CN108998406A - 一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人类原代培养细胞定点基因敲入方法，利用基于切口酶产生DNA单链缺口的技术，辅以一套同源重组修复因子RecOFAR来实现高效、精确、定点的人类原代培养细胞基因组编辑，包括定点基因敲入整合。本发明方法大幅度提高人类原代细胞基因组同源重组整合的效率（可达到20%以上），大大降低成本；本发明方法提高基因组编辑的安全性，有效降低靶位点处（on‑target）随机序列增删（indels)发生的频率，并且有效降低脱靶（off‑target)频率。

Description

一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类原代培养细胞精确基因组编辑、定点基因敲入的方法。

背景技术

随着全基因组测序技术的不断发展完善以及大型基因组注释项目的实施，生物科学的研究进入后基因组时代。在后基因组时代，基因组研究的重心将转向基因功能，即由测定基因的DNA 序列、解释生命的所有遗传信息转移到从分子整体水平对生物学功能的研究上，在分子层面上探索人类健康和疾病的奥秘(Peltonen and McKusick, 2001)。科研人员们已经开始通过各种尝试，想要将基因组研究的成果尽早地运用到基础科学研究的各个领域，以及个性化医疗（personalized medicine）工作当中(Chan and Ginsburg, 2011)。不过面对海量枯燥的基因组信息，科研人员们该如何将这些数据转换成有意义的基因组功能,解决这个问题的一个关键在于尽快开发出一种高效率的、可靠的方法，来帮助科研人员研究基因型（genotype）对表型(phenotype）的影响作用。

利用同源重组机制（homologous recombination）对基因进行定向失活（Targetedgene inactivation）就是这样一种好方法，可以帮助科研人员明确基因的功能(Capecchi,2005)。不过在实际工作中使用这种方法也会受到好几个因素，比如存在效率太低、费时费力、而且有可能导致突变等的限制。而 RNA 干扰技术（RNA interference，RNAi）等基因靶向敲除技术则为科学家们提供了一种快捷、廉价而且可以开展高通量研究的新方法(Hannon, 2002; McManus and Sharp, 2002)。不过RNAi 这种基因敲除技术的敲除效果还不够彻底，每次试验以及每个实验室的试验结果都会有差异，另外还存在不可预知的脱靶情况（off-target effect），所以只能够用于需要暂时抑制基因功能的试验当中(Jacksonet al., 2003; Jackson andLinsley, 2004)。

近十年来出现了一种新的研究手段，可以帮助科研人员对各种细胞和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作。这种新技术就是我们常说的“基因组编辑技术（genomeediting）”，比如锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases,ZFN）、转录激活因子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases, TALEN）、基于成簇的规律间隔的短回文重复序列和Cas 蛋白的DNA 核酸内切酶（clustered regulatory interspacedshort palindromic repeat (CRISPR)/Cas-based RNA-guided DNA endonucleases）等介导的基因编辑技术(Gaj et al., 2013)。这些核酸酶能够对基因组进行人工修饰，其基本原理是在靶位点区诱发DNA 双链缺口（double-strand breaks, DSBs），然后启动非同源区的末端连接（NHEJ）DSB 修复机制产生突变(Barnes, 2001; Lieber, 2010)或是利用同源重组（HR）修复机制(van den Bosch et al., 2002)完成我们所需要的各种人工修饰。

在细胞内，乐观估计DSB 自发产生的概率低于10-4，如果通过基因工程采用I-SceI(Choulika et al., 1995; Bellaiche et al., 1999)、I-AniI(McConnell Smith etal., 2009)等归位内切酶（homing endonuclease）或FokI(Guo et al., 2010)、Cas9 (Choet al., 2013)等核酸酶诱发DSBs，效率可提高至10%以上。但DSBs 的产生会带来基因组的不稳定，包括在DSB 附近局部产生indels，如随机的缺失、重排等，DSBs 还可以在靶位点以外的其他区域产生不可预测的变化，因而导致染色体组不稳定性（chromosomalinstability）的发生(Pfeiffer et al., 2000; Lo et al., 2002)。即使在同源序列模板存在的情况下，DSB 产生基因组破坏所诱发的反应主要以NHEJ 为主，尽管有部分反应可以以具有同源序列的模板进行重组修复，因为indels 的产生也将在同源重组修复中引入不可预测的突变(Kim et al., 2012)。因此利用制造DSB 实现基因组精准定点改造的效率较低。

