CN111139259A - 一种提高基因编辑中同源重组效率的方法 - Google Patents

一种提高基因编辑中同源重组效率的方法 Download PDF

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Abstract

一种提高基因编辑中同源重组效率的方法及该方法中用到的质粒，包括以下步骤：首先，进行目的基因编辑设计及分子克隆；其次，在细胞培养基中加入化合物RS‑1，于37℃下培养24小时，然后采用电穿孔转染法或显微注射技术将Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段导入CRISPR‑Cas9基因编辑系统；本发明的在基因编辑中提高同源重组效率的方法，能够对真核细胞尤其是哺乳动物细胞进行精准基因编辑，适用于任意目的基因，如引入点突变、精准敲除或插入小片段等，相比常规的CRISPR‑Cas9系统可以提升至少50％的同源重组修复效率，针对某些基因位点甚至可以达到2～5倍的提升。

Description

一种提高基因编辑中同源重组效率的方法
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，具体说是一种在基因编辑中提高同源重组效率的方法。
背景技术
新一代基因编辑技术CRISPR已经在多个科研领域取得突破性的进展。迄今为止，各种动植物细胞及干细胞的基因都可以被系统编辑，为攻克艾滋病、多种癌症、遗传病及罕见病等顽症提供了可能，具有很好的研究意义。
CRISPR系统应用最广泛的为CRISPR-Cas9系统，Cas9为一种核酸内切酶，会在引导RNA(gRNA)的引导下切断与其配对的DNA双链，双链断裂后，细胞会启动DNA修复机制以修复断裂的DNA，由于CRISPR-Cas9系统不参与DNA的修复过程，因此，要进行精准的基因编辑，必须对DNA的修复加以人工干预，使其修复过程向着实验设计的方向进行。
在真核细胞中，DNA的修复机制包括两种：非同源重组的末端连接(Non-Homologous End Joining，NHEJ)和同源重组修复(Homology Directed Repair，HDR)，其中NHEJ的修复机制简单，并且始终存在于细胞分裂的中间期，只要DNA发生断裂或损伤，NHEJ就会启动，迅速修复DNA，但是DNA断裂处会引入随机突变；而HDR主要存在于细胞分裂中间期的S期和G2期，由于HDR修复复杂，有多种酶参与，并且需要可以使用的DNA模板。在一般情况下，细胞会利用染色体的另外一个拷贝作为模板修复损伤的DNA。但是，如果在损伤附近有可以利用的其他DNA模板，细胞也会利用这些模板进行DNA修复。DNA发生双链断裂后，由于NHEJ机制贯穿于细胞分裂中间期始终，而且更为简单有效，所以细胞更倾向于利用NHEJ机制修复损伤DNA；这就导致基因编辑中由于NHEJ会引入各种随机突变，从而降低了基因编辑的精准度。为了提高基因编辑的准确性，必须促进HDR修复机制，使细胞更倾向于使用HDR机制修复DNA，因此，加入适当的DNA模板，可以大幅度提高基因编辑的精准度。
因此，亟需一种在基因编辑中可以通用的高准确度的同源重组修复的方法，以便对哺乳动物细胞或受精卵的基因进行精准的基因编辑，如引入点突变、敲除或插入小片段等。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种在基因编辑中提高同源重组效率的方法，可以准确的在真核细胞的基因中进行精准的基因编辑，引入点突变，敲除或插入小片段等。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种DNA质粒pU6-CGA-110，包含编码Cas9、AUNIP和EGFP的序列，期间用P2A和T2A片段隔开；
DNA质粒pU6-CGA-110的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还包括DNA质粒pU6-CGA-110在提高基因编辑中同源重组效率中的应用。
一种DNA质粒pT7-C-111，基于pBluescriptII骨架的质粒，由T7启动子驱动Cas9基因表达，用于体外合成Cas9 mRNA；其基因序列如SEQ ID NO：2所示。
一种DNA质粒pT7-A-120，基于pBluescriptII骨架的质粒，由T7启动子驱动AUNIP基因表达，用于体外合成AUNIPmRNA；其基因序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明还包括一种提高基因编辑中同源重组效率的方法，包括以下步骤：
首先，进行目的基因编辑设计及分子克隆：设计目的基因gRNA序列和单链DNA寡核苷酸，分别在5’末端加上BsbI酶切位点；设计修复模板的单链DNA；设计PCR引物然后进行分子克隆，将目的基因gRNA序列插入到pU6-CGA-110的特定位点；
设计修复模板的单链DNA时，修复模板的单链DNA中引入突变的两端的同源重组臂的长度为70～80bp，并且修复模板的单链DNA在5’和3’末端的两位碱基处加入硫代磷酸酯键；
其次，在细胞培养基中加入化合物RS-1，于37℃下培养24小时，最后将Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段和作为修复模板的单链DNA导入CRISPR-Cas9基因编辑系统。
优选的，将Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段和作为修复模板的单链DNA导入CRISPR-Cas9基因编辑系统的方法为电穿孔转染法或显微注射法，具体的：
当细胞为非受精卵细胞时，采用电穿孔转染法转染Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段和作为修复模板的单链DNA，转染完成后持续在含有RS-1的培养基中培养细胞45～48小时；
当细胞为受精卵细胞时，利用显微注射的方法合并注射Cas9 mRNA，目的基因gRNA、AUNIP mRNA、RS-1化合物和作为修复模板的单链DNA的混合物，注射完成后，在培养基中培养受精卵16～20小时；其中RS-1化合物的注入浓度为8～10μM。
进一步优选的，采用电穿孔转染法转染Cas9基因片段、AUNIP基因片段和目的基因gRNA片段的方式为转染含有目的基因gRNA序列的DNA质粒pU6-CGA-110。
进一步优选的，采用电穿孔转染法转染Cas9基因片段、AUNIP基因片段和目的基因gRNA片段的方式为转染Cas9 mRNA，目的基因gRNA和AUNIPmRNA。
优选的，进行目的基因编辑设计及分子克隆具体包括以下步骤：
①设计基因编辑所需的目的基因gRNA序列，并根据序列设计所需的单链DNA寡核苷酸，分别在5’末端加上BsbI酶切位点；
②设计修复模板的单链DNA，引入突变的两端的同源重组臂的长度为70～80bp；并且修复模板的单链DNA在5’和3’末端的两位碱基处加入硫代磷酸酯键，然后加入目的基因；
③设计PCR引物，作为基因编辑后的测序确认；
④进行分子克隆，将gRNA的表达序列插入到质粒pU6-CGA-110的特定位点。
进一步优选的，进行分子克隆包括以下步骤：
首先，用限制性内切酶BsbI将pU6-CGA-110质粒酶切，回收切割后线性化片段；
其次，把表达目的基因gRNA的DNA序列在PCR机上退火，设置条件为：37℃30分钟，95℃5分钟，以每秒0.1℃的速率降温至20℃；
最后，将退火产物稀释后与切割后线性化的pU6-CGA-110质粒混合，加入T7DNA连接酶进行连接反应，转染质粒至细菌中，接种至培养基，在37℃下培养8～12小时，测序验证序列。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明的DNA质粒pU6-CGA-110，首先，该质粒包含编码Cas9、AUNIP和EGFP的序列，期间用P2A和T2A片段隔开；表达融合蛋白后会在P2A和T2A处切断，独立形成各个蛋白。转染成功后如果有EGFP荧光，可以判定各种蛋白都正常表达；其次，该质粒中还含有gRNA序列，在分子克隆时可以与目的基因的gRNA进行置换，将目的基因的gRNA插入到pU6-CGA-110的特定位点；最后，该质粒还可以体外合成目的基因gRNA；
本发明的DNA质粒pT7-C-111能够在体外高效合成Cas9 mRNA，DNA质粒pT7-A-120在体外高效合成AUNIP mRNA；
本发明的在基因编辑中提高同源重组效率的方法分为三种：
第一种，在培养细胞系(非受精卵细胞)做基因编辑，可采用电击穿孔法导入CRISPR-Cas9基因编辑系统。于电击穿孔转染前24小时在细胞培养基中加入化合物RS-1并在37度培养。电击穿孔转染法包括转染含Cas9、AUNIP、目的基因gRNA序列的质粒pU6-CGA-110和末端化学修饰过的单链DNA(ssDNA)修复模板。其中ssDNA的5’和3’末端需要进行化学修饰以提高精准修复效率；
第二种只是和第一种只是转染的遗传物质不同，转染Cas9 mRNA(利用质粒pT7-C-111体外合成)，gRNA(利用质粒pU6-CGA-110体外合成)，AUNIP mRNA(利用质粒pT7-A-120体外合成)和末端化学修饰过的ssDNA修复模板。
第三，在受精卵中进行基因编辑，利用显微注射法合并注射Cas9 mRNA，目的基因gRNA、AUNIP mRNA、RS-1化合物和末端化学修饰过的ssDNA修复模板，注射完成后，在加有RS-1化合物的培养基中培养受精卵16-20小时。
在培养细胞中进行编辑时，第二种的方法比第一种更加优异，因为该方法可以降低CRISPR-Cas9系统的脱靶效应；如果针对哺乳动物(如小鼠或大鼠)受精卵细胞进行基因编辑时，可以采用方法三，该方法可以有效降低哺乳动物形成嵌合体的概率。
本发明的在基因编辑中提高同源重组效率的方法，联合应用AUNIP蛋白和RS-1化合物，并对DNA修复模板同源重组臂的长度进行优化，大幅度促进了HDR修复机制，达到精确编辑的目的；
本发明的在基因编辑中提高同源重组效率的方法，能够对真核细胞尤其是哺乳动物细胞进行精准基因编辑，适用于任意目的基因，如引入点突变、敲除或插入小片段等，相比常规的CRISPR-Cas9系统可以提升至少50％的效率，针对某些基因位点如Sox18和HoxA9基因等，甚至可以达到2～5倍的提升。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种在基因编辑中提高同源重组效率的方法，通过以下技术方案实现：
一种DNA质粒pU6-CGA-110，包含编码Cas9、AUNIP和EGFP的序列，期间用P2A和T2A片段隔开；
DNA质粒pU6-CGA-110的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还包括DNA质粒pU6-CGA-110在提高基因编辑中同源重组效率中的应用。
