CN111394393B - 提高基因组定点整合效率的抑制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了通过筛选出可以提高基因组定点整合效率的抑制剂，包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂或JAK抑制剂中的至少一种。组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以在基因组定点整合时，抑制组蛋白的去乙酰化，而促进组蛋白的乙酰化，进而有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录及定点整合效率。JAK抑制剂通过抑制细胞JAK自发性磷酸化，影响其与STAT蛋白结合，使STAT转录因子磷酸化不能有效转移至细胞核内，影响非DNA连接因子的结合，有利于NHEJ/HDR因子的结合，进而有效增加基因整合至基因组的概率，提高基因组定点整合效率。

Description

提高基因组定点整合效率的抑制剂及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及提高基因组定点整合效率的 试剂及其应用。
背景技术
基因编辑技术是一项对基因组进行精确定点修饰的技术，可对特定 DNA片段进行敲除、加入和替换等，从而在基因组水平上进行精确的基因 编辑。其技术本质均是利用非同源末端链接途径修复和同源重组修复，联 合特异性DNA靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。在医学领域， 科研人员通过构建模型动物，深入了解疾病的发病机制和探究基因功能、 异种器官移植、以及改造相关疾病基因，达到基因治疗的目的等；在动物 育种领域，科研人员利用基因编辑技术敲除或者加入某个特定基因，进行 生产性状改良。
锌指核酸内切酶(Zinc-finger endonuclease,ZFN)、类转录激活因子效 应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)、规律成 簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)等基因编辑技术的出现，可在基因组内高效产生双链断裂 (double strand break,DSB)为精确定点修饰提供了极大的技术支撑。通常 细胞发生DSB后，激活自身两种DNA修复机制——非同源末端连接 (non-homologous endjoining,NHEJ)和同源介导修复(homology-directed repair,HDR)，其中HDR机制需要同源模板，修复过程产生错误的概率较 低，是定向突变和定点敲入的最佳修复路径。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高基因组定点整合效率的抑制剂及其应 用，以解决基因组定点整合效率低的问题，提高基因组定点整合效率。
根据本发明的一个方面，提供了一种提高基因组定点整合效率的抑制 剂，该抑制剂包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂或JAK抑制剂中的至少一种。
在某些实施方式中，可提高基因组定点整合效率的组蛋白去乙酰化酶 抑制剂包括4SC-202、Benzenebutyric acid或Remetinostat中的至少一种。
在某些实施方式中，可提高基因组定点整合效率的JAK抑制剂包括Peficitinib、CHZ868或Solcitinib中的至少一种。
在某些实施方式中，可提高基因组定点整合效率的组蛋白去乙酰化酶 抑制剂4SC-202的使用浓度为1μM时可显著提高基因组定点整合效率，可 将整合效率由10.4％提高到26.9％，提高了260％。
在某些实施方式中，可提高基因组定点整合效率的JAK抑制剂 Peficitinib的使用浓度为5μM时可显著提高基因组定点整合效率，可将整 合效率由11.8％提高到25.9％，提高了220％。
根据本发明的另一个方面，提供了一种提高基因组定点整合效率的抑 制剂在提高转基因效率的产品中的应用。
在一些实施方式中，该应用中提高基因组定点整合效率的抑制剂选自 组蛋白去乙酰化酶抑制剂；或JAK抑制剂；或4SC-202、Benzenebutyric acid、 Remetinostat等组蛋白去乙酰化酶抑制剂；或Peficitinib、CHZ868、Solcitinib 等JAK抑制剂；或1μM的组蛋白去乙酰化酶抑制剂4SC-202；或5μM的 JAK抑制剂Peficitinib，或这些选项中的至少一种。
在一些实施方式中，该应用通过CRISPR/Cas9系统与所述的抑制剂共 同作用于基因组来实现。
根据本发明的再一个方面，提供了一种提高转基因效率的试剂盒，该 试剂盒中包括可提高基因组定点整合效率的抑制剂。
在某些实施方式中，试剂盒中包括可提高基因组定点整合效率的组蛋 白去乙酰化酶抑制剂或JAK抑制剂中的至少一种。
在某些实施方式中，试剂盒中包括可提高基因组定点整合效率的抑制 剂选自组蛋白去乙酰化酶抑制剂；或JAK抑制剂；或4SC-202、 Benzenebutyric acid、Remetinostat等组蛋白去乙酰化酶抑制剂；或 Peficitinib、CHZ868、Solcitinib等JAK抑制剂；或1μM的组蛋白去乙酰化 酶抑制剂4SC-202；或5μM的JAK抑制剂Peficitinib，或这些选项中的至少一种。
根据本发明的又一个方面，提供了一种提高基因组定点整合效率的抑 制剂的筛选方法，该方法包括如下步骤：
合成绿色荧光报告载体；
构建CRISPR/Cas9载体；
将绿色荧光报告载体、CRISPR/Cas9载体及抑制剂共处理细胞，筛 选出提高基因组定点整合效率的小分子化合物抑制剂。
本发明的有益之处在于：
1、提供了可以提高基因组定点整合效率的抑制剂，包括组蛋白去乙 酰化酶抑制剂或JAK抑制剂中的至少一种。组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以 在基因组定点整合时，抑制组蛋白的去乙酰化，而促进组蛋白的乙酰化， 进而有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转 录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录及 定点整合效率。JAK抑制剂通过抑制细胞JAK自发性磷酸化，影响其与 STAT蛋白结合，使STAT转录因子磷酸化不能有效转移至细胞核内，影响 非DNA连接因子的结合，有利于NHEJ/HDR因子的结合，进而有效增加 基因整合至基因组的概率，提高基因组定点整合效率。由此，通过使用上 述抑制剂，可以提高基因的定点整合效率。相较于对照组，整合效率可以 提高200％以上。
