CN103146735A - Tale重复单元四聚体库的构建方法、talen表达载体的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明TALE重复单元四聚体库的构建方法、TALEN表达载体的构建方法及其应用，属于基因工程技术领域。所述四聚体库的构建包括构建TALE单个重复单元、构建TALE单体质粒以及在T4DNA连接酶缓冲液中加入TALE单体质粒，同时加入BsaI内切酶和T4DNA Ligase进行酶切-连接反应得到TALE重复单元四聚体库的过程。TALEN表达载体是基于TALE重复单元四聚体库构建所得。本发明具有通过PCR扩增和酶切-连接过程就可以构建TALE重复序列四聚体质粒库以及基于四聚体质粒库构建得到TALEN表达载体，减少了成本的投入、减化了构建方法的优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种TALE重复单元四聚体库的构建方法、TALEN表达载体的构建方法及其应用，具体涉及组装多个TALE重复序列，同时将组装的重复序列插入TALEN表达载体的方法，该方法基于Golden Gate克隆技术。
背景技术
基因组靶向修饰是近年来生命科学研究的热点之一，特别是在基因治疗人类疾病方面，基因组靶向修饰具有广阔的应用前景。通过转基因或者基因敲除等操作改变动物基因的遗传组成，可按人们的意愿对动物进行各种基因改造，获得满足各种需要的基因工程动物。当前转基因动物生产中面临的最大技术难题是动物基因组中外源基因的插入或特定基因敲除的效率低和精确性差。传统较常用的转基因方法为同源重组法和反转录病毒携带法。但同源重组法成功率低(重组概率为10-6～10-7)，而反转录病毒携带目的基因的随机插入法虽效率高，但由于其插入位点的不确定性和对其它内源基因表达的影响，限制了该方法的应用。人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFNs)技术是一种能够对基因组进行精确定点修饰的技术。ZFN利用了锌指蛋白特异结合DNA的特性和Fok I核酸酶非特异的DNA切割特性，能够在靶基因特定位点切割DNA双链，细胞内部DNA断裂修复机制能够有效地将含有同源片段的外源基因插入到DNA断裂处，从而实现高效、定点转基因，该技术介导的转基因成功率高达20%。尽管锌指核酸酶技术的出现促使基因组靶向修饰技术向前迈进了一大步，然而目前对于许多研究者而言设计出高效、高特异性的锌指核酸酶仍然是一个相当大的技术挑战。而且，由于锌指蛋白之间存在相互作用，锌指模块与DNA序列之间没有一个简单的对应关系，所以以锌指蛋白为基础设计针对序列特异性DNA结合蛋白依然是个难题，并且花费昂贵，经常要做大规模的筛选，构建过程长达几周至数月。
TALE(transcription activator-like effector)是在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现的一种转录激活子样效应因子。植物病原体黄单胞菌将TALE蛋白通过III型分泌系统注入植物细胞，TALE细菌蛋白与转录因子行为相似，穿过核膜进入细胞核内与特定的UPT(Up-regulated by TALE)盒结合，调控植物基因组中与疾病和抵抗力相关基因的表达。
TALE具有特殊的结构特征，包括N端分泌信号、中央的DNA结合域、1个核定位信号和C端的激活域。其中N端的分泌信号在TALE通过III型转运系统转移到植物体内的过程中发挥作用，中间重复区域介导TALE进行序列特异性DNA结合，C末端的核定位信号和酸性转录激活结构域在TALE定位于细胞核并发挥转录激活活性过程中具有重要作用。通过分析天然的TALE蛋白，发现TALE蛋白中DNA结合域有1个共同的特点：不同的TALE蛋白的DNA结合域是由数目不同的(12～30)、高度保守的重复单元组成，每个重复单元含有33～35个氨基酸。这些重复单元的氨基酸组成相当保守，除了第12和13位氨基酸可变外，其它氨基酸都是相同的，这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基(repeatvariable di-residues，RVD)，与碱基识别相关。TALE识别DNA的机制在于每个重复序列的2个RVD可以特异识别DNA的4个碱基中的1个，目前常用的RVD共有4种。HD(氨基酸名称)特异识别C碱基，NI(氨基酸名称)识别A碱基，NN(氨基酸名称)识别G或A碱基，NG(氨基酸名称)识别T碱基。通过对天然TALE的研究发现，TALE蛋白框架固定识别1个T碱基，所以TALE的识别序列总是以T碱基开始。
自然界中，不同TALE蛋白的DNA结合域所含重复序列数目不同，因此，产生相互作用的靶DNA的碱基数目也不同。可以利用TALE蛋白的这一特点设计基因组修饰的操作工具，理论上可以根据实验需要对DNA结合域的重复进行设计，得到特异识别任意序列靶位点的TALE蛋白。通过对TALE重复序列进行设计并将其与一些功能域融合产生的dTALE(designer TALE-type transcription factor)和TALEN(TALE nuclease)引起了人们极大的兴趣。这些功能域包括激活子、抑制子、核酸酶、甲基化酶和整合酶等。TALE的DNA结合域与FokI核酸内切酶的切割域融合，就产生了能够在特定位点产生双链断裂(doublestrand break，DSB)的嵌合酶——TALEN。
由于TALE DNA结合结构域每个重复之间几乎完全相同，因此构建TALEN表达载体的最大挑战是如何把这些能够结合靶DNA的重复序列按照一定的顺序组装起来。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种TALE四聚体质粒库的构建方法。
本发明的另一个目的在于公开了基于上述四聚体质粒库的TALEN表达载体快速构建方法。
本发明的第三个目的在于公开了基于上述四聚体质粒库的TALEN表达载体快速构建方法在构建构建靶向鼠Rosa26基因的TALEN哺乳动物细胞表达载体中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
TALE重复单元四聚体库的构建方法，包括下述步骤：
(1)、PCR扩增TALE单个重复单元：以TALE单个重复片段monomer NI为模板，用TALE-F1/TALE-R1为引物PCR扩增得到TALE单体NI1、NI2、NI3、NI4；以TALE单个重复片段monomer NG为模板，用TALE-F2/TALE-R2为引物PCR扩增得到TALE单体NG1、NG2、NG3、NG4；以TALE单个重复片段monomer HD为模板，用TALE-F3/TALE-R3为引物PCR扩增得到TALE单体HD1、HD2、HD3、HD4；以TALE单个重复片段monomer NN为模板，用TALE-F4/TALE-R4为引物PCR扩增得到TALE单体NN1、NN2、NN3、NN4，其中monomer NI识别A碱基、monomer NG识别T碱基、monomer HD识别C碱基、monomer NN识别G碱基；
