CN111518839B - 一种等位特异性位点编辑方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种等位特异性位点编辑方法，包括以下步骤：1)取MII期的卵母细胞分为两组，第一组对其进行Cas9 mRNA和靶向目的基因的sgRNA的显微注射，第二组不做任何处理；2)对两组MII卵母细胞同时进行体外受精；3)待胚胎大约发育到受精卵PN3‑4时期，利用原核互换的显微操作方法，将注射组受精卵的雌雄原核分别取出，然后将未处理组受精卵分为两组，一组去掉雌原核，一组去掉雄原核，再将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中；4)将操作后胚胎放入培养箱中等待其充分恢复从而组成一个新的重构胚胎。本发明实现了Cas9活性控制及单等位位点编辑，扩大了基因编辑的应用范围。

Description

一种等位特异性位点编辑方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基因编辑方法，具体地说，是一种等位特异性位点编辑方法。
背景技术
CRISPR-Cas9基因敲除系统的建立大大简化了基因编辑的操作流程并具有很高的效率，它对生物技术、医学等领域的发展产生了深远的影响。CRISPR-Cas9在sgRNA的引导下能够在体内或者体外条件下特异性的识别基因组序列并且诱导双链断裂(DSBs)。此时，主要激活了非同源末端连接(NHEJ)的修复通路，在断裂位点处随机的引入小片段的插入或者缺失导致编码序列的移码突变。利用NHEJ的相对较高的修复效率这一优势，在受精卵中共注射Cas9 mRNA和靶向目的基因的sgRNA可以有效的产生基因编辑的模式动物。
然而，由于Cas9一旦表达即具有持续切割的活性并且很难精确的在时间和空间的层次上控制Cas9的表达，这将会很大程度地限制Cas9对基因编辑的灵活性，因此仍然会带来许多的弊端。首先，由于持续的Cas9切割活性，通过这种方法产生的胚胎或者出生的动物绝大多数会存在基因型的嵌合结果。其次，对于二倍体生物，在传统的CRISPR-Cas9系统作用下，很难精确的对单等位位点进行编辑。因此，亲缘性等位特异性的基因组位点也不能通过传统的CRISPR-Cas9系统进行选择性的识别或者修改。这些缺陷归根结底是因不能有效的对Cas9活性进行时空特异性控制，这很大程度的限制了Cas9在基因功能性验证或者临床应用的效率。
由于无法高效实现Cas9活性控制及单等位位点编辑，这极大地限制了基因编辑的应用范围。例如产生的基因敲除动物大多是嵌合体，需要进行进一步纯化，耗费大量时间；无法有效得到携带有致死基因突变的动物模型或一步获得杂合敲除动物模型；在机制研究中无法对印记基因进行有效的功能性鉴定；同时在基因治疗中也存在很大的局限性。
专利文献CN109152848A，公开日20190104，公开了一种控制Cas9基因编辑活性的II-C型Cas9抗-CRISPR(Acr)抑制剂，此类Acr抑制剂的共施用可以在下列方面提供有利的辅助：允许通过在空间或时间上控制Cas9活性来进行安全且实用的生物学治疗法；控制在野生群体中的基于Cas9的基因驱动以减轻此类强制遗传计划的生态学后果；和对进入基因编辑技术的各种生物技术、农业和医学应用中的一般性研究作出贡献。然而，该技术也并未很好地解决前述问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供了一种等位特异性位点编辑的方法。
第一方面，本发明提供了一种等位特异性位点编辑方法，包括以下步骤：
1)取MII期的卵母细胞分为两组，第一组对其进行Cas9 mRNA和靶向目的基因的sgRNA的显微注射，第二组不做任何处理；
2)操作后的卵母细胞进行短暂恢复后对两组MII卵母细胞同时进行体外受精；
3)等待胚胎大约发育到受精卵PN3-4时期，利用原核互换的显微操作方法，将注射组受精卵的雌雄原核分别取出，然后将未处理组受精卵分为两组，一组去掉雌原核，一组去掉雄原核；再将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中；
4)将操作后胚胎放入培养箱中等待其充分恢复从而组成一个新的重构胚胎。
作为一个优选例，步骤4)之后还包括步骤5)：将重构胚胎进行体外培养到囊胚。
作为另一优选例，步骤4)之后还包括步骤5)：将重构胚胎进行胚胎移植入假孕受体产生胎儿。
更优选地，步骤5)之后还包括步骤6)：重构胚胎或胎儿利用Sanger测序进行基因型鉴定。
作为另一优选例，步骤3)中将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中所采用的方法是基于仙台病毒蛋白的胞膜融合方法。