2、提供了一种提高基因组定点整合效率的抑制剂在提高转基因效 率的产品中的应用，以此可以大大提高转基因的效率，尤其是定点整合的 效率。
3、提供了一种提高转基因效率的试剂盒，该试剂盒中包括可提高基 因组定点整合效率的抑制剂，该试剂盒可以提高转基因的效率，尤其是定 点整合的效率。
4、提供了一种提高基因组定点整合效率的抑制剂的筛选方法，通过 此方法可以快速的高效的筛选出可以提高基因组定点整合效率的抑制剂。
附图说明
下面结合附图对发明作进一步详细的说明。
图1为小分子化合物提高CRISPR/Cas9介导的基因组定点修复机制图；
图2为小分子化合物对ACTB基因位点定点修复效率影响的结果统计 图；
图3为小分子化合物对GAPDH基因位点定点修复效率影响的结果统计 图；
图4为对ACTB与GAPDH基因位点有共同提高作用的小分子化合物统计 图；
图5为4SC-202与Peficit inib对细胞基因组定点整合效率的结果图；
图6为4SC-202与Peficit inib联合处理对ACTB基因位点定点整合效 率影响的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。如无特殊 说明，实施例中所用试剂均为市售，所用的技术手段为本领域技术人员所 熟知的常规手段。
实施例一：CRISPR/Cas9系统及EGFP报告载体的构建
EGFP报告载体：分别构建了两种ACTB-T2A-GFP(核苷酸序列如SEQ ID No:3所示)与GAPDH-T2A-GFP(核苷酸序列如SEQ ID No:4所示)报告 载体，该两种报告载体均由南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成，其工 作原理如图1所示：CRISPR/Cas9系统切割ACTB基因(NC_000007.14) 或GAPDH基因(NC_000012.12)，DNA产生双链断裂后，细胞发生同源 定向整合，EGFP整合至ACTB或GAPDH基因，细胞可以产生绿色荧光。 绿色荧光信号能被流式细胞仪检测到。由此，可通过检测表达绿色荧光的 细胞数量来评估基因组定点整合的效率。
CRISPR/Cas9系统构建：通过在线网站 https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html，设计ACTB和GAPDH基因的 CRISPR/Cas9向导序列sgRNA，具体引物如表1所示。将合成得到的上、 下游引物按表2体系配制混合，在PCR仪中退火，并使用PCR仪进行单链 引物退火，运行以下程序：95℃，5min→10℃，1min→95℃，5min→10℃，1min→95℃，5min→10℃，3min。然后将退火产物与Bbs I线性化后的PX330 载体(市购)进行T4连接(参考Takara T4 DNALigase说明书)。连接产 物用Trans10感受态细胞进行转化，挑菌和hU6-F： GAGGGCCTATTTCCCATGATT测序验证。测序结果正确的菌体即为 CRISPR/Cas9系统(其中GAPDH基因的CRISPR/Cas9系统核苷酸序列如 SEQ ID No:1所示；ACTB基因的CRISPR/Cas9系统核苷酸序列如SEQ ID No:2所示)。菌体用LB培养基加1/1000氨苄抗生素于摇床摇晃17小时后， 参考Omega Endo-free PlasmidMini Kit II说明书进行质粒抽提，并进行纯化 和保存，即为CRISPR/Cas9系统。
表1sgRNA序列信息
Figure BDA0002391603590000041
表2反应体系
Figure BDA0002391603590000042
实施例二：人肾上皮细胞(293T)的培养
预先将水浴锅的温度调至37℃，从液氮中取出冻存细胞，立即投入水浴 锅快速晃动，在1～2min内使细胞溶液完全溶解。随后将1ml细胞溶液加 入8ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿，放回37℃、5％CO2和95％ 相对湿度的培养箱中培养。待培养的细胞长至70％-80％汇合度时，可进行 后续实验。
实施例三：提高定点整合效率的表观修饰小分子化合物文库筛选
小分子化合物文库Epigenetics Compound Library购自MCE公司。使用 ACTB-T2A-GFP和GAPDH-T2A-GFP报告载体对文库中的182种化合物是 否能显著提高基因组定点整合效率进行筛选，具体筛选方法如下：待293T 细胞在10cm细胞培养皿中生长至汇合度70％-80％时，按照 Lipofectamine3000转染试剂的说明书转染CRISPR/Cas9载体与EGFP报告 载体，然后将细胞均匀铺到24孔板中，12小时后吸去旧培养基，每孔分别 加入含有1μl小分子化合物(文库中182个化合物中的一种)的细胞培养 基1ml；对照组使用1μl DMSO。该细胞随后放入37℃培养箱孵育48小时， 使用流式细胞仪检测绿色荧光细胞百分比。通过检测绿色荧光的百分比来 分析不同小分子化合物对基因组定点整合效率的影响。结果表明，在ACTB 基因位点上，检测出有88种小分子化合物可提高基因组定点整合效率(结 果见附图2)，79种小分子化合物降低基因组定点整合效率，15种小分子 化合物无显著影响的小分子；GAPDH基因位点上有63种小分子化合物可 提高基因组定点整合效率(结果见附图3)，99种小分子化合物降低基因 组定点整合效率，20种小分子化合物无显著影响；其中有29种小分子化合 物对两个基因位点共同提高作用(图4)。综合考虑小分子化合物对多个基 因位点的定点整合效率的提高作用，在29种小分子化合物中选择HDAC 抑制剂4SC-202、Benzenebutyric acid或Remetinostat等，和JAK抑制剂 Peficitinib、CHZ868或Solcitinib等进行后续实验。
实施例四：不同浓度的化合物4SC-202和Peficitinib对293T细胞定点整合 效率的影响
一、将293T细胞均匀铺到10cm细胞培养板中，待细胞生长至70-90％ 汇合度时按照Lipofectamine3000转染试剂的说明书转染CRISPR/Cas9系统 与ACTB-T2A-GFP报告载体，然后将细胞均匀铺到24孔板，12小时后吸 去旧培养基，选用10μM、5μM及2.5μM三个浓度Peficitinib抑制剂分 别加入至1ml完全培养基中配成培养液加入293T细胞中，继续培养48小 时后通过流式细胞仪检测细胞荧光数的百分比。结果显示：5μM的 Peficitinib可以使表达绿色荧光的细胞数量显著增加(如附图5A、5B)， 表达绿色荧光的细胞数量从对比组的11.8％提高到25.9％，增加了1.2倍。 在其他细胞中，亦得到相似的结果。因此，5μM的Peficitinib可显著提高 基因组定点整合的效率。
