CN105154436A - 包含突变的核酸内切酶识别区dna及其基因组编辑应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种包含突变的基因组编辑核酸内切酶靶向识别区段的DNA及其在基因组编辑中的应用，其中所述的DNA包括1)人工编辑的目标敲入序列；和2)突变的核酸内切酶识别区序列；和3)两侧同源臂序列。本发明还提供包含上述DNA的载体、系统、细胞及其上述产品在提高基因组编辑效率、制备基因修饰细胞及动物模型、制备采用基因治疗的疾病的药品等方面的应用。采用本发明的DNA及其后续产品能避免在已成功完成DNA编辑的特定基因组序列上，再次或多次发生核酸内切酶介导的双链切断和NHEJ修复，从而极大地提高基因编辑效率，避免错误突变。

Description

包含突变的核酸内切酶识别区DNA及其基因组编辑应用

技术领域

本发明涉及基因工程与基因治疗领域，具体涉及一种通过突变基因组编辑核酸内切酶的靶向识别位点DNA序列，提高基因敲入效率并有效降低突变频率的方法，从而改善基因修饰细胞、动物模型的构建与人类疾病的基因治疗。

背景技术

基因组编辑(Genomeediting)是利用基因工程方法改造基因组上的特定序列,以实现特定的点突变(碱基修复)，序列敲除或敲入。近些年来，基因组编辑技术得到了长足的发展，并在很多领域大放异彩。目前，基因组编辑最主要的应用包括人类疾病的基因治疗和基础科学研究中的基因修饰细胞、动物模型的构建。

基因治疗是将外源正常基因或治疗性基因通过一定方式导入人体靶细胞，以达到纠正人体的原有缺陷基因或治疗疾病的治疗方法。对缺陷基因的纠正即可以通过在原位对缺陷基因进行修复，也可以通过在基因组其他位置引入正常基因或治疗性基因，实现对缺陷基因的功能增强或功能缺失。在传统的研究与医学实践中，基因治疗主要通过以下两种途径来实现：一、通过同源重组(Homologousrecombination)或基因打靶(Genetargeting)技术原位修复缺陷基因；二、通过整合的或非整合的途径将正确基因或治疗性基因片段导入靶细胞。传统的同源重组或基因打靶技术技术要求较高，同时效率低下。而通过将外源基因补充到基因组的方法，虽然能一定程度治疗疾病，但并未清除缺陷基因，同时外源基因随机整合会带来致癌等风险。高效精确地在缺陷基因原位进行修正或在特定基因位点引入治疗性基因是最理想的基因治疗模式，同时也是目前大家研究的热点。

基因治疗的最主要应用是治疗人类遗传病。遗传病是指遗传物质的改变(包括染色体畸变及基因突变)而导致的疾病。例如染色体数量异常导致的21三体综合征、多基因遗传病唇裂和HBB单基因突变导致的地中海贫血症等。由于医学的不断发展与进步，人类已经对多种遗传病的发生过程有了比较清楚的认识，并针对性地开发了多种治疗手段用于治疗或缓解病人的症状。例如，苯丙酮尿症和肝豆状核变性等遗传病会导致代谢阻碍或失衡，可通过改变饮食或服用药物予以纠正、缓解。然而，这些治疗手段往往治标不治本，要么效果有限，要么需终身防治。基因治疗是治疗遗传病的最彻底、最有效的方式。

除遗传病之外，其他一些人类疾病也可以通过基因治疗实现最彻底的治愈。例如，通过失活CCR5基因可以保护人类免疫系统免受艾滋病病毒的侵袭以防治传染病。通过向患者输入表达外源抗肿瘤基因的淋巴细胞可以杀死黑色素瘤等肿瘤细胞以治疗肿瘤。通过在造血干细胞中敲入基因工程改造的特异抗体基因以消除白血病或抗感染。目前，基因治疗大多都停留在实验室研究或动物实验上，尚未进行大规模的临床实践。

基础科学研究中的基因修饰细胞、动物模型的构建是基因组编辑的另一大应用。在基因功能研究中，携带特定基因修饰的细胞和动物模型是极其重要的实验材料。传统的制备方法包括：(1)首先制备携带预期突变或修饰的基因序列，通过质粒转染或病毒转导等途径随机整合到细胞基因组中，得到表达外源突变基因的细胞系或动物模型。(2)通过基因打靶技术在胚胎干细胞上对相应位点进行突变，得到基因突变胚胎干细胞或继而得到相应的基因突变动物。方法(1)由于随机整合，插入位点不一，表达模式跟原基因可能不一致。方法(2)可实现定点突变，且方法成熟，缺点是周期较长，技术要求比较高。

