CN109152848B - 抗-crispr化合物以及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及CRISPR‑Cas9基因编辑平台的领域。特别地，本发明鉴定出了控制Cas9基因编辑活性的II‑C型Cas9抗‑CRISPR(Acr)抑制剂。此类Acr抑制剂的共施用可以在下列方面提供有利的辅助：允许通过在空间或时间上控制Cas9活性来进行安全且实用的生物学治疗法；控制在野生群体中的基于Cas9的基因驱动以减轻此类强制遗传计划的生态学后果；和对进入基因编辑技术的各种生物技术、农业和医学应用中的一般性研究作出贡献。

Description

抗-CRISPR化合物以及使用方法
发明领域
本发明涉及CRISPR-Cas9基因编辑平台的领域。特别地，本发明鉴定出了控制Cas9基因编辑活性的II-C型Cas9抗-CRISPR(Acr)抑制剂。此类Acr抑制剂的共施用可以在下列方面提供有利的辅助：允许通过在空间或时间上控制Cas9活性来进行安全且实用的生物学治疗法；控制在野生群体中的基于Cas9的基因驱动器(gene drive)以减轻此类强制遗传计划的生态学后果；和对进入基因编辑技术的各种生物技术、农业和医学应用中的一般性研究作出贡献。
发明背景
CRISPR-Cas9(成簇规律间隔短回文重复序列；CRISPR-相关系统)包括识别和破坏外来核酸的细菌免疫系统。作为用于基因组工程的可编程核酸酶的II型CRISPR-Cas9系统的开发在生物医学科学中已经是有益的。例如，Cas9平台已经使得能够在各种各样的生物学系统中进行基因编辑，其中基因敲除和特制的改变都以前所未有的精确性和效率在复杂的基因组内是可能的。CRISPR-Cas9系统具有应用至用于疾病治疗的基因疗法方法的潜力，无论是用于产生定制的、基于经基因组编辑的细胞的疗法，还是用于直接纠正或切除患者内的异常基因组座位。还已经开发了其中DNA切割活性已被失活的Cas9的突变型版本[“死的”Cas9(dCas9)]用于RNA-指导的基因组结合，这使得在基因表达控制和基因组结构可视化中的进一步应用成为可能。
CRISPR-Cas9在基因疗法中的安全应用要求这样的能力：一旦所期望的用途已经实现，就控制Cas9/sgRNA复合物的基因编辑活性。尽管几个经改造的系统允许CRISPR-Cas9的受控激活以提高精确度，但是所有这些系统仍然缺乏提供可预测的控制和稳健的抑制的能力。
本领域中所需要的是这样的能力，即可预测地控制基因编辑(Cas9)或基因组结合(dCas9)活性，以便一旦已达到特定的目标就阻止不期望的Cas9切割或DNA结合活性。另外，将Cas9切割活性限制于特定的位点、组织或细胞周期阶段的能力将会大大改善基于Cas9的临床治疗和研究应用的效力和安全性。
发明概述
本发明涉及CRISPR-Cas9基因编辑平台的领域。特别地，本发明鉴定出了控制Cas9基因编辑活性的II-C型Cas9抗-CRISPR(Acr)抑制剂。此类Acr抑制剂的共施用可以在下列方面提供有利的辅助：允许通过在空间或时间上控制Cas9活性来进行安全且实用的生物学治疗法；控制在野生群体中的基于Cas9的基因驱动器以减轻此类强制遗传计划的生态学后果；和对进入基因编辑技术的各种生物技术、农业和医学应用中的一般性研究作出贡献。
在一个实施方案中，本发明考虑了II-C型抗-CRISPR(Acr)蛋白。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为经截短的蛋白。在一个实施方案中，所述经截短的蛋白源自包括但不限于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为融合蛋白。在一个实施方案中，所述Acr融合蛋白包含C-末端加合物。在一个实施方案中，所述Acr融合蛋白包含N-末端加合物。在一个实施方案中，所述加合物为核定位序列。在一个实施方案中，所述加合物为亲和标签。在一个实施方案中，所述亲和标签为FLAG。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr二聚体蛋白为Acr同二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr二聚体蛋白为Acr异二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为经突变的蛋白。在一个实施方案中，所述Acr蛋白包含从由下列各项组成的组中选择的氨基酸序列的至少一部分：AcrIIC1Boe、AcrIIC1Nme、AcrIIC2Nme、AcrIIC3Nme、AcrIIC4Hpa和AcrIIC5Smu。在一个实施方案中，所述蛋白小于大约14kDa。
在一个实施方案中，本发明考虑了组合物，其包含含有结合位点的II-C型Cas9蛋白，和II-C型抗-CRISPR(Acr)蛋白，其中所述Acr蛋白以特异性亲和力与所述结合位点相结合。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为裸面小绢猴布拉克氏菌(Brackiellaoedipodis)Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为副流感嗜血菌(Haemophilus parainfluenzae)Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为茄罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为经截短的蛋白。在一个实施方案中，所述经截短的蛋白源自包括但不限于SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14和/或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为融合蛋白。在一个实施方案中，所述Acr融合蛋白包含C-末端加合物。在一个实施方案中，所述Acr融合蛋白包含N-末端加合物。在一个实施方案中，所述加合物为核定位序列。在一个实施方案中，所述加合物为亲和标签。在一个实施方案中，所述亲和标签为FLAG。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr二聚体蛋白为Acr同二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr二聚体蛋白为Acr异二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为经突变的蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为II-C型dCas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型dCas9蛋白为dNmeCas9。
在一个实施方案中，本发明考虑了方法，其包括：a)提供：i)包含至少一个可疑基因的生物细胞；ii)II-C型Cas9/sgRNA复合物，其中所述sgRNA能够与所述至少一个可疑基因的靶位点杂交，并且所述II-C型Cas9蛋白包含结合位点；和iii)II-C型抗-CRISPR(Acr)蛋白，其以特异性亲和力与所述结合位点相结合；b)使所述II-C型Cas9/sgRNA复合物与所述生物细胞相接触，从而使得所述II-C型Cas9/sgRNA复合物与所述靶位点杂交；c)用所述II-C型Cas9/sgRNA复合物编辑所述可疑基因；和d)使所述结合位点与所述Acr蛋白相接触，从而使得所述编辑被减少。在一个实施方案中，所述生物细胞为细菌细胞。在一个实施方案中，所述生物细胞为真菌细胞。在一个实施方案中，所述生物细胞为哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述生物细胞为昆虫细胞。在一个实施方案中，所述生物细胞为植物细胞。在一个实施方案中，由于Acr蛋白作用而导致的减少的编辑减缓所述基因驱动器繁殖。在一个实施方案中，所述可疑基因为经突变的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为失调的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为受损的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为功能异常的基因。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为裸面小绢猴布拉克氏菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为副流感嗜血菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为米氏西蒙斯氏菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为茄罗尔斯通氏菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述靶位点为N-TS3。在一个实施方案中，所述靶位点为N-TS7。在一个实施方案中，所述靶位点为N-TS25。在一个实施方案中，所述靶位点为D-TS3。在一个实施方案中，所述靶位点为D-TS7。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为经截短的蛋白。在一个实施方案中，所述经截短的蛋白源自包括但不限于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和/或SEQ IDNO:16的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为融合蛋白。在一个实施方案中，所述Acr融合蛋白包含C-末端加合物。在一个实施方案中，所述Acr融合蛋白包含N-末端加合物。在一个实施方案中，所述加合物为核定位序列。在一个实施方案中，所述加合物为亲和标签。在一个实施方案中，所述亲和标签为FLAG。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr二聚体蛋白为Acr同二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr二聚体蛋白为Acr异二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为经突变的蛋白。在一个实施方案中，所述Acr蛋白包含从由下列各项组成的组中选择的氨基酸序列的至少一部分：AcrIIC1Boe、AcrIIC1Nme、AcrIIC2Nme、AcrIIC3Nme、AcrIIC4Hpa和AcrIIC5Smu。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9选自由下列各项组成的组：裸面小绢猴布拉克氏菌Cas9蛋白、脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白、流感嗜血菌Cas9蛋白、米氏西蒙斯氏菌Cas9蛋白和茄罗尔斯通氏菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为II-C型dCas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型dCas9蛋白为dNmeCas9。在一个实施方案中，所述减少的编辑防止Cas9结合的至少一个脱靶事件。在一个实施方案中，所述至少一个脱靶事件选自由下列各项组成的组：DNA切割和DNA突变。在一个实施方案中，所述减少的编辑在细胞周期的G1期期间出现。在一个实施方案中，所述减少的编辑防止嵌合基因型。在一个实施方案中，所述减少的编辑抑制基因驱动器。在一个实施方案中，所述减少的编辑选自由下列各项组成的组：至少70％、75％、90％或更大和100％。在一个实施方案中，所述减少的编辑是受到精确控制的。在一个实施方案中，所述可疑基因为经突变的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为失调的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为受损的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为功能异常的基因。
在一个实施方案中，本发明考虑了方法，其包括：a)提供：i)包含至少一个可疑基因的病毒；ii)II-C型Cas9/sgRNA复合物，其中所述sgRNA能够与所述至少一个可疑基因的靶位点杂交，并且所述II-C型Cas9蛋白包含结合位点；和iii)II-C型抗-CRISPR(Acr)蛋白，其以特异性亲和力与所述结合位点相结合；b)使所述II-C型Cas9/sgRNA复合物与所述病毒相接触，从而使得所述II-C型Cas9/sgRNA复合物与所述可疑基因杂交；c)用所述II-C型Cas9/sgRNA复合物编辑所述可疑基因；和d)使所述结合位点与所述Acr蛋白相接触，从而使得所述编辑被减少。在一个实施方案中，所述可疑基因为经突变的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为失调的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为受损的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为功能异常的基因。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为裸面小绢猴布拉克氏菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为副流感嗜血菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为米氏西蒙斯氏菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为茄罗尔斯通氏菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述靶位点为N-TS3。在一个实施方案中，所述靶位点为N-TS7。在一个实施方案中，所述靶位点为N-TS25。在一个实施方案中，所述靶位点为D-TS3。在一个实施方案中，所述靶位点为D-TS7。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为经截短的蛋白。在一个实施方案中，所述经截短的蛋白源自包括但不限于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为融合蛋白。在一个实施方案中，所述Acr融合蛋白包含C-末端加合物。在一个实施方案中，所述Acr融合蛋白包含N-末端加合物。在一个实施方案中，所述加合物为核定位序列。在一个实施方案中，所述加合物为亲和标签。在一个实施方案中，所述亲和标签为FLAG。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr二聚体蛋白为Acr同二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr二聚体蛋白为Acr异二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为经突变的蛋白。在一个实施方案中，所述Acr蛋白包含从由下列各项组成的组中选择的氨基酸序列的至少一部分：AcrIIC1Boe、AcrIIC1Nme、AcrIIC2Nme、AcrIIC3Nme、AcrIIC4Hpa和AcrIIC5Smu。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9选自由下列各项组成的组：裸面小绢猴布拉克氏菌Cas9蛋白、脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白、流感嗜血菌Cas9蛋白、米氏西蒙斯氏菌Cas9蛋白和茄罗尔斯通氏菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为II-C型dCas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型dCas9蛋白为dNmeCas9。在一个实施方案中，所述减少的编辑防止Cas9结合的至少一个脱靶事件。在一个实施方案中，所述至少一个脱靶事件选自由下列各项组成的组：DNA切割和DNA突变。在一个实施方案中，所述减少的编辑在细胞周期的G1期期间出现。在一个实施方案中，所述减少的编辑防止嵌合基因型。在一个实施方案中，所述减少的编辑抑制基因驱动器。在一个实施方案中，所述减少的编辑选自由下列各项组成的组：至少70％、75％、90％或更大和100％。在一个实施方案中，所述减少的编辑是受到精确控制的。在一个实施方案中，所述可疑基因为经突变的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为失调的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为受损的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为功能异常的基因。
在一个实施方案中，本发明考虑了方法，其包括：a)提供：i)包含至少一个可疑基因的哺乳动物；ii)II-C型Cas9/sgRNA复合物，其中所述sgRNA能够与至少一个可疑基因的靶位点杂交，并且所述II-C型Cas9蛋白包含结合位点；和iii)II-C型抗-CRISPR(Acr)蛋白，其能够以特异性亲和力与所述结合位点相结合；b)向所述哺乳动物施用所述II-C型Cas9/sgRNA复合物，从而使得所述II-C型Cas9/sgRNA复合物与所述靶位点相结合；c)用所述II-C型Cas9/sgRNA复合物编辑所述可疑基因；和d)向所述哺乳动物施用所述Acr蛋白，从而使得所述Acr蛋白以特异性亲和力与所述结合位点相结合，从而使得所述编辑被减少。在一个实施方案中，所述哺乳动物为人。在一个实施方案中，所述哺乳动物为家畜物种。在一个实施方案中，所述哺乳动物展示出由于所述可疑基因的存在而导致的医学病症或疾病的至少一个症状。在一个实施方案中，所述可疑基因的编辑减轻所述至少一个症状。在一个实施方案中，所述可疑基因为经突变的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为失调的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为受损的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为功能异常的基因。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为裸面小绢猴布拉克氏菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为副流感嗜血菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为米氏西蒙斯氏菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为茄罗尔斯通氏菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述靶位点为N-TS3。在一个实施方案中，所述靶位点为N-TS7。在一个实施方案中，所述靶位点为N-TS25。在一个实施方案中，所述靶位点为D-TS3。在一个实施方案中，所述靶位点为D-TS7。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为经截短的蛋白。在一个实施方案中，所述经截短的蛋白源自包括但不限于SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为融合蛋白。在一个实施方案中，所述Acr融合蛋白包含C-末端加合物。在一个实施方案中，所述Acr融合蛋白包含N-末端加合物。在一个实施方案中，所述加合物为核定位序列。在一个实施方案中，所述加合物为亲和标签。在一个实施方案中，所述亲和标签为FLAG。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr二聚体蛋白为Acr同二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr二聚体蛋白为Acr异二聚体蛋白。在一个实施方案中，所述Acr蛋白为经突变的蛋白。在一个实施方案中，所述Acr蛋白包含从由下列各项组成的组中选择的氨基酸序列的至少一部分：AcrIIC1Boe、AcrIIC1Nme、AcrIIC2Nme、AcrIIC3Nme、AcrIIC4Hpa和AcrIIC5Smu。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9选自由下列各项组成的组：裸面小绢猴布拉克氏菌Cas9蛋白、脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白、流感嗜血菌Cas9蛋白、米氏西蒙斯氏菌Cas9蛋白和茄罗尔斯通氏菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为II-C型dCas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型dCas9蛋白为dNmeCas9。在一个实施方案中，所述减少的编辑防止Cas9结合的至少一个脱靶事件。在一个实施方案中，所述至少一个脱靶事件选自由下列各项组成的组：DNA切割和DNA突变。在一个实施方案中，所述至少一个脱靶事件在细胞周期的G1期期间出现。在一个实施方案中，所述减少的编辑防止嵌合基因型。在一个实施方案中，所述减少的编辑抑制基因驱动器。在一个实施方案中，所述减少的编辑选自由下列各项组成的组：至少70％、75％、90％或更大和100％。在一个实施方案中，所述减少的编辑是受到精确控制的。在一个实施方案中，所述可疑基因为经突变的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为失调的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为受损的基因。在一个实施方案中，所述可疑基因为功能异常的基因。
