CN105907785A - 化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用 - Google Patents

化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105907785A
CN105907785A CN201610292302.XA CN201610292302A CN105907785A CN 105907785 A CN105907785 A CN 105907785A CN 201610292302 A CN201610292302 A CN 201610292302A CN 105907785 A CN105907785 A CN 105907785A
Authority
CN
China
Prior art keywords
groups
cells
plasmid
crrna
cpf1 system
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610292302.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105907785B (zh
Inventor
张佩琢
王德华
徐明亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SUZHOU GENEPHARMA CO Ltd
Original Assignee
SUZHOU GENEPHARMA CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SUZHOU GENEPHARMA CO Ltd filed Critical SUZHOU GENEPHARMA CO Ltd
Priority to CN201610292302.XA priority Critical patent/CN105907785B/zh
Publication of CN105907785A publication Critical patent/CN105907785A/zh
Priority to PCT/CN2017/082968 priority patent/WO2017190664A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105907785B publication Critical patent/CN105907785B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用；所述CRISPR/Cpf1系统中包括a1)或a2)：a1)化学合成的crRNA；a2)表达crRNA的载体。所述CRISPR/Cpf1系统为c1)或c2)或c3)或c4)：c1)LbCRISPR/Cpf1系统；c2)Lb2CRISPR/Cpf1系统；c3)FnCRISPR/Cpf1系统；c4)AsCRISPR/Cpf1系统。实验证明，化学合成的crRNA能有效行使引导Cpf1剪切编辑特定靶位点的作用，且效率很高。载体表达的crRNA或化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中均具有重要的应用价值。