本发明利用DNA序列上的协同nicks而非DSB诱发同源重组修复（HR）。DNA 单链缺口（SSB 或是nick）而非DSB 介导的重组修复，可以避免DSB 的种种不足。因为缺口只存在于DNA 的单链本，所以产生indels 的概率较低；同时因为有完整互补链的存在，染色体组不稳定性（chromosomal instability）发生的概率也较低(Kim et al., 2012)。通常情况下，细胞通过BER机制（碱基断点修复）在nick 原位进行修复；当细胞内存在同源序列时，同源重组反应得以以一定比例发生(Dianov and Hubscher, 2013)。目前在序列特异的DNA区域诱发产生nicks 有不同的策略，包括基因工程改造过的I-sceI、I-AniI、FokI、Cas9 以及一些合成多核苷酸，如LNA、PNA 等。由于单个nick 诱发的同源重组概率可能比单个DSB本身低一个或几个数量级，所以在具体执行中，可以采用2 个或多个nicks，在靶位点处协同诱发同源重组，提高重组效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法，利用基于切口酶产生DNA单链缺口的技术，辅以一套同源重组修复因子RecOFAR来实现高效、精确、定点的人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入整合。

所述的同源重组因子RecOFAR为RecO、RecF、RecA、RecR组合联用，合称为RecOFAR。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

包括以下方法：

A、野生型Cas9或Cas9n（D10A）及sgRNA的制备，但不局限于Cas9酶，还包括其他任何DNA单链切口酶；

B、定位整合目标靶位点处潜在的nicks；

C、设计外源供体DNA 模板；

D、制备并提供本发明体系的重组因子RecOFAR；

E、利用电转人类原代培养细胞进行精确定点基因组编辑、基因改造；

F、确定定点敲入整合KI 效率；

G、基因打靶on-target indels和off-target indels发生频率的检测。

具体包括如下步骤：

（1） 野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列及sgRNA的制备

野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列分别加入核定位序列 (nucleus localizationsequence)，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽(capped)及加polyA的mRNA，以不同组合混合后-80℃冻存备用；sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到；

（2）定位整合目标靶位点处潜在的nick

选定nick位点，整合位点选在nick位点处或协同nick位点之间的核苷酸上；

（3） 设计外源供体DNA模板

在上游nick的上游有1 kb的同源序列即上游同源臂，在下游nick的下游有1 kb的同源序列即下游同源臂；在整合位点处加入敲入元件；供体DNA同源臂上对应D10A识别的序列如果属于编码区，进行同义突变，非编码区则进行部分碱基突变，防止供体DNA被切割；将包含上下游同源臂以及敲入元件的该片段分子克隆入pBluescript II载体上，经过扩增提取质粒成为外源供体DNA；

（4）重组因子的制备

从DH5alpha菌株基因组中克隆重组因子的读码框序列，测序验证后再经过密码子优化；各重组因子序列分别加入核定位序列，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽(capped)及加polyA的mRNA，以不同组合混合后-80℃冻存备用；

（5）基因编辑人类原代外周血淋巴细胞

利用电转方法将基因打靶所用复合物 Cas9 或Cas9n（D10A）mRNA，sgRNA，Recs mRNA）导入人原代外周血淋巴细胞，电转用Celetrix Electroporator (CTX-1500A-L, CeletrixLLC, Manassas VA), 将约2×10⁶原代外周血淋巴细胞放入20 μl电极管中用于, 电转操作条件为730V/20ms. 每20 μl电极管含1.5 μg Cas9/ Cas9n（D10A） mRNA，1 μg for eachRecOFAR Capped mRNA，0.5 μg sgRNA和1 μg Donor DNA Capped mRNA.；

（6）确定定点敲入整合KI效率

KI阳性成功的细胞将表达报告荧光蛋白mCherry，与蓝色荧光蛋白BFP标识的电转阳性细胞数进行比较，得到整合KI效率；并提取细胞基因组，利用 PCR测序进一步验证。