(2)、将步骤(1)构建所得的TALE单体插入线性化pGEM-T easy载体中，得到相应的16个TALE单体质粒pGEM-T-NI1、pGEM-T-NI 2、pGEM-T-NI3、pGEM-T-NI4、pGEM-T-NG1、pGEM-T-NG2、pGEM-T-NG3、pGEM-T-NG4、pGEM-T-HD1、pGEM-T-HD2、pGEM-T-HD3、pGEM-T-HD4、pGEM-T-NN1、pGEM-T-NN2、pGEM-T-NN3和pGEM-T-NN4；
(3)、在T4DNA连接酶缓冲液中加入TALE单体质粒，同时加入BsaI内切酶和T4DNALigase进行酶切-连接反应，所述TALE单体质粒为pGEMT-Momomer1，pGEMT-Monomer2，pGEMT-Monomer3和pGEMT-Monomer4，得到含256个四聚体质粒的TALE重复单元四聚体库，其中pGEMT-Momomer1为pGEM-T-NI1、pGEM-T-HD1、pGEM-T-NG1或pGEM-T-NN1中的一个，pGEMT-Monomer2为pGEM-T-NI2、pGEM-T-HD2、pGEM-T-NG2或pGEM-T-NN2中的一个，pGEMT-Monomer3为pGEM-T-NI3、pGEM-T-HD3、pGEM-T-NG3或pGEM-T-NN3中的一个，pGEMT-Monomer4为pGEM-T-NI4、pGEM-T-HD4、pGEM-T-NG4或pGEM-T-NN4中的一个。
上述技术方案所述的TALE重复单元四聚体库的构建方法，其中，步骤(1)中PCR扩增的体系为模板1μL、正向引物1μL、反向引物1μL、10×Taq Buffer 5μL、2.5mmol/L dNTPs4μL、Taq DNApolymerase 0.5μL和H2O 37.5μL；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，扩增30个循环；72℃延伸10min。
上述技术方案所述的TALE重复单元四聚体库的构建方法，其中，所述步骤(2)中TALE单体插入线性化pGEM-T easy载体中的具体步骤为TALE单体与末端含T碱基的线性化pGEM-T easy载体连接，连接体系为线性化pGEM-T easy载体1μL、TALE单体1μL、10×T4DNA酶Buffer 1μL、T4连接酶1μL和H2O 6μL。
上述技术方案所述的TALE重复单元四聚体库的构建方法，其中，步骤(3)中的酶切- 连接反应体系为pGEMT-Momomer12μL、pGEMT-Momomer22μL、pGEMT-Momomer32μL、pGEMT-Momomer42μL、10×T4DNA酶Buffer 2μL、BsaI 0.5μL、T4连接酶0.5μL和H2O 9μL；反应条件为首先37℃5min，16℃5min，循环30次；16℃10h；65℃20min。
TALEN表达载体的构建方法，包括上述技术方案中所述的TALE重复单元四聚体库的构建过程，该TALEN表达载体的构建方法还包括下述步骤：
(A)、将含14个碱基的靶向序列中由TALEN骨架载体N端决定的第一个T碱基和0.5个重复单元决定的最后一个碱基之间的12个碱基序列按照从N端到C端的顺序分成NNNN(1-4)、NNNN(5-8)和NNNN(9-12)三个碱基组，从上述技术方案中所构建的TALE重复单元四聚体库中筛选与碱基组对应的pGEM-T-NNNN(1-4)、pGEM-T-NNNN(5-8)和pGEM-T-NNNN(9-12)，其中N为A、T、C或G中的一种；
(B)、以pGEM-T-NNNN(1-4)为模板，用Tetramer-F1/Tetramer-R1引物对进行PCR扩增，得到片段TALE-NNNN(1-4)；以pGEM-T-NNNN(5-8)为模板，用Tetramer-F2/Tetramer-R2引物对进行PCR扩增，得到片段TALE-NNNN(5-8)；以pGEM-T-NNNN(9-12)为模板，用Tetramer-F3/Tetramer-R3引物对进行PCR扩增，得到片段TALE-NNNN(9-12)；
(C)、以pLenti-EF1a-Backbone(N13)为模板，以TAL-N-F/TAL-C-R为引物PCR扩增，扩增产物经XbaI和BamHI双酶切后与同样经XbaI和BamHI双酶切的pST1374载体进行连接，得到TALEN表达骨架载体pTALEN-Backbone(N13)，其中N13为NI、HD、NG或NN中的一种，能识别靶向序列最后一个碱基；
(D)、在T4DNA连接酶缓冲液中同时加入等量的TALE-NNNN(1-4)、TALE-NNNN(5-8)、TALE-NNNN(9-12)和pTALEN-Backbone(N13)以及BsmBI和T4DNA Ligase进行酶切-连接反应，得到与靶向序列相对应的TALEN哺乳动物细胞表达载体。
上述技术方案所述的TALEN表达载体的构建方法，其中，步骤(B)中的PCR扩增体系为模板1μL、正向引物2μL、反向引物2μL、10×pfu Buffer 10μL、2.5mmol/L dNTPs 5μL、pfu:Taq=4:12μL和H2O 67μL；反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；最后72℃延伸10min。
上述技术方案所述的TALEN表达载体的构建方法，其中，步骤(C)中的PCR扩增体系为pLenti-EF1a-Backbone(N13)模板1μL、TAL-N-F 1μL、TAL-C-R 1μL、10×pfu Buffer 5μL、2.5mmol/L dNTPs 4μL、Pfu DNA polymerase 0.5μL和H2O 37.5μL；连接体系为酶切后的 pST13741μL、酶切后的扩增产物0.5μL、10×T4DNA Ligase Buffer1μL、T4DNA Ligase0.2μL和H2O 7.3μL。
上述技术方案所述的TALEN表达载体的构建方法，其中，步骤(D)中的酶切-连接反应体系为TALE-NNNN(1-4)2μL、TALE-NNNN(5-8)2μL、TALE-NNNN(9-12)2μL、pTALEN-Backbone(N13)2μL、10×T4DNA Ligase Buffer 1μL、、BsmBI 0.5μL和T4DNA Ligase0.5μL；反应条件为：首先46℃5min，16℃5min，30个循环；然后55℃3h；最后80℃灭活20min。
上述技术方案所述的方法在构建靶向鼠Rosa26基因的TALEN哺乳动物细胞表达载体中的应用，包括下述步骤：
(1)、将鼠Rosa26基因的序列TCGTGATCTGCAAC中由TALEN骨架载体N端决定的第一个T碱基和0.5个重复单元决定的最后一个碱基C之间的含12个碱基序列按照从N端到C端的顺序分成CGTG、ATCT和GCAA三个碱基组，从上述技术方案中所构建的TALE重复单元四聚体库中筛选与碱基组对应的pGEM-T-CGTG、pGEM-T-ATCT和pGEM-T-GCAA；
(B)、以pGEM-T-CGTG为模板，用Tetramer-F1/Tetramer-R1引物对进行PCR扩增，得到片段TALE-CGTG(1-4)；以pGEM-T-ATCT为模板，用Tetramer-F2/Tetramer-R2引物对进行PCR扩增，得到片段TALE-ATCT(5-8)；以pGEM-T-GCAA为模板，用Tetramer-F3/Tetramer-R3引物对进行PCR扩增，得到片段TALE-GCAA(9-12)；其中PCR扩增体系为模板1μL、正向引物2μL、反向引物2μL、10×pfu Buffer 10μL、2.5mmol/LdNTPs5μL、pfu:Taq=4:12μL和H2O 67μL；反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；最后72℃延伸10min。
