CN110241117A - 一种双碱基突变的高活性sgRNA骨架、sgRNA骨架载体及其应用 - Google Patents

一种双碱基突变的高活性sgRNA骨架、sgRNA骨架载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双碱基突变的高活性sgRNA骨架、sgRNA骨架载体及其应用，在张峰实验室的sgRNA scaffold载体的基础上通过对该骨架序列两个碱基的改变实现的。PCR获得的高活性骨架片段sgRNA(TTAT)scaffold，通过EcoRI与SpeI位点连入载体pUC19/hU6‑sgRNA backbone中，替换原载体的sgRNA scaffold获得高活性sgRNA骨架载体pU6‑sgRNA(TTAT)scaffold；使用BsaI酶切载体pU6‑sgRNA(TTAT)scaffold，并利用粘性末端连入针对目标基因的sgRNA序列，获得载体pU6‑sgRNA(TTAT)‑target site。能显著提高介导Cas9蛋白的基因组编辑作用，效果明显优于野生sgRNA骨架载体。

Description

一种双碱基突变的高活性sgRNA骨架、sgRNA骨架载体及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种载体，具体涉及一种双碱基突变的高活性sgRNA骨架、sgRNA骨架载体及其应用。
背景技术
CRISPR/Cas9系统是第三代基因编辑技术，依赖sgRNA引导Cas9核酸酶在特定位置进行基因编辑，被广泛用于基因组编辑，在农业、生命科学以及医学领域发挥重要的价值。CRISPR/Cas9系统主要包括两个部分：(1)来自链球菌(S.pyogenes Cas9(SpCas9))的核酸酶；(2)Single guide RNA(sgRNA)，sgRNA表达载体包含20bp特异性可变靶位点和82bp固定不变的sgRNA骨架(sgRNA scaffold)。sgRNA骨架是人为构建的CRISPR靶向识别系统中两个RNA分子(CRISPR RNA(crRNA)、trans-activating CRISPR RNA(tracrRNA))的嵌合体(Jinek，et al.，2012；Hsu P D，et al.，2013)。
crRNA是全长为42bp的RNA，其5’端20bp的碱基可以和基因组目标序列(targetsequence)匹配，其随着目标基因改变。crRNA的3’端为22bp不可变序列，即“repeat”序列，用于和tracrRNA配对。tracrRNA是全长约为87bp的RNA序列，其5’可以和crRNA的3’的“repeat-sequence”配对，称为“anti-repeat”，而剩余序列可以形成多个有发卡环的二级结构。sgRNA就是将原来单独的crRNA和tracrRNA人工嵌合成单一的导向RNA，使其可以发挥原来crRNA和tracrRNA的作用又方便之后的实验操作。目前广泛应用的全长82bp的sgRNA骨架序列来自张峰实验室(Ran F A，et al.，2013；Hsu D，et al.，2013)，该sgRNA骨架也是经过多个团队多次优化的。2012年末，Jennifer A.Doudna和Emmanuelle Charpentier两个团队合作首次提出将crRNA和tracrRNA连接起来成为一个RNA，即sgRNA(Jinek，etal.，2012)，这就是现在通用sgRNA骨架的原型。该sgRNA骨架将crRNA的3’端10个碱基以及tracrRNA的5’碱基19个碱基删除，并且将tracrRNA的3’尾巴切掉一部分，通过GAAA4个碱基将剩下的crRNA和tracrRNA连接起来。该sgRNA后来被张峰团队证明在体内介导Cas9酶的基因编辑效果不够理想。之后2013年初，张峰团队和George M.Church分别在同一期Science杂志对Jennifer A.Doudna的sgRNA进行优化，通过加上tracrRNA的3’尾巴，使得该sgRNA介导的Cas9对目标基因的编辑效果更好更稳定(Cong L，et al.，2013、Mali P，et al.，2013)。2013年6月份，张峰团队又再次对该sgRNA进行评估，认为tracrRNA尾巴对于体内SpCas9的最佳表达和活性至关重要(Hsu PD，et al.，2013)。至此，sgRNA scaffold序列就已成型，其包括12bp crRNA，66bp tracrRNA以及人工添加的4个用于连接crRNA和tracrRNA的碱基GAAA。sgRNA骨架任何序列都很关键，对于Cas9酶的活性介导至关重要，对Cas9核酸酶复合体切割DNA是必需的。