在一个实施方案中，本发明考虑了试剂盒，其包含：a)第一容器，其包含至少一种II-C型抗-CRISPR(Acr)蛋白；b)第二容器，其包含II-C型Cas9蛋白；和c)第三容器，其包含sgRNA。在一个实施方案中，所述Acr蛋白包含从由下列各项组成的组中选择的氨基酸序列的至少一部分：AcrIIC1Boe、AcrIIC1Nme、AcrIIC2Nme、AcrIIC3Nme、AcrIIC4Hpa和AcrIIC5Smu。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9选自由下列各项组成的组：裸面小绢猴布拉克氏菌Cas9蛋白、脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白、流感嗜血菌Cas9蛋白、米氏西蒙斯氏菌Cas9蛋白和茄罗尔斯通氏菌Cas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型Cas9蛋白为II-C型dCas9蛋白。在一个实施方案中，所述II-C型dCas9蛋白为dNmeCas9。
定义
为了促进本发明的理解，下面定义了许多术语。在本文中所定义的术语具有在与本发明相关的领域中的普通技术人员通常所理解的含义。诸如“a”、“an”和“the”的术语意在不仅是指单数实体，而且还是指复数实体，并且还包括其特定的实例可以用于举例说明的一般类别。本文中的术语用于描述本发明的特定实施方案，但是它们的使用并不限制本发明，除了在权利要求书中所概括的之外。
本领域技术人员将会理解由于在文献中缺乏一致性而引起的指明各种抗-CRISPR蛋白的术语的可互换性，和本领域中正在进行的为统一此类术语的努力。例如，如在本文中所使用的，Acr1-Bo的名称与AcrIIC1Boe是可互换的，并且Acr2-Nm的名称与AcrIIC2Nme是可互换的。此外，如在本文中所使用的，Acr88a-32的名称与AcrE2是可互换的。该类型的等价性还可以见于在整个本申请中所使用的各种其他名称之中。
在任何测定法测量值的背景下，在本文中所使用的术语“大约”是指所给定的测量值的+/-5％。
在本文中所使用的术语“内含肽”是指在称为蛋白质剪接的过程中能够切除自身并用肽键连接该蛋白质的其余部分(例如，外显肽)的蛋白质区段。内含肽还称为“蛋白质内含子”。该过程涉及在包含内含肽的mRNA已被翻译成蛋白质后出现的由内含肽介导的蛋白质剪接。因此，前体蛋白质包含三个区段：N-外显肽，随后为内含肽，随后为C-外显肽。在剪接发生后，所得的蛋白质包含与C-外显肽相连接的N-外显肽；该剪接产物也称为外显肽。
在本文中所使用的术语“可疑基因”是指目的基因，其中该基因的编辑对于该基因所位于之中的细胞的健康，或该细胞所位于之中的生物体的健康可能具有有益后果。可疑基因还是指在细胞或生物体中的目的基因，其中该基因的编辑可以在实验室实验中提供生物学洞察力。通常，可疑基因可以包括但不限于经突变的基因、失调的基因、受损的基因和/或功能异常的基因。
在本文中所使用的术语“CRISPR”或“成簇规律间隔短回文重复序列”是指关于包含多个短的同向的碱基序列重复的DNA座位的首字母缩略词。每个重复包含一系列碱基，随后为相反的相同系列，然后是称为“间隔子DNA”的大约30个碱基对。间隔子是短的DNA区段，其常常源自细菌、病毒或其他外来遗传元件，并且可以充当过去暴露的“记忆”以促进针对未来侵袭的适应性防御。Doudna等人,“Genome editing.The new frontier of genomeengineering with CRISPR-Cas9”Science.2014 346(6213):1258096。
在本文中所使用的术语“Cas”或“CRISPR-相关(的)(cas)”，是指常常与CRISPR重复序列-间隔子阵列相关联的基因或衍生蛋白质。Doudna等人,“Genome editing.The newfrontier of genome engineering with CRISPR-Cas9”Science.2014 346(6213):1258096。
在本文中所使用的术语“Cas9”是指来自II型CRISPR系统的核酸酶，一种专门用于在DNA中产生双链断裂的酶，其具有两个活性切割位点(HNH和RuvC结构域)，双螺旋的每条链一个。Jinek等人将tracrRNA和间隔子RNA组合成“单一指导RNA”(sgRNA)分子，其在与Cas9相混合的情况下可以通过在sgRNA内的指导序列与靶DNA序列之间的Watson-Crick配对找到并切割DNA靶标。Jinek等人,“A programmable dual-RNA-guided DNAendonuclease in adaptive bacterial immunity”Science.2012 337(6096):816-821Epub2012Jun 28。
在本文中所使用的术语“在催化上有活性的Cas9”是指包含完全的核酸酶活性的未修饰的Cas9核酸酶。
在本文中所使用的术语“结合位点”是指对于Acr1蛋白具有特异性亲和力的Cas9氨基酸序列。
在本文中所使用的术语“靶位点”是指与sgRNA序列杂交的位于可疑基因侧翼的核酸序列。
在本文中所使用的术语“切口酶”是指仅切割单个DNA链的核酸酶，这要么是由于其天然功能，要么因为它已被改造成仅切割单个DNA链。突变了RuvC或HNH结构域的Cas9切口酶变体提供了对于哪条DNA链被切割和哪条保持完整的控制。Cong等人,“Multiplexgenome engineering using CRISPR/Cas systems”Science.2013339(6121):819-823.Epub 2013Jan 3。
在本文中所使用的术语“原间隔子邻近基序(protospacer adjacent motif)”(或PAM)是指存在于靶DNA分子上的与匹配指导RNA间隔子的序列相邻的DNA序列。PAM对于Cas9/sgRNA形成R-环以通过其指导RNA与基因组的Watson-Crick配对来探问特定DNA序列来说是必需的。PAM特异性可以是Cas9蛋白的DNA结合特异性的功能(例如，在Cas9的C-末端处的“原间隔子邻近基序识别结构域”)。
在本文中所使用的术语“sgRNA”是指与CRISPR-相关系统(Cas)一起共同使用的单个指导RNA。sgRNA是crRNA和tracrRNA的融合物，并且包含与所希望的靶位点互补的序列的核苷酸。sgRNA与靶位点的Watson-Crick配对允许R-环形成，其在与功能性PAM一起时，允许DNA切割，或者在核酸酶缺陷型Cas9的情况下，允许在那个座位处与DNA紧紧结合。
在本文中所使用的术语“二聚化结构域”是指允许两个不同分子相联合的结构域，蛋白质或多核苷酸。二聚化结构域可以允许同型和/或异型相互作用。二聚化结构域还可以是药物依赖性的(即，依赖于小分子的存在以便起作用)。Ho等人,“Dimeric ligandsdefine a role for transcriptional activation domains in reinitiation”Nature.1996382(6594):822-826。
在本文中所使用的术语“编辑”或“经编辑的”是指通过经由使用外源提供的DNA模板而选择性地缺失特定基因组靶标或特异性地包括新序列来改变多核苷酸的核酸序列(例如，野生型天然出现的核酸序列或经突变的天然出现的序列)的方法。这样的特定基因组靶标包括但可以不限于染色体区域、线粒体DNA、基因、启动子、开放阅读框或任何核酸序列。
在本文中所使用的术语“缺失”、“缺失的”或“缺失了”可以被定义为核苷酸序列或氨基酸序列中的变化，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基分别是不存在的或变成不存在。
在本文中所使用的术语“被怀疑具有”是指由患者所展示出的一种医学状况或一组医学状况(例如，初始症状)，其不足以提供鉴别诊断。尽管如此，所展示出的状况将会证明有理由进行进一步的测试(例如，自身抗体测试)以获得进一步的信息，基于所述进一步的信息来提供诊断依据。
在本文中所使用的术语“处于……的风险中”是指由患者所展示出的一种医学状况或一组医学状况，其可以使所述患者倾向于特定的疾病或痛苦。例如，这些状况可以由于包括但不限于下列各项的影响而导致：行为的、情感的、化学的、生物化学的或环境的影响。
在本文中所使用的术语“有效量”是指包含治疗试剂的药用组合物的特定的量，其取得在临床上有益的结果(即，例如症状的减轻)。此类组合物的毒性和治疗效力可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来测定，例如用于测定LD50(对于群体的50％来说致死的剂量)和ED50(在群体的50％中在治疗上有效的剂量)的那些。毒性效应和治疗效应之间的剂量比为治疗指数，并且可以将它表示为比例LD50/ED50。展示出大的治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养物测定法和另外的动物研究中获得的数据可以在制订用于人使用的剂量范围中进行使用。此类化合物的剂量优选地在具有很小毒性或不具有毒性的包括ED50的循环浓度的范围内。取决于所采用的剂型、患者的敏感性和施用途径，剂量在该范围内变动。
在本文中所使用的术语“症状”是指由患者所观察到的疾病或身体紊乱的任何主观或客观的证据。例如，主观证据通常基于患者自我报告，并且可以包括但不限于疼痛、头痛、视觉障碍、恶心和/或呕吐。备选地，客观证据通常为医学测试的结果，包括但不限于体温、全血细胞计数、脂质谱(lipid panels)、甲状腺谱(thyroid panels)、血压、心率、心电图、组织和/或身体成像扫描。
在本文中所使用的术语“疾病”或“医学状况”是指活的动物或植物体或者其部分之一的正常状态的任何损害，其打断或更改了至关重要的功能的执行。典型地通过区别性征候和症状所显现出的，它通常是对下列各项的应答：i)环境因素(例如营养不良、工业危害或气候)；ii)特定的感染性因子(例如虫、细菌或病毒)；iii)生物体的固有缺陷(例如，基因异常)；和/或iv)这些因素的组合。
当涉及相对于经治疗的受试者而言在未治疗的受试者中的任何症状的陈述时，术语“减轻”、“抑制”、“减少”、“遏制”、“降低”、“防止”和语法等价物(包括“更低”、“更小”等)意指，在经治疗的受试者中症状的数量和/或大小程度比在未治疗的受试者中低任何被任何经医学训练的人员认为在临床上有关的量。在一个实施方案中，在经治疗的受试者中症状的数量和/或大小程度比在未治疗的受试者中症状的数量和/或大小程度低至少10％、至少25％、至少50％、至少75％和/或至少90％。
在本文中所使用的术语“抑制性化合物”是指任何这样的化合物，其能够与结合伙伴在一定的条件下相互作用(即，例如附着、结合等)，从而使得所述结合伙伴变得对其天然配体无应答。抑制性化合物可以包括但不限于小的有机分子、抗体和蛋白质/肽。
在本文中所使用的术语“施用的”或“施用”是指任何向患者提供组合物从而使得所述组合物对于所述患者具有它的所期望的效应的方法。一个示例性的施用方法是通过直接的机制，例如局部组织施用(即，例如血管外放置)、口服摄入、透皮贴剂、表面施用、吸入、栓剂等。
在本文中所使用的术语“患者”或“受试者”为人或动物，并且不需要住院。例如，门诊病人、疗养院中的人是“患者”。患者可以包括任何年龄的人或非人动物，并因此包括成年人和青少年(即，儿童)。不希望的是，术语“患者”隐含对医学治疗的需要，因此患者可以自愿地或非自愿地是实验的一部分，不论是临床的实验还是支持基础科学研究的实验。
在本文中所使用的术语“亲和力”是指任何在物质或颗粒之间的吸引力，其引起它们参加并保持处于化学组合中。例如，对于受体具有高亲和力的抑制剂化合物比具有低亲和力的抑制剂在阻止该受体与其天然配体相互作用中将会提供更大的效力。
当关于蛋白质或肽的相互作用进行使用时，术语“特异性亲和力”或“特异性地结合的”意指，所述相互作用依赖于由一级氨基酸序列的三级和/或四级折叠所决定的在蛋白质上的特定结构(即，例如靶位点或结合位点)的存在。换言之，蛋白质或肽识别并结合特定的构象的蛋白质结构，而非一般意义上的蛋白质。
在本文中所使用的术语“小的有机分子”是指任何具有与在医药制剂中通常使用的那些有机分子相当的大小的分子。所述术语不包括生物学大分子(例如，蛋白质、核酸等)。优选的小的有机分子的大小范围为大约10Da直至大约5000Da，更优选地直至2000Da，和最优选地直至大约1000Da。
在本文中所使用的术语“源自”是指化合物或序列的来源。在一个方面，化合物或序列可以源自生物体或特定的物种。在另一个方面，化合物或序列可以源自更大的复合物或序列。
在本文中所使用的术语“受试化合物”是指任何被考虑为作为抑制性化合物的候选物的化合物或分子(包括蛋白质)。
在本文中所使用的术语“蛋白(质)”是指众多天然出现的极其复杂的物质(例如，酶或抗体)中的任何一种，所述天然出现的极其复杂的物质由通过肽键相连接的氨基酸残基组成并且包含元素碳、氢、氮、氧、通常硫。通常，蛋白质包含具有在数百个之内的数量级的氨基酸。
在本文中所使用的术语“肽”是指各种酰胺中的任何一种，所述酰胺通过一个酸的氨基基团与另一个酸的羧基基团的化合而源自两个或更多个氨基酸，并且通常通过蛋白质的部分水解来获得。通常，肽包含具有数十个的数量级的氨基酸。
术语“多肽”是指各种酰胺中的任何一种，所述酰胺通过一个酸的氨基基团与另一个酸的羧基基团的化合而源自两个或更多个氨基酸，并且通常通过蛋白质的部分水解来获得。通常，多肽包含具有数十个或更大的数量级的氨基酸。
在本文中所使用的术语“在药学上可接受的”或“在药理学上可接受的”是指这样的分子实体和组合物，其在当施用给动物或人时不产生不利的、变应性的或其他事与愿违的反应。
在本文中所使用的术语“在药学上可接受的承载体”包括任何的和所有的溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物，以及植物油，包衣剂、等渗剂和吸收延迟剂，脂质体，商购可得的清洁剂，等等。还可以将补充的生物活性成分掺入到此类承载体中。
在本文中所使用的“核酸序列”和“核苷酸序列”是指寡核苷酸或多核苷酸，以及其片段或部分，并且是指基因组来源或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的，并且代表有义或反义链。
在本文中所使用的术语“分离的核酸”是指任何已从其天然状态中移除(例如，从细胞中移除，和在一个优选的实施方案中，没有其他基因组核酸)的核酸分子。
在本文中所使用的术语“氨基酸序列”和“多肽序列”是可互换的，并且是指氨基酸的序列。
当涉及蛋白质(例如在“给定蛋白质的一部分”中)时，在本文中所使用的术语“部分”是指那个蛋白质的片段。所述片段的大小范围可以为四个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去一个氨基酸。
当关于核苷酸序列进行使用时，术语“部分”是指那个核苷酸序列的片段。所述片段的大小范围可以为5个核苷酸残基至整个核苷酸序列减去一个核酸残基。
蛋白质的“变体”被定义为与多肽序列或该多肽序列的任何同源物相差一个或多个氨基酸的氨基酸序列。所述变体可以具有“保守的”变化，其中被置换的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如用异亮氨酸替代亮氨酸。更罕见地，变体可以具有“非保守的”变化，例如用色氨酸替代甘氨酸。相似的小的变化还可以包括氨基酸缺失或插入(即，添加)，或两者。在确定哪些和多少氨基酸残基可以被置换、插入或缺失而不取消生物学或免疫学活性方面的指导可以通过使用计算机程序(包括但不限于
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软件)来找到。
核苷酸序列的“变体”被定义为由于具有缺失、插入和置换而不同于参考寡核苷酸的新的核苷酸序列。这些可以通过使用各种各样的方法(例如测序、杂交测定法等)来进行检测。
“缺失”被定义为核苷酸序列或氨基酸序列中的变化，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基分别是不存在的。
“插入”或“添加”是核苷酸序列或氨基酸序列中的那种变化，其导致添加了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。“置换”是由于将一个或多个核苷酸或氨基酸分别用不同的核苷酸或氨基酸进行替代而导致的。
在本文中所使用的术语“衍生物”是指核酸或氨基酸的任何化学修饰。此类修饰的举例说明将会是用烷基、酰基或氨基基团替代氢。例如，核酸衍生物将会编码保留基本的生物学特征的多肽。
术语“在生物学上有活性的”是指任何具有结构功能、调节功能或生物化学功能的分子。例如，生物学活性可以例如通过在缺乏蛋白质活性的细胞中野生型生长的恢复来进行测定。缺乏蛋白质活性的细胞可以通过许多方法(即，例如点突变和移码突变)来产生。通过用表达该蛋白质、其衍生物或其部分的表达载体转染缺乏蛋白质活性的细胞来实现互补。
在本文中所使用的术语“结合组分”、“目的分子”、“目的试剂”、“配体”或“受体”可以是大量的不同分子、生物细胞或聚集体中的任何一种，并且所述术语可互换使用。蛋白质、多肽、肽、核酸(核苷酸、寡核苷酸和多核苷酸)、抗体、配体、糖类、多糖、微生物(例如细菌、真菌和病毒)、受体、抗生素、受试化合物(特别是由组合化学所产生的那些)、植物和动物细胞、各自的器官或级分以及其他生物学实体各自可以是结合组分。在本文中所使用的术语“大分子”是指任何具有高分子量的目的分子。例如，有些具有高分子量的生物聚合物将会由多于100个氨基酸、核苷酸或糖分子构成。
在本文中所使用的术语“结合”、“结合性(的)”或“结合的”包括任何物理附着或紧密联合，其可以是永久的或暂时的。通常，氢键键合、疏水力、范德华力、共价键合和离子键合等的相互作用促进目的分子与正被测量的分析物之间的物理附着。“结合性”相互作用可以是短暂的，如在其中结合引起化学反应发生的情形下。当结合组分为酶并且分析物为关于该酶的底物时，这是典型的。由于结合试剂与分析物之间的接触而导致的反应也在为了本发明的目的的结合的定义之内。
附图简述
图1呈现了示例性数据，其显示了用几种Acr蛋白在N-TS3靶位点处对于NmeCas9基因编辑的选择性抑制。NmeCas9+SgRNA质粒(200ng)+Acr质粒(100ng)。
图2呈现了示例性数据，其显示了用几种Acr蛋白在N-TS25靶位点处对于NmeCas9基因编辑的选择性抑制。NmeCas9+SgRNA质粒(200ng)+Acr质粒(200ng)。
图3呈现了示例性数据，其显示了用几种Acr蛋白在N-TS7靶位点处对于NmeCas9基因编辑的选择性抑制。NmeCas9+SgRNA质粒(200ng)+Acr质粒(200ng)。
图4呈现了示例性数据，其显示了用几种Acr蛋白(加有标签的和未加标签的两者)在D-TS7双重靶位点处相对于SpyCas9(II-A型)基因编辑而言对于NmeCas9(II-C型)基因编辑的选择性抑制。Nme/Spy Cas9+SgRNA质粒(150ng)+Acr质粒(100ng)。
图5呈现了示例性数据，其显示了用几种Acr蛋白(一些是未加标签的)在D-TS3双重靶位点处相对于SpyCas9(II-A型)基因编辑而言对于NmeCas9(II-C型)基因编辑的选择性抑制。Nme/Spy Cas9+SgRNA质粒(150ng)+Acr质粒(100ng)。
图6呈现了示例性数据，其显示了在D-TS3靶位点处NmeCas9(II-C型)基因编辑的Acr1Bo抑制的剂量-反应关系。NmeCas9+SgRNA质粒(150ng)+Acr质粒(150ng)。
图7呈现了示例性数据，其显示了在D-TS3靶位点处NmeCas9(II-C型)基因编辑的Acr1Nm抑制的剂量-反应关系。NmeCas9+SgRNA质粒(150ng)+Acr质粒(150ng)。
图8呈现了示例性数据，其显示了在D-TS3靶位点处NmeCas9(II-C型)基因编辑的Acr2Nm抑制的剂量-反应关系。NmeCas9+SgRNA质粒(150ng)+Acr质粒(150ng)。
图9呈现了示例性数据，其显示了用几种Acr蛋白(完整的未加标签的组)在D-TS3双重靶位点处相对于SpyCas9(II-A型)基因编辑而言对于NmeCas9(II-C型)基因编辑的选择性抑制。Nme/Spy Cas9+SgRNA质粒(150ng)+Acr质粒(100ng)。
图10呈现了示例性数据，其显示了在D-TS3靶位点处NmeCas9(II-C型)基因编辑的Acr3Nm抑制的剂量-反应关系。NmeCas9+SgRNA质粒(150ng)+Acr质粒(150ng)。
图11呈现了示例性数据，其显示了加有标签的Acr1Bo DTS3位点编辑的滴定，其中用Acr88-32作为阴性对照，使用150ng Cas9/150ng SgRNA。
图11A：具有C-末端FLAG标签的Acr1Bo。
图11B：具有N-末端FLAG标签的Acr1Bo。
图12呈现了示例性数据，其显示了加有标签的Acr1Nm DTS3位点编辑的滴定，其中用Acr88-32作为阴性对照，使用150ng Cas9/150ng SgRNA。