（7）Cas9和Cas9n (D10A)+重组酶群两种组分on-target和off-target indels发生频率的检测

采用毛细管电泳的方法对不同基因打靶组分产生的on-target以及off-targetindels发生频率进行定量检测。

本发明利用DNA序列上的协同nicks而非DSB诱发同源重组修复（HR）。DNA 单链缺口（SSB 或是nick）而非DSB 介导的重组修复，可以避免DSB 的种种不足。因为缺口只存在于DNA 的单链本，所以产生indels 的概率较低；同时因为有完整互补链的存在，染色体组不稳定性（chromosomal instability）发生的概率也较低(Kim et al., 2012)。通常情况下，细胞通过BER机制（碱基断点修复）在nick 原位进行修复；当细胞内存在同源序列时，同源重组反应得以以一定比例发生(Dianov and Hubscher, 2013)。目前在序列特异的DNA区域诱发产生nicks 有不同的策略，包括基因工程改造过的I-sceI、I-AniI、FokI、Cas9 以及一些合成多核苷酸，如LNA、PNA 等。由于单个nick 诱发的同源重组概率可能比单个DSB本身低一个或几个数量级，所以在具体执行中，可以采用2 个或多个nicks，在靶位点处协同诱发同源重组，提高重组效率。

目前在序列特异的DNA 区域诱发产生nicks 有不同的策略，包括基因工程改造过的I-sceI、I-AniI、Talen-FokI、CRISPR/Cas9 以及一些合成的多核苷酸，如LNA、PNA 等。其中，Talen-FokI 和CRISPR/Cas9 是最新出现应用较多的基因组编辑技术。Talen-FokI 系统主要由 Fok I 内切酶结构域和TALE 蛋白的DNA 结合结构域组合而成，TALE 蛋白含有多个33-35 个氨基酸组成的重复肽段，而每一个肽段都能够识别一个碱基。FokI 必须是由两个异源二聚体（FokI-KK 和Fok-EL）在一起才有内切酶活性。我们只要在DNA 靶点对应两侧设计两个TALE 识别元件，然后分别连上FokI-KK 和Fok-EL，便能使DNA 靶序列断裂形成DSB。如果对FokI 其中一个亚基的催化活性部位进行氨基酸突变（Asp450 变成Ala，对应FokI-KK和FokI-EL，突变型称为FokI-kk 和FokI-el），一个正常FokI 亚基搭配一个突变的FikI 亚基形成的异源二聚体就会有nickase 活性(Kim et al., 2012)。而CRISPR/Cas9系统中Cas9 核酸内切酶在双链RNA 分子的介导下便能对与双链RNA 分子互补结合的DNA序列进行切割。所以，本发明执行实例中主要采用CRISPR/Cas 系统。此系统为细菌中一种获得性免疫保护机制，在2型CRISPR/Cas 系统里， Cas9 核酸酶在crRNA 和tracRNA 两个非编码RNA形成的复合体介导下进行序列特异性的切割产生DSB（图1）。成熟的crRNA 上长度为20 个碱基的序列通过与目的DNA 的序列互补来引导整个Cas9 复合体取切割目的DNA。同时，除了crRNA 上的互补序列外，在紧挨着互补序列的3’端，Cas9 识别的靶标DNA位点还必须有一段5’-NGG 的序列，此序列我们称为间隔前临近基序序列（protospaceradjacent motif sequence, PAM）(Gasiunas et al., 2012; Jinek et al., 2012)。因此，整个Cas9识别位点的特异性由20 个碱基的序列和3 个碱基的PAM 序列共同决定。在实际的基因编辑应用中，CRISPR/Cas 系统被简化成Cas9 核酸酶和单向导RNA（single guideRNA，sgRNA）两个组分，sgRNA 为人工设计的已经包含了crRNA 和tracRNA 序列的RNA。但是，只靠20 个碱基和PAM 序列决定Cas9 识别位点的特异性容易造成脱靶效应，而且诱导HR 的效率很低。