利用核酸内切酶定点靶向基因组(Endonuclease-mediatedgenomeediting，EMGE)的技术是近年来发展起来的一种高效基因组编辑技术，可以实现随机或者特定碱基的点突变，序列敲除或敲入。该技术利用基因组编辑核酸内切酶识别特异的基因组序列，其内切酶活性能造成识别序列内或者附近的基因组DNA双链断裂(Doublestrandbreak,DSB)，然后利用细胞中的DNA修复机制实现基因组编辑(包括定点突变，序列敲除或敲入)。

细胞中有两种主要的DNA修复机制：同源重组(Homologousrecombination,HR)和非同源重组末端连接(Non-homologousend-joining,NHEJ)。HR修复是以内源或外源序列相同DNA为模板，以同源重组的方式修复断裂DNA，这种修复方式通常能完美修复基因组。利用核酸内切酶介导的特定基因组区域DSB和HR的DNA修复机制能实现特定人工DNA序列的基因组序列替换，也就是特定碱基点突变、特定人工序列的敲除或者特定人工序列的敲入。NHEJ是无需同源重组模板直接将断裂的DNA强行连接在一起的修复方式，这种不精确的修复方式往往会导致随机的碱基缺失、插入或突变。利用核酸内切酶介导的特定基因组区域DSB和NHEJ的DNA修复机制能产生随机的点突变，序列敲除或敲入。

目前已经有三种能用于基因组编辑的核酸内切酶，分别是ZFN(锌指核酸内切酶)、TALEN(转录因子激活样效应器内切酶)和CRISPR-Cas9系统。ZFN和TALEN的工作原理类似，这两类核酸内切酶均由两部分融合而成，即N端的核酸识别结构域跟C端的内切酶FokI。ZFN是通过锌指结构域识别特定的三联体碱基，而TALEN是利用一种植物病原菌中的TALE结构域识别单个碱基。当人工串联多个特定碱基识别的锌指结构域或TALE结构域，便能实现识别特定碱基序列的目的。核酸内切酶FokI需形成二聚体才具有酶切活力，能够在基因组上定点切割造成DNA双链断裂(Doublestrandbreak,DSB)。因此，当成对ZFNs或TALENs探针(DNA、mRNA或蛋白)被引入细胞之后便能实现基因组定点切割，以实现由NHEJ修复导致的基因突变或基于同源重组的基因修复、序列敲入。

CRISPR-Cas9系统是最新出现的第三类基因组编辑工具。CRISPR-Cas9系统源于细菌的一种免疫防御机制，用于抵御外来质粒或病毒对细菌的侵染。该系统包括三个组分，分别是crRNA、tracrRNA和Cas9。crRNA5’端通过碱基互补配对的方式靶向基因组特定位点，tracrRNA通过局部互补配对结合crRNA3’端,并与核酸内切酶Cas9形成复合物。随后Cas9分别在DNA的两条链上进行切割，进而形成DNA双链断裂。经过众多科学家的不断研究与改进，将crRNA和tracrRNA融合成一条模拟其局部互补配对构象的嵌合RNA，简称靶向RNA，也能有效地介导Cas9的特异切割。即该系统可以简化为一个Cas9酶和一条靶向RNA(GuideRNA,gRNA)。

核酸内切酶介导的基因组编辑已被广泛应用于在不同物种(植物、动物、微生物等)，不同实验体系(细胞系、干细胞、小鼠等)中的基因敲除与基因敲入。其在人类遗传病的基因治疗研究中也大显身手，基于定点的基因敲入技术，世界上已有多个研究组通过ZFN、TALEN或CRISPR-Cas9技术修复了地中海贫血症等疾病细胞中的基因突变。

尽管有成功例子，但是目前基因组编辑的效率较低，尤其是利用HR的特定单碱基或少量碱基的靶向编辑(突变或者修复)效率更差，且易引入额外的或者错误的碱基突变。当前技术所存在的问题严重影响了其在人类疾病的基因治疗和基因修饰细胞、动物模型构建中的广泛应用，急需克服其潜在的问题并释放出其最大的效能。如何精确且高效地进行基于HR的基因组编辑是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是建立一种通过构建特殊的同源重组DNA模板，避免基因组编辑核酸内切酶在已成功编辑(特定突变或者修复)的基因组DNA靶点上的二次切割和突变(类似于脱靶效应)，固化已成功进行的同源重组介导的基因组编辑，从而提高基因敲入效率和正确率的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种用作基因组编辑的同源重组模板DNA，其中，所述DNA包括1)人工编辑的目标敲入序列；和2)突变的基因组编辑核酸内切酶的识别区；和3)两侧同源臂序列。其中，所述1)人工编辑的目标敲入序列是来源于细胞基因组上待编辑的对应目标DNA序列，经人工完成了所需的特定点突变(Pointmutations)、特定插入突变(Insertion)或者特定删除突变(Deletion)。对基因治疗的疾病而言，上述对应的编辑方式也称为特定碱基修复，修复DNA片段缺失和消除DNA片段插入。所述2)突变的核酸内切酶识别区是来源于基因组上核酸内切酶识别区域的对应DNA序列，并且在该序列上已经完成碱基突变，目的在于避免被基因组编辑核酸内切酶识别，防止在已经完成同源重组介导的基因编辑(碱基突变或修复)的基因组DNA上再次发生核酸内切酶介导的双链切割和NHEJ修复。所述3)两侧同源臂序列与待编辑的细胞基因组DNA序列完全相同，其能与对应的基因组发生同源重组，从而介导人工编辑的目标敲入序列和突变的识别区序列替代基因组中原有的对应DNA区域。该DNA的结构与组成见图1。

