CN109371040A

CN109371040A - 水稻OsARF6基因在调控水稻种子粒型中的应用

Info

Publication number: CN109371040A
Application number: CN201811406321.6A
Authority: CN
Inventors: 齐艳华; 王梅; 乔继月
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-11-23
Filing date: 2018-11-23
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2038-11-23
Also published as: CN109371040B

Abstract

本发明公开了水稻OsARF6基因在调控水稻种子粒型中的应用，属于生物化学技术领域。本发明还提供了一种长粒型种子水稻的育种方法，包括：利用CRISPR/Cas9技术定点编辑所述水稻OsARF6基因的靶位点，所述靶位点的序列分别为：GACGCTGCAGCCACTCAGCC，ACCACTGGCTAAATATGTAA。本发明利用CRISPR/Cas9系统构建水稻OsARF6基因靶位点特异性敲除的植物重组表达载体，利用转基因获得OsARF6纯合稳定的突变体植株，可用于分析OsARF6基因在水稻中的生物学功能；本发明还提供了水稻OsARF6突变体植株在水稻粒型研究的新方向，在农业开发方面具有潜在的应用价值。

Description

水稻OsARF6基因在调控水稻种子粒型中的应用

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及水稻OsARF6基因在调控水稻种子粒型中的应用。

背景技术

CRISPR/Cas9是新发展起来的一项有着巨大影响力的基因编辑技术，其简单的操作以及广泛的应用而受到青睐。CRISPR/Cas9体系中的载体主要由两大元件构成：sgRNA(single guide RNA)以及Cas9。sgRNA是一种非编码的小RNA，由U3或者U6启动子启动。Cas9编码核酸酶蛋白，分子量大于1000个氨基酸，可以切割DNA核酸序列。CRISPR/Cas9体系主要借助sgRNA来匹配到基因组的特定位置(靶点)，之后Cas9核酸酶将此处DNA切断，形成双链切口。在DNA损伤修复过程中，无论是同源重组修复(Homologous recombination-basedrepair,HR)还是非同源末端连接修复(Nonhomologous end-joining,NHEJ)，都会在切口处引入突变。

目前CRISPR/Cas9系统已成功在拟南芥、烟草、甜橙、水稻、小麦、高粱、玉米以及苔藓植物地钱等植物中实现了定点基因组编辑，但对水稻育种中有重要价值的产量、品质、育性等关键基因的定向编辑的研究鲜有报道。

公告号为CN 105063061 B的专利文献公开了一种水稻千粒重基因tgw6突变体及其制备方法与应用。本发明通过设计特定的TGW6位点，利用CRISPR/Cas9技术定点编辑了调控水稻千粒重的TGW6基因，获得了一套具有重要应用价值的水稻tg w6缺失突变体新种质，该类突变体显著影响水稻的千粒重，提高水稻千粒重5％以上，可以用于水稻的高产、稳产育种。

生长素响应因子ARF基因是一类调控生长素相应基因表达的转录因子，他与生长素响应元件特异性结合，促进或抑制基因的表达。植物ARF由三个结构域组成氨基端的结合结构域(DBD)，中间结构域(MR)，以及羟基末端的二聚结构域(CTD)。中间结构域包括激活结构域(AD)和抑制结构域(RD)。ARFs是一大类基因家族，不同的ARF在不同的组织和器官中都有特异性的表达。

水稻是我国的主要粮食作物，利用生物信息学分析，水稻中有24个OsARF基因，目前发现OsARF4参与调控水稻的粒型，OsARF6则通过调控下游基因FZP的表达来调控水稻花序次生枝梗数量。但是关于OsARF6对水稻粒型方面的影响还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可调控水稻种子粒型的基因，通过基因改造达到改良水稻种子粒型的目的。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种CRISPR/Cas9基因编辑敲除系统，对OsARF6基因进行编辑，研究发现，对OsARF6基因进行编辑获得的阳性纯合株系，表现出粒型变长的表型，表明OsARF6基因的重新编辑在改良水稻粒型中具有一定应用价值。

因此，本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsARF6基因在调控水稻种子粒型中的应用。

具体地，利用RNAi或CRISPR/CAS9技术降低水稻OsARF6基因编码蛋白的表达或活性，进而获得长粒型种子的水稻突变体。

本发明还提供了一种长粒型种子水稻的育种方法，包括：利用CRISPR/Cas9技术定点编辑所述水稻OsARF6基因的靶位点，所述靶位点的序列分别为：GACGCTGCAGCCACTCAGCC，ACCACTGGCTAAATATGTAA。

