CN107312788B

CN107312788B - 一种tale重复序列载体的构建方法

Info

Publication number: CN107312788B
Application number: CN201610266044.8A
Authority: CN
Inventors: 王崧; 胡宝洋
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2036-04-26
Also published as: CN107312788A

Abstract

本发明提供了一种构建TALE重复序列载体的方法，其特征在于，所述方法包括：1)以含有TALE二聚体的核苷酸序列为模板进行PCR扩增；2)以BsaI酶切步骤1)得到的扩增产物，将所述酶切获得的含TALE的片段连接形成TALEN重复序列载体。本发明操作更加简单，需要的载体数量和工作量更少，并且能够通过PCR的方式进行扩增，大大提高了工作效率。

Description

一种TALE重复序列载体的构建方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，涉及一种快速、高效构建TALE重复序列载体的方法。

背景技术

对基因组特定位点进行定向修饰是科研工作者长久以来的梦想。虽然锌指核酸酶(zinc finger nuclease)的出现大大促进了基因组编辑领域的发展，但是筛选出能高效、特异结合特定DNA序列的锌指蛋白是非常困难的技术难题，并且这项技术耗时、费力、成本较高。来自于植物病原体Xanthomonas的类转录激活因子(transcription activator-likeeffector，TALE)能够特异地识别特定的DNA序列。研究表明，TALE的DNA识别结构域主要由1到33个长度为33-35个氨基酸残基的重复单元串联后，再加上末尾的一个含有20个氨基酸残基的半重复单位构成。在单个重复单元中，第12、13位氨基酸残基决定了TALE识别DNA的特异性，被称为重复可变二残基(repeat variable di-residue，简称RVD)位点；其它位点的氨基酸残基则高度保守。不同的RVD能够分别特异识别A、T、C、G四种碱基(Boch et al.,2009)。由于TALE蛋白识别DNA是基于一种氨基酸：核苷酸特异对应识别的模式，可以预期其在生物医学基础理论研究、临床治疗及药物研发，以及农林牧渔业经济物种遗传改造等领域具有广阔的应用前景。将TALE的DNA结合结构域与其它功能性的结构域融合后，可以得到各种衍生的融合蛋白，由此，在理论上能对基因组的特定位点进行多种不同的特定修饰。比如，与转录激活结构域融合后，能够特异增强靶基因的表达(Zhang et al.,2011a)；与组蛋白去甲基化酶融合后，可以改变特定基因座(genome locus)的表观遗传状态(Mendenhallet al.,2013)；与FokI核酸内切酶的切割结构域融合形成的蛋白称为TALE核酸酶(TALEnuclease，简称TALEN)，能够对基因组的特定靶位点进行定向切割，从而实现基因打靶(Miller et al.,2011)。目前，TALE技术已经广泛地应用于基因组修饰领域，而关键步骤是要构建识别特异DNA序列的TALE载体。为保证TALE蛋白识别的特异性并减少脱靶效应，人工合成的TALE蛋白通常含有15个以上的重复单元。由于TALE序列的高度保守性，TALE串联重复序列的构建不能用常规的分子克隆方法来完成，这成为TALE应用的最大障碍。目前，构建TALE串联重复序列的主要方法包括人工合成全长的TALE序列，基于Golden Gate的载体克隆技术，基于同尾酶的载体克隆技术，基于T4DNA聚合酶的不依赖连接酶(ligation-independent cloning,LIC)的载体克隆技术，以及基于USER酶的ULtiMATE技术。GoldenGate技术主要利用IIS类限制性内切酶的特性：识别位点和切割位点不在同一位置；因此，当把含有切割位点的接头加在5’和3’端时，通过酶切反应产生的黏性末端如果互补，就可以通过连接反应将这些DNA片段连接在一起，并且正确连接的片段将不再有对应的识别位点。未连接的产物由于具有识别位点会再次被切割，最终正确连接的产物越来越多。基于这种方法的TALE载体构建已经广泛报道(Cermak et al.,2011；Zhang et al.,2011b)。基于同尾酶的TALE构建原理如下：其采用了“替代重复单元”(或称“旁重复单元”,alternativerepeat unit),从而能够利用氨基酸密码的简并性在这种重复单元的两端设计一对同尾酶(5′端SpeⅠ和3′端NheⅠ)的酶切位点，再加上一个辅助性的HindⅢ位点,这样就可以用相同的酶切策略、通过酶切-连接的循环操作构建任意长度的重复序列(Huang etal.,2011)。基于T4DNA聚合酶的不依赖连接酶(ligation-independent cloning,LIC)的TALE构建原理如下：在只有一种dNTP情况下利用T4DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性产生固定长度的互补尾部。该酶以3’-5’方向切除核苷酸直至其遇到与反应混合物中加入的那种dNTP相同的核苷酸。此时，由于dNTP的掺入，T4DNA聚合酶的聚合酶活性取代了核酸外切酶活性。由于这些互补尾部较长，因此不需要额外的DNA连接酶就可以被连接起来(Schmid-Burgk et al.,2013)。ULtiMATE原理如下：这种方法需要先构建3个单体所有可能组和的载体库，然后利用USER酶特异识别并切割脱氧尿嘧啶核苷酸残基(dU)的特性，使DNA片段产生独特的单链DNA突出末端，从而达到组装TALE的目的(Yang et al.,2013)。