Description

化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用。
背景技术
基因编辑是在基因组水平上进行精确修饰的一种技术，可完成基因定点删除(InDel)突变、基因定点插入突变、多位点同时突变和小片段的删失等。基因编辑技术可用于基因功能及疾病发病机理研究、构建疾病动物模型、生物治疗、遗传和肿瘤相关疾病研究、整合病毒疾病研究和改良农畜牧物种。基因编辑技术是从根本上改变物种遗传物质DNA的工具，具有极其广泛的应用价值和发展前景。
锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系统是三大基因编辑技术，本质上均是利用非同源末端链接途径(NHEJ)修复和同源重组(HR)修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。NHEJ修复使基因产生插入或删除突变，从而造成基因移码突变，以实现编码蛋白基因敲除，如果是基因组邻近位置两处双链断裂，NHEJ修复后则可造成基因组片段缺失。锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系统三种编辑技术的共同点是含有靶点DNA序列的识别区域及DNA剪切功能区域。其中ZFN通过锌指结构域识别靶点DNA序列，TALEN识别靶点DNA序列的区域是重复可变双残基的重复，ZFN和TALEN的DNA剪切功能区域均为一种名为Fokl的核酸内切酶结构域，FokI结构需要形成二聚体才能发挥DSB剪切功能，所以ZFNs和TALEN均需要表达两个DNA靶向-FokI核酸内切酶结构融合蛋白。而CRISPR/Cas9系统是存在于大多数细菌(约40％)和古细菌(约90％)中的一种后天免疫系统，可用来消灭或对抗外来的质体或者噬菌体，并在自身基因组中留下外来基因片段作为“记忆”，在下一次外源DNA入侵时，表达的Cas9核酸酶在含有记忆片段的crRNA及tracrRNA的指导下切割与记忆片段一样且含有PAM的外源基因，发挥抵抗外源DNA片段入侵的免疫作用。利用CRISPR/Cas9系统编辑生物基因组，可在靶标片段处造成不同形式的缺失或插入，现已成功应用于人类细胞系、斑马鱼、大鼠、小鼠、果蝇等生物中。与ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9系统中蛋白质对DNA序列的识别要更加精确得多，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性，而且CRISPR/Cas9系统的构建仅仅需要设计与靶序列互补的gRNA即可，更为简单和廉价，大大提高了基因操作的效率及简便性。但是，CRISPR/Cas9系统也存在着一些不足，如Cas9蛋白不能对任意序列进行切割，其靶点3’端要求必须含有PAM序列(如SpCas9蛋白要求PAM序列为NGG)。
最新发现的CRISPR/Cpf1系统(Zetsche B,Gootenberg JS et al.Cpf1is asingle RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system.Cell.2015Oct 22；163(3):759-71.)和CRISPR/Cas9系统同属CRISPR-Cas Class2系统，但前者仅需要一条更短的crRNA即可实现基因编辑，更有潜力实现更简单、更精确的基因组工程操作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何进行基因编辑。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用；所述CRISPR/Cpf1系统中包括a1)或a2)：
a1)化学合成的crRNA；
a2)表达crRNA的载体。
所述a2)中，所述载体可为将所述crRNA的编码DNA插入骨架载体的多克隆位点得到的重组载体。所述骨架载体可为克隆载体。所述克隆载体具体可为苏州吉玛基因股份有限公司的生产的质粒pU6gRNA。
所述a2)中，所述载体具体可为将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为所述crRNA的编码DNA得到的重组载体。
上述应用中，所述CRISPR/Cpf1系统可为c1)或c2)或c3)或c4)：
c1)LbCRISPR/Cpf1系统；
c2)Lb2CRISPR/Cpf1系统；
c3)FnCRISPR/Cpf1系统；
c4)AsCRISPR/Cpf1系统。
所述AsCRISPR/Cpf1系统来自Acidaminococcus_sp.BV3L6，其表达AsCpf1蛋白。所述FnCRISPR/Cpf1系统来自Francisella_novicida，其表达FnCpf1蛋白。所述LbCRISPR/Cpf1系统来自Lachnospiraceae bacterium ND2006，其表达LbCpf1蛋白。所述Lb2CRISPR/Cpf1系统来自Lachnospiraceae_bacterium_MA2020，其表达的Lb2Cpf1蛋白。
所述AsCpf1蛋白可为h1)或h2)或h3)：
h1)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；
h2)在h1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
h3)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
所述FnCpf1蛋白可为i1)或i2)或i3)：
i1)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白质；
i2)在i1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
i3)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
所述LbCpf1蛋白可为j1)或j2)或j3)：
j1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；
j2)在j1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
j3)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
所述Lb2Cpf1蛋白可为k1)或k2)或k3)：
k1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；
k2)在k1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
k3)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
为解决上述技术问题，本发明还提供了定向编辑基因组的方法。
本发明所提供的定向编辑基因组的方法可为方法一，可包括如下步骤：
(1)根据受体基因组中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA；
(2)化学合成所述crRNA；
(3)将所述化学合成的crRNA和编码Cpf1蛋白的基因导入所述受体，从而定向编辑所述受体基因组中的所述靶基因。
所述(1)和(3)中，所述靶基因具体可为hAAVS1基因(Gene ID：54776)和THUMPD3-AS1基因(Gene ID：440944)。根据所述hAAVS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅰ，所述靶序列Ⅰ的核苷酸序列具体可为：5’-TCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGG-3’。根据所述THUMPD3-AS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅱ，所述靶序列Ⅱ的核苷酸序列具体可为：5’-GAGAACAAGCGCCTCCCACCCACA-3’。
所述(3)中，所述Cpf1蛋白可为所述AsCpf1蛋白、所述FnCpf1蛋白、所述LbCpf1蛋白或所述Lb2Cpf1蛋白。
所述(2)和(3)中，所述化学合成的crRNA具体可为e9)-e14)中的任一种：
e9)5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUucuguccccuccaccccac-3’；
e10)5’-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUgagaacaagcgccucccac-3’；
e11)5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccac-3’；
e12)5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccacagug-3’；
e13)5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUgagaacaagcgccucccac-3’；
e14)5’-AAUUUCUACUAUUGUAGAUgagaacaagcgccucccacccac-3’。
所述e9)或所述e10)，具体可和编码所述LbCpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述LbCpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hLbCpf1。所述受体可为293T细胞。
所述e11)或所述e12)或所述e13)或所述e14)，具体可和编码所述Lb2Cpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述Lb2Cpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hLb2Cpf1。所述受体可为293T细胞。
本发明所提供的定向编辑基因组的方法可为方法二，可包括如下步骤：
㈠根据受体基因组中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA；
㈡构建表达所述crRNA的重组载体；
㈢将所述重组载体和编码Cpf1蛋白的基因导入所述受体，从而定向编辑所述受体基因组中的所述靶基因。
所述㈡和㈢中，所述重组载体可为将所述crRNA的编码DNA插入骨架载体的多克隆位点得到的重组载体。所述骨架载体可为克隆载体。所述克隆载体具体可为苏州吉玛基因股份有限公司的生产的质粒pU6gRNA。
所述㈡和㈢中，所述重组载体具体可为将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为所述crRNA的编码DNA得到的重组载体。
所述㈠和㈢中，所述靶基因具体可为hAAVS1基因(Gene ID：54776)和THUMPD3-AS1基因(Gene ID：440944)。根据所述hAAVS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅰ，所述靶序列Ⅰ的核苷酸序列具体可为：5’-TCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGG-3’。根据所述THUMPD3-AS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅱ，所述靶序列Ⅱ的核苷酸序列具体可为：5’-GAGAACAAGCGCCTCCCACCCACA-3’。
所述㈢中，所述Cpf1蛋白可为所述AsCpf1蛋白、所述FnCpf1蛋白、所述LbCpf1蛋白或所述Lb2Cpf1蛋白。
所述㈠中，所述“根据受体基因组中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA”具体可为e1)-e8)中的任一种：
e1)5’-UAAUUUCUACUCUUGUAGAUucuguccccuccaccccacaguggUUUUUU-3’；
e2)5’-UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCACAUUUUUU-3’；
e3)5’-UAAUUUCUACUGUUGUAGAUucuguccccuccaccccacaguggUUUUUU-3’；
e4)5’-UAAUUUCUACUGUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCACAUUUUUU-3’；
e5)5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUucuguccccuccaccccacaguggUUUUUU-3’；
e6)5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCACAUUUUUU-3’；
e7)5’-GAAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccacaguggUUUUUU-3’；
e8)5’-GAAUUUCUACUAUUGUAGAUGAGUUCUUGCGCCUCCCACCCACAUUUUUU-3’。
表达所述e1)或所述e2)的重组载体，具体可和编码所述AsCpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述AsCpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hAsCpf1。所述受体可为293T细胞。
表达所述e3)或所述e4)的重组载体，具体可和编码所述FnCpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述FnCpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hFnCpf1。所述受体可为293T细胞。
表达所述e5)或所述e6)的重组载体，具体可和编码所述LbCpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述LbCpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hLbCpf1。所述受体可为293T细胞。
表达所述e7)或所述e8)的重组载体，具体可和编码所述Lb2Cpf1蛋白的基因导入所述受体。所述编码所述Lb2Cpf1蛋白的基因可通过质粒的形式导入所述受体。所述质粒具体可为Addgene公司的质粒pcDNA3.1-hLb2Cpf1。所述受体可为293T细胞。
为解决上述技术问题，本发明还提供了定向编辑基因组的CRISPR/Cpf1系统。
本发明所提供的定向编辑基因组的CRISPR/Cpf1系统，该系统中包括a1)或a2)：
a1)化学合成的crRNA；
a2)表达crRNA的载体。
所述a2)中，所述载体可为将所述crRNA的编码DNA插入骨架载体的多克隆位点得到的重组载体。所述骨架载体可为克隆载体。所述克隆载体具体可为苏州吉玛基因股份有限公司的生产的质粒pU6gRNA。
所述a2)中，所述载体具体可为将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为所述crRNA的编码DNA得到的重组载体。
上述系统中，所述CRISPR/Cpf1系统可为上述任一所述LbCRISPR/Cpf1系统或上述任一所述Lb2CRISPR/Cpf1系统或上述任一所述FnCRISPR/Cpf1系统或上述任一所述AsCRISPR/Cpf1系统。