sgRNA表达载体以U6启动子启动sgRNA序列的表达。U6启动子是RNA聚合酶III依赖的启动子，在哺乳动物细胞内引导RNA的转录，U6启动子具有明确的转录起始点G，以连续的5个T序列终止转录，转录产物会在3′端悬挂2-4个寡聚U(Lin X,et al.2004)，且遇到连续的4-5个TTTT也会终止转录。在张峰实验组sgRNA scaffold序列中，除过序列末端有5个连续的T碱基，在sgRNA scaffold起始位点即crRNA的repeat序列也有4个连续的T碱基，申请人推测该序列会影响转录提前终止，从而降低sgRNA scaffold转录，也就间接影响Cas9/sgRNA复合体的基因编辑活力。张峰团队为了解决该问题而将TTTT改为TATT碱基，但是通过T7EndonucleaseⅠ酶切鉴定，结果显示，该突变对其介导Cas9的编辑活力几乎没有提高(HsuPD，et al.，2013)。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种双碱基突变的高活性sgRNA骨架、sgRNA骨架载体及其应用，显著提高CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种双碱基突变的高活性sgRNA骨架，将其命名为sgRNA(TTAT)scaffold，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
一种双碱基突变的高活性sgRNA骨架载体，将其命名为pU6-sgRNA(TTAT)scaffold，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。
一种靶向目标基因的高活性sgRNA骨架载体，是在上述pU6-sgRNA(TTAT)scaffold上，利用粘性末端连入靶向目标基因的sgRNA片段，获得的载体命名为pU6-sgRNA(TTAT)-target site。
优选的，目标基因为人TPI1P2基因、人EMX1基因或者人RANKL基因。
进一步的，靶向人TPI1P2基因的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。
进一步的，靶向人EMX1基因的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
进一步的，靶向人RANKL基因的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示。
所述的靶向目标基因的高活性sgRNA骨架载体在基因组编辑中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明通过改变现有sgRNA骨架序列中的两个碱基，即原sgRNA骨架序列crRNArepeat序列中连续的TTTT碱基替换为TTAT碱基，并将与其对应互补的trancRNA序列中连续AAAA碱基替换为ATAA碱基，形成新的sgRNA骨架，命名为sgRNA(TTAT)scaffold。实验证明sgRNA(TTAT)scaffold可以提高sgRNA转录水平及其介导的Cas9酶切活性，能够使sgRNA引导的CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑和转录调控时，活性增强。这种方法简便易操作，只通过两个碱基的改变就能显著增强sgRNA scaffold的转录水平，从而提高CRISPR/Cas9系统打靶效率，提高基因编辑效率。
本发明所构建的包含sgRNA(TTAT)scaffold的高活性sgRNA骨架载体，能有效介导Cas9蛋白的基因组编辑作用，且高于普通sgRNA载体介导的编辑效果。
本发明构建的高活性sgRNA骨架载体pU6-sgRNA(TTAT)-target site与载体hCas9共转染HEK293细胞，进行了对目标基因的编辑实验，同时将已有通用sgRNA骨架载体与载体hCas9共转染HEK293细胞作对照。实验结果表明，本发明的高活性sgRNA的载体与hCas9载体共转染细胞后，对目标基因可以进行有效编辑，且显著高于已有通用sgRNA载体介导的编辑效果。
附图说明
图1是sgRNA scaffold和sgRNA(TTAT)scaffold序列结构图。
图2是pU6-sgRNA scaffold和pU6-sgRNA(TTAT)scaffold载体结构图。
图3是pU6-sgRNA-target site和pU6-sgRNA(TTAT)-target site载体结构图。
图4是实施例1构建的pU6-sgRNA(TTAT)-TPI1P2载体介导的目标基因编辑效率检测图。
图5是实施例2构建的pU6-sgRNA(TTAT)-EMX1载体介导的目标基因编辑效率检测图。
图6是实施例3构建的pU6-sgRNA(TTAT)-RANKL载体介导的目标基因编辑效率检测图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明的高活性sgRNA骨架载体是在张峰实验室的sgRNA scaffold载体的基础上通过对该sgRNA骨架序列两个碱基的改变实现的。PCR获得的高活性骨架片段sgRNA(TTAT)scaffold，通过EcoRⅠ与SpeⅠ位点连入载体pUC19/hU6-sgRNA scaffold中，替换原载体的sgRNA scaffold获得高活性sgRNA骨架载体pU6-sgRNA(TTAT)scaffold(如图1和图2)；使用BsaⅠ酶切载体pU6-sgRNA(TTAT)scaffold，并利用粘性末端连入针对目标基因的sgRNA序列，获得载体pU6-sgRNA(TTAT)-target site(如图3)。所述粘性末端连入针对目标基因编辑靶点的长度为19或20个核苷酸，退火构成其sgRNA片段的引物序列，所述的针对目标基因的sgRNA序列是针对目标基因编辑靶点，它们是针对TPI1P2基因、EMX1基因或者RANKL基因启动子中的任意一种，但并不只限于这三种。
