11和HD11；
使用TALE-F12/TALE-R1引物对进行扩增，得到第十二类单体的混合物，即NI12，NG12，NH12和HD12；
使用TALE-F5/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十三类单体的混合物，即NI13，NG13，NH13和HD13；
使用TALE-F3/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十四类单体的混合物，即NI14，NG14，NH14和HD14；
使用TALE-F2/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十五类单体的混合物，即NI15，NG15，NH15和HD15；
使用TALE-F1/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十六类单体，即单体NI16，NG16，NH16和HD16，命名为N16。
优选的，所述构建酶切连接产物包括如下步骤：
将第一类、第二类、第三类、第四类和第五类单体混合物进行酶切和连接，得到第一酶切连接产物；
将第六类、第二类、第三类、第四类和第七类单体混合物进行酶切和连接，得到第二酶切连接产物；
将第八类、第二类、第三类、第四类和第九类单体混合物进行酶切和连接，得到第三酶切连接产物；
将第十类、第二类、第三类、第四类和第十一类单体混合物进行酶切和连接，得到第四酶切连接产物；
将第十二类、第二类、第三类、第四类和第十三类单体混合物进行酶切和连接，得到第五酶切连接产物；
将第十类、第二类、第三类、第四类和第十三类单体混合物进行酶切和连接，得到第六酶切连接产物；
将第十二类、第二类、第十四类单体混合物进行酶切和连接，得到第七酶切连接产物；
将第十二类，第十五类单体混合物进行酶切和连接，得到第八酶切连接产物。优选的，所述酶切连接产物扩增包括如下步骤：
分别以所述第一至第八酶切连接产物和N16为模板，使用引物对attB1-F/attB1-R进行扩增，分别得到第一类五聚体混合物N1N2N3N4N5；第二类五聚体混合物N6N2N3N4N7；第三类五聚体混合物N8N2N3N4N9；第四类五聚体混合物N10N2N3N4N11；第五类五聚体混合物N12N2N3N4N13；第六类五聚体混合物N10N2N3N4N13；三聚体混合物N12N2N14；二聚体混合物N12N15和N16扩增产物。优选的，所述TALE聚体克隆包括如下步骤：
分别将所述第一类、第二类、第三类、第四类、第五类、第六类五聚体混合物、三聚体、二聚体混合物以及N16扩增产物，与pDonr221载体（Kana+）进行BP反应，将BP反应产物进行转化并进行测序。根据确定的五聚体、三聚体、二聚体和单体序列信息，得到第一类至第五类五聚体库、三聚体库、二聚体库和单体库。
一种使用所述的TALE聚体库的构建方法构成的TALEN表达载体的构建方法，
从所述的五聚体库、三聚体库、二聚体库和单体库中，分别确定相应的质粒，与表达载体pTALEN-backbone（Amp+）进行Goldengate反应，构建TALEN表达载体，所述的TALE识别序列的长度为20-25个碱基。
本发明主要利用了在每一对存在的TALE重复单元之间交界位置的Gly-Leu双氨基酸的编码序列。根据密码子的简并性，两端的引物引入attB1，attB2位点,并引入BsmBI酶切位点。用带有attB1，attB2位点的引物扩增第一至第八酶切连接产物和N16，然后通过BP反应，分别把五聚体、三聚体、二聚体和单体克隆到pDonr221（Invitrogen）载体上。几种不同的pDonr22-TALE放在一起通过酶切连接的方法克隆目的载体上。
通过这种本发明提供的方法，利用密码子的简并性。设计了一系列的两端带有attB1，attB2位点和BsmBI酶切位点的引物。然后用这些引物去扩增第一至第八酶切连接产物和N16，把扩增产物通过BP反应克隆到pDorn221载体上，建立五聚体库，三聚体库和二聚体库和单体库。利用这些库，可以组装识别20-25bpTales模块，扩大识别区域。本发明的方法准确率高，灵活性和高通量。这些库构建好之后，可以准确地高通量构建载体，大大节约成本。
具体实施方式
1、TALE单体的扩增：
