CN112048011A

CN112048011A - 水稻基因OsNF-YC5在提高水稻耐盐能力中的应用

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Publication number: CN112048011A
Application number: CN202010913903.4A
Authority: CN
Inventors: 廖鹏飞; 王乐权; 李惠; 李绍波; 王鑫; 朱友林
Original assignee: Nanchang University
Current assignee: Jiangxi Daduo Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-09-03
Filing date: 2020-09-03
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2040-09-03
Also published as: CN112048011B

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术和水稻分子育种技术领域；具体涉及水稻基因OsNF‑YC5在提高水稻耐盐能力中的应用。对水稻基因OsNF‑YC5进行敲除或下调其表达，提高水稻的耐盐能力，或者选育耐盐能力高的水稻品种；水稻基因OsNF‑YC5基因组DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明可通过CRISPR等基因靶向编辑技术等基因工程手段对OsNF‑YC5基因进行基因敲除或下调表达，获得该基因下调表达或功能缺失水稻突变体显著提高了高盐胁迫的耐受能力，因此，该基因可以应用于培育耐盐水稻品种。

Description

水稻基因OsNF-YC5在提高水稻耐盐能力中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术和水稻分子育种技术领域；具体涉及水稻基因OsNF-YC5在提高水稻耐盐能力中的应用。

背景技术

据报道，世界上约有10亿hm²的土地受到盐渍化影响，在我国，盐渍化土地面积约为3600万hm²，盐碱化耕地面积约为760万hm²，占全国可利用土地面积的4.88％左右，并且盐碱化耕地每年还在迅速地增长。盐碱土壤中过量的钠(Na⁺)等会对植物造成渗透胁迫、离子胁迫和氧化胁迫。渗透胁迫导致水分流失和内部脱水，抑制细胞的膨胀和细胞分裂和营养成分的吸收，而离子和氧化胁迫导致离子毒性和代谢紊乱，影响蛋白质合成、酶活性和抑制光合作用，从而影响作物的生长和发育，给农业生产和产量带来严重的威胁。因此，如何有效地利用大面积的盐渍化土地，稳定并提高农作物的产量，成为人们关注的焦点问题。其中，应用基因工程等手段利用植物有利抗性相关基因培育优异的耐盐、高产作物新品种，是解决上述问题的有效途径之一。

NF-Y(The nuclear factor Y，核因子Y)也称之为血红素激活蛋白(HAP)，是一种CCAAT特异性结合转录因子，包含三个不同的亚基：NF-YA/HAP2，NF-YB/HAP3和NF-YC/HAP5，在哺乳动物和酵母中每种NF-Y亚基是由单个基因编码的，而在植物中是由一个大的基因家族所编码，例如在双子叶模式植物-拟南芥中基因组分别有10个NF-YA，10个NF-YB和10个NF-YC编码基因，在单子叶植物-水稻基因组中含有28个NF-Y，分别为10个NF-YA，11个NF-YB和7个NF-YC编码基因，在植物中该基因家族成员的多样性可能也暗示NF-Y多种亚基不同结合而在基因表达调控起到不同的作用，从而行使不同的功能。目前报道NF-Y因子不仅在植物生长和发育，如根的生长、叶绿体的形成、脂肪酸合成、植物开花时间和种子和胚发育中起重要的调控作用，并且在非生物胁迫中也起到非常重要的作用。例如拟南芥AtNF-YA5受到干旱和ABA强烈诱导表达，过表达AtNF-YA5的拟南芥耐旱性大大提高，主要是因为提高一系列干旱胁迫响应基因的表达，在低氮，9.4％蔗糖或低P条件下，AtNF-YA 2,3,5,7,10基因表达水平提高了5-50倍，在100mM NaCl处理下，AtNF-YA 3,5的表达水平显著提高，过表达AtNF-YA2,7和10通过参与介导基因表达调控，而提高植物对洪涝，N饥饿、冷胁迫和热胁迫等多种非生物逆境胁迫的耐受性。在盐胁迫下，AtNF-YA1负调控种子的发芽和发芽后的生长发育。在水稻中OsNF-YA2也是一个非生物胁迫的负调控子，该基因的T-DNA插入突变体水稻的旱耐性增强，大豆中GmNF-YA3表达受到ABA和PEG、NaCl和冷等逆境胁迫诱导，过量表达GmNF-YA3可以减少转基因拟南芥叶片水分散失，增强其抗旱能力以及对高盐和ABA的敏感性，青杄Pw-NF-YC基因表达能够被高盐，脱水剂和ABA诱导，过量表达可以增强拟南芥对高盐和渗透胁迫的耐受性，减少对ABA的敏感性，在水稻中过量表达狗牙根草(bermudagrass)Cdt-NF-YC1也可以增强水稻对干旱和盐胁迫的耐受性，以上研究表明植物NF-Y转录因子在植物响应和适应各种非生物逆境胁迫中具有重要作用。