二、将293T细胞均匀铺到10cm细胞培养板中，待细胞生长至70-90％ 汇合度时按照Lipofectamine3000转染试剂的说明书转染CRISPR/Cas9系统 与ACTB-T2A-GFP报告载体，然后将细胞均匀铺到24孔板，12小时后吸 去旧培养基，选用1.25μM、1μM及0.5μM三个浓度4SC-202抑制剂分 别加入至1ml完全培养基中配成培养液加入293T细胞中，继续培养48小 时后通过流式细胞仪检测细胞荧光数的百分比。结果显示：1μM的4SC-202 可以使表达绿色荧光的细胞数量显著增加(如附图5A、5B)，表达绿色荧 光的细胞数量从对比组的10.4％提高到26.9％，增加了1.6倍。在其他细胞 中，亦得到相似的结果。因此，1μM的4SC-202可显著提高基因组定点整 合的效率。
实施例五：化合物4SC-202和Peficitinib联合使用对293T细胞定点整合效 率的影响
将293T细胞均匀铺到10cm细胞培养板中，待细胞生长至70-90％汇合 度时按照Lipofectamine3000转染试剂的说明书转染CRISPR/Cas9系统与 ACTB-T2A-GFP报告载体，然后将细胞均匀铺到24孔板，12小时后吸去旧 培养基，分别加入经优化后的化合物4SC-202浓度和Peficitinib浓度(分为 三组加入：即5μM Peficitinib、1μM 4SC-202、5μMPeficitinib与1μM 4SC-202混合物)继续培养48小时后通过流式细胞仪检测细胞荧光数的百 分比。结果显示，5μM的Peficitinib与1μM的4SC-202抑制剂联合使用 相较于其中任何一种抑制剂单独使用，其表达绿色荧光的细胞数量可提高 35％(各个组别表达绿色荧光的细胞数量百分比为：对照组13.1％、实验组 A24.4％、实验组B 26.0％、实验组C 30.6％)(结果见附图6A、6B)。在 其他细胞中，亦得到相似的结果。因此，5μM的Peficitinib与1μM的4SC-202抑制剂联合使用可显著提高基因组定点整合的效率。
在其他实施例中，Benzenebutyric acid、Remetinostat等组蛋白去乙酰化 酶抑制剂也可以提高基因组定点整合效率。
在其他实施例中，CHZ868、Solcitinib等JAK抑制剂也可以提高基因 组定点整合效率。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进， 这些都属于发明的保护范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 提高基因组定点整合效率的抑制剂及其应用
<130> 20200225
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8486
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt gagggcctat ttcccatgat tccttcatat 60
ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca 120
aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt 180
ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat 240
ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg tccaggggct cttactcctg 300
ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg 360
gcaccgagtc ggtgcttttt tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 420
ccgtttttag cgcgtgcgcc aattctgcag acaaatggct ctagaggtac ccgttacata 480
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 540
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 600
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cggtaaatgg cccgcctggc attgtgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 720
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<210> 2
<211> 8486
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
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ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 6300
gttccaaact ggaacaacac tcaactctat ctcgggctat tcttttgatt tataagggat 6360
tttgccgatt tcggtctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 6420
ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga 6480
tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 6540
ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 6600
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tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga 7140
gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag 7200
tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg 7260
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ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt 7380
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gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa 7740
acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa 7800
aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg 7860
atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 7920
gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 7980
tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca 8040
ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 8100
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ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 8220
aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 8280
cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 8340
gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 8400
ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 8460
cagcaacgcg gcctttttac ggttcc 8486
<210> 3
<211> 4463
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
ccaatgatgg tacccctctt gtgctcttgc tggggctacg ctcccctgac ttgcgccccg 60
ctccctcttt ctttgcagca atgcctcctg caccaccaac tgcttagcac ccctggccaa 120
ggtcatccat gacaactttg gtatcgtgga aggactcatg gtatgagagc tggggaatgg 180
gactgaggct cccacctttc tcatccaaga ctggctcctc cctgccgggg ctgcgtgcaa 240
ccctggggtt gggggttctg gggactggct ttcccataat ttcctttcaa ggtggggagg 300
gaggtagagg ggtgatgtgg ggagtacgct gcagggcctc actccttttg cagaccacag 360
tccatgccat cactgccacc cagaagactg tggatggccc ctccgggaaa ctgtggcgtg 420
atggccgcgg ggctctccag aacatcatcc ctgcctctac tggcgctgcc aaggctgtgg 480
gcaaggtcat ccctgagctg aacgggaagc tcactggcat ggccttccgt gtccccactg 540
ccaacgtgtc agtggtggac ctgacctgcc gtctagaaaa acctgccaaa tatgatgaca 600
tcaagaaggt ggtgaagcag gcgtcggagg gccccctcaa gggcatcctg ggctacactg 660
agcaccaggt ggtctcctct gacttcaaca gcgacaccca ctcctccacc tttgacgctg 720
gggctggcat tgccctcaac gaccactttg tcaagctcat ttcctggtat gtggctgggg 780
ccagagactg gctcttaaaa agtgcagggt ctggcgccct ctggtggctg gctcagaaaa 840
agggccctga caactctttt catcttctag gtatgacaac gaatttggct acagcaacag 900
ggtggtggac ctcatggccc acatggcctc caaggagggc agcggagcta ccaacttctc 960
cctgctgaag caggctggcg acgtggagga gaacccagga ccaatggtga gcaagggcga 1020
ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca 1080
caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa 1140
gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac 1200
ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa 1260
gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa 1320
ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct 1380
gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta 1440
caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt 1500
caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa 1560
cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc 1620
cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac 1680
cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag tagtaagctt aagaggaaga 1740
gagagaccct cactgctggg gagtccctgc cacactcagt cccccaccac actgaatctc 1800
ccctcctcac agttgccatg tagacccctt gaagagggga ggggcctagg gagccgcacc 1860
ttgtcatgta ccatcaataa agtaccctgt gctcaaccag ttacttgtcc tgtcttattc 1920
tagggtctgg ggcagagggg agggaagctg ggcttgtgtc aaggtgagac attcttgctg 1980
gggagggacc tggtatgttc tcctcagact gagggtaggg cctccaaaca gccttgcttg 2040
cttcgagaac catttgcttc ccgctcagac gtcttgagtg ctacaggaag ctggcaccac 2100
tacttcagag aacaaggcct tttcctctcc tcgctccagt cctaggctat ctgctgttgg 2160
ccaaacatgg aagaagctat tctgtgggca gccccaggga ggctgacagg tggaggaagt 2220
cagggctcgc actgggctct gacgctgact ggttagtgga gctcagcctg gagctgagct 2280
gcagcgggca attccagctt ggcctccgca gctgtgaggt cttgagcacg tgctctattg 2340
ctttctgtgc cctcgtgtct tatctgagga catcgtggcc agcccctaag gtcttcaagc 2400
aggattcatc taggtaaacc aagtacctaa aaccatgccc aaggcggtaa ggactatata 2460
atgtttaaaa atcggtaaaa atgcccacct cgcatagttt tgaggaagat gaactgagat 2520
gtgtcagggt gacttatttc catcatcgtc cttaggggaa cttgggtagg ggcaaggcgt 2580
gtagctggga cctaggtcca gacccctggc tctgccactg aacggctcag gatatcatcg 2640
gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 2700
tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 2760
agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 2820
tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 2880
cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 2940
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ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 3060
ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 3120
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atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 3360
ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 3420
gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 3480
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ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 3600
taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 3660
gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 3720
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gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 3960
cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 4020
actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 4080
caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 4140
gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 4200
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<210> 4
<211> 4311
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
ccaatgatga attccctaga agcatttgcg gtggacgaga tcttggacct ggctggccgg 60
gacctgactg actacctcat gaagatcctc accgagcgcg gctacagctt caccaccacg 120