因此，我们利用双重单缺口（double-nick）或多对双重单缺口（multiple pairsofdouble-nicks) 来提高HR 效率，并降低脱靶效应。双重单缺口技术利用了突变型Cas9 蛋白Cas9-D10A，以下简称D10A（突变RuvC 结构域），只能剪切双链DNA 一条链的特点，同时提供相近两个位点的sgRNA,从而在双链DNA 上可以产生两个一定间距的单缺口。为了进一步避免脱靶，选定的D10A 识别位点的特异性20 个碱基的序列连同3 个碱基的PAM序列在整个果蝇基因组中进行blast 比对，尽量避免脱靶问题。

本发明在具体的实施中，野生型Cas9 或D10A 序列分别加入核序列（nucleuslocalization sequence），然后于整段序列之上游加入SP6 启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽（capped）及加polyA 的mRNA，以不同组合混合后-80 度冻存备用。sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR 扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到。

不管是DSB还是SSB（或nick）发生时，细胞的DNA修复机制将被激活。如上所言，在具有同源序列模板存在的情况下，细胞可以按一定比例进行重组修复。具有同源序列的模板可以来自细胞内的姐妹染色体，也可以来自提供的外源DNA模板。细胞内的重组修复机制在物种间是比较保守的，是非常复杂且精妙，涉及到至少几十种蛋白。虽然详尽的细胞生物学机制仍然不尽清楚，但基本包括切口加工(cut processing)、同源配对（pairing）、复制延伸（replicative extension）、互换（displacement）、连接（ligation）等过程(Johnsonand Jasin, 2001; van den Bosch et al., 2002)。另一方面，整个修复过程涉及到的蛋白，简称重组因子，其表达水平或活力有可能成为重组修复的限速因素。在大肠杆菌的研究中发现Rec途径对于诱发HR至关重要，主要包括RecBCD(Kowalczykowski, 2000)、RecF等几条通路，这些通路中有接近20个重组因子的参与(Kowalczykowski et al., 1994)。这些重组因子在重组修复不同步骤中分工协作促进修复，而且这些重组因子在多物种间的作用机制是高度相似的(Morimatsu and Kowalczykowski, 2003)，蛋白序列也存在较高的保守性(Lin et al., 2006)。

本发明的优点在于：

1、大幅度提高人类原代细胞基因组同源重组整合的效率一倍以上（整合率可接近20%）；

2、显著提高基因组编辑的安全性，有效降低靶位点处（on-target）随机序列增删（indels）发生的频率，并有效降低脱靶（off-target）频率；

3、在人类基因组的任意位点进行定点整合，不仅仅局限于内含子。

附图说明

图1 nicks 位点选择例子。

图2 外源供体DNA 模板。

图3 人原代外周血淋巴细胞Rpl41、TUFm基因打靶on-target 以及off-targetinels频率分析。

具体实施方式

“靶位点”在本申请中是指，在目标核苷酸中任何一段欲加以改造的DNA序列。靶位点附近的DNA序列，能够容纳外源序列在靶位点处的整合。在具体实施方式中，目标DNA序列是双链的DNA 序列，包括，但不限于，细胞的染色体基因组中的DNA序列、细胞基因组外的DNA序列（例如线粒体基因组）、质粒、病毒等的DNA序列。

“定点重组”，在本申请中是指，将外源序列通过非随机的方式整合到特定的靶位点处，包括整合到某特定靶位点的5’上游、3’下游。

“外源DNA序列”在本申请中是指，期望被定点重组到靶位点处的DNA序列。外源DNA序列可以是目标核苷酸处不存在或被改变的序列。

“重组修复因子”或“重组因子”在本申请中是指细胞进行重组修复涉及到的酶，包括RecOFAR,可使用天然野生型的，也可以是通过基因工程改造过的以及其他物种同源基因编码的蛋白, 也可使用天然野生型的以及通过基因工程改造过的。