（1）分别以pTALE-NI，pTALE-NG，pTALE-NH，pTALE-HD为模板；
使用引物对TALE-F1/TALE-R1，进行扩增，得到第一类单体的混合物，即NI1，NG1，NH1和HD1；
使用TALE-F2/TALE-R2引物对进行扩增，得到第二类单体的混合物，即NI2，NG2，NH2和HD2；
使用TALE-F3/TALE-R3引物对进行扩增，得到第三类单体的混合物，即NI3，NG3，NH3和HD3；
使用TALE-F4/TALE-R4引物对进行扩增，得到第四类单体的混合物，即NI4，NG4，NH4和HD4；
使用TALE-F5/TALE-R5引物对进行扩增，得到第五类单体的混合物，即NI5，NG5，NH5和HD5；
使用TALE-F6/TALE-R1引物对进行扩增，得到第六类单体的混合物，即NI6，NG6，NH6和HD6；
使用TALE-F5/TALE-R7引物对进行扩增，得到第七类单体的混合物，即NI7，NG7，NH7和HD7；
使用TALE-F8/TALE-R1引物对进行扩增，得到第八类单体的混合物，即NI8，NG8，NH8和HD8；
使用TALE-F5/TALE-R9引物对进行扩增，得到第九类单体的混合物，即NI9，NG9，NH9和HD9；
使用TALE-F10/TALE-R1引物对进行扩增，得到第十类单体的混合物，即NI10，NG10，NH10和HD10；
使用TALE-F5/TALE-R11引物对进行扩增，得到第十一类单体的混合物，即NI11，NG11，NH11和HD11；
使用TALE-F12/TALE-R1引物对进行扩增，得到第十二类单体的混合物，即NI12，NG12，NH12和HD12；
使用TALE-F5/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十三类单体的混合物，即NI13，NG13，NH13和HD13；
使用TALE-F3/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十四类单体的混合物，即NI14，NG14，NH14和HD14；
使用TALE-F2/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十五类单体的混合物，即NI15，NG15，NH15和HD15；
使用TALE-F1/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十六类单体，即单体NI16，NG16，NH16和HD16，命名为N16。
（2）扩增单体的PCR体系和条件为：
PCR体系：
模板：1ul(5ng/ul)
5×buffer：10ul
dNTP(100mM)：0.5ul
正向引物（20uM）：0.5ul
反向引物（20uM）：0.5ul
Taq DNApolymerase：0.5ul
ddH2O：37ul
PCR条件：95℃预变性3min，95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸10s，扩增26个循环,72℃延5min。
2、TALE五聚体库，三聚体库和二聚体库的构建：
（1）将第一类、第二类、第三类、第四类和第五类单体混合物分别定量至20ng/ul，五种单体混合物进行酶切和连接；
体系为：每种单体混合物各取2ul，BsmB I1.5ul，10×buffer2ul，DTT2ul，dATP2ul，T4DNA连接酶0.5ul，ddH2O2ul；反应条件为37℃酶切5min,20℃连接5min，12个循环，得到酶切连接产物1。
（2）将第六类、第二类、第三类、第四类和第七类单体混合物分别定量至20ng/ul，五种单体混合物进行酶切和连接；
体系为：每种单体混合物各取2ul，BsmBI1.5ul，10×buffer2ul，DTT2ul，dATP2ul，T4DNA连接酶0.5ul，ddH2O2ul；反应条件为37℃酶切5min，20℃连接5min，12个循环，得到酶切连接产物2。
（3）将第八类、第二类、第三类、第四类和第九类单体混合物分别定量至20ng/ul，五种单体混合物进行酶切和连接；
体系为：每种单体混合物各取2ul，BsmBI1.5ul，10×buffer2ul，DTT2u，dATP2ul，T4DNA连接酶0.5ul，ddH2O2ul；反应条件为37℃酶切5min，20℃连接5min，12个循环，得到酶切连接产物3。
