CN108949830A - 一种在鱼类中实现基因组编辑、精确定点基因敲入的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在鱼类中实现精确定点基因敲入的方法，利用基于切口酶产生DNA单链缺口的技术，辅以一套同源重组修复因子RecOFAR来实现高效、精确、定点的鱼类基因组编辑、基因敲入整合。克服了目前已有方法效率偏低、靶位点随机突变频率较高等等问题。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在鱼类中实现精确基因组编辑、定点基因敲入的方法。
背景技术
随着全基因组测序技术的不断发展完善以及大型基因组注释项目的实施，生物科学的研究进入后基因组时代。在后基因组时代，基因组研究的重心将转向基因功能，即由测定基因的DNA 序列、解释生命的所有遗传信息转移到从分子整体水平对生物学功能的研究上，在分子层面上探索人类健康和疾病的奥秘(Peltonen and McKusick, 2001)。科研人员们已经开始通过各种尝试，想要将基因组研究的成果尽早地运用到基础科学研究的各个领域，以及个性化医疗（personalized medicine）工作当中(Chan and Ginsburg, 2011)。不过面对海量枯燥的基因组信息，科研人员们该如何将这些数据转换成有意义的基因组功能，解决这个问题的一个关键在于尽快开发出一种高效率的、可靠的方法，来帮助科研人员研究基因型（genotype）对表型(phenotype）的影响作用。
利用同源重组机制（homologous recombination）对基因进行定向失活（Targetedgene inactivation）就是这样一种好方法，可以帮助科研人员明确基因的功能(Capecchi,2005)。不过在实际工作中使用这种方法也会受到好几个因素，比如存在效率太低、费时费力、而且有可能导致突变等的限制。而 RNA 干扰技术（RNA interference，RNAi）等基因靶向敲除技术则为科学家们提供了一种快捷、廉价而且可以开展高通量研究的新方法(Hannon, 2002; McManus and Sharp, 2002)。不过RNAi 这种基因敲除技术的敲除效果还不够彻底，每次试验以及每个实验室的试验结果都会有差异，另外还存在不可预知的脱靶情况（off-target effect），所以只能够用于需要暂时抑制基因功能的试验当中(Jacksonet al., 2003; Jackson andLinsley, 2004)。
近十年来出现了一种新的研究手段，可以帮助科研人员对各种细胞和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作。这种新技术就是我们常说的“基因组编辑技术（genomeediting）”，比如锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases,ZFN）、转录激活因子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases, TALEN）、基于成簇的规律间隔的短回文重复序列和Cas 蛋白的DNA 核酸内切酶（clustered regulatory interspacedshort palindromic repeat (CRISPR)/Cas-based RNA-guided DNA endonucleases）等介导的基因编辑技术(Gaj et al., 2013)。这些核酸酶能够对基因组进行人工修饰，其基本原理是在靶位点区诱发DNA 双链缺口（double-strand breaks, DSBs），然后启动非同源区的末端连接（NHEJ）DSB 修复机制产生突变(Barnes, 2001; Lieber, 2010)或是利用同源重组（HR）修复机制(van den Bosch et al., 2002)完成我们所需要的各种人工修饰。
在细胞内，乐观估计DSB 自发产生的概率低于10-4，如果通过基因工程采用I-SceI(Choulika et al., 1995; Bellaiche et al., 1999)、I-AniI(McConnell Smith etal., 2009)等归位内切酶（homing endonuclease）或FokI(Guo et al., 2010)、Cas9 (Choet al., 2013)等核酸酶诱发DSBs，效率可提高至10%以上。但DSBs 的产生会带来基因组的不稳定，包括在DSB 附近局部产生indels，如随机的缺失、重排等，DSBs 还可以在靶位点以外的其他区域产生不可预测的变化，因而导致染色体组不稳定性（chromosomalinstability）的发生(Pfeiffer et al., 2000; Lo et al., 2002)。即使在同源序列模板存在的情况下，DSB 产生基因组破坏所诱发的反应主要以NHEJ 为主，尽管有部分反应可以以具有同源序列的模板进行重组修复，因为indels 的产生也将在同源重组修复中引入不可预测的突变(Kim et al., 2012)。因此利用制造DSB 实现基因组精准定点改造的效率较低。