一种DNA质粒pT7-C-111，利用pBluescriptII-KS做为骨架，并利用T7启动子驱动Cas9基因表达，可在体外高效转录合成Cas9 mRNA；其基因序列如SEQ ID NO：2所示。
一种DNA质粒pT7-A-120，利用pBluescriptII-KS做为骨架,并利用T7启动子驱动AUNIP基因的第1-70位氨基酸表达，可在体外高效转录合成AUNIPmRNA，其基因序列如SEQID NO：3所示。
本发明还包括一种提高基因编辑中同源重组效率的方法，包括以下步骤：
首先，进行目的基因编辑设计及分子克隆：设计目的基因gRNA序列和单链DNA寡核苷酸，分别在5’末端加上BsbI酶切位点；设计修复模板的单链DNA；设计PCR引物然后进行分子克隆，将目的基因gRNA序列插入到pU6-CGA-110的特定位点；
设计修复模板的单链DNA时，修复模板的单链DNA中引入突变的两端的同源重组臂的长度为70～80bp，并且修复模板的单链DNA在5’和3’末端的两位碱基处加入硫代磷酸酯键；
其次，在细胞培养基中加入化合物RS-1，于37℃下培养24小时，最后采用电穿孔转染法或显微注射法将Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段和作为修复模板的单链DNA导入CRISPR-Cas9基因编辑系统，
具体的：
⑴当细胞为非受精卵细胞时：
可采用电穿孔转染法转染含有目的基因gRNA序列的DNA质粒pU6-CGA-110和作为修复模板的单链DNA，转染完成后持续在含有RS-1的培养基中培养细胞45～48小时；
或者采用电穿孔转染法转染转染Cas9 mRNA，目的基因gRNA，AUNIPmRNA和作为修复模板的单链DNA转染完成后持续在含有RS-1的培养基中培养细胞45～48小时；
⑵当细胞为受精卵细胞时，利用显微注射的方法合并注射Cas9 mRNA，目的基因gRNA、AUNIP mRNA、RS-1化合物和作为修复模板的单链DNA的混合物，注射完成后，在培养基中培养受精卵16～20小时，其中RS-1化合物的注入浓度为8～10μM。
优选的，进行目的基因编辑设计及分子克隆具体包括以下步骤：
①设计基因编辑所需的目的基因gRNA序列，并根据序列设计所需的单链DNA寡核苷酸，分别在5’末端加上BsbI酶切位点；
②设计修复模板的单链DNA，引入突变的两端的同源重组臂的长度为70～80bp；并且修复模板的单链DNA在5’和3’末端的两位碱基处加入硫代磷酸酯键，然后加入目的基因；
③设计PCR引物，作为基因编辑后的测序确认；
④进行分子克隆，将gRNA的表达序列插入到质粒pU6-CGA-110的特定位点。
优选的，进行分子克隆包括以下步骤：
首先，用限制性内切酶BsbI将pU6-CGA-110质粒酶切，回收切割后线性化片段；
其次，把表达目的基因gRNA的DNA序列在PCR机上退火，设置条件为：37℃30分钟，95℃5分钟，以每秒0.1℃的速率降温至20℃；
最后，将退火产物稀释后与切割后线性化的pU6-CGA-110质粒混合，加入T7DNA连接酶进行连接反应，转染质粒至细菌中，接种至培养基，在37℃下培养8～12小时，测序验证序列。
本发明中的RS-1化合物信息：
CAS Number 312756-74-4，分子量：524.23，化学方程式：C20H16Br2N2O3S，结构式为：
Figure BDA0002373012030000071
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1
采用质粒转染法在小鼠NIH3T3细胞系的Sox18蛋白C末端精准敲入myc-tag基因
1.1基因编辑设计与分子克隆
1.1.1.利用线上CRISPR设计工具(http://crispor.tefor.net/)设计基因编辑所需的gRNA序列，依据序列设计所需的单链DNA寡核苷酸，分别在5’末端加上BsbI酶切位点；
Sox18 gRNA-F的基因序列如SEQ ID NO：4所示；
Sox18 gRNA-R的基因序列如SEQ ID NO：5所示；
1.1.2设计ssDNA模板(作为修复模板的单链DNA)，Sox18ssDNA模板基因序列如SEQID NO：6所示。ssDNA模板也可以从IDT(http://idtdna.com)购入。为提高精准编辑效率，ssDNA模板的5’端和3’端需要加入化学修饰，具体为在5’和3’末端的两位碱基处加入硫代磷酸酯键(phosphorothioate bonds，PS bonds)；PS bonds被标记为星号*，在ssDNA模板中加入了myc-tag；同源重组臂长度为70～80bp可以达到较高的同源重组修复效率，超过80bp后，效率提升十分有限。因此，将同原重组臂的长度设定为70～80bp左右；
化学修饰后的Sox18ssDNA模板基因序列为：
c*a*gaagagagcagcctcatttctgcgctgtctgatgctagcagcgcggtctattacagtgcttgcatctcaggcgagcagaagctgatcagcgaggaggacctgtagacactgtccttgctctccaccgcttctgcatgtggccaagtggcagagttgcctgctcccttcctttcgcatatgtatgttagggtatgca*a*；
1.1.3设计PCR引物，作为基因编辑后的测序确认；
Sox18 Seq Primer F的基因序列如SEQ ID NO：7所示；
Sox18 Seq Primer R的基因序列如SEQ ID NO：8所示；
1.1.4分子克隆步骤，将gRNA的表达序列插入到pU6-CGA-110的特定位点；
首先，用限制性内切酶BsbI将pU6-CGA-110质粒酶切，回收切割后线性化片段；然后，把Sox18 gRNA-F和Sox18 gRNA-R按摩尔比例1：1混合(100μM)，在PCR机上退火，设置条件为：37℃30分钟，95℃5分钟，以每秒0.1℃的速率降温至20℃；退火完成后，将退火产物稀释200倍与线性化的pU6-CGA-110混合，加入T7DNA连接酶，在室温进行连接反应一小时，完成后转染质粒至DH5α大肠杆菌，接种到含有50mg/ml的LB凝胶平板后在37℃培养箱培养过夜，次日挑选3～5个独立克隆，小量制备DNA纯化，验证序列后，可用于细胞转染步骤；
1.2细胞培养与转染
电转仪：Neon Transfection System。
1.2.1 NIH3T3细胞株培养液为高糖DMEM和10％小牛血清FBS；
培养条件：37℃恒温，5％CO2；培养至细胞密度达培养皿面积80-90％时传代，并在电转前24小时于培养基中加入10μM RS-1化合物，在细胞生长对数期收集，1500g的速度4℃离心5min取沉淀弃上清，一次转染需要10～20万个细胞；
1.2.2准备12孔培养板，加入含10μM RS-1的培养液放在培养箱预热；
1.2.3所需1.1.4步骤制作的含有gRNA序列的pU6-CGA-110质粒500ng；
1.2.4所需Sox18ssDNA模板10μM，体积1μl；
1.2.5用Neon电转仪推荐的R溶液混合10～20万左右的细胞，1.2.3所示的质粒和Sox18ssDNA模板，调整体积为100μl，并吸入Neon tip中，准备电击；
1.2.6迅速将Neon tip转移至已经添加好3ml E2溶液的Neon卡槽中，电击条件为1400v,5ms；
1.2.7电击结束后，迅速将细胞转入已经预热好的12孔培养板中。之后放入培养箱培养2～3日，并在培养液中加入10μM的RS-1化合物；
1.2.8用带有观测绿色荧光的显微镜检查是否转染成功；转染成功后，细胞会产生绿色荧光；
1.2.9冻结50％左右的细胞，余下的细胞用于提取基因组DNA，进行PCR和测序验证；用Sox18 Seq Primer F和Sox18 Seq Primer R，可扩增出397bp长的片段，证明基因被成功编辑。未被编辑的片段长度为367bp，为野生型，约有81％的细胞被编辑。
对照组，仅电转染含有Cas9和gRNA序列的质粒(无AUNIP序列)以及未经化学修饰的ssDNA修复模板，细胞培养约有36％左右的细胞基因组检测到编辑，实施例1中的编辑效率是对照组的两倍以上。
实施例2
采用RNA转染法在小鼠NIH3T3细胞系的Sox18蛋白C末端精准敲入myc-tag基因
2.1基因编辑设计与分子可隆
2.1.1与实施例1中1.1.1相同；
2.1.2与实施例1中1.1.2相同；
2.1.3与实施例1中1.1.3相同；
2.1.4与实施例1中1.1.4相同；
2.2细胞培养与转染：使用电转仪：Neon Transfection System；
2.2.1与实施例1中1.2.1相同；
2.2.2准备12孔培养板，加入含10μM RS-1的培养液放在培养箱预热；
2.2.3利用pU6-CGA-110质粒和MEGAshortscript kit(Ambion,AM1354)体外合成目的基因gRNA；(操作步骤为试剂盒的标准步骤)；
2.2.4利用质粒pT7-A-120和Ambion的mMESSAGE mMACHINE Kit(AM1340)体外合成AUNIP mRNA；(操作步骤为试剂盒的标准步骤)；
2.2.5利用质粒pT7-C-111和Ambion的mMESSAGE mMACHINE Kit(AM1340)体外合成Cas9 mRNA；(操作步骤为试剂盒的标准步骤)；
2.2.6用Neon电转仪推荐的R溶液混合10～20万左右的细胞，2.2.3所得的gRNA 2μM、2.2.4所得AUNIP mRNA 1μM、2.2.5所得Cas9 mRNA 1μM以及Sox18ssDNA模板10μM，调整体积为100μl，并吸入Neon tip中，准备电击；
2.2.7迅速将Neon tip转移至已经添加好3ml E2溶液的Neon卡槽中，电击条件为1400v,5ms；
2.2.8电击结束后，迅速将细胞转入已经预热好的12孔培养板中，之后放入培养箱培养2～3日，并在培养液中加入10μM的RS-1化合物；
2.2.9用带有观测绿色荧光的显微镜检查是否转染成功，转染成功后，细胞会产生绿色荧光；
2.2.10冻结50％左右的细胞，余下的细胞用于提取基因组DNA，进行PCR和测序验证，用Sox18 Seq Primer F和Sox18 Seq Primer R，可扩增出397bp长的片段，证明基因被成功编辑，未被编辑的片段长度为367bp，为野生型。约有81％的细胞被编辑。
对照组，仅电转相同浓度Cas9 mRNA、gRNA以及未经化学修饰的ssDNA修复模板，细胞培养约有39％左右的细胞基因组检测到编辑；实施例2中的编辑效率是对照组的两倍以上。
实施例3
在小鼠Hox9A蛋白C末端精准敲入P2A-EGFP荧光蛋白，使Hox9A蛋白的表达带有荧光标记。
3.1基因编辑设计与分子克隆