（4）将第十类、第二类、第三类、第四类和第十一类单体混合物分别定量至20ng/ul，五种单体混合物进行酶切和连接；
体系为：每种单体混合物各取2ul，BsmBI1.5ul，10×buffer2ul，DTT2ul，dATP2ul，T4DNA连接酶0.5ul，ddH2O2ul；反应条件为37℃酶切5min，20℃连接5min，12个循环，得到酶切连接产物4。
（5）将第十二类、第二类、第三类、第四类和第十三类单体混合物分别定量至20ng/ul，五种单体混合物进行酶切和连接；
体系为：每种单体混合物各取2ul，BsmBI1.5ul，10×buffer2ul，DTT2ul，dATP2ul，T4DNA连接酶0.5ul，ddH2O2ul；反应条件为37℃酶切5min，20℃连接5min，12个循环，得到酶切连接产物5。
（6）将第十类、第二类、第三类、第四类和第十三类单体混合物分别定量至20ng/ul，五种单体混合物进行酶切和连接；
体系为：每种单体混合物各取2ul，BsmBI1.5ul，10×buffer2ul，DTT2ul，dATP2ul，T4DNA连接酶0.5ul，ddH2O2ul，反应条件为37℃酶切5min，20℃连接5min，12个循环，得到酶切连接产物6。
（7）将第十二类、第二类、第十四类单体混合物分别定量至20ng/ul，三种单体混合物进行酶切和连接；
体系为：每种单体混合物各取2ul，BsmBI1.5ul，10×buffer2ul，DTT2ul，dATP2ul，T4DNA连接酶0.5ul，ddH2O6ul；反应条件为37℃酶切5min，20℃连接5min，12个循环，得到酶切连接产物7。
（8）将第十二类，第十五类单体混合物分别定量至20ng/ul，两种单体混合物进行酶切和连接；
体系为：每种单体混合物各取2ul，BsmBI1.5ul，10×buffer2ul，DTT2ul，dATP2ul，T4DNA连接酶0.5ul，ddH2O8ul；反应条件为37℃酶切5min，20℃连接5min，12个循环，得到酶切连接产物8。
（9）分别以酶切连接产物1、2、3、4、5、6、7、8和N16为模板，使用引物对attB1-F/attB1-R进行扩增，分别得到第一类五聚体混合物N1N2N3N4N5；第二类五聚体混合物N6N2N3N4N7；第三类五聚体混合物N8N2N3N4N9；第四类五聚体混合物N10N2N3N4N11；第五类五聚体混合物N12N2N3N4N13；第六类五聚体混合物N10N2N3N4N13；三聚体混合物N12N2N14；二聚体混合物N12N15；N16扩增产物。
PCR体系：
酶切连接产物：2ul
5×buffer：10ul
dNTP(100mM)：0.5ul
attB1-F（20uM）：0.5ul
attB1-R（20uM）：0.5ul
Taq DNApolymerase：0.5ul
ddH2O：36ul
PCR条件：95℃预变性3min，95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s，扩增26个循环，72℃延5min。
（10）分别将第一类、第二类、第三类、第四类、第五类、第六类五聚体混合物以及三聚体，二聚体混合物，N16扩增产物与pDonr221载体（Kana+）进行BP反应，将BP反应产物进行转化，针对1-6类混合物分别挑取2400个单菌落，使用pDonr221-F/pDonr221-R引物进行菌落PCR，即总共挑取14400个单菌落，针对三聚体混合物则挑取300个单菌落进行菌落筛选，针对二聚体挑取60个单菌落进行菌落筛选，针对N16扩增产物即得到单体库，将菌落PCR阳性的单菌落进行扩大培养，抽提质粒后进行测序。
BP反应体系：
混合物：2ul(100ng/ul)
pDonr221：1ul(100ng/ul)
BP酶：1ul
ddH2O：1ul
BP反应条件：25℃反应2-3h