图12A：具有C-末端FLAG标签的Acr1Nm。
图12B：具有N-末端FLAG标签的Acr1Nm。
图13呈现了示例性数据，其显示了加有标签的Acr2Nm DTS3位点编辑的滴定，其中用Acr88-32作为阴性对照，使用150ng Cas9/150ng SgRNA。
图13A：具有C-末端FLAG标签的Acr2Nm。
图13B：具有N-末端FLAG标签的Acr2Nm。
图14呈现了示例性数据，其显示了加有标签的Acr3Nm DTS3位点编辑的滴定，其中用Acr88-32作为阴性对照，使用150ng Cas9/150ng SgRNA。
图14A：具有C-末端FLAG标签的Acr3Nm。
图14B：具有N-末端FLAG标签的Acr3Nm。
图15呈现了滴定数据的定量总结，其显示相比于没有加合物的Acr蛋白而言，Acr加合物蛋白(例如，加有FLAG标签的)具有相似的活性。
图15A：Acr1Bo。
图15B：Acr1Nm。
图15C：Acr2Nm。
图15D：Acr3Nm。
图16呈现了示例性数据，其显示了Acr蛋白与Cas9蛋白的直接结合。特别地，经考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析显示了NmeCas9与Acr1Nm、Acr2Nm、Acr3Nm和Acr1Bo之间的结合性相互作用(用*指出)，具有关于NmeCas9与Acr6rs与Acr7pa之间的相互作用的可能的初步证据(用*？指出)。使用AcrF1(一种I-F型抗-CRISPR)作为阴性对照。
图17呈现了示例性数据，其显示了Acr蛋白与NmeCas9蛋白的直接结合。显示了输入(即，总蛋白质)和洗脱级分。使用AcrF1(在此标记为30-35)(一种I-F型抗-CRISPR)作为阴性对照。
图18呈现了示例性数据，其显示了Acr1Nm和Acr2Nm与NmeCas9蛋白的同时的、非竞争性的结合。
图19呈现了关于II-C型抗-CRISPR蛋白的鉴定和验证的举例说明性实施方案。
图19A：在裸面小绢猴布拉克氏菌和脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的基因组中的推定的MGE之内的候选II-C型acr和aca基因的示意性图示。直向同源基因是颜色匹配的，具有所示的氨基酸同一性百分比。基因箭头未按比例绘制。任何已知的、相关的基因产物功能注释如下：Rep，质粒复制蛋白；Reg，转录调节子；Tra，接合转移蛋白；Rec，重组酶；Tail，噬菌体尾部结构蛋白；Lysis，噬菌体裂解盒。着色为灰色的基因具有MGE-相关功能或者显示出清楚的水平转移证据。
图19B：在用于测试候选抗-CRISPR功能的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中的基因型的示意性图示。菱形，CRISPR重复序列；带编号的矩形，CRISPR间隔子；箭头，CRISPR转录。ermC，整合的红霉素抗性盒；acrX，整合的候选抗-CRISPR盒。独个遗传元件不是按比例的。
图19C：候选II-C型抗-CRISPR蛋白抑制在脑膜炎奈瑟氏球菌中的CRISPR干扰。绘制了在脑膜炎奈瑟氏球菌菌株8013中的转化测定法的结果，和各自具有整合在nics座位(参见B)处的所示的acr基因的同基因衍生物。CRISPR-靶向的原间隔子质粒(藏青色)由于具有活性的CRISPR-Cas系统而不能转化野生型和包含空载体的细胞，这导致零转化体。BDL＝在该测定法的检测极限以下。缺乏靶原间隔子序列的质粒DNA可以同样好地转化所有菌株(黄色)。实验重复三次，并且误差条表示三次重复之间的平均值的标准误差(s.e.m.)。还将细胞在非选择性培养基上进行铺板，并且存在的cfu/mL的总数目在每个样品中是相等的(数据未显示)。
图20呈现了广泛分散在不同物种的MGE中的推定的AcrIIC1直向同源物的示意图。所述AcrIIC1直向同源物的示意性图示是通过PSI-BLAST和它们的基因组背景来鉴别的。指出了其中发现了各个直向同源物的物种，和其预测的基因组区域分类(即原噬菌体、整合的接合因子)。基因箭头未按比例绘制。灰色箭头表示与可移动DNA具有清楚的联系的基因，要么通过功能(即整合酶)，要么通过水平转移证据，其通过BLAST搜索来确定。已知的、相关的基因功能用下列标记来指出：Rep，质粒复制蛋白；Reg，转录调节子；Tra，接合转移蛋白；Par，质粒分配蛋白；H-NS，组蛋白样类核构造蛋白；HTH，螺旋-转角-螺旋DNA结合蛋白；Transp，转座酶；Lysis，噬菌体裂解盒；Nuc，核酸酶；Met，甲基转移酶；RM，限制性修饰系统。
图21呈现了示例性数据，其显示抗-CRISPR蛋白直接与NmeCas9:sgRNA相结合。
图21A：在体外将经纯化的、未加标签的抗-CRISPR蛋白与经纯化的、加有6xHis标签的NmeCas9:sgRNA相混合。在经考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的右侧和左侧分别显示了输入和洗脱级分(在镍亲和纯化之前和之后)。在左边标注了分子量标准参照物蛋白质的迁移率(以kDa)。AcrE2是I-E型CRISPR-Cas系统的抑制剂，并且被包括在该测定法中作为阴性对照。
图21B：在(A)中所测试的相同的抗-CRISPR蛋白与来自内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii)的Cas9(AnaCas9)之间进行结合测定法。AnaCas9是关系较远的II-C型Cas9蛋白(与NmeCas9具有～20％氨基酸序列同一性)。
图22重新显示了图21的示例性数据，作为经考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析的未裁剪的图像。
图23呈现了示例性数据，其显示II-C型抗-CRISPR蛋白特异性地阻断由NmeCas9进行的体外DNA切割。使携带邻近PAM序列的原间隔子的线性质粒DNA经历由经纯化的、重组的、经sgRNA编程的NmeCas9(上图版)和SpyCas9(下图版)来进行的体外消化。当在每条泳道的顶部指出时，将Cas9与经纯化的所示的抗-CRISPR蛋白一起进行预温育，其中AcrE2作为阴性对照。抗-CRISPR蛋白的摩尔当量(相对于Cas9而言)显示在每条泳道的顶部，并且在右边标注了输入和经切割的DNA的迁移率。
图24呈现了示例性数据，其显示II-C型抗-CRISPR蛋白在人细胞中特异性地阻断由NmeCas9进行的基因组编辑。
图24A：可以被SpyCas9(上)或NmeCas9(下)切割和编辑的在人基因组中的双重靶位点(DTS3)处的R-环结构的示意性图示。指出了指导序列(紫色)、PAM(加有框的)和Cas9切割位点(红线)。
图24B：在瞬时转染人HEK293T细胞后在DTS3处的NmeCas9或SpyCas9编辑效率的T7E1测定法。如在每条泳道的顶部所示的，共转染编码抗-CRISPR蛋白的构建体。在右边指出了经T7E1消化的(经编辑的)和未消化的(未编辑的)条带的迁移率，并且在每条泳道的底部给出了编辑效率(“％损伤”)。
图25呈现了示例性数据，其显示AcrIIC1Boe阻断在多个人基因组位点处的由NmeCas9介导的基因组编辑。与图24相关。
图25A：在瞬时转染人HEK293T细胞后用规范PAM(N4GATT)或变体PAM(N4GTTT，N4GTCT)的在多个位点处的NmeCas9编辑效率的T7E1测定法。如在每条泳道的顶部所示的，共转染编码AcrIIC1Boe蛋白的质粒。对于D-TS7靶位点，还测试了SpyCas9编辑(具有或没有AcrIIC1Boe)。在每条泳道的底部给出了编辑效率(“％损伤”)。
图25B：对于在图24中所测试的D-TS3位点，和对于在图25A中所测试的每个位点，列出了NmeCas9 sgRNA间隔子序列(5’至3’)和DNA靶位点(非互补链，5’至3’)。
图26呈现了示例性数据，其显示了在人基因组编辑中抗-CRISPR蛋白的质粒滴定。与图24相关。
图26A：在瞬时转染人HEK293T细胞后在DTS3处的NmeCas9编辑效率的T7E1测定法。如在每条泳道的顶部所示的，共转染编码抗-CRISPR蛋白的构建体。抗-CRISPR蛋白的总量保持恒定在100ng/孔，但改变阴性对照抗-CRISPR(AcrE2)和受试抗-CRISPR(AcrIIC1Boe)的相对量。在每条泳道的底部给出了编辑效率(“％损伤”)。
图26B-E：如在(A)中那样，除了使用AcrIIC1Nme(B)、AcrIIC2Nme(C)和AcrIIC3Nme(D和E)之外。在(D)中，因为即使在最低剂量(10ng)的AcrIIC3Nme质粒之时，抑制也几乎是完全的，因而我们在(E)中用更低水平的质粒重复了滴定，这揭示了抑制的剂量依赖性。
图27呈现了示例性数据，其显示AcrIIC2Nme和AcrIIC3Nme在人细胞中阻止由NmeCas9进行的DNA结合。
图27A：用于表达dNmeCas9-(sfGFP)3、dSpyCas9-(mCherry)3、它们各自的端粒sgRNA和抗-CRISPR蛋白的质粒的示意性图示。还将编码抗-CRISPR蛋白的质粒用蓝色荧光蛋白mTagBFP2进行了标记。
图27B-F：用在图27A中所描绘的质粒瞬时转染的U2OS细胞的荧光图像。在每行的右边给出了每个质粒组的特定版本(具有或没有sgRNA，具有或没有抗-CRISPR)。第一列：微分干涉相差(DIC)和mTagBFP2成像，合并的。第二列：dNmeCas9-(sfGFP)3。第三列：dSpyCas9-(mCherry)3。第四列：dNmeCas9-(sfGFP)3和dSpyCas9-(mCherry)3，合并的。比例尺，5μm。
图28呈现了示例性分析，其显示抗-CRISPR蛋白可以与大多数的(如果不是全部的)CRISPR-Cas系统相互作用。
图28A：具有代表性的一组CRISPR-Cas系统的干扰蛋白的序列相似性树(Makarova等人,2015)。1类系统是多亚基效应子复合物，而2类系统采用单个效应子蛋白质。标记了类型和亚型进化枝。星号指出了对于其已经发现了抗-CRISPR蛋白的CRISPR-Cas系统的类型。
图28B：具有代表性的Cas9蛋白序列的最大似然系统发生树。基于它所位于之中的CRISPR座位，将每种蛋白质分类为II-A型(蓝色)、II-B型(黄色)或II-C型(紫色)。将属于任何具有II-C型抗-CRISPR直向同源物的类别的Cas9蛋白着色为红色。假设给定的抗-CRISPR直向同源物抑制在其中发现了它的物种之中的CRISPR-Cas系统，那么该可视化提供了由在此所发现的抗-CRISPR家族所包括的活性广度的估计。
图29呈现了示例性数据，其显示了用三种Acr蛋白(AcrIIC3Nme(阳性对照)、AcrIIC4Hpa和AcrIIC5Smu))在D-TS3(上图版)和D-TS7(下图版)双重靶位点处相对于SpyCas9(II-A型)基因编辑而言对于NmeCas9(II-C型)基因编辑的选择性抑制。Nme/SpyCas9+SgRNA质粒(各自150ng)+Acr质粒(100ng)。
图30呈现了示例性数据，其显示了在D-TS3双重靶位点处NmeCas9(II-C型)编辑的AcrIIC4Hpa(上图版)和AcrIIC5Smu(下图版)抑制的剂量-反应关系。NmeCas9+SgRNA质粒(各自150ng)+Acr质粒(100ng)。
图31(图版A-E)呈现了用在图27A中所描绘的质粒瞬时转染的U2OS细胞的荧光图像。在每行的右边给出了每个质粒组的特定版本(具有或没有sgRNA，具有或没有抗-CRISPR)。第一列：微分干涉相差(DIC)和mTagBFP2成像，合并的。第二列：dNmeCas9-(sfGFP)3。第三列：dSpyCas9-(mCherry)3。第四列：dNmeCas9-(sfGFP)3和dSpyCas9-(mCherry)3，合并的。比例尺，5μm。图版F：在不表达抗-CRISPR、表达阴性对照抗-CRISPR(AcrE2)、表达AcrIIC3Nme、表达AcrIIC4Hpa或表达AcrIIC5Smu的细胞中，通过与dSpyCas9-(mCherry)3端粒灶的共定位来判断的dNmeCas9-(sfGFP)3端粒灶的定量。对灶进行盲评分。
图32呈现了示例性数据，其显示一些Acr蛋白当在人细胞中共表达时影响NmeCas9进行积聚的能力，没有(上图版)或具有(下图版)共表达的sgRNA。用NmeCas9+SgRNA质粒(各自100ng)+Acr质粒(200ng)转染HEK293细胞。在每个图版中，通过使用抗-HA抗体探测来自经转染的细胞的总蛋白质(20微克/泳道)的Werstern印迹来检测加有HA标签的NmeCas9。将用抗-GAPDH抗体检测GAPDH蛋白用作上样对照，如所示的那样。
图33显示AcrIIC1、AcrIIC2和AcrIIC3在不同的相互作用表面与NmeCas9相结合。在大肠杆菌(E.coli)中使未加标签的AcrIIC3Nme与加有6His标签的NmeCas9进行共表达。通过使用Ni亲和色谱法来纯化这两种蛋白质的复合物。在纯化后，将该NmeCas9/AcrIIC3Nme复合物与经纯化的、未加标签的AcrII1Boe、AcrIIC2Nme或这两种蛋白质一起进行温育。然后，通过使用第二个Ni亲和柱来纯化NmeCas9和结合的蛋白质，并且通过SDS-PAGE以及随后的考马斯蓝染色来分析所得的复合物。所有三种抗-CRISPR蛋白都能够同时结合NmeCas9，并且一个的结合并不取消任何另一个的结合。这表明，它们可以同时用于抑制Cas9的活性并且减少抗-CRISPR抗性突变体出现的机会。
图34呈现了在抗-CRISPR蛋白不存在和存在下由NmeCas9进行的DNA结合，其通过使用电泳迁移率变动测定法来进行检定。经纯化的NmeCas9+sgRNA在除了第一泳道外的所有泳道中存在。在每条泳道上方记录了添加至反应的相关的抗-CRISPR蛋白。将NmeCas9+sgRNA和抗-CRISPR蛋白预混合并在冰上温育5分钟，添加经32P标记的DNA，并且将反应体系在37℃下温育30分钟。AcrIIC1Boe和AcrIIC5Smu完全阻断Cas9DNA-结合，而AcrIIC4Hpa在所使用的浓度下部分地抑制结合。AcrIIC2Nme不干扰DNA结合，并且看起来与NmeCas9/DNA复合物相结合。AcrE2(一种关于I-E型CRISPR系统的抗-CRISPR蛋白)不抑制由NmeCas9进行的DNA结合。
图35显示了AcrIIC4Hpa与NmeCas9的直接相互作用。使未加标签的AcrIIC4Hpa与加有6His标签的NmeCas9进行共表达，并且将复合物进行纯化并通过SDS-PAGE以及随后的考马斯蓝染色来可视化。
发明详述
本发明涉及CRISPR-Cas9基因编辑平台的领域。特别地，本发明鉴定出了控制Cas9基因编辑活性的II-C型Cas9抗-CRISPR(Acr)抑制剂。此类Acr抑制剂的共施用可以在下列方面提供有利的辅助：允许通过在空间或时间上控制Cas9活性来进行安全且实用的生物学治疗法；控制在野生群体中的基于Cas9的基因驱动器以减轻此类强制遗传计划的生态学后果；和对进入基因编辑技术的各种生物技术、农业和医学应用中的一般性研究作出贡献。
I.CRISPR基因编辑平台
CRISPR-Cas系统是在细菌和古细菌中的适应性免疫系统，其帮助抵御捕食性病毒的攻击。这些系统使用小的RNA[CRISPR RNA(crRNA)]作为指导来鉴别其核酸靶标，所述核酸靶标然后被切割并失活。在大多数情况下，所述靶核酸为DNA，而不是RNA。
成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA序列和CRISPR-相关(Cas)基因形成催化性的蛋白质-RNA复合物，其利用所掺入的RNA来在互补DNA序列处产生序列特异性的双链断裂。该核酸酶平台对于所靶向的基因失活或特制的基因组编辑已展现出非凡的稳健性。Sander等人,CRISPR-Cas systems for editing,regulating and targetinggenomes.Nature Biotechnology 32,347-355(2014)；Mali等人,RNA-guided humangenome engineering via Cas9.Science 339,823-826(2013)；Ran等人,Double Nickingby RNA-Guided CRISPR Cas9for Enhanced Genome Editing Specificity.Cell 154,1380-1389(2013)；Fu等人,Improving CRISPR-Cas nuclease specificity usingtruncated guide RNAs.Nature Biotechnology 32,279-284(2014)；和Wang等人,One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.Cell 153,910-918(2013)。
CRISPR/Cas9基因组工程系统由于其简单性和效力而是革命性的生物科学1-3。最经常被研究的Cas9核酸酶来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(SpyCas9)4。SpyCas9和其相关指导RNA准许DNA序列基于至少两个阶段的序列探问来进行切割4-8：i)PAM元件与PAM-相互作用结构域的特异性的相容性，和ii)指导RNA序列与靶位点的互补性。因为直接去规划Cas9通过掺入互补的单一指导RNA(sgRNA)来切割所希望的靶位4，所以对Cas9靶向的首要限制是相容的PAM元件的存在4,9,10。例如，野生型SpyCas9(SpyCas9WT)的PAM-相互作用结构域优先地识别NGG元件4，尽管它可以无效地使用其他PAM序列(例如，nAG、nGA)9,11。SpyCas9/sgRNA系统的简单性允许在各种各样的生物体和细胞系中容易地进行基因组编辑1-3。靶特异性可以是经由指导RNA(通过Watson-Crick碱基配对)和Cas9的固有特异性(通过识别邻接基序(例如，原间隔子邻近基序(PAM)))两者进行识别的功能。
CRISPR-Cas系统的一个亚组(称为“II型”的那些)采用了称为Cas9的蛋白质，并且该蛋白质(连同其RNA指导者一起)已适应于作为革命性的基因组编辑平台。还已开发了在其核酸酶活性位点中携带突变的变体作为RNA-指导的DNA结合平台，以使得能够进行基因标记和转录控制。Cas9已经被广泛用作研究工具，并且它还正用于宽范围的生物技术应用，和用于畜牧业、农业和其他地方。
另外，CRISPR-Cas9平台正在被开发为用于许多疾病的潜在地革命性的治疗方法，鉴于其修饰对疾病作出贡献的基因组座位、破坏病原体的基因组或引入在治疗上有用的序列(例如，用于癌症免疫疗法的嵌合抗原受体)的潜在能力。为了这些目的已经开发和调整了来自各种来源的许多Cas9，包括但不限于由酿脓链球菌、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的某些菌株的基因组所编码的Cas9。这三者都来自称为II-A型的CRISPR-Cas系统的亚型。
迄今大多数所报道的应用使用了酿脓链球菌Cas9(SpyCas9)，其是最好地经表征的版本，和更近来，金黄色葡萄球菌Cas9(SauCas9)。除了这些II-A型Cas9外，还已通过使用脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9(NmeCas9，II-C型)开发了基因组编辑应用。Hou等人,“Efficientgenome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseriameningitidis”Proc Natl.Acad Sci.USA 110:15644-15649(2013)；和Zhang等人,“DNaseH activity of Neisseria meningitidis Cas9”Molecular Cell 60:242-255(2015)。
A.Cas9活性调节
Cas9应用的一个目前的限制是，其活性可以是非常难以控制的：它一般是具有活性的，只要它存在并且能够接近通常以所谓的单一指导RNA(sgRNA)形式的其crRNA指导者。该控制缺乏可以因许多原因而引入困难。最值得注意的是，尽管Cas9在仅编辑它被导向的基因组座位方面常常是高度准确的，但是脱靶效应并非不常见。脱靶Cas9活性具有将突变引入至不期望的位点的不期望的后果。这对于许多目的来说是所关注的事，尤其是但非仅仅对于临床治疗法。
已充分确立，细胞中存在的有功能的Cas9/sgRNA越多，并且Cas9/sgRNA持续越久，那么脱靶效应的可能性就越大。虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为一旦发生了“中靶”基因组编辑，持续的Cas9/sgRNA可以不再识别和编辑所期望的座位，由此完成其预期目的。尽管如此，仍然有功能的Cas9/sgRNA复合物可以继续在其他地方找到和编辑脱靶位点。
在一个实施方案中，本发明考虑了抑制Cas9/sgRNA活性的组合物。虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为这些抑制剂化合物与具有活性的Cas9/sgRNA相互作用，并且作为“关闭开关”起作用，所述关闭开关使Cas9/sgRNA活性减小至最小量和/或保持对于其预期目的来说必需的持续时间。进一步，认为Cas9/sgRNA抑制剂组合物可以将Cas9/sgRNA活性限制至特定的组织或器官，或者限制至任何给定的一套使用者自定义的条件，通过当不希望其活性时，在任何地方、在任何时间或在任何环境下“触动关闭开关”。