3.1.1利用在线CRISPR设计工具(http://crispor.tefor.net/)设计基因编辑所需的gRNA序列，依据序列设计所需的单链DNA寡核苷酸，分别在5’末端加上BsbI酶切位点。
HoxA9 gRNA-F的基因序列如SEQ ID NO：9所示；
HoxA9 gRNA-R的基因序列如SEQ ID NO：10所示；
3.1.2设计ssDNA模板，
HoxA9 ssDNA模板的基因序列如SEQ ID NO：11所示；ssDNA模板可以从IDT(http://idtdna.com)购入；设计为IDT Ultramer的ssDNA，为提高精准编辑效率，ssDNA模板的5‘端和3‘端需要加入化学修饰，具体为在5’和3’末端的两位碱基处加入硫代磷酸酯键(phosphorothioate bonds，PS bonds)，其中，PS bonds被标记为星号*，在ssDNA模板中加入了GFP序列，同源重组臂长度为70bp；
化学修饰后的HoxA9 ssDNA模板的基因序列为：
c*t*ggttccagaaccgcaggatgaaaatgaagaaaatcaacaaggaccgagcaaaagacgagggatccggagctactaatttctccttgcttaagcaagctggtgatgttgaagaaaatcctggtcctatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtgagccttttaggggctcatttaaaaagagagcaagctagaaagaaaaagaaaggactgtccgtctccctct*g*
3.1.3设计PCR引物，作为基因编辑后的测序确认；
HoxA9 Seq Primer F的基因序列如SEQ ID NO：12所示；
HoxA9 Seq Primer R的基因序列如SEQ ID NO：13所示；
3.1.4分子克隆步骤，将目的基因gRNA的表达序列插入到pU6-CGA-110的特定位点。
首先用限制性内切酶BsbI将pU6-CGA-110质粒酶切，回收切割后线性化片段；然后把HoxA9 gRNA-F和HoxA9 gRNA-R按摩尔比例1：1混合(100μM)，然后在PCR机上退火，设置条件为：37℃30分钟，95℃5分钟，降温至25℃，尽量保持降温速率为5℃每分钟；退火完成后，将退火产物稀释200倍与线性化的pU6-CGA-110混合，加入T7 DNA连接酶，在室温进行连接反应一小时；完成后转染质粒至DH5α大肠杆菌，接种到含有50mg/ml的LB凝胶平板后在37℃培养箱培养过夜，次日挑选3～5个独立克隆，小量制备DNA纯化，测序验证序列。
3.1.5体外合成目的基因gRNA，利用MEGAshortscript kit(Ambion,AM1354)和从3.1.4获得的质粒在体外反应合成目的基因gRNA，合成后的gRNA理想浓度在800ng/μl以上，可分装后于-80℃保存；
3.1.6体外合成AUNIP mRNA，质粒pT7-A-120包含有T7启动子和AUNIP的cDNA，结合利用Ambion的mMESSAGE mMACHINE Kit(AM1340)，可以在体外合成AUNIP的mRNA。合成后的mRNA理想浓度在800ng/μl以上，可分装后于-80℃保存，此mRNA用于后续的显微注射。
3.1.7小鼠受精卵显微注射：
将Cas9 mRNA，3.1.2中的ssDNA模板，3.1.5中得来的gRNA，3.1.6得来的AUNIPmRNA，并按以下比例混合：
Cas9 mRNA：20ng/μl
AUNIP mRNA：20ng/μl
HoxA9 gRNA：10ng/μl
ssDNA：5ng/μl
以上混合物溶解于纯水，并加入10μM RS-1化合物，利用显微注射的方法注入小鼠受精卵，注射完成后，在37℃，5％CO2条件下，利用
Figure BDA0002373012030000121
Advanced KSOM EmbryoMedium培养液(Sigma-Aldrich，MR-121)培养过夜，同时在培养液中加入10μM RS-1化合物，第二天把成功发育到2-celll阶段的卵细胞移植到假妊娠的雌性小鼠输卵管中，20天后CRISPR小鼠诞生。
使用本发明方法的实验组，注射50颗受精卵，成活43颗，诞生小鼠10只，有5只确认为正确编辑。
对照组，仅注射Cas9 mRNA，gRNA和未修饰的ssDNA修复模板，注射50颗受精卵，成活41颗，诞生小鼠11只，有1只确认为正确编辑。
可以看出本申请的方法同源重组效率是对照组的5倍。
序列表
<110> 潍坊医学院
<120> 一种提高基因编辑中同源重组效率的方法
<141> 2020-01-18
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9616
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccccacgagg gcctatttcc catgattcct tcatatttgc atatacgata caaggctgtt 60
agagagataa ttggaattaa tttgactgta aacacaaaga tattagtaca aaatacgtga 120
cgtagaaagt aataatttct tgggtagttt gcagttttaa aattatgttt taaaatggac 180
tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg 240
aaaggacgaa acaccgggtc ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat agcaagttaa 300
aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct tttttgtttt 360
agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgttt ttagcgcgtg cgccaattct 420
gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 480
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caatagtaac gccaataggg actttccatt 540
gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 600
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattgtg 660
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 720
ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 780
ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 840
gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 900
ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 960
cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg 1020
cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc gccccggctc 1080
tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt 1140
aattagctga gcaagaggta agggtttaag ggatggttgg ttggtggggt attaatgttt 1200
aattacctgg agcacctgcc tgaaatcact ttttttcagg ttggaccggt gccaccatgg 1260
actataagga ccacgacgga gactacaagg atcatgatat tgattacaaa gacgatgacg 1320
ataagatggc cccaaagaag aagcggaagg tcggtatcca cggagtccca gcagccgaca 1380
agaagtacag catcggcctg gacatcggca ccaactctgt gggctgggcc gtgatcaccg 1440
acgagtacaa ggtgcccagc aagaaattca aggtgctggg caacaccgac cggcacagca 1500
tcaagaagaa cctgatcgga gccctgctgt tcgacagcgg cgaaacagcc gaggccaccc 1560
ggctgaagag aaccgccaga agaagataca ccagacggaa gaaccggatc tgctatctgc 1620
aagagatctt cagcaacgag atggccaagg tggacgacag cttcttccac agactggaag 1680
agtccttcct ggtggaagag gataagaagc acgagcggca ccccatcttc ggcaacatcg 1740
tggacgaggt ggcctaccac gagaagtacc ccaccatcta ccacctgaga aagaaactgg 1800
tggacagcac cgacaaggcc gacctgcggc tgatctatct ggccctggcc cacatgatca 1860
agttccgggg ccacttcctg atcgagggcg acctgaaccc cgacaacagc gacgtggaca 1920
agctgttcat ccagctggtg cagacctaca accagctgtt cgaggaaaac cccatcaacg 1980
ccagcggcgt ggacgccaag gccatcctgt ctgccagact gagcaagagc agacggctgg 2040
aaaatctgat cgcccagctg cccggcgaga agaagaatgg cctgttcgga aacctgattg 2100
ccctgagcct gggcctgacc cccaacttca agagcaactt cgacctggcc gaggatgcca 2160
aactgcagct gagcaaggac acctacgacg acgacctgga caacctgctg gcccagatcg 2220