优选的，所述DNA既可以是合成的单链DNA，也可以是双链DNA。所述双链DNA既可以是线性化的，也可以是被克隆在环状质粒中。

优选的，目标敲入序列可位于突变的基因组编辑核酸内切酶的识别区内，也可以位于突变的基因组编辑核酸内切酶的识别区的两侧。

优选的，相对于待编辑细胞基因组DNA上对应序列,所述突变的基因组编辑核酸内切酶的识别区序列具有至少1个碱基突变。

更优选的，所述基因组编辑核酸内切酶的识别区的碱基突变原则是在不改变蛋白编码或者基因组功能的条件下，引入足够多的突变碱基，以最大限度地避免被再次识别的可能。

更优选的，所述基因组编辑核酸内切酶的识别位点的碱基突变原则包括：(1)如果识别位点位于蛋白编码区，在考虑物种密码子使用偏好的基础上按照密码子简并的规则进行同义突变；(2)如果识别位点位于内含子，则按照不突变可能会影响mRNA剪接或其他生物学功能的序列，而其他序列可随意突变的原则进行突变。(3)根据基因组编辑核酸内切酶种类的不同，引入足够多的突变碱基，以最大限度地避免被再次识别的可能。

优选的，所述基因敲入包括对特定碱基进行点突变(对疾病治疗而言，称碱基修复)，插入特定DNA片段(对疾病治疗而言，称修复DNA片段缺失)和引入特定DNA片段缺失(对疾病治疗而言，称消除DNA片段插入)。

优选的，所述两侧同源臂长度视目标敲入序列长度而定，一般大于50bp，且两侧同源臂长度尽可能相近。

优选的，所述基因组编辑核酸内切酶是任何能识别特定DNA序列的核酸内切酶。更优选的，所述基因组编辑核酸内切酶包括任何通过识别特异基因组序列并剪切靶点序列的单链或者双链DNA的核酸内切酶，包括但不仅限于ZFN、TALEN、Cas9等。

进一步的，一方面，所述基因组编辑核酸内切酶是Cas9或者类似作用原理的酶，所述基因组编辑核酸内切酶的识别区包括靶向RNA识别区及后随NGG序列。

更优选的，所述靶向RNA识别区及后随NGG序列覆盖目标敲入序列。

更优选的，所述靶向RNA识别区在靠近NGG序列的位置(NGG序列上游的13个碱基)发生同义突变。

更优选的，所述靶向RNA识别区至少1个碱基突变。

更优选的，所述NGG序列被同义突变成非NGG序列。

第二方面，所述基因组编辑核酸内切酶是TALEN，所述突变的基因组编辑核酸内切酶的识别区来源于对成对TALE结构域识别序列的碱基突变。

更优选的，所述TALE识别区及成对TALE识别区之间的序列覆盖目标敲入序列。

更优选的，所述每个TALE识别区至少1个突变

第三方面，所述基因组编辑核酸内切酶是ZFN，所述突变的基因组编辑核酸内切酶的识别区来源于对成对锌指结构识别序列的碱基突变。

更优选的，所述锌指结构域识别区及成对锌指结构域识别区之间的序列覆盖目标敲入序列。

更优选的，所述每个ZFN识别区至少1个突变。

本发明还提供一种载体，其中，所述载体包括上述DNA。

优选的，所述载体包括但不仅限于质粒、病毒等。

本发明还提供一种基因组编辑核酸内切酶系统，所述系统包括上述DNA。

优选的，所述系统是CRISPR-Cas9系统。进一步的，所述系统中任何位于NGG前的20个碱基均可作为靶向RNA识别位点，

更优选的，该靶向RNA识别位点在基因组其他区域无完全相同序列。

更优选的，该靶向RNA识别位点在基因组其他区域的可能脱靶位点的不匹配碱基对不少于3对。

更优选的，所述靶向RNA通过包括并不限于pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)等质粒表达。进一步的，所述靶向RNA也可通过慢病毒、腺病毒等病毒载体表达。进一步的，所述靶向RNA也可通过T3、T7或SP6等启动子体外转录而成。

进一步的，所述系统中Cas9蛋白通过包括并不限于pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)等质粒表达。进一步的，所述Cas9也可通过慢病毒、腺病毒等病毒载体表达。进一步的，所述Cas9也可通过T3、T7或SP6等启动子体外转录成mRNA，并进一步通过核酸递呈技术转运到细胞内翻译成蛋白质。