实验证明，重组载体表达的crRNA在AsCRISPR/Cpf1系统、FnCRISPR/Cpf1系统、LbCRISPR/Cpf1系统和Lb2CRISPR/Cpf1系统中均有一定的基因编辑能力，且上述各CRISPR/Cpf1系统的基因编辑能力依次为：AsCRISPR/Cpf1系统＞FnCRISPR/Cpf1系统＞LbCRISPR/Cpf1系统＞Lb2CRISPR/Cpf1系统；化学合成的crRNA能有效行使引导Cpf1剪切编辑特定靶位点的作用，且效率很高，同时化学合成的crRNA在LbCRISPR/Cpf1系统和Lb2CRISPR/Cpf1系统中均有一定的基因编辑能力，并且化学合成的crRNA可直接转染，比通过构建重组载体转染便于操作，更可控，并且便于进行化学修饰。因此，重组载体表达的crRNA和/或化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中均具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1步骤二中3的T7E1突变检测结果。
图2为实施例1步骤二中4的测序结果。
图3为实施例2步骤二中3的T7E1突变检测结果。
图4为实施例2步骤二中4的测序结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
质粒pcDNA3.1-hAsCpf1、质粒pcDNA3.1-hFnCpf1、质粒pcDNA3.1-hLbCpf1和质粒pcDNA3.1-hLb2Cpf1均为Addgene公司的产品，在下文中，质粒pcDNA3.1-hAsCpf1简称为质粒Y1681，质粒pcDNA3.1-hFnCpf1简称为质粒Y1682，质粒pcDNA3.1-hLbCpf1简称为质粒Y1683，质粒pcDNA3.1-hLb2Cpf1简称为质粒Y1684。
质粒pU6gRNA为苏州吉玛基因股份有限公司的产品，质粒pU6gRNA(环形)的核苷酸序列如序列表序列1所示。在下文中，质粒pU6gRNA简称为Y523。293T细胞为中国科学院细胞库产品，目录号为GNHu17。DMEM培养基和FBS均为Gibco公司的产品。细胞孔板为Corning公司的产品。Max酶为Vazyme公司产品，货号为P505。Genomic DNA Extraction kit为Takara公司产品，产品目录号为#9765。Trypsin-EDTA Solution为Hyclone公司，货号为SH30042.02。PBS缓冲液是用超纯水稀释PBS(10×)至10倍体积得到的；PBS(10×)为生工生物工程(上海)股份有限公司产品，货号为E607016。OPTI-MEM培养基为Gibco公司产品，产品目录号为#31985-070。lipofectamine 2000为thermo fisher-invitrogen公司产品，货号为11668-027。T7E1为T7E1突变检测试剂盒中的组件；T7E1突变检测试剂盒为苏州吉玛基因股份有限公司的产品。DNA Marker为Thermo Fisher公司产品，产品名称为GeneRuler DNALadder Mix，货号为SM0331。10×退火buffer：含10mM EDTA·2Na、1000mM NaCl的pH 8.0、100mM Tris-HCl缓冲液。
实施例1、检测AsCRISPR/Cpf1系统、FnCRISPR/Cpf1系统、LbCRISPR/Cpf1系统和Lb2CRISPR/Cpf1系统的基因编辑能力
选择hAAVS1基因(Gene ID：54776)和THUMPD3-AS1基因(Gene ID：440944)作为检测AsCRISPR/Cpf1系统、FnCRISPR/Cpf1系统、LbCRISPR/Cpf1系统和Lb2CRISPR/Cpf1系统的基因编辑能力的靶基因。其中AsCRISPR/Cpf1系统来自Acidaminococcus_sp.BV3L6，其表达序列表中序列6所示的AsCpf1蛋白；FnCRISPR/Cpf1系统来自Francisella_novicida，其表达序列表中序列5所示的FnCpf1蛋白；LbCRISPR/Cpf1系统来自Lachnospiraceaebacterium ND2006，其表达序列表中序列3所示的LbCpf1蛋白；Lb2CRISPR/Cpf1系统来自Lachnospiraceae_bacterium_MA2020，其表达序列表中序列4所示的Lb2Cpf1蛋白。
根据hAAVS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅰ，根据THUMPD3-AS1基因的核苷酸序列选择靶序列Ⅱ。靶序列Ⅰ和靶序列Ⅱ的序列如下：
靶序列Ⅰ：5’-TCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGG-3’；
靶序列Ⅱ：5’-GAGAACAAGCGCCTCCCACCCACA-3’。
一、质粒的构建
1、质粒Y1640的构建
(1)用限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ双酶切质粒pU6gRNA，回收约2955bp的载体骨架。
(2)由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1640-S：5’-CACCgTAATTTCTACTCTTGT AGAT g-3’(单下划线为AscrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)和引物Y1640-A：5’-aattc ATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为AscrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1640-S和引物Y1640-A稀释至100μM，得到引物Y1640-S稀释液和引物Y1640-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅰ。
退火体系：引物Y1640-S稀释液5μL、引物Y1640-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
(3)将载体骨架和DNA分子Ⅰ连接，得到质粒Y1640。
根据测序结果，对质粒Y1640进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅰ。质粒Y1640的核苷酸序列如序列表序列2所示。
2、质粒Y1641的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅱ，其它步骤均不变，得到质粒Y1641。
DNA分子Ⅱ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1641-S：5’-CACCgTAATTTCTACTCTTGTAGAT g-3’(单下划线为AscrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)和引物Y1641-A：5’-aattc ATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为AscrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1641-S和引物Y1641-A稀释至100μM，得到引物Y1641-S稀释液和引物Y1641-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅱ。
退火体系：引物Y1641-S稀释液5μL、引物Y1641-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1641进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅱ。
3、质粒Y1642的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅲ，其它步骤均不变，得到质粒Y1642。
DNA分子Ⅲ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1642-S：5’-CACCgTAATTTCTACTGTTGTAGAT g-3’(单下划线为FncrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)和引物Y1642-A：5’-aattc ATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为Fn crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1642-S和引物Y1642-A稀释至100μM，得到引物Y1642-S稀释液和引物Y1642-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅲ。
退火体系：引物Y1642-S稀释液5μL、引物Y1642-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1642进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅲ。
4、质粒Y1643的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅳ，其它步骤均不变，得到质粒Y1643；
DNA分子Ⅳ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1643-S：5’-CACCgTAATTTCTACTGTTGTAGAT g-3’(单下划线为FncrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)和引物Y1643-A：5’-aattc ATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为Fn crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1643-S和引物Y1643-A稀释至100μM，得到引物Y1643-S稀释液和引物Y1643-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅲ。
退火体系：引物Y1643-S稀释液5μL、引物Y1643-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1643进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅳ。
5、质粒Y1644的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅴ，其它步骤均不变，得到质粒Y1644。
DNA分子Ⅴ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1644-S：5’-CACCgTAATTTCTACTAAGTGTAGAT g-3’(单下划线为LbcrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)和引物Y1644-A：5’-aattc ATCTACACTTAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为Lb crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1644-S和引物Y1644-A稀释至100μM，得到引物Y1644-S稀释液和引物Y1644-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅴ。
退火体系：引物Y1644-S稀释液5μL、引物Y1644-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1644进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅴ。
6、质粒Y1645的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅵ，其它步骤均不变，得到质粒Y1645。
DNA分子Ⅵ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1645-S：5’-CACCgTAATTTCTACTAAGTGTAGAT g-3’(单下划线为LbcrRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)和引物Y1645-A：5’-aattc ATCTACACTTAGTAGAAATTAc-3’(单下划线为Lb crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1645-S和引物Y1645-A稀释至100μM，得到引物Y1645-S稀释液和引物Y1645-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅵ。
退火体系：引物Y1645-S稀释液5μL、引物Y1645-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1645进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅵ。
7、质粒Y1646的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅶ，其它步骤均不变，得到质粒Y1646。
DNA分子Ⅶ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1646-S：5’-CACCgGAATTTCTACTATTGTAGAT g-3’(单下划线为Lb2crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)和引物Y1646-A：5’-aattc ATCTACAATAGTAGAAATTCc-3’(单下划线为Lb2crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅰ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1646-S和引物Y1646-A稀释至100μM，得到引物Y1646-S稀释液和引物Y1646-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅶ。
退火体系：引物Y1646-S稀释液5μL、引物Y1646-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1646进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅶ。
8、质粒Y1647的构建
按照步骤1的方法，仅将DNA分子Ⅰ替换为DNA分子Ⅷ，其它步骤均不变，得到质粒Y1647。
DNA分子Ⅷ的制备方法如下：由苏州吉玛基因股份有限公司合成引物Y1647-S：5’-CACCgGAATTTCTACTATTGTAGAT g-3’(单下划线为Lb2crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)和引物Y1647-A：5’-aattc ATCTACAATAGTAGAAATTCc-3’(单下划线为Lb2crRNA骨架序列，双下划线为靶序列Ⅱ，波浪线为终止序列)，用去离子水分别将引物Y1647-S和引物Y1647-A稀释至100μM，得到引物Y1647-S稀释液和引物Y1647-A稀释液；然后进行退火反应，形成DNA分子Ⅷ。