gcgaccagta cgccgacctg tttctggccg ccaagaacct gtccgacgcc atcctgctga 2280
gcgacatcct gagagtgaac accgagatca ccaaggcccc cctgagcgcc tctatgatca 2340
agagatacga cgagcaccac caggacctga ccctgctgaa agctctcgtg cggcagcagc 2400
tgcctgagaa gtacaaagag attttcttcg accagagcaa gaacggctac gccggctaca 2460
ttgacggcgg agccagccag gaagagttct acaagttcat caagcccatc ctggaaaaga 2520
tggacggcac cgaggaactg ctcgtgaagc tgaacagaga ggacctgctg cggaagcagc 2580
ggaccttcga caacggcagc atcccccacc agatccacct gggagagctg cacgccattc 2640
tgcggcggca ggaagatttt tacccattcc tgaaggacaa ccgggaaaag atcgagaaga 2700
tcctgacctt ccgcatcccc tactacgtgg gccctctggc caggggaaac agcagattcg 2760
cctggatgac cagaaagagc gaggaaacca tcaccccctg gaacttcgag gaagtggtgg 2820
acaagggcgc ttccgcccag agcttcatcg agcggatgac caacttcgat aagaacctgc 2880
ccaacgagaa ggtgctgccc aagcacagcc tgctgtacga gtacttcacc gtgtataacg 2940
agctgaccaa agtgaaatac gtgaccgagg gaatgagaaa gcccgccttc ctgagcggcg 3000
agcagaaaaa ggccatcgtg gacctgctgt tcaagaccaa ccggaaagtg accgtgaagc 3060
agctgaaaga ggactacttc aagaaaatcg agtgcttcga ctccgtggaa atctccggcg 3120
tggaagatcg gttcaacgcc tccctgggca cataccacga tctgctgaaa attatcaagg 3180
acaaggactt cctggacaat gaggaaaacg aggacattct ggaagatatc gtgctgaccc 3240
tgacactgtt tgaggacaga gagatgatcg aggaacggct gaaaacctat gcccacctgt 3300
tcgacgacaa agtgatgaag cagctgaagc ggcggagata caccggctgg ggcaggctga 3360
gccggaagct gatcaacggc atccgggaca agcagtccgg caagacaatc ctggatttcc 3420
tgaagtccga cggcttcgcc aacagaaact tcatgcagct gatccacgac gacagcctga 3480
cctttaaaga ggacatccag aaagcccagg tgtccggcca gggcgatagc ctgcacgagc 3540
acattgccaa tctggccggc agccccgcca ttaagaaggg catcctgcag acagtgaagg 3600
tggtggacga gctcgtgaaa gtgatgggcc ggcacaagcc cgagaacatc gtgatcgaaa 3660
tggccagaga gaaccagacc acccagaagg gacagaagaa cagccgcgag agaatgaagc 3720
ggatcgaaga gggcatcaaa gagctgggca gccagatcct gaaagaacac cccgtggaaa 3780
acacccagct gcagaacgag aagctgtacc tgtactacct gcagaatggg cgggatatgt 3840
acgtggacca ggaactggac atcaaccggc tgtccgacta cgatgtggac catatcgtgc 3900
ctcagagctt tctgaaggac gactccatcg acaacaaggt gctgaccaga agcgacaaga 3960
accggggcaa gagcgacaac gtgccctccg aagaggtcgt gaagaagatg aagaactact 4020
ggcggcagct gctgaacgcc aagctgatta cccagagaaa gttcgacaat ctgaccaagg 4080
ccgagagagg cggcctgagc gaactggata aggccggctt catcaagaga cagctggtgg 4140
aaacccggca gatcacaaag cacgtggcac agatcctgga ctcccggatg aacactaagt 4200
acgacgagaa tgacaagctg atccgggaag tgaaagtgat caccctgaag tccaagctgg 4260
tgtccgattt ccggaaggat ttccagtttt acaaagtgcg cgagatcaac aactaccacc 4320
acgcccacga cgcctacctg aacgccgtcg tgggaaccgc cctgatcaaa aagtacccta 4380
agctggaaag cgagttcgtg tacggcgact acaaggtgta cgacgtgcgg aagatgatcg 4440
ccaagagcga gcaggaaatc ggcaaggcta ccgccaagta cttcttctac agcaacatca 4500
tgaacttttt caagaccgag attaccctgg ccaacggcga gatccggaag cggcctctga 4560
tcgagacaaa cggcgaaacc ggggagatcg tgtgggataa gggccgggat tttgccaccg 4620
tgcggaaagt gctgagcatg ccccaagtga atatcgtgaa aaagaccgag gtgcagacag 4680
gcggcttcag caaagagtct atcctgccca agaggaacag cgataagctg atcgccagaa 4740
agaaggactg ggaccctaag aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtg gcctattctg 4800
tgctggtggt ggccaaagtg gaaaagggca agtccaagaa actgaagagt gtgaaagagc 4860
tgctggggat caccatcatg gaaagaagca gcttcgagaa gaatcccatc gactttctgg 4920
aagccaaggg ctacaaagaa gtgaaaaagg acctgatcat caagctgcct aagtactccc 4980
tgttcgagct ggaaaacggc cggaagagaa tgctggcctc tgccggcgaa ctgcagaagg 5040
gaaacgaact ggccctgccc tccaaatatg tgaacttcct gtacctggcc agccactatg 5100
agaagctgaa gggctccccc gaggataatg agcagaaaca gctgtttgtg gaacagcaca 5160
agcactacct ggacgagatc atcgagcaga tcagcgagtt ctccaagaga gtgatcctgg 5220
ccgacgctaa tctggacaaa gtgctgtccg cctacaacaa gcaccgggat aagcccatca 5280
gagagcaggc cgagaatatc atccacctgt ttaccctgac caatctggga gcccctgccg 5340
ccttcaagta ctttgacacc accatcgacc ggaagaggta caccagcacc aaagaggtgc 5400
tggacgccac cctgatccac cagagcatca ccggcctgta cgagacacgg atcgacctgt 5460
ctcagctggg aggcgacaaa aggccggcgg ccacgaaaaa ggccggccag gcaaaaaaga 5520
aaaagcttga gggcagagga agtctgctaa catgcggtga cgtggaggag aatcccggcc 5580
ctgctagcat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg 5640
agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg 5700
ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct 5760
ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc 5820
acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca 5880
ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 5940
acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 6000
tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc 6060
agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc 6120
agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 6180
acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc 6240
acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt 6300