水稻中OsNF-YC5基因编码NF-Y转录因子的一种亚基，但目前关于水稻OsNF-YC5具体功能尚未见报道，本专利首次报道通过CRISPR-Cas9基因靶向编辑技术等基因工程手段对OsNF-YC5基因进行敲除或下调表达，发现可以增强水稻的耐盐能力，可为培育耐盐的水稻品种提供新的基因和方法。

发明内容

本发明的目的是提供一个显著提高水稻耐盐能力的基因OsNF-YC5，通过CRISPR基因靶向编辑技术等基因工程手段对该基因进行下调表达或敲除，可以显著提高水稻对盐胁迫的耐受能力，可为培育耐盐的水稻品种提供新的基因和方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供了水稻基因OsNF-YC5在提高水稻耐盐能力中的应用，对水稻基因OsNF-YC5进行敲除或下调其表达，提高水稻的耐盐能力，或者选育耐盐能力高的水稻品种；所述水稻基因OsNF-YC5基因组DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述水稻基因OsNF-YC5的CDS序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步地，通过CRISPR-Cas9、锌指核酸酶(ZFNs)、TALENs或RNAi对水稻基因OsNF-YC5进行敲除或下调其表达。

优选利用CRISPR-Cas9技术来对水稻OsNF-YC5基因进行基因敲除，包括以下步骤：

利用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体构建OsNF-YC5基因的CRISPR-Cas9敲除载体。首先在OsNF-YC5基因ORF(Open Reading Frame)设计一个或者2个包含PAM位点的20bp左右的特异性靶位点，构建OsNF-YC5基因的靶向敲除载体，将上述载体转化水稻愈伤组织或者细胞，获得再生转基因水稻植株，经特异引物PCR扩增、测序鉴定、遗传分析等获得不同突变类型纯合缺失突变体。

本发明还提供了一种提高水稻耐盐性的方法，其特征在于，降低水稻基因OsNF-YC5的表达，所述水稻基因OsNF-YC5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过CRISPR等基因靶向编辑技术等基因工程手段对OsNF-YC5基因进行基因敲除或下调表达，获得该基因下调表达或功能缺失水稻突变体显著提高了高盐胁迫的耐受能力，因此，该基因可以应用于培育耐盐水稻品种。

附图说明

图1为pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒结构示意图；

图2为OsNF-YC5基因结构及其敲除靶点1和靶点2位置示意图；

图3为pYLsgRNA-OsU6a、pYLsgRNA-OsU6b质粒结构示意图；

图4为OsNF-YC5基因突变体基因组DNA靶点位置测序结果，其中A为靶点1位置DNA测序图，B为靶点2位置DNA测序图；1为京系17(JX17)，2、3、4分别为突变体10560-5-6、10560-39-10、10560-81-5；

图5为三个OsNF-YC5基因突变体的OsNF-YC5蛋白质氨基酸序列变化；

图6为三个OsNF-YC5基因水稻突变体和野生型(京系17)在200mM盐胁迫前、后和恢复培养一个月的表型图，其中I为突变体10560-5-6在盐胁迫下表型图，II为突变体10560-39-10在盐胁迫下表型图，III为突变体10560-81-5在盐胁迫下表型图；1为野生型(京系17)，2为OsNF-YC5基因的突变体；A为盐胁迫前；B为盐胁迫2天后；C为恢复培养一个月；

图7为三个OsNF-YC5基因水稻突变体和野生型(京系17)在200mM盐胁迫后，恢复培养一个月后存活率比较；其中**表示突变体与野生型存活率比较差异极显著。

具体实施方式

下列实施例中所用的方法如无特别说明均为常规分子生物学方法，所用引物和DNA序列为北京擎科生物科技有限公司合成和制备。

实施例1 CRISPR-Cas9敲除载体构建

(1)设计敲除靶点：OsNF-YC5基因的序列全长为6203bp，含有6个外显子，所示；然后利用在线工具CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)，在OsNF-YC5基因第3个和第6外显子选择两个敲除靶位点，见图2，并分别连上靶点选用的启动子相应的接头，第一个靶点接头正向引物碱基序列SEQ ID NO.4：5’-GCCGCTCGACCTCAGGAATGCGG-3；第一个靶点接头反向引物碱基序列SEQ ID NO.5：5’-AAACCCGCATTCCTGAGGTCGAG-3’。第二靶点靶点接头正向引物碱基序列SEQ ID NO.6：5'-GTTGTCTTGATCCTTGCAAGCGGG-3'；第二靶点靶点接头反向引物碱基序列SEQ ID NO.7：5’-AAACCCCGCTTGCAA GGATCAAG A-3’。