优选的，所述系统是TALEN系统。进一步的，所述系统通过一对TALEN蛋白识别特定的两段相邻DNA序列来介导定点的基因组编辑。

更优选的，所述两段相邻DNA序列间隔14-25个碱基。

更优选的，所述两段相邻DNA序列长度各为16-50个碱基，一般为20个碱基。

进一步的，所述系统中TALEN蛋白通过包括并不限于pCS2-Pease-T等质粒表达。进一步的，所述TALEN蛋白也可通过慢病毒、腺病毒等病毒载体表达。进一步的，所述TALEN蛋白也可通过T3、T7或SP6等启动子体外转录成mRNA，并进一步通过核酸递呈技术转运到细胞内翻译成蛋白质。

优选的，所述系统是ZFN系统。进一步的，所述系统通过一对ZFN蛋白识别特定的两段相邻DNA序列来介导定点的基因组编辑。

更优选的，所述两段相邻DNA序列间隔14-25个碱基。

更优选的，所述两段相邻DNA序列长度各为3到6个三联体碱基，即9至18个碱基。

进一步的，所述系统中ZFN蛋白通过包括并不限于pcDNA3.1等质粒表达。进一步的，所述ZFN蛋白也可通过慢病毒、腺病毒等病毒载体表达。进一步的，所述ZFN蛋白也可通过T3、T7或SP6等启动子体外转录成mRNA，并进一步通过核酸递呈技术转运到细胞内翻译成蛋白质。

本发明还提供一种细胞，其中，所述细胞通过核酸递呈技术被转入了上述同源重组模板DNA、载体、或者系统，或者基因组编辑核酸内切酶载体或mRNA、靶向RNA载体或体外转录的靶向RNA。

优选的，所述细胞包括但不仅限于包括293FT细胞在内的各种细胞系、受精卵、不同类型干细胞等。

本发明还提供一种上述DNA、载体、系统或者细胞在提高基因敲入效率中的用途。本发明还提供一种提高基因敲入效率的方法，包括利用上述DNA、载体、系统或者细胞进行基因敲入。

本发明还提供一种上述DNA、载体、系统或者细胞在制备基因修饰细胞、动物模型或者基因治疗疾病的药物中的用途。

本发明还提供一种基因修饰细胞、动物模型或者采用基因治疗的疾病的药物的制备方法，包括利用上述DNA、载体、系统或者细胞进行制备。

本发明还提供一种药物，其中，所述药物包括上述任一的DNA、或上述的载体、系统或者细胞。

本发明还提供一种上述药物在疾病的基因治疗中的用途。

本发明还提供一种采用基因治疗的疾病的治疗方法，其中，所述方法包括向需要的患者给予上述药物。

优选的，所述采用基因治疗的疾病包括艾滋病，肿瘤，遗传病等任何可通过以HR介导的基因组编辑来治疗的疾病。

更优选的，上述遗传病包括镰刀形贫血症、地中海贫血症、血友病等所有由于基因突变导致的遗传病。

本发明通过构建不会被识别特定序列的基因组编辑核酸内切酶的同源重组模板(基因组编辑核酸内切酶耐受同源重组模板)，避免在已成功进行DNA编辑的基因组序列上出现二次(或者多次)基因组编辑核酸内切酶剪切和NHEJ修复，从而防止引入额外的或者错误的碱基突变，并最终提高基因组编辑效率。本发明大幅度改进了目前核酸内切酶和HR介导的基因组编辑所存在的低效且易引入突变的问题，为人类疾病的基因治疗及基因修饰细胞与动物模型的构建提供了一种切实可行的方案。本发明所述方法适用于任何单基因及多基因遗传病的基因治疗，以及任何利用有序列识别特异性的核酸内切酶和HR介导的基因组编辑来治疗的人类疾病。本发明并不针对特定的核酸内切酶，任何具有序列识别特异性的核酸内切酶均有效，例如ZFN、TALEN和CRISPR-Cas9。

本发明所述通过突变识别位点提高编辑效率并降低突变频率的方法适用于所有情况的点突变(或碱基修复)，即点突变或碱基修复位点既可位于基因组编辑核酸内切酶识别位点内，也可位于识别位点两侧。对插入特定DNA片段(对疾病治疗而言，称修复DNA片段缺失)和引入特定基因片段缺失(对疾病治疗而言，称消除DNA片段插入)部分适用。适用范围包括：(1)发生插入或消除的位点位于基因组编辑核酸内切酶识别位点之外。(2)发生插入或消除的位点位于基因组编辑核酸内切酶识别位点之内。但发生插入或消除后，基因组编辑核酸内切酶识别位点序列未被显著改变，即发生插入或消除后的DNA序列仍有可能被原基因组编辑核酸内切酶错误识别的情况。