直接合成法最大的缺点在于价格非常昂贵，而且对于发片段的合成容易出错。基于Golden Gate的方法技巧性较强，反应条件需要反复摸索和调整，而且效率相对较低。LIC和ULtiMATE的方法需要构建大量的质粒库，过程比较繁琐。

固相合成法：这种方法使通过亲和素-链霉素系统将TALE重复单元和磁珠偶联，通过不断地添加和洗脱达到构建任意长度TALE重复序列的目的。但是这种方法比较昂贵且耗时，工作量大(Reyon et al.,2012)。

目前的技术在高通量文库的构建方面存在技术复杂，工作量大等方面的缺陷。

发明内容

针对目前构建TALE高通量文库的方法工作量大且复杂，不利于TALE技术的推广的问题。本发明提供了一种通过一步克隆反应即可得到完整的TALE载体的方法，极大地简化了高通量文库的构建。

本发明提供了一种构建TALE重复序列载体的方法，所述方法包括：

1)以含有TALE二聚体的核苷酸序列为模板进行PCR扩增；

2)以BsaI酶切步骤1)得到的扩增产物，将所述酶切获得的含TALE的片段连接形成TALEN重复序列载体。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中所述TALE二聚体的单体具有如SEQ IDNO:1所示的通式：

SEQ ID NO:1LTPEQVVAIASX₁X₂GGKQALETVQRLLPVLCQX₃HG；

其中，X₁X₂选自NH、NI、HD和NG中的一个组合；X₃为A或D。

在根据本发明的一个实施方案中，编码所述单体的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

在根据本发明的一个实施方案中，所述含有TALE二聚体的序列是通过包含下述步骤的方法得到的：

首先，以包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列为模板，使用引物F9/R9和F10/R10分别用Q5DNA聚合酶PCR扩增得到第一个TALE单体和第二个TALE单体；然后使用引物F9/R10通过重叠PCR将所述第一个和第二个TALE单体拼接起来；其中，所述引物F9为SEQ ID NO:19；引物R9为SEQ ID NO:20；引物F10为SEQ ID NO:21；引物R10为SEQ ID NO:22。

在根据本发明的一个实施方案中，所述步骤1)中PCR所使用的二聚体扩增引物选自下述组合中一组或多组：

以SEQ ID NO:3为上游引物，SEQ ID NO:4为下游引物；

以SEQ ID NO:5为上游引物，SEQ ID NO:6为下游引物；

以SEQ ID NO:7为上游引物，SEQ ID NO:8为下游引物；

以SEQ ID NO:9为上游引物，SEQ ID NO:10为下游引物；

以SEQ ID NO:11为上游引物，SEQ ID NO:12为下游引物；

以SEQ ID NO:13为上游引物，SEQ ID NO:14为下游引物；

以SEQ ID NO:15为上游引物，SEQ ID NO:16为下游引物；

或以SEQ ID NO:17为上游引物，SEQ ID NO:18为下游引物；

优选地，所述二聚体扩增的反应条件为：98℃反应30秒，98℃反应10秒,55℃反应10秒,72℃反应20秒；30个循环后，72℃延伸2min，产物于4℃保存。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)是通过包括下述步骤的方法实现的：