具体地，将所述水稻OsARF6基因靶位点连入CRISPR/Cas9系统的表达载体中，构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到受体植物材料中，培育获得粒型改良的转基因植株。

作为优选，所述的表达载体为pRGEB32，所述受体植物为水稻。

所述的育种方法，包括以下步骤：

(1)针对所述的靶位点和pGTR质粒序列分段设计PCR引物，以pGTR质粒为模板进行PCR扩增，获得含有pGTR质粒不同分段的PCR产物，将PCR产物回收并连接获得含所述靶位点序列的线性化片段；

(2)以线性化片段为模块，PCR扩增获得含所述靶位点序列的目标产物，将目标产物连入终载体pRGEB质粒，构建得到CRISPR/Cas9重组载体；

(3)将CRISPR/Cas9重组载体转入待基因编辑的受体水稻中，培育，筛选获得含有Cas9序列标签的T0代阳性苗；

(4)T0代阳性苗自交一代得到T1代苗，通过筛选获得Cas9标签去除的T1代苗，即得具有长粒型种子表型的水稻植株。

作为优选，步骤(1)中，采用的PCR引物对为：

P1：

L5AD5-F：5’-CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG-3’；

gR3-R：5’-ATGGTCTCAGGCTGCAGCGTCTGCACCAGCCGGGAA-3’；

P2：

gR3-F：5’-TAGGTCTCCAGCCACTCAGCCGTTTTAGAGCTAGAA-3’；

gR4-R：5’-CGGGTCTCATTAGCCAGTGGTTGCACCAGCCGGG-3’；

P3：

gR4-F：5’-TAGGTCTCCCTAAATATGTAAGTTTTAGAGCTAGAA-3’；

L3AD5-R：5’-TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAA GCACCGACTCG-3’。

设计引物时，引入酶切位点，PCR扩增得到的P1、P2、P3利用酶切产生粘性末端，在连接酶的作用下连接得到线性长片段。

作为优选，步骤(2)中，设计的PCR引物为：

S5AD5-F：5’-CG GGTCTC A GGCA GGATG GGCAGTCTG GGCA-3’；

S3AD5-R：5’-TA GGTCTC C AAAC GGATG AGCGACAGC AAAC-3’。

步骤(3)中，将CRISPR/Cas9重组载体转化到受体水稻(如愈伤组织)中，培育获得转基因植株T0代，利用扩增编码Cas9蛋白基因序列的特异性引物，对转基因株系T0代基因组进行PCR扩增检测，从而筛选出含有Cas9序列标签的转基因苗。

步骤(4)中，转基因苗自交一代得到T1代苗，利用扩增编码Cas9蛋白基因序列的特异性引物，对T1代苗进行PCR扩增检测，筛选出自交去除Cas9标签的T1代苗。进一步地，筛选获得稳定纯合的突变体水稻长粒型的植株。

本发明还提供了一种水稻osarf6基因突变体在改良水稻种子粒型中的应用，所述水稻osarf6基因突变体编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5所示。上述的水稻突变体植株均表现出粒型变长的表型。

所述水稻Osarf6基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9所示。

本发明具备的有益效果：

本发明通过利用CRISPR/Cas9系统构建水稻OsARF6基因靶位点特异性敲除的植物重组表达载体，利用转基因获得OsARF6纯合稳定的突变体植株，可用于分析OsARF6基因在水稻中的生物学功能；本发明还提供了水稻OsARF6突变体植株在水稻粒型研究的新方向，在农业开发方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为以CRISPR/Cas9系统提供的pGTR质粒为模板进行PCR扩增得到P1,P2,P3三个短片段的电泳图，结果的电泳图，M：DL2000bp。