(C)、以pLenti-EF1a-Backbone(HD)为模板，以TAL-N-F/TAL-C-R为引物PCR扩增，扩增产物经XbaI和BamHI双酶切后与同样经XbaI和BamHI双酶切的pST1374载体进行连接，得到TALEN表达骨架载体pTALEN-Backbone(HD)；其中PCR扩增体系为pLenti-EF1a-Backbone(HD)模板1μL、TAL-N-F 1μL、TAL-C-R 1μL、10×pfu Buffer 5μL、2.5mmol/L dNTPs 4μL、Pfu DNA polymerase 0.5μL和H2O 37.5μL；连接体系为酶切后的pST1374 1μL、酶切后的扩增产物0.5μL、10×T4DNA Ligase Buffer 1μL、T4DNALigase 0.2μL和H2O 7.3μL。
(D)、在T4DNA连接酶缓冲液中同时加入等量的TALE-CGTG(1-4)、TALE-ATCT(5-8)、TALE-GCAA(9-12)和pTALEN-Backbone(HD)以及BsmBI和T4DNA Ligase进行酶切-连接反 应，得到与靶向序列相对应的TALEN哺乳动物细胞表达载体；其中酶切-连接反应体系为TALE-CGTG(1-4)2μL、TALE-ATCT(5-8)2μL、TALE-GCAA(9-12)2μL、pTALEN-Backbone(HD)2μL、10×T4DNA Ligase Buffer1μL、、BsmBI 0.5μL和T4DNALigase 0.5μL；反应条件为：首先46℃5min，16℃5min，30个循环；然后55℃3h；最后80℃灭活20min。
本发明涉及的引物对中位于“/”符号前面的为正向引物，位于“/”符号后面的为反向引物，如TALE-F1/TALE-R1中TALE-F1为正向引物，TALE-R1为反向引物。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种方便快捷、花费较少、不需特别设备即可进行的靶向14bp任意DNA序列TALEN表达载体的构建方法；该方法基于Golden Gate克隆技术和PCR突变。
2、本发明的方法通过PCR扩增和酶切-连接过程就可以构建TALE重复序列四聚体质粒库以及基于四聚体质粒库构建得到TALEN表达载体，减少了成本的投入、减化了构建方法；
3、本发明提供了构建TALE重复序列四聚体质粒库的构建方法，该质粒库中的每个质粒上都插入了不同的四聚体TALE重复序列，库中的256个质粒对应了4bp DNA序列的所有的256种可能。
附图说明：
1、图1为构建的pTALEN-Backbone(NI)图谱；
2、图2为NdeI/EcoRI双酶切检测pTALEN-Backbone(NI)电泳图；
3、图3为基于Golden Gate克隆方法用酶切-连接反应组装TALE四聚体图；
4、图4为菌落PCR检测TALE四聚体质粒电泳图；
5、图5为基于四聚体库的TALEN哺乳动物细胞表达载体快速组装的方法示意图；
6、图6为扩增的四聚体电泳图；
7、图7为菌落PCR检测TALEN表达载体电泳图。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明的构建过程和原理作进一步的说明。
本发明中TALE-F1/TALE-R1、TALE-F2/TALE-R2、TALE-F3/TALE-R3、TALE-F4/TALE-R4四对PCR扩增TALE单体的引物参考于文献（Zhang F,Cong L,Lodato S,Kosuri S,Church GM,et al.(2011)Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulatingmammalian transcription.Nat Biotechnol 29:149-153.），其余引物均由上海博尚生物公司设计 合成。
实施例一：TALEN哺乳动物细胞表达骨架载体的构建：
分别以购自Addgene的pLenti-EF1a-Backbone(NI)，pLenti-EF1a-Backbone(HD)，pLenti-EF1a-Backbone(NG)和pLenti-EF1a-Backbone(NN)四个载体为模板，以TAL-N-F/TAL-C-R为引物，构建pTALEN-Backbone(NI)、pTALEN-Backbone(HD)、pTALEN-Backbone(NG)和pTALEN-Backbone(NN)四个TALEN表达骨架载体。
一、TALEN哺乳动物细胞表达骨架载体pTALEN-Backbone(NI)的构建：
1、TALE原件的PCR扩增：
以pLenti-EF1a-Backbone(NI)为模板，以TAL-N-F/TAL-C-R为引物，PCR扩增含TALE的N端、0.5个NI重复、C端和用于重复序列插入的两个BsmBI位点的片段，PCR体系如表1.1所示，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2min，扩增30个循环；72℃延伸10min。
TAL-N-F/TAL-C-R引物序列见SEQ No.1和SEQ No.2所示。
表1.1PCR扩增TALE原件体系
2、pTALEN-Backbone(NI)的构建:
XbaI和BamHI双酶切pST1374载体和PCR扩增产物后跑琼脂糖凝胶电泳，用Vigorous胶回收试剂盒纯化，将酶切后载体与酶切后PCR产物进行连接，连接体系见表1.2。
pST1374载体(购自Addgene)，含有一个CMV启动子，一个FLAG标签，一个SV40核定为信号序列(NLS)和一个野生型FokI切割域。通过XbaI和BamHI将TALE N端、C端两个靠近的BsmBI酶切位点和0.5个NI重复片段插入到pST1374载体中，完成pTALEN-Backbone(NI)的构建。
表1.2pST1374骨架与PCR产物双酶切后的连接体系
16℃连接过夜后转化DH5a感受态细胞，涂布于含有AMP的LB平板，37℃过夜培养。挑取6个克隆于4ml含AMP的LB液体培养基，37℃过夜摇菌，次日提取质粒。
3、双酶切和测序验证载体的正确性：
NdeI和EcoRI双酶切载体(上一步骤提取的质粒)，跑胶检测，由于NdeI位点位于CMV启动子，EcoRI位点位于插入片段末尾，双酶切出现5100bp和1600bp的条带说明含TALE原件的DNA片段成功插入pST1374载体中；出现其他大小条带的为非阳性载体，说明载体构建不正确。
检测结果如图2所示，图2中出现5100bp和1600bp两条带的载体为阳性pTALEN-Backbone(NI)载体，说明载体构建正确。
用T7通用引物(序列如SEQ No.11所示)对酶切鉴定阳性载体进行测序，结果显示TALEN骨架载体pTALEN-Backbone(NI)构建成功，pTALEN-Backbone(NI)的结构如图1所示。
二、pTALEN-Backbone(HD)、pTALEN-Backbone(NG)和pTALEN-Backbone(NN)的构建:
pTALEN-Backbone(HD)、pTALEN-Backbone(NG)和pTALEN-Backbone(NN)三个TALEN骨架载体的构建过程与pTALEN-Backbone(NI)构建过程完全相同，区别仅在于PCR扩增所采用的模板不同，构建所得的4个pTALEN-Backbone只有0.5个重复不同，其他部分完全相同。
4个pTALEN-Backbone只有0.5个重复不同是因为自然界存在的TALE蛋白最后有都含0.5个重复单元，构建的4个TALEN哺乳动物细胞表达骨架载体：pTALEN-Backbone(NI)、pTALEN-Backbone(HD)、pTALEN-Backbone(NG)和pTALEN-Backbone(NN)中，每个也分别含有0.5个TALE重复单元，与载体后括号中（NI）、（HD）、（NG）和（NN）相对应。
实施例二：TALE单体质粒的构建：
1、PCR扩增TALE单个重复单元：
以可以识别不同碱基的TALE单个重复片段monomer NI(识别A碱基)、monomer NG(识别T碱基)、monomer HD(识别C碱基)、monomer NN(识别G碱基)为模板(单个重复片段购自Addgene)，分别用TALE-F1/TALE-R1、TALE-F2/TALE-R2、TALE-F3/TALE-R3、TALE-F4/TALE-R4四对引物PCR扩增TALE单体，产物分别命名为NI-1、NI-2、NI-3、NI-4,NG-1、NG-2、NG-3、NG-4,HD-1、HD-2、HD-3、HD-4,NN-1、NN-2、NN-3、NN-4；引物 序列如SEQ No.3-SEQ No.10所示，PCR反应体系如表2.1.1所示，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，扩增30个循环；72℃延伸10min；其中四对引物序列分别如SEQ No.3-SEQ No.10所示，为在四聚体两端添加不同的接头序列(序列3-10中第28-31位的碱基)，BsmBI位点(序列3和10中第21-26位的碱基)和BsaI位点(序列4-9中第21-26位的碱基)。
表2.1扩增TALE单体的PCR体系
2、TALE单个重复单元插入线性化pGEM-T easy载体：
将扩增得到的TALE单体(单个重复单元)片段跑琼脂糖凝胶电泳，用Vigorous胶回收长度为160bp的DNA条带试剂盒纯化后，分别与末端含T碱基的线性化pGEM-T easy载体(购自天根（Tiangen）公司)连接2h，连接体系见表2.2，将连接产物转化感受态细胞DH5α，涂布于表面预先涂有50mg/mLIPTG和20mg/mL X-gal的含有AMP的LB培养基平板，37℃避光培养14h；由于未插入目的片段的pGEM-T easy载体自连接后在IPTG的诱导下表达LacZ基因，分解X-gal，产生蓝色产物，所以蓝色菌落为未插入目的片段克隆，白色菌落为插入目的片段的克隆；挑取白色菌落于含AMP的LB液体培养基，37℃过夜摇菌并提取质粒，各质粒与PCR片段名称相对应，将TALE单体质粒分别命名为pGEM-T-NI1、pGEM-T-NI2、pGEM-T-NI3、pGEM-T-NI4……pGEM-T-NN1、pGEM-T-NN2、pGEM-T-NN3、pGEM-T-NN4。用T7通用引物对所提质粒进行测序，选择TALE单体插入方向一致的载体质粒用于四聚体库的构建。
表2.2单体与末端含T碱基的线性化pGEM-T easy载体连接体系
实施例三：TALE四聚体库的构建：
四聚体1,2,3,4位置上分别有四种可能(NI,HD,NG或NN)，共有256种组合方式，利用上述构建的16个TALE单体质粒，基于Golden Gate克隆方法，应用酶切-连接反应构建了含所有组合的256个四聚体质粒库。构建方法除了选取的4个单体质粒不同，其他步骤均相同。
1、酶切-连接反应构建TALE四聚体质粒
在T4DNA连接酶缓冲液中加入4种TALE单体质粒(位于四聚体1,2,3,4位的单体质粒分别表示为pGEMT-Momomer1，pGEMT-Monomer2，pGEMT-Monomer3和pGEMT-Monomer4，pGEMT-Momomer1表示pGEM-T-NI1、pGEM-T-HD1、pGEM-T-NG1、pGEM-T-NN1中任意一个，pGEMT-Monomer2表示pGEM-T-NI2、pGEM-T-HD2、pGEM-T-NG2、pGEM-T-NN2中任意一个，pGEMT-Monomer3和pGEMT-Monomer4依次类推。四聚体每个位置上都有4种可能，即4×4×4×4=256，共256种组合方式。)，同时加入BsaI内切酶和T4DNALigase进行酶切-连接反应；酶切-连接反应体系如表3.1所示，反应条件为：首先37℃5min，16℃5min，循环30次；16℃10h；65℃20min。
上述反应的原理为37℃时，BsaI切割单体质粒，暴露出TALE单个重复序列两端的粘性接头，位于位置1的单体末端与位于位置2单体的前端互补，位置2单体的末端与位置3单体前端互补，单体3末端与单体4前端互补；温度降到16℃时，DNA连接酶将4个单体连接起来并重新连回载体中，连接正确的四聚体质粒不再含有BsaI位点，所以随着循环的进行，阳性质粒的数量会不断增加如图3所示，图3为基于Golden Gate克隆方法用酶切-连接反应组装TALE四聚体图。
表3.1构建四聚体酶切-连接体系
将3ul酶切-连接产物转化50ul DH5α感受态细胞，涂布于含有Amp的LB培养基平板，37℃过夜培养；
2、TALE四聚体质粒的PCR检测：
挑取单个菌落，利用通用引物T7/SP6进行菌落PCR检测TALE重复单元四聚体阳性质粒，引物序列如SEQ No.11和SEQ No.12所示，PCR反应体系如表3.2所示，反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；最后72℃延伸10min。
表3.2菌落PCR检测四聚体体系
PCR产物用20g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，T7引物位于插入位点上游80bp处，SP6引物位于插入位点下游100bp处，插入片段约460bp，含正确插入四聚体片段质粒的菌落经T7和SP6引物扩增后应得到约640bp的条带；检测结果如图4所示，检测扩增得到单条约640bp条带的菌落为阳性四聚体菌落。阳性菌落在4ml含AMP的LB液体培养基中培养12h，提取质粒后以T7通用引物进行测序；测序结果表明，256个四聚体质粒全部构建成功。
实施例四：由TALE四聚体质粒库构建TALEN哺乳动物细胞表达载体：
TALE蛋白N端可以识别一个T碱基，应用本方法可以组装靶向任意序列为TNNNNNNNNNNNNN(N表示任意碱基)的TALEN表达载体。
应用上述方法构建一个识别序列为TN1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13(N1，N2，N3……N12为A，T，C，G 4个碱基中的任意一个)的TALEN表达的具体步骤如下：
1、PCR扩增TALE重复单元四聚体质粒