(2)靶点接头制备：将靶点接头正向和反向引物溶解稀释至10pmol/μL，各取1μL加入至8μL超纯水中(终浓度1pmol/μL)，混匀，95℃1min，移至室温冷却完成退火；

(3)sgRNA载体酶切：取质粒pYLsgRNA-OsU6a、pYLsgRNA-OsU6b各1μg，质粒结构见图3所示，分别在25μL反应体系中用10U BsaI-HF于37℃酶切20min，65℃20min热失活处理；

(4)sgRNA表达盒连接：分别将线性化的pYLsgRNA-OsU6a、pYLsgRNA-OsU6b与对应的靶点接头用0.5μL T4 DNA Ligase(终浓度10U/μL)于室温反应15min；

(5)sgRNA表达盒扩增：分为两轮PCR进行。第一轮PCR中每个表达盒分为2个PCR反应，各25μL反应体系：分别取1μL连接产物作为模板，引物为U-F(SEQ ID NO.8)/接头反向引物(SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7)(反应1)或接头正向引物(SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6)/gR-R(SEQ ID NO.9)(反应2)各5pmol，0.5U KOD-Plus；反应条件均为：94℃预变性3min；94℃10s，60℃15s，68℃20s，共25个循环；68℃延伸3min。取5μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。第二轮PCR中，OsU6a-Target1-sgRNA表达盒扩增引物为Pps-GGL(SEQ IDNO.10)和Pgs-GG2(SEQ ID NO.11)，OsU6b-Target2-sgRNA表达盒扩增引物为Pps-GG2(SEQID NO.12)和Pgs-GGR(SEQ ID NO.13)，各10pmol；取第一轮PCR产物各1μL用超纯水稀释10倍，再取稀释后的产物各1μL混合作为第二轮PCR的模板，1U KOD-Plus，配制50μL反应体系；反应条件均为：94℃预变性3min；94℃10s，58℃20s，68℃30s，共25个循环；68℃延伸3min。

将PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳检测并进行切胶回收。

SEQ ID NO.8：CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG

SEQ ID NO.9：CGGAGGAAAATTCCATCCAC

SEQ ID NO.10：TTCAGAggtctcTctcgACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG

SEQ ID NO.11：AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC

SEQ ID NO.12：TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG

SEQ ID NO.13：AGCGTGggtctcGaccgACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC

(6)酶切-连接反应：反应体系：10×CutSmart Buffer 1.5μL；10mM ATP 1.5μL；pYLCRISPR/Cas9Pubi-H质粒60-80ng；sgRNA表达盒混合物(10-15ng每表达盒)；10U BsaI-HF；200U T4 DNA Ligase；超纯水补足至15μL。反应条件：37℃5min；10℃5min，20℃5min，10个循环；37℃5min。

(7)转化及测序验证：取3μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，倒置培养过夜后，挑单克隆进行菌落PCR，并选取菌落PCR阳性的单克隆进行液体培养，提取质粒送生物公司测序验证，获得构建好的pYLCRISPR/Cas9-OsNF-YC5-sgRNA。

实施例2 OsNF-YC5水稻突变体获得

将上述构建成功的pYLCRISPR/Cas9-OsNF-YC5-sgRNA双靶点载体通过冻融法转化农杆菌EHA105，参照Hiei方法(Hiei Y,Ohta S,Komari T,et al.Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA[J].The Plant Journal,1994,6(2):271-282.)，采用农杆菌介导法转化水稻(京系17，JX17)的愈伤组织，经过抗性愈伤筛选、分化、生根等过程获得再生水稻幼苗，种植于大田中，然后经过潮霉素磷酸转移酶基因PCR扩增获得转基因阳性水稻苗，采用引物SEQ ID NO.14和引物SEQ ID NO.15对转基因阳性水稻基因组DNA经过PCR扩增，获得包含靶点1的DNA序列，采用引物SEQ ID NO.16和引物SEQ IDNO.17对转基因阳性水稻基因组DNA经过PCR扩增，获得包含靶点2的DNA序列测序分析获得OsNF-YC5序列改变的水稻突变体，水稻突变体靶序列测序结果，见图4，突变体10560-5-6在靶点1插入了1个碱基A，在靶点2缺失了17个碱基；突变体10560-39-10在靶点1缺失19个碱基，在靶点2缺失8个碱基；突变体10560-81-5在靶点1缺失1个碱基G，在靶点2插入了C。使3个突变体编码的蛋白质氨基酸序列提前终止，其蛋白质氨基酸序列见图5。经过繁殖加代，获得T₂代纯合突变植株。