本实施方案具有优于用于控制Cas9/sgRNA活性和/或组织特异性的其他可能的方式的特别的优点，例如：i)限制Cas9/sgRNA产生；ii)控制Cas9/sgRNA剂量；iii)使用特异性的启动子或其他基因表达控制元件；iv)使用瞬时的或组织特异性的递送形式。由这些备选的方法所赋予的调控控制不能像所需要的那样精确和/或瞬时，并且任何确实被引入的Cas9/sgRNA保持具有活性，只要它存在。
其他人已提出了各种用于控制Cas9/sgRNA活性的方法：
(i)可以将Cas9/sgRNA裂开成两个分开的半蛋白质(half-protein)，其中其二聚化为依赖于小分子(例如，雷帕霉素)的活性形式。Zetsche等人,“A split-Cas9architecture for inducible genome editing and transcription modulation”NatureBiotechnol.33:139-140(2015)。在此，小分子担当“打开开关”，并且它的撤除可以代替“关闭开关”。但是，在其他限制中尤其要指出的是，小分子撤除的效应不是立即的，这取决于其从Cas9上的脱离速率以及先前递送的小分子的持久性。
(ii)可以用配体依赖性内含肽来瓦解Cas9/sgRNA，从而使得Cas9失活直至添加配体(例如，4-羟基他莫昔芬(4-HT))以触发内含肽自切除和Cas9激活。Davis等人,“Smallmolecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity”Nature Chem.Biol.11:316-318(2015)。再次，这是一种打开开关机制，并且4-HT的撤除将会阻止进一步产生具有活性的Cas9。但是，仍然不存在关闭开关，并且先前产生的Cas9将会保持存在和具有活性。
(iii)可以将Cas9/sgRNA融合至外源蛋白质结构域，其赋予向靶基因组所位于之中的细胞核的光可诱导的定位。只要存在具有合适波长的光，Cas9/sgRNA就保持在细胞核中并且基因编辑继续。当撤除光时，Cas9/sgRNA移位至细胞质并且细胞核基因编辑停止。Nihongaki等人,“Photoactivatable CRISPR-Cas9for optogenetic genome editing”Nature Biotechnol.33:755-760(2015)。但是，通常不可能对合适光的存在或不存在施加足够的控制，尤其是在活的植物和动物中，或者在受控环境例如实验室外面。进一步地，Cas9/sgRNA可能仍然能够接近基因组，例如在当核被膜不存在或受损的条件下，例如在有丝分裂期间。
因此，有效的Cas9关闭开关的鉴定或开发将会是本领域中的有用的改进。因为CRISPR-Cas系统抵御病毒(细菌噬菌体)捕食，所以这些系统对于病毒强加了强大的进化压力以发展出用于逃避或抵消CRISPR-Cas防御功能的机制。
B.I型CRISPR-Cas抑制剂
与基于Cas9-的II型系统不同，I型CRISPR-Cas系统采用大的多亚基蛋白质复合物来进行DNA监视和切割。如此，I型系统对于许多基因编辑平台来说不是有前途的，因为它们包含更复杂的系统。但是，I型系统在细菌中是普遍的，并且它们提供了针对感染细菌的病毒(称为噬菌体)的免疫性。已鉴定了编码I型CRISPR-Cas系统的蛋白质抑制剂(抗-CRISPR：Acr)的噬菌体基因。Bondy-Denomy等人,“Bacteriophage genes that inactivate theCRISPR/Cas bacterial immune system”Nature 493:429-432(2013)；Bondy-Denomy等人,“Multiple mechanisms for CRISPR-Cas inhibition by anti-CRISPR proteins”Nature526:136-139(2015)；和Pawluk等人,“A new group of phage anti-CRISPR genesinhibits the Type I-E CRISPR-Cas system of Pseudomonas aeruginosa”mBio 5:e00896-14(2014)。迄今所鉴定的每种I型抗-CRISPR具有对于CRISPR-Cas系统的I-E型或I-F型这些亚型的特异性，并因此不会预期它们对于任何基于Cas9的II型系统具有效应。已被表征的I型Acr蛋白据报道通过与CRISPR-Cas机器的组分的直接的抑制性结合来起作用，并且每种不同的Acr蛋白据报道通过不同的作用机制来起作用。
II.II型Cas9抑制剂组合物
除了阻止基于I型CRISPR的免疫性的由噬菌体编码的Acr蛋白外，螺旋-转角-螺旋生物异源物质应答元件(HTH-XRE)家族的Acr-相关的(Aca)转录调节物的鉴定也已为大家所知。Aca转录调节物被认为调节Acr蛋白表达，并且通常在噬菌体/原噬菌体基因组内由邻近的、小的开放阅读框编码。通过使用已知的Aca蛋白序列作为生物信息学搜索查询，鉴定出了另外的Aca蛋白。这些新鉴定出的Aca基因中的许多由感染具有I型CRISPR-Cas系统的物种的噬菌体编码。被发现与aca基因相邻的、小的、先前未表征的开放阅读框显示出具有针对I-F和I-E型系统的抗-CRISPR活性。
在一个实施方案中，本发明考虑了包含处于裸面小绢猴布拉克氏菌基因组内的aca基因的组合物。在一个实施方案中，裸面小绢猴布拉克氏菌基因组包含II-C型CRISPR-Cas座位。虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为裸面小绢猴布拉克氏菌II-C型CRISPR-Cas座位是包括NmeCas9的类别，并且不与I型CRISPR-Cas座位类似。事实上，已确定裸面小绢猴布拉克氏菌Cas9座位是与NmeCas9～47％同一的。
进一步地，已发现裸面小绢猴布拉克氏菌Aca蛋白与未表征的编码候选Acr蛋白(Acr1Bo)的ORF相邻。在一个实施方案中，本发明考虑了位于多个噬菌体内的多个II-型Aca基因，它们中的每一个与小的未表征的编码候选Acr蛋白的ORF相邻，例如：
1.裸面小绢猴布拉克氏菌Acr(Acr1Bo)
开放阅读框(276个核苷酸)：
ATGaaagaggtatttaaattaaaaccagagctagtgacttataaaggttgcggctgggcactggcgtgcatcaaagacggagagatcatcgatctcacctacgttcgtgaccttggtattgaagaatatgatgaaaacttcgatggccttgaacctgaaatcatctattacgatgttgtggcttctcaagcgtgcaaagaagtcgcctatcgttatgaagaaatgggcgaatttaccttcggcttatgctcgtgttgggaattcaatgtaatgTAG(SEQ ID NO:1)
蛋白质(91个氨基酸)：
MKEVFKLKPELVTYKGCGWALACIKDGEIIDLTYVRDLGIEEYDENFDGLEPEIIYYDVVASQACKEVAYRYEEMGEFTFGLCSCWEFNVM(SEQ ID NO:2)
2.脑膜炎奈瑟氏球菌Acr#1(Acr1Nm)
开放阅读框(258个核苷酸)：
ATGaataaaacttataaaattggaaaaaatgccgggtatgatggctgcggtctttgtcttgcggccatttctgaaaatgaagctatcaaagttaagtatttgcgcgacatttgtcctgattacgatggcgatgataaagctgaggattggctgagatggggaacggacagccgcgtcaaagcagccgctcttgaaatggagcagtacgcatatacgtcggttggtatggcctcatgttgggagtttgttgaactaTGA(SEQ ID NO:3)
蛋白质(85个氨基酸)：
MNKTYKIGKNAGYDGCGLCLAAISENEAIKVKYLRDICPDYDGDDKAEDWLRWGTDSRVKAAALEMEQYAYTSVGMASCWEFVEL(SEQ ID NO:4)
3.脑膜炎奈瑟氏球菌Acr#2(Acr2Nm)
开放阅读框(372个核苷酸)：
ATGagcaaaaacaatattttcaacaagtatccaacaattattcacggcgaagcgcggggggagaatgacgaatttgtggtgcatacgcgctacccgcgattcttggcgcggaaatcttttgacgacaatttcacgggcgaaatgcctgcaaaacctgttaacggggaattgggacaaatcggcgaaccgcgccgccttgcttatgattcacggcttggtttgtggctttctgacttcatcatgttggacaacaacaagccgaaaaacatggaggattggcttgggcaattaaaagccgcctgcgatcgaatcgcggcggatgatttgatgctgaatgaagatgcggcggatttggagggctgggatgatTGA(SEQ ID NO:5)
蛋白质(123个氨基酸)：
MSKNNIFNKYPTIIHGEARGENDEFVVHTRYPRFLARKSFDDNFTGEMPAKPVNGELGQIGEPRRLAYDSRLGLWLSDFIMLDNNKPKNMEDWLGQLKAACDRIAADDLMLNEDAADLEGWDD(SEQ ID NO:6)
4.脑膜炎奈瑟氏球菌Acr#3(Acr3Nm)
开放阅读框(351个核苷酸)：
ATGttcaaacgcgctattatcttcacttctttcaacggctttgaaaaagtttctcgaactgaaaaacgccgccttgccaaaatcatcaatgctcgagtttccatcatcgacgaatacttgagagccaaagacaccaacgcatcgcttgacggtcagtaccgcgctttcttgttcaacgacgaatcgcccgcaatgaccgaatttctggcaaaacttaaagcctttgccgaaagttgcaccggaatcagcatcgacgcatgggaaattgaagaaagcgaatacgtccgcctgccggtggaacgcagggatttcttagcggcagccaacggcaaagagatttttaaaattTAA(SEQ ID NO:7)
蛋白质(116个氨基酸)：
MFKRAIIFTSFNGFEKVSRTEKRRLAKIINARVSIIDEYLRAKDTNASLDGQYRAFLFNDESPAMTEFLAKLKAFAESCTGISIDAWEIEESEYVRLPVERRDFLAAANGKEIFKI(SEQ ID NO:8)
5.脑膜炎奈瑟氏球菌Acr#4(Acr4Nm)
开放阅读框(267个核苷酸)
ATGgcaaaaggtagaacaagcattacagagcggctcaaaaagagccaaaaacgagaggcgcgccgtgatatggcgcacgaatgggcggaaaaatgggagcaggattatttgagcctgctctctcaaatcaaacaggcaatcagcaaaggacacgatgacgagcttatcgacttatttgctgatttacgcgcgctgcaacagccaaaatttgaggcattgcatcgagtgattgatgagcttatcacgccgacacgggagcttataTGA(SEQ ID NO:9)
蛋白质(88个氨基酸)
MAKGRTSITERLKKSQKREARRDMAHEWAEKWEQDYLSLLSQIKQAISKGHDDELIDLFADLRALQQPKFEALHRVIDELITPTRELI(SEQ ID NO:10)
6.脑膜炎奈瑟氏球菌Acr#5(Acr5Nm)
开放阅读框(192个核苷酸)
ATGaaatacgccaaatcaaaatctatcagcaaaatcggtcaatatcatcaaacttttaaaatcctttgggataaactaccaaaagaattgattgagaaatcaacagccaaaaatctcgccattattattgatttgatgtatgagcaaaaagaatatggccatacagaggcatggcgcgaattaacatcaTAA(SEQ ID NO:11)
蛋白质(63个氨基酸)
MKYAKSKSISKIGQYHQTFKILWDKLPKELIEKSTAKNLAIIIDLMYEQKEYGHTEAWRELTS(SEQID NO:12)
7.茄罗尔斯通氏菌Acr(Acr6Rs)
开放阅读框(312个核苷酸)
ATGtacgcaatctacacggacgcaggaatcctggcagtagcccccactgtggaggcagcgatcgaacgggccaggtgcgagcatgggctaaaagccgctcttgtggctcagaacacgagctgcatctaccacggcgggatcgttgatttgaccactgcatggcgaatctctgccgattcagagcgagccggagattcggagacgaaattgcgccgctgctcggcgcgcttggcggcagcagtagaggctgggcgacttcccgtgttcgctgtgatggcgcatggcgagttagatctaatcgaggatgccTGA(SEQ ID NO:13)
蛋白质(103个氨基酸)
MYAIYTDAGILAVAPTVEAAIERARCEHGLKAALVAQNTSCIYHGGIVDLTTAWRISADSERAGDSETKLRRCSARLAAAVEAGRLPVFAVMAHGELDLIEDA(SEQ ID NO:14)
8.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)Acr(Acr7Pa)
ORF(261个核苷酸)
ATGctggagcgatgcctccagattgtcaccacgccgggcgctgtgccccgagatcaggcggaggccaacgtttgccgtttggccgggatgatcgtggacggcaggtatccagtggcaggcaaacgactgtctgatgcggctgcgacctactttgccgaccatccagagcagcaagtgccgtccgccgaggtcgcccggcgcggctggatcataaacgccccacgcctccggacgcgactggagcgcctgctgggcgggTAA(SEQ ID NO:15)
蛋白质(86个氨基酸)
MLERCLQIVTTPGAVPRDQAEANVCRLAGMIVDGRYPVAGKRLSDAAATYFADHPEQQVPSAEVARRGWIINAPRLRTRLERLLGG(SEQ ID NO:16)
9.副流感嗜血菌Acr(AcrIIC4Hpa)
ORF(267个核苷酸)：
ATGaagatcaccagcagcaacttcgcgaccattgcgaccagcgagaactttgcgaagctgagcgtgctgccgaaaaaccaccgtgagccgatcaagggtctgttcaaaagcgcggttgaacagtttagcagcgcgcgtgacttctttaagaacgagaactacagcaaagagctggcggaaaagttcaacaaagaagcggtgaacgaggcggttgaaaagctgcaaaaagcgatcgatctggcggaaaaacagggcattcaatttTGA(SEQ ID NO:22)
蛋白质(88个氨基酸)：
MKITSSNFATIATSENFAKLSVLPKNHREPIKGLFKSAVEQFSSARDFFKNENYSKELAEKFNKEAVNEAVEKLQKAIDLAEKQGIQF(SEQ ID NO:23)
10.米氏西蒙斯氏菌Acr(AcrIIC5Smu)
ORF(393个核苷酸)：
ATGaacaacagcatcaagttccacgtgagctacgacggtaccgcgcgtgcgctgtttaacaccaaggagcaggcggaaaaatactgcctggttgaggaaattaacgatgagatgaacggctataagcgtaaaagctgggaggaaaagctgcgtgaggaaaactgcgcgagcgtgcaggactgggttgagaagaactacaccagcagctatagcgacctgttcaacatctgcgagattgaagtgagcagcgcgggtcaactggttaagatcgacaacaccgaggtggacgatttcgttgaaaactgctatggctttaccctggaggacgatctggaggaattcaacaaggcgaaacagtacctgcaaaaattttatgcggagtgcgaaaacTGA(SEQ ID NO:24)
蛋白质(130个氨基酸)：
MNNSIKFHVSYDGTARALFNTKEQAEKYCLVEEINDEMNGYKRKSWEEKLREENCASVQDWVEKNYTSSYSDLFNICEIEVSSAGQLVKIDNTEVDDFVENCYGFTLEDDLEEFNKAKQYLQKFYAECEN(SEQ ID NO:25)
在一个实施方案中，本发明考虑了包含II型CRISPR-Cas9抑制剂(例如Acr)的组合物。在一个实施方案中，所述II型Acr为Acr1Bo，其抑制II-C型CRISPR-Cas系统。在一个实施方案中，所述II型Acr源自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株。在一个实施方案中，本发明考虑了包括但不限于AcrIIC1Boe、AcrIIC1Nme、AcrIIC2Nme、AcrIIC3Nme、AcrIIC4Hpa和AcrIIC5Smu的II型Acr。在本文中所呈现的数据证明，II型Cas9抑制剂AcrIIC1Boe、AcrIIC1Nme、AcrIIC2Nme、AcrIIC3Nme、AcrIIC4Hpa和AcrIIC5Smu控制脑膜炎奈瑟氏球菌CRISPR-Cas系统免疫功能。
已经建立了用于NmeCas9编辑的测试和读出器，包括荧光报道基因的失活，以及用于检测基因组损伤的引入的标准T7E1测定法(例如，在所附的附图中)。关于后者，用编码NmeCas9(其与表位标签和核定位序列相融合)和靶向与功能性原间隔子邻近部分(PAM)(通常NNNNGATT，虽然偏离那个共有序列的一些变化是允许的)相邻的位点的sgRNA的质粒瞬时感染HEK293T细胞。Zhang等人,“DNase H activity of Neisseria meningitidis Cas9”Molecular Cell 60:242-255(2015)；和Hou等人,“Efficient genome engineering inhuman pluripotent stem cells using Cas9from Neisseria meningitidis”ProcNatl.Acad Sci.USA 110:15644-15649(2013)。
在这些初步实验中所使用的代表性基因组靶位点如下，其中显示了完整的PCR扩增子：
24-nt NmeCas9靶间隔子：粗体
20-nt Spy靶间隔子：斜体
原间隔子邻近部分：加下划线的(NNNNGAT(A/T)，对于NmeCas9；NGG，对于SpyCas9)
靶位点N-TS3
CATTTCTTTATATGTCTTAATGCTGACCTTCTGCACAAATGCACCACTATACCATTACCAGTTATTACCAGCTAATAGGGTGGGAGCTAATGAACACTTACAACTCTGTCCTCAGGAAAGTGCAGAGAAATTCATGCATCCCAGGAGGGGATGCTCAGAAAGAGGAAGCTGGTTTATGATTGGACTGCGTGGGCGTTTGCAAAGCAAGGTTTCATTGAAAAGAGATGTTTTCTTGTGGGGCATTTGAGTCAATTACCAAAGTCTATTTTTAAAACTTCTCCATATGAGCCTGATCTATCTCTGAAGTTGTTTTGAAGACCACAGGACTGCTTGTAACATGTGCCATTGCCATTCTGCTTTTTATTCTTTTGATTGGAAGGACTAAAATGATTTTCACTTA(SEQ ID NO:17)
靶位点N-TS7
Figure BDA0001863228310000371
靶位点N-TS25
GCAATCCACCCAATGCTAACTGGGATGTTTGATTTTGCAGCCTCTTTCAGAGCAGTTGCTAAAAGTGGCTCCACATCATAAGAGGGCTTCCCTCCCTCAATCCATGAGAGCAACTAGGTTTTGCATCAGTGAAAGGAAGAAAAAGCAGGAGTTTGGCAAGAGGCTGCAAAGAGACGGCACTGGGCTCCACTAGAGTTCCTTCCCACCGCGTTTCTCATCCTGTCTTCTGCCTAGTGGATATGTCTGCGTGGGCGTGCACACACATTGGCTGATGAAACCCCCTTCCTGTTGCACAGGGTCAGAACTAAGCGAGGTGGGTGTAGCTTTGGAGGGTTCTGAAATCTAAGAACCAGCTTCCTTTCCCACCGCTTTCCGCTGAGTCAGTTCACTGCAGAGTGCTCTGCAGGATCTGGAGGCCTTTGTGTTCA(SEQ ID NO:19)
靶位点D-TS3
Figure BDA0001863228310000381
靶位点D-TS7
Figure BDA0001863228310000382
Figure BDA0001863228310000391