我们前面提到多种新出现的基因编辑技术在鱼类（主要是模式生物斑马鱼）上也展开研究。除了ZFN 和TALEN 系统外,出现得比较晚的CRISPR/Cas9 系统也已经证实可以用于鱼类基因组的编辑。但是到目前为止，这些技术在鱼类的应用大部分是利用NHEJ 修复机制在开放性阅读框（ORF）上产生移码突变。虽然这能有效扰乱基因的功能，但是它是随机并且局限于产生indels。利用TALEN 产生DSB最终诱发定点整合效率较低，不到6%，而且整合DNA片段非常短，短于50bps (Victoria M. Bedell1 et al., 2012)。 也有实验室利用NHEJ原理而非同源重组（HR）来进行knock-in的报道（Thomas O. Auer，et al. 2014），该方法在斑马鱼基因组以及donor DNA上同时产生DSB，以此介导基因组与外源 DNA在断链处的直接连接，实现特定外源DNA的插入整合，但是因为NHEJ本身易产生indels的特点，并且产生indels有很高的随机性，因此定点整合的效率并不高，只有4%；此外，此种方法容易出现多拷贝插入的问题；最后，该方法对于整合某类特殊的外源DNA片段，如Gal4、GFP等比较有利，否则后期筛选的工作量较大。
因此，如何精准并且能高效率（时间短，成功率高）地对鱼类基因组进行长片段外源基因的定点整合是鱼类转基因技术面临的问题。高效精确的转基因技术不仅将为基础、应用科研工作服务，也将为基因改造如经济鱼类提供转基因改造的手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在鱼类中实现精确定点基因敲入的方法，利用基于切口酶产生DNA单链缺口的技术，辅以一套同源重组修复因子来实现高效、精确、定点的、带可视性的遗传学筛选标记的鱼类转基因敲入整合。
所述的同源重组因子RecOFAR为RecO、RecF、RecA、RecR组合联用，合称为RecOFAR。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种在鱼类中实现精确定点基因敲入的方法，包括以下方法：
A、野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列及sgRNA的制备；
B、定位整合目标靶位点处潜在的nicks；
C、设计外源供体DNA 模板；
D、制备并提供NEO体系的重组因子RecOFAR；
E、利用显微注射鱼受精卵得到基因编辑鱼品系；
F、确定定点敲入整合KI 效率的方法。
具体包括以下方法：
（1） 野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列及sgRNA的制备
野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列分别加入核定位序列 (nucleus localizationsequence)，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽(capped)及加polyA的mRNA，获得Cas9或Cas9n（D10A）mRNA， 以不同组合混合后-80℃冻存备用；sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到；
（2）定位整合目标靶位点处潜在的nick
选定nick位点，整合位点选在nick位点处或协同nick位点之间的核苷酸上；实例中采用Cas9n D10A，与配套的sgRNAs联用。整合位点选择在两个nick 位点之间（图1）。
（3） 设计外源供体DNA模板
在上游nick的上游有1 kb的同源序列即上游同源臂，在下游nick的下游有1 kb的同源序列即下游同源臂；在整合位点处加入敲入元件；供体DNA同源臂上对应Cas9n（D10A）识别的序列如果属于编码区，进行同义突变，非编码区则进行部分碱基突变，防止供体DNA被切割；将包含上下游同源臂以及敲入元件的该片段分子克隆入pBluescript II载体上，经过扩增提取质粒成为外源供体DNA；
（4）重组因子的制备
从DH5alpha菌株基因组中克隆重组因子的读码框序列，测序验证后再经过密码子优化；各重组因子序列分别加入核定位序列，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽(capped)及加polyA的mRNA，以不同组合混合后-80℃冻存备用；
（5）基因编辑斑马鱼受精卵
利用显微注射斑马鱼受精卵得到转基因斑马鱼品系，配备的注射液包含：各重组因子各种100 ng/µl，50 ng/µl的sgRNA, 100 ng/µl的Cas9或Cas9n（D10A） mRNA以及300 ng/µl的供体DNA，每个胚胎注射1 nl；
（6）确定定点敲入整合KI效率
提取单尾鱼苗基因组，设计靶标位点及潜在脱靶位点两端引物进行基因组扩增测序鉴定阳性率及计算脱靶概率；注射后的单尾F0代斑马鱼苗与注射时相应的野生型斑马鱼杂交，F1代通过序列特异性PCR进行筛选。