退火体系：引物Y1647-S稀释液5μL、引物Y1647-S稀释液5μL、去离子水35μL、10×退火buffer(含)5μL。
退火程序：99℃10min，85℃5min，80℃5min，75℃5min，70℃5min，16℃保存。
根据测序结果，对质粒Y1647进行结构描述如下：将质粒pU6gRNA的限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ识别序列间的片段(质粒pU6gRNA被限制性内切酶BbsⅠ和EcoRⅠ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为DNA分子Ⅷ。
二、检测AsCRISPR/Cpf1系统、FnCRISPR/Cpf1系统、LbCRISPR/Cpf1系统和Lb2CRISPR/Cpf1系统的基因编辑能力
1、共转染
(1)Y1681-Y1640-293T细胞组的获得
质粒Y1681和质粒Y1640共转染293T细胞的步骤如下：
①将293T细胞置于装有10％(体积比)FBS的DMEM培养基的培养皿(直径为10cm)，37℃、5％CO2培养箱中培养，待293T细胞培养至80～90％融合时，弃培养基，用3mL PBS洗涤两次。
②完成步骤①后，向所述培养皿中加入1mL Trypsin-EDTA Solution，混匀，然后吸出液相，37℃静置1～2min。
③完成步骤②后，向所述培养皿中加入2mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，吹打形成单细胞悬液。
④完成步骤③后，将所述单细胞悬液接种于6孔板，每孔约接种2×105个293T细胞，37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
⑤完成步骤④后，将所述6孔板中的培养基更换为OPTI-MEM培养基，然后加入4μg质粒Y1681和4μg质粒Y1640，进行共转染(共转染过程中，转染试剂为lipofectamine 2000，培养基为OPTI-MEM培养基，共转染的步骤参考Lipofectamin2000说明书)，然后37℃、5％CO2培养箱中孵育6h，然后更换为新的OPTI-MEM培养基，37℃、5％CO2培养箱中继续培养18h。
⑥重复步骤⑤一次。
⑦完成步骤⑥后48h，收集细胞，然后用1mL PBS洗涤一次。
⑧完成步骤⑦后，向所述培养皿中加入0.5mL Trypsin-EDTA Solution，混匀，然后吸出液相，37℃静置1～2min。
⑨完成步骤⑧后，向所述培养皿中加入1mL含10％(体积比)FBS的DMEM培养基，吹打形成单细胞悬液；将该单细胞悬液1000rpm离心3min，得到沉淀1。
⑩完成步骤⑨后，向所述沉淀中加入1mL PBS，1000rpm离心3min，得到沉淀2。
沉淀2即为质粒Y1681和质粒Y1640共转染后的293T细胞组，简称Y1681-Y1640-293T细胞组。
(2)Y1681-293T细胞组的获得
质粒Y1681转染293T细胞的步骤如下：
①同步骤(1)中①。
②同步骤(1)中②。
③同步骤(1)中③。
④同步骤(1)中④。
⑤完成步骤④后，将所述6孔板中的培养基更换为OPTI-MEM培养基，然后加入4μg质粒Y1681，进行转染(共转染过程中，转染试剂为lipofectamine 2000，培养基为OPTI-MEM培养基，共转染的步骤参考Lipofectamin2000说明书)，然后37℃、5％CO2培养箱中孵育6h，然后更换为新的OPTI-MEM培养基，37℃、5％CO2培养箱中继续培养18h。
⑥重复步骤⑤一次。
⑦同步骤(1)中⑦。
⑧同步骤(1)中⑧。
⑨同步骤(1)中⑨。
⑩同步骤(1)中⑩。
步骤⑩获得的沉淀即为质粒Y1681转染后的293T细胞组，简称Y1681-293T细胞组。
(3)Y1681-Y1641-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1641，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1641-293T细胞组。
(4)Y1681-Y1642-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1642，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1642-293T细胞组。
(5)Y1681-Y1643-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1643，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1643-293T细胞组。
(6)Y1681-Y1644-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1644，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1644-293T细胞组。
(7)Y1681-Y1645-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1645，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1645-293T细胞组。
(8)Y1681-Y1646-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1646，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1646-293T细胞组。
(9)Y1681-Y1647-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1647，其它步骤均不变，得到Y1681-Y1647-293T细胞组。
(10)Y1682-Y1640-293T细胞组、Y1683-Y1640-293T细胞组和Y1684-Y1640-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1640-293T细胞组、Y1683-Y1640-293T细胞组和Y1684-Y1640-293T细胞组。
(11)Y1682-293T细胞组、Y1683-293T细胞组和Y1684-293T细胞组的获得
按照上述步骤(2)的方法，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-293T细胞组、Y1683-293T细胞组和Y1684-293T细胞组。
(12)Y1682-Y1641-293T细胞组、Y1683-Y1641-293T细胞组和Y1684-Y1641-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1641，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1641-293T细胞组、Y1683-Y1641-293T细胞组和Y1684-Y1641-293T细胞组。
(13)Y1682-Y1642-293T细胞组、Y1683-Y1642-293T细胞组和Y1684-Y1642-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1642，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1642-293T细胞组、Y1683-Y1642-293T细胞组和Y1684-Y1642-293T细胞组。
(14)Y1682-Y1643-293T细胞组、Y1683-Y1643-293T细胞组和Y1684-Y1643-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1643，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1643-293T细胞组、Y1683-Y1643-293T细胞组和Y1684-Y1643-293T细胞组。
(15)Y1682-Y1644-293T细胞组、Y1683-Y1644-293T细胞组和Y1684-Y1644-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1644，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1644-293T细胞组、Y1683-Y1644-293T细胞组和Y1684-Y1644-293T细胞组。
(16)Y1682-Y1645-293T细胞组、Y1683-Y1645-293T细胞组和Y1684-Y1645-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1645，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1645-293T细胞组、Y1683-Y1645-293T细胞组和Y1684-Y1645-293T细胞组。
(17)Y1682-Y1646-293T细胞组、Y1683-Y1646-293T细胞组和Y1684-Y1646-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1646，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1646-293T细胞组、Y1683-Y1646-293T细胞组和Y1684-Y1646-293T细胞组。
(18)Y1682-Y1647-293T细胞组、Y1683-Y1647-293T细胞组和Y1684-Y1647-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1647，将质粒Y1681分别替换为质粒Y1682、质粒Y1683和质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1682-Y1647-293T细胞组、Y1683-Y1647-293T细胞组和Y1684-Y1647-293T细胞组。
2、各细胞的基因组DNA的提取和PCR扩增产物的回收
(1)用Genomic DNA Extraction kit分别提取步骤1获得的各细胞组的基因组DNA。
(2)完成步骤(1)后，以步骤(1)提取的Y1681-Y1640-293T细胞组、Y1682-Y1640-293T细胞组、Y1683-Y1640-293T细胞组和Y1684-Y1640-293T细胞组、Y1681-Y1642-293T细胞组、Y1682-Y1642-293T细胞组、Y1683-Y1642-293T细胞组、Y1684-Y1642-293T细胞组、Y1681-Y1644-293T细胞组、Y1682-Y1644-293T细胞组、Y1683-Y1644-293T细胞组、Y1684-Y1644-293T细胞组、Y1681-Y1646-293T细胞组、Y1682-Y1646-293T细胞组、Y1683-Y1646-293T细胞组或Y1684-Y1646-293T细胞组的基因组DNA为模板，以hAAV-F：5’-GGGTCACCTCTCACTCCTTTCAT-3’和hAAV-R：5’-ATCCTCTCTGGCTCCATCGTAAG-3’组成的引物，用Max酶进行PCR扩增，得到475bp的PCR扩增产物甲。
(3)完成步骤(1)后，以步骤(1)提取的Y1681-Y1641-293T细胞组、Y1682-Y1641-293T细胞组、Y1683-Y1641-293T细胞组和Y1684-Y1641-293T细胞组、Y1681-Y1643-293T细胞组、Y1682-Y1643-293T细胞组、Y1683-Y1643-293T细胞组、Y1684-Y1643-293T细胞组、Y1681-Y1645-293T细胞组、Y1682-Y1645-293T细胞组、Y1683-Y1645-293T细胞组、Y1684-Y1645-293T细胞组、Y1681-Y1647-293T细胞组、Y1682-Y1647-293T细胞组、Y1683-Y1647-293T细胞组或Y1684-Y1647-293T细胞组的基因组DNA为模板，以hRosa26-F：5’-AACCTCGACACCAACTCTAGTCC-3’和hRosa26-R：5’-TCTCACATGAGCGAAACCACTGC-3’组成的引物，用Max酶进行PCR扩增，得到670bp的PCR扩增产物乙。
3、T7E1突变检测
(1)样品的制备
①将PCR扩增产物甲进行胶回收，得到回收产物甲；将PCR扩增产物乙进行胶回收，得到回收产物乙。
②完成步骤①后，配制退火反应体系：退火反应体系包括回收产物甲或回收产物乙1～3μg、突变检测buffer 3μL，用ddH2O补至30μL。
③完成步骤②后，进行退火反应。反应条件为：首先98℃10min，然后缓慢降温(降温速度<1℃/10s)至25℃，最后25℃5min。
完成步骤③后的退火反应体系即为制备的样品。
(2)T7E1处理
取步骤(1)制备的样品20μL，加入0.5μL T7E1，得到处理体系；然后37℃条件下反应30min。
(3)电泳分析和结果判断
将完成步骤(2)的处理体系用浓度为1.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，然后进行如下结果判断：
如果PCR扩增产物甲可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为198bp和277bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成hAAVS1基因的突变；如果PCR扩增产物甲被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成hAAVS1基因的突变；
如果PCR扩增产物乙可被T7EⅠ酶切为两段且大小分别约为286bp和384bp、说明相应的CRISPR/Cpf1系统造成THUMPD3-AS1基因的突变；如果PCR扩增产物乙被T7EⅠ酶切后的大小无明显变化，则相应的CRISPR/Cpf1系统不造成THUMPD3-AS1基因的突变。