第二方面，本发明提供了一种精确的实现亲缘性等位特异性基因编辑的方法，其包含如上任一所述等位特异性位点编辑方法的步骤。
第三方面，本发明提供了一种减少基因型嵌合现象的基因编辑方法，其包含如上任一所述等位特异性位点编辑方法的步骤。
第四方面，本发明提供了一种构建携带有胚胎致死性基因突变动物模型的方法，其包含如上任一所述等位特异性位点编辑方法的步骤。
第五方面，本发明提供了一种印记基因的功能性鉴定方法，其包含如上任一所述等位特异性位点编辑方法的步骤。
第六方面，本发明提供了一种基因编辑方法，包含以下步骤：
1)取MII期的卵母细胞分为两组，第一组对其进行Cas9 mRNA和靶向目的基因的sgRNA的显微注射，第二组不做任何处理；
2)操作后的卵母细胞进行短暂恢复后对两组MII卵母细胞同时进行体外受精；
3)待胚胎大约发育到受精卵PN3-4时期，利用原核互换的显微操作方法，将注射组每个受精卵的雌雄原核共同取出备用，将未处理组受精卵的雌雄原核取出弃掉，然后将注射组取出的雌雄原核融合到已经弃掉双原核的未处理组受精卵中；
4)将操作后胚胎放入培养箱中等待其充分恢复从而组成一个新的重构胚胎。
作为一个优选例，步骤4)之后还包括步骤5)：将重构胚胎进行体外培养到囊胚。
作为另一优选例，步骤4)之后还包括步骤5)：将重构胚胎进行胚胎移植入假孕受体产生胎儿。
更优选地，步骤5)之后还包括步骤6)：重构胚胎或胎儿利用Sanger测序进行基因型鉴定。
作为另一优选例，步骤3)中将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中所采用的方法是基于仙台病毒蛋白的胞膜融合方法。
第七方面，本发明提供了一种构建具有一致突变位点的双等位位点敲除动物模型的方法，其包含如上任一所述基因编辑方法的步骤。
本发明优点在于：通过显微操作的辅助方式实现核质分离以过滤掉存留在胞质中的多余Cas9并利用物理稀释的方法更加精确的控制Cas9的靶向活性，从而进一步实现单等位位点编辑，扩大了基因编辑的应用范围，例如，很大程度的降低了敲除基因型的嵌合率；可以得到携带有致死基因突变的动物模型或一步获得杂合敲除动物模型；可对印记基因进行有效的功能性鉴定，便于机制研究；能有效的用于显性突变引起的遗传病治疗，等等。
本文中，所述Cas9和sgRNA的显微注射、卵母细胞的体外受精、受精卵的雌雄原核分离、仙台病毒蛋白介导的核移植、胚胎移植均为本领域熟知的技术，不存在操作上的困难。所述胚胎移植技术为非手术性胚胎移植技术，该技术在人工受孕和动物实验中均广泛应用，以小鼠非手术性胚胎移植为例，其具体操作可参见文献(段新崇,等.一种非手术性小鼠胚胎移植技术.《生物工程学报》2016年04期)等现有技术。
附图说明
附图1：本发明Past-CRISPR方法的主要操作步骤示意图。
附图2：两组单等位位点突变胚胎占比。左图为Past-CRISPR处理胚胎组；右图为传统受精卵注射胚胎组。
附图3：单等位位点突变胚胎的亲缘性等位特异性靶向位点与各自的SNP对比图。
附图4：两组基因型嵌合胚胎占比。左图为Past-CRISPR处理胚胎组；右图为传统受精卵注射胚胎组。
附图5：携带有胚胎致死性基因单等位位点突变小鼠的照片。
附图6：印记基因功能性验证结果。
附图7：基于Past-CRISPR的双原核互换(2PN-transfer)方法的主要操作步骤示意图。
附图8：两组毛色嵌合表型情况。左图为2PN-transfer方法产生的小鼠，右图为传统受精卵注射方法产生小鼠。
附图9：经Past-CRISPR方法靶向切割显性突变等位的小鼠照片。
具体实施方式
本发明通过将CRISPR/Cas9基因编辑系统和原核互换的显微操作方法相结合从而开发出等位特异性位点编辑的新方法，命名为Past-CRISPR。
主要操作步骤为(图1)：
1.取MII期的卵母细胞分为两组，第一组对其进行Cas9 mRNA(100ng/μl)和靶向目的基因的sgRNA(150ng/μl)的显微注射；第二组不做任何处理。
2.操作后的卵母细胞进行短暂恢复后(一般在培养箱中恢复15-30分钟)对两组MII卵母细胞同时进行体外受精。
3.等待5-10小时后，此时胚胎大约发育到受精卵PN3-4时期。此时，Cas9的酶切活动已经充分进行，并且能够通过对雌雄原核的大小及它们之间的距离更清晰的进行辨认。利用原核互换的显微操作方法，将注射组受精卵的雌雄原核分别取出。然后将未处理组受精卵分为两组，一组去掉雌原核，一组去掉雄原核。再利用仙台病毒蛋白的胞膜融合作用将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中。
4.将操作后胚胎放入培养箱中静置半小时左右等待其充分恢复从而组成一个新的重构胚胎。