“单切口酶”（nickase）在本申请中是指能在DNA上产生单链切口（SSB）的酶，可以使用天然野生型的，也可以是通过基因工程改造过的酶。

实施例1野生型Cas9或Cas9n-D10A序列及sgRNA的制备

野生型Cas9或D10A序列分别加入核定位序列 (nucleus localization sequence)（序列为CCGCCACC），然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列（序列为CATACGATTTAGGTGACACTATAG）利用体外转录的试剂盒得到加帽 (capped)及加polyA的mRNA，得到Cas9或Cas9n-D10AmRNA，以不同组合混合后-80℃冻存备用。sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到。

sgRNA合成用的DNA模板序列引物合成序列

实施例2. 定位人类细胞Rpl41和TUFm整合目标靶位点处潜在的nicks

在基因组数据库(如NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上查询下载人类Rpl41基因组序列（NM_021104）和TUFm基因组序列（NM_003321），对拟整合区域序列进行PAM分析，根据图1所示的间距挑选分值较高的两个PAM位点。以人类TUFm序列为例，分析结果如下：agaacgatagaaccgtagtgcttgttcattttaccacctcattctttatgtggacgtttgatttaatgtgggagggaaaggcaactctggtttgaggtgtattccattcct（Rpl41-PAM1）gtgtctgcttttcaggctgaagcgcaaaagaagaaagatgaggcagaggtccaagtaa（终止密码子区域）accgctagcttgttgcaccgtgg（Rpl41-PAM2）aggccacaggagcagaaacatggaatgccagacgctggggatgctggtaca agttgtg。以人类TUFm序列为例，分析结果如下：ttcaacctaatcttgcggcagccaatgatcttagagaaaggc cagcgtttcaccct（TUFm-PAM1）gcgagatggcaaccggactattggca ccggtctagtcaccaacacgctggccatgact gaggaggagaaga atatcaaatg gggttga（终止密码子区域）gtgtgcagatct ctgctcagcttcccttgcgtttaaggcctgcccta gccagg (TUFm-PAM2) gctccc tcctgcttccagtaccctctcatggcataggctgcaacccagcagag。

实施例3. 制备外源供体DNA Rpl41-IRES-mito-EGFP和TUFm-IRES-mito-mCherry

如图2所示，制备外源供体的时候，首先，我们使用引物扩增并纯化出来5’端的同源臂（5’ HA），插入片段，3’端的同源臂（3’ HA）以及载体骨架；然后，将5’ HA，插入片段和3’ HA通过两两搭桥PCR获得三段连接在一起的PCR片段；最后，5’HA-插入片段-3’HA产物与载体骨架片段通过In-Fusion HD克隆试剂盒（Clonetech, 639649）无缝连接后转化到大肠杆菌中，通过挑克隆测序鉴定后获得外源供体DNA。构建获得Rpl41-IRES-mito-EGFP 和TUFm-IRES-mito-mCherry。

实施例4. 制备重组酶复合物

从DH5alpha菌株基因组中克隆来源于大肠杆菌(E.coli)的4种重组因子，合称OFAR(RecO（SEQ ID NO.3）、RecF（SEQ ID NO.2）、RecA（SEQ ID NO.1）、RecR（SEQ ID NO.4）)的读码框序列。测序验证后再经过哺乳动物密码子优化，分别加入核序列(nucleuslocalization sequence)。然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列(ATTTA GGTGACACTA TAGAA)，利用体外转录试剂盒(mMESSAGEmMACHINE T7/SP6 kit，LifeTechnologies)以及转录载体pSP73(Promega，USA)得到加帽(capped)及加polyA的mRNA，混合后于-80℃冻存，工作浓度为100 ng/ul。

实施例5. 基因重组组合物导入人原代外周血淋巴细胞中

本实施例采用电转法将本发明的基因重组组合物导入人原代外周血淋巴细胞中。电转用Celetrix Electroporator (CTX-1500A-L, Celetrix LLC, Manassas VA), 将约2×10⁶原代外周血淋巴细胞放入20 μl电极管中用于, 电转操作条件为730V/20ms. 每20 μl电极管含1.5 μgCas9或Cas9n（D10A）mRNA，1 μg for each RecOFAR Capped mRNA，0.5 μgsgRNA和1 μg Donor DNA Capped mRNA。