提取基因组DNA，并且使包含靶位点的片段经历聚合酶链式反应扩增。使所得的扩增子进行热变性并重退火以形成异源双链体。然后，用切割包含错配或凸起的DNA的T7E1消化所述异源双链体。T7E1消化的量反映了异源双链体形成的程度，其反过来反映了NmeCas9在靶位点处的诱变效率。所产生的质粒各自表达用于进行测试的Acr。作为阴性对照，产生了表达先前经表征的、大小相似的Acr(Acr88a-32：84个氨基酸)的质粒。Acr88a-32特异性地抑制不相关的I-E型CRISPR-Cas系统，并且将会被预期对于任何形式的Cas9不具有效应。Pawluk等人,“A new group of phage anti-CRISPR genes inhibits the Type I-ECRISPR-Cas system of Pseudomonas aeruginosa”mBio 5:e00896-14(2014)。
从分开的质粒上表达每种独个Acr，各自以三种形式之一：i)天然的由噬菌体编码的序列(没有附加额外的氨基酸)；ii)N-末端融合有核定位信号(NLS)和FLAG表位标签；和iii)C-末端融合有NLS和FLAG标签。虽然并不需要理解本发明的机制，但是具有85至123个氨基酸的Acr被认为远低于关于通过核孔的被动蛋白质扩散的大小界限。
在本文中所呈现的数据显示，用NmeCas9靶位点N-TS3，在标准的非抑制的NmeCas9编辑测定法中观察到15-20％的编辑效率。在二分之一的经转染的编码II型CRISPR-Cas抑制剂蛋白的质粒的相对量/比例时，用未加标签的Acr1Bo和Acr1Nm看到相当强的抑制效应，和用未加标签的Acr2Nm看到温和的效应。用加有标签的Acr，尤其是在C-末端处加有标签的Acr1Bo(“Acr1Bo/Flag-NLS”)，观察到部分抑制效应。阴性对照(Acr88a-32)不具有一致的抑制效应。这些结果暗示，推定的II-C型抑制剂限制NmeCas9编辑效率，但可能需要以较高的量(相对于NmeCas9而言)进行表达以便观察到完全的抑制。所述数据还暗示，所述标签中的一些可能与Acr功能相容。参见，图1。
用相等量的显露出稳健的NmeCas9抑制的Acr质粒来进行采用不同靶位点(例如，N-TS25和N-TS7)的另外测试。所有三种未加标签的Acr蛋白都是强烈抑制性的，如在C-末端处加有标签的Acr1Bo那样。其他加有标签的Acr显示出部分效应，而阴性对照Acr88a-32是非功能性的。分别参见图2和3。
编辑了“双重”靶位点(例如D-TS7)，其中“双重”是指所述位点可以被SpyCas9(II-A型)或NmeCas9(II-C型)所靶向的事实。对于双重靶向的能力产生自这样的事实，即双重位点侧翼序列(例如，GGGAGATT)匹配关于SpyCas9的NGG PAM共有序列，以及关于NmeCas9的NNNNGATT PAM共有序列。因此，该相似性允许于在其他方面相等的条件下，直接比较在完全相同的位点上Acr蛋白对于SpyCas9和NmeCas9的相对抑制效应。此外，使用具有相同的启动子、末端融合物等的SpyCas9和NmeCas9表达构建体，以便有助于直接比较。结果显示，各种II型Acr抑制剂显示出强烈的对于NmeCas9编辑活性的抑制，但在相同的位点处没有SpyCas9活性的抑制。这显示，所述II型Acr抑制剂(加有标签的和未加标签的两者)可能对于II-C型系统是特异性的，并且不能对关系较远的II-A型系统起作用。参见图4。仅使用显示出相似结果的未加标签的Acr测试了第二个双重靶位点，D-TS3。参见图5。
用未加标签的Acr1Bo、Acr1Nm或Acr2Nm来进行的采用D-TS3靶位点的NmeCas9编辑的进一步测试显示，这些Acr对于NmeCas9编辑的抑制效应是剂量依赖性的。分别参见图6、7和8。观察到Acr1Bo和Acr1Nm两者的抑制效应是完全的。但是，Acr2Nm的抑制效应是不完全的。
与图5中所呈现的上述数据不同，用完整的未加标签的Acr的组测试了双重靶位点D-TS3。所述测试揭示了Acr3Nm是有效的NmeCas9抑制剂，而对于SpyCas9抑制不具有效应。参见图9。
图10呈现了示例性数据，其显示了在D-TS3靶位点处NmeCas9(II-C型)基因编辑的Acr1Bo抑制的剂量-反应关系。NmeCas9+SgRNA质粒(150ng)+Acr质粒(150ng)。
D-TS3靶位点的Acr3Nm和NmeCas9编辑之间的剂量-反应关系显示，出现了完全的抑制，即使用非常小量的经转染的Acr3Nm质粒，这暗示Acr3Nm可能是特别强有力的抑制剂。参见图10。
总之，这些数据证明，各种NmeCas9抑制剂可以在人细胞中阻止NmeCas9基因编辑活性。虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为这些Acr抑制剂为Cas9基因组编辑“关闭开关”。
A.经截短的Acr蛋白
在一个实施方案中，本发明考虑了编码Acr蛋白的经截短的核酸序列，其源自包括但不限于下列各项的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15。
在一个实施方案中，本发明考虑了包含经截短的氨基酸序列的Acr蛋白，所述经截短的氨基酸序列源自包括但不限于下列各项的组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:16。
B.Acr二聚体蛋白
在一个实施方案中，本发明考虑了同二聚体Acr蛋白，其选自包括但不限于下列各项的组：(SEQ ID NO:2)-(SEQ ID NO:2)、(SEQ ID NO:4)-(SEQ ID NO:4)、(SEQ ID NO:6)-(SEQ ID NO:6)、(SEQ ID NO:8)-(SEQ ID NO:8)、(SEQ ID NO:10)-(SEQ ID NO:10)、(SEQID NO:12)-(SEQ ID NO:12)、(SEQ ID NO:14)-(SEQ ID NO:14)和/或(SEQ ID NO:16)-(SEQ ID NO:16)。
在一个实施方案中，本发明考虑了异二聚体Acr蛋白，其包含至少两个从包括但不限于下列各项的组中选择的不同序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:16。
在一个实施方案中，本发明考虑了异二聚体Acr蛋白，其选自包括但不限于下列各项的组：(SEQ ID NO:2)-(SEQ ID NO:4)、(SEQ ID NO:2)-(SEQ ID NO:6)、(SEQ ID NO:2)-(SEQ ID NO:8)、(SEQ ID NO:2)-(SEQ ID NO:10)、(SEQ ID NO:2)-(SEQ ID NO:12)、(SEQID NO:2)-(SEQ ID NO:14)和/或(SEQ ID NO:2)-(SEQ ID NO:16)。
在一个实施方案中，本发明考虑了异二聚体Acr蛋白，其选自包括但不限于下列各项的组：(SEQ ID NO:4)-(SEQ ID NO:6)、(SEQ ID NO:4)-(SEQ ID NO:8)、(SEQ ID NO:4)-(SEQ ID NO:10)、(SEQ ID NO:4)-(SEQ ID NO:12)、(SEQ ID NO:4)-(SEQ ID NO:14)和/或(SEQ ID NO:4)-(SEQ ID NO:16)。
在一个实施方案中，本发明考虑了异二聚体Acr蛋白，其选自包括但不限于下列各项的组：(SEQ ID NO:6)-(SEQ ID NO:8)、(SEQ ID NO:6)-(SEQ ID NO:10)、(SEQ ID NO:6)-(SEQ ID NO:12)、(SEQ ID NO:6)-(SEQ ID NO:14)和/或(SEQ ID NO:6)-(SEQ ID NO:16)。
在一个实施方案中，本发明考虑了异二聚体Acr蛋白，其选自包括但不限于下列各项的组：(SEQ ID NO:8)-(SEQ ID NO:10)、(SEQ ID NO:8)-(SEQ ID NO:12)、(SEQ ID NO:8)-(SEQ ID NO:14)和/或(SEQ ID NO:8)-(SEQ ID NO:16)。
在一个实施方案中，本发明考虑了异二聚体Acr蛋白，其选自包括但不限于下列各项的组：(SEQ ID NO:10)-(SEQ ID NO:12)、(SEQ ID NO:10)-(SEQ ID NO:14)和/或(SEQID NO:10)-(SEQ ID NO:16)。
在一个实施方案中，本发明考虑了异二聚体Acr蛋白，其选自包括但不限于下列各项的组：(SEQ ID NO:12)-(SEQ ID NO:14)和/或(SEQ ID NO:12)-(SEQ ID NO:16)。
在一个实施方案中，本发明考虑了(SEQ ID NO:14)-(SEQ ID NO:16)的异二聚体Acr蛋白。
在本文中所呈现的数据证明了几种Acr与NmeCas9的直接结合，以及暗示Acr1Nm和Acr2Nm可以同时与NmeCas9相结合的数据。例如，将包含未加标签的、过表达的抗-CRISPR蛋白的大肠杆菌裂解物与单独的Ni-NTA树脂(-)或结合有加有6xHis标签的NmeCas9的Ni-NTA树脂(+)一起进行温育，并且通过SDS-PAGE以及随后的考马斯蓝染色来分析所得的洗脱级分。参见图16。通过使用与单独的Ni-NTA树脂(-)或结合有加有6xHis标签的NmeCas9的Ni-NTA树脂(+)相混合的经纯化的、未加标签的抗-CRISPR蛋白，也显示了Acr1Nm和Acr2Nm与NmeCas9之间的直接相互作用，其中输入和所得的洗脱级分通过经考马斯蓝染色的SDS-PAGE来进行分析。参见图17。
虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为包含Acr1Nm和Acr2Nm的活性结合位点的融合蛋白将会协同地起作用，以提供相比于从单独的Acr或作为分开的蛋白质同时进行使用的仅仅累加的功能将会预期到的而言经改善的基因编辑。这是因为Acr1Nm和Acr2Nm在本文中显示出同时与NmeCas9相结合。将结合有6xHis-NmeCas9的Ni-NTA树脂与经纯化的、未加标签的Acr2Nm，随后为Acr1Nm，一起进行温育，或者反过来。用NmeCas9洗脱的每种Acr的量没有降低，当NmeCas9与另一种Acr预结合时。参见图18。因此，该数据暗示，Acr1Nm和Acr2Nm不竞争结合NmeCas9，并且它们结合在NmeCas9蛋白上的不同的、非重叠的位点。虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为这些数据提出了Acr1Nm和Acr2Nm的组合将会相比于单独的任一种Acr而言对于NmeCas9活性具有协同效应这样的可能性。
C.Acr融合/加合蛋白
在一个实施方案中，本发明考虑了Acr融合蛋白。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含核定位序列。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含表位序列标签。在一个实施方案中，所述表位序列标签为FLAG(例如，DYKDDDDK)。
在本文中所呈现的数据证明，加有FLAG标签的Acr蛋白具有与没有FLAG标签的Acr蛋白相似的基因编辑抑制活性。例如，用阴性对照Acr88-32蛋白检定了加有FLAG标签的Acr蛋白的滴定。数据进一步证明了相似的活性，无论将FLAG标签附着至C-末端还是N-末端。例如，当附着在C-末端或N-末端处时，Acr1Bo的基因编辑是相似的。参见图11A和图11B。对于Acr1Nm、Acr2Nm和Acr3Nm显示了相似的数据。分别参见图12A/B、13A/B和14A/B。对这些数据进行了定量和总结。参见图15A-15D。
D.Acr经突变的蛋白
在一个实施方案中，本发明考虑了经突变的Acr蛋白。在一个实施方案中，所述Acr蛋白包含至少一个非野生型氨基酸残基。在一个实施方案中，所述Acr蛋白包含至少两个非野生型氨基酸残基。在一个实施方案中，所述Acr蛋白包含至少三个非野生型氨基酸残基。在一个实施方案中，所述非野生型氨基酸残基为AAWT→Ala突变。在一个实施方案中，所述非野生型氨基酸残基为Cys→Arg突变。在一个实施方案中，所述非野生型氨基酸残基为Phe→Ser突变。
III.使用II型Cas9抑制剂组合物的方法
在一个实施方案中，本发明考虑了用于控制Cas9基因组编辑和/或基因组结合的方法，其提供了对于Cas9活性的限制。在一个实施方案中，所述控制为对于Cas9活性持续时间的限制。在一个实施方案中，所述控制为对于Cas9活性效率的限制。在一个实施方案中，所述控制为对于Cas9活性空间范围的限制。在一个实施方案中，所述控制为对于Cas9活性组织特异性的限制。在一个实施方案中，所述控制为对于Cas9活性环境条件的限制。
A.生物学治疗法
在一个实施方案中，本发明考虑了用于治疗和/或预防疾病的方法。在一个实施方案中，所述疾病为哺乳动物疾病。在一个实施方案中，所述哺乳动物疾病为人疾病。在一个实施方案中，所述哺乳动物疾病为家畜疾病。在一个实施方案中，所述疾病为鸟类疾病。在一个实施方案中，所述疾病为农产品疾病。
1.脱靶效应的最小化
在一个实施方案中，本发明考虑了用于控制Cas9活性持续时间的方法。例如，可以将Cas9/sgRNA递送入细胞，允许其起作用经过根据经验显示出产生有效的中靶编辑的预先确定的持续时间，然后通过递送Acr蛋白来使其失活。
2.空间活性的控制
在一个实施方案中，本发明考虑了用于控制Cas9空间活性的方法，其提供具有至少两种组织或细胞类型特异性活性的Cas9和至少一种对于所述多种组织或细胞类型特异性活性中的至少一种来说选择性的Acr抑制剂。虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为通过Acr抑制剂的Cas9空间控制将会允许施用具有多种组织或细胞类型特异性活性的Cas9，其中同时施用对于不想要的组织/细胞类型活性来说选择性的Acr将会导致仅对于所选择的亚组的可能的细胞类型或组织的Cas9活性。
B.基因驱动器
在一个实施方案中，本发明考虑了用于控制基于Cas9的“基因驱动器”以便为了潜在地有益的目的而修饰整个生物体群体的基因组的方法。实例包括但不限于：i)防止在感染性疾病(疟疾、登革热等)的昆虫媒介中的基因散布；ii)防止一般群体担当病原体的宿主的能力；或iii)使特定群体变成具有低生育力或甚至不育。
但是，不受控的基因驱动器具有关于下述方面的潜力：在生态系统范围内的遗传修饰这样的负面的不期望的后果。抗-CRISPR蛋白可能可以用作“解毒剂”，其可以在负面的不期望的后果变得明显的情况下减缓“失控”基因驱动器的进一步散布。例如，如果将Cas9基因驱动改造入例如埃及伊蚊(Aedes aegypti)这种蚊子中，那么可以产生另一个表达Acr蛋白的埃及伊蚊群体，并且保持备用以便以后释放到相同的群体中，如果需要。该表达Acr的群体将会是基因驱动器抗性的。
IV.作为CRISPR-Cas9“关闭开关”的Acr蛋白
虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为CRISPR-Cas9技术将会通过在空间上、在时间上或在条件上抑制Cas9功能的能力而得到增强。如上面所讨论的，由噬菌体编码的小蛋白质已显示出抑制宿主细菌的CRISPR-Cas系统。这些“抗-CRISPR”对于不采用Cas9蛋白的I型CRISPR-Cas系统来说是特异性的。在一些实施方案中，本发明考虑了多种Cas9抑制剂。例如，在本文中所呈现的数据暗示了至少三个不同的抗-CRISPR蛋白家族，其特异性地抑制脑膜炎奈瑟氏球菌的CRISPR-Cas9系统。如所显示的，这些抗-CRISPR蛋白直接与脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9(NmeCas9)相结合，并且可以用作基因组编辑的强有力的抑制剂，例如在人细胞中。这些抗-CRISPR蛋白是首次已知的关于CRISPR-Cas9活性的“关闭开关”，并且它们提供了用于在真核生物中抑制CRISPR-Cas9基因组编辑的在遗传上可编码的手段。
在一个实施方案中，本发明考虑了用于临床治疗法的包括由CRISPR-Cas9介导的基因组编辑的方法。例如，Cas9是可以用指导RNA分子进行编程以切割几乎任何所希望的DNA序列的核酸酶(Gasiunas等人,2012；Jinek等人,2012)，从而使得在切割位点处的诱变或编辑成为可能(Cho等人,2013；Cong等人,2013；Hwang等人,2013；Jiang等人,2013；Jinek等人,2013；Mali等人,2013)。该RNA-指导的DNA编辑技术已被建议用于进行开发以提供个人化的基因疗法来纠正遗传疾病，用于病原体的序列特异性靶向以治疗感染性疾病，和许多其他应用(Bikard等人,2014；Ebina等人,2013；Gomaa等人,2014；Kaminski等人,2016；Ousterout等人,2015；Wu等人,2013；Yin等人,2014)。
虽然Cas9DNA靶向的效用被广为认可，但是目前存在有限的手段来在一旦Cas9活性被激活或递送时就施加对其的控制，这导致实际困难和安全性担忧(其在临床背景下是重要的)。例如，脱靶效应(在不期望的、近同族基因组位点处的切割和突变)通过过度的或延长的Cas9活性而加重(Fu等人,2014；Hsu等人,2013；Pattanayak等人,2013)。CRISPR-Cas9的许多潜在的治疗性应用要求在特定靶组织处的编辑。因此，在辅助组织中的旁侧Cas9活性在最好的情况下是无用的，而在最坏的情况下是一种安全风险。例如，当使用CRISPR Cas9组分的合子注射来产生突变型动物时，在最初几轮的有丝分裂后，Cas9活性可以引起嵌合基因型(Wang等人,2013；Yen等人,2014)。备选地，精确的Cas9基因编辑涉及依赖于同源性的修复(HDR)。因为HDR途径在细胞周期的G1期期间受到遏制，因而在G1期间的Cas9活性增加了不希望的不精确编辑的背景(Orthwein等人,2015)。最近，已开发了CRISPR-Cas9基因驱动器(见上)，部分地为了推进根除疾病媒介(例如，蚊子)的长期目标(Gantz等人,2015；Hammond等人,2016)。该方法的一个危险是：基因驱动器一旦被引入到环境中可能会难以约束，并且可能会具有不可预测的生态学后果。基于这些和其他考虑，如果可以更有效地控制Cas9活性，那么CRISPR-Cas9应用的性能和安全性可以大为改善。几个小组已经想出了响应于特定提示而激活CRISPR Cas9基因组编辑的方法，包括光可诱导的和药物可诱导的Cas9活性(Nihongaki等人,2015；Nunez等人,2016；Wright等人,2015)。但是，尚未鉴定出关于Cas9活性的稳健的、特异性的和在遗传上可编码的“关闭开关”。
在一个实施方案中，本发明考虑了源自细菌的II型CRISPR-Cas9适应性免疫系统的CRISPR-Cas9技术。在一个实施方案中，II型CRISPR-Cas9复合物可以靶向和破坏外来DNA实体例如噬菌体和质粒(Barrangou等人,2007；Deltcheva等人,2011)。虽然经常使用来自酿脓链球菌菌株SF370的Cas9直向同源物(SpyCas9，II-A亚型)，但是也已经调整了来自几个其他细菌物种的II型CRISPR-Cas系统用于真核生物基因组编辑(Makarova等人,2015；Cong等人,2013；Esvelt等人,2013；Hirano等人,2016；Hou等人,2013；Lee等人,2016；Muller等人,2016；Ran等人,2015)。例如，来自脑膜炎奈瑟氏球菌的Cas9(NmeCas9；II-C亚型)可以是用于人基因组编辑的有效工具(Makarova等人,2015；Esvelt等人,2013；Hou等人,2013；Lee等人,2016)。NmeCas9的一个优点是因为它倾向于脱靶效应(Esvelt等人,2013；Hou等人,2013；Lee等人,2016)。备选地，其中核酸酶活性位点残基已被突变的“死的”NmeCas9(dNmeCas9)也已经被证明是有效的、特异性的RNA-指导的基因组结合平台(Esvelt等人,2013；Hilton等人,2015；Kearns等人,2015；Ma等人,2015b)。类似地，dSpyCas9和其他核酸酶被失活的直向同源物在现在所公开的发明中也可以是有用的(Dominguez等人,2016；Wang等人,2016)。
A.脑膜炎奈瑟氏球菌抗-CRISPR蛋白
初步研究将抗-CRISPR(acr)基因的保守特征表征为编码推定的转录调节物的下游基因。例如，鉴定出了两个不同的具有螺旋-转角-螺旋(HTH)的家族，包括抗-CRISPR-相关的(Aca)蛋白，其在本文中被称为Aca1和Aca2。在多种多样的细菌物种中编码Aca蛋白的基因的鉴定也表现在五个其他家族的直接在aca基因上游所编码的I-F型acr基因中(Pawluk等人,2016)。
在一个实施方案中，本发明考虑了多个编码II型CRISPR-Cas系统的抑制剂的基因。在一个实施方案中，II型acr位于在携带II型系统的物种之内的MGE中的aca基因的上游。例如，在裸面小绢猴布拉克氏菌中的推定的抗-CRISPR基因编码具有91个残基的假设的蛋白质(登录号WP_028357638.1)，其直接位于aca2基因的上游。图19A。该推定的抗-CRISPR具有几个在多种多样的变形菌的MGE中所编码的直向同源物，和一个在马西利亚费诺利亚尔氏菌(Fenollaria massiliensis)这种厚壁菌中的远缘的、推定的直向同源物。图20。
数据暗示，在这些物种中最经常观察到的CRISPR-Cas系统的同源物为II-C型同源物。在一个实施方案中，本发明考虑了抑制一种或多种代表性II-C型Cas9直向同源物的活性的抗-CRISPR家族。
脑膜炎奈瑟氏球菌菌株8013包含有II-C型CRISPR-Cas系统(Zhang等人,2013；Zhang等人,2015)。进一步地，脑膜炎奈瑟氏球菌的菌株属于包含编码该推定的抗-CRISPR家族的成员的MGE的基因组。图19A、图20。因此，使用NmeCas9来建立关于II型Cas9抑制剂蛋白的原理证明。参见表1和表2。
表1：II型NmeCas9抑制剂蛋白的代表性的核苷酸和氨基酸序列
Figure BDA0001863228310000501