5.重构胚胎进行体外培养到囊胚。同时，也可以将重构胚胎进行胚胎移植入假孕受体产生胎儿。
6.重构胚胎及胎儿利用Sanger测序进行基因型鉴定。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1实验材料
实验动物：C57BL/6母鼠用于MII卵母细胞及受精卵的获取；DBA和PWK公鼠用于成熟期精子的获取。
主要实验仪器：显微操作系统，体式显微镜，CO2培养箱等。
主要实验试剂：胚胎培养液及胚胎操作液，仙台病毒蛋白，Nocodazole等。
2实验方法
实验中涉及到Past-CRISPR方法和胚胎的基因型鉴定的具体操作步骤参照上述“主要操作步骤”的内容。将传统受精卵注射实验设置为对照组，即对PN3-4阶段的受精卵进行相同浓度的Cas9/sgRNA的注射。Past-CRISPR方法和传统受精卵注射方法得到的单个胚胎的基因型通过利用Snapgene软件对Sanger测序结果进行比对分析。
所用的sgRNA：
Anapc2 CTTTGGTGGGACTGCACCGCTGG SEQ ID NO:1
Mash2 TGGGCCCCTGCTACGAGTTCTGG SEQ ID NO:2
Peg10 CAGACGTCTGATCTTGCGTTTGG SEQ ID NO:3
所用的基因切割位点鉴定引物：
Anapc2-F GCAAAGTCGCGGGAAATCTG SEQ ID NO:4
Anapc2-R TCTCTTTGGCGTCGTACCAAT SEQ ID NO:5
Mash2-F CACGAGAGTACCACGCTTCC SEQ ID NO:6
Mash2-R GCGTCTCCACCTTACTCAGC SEQ ID NO:7
Peg10-F TGATGAACGCAGACACGA SEQ ID NO:8
Peg10-R AGGCTCTGGGTGAAGGAT SEQ ID NO:9
3实验结果
3.1 Past-CRISPR方法可以精确的实现亲缘性等位特异性基因编辑
利用Past-CRISPR方法针对不同批次的胚胎分别对三个不同基因(Anacp2,Peg10,Mash2)各自的父源和母源等位位点进行基因编辑，其中对60枚胚胎进行基因型鉴定。同时对照组设置为传统的受精卵注射方法得到的胚胎，其中对18枚胚胎进行基因型鉴定。结果表明其中91.7％的Past-CRISPR处理胚胎为单等位位点突变胚胎，而传统受精卵注射方法处理组为0％(图2：左图为Past-CRISPR处理胚胎组；右图为传统受精卵注射胚胎组)。
同时，我们利用PWK公鼠的精子及C57母鼠的卵母细胞得到的杂合胚胎利用SNP对亲源等位进行标记，利用Past-CRISPR方法得到亲源性单等位位点编辑的重构胚胎。分别对15枚胚胎进行基因型鉴定，其中13枚胚胎为单等位位点突变胚胎，并且所有胚胎的亲缘性等位特异性靶向位点均能与各自的SNP匹配(图3)。
3.2 Past-CRIPSR方法得到的基因编辑胚胎具有很低的基因型嵌合现象
分别对60枚Past-CRISPR方法得到的重构胚胎和18枚传统受精卵注射方法得到的胚胎进行基因型鉴定。结果表明Past-CRISPR方法得到的基因编辑重构胚胎中仅有7.1％为基因型嵌合，而传统受精卵注射方法得到的基因编辑胚胎中有88.9％基因型嵌合胚胎(图4：左图为Past-CRISPR处理胚胎组；右图为传统受精卵注射胚胎组)。
实施例2
1实验材料
实验动物：C57BL/6和BDF1母鼠用于MII卵母细胞及受精卵的获取；DBA和PWK公鼠用于成熟期精子的获取；ICR假孕母鼠用于胚胎移植。
主要实验仪器：显微操作系统，体式显微镜，CO2培养箱，胚胎移植相关器材等。
主要实验试剂：胚胎培养液及胚胎操作液，仙台病毒蛋白，Nocodazole等。
2实验方法
实验中涉及到Past-CRISPR方法具体操作步骤参照上述“主要操作步骤”的内容。出生小鼠的基因型鉴定，即通过鼠尾鉴定方法，利用Snapgene软件对Sanger测序结果进行比对分析确定。
所用的sgRNA：
Anapc2 CTTTGGTGGGACTGCACCGCTGG SEQ ID NO:10
所用的基因切割位点鉴定引物：
Anapc2-F GCAAAGTCGCGGGAAATCTG SEQ ID NO:11
Anapc2-R TCTCTTTGGCGTCGTACCAAT SEQ ID NO:12
3实验结果
3.1 Past-CRISPR方法应用于携带有胚胎致死性基因突变动物模型的构建
通过实验验证Anapc2基因敲除的胚胎均在桑椹胚时期发育阻滞，因此利用传统的受精卵注射方法无法得到携带有Anapc2基因突变的小鼠模型。我们利用Past-CRISPR方法对Anapc2的母源等位进行编辑得到重构胚胎并将其中60枚胚胎移植入假孕受体。其中有8只小鼠出生，其中4只经基因型鉴定为单等位位点突变小鼠。同时通过对突变小鼠进行交配能够实现致死突变位点的生殖系传递(图5)。