将步骤1)中得到的PCR回收片段、TALEN骨架载体、BsaI酶、DNA连接酶、CutSmart缓冲液、ATP混匀，置于PCR仪中，反应条件为：37℃反应5分钟，20℃反应5分钟，20个循环；50℃反应5分钟，80℃反应5分钟；优选地，所述TALEN骨架载体选自pTALEN-NI、pTALEN-NN、pTALEN-NG或pTALEN-HD；；优选地，所述DNA连接酶为T4连接酶或T7连接酶。

在根据本发明的一个实施方案中，所述PCR回收片段为多种不同的片段；优选地，每一种PCR回收片段与TALEN骨架载体的质量比为1：10。

本发明进一步提供了一种含有TALE二聚体的质粒，所述质粒是通过包括下述步骤的方法得到的：

首先，以SEQ ID NO:2为模板，使用引物F9/R9和F10/R10分别用Q5DNA聚合酶PCR扩增得到第一个TALE单体和第二个TALE单体；然后使用引物F9/R10通过重叠PCR将所述第一个和第二个TALE单体拼接起来；然后，通过EcoRⅠ/BamHⅠ酶切，得到TALE二聚体单元；最后，将所述TALE二聚体单元克隆到pEGFP-N1载体中，即得；其中，所述引物F9为SEQ ID NO:19；引物R9为SEQ ID NO:20；引物F10为SEQ ID NO:21；引物R10为SEQ ID NO:22。

另一方面，本发明具有以下有益效果：

尽管现有技术中存在利用USER克隆快速、简便地构建TALE相关质粒的方法，但是该方法需要两步反应才能得到完整的TALE载体，而且在第一步反应时涉及到载体连接，需要转化、摇菌、鉴定及提取质粒，客观上提高了工作量，耗费了时间，不利于高通量构建TALE相关载体。基于此，本发明进一步提供了一种可以一步快速构建TALE相关载体的方法，非常适合高通量TALE文库的构建。

本发明方法为了达到一步能够完成载体构建的目的，在工作量和起始TALE重复单元的数量之间取得平衡，发明人在研究中：发现如果选用TALE单体作为起始模板只需要构建4个起始质粒，但需要将十几个单体一次性连接起来，难度大、效率低；如果选用TALE三聚体作为起始模板则需要构建64个起始质粒(4×4×4)，需要的质粒过多，工作量较大，但相对比较容易将片段连接起来。最优选地以TALE二聚体作为起始的模板，这样涉及的载体数量不会太多，也比较有可能将8个片段一次性连接起来。

相对于现有技术中构建TALEN的方法，本发明操作更加简单，需要的载体数量和工作量更少，并且能够通过PCR的方式进行扩增，大大提高了工作效率。

附图说明

图1为一步法构建TALEN的方法的示意图。其中，每个TALE二聚体两侧各包含一个BsaI识别位点。PCR产物经BsaI酶切后产生各不相同的粘性末端，然后被连接成完整的TALEN载体。

图2为TALE二聚体单元的构建步骤。该图为TALEN结构示意图，包含一个氨基端保守结构域，一个胸腺嘧啶识别结构域和一系列的重复单元以及融合FokI结构域的羧基端保守序列；TALE二聚体PCR和菌落PCR鉴定结果。

图3为利用一步法构建TALEN质粒。a为PCR扩增对应的1-8位TALE二聚体；b为分别利用T4；c为T7DNA连接酶构建TALEN质粒的菌落PCR鉴定结果。

图4为通过FLASH法构建TALEN载体的步骤示意图。

图5为通过LIC法构建TALEN载体的步骤示意图；其中，a为将TALE单体组装成五聚体的示意图；b为将五聚体组装进载体的示意图；c为将五聚体组装成完整TALEN载体的示意图。

图6为其它构建TALEN载体的常见方法，其中，a为利用三聚体文库构建完整TALEN载体的示意图；b为利用此法构建TALEN的流程图；c为利用此法构建的TALEN体内切割活性检测实例。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非特殊指明，本发明所使用的试剂和材料均可通过商业途径获得。