本发明利用DNA序列上的协同nicks而非DSB诱发同源重组修复（HR）。DNA 单链缺口（SSB 或是nick）而非DSB 介导的重组修复，可以避免DSB 的种种不足。因为缺口只存在于DNA 的单链本，所以产生indels 的概率较低；同时因为有完整互补链的存在，染色体组不稳定性（chromosomal instability）发生的概率也较低(Kim et al., 2012)。通常情况下，细胞通过BER机制（碱基断点修复）在nick 原位进行修复；当细胞内存在同源序列时，同源重组反应得以以一定比例发生(Dianov and Hubscher, 2013)。目前在序列特异的DNA区域诱发产生nicks 有不同的策略，包括基因工程改造过的I-sceI、I-AniI、FokI、Cas9 以及一些合成多核苷酸，如LNA、PNA 等。由于单个nick 诱发的同源重组概率可能比单个DSB本身低一个或几个数量级，所以在具体执行中，可以采用2 个或多个nicks，在靶位点处协同诱发同源重组，提高重组效率。
目前在序列特异的DNA 区域诱发产生nicks 有不同的策略，包括基因工程改造过的I-sceI、I-AniI、Talen-FokI、CRISPR/Cas9 以及一些合成的多核苷酸，如LNA、PNA 等。其中，Talen-FokI 和CRISPR/Cas9 是最新出现应用较多的基因组编辑技术。Talen-FokI 系统主要由 Fok I 内切酶结构域和TALE 蛋白的DNA 结合结构域组合而成，TALE 蛋白含有多个33-35 个氨基酸组成的重复肽段，而每一个肽段都能够识别一个碱基。FokI 必须是由两个异源二聚体（FokI-KK 和Fok-EL）在一起才有内切酶活性。我们只要在DNA 靶点对应两侧设计两个TALE 识别元件，然后分别连上FokI-KK 和Fok-EL，便能使DNA 靶序列断裂形成DSB。如果对FokI 其中一个亚基的催化活性部位进行氨基酸突变（Asp450 变成Ala，对应FokI-KK和FokI-EL，突变型称为FokI-kk 和FokI-el），一个正常FokI 亚基搭配一个突变的FikI 亚基形成的异源二聚体就会有nickase 活性(Kim et al., 2012)。而CRISPR/Cas9系统中Cas9 核酸内切酶在双链RNA 分子的介导下便能对与双链RNA 分子互补结合的DNA序列进行切割。所以，本发明执行实例中主要采用CRISPR/Cas 系统。此系统为细菌中一种获得性免疫保护机制，在2型CRISPR/Cas 系统里， Cas9 核酸酶在crRNA 和tracRNA 两个非编码RNA形成的复合体介导下进行序列特异性的切割产生DSB（图1）。成熟的crRNA 上长度为20 个碱基的序列通过与目的DNA 的序列互补来引导整个Cas9 复合体取切割目的DNA。同时，除了crRNA 上的互补序列外，在紧挨着互补序列的3’端，Cas9 识别的靶标DNA位点还必须有一段5’-NGG 的序列，此序列我们称为间隔前临近基序序列（protospaceradjacent motif sequence, PAM）(Gasiunas et al., 2012; Jinek et al., 2012)。因此，整个Cas9识别位点的特异性由20 个碱基的序列和3 个碱基的PAM 序列共同决定。在实际的基因编辑应用中，CRISPR/Cas 系统被简化成Cas9 核酸酶和单向导RNA（single guideRNA，sgRNA）两个组分，sgRNA 为人工设计的已经包含了crRNA 和tracRNA 序列的RNA。但是，只靠20 个碱基和PAM 序列决定Cas9 识别位点的特异性容易造成脱靶效应，而且诱导HR 的效率很低。
因此，我们利用双重单缺口（double-nick）或多对双重单缺口（multiple pairsofdouble-nicks) 来提高HR 效率，并降低脱靶效应。双重单缺口技术利用了突变型Cas9 蛋白Cas9-D10A，以下简称D10A（突变RuvC 结构域），只能剪切双链DNA 一条链的特点，同时提供相近两个位点的sgRNA,从而在双链DNA 上可以产生两个一定间距的单缺口。为了进一步避免脱靶，选定的D10A 识别位点的特异性20 个碱基的序列连同3 个碱基的PAM序列在整个果蝇基因组中进行blast 比对，尽量避免脱靶问题。
本发明在具体的实施中，野生型Cas9 或D10A 序列分别加入核序列（nucleuslocalization sequence），然后于整段序列之上游加入SP6 启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽（capped）及加polyA 的mRNA，以不同组合混合后-80 度冻存备用。sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR 扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到。
不管是DSB还是SSB（或nick）发生时，细胞的DNA修复机制将被激活。如上所言，在具有同源序列模板存在的情况下，细胞可以按一定比例进行重组修复。具有同源序列的模板可以来自细胞内的姐妹染色体，也可以来自提供的外源DNA模板。细胞内的重组修复机制在物种间是比较保守的，是非常复杂且精妙，涉及到至少几十种蛋白。虽然详尽的细胞生物学机制仍然不尽清楚，但基本包括切口加工(cut processing)、同源配对（pairing）、复制延伸（replicative extension）、互换（displacement）、连接（ligation）等过程(Johnsonand Jasin, 2001; van den Bosch et al., 2002)。另一方面，整个修复过程涉及到的蛋白，简称重组因子，其表达水平或活力有可能成为重组修复的限速因素。在大肠杆菌的研究中发现Rec途径对于诱发HR至关重要，主要包括RecBCD(Kowalczykowski, 2000)、RecF等几条通路，这些通路中有接近20个重组因子的参与(Kowalczykowski et al., 1994)。这些重组因子在重组修复不同步骤中分工协作促进修复，而且这些重组因子在多物种间的作用机制是高度相似的(Morimatsu and Kowalczykowski, 2003)，蛋白序列也存在较高的保守性(Lin et al., 2006)。