本发明构建方法，具体步骤为：
(1)PCR合成高活性sgRNA骨架片段sgRNA(TTAT)scaffold；
根据已知sgRNA骨架序列，以骨架上游EcoRⅠ位点为5’起点向下游即3’方向延伸合成上游引物59bp，该上游引物将原sgRNA骨架序列crRNA repeat序列中连续的TTTT碱基替换为TTAT碱基，并将与其对应互补的trancRNA序列中连续AAAA碱基替换为ATAA碱基，即改变原sgRNA骨架两个碱基。以该已知骨架末端下游SpeI位点为5’起点并加上保护碱基向上游即3’方向延伸合成下游引物59bp，上下游引物之间有16bp碱基可以互相匹配。PCR扩增形成5’末端带有EcoRⅠ位点，3’末端带有SpeⅠ位点的长度与原sgRNA scaffold长度相同的高活性sgRNA(TTAT)scaffold片段。
(2)构建pU6-sgRNA(TTAT)scaffold载体
将高活性sgRNA(TTAT)scaffold片段经过EcoRⅠ与SpeⅠ酶切，使用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段，载体pUC19/hU6-sgRNA scaffold通过EcoRⅠ与SpeⅠ酶切后，使用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体；使用T4连接酶将片段sgRNA(TTAT)scaffold与载体pUC19/hU6-sgRNA scaffold连接，产物转化入大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pU6-sgRNA(TTAT)scaffold。
(3)构建靶向人TPI1P2基因的pU6-sgRNA(TTAT)-TPI1P2载体
靶向人TPI1P2基因的sgRNA片段由引物退火形成，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：
正向引物序列为：ACCGCCTAGAGTGGCCACAGTAC；
反向引物序列为：TAACGTACTGTGGCCACTCTAGG。
两条引物用超纯水稀释成浓度为10μM的溶液，各取15μL混合后于室温退火3-4小时。获得的片段即为靶向人TPI1P2基因的sgRNA片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pU6-sgRNA(TTAT)scaffold经BsaI酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，用T4连接酶将靶向人TPI1P2基因的sgRNA片段与经BsaI酶切的载体pU6-sgRNA(TTAT)scaffold连接，产物转化入大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pU6-sgRNA(TTAT)-TPI1P2。
(4)构建靶向人EMX1基因的pU6-sgRNA(TTAT)-EMX1载体
靶向人EMX1基因的sgRNA片段由引物退火形成，引物由上海生工公司合成，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：
正向引物序列为：ACCGAGTCCGAGCAGAAGAAGAA；
反向引物序列为：TAACTTCTTCTTCTGCTCGGACT。
两条引物用超纯水稀释成浓度为10μM的溶液，各取15μL混合后于室温退火3-4小时。获得的片段即为靶向人EMX1基因的sgRNA片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pU6-sgRNA(TTAT)scaffold经BsaI酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，用T4连接酶将靶向人EMX1基因的sgRNA片段与经BsaI酶切的载体pU6-sgRNA(TTAT)scaffold连接，产物转化入大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pU6-sgRNA(TTAT)-EMX1。
(5)构建靶向人RANKL基因的pU6-sgRNA(TTAT)-RANKL载体
靶向人RANKL基因的sgRNA片段由引物退火形成，引物由上海生工公司合成，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：
正向引物序列为：ACCGGCTTCTTCTTCTTCTCTCT；
反向引物序列为：TAACAGAGAGAAGAAGAAGAAGC。