附图说明

图1为用作同源重组模板的DNA结构示意图

图2为水、未经处理组和实验组PCR扩增产物电泳结果

图3为未经处理组和实验组BbvI酶切产物电泳结果

图4为对照组和实验组正确的基因敲入效率分析结果

图5为对照组和实验组代表性测序读段的比对结果，其中，图5A为PTEN-C124S-1N比对结果，图5B为PTEN-C124S-7N比对结果

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。可以理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，其并不作为对本发明的限制。在不偏离于本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。本领域的技术人员将会意识到或能够确认，仅仅使用常规实验，许多等同物都能应用于本文所描述的特定步骤中。这些等同物被认为处在本发明的范围之内，并且被权利要求所覆盖。

实施例一

以下实例以在293FT细胞中引入PTEN-C124S和PTEN-G129E点突变为例介绍本发明的操作原理。

人PTEN基因编码区对应的第124位氨基酸-半胱氨酸的密码子为TGT,通过改变一个碱基，变成TCT，即可实现从半胱氨酸到丝氨酸的转变。同理，通过将GGA变换成GAA，即可实现将PTEN第129位的甘氨酸变成谷氨酸。通过网站http://crispr.mit.edu，确定了两条识别区分别涵盖了PTEN-C124位点和PTEN-G129位点的靶向RNA。本发明的创新点在于，在制备同源重组模板时，除了目标碱基的突变外，还将靶向RNA识别区的20个碱基及后随的NGG基序按照密码子简并的规则进行突变，以保护业已发生同源重组修复的基因组序列不再因Cas9的脱靶效应被识别而发生NHEJ效应。为了显示该改进的效果，以下实施例还设置了只突变PTEN-C124和PTEN-G129对应碱基的对照组。

一.构建靶向PTEN-C124和PTEN-G129位点的CRISPR-Cas9载体

1.合成如下单链寡聚核苷酸，

PTEN-C124R-BbsILCACCGCAGCAATTCACTGTAAAGC(SEQIDNo.1)

PTEN-C124R-BbsIRAAACGCTTTACAGTGAATTGCTGC(SEQIDNo.2)

PTEN-G129-BbsILCACCGAAAGCTGGAAAGGGACGAAC(SEQIDNo.3)

PTEN-G129-BbsIRAAACGTTCGTCCCTTTCCAGCTTTC(SEQIDNo.4)

2.按如下列表在0.2mlPCR管中配制退火反应体系。

3.将PCR管放在带有热盖功能的PCR仪中，按如下程序对上一步反应体系进行退火。

4.按照如下反应体系通过限制性内切酶BbsI消化pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)质粒并回收。

37℃孵育4小时，并用天根DNA回收试剂盒回收酶切的质粒。

5.按照如下反应体系配制连接反应。

16℃过夜连接。

6.转化连接产物，37℃过夜培养。

7.挑取单克隆，分别培养在1ml氨苄抗性的LB培养基。

8.通过如下PCR反应鉴定阳性单克隆，并分别挑取一个阳性克隆扩大培养。

9.使用OMEGA无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒以备转染，并分别命名为px458M-hPTEN-C124和px458M-hPTEN-G129。

二.构建CRISPR-Cas9耐受和仅携带目标突变的同源重组模板

1.通过如下引物扩增包含PTEN-C124和PTEN-G129靶向RNA识别位点的基因组DNA片段，该片段(hPTEN-TP-978bp)序列如下：

hPTEN-TP-LTGCATTGAGAGTCCTGACGA(SEQIDNo.5)

hPTEN-TP-RTTTTCCAGGGACTGAGGGTG(SEQIDNo.6)

hPTEN-TP-978bpDNA片段(SEQIDNo.7)

TGCATTGAGAGTCCTGACGAAATGTCCATGTGACAGTTCATTTTGGGTTTAGCTCTACCTCTAATATGTGACCTATGCTACCAGTCCGTATAGCGTAAATTCCCAGAATATATCCTCCTGAATAAAATGGGGGAAAATAATACCTGGCTTCCTTAATGATTATATTTAAGACTTATCAAGAGACTATTTTCTATTTAACAATTAGAAAGTTAAGCAATACATTATTTTTCTCTGGAATCCAGTGTTTCTTTTAAATACCTGTTAAGTTTGTATGCAACATTTCTAAAGTTACCTACTTGTTAATTAAAAATTCAAGAGTTTTTTTTTCTTATTCTGAGGTTATCTTTTTACCACAGTTGCACAATATCCTTTTGAAGACCATAACCCACCACAGCTAGAACTTATCAAACCCTTTTGTGAAGATCTTGACCAATGGCTAAGTGAAGATGACAATCATGTTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGGGACGAACTGGTGTAATGATATGTGCATATTTATTACATCGGGGCAAATTTTTAAAGGCACAAGAGGCCCTAGATTTCTATGGGGAAGTAAGGACCAGAGACAAAAAGGTAAGTTATTTTTTGATGTTTTTCCTTTCCTCTTCCTGGATCTGAGAATTTATTGGAAAACAGATTTTGGGTTTCTTTTTTTCCTTCAGTTTTATTGAGGTGTAATTGACAAGTAAAAATTATATATAAATACAATGTATAATATGATGTTTTGATGTATGTGTATATACATTGTGAAATGATTACTACAGTCAAACTACTTAACATATTCATCACCTCACATAATTATTATTCTCCCCCCAGGGTGAAAGCATTTAAGATCTACAAGCTACAATTTTCAATTATACAATGTTATTATTAACTATAGTCACTATGCTGTCCAGTAGAGCTTCAGATCTTGTTCATCTTGTGTTCCTCCCTCCCCACCCTCAGTCCCTGGAAAA