实施例6. 制备基因编辑人原代外周血淋巴细胞

人原代外周血淋巴细胞从新鲜的血液中通过人外周血分离液（SolarbioCAT.NO.P8610）分离获得。通常情况下25 ml 新鲜血液可以获得9×10⁶个细胞。获得的细胞马上进行电转操作，在TUFm位点进行基因敲入，最终得到Rpl41-IRES-mito-EGFP和TUFm-linker-mcherry 基因敲入细胞。

实施例7. 确定定点整合的效率

利用目前已有方法，即Cas9野生酶以及切口酶Ca9n-D10A方法，基因打靶定点整合效率低于10%；利用本发明的方法，效率提高一倍以上（如表1所示），可接近20%。

表1 人原代外周血淋巴细胞基因打靶定点整合效率

实施例8. 基因打靶on-target indels和off-target indels发生频率的检测方法

以人类Rpl41-IRES-mitoEGFP和TUFm-IRES-mitomCherry改造位点为例，采用毛细管电泳的方法（Indel Detection by Amplicon Analysis， IDAA）对Cas9或D10A不同组分的on-target和off-target比例进行检测。结果显示（图3），加了重组酶的组分在Rpl41 基因座、TUFm基因座靶位点处（on-target）的随机序列删增（indels)发生频率显著降低（图3a,3c）, Rp141基因座的一个脱靶（off-target）效应被抑制 （图3b）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法

<130> 10

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1167

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatatcatac gatttaggtg acactataga accgccacca tggtcccaaa aaagaaaagg 60

aaggtggcta ttgacgagaa caaacagaaa gcactggcag cagcactggg gcagattgag 120

aaacagttcg ggaagggatc cattatgagg ctgggggaag accgctcaat ggatgtggag 180

actatcagca ccggatctct gagtctggac attgctctgg gagcaggagg actgccaatg 240

ggacgaatcg tggaaatcta cggacctgag agctccggca agaccacact gaccctgcag 300

gtcatcgccg ctgcacagag agagggcaaa acatgcgcct tcatcgacgc cgaacacgct 360

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ggacacctgg gatacggagt gaacttcacc cattgtgcag gaagtggaga gccagtcgac 540

gatactatga cctaccggta ccgggaggaa aaaggattca tcgcttccgt ggtcattgat 600

aacaagacct tcaccggccg acagctgaag gccctgaatg ctcgcgagtt ccctgacgct 660

gataccctgc gggccgctaa gcggttcacc cgaatggcac tgaaacctta tctgggaggc 720

aagccactga agtcaagaga gctgttcaga cagtttatgc ccaagaggac cgtcaagacc 780

cattacgaga gccccaagaa gaagagaaag gtggaggcca gctgataaga tatc 834

<210> 4

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatatcatac gatttaggtg acactataga accgccacca tggtgcccaa aaagaagaga 60

aaagtccaga caagccccct gctgacccag ctgatggaag ccctgaggtg cctgcccggc 120

gtcggcccca agtctgctca gcgcatggca ttcaccctgc tgcagaggga ccgcagtgga 180

ggaatgagac tggcacaggc tctgacaagg gccatgtcag agatcggcca ctgcgctgat 240

tgtcgaacct ttacagagca ggaagtgtgc aacatctgta gcaatccacg gagacaggag 300

aacgggcaga tttgcgtggt cgaatccccc gccgacatct acgctattga acagaccggc 360

cagttcagcg ggaggtattt tgtcctgatg ggacatctgt cccccctgga cgggatcgga 420

cctgacgata ttggactgga tcgactggag cagcggctgg cagaggaaaa aatcacagaa 480

gtgattctgg ccactaaccc taccgtcgag ggggaagcaa ctgccaatta catcgcagag 540

ctgtgcgccc agtatgatgt ggaagctagt cggattgcac acggagtgcc agtcggaggc 600

gagctggaga tggtggatgg aacaacactg tcacattcac tggcagggag gcacaagatt 660

cggtttagcc ccaagaagaa gagaaaggtg gaggccagct gataagatat c 711

<210> 5

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccgccacc 8

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catacgattt aggtgacact atag 24

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaaattaata cgactcacta tagggtttta gagctagaaa tagc 44