表2：关于II型NmeCas9抑制剂蛋白的详细说明
Figure BDA0001863228310000511
Figure BDA0001863228310000521
Figure BDA0001863228310000531
在其天然背景下测量来自裸面小绢猴布拉克氏菌和脑膜炎奈瑟氏球菌基因的候选II-C型抗-CRISPR蛋白对II-C型CRISPR-Cas活性进行抑制，其中使用先前所描述的在脑膜炎奈瑟氏球菌8013中的天然转化测定法。图19A；Zhang等人,2013；Zhang等人,2015。在该测定法中，将携带CRISPR-靶向的原间隔子序列的质粒的转化频率与缺乏原间隔子的对照质粒的转化频率进行比较。由脑膜炎奈瑟氏球菌cas9启动子来驱动野生型菌株，以及具有经整合的空nics(例如，奈瑟氏菌基因间互补位点(Neisseria intergeniccomplementation site))的同基因衍生物，和两种候选抗-CRISPR蛋白中的任一种。图19B。在野生型细胞和空载体对照中，稳健的II-C型CRISPR-Cas活性导致CRISPR-靶向的DNA的转化频率的≥104倍降低。引人注目的是，当使用被靶向的或未被靶向的DNA时，推定的抗-CRISPR蛋白的表达导致相等的转化频率，这反映了缺乏CRISPR干扰。图19C。
这些数据显示，脑膜炎奈瑟氏球菌的II-C型CRISPR-Cas系统被由至少两个推定的抗-CRISPR基因(其在本文中被命名为acrIIC1Boe和acrIIC1Nme)所编码的蛋白质抑制。虽然acrIIC1Boe据推测已进化为抑制在裸面小绢猴布拉克氏菌中所发现的Cas9直向同源物(BoeCas9)，但是NmeCas9与BoeCas9是47％同一的，这暗示该相似性足以解释所观察到的跨物种抑制。对于大多数的情况，上面所鉴定的acrIIC1直向同源物(除了acrIIC1Boe)未被发现与aca1或aca2基因相邻，而是在编码不同的包含HTH的蛋白质的基因上游被编码。图19、图20。
在一个实施方案中，本发明考虑了编码多种抗-CRISPR蛋白的多个aca基因。例如，克隆了两个不同的基因，其位于紧接在候选aca3基因上游的推定的脑膜炎奈瑟氏球菌原噬菌体中。这些基因还展现出稳健的抗-CRISPR活性，并且在本文中被称为acrIIC2Nme和acrIIC3Nme。图19B和19C；表1和表2。这些结果证明了针对II型CRISPR-Cas系统具有活性的抗-CRISPR基因的存在。
B.II-C型抗-CRISPR蛋白与NmeCas9的直接相互作用
通过将经纯化的、未加标签的抗-CRISPR蛋白与经纯化的、加有6xHis标签的NmeCas9蛋白(预加载有共表达的sgRNA)相混合并且进行镍亲和色谱法以评估所述抗-CRISPR蛋白是否在体外直接结合NmeCas9，来测定II-C型CRISPR蛋白与NmeCas9的直接相互作用。发现AcrIIC1Nme、AcrIIC2Nme和AcrIIC3Nme都保留在镍柱上，这反映了与NmeCas9的缔合。相反地，先前鉴定出的I型抗-CRISPR蛋白(AcrE2；(Pawluk等人,2014))不与NmeCas9相缔合，并且所述抗-CRISPR蛋白不显著地与AnaCas9相结合。图21B和22。AnaCas9是关系较远的II-C型Cas9同源物(与NmeCas9具有～20％序列同一性)。Jinek等人,2014；Ma等人,2015a。这些数据证明，在本文中所公开的抗-CRISPR蛋白与NmeCas9特异性地相结合。
为了评估所述抗-CRISPR蛋白对于Cas9酶促活性的效应，进行体外DNA切割测定法(Zhang等人,2015)。当给经纯化的NmeCas9加载在体外转录出的sgRNA并且然后与靶DNA相混合时，观察到稳健且特异性的切割。图23。切割没有受到在前的NmeCas9与数量渐增的对照(I型特异性抗-CRISPR，AcrE2)的温育的影响。与此相反，向这些反应体系添加脑膜炎奈瑟氏球菌抗-CRISPR蛋白导致以剂量依赖性的方式抑制由NmeCas9所催化的切割。当以1:1的摩尔比添加抗-CRISPR蛋白时，产生大约50％的切割抑制，和在5:1的抗-CRISPR:NmeCas9比例下看到完全的抑制。图23。酿脓链球菌Cas9(SpyCas9)(其是用于基因组编辑的最经常使用的Cas9)的DNA切割活性没有受到添加任何所述抗-CRISPR蛋白的影响(图23，下图版)。该结果是所预期的，因为SpyCas9属于II-A型CRISPR-Cas类型并且与NmeCas9关系非常远。总的来说，这些体外数据清楚地证明，这些抗-CRISPR蛋白直接与NmeCas9相结合并且特异性地抑制NmeCas9的DNA切割活性。抗-CRISPR蛋白对于以其加载有sgRNA的形式的NmeCas9的抑制效应暗示，所述抗-CRISPR蛋白的天然保护功能需要在噬菌体感染的时候抑制已经存在于宿主细胞中的加载有crRNA/tracrRNA的NmeCas9。
C.抗-CRISPR蛋白抑制NmeCas9基因组编辑
在一个实施方案中，本发明考虑了NmeCas9活性的多种直接抗-CRISPR蛋白抑制剂，其是对于在哺乳动物细胞中的CRISPR-Cas9基因组编辑的关闭开关。例如，用三种质粒共转染HEK293T细胞：一种表达NmeCas9，一种表达靶向基因组的sgRNA，和一种表达抗-CRISPR。通过使用已建立的基于T7核酸内切酶1(T7E1)的实验方案来测定基因组编辑效率。引人注目的是，发现所述抗-CRISPR蛋白中的每一种均大大降低了NmeCas9在培养的人细胞中产生基因组损伤的能力。图24、图25、图26和表3。
表3：用于转录靶向几个人基因组位点的sgRNA的模板
Figure BDA0001863228310000561
在一个实施方案中，本发明考虑了小于大约14kDa的抗-CRISPR蛋白。虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为这些抗-CRISPR蛋白小到足以通过核孔自由地扩散，从而它们可以抑制NmeCas9基因组编辑，即使没有附加的异源核定位序列(NLS)。
这些质粒滴定实验证明，至少三个抗-CRISPR家族可以完全抑制II型Cas9基因编辑(例如，100％抑制)，其中AcrIIC3Nme看起来是最强有力的。但是，基因编辑被抑制至少70％，优选地75％，和最优选地90％或更多。图26。在哺乳动物细胞中AcrIIC3Nme抗-CRISPR活性的优异的效能是值得注意的，鉴于它在抑制脑膜炎球菌细胞中的转化干扰方面稍微不太有效。图19C。在哺乳动物细胞中这些抗-CRISPR蛋白的活性的变化可能是由于表达或稳定性的差异，因为它们在体外均展现出相似的抑制活性。图23。与其他体外结果相一致，所述抗-CRISPR蛋白对于靶向相同基因组位点的由SpyCas9介导的编辑没有效应。图24和25。另外，在这些实验中的任何一个之中，I-E型抗-CRISPR AcrE2没有显著的抑制效应。在任何情况下，用任何抗-CRISPR蛋白均未观察到任何细胞毒性的迹象。在一个实施方案中，本发明考虑了多种借助于抑制来精确地控制由Cas9介导的基因组编辑的抗-CRISPR蛋白。
D.AcrIIC3Nme阻止dNmeCas9基因组结合
“死的”Cas9(dCas9)直向同源物(包括dNmeCas9)已被报道对于RNA-指导的DNA结合是有用的，而没有由Cas9催化的DNA切割。Esvelt等人,2013；Hilton等人,2015；228Kearns等人,2015；Ma等人,2015b。虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为dCas9蛋白具有宽范围的结构域和官能度，其可以融合或栓束至DNA-结合的dCas9/sgRNA复合物。Dominguez等人,2016；Wang等人,2016。
如上面所显示的，sgRNA-指导的NmeCas9 DNA切割和基因组编辑的抗-CRISPR抑制可以反映在稳定的R-环形成上游的抑制，或者在稳定的R-环形成之后NmeCas9催化激活的抑制。图23和24。在前一种情况下，抗-CRISPR可以用作关闭开关，不仅对于基因组编辑，而且还对于dNmeCas9 DNA结合应用例如CRISPRi和CRISPRa。Dominguez等人,2016；Wang等人,2016。
为了测定基因组编辑抑制剂(例如，AcrIIC3Nme)是否可以在哺乳动物细胞中阻止由dNmeCas9进行的稳定DNA结合，使用了先前开发的系统，其中在将它们的表达质粒共转染到U2OS细胞中后通过同族sgRNA将经superfolder(sf)GFP标记的dNmeCas9和经mCherry标记的dSpyCas9同时共定位于端粒座位。图27A；Ma等人,2015b。观察到端粒dNmeCas9-(sfGFP)3和dSpyCas9-(mCherry)3灶的共定位，只要这两种由端粒指导的sgRNA都被包括在内作为所述两种dCas9直向同源物。图27B-D。还测试了共转染的、也携带抗-CRISPR表达盒的、经mTagBFP2标记的质粒。图27A，下面。AcrE2对于dNmeCas9-(sfGFP)3和dSpyCas9-(mCherry)3的端粒共定位没有效应。图27E。与此相反，AcrIIC3Nme的共表达阻止了dNmeCas9-(sfGFP)3与dSpyCas9-(mCherry)3端粒灶的共定位。图27F。
在任何Acr蛋白不存在下在94％(33个中的31个)的细胞中，和在阴性对照AcrE2蛋白存在下在88％(37个中的31个)的细胞中，观察到端粒dNmeCas9-(sfGFP)3灶。相反地，当共表达AcrIIC3Nme时，0％的细胞(46个中的0个)展示出dNmeCas9-(sfGFP)3端粒灶。这些结果确证了AcrIIC3Nme对于由dNmeCas9进行的稳定的、经sgRNA编程的DNA结合的稳健的抑制效应，并且表明它们可以用作强有力的关闭开关，不仅对于NmeCas9基因组编辑，而且还对于在哺乳动物细胞中的基于dNmeCas9的应用。
E.通过抗-CRISPR蛋白的II-C型CRISPR-Cas9的整体抑制
可以将CRISPR-Cas系统分为至少两个宽的类别，每个包括几个类型和许多亚型。例如1类系统采用多亚基监视复合物，而2类系统具有单一的、大的效应子蛋白例如Cas9。Makarova等人,2015；图28/6A。关于作用于I型系统(即，例如属于1类)的抗-CRISPR蛋白的初步数据暗示，每种抗-CRISPR蛋白作用于在一个亚型内的特定范围的系统，这是由于抗-CRISPR与Cas蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用的特异性。Bondy-Denomy等人,2015；Bondy-Denomy等人,2013；Pawluk等人,2014；Pawluk等人,2016。虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为如果抗-CRISPR基因抑制在其中发现了它的细菌的CRISPR-Cas系统，那么它可能将会被选择，因为这些基因几乎总是位于已成功侵入宿主的MGE上。该信条被用于准确地预测，在本文中所描述的一些抗-CRISPR蛋白可以阻断脑膜炎奈瑟氏球菌的II-C型CRISPR-Cas系统。抗-CRISPR活性对于II型CRISPR-Cas系统的潜在的总体影响可以通过使用Cas9的系统发生树来进行可视化，所述系统发生树显示了它们作为II-C型抗-CRISPR蛋白的直接结合靶标的关系。图28B。将其中编码了已知的II-C型抗-CRISPR同源物的细菌类群以红色指出。从该分析中，基于由抗-CRISPR直向同源物所跨越的系统发生宽度，可以提出，多于一半的II-C型CRISPR-Cas系统可以是易受在本文中所公开的抗-CRISPR家族中的三个的影响的。这些数据与I-F型CRISPR-Cas系统和其同族抗-CRISPR蛋白的初步研究相组合地暗示，即使迄今所发现的相对较少数目的抗-CRISPR基因家族也可以对于在细菌中的CRISPR-Cas系统具有广泛的影响。由于抗-CRISPR蛋白已被报道抑制1类和2类CRISPR-Cas系统两者，因而在本文中所描述的方法将会被预期能够鉴定另外的抗-CRISPR蛋白，其可能能够抑制所有类型和亚型的CRISPR-Cas系统。
在本文中所呈现的数据首次描述了三个不同的II-C型抗-CRISPR蛋白家族的存在。在一个实施方案中，本发明考虑了在培养的人细胞中阻断由NmeCas9进行的基因组编辑的抗-CRISPR蛋白。虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为在遗传上经编码的Cas9抑制剂提供了用于在空间上、在时间上或在条件上控制Cas9活性的手段，由此潜在地允许基因组编辑的组织特异性的、细胞周期阶段特异性的、发育阶段特异性的或刺激特异性的失活。
通常认为，当考虑基因疗法的临床CRISPR-Cas9应用时，靶位点精确度和组织特异性发挥作用，其中延长的或错误表达的核酸酶活性可以加重不希望的脱靶效应。在一个实施方案中，本发明考虑了有效的Cas9关闭开关，其通过使得能够在无论何时或无论何处不想要编辑活性时使抗-CRISPR蛋白进行积聚的表达或递送策略来改善脱靶效应。在一个实施方案中，本发明考虑了这样的方法，其包括抗-CRISPR蛋白用于调节具有CRISPR-Cas9的基因驱动器以力促所希望的等位基因的遗传(例如，在昆虫群体中)，具有起作用的“关闭开关”可以提供有用的安全或牵制措施以避开不期望的不利后果。
在本文中所呈现的数据还显示，抗-CRISPR蛋白可以直接与NmeCas9/sgRNA复合物相结合，并且抑制体外DNA切割。鉴于这些抗-CRISPR蛋白的完全不相关的序列，可以预期到所述抗-CRISPR蛋白可以通过不同的机制来取消活性。该机制是先前所报道的I-F型抗-CRISPR蛋白的情况。Bondy-Denomy等人,2015。由于数据已确定AcrIIC3Nme在哺乳动物细胞中阻止加载有sgRNA的dNmeCas9的稳定的基因组定位，因而这些蛋白质可以用作对于基于dNmeCas9的应用的关闭开关。备选地，仍然可能的是，其他抗-CRISPR蛋白可能允许NmeCas9DNA结合活性但阻止催化激活。如果如此，那么该机制将会有效地产生NmeCas9复合物，其具有用于调节转录的效用，这与I-F型抗-CRISPR蛋白相似。Dominguez等人,2016；Wang等人,2016；Bondy-Denomy等人,2015。
应当注意的是，CRISPR-Cas系统存在于大约一半的经测序的原核生物基因组中，并且是跨多种多样的细菌和古细菌谱系广泛分布的。与在许多基因组中几种不同的CRISPR-Cas系统类型的共出现相组合地，CRISPR-Cas系统中的极度多样性和对于CRISPR-Cas系统的纯化选择压力指示了在原核生物和寄生性MGE之间的动态的共进化式生存斗争。Makarova等人,2015；Takeuchi等人,2012。预期CRISPR-Cas系统对于水平基因转移的过程造成明显的挑战，尤其是鉴于其获得针对新遇到的威胁的可遗传的免疫性和通过新间隔子获取来升级其武器库的能力。Barrangou等人,2007；Fineran等人,2014；Richter等人,2014。但是，最近的研究已显示，CRISPR Cas系统的存在与在进化时间尺度上较低的HGT水平或者与较低数目的所获取的原噬菌体元件并不相关。Gophna等人,2015；Touchon等人,2016。我们提出，广泛分布的由MGE编码的抗-CRISPR蛋白可以调和该悖论。此外，从进化的角度，要注意的是，来自II-A型系统的Cas9不仅对于现有间隔子的干扰功能，而且对于新间隔子的适应性获取都发挥作用。Heler等人,2015；Wei等人,2015。如果II-A型Cas9的该适应作用扩展至II-C型系统(如看起来可能的那样)，那么Cas9-缔合性抗-CRISPR蛋白可以响应于正在进行的侵袭而阻止新间隔子的获取。
最近的体外进化研究显示，关于噬菌体逃避由CRISPR338介导的消灭的唯一途径是通过表达抗-CRISPR基因(van Houte等人,2016)。与红皇后理论(Red Queen theory)强烈一致，已报道总共十七个不同的抗-CRISPR蛋白家族在变形菌中广泛分布，它们每一个抑制I-E、I-F或II-C型系统。Bondy-Denomy等人,2013；Pawluk等人,2014；Pawluk等人,2016。抗-CRISPR蛋白已进化成抑制1类和2类CRISPR-Cas系统两者这一事实强烈地暗示，对于其他CRISPR-Cas类型它们也存在。图28A。可以使人想到，抗-CRISPR活性可以对于横跨原核生物的CRISPR-Cas系统和对于水平基因转移具有大的影响。
V.试剂盒
在一个实施方案中，本发明考虑了包含Acr蛋白的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒可以用于生物学治疗法。在一个实施方案中，所述试剂盒可以用于基因驱动器。在一个实施方案中，所述试剂盒可以用于细胞系操作。在一个实施方案中，所述试剂盒可以用于药物靶标验证。
VI.药用制剂
本发明进一步提供了药用组合物(例如，包含上面所描述的化合物)。本发明的药用组合物可以以许多方式进行施用，这取决于希望局部还是全身治疗以及待治疗的面积。施用可以是表面的(包括眼的和向粘膜的，包括阴道和直肠递送)、肺的(例如，通过吸入或吹入粉剂或气雾剂，包括用喷雾器；气管内的、鼻内的、表皮的和透皮的)、口服的或肠胃外的。肠胃外施用包括静脉内的、动脉内的、皮下的、腹膜内的或肌内的注射或输注；或者颅内的，例如鞘内的或心室内的施用。
用于表面施用的药用组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规的药用承载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等可以是需要的或所希望的。
用于口服施用的组合物和制剂包括粉剂或颗粒剂、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、囊剂或片剂。增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是所希望的。
用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可以包括无菌水性溶液，其还可以包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂，例如但不限于渗透增强剂、承载体化合物和其他在药学上可接受的承载体或赋形剂。
本发明的药用组合物包括但不限于溶液、乳状液和包含脂质体的制剂。这些组合物可以从各种各样的组分来产生，包括但不限于预制液体、自乳化固体和自乳化半固体。
本发明的药用制剂(其可以方便地以单位剂量形式存在)可以按照在制药工业中众所周知的常规技术来制备。此类技术包括将活性成分与药用承载体或赋形剂相联合的步骤。一般地，通过下述方式来制备制剂：将活性成分与液体承载体或细碎的固体承载体或者两者均匀且紧密地相联合，和然后，如果需要，使产品成形。
本发明的组合物可以被配制成许多可能的剂型中的任何一种，例如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆剂、软凝胶剂、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可以被配制为在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液的粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或右旋糖酐。所述悬浮液还可以包含稳定剂。
在本发明的一个实施方案中，可以将所述药用组合物作为泡沫来进行配制和使用。药用泡沫包括诸如但不限于乳状液、微乳状液、霜剂、胶冻剂和脂质体的制剂。尽管在性质上基本上相似，但是这些制剂在最终产品的组分和稠度方面变动。
还可以向本发明的药用和其他组合物添加在细胞水平上增强寡核苷酸的摄取的试剂。例如，阳离子脂质，例如lipofectin(美国专利号5,705,188)，阳离子甘油衍生物，和聚阳离子分子，例如聚赖氨酸(WO 97/30731)，也增强寡核苷酸的细胞摄取。
本发明的组合物另外还可以包含其他在药用组合物中常规发现的辅助组分。因此，例如，所述组合物可以包含额外的、相容的、在药学上具有活性的材料，例如止痒药、收敛药、局部麻醉药或抗炎试剂，或者可以包含额外的在以物理方式配制本发明的组合物的各种剂型中有用的材料，例如染料、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。但是，当添加时，此类材料不应当不适当地干扰本发明的组合物的组分的生物学活性。可以将所述制剂进行灭菌，和如果希望，与不有害地与该制剂的核酸相互作用的辅助试剂(例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等)相混合。
按剂量给药取决于待治疗的疾病状态的严重度和应答性，其中治疗过程持续几天至几个月，或者直至实现治愈或达到疾病状态的减轻。最佳的按剂量给药时间表可以从在患者身体中药物积累的测量结果来进行计算。给药医师可以容易地确定最佳剂量、按剂量给药方法和重复率。最佳剂量可以取决于独个寡核苷酸的相对效能而变动，并且通常可以基于在体外和体内动物模型中被发现有效的EC50或基于在本文中所描述的实施例来进行估计。一般地，剂量为0.01μg至100g/kg体重，并且可以每日、每周、每月或每年给予一次或多次。治疗医师可以基于所测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度来估计用于按剂量给药的重复率。在成功的治疗之后，可以希望让受试者经历维持疗法以防止疾病状态的复发，其中所述化合物以在0.01μg至100g/kg体重的范围内变化的维持剂量进行施用，每日一次或多次至每20年一次。
VI.组合物递送系统