（11）根据测序序列分析结果，针对每种五聚体混合物，得到序列确定的五聚体。每种五聚体混合物分别得到1024种五聚体，即总共会得到6144种五聚体，针对三聚体混合物，得到64种三聚体，针对二聚体混合物，得到16种二聚体。第一类五聚体库命名为TALE-N1N2N3N4N5；第二类五聚体库命名为TALE-N6N2N3N4N7；第三类五聚体库命名为TALE-N8N2N3N4N9；第四类五聚体库命名为TALE-N10N2N3N4N11；第五类五聚体库命名为TALE-N12N2N3N4N13；第六类五聚体库命名为TALE-N10N2N3N4N13；三聚体库命名为TALE-N12N2N14；二聚体库命名为TALE-N12N15；单体库则命名为TALE-N16。
3、根据上述的四种库，可以将TALE识别序列的长度增至20-25个碱基，可从TALE五聚体库，三聚体库，二聚体库和单体库中分别挑选相应的质粒与表达载体pTALEN-backbone（Amp+）进行Goldengate反应，完成TALEN表达载体的构建。
（1）将序列确定的质粒TALE-N1N2N3N4N5，TALE-N6N2N3N4N7，TALE-N8N2N3N4N9，TALE-N10N2N3N4N11，TALE-N12N2N3N4N13，分别TALE稀释至20ng/ul,与表达载体pTALEN-backbone进行酶切连接，得到可识别25个碱基的TALEN表达载体pN1N2N3N4N5N6N2N3N4N7N8N2N3N4N9N10N2N3N4N11N12N2N3N4N13；
（2）将序列确定的质粒TALE-N1N2N3N4N5，TALE-N6N2N3N4N7，TALE-N8N2N3N4N9，TALE-N10N2N3N4N13分别稀释至20ng/ul，与表达载体pTALEN-backbone进行酶切连接，得到可识别20个碱基的TALEN表达载体pN1N2N3N4N5N6N2N3N4N7N8N2N3N4N9N10N2N3N4N13；
（3）将序列确定的质粒TALE-N1N2N3N4N5，TALE-N6N2N3N4N7，TALE-N8N2N3N4N9，TALE-N10N2N3N4N11，TALE-N12N2N14分别稀释至20ng/ul，与表达载体pTALEN-backbone进行酶切连接，得到可识别23个碱基的TALEN表达载体pN1N2N3N4N5N6N2N3N4N7N8N2N3N4N9N10N2N3N4N11N12N2N14；
（4）将序列确定的质粒TALE-N1N2N3N4N5，TALE-N6N2N3N4N7，TALE-N8N2N3N4N9，TALE-N10N2N3N4N11，TALE-N12N15分别稀释至20ng/ul，与表达载体pTALEN-backbone进行酶切连接，得到可识别22个碱基的TALEN表达载体pN1N2N3N4N5N6N2N3N4N7N8N2N3N4N9N10N2N3N4N11N12N15
（5）将序列确定的质粒TALE-N1N2N3N4N5，TALE-N6N2N3N4N7，TALE-N8N2N3N4N9，TALE-N10N2N3N4N11，TALE-N16分别稀释至20ng/ul，与表达载体pTALEN-backbone进行酶切连接，得到可识别21个碱基的TALEN表达载体pN1N2N3N4N5N6N2N3N4N7N8N2N3N4N9N10N2N3N4N11N16；
酶切连接体系：将需要进行反应的质粒各取1ul，BsaI0.75ul，10×buffer1ul，100×BSA0.1ul，dATP1ul，T4DNA连接酶0.25ul，补足ddH2O至10ul；反应条件为37℃酶切5min，20℃连接5min，16个循环，80℃灭活20min，取5ul反应产物进行转化，使用Final-F/Final-R引物进行菌落PCR，菌落PCR为阳性的克隆则为目的克隆。
实施例
以敲除小鼠Mapk11基因为例，设计TALEN打靶位点，靶点识别序列位于第2个外显子。
左侧TALE识别的DNA序列为5’TCGCCCACCTTGCAGCTCGGCC
右侧TALE识别的DNA序列为5’TTCTTTACAGCCACCTTCTGGCGC。
识别T和最后一个碱基的0.5repeat位于骨架载体上，我们只需将中间的序列克隆到骨架载体上。
根据左侧TALE识别DNA序列（T）CGCCCACCTTGCAGCTCGGC（C），我们可以从第一类五聚体库中拿出TALE-HD1NH2HD3HD4HD5，从第二类五聚体库中拿出质粒TALE-NI6HD2HD3NG4NG7，从第三类五聚体库中拿出质粒TALE-NH8HD2NI3NH4HD9，第四类五聚体库中拿出质粒TALE-NG10HD2NH3NH4HD11，分别将这四个质粒稀释至20ng/ul,与pTALEN-backbone（HD）进行goldengate反应；