图2为将P1,P2,P3连接后的产物作为底物进行PCR扩增的电泳图，M：DL2000bp；1，2为P1,P2,P3三个短片段连接而成的产物完整的扩增条带。

图3为水稻OsARF6检测阳性重组载体pRGEB32PCR结果的电泳图，M：DL2000bp；1，2：阳性克隆；0：空载体对照。

图4为pRGEB32载体的图谱(A、B)及克隆位点信息(C)。

图5为OsARF6基因转基因植株T1代阳性苗检测标签核酸酶蛋白Cas9PCR结果电泳图：自交一代去除标签核酸酶蛋白Cas9的阳性苗泳道(1,3,4,7,8,9,11,12)；未洗掉标签泳道为(2,5,6,10)；0：作为空白对照的野生型DJ。

图6为取除Cas9序列的OsARF6基因转基因植株T1代阳性苗各株系基因组编辑测序结果，其中(A)为osarf6-1的比对结果，(B)为osarf6-2的比对结果，(C)为osarf6-3的比对结果，(D)为osarf6-4的比对结果。

图7为稳定的纯合突变体osarf6各株系的种子粒型的表型图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

构建CRISPR/Cas9重组载体

(1)根据TIGR水稻基因注释数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)获得水稻OsARF6基因全长cDNA序列，根据http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html设计分析出最佳两个靶位点，分别为GACGCTGCAGCCACTCAGCC，ACCACTGGCTAAATATGTAA。根据CRISPR/Cas9系统要求设计引物。

上游引物(gR3-F)：5’-TA GGTCTCC AGCCACTCAGCC gttttagagctagaa-3’(SEQ IDNO.10)；

下游引物(gR3-R)：5’-AT GGTCTCA GGCTGCAGCGTC tgcaccagccgggaa-3’(SEQ IDNO.11)；

上游引物(gR4-F)：5’-TA GGTCTCC CTAAATATGTAA gttttagagctagaa-3’(SEQ IDNO.12)；

下游引物(gR4-R)：5’-CG GGTCTCA TTAGCCAGTGGT tgcaccagccggg-3’(SEQ IDNO.13)；

L5AD5-F：5’-CG GGTCTC A GGCA GGATG GGCAGTCTG GGCAACAAAGCACCAGTGG-3’(SEQ ID NO.14)；

L3AD5-R：5’-TA GGTCTC C AAAC GGATG AGCGACAGC AAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG-3’(SEQ ID NO.15)；

(2)以CRISPR/Cas9系统提供的pGTR质粒为模板进行PCR扩增。每个PCR体系50μl扩增体系，含pGTR plasmid 3.5μl，5×Phusion HF buffer 10μl，dNTPs(10mM)1μl，上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，Phusion(2U/μl,NEB)0.5μl，H₂O 30μl。每个反应体系所用的上下游引物为：

P1(L5AD-gR3)：L5AD5-F、gR3-R；

P2(gR3-gR4)：gR3-F、gR4-R；

P3(gR4-L3AD)：gR4-F、L3AD5-R；

PCR条件是：98℃预变性2分钟后，进入循环反应即98℃10s，50℃20s，72℃20s，循环数为35，最后72℃延伸2.5min。

PCR产物加loading buffer后进行凝胶电泳，如图1，割胶回收。PCR产物回收采用BioTeke公司的快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

(3)将回收产物P1，P2，P,3三个回收片段连接过夜。

连接体系如下：

连接条件是：37℃5min，20℃10min，循环数30-50个循环，最后，20℃60min。

(4)将连接产物作为底物进行PCR扩增。PCR体系为50μl扩增体系：

反应体系所用的上下游引物为：

S5AD5-F：5’-CG GGTCTC A GGCA GGATG GGCAGTCTG GGCA-3’(SEQ ID NO.16)；

S3AD5-R：5’-TA GGTCTC C AAAC GGATG AGCGACAGC AAAC-3’(SEQ ID NO.17)；

PCR程序为：95℃2min；95℃10s，60℃20s，72℃1min/kb，35Cycles；72℃5min；4℃，Hold。

PCR产物加loading buffer后进行凝胶电泳，如图2，割胶回收。PCR产物回收采用BioTeke公司的快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

(5)将PCR产物回收纯化产物用Fok I(NEB)酶切，同时终载体pRGEB质粒用BsaI(NEB)酶切，跑电泳回收酶切产物。酶切产物回收采用BioTeke公司的快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

用T4DNA ligase(NEB)将两个回收产物连接。

(6)连接产物热击转化DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素(Kan)平板，37℃培养12小时以上，挑取单克隆，用pRGE32载体两端通用引物UGW-U3-F和UGW-gRNA-R，通过PCR鉴定阳性克隆。引物序列如下：