本发明考虑了几种组合物递送系统，其提供大致均匀的分布，具有其组分(例如载体、蛋白质、核酸、药物等)的可控的释放速率。下面描述了在产生组合物递送系统中有用的各种各样的不同介质。并不意在任何一种介质或承载体对于本发明是限制性的。注意，可以将任何介质或承载体与另一种介质或承载体相组合，例如，在一个实施方案中，可以将附着至化合物的聚合物微颗粒承载体与凝胶介质相组合。
本发明所考虑的承载体或介质包含从包括下列各项的组中选择的材料：明胶、胶原、纤维素酯、硫酸右旋糖酐、多硫酸戊聚糖、几丁质、糖、白蛋白、纤维蛋白密封剂、合成聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧乙烷、聚环氧丙烷、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的嵌段聚合物、聚乙二醇、丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯(包括但不限于甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚原酸酯、氰基丙烯酸酯、明胶-雷琐酚-醛型生物粘合剂、聚丙烯酸以及其共聚物和嵌段共聚物。
本发明的一个实施方案考虑了包含在本文中所描述的治疗试剂的组合物递送系统。
微颗粒
本发明的一个实施方案考虑了包含微颗粒的介质。优选地，微颗粒包括脂质体、纳米颗粒、微球、纳米球、微胶囊和纳米胶囊。优选地，本发明所考虑的一些微颗粒包含聚丙交酯-乙交酯共聚物、脂肪族聚酯(包括但不限于，聚乙醇酸和聚乳酸)、透明质酸、改性多糖、壳聚糖、纤维素、右旋糖酐、聚氨酯、聚丙烯酸、假聚氨基酸、聚羟基丁酸酯相关共聚物、聚酐、聚甲基丙烯酸甲酯、聚环氧乙烷、卵磷脂和磷脂。
脂质体
本发明的一个实施方案考虑了能够附着和释放在本文中所描述的治疗试剂的脂质体。脂质体是由两亲性分子例如磷脂制成的环绕水性核心的微小球状脂质双层。例如，脂质体可以在磷脂胶束的疏水性尾部之间捕集治疗试剂。可以将水可溶性试剂包载在核心中，和可以将脂溶性试剂溶解在壳样双层中。脂质体具有特殊的特性，因为它们使得水溶性和水不溶性化学品能够在介质中一起使用而不使用表面活性剂或其他乳化剂。脂质体可以通过在水性介质中强力地混合磷脂而自发地形成。将水溶性化合物溶解在能够使磷脂水合的水性溶液中。因此，在形成脂质体后，这些化合物被捕集在水性脂质体中心内。脂质体壁(其是磷脂膜)容纳脂溶性材料例如油。脂质体提供所掺入的化合物的受控释放。另外，脂质体可以用水溶性聚合物例如聚乙二醇进行包覆，以增加药物代谢动力学半寿期。本发明的一个实施方案考虑了超高剪切技术以精细化脂质体产生，从而导致具有经特别地设计的结构特征的、稳定的、单层的(单个层)脂质体。脂质体的这些独特的特性允许通常不混溶的化合物的同时贮存和其受控释放的能力。
在一些实施方案中，本发明考虑了阳离子和阴离子脂质体，以及具有中性脂质的脂质体。优选地，阳离子脂质体包含带负电荷的材料，通过将所述材料与脂肪酸脂质体组分相混合并允许它们电荷联合。明显地，阳离子或阴离子脂质体的选择取决于所希望的最终脂质体混合物的pH。阳离子脂质体的实例包括lipofectin、lipofectamine和lipofectace。
本发明的一个实施方案考虑了包含提供至少一种治疗试剂的受控释放的脂质体的介质。优选地，能够进行受控释放的脂质体：i)是生物可降解的和非毒性的；ii)携带水溶性和油溶性化合物；iii)使顽固的化合物增溶；iv)防止化合物氧化；v)促进蛋白质稳定化；vi)控制水合；vii)通过双层组成的变化(例如但不限于，脂肪酸长度，脂肪酸脂质组成，饱和与不饱和脂肪酸的相对量，物理构造)来控制化合物释放；viii)具有溶剂依赖性；iv)具有pH-依赖性；和x)具有温度依赖性。
脂质体的组合物大致被归类为两类。常规的脂质体通常是经稳定化的天然卵磷脂(PC)的混合物，其可以包含合成的相同链磷脂(其可以包含或不包含糖脂)。特殊的脂质体可以包含：i)双极性脂肪酸；ii)附着用于组织靶向疗法的抗体的能力；iii)用诸如但不限于脂蛋白和碳水化合物的材料进行包覆；iv)多重包囊；和v)乳状液相容性。
脂质体可以在实验室中通过诸如但不限于超声处理和振荡的方法容易地制备。备选地，化合物递送脂质体是商购可得的。例如，已知Collaborative Laboratories,Inc.制造用于特殊递送要求的定制设计的脂质体。
微球、微颗粒和微胶囊
微球和微胶囊由于其保持通常均匀的分布的能力而是有用的，提供稳定的受控化合物释放，并且对于生产和分配是经济的。优选地，经联合的递送凝胶或经化合物浸渍的凝胶是清澈的，或者备选地，所述凝胶是有色的以便医务人员容易看见。
微球是商购可得的(
Figure BDA0001863228310000661
Alkerme's:Cambridge,Mass.)。例如，将经冷冻干燥的包含至少一种治疗试剂的介质在合适的溶剂中均质化，并进行喷雾，以制造在20至90μm的范围内的微球。然后，接着为在纯化、包囊和贮存阶段期间保持持续的释放完整性的技术。Scott等人,Improving Protein Therapeutics With Sustained ReleaseFormulations,Nature Biotechnology,第16卷:153-157(1998)。
通过使用生物可降解聚合物来对微球组成进行修饰可以提供控制治疗试剂释放速率的能力。Miller等人,Degradation Rates of Oral Resorbable Implants{Polylactates and Polyglycolates:Rate Modification and Changes in PLA/PGACopolymer Ratios,J.Biomed.Mater.Res.,Vol.II:711-719(1977)。
备选地，持续或受控释放微球制备物通过使用水中干燥方法来进行制备，其中首先制备生物可降解聚合物金属盐的有机溶剂溶液。随后，向所述生物可降解聚合物金属盐溶液添加经溶解或分散的治疗试剂介质。治疗试剂与生物可降解聚合物金属盐的重量比可以例如为大约1:100000至大约1:1，优选地大约1:20000至大约1:500，和更优选地大约1:10000至大约1:500。接下来，将包含生物可降解聚合物金属盐和治疗试剂的有机溶剂溶液倾倒入水相中以制备油/水乳状液。然后，将油相中的溶剂蒸发掉以提供微球。最后，然后将这些微球收回，洗涤，并冻干。此后，可以将所述微球在减低的压力下进行加热以去除残留的水和有机溶剂。
其他在产生与生物可降解聚合物金属盐和治疗试剂混合物相容的微球中有用的方法为：i)在逐渐添加凝聚剂过程中的相分离；ii)水中干燥法或相分离法，其中添加防絮凝剂以防止颗粒附聚；和iii)通过喷雾干燥法。
在一个实施方案中，本发明考虑了这样的介质，其包含能够递送治疗试剂的受控释放经过大约1天至6个月的持续时间的微球或微胶囊。在一个实施方案中，所述微球或微颗粒可以是有色的，以允许执业医生能够在分配它时清楚地看到该介质。在另一个实施方案中，所述微球或微胶囊可以是清澈的。在另一个实施方案中，所述微球或微颗粒用不透射线的荧光检查法染料进行浸渍。
受控释放微胶囊可以通过使用已知的包囊技术例如离心挤出、锅包覆和空气悬浮来产生。可以改造此类微球和/或微胶囊以取得所希望的释放速率。例如，
Figure BDA0001863228310000671
(Macromed)是一种受控释放微球系统。这些特定的微球是以在5-500μm的范围内变化的一致大小可得的，并且由生物相容的且生物可降解的聚合物组成。微球的特别的聚合物组成可以控制治疗试剂释放速率，从而定制设计的微球是可能的，包括突释效应的有效管理。
Figure BDA0001863228310000672
(Epic Therapeutics,Inc.)是一种蛋白质-基质递送系统。该系统在性质上是水性的，并且可适应于标准药学递送模型。特别地，
Figure BDA0001863228310000673
是递送小分子和大分子药物两者的生物可蚀解的蛋白质微球，并且可以在微球大小和所希望的释放特征这两方面进行定制。
在一个实施方案中，微球或微颗粒包含在比内肠系膜的pH小的pH下稳定的pH敏感型包囊材料。内肠系膜中的典型范围为pH 7.6至pH 7.2。因此，所述微胶囊应当被维持在小于7的pH下。但是，如果预期到pH可变性，那么可以基于对于溶解所述微胶囊来说所需要的不同pH标准来选择所述pH敏感型材料。因此，将会就其中希望发生溶解的pH环境来选择所包囊的化合物，并且将其贮存在经预先选择以保持稳定性的pH中。作为包囊剂有用的pH敏感型材料的实例为
Figure BDA0001863228310000674
L-100或S-100(Rohm GMBH)、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、乙酸邻苯二甲酸纤维素和乙酸偏苯三酸纤维素。在一个实施方案中，脂质构成微胶囊的内包覆层。在这些组合物中，这些脂质可以为但不限于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯，和可食用脂肪例如甘油三酯。Lew C.W.,Controlled-Release pH Sensitive Capsule And Adhesive System And Method.美国专利号5,364,634(其通过提及而合并入本文)。
在一个实施方案中，本发明考虑了包含明胶或其他具有与明胶相似的电荷密度的聚合阳离子(即聚-L-赖氨酸)的微颗粒，并且将其作为复合物进行使用以形成初级微颗粒。初级微颗粒以具有下列组成的混合物来产生：i)明胶(60布卢姆，A型，来自猪皮)，ii)4-硫酸软骨素(0.005％-0.1％)，iii)戊二醛(25％，1级)，和iv)盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(盐酸EDC)，和超纯蔗糖(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)。不认为明胶的来源是关键性的；它可以来自牛、猪、人或其他动物来源。典型地，所述聚合阳离子在19,000-30,000道尔顿之间。然后，向该复合物添加硫酸软骨素，其中以硫酸钠或乙醇作为凝聚剂。
在微颗粒形成后，将治疗试剂直接结合至微颗粒的表面或者通过“桥”或“间隔体”间接地附着。明胶赖氨酸基团的氨基基团容易被衍生化以提供用于直接偶联化合物的位点。备选地，间隔体(即，靶向性配体上的连接分子和衍生化部分)例如抗生物素蛋白-生物素对于间接地将靶向性配体偶联至微颗粒来说也是有用的。微颗粒的稳定性通过由盐酸EDC所诱导的戊二醛-间隔体交联的量来进行控制。受控释放介质也通过戊二醛-间隔体交联的最终密度依据经验来确定。
在一个实施方案中，本发明考虑了通过使包含纤维蛋白原或凝血酶的组合物与治疗试剂一起进行喷雾干燥而形成的微颗粒。优选地，这些微颗粒是可溶的，并且所选择的蛋白质(即纤维蛋白原或凝血酶)产生所述微颗粒的壁。因此，治疗试剂被掺入到所述微颗粒的蛋白质壁之内和之间。Heath等人,Microparticles And Their Use In Wound Therapy.美国专利号6,113,948(其通过提及而合并入本文)。在向活组织施加所述微颗粒后，随后的在纤维蛋白原和凝血酶之间的反应产生组织密封剂，由此将所掺入的化合物释放入紧邻的周围区域中。
本领域技术人员将会理解，微球的形状不需要是精确地球形的；仅作为能够被喷雾或散布入外科手术位点(即，开放的或封闭的)之中或之上的非常小的颗粒。在一个实施方案中，微颗粒由从由下列各项组成的组中选择的生物相容的和/或生物可降解的材料构成：聚丙交酯、聚乙交酯和丙交酯/乙交酯的共聚物(PLGA)，透明质酸，改性多糖，和任何其他众所周知的材料。
VII.噬菌体疗法
在一个实施方案中，本发明考虑了包含噬菌体基因、II型Cas9/sgRNA基因复合物和编码Acr蛋白的基因的组合物。在一个实施方案中，本发明考虑了这样的方法，其包括：a)提供：i)包含细菌感染的患者，其中所述细菌包含CRISPR-Cas9系统；和ii)包含编码Acr蛋白的基因的噬菌体；b)向所述患者施用所述噬菌体，从而使得所述噬菌体接触所述细菌；c)在所述Acr基因进行表达的条件下用所述Acr基因注射所述细菌；和d)用所述经表达的Acr基因来抑制所述细菌CRISPR-Cas9系统。在一个实施方案中，所述噬菌体进一步包含CRISPR-Cas9基因复合物，其包含能够与细菌基因靶位点相结合的sgRNA序列。在一个实施方案中，所述噬菌体CRISPR-Cas9基因复合物在所述细菌中进行表达并且编辑所述细菌基因。
虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为一些细菌具有将会使噬菌体失活的CRISPR-Cas系统，因此使得常规的噬菌体疗法极为无效。在一个实施方案中，所述方法进一步包括施用Acr蛋白以抑制细菌CRISPR-Cas系统，由此允许生产性噬菌体感染，和随后的细菌感染症状的减轻。值得注意的是，脑膜炎奈瑟氏球菌和密切相关的淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)是人病原体，对其来说噬菌体疗法可以是极为有用的，因为它们快速地获得抗生素抗性。
在一个实施方案中，本发明考虑了在哺乳动物细胞上的噬菌体疗法的方法。噬菌体疗法或病毒噬菌体疗法是噬菌体用于治疗病原体感染的治疗性用途。噬菌体疗法在人类医学以及牙医学、兽医科学和农业中具有许多潜在的应用。如果噬菌体疗法治疗的靶宿主不是动物，那么通常采用术语“生物防治”(如在“细菌的由噬菌体介导的生物防治”中)，而不是“噬菌体疗法”。
虽然关于噬菌体的天然宿主是细菌，但是越来越多的数据显示噬菌体也可以与一些哺乳动物细胞群体，尤其是与免疫系统细胞相互作用。一般而言，这些相互作用包括两个主要方面。第一个是噬菌体免疫原性，即噬菌体诱导特异性免疫应答(特别是针对噬菌体抗原的特异性抗体的产生)的能力。另一个方面包括噬菌体的免疫调节活性，即噬菌体对于在先天和适应性免疫应答两者中所牵涉的主要免疫细胞群体的不同功能的非特异性效应。这些功能尤其包括吞噬细胞的吞噬作用和突发性呼吸，细胞因子的产生，和针对非噬菌体抗原的抗体的产生。本章节的目标是讨论噬菌体与免疫系统细胞之间的相互作用，以及它们对于噬菌体疗法的隐含意义。这些话题是基于实验研究的结果和关于在用噬菌体制备物进行治疗的具有细菌感染的患者中所发现的免疫调节效应的独特数据而提出的。Górski等人,“Phage as a modulator of immune responses:practical implications for phagetherapy”,Adv Virus Res.2012；83:41-71。
噬菌体T4是具有熟知的遗传学、结构和生物学的病毒。诸如X-射线晶体学、冷冻EM和三维(3D)图像重构的技术允许非常精确地描述其结构。该噬菌体的基因组已完全得到测序，这打开了关于使用许多分子技术例如位点特异性诱变(其被广泛应用于例如探究一些必需的T4蛋白质的功能)的途径。噬菌体展示方法(其通常被应用于噬菌体修饰)被成功地用于在T4的衣壳平台上展示抗原(PorA蛋白，vvIBDV的VP2蛋白，以及炭疽和HIV的抗原)。如最初的研究所显示的，噬菌体展示系统以及位点特异性诱变也可以用于修饰噬菌体颗粒与哺乳动物细胞之间的相互作用，或者用于获得感染除了宿主细菌之外的其他物种的噬菌体。这些尤其可以用在不断发展的噬菌体疗法中。该大众化的噬菌体的所有操作可以使得能够发展疫苗技术、噬菌体疗法以及生物学和医学科学的其他分支。Kurzepa等人,“Molecular modification of T4bacteriophage proteins and its potentialapplication-review”Folia Microbiol(Praha).2009；54(1):5-15.Epub 2009Mar 29。
噬菌体是感染细菌的病毒并且缺乏感染哺乳动物细胞的能力，但是有希望成为新的发散性治疗方法。噬菌体系统的巨大的多功能性已导致开发出经改善的噬菌体递送载体。基于多重噬菌体和其他药学治疗的联合疗法具有很大的前景。潜在的治疗性噬菌体疗法产生自其缺乏对于哺乳动物细胞的天然向性，从而不导致副作用。Sohrab等人,“Bacteriophage--a common divergent therapeutic approach for Alzheimer'sdisease and type II diabetes mellitus”CNS Neurol Disord Drug Targets.2014 13(3):491-500。
噬菌体疗法中的进展鼓励了在噬菌体与人和动物生物体的相互作用方面的科学兴趣。这产生了对于开发出促进在组织和细胞中的噬菌体循环和沉积的研究的工具的需要。一种新的基于绿色荧光蛋白(GFP)的方法已被公开用于在活系统中施行T4噬菌体分子成像。该方法采用通过体内噬菌体展示用与Hoc蛋白的N-末端相融合的GFP来对噬菌体衣壳进行装饰。荧光噬菌体在其用于在活的哺乳动物细胞(通过吞噬作用)和组织(由淋巴结和脾脏进行的过滤和滞留)内部进行检测的可应用性方面得到了积极评估。
Figure BDA0001863228310000711
等人,“Molecular imaging of T4phage in mammalian tissues andcells”Bacteriophage.2014 4(1):e28364.Epub 2014Feb 27。
开发对于基因转移应用来说有效、安全且选择性的纳米材料是具有挑战性的。噬菌体(通常已知仅感染细菌的病毒)已显示出对于靶向基因转移应用来说是有希望的。不幸的是，在改善其克服哺乳动物细胞屏障的潜力方面仅取得了有限的进展。已提出对噬菌体衣壳进行化学修饰以改善通过噬菌体载体向哺乳动物细胞中的靶向基因递送。例如，对包括两类纳米材料系统(阳离子聚合物和M13噬菌体病毒颗粒)的杂合系统进行基因工程改造以展示出肿瘤靶向性配体并携带转基因盒。具有阳离子聚合物的噬菌体复合物产生带正电荷的噬菌体，并且大的聚集体显示出经增强的细胞表面附着、缓冲能力和经改善的转基因表达，而同时保留细胞类型特异性。而且，携带治疗性基因的噬菌体/聚合物复合物取得比单独的噬菌体更大的癌细胞杀伤。该新的杂合纳米材料平台类别可以推进通过噬菌体的靶向基因递送应用。Yata等人,“Hybrid Nanomaterial Complexes for Advanced Phage-guided Gene Delivery”Mol Ther Nucleic Acids.2014Aug 12；3:e185。
实验
实施例I
Acr载体的构建
被发现编码Acr蛋白的序列可以从销售定制DNA序列样品的公司订购，或者它们可以从合适的生物学DNA样品中进行PCR扩增。然后，可以通过标准的重组DNA克隆实验方案(例如，限制性核酸内切酶消化和重连接，或Gibson装配)来将它们引入到载体(包括但不限于质粒和病毒载体)中。所述载体通常包括适合于在目的细胞内进行表达的启动子序列。它们还包含促进基因表达和控制的其他序列[例如，5’和3’非翻译区，poly(A)信号，和转录终止子]。然后，可以通过使用本领域中众所周知的标准递送方法将这些载体引入到靶细胞中。
实施例II
筛选Acr蛋白候选物
许多其他的acr基因候选物可以通过它们与aca基因或推定的aca基因的遗传关联来进行鉴定。可以从起源物种中直接克隆Acr开放阅读框，或者备选地，可以由公司来合成基因序列。存在几条筛选针对II型系统的Acr活性的途径。1)通过使用先前所描述的测量由CRISPR-Cas9所靶向的DNA的转化效率的测定法，关于在其天然背景下即在脑膜炎奈瑟氏球菌中NmeCas9活性的抑制的测试；2)关于在异源的大肠杆菌系统(其中NmeCas9经编程以靶向大肠杆菌噬菌体(例如，λ噬菌体))中NmeCas9活性的抑制的测试；3)通过使用在本文中所描述的T7E1测定法，关于在人细胞培养物中NmeCas9活性的抑制的测试。
实施例III
用于控制基因驱动器扩散的Acr施用
Cas9目前正被考虑用在基因驱动器中，所述基因驱动器是可以在整个天然群体中快速散布的经改造的遗传元件。如果那个天然群体是不希望的群体，例如传播病原体例如疟疾寄生虫或登革热病毒的昆虫，那么所述基因驱动器可以包括对于任何获得该基因驱动器的昆虫诱导死亡或不育的元件。虽然该方法用于控制昆虫传播疾病的潜力广泛地得到认可，但是存在许多关于其安全性和对于在释放入自然环境中后的不期望的不利后果(可预测的或不可预测的)的潜力的担忧。该担忧的一部分产生自这样的可能性，即它一旦被释放，基因驱动器的散布可能难以或不可能停止。可以想象这样的基因驱动器，其使用II-C型Cas9酶，例如NmeCas9，来支持其繁殖。在释放基因驱动器之前，可以产生一个分开的昆虫群体，其经改造以表达Acr蛋白，这使得它们对于基因驱动器具有抗性。如果基因驱动器繁殖的不利后果变得明显，那么可以释放表达Acr的昆虫群体以减缓该基因驱动器在整个群体中的繁殖。
实施例IV
用于生物学治疗法的Acr施用
NmeCas9和其sgRNA可以编码在载体中，然后引入到患者的细胞中以用于治疗性基因组编辑的目的。一旦所期望的编辑已经发生，进一步的NmeCas9活性就是不希望的了：因为所期望的编辑位点已被改变，剩下的仅有的潜在编辑位点是不期望的位点。在不期望的位点处的DNA切割对于患者来说可能是有害的(例如，它们可能诱导癌基因染色体易位)。在所期望的编辑事件已经发生后，可以将编码Acr蛋白的载体引入到患者的细胞中以从那时起抑制NmeCas9，从而防止这些不期望的DNA切割事件发生。
实施例V
Acr融合蛋白的产生
可以将被发现结合处于Cas9蛋白表面上的不同区域的两种Acr融合在一起，以提供关于Cas9抑制的潜在地协同的效应。可以通过使用体外实验来检测非竞争性的同时结合，其中用一种Acr使Cas9蛋白饱和，然后添加第二种Acr并且评估其结合。如果第二种Acr可以与Cas9相结合而不替换第一种Acr，那么其结合一定是非竞争性的并且它们与在Cas9蛋白上的非重叠区域相结合。这是可想象的，因为Cas9蛋白比所述Acr中的任何一个都大得多(>10x更大)。此类非竞争性Acr的融合可以通过产生合成构建体来实现，所述合成构建体将会表达通过柔韧的肽连接体而分开的相互符合读框的这两个Acr开放阅读框。可以测试该连接体的几种长度和组成以达到最大活性。