acaagctcga ggcaacaaac ttctcactac tcaaacaagc aggtgacgtg gaggagaatc 6360
ccgggcctct taagatgagg cggacaggcc ccgaggagga ggcctgcggc gtgtggctgg 6420
acgcggcggc gctgaagagg cggaaagtgc agacacattt aatcaaacca ggcaccaaaa 6480
tgctaacact ccttcctgga gaaagaaagg ctaatattta ttttactcaa agaagagctc 6540
catctacagg cattcaccag agaagcattg cttccttctt caccaaaagg ccggcggcca 6600
cgaaaaaggc cggccaggca aaaaagaaaa aggaattcct agagctcgct gatcagcctc 6660
gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac 6720
cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg 6780
tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga 6840
ttgggaagag aatagcaggc atgctgggga gcggccgcag gaacccctag tgatggagtt 6900
ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg 6960
acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcaggg 7020
gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatacgtca 7080
aagcaaccat agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 7140
cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 7200
tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 7260
gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt 7320
tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 7380
ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcgggctat 7440
tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 7500
taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt atggtgcact 7560
ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 7620
gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 7680
gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga 7740
aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 7800
acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 7860
atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 7920
tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 7980
gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 8040
gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 8100
gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 8160
ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 8220
tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 8280
acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 8340
cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 8400
catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 8460
cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 8520
ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 8580
ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 8640
ggtgagcgtg gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 8700
atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 8760
gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat 8820
atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 8880
tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 8940
cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 9000
ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 9060
actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta 9120
gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 9180
ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 9240
gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 9300
acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 9360
tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 9420
gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 9480
cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 9540
cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 9600
ccttttgctc acatgt 9616
<210> 2
<211> 7233
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 60
ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 120
ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 180
ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 240
ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 300
gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 360
tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 420
ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660
ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggt gccaccatgg actataagga 720
ccacgacgga gactacaagg atcatgatat tgattacaaa gacgatgacg ataagatggc 780
cccaaagaag aagcggaagg tcggtatcca cggagtccca gcagccgaca agaagtacag 840
catcggcctg gacatcggca ccaactctgt gggctgggcc gtgatcaccg acgagtacaa 900
ggtgcccagc aagaaattca aggtgctggg caacaccgac cggcacagca tcaagaagaa 960
cctgatcgga gccctgctgt tcgacagcgg cgaaacagcc gaggccaccc ggctgaagag 1020
aaccgccaga agaagataca ccagacggaa gaaccggatc tgctatctgc aagagatctt 1080
cagcaacgag atggccaagg tggacgacag cttcttccac agactggaag agtccttcct 1140
ggtggaagag gataagaagc acgagcggca ccccatcttc ggcaacatcg tggacgaggt 1200
ggcctaccac gagaagtacc ccaccatcta ccacctgaga aagaaactgg tggacagcac 1260