SEQ ID NO.14：ACCGTCCATCTCGCAGTC

SEQ ID NO.15：CTCCAGCAAGTCACAACAAT

SEQ ID NO.16：ATTGGTGACAACCCTGACG

SEQ ID NO.17：ATATGCGAGGTGATGCTG

实施例3 OsNF-YC5水稻突变体抗盐性表型鉴定

将野生型水稻(京系17)和3个不同突变类型的OsNF-YC5水稻突变体T₂代种子用3％的次氯酸钠消毒30min，然后用水冲洗数次，再用水于28℃浸泡种子2天。种子露白后放置于37℃培养箱过夜。将野生型和转基因幼苗用木村B水培营养液于培养箱中培养。具体培养条件为：长日照条件(16h光照//8h黑暗)，温度为白天30℃，夜晚30℃，相对湿度为60-70％。将生长15天的野生型和转基因植株(二叶一心)分别用200mM NaCl处理48h，再用正常的水培营养液恢复一个月，然后统计野生型和转基因植株的存活率，并对生长表型进行拍照。结果表明：盐胁迫处理后，经过恢复培养，3个OsNF-YC5水稻突变体敲除突变体(10560-5-6；10560-39-10；10560-81-5的平均存活率分别为50.00％；45.83％；62.50％，显著高于野生型存活率16.67％，表明OsNF-YC5基因突变可以显著提高了水稻的耐盐性，见图6和图7。

综上所示，通过CRISPR-Cas9等基因靶向编辑技术等基因工程手段对OsNF-YC5基因进行基因敲除或下调表达，获得该基因下调表达或功能缺失水稻突变体，水稻突变体(相对于野生型)表现出对盐胁迫的耐受性显著增强，因此，该基因可以应用于改良水稻耐盐的能力。

序列表

<110> 南昌大学

<120> 水稻基因OsNF-YC5在提高水稻耐盐能力中的应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6203

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgttatcct ctatgttcct cttcctcctc cctctctccc ttctctcttt ctctctcttg 60