两条引物用超纯水稀释成浓度为10μM的溶液，各取15μL混合后于室温退火3-4小时。获得的片段即为靶向人RANKL基因的sgRNA片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pU6-sgRNA(TTAT)scaffold经BsaI酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，用T4连接酶将靶向人RANKL基因的sgRNA片段与经BsaI酶切的载体pU6-sgRNA(TTAT)scaffold连接，产物转化入大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pU6-sgRNA(TTAT)-RANKL。
以下是发明人给出的具体实施例，需要说明的是，以下的实施例是较佳的例子，本发明并不限于这些实施例。
实施例1：
本实施例构建的表达靶向人TPI1P2基因的高活性sgRNA载体pU6-sgRNA(TTAT)-TPI1P2如下：
高活性sgRNA(TTAT)scaffold中，将原骨架序列crRNA repeat序列中连续的TTTT碱基替换为TTAT碱基，并将与其对应互补的trancRNA序列中连续AAAA碱基替换为ATAA碱基，即改变原sgRNA骨架两个碱基(图1)。利用PCR合成该高活性sgRNA(TTAT)scaffold片段：
上游引物序列SEQ.ID.NO.2如下：
GAATTCGGTCTCCGTTATAGAGCTAGAAATAGCAAGTTATAATAAG GCTAGTCCGTTAT
下游引物序列SEQ.ID.NO.3如下：
TACTAGTAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATA ACGGACTAGCCTT
5’端包含EcoRⅠ且3’端包含SpeⅠ酶切位点的sgRNA(TTAT)scaffold骨架的完整序列SEQ.ID.NO.1为：
GAATTCGGTCTCCGTTATAGAGCTAGAAATAGCAAGTTATAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTACTAGT
高活性sgRNA骨架载体pU6-sgRNA(TTAT)scaffold中，U6启动子序列SEQ.ID.NO.8如下：
GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGAC
完整表达元件U6-sgRNA(TTAT)scaffold部分的序列SEQ.ID.NO.4为：
GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGAGACCGAATTCGGTCTCCGTTATAGAGCTAGAAATAGCAAGTTATAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTA
在两个BsaⅠ中插入的靶向人TPI1P2基因的sgRNA片段的序列SEQ.ID.NO.5如下：
CCTAGAGTGGCCACAGTAC。
上述的表达靶向人TPI1P2基因的高活性pU6-sgRNA(TTAT)-TPI1P2的载体构建方法步骤如下：
1、合成将原骨架序列crRNA repeat序列中连续的TTTT改为TTAT碱基和trancRNA序列中与其对应互补的连续AAAA改为ATAA碱基的高活性sgRNA骨架所需的两条引物，普通PCR获得目标高活性sgRNA(TTAT)scaffold骨架；
根据已知序列和发明人设计，由上海生工公司合成5’前端带有EcoRⅠ位点的上游引物P1如SEQ.ID.NO.2，5’前端带有SpeⅠ位点的下游引物P2如SEQ.ID.NO.3。在该上下游引物中，有16bp(互补序列双下划线表示)碱基完全互相匹配(引物如下)：
以该引物为模板，使用普通PCR扩增合成sgRNA(TTAT)scaffold骨架片段
反应体系：
聚合酶链式反应的条件是：98℃15秒，98℃10秒，60℃30秒，72℃10秒，72℃5分钟，25个循环。
2、构建pU6-sgRNA(TTAT)scaffold载体
将sgRNA(TTAT)scaffold骨架片段经过EcoRⅠ与SpeⅠ酶切，使用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段，载体pUC19/hU6-sgRNA scaffold通过EcoRⅠ与SpeⅠ酶切后，使用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体；使用T4连接酶将片段sgRNA(TTAT)scaffold与载体pUC19/hU6-sgRNA scaffold连接，连接条件为：pUC19/hU6-sgRNA scaffold载体0.5μL，sgRNA(TTAT)scaffold片段4.5μL，T4-ligation Mix5μL，25℃反应20min后转化感受态细胞DH5α，并涂布于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养液中，14小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pU6-sgRNA(TTAT)scaffold载体，该pU6-sgRNA(TTAT)scaffold载体结构图(如图2)所示。