UGW-U3-F：5’-GACCATGATTACGCCAAGCTTAAGGAATCTTTAAACATACG-3’(SEQ IDNO.18)；

UGW-gRNA-R：5’-GGACCTGCAGGCATGCACGCGCTAAAAACGGACTAGC-3’(SEQ ID NO.19)；

通过PCR检测，阳性克隆能够扩增出700bp的条带，如图3所示：M，DNA MARKER；1，空载体对照；2，阳性克隆。

提取的质粒送到上海生工生物工程公司测序。

实施例2

1、转基因水稻

将阳性克隆质粒电转化农杆菌EHA105，涂布卡那霉素(Kan)和链霉素(Str)的平板，28℃培养36个小时以上。挑取单克隆，提取质粒，用特定引物PCR鉴定阳性克隆。将阳性克隆放入-80℃保存。

将已经构建好的超表达载体质粒通过电击的方法导入农杆菌EHA105感受态细胞，然后运用侵染水稻愈伤的方法(Hiei等，1994)将其整合到水稻基因组上。转化的水稻愈伤经过农杆菌共培养、阳性愈伤的筛选、愈伤分化出苗、小苗生根和炼苗后，培育获得转基因植株T0代。

提取幼苗基因组DNA，利用扩增编码Cas9蛋白基因序列的特异性引物，PCR鉴定出含有Cas9序列标签的T0代阳性苗，野生型Dongjing为对照，移到大田繁种。

引物序列如下：

promoter u3：5’-TGGGTACGTTGGAAACCACG-3’(SEQ ID NO.20)；

pUBI10：5’-GTTTGTTGGTCGCCGTTAGG-3’(SEQ ID NO.21)。

2、T1代阳性苗纯合突变体鉴定

T0代阳性苗自交一代得到T1代苗，利用上述的扩增编码Cas9蛋白基因序列的特异性引物，PCR筛选出自交去除Cas9标签的T1代苗，野生型Dongjing为对照。如图5所示，

然后针对OsARF6基因靶位点两端设计特异性引物，对去除标签的阳性苗基因组进行PCR，引物为：

OsARF6(gRNA3,4)-FP：5’-ATGCACGTAAGTCTGGAGCA-3’(SEQ ID NO.22)；

OsARF6(gRNA3,4)-RP：5’-GGAAATAGCATTACGTGATGC-3’(SEQ ID NO.23)；

将对应的PCR产物送到上海生工生物工程公司测序，分析测序结果，与OsARF6基因原始序列(SEQ ID NO.1)比对，确定各个株系的OsARF6基因编辑情况，如图6所示。

osarf6-1：对比原始序列，突变体表达蛋白的核酸序列第328bp-329bp之间插入一个T、871bp-872bp之间插入一个T，蛋白水平上造成翻译提前终止，蛋白结构改变，只得到含有140个氨基酸的肽段(SEQ ID NO.2)。

osarf6-2：对比原始序列，突变体表达蛋白的核酸序列第327bp-328bp之间插入一个A、867bp-872bp之间缺失TATG四个碱基，蛋白水平上造成翻译提前终止，蛋白结构改变，只得到含有140个氨基酸的肽段(SEQ ID NO.3)。

osarf6-3：对比原始序列，突变体表达蛋白的核酸序列第303bp-329bp之间缺失长片段、871bp缺失一个碱基G，蛋白水平上造成翻译提前终止，蛋白结构改变，只得到含有114个氨基酸的肽段(SEQ ID NO.4)。

osarf6-4：对比原始序列，突变体表达蛋白的核酸序列第325bp-329bp之间缺失TCA三个碱基、871bp缺失一个碱基G，蛋白水平上造成翻译提前终止，蛋白结构改变，只得到含有289个氨基酸的肽段(SEQ ID NO.5)。

3、将不同基因编辑结果的T1代苗编号，繁种。对纯和稳定的突变体株系的种子粒型进行统计。

经过鉴定得到的各个纯和株系T1代苗进行繁种得到种子进行表性分析发现；如图7所示对比野生型的粒长，osarf6-1，osarf6-2，osarf6-4突变体株系的粒长变长10％，osarf6-3变长6％。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 水稻OsARF6 基因在调控水稻种子粒型中的应用