cgacaaggcc gacctgcggc tgatctatct ggccctggcc cacatgatca agttccgggg 1320
ccacttcctg atcgagggcg acctgaaccc cgacaacagc gacgtggaca agctgttcat 1380
ccagctggtg cagacctaca accagctgtt cgaggaaaac cccatcaacg ccagcggcgt 1440
ggacgccaag gccatcctgt ctgccagact gagcaagagc agacggctgg aaaatctgat 1500
cgcccagctg cccggcgaga agaagaatgg cctgttcgga aacctgattg ccctgagcct 1560
gggcctgacc cccaacttca agagcaactt cgacctggcc gaggatgcca aactgcagct 1620
gagcaaggac acctacgacg acgacctgga caacctgctg gcccagatcg gcgaccagta 1680
cgccgacctg tttctggccg ccaagaacct gtccgacgcc atcctgctga gcgacatcct 1740
gagagtgaac accgagatca ccaaggcccc cctgagcgcc tctatgatca agagatacga 1800
cgagcaccac caggacctga ccctgctgaa agctctcgtg cggcagcagc tgcctgagaa 1860
gtacaaagag attttcttcg accagagcaa gaacggctac gccggctaca ttgacggcgg 1920
agccagccag gaagagttct acaagttcat caagcccatc ctggaaaaga tggacggcac 1980
cgaggaactg ctcgtgaagc tgaacagaga ggacctgctg cggaagcagc ggaccttcga 2040
caacggcagc atcccccacc agatccacct gggagagctg cacgccattc tgcggcggca 2100
ggaagatttt tacccattcc tgaaggacaa ccgggaaaag atcgagaaga tcctgacctt 2160
ccgcatcccc tactacgtgg gccctctggc caggggaaac agcagattcg cctggatgac 2220
cagaaagagc gaggaaacca tcaccccctg gaacttcgag gaagtggtgg acaagggcgc 2280
ttccgcccag agcttcatcg agcggatgac caacttcgat aagaacctgc ccaacgagaa 2340
ggtgctgccc aagcacagcc tgctgtacga gtacttcacc gtgtataacg agctgaccaa 2400
agtgaaatac gtgaccgagg gaatgagaaa gcccgccttc ctgagcggcg agcagaaaaa 2460
ggccatcgtg gacctgctgt tcaagaccaa ccggaaagtg accgtgaagc agctgaaaga 2520
ggactacttc aagaaaatcg agtgcttcga ctccgtggaa atctccggcg tggaagatcg 2580
gttcaacgcc tccctgggca cataccacga tctgctgaaa attatcaagg acaaggactt 2640
cctggacaat gaggaaaacg aggacattct ggaagatatc gtgctgaccc tgacactgtt 2700
tgaggacaga gagatgatcg aggaacggct gaaaacctat gcccacctgt tcgacgacaa 2760
agtgatgaag cagctgaagc ggcggagata caccggctgg ggcaggctga gccggaagct 2820
gatcaacggc atccgggaca agcagtccgg caagacaatc ctggatttcc tgaagtccga 2880
cggcttcgcc aacagaaact tcatgcagct gatccacgac gacagcctga cctttaaaga 2940
ggacatccag aaagcccagg tgtccggcca gggcgatagc ctgcacgagc acattgccaa 3000
tctggccggc agccccgcca ttaagaaggg catcctgcag acagtgaagg tggtggacga 3060
gctcgtgaaa gtgatgggcc ggcacaagcc cgagaacatc gtgatcgaaa tggccagaga 3120
gaaccagacc acccagaagg gacagaagaa cagccgcgag agaatgaagc ggatcgaaga 3180
gggcatcaaa gagctgggca gccagatcct gaaagaacac cccgtggaaa acacccagct 3240
gcagaacgag aagctgtacc tgtactacct gcagaatggg cgggatatgt acgtggacca 3300
ggaactggac atcaaccggc tgtccgacta cgatgtggac catatcgtgc ctcagagctt 3360
tctgaaggac gactccatcg acaacaaggt gctgaccaga agcgacaaga accggggcaa 3420
gagcgacaac gtgccctccg aagaggtcgt gaagaagatg aagaactact ggcggcagct 3480
gctgaacgcc aagctgatta cccagagaaa gttcgacaat ctgaccaagg ccgagagagg 3540
cggcctgagc gaactggata aggccggctt catcaagaga cagctggtgg aaacccggca 3600
gatcacaaag cacgtggcac agatcctgga ctcccggatg aacactaagt acgacgagaa 3660
tgacaagctg atccgggaag tgaaagtgat caccctgaag tccaagctgg tgtccgattt 3720
ccggaaggat ttccagtttt acaaagtgcg cgagatcaac aactaccacc acgcccacga 3780
cgcctacctg aacgccgtcg tgggaaccgc cctgatcaaa aagtacccta agctggaaag 3840
cgagttcgtg tacggcgact acaaggtgta cgacgtgcgg aagatgatcg ccaagagcga 3900
gcaggaaatc ggcaaggcta ccgccaagta cttcttctac agcaacatca tgaacttttt 3960
caagaccgag attaccctgg ccaacggcga gatccggaag cggcctctga tcgagacaaa 4020
cggcgaaacc ggggagatcg tgtgggataa gggccgggat tttgccaccg tgcggaaagt 4080
gctgagcatg ccccaagtga atatcgtgaa aaagaccgag gtgcagacag gcggcttcag 4140
caaagagtct atcctgccca agaggaacag cgataagctg atcgccagaa agaaggactg 4200
ggaccctaag aagtacggcg gcttcgacag ccccaccgtg gcctattctg tgctggtggt 4260
ggccaaagtg gaaaagggca agtccaagaa actgaagagt gtgaaagagc tgctggggat 4320
caccatcatg gaaagaagca gcttcgagaa gaatcccatc gactttctgg aagccaaggg 4380
ctacaaagaa gtgaaaaagg acctgatcat caagctgcct aagtactccc tgttcgagct 4440
ggaaaacggc cggaagagaa tgctggcctc tgccggcgaa ctgcagaagg gaaacgaact 4500
ggccctgccc tccaaatatg tgaacttcct gtacctggcc agccactatg agaagctgaa 4560
gggctccccc gaggataatg agcagaaaca gctgtttgtg gaacagcaca agcactacct 4620
ggacgagatc atcgagcaga tcagcgagtt ctccaagaga gtgatcctgg ccgacgctaa 4680
tctggacaaa gtgctgtccg cctacaacaa gcaccgggat aagcccatca gagagcaggc 4740
cgagaatatc atccacctgt ttaccctgac caatctggga gcccctgccg ccttcaagta 4800
ctttgacacc accatcgacc ggaagaggta caccagcacc aaagaggtgc tggacgccac 4860
cctgatccac cagagcatca ccggcctgta cgagacacgg atcgacctgt ctcagctggg 4920
aggcgacaaa aggccggcgg ccacgaaaaa ggccggccag gcaaaaaaga aaaagtaaga 4980
attcgatatc aagcttatcg ataccgtcga cctcgagggg gggcccggta cccagctttt 5040
gttcccttta gtgagggtta attgcgcgct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 5100
tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 5160
aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 5220
ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 5280
gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 5340
tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 5400
aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 5460
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 5520
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 5580
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 5640
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 5700
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 5760
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 5820
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 5880
ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 5940
tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 6000
aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 6060
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 6120
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 6180
ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 6240
acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 6300
ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 6360
gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 6420
taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 6480
tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 6540
gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 6600
cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 6660
aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 6720
cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 6780
tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 6840
gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 6900
tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 6960
gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 7020
ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 7080
cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 7140
agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 7200
gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cac 7233
<210> 3
<211> 3342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 60
ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 120
ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 180
ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 240
ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 300
gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 360
tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 420
ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttc cattcgccat tcaggctgcg 480
caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540
gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660
ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggt gccaccatgg actataagga 720
ccacgacgga gactacaagg atcatgatat tgattacaaa gacgatgacg ataagatggc 780
cccaaagaag aagcggaagg tcggtatcca cggagtccca gcagccatga ggcggacagg 840
ccccgaggag gaggcctgcg gcgtgtggct ggacgcggcg gcgctgaaga ggcggaaagt 900
gcagacacat ttaatcaaac caggcaccaa aatgctaaca ctccttcctg gagaaagaaa 960
ggctaatatt tattttactc aaagaagagc tccatctaca ggcattcacc agagaagcat 1020
tgcttccttc ttcaccaaaa ggccggcggc cacgaaaaag gccggccagg caaaaaagaa 1080
aaagtaagaa ttcgatatca agcttatcga taccgtcgac ctcgaggggg ggcccggtac 1140
ccagcttttg ttccctttag tgagggttaa ttgcgcgctt ggcgtaatca tggtcatagc 1200
tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 1260
taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 1320
cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 1380
gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 1440
tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 1500
tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 1560
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 1620
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 1680
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 1740
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 1800
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 1860
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 1920
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 1980
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 2040
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 2100
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 2160
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 2220
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 2280
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 2340
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 2400
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 2460
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 2520
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 2580