T7E1突变检测实验结果见图1(图1中A为hAAVS1基因的突变检测结果：左上为AsCRISPR/Cpf1系统，其中M为DNA Marker，“-”为Y1681-293T细胞组，As为Y1681-Y1640-293T细胞组，Fn为Y1681-Y1642-293T细胞组，Lb为Y1681-Y1644-293T细胞组，Lb2为Y1681-Y1646-293T细胞组；右上为FnCRISPR/Cpf1系统，其中M为DNA Marker，“-”为Y1682-293T细胞组，As为Y1682-Y1640-293T细胞组，Fn为Y1682-Y1642-293T细胞组，Lb为Y1682-Y1644-293T细胞组，Lb2为Y1682-Y1646-293T细胞组；左下为LbCRISPR/Cpf1系统，其中M为DNAMarker，“-”为Y1683-293T细胞组，As为Y1683-Y1640-293T细胞组，Fn为Y1683-Y1642-293T细胞组，Lb为Y1683-Y1644-293T细胞组，Lb2为Y1683-Y1646-293T细胞组；右下为Lb2CRISPR/Cpf1系统，其中M为DNA Marker，“-”为Y1684-293T细胞组，As为Y1684-Y1640-293T细胞组，Fn为Y1684-Y1642-293T细胞组，Lb为Y1684-Y1644-293T细胞组，Lb2为Y1684-Y1646-293T细胞组。图1中B为THUMPD3-AS1基因的突变检测结果：左上为AsCRISPR/Cpf1系统，其中M为DNA Marker，“-”为Y1681-293T细胞组，As为Y1681-Y1641-293T细胞组，Fn为Y1681-Y1643-293T细胞组，Lb为Y1681-Y1645-293T细胞组，Lb2为Y1681-Y1647-293T细胞组；右上为FnCRISPR/Cpf1系统，其中M为DNA Marker，“-”为Y1682-293T细胞组，As为Y1682-Y1641-293T细胞组，Fn为Y1682-Y1643-293T细胞组，Lb为Y1682-Y1645-293T细胞组，Lb2为Y1682-Y1647-293T细胞组；左下为LbCRISPR/Cpf1系统，其中M为DNA Marker，“-”为Y1683-293T细胞组，As为Y1683-Y1641-293T细胞组，Fn为Y1683-Y1643-293T细胞组，Lb为Y1683-Y1645-293T细胞组，Lb2为Y1683-Y1647-293T细胞组；右下为Lb2CRISPR/Cpf1系统，其中M为DNA Marker，“-”为Y1684-293T细胞组，As为Y1684-Y1641-293T细胞组，Fn为Y1684-Y1643-293T细胞组，Lb为Y1684-Y1645-293T细胞组，Lb2为Y1684-Y1647-293T细胞组)。结果表明，AsCRISPR/Cpf1系统、FnCRISPR/Cpf1系统、LbCRISPR/Cpf1系统和Lb2CRISPR/Cpf1系统均造成hAAVS1基因和THUMPD3-AS1基因的突变。因此，上述各CRISPR/Cpf1系统均有一定的基因编辑能力。
4、PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙的测序
将步骤2中(2)得到的PCR扩增产物甲进行测序，引物为hAAV-ce：5’-cagctcccctaccccccttac-3’。将步骤2中(3)得到的PCR扩增产物乙进行测序，引物为hRosa26-ce：5’-cgcccagggaccaagttagc-3’。测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
测序结果见图2(图2中A为AsCRISPR/Cpf1系统对hAAVS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1681-293T细胞组，(b)为Y1681-Y1640-293T细胞组，(c)为Y1681-Y1642-293T细胞组，(d)为Y1681-Y1644-293T细胞组，(e)为Y1681-Y1646-293T细胞组；图2中B为AsCRISPR/Cpf1系统对THUMPD3-AS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1681-293T细胞组，(b)为Y1681-Y1641-293T细胞组，(c)为Y1681-Y1643-293T细胞组，(d)为Y1681-Y1645-293T细胞组，(e)为Y1681-Y1647-293T细胞组；图2中C为FnCRISPR/Cpf1系统对hAAVS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1682-293T细胞组，(b)为Y1682-Y1640-293T细胞组，(c)为Y1682-Y1642-293T细胞组，(d)为Y1682-Y1644-293T细胞组，(e)为Y1682-Y1646-293T细胞组；图2中D为FnCRISPR/Cpf1系统对THUMPD3-AS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1682-293T细胞组，(b)为Y1682-Y1641-293T细胞组，(c)为Y1682-Y1643-293T细胞组，(d)为Y1682-Y1645-293T细胞组，(e)为Y1682-Y1647-293T细胞组；图2中E为LbCRISPR/Cpf1系统对hAAVS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1683-293T细胞组，(b)为Y1683-Y1640-293T细胞组，(c)为Y1683-Y1642-293T细胞组，(d)为Y1683-Y1644-293T细胞组，(e)为Y1683-Y1646-293T细胞组；图2中F为LbCRISPR/Cpf1系统对THUMPD3-AS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1683-293T细胞组，(b)为Y1683-Y1641-293T细胞组，(c)为Y1683-Y1643-293T细胞组，(d)为Y1683-Y1645-293T细胞组，(e)为Y1683-Y1647-293T细胞组；图2中G为Lb2CRISPR/Cpf1系统对hAAVS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1684-293T细胞组，(b)为Y1684-Y1640-293T细胞组，(c)为Y1684-Y1642-293T细胞组，(d)为Y1684-Y1644-293T细胞组，(e)为Y1684-Y1646-293T细胞组；图2中H为Lb2CRISPR/Cpf1系统对THUMPD3-AS1基因的编辑能力，其中(a)为Y1684-293T细胞组，(b)为Y1684-Y1641-293T细胞组，(c)为Y1684-Y1643-293T细胞组，(d)为Y1684-Y1645-293T细胞组，(e)为Y1684-Y1647-293T细胞组)。测序结果表明，AsCRISPR/Cpf1系统、FnCRISPR/Cpf1系统、LbCRISPR/Cpf1系统和Lb2CRISPR/Cpf1系统均造成hAAVS1基因和THUMPD3-AS1基因的突变，且上述各CRISPR/Cpf1系统的基因编辑能力依次为：AsCRISPR/Cpf1系统＞FnCRISPR/Cpf1系统＞LbCRISPR/Cpf1系统＞Lb2CRISPR/Cpf1系统。因此，AsCRISPR/Cpf1系统、FnCRISPR/Cpf1系统、LbCRISPR/Cpf1系统和Lb2CRISPR/Cpf1系统均可运用于基因编辑技术。
实施例2、化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用
一、化学合成的crRNA的制备
合成表1中所示的crRNA。表1中，单下划线为Lb crRNA骨架序列自5’末端起第2至21位，虚线为Lb2crRNA骨架序列自5’末端起第2至20位，双下划线为靶序列Ⅰ自5’末端起第1至19位，方框为靶序列Ⅰ自5’末端起第1至23位，单波浪线为靶序列Ⅱ自5’末端起第1至23位，双波浪线为靶序列Ⅱ自5’末端起第1至19位。
表1中所示的所有crRNA为均1OD(33μg)一管，每管中加入66μL DEPC水，得到RNA浓度均为0.5μg/μL的RNA溶液。
表1.化学合成的crRNA的基本信息
二、检测化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统中的基因编辑能力
1、共转染
(1)Y1683-A39-293T细胞组的获得
质粒Y1683和A39共转染293T细胞的步骤如下：
①同实施例1步骤二1(1)中①。
②同实施例1步骤二1(1)中②。
③同实施例1步骤二1(1)中③。
④同实施例1步骤二1(1)中④。
⑤完成步骤④后，将所述6孔板中的培养基更换为OPTI-MEM培养基，然后加入4μg质粒Y1683和2μg A39(即加入RNA溶液4μL)，进行共转染(共转染过程中，转染试剂为lipofectamine 2000，培养基为OPTI-MEM培养基，共转染的步骤参考Lipofectamin2000说明书)，然后37℃、5％CO2培养箱中孵育6h，然后更换为新的OPTI-MEM培养基，37℃、5％CO2培养箱中继续培养18h。
⑥重复步骤⑤一次。
⑦同实施例1步骤二1(1)中⑦。
⑧同实施例1步骤二1(1)中⑧。
⑨同实施例1步骤二1(1)中⑨。
⑩同实施例1步骤二1(1)中⑩。
步骤⑩中的沉淀即为质粒Y1683和A39共转染后的293T细胞组，简称Y1683-A39-293T细胞组。
(2)Y1683-R39-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒A39替换为R39，其它步骤均不变，得到Y1683-R39-293T细胞组。
(3)Y1683-293T细胞组的获得
按照实施例1步骤二1中(2)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1683，其它步骤均不变，得到Y1683-293T细胞组。
(4)Y1683-Y1644-293T细胞组的获得
按照实施例1步骤二1中(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1644，将质粒Y1681替换为质粒Y1683，其它步骤均不变，得到Y1683-Y1644-293T细胞组。
(5)Y1683-Y1645-293T细胞组的获得
按照实施例1步骤二1中(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1645，将质粒Y1681替换为质粒Y1683，其它步骤均不变，得到Y1683-Y1645-293T细胞组。
(6)Y1684-A38-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1683替换为质粒Y1684，将质粒A39替换为A38，其它步骤均不变，得到Y1684-A38-293T细胞组。
(7)Y1684-A42-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1683替换为质粒Y1684，将质粒A39替换为A42，其它步骤均不变，得到Y1684-A42-293T细胞组。
(8)Y1684-R38-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1683替换为质粒Y1684，将质粒A39替换为R38，其它步骤均不变，得到Y1684-R38-293T细胞组。
(9)Y1684-R42-293T细胞组的获得
按照上述步骤(1)的方法，将质粒Y1683替换为质粒Y1684，将质粒A39替换为R42，其它步骤均不变，得到Y1684-R42-293T细胞组。
(10)Y1684-293T细胞组的获得
按照实施例1步骤二1中(2)的方法，将质粒Y1681替换为质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1684-293T细胞组。
(11)Y1684-Y1646-293T细胞组的获得
按照实施例1步骤二1中(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1646，将质粒Y1681替换为质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1684-Y1646-293T细胞组。
(12)Y1684-Y1647-293T细胞组的获得
按照实施例1步骤二1中(1)的方法，将质粒Y1640替换为质粒Y1647，将质粒Y1681替换为质粒Y1684，其它步骤均不变，得到Y1684-Y1647-293T细胞组。
2、各细胞的基因组DNA的提取和PCR扩增产物的回收
(1)用Genomic DNA Extraction kit分别提取步骤1获得的各细胞组的基因组DNA。
(2)完成步骤(1)后，以步骤(1)提取的Y1683-293T细胞组、Y1683-Y1644-293T细胞组、Y1684-Y1646-293T细胞组、Y1683-A39-293T细胞组、Y1684-A38-293T细胞组或Y1684-A42-293T细胞组的基因组DNA为模板，以hAAV-F：5’-GGGTCACCTCTCACTCCTTTCAT-3’和hAAV-R：5’-ATCCTCTCTGGCTCCATCGTAAG-3’组成的引物，用Max酶进行PCR扩增，得到475bp的PCR扩增产物甲。
(3)完成步骤(1)后，以步骤(1)提取的Y1684-293T细胞组、Y1683-Y1645-293T细胞组、Y1684-Y1647-293T细胞组、Y1683-R39-293T细胞组、Y1684-R38-293T细胞组或Y1684-R42-293T细胞组的基因组DNA为模板，以hRosa26-F：5’-AACCTCGACACCAACTCTAGTCC-3’和hRosa26-R：5’-TCTCACATGAGCGAAACCACTGC-3’组成的引物，用Max酶进行PCR扩增，得到670bp的PCR扩增产物乙。
3、PCR扩增产物的T7E1突变检测
同实施例1步骤二中3。
实验结果见图3(图3中A为化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统中hAAVS1基因的突变检测结果：其中M为DNA Marker，B为Y1683-293T细胞组，LbA为Y1683-Y1644-293T细胞组，Lb2A为Y1684-Y1646-293T细胞组，A39为Y1683-A39-293T细胞组，A38为Y1684-A38-293T细胞组，A42为Y1684-A42-293T细胞组；图3中B为化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统中THUMPD3-AS1基因的突变检测结果：其中M为Marker，B为Y1684-293T细胞组，LbR为Y1683-Y1645-293T细胞组，Lb2R为Y1684-Y1647-293T细胞组，R39为Y1683-R39-293T细胞组，R38为Y1684-R38-293T细胞组，R42为Y1684-R42-293T细胞组)。结果表明，化学合成的crRNA在LbCRISPR/Cpf1系统和Lb2CRISPR/Cpf1系统中均有一定的基因编辑能力。
4、PCR扩增产物的测序
同实施例1步骤二中4。测序结果见图4(图4中A为化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统中hAAVS1基因的编辑能力：其中LbCpf1为Y1683-293T细胞组，LbCpf1+LbA为Y1683-Y1644-293T细胞组，Lb2Cpf1+Lb2A为Y1684-Y1646-293T细胞组，LbCpf1+A39为Y1683-A39-293T细胞组，Lb2Cpf1+A38为Y1684-A38-293T细胞组，Lb2Cpf1+A42为Y1684-A42-293T细胞组。图4中B为化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统中THUMPD3-AS1基因的编辑能力：其中Lb2Cpf1为Y1684-293T细胞组，LbCpf1+LbR为Y1683-Y1645-293T细胞组，Lb2Cpf1+Lb2R为Y1684-Y1647-293T细胞组，LbCpf1+R39为Y1683-R39-293T细胞组，Lb2Cpf1+R38为Y1684-R38-293T细胞组，Lb2Cpf1+R42为Y1684-R42-293T细胞组)。测序结果表明，化学合成的crRNA能有效行使引导Cpf1剪切编辑特定靶位点的作用，且效率很高。因此，化学合成的crRNA在LbCRISPR/Cpf1系统和Lb2CRISPR/Cpf1系统中均有一定的基因编辑能力。