gccgagcggg aaatcgtgcg tgacattaag gagaagctgt gctacgtcgc cctggacttc 180
gagcaagaga tggccacggc tgcttccagc tcctccctgg agaagagcta cgagctgcct 240
gacggccagg tcatcaccat tggcaatgag cggttccgct gccctgaggc actcttccag 300
ccttccttcc tgggtgagtg gagactgtct cccggctctg cctgacatga gggttacccc 360
tcggggctgt gctgtggaag ctaagtcctg ccctcatttc cctctcaggc atggagtcct 420
gtggcatcca cgaaactacc ttcaactcca tcatgaagtg tgacgtggac atccgcaaag 480
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ttcgaattcg gcagcggagc taccaacttc tccctgctga agcaggctgg cgacgtggag 900
gagaacccag gaccaatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 960
ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 1020
ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 1080
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aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 1380
gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 1440
agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 1500
ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 1560
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tcttgacaaa acctaacttg cgcagaaaac aagatgagat tggcatggct ttatttgttt 1740
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gccttcgtgc ccccccttcc cccttttttg tcccccaact tgagatgtat gaaggctttt 2160
ggtctccctg ggagtgggtg gaggcagcca gggcttacct gtacactgac ttgagaccag 2220
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acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 3300
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tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 3600
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cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 3960
actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 4020
ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 4080
tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 4140
ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 4200
agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 4260
aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt c 4311

Claims (6)

1.抑制剂在提高HDR介导的基因组定点整合效率上的应用，其中，该应用通过CRISPR/Cas9系统与所述的抑制剂共同作用于基因组来实现，所述的抑制剂为组蛋白去乙酰化酶抑制剂4SC-202；或JAK抑制剂Peficitinib。
2.根据权利要求1所述的抑制剂在提高HDR介导的基因组定点整合效率上的应用，其中，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂4SC-202的使用浓度为1μM。
3.根据权利要求1所述的抑制剂在提高HDR介导的基因组定点整合效率上的应用，其中，所述的JAK抑制剂Peficitinib的使用浓度为5μM。
4.根据权利要求1所述的抑制剂在提高HDR介导的基因组定点整合效率上的应用，其中，所述的抑制剂为4SC-202与Peficitinib的组合。
5.根据权利要求4所述的抑制剂在提高HDR介导的基因组定点整合效率上的应用，其中，所述4SC-202的使用浓度为1μM；所述Peficitinib的使用浓度为5μM。
6.权利要求1-5任一项所述的提高HDR介导的基因组定点整合效率的抑制剂在制备提高HDR介导的基因组定点整合效率的产品中的应用，该应用通过CRISPR/Cas9系统与所述的抑制剂共同作用于基因组来实现。
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Small molecules enhance CRISPR/Cas9-mediated homology-directed genome editing in primary cells;Guoling Li等;《Scentific Reports》;20170821;第7卷;8943 *

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