ggcaatctgt gggcaggggc ggcgacgtcg gcgggcgagg gctggagcag cgtcgggctg 120

cggctcatgc tactaggtac gaaactggtc agattttagc gtcgcaacga accagcgttc 180

caattagcaa gggagtagct atatttatgg cgccatattt ttcataaaaa atagtcggca 240

tgcatttaca ttgtaagtcc ctaaattaca tatgtaattt tagtgtattt acaatgtaag 300

ttctaaaatt acatatgtaa gttataaaat tacatatgta gttttagtgt atttaccatg 360

tgaattgcaa attacatatg taagtagata taaatagaag agatgctagt gcaaattcaa 420

tgggaaacta atgtataaca ggagcaacat gttcgtagta cagagagatc aaataactac 480

agacttagca aatcaaacgt tcgttaagtc aatcattaac agtgcaacat gaatctacat 540

gatatccaag ggtcagatta accgactgtg atcaagctaa ttttatgtcg ccataaatat 600

agcatgtccg aattagcaat catttgattt gattggtcag gaggtgctac tccatttttc 660

tacattaaca tcgagacggt gatcatcacc aacatgaact actacccggt tggctgttgc 720

cagctaccac ttcgacctga gcggcacggc gttcggcgcc atggccaagc cggggctcaa 780

cgacaagctc cgccactccg gcatcatcga catccacttt aggcgtgtgc cgtgcaacta 840

cccggggctc aagataaact tccacattta ggaggggtcc aacccggtgt acttcgccgt 900

gctcgtcaag tacgaggacc tcgacggcga cgtcgtgcag gtcgacctca tggagtccaa 960

gtcggcgtac ggcggcgcca tcggagtgtg gacaccgatg agggagtcat ggggctccgc 1020

atcggcagtg acatcggcaa gaccctttgt caccaacaac gtcatcccag ccatctggtc 1080

tcgaatcgcg ccatcactgc ctccgtcacc ccttccgcgc cgacctcgtt ccgcgctcgc 1140

ccactgccgc gcctctcccg cctcggtctc tccctctgcc cgcgcctccc cgacgccacc 1200

ctcgccgcgc tcaccgccgc accgtccatc tcgcagtcga catctcctgc tctcggggat 1260

tcctgctgct gcgcttgtcg ttgcatgccc gaatctgaat gatctcgact tctccaatga 1320

ccactatggc tcgacctcag gaatgcggcg gcggcggagg tggccaaggt gcgtcgcctg 1380

cagagggaga gaccgaggat gacatgtggg cccccacatg tcagtaggac ccacaatatt 1440

tttttcgtga ataatagatg ggtcatacag attttttttt ttaattctaa tgcaacgtaa 1500

gcgccacatg ggacctggac taggtcaacg tcgccacgtc agcgccacat cagcaaaatc 1560

accctccaaa accgctgagg gagtcaaatt gcactggttt caatagttcg gggagtcgtc 1620

ctatccggtt ttacggttaa gggtcaagga ttaaattcgg atcactttta agggagtcaa 1680

tgtggacttg ttccgctcac aaaatgctaa aaaattcaca aatatttatc ccttcaaaaa 1740

ccaaattggc tgtgttcggc tgggctagct gctgctacaa ttgttgtgac ttgctggagc 1800

ctgctaatgg cctaagaccc gctccattcc caatccacac cacaacagtc agatcaaata 1860

gttcaaacca acccaacccg caaatctcct ttcagaaccc aaaccaatcc aatccatttc 1920

tcacctcagc ccaaaccgca ccaatccaat cccttcctat ggattcaatc caccttgtca 1980

aaccattcta gaccatttag aatccacctt gactacaaat ccatttgatt caccatcaac 2040

tagaacatgc agcgtgctcg gcgaggagcc ctgctccgtg gcatgatcgt ctggatgggc 2100

tcggcggtgt gatggtgccg gcgtgctcga caacgacggg gaaggagcgt ggagccggtg 2160

gaatcgagca agacgaggtc tccggcgcgg cgagagcagc agctacatgt ttccctatgt 2220

agaagcagtc agcgcacgac ggcgagcctg gcattcatgg tgccgccgcc atggtttgcg 2280

tcgacctcgc cggccatcac ggcgtcgcgc gcagcctgaa cggcaacagc aagccgagca 2340

cgcggtggcc gcgatgcagc ttgttaatcg accaggaaca tgcaccgtct gtcgccgtac 2400

ttccgggcga ggcctgcgcg cggcggcatg aacgctcgta agcgtgaagc gtgggtgtac 2460

gtcgccaccg tcgccgccac caaagctgct ggagtgggtc gtccacgact atgagacctg 2520

atctagtctg tttagttgaa accattcaca atccatgggt tcaatctatg gactgaatcc 2580

atgttgtact cagaaaatcg taaccatcac caaaccaccc caaacctctt ttctggtgga 2640

tccaaaccaa tcttcagtcc aaccaaagca cacccagata caaaaccaat ccattcaacc 2700

cattacttgc tgcagttggc tgccggtttg aacagccgca gccgcagcta gtgcctccga 2760

acaagtccat tataagcaaa attaattttt cacattttca tgcaactttc ctcgaatctc 2820

tgccatgatt tgcatgattt tcacgtcgac tagaaaaaca aaataatgag cccatacact 2880

caagggttca cctttctgat tgagcgtagg atctttgatc caagcgatat gataattttc 2940

gtcaaacttc aagaaacttc tactctctcc gtccgtgaat ataagagatt ttgatatttt 3000

gtttgcaccg tttgaccatt catctttttt ttggaggtta ttcaaaaatt tttgaaatta 3060

ttatttattt tatttgtaac ttactttatt atccaaagta atttaagcat aatttttcat 3120

tttttatatt tatacaaatt tttttaataa gacaagtggt caaacgttat attagaatag 3180