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2727

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgaagctct cgccgtcggc cggcggcgtc tccgaccagc cgccgtcgcc gccggaagtt 60

gcagaggagc agaagtgcct aaattctgag ttgtggcatg catgcgccgg ccctctcgtt 120

tcgctgcctg cggtcggtag tcgggtggtt tattttcctc aaggccacag tgagcaggta 180

gctgcatcaa caaataagga aatggagtct cagatcccca actatcctaa cctgccgccg 240

cagcttatat gccagctaca taatgtgacc atgcacgccg atgcagagac ggatgaagtc 300

tatgcgcaaa tgacgctgca gccactcagc ccgcaagagc tcaaggatcc attcctaccc 360

gccgagctag gcactgccag caagcagcca acaaattatt tctgcaaaac gttaactgct 420

agtgacacaa gtacacatgg tggattctct gttccccgtc gagcagcaga gaaagtattt 480

cctccgctgg atttcactca gcagcctcca gctcaagagt tgatggcgaa agacctccat 540

ggaaatgaat ggaaattccg tcatatcttt cgtggccaac cgaagcggca tcttctgact 600

acgggttgga gcgtctttgt aagtgcaaag agactggttg ctggagactc tgtccttttt 660

atctggaatg acagtaatca gctgcttctg ggaattcgtc gggcaaatag gccacaaacg 720

gtcatgccat catcagtatt gtctagtgac agcatgcata ttggtctgct tgctgcagct 780

gctcacgccg catcaacaaa tagccggttt actattttct ataatccaag agcaagccct 840

tcggagtttg ttataccact ggctaaatat gtaaaggctg tctaccatac ccgcatatcg 900

gtgggcatgc gtttccggat gctttttgaa acagaagaat ccagtgttag gagatacatg 960

gggacaataa caggaataag tgatcttgat cctgttcgtt ggatgaactc acactggcgc 1020

tctgtcaagg ttggatggga tgagtcgact gctggagaga gacagccaag ggtgtctctt 1080

tgggagatcg agcctctgac aactttcccg atgtatccat ctccttttcc tctcagacta 1140

aagcgtccat ggccaacagg cttaccttct ttatatggcg gaaaggagga tgacttggct 1200

tcttctctta tgtggcttcg agatagtcaa aacacaggtt tccaatctct gaattttgga 1260

ggacttggta tgagtccgtg gatgcagcca aggctggata gttccctact tggtctgcaa 1320

cctgacatgt accaaacgat agcggcggcg gcggctttac agaacaccac taagcaagta 1380

tcacctgcca tgctgcagtt ccagcagccg caaaacattg tcggtagatc ttctcttcta 1440

tccagtcaga ttctgcagca agcacagcct caatttcagc agatgtacca ccaaaacatc 1500

aatggcaact caatccaagg ccatagtcag cctgagtacc tccagcaacc gcttcaacat 1560

tgccaatcat ttaacgaaca gaagcctcag ttgcagccgc agcaacagca gcaagaatca 1620

caccagcagc aacctcagca tcaacaaatg caacaacaga aacacttgtc caactttcag 1680

actgtaccaa atgcattgtc ggttttttca cagctttcct ccacccctca gtctacaccc 1740

tccacattgc agacagtttc accattctca cagcaacata atttccctga cacaaatatc 1800

agttgtctct ctccatccaa tgtctcatcc atgcacgata cactgagatc attcccttca 1860

gaagctgctt cagacctccc aggtgtgcca agaatcaccc ctgtacctgt ctctgaccca 1920

tggtcatcta agcgagttgc agtggaatct acgatcactt ctcgcccaca tgacatttca 1980

tcacagatag agaacttcga cttgacacct tctagtattc ctcaaaactc cacgttagca 2040

ccactgcctg gaagggaatg cctggtggat caagatggga gctctgatcc tcaaaatcac 2100

ttcttgtttg gtgtaaatat agactcacag tcacttttga tgcaagatgg cattccaagc 2160

cttcacaatg aaaacagttc aagcacaatt ccatattcca catccaactt ccttagccct 2220