实施例3
1实验材料
实验动物：C57BL/6母鼠用于MII卵母细胞及受精卵的获取；DBA和PWK公鼠用于成熟期精子的获取；ICR假孕母鼠用于胚胎移植。
主要实验仪器：显微操作系统，体式显微镜，CO2培养箱，胚胎移植相关器材等。
主要实验试剂：胚胎培养液及胚胎操作液，仙台病毒蛋白，Nocodazole等。
2实验方法
实验中涉及到Past-CRISPR方法和胚胎及胎儿的基因型鉴定的具体操作步骤参照上述“主要操作步骤”的内容。基因型鉴定即通过Snapgene软件对Sanger测序结果进行比对确定。
所用的sgRNA：
Mash2 TGGGCCCCTGCTACGAGTTCTGG SEQ ID NO:13
Peg10 CAGACGTCTGATCTTGCGTTTGG SEQ ID NO:14
所用的基因切割位点鉴定引物：
Mash2-F CACGAGAGTACCACGCTTCC SEQ ID NO:15
Mash2-R GCGTCTCCACCTTACTCAGC SEQ ID NO:16
Peg10-F TGATGAACGCAGACACGA SEQ ID NO:17
Peg10-R AGGCTCTGGGTGAAGGAT SEQ ID NO:18
3实验结果
3.1 Past-CRISPR方法应用于印记基因的功能性鉴定
我们利用Past-CRISPR方法分别对Mash2和Peg10两个对早期胚胎具有重要作用的印记基因进行功能性验证。得到四种类型的胚胎(Mash2M-ko/P-wt，Mash2M-wt/P-ko，Peg10M -ko/P-wt，Peg10M-wt/P-ko)并将其移植入假孕受体中产生小鼠。结果表明，Mash2M-ko/P-wt和Peg10M-wt/P-ko小鼠未出生且在植入后10天左右出现胚胎发育阻滞；Mash2M-wt/P-ko和Peg10M -ko/P-wt小鼠均能正常出生(图6)。
实施例4
1实验材料
实验动物：C57BL/6母鼠用于MII卵母细胞及受精卵的获取；DBA和PWK公鼠用于成熟期精子的获取；ICR假孕母鼠用于胚胎移植。
主要实验仪器：显微操作系统，体式显微镜，CO2培养箱，胚胎移植相关器材等。
主要实验试剂：胚胎培养液及胚胎操作液，仙台病毒蛋白，Nocodazole等。
2实验方法
Tyr基因是控制毛色的基因。如果发生Tyr的双等位的功能缺失突变，小鼠的毛色表现为明显的白化病表型；如果发生Tyr双等位不完全的功能性缺失突变，表现为黑白色斑表型；如果发生Tyr单等位杂合突变或者未突变，则表现为正常的毛色。因此Tyr基因可作为指示编辑状态的基因。我们利用Tyr基因作为指示编辑状态的基因，设计开发了基于Past-CRISPR的双原核互换(2PN-transfer)方法(图7)，操作步骤为：
1)取MII期的卵母细胞分为两组，第一组对其进行Cas9 mRNA和靶向目的基因的sgRNA的显微注射，第二组不做任何处理；
2)操作后的卵母细胞进行短暂恢复后对两组MII卵母细胞同时进行体外受精；
3)等待7小时后，此时胚胎大约发育到受精卵PN3-4时期。利用原核互换的显微操作方法，将注射组每个受精卵的雌雄原核共同取出备用，将未处理组受精卵的雌雄原核取出弃掉。然后利用仙台病毒蛋白的胞膜融合作用将注射组取出的雌雄原核融合到已经弃掉双原核的未处理组受精卵中；
4)将操作后胚胎放入培养箱中静置半小时等待其充分恢复从而组成一个新的重构胚胎；
5)重构胚胎进行体外培养到囊胚。同时，也可以将重构胚胎进行胚胎移植入假孕受体产生胎儿；
6)重构胚胎及胎儿利用Sanger测序进行基因型鉴定。
Past-CRISPR双原核互换方法和传统注射方法得到的单个胚胎的基因型通过利用Snapgene软件对Sanger测序结果进行比对分析。
所用的sgRNA：
Tyr GTTATGGCCGATAGGTGCATTGG SEQ ID NO:19
所用的基因切割位点鉴定引物：
Tyr-F TCCTCACACTACTTCTGATG SEQ ID NO:20
Tyr-R GTCTCAAGATGGAAGATCAC SEQ ID NO:21
3实验结果
3.1 Past-CRISPR应用于具有一致突变位点的双等位位点敲除动物模型构建
通过对得到的小鼠进行毛色观察，传统受精卵注射方法得到小鼠有42.9％为严重毛色嵌合表型，而2PN-transfer方法得到的小鼠仅10％表现为轻微的毛色嵌合表型(图8：左图为2PN-transfer方法产生的小鼠，右图为传统受精卵注射方法产生小鼠)。通过对两组方法得到的胚胎分别进行基因型鉴定，表明2PN-transfer方法具有更高几率产生具有一致突变位点的双等位突变基因型胚胎(50％vs 18％)。