tgaatatccc ttatactcac ggatggaggg agtatataat ctatgtcgaa tttgttattt 3240

caaaattata ttctcgaaaa ccattcgaaa tttccctccg aatcttctcc cgttccaggt 3300

cgaaacctct aaattcgatc caattttgtt aaaattttca cggtttcgaa tcggttctcg 3360

cccaaacaaa aaccttcaca tccacatccg catccactcc cagcctggcc gaggaggcac 3420

tgcgcggtgg gccccacatg gcagcgacgc ccccctgacc ccactccgca agacacgcgt 3480

ccgctccacg agtcataggc gaggtctcct cccttcttcc gccgcgcgtc gccttctcct 3540

ccttcctaac ctagggctcc gatttcgcca ggtgttgccc atcgcgaccg cgccaccgcc 3600

gccgccgccg ccaccgccac cgccgccgcc accgccaccg ccacctgccg gtaagcgagc 3660

ggcgccaccc taaccctgac cccgtcgtcc gtccggggtc gtcgggttcg ttgttgattc 3720

tattttattt atttttttat ctcttctctt gcagttgtgt ggggttttgg gggggttttg 3780

gcgatggaga tggtgatcgg tgcggttttg ctttcctcgt gggggagggt ttttttcttt 3840

ttttttattc tgtggtttgc gatggattgg tggtgatgtt gatgttggaa ggacgatttt 3900

ttgctcgttg atcgcgattc cccgcgcact ttgtgtttgg atcaaacaga ggcgggtctt 3960

tgccctcgta ctgttcgttc accattcgct cgatcgacag aagaagaaaa aaagaagtgc 4020

agaaagcgat ggatggagga ggggacaagg cagagacaga gatagttctc atgtttcact 4080

tttaaaaaaa aagtattttc ttttcctcta gtggtgggaa tccaattaat ttcaatttcg 4140

atcgaaagta cacaaggatg atatgatcgg tctttgtcaa tcactaatcc tgaacttagt 4200

cgtaaaagta tctgtttcga gaaatagaaa aaaaaaggga ctttctttcg tttgttcgtt 4260

caaaaataag atttcctttt tcctggatta ccgttcgtaa attcacatcg cttttgcttt 4320

attcgaacac caaactttct taggttgaac agttattcca tcaccttctc tgcatatatt 4380

gtagtgttaa gaactcaaga ggcatatgtg caggttatta aatatgcctg ttgaattaca 4440

attgcacaga acaaagcata tctgataaat ctgttaacca gaatgagact atgagtgatt 4500

ttgtcacgta ggctaatgca aaggtcatgg attgtgcatg gttctcatag tagctagtca 4560

atccactagt ttgttggacc agataattta tttatatcat gatgtggtgc cctgtgccca 4620

caccacatgg ctacatgtga ttctgcactt cttcatgctc cacaatgctg tatgagcacc 4680

tgaatagctc tgctctgcgc cgctgcacgc catctgggag gcctactttt catgcttttc 4740

actccgcaaa aactggcaga tatgagtgat atgctgaatt ggtcttgggc tgtacacttt 4800

ctctgacagt acaggtagag tttcatttgt ttgtggattg cttgatgata accaatggag 4860

ggctcctgtt gatccatggc agctgctatc tttctttcat tgatttctgc cggataggac 4920

tgagcctttt ctctgtgtgc attactgtag tattagtgtg gcatagactg ttattttact 4980

tatttggaaa aaaatggagg atggaacaat gaaatatatt cagaaatatc actatttttg 5040

tataccgtac atttaatgct gtagcatcgt tctgccttca tattatatat cgtagttttt 5100

gctcatttgg tttcttgact tcatttatca ctatatatcg aattatcact atcctgttgc 5160

tctcgtagct ggaagttgta agcttggagt agttttatat agtaattcat gcaatacatt 5220

gttggttagt ctgtttacac attttccctc aatttctgga ggtgcaacat ttttcattct 5280

ggatttgtga agaaactgga ctttagtcgt tttcactcac ctgttatcat ccttactgta 5340

ttgtagttct aatgtttaaa tttggacatt gctgtattgt tgaactgact agtttgtttt 5400

ccttctgtaa atgacagatc ctacagcagt tgcataggag tacatcttta gaaatggacc 5460

cacattcaca caagaaggca catgaaggtc tgattggtga caaccctgac gcgtatgccg 5520

tgacgacata ccaacctgtg ctgatggtag aaccatcagc cgctgctgcc ttccctccag 5580

ctccccaggt tgctccagcc tatccagtga acccaatgca gcttccagag catcagcagc 5640

acgcaatcca gcaagttcag cagctccagc agcagcagaa ggagcagctc caggcgttct 5700

gggccgacca gatggccgag gttgaacaga tgactgagtt caagctcccc aacctcccgc 5760

ttgcaaggat caagaagatc atgaaggccg atgaggacgt caagatgatc gcgggcgagg 5820

caccggcgct cttcgccaag gcctgcgaga tgttcatcct ggacatgacg ctgcggtcct 5880

ggcagcacac cgaggagggc aggaggagga cgctgcagag gagcgacgtc gaggcggtga 5940

tcaagaagac cgacatcttc gatttcttgg tggatatcat cactgatgat aagatgaagg 6000

atgatggcat gggctctcag gctgcatcca tggtttcgcc atatacctca ggaggaatgg 6060

gattttcctt tgatctgtac ccgaaccagc atcacctcgc atatatgtgg cctccacaag 6120

agcagcagga gcagtggcct ccacaggagc agcaggagca gaagcagaag caggattctg 6180

atggtggtgg acaagatgaa tga 6203

<210> 2

<211> 1593

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atgttatcct ctatgttcct cttcctcctc cctctctccc ttctctcttt ctctctcttg 60