实施例VI
生物信息学分析
关于Aca2的BLASTp搜索用来自斯米尔诺夫氏海洋单胞菌(Oceanimonassmirnovii)的WP_019933869.1作为查询序列来进行(Pawluk等人,2016)。关于Aca3的BLASTp搜索用来自脑膜炎奈瑟氏球菌的WP_049360086.1作为查询序列来进行。使用来自Makarova等人(2015)的信息(包括CRISPR-Cas干扰蛋白的代表性列表)来产生关于所有已知CRISPR-Cas类型的CRISPR-Cas干扰模块的序列相似性系统树形图(Makarova等人,2015)。对于Cas9蛋白序列的系统发生分析，从先前的分析(Fonfara等人,2014)中抽取具有257个代表性Cas9蛋白序列的一个列表，并且用在NCBI蛋白质数据库中的新近存放的序列进行更新。对该列表进行手工整修，从而使得仅保留一个来自每个物种的代表。在用MUSCLE(Edgar,2004)进行序列比对之后，使用FastTree来产生无根最大似然树(Price等人,2009,2010)。在每个节点处显示自展值(bootstrap value)。基于来自Fonfara等人(2014)的数据，将每个进化枝归类为II-A(蓝色)、II-B(黄色)或II-C(紫色)亚型。将树上的进化枝着色为红色，如果它们属于任何其中发现了经证实的II-C型抗-CRISPR基因或其直向同源物的类别。一些值得注意的Cas9蛋白在树上用星号突显出来。
实施例VII
质粒构建
用于蛋白质纯化的Acr表达载体，由GenScript(Piscataway,NJ,USA)合成编码候选抗-CRISPR蛋白的DNA序列，并且使用NcoI-HindIII限制位点将其亚克隆入pHAT4中(Peranen等人,1996)。通过PCR从假单胞菌噬菌体JBD88a中扩增出编码AcrE2的基因，并且使用NcoI-HindIII限制位点将其连接入pHAT4中。表1包含在本研究中所测试的抗-CRISPR蛋白的DNA和蛋白质序列。AcrIIC3Nme被发现在添加了N-末端FLAG标签后是显著地更可溶的，因此将那个构建体用于体外分析。
实施例VIII
用于蛋白质纯化的Cas9:sgRNA载体
由GenScript(Piscataway,NJ,USA)合成具有下述序列的编码在随机序列sgRNA(即，在大肠杆菌中没有基因组靶标)上游的最小T7启动子的DNA：
5’-TGAGACCAGTCTCGGAAGCTCAAAGGTCTCGTTGTAGCTCCCTTTCTCATTTCGGAAACGAAATGAGAACCGTTGCTACAATAAGGCCGTCTGAAAAGATGTGCCGCAACGCTCTGCCCCTTAAAGCTTCTGCTTTAAGGGGCATCGTTTATTTCGGTTAAAAAATGCCGT-3’。
将该插入片段克隆到先前所描述的pMCSG7-NmeCas9表达载体(Zhang等人,2015)中，在编码NmeCas9蛋白的区域的下游，进入SalI-XhoI限制位点中。
实施例IX
Cas9/sgRNA哺乳动物表达载体
对于由SpyCas9和NmeCas9两者来进行DTS3和DTS7的编辑，我们使用了除了各自的Cas9ORF之外在所有方面[质粒主链，CMVIE94启动子(Villefranc等人,2007)，UTR，NLS和表位标签的末端融合，等等]均相同的Cas9表达载体。
先前已描述了SpyCas9表达质粒(pEJS24)(Bolukbasi等人,2015)，和经由Gibson装配通过Cas9 ORF替换从(pEJS24)产生了NmeCas9表达质粒(pEJS424)(New EnglandBiolabs)。类似地，用于表达关于每种Cas9直向同源物的sgRNA的质粒也在除了sgRNA序列本身之外的所有方面是相同的。先前已描述了SpyCas9 sgRNA质粒pLKO.1-puro(Kearns等人,2014)，并且通过Gibson装配从它产生了NmeCas9 sgRNA表达质粒(pEJS333)。表达NmeCas9和其sgRNA的质粒在别处作了详细描述(Amrani等人，准备中的手稿)。对于N-TS1C、N-TS4B、N-TS4C、N-TS7、N-TS8、N-TS11和N-TS25位点的编辑，使用表达NmeCas9(在EF-1a启动子的控制之下)和其sgRNA(在U6启动子的控制之下)两者的一体化载体(pEJS15)。源自pSimpleII(Hou等人,2013)的该质粒也在别处作了描述(Amrani等人，准备中的手稿)。通过将合成的寡核苷酸双链体连接入其BsmBI位点中来将关于每个不同靶位点的24-nt指导序列插入到pEJS15的sgRNA盒中。
实施例X
用于哺乳动物表达的Acr载体
为了产生Acr表达质粒p427-AcrE2、p430-AcrIIC1Boe、p433-AcrIIC1Nme、p436-AcrIIC2Nme和p443-AcrIIC3Nme，将每个ORF合成为侧翼有XhoI和BstBI位点的基因块(Integrated DNA Technologies)，其中在起始密码子的上游为Kozak共有序列。然后，将合成的Acr序列插入到pCS2-Dest载体(Addgene)的XhoI和BstBI位点中。所得的质粒将Acr-编码基因置于CMV IE94启动子的控制之下。
实施例XI
脑膜炎奈瑟氏球菌转化
如先前所描述的那样(Zhang等人,2013)，将具有天然NmeCas9启动子和Shine-Dalgarno序列的候选抗-CRISPR基因克隆到pGCC2(一种包含用于将插入片段在nics座位处整合到脑膜炎奈瑟氏球菌染色体中的同源性臂的脑膜炎奈瑟氏球菌载体)中。将pGCC2构建体转化到脑膜炎奈瑟氏球菌菌株8013中，并且选择红霉素抗性转化体。通过在选择性平板上再划线两次来检验两个或三个代表性转化体/反应，然后通过对经纯化的基因组DNA的PCR来进行确证。该程序导致脑膜炎奈瑟氏球菌菌株8013衍生物，其具有整合在染色体中的在脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9的天然启动子的控制之下的抗-CRISPR基因。在所有情况下，在所衍生出的菌株中对CRISPR座位进行序列确证，以确保待就干扰活性进行检测的间隔子是完整的。
如先前所描述的那样(Duffin和Seifert,2012；Zhang等人,2013)，完成用于评估这些菌株的CRISPR-Cas活性的转化测定法，其中具有原间隔子25(即，与源自内源性CRISPR间隔子#25的crRNA互补的)作为靶标。简而言之，每个转化反应使用150ng的质粒，并且将10μL的10-倍系列稀释物在合适的抗生素存在和不存在下以三次重复点在的GCB平板上。将来自未稀释的最终转化混合物的200μL也铺板在GCB平板(其具有合适的抗生素以增强检测)上。
通过在选择性平板上再划线两次来检验八个代表性转化体/反应，然后通过对细胞提取物的PCR来进行检验。将转化频率报告为抗生素抗性cfu/mL除以总cfu/mL，其来自至少三次独立实验(平均值±s.e.m.)。抗-CRISPR蛋白的克隆和纯化。如先前所描述的那样(Bondy-Denomy等人,2015)，从在大肠杆菌BL21中表达的pHAT4构建体纯化出抗-CRISPR蛋白。在从Ni-NTA树脂上洗脱后，将抗-CRISPR蛋白在10mM Tris pH 7.5、250mM NaCl和5mMβ-巯基乙醇中进行透析，并且与加有His标签的烟草蚀斑病毒(TEV)蛋白酶一起在4℃下温育过夜。使用第二轮Ni-NTA纯化，以通过收集未结合的级分来分离成功经切割的、未加标签的抗-CRISPR蛋白。
实施例XII
Cas9的纯化
在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达6xHis-NmeCas9:sgRNA。在Lex Bubbling System(Structural Genomics Consortium,Toronto,Canada)中，使细胞在37℃下在TerrificBroth(TB)培养基中生长至0.8的光密度(OD600nm)。通过在16℃下添加1mM IPTG 16小时来诱导蛋白质表达。在补充有0.5mM PMSF、溶菌酶和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的50mMTris pH 7.5、500mM NaCl、20mM咪唑、0.5mM DTT和5％甘油中通过超声处理来裂解细胞。使经澄清的裂解物成批地结合至Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)，并将结合的蛋白质用300mM咪唑进行洗脱。将经纯化的Cas9:sgRNA透析入20mM HEPES pH 7.5、250mM NaCl、5％甘油、1mM DTT和1mM PMSF中以用于蛋白质相互作用实验。如先前所描述的那样(Ma等人,2015a)，从大肠杆菌BL21 Rosetta细胞中纯化出加有6xHis-MBP标签的AnaCas9。
实施例XIII
Cas9-抗-CRISPR蛋白Pulldown测定法
将未加标签的抗-CRISPR蛋白(在TEV切割后)与和不与NmeCas9一起在4℃下在结合缓冲液(20mM HEPES pH 7.5、250mM NaCl、5％甘油、5mM咪唑)中温育1小时，并且将输入级分留出以用于SDS–PAGE分析。向每个管中添加50μL 50％浆状Ni-NTA珠粒。在4℃下在旋转下进行30分钟温育之后，通过以3000rpm离心2分钟来收集珠粒。将珠粒用1mL的补充有20mM咪唑的结合缓冲液洗涤四次，并且通过离心来进行收集。用洗脱缓冲液(包含300mM咪唑的结合缓冲液)来洗脱结合的蛋白质。通过SDS-PAGE以及随后的考马斯蓝染色来分析输入和洗脱级分。
实施例XIV
体外DNA切割
通过体外T7转录(Ampliscribe)产生源自间隔子的NmeCas9 sgRNA(Zhang等人,2015)。将NmeCas9(500nM)与经纯化的重组抗-CRISPR蛋白在切割缓冲液[20mM HEPES-KOH(pH 7.5)、150mM KCl、10％甘油、1mM DTT和10mM MgCl2]中一起温育10分钟。接下来，添加sgRNA(1:1，500nM)并将混合物再温育15分钟。将包含靶原间隔子的线性质粒以～5nM最终浓度添加至Cas9/sgRNA复合物。将反应体系在37℃下温育30分钟，并且在1％琼脂糖/1xTAE凝胶中进行电泳后进行可视化。
实施例XV
哺乳动物基因组编辑质粒
在本文中公开了用于NmeCas9、SpyCas9、其各自的sgRNA和抗-CRISPR蛋白的哺乳动物表达的质粒。表4。
表4：对Cas9系统的哺乳动物表达来说有用的质粒
Figure BDA0001863228310000811
按照制造商的说明书使用Polyfect转染试剂(Qiagen)，在24-孔平板中用150ng表达Cas9的质粒和150ng表达sgRNA的质粒瞬时转染在DMEM+10％FBS+1％青霉属/链霉素(Gibco)中在37℃和5％CO2下进行培养的大约1.5×105个中间传代HEK293T细胞。备选地，将200ng的表达NmeCas9和合适的sgRNA两者的一体化质粒用于转染。
对于包括Acr蛋白表达的实验，将100ng的Acr质粒包括在共转染混合物中。在转染后72小时，收获细胞并按照制造商的说明书用DNeasy Blood and Tissue试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA。将50ng基因组DNA用于PCR扩增(High Fidelity 2X PCR Master Mix(NewEngland Biolabs))，其中使用位于所靶向的位点侧翼的引物。使10μl的每种PCR产物热变性，重退火，并用T7核酸内切酶I(New England Biolabs)进行消化。将样品在2.5％琼脂糖/1xTAE凝胶中进行分级分离，并且用ImageMaster-TotalLab程序进行定量。如先前所描述的那样(Guschin等人,2010)，计算插入/缺失百分比(附图中的“％损伤”)。
实施例XVI
dNmeCas9的荧光显微术
在补充有10％FBS和1％Pen/Strep的DMEM(Life Technologies)中在37℃(5％CO2)下进行培养的U2OS细胞中使用dNmeCas9-(sfGFP)3、dSpyCas9-(mCherry)3和抗-CRISPR/mTagBFP2质粒。为了成像，使细胞在170μm,35x10mm玻璃底平皿(Eppendorf)中进行生长。按照制造商的说明书使用PolyFect(Qiagen)，用300ng的一体化质粒(150ng的各自dNmeCas9和dSpyCas9质粒)、另外的600ng的表达sgRNA的质粒和100ng的抗-CRISPR/mTagBFP2质粒共转染细胞。在24小时的温育后，用配备有滨松照相机(C11440-22CU)、65x油物镜和Microsystems软件(LASX)的徕卡DMi8显微镜对活细胞进行成像。进一步的成像处理用ImageJ来进行。
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Claims (37)

1.质粒，其包含核酸序列，所述核酸序列编码：i)从由下列各项组成的组中选择的II-C型抗-CRISPR(Acr)氨基酸序列的至少一部分：脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)Acr、裸面小绢猴布拉克氏菌(Brackiella oedipodis)Acr、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)Acr、米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)Acr、茄罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)Acr和与脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白具有至少47％同源性的Cas9蛋白相结合的Acr；ii)抗-CRISPR-相关的转录调节物蛋白；和iii)启动子。
2.权利要求1的质粒，其中所述所编码的II-C型Acr氨基酸序列的至少一部分进一步包含加合物，其选自由下列各项组成的组：核定位序列、亲和标签、表位序列标签和DYKDDDDK肽。
3.一种组合物，其包含II-C型脑膜炎奈瑟氏球菌(Nme)Cas9蛋白，以及从由下列各项组成的组中选择的II-C型抗-CRISPR(Acr)氨基酸序列的至少一部分：脑膜炎奈瑟氏球菌Acr、裸面小绢猴布拉克氏菌Acr、流感嗜血菌Acr、米氏西蒙斯氏菌Acr、茄罗尔斯通氏菌Acr和与脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白具有至少47％同源性的Cas9蛋白相结合的Acr。
4.权利要求3的组合物，其中所述II-C型Acr氨基酸序列进一步包含加合物，其选自由下列各项组成的组：核定位序列、亲和标签、表位序列标签和DYKDDDDK肽。
5.权利要求3的组合物，其中所述II-C型NmeCas9蛋白为II-C型dNmeCas9蛋白。
6.一种方法，其包括：
a)提供：
i)包含至少一个可疑基因的生物细胞；
ii)II-C型脑膜炎奈瑟氏球菌(Nme)Cas9/sgRNA复合物，
其中所述sgRNA能够与至少一个可疑基因的靶位点杂交，并且所述II-C型NmeCas9蛋白包含结合位点；和
iii)从由下列各项组成的组中选择的II-C型抗-CRISPR(Acr)氨基酸序列的至少一部分：脑膜炎奈瑟氏球菌Acr、裸面小绢猴布拉克氏菌Acr、流感嗜血菌Acr、米氏西蒙斯氏菌Acr、茄罗尔斯通氏菌Acr和与脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白具有至少47％同源性的Cas9蛋白相结合的Acr，其以特异性亲和力与所述结合位点相结合；
b)使所述II-C型NmeCas9/sgRNA复合物与所述生物细胞相接触，从而使得所述II-C型NmeCas9/sgRNA复合物与所述靶位点杂交；
c)用所述II-C型NmeCas9/sgRNA复合物编辑所述可疑基因；和
d)使所述结合位点与所述II-C型抗-CRISPR氨基酸序列的所述至少一部分相接触，从而使得所述编辑被减少。
7.权利要求6的方法，其中所述II-C型NmeCas9蛋白为II-C型dNmeCas9蛋白。
8.权利要求6的方法，其中所述减少的编辑防止NmeCas9结合的至少一个脱靶事件。
9.权利要求8的方法，其中所述至少一个脱靶事件选自由下列各项组成的组：DNA切割和DNA突变。
10.权利要求8的方法，其中所述减少的编辑在细胞周期的G1期期间出现。
11.权利要求6的方法，其中所述减少的编辑防止嵌合基因型。
12.权利要求6的方法，其中所述减少的编辑抑制基因驱动。
13.权利要求6的方法，其中所述减少的编辑选自由下列各项组成的组：至少70％、75％、90％和100％。
14.权利要求6的方法，其中所述减少的编辑是受到精确控制的。
15.权利要求6的方法，其中所述可疑基因为功能异常的基因。
16.一种方法，其包括：
a)提供：
i)包含至少一个可疑基因的病毒；
ii)II-C型脑膜炎奈瑟氏球菌(Nme)Cas9/sgRNA复合物，其中所述sgRNA能够与至少一个可疑基因的靶位点杂交，并且所述II-C型NmeCas9蛋白包含结合位点；和
iii)从由下列各项组成的组中选择的II-C型抗-CRISPR(Acr)氨基酸序列的至少一部分：脑膜炎奈瑟氏球菌Acr、裸面小绢猴布拉克氏菌Acr、流感嗜血菌Acr、米氏西蒙斯氏菌Acr、茄罗尔斯通氏菌Acr和与脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白具有至少47％同源性的Cas9蛋白相结合的Acr，其以特异性亲和力与所述结合位点相结合；
b)使所述II-C型NmeCas9/sgRNA复合物与所述病毒相接触，从而使得所述II-C型NmeCas9/sgRNA复合物与所述靶位点相结合；
c)用所述II-C型NmeCas9/sgRNA复合物编辑所述可疑基因；和
d)使所述结合位点与所述II-C型抗-CRISPR氨基酸序列的所述至少一部分相接触，从而使得所述编辑被减少。
17.权利要求16的方法，其中所述II-C型NmeCas9蛋白为II-C型dNmeCas9蛋白。
18.权利要求16的方法，其中所述减少的编辑防止NmeCas9结合的至少一个脱靶事件。
19.权利要求18的方法，其中所述至少一个脱靶事件选自由下列各项组成的组：DNA切割和DNA突变。
20.权利要求18的方法，其中所述减少的编辑在细胞周期的G1期期间出现。
21.权利要求16的方法，其中所述减少的编辑防止嵌合基因型。
22.权利要求16的方法，其中所述减少的编辑抑制基因驱动。
23.权利要求16的方法，其中所述减少的编辑选自由下列各项组成的组：至少70％、75％、90％和100％。
24.权利要求16的方法，其中所述减少的编辑是受到精确控制的。
25.权利要求16的方法，其中所述可疑基因为失调的基因。
26.在II-C型脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白存在下以特异性亲和力与至少一个可疑基因的靶位点相结合的II-C型抗-CRISPR(Acr)氨基酸序列的至少一部分在制备药物中的用途，所述药物用于对包含所述至少一个可疑基因的哺乳动物进行治疗，所述II-C型抗-CRISPR氨基酸序列选自由下列各项组成的组：脑膜炎奈瑟氏球菌Acr、裸面小绢猴布拉克氏菌Acr、流感嗜血菌Acr、米氏西蒙斯氏菌Acr、茄罗尔斯通氏菌Acr和与脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白具有至少47％同源性的Cas9蛋白相结合的Acr，其中所述至少一个可疑基因的编辑被减少。
27.权利要求26的用途，其中所述II-C型NmeCas9蛋白为II-C型dNmeCas9蛋白。
28.权利要求26的用途，其中所述减少的编辑防止NmeCas9结合的至少一个脱靶事件。
29.权利要求28的用途，其中所述至少一个脱靶事件选自由下列各项组成的组：DNA切割和DNA突变。
30.权利要求28的用途，其中所述减少的编辑在细胞周期的G1期期间出现。
31.权利要求26的用途，其中所述减少的编辑防止嵌合基因型。
32.权利要求26的用途，其中所述减少的编辑抑制基因驱动。
33.权利要求26的用途，其中所述减少的编辑选自由下列各项组成的组：至少70％、75％、90％和100％。
34.权利要求26的用途，其中所述减少的编辑是受到精确控制的。
35.权利要求26的用途，其中所述可疑基因为经突变的基因。
36.一种试剂盒，其包含：
a)第一容器，其包含从由下列各项组成的组中选择的II-C型抗-CRISPR(Acr)氨基酸序列的至少一部分：脑膜炎奈瑟氏球菌Acr、裸面小绢猴布拉克氏菌Acr、流感嗜血菌Acr、米氏西蒙斯氏菌Acr、茄罗尔斯通氏菌Acr和与脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9蛋白具有至少47％同源性的Cas9蛋白相结合的Acr；
b)第二容器，其包含以特异性亲和力与所述II-C型抗-CRISPR氨基酸序列的所述至少一部分相结合的II-C型脑膜炎奈瑟氏球菌(Nme)Cas9蛋白；和
c)第三容器，其包含sgRNA。
37.权利要求36的试剂盒，其中所述II-C型NmeCas9蛋白为II-C型dNmeCas9蛋白。
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