本发明的优点在于：
a.大幅度提高鱼类基因组同源重组整合的效率（3-5倍），大大降低成本；
b.在鱼类基因组的任意位点进行定点整合，不仅仅局限于内含子；
c.实现大片段DNA（>5kb）的定点整合。
附图说明
图1 nicks 位点选择例子。
图2 外源供体DNA 模板。
具体实施方式
“靶位点”在本申请中是指，在目标核苷酸中任何一段欲加以改造的DNA序列。靶位点附近的DNA序列，能够容纳外源序列在靶位点处的整合。在具体实施方式中，目标DNA序列是双链的DNA 序列，包括，但不限于，细胞的染色体基因组中的DNA序列、细胞基因组外的DNA序列（例如线粒体基因组）、质粒、病毒等的DNA序列。
“定点重组”，在本申请中是指，将外源序列通过非随机的方式整合到特定的靶位点处，包括整合到某特定靶位点的5’上游、3’下游。
“外源DNA序列”在本申请中是指，期望被定点重组到靶位点处的DNA序列。外源DNA序列可以是目标核苷酸处不存在或被改变的序列。
“重组修复因子”或“重组因子” 在本申请中是指细胞进行重组修复涉及到的酶，包括RecOFAR,可使用天然野生型的，也可以是通过基因工程改造过的以及其他物种同源基因编码的蛋白, 也可使用天然野生型的以及通过基因工程改造过的。
“单切口酶”（nickase）在本申请中是指能在DNA上产生单链切口（SSB）的酶，可以使天然野生型的，也可以是通过基因工程改造过的酶，不仅限于Cas9n。
实施例1野生型Cas9或Cas9n-D10A序列及sgRNA的制备
野生型Cas9或Cas9n-D10A序列分别加入核定位序列 (nucleus localizationsequence)（序列为CCGCCACC），然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列（序列为CATACGATTTAGGTGACACTATAG），利用体外转录的试剂盒得到加帽 (capped)及加polyA的mRNA，获得Cas9或Cas9n-D10A mRNA以不同组合混合后-80℃冻存备用。sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到。
sgRNA合成用的DNA模板序列引物合成序列
实施例2. 定位斑马鱼Ndr2和GFAP整合目标靶位点处潜在的nicks
在基因组数据库(如NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上查询下载斑马鱼Ndr2基因组序列（NM_139133），对拟整合区域序列进行PAM分析，根据图1所示的间距挑选分值较高的两个PAM位点。
以斑马鱼Ndr2为例，分析结果如下：agcagcaggacggggccagtctcctgcacactgccggggcctcgaagtttctgttttctagaaataagaaagaagtcaagcgaggacgggccctcaggagccgcaggggccgccg(PAM1)ggggcc(插入区域)acctgtcaggagcccagagctgcagagaacaccactgcacaagagcaccacctgcagg(PAM2)agggtggacatgcatgtggattttaaccagatcggatggggctcctggatcgtgttccctaagaagtacaa
以斑马鱼GFAP为例，分析结果如下：
caattaagttgtccccaaaaacatctcaagaattgtgttgattctgctaattcttcattttacacattctctctttcgcagatcattaaagagtcca(PAM1)ctacggagaggaaggatctgccataa(终止子)tgaggctcagacactggcttggctgcagaagaagatctccttcactaatgcttcagg (PAM2)aagctgtgtttgtcaaaccttgtattttctcaccaactttccctgcttctctcctggtatatatagttca。
实施例3. 制备外源供体DNA Ndr2-linker-Dendra2和 GFAP-p2AV1-NpHR3.0-EYFP-p2AV2-hChR2-mCherry-IRES-WGA-Cre（GFAP-5.5 kb）
如图2所示，制备外源供体的时候，首先，我们使用引物扩增并纯化出来5’端的同源臂（5’ HA），插入片段，3’端的同源臂（3’ HA）以及载体骨架；然后，将5’ HA，插入片段和3’ HA通过两两搭桥PCR获得三段连接在一起的PCR片段；最后，5’HA-插入片段-3’HA产物与载体骨架片段通过In-Fusion HD克隆试剂盒（Clonetech, 639649）无缝连接后转化到大肠杆菌中，通过挑克隆测序鉴定后获得外源供体DNA，构建获得Ndr2-linker-Dendra2和GFAP-p2AV1-NpHR3.0- EYFP-p2AV2-hChR2-mCherry-IRES-WGA-Cre（GFAP-5.5 kb）。