tctcaagatg attatccatt gagtcaaaca ctaactactc cgggctgctt agatgaatca 2280

ggatatgttc catgttcaga taatgctgat caagtgaagc gaccgcatgc aacctttgtg 2340

aaggtttaca aatctggaac cgttggaagg ttgctcgaca tcactagatt tagcagttat 2400

catgaacttc gtagtgaggt agggcgcctt tttggccttg agggccagtt ggaagaccct 2460

ttgagatcag gctggcagct tgtatttgtt gaccgagagg acgacgttct tctagttggc 2520

gatgatccgt ggcaggaatt tgtgaacagt gtgtcttgca taaagatact ttcgccgcag 2580

gaggttcagc agatgggcaa gccgggcatt gaactcttct cgacttctgc aaggagactt 2640

ggcaacagct gtgacaacta catgagcagg caggaatcaa gaagcctaag cactggaatc 2700

gcgtcggtgg gctcagttga gttctga 2727

<210> 2

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Leu Ser Pro Ser Ala Gly Gly Val Ser Asp Gln Pro Pro Ser

1 5 10 15

Pro Pro Glu Val Ala Glu Glu Gln Lys Cys Leu Asn Ser Glu Leu Trp

20 25 30

His Ala Cys Ala Gly Pro Leu Val Ser Leu Pro Ala Val Gly Ser Arg

35 40 45

Val Val Tyr Phe Pro Gln Gly His Ser Glu Gln Val Ala Ala Ser Thr

50 55 60

Asn Lys Glu Met Glu Ser Gln Ile Pro Asn Tyr Pro Asn Leu Pro Pro

65 70 75 80

Gln Leu Ile Cys Gln Leu His Asn Val Thr Met His Ala Asp Ala Glu

85 90 95

Thr Asp Glu Val Tyr Ala Gln Met Thr Leu Gln Pro Leu Met Pro Ala

100 105 110

Arg Ala Gln Gly Ser Ile Pro Thr Arg Arg Ala Arg His Cys Gln Gln

115 120 125

Ala Ala Asn Lys Leu Phe Leu Gln Asn Val Asn Cys

130 135 140

<210> 3

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Lys Leu Ser Pro Ser Ala Gly Gly Val Ser Asp Gln Pro Pro Ser

1 5 10 15

Pro Pro Glu Val Ala Glu Glu Gln Lys Cys Leu Asn Ser Glu Leu Trp

20 25 30

His Ala Cys Ala Gly Pro Leu Val Ser Leu Pro Ala Val Gly Ser Arg

35 40 45

Val Val Tyr Phe Pro Gln Gly His Ser Glu Gln Val Ala Ala Ser Thr

50 55 60

Asn Lys Glu Met Glu Ser Gln Ile Pro Asn Tyr Pro Asn Leu Pro Pro

65 70 75 80

Gln Leu Ile Cys Gln Leu His Asn Val Thr Met His Ala Asp Ala Glu

85 90 95

Thr Asp Glu Val Tyr Ala Gln Met Thr Leu Gln Pro Leu Lys Pro Ala

100 105 110

Arg Ala Gln Gly Ser Ile Pro Thr Arg Arg Ala Arg His Cys Gln Gln

115 120 125

Ala Ala Asn Lys Leu Phe Leu Gln Asn Val Asn Cys

130 135 140

<210> 4

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Leu Ser Pro Ser Ala Gly Gly Val Ser Asp Gln Pro Pro Ser

1 5 10 15

Pro Pro Glu Val Ala Glu Glu Gln Lys Cys Leu Asn Ser Glu Leu Trp

20 25 30

His Ala Cys Ala Gly Pro Leu Val Ser Leu Pro Ala Val Gly Ser Arg

35 40 45

Val Val Tyr Phe Pro Gln Gly His Ser Glu Gln Val Ala Ala Ser Thr

50 55 60

Asn Lys Glu Met Glu Ser Gln Ile Pro Asn Tyr Pro Asn Leu Pro Pro

65 70 75 80

Gln Leu Ile Cys Gln Leu His Asn Val Thr Met His Ala Asp Ala Glu

85 90 95

Thr Asp Glu Val Tyr Ala Arg Lys Ser Ser Arg Ile His Ser Tyr Pro

100 105 110

Pro Ser

<210> 5

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Lys Leu Ser Pro Ser Ala Gly Gly Val Ser Asp Gln Pro Pro Ser