ggcaatctgt gggcaggggc ggcgacgtcg gcgggcgagg gctggagcag cgtcgggctg 120

cggctcatgc tactaggagg tgctactcca tttttctaca ttaacatcga gacggtgatc 180

atcaccaaca tgaactacta cccggagggg tccaacccgg tgtacttcgc cgtgctcgtc 240

aagtacgagg acctcgacgg cgacgtcgtg caggtcgacc tcatggagtc caagtcggcg 300

tacggcggcg ccatcggagt gtggacaccg atgagggagt catggggctc cgcatcggca 360

gtgacatcgg caagaccctt tgtcaccaac aacgtcatcc cagccatctg gtctcgaatc 420

gcgccatcac tgcctccgtc accccttccg cgccgacctc gttccgcgct cgcccactgc 480

cgcgcctctc ccgcctcggt ctctccctct gcccgcgcct ccccgacgcc accctcgccg 540

cgctcaccgc cgcaccgtcc atctcgcagt cgacatctcc tgctctcggg gattcctgct 600

gctgcgcttg tcgttgcatg cccgaatctg aatgatctcg acttctccaa tgaccactat 660

ggctcgacct caggaatgcg gcggcggcgg aggtggccaa gttgtgtggg gttttggggg 720

ggttttggcg atggagatgg tgatcgttat tccatcacct tctctgcata tattgtagtg 780

ttaagaactc aagaggcata tgtgcagatc ctacagcagt tgcataggag tacatcttta 840

gaaatggacc cacattcaca caagaaggca catgaaggtc tgattggtga caaccctgac 900

gcgtatgccg tgacgacata ccaacctgtg ctgatggtag aaccatcagc cgctgctgcc 960

ttccctccag ctccccaggt tgctccagcc tatccagtga acccaatgca gcttccagag 1020

catcagcagc acgcaatcca gcaagttcag cagctccagc agcagcagaa ggagcagctc 1080

caggcgttct gggccgacca gatggccgag gttgaacaga tgactgagtt caagctcccc 1140

aacctcccgc ttgcaaggat caagaagatc atgaaggccg atgaggacgt caagatgatc 1200

gcgggcgagg caccggcgct cttcgccaag gcctgcgaga tgttcatcct ggacatgacg 1260

ctgcggtcct ggcagcacac cgaggagggc aggaggagga cgctgcagag gagcgacgtc 1320

gaggcggtga tcaagaagac cgacatcttc gatttcttgg tggatatcat cactgatgat 1380

aagatgaagg atgatggcat gggctctcag gctgcatcca tggtttcgcc atatacctca 1440

ggaggaatgg gattttcctt tgatctgtac ccgaaccagc atcacctcgc atatatgtgg 1500

cctccacaag agcagcagga gcagtggcct ccacaggagc agcaggagca gaagcagaag 1560

caggattctg atggtggtgg acaagatgaa tga 1593

<210> 3

<211> 530

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Leu Ser Ser Met Phe Leu Phe Leu Leu Pro Leu Ser Leu Leu Ser