实施例4. 制备重组酶复合物
从DH5alpha菌株基因组中克隆来源于大肠杆菌(E.coli)的4种重组因子，合称OFAR(RecO、RecF、RecA、RecR)的读码框序列。测序验证后再经过哺乳动物密码子优化，分别加入核序列(nucleus localization sequence)。然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列(ATTTA GGTGA CACTA TAGAA)，利用体外转录试剂盒(mMESSAGEmMACHINE T7/SP6 kit，LifeTechnologies)以及转录载体pSP73(Promega，USA)得到加帽(capped)及加polyA的mRNA，混合后于-80℃冻存，工作浓度为100 ng/ul。构建获得RecA 、RecF 、RecO、RecR重组酶序列分别为SEQ ID NO.1-4所示。
实施例5. 基因重组组合物导入斑马鱼受精卵
为方便起见，本实施例采用显微注射将本发明的基因重组组合物导入斑马鱼受精卵中。各重组酶终mRNA浓度为100 ng/ul；sgRNA终浓度为50 ng/ul；切口酶mRNA 100 ng/ul；Cas9或Cas9n-D10AmRNA100 ng/ul；供体DNA 300 ng/ul。每个胚胎注射1 nl，显微注射的存活率60-90%。
实施例6. 制备转基因斑马鱼品系
收集单细胞期斑马鱼胚胎，按上述方案进行注射，在斑马鱼Ndr2和GFAP位点进行基因敲入，最终制备Ndr2-linker-Dendra2和GFAP-p2AV1-NpHR3.0-EYFP-p2AV2-hChR2-mCherry- IRES-WGA-Cre（GFAP-5.5 kb）基因敲入斑马鱼品系。
实施例7. 确定定点整合的效率
利用目前已有方法，即Cas9野生酶以及切口酶Ca9n-D10A方法，在Ndr2基因座基因打靶定点敲入2kb的整合效率分别为4%以及3.3%；利用本发明的方法，效率为10-14.5%， 在GFAP基因座定点敲入5.5kb的整合效率为6.3%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种在鱼类中实现基因组编辑、精确定点基因敲入的方法
<130> 10
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
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taatgaggct cagacactgg cttggctgca gaagaagatc tccttcacta atgcttcagg 180
aagctgtgtt tgtcaaacct tgtattttct caccaacttt ccctgcttct ctcctggtat 240
atatagttca 250
Claims (4)
1.一种在鱼类中实现精确定点基因敲入的方法，其特征在于：利用基于切口酶产生DNA单链缺口的技术，辅以一套同源重组修复因子RecOFAR来实现高效、精确、定点的鱼类基因组编辑、基因敲入整合。
2.根据权利要求1所述的一种在鱼类中实现精确定点基因敲入的方法，其特征在于：所述的同源重组因子RecOFAR为RecO、RecF、RecA、RecR组合联用，合称为RecOFAR。
3.根据权利要求1所述的一种在鱼类中实现精确定点基因敲入（knock-in, KI）的方法，其特征在于：包括以下方法：
A、野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列及sgRNA的制备；
B、定位整合目标靶位点处潜在的nicks；
C、设计外源供体DNA 模板；
D、制备并提供NEO体系的重组因子群RecOFAR；
E、利用显微注射鱼受精卵得到转基因鱼品系；
F、确定定点敲入整合KI 效率的方法。
4.根据权利要求1所述的一种在鱼类中实现精确定点基因敲入的方法，其特征在于：具体包括以下方法：
（1） 野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列及sgRNA的制备
野生型Cas9或Cas9n（D10A）序列分别加入核定位序列，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽及加polyA的mRNA，以不同组合混合后-80℃冻存备用；sgRNA通过DNA合成上游带有T7启动子序列及与上游存在部分互补的下游序列，经过PCR扩增得到双链DNA，利用体外转录的试剂盒得到；
（2）定位整合目标靶位点处潜在的nick
选定nick位点，整合位点选在nick位点处或协同nick位点之间的核苷酸上；
（3） 设计外源供体DNA模板
在上游nick的上游有1 kb的同源序列即上游同源臂，在下游nick的下游有1 kb的同源序列即下游同源臂；在整合位点处加入敲入元件；供体DNA同源臂上对应Cas9n（D10A）识别的序列如果属于编码区，进行同义突变，非编码区则进行部分碱基突变，防止供体DNA被切割；将包含上下游同源臂以及敲入元件的该片段分子克隆入pBluescript II载体上，经过扩增提取质粒成为外源供体DNA；
（4）重组因子的制备