3、构建靶向人TPI1P2基因的pU6-sgRNA(TTAT)-TPI1P2载体
设计的靶向人TPI1P2基因的sgRNA片段由引物退火形成，引物由上海生工公司合成，上游引物P3即SEQ.ID.NO.9，下游引物P4即SEQ.ID.NO.10(下划线表示粘性末端序列)：
P3：ACCGCCTAGAGTGGCCACAGTAC；
P4：TAACGTACTGTGGCCACTCTAGG。
两条引物用超纯水稀释成浓度为10μM的溶液，各取15μL混合后于室温退火3-4小时。获得的片段即为靶向人TPI1P2基因的sgRNA片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pU6-sgRNA(TTAT)scaffold经BsaⅠ酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，将靶向人TPI1P2基因的sgRNA片段与经BsaⅠ酶切的载体pU6-sgRNA(TTAT)scaffold连接，连接条件为：pUC19/hU6-sgRNA scaffold载体0.5μL，靶向人TPI1P2基因的sgRNA片段4.5μL，T4-ligation Mix缓冲液5μL，25℃反应20min后转化感受态细胞DH5α，并涂布于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落接种到含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养液中，14小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pU6-sgRNA(TTAT)-TPI1P2。
实施例2：
本实施例构建的表达靶向人EMX1基因的高活性sgRNA载体pU6-sgRNA(TTAT)-EMX1如下：
实施例1中靶向人TPI1P2基因的sgRNA片段由靶向人EMX1基因的sgRNA片段替换。在两个BsaⅠ中插入的靶向人EMX1基因的sgRNA片段的序列SEQ.ID.NO.6如下：
AGTCCGAGCAGAAGAAGAA。
载体的其它结构与实施例1相同。
其构建方法步骤3中，构建靶向人EMX1基因的pU6-sgRNA(TTAT)-EMX1载体的方法是：
靶向人EMX1基因的sgRNA片段由引物退火形成，引物由上海生工公司合成，上游引物P5即SEQ.ID.NO.11，下游引物P6即SEQ.ID.NO.12，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：
P5：ACCGAGTCCGAGCAGAAGAAGAA；
P6：TAACTTCTTCTTCTGCTCGGACT。
其余构建方法与实施例1相同，构建成表达靶向人EMX1基因的的高活性sgRNA载体pU6-sgRNA(TTAT)-EMX1。
实施例3：
本实施例构建的表达靶向人RANKL基因的高活性sgRNA载体pU6-sgRNA(TTAT)-RANKL如下：
实施例1中靶向人TPI1P2基因的sgRNA片段由靶向人RANKL基因的sgRNA片段替换。在两个BsaⅠ中插入的靶向人RANKL基因的sgRNA片段的序列SEQ.ID.NO.7如下：
GCTTCTTCTTCTTCTCTCT。
载体的其它结构与实施例1相同。
其构建方法步骤3中，构建靶向人RANKL基因的pU6-sgRNA(TTAT)-RANKL载体的方法是：
靶向人RANKL基因的sgRNA片段由引物退火形成，引物由上海生工公司合成，上游引物P7即SEQ.ID.NO.13，下游引物P8即SEQ.ID.NO.14，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：
P7：ACCGGCTTCTTCTTCTTCTCTCT；
P8：TAACAGAGAGAAGAAGAAGAAGC。
其余构建方法与实施例1相同，构建成表达靶向人RANKL基因的的高活性sgRNA载体pU6-sgRNA(TTAT)-RANKL。
为了验证构建的高活性sgRNA骨架载体有益效果，发明人采用实施例1构建的表达靶向人TPI1P2基因的高活性sgRNA载体pU6-sgRNA(TTAT)-TPI1P2，实施例2构建的表达靶向人EMX1基因的高活性sgRNA的载体pU6-sgRNA(TTAT)-EMX1，实施例3构建的表达靶向人RANKL基因的高活性sgRNA的载体pU6-sgRNA(TTAT)-RANKL，并进行了实验，实验情况如下：
1、表达靶向人TPI1P2基因的高活性sgRNA的载体对目标基因的编辑效率