根据右侧TALE识别DNA序列（T）TCTTTACAGCCACCTTCTGGCG（C），我们可以从第一类五聚体库中拿出TALE-NG1HD2NG3NG4NG5，从第二类五聚体库中拿出质粒TALE-NI6HD2NI3NH4HD7，从第三类五聚体库中拿出质粒TALE-HD8NI2HD3HD4NG9，从第四类五聚体库中拿出质粒TALE-NG10HD2NG3NH4NH11，从二聚体库中拿出质粒TALE-HD12NH15，分别将这五个质粒稀释至20ng/ul,与pTALEN-backbone（HD）进行goldengate反应；
表1Goldengate反应体系
| 反应物 体积 |
| TALE聚体质粒(20ng/ul) 4/5μl |
| 25mM ATP 1μl |
| 10×Buffer4 1μl |
| 10×BSA 1μl |
| BsaI(20,000U/ul) 0.75ul |
| T7DNA连接酶(3,000,000U/ul) 0.25μl |
| pTALEN-backbone(100ng/ul) 1μl |
| ddH2O 1/0ul |
将酶切连接反应体系至于PCR仪中，37℃酶切5min,20℃连接5min,16个循环，80℃灭活20min。将经反应的产物使用氯化钙法转化Stbl3感受态细胞。
具体步骤：将5μl连接产物和Stbl3感受态细胞（100μl）温和混匀，冰浴30min后，将离心管放到42℃水浴锅中热击60sec，迅速将离心管置冰上冰浴3-5min，再往离心管中加入400μl SOC液体培养基，于37℃，250rpm培养30～60min。取200μl已转化的感受态细胞涂布在LB固体培养基平板上（含100μg/ml Amp），吹干，倒置平板于37℃下培养16-24h。
挑取平板中菌落一致的克隆，以引物Final-F/Final-R进行菌落PCR鉴定。
表2菌落PCR反应体系
| 反应物 体积 |
| 10μmol/L Final-F 0.5μl |
| 10μmol/L Final-R 0.5μl |
| LA Taq premix 7.5ul |
| ddH2O 6.5μl |
扩增程序为：95℃预变性2min，94℃变性30sec—60℃复性30min—72℃延伸2min（30个循环），72℃延伸10min。电泳检测确定目的片段克隆成功后，挑取单菌落扩大培养后送测序。经试验，按照本专利的方法，菌落PCR正确的克隆则为阳性克隆。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
Claims (5)
1.一种TALE聚体库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）TALE单体扩增：分别以pTALE-NI，pTALE-NG，pTALE-NH，pTALE-HD载体为模板，使用引物对TALE-Fn/TALE-Rn进行扩增，分别得到第一类至第十五类单体的混合物和第十六类单体N16，其中，所述n为1至16；
（2）构建酶切连接产物：分别将所述第一类至第十五类单体进行酶切和连接，得到第一至第八酶切连接产物；
（3）酶切连接产物扩增：分别以所述第一至第八酶切连接产物和第十六类单体N16为模板，使用引物对attB1-F/attB1-R进行扩增，分别得到第一类至第六类五聚体混合物、三聚体混合物、二聚体混合物和第十六类单体N16扩增产物；
（4）TALE聚体克隆：分别将所述第一类、第二类、第三类、第四类、第五类、第六类五聚体混合物、三聚体、二聚体混合物以及第十六类单体N16扩增产物，与pDonr221载体（Kana+）进行BP反应，将BP反应产物进行转化并进行测序；
（5）TALE聚体库构建：根据确定的五聚体、三聚体、二聚体和单体序列信息，得到第一类至第五类五聚体库、三聚体库、二聚体库和单体库。
2.根据权利要求1所述的TALE聚体库的构建方法，其特征在于，所述TALE单体扩增包括如下步骤：
分别以pTALE-NI，pTALE-NG，pTALE-NH，pTALE-HD为模板，
使用引物对TALE-F1/TALE-R1，进行扩增，得到第一类单体的混合物，即NI1，NG1，NH1和HD1；