<210> 8

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttgtgaaaag caccgactcg gtgccacttt ttcaagttga taacggacta gccttatttt 60

aacttgctat ttctagctct aaaac 85

<210> 9

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agaacgatag aaccgtagtg cttgttcatt ttaccacctc attctttatg tggacgtttg 60

atttaatgtg ggagggaaag gcaactctgg tttgaggtgt attccattcc tgtgtctgct 120

tttcaggctg aagcgcaaaa gaagaaagat gaggcagagg tccaagtaaa ccgctagctt 180

gttgcaccgt ggaggccaca ggagcagaaa catggaatgc cagacgctgg ggatgctggt 240

acaagttgtg 250

<210> 10

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttcaacctaa tcttgcggca gccaatgatc ttagagaaag gccagcgttt caccctgcga 60

gatggcaacc ggactattgg caccggtcta gtcaccaaca cgctggccat gactgaggag 120

gagaagaata tcaaatgggg ttgagtgtgc agatctctgc tcagcttccc ttgcgtttaa 180

ggcctgccct agccagggct ccctcctgct tccagtaccc tctcatggca taggctgcaa 240

cccagcagag 250

Claims (4)

1.一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法，其特征在于：利用基于切口酶产生DNA单链缺口的技术，辅以一套同源重组因子RecOFAR来实现高效、精确、定点的的人类原代培养细胞基因组编辑，包括定点基因敲入整合。

2.根据权利要求1所述的一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法，其特征在于：所述的同源重组因子RecOFAR为RecO、RecF、RecA、RecR组合联用，合称为RecOFAR。

3.根据权利要求1所述的一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法，其特征在于：包括以下方法：

A、野生型Cas9或Cas9n（D10A）及sgRNA的制备，但不局限于Cas9酶，还包括其他任何DNA单链切口酶；

B、定位整合目标靶位点处潜在的nicks；

C、设计外源供体DNA 模板；

D、制备并提供本发明体系中的重组因子群RecOFAR；

E、利用电转人类原代培养细胞进行精确定点基因编辑、改造；

F、确定定点敲入整合KI 效率；

G、靶位点处on-target以及脱靶off-target发生频率的检测。

4.根据权利要求3所述的一种人类原代培养细胞定点基因敲入方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

（1） 野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列及sgRNA的制备

野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列分别加入核定位序列，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽及加polyA的mRNA，得到Cas9或Cas9n（D10A）mRNA， 以不同组合混合后-80℃冻存备用；sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到；

（2）定位整合目标靶位点处潜在的nick

选定nick位点，整合位点选在nick位点处或协同nick位点之间的核苷酸上；

（3） 设计外源供体DNA模板

在上游nick的上游有1 kb的同源序列即上游同源臂，在下游nick的下游有1 kb的同源序列即下游同源臂；在整合位点处加入敲入元件；供体DNA同源臂上对应D10A识别的序列如果属于编码区，进行同义突变，非编码区则进行部分碱基突变，防止供体DNA被切割；将包含上下游同源臂以及敲入元件的该片段分子克隆入pBluescript II载体上，经过扩增提取质粒成为外源供体DNA；

（4）重组因子的制备

从DH5alpha菌株基因组中克隆重组因子的读码框序列，测序验证后再经过密码子优化；各重组因子序列分别加入核定位序列，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽及加polyA的mRNA，以不同组合混合后-80℃冻存备用；

（5）基因编辑人类原代外周血淋巴细胞

利用电转方法将基因打靶所用复合物按比例要求导入人原代外周血淋巴细胞；所述复合物为Cas9 或 Cas9n D10A mRNA，sgRNA，Recs mRNA，Donor DNA以及BFP mRNA；

（6）确定定点敲入整合KI效率

KI阳性成功的细胞将表达报告荧光蛋白mCherry，与蓝色荧光蛋白BFP标识的电转阳性细胞数进行比较，得到整合KI效率；并提取细胞基因组，利用 PCR测序进一步验证；

（7）Cas9和Cas9n (D10A)+重组酶群两种组分on-target和off-target indels发生频率的检测

采用毛细管电泳的方法对不同基因打靶组分产生的on-target以及off-targetindels发生频率进行定量检测。