将未经修饰的通用型sgRNA骨架载体命名为pUC19/hU6-sgRNA scaffold，在本实验中作为阳性对照。载体pUC19/hU6-sgRNA scaffold中也插入了靶向人TPI1P2基因的sgRNA片段，上游引物为P3即SEQ.ID.NO.9，下游引物为P9即SEQ.ID.NO.15(AAACGTACTGTGGCCACTCTAGG，仅将引物P4第一个碱基从T变为A)其方法与实施例1中构建方法步骤3相同，获得的载体命名为pU6-sgRNA-TPI1P2。接种HEK293细胞于6孔板，每孔4×105个细胞，共同转染表达Cas9的蛋白的载体hCas9(Addgene，#41815)与pU6-sgRNA(TTAT)-TPI1P2进入细胞；而同时，共同转染表达Cas9的蛋白的载体hCas9与pU6-sgRNA-TPI1P2进入细胞，作为阳性对照。72小时后提取细胞基因组DNA。使用巢式PCR扩增基因组中包含编辑位点的区域。
外巢反应：
上游引物P10即SEQ.ID.NO.16，下游引物P11即SEQ.ID.NO.17：
P10:AAGGCTCTCCGTGGAAGTTG；
P11:AGTGCAAAGGACTAGCAGCA。
反应体系：
聚合酶链式反应的条件是：95℃3分钟，95℃15秒，56℃15秒，72℃60秒，72℃5分钟，30个循环。
内巢反应：
上游引物P12即SEQ.ID.NO.18，下游引物P13即SEQ.ID.NO.19：
P12:GTACACTACAAACGGCCTCCT；
P13:AGCTGTAAGCAGAATGAAGACCT。
反应体系：
聚合酶链式反应的条件是：95℃3分钟，95℃15秒，56℃15秒，72℃30秒，72℃5分钟，30个循环。
所获得的PCR产物经过PCR仪器变性退火的程序是：
95℃，5分钟；95℃-85℃，每秒降低2℃(-2℃/s)；85℃-25℃，每秒降低0.1℃(-0.1℃/s)。
PCR变性退火产物经过质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收后，测量含量，然后使用经典的T7 EndonucleaseⅠ内切酶检测法检测各组中目标基因的编辑效率。具体方法如下：每组取PCR产物DNA 500ng，0.5μL的T7 EndonucleaseⅠ(NEB,M0302S)内切酶，2μL的10×Buffer，补水至总体积20μL。37℃，反应25分钟。结束后进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。T7 EndonucleaseⅠ内切酶能够将PCR产物中不配对的部分切断，如果PCR产物被切开成两条小的条带，则说明其在目标位置发生了基因组编辑，产生了碱基突变，而两条小的条带的亮度越亮，则说明基因组编辑的效率越高。结果见图4所示，在相同的转染条件下，与Control组(阴性对照，空转Cas9质粒细胞)相比，pU6-sgRNA-TPI1P2与pU6-sgRNA(TTAT)-TPI1P2均能介导Cas9进行基因组编辑，但载体pU6-sgRNA(TTAT)-TPI1P2介导Cas9进行基因组编辑的效应强于pU6-sgRNA-TPI1P2。此结果说明，经过碱基改变以后的高活性sgRNA表达载体介导Cas9对人TPI1P2位点基因组编辑的效应高于普通sgRNA载体。
2、表达靶向人EMX1基因的高活性sgRNA的载体对目标基因的编辑效率
发明人将在验证实验1中使用的载体pUC19/hU6-sgRNA scaffold中也插入了靶向人EMX1基因的sgRNA序列，上游引物为P5即SEQ.ID.NO.11，下游引物为P14即SEQ.ID.NO.20(AAACTTCTTCTTCTGCTCGGACT，仅将引物P6的第一个碱基从T变为A)，其方法与实施例1中构建方法步骤3相同，获得的载体命名为pU6-sgRNA-EMX1。接种HEK293细胞(同实验1)后并转染表达Cas9的蛋白的载体hCas9(Addgene，#41815)与pU6-sgRNA(TTAT)-EMX1进入细胞；以及共同转染表达Cas9的蛋白的载体hCas9与pU6-sgRNA-EMX1进入细胞，作为阳性对照。72小时后提取细胞基因组DNA并使用巢式PCR扩增基因组中包含编辑位点的区域。
外巢反应：
上游引物P15即SEQ.ID.NO.21，下游引物P16即SEQ.ID.NO.22：
P15:GGAGCAGCTGGTCAGAGGGG；
P16:GGGAAGGGGGACACTGGGGA。
反应体系：
聚合酶链式反应的条件是：95℃3分钟，95℃15秒，60℃15秒，72℃42秒，72℃5分钟，30个循环。
内巢反应：
上游引物P16即SEQ.ID.NO.23，下游引物P17即SEQ.ID.NO.24：
P17:GCCTGAGTGTTGAGGCCC；
P18:GAAGGCCAAGTGGTCCCAG。
反应体系：
聚合酶链式反应的条件是：95℃3分钟，95℃15秒，60℃15秒，72℃42秒，72℃5分钟，30个循环。
所获得的PCR产物经过PCR变性退火并进行T7EⅠ酶切，具体操作同实验1。结果见图5所示，虽然相同的转染条件下，pU6-sgRNA-EMX1与pU6-sgRNA(TTAT)-EMX1均能介导Cas9进行基因组编辑，但是载体pU6-sgRNA(TTAT)-EMX1介导Cas9进行基因组编辑的效应强于pU6-sgRNA-EMX1。此结果说明，经过碱基改变以后的高活性sgRNA表达载体介导Cas9对人EMX1位点基因组编辑的效应高于普通sgRNA载体。
3、表达靶向人RANKL基因的高活性sgRNA的载体对目标基因的编辑效率