使用TALE-F2/TALE-R2引物对进行扩增，得到第二类单体的混合物，即NI2，NG2，NH2和HD2；
使用TALE-F3/TALE-R3引物对进行扩增，得到第三类单体的混合物，即NI3，NG3，NH3和HD3；
使用TALE-F4/TALE-R4引物对进行扩增，得到第四类单体的混合物，即NI4，NG4，NH4和HD4；
使用TALE-F5/TALE-R5引物对进行扩增，得到第五类单体的混合物，即NI5，NG5，NH5和HD5；
使用TALE-F6/TALE-R1引物对进行扩增，得到第六类单体的混合物，即NI6，NG6，NH6和HD6；
使用TALE-F5/TALE-R7引物对进行扩增，得到第七类单体的混合物，即NI7，NG7，NH7和HD7；
使用TALE-F8/TALE-R1引物对进行扩增，得到第八类单体的混合物，即NI8，NG8，NH8和HD8；
使用TALE-F5/TALE-R9引物对进行扩增，得到第九类单体的混合物，即NI9，NG9，NH9和HD9；
使用TALE-F10/TALE-R1引物对进行扩增，得到第十类单体的混合物，即NI10，NG10，NH10和HD10；
使用TALE-F5/TALE-R11引物对进行扩增，得到第十一类单体的混合物，即NI11，NG11，NH11和HD11；
使用TALE-F12/TALE-R1引物对进行扩增，得到第十二类单体的混合物，即NI12，NG12，NH12和HD12；
使用TALE-F5/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十三类单体的混合物，即NI13，NG13，NH13和HD13；
使用TALE-F3/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十四类单体的混合物，即NI14，NG14，NH14和HD14；
使用TALE-F2/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十五类单体的混合物，即NI15，NG15，NH15和HD15；
使用TALE-F1/TALE-R13引物对进行扩增，得到第十六类单体，即单体NI16，NG16，NH16和HD16，命名为N16。
3.根据权利要求1所述的TALE聚体库的构建方法，其特征在于，所述构建酶切连接产物包括如下步骤：
将第一类、第二类、第三类、第四类和第五类单体混合物进行酶切和连接，得到第一酶切连接产物；
将第六类、第二类、第三类、第四类和第七类单体混合物进行酶切和连接，得到第二酶切连接产物；
将第八类、第二类、第三类、第四类和第九类单体混合物进行酶切和连接，得到第三酶切连接产物；
将第十类、第二类、第三类、第四类和第十一类单体混合物进行酶切和连接，得到第四酶切连接产物；
将第十二类、第二类、第三类、第四类和第十三类单体混合物进行酶切和连接，得到第五酶切连接产物；
将第十类、第二类、第三类、第四类和第十三类单体混合物进行酶切和连接，得到第六酶切连接产物；
将第十二类、第二类、第十四类单体混合物进行酶切和连接，得到第七酶切连接产物；
将第十二类，第十五类单体混合物进行酶切和连接，得到第八酶切连接产物。
4.根据权利要求1所述的TALE聚体库的构建方法，其特征在于，所述酶切连接产物扩增包括如下步骤：
分别以所述第一至第八酶切连接产物和第十六类单体N16为模板，使用引物对attB1-F/attB1-R进行扩增，分别得到第一类五聚体混合物N1N2N3N4N5；第二类五聚体混合物N6N2N3N4N7；第三类五聚体混合物N8N2N3N4N9；第四类五聚体混合物N10N2N3N4N11；第五类五聚体混合物N12N2N3N4N13；第六类五聚体混合物N10N2N3N4N13；三聚体混合物N12N2N14；二聚体混合物N12N15以及第十六类单体N16扩增产物。
5.一种使用如权利要求1至4任一所述的TALE聚体库的构建方法构成的TALEN表达载体的构建方法，其特征在于，
从所述的五聚体库、三聚体库、二聚体库和单体库中，分别确定相应的质粒，与表达载体pTALEN-backbone（Amp+）进行Goldengate反应，构建TALEN表达载体，所述的TALE识别序列的长度为20-25个碱基。
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