从DH5alpha菌株基因组中克隆重组因子的读码框序列，测序验证后再经过密码子优化；各重组因子序列分别加入核定位序列，然后于整段序列之上游加入SP6启动子序列，利用体外转录的试剂盒得到加帽(capped)及加polyA的mRNA，以不同组合混合后-80℃冻存备用；
（5）基因编辑斑马鱼受精卵
利用显微注射斑马鱼受精卵得到转基因斑马鱼品系；
（6）确定定点敲入整合KI效率
提取单尾鱼苗基因组，设计靶标位点及潜在脱靶位点两端引物进行基因组扩增测序鉴定阳性率及计算脱靶概率；注射后的单尾F0代斑马鱼苗与注射时相应的野生型斑马鱼杂交，F1代通过序列特异性PCR进行筛选。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108998406A (zh) * | 2018-08-03 | 2018-12-14 | 福州大学 | 一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法 |
| CN110305896A (zh) * | 2019-05-09 | 2019-10-08 | 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院 | 一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法 |
| CN110452930A (zh) * | 2019-08-19 | 2019-11-15 | 杭州荣泽生物科技有限公司 | 一种基于免疫细胞的基因组编辑方法和用途 |
| CN110669795A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-01-10 | 福州大学 | 一种在鱼类胚胎中实现精确定点rna剪切的技术 |
| CN111139259A (zh) * | 2020-01-18 | 2020-05-12 | 潍坊医学院 | 一种提高基因编辑中同源重组效率的方法 |
| CN111321171A (zh) * | 2018-12-14 | 2020-06-23 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种应用CRISPR/Cas9介导ES打靶技术制备基因打靶动物模型的方法 |
| CN115678912A (zh) * | 2021-07-26 | 2023-02-03 | 福州大学 | 一种构建dgtm转基因斑马鱼作为载体表达人源dgtm蛋白的方法 |
Citations (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102858985A (zh) * | 2009-07-24 | 2013-01-02 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 基因组编辑方法 |
| CN104195177A (zh) * | 2014-08-05 | 2014-12-10 | 南京大学 | 一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法 |
| CN104769112A (zh) * | 2012-11-01 | 2015-07-08 | 菲克特生物科学股份有限公司 | 用于在细胞中表达蛋白质的方法和产品 |
| CN104946621A (zh) * | 2014-03-28 | 2015-09-30 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 基因敲入组合物及其使用方法和应用 |
| CN105315352A (zh) * | 2014-07-01 | 2016-02-10 | 福州大学 | 昆虫定点基因敲入组合物及其使用方法和应用 |
| CN105492611A (zh) * | 2013-06-17 | 2016-04-13 | 布罗德研究所有限公司 | 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物 |
| WO2016149422A1 (en) * | 2015-03-16 | 2016-09-22 | The Broad Institute, Inc. | Encoding of dna vector identity via iterative hybridization detection of a barcode transcript |
| WO2017049266A2 (en) * | 2015-09-18 | 2017-03-23 | The Regents Of The University Of California | Methods for autocatalytic genome editing and neutralizing autocatalytic genome editing and compositions thereof |
| CN106893739A (zh) * | 2015-11-17 | 2017-06-27 | 香港中文大学 | 用于靶向基因操作的新方法和系统 |