1 5 10 15

Pro Pro Glu Val Ala Glu Glu Gln Lys Cys Leu Asn Ser Glu Leu Trp

20 25 30

His Ala Cys Ala Gly Pro Leu Val Ser Leu Pro Ala Val Gly Ser Arg

35 40 45

Val Val Tyr Phe Pro Gln Gly His Ser Glu Gln Val Ala Ala Ser Thr

50 55 60

Asn Lys Glu Met Glu Ser Gln Ile Pro Asn Tyr Pro Asn Leu Pro Pro

65 70 75 80

Gln Leu Ile Cys Gln Leu His Asn Val Thr Met His Ala Asp Ala Glu

85 90 95

Thr Asp Glu Val Tyr Ala Gln Met Thr Leu Gln Pro Arg Pro Gln Glu

100 105 110

Leu Lys Asp Pro Phe Leu Pro Ala Glu Leu Gly Thr Ala Ser Lys Gln

115 120 125

Pro Thr Asn Tyr Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ser Thr

130 135 140

His Gly Gly Phe Ser Val Pro Arg Arg Ala Ala Glu Lys Val Phe Pro

145 150 155 160

Pro Leu Asp Phe Thr Gln Gln Pro Pro Ala Gln Glu Leu Met Ala Lys

165 170 175

Asp Leu His Gly Asn Glu Trp Lys Phe Arg His Ile Phe Arg Gly Gln

180 185 190

Pro Lys Arg His Leu Leu Thr Thr Gly Trp Ser Val Phe Val Ser Ala

195 200 205

Lys Arg Leu Val Ala Gly Asp Ser Val Leu Phe Ile Trp Asn Asp Ser

210 215 220

Asn Gln Leu Leu Leu Gly Ile Arg Arg Ala Asn Arg Pro Gln Thr Val

225 230 235 240

Met Pro Ser Ser Val Leu Ser Ser Asp Ser Met His Ile Gly Leu Leu

245 250 255

Ala Ala Ala Ala His Ala Ala Ser Thr Asn Ser Arg Phe Thr Ile Phe

260 265 270

Tyr Asn Pro Arg Ala Ser Pro Ser Glu Phe Val Ile Pro Leu Ala Lys

275 280 285

Tyr

<210> 6

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgaagctct cgccgtcggc cggcggcgtc tccgaccagc cgccgtcgcc gccggaagtt 60

gcagaggagc agaagtgcct aaattctgag ttgtggcatg catgcgccgg ccctctcgtt 120

tcgctgcctg cggtcggtag tcgggtggtt tattttcctc aaggccacag tgagcaggta 180

gctgcatcaa caaataagga aatggagtct cagatcccca actatcctaa cctgccgccg 240

cagcttatat gccagctaca taatgtgacc atgcacgccg atgcagagac ggatgaagtc 300

tatgcgcaaa tgacgctgca gccactcatg cccgcaagag ctcaaggatc cattcctacc 360

cgccgagcta ggcactgcca gcaagcagcc aacaaattat ttctgcaaaa cgttaactgc 420

tag 423

<210> 7

<211> 423

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgaagctct cgccgtcggc cggcggcgtc tccgaccagc cgccgtcgcc gccggaagtt 60

gcagaggagc agaagtgcct aaattctgag ttgtggcatg catgcgccgg ccctctcgtt 120

tcgctgcctg cggtcggtag tcgggtggtt tattttcctc aaggccacag tgagcaggta 180

gctgcatcaa caaataagga aatggagtct cagatcccca actatcctaa cctgccgccg 240

cagcttatat gccagctaca taatgtgacc atgcacgccg atgcagagac ggatgaagtc 300

tatgcgcaaa tgacgctgca gccactcaag cccgcaagag ctcaaggatc cattcctacc 360

cgccgagcta ggcactgcca gcaagcagcc aacaaattat ttctgcaaaa cgttaactgc 420

tag 423

<210> 8

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaagctct cgccgtcggc cggcggcgtc tccgaccagc cgccgtcgcc gccggaagtt 60

gcagaggagc agaagtgcct aaattctgag ttgtggcatg catgcgccgg ccctctcgtt 120

tcgctgcctg cggtcggtag tcgggtggtt tattttcctc aaggccacag tgagcaggta 180

gctgcatcaa caaataagga aatggagtct cagatcccca actatcctaa cctgccgccg 240

cagcttatat gccagctaca taatgtgacc atgcacgccg atgcagagac ggatgaagtc 300

tatgcccgca agagctcaag gatccattcc tacccgccga gctag 345

<210> 9

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaagctct cgccgtcggc cggcggcgtc tccgaccagc cgccgtcgcc gccggaagtt 60

gcagaggagc agaagtgcct aaattctgag ttgtggcatg catgcgccgg ccctctcgtt 120

tcgctgcctg cggtcggtag tcgggtggtt tattttcctc aaggccacag tgagcaggta 180

gctgcatcaa caaataagga aatggagtct cagatcccca actatcctaa cctgccgccg 240

cagcttatat gccagctaca taatgtgacc atgcacgccg atgcagagac ggatgaagtc 300

tatgcgcaaa tgacgctgca gccacgcccg caagagctca aggatccatt cctacccgcc 360

gagctaggca ctgccagcaa gcagccaaca aattatttct gcaaaacgtt aactgctagt 420

gacacaagta cacatggtgg attctctgtt ccccgtcgag cagcagagaa agtatttcct 480

ccgctggatt tcactcagca gcctccagct caagagttga tggcgaaaga cctccatgga 540

aatgaatgga aattccgtca tatctttcgt ggccaaccga agcggcatct tctgactacg 600

ggttggagcg tctttgtaag tgcaaagaga ctggttgctg gagactctgt cctttttatc 660

tggaatgaca gtaatcagct gcttctggga attcgtcggg caaataggcc acaaacggtc 720

atgccatcat cagtattgtc tagtgacagc atgcatattg gtctgcttgc tgcagctgct 780

cacgccgcat caacaaatag ccggtttact attttctata atccaagagc aagcccttcg 840

gagtttgtta taccactggc taaatattaa 870

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taggtctcca gccactcagc cgttttagag ctagaa 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggtctcag gctgcagcgt ctgcaccagc cgggaa 36

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taggtctccc taaatatgta agttttagag ctagaa 36

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgggtctcat tagccagtgg ttgcaccagc cggg 34

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggc aacaaagcac cagtgg 46

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

taggtctcca aacggatgag cgacagcaaa caaaaaaaaa agcaccgact cg 52

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgggtctcag gcaggatggg cagtctgggc a 31

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

taggtctcca aacggatgag cgacagcaaa c 31

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaccatgatt acgccaagct taaggaatct ttaaacatac g 41

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggacctgcag gcatgcacgc gctaaaaacg gactagc 37

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgggtacgtt ggaaaccacg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtttgttggt cgccgttagg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

atgcacgtaa gtctggagca 20

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggaaatagca ttacgtgatg c 21

Claims

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsARF6基因在调控水稻种子粒型中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，利用RNAi或CRISPR/CAS9技术降低水稻OsARF6基因编码蛋白的表达或活性，进而获得长粒型种子的水稻突变体。

3.一种长粒型种子水稻的育种方法，其特征在于，包括：利用CRISPR/Cas9技术定点编辑核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsARF6基因的靶位点，所述靶位点的序列分别为：GACGCTGCAGCCACTCAGCC，ACCACTGGCTAAATATGTAA。

4.如权利要求3所述的育种方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的育种方法，其特征在于，步骤(1)中，采用的PCR引物为：

P1：

L5AD5-F：5’-CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG-3’；

gR3-R：5’-ATGGTCTCAGGCTGCAGCGTCTGCACCAGCCGGGAA-3’；

P2：

gR3-F：5’-TAGGTCTCCAGCCACTCAGCCGTTTTAGAGCTAGAA-3’；

gR4-R：5’-CGGGTCTCATTAGCCAGTGGTTGCACCAGCCGGG-3’；

P3：

gR4-F：5’-TAGGTCTCCCTAAATATGTAAGTTTTAGAGCTAGAA-3’；

L3AD5-R：5’-TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG-3’。

6.如权利要求4所述的育种方法，其特征在于，步骤(2)中，设计的PCR引物为：

S5AD5-F：5’-CG GGTCTC A GGCA GGATG GGCAGTCTG GGCA-3’；

S3AD5-R：5’-TA GGTCTC C AAAC GGATG AGCGACAGC AAAC-3’。

7.一种水稻osarf6基因突变体在改良水稻种子粒型中的应用，其特征在于，所述水稻osarf6基因突变体编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5所示。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述水稻Osarf6基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。