实施例5
1实验材料
实验动物：C57BL/6母鼠用于MII卵母细胞获取；Fgfr3G369C/+公鼠用于成熟期精子的获取；ICR假孕母鼠用于胚胎移植。
主要实验仪器：显微操作系统，体式显微镜，CO2培养箱，胚胎移植相关器材等。
主要实验试剂：胚胎培养液及胚胎操作液，仙台病毒蛋白，Nocodazole等。
2实验方法
实验中涉及到Past-CRISPR方法的具体操作步骤参照上述“主要操作步骤”的内容。胚胎及出生小鼠的基因型鉴定通过对覆盖靶向位点和点突位点的基因组区域进行PCR扩增和Sanger测序。测序结果通过Snapgene进行比对分析。
所用的sgRNA：
Fgfr3 AAGCGGACAGTGTTTGCGGCTGG SEQ ID NO:22
所用的基因切割位点鉴定引物：
Fgfr3-target-F AATCCAGAAGGGTAAACAGG SEQ ID NO:23
Fgfr3-target-R AAGGTACTGGTTCGAGGT SEQ ID NO:24
Fgfr3-pointmutant-F CTCCAAGTATCCCAGGTCC SEQ ID NO:25
Fgfr3-pointmutant-R AGGAGACACGAGGCAGGA SEQ ID NO:26
Fgfr3-all-F GGAGCGAATGGATAAGAAA SEQ ID NO:27
Fgfr3-all-R TGGAAACAGAGGCAGTGAG SEQ ID NO:28
3实验结果
3.1 Past-CRISPR应用于治疗显性突变引起的遗传病治疗
Fgfr3功能性获得突变小鼠疾病模型(Fgfr3 Gly369Cys)可以模拟人的软骨发育不全症。主要的疾病表型为扁圆型的头部，严重缩短的四肢骨及缩短的尾巴。通过Past-CRISPR方法能有效的靶向切割显性突变等位(显性等位的突变效率为79±4％)。并且得到的Fgfr3显性等位位点破坏的Fgfr3G369C del/+小鼠疾病表型均得以纠正，呈现正常的体型(图9)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市第一妇婴保健院
<120> 一种等位特异性位点编辑方法
<130> /
<160> 28
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctttggtggg actgcaccgc tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgggcccctg ctacgagttc tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cagacgtctg atcttgcgtt tgg 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcaaagtcgc gggaaatctg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tctctttggc gtcgtaccaa t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cacgagagta ccacgcttcc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcgtctccac cttactcagc 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgatgaacgc agacacga 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aggctctggg tgaaggat 18
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctttggtggg actgcaccgc tgg 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gcaaagtcgc gggaaatctg 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tctctttggc gtcgtaccaa t 21
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgggcccctg ctacgagttc tgg 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cagacgtctg atcttgcgtt tgg 23