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 2640
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 2700
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 2760
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 2820
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 2880
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 2940
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 3000
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 3060
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 3120
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 3180
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 3240
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 3300
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc ac 3342
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 4
caccgccaca tgcagaagcg gtgga 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
aaactccacc gcttctgcat gtggc 25
<210> 6
<211> 199
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
cagaagagag cagcctcatt tctgcgctgt ctgatgctag cagcgcggtc tattacagtg 60
cttgcatctc aggcgagcag aagctgatca gcgaggagga cctgtagaca ctgtccttgc 120
tctccaccgc ttctgcatgt ggccaagtgg cagagttgcc tgctcccttc ctttcgcata 180
tgtatgttag ggtatgcaa 199
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 7
tcttgagggc acagagcaac 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
aatggcatct ttaggccacc a 21
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 9
caccgaagac gagtgagcct tttag 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 10
aaacctaaaa ggctcactcg tcttc 25
<210> 11
<211> 917
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 11
ctggttccag aaccgcagga tgaaaatgaa gaaaatcaac aaggaccgag caaaagacga 60
gggatccgga gctactaatt tctccttgct taagcaagct ggtgatgttg aagaaaatcc 120
tggtcctatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 180
gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc 240
cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg 300
gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 360
catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac 420
catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga 480
caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 540
ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca 600
gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca 660
gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 720
caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 780
catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta 840
caagtgagcc ttttaggggc tcatttaaaa agagagcaag ctagaaagaa aaagaaagga 900
ctgtccgtct ccctctg 917
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 12
ccaactggct acatgctcgc 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 13
cgtcgccgtc cagctcgacc ag 22

Claims (10)

1.一种DNA质粒pU6-CGA-110，其特征在于：包含编码Cas9、AUNIP和EGFP的序列，期间用P2A和T2A片段隔开；
DNA质粒pU6-CGA-110的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述DNA质粒pU6-CGA-110的应用，其特征在于：在提高基因编辑中同源重组效率中的应用。
3.一种DNA质粒pT7-C-111，其特征在于：基于pBluescriptII骨架的质粒，由T7启动子驱动Cas9基因表达，用于体外合成Cas9mRNA；其基因序列如SEQ ID NO：2所示。
4.一种DNA质粒pT7-A-120，其特征在于：基于pBluescriptII骨架的质粒，由T7启动子驱动AUNIP基因表达，用于体外合成AUNIPmRNA；其基因序列如SEQ ID NO：3所示。
5.一种提高基因编辑中同源重组效率的方法，其特征在于：包括以下步骤：
首先，进行目的基因编辑设计及分子克隆：设计目的基因gRNA序列和单链DNA寡核苷酸，分别在5’末端加上BsbI酶切位点；设计修复模板的单链DNA；设计PCR引物然后进行分子克隆，将目的基因gRNA序列插入到pU6-CGA-110的特定位点；
设计修复模板的单链DNA时，修复模板的单链DNA中引入突变的两端的同源重组臂的长度为70～80bp，并且修复模板的单链DNA在5’和3’末端的两位碱基处加入硫代磷酸酯键；
其次，在细胞培养基中加入化合物RS-1，于37℃下培养24小时，最后将Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段和作为修复模板的单链DNA导入CRISPR-Cas9基因编辑系统。
6.根据权利要求5所述的一种提高基因编辑中同源重组效率的方法，其特征在于：将Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段和作为修复模板的单链DNA导入CRISPR-Cas9基因编辑系统的方法为电穿孔转染法或显微注射法，具体的：
当细胞为非受精卵细胞时，采用电穿孔转染法转染Cas9基因片段、AUNIP基因片段、目的基因gRNA片段和作为修复模板的单链DNA，转染完成后持续在细胞培养基中培养45～48小时；
当细胞为受精卵细胞时，利用显微注射的方法合并注射Cas9 mRNA，目的基因gRNA、AUNIP mRNA、RS-1化合物和作为修复模板的单链DNA的混合物，注射完成后，在细胞培养基中培养受精卵16～20小时。
7.根据权利要求6所述的一种提高基因编辑中同源重组效率的方法，其特征在于：采用电穿孔转染法转染Cas9基因片段、AUNIP基因片段和目的基因gRNA片段的方式为转染含有目的基因gRNA序列的DNA质粒pU6-CGA-110。
8.根据权利要求6所述的一种提高基因编辑中同源重组效率的方法，其特征在于：采用电穿孔转染法转染Cas9基因片段、AUNIP基因片段和目的基因gRNA片段的方式为转染Cas9mRNA，目的基因gRNA和AUNIPmRNA。
9.根据权利要求5所述的一种提高基因编辑中同源重组效率的方法，其特征在于：进行目的基因编辑设计及分子克隆具体包括以下步骤：
①设计基因编辑所需的目的基因gRNA序列，并根据序列设计所需的单链DNA寡核苷酸，分别在5’末端加上BsbI酶切位点；
②设计修复模板的单链DNA，引入突变的两端的同源重组臂的长度为70～80bp；并且修复模板的单链DNA在5’和3’末端的两位碱基处加入硫代磷酸酯键，然后加入目的基因；
③设计PCR引物，作为基因编辑后的测序确认；
④进行分子克隆，将gRNA的表达序列插入到质粒pU6-CGA-110的特定位点。
10.根据权利要求5所述的一种提高基因编辑中同源重组效率的方法，其特征在于：进行分子克隆包括以下步骤：
首先，用限制性内切酶BsbI将pU6-CGA-110质粒酶切，回收切割后线性化片段；
其次，把表达目的基因gRNA的DNA序列在PCR机上退火，设置条件为：37℃ 30分钟，95℃5分钟，以每秒0.1℃的速率降温至20℃；
最后，将退火产物稀释后与切割后线性化的pU6-CGA-110质粒混合，加入T7DNA连接酶进行连接反应，转染质粒至细菌中，接种至培养基，在37℃下培养8～12小时，测序验证序列。
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