Claims (10)

1.CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用；所述CRISPR/Cpf1系统中包括a1)或a2)：
a1)化学合成的crRNA；
a2)表达crRNA的载体。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述a2)中，所述表达crRNA的载体是将所述crRNA的编码DNA插入骨架载体的多克隆位点得到的重组载体。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述骨架载体为克隆载体。
4.如权利要求1至3任一所述的应用，其特征在于：所述CRISPR/Cpf1系统为c1)或c2)或c3)或c4)：
c1)LbCRISPR/Cpf1系统；
c2)Lb2CRISPR/Cpf1系统；
c3)FnCRISPR/Cpf1系统；
c4)AsCRISPR/Cpf1系统。
5.一种定向编辑基因组的方法，包括如下步骤：
(1)根据受体基因组中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA；
(2)化学合成所述crRNA；
(3)将所述化学合成的crRNA和编码Cpf1蛋白的基因导入所述受体，从而定向编辑所述受体基因组中的所述靶基因。
6.一种定向编辑基因组的方法，包括如下步骤：
㈠根据受体基因组中预期进行定向编辑的靶基因设计crRNA；
㈡构建表达所述crRNA的重组载体；
㈢将所述重组载体和编码Cpf1蛋白的基因导入所述受体，从而定向编辑所述受体基因组中的所述靶基因。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述表达所述crRNA的重组载体是将所述crRNA的编码DNA插入骨架载体的多克隆位点得到的。
8.如权利要求5至7任一所述的方法，其特征在于：所述编码Cpf1蛋白的基因是通过质粒的形式导入所述受体的。
9.一种定向编辑基因组的CRISPR/Cpf1系统，其特征在于：所述CRISPR/Cpf1系统中包括a1)或a2)：
a1)化学合成的crRNA；
a2)表达crRNA的载体。
10.如权利要求9所述的系统，其特征在于：所述CRISPR/Cpf1系统为c1)或c2)或c3)或c4)：
c1)LbCRISPR/Cpf1系统；
c2)Lb2CRISPR/Cpf1系统；
c3)FnCRISPR/Cpf1系统；
c4)AsCRISPR/Cpf1系统。
CN201610292302.XA 2016-05-05 2016-05-05 化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用 Active CN105907785B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610292302.XA CN105907785B (zh) 2016-05-05 2016-05-05 化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用
PCT/CN2017/082968 WO2017190664A1 (zh) 2016-05-05 2017-05-04 化学合成的crRNA和修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610292302.XA CN105907785B (zh) 2016-05-05 2016-05-05 化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105907785A true CN105907785A (zh) 2016-08-31
CN105907785B CN105907785B (zh) 2020-02-07