分别以四聚体库中的质粒pGEM-T-N1N2N3N4、pGEM-T-N5N6N7N8和pGEM-T-N9N10N11N12为模板，分别用Tetramer-F1/Tetramer-R1，Tetramer-F2/Tetramer-R2，Tetramer-F3/Tetramer-R33对引物PCR扩增3个质粒，通过PCR突变更改四聚体两端的末端接头序列(序列13-18中第28-31位的碱基)和BsmBI位点(序列13和18中第21-26位的碱基)，扩增产物分别命名为TALE-N1N2N3N4(1-4)、TALE-N5N6N7N8(5-8)、TALE-N9N10N11N12(9-12)，所用引物序列见SEQ No.13-SEQ No.18；PCR反应体系如表4.1.1-表4.1.3除模板不同外，其余均相同；反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃ 变性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；最后72℃延伸10min。
表4.1.1扩增TALE-N1N2N3N4(1-4)的PCR体系
表4.1.2扩增TALE-N5N6N7N8(5-8)的PCR体系
表4.1.3扩增TALE-N9N10N11N12(9-12)的PCR体系
PCR产物[TALE-N1N2N3N4(1-4)、TALE-N5N6N7N8(5-8)、TALE-N9N10N11N12(9-12)]跑琼脂糖凝胶电泳，回收大小约460bp的TALE(该460bp条带为经过PCR扩增更改了接头序列的四聚体片段，片段两头含有两个BsmBI位点)，用Vigorous胶回收试剂盒纯化，回收完后跑胶检测，确定回收产物为单一的条带。
2、应用酶切-连接反应组装TALE重复单元四聚体片段并插入骨架载体：
在T4DNA连接酶缓冲液中同时加入等量(约100ng)的TALE-N1N2N3N4(1-4)、TALE-N5N6N7N8(5-8)、TALE-N9N10N11N12(9-12)和与N13相对应的200ngpTALEN-Backbone以及BsmBI和T4DNALigase进行酶切-连接反应。酶切-连接体系如表4.2所示，反应条件为：首先46℃5min，16℃5min，30个循环；然后55℃3h； 最后80℃灭活20min。
与组装四聚体原理相同，46℃时BsmBI在TALE重复单元四聚体两端和骨架载体上进行切割，产生对应的粘性末端，骨架载体的一端与位置1上的四聚体前端互补，位置1上的四聚体末端与位置2上的四聚体前端互补，位置2四聚体末端与位置3四聚体前端互补，位置3上的四聚体末端与骨架载体另一端互补；温度降到16℃时，4个四聚体片段按照顺序连接在一起并插入到骨架载体中。正确连接的载体中不再含有BsmBI酶切位点，随着循环的进行，正确连接的载体数量会一直增加。
表4.2酶切-连接反应体系
将3ul上述酶切-连接产物转化50ul感受态细胞DH5α，涂含有Amp的LB培养基平板，37℃培养10h。
3、菌落PCR检测构建的TALEN表达载体
挑取单个菌落，利用引物Seq-F/Seq-R菌落PCR检测TALEN表达载体阳性质粒，引物序列见SEQ No.19-SEQ No.20。
PCR反应体系如表4.3所示，反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min；检测产物用10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。
表4.3菌落PCR检测TALEN表达载体体系
含有约1500bp单一条带的菌落为组装成功的TALEN阳性菌落，将阳性菌落在含Amp的LB液体培养基中培养12h并提取质粒(TALEN哺乳动物细胞表达载体)，阳性质粒用引物Seq-F和Seq-R进行测序。
本发明中使用的BsaI和BsmBI属于IIs型限制性内切酶，他们在DNA双链的切割位点在识别位点之外，利用这一特性可以通过适当设计，在切割后得到不同的粘性末端。而且这两种内切酶在连接酶缓冲体系中都可以保持其DNA切割活性。利用这两种内切酶的以上性质，将内切酶(BsaI或BsmBI)、DNA连接酶、多个DNA片段及载体共同加入到连接酶缓冲液中，通过改变环境温度实现酶切和连接在同一反应体系中分布进行，从而将多个DNA片段按照一定的顺序连接在一起，并插入到目的载体中。
本发明首先构建了16个TALE单体载体；根据的Golden Gate克隆方法，应用酶切-连接反应将单体载体组装成为四聚体质粒，构建了含有256个包含所有可能组合的TALE重复单元四聚体质粒库；通过PCR扩增特定的四聚体质粒突变TALE重复单元四聚体的末端接头，再次用酶切-连接反应将TALE重复单元四聚体按照一定顺序连接起来，并插入到骨架载体中，构建与目的DNA序列相对应的TALEN哺乳动物表达载体的构建。
本发明基于构建的TALE重复单元四聚体库的TALEN哺乳动物细胞表达载体快速组装的方法中基于所构建的四聚体库，可以在4-5天可以完成一个靶向任意序列为TNNNNNNNNNNNNN(N表示任意碱基)TALEN表达载体的构建，而且可以平行进行多个TALEN表达载体的同时构建，构建过程图如图5所示。
以下是构建一个靶向鼠Rosa26基因(序列为：TCGTGATCTGCAAC，如SEQ No.21)的TALEN哺乳动物细胞表达载体的具体实施方法。
实施例五：靶向鼠Rosa26基因的TALEN哺乳动物细胞表达载体的构建：
鼠Rosa26基因的序列为：TCGTGATCTGCAAC，第一个T碱基和最后一个C碱基分别由pTALEN-Backbone骨架载体上的N端和0.5个重复决定，所以要组装的串联重复单元对应的序列为CGTGATCTGCAA。
1、PCR扩增TALE重复单元四聚体质粒
分别从TALE重复单元四聚体库中挑选pGEM-T-CGTG、pGEM-T-ATCT和pGEM-T-GCAA，以四聚体质粒pGEM-T-CGTG、pGEM-T-ATCT和pGEM-T-GCAA为模板，分别用Tetramer-F1/Tetramer-R1，Tetramer-F2/Tetramer-R2，Tetramer-F3/Tetramer-R33对引物PCR扩增3个质粒，通过PCR突变更改四聚体两端的末端接头序列(序列13-18中第 28-31位的碱基)和BsmBI位点(序列13和18中第21-26位的碱基)，扩增产物分别命名为TALE-CGTG(1-4)、TALE-ATCT(5-8)、TALE-GCAA(9-12)，所用引物序列见SEQ No.13-SEQNo.18；PCR反应体系如表5.1.1-表5.1.3(与表4.1.1-表4.1.3相同)；反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；最后72℃延伸10min。
表5.1.1扩增TALE-CGTG(1-4)的PCR体系
表5.1.2扩增TALE-CTCG(5-8)的PCR体系
表5.1.3扩增TALE-GTCG(9-12)的PCR体系
PCR产物[TALE-CGTG(1-4)、TALE-ATCT(5-8)、TALE-GCAA(9-12)]跑琼脂糖凝胶电泳，回收大小约460bp的TALE，用Vigorous胶回收试剂盒纯化，回收完后跑胶检测，确定回收产物为单一的条带，如图6所示，图6为四聚体库中质粒pGEM-T-CGTG、pGEM-T-ATCT和pGEM-T-GCAA，分别用Tetramer-F1/Tetramer-R1，Tetramer-F2/Tetramer-R2，Tetramer-F3/Tetramer-R33对引物PCR扩增后，产物TALE-CGTG(1-4)、TALE-ATCT(5-8)、 TALE-GCAA(9-12)（图中顺序依次从左到右）回收后电泳图；460bp的条带为正确扩增的TALE重复单元四聚体。。