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cacgagagta ccacgcttcc 20
<210> 16
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<213> 人工序列
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gcgtctccac cttactcagc 20
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tgatgaacgc agacacga 18
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aggctctggg tgaaggat 18
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gttatggccg ataggtgcat tgg 23
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tcctcacact acttctgatg 20
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gtctcaagat ggaagatcac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aagcggacag tgtttgcggc tgg 23
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
aatccagaag ggtaaacagg 20
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aaggtactgg ttcgaggt 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ctccaagtat cccaggtcc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aggagacacg aggcagga 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
ggagcgaatg gataagaaa 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tggaaacaga ggcagtgag 19

Claims (6)

1.一种等位特异性位点编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）取MII期的小鼠卵母细胞分为两组，第一组对其进行Cas9 mRNA和靶向目的基因的sgRNA的显微注射，第二组不做任何处理；
2）操作后的卵母细胞进行短暂恢复后对两组MII卵母细胞同时进行体外受精；
3）等待胚胎发育到受精卵PN3-4时期，利用原核互换的显微操作方法，将注射组受精卵的雌雄原核分别取出，然后将未处理组受精卵分为两组，一组去掉雌原核，一组去掉雄原核；再将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中；
4）将操作后受精卵放入培养箱中等待其充分恢复从而组成一个新的重构胚胎；
所述短暂恢复是在培养箱中恢复15-30分钟；
所述编辑方法是非疾病诊断和治疗目的。
2.根据权利要求1所述的等位特异性位点编辑方法，其特征在于，步骤4）之后还包括步骤5）：将重构胚胎进行体外培养到囊胚。
3.根据权利要求1所述的等位特异性位点编辑方法，其特征在于，步骤4）之后还包括步骤5）：将重构胚胎进行胚胎移植入假孕受体产生胎儿。
4.根据权利要求2或3所述的等位特异性位点编辑方法，其特征在于，步骤5）之后还包括步骤6）：重构胚胎或胎儿利用Sanger测序进行基因型鉴定。
5.根据权利要求1所述的等位特异性位点编辑方法，其特征在于，步骤3）中将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中所采用的方法是基于仙台病毒蛋白的胞膜融合方法。
6.一种构建携带有胚胎致死性基因突变动物模型的方法，其特征在于，包含权利要求1-5任一所述等位特异性位点编辑方法的步骤。
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