发明人将在验证实验1中使用的载体pUC19/hU6-sgRNA scaffold中也插入了靶向人RANKL基因的sgRNA序列，上游引物为P7即SEQ.ID.NO.13，下游引物将P19即SEQ.ID.NO.25(TAACAGAGAGAAGAAGAAGAAGC，仅将引物P8中的第一个碱基从T变为A)，其方法与实施例1中构建方法步骤3相同，获得的载体命名为pU6-sgRNA-RNAKL。接种HEK293细胞(同实验1)后并转染表达Cas9的蛋白的载体hCas9(Addgene，#41815)与pU6-sgRNA(TTAT)-RANKL进入细胞；以及共同转染表达Cas9的蛋白的载体hCas9与pU6-sgRNA-RANKL进入细胞，作为阳性对照。72小时后提取细胞基因组DNA并使用巢式PCR扩增基因组中包含编辑位点的区域。
外巢反应：
上游引物P20即SEQ.ID.NO.26，下游引物P21即SEQ.ID.NO.27：
P20:TTGCTAGGGCAACAAGTGGA；
P21:TGGCCTCTGGATCTCACCAA。
反应体系：
聚合酶链式反应的条件是：95℃3分钟，95℃15秒，62℃15秒，72℃2分钟，72℃5分钟，30个循环。
内巢反应：
上游引物P22即SEQ.ID.NO.28，下游引物P23即SEQ.ID.NO.29：
P22:TCACCCAATGCAGAGCTGAAG；
P23:TCTCTGATGTTTGTGGGGGAAG。
反应体系：
聚合酶链式反应的条件是：95℃3分钟，95℃15秒，60℃15秒，72℃25秒，72℃5分钟，30个循环。
所获得的PCR产物经过PCR变性退火并进行T7EⅠ酶切，具体操作同实验1。结果见图6所示，虽然相同的转染条件下，pU6-sgRNA-RANKL与pU6-sgRNA(TTAT)-RANKL均能介导Cas9进行基因组编辑，但是载体pU6-sgRNA(TTAT)-RANKL介导Cas9进行基因组编辑的效应强于pU6-sgRNA-RANKL。此结果说明，经过碱基改变以后的高活性sgRNA表达载体介导Cas9对人RANKL位点基因组编辑的效应高于普通sgRNA载体。
上述实验1、实验2和实验3说明，高活性sgRNA的载体介导Cas9对目标位点基因组编辑的效应显著强于普通sgRNA载体。
序列表
<110> 西安交通大学
<120> 一种双碱基突变的高活性sgRNA骨架、sgRNA骨架载体及其应用
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcggtc tccgttatag agctagaaat agcaagttat aataaggcta gtccgttatc 60
aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct tttttactag t 101
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaattcggtc tccgttatag agctagaaat agcaagttat aataaggcta gtccgttat 59
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tactagtaaa aaagcaccga ctcggtgcca ctttttcaag ttgataacgg actagcctt 59
<210> 4
<211> 353
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg ggagaccgaa ttcggtctcc gttatagagc tagaaatagc aagttataat 300
aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tta 353
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctagagtgg ccacagtac 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtccgagca gaagaagaa 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcttcttctt cttctctct 19
<210> 8
<211> 241
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
c 241
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
accgcctaga gtggccacag tac 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taacgtactg tggccactct agg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
accgagtccg agcagaagaa gaa 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