2、应用酶切-连接反应组装TALE重复单元四聚体片段并插入骨架载体：
在T4DNA连接酶缓冲液中同时加入等量(约100ng)的TALE-CGTG(1-4)、TALE-ATCT(5-8)、TALE-GCAA(9-12)和200ng pTALEN-Backbone(HD)以及BsmBI和T4DNALigase进行酶切-连接反应，酶切-连接体系如表5.2(与表4.2相同)，反应条件为：首先46℃5min，16℃5min，30个循环；然后55℃3h；最后80℃灭活20min。
表5.2酶切连接反应体系
将3ul上述酶切-连接产物转化50ul感受态细胞DH5α，涂含有Amp的LB培养基平板，37℃培养10h。
3、菌落PCR检测构建的TALEN表达载体
挑取单个菌落，利用引物Seq-F/Seq-R菌落PCR检测TALEN表达载体阳性质粒，引物序列见SEQ No.19-SEQ No.20；
PCR反应体系如表5.3(与表4.3相同)所示，反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性45s，57℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min；检测产物用10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。
表5.3菌落PCR检测TALEN表达载体体系
菌落PCR检测TALEN表达载体结果如图7所示，图7中经菌落PCR检测得到1500bp条带的5个样品为成功构建的TALEN表达载体；其他两个为3个四聚体未完整插入样品或污染样品。
含有约1500bp单一条带的菌落为组装成功的TALEN阳性菌落(图7)，将阳性菌落在含Amp的LB液体培养基中培养12h并提取质粒，阳性质粒用引物Seq-F和Seq-R进行测序，测序结果表明，与鼠Rosa26基因上TCGTGATCTGCAAC序列相对应的TALEN表达载体成功构建。
申请人已经运用上述方法构建了靶向猪ApoE基因、猪内源病毒PERV及鼠Rosa26基因的5对TALEN，共计10个TALEN表达载体。测序结果表明，这些TALEN表达载体均构建成功。菌落PCR鉴定结果表明，该方法产生的阳性克隆率约为65%，这些实例证实了本构建方法的可行性和足够高的成功率。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 西北农林科技大学
<120> TALE重复单元四聚体库的构建方法、TALEN表达载体的构建方法及其应用
<130>
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> TAL-N-F引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<400> 1
cgctctagaa tgtcgcggac ccggctcc 28
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> TAL-C-R引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<400> 2
cgcggatccg ccgaggcagg ccagcgctac 30
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> TALE-F1引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(48)
<400> 3
atatagatgc cgtcctagcg cgtctcctga ccccagagca ggtcgtgg 48
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> TALE-F2引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(49)
<400> 4
tgctctttat tcgttgcgtc ggtctcgact caccccagag caggtcgtg 49
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> TALE-F3引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(49)
<400> 5
tgctctttat tcgttgcgtc ggtctcgcct caccccagag caggtcgtg 49
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> TALE-F4引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(49)
<400> 6
tgctctttat tcgttgcgtc ggtctcgatt aaccccagag caggtcgtg 49
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> TALE-R1引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<400> 7
tcttatcggt gcttcgttct ggtctctgag tccgtgcgct tggcac 46
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> TALE-R2引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<400> 8
tcttatcggt gcttcgttct ggtctctgag gccgtgcgct tggcac 46
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> TALE-R3引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<400> 9
tcttatcggt gcttcgttct ggtctcttaa tccgtgcgct tggcac 46
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> TALE-R4引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<400> 10
aagtatcttt cctgtgccca cgtctcttaa gccgtgcgct tggcac 46
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> T7引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 11
taatacgact cactataggg 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> SP6引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<400> 12