2.将上一步的PCR产物克隆到T-A克隆载体EZ-T中，记为EZ-T-hPTEN-978bp。

3.根据氨基酸密码子简并规则及密码子种属偏好性分别设计并确定将PTEN-C124位点半胱氨酸突变成丝氨酸，或将PTEN-G129位点甘氨酸突变成谷氨酸的突变类型。根据氨基酸密码子简并规则及密码子种属偏好性，在上一步已引入目标突变的基础上，将PTEN-C124和PTEN-G129靶向RNA及后随NGG序列进行同义突变。以上的目标突变与靶向RNA后及后随NGG序列同义突变的过程如下所示：

PTEN-C124靶向RNA识别及后随NGG序列(方框内为NGG序列)，加粗显示的TGT为第124位半胱氨酸对应碱基。

GCAGCAATTCACTGTAAAGC(SEQIDNo.8)

步骤一：引入目标突变

将PTEN蛋白的第124位半胱氨酸(简称C)突变成丝氨酸(简称S)，

编码丝氨酸的密码子有六个，分别是TCA、TCT、TCC、TCG、AGT、AGC，而半胱氨酸密码子TGT的使用频率为10.6％，与TCA(12.2％)接近，故将TGT突变为TCA。从而实现将PTEN的124位半胱氨酸突变成丝氨酸，如下所示。下划线标注的碱基为突变后的形式。

GCAGCAATTCACTCAAAAGC(SEQIDNo.9)

步骤二：引入同义突变

将靶向RNA识别及NGG序列上除124位点的TCA外的碱基进行同义突变。以下显示了各个同义突变的情况及密码子使用频率对比。

对于第七个三联体，尽管可以突变成GCA/GCC/GCT等，但第八个三联体的所有同义密码子均以GG开头，无法实现将TGG突变成非NGG的类型，故不予突变。

因此，最终在同源重组模板DNA上，对应的靶向RNA识别及NGG序列被突变为如下序列，该突变序列包含了目标突变，也包含了对靶向RNA识别区的同义突变，总共预期引入7个碱基突变。同上，标下划线的碱基为突变后的形式。

GCCGCCATCCATTCAAAGGC(SEQIDNo.10)

同理，对PTEN-G129靶向RNA识别及后随NGG序列进行突变。

PTEN-G129靶向RNA识别及后随NGG序列(方框内为NGG序列)，加粗显示的GGA为第129位甘氨酸对应碱基。

AAAGCTGGAAAGGGACGAAC(SEQIDNo.11)

步骤一：引入目标突变

将PTEN蛋白的第129位甘氨酸(简称G)突变成谷氨酸(简称E)，

AAAGCTGGAAAGGGACGAAC人类密码子使用频率

GAA29.0％

GAG39.6％

以上显示的是谷氨酸(E)的两个密码子在人类细胞中的使用频率,GAA与GAG均可以替换GGA。选择将GGA突变成GAG，从而实现将PTEN的第129位甘氨酸突变成谷氨酸，如下所示。下划线标注的碱基为突变后的形式。

AAAGCTGGAAAGGAGCGAAC(SEQIDNo.12)

步骤二：引入同义突变

将靶向RNA识别及NGG序列上除129位点的GAG外的碱基进行同义突变。以下显示了各个同义突变的情况及密码子使用频率对比。

因此，最终在同源重组模板DNA上，对应的靶向RNA识别及NGG序列被突变为如下序列，该突变序列包含了目标突变PTEN-G129E，也包含了对靶向RNA识别区的同义突变，总共预期引入8个碱基突变。同上，标下划线的碱基为突变后的形式。

AAGGCCGGCAAAGAGAGGAC(SEQIDNo.13)

总体来说，引入目标突变或同义突变时，突变后的密码子使用频率相当或不显著低于原密码子使用频率。在靶向RNA识别序列上累计突变最好不低于三个，优先在靠近NGG的区域进行突变。如能将NGG突变成非NGG类型，将是最优选择。