Family

ID=56752336

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610292302.XA Active CN105907785B (zh) 2016-05-05 2016-05-05 化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105907785B (zh)

Cited By (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106591335A (zh) * 2016-11-08 2017-04-26 安徽省农业科学院水稻研究所 一种密码子植物化改造的LbCpf1基因及其应用
CN106755059A (zh) * 2016-11-08 2017-05-31 安徽省农业科学院水稻研究所 一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用
WO2017190664A1 (zh) * 2016-05-05 2017-11-09 苏州吉玛基因股份有限公司 化学合成的crRNA和修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
CN107475292A (zh) * 2017-08-02 2017-12-15 山东百福基因科技有限公司 Pd‑1基因缺陷型t淋巴细胞制剂的制备方法
CN107881184A (zh) * 2016-09-30 2018-04-06 中国科学院上海生命科学研究院 一种基于Cpf1的DNA体外拼接方法
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
WO2018188571A1 (zh) * 2017-04-10 2018-10-18 中国科学院动物研究所 基因组编辑系统和方法
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
WO2019041296A1 (zh) * 2017-09-01 2019-03-07 上海科技大学 一种碱基编辑系统及方法
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
WO2019120283A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-27 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Method for base editing in plants
CN109971789A (zh) * 2019-03-25 2019-07-05 江南大学 一种基因编辑系统及其在新金色分枝杆菌中的应用
WO2019214604A1 (zh) * 2018-05-07 2019-11-14 中国农业大学 CRISPR/Cas效应蛋白及系统
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
WO2019237383A1 (zh) * 2018-06-16 2019-12-19 深圳市博奥康生物科技有限公司 用于人 tnfsf18 基因编辑的修饰载体、其制备方法及应用
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
CN111647618A (zh) * 2020-01-15 2020-09-11 温州医科大学 一种新型基因组编辑工具（Lb2Cas12a-RVR）及其构建方法和应用方法
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11414657B2 (en) 2015-06-29 2022-08-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified CRISPR RNA and modified single CRISPR RNA and uses thereof
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
WO2022216857A1 (en) * 2021-04-07 2022-10-13 Century Therapeutics, Inc. Gene transfer vectors and methods of engineering cells
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104520429A (zh) * 2012-03-20 2015-04-15 维尔纽斯大学 通过Cas9-crRNA复合物的RNA指导的DNA裂解
CN104762321A (zh) * 2015-04-22 2015-07-08 东北林业大学 基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法及其crRNA原件