atttaggtga cactatag 18
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> Tetramer-F1引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<400> 13
atatagatgc cgtcctagcg cgtctcctga ccccag 36
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> Tetramer-F2引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(38)
<400> 14
atatagatgc cgtcctagcg cgtctcgctt aaccccag 38
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> Tetramer-F3引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(38)
<400> 15
atatagatgc cgtcctagcg cgtctcggct caccccag 38
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> Tetramer-R1引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<400> 16
aagtatcttt cctgtgccca cgtctcttaa gccgtgc 37
<210> 17
<211> 37
<212> DNA
<213> Tetramer-R2引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<400> 17
aagtatcttt cctgtgccca cgtctctgag cccgtgc 37
<210> 18
<211> 37
<212> DNA
<213> Tetramer-R3引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<400> 18
aagtatcttt cctgtgccca cgtctctgag tccgtgc 37
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Seq-F引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 19
catgaggcga tcgtcggtgt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Seq-R引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 20
aaagctgggc cacgattgac 20
<210> 21
<211> 14
<212> DNA
<213> 靶向鼠Rosa26基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<400> 21
tcgtgatctg caac 14
Claims (9)
1.TALE重复单元四聚体库的构建方法，包括下述步骤：
(1)、PCR扩增TALE单个重复单元：以TALE单个重复片段monomer NI为模板，用TALE-F1/TALE-R1为引物PCR扩增得到TALE单体NI1、NI2、NI3、NI4；以TALE单个重复片段monomer NG为模板，用TALE-F2/TALE-R2为引物PCR扩增得到TALE单体NG1、NG2、NG3、NG4；以TALE单个重复片段monomer HD为模板，用TALE-F3/TALE-R3为引物PCR扩增得到TALE单体HD1、HD2、HD3、HD4；以TALE单个重复片段monomer NN为模板，用TALE-F4/TALE-R4为引物PCR扩增得到TALE单体NN1、NN2、NN3、NN4，其中monomer NI识别A碱基、monomer NG识别T碱基、monomer HD识别C碱基、monomer NN识别G碱基；
(2)、将步骤(1)构建所得的TALE单体插入线性化pGEM-T easy载体中，得到相应的16个TALE单体质粒pGEM-T-NI1、pGEM-T-NI2、pGEM-T-NI3、pGEM-T-NI4、pGEM-T-NG1、pGEM-T-NG2、pGEM-T-NG3、pGEM-T-NG4、pGEM-T-HD1、pGEM-T-HD2、pGEM-T-HD3、pGEM-T-HD4、pGEM-T-NN1、pGEM-T-NN2、pGEM-T-NN3和pGEM-T-NN4；
(3)、在T4DNA连接酶缓冲液中加入TALE单体质粒，同时加入BsaI内切酶和T4DNALigase进行酶切-连接反应，所述TALE单体质粒为pGEMT-Momomer1，pGEMT-Monomer2，pGEMT-Monomer3和pGEMT-Monomer4，得到含256个四聚体质粒的TALE重复单元四聚体库，其中pGEMT-Momomer1为pGEM-T-NI1、pGEM-T-HD1、pGEM-T-NG1或pGEM-T-NN1中的一个，pGEMT-Monomer2为pGEM-T-NI2、pGEM-T-HD2、pGEM-T-NG2或pGEM-T-NN2中的一个，pGEMT-Monomer3为pGEM-T-NI3、pGEM-T-HD3、pGEM-T-NG3或pGEM-T-NN3中的一个，pGEMT-Monomer4为pGEM-T-NI4、pGEM-T-HD4、pGEM-T-NG4或pGEM-T-NN4中的一个。
2.根据权利要求1所述的TALE重复单元四聚体库的构建方法，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增的体系为模板1μL、正向引物1μL、反向引物1μL、10×Taq Buffer 5μL、2.5mmol/L dNTPs 4μL、Taq DNApolymerase 0.5μL和H2O 37.5μL；PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，扩增30个循环；72℃延伸10min。
3.根据权利要求1所述的TALE重复单元四聚体库的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中TALE单体插入线性化pGEM-T easy载体中的具体步骤为TALE单体与末端含T碱基的线性化pGEM-T easy载体连接，连接体系为线性化pGEM-T easy载体1μL、TALE单体1μL、10×T4DNA酶Buffer 1μL、T4连接酶1μL和H2O 6μL。
4.根据权利要求1所述的TALE重复单元四聚体库的构建方法，其特征在于，步骤(3)中的酶切-连接反应体系为pGEMT-Momomer12μL、pGEMT-Momomer22μL、pGEMT-Momomer32μL、pGEMT-Momomer42μL、10×T4DNA酶Buffer 2μL、BsaI 0.5μL、T4连接酶0.5μL和H2O 9μL；反应条件为首先37℃5min，16℃5min，循环30次；16℃10h；65℃20min。