实施例1一步法构建TALEN的方法

1.按照TALEN位点选取原则在基因外显子区域选择16bpTALE结合位点。

2.利用二聚体扩增引物(如表1所示)PCR扩增TALE结合位点对应位置的TALE二聚体，并纯化回收PCR产物。

3.选取对应位置的二聚体PCR回收片段各10ng,TALEN骨架载体100ng，加入BsaI、T4/T7DNA连接酶、CutSmart缓冲液、ATP等混匀，于PCR仪中按如下反应操作：37℃反应5分钟，20℃反应5分钟，20个循环；50℃反应5分钟，80℃反应5分钟。

4.反应结束后将产物加入感受态细胞中转化，第二天挑单克隆摇菌，利用菌落PCR鉴定阳性克隆。

表1二聚体扩增引物

表中下划线处表示BsaI酶切位点。

实施例2TALE二聚体起始质粒的构建

由于TALE重复序列的性质，为了使PCR能够顺利地扩增TALE二聚体，利用密码子的简并性发明人对编码前后两个TALE单体的DNA序列做了优化，同时将第二个单体的倒数第三个氨基酸由A变成D。首先以包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列为模板，使用引物F9/R9和F10/R10分别用Q5DNA聚合酶PCR扩增第一和第二个TALE单聚体，然后使用引物F9/R10通过重叠PCR将第一个和第二个TALE单聚体拼接起来；再用EcoRI/BamHI双酶切，将TALE二聚体单元克隆进pEGFP-N1载体中，测序后提取质粒。

SEQ ID NO:2CTCACCCCAGAGCAGGTCGTGGCAATTGCGAGCAACATCGGGGGAAAGCAGGCACTCGAAACCGTCCAGAGGTTGCTGCCTGTGCTGTGCCAAGCGCACGGATTGACGCCCGCACAAGTAGTTGCAATTG CGAGCAACATCGGGGGAAAGCAGGCACTCGAAACCGTCCAGAGGTTGCTGCCCGTTTTATGTCAGGACCATGGC

F9：SEQ ID NO:19 5'CGCgaattcCTCACCCCAGAGCAGGTCGTGG3'

R9：SEQ ID NO:20 5’CTACTTGTGCGGGCGTCAATCCGTGCGCTTGGCACAGCA 3’

F10：SEQ ID NO:21 5’TGCTGTGCCAAGCGCACGGATTGACGCCCGCACAAGTAG 3’

R10：SEQ ID NO:22 5'GGCggatccGCCATGGTCCTGACATAAAAC3'

实施例3TALE一步法构建TALEN载体

首先验证PCR能否扩增出TALE二聚体条带。利用表1所示的扩增引物进行PCR扩增，电泳条带显示对应1-8个二聚体均能够被扩增(图3)。然后回收PCR产物并利用实施例1中的方法验证是否能够得到正确组装的阳性克隆。图3中b和c分别利用T4或者T7DNA连接酶来连接，发现用这两种酶都能得到正确组装的TALEN载体。

比较例4TALE一步法与FLASH法的比较

图4为FLASH法构建TALEN载体的步骤示意图，其步骤为：

FLASH法主要是将TALE重复单元与生物素偶联，利用生物素-亲和素系统不断地纯化、回收连接的片段，最终合成预定长度的片段并将其插入TALEN表达载体中。

具体可参见Reyon et al,2012；Nat Biotechnol。

与FLASH法相比，本发明的TALE一步法更加简单、快速，并且仅需要更少的工作量即可完成。

比较例5TALE一步法与LIC法的比较

图5为LIC法构建TALEN载体的步骤示意图，其步骤为：

LIC法主要利用T4DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性形成粘性末端，在退火反应中具有同源序列的载体和插入基因会连接起来；带缺口和突出端的DNA复合物在细菌中能有效被修复。通过这种克隆方法可以同时将多个TALE重复单元连接起来，从而得到完整的TALEN载体。