1 5 10 15

Phe Ser Leu Leu Gly Asn Leu Trp Ala Gly Ala Ala Thr Ser Ala Gly

20 25 30

Glu Gly Trp Ser Ser Val Gly Leu Arg Leu Met Leu Leu Gly Gly Ala

35 40 45

Thr Pro Phe Phe Tyr Ile Asn Ile Glu Thr Val Ile Ile Thr Asn Met

50 55 60

Asn Tyr Tyr Pro Glu Gly Ser Asn Pro Val Tyr Phe Ala Val Leu Val

65 70 75 80

Lys Tyr Glu Asp Leu Asp Gly Asp Val Val Gln Val Asp Leu Met Glu

85 90 95

Ser Lys Ser Ala Tyr Gly Gly Ala Ile Gly Val Trp Thr Pro Met Arg

100 105 110

Glu Ser Trp Gly Ser Ala Ser Ala Val Thr Ser Ala Arg Pro Phe Val

115 120 125

Thr Asn Asn Val Ile Pro Ala Ile Trp Ser Arg Ile Ala Pro Ser Leu

130 135 140

Pro Pro Ser Pro Leu Pro Arg Arg Pro Arg Ser Ala Leu Ala His Cys

145 150 155 160

Arg Ala Ser Pro Ala Ser Val Ser Pro Ser Ala Arg Ala Ser Pro Thr

165 170 175

Pro Pro Ser Pro Arg Ser Pro Pro His Arg Pro Ser Arg Ser Arg His

180 185 190

Leu Leu Leu Ser Gly Ile Pro Ala Ala Ala Leu Val Val Ala Cys Pro

195 200 205

Asn Leu Asn Asp Leu Asp Phe Ser Asn Asp His Tyr Gly Ser Thr Ser

210 215 220

Gly Met Arg Arg Arg Arg Arg Trp Pro Ser Cys Val Gly Phe Trp Gly

225 230 235 240

Gly Phe Gly Asp Gly Asp Gly Asp Arg Tyr Ser Ile Thr Phe Ser Ala

245 250 255

Tyr Ile Val Val Leu Arg Thr Gln Glu Ala Tyr Val Gln Ile Leu Gln

260 265 270

Gln Leu His Arg Ser Thr Ser Leu Glu Met Asp Pro His Ser His Lys

275 280 285

Lys Ala His Glu Gly Leu Ile Gly Asp Asn Pro Asp Ala Tyr Ala Val

290 295 300

Thr Thr Tyr Gln Pro Val Leu Met Val Glu Pro Ser Ala Ala Ala Ala

305 310 315 320

Phe Pro Pro Ala Pro Gln Val Ala Pro Ala Tyr Pro Val Asn Pro Met

325 330 335

Gln Leu Pro Glu His Gln Gln His Ala Ile Gln Gln Val Gln Gln Leu

340 345 350

Gln Gln Gln Gln Lys Glu Gln Leu Gln Ala Phe Trp Ala Asp Gln Met

355 360 365

Ala Glu Val Glu Gln Met Thr Glu Phe Lys Leu Pro Asn Leu Pro Leu

370 375 380

Ala Arg Ile Lys Lys Ile Met Lys Ala Asp Glu Asp Val Lys Met Ile

385 390 395 400

Ala Gly Glu Ala Pro Ala Leu Phe Ala Lys Ala Cys Glu Met Phe Ile

405 410 415

Leu Asp Met Thr Leu Arg Ser Trp Gln His Thr Glu Glu Gly Arg Arg

420 425 430

Arg Thr Leu Gln Arg Ser Asp Val Glu Ala Val Ile Lys Lys Thr Asp

435 440 445

Ile Phe Asp Phe Leu Val Asp Ile Ile Thr Asp Asp Lys Met Lys Asp

450 455 460

Asp Gly Met Gly Ser Gln Ala Ala Ser Met Val Ser Pro Tyr Thr Ser

465 470 475 480

Gly Gly Met Gly Phe Ser Phe Asp Leu Tyr Pro Asn Gln His His Leu

485 490 495

Ala Tyr Met Trp Pro Pro Gln Glu Gln Gln Glu Gln Trp Pro Pro Gln

500 505 510

Glu Gln Gln Glu Gln Lys Gln Lys Gln Asp Ser Asp Gly Gly Gly Gln

515 520 525

Asp Glu

530

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccgctcgac ctcaggaatg cgg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaacccgcat tcctgaggtc gag 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttgtcttga tccttgcaag cggg 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaccccgct tgcaaggatc aaga 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttcagaggtc tctctcgact agtatggaat cggcagcaaa gg 42

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agcgtgggtc tcgaccgacg cgtatccatc cactccaagc tc 42

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

accgtccatc tcgcagtc 18

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctccagcaag tcacaacaat 20

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

attggtgaca accctgacg 19

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atatgcgagg tgatgctg 18

Claims

1.水稻基因OsNF-YC5在提高水稻耐盐能力中的应用，其特征在于，对水稻基因OsNF-YC5进行敲除或下调其表达，提高水稻的耐盐能力，或者选育耐盐能力高的水稻品种；所述水稻基因OsNF-YC5基因组DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的水稻基因OsNF-YC5在提高水稻耐盐能力中的应用，其特征在于，所述水稻基因OsNF-YC5的CDS序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.根据权利要求1所述的水稻基因OsNF-YC5在提高水稻耐盐能力中的应用，其特征在于，通过CRISPR-Cas9、锌指核酸酶(ZFNs)、TALENs或RNAi对水稻基因OsNF-YC5进行敲除或下调其表达。

4.根据权利要求3所述的水稻基因OsNF-YC5在提高水稻耐盐能力中的应用，其特征在于，通过CRISPR-Cas9对水稻OsNF-YC5基因进行基因敲除，利用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体构建OsNF-YC5基因的CRISPR-Cas9敲除载体，包括以下步骤：首先在OsNF-YC5基因ORF设计一个或者2个包含PAM位点的20bp左右的特异性靶位点，构建OsNF-YC5基因的靶向敲除载体，将上述载体转化水稻愈伤组织或者细胞，获得再生转基因水稻植株，经特异引物PCR扩增、测序鉴定、遗传分析获得不同突变类型纯合缺失突变体，所述突变体耐盐能力高。

5.一种提高水稻耐盐性的方法，其特征在于，降低水稻基因OsNF-YC5的表达，所述水稻基因OsNF-YC5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。