4.基于上一步突变设计合成用于构建Cas9耐受模板DNA的突变引物，如下所示：

5.以EZ-T-hPTEN-978bp质粒为模板，以上一步所示的引物扩增，构建突变质粒。配制如下PCR反应体系：

设置并运行如下PCR反应程序：

6.向上述PCR产物中各加入1ulDMT酶，37℃孵育1小时。

7.使用DMT感受态细胞转化上一步酶切产物，涂布在氨苄抗性的LB平板上，37℃培养过夜。

8.挑取3个单克隆，扩大培养后提质粒，送测序公司进行sanger测序，确定定点突变是否成功。选取正确突变的质粒用作同源重组模板，分别记为EZ-T-C124S-7N和EZ-T-G129E-8N。

9.为了对比CRISPR-Cas9耐受重组模板的效果，构建只携带目标突变的重组模板作为对照。为了充分说明对照处理组可能存在的低效且易携带额外突变的情况，尽可能不改变过多碱基，事实上，传统的构建重组模板的策略也是以最小的改变来实现目标碱基的突变或修复。具体地来说，即将PTEN-C124位点的TGT突变为TCT,将PTEN-G129位点的GGA突变为GAA。突变的类型如下所示,标下划线的碱基为突变后的形式。

PTEN-C124S-1N

GCAGCAATTCACTCTAAAGC(SEQIDNo.18)

PTEN-G129E-1N

AAAGCTGGAAAGGAACGAAC(SEQIDNo.19)

根据上述构建突变质粒的方法获得对照组重组模板质粒，分别记为EZ-T-C124S-1N和EZ-T-G129E-1N。

三.检测并比较使用Cas9耐受重组模板和对照模板的对应点突变敲入

1.使用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养293FT细胞，测试前一天，取合适数量细胞接种六孔板，用于次日质粒转染，并确保24小时内细胞覆盖度达到约80％。

2.使用NeofectDNA转染试剂共转染px458M-hPTEN-C124和EZ-T-C124S-7N质粒用以敲入C124S点突变，共转染px458M-hPTEN-C124和EZ-T-C124S-1N质粒敲入C124S点突变作为对照。共转染px458M-hPTEN-G129和EZ-T-G129E-8N质粒用以敲入G129E点突变，共转染px458M-hPTEN-G129和EZ-T-G129E-1N质粒敲入G129E点突变作为对照。

对6孔板的每个孔，用100ulOpti-MEM在同一1.5ml管稀释2ugCas9-靶向RNA表达质粒和1ug模板质粒，混匀后加入3ulNeofect，再次混匀。20分钟后逐滴加入含2ml培养基的培养孔中，37度培养48小时。

3.转染48小时后，去掉培养基，收集细胞，提取基因组DNA。-20度保存。

4.在PTEN-C124和PTEN-G129靶向RNA识别序列附近设计跟实验组重组模板完全匹配，与原基因组序列不完全匹配的引物，搭配下游反向引物，检测敲入是否成功。检测实验组PTEN-C124S敲入的特异引物为

PTEN-C124-7MS-LGTTGCCGCCATCCATTCAAAG(SEQIDNo.20)

检测实验组PTEN-G129E敲入的特异引物为

PTEN-G129-8MS-LTAAGGCCGGCAAAGAGAGG(SEQIDNo.21)

下游通用引物为

PTEN-E5-KI-RGAAATTGAGGCAGCAACTGA(SEQIDNo.22)

实验组PTEN-C124S敲入检测的PCR产物大小为589bp，实验组PTEN-G129E敲入检测的PCR产物大小为572bp。

需要指出的是，该下游通用引物位于hPTEN-TP-R引物的下游，以避免扩增到残留在细胞中的重组模板质粒。

5.PCR检测实验组点突变敲入是否成功。

配制如下PCR反应体系。

设置并运行如下PCR反应程序：

第2到第4歩循环35次

结果如图2所示，PTEN-C124S-7N和PTEN-G129E-8N均扩增得到非常明显的PCR条带，且条带大小符合预期。而水和未经转染的细胞对照组无条带(PTEN-G129E对应的未经转染组有少许非特异条带)。

6.通过酶切PCR产物检测点突变敲入效率

本实例介绍的实验组PTEN-C124S敲入会破坏PTEN-C124靶向RNA上一个原有的酶切位点，即BbvI的识别位点GCAGC突变为GCCGC，被成功敲入的基因组DNA片段在该处不会被BbvI识别切割。通过一对引物扩增一段包含编辑位点的DNA片段，BbvI酶切，并检测被切割和未被切割PCR片段的丰度可以粗略评估敲入效率。用于扩增的引物为

PTEN-KI-F	ACAACACTAACATTTGCAAGACC(SEQ ID No.23)
		hPTEN-TP-R	TTTTCCAGGGACTGAGGGTG(SEQ ID No.24)

扩增的PCR产物大小为1146bp。需要说明的是PTEN-KI-F位于hPTEN-TP-F引物的上游，目的是防止模板质粒的干扰。用以上引物扩增第3步所得基因组DNA,纯化回收PCR产物，用BbvI酶切。