5.TALEN表达载体的构建方法，包括权利要求1-4中所述的TALE重复单元四聚体库的构建过程，该TALEN表达载体的构建方法还包括下述步骤：
(A)、将含14个碱基的靶向序列中由TALEN骨架载体N端决定的第一个T碱基和0.5个重复单元决定的最后一个碱基之间的12个碱基序列按照从N端到C端的顺序分成NNNN(1-4)、NNNN(5-8)和NNNN(9-12)三个碱基组，从权利要求1-4中所述方法构建的TALE重复单元四聚体库中筛选与碱基组对应的pGEM-T-NNNN(1-4)、pGEM-T-NNNN(5-8)和pGEM-T-NNNN(9-12)，其中N为A、T、C或G中的一种；
(B)、以pGEM-T-NNNN(1-4)为模板，用Tetramer-F1/Tetramer-R1引物对进行PCR扩增，得到片段TALE-NNNN(1-4)；以pGEM-T-NNNN(5-8)为模板，用Tetramer-F2/Tetramer-R2引物对进行PCR扩增，得到片段TALE-NNNN(5-8)；以pGEM-T-NNNN(9-12)为模板，用Tetramer-F3/Tetramer-R3引物对进行PCR扩增，得到片段TALE-NNNN(9-12)；
(C)、以pLenti-EF1a-Backbone(N13)为模板，以TAL-N-F/TAL-C-R为引物PCR 扩增，扩增产物经XbaI和BamHI双酶切后与同样经XbaI和BamHI双酶切的pST1374载体进行连接，得到TALEN表达骨架载体pTALEN-Backbone(N13)，其中N13为NI、HD、NG或NN中的一种，能识别靶向序列最后一个碱基；
(D)、在T4DNA连接酶缓冲液中同时加入等量的TALE-NNNN(1-4)、TALE-NNNN(5-8)、TALE-NNNN(9-12)和pTALEN-Backbone(N13)以及BsmBI和T4DNA Ligase进行酶切-连接反应，得到与靶向序列相对应的TALEN哺乳动物细胞表达载体。
6.根据权利要求5所述的TALEN表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(B)中的PCR扩增体系为模板1μL、正向引物2μL、反向引物2μL、10×pfu Buffer 10μL、2.5mmol/L dNTPs5μL、pfu:Taq=4:12μL和H2O 67μL；反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；最后72℃延伸10min。
7.根据权利要求5所述的TALEN表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(C)中的PCR扩增体系为pLenti-EF1a-Backbone(N13)模板1μL、TAL-N-F 1μL、TAL-C-R 1μL、10×pfu Buffer 5μL、2.5mmol/L dNTPs 4μL、Pfu DNA polymerase 0.5μL和H2O37.5μL；连接体系为酶切后的pS T13741μL、酶切后的扩增产物0.5μL、10×T4DNALigase Buffer 1μL、T4DNA Ligase 0.2μL和H2O 7.3μL。
8.根据权利要求5所述的TALEN表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(D)中的酶切-连接反应体系为TALE-NNNN(1-4)2μL、TALE-NNNN(5-8)2μL、TALE-NNNN(9-12)2μL、pTALEN-Backbone(N13)2μL、10×T4DNA Ligase Buffer 1μL、、BsmBI 0.5μL和T4DNA Ligase 0.5μL；反应条件为：首先46℃5min，16℃5min，30个循环；然后55℃3h；最后80℃灭活20min。
9.权利要求5所述的方法在构建靶向鼠Rosa26基因的TALEN哺乳动物细胞表达载体中的应用，包括下述步骤：
(A)、将鼠Rosa26基因的序列TCGTGATCTGCAAC中由TALEN骨架载体N端决定的第一个T碱基和0.5个重复单元决定的最后一个碱基C之间的含12个碱基序列按照从N端到C端的顺序分成CGTG、ATCT和GCAA三个碱基组，从权利要求1-4中所述方法构建的TALE重复单元四聚体库中筛选与碱基组对应的pGEM-T-CGTG、pGEM-T-ATCT和pGEM-T-GCAA；
(B)、以pGEM-T-CGTG为模板，用Tetramer-F1/Tetramer-R1引物对进行PCR扩增，得到质粒TALE-CGTG(1-4)；以pGEM-T-ATCT为模板，用Tetramer-F2/Tetramer-R2引物对进行PCR扩增，得到质粒TALE-ATCT(5-8)；以pGEM-T-GCAA为模板，用Tetramer-F3/Tetramer-R3引物对进行PCR扩增，得到质粒TALE-GCAA(9-12)；其中PCR扩增体系为模板1μL、正向引物2μL、反向引物2μL、10×pfu Buffer 10μL、2.5mmol/LdNTPs5μL、pfu:Taq=4:12μL和H2O 67μL；反应条件为：95℃预变性5min；然后95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环；最后72℃延伸10min。
(C)、以pLenti-EF1a-Backbone(HD)为模板，以TAL-N-F/TAL-C-R为引物PCR扩增，扩增产物经XbaI和BamHI双酶切后与同样经XbaI和BamHI双酶切的pST1374载体进行连接，得到TALEN表达骨架载体pTALEN-Backbone(HD)；其中PCR扩增体系为pLenti-EF1a-Backbone(HD)模板1μL、TAL-N-F 1μL、TAL-C-R 1μL、10×pfu Buffer5μL、2.5mmol/L dNTPs 4μL、Pfu DNA polymerase 0.5μL和H2O 37.5μL；连接体系为酶切后的pS T13741μL、酶切后的扩增产物0.5μL、10×T4DNA Ligase Buffer1μL、T4DNA Ligase 0.2μL和H2O 7.3μL。
(D)、在T4DNA连接酶缓冲液中同时加入等量的TALE-CGTG(1-4)、TALE-ATCT(5-8)、TALE-GCAA(9-12)和pTALEN-Backbone(HD)以及BsmBI和T4DNA Ligase进行酶切-连接反应，得到与靶向序列相对应的TALEN哺乳动物细胞表达载体；其中酶切-连接反应体系为TALE-CGTG(1-4)2μL、TALE-ATCT(5-8)2μL、TALE-GCAA(9-12)2μL、pTALEN-Backbone(HD)2μL、10×T4DNA Ligase Buffer 1μL、、BsmBI 0.5μL和T4DNALigase 0.5μL；反应条件为：首先46℃5min，16℃5min，30个循环；然后55℃3h；最后80℃灭活20min。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130612 |