taacttcttc ttctgctcgg act 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
accggcttct tcttcttctc tct 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
taacagagag aagaagaaga agc 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaacgtactg tggccactct agg 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaggctctcc gtggaagttg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agtgcaaagg actagcagca 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtacactaca aacggcctcc t 21
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agctgtaagc agaatgaaga cct 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaacttcttc ttctgctcgg act 23
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggagcagctg gtcagagggg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gggaaggggg acactgggga 20
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcctgagtgt tgaggccc 18
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaaggccaag tggtcccag 19
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
taacagagag aagaagaaga agc 23
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ttgctagggc aacaagtgga 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tggcctctgg atctcaccaa 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcacccaatg cagagctgaa g 21
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tctctgatgt ttgtggggga ag 22

Claims (8)

1.一种双碱基突变的高活性sgRNA骨架，其特征在于，将其命名为sgRNA(TTAT)scaffold，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.一种双碱基突变的高活性sgRNA骨架载体，其特征在于，将其命名为pU6-sgRNA(TTAT)scaffold，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。
3.一种靶向目标基因的高活性sgRNA骨架载体，其特征在于，是在权利要求3所述的pU6-sgRNA(TTAT)scaffold上，利用粘性末端连入靶向目标基因的sgRNA片段，获得的载体，命名为pU6-sgRNA(TTAT)-target site。
4.根据权利要求3所述的靶向目标基因的高活性sgRNA骨架载体，其特征在于，目标基因为人TPI1P2基因、人EMX1基因或者人RANKL基因。
5.根据权利要求4所述的靶向目标基因的高活性sgRNA骨架载体，其特征在于，靶向人TPI1P2基因的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。
6.根据权利要求4所述的靶向目标基因的高活性sgRNA骨架载体，其特征在于，靶向人EMX1基因的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。
7.根据权利要求4所述的靶向目标基因的高活性sgRNA骨架载体，其特征在于，靶向人RANKL基因的sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示。
8.权利要求3-7任一项所述的靶向目标基因的高活性sgRNA骨架载体在基因组编辑中的应用。
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