| CN107043782A (zh) * | 2017-04-10 | 2017-08-15 | 西南大学 | 一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用 |
| CN107058383A (zh) * | 2011-02-25 | 2017-08-18 | 重组股份有限公司 | 经遗传修饰的动物及其生成方法 |
| WO2017189336A1 (en) * | 2016-04-25 | 2017-11-02 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for genomic editing |
| CN108290933A (zh) * | 2015-06-18 | 2018-07-17 | 布罗德研究所有限公司 | 降低脱靶效应的crispr酶突变 |
| CN108291218A (zh) * | 2015-07-15 | 2018-07-17 | 新泽西鲁特格斯州立大学 | 核酸酶非依赖性靶向基因编辑平台及其用途 |
| US20180320163A1 (en) * | 2015-06-18 | 2018-11-08 | The Broad Institute Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
| CN109863143A (zh) * | 2016-07-13 | 2019-06-07 | 威泰克斯制药公司 | 提高基因组编辑效率的方法、组合物和试剂盒 |
| CN111671904A (zh) * | 2020-04-15 | 2020-09-18 | 四川大学华西第二医院 | 一种含有抑制核酸内切酶功能的药物及其抗肿瘤的用途 |
-
2018
- 2018-08-03 CN CN201810875554.4A patent/CN108949830B/zh active Active
Patent Citations (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102858985A (zh) * | 2009-07-24 | 2013-01-02 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 基因组编辑方法 |
| CN107090470A (zh) * | 2011-02-25 | 2017-08-25 | 重组股份有限公司 | 经遗传修饰的动物及其生成方法 |
| CN107058383A (zh) * | 2011-02-25 | 2017-08-18 | 重组股份有限公司 | 经遗传修饰的动物及其生成方法 |
| CN104769112A (zh) * | 2012-11-01 | 2015-07-08 | 菲克特生物科学股份有限公司 | 用于在细胞中表达蛋白质的方法和产品 |
| CN105492611A (zh) * | 2013-06-17 | 2016-04-13 | 布罗德研究所有限公司 | 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物 |
| CN104946621A (zh) * | 2014-03-28 | 2015-09-30 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 基因敲入组合物及其使用方法和应用 |
| CN105315352A (zh) * | 2014-07-01 | 2016-02-10 | 福州大学 | 昆虫定点基因敲入组合物及其使用方法和应用 |
| CN104195177A (zh) * | 2014-08-05 | 2014-12-10 | 南京大学 | 一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法 |
| WO2016149422A1 (en) * | 2015-03-16 | 2016-09-22 | The Broad Institute, Inc. | Encoding of dna vector identity via iterative hybridization detection of a barcode transcript |
| US20200087641A1 (en) * | 2015-06-18 | 2020-03-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr enzyme mutations reducing off-target effects |
| US20180320163A1 (en) * | 2015-06-18 | 2018-11-08 | The Broad Institute Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
| CN108290933A (zh) * | 2015-06-18 | 2018-07-17 | 布罗德研究所有限公司 | 降低脱靶效应的crispr酶突变 |
| CN108291218A (zh) * | 2015-07-15 | 2018-07-17 | 新泽西鲁特格斯州立大学 | 核酸酶非依赖性靶向基因编辑平台及其用途 |