如图3所示，第一个泳道是未经转染的细胞基因组DNA对应的酶切条带，1146bp的条带几乎都被切开。第二个泳道是PTEN-C124S-7N的实验组对应的酶切带型，部分条带不能被切开。通过分析条带相对丰度，考虑到质粒的转染效率(40-50％左右)可以初略估算出敲入的效率接近30-40％，显示出非常高效率的基因敲入。

7.扩增包含点突变位点的基因组DNA片段(187bp)，两端连接接头，利用Illumina测序仪进行高通量测序，准确计算两种方法精确点突变敲入的效率，同时计算脱靶频率。

如图4所示，通过Illumina测序，对照组PTEN-C124S-1N和实验组PTEN-C124S-7N分别得到11171和13930条有效测序读段。经比对分析，实验组的精确敲入效率达到13.6％，比对照组的6.1％高一倍多。同时分析所有分别携带了目标敲入碱基的测序读段，发现对照组中有约40.3％的读段在业已成功发生正确敲入的情况下发生了后续的突变。而在实验组中，只有6％携带了目标碱基敲入的读段发生了额外突变。值得注意的是，约15.3％的读段显示未纳入第一个碱基C,暗示同义突变并非越多越好，理论上，在靠近NGG序列的位置引入三个及以上的同义突变就足够有效。

图5A,5B分别展示了对照组和实验组代表性测序读段的比对结果，最上方的23个碱基的序列为PTEN-C124的靶向RNA识别序列和后随的NGG序列，作为参考序列。序列下方的灰色长条代表局部测序读段，灰色区域代表与参考序列一致，不同标记的字母代表与参考序列不一致,此处代表成功地敲入了预期突变碱基。其中，如图5A所示，竖线代表碱基插入，在碱基T和A之间，黑色横线代表碱基缺失(碱基AA)，灰色长条中的A代表对碱基T的替换。图5B所示，测序读段上不同字母的碱基代表成功地将总共7个突变碱基敲入基因组。

Claims (10)

1.一种用作基因组编辑的同源重组模板的DNA，其特征在于，所述DNA包括1)人工编辑的目标敲入序列；和2)突变的基因组编辑核酸内切酶的识别区序列；和3)两侧同源臂序列，其中，所述1)人工编辑的目标敲入序列是来源于细胞基因组上待编辑的对应目标DNA序列，并且人工完成了所需的特定点突变，特定插入突变或者特定删除突变，所述2)突变的核酸内切酶识别区是来源于基因组上核酸内切酶识别区域的对应DNA序列，并且在该序列上已经完成碱基突变，目的在于避免被基因组编辑核酸内切酶识别，防止在已经完成同源重组介导的序列编辑的基因组DNA上再次发生核酸内切酶介导的双链切割和NHEJ修复，所述3)两侧同源臂序列与待编辑的细胞基因组DNA序列完全相同，其能与对应的基因组发生同源重组，从而介导已经人工编辑的目标敲入序列和突变的识别区序列替代基因组中原有的对应DNA区域。

2.根据权利要求1所述的DNA，其特征在于，所述目标敲入序列可位于突变的基因组编辑核酸内切酶的识别区内，也可以位于突变的基因组编辑核酸内切酶识别区的两侧。

3.根据权利要求1-2任一所述的DNA，其特征在于，相对于待编辑细胞基因组DNA上对应序列,所述突变的基因组编辑核酸内切酶的识别区序列具有至少1个碱基突变。

4.根据权利要求3所述的DNA，其特征在于，所述基因组编辑核酸内切酶的识别区的碱基突变原则是在不改变蛋白编码或者基因组功能的条件下，引入足够多的突变碱基，以最大限度地避免被再次识别的可能。

5.根据权利要求1-4任一所述的DNA，其特征在于，所述基因组编辑核酸内切酶是任何能识别特定DNA序列的核酸内切酶，优选的，所述基因组编辑核酸内切酶包括ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等。

6.一种载体、系统或者细胞，其特征在于，所述载体、系统或者细胞包括权利要求1-5任一所述的DNA。

7.权利要求1-5任一所述的DNA，或者权利要求6所述的载体、系统或者细胞在(1)提高基因组编辑效率，(2)制备基因组编辑细胞或动物模型，(3)制备采用基因治疗的疾病的药物中的用途。

8.一种提高基因编辑效率的方法，其中，所述方法包括利用权利要求1-5任一所述的DNA、或权利要求6所述的载体、系统或者细胞进行基因组编辑。

9.一种基因编辑细胞、动物模型或者药物的制备方法，其中，所述方法包括利用权利要求1-5任一所述的DNA、或权利要求6所述的载体、系统或者细胞进行制备。

10.一种药物，其中，所述药物包括权利要求1-5任一所述的DNA、或权利要求6所述的载体、系统或者细胞。