具体可参见Schmid-Burgk et al,2013；Nat Biotechnol。

与LIC法相比，本发明的TALE一步法具有需要载体量和工作量更少的优点。

比较例6TALE一步法与其它方法的比较

图6为另一种常见的构建TALEN载体的步骤示意图，其步骤为：

这种方法主要是利用Golden Gate克隆法首先构建一个TALE三聚体的载体库，再根据需要从这个载体库中选择对应的TALE三聚体通过一轮Golden Gate反应得到完整的TALEN载体。

具体可参见Kim et al.,2013；Nat Biotechnol。

与该方法相比，本发明的TALE一步法需要的载体量少、工作量更少，并且本发明的TALE一步法可以通过PCR的方法实现，更加快捷简便。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims

1.一种构建TALE重复序列载体的方法，其特征在于，所述方法包括：

1）以含有TALE二聚体的核苷酸序列为模板进行PCR扩增；

2）以BsaI酶切步骤1）得到的扩增产物，将所述酶切获得的含TALE的片段连接形成TALEN重复序列载体；

其中，步骤1）中所述TALE二聚体的单体具有如SEQ ID NO:1所示的通式：

SEQ ID NO:1 LTPEQVVAIASX₁X₂GGKQALETVQRLLPVLCQX₃HG；

其中，X₁X₂选自NH、NI、HD和NG中的一个组合；X₃为A或D；其中，所述二聚体单体中的一个X₃为A，另一个X₃为D；

其中，步骤2）是通过包括下述步骤的方法实现的：

将步骤1）中得到的PCR回收片段、TALEN骨架载体、BsaI酶、DNA连接酶、CutSmart缓冲液、ATP混匀，置于PCR仪中反应；每一种PCR回收片段与TALEN骨架载体的质量比为1：10。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述单体的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有TALE二聚体的序列是通过包含下述步骤的方法得到的：

首先，以包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列为模板，使用引物F9/R9和F10/R10分别用Q5DNA聚合酶PCR扩增得到第一个TALE单体和第二个TALE单体；然后使用引物F9/R10通过重叠PCR将所述第一个和第二个TALE单体拼接起来；其中，所述引物F9为SEQ ID NO:19；引物R9为SEQ ID NO:20；引物F10为SEQ ID NO:21；引物R10为SEQ ID NO:22 。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中PCR所使用的二聚体扩增引物选自下述组合中一组或多组：

以SEQ ID NO:3为上游引物，SEQ ID NO:4为下游引物；

以SEQ ID NO:5为上游引物，SEQ ID NO:6为下游引物；

以SEQ ID NO:7为上游引物，SEQ ID NO:8为下游引物；

以SEQ ID NO:9为上游引物，SEQ ID NO:10为下游引物；

以SEQ ID NO:11为上游引物，SEQ ID NO:12为下游引物；

以SEQ ID NO:13为上游引物，SEQ ID NO:14为下游引物；

以SEQ ID NO:15为上游引物，SEQ ID NO:16为下游引物；

或以SEQ ID NO:17为上游引物，SEQ ID NO:18为下游引物。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，二聚体扩增的反应条件为：

98℃反应30秒，98℃反应10秒, 55℃反应10秒, 72℃反应20秒；30个循环后，72℃延伸2min, 产物于4℃保存。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述PCR反应条件为：37℃反应5分钟，20℃反应5分钟，20个循环；50℃反应5分钟，80℃反应5分钟。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述TALEN骨架载体选自pTALEN-NI、pTALEN-NN、pTALEN-NG或pTALEN-HD。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述DNA连接酶为T4连接酶或T7连接酶。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR回收片段为多种不同的片段。

10.一种含有TALE二聚体的质粒，其特征在于，所述质粒是通过包括下述步骤的方法得到的：

首先，以SEQ ID NO:2为模板，使用引物F9/R9和F10/R10分别用Q5 DNA聚合酶PCR扩增得到第一个TALE单体和第二个TALE单体；然后使用引物F9/R10通过重叠PCR将所述第一个和第二个TALE单体拼接起来；然后，通过EcoRⅠ/BamHⅠ酶切，得到TALE二聚体单元；最后，将所述TALE二聚体单元克隆到pEGFP-N1载体中，即得；其中，所述引物F9为SEQ ID NO:19 ;引物R9为SEQ ID NO:20; 引物F10为SEQ ID NO:21 ；引物R10为SEQ ID NO:22。