| WO2017049266A2 (en) * | 2015-09-18 | 2017-03-23 | The Regents Of The University Of California | Methods for autocatalytic genome editing and neutralizing autocatalytic genome editing and compositions thereof |
| CN106893739A (zh) * | 2015-11-17 | 2017-06-27 | 香港中文大学 | 用于靶向基因操作的新方法和系统 |
| WO2017189336A1 (en) * | 2016-04-25 | 2017-11-02 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for genomic editing |
| CN109863143A (zh) * | 2016-07-13 | 2019-06-07 | 威泰克斯制药公司 | 提高基因组编辑效率的方法、组合物和试剂盒 |
| CN107043782A (zh) * | 2017-04-10 | 2017-08-15 | 西南大学 | 一种基因敲除方法及其sgRNA片段与应用 |
| CN111671904A (zh) * | 2020-04-15 | 2020-09-18 | 四川大学华西第二医院 | 一种含有抑制核酸内切酶功能的药物及其抗肿瘤的用途 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| XIAOZHEN HE等: "Efficient and risk-reduced genome editing using double nicks enhanced by bacterial recombination factors in multiple species", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 * |
| 李国玲等: "动物基因组定点整合转基因技术研究进展", 《遗传》 * |
| 李国玲等: "提高CRISPR/Cas9介导的动物基因组精确插入效率研究进展", 《遗传》 * |
| 李广栋等: "单碱基编辑工具—腺嘌呤碱基编辑器ABE的研究进展", 《农业生物技术学报》 * |
| 陈薇等: "《生物技术发展年鉴 2013》", 31 December 2014, 军事医学科学出版社 * |
| 韩冰舟等: "基因组靶向敲入技术在模式动物中的发展与应用：以斑马鱼为例", 《生命科学》 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108998406A (zh) * | 2018-08-03 | 2018-12-14 | 福州大学 | 一种人类原代培养细胞基因组编辑、定点基因敲入方法 |
| CN111321171A (zh) * | 2018-12-14 | 2020-06-23 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种应用CRISPR/Cas9介导ES打靶技术制备基因打靶动物模型的方法 |
| CN110305896A (zh) * | 2019-05-09 | 2019-10-08 | 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院 | 一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法 |
| CN110305896B (zh) * | 2019-05-09 | 2020-11-24 | 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院 | 一种斑马鱼肾脏祖细胞标记转基因系的构建方法 |
| CN110452930A (zh) * | 2019-08-19 | 2019-11-15 | 杭州荣泽生物科技有限公司 | 一种基于免疫细胞的基因组编辑方法和用途 |
| CN110669795A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-01-10 | 福州大学 | 一种在鱼类胚胎中实现精确定点rna剪切的技术 |
| WO2021073173A1 (zh) * | 2019-10-18 | 2021-04-22 | 福州大学 | 一种在鱼类胚胎中实现精确定点 rna 剪切的技术 |
| CN111139259A (zh) * | 2020-01-18 | 2020-05-12 | 潍坊医学院 | 一种提高基因编辑中同源重组效率的方法 |
| CN115678912A (zh) * | 2021-07-26 | 2023-02-03 | 福州大学 | 一种构建dgtm转基因斑马鱼作为载体表达人源dgtm蛋白的方法 |
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| Publication number | Publication date |
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