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104520429A (zh) * 2012-03-20 2015-04-15 维尔纽斯大学 通过Cas9-crRNA复合物的RNA指导的DNA裂解
CN104762321A (zh) * 2015-04-22 2015-07-08 东北林业大学 基于CRISPR/Cas9系统靶向敲除KHV基因的敲除载体构建方法及其crRNA原件

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERND ZETSCHE ET AL: "Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System", 《CELL》 *

Cited By (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12006520B2 (en) 2011-07-22 2024-06-11 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US11920181B2 (en) 2013-08-09 2024-03-05 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US10954548B2 (en) 2013-08-09 2021-03-23 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10912833B2 (en) 2013-09-06 2021-02-09 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US11299755B2 (en) 2013-09-06 2022-04-12 President And Fellows Of Harvard College Switchable CAS9 nucleases and uses thereof
US10682410B2 (en) 2013-09-06 2020-06-16 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US11124782B2 (en) 2013-12-12 2021-09-21 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
US10465176B2 (en) 2013-12-12 2019-11-05 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US11578343B2 (en) 2014-07-30 2023-02-14 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US11414657B2 (en) 2015-06-29 2022-08-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified CRISPR RNA and modified single CRISPR RNA and uses thereof
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US11214780B2 (en) 2015-10-23 2022-01-04 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
WO2017190664A1 (zh) * 2016-05-05 2017-11-09 苏州吉玛基因股份有限公司 化学合成的crRNA和修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
US11999947B2 (en) 2016-08-03 2024-06-04 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10947530B2 (en) 2016-08-03 2021-03-16 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11702651B2 (en) 2016-08-03 2023-07-18 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN107881184A (zh) * 2016-09-30 2018-04-06 中国科学院上海生命科学研究院 一种基于Cpf1的DNA体外拼接方法
CN107881184B (zh) * 2016-09-30 2021-08-27 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一种基于Cpf1的DNA体外拼接方法
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
CN106755059B (zh) * 2016-11-08 2020-02-18 安徽省农业科学院水稻研究所 一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用
CN106755059A (zh) * 2016-11-08 2017-05-31 安徽省农业科学院水稻研究所 一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用
CN106591335A (zh) * 2016-11-08 2017-04-26 安徽省农业科学院水稻研究所 一种密码子植物化改造的LbCpf1基因及其应用
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11820969B2 (en) 2016-12-23 2023-11-21 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR2 receptor gene to protect against HIV infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11702643B2 (en) 2017-04-10 2023-07-18 Institute Of Zoology, Chinese Academy Of Sciences System and method for genome editing
CN108690845B (zh) * 2017-04-10 2021-04-27 中国科学院动物研究所 基因组编辑系统和方法
WO2018188571A1 (zh) * 2017-04-10 2018-10-18 中国科学院动物研究所 基因组编辑系统和方法
CN108690845A (zh) * 2017-04-10 2018-10-23 中国科学院动物研究所 基因组编辑系统和方法
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
CN107475292A (zh) * 2017-08-02 2017-12-15 山东百福基因科技有限公司 Pd‑1基因缺陷型t淋巴细胞制剂的制备方法
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11932884B2 (en) 2017-08-30 2024-03-19 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
WO2019041296A1 (zh) * 2017-09-01 2019-03-07 上海科技大学 一种碱基编辑系统及方法
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11820990B2 (en) 2017-12-21 2023-11-21 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Method for base editing in plants
CN110157727A (zh) * 2017-12-21 2019-08-23 中国科学院遗传与发育生物学研究所 植物碱基编辑方法
WO2019120283A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-27 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Method for base editing in plants
WO2019214604A1 (zh) * 2018-05-07 2019-11-14 中国农业大学 CRISPR/Cas效应蛋白及系统
WO2019237383A1 (zh) * 2018-06-16 2019-12-19 深圳市博奥康生物科技有限公司 用于人 tnfsf18 基因编辑的修饰载体、其制备方法及应用
US11795452B2 (en) 2019-03-19 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11643652B2 (en) 2019-03-19 2023-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
CN109971789A (zh) * 2019-03-25 2019-07-05 江南大学 一种基因编辑系统及其在新金色分枝杆菌中的应用
CN111647618A (zh) * 2020-01-15 2020-09-11 温州医科大学 一种新型基因组编辑工具（Lb2Cas12a-RVR）及其构建方法和应用方法
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
WO2022216857A1 (en) * 2021-04-07 2022-10-13 Century Therapeutics, Inc. Gene transfer vectors and methods of engineering cells

Also Published As

Publication number Publication date
CN105907785B (zh) 2020-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105907785A (zh) 化学合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系统在基因编辑中的应用
CN106244591A (zh) 修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
CN106479985A (zh) 病毒介导的Cpf1蛋白在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
CN104745626B (zh) 一种条件性基因敲除动物模型的快速构建方法及应用
WO2017190664A1 (zh) 化学合成的crRNA和修饰crRNA在CRISPR/Cpf1基因编辑系统中的应用
CN106047877B (zh) 一种靶向敲除FTO基因的sgRNA及CRISPR/Cas9慢病毒系统与应用
CN106916820B (zh) 能有效编辑猪ROSA26基因的sgRNA及其应用
CN108610399B (zh) 特异性增强crispr-cas系统在表皮干细胞中进行基因编辑效率的方法
US10858662B2 (en) Genome editing with split Cas9 expressed from two vectors
CN103388006B (zh) 一种基因定点突变的构建方法
CN106795521A (zh) 用于修饰所靶向基因座的方法和组合物
CN109136248B (zh) 多靶点编辑载体及其构建方法和应用
CN107208113A (zh) 用于通过单步多重靶向进行靶向遗传修饰的方法和组合物
BR8200191A (pt) Celula viva renina preprorrenina prorrenina processo para obter expressao de preporrenina prorrenina e renina gene de prorrenina preprorrenina e renina e coli material dna recombinador saccharomyces cerevisiae polipetidio processo para exprimir um gene
CN104818253B (zh) 靶向定点整合cho细胞系的改造及其用途
CN104611368B (zh) 重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用
CN109880851A (zh) 用于富集CRISPR/Cas9介导的同源重组修复细胞的筛选报告载体及筛选方法
CN109706148A (zh) 一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA、gRNA组合物以及电转方法
CN105154436A (zh) 包含突变的核酸内切酶识别区dna及其基因组编辑应用
CN109321548A (zh) 一种Cas9蛋白、CRISPR/Cas9系统、蘑菇基因编辑的方法及应用
CN105018523A (zh) 一种zb转座子系统及其介导的基因转移方法
CN102839156A (zh) 一种在小鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建方法
CN103540587B (zh) 靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26位点的方法及其应用
CN102702331B (zh) 一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用
Yoon et al. Intramitochondrial transfer and engineering of mammalian mitochondrial genomes in yeast

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant