CN113584064B - 一种基于密码子简并性的快速tale表达载体构建方法 - Google Patents

一种基于密码子简并性的快速tale表达载体构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113584064B
CN113584064B CN202110746218.1A CN202110746218A CN113584064B CN 113584064 B CN113584064 B CN 113584064B CN 202110746218 A CN202110746218 A CN 202110746218A CN 113584064 B CN113584064 B CN 113584064B
Authority
CN
China
Prior art keywords
tale
leu
pro
gly
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110746218.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113584064A (zh
Inventor
邹庆剑
程令印
郑雨龄
郑淑文
刘玉
周小青
唐成程
陈敏
赖良学
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuyi University
Original Assignee
Wuyi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuyi University filed Critical Wuyi University
Priority to CN202110746218.1A priority Critical patent/CN113584064B/zh
Publication of CN113584064A publication Critical patent/CN113584064A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113584064B publication Critical patent/CN113584064B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于密码子简并性的快速TALE表达载体构建方法。本发明针对现有TALE模块的组装需要大量载体库，以及构建过程复杂的不足，从头设计了基于引物扩增、串接和等温装配的TALE载体组装策略。本发明利用基础引物扩增出RVD模块三联体，快速获得64个三联体模块组合；然后在通过串接引物依序扩出多个三联体(或四联体)，并利用等温装配的方法构建各种TALE载体。本发明简单可行，易于掌握，载体组装过程仅需1.5到2个小时，可以快速构建靶向24bp内任意长度和组合的DNA序列的TALE载体以及TALE基础上的衍生效应子载体。

Description

一种基于密码子简并性的快速TALE表达载体构建方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于密码子简并性的快速TALE表达载体构建方法。
背景技术
类转录激活效应器(TALE)蛋白家族是来自于植物病原体－黄单胞杆菌的天然细菌效应蛋白。它类似于真核生物的转录因子，通过识别特异DNA序列来调节宿主基因的转录，促进细菌定植。TALE蛋白中部包含一段由串联重复单体构成的DNA特异识别和结合区域，其中每个单体由34个重复氨基酸组成。而TALE的重复部分是由数个重复单体加约含20个氨基酸残基的0.5个重复单位构成。每个单体的第12和13位点的氨基酸却有所不同，这两个位点被命名为重复可变双残基(RVD)。每个RVD中有一个简单密码来指定识别一个特定的碱基，从而决定了TALE核苷酸结合的特异性。如NI对应A、NG对应T、HD对应C、NN对应G(Bochet al.,2009；Moscou and Bogdanove,2009)。天然形成的TALE具有大约2～34个数量不等的单体模块组成。
目前，TALE技术广泛地应用于基因组工程技术领域的多个方面，例如TALE与FokI融合形成TALE核酸酶(TALEN)，与转录调剂结构域(比如VP16和KRAB)结合形成TALE转录因子(TALE-TFs)(Gao et al.,2014)，和组蛋白修饰因子(比如LSD1)结合构建TALE染色质编辑(TALE-CEs)(Mendenhall et al.,2013)等。
TALE技术的关键是构建识别特异DNA序列的TALE载体。由于TALE序列的高度保守性，TALE串联重复序列的构建不能用常规的分子克隆方法来完成，这成为TALE应用的最大障碍。目前，构建TALE串联重复序列的主要方法包括人工合成DNA技术，基于Golden Gate的克隆技术(Cermak et al.,2011)，基于T4 DNA聚合酶不依赖连接酶的LIC克隆技术(Schmid-Burgk et al.,2013)，基于固相合成的克隆技术：如FLASH和ICA技术(Briggs etal.,2012；Reyon et al.,2012)，高通量合成技术：如FairyTALE(Liang et al.,2014)和reTALE(Yang et al.,2013)，以及基于酶切法和Gibson组装法的STAR技术(Gogolok etal.,2016)等。直接DNA合成法在TALE技术出现早期使用，现已很少使用，因为重复片段的合成易出错，且价格非常昂贵。Golden Gate法是TALEn设计和构建组装用得最为广泛的技术。该方法根据RVD识别核苷酸的规律以及在TALE蛋白中的顺序位置，分别构建包含50个RVD单元模块的质粒载体、5个末位RVD模块质粒载体、13个中间载体以及4个表达骨架载体，形成一个载体文库。TALE组装原理是根据靶序列核苷酸顺序从文库中挑出所需的不同RVD单元载体，通过特点II型内切酶切开形成多种按顺序一一对应的、特异匹配的粘性末端。经过反复酶切连接循环，实现多个RVD单元模块的有序组装。Golden Gate法构建TALE一般需要5天时间，过程繁琐、耗时且效率低。其它方法，如LIC法是基于T4DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性和聚合酶活性通过控制dNTP的渗入来实现RVD单位模块的组装。但这种方法同样需要构建大量载体库，实验步骤复杂，过程繁琐，易出错。FairyTALE和reTALE固相合成法用亲和素-链霉素系统将TALE的RVD单元模块和磁珠偶联，通过不断的添加和洗脱达到构建组装TALE模块的目的。这个过程工作量大、耗时且比较昂贵。基于Gibson法的STAR技术能在一天完成TALE组装，但同样需要大量载体库，且步骤繁琐，成功率较低。
综上所述，目前的技术在TALE重复模块组装方面仍然存在诸多问题，严重限制TALE技术的进一步应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于密码子简并性的快速TALE表达载体构建方法。
本发明针对现有TALE载体构建存在的昂贵、繁琐和低效等问题，提出了一种新型TALE载体构建方法。本发明是一种用户友好、省时省力的TALE载体组装策略，有利于在各个研究机构和公司广泛应用。
TALE组装的理想方法包括简单的设计，高效率，最少的动手时间，高通量组装，并且不需要复杂的质粒文库。为了满足这一需求，我们设计了一种基于引物的TALE(PriTA)装配技术，实现TALE的RVD单元模块按顺序组装。我们的发明使TALE质粒的构建简单易行，快速高效。本发明将使更多实验室轻松掌握TALE装配，使TALE重新成为遗传修饰和调控的主要工具。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种TALE表达载体构建方法，所述构建方法为通过密码子简并性构建获得TALE三联体模块，再通过TALE三联体模块按顺序拼接，连接到TALE骨架载体上形成TALE表达载体。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，所述TALE三联体模块为三个TALE模块的单体串联得到，包括三个重复的氨基酸序列，所述TALE三联体模块的氨基酸序列为：LTPDQVVAIASX1X2GGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASX3X4GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASX5X6GGKQALETVQRLLPVLCQAHG，如SEQ ID NO:1所示；
其中X1X2、X3X4、X5X6为NI、NN、NG、HD的任意一种组合，共64种组合。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，所述TALE三联体模块的核苷酸序列为：CTTACACCGGATCAAGTTGTCGCTATTGCTTCTMACRDTGGTGGGAAGCAGGCATTGGAAACCGTCCAGAGACTCCTTCCCGTGCTTTGCCAAGCTCATGGACTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCMACRDTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTCACCCCCGATCAGGTCGTTGCAATCGCATCCMACRDTGGCGGAAAACAAGCCCTGGAGACAGTGCAACGATTGCTGCCGGTCCTGTGTCAAGCACACGGC，如SEQ ID NO:2所示；
其中MACRDT分别代表AACAAT、AACATT、AACGGT、CACGAT的任意一种组合，共64种组合。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，所述构建方法包括以下步骤：
S1.通过PCR技术获得64种TALE三联体模块组合库；
S2.以三联体模块为模板，利用接头引物进行PCR，再按顺序将多个三联体进行重组串联，并同时与TALE骨架载体进行重组连接获得重组TALE表达载体。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，步骤S1具体为：
分别以SEQ ID NO:3～6为模板，以SEQ ID NO:7～8为引物，扩增得到4个片段，再以所述4个片段为模板，以SEQ ID NO:9～13为上游引物和SEQ ID NO:14～16为下游引物进行扩增，共获得64种组合的三联体模块的核苷酸片段。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，步骤S2中所述按顺序将多个三联体进行重组串联为利用等温重组技术进行串联；
所述串联中接头引物以三联体模板库作为扩增模板，具有顺序性和方向性；接头引物扩增产物按顺序有15～25bp的重叠区域，最后一条产物下游与TALE骨架载体的C端重叠；第1条产物上游与TALE骨架载体N端有20bp重叠序列，下游与第2条产物上游有20bp重叠......依次类推。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，所述等温重组技术包括目前市面上常见的无缝克隆技术及其衍生技术，能同时进行载体和多个片段的一步重组连接。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，所述等温重组技术为Gibson等温重组法。其中，在三联体扩增引物末端添加15～28bp的NDA重叠区域，每个三联体模块前后重叠区域由于密码子简并性，DNA序列不同。其中第一个片段的上游末端与载体酶切后的TALE的N端重叠，下游与第二个三联体片段上游重叠，第二个三联体的下游与第三个三联体上游末端重叠，以此类推，最后一个三联体，引物分别设计结合三联体第一个、第二个和第三个模块的中部，扩增获得包含最后一个模块的单体，二联体或三联体，突出的末端与TALE载体的C端重叠。
根据识别的目标序列调取TALE三联体模块和衔接引物对，扩增获得PCR产物。进一步的，PCR产物纯化。进一步的，将纯化PCR产物与骨架载体1:1混合，加入等温重组酶，进行重组反应。三联体按顺序连入骨架载体。进一步的，将重组载体进行转化、提质粒和鉴定。
本发明还给出了利用等温重组技术进行串联的一个范例：
为构建结合靶序列TTTCTGTGACCAATCCT的TALE表达载体，将目标序列按顺序分拆TTT、CTG、TGA、CCA、ATC、CT，找到对应的三联体核苷酸模板，TTT、CTG、TGA、CCA、ATC、CTN，按顺序用引物进行PCR扩增。
所述接头引物核苷酸序列如SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:34所示；
所述TALE三联体模块识别DNA核苷酸长度设为X，10≤X≤24，将X个核苷酸按顺序分为3个一组，大于三组，小于等于八组，扩增三联体模块按顺序分别结合每组核苷酸。
具体的，SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:18扩增第1条三联体模块，SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:20扩增第2条三联体模块，SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:22扩增第3条三联体模块，SEQ ID NO:23～SEQ ID NO:24扩增第4条三联体模块，SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:26扩增第5条三联体模块，SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:28扩增第6条三联体模块，SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:30扩增第7条三联体模块。
最后一个产物上游引物可以是SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQID NO:29、SEQ ID NO:31中的任意一个；
下游引物可以是SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34中的任意一个。
具体的，SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34分别结合三联体模块中的第1，第2和第3个TALE模块。与上游引物的不同组合可以从三联体模板扩增出最后一个TALE模块(第10到第24个模块)。与前面的三联体模块组合后，形成完整的模块组合。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，步骤S2中所述按顺序将多个三联体进行重组串联为利用Golden Gate酶切连接技术进行串联；
其中，在三联体扩增引物末端添加IIS限制性内切酶酶切位点，每个三联体模块酶切产生的粘性末端不同，其中第一个片段的上游粘性末端与载体酶切后的TALE的N端互补配对，下游与第二个三联体酶切片段上游互补，第二个三联体的下游与第三个三联体上游末端互补，以此类推，最后一个三联体，分别设计结合三联体第一个、第二个和第三个模块的中部，扩增获得包含最后一个模块的单体，二联体或三联体，突出的粘性末端与TALE载体的C端互补配对。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，步骤S2具体包括以下步骤：
S21.根据识别的目标序列调取TALE三联体模块和衔接引物对，扩增获得PCR产物；
S22.PCR产物纯化；
S23.将纯化PCR产物与TALE骨架载体1:1混合，加入相应的IIS限制性内切酶和DNA连接酶，进行Golden Gate法酶切连接反应，将三联体模块按顺序连入TALE骨架载体得到TALE表达载体。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，利用Golden Gate酶切连接技术进行串联中，所述接头引物都是以三联体模板库作为扩增模板，具有顺序性和方向性。接头引物扩增产物末端加上一段IIS型限制性内切酶识别位点，酶切产物形成粘性末端，可以按顺序互补。例如：第1条产物上游与TALE表达载体N端互补，下游与第2条产物上游互补......依次类推；最后一条产物下游与TALE表达载体的C端重叠。接头引物核苷酸序列为SEQ ID NO:35～SEQ ID NO:52。
具体的，TALE模块识别DNA核苷酸长度设为X(本实施方案中10≤X≤24)。将X个核苷酸按顺序分为3个一组，大于三组，小于等于八组。扩增三联体模块按顺序分别结合每组核苷酸。
具体的，SEQ ID NO:35～SEQ ID NO:36扩增第1条三联体模块，SEQ ID NO:37～SEQ ID NO:38扩增第2条三联体模块，SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:40扩增第3条三联体模块，SEQ ID NO:41～SEQ ID NO:42扩增第4条三联体模块，SEQ ID NO:43～SEQ ID NO:44扩增第5条三联体模块，SEQ ID NO:45～SEQ ID NO:46扩增第6条三联体模块，SEQ ID NO:47～SEQ ID NO:48扩增第7条三联体模块。最后一个产物上游引物可以是SEQ ID NO:41、SEQID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49；下游引物可以是SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52。
具体的，SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52分别结合三联体模块中的第1，第2和第3个TALE模块。与上游引物的不同组合可以从三联体模板扩出最后一个TALE模块(第10到第24个模块)。与前面的三联体模块组合后，形成完整的模块组合。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，所述Golden Gate酶切连接技术包括目前市面上常见的IIS限制性酶和连接酶，进行循环酶切和连接，实现载体和多个片段的一步连接。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，所述TALE骨架载体是可转化细菌，经克隆生长、细菌培养和质粒提取后，获得用于转染细胞的载体。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，所述TALE骨架载体含有启动子、TALE恒定N端序列、IIS限制性内切酶识别位点1、lacZ表达框、IIS限制性内切酶识别位点2、TALE恒定C端序列、以及编码功能性结构域的效应子序列。其中lacZ表达框可以用其它任意序列替代，功能性结构域的效应子序列可以位于TALE序列的N端之前，也可以位于C端之后。功能性结构域效应子序列可以是FokI编码序列、表观遗传调控序列、荧光蛋白序列、转录调控序列等。
作为本发明所述构建方法的优选实施方式，所述TALE表达载体还包含TALE N端和C端的非重复模块区域，以及效应子区域。
具体的，TALE N端和C端之间插入一个原核表达LacZ序列，LacZ序列两头有同一个酶切位点Esp3I，核酸序列为SEQ ID NO:53所示。
具体的，TALE后效应子包括但不限于以下序列：
(1)基因编辑蛋白FokI(EL)，氨基酸序列为SEQ ID NO:54；
(2)基因编辑蛋白FokI(KK)，氨基酸序列为SEQ ID NO:55；
(3)调控基因转录蛋白VP64，氨基酸序列为SEQ ID NO:56；
(4)调控基因转录蛋白VPR，氨基酸序列为SEQ ID NO:57；
(5)基因位点定位蛋白EGFP，氨基酸序列为SEQ ID NO:58；
(6)表观遗传调控蛋白TET1，氨基酸序列为SEQ ID NO:59；
(7)表观遗传调控蛋白DMNT1，氨基酸序列为SEQ ID NO:60；
(8)单碱基编辑蛋白DddAn，氨基酸序列为SEQ ID NO:61；
(9)单碱基编辑蛋白DddAc，氨基酸序列为SEQ ID NO:62。
本发明还提供所述构建方法构建得到的TALE表达载体。
本发明的有益效果：
尽管目前有各种技术可以实现TALE载体模块定制，但这些方法要么费时耗力，要么效率低下，要么仅能实现特定长度的TALE构建。本发明克服了TALE模块装配过程中的诸多缺点，本发明不需要特别的技术和原料，仅用实验室的常规试剂耗材，就能以最快的速度实现高效率的TALE装配。利用本发明构建的TALE模块在细胞内能有效结合到相应的DNA核苷酸区段，根据效应子的不同实现相应的功能。
附图说明
图1：TALE三联体模块核苷酸序列的构建。A：TALE单体模块结构由34个氨基酸组成，其RVD区域为第12、13氨基酸(NI识别A、NG识别T、NN识别G、HD识别C)，对应表达的氨基酸的DNA核苷酸序列为102bp长度。B：根据密码子简并性原理，设计表达三联体氨基酸的非重复核苷酸序列。合成四条RVD区域的第一模块，第二模块和第三模块引物，以中间模块引物为模块扩增第一轮，再以两头引物为模板扩出全长非重复三联体模块核苷酸序列。
图2：Tale构建图例。
图3：蓝白斑筛选菌落图；其中，上：Gibson法平板；下：Golden Gate法平板。
图4：重组法构建质粒的酶切鉴定；其中，上：Gibson法构建质粒酶切图；下：GoldenGate法构建质粒酶切图。
图5：PB-CAG-PURO-T-sfGFP载体图谱。
图6：Reporter载体与TALEN质粒共转染293T细胞后，细胞荧光表达图。上：空白对照，仅转入PTG质粒；中：阳性对照，转入PTG和PX459+grna质粒；下：转入PTG、TALEN-L(EL)、TALEN-R(KK)质粒。
图7：TALE-EGFP活体标记人细胞染色体端粒。
图8：TALE-VPR对内源VEGF-A基因的激活作用；其中，上：转入VPR-1；下：转入VPR-2。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
除非特殊指明，本发明所用的试剂盒耗材均可通过商业途径获得。
本发明中涉及的部分序列的编号如下：
TALE三联体模块的氨基酸序列：SEQ ID NO:1
TALE三联体模块的核苷酸序列：SEQ ID NO:2
A2：SEQ ID NO:3
T2：SEQ ID NO:4
C2：SEQ ID NO:5
G2：SEQ ID NO:6
T-f：SEQ ID NO:7
T-r：SEQ ID NO:8
A1：SEQ ID NO:9
T1：SEQ ID NO:10
C1：SEQ ID NO:11
G1：SEQ ID NO:12
A3：SEQ ID NO:13
T3：SEQ ID NO:14
C3：SEQ ID NO:15
G3：SEQ ID NO:16
r1F：SEQ ID NO:17
r1R：SEQ ID NO:18
r2F：SEQ ID NO:19
r2R：SEQ ID NO:20
r3F：SEQ ID NO:21
r3R：SEQ ID NO:22
r4F：SEQ ID NO:23
r4R：SEQ ID NO:24
r5F：SEQ ID NO:25
r5R：SEQ ID NO:26
r6F：SEQ ID NO:27
r6R:SEQ ID NO:28
r7F:SEQ ID NO:29
r7R:SEQ ID NO:30
r8F:SEQ ID NO:31
rRP+1:SEQ ID NO:32
rRP+2:SEQ ID NO:33
rRP+3:SEQ ID NO:34
1F:SEQ ID NO:35
1R:SEQ ID NO:36
2F:SEQ ID NO:37
2R:SEQ ID NO:38
3F:SEQ ID NO:39
3R:SEQ ID NO:40
4F:SEQ ID NO:41
4R:SEQ ID NO:42
5F:SEQ ID NO:43
5R:SEQ ID NO:44
6F:SEQ ID NO:45
6R:SEQ ID NO:46
7F:SEQ ID NO:47
7R SEQ ID NO:48
8F:SEQ ID NO:49
RP+1:SEQ ID NO:50
RP+2:SEQ ID NO:51
RP+3:SEQ ID NO:52
实施例1 TALE三联体模板的构建
第一轮PCR：分别以SEQ ID NO:3～6为模板，以SEQ ID NO:7～8为引物，扩出4个片段；
第二轮PCR：再以此4片段为模板，以SEQ ID NO:9～13为上游引物和SEQ ID NO:14～16为下游引物分别进行扩增，共获得64种组合的非重复的三联体核苷酸片段。
两轮PCR体系和反应条件相同，PCR试剂为Takara公司的PrimerStar MAX预混液，反应体系为PrimerStar MAX 15μL、引物(10μM)各1μL、模板0.2μL、H2O 14μL。PCR反应条件为98℃1min预变性，98℃10s变性，55℃10s退火，72℃10s延伸，循环数为30，最后延伸时间为2min。
将64个三联体核苷酸片段进行直接测序，或是进一步连入Pmd19 T载体测序，结果正确后作为模板库(如图1)。模板库存储于-80℃，用于后续试验。
实施例2构建结合靶序列TTTCTGTGACCAATCCT的TALE载体
首先，将TALE骨架质粒用esp3I进行酶切，获得线性化的载体。
然后，将目标序列按顺序分拆TTT、CTG、TGA、CCA、ATC、CT，找到对应的三联体核苷酸模板，TTT、CTG、TGA、CCA、ATC、CTN，按顺序用引物进行PCR扩增(如图2)。PCR试剂为takara公司的PrimerStar MAX预混液，反应体系为PrimerStar MAX 15μL、引物(10μM)各1μL、模板0.2μL、H2O 14μL。PCR反应条件为98℃1min预变性，98℃10s变性，55℃10s退火，72℃10s延伸，循环数为30，最后延伸时间为2min。
用PCR产物回收或胶回收的方法回收6个片段，测定片段DNA浓度。骨架载体和每个片段分别取25fmol，再加上重组酶，配制5μL重组反应体系。反应条件为，50℃20min。
重组反应完成后，进行细菌转化实验，将重组产物与感受态细菌混合，通过42℃热击将质粒转化到细菌中，再涂抹于细菌培养板中，通过抗生素和蓝白斑筛选系统进行筛选。第二天观察主要菌落为白色菌落，有少部分蓝色菌落(图3)。挑取白色细菌克隆进行进一步扩大培养，提取质粒，通过酶切和测序鉴定重组连接正确的克隆质粒。
酶切结果如图4所示，17RVD为酶切正确的样本，Wrong为酶切错误的样本，两个Marker依次分别为15000bp和2000bp。上图表明Gibson方法构建的样本成功效率为73.3％(11/15)，下图表明Golden Gate方法构建的样本成功效率为93.3％(14/15)。
实施例3 TALEN载体的构建和活性验证
首先，构建reporter载体PB-CAG-PURO-T-sfGFP(图5)，载体包含CAG启动子，在真核细胞内可启动puro抗性基因的表达，puro抗性基因下游包含一段TALEN识别序列PURO-GGAGGTGGCAGCGGTGGGGGATCCCATCCTCAGTACTCCGGTCTACCTGGATGCCCTGGTCTCGGGCAACTGGGAGGACCATCGAACAGTAACTGACGAAGGATCC-nsfGFP，其中黄色背景为TALEN对的识别位点，TAA为PURO基因表达的终止密码。由于有终止密码，这个载体转染细胞后，nsfGFP不会表达出绿色荧光蛋白。
其次，构建一对TALEn，TALE效应子，下游插入FokI内切酶的催化结构域，然后根据target序列设计针对CTCGGGCAACTG和CCTTCGTCAGTTA，载体构建方法分别用Golden Gate法和Gibson重组法。构建获得正确序列的TALEn载体。
然后，将两种方法获得的TALEn载体对，分别与reporter载体共转染293T细胞，转染方法按照lipofectamine 3000的标准方法进行。转染的细胞表达绿色荧光，并且荧光主要定位在细胞核。而只转染reporter载体的细胞没有荧光表达(图6)。由图可知，TALEn对reporter载体进行了基因编辑，使puro后面的DNA序列发生了移码突变，从而越过了终止密码子表达了后面的nsfGFP基因。从而证明了本发明方法构建的TALEn载体具有基因编辑功能。
实施例4 TALE-GFP载体的构建和染色质端粒的活细胞标记
(1)在TALE效应子下游插入EGFP基因，针对人端粒重复序列TTAGGG，设计针对AGGGTTAGGGTTAG的TALE模块，构建获得正确序列的TALE荧光标记载体。
(2)将TALE-EGFP表达载体转染U2OS细胞，转染方法按照lipofectamine3000的标准方法进行。转染后第二天，在共聚焦显微镜下观察荧光表达情况。由图7可见，转染TALE-EGFP的细胞，在细胞核里观察到几十个绿色小点，而普通EGFP质粒在细胞中均匀分布。从而证实本发明方法构建的TALE-EGFP具有在活体内高效结合染色体端粒的能力。
实施例5 TALE-VPR载体的构建和内源VEGF-A基因激活
(1)在TALE效应子下游插入VPR融合基因，针对人内源VEGF-A基因，设计针对TGAGTGACCTGCTTTTGGG和TGAGTGAGTGTGTGCGTGT的两个TALE模块TV1，TV2，构建获得正确序列的TALE基因激活载体。
(2)将TALE-VPR表达载体转染293T细胞，转染方法按照lipofectamine8000的标准方法进行。转染后第二天，培养基换为无血清培养基，并继续培养24小时。收集细胞培养上清液，用于检测VEGF-A的表达。
(3)使用人VEGF-A ELISA试剂盒(R&D Systems)测定培养基中分泌的VEGF-A蛋白水平。所有样品均根据制造商的说明进行测量。检测结果如图8所示，对照组浓度低，为：31.17，转染TALE-VPR质粒TV1的值为：52.94，TV2的值为：56.04。说明TALE-VPR能有效结合到VEGF-A基因调控区，并启动内源基因的表达。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
参考文献
Boch,J.,Scholze,H.,Schornack,S.,Landgraf,A.,Hahn,S.,Kay,S.,Lahaye,T.,Nickstadt,A.,and Bonas,U.(2009).Breaking the code of DNA binding specificityof TAL-type III effectors.Science 326,1509-1512.
Briggs,A.W.,Rios,X.,Chari,R.,Yang,L.,Zhang,F.,Mali,P.,and Church,G.M.(2012).Iterative capped assembly:rapid and scalable synthesis of repeat-module DNA such as TAL effectors from individual monomers.Nucleic acidsresearch 40,e117.
Cermak,T.,Doyle,E.L.,Christian,M.,Wang,L.,Zhang,Y.,Schmidt,C.,Baller,J.A.,Somia,N.V.,Bogdanove,A.J.,and Voytas,D.F.(2011).Efficient design andassembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNAtargeting.Nucleic acids research 39,e82.
Gao,X.,Tsang,J.C.,Gaba,F.,Wu,D.,Lu,L.,and Liu,P.(2014).Comparison ofTALE designer transcription factors and the CRISPR/dCas9 in regulation ofgene expression by targeting enhancers.Nucleic acids research 42,e155.
Gogolok,S.,Garcia-Diaz,C.,and Pollard,S.M.(2016).STAR:a simple TALeffector assembly reaction using isothermal assembly.Scientific reports 6,33209.
Liang,J.,Chao,R.,Abil,Z.,Bao,Z.,and Zhao,H.(2014).FairyTALE:a high-throughput TAL effector synthesis platform.ACS synthetic biology 3,67-73.
Mendenhall,E.M.,Williamson,K.E.,Reyon,D.,Zou,J.Y.,Ram,O.,Joung,J.K.,and Bernstein,B.E.(2013).Locus-specific editing of histone modifications atendogenous enhancers.Nature biotechnology 31,1133-1136.
Moscou,M.J.,and Bogdanove,A.J.(2009).A simple cipher governs DNArecognition by TAL effectors.Science 326,1501.
Reyon,D.,Tsai,S.Q.,Khayter,C.,Foden,J.A.,Sander,J.D.,and Joung,J.K.(2012).FLASH assembly of TALENs for high-throughput genome editing.Naturebiotechnology 30,460-465.
Schmid-Burgk,J.L.,Schmidt,T.,Kaiser,V.,Honing,K.,and Hornung,V.(2013).A ligation-independent cloning technique for high-throughput assemblyof transcription activator-like effector genes.Nature biotechnology 31,76-81.
Yang,L.,Guell,M.,Byrne,S.,Yang,J.L.,De Los Angeles,A.,Mali,P.,Aach,J.,Kim-Kiselak,C.,Briggs,A.W.,Rios,X.,et al.(2013).Optimization of scarlesshuman stem cell genome editing.Nucleic acids research 41,9049-9061.
SEQUENCE LISTING
<110> 五邑大学
<120> 一种基于密码子简并性的快速TALE表达载体构建方法
<130> 2021.6.29
<160> 62
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> UNSURE
<222> (12)..(13)
<223> Xaa Xaa为NI、NN、NG、HD的任意一种组合
<220>
<221> UNSURE
<222> (46)..(47)
<223> Xaa Xaa为NI、NN、NG、HD的任意一种组合
<220>
<221> UNSURE
<222> (80)..(81)
<223> Xaa Xaa为NI、NN、NG、HD的任意一种组合
<400> 1
Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Xaa Xaa Gly Gly Lys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala
20 25 30
His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Xaa Xaa Gly
35 40 45
Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys
50 55 60
Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Xaa
65 70 75 80
Xaa Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val
85 90 95
Leu Cys Gln Ala His Gly
100
<210> 2
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(39)
<223> MACRDT代表AACAAT、AACATT、AACGGT、CACGAT的任意一种组合
<220>
<221> misc_feature
<222> (136)..(141)
<223> MACRDT代表AACAAT、AACATT、AACGGT、CACGAT的任意一种组合
<220>
<221> misc_feature
<222> (238)..(243)
<223> MACRDT代表AACAAT、AACATT、AACGGT、CACGAT的任意一种组合
<400> 2
cttacaccgg atcaagttgt cgctattgct tctmacrdtg gtgggaagca ggcattggaa 60
accgtccaga gactccttcc cgtgctttgc caagctcatg gactgactcc ggaccaagtg 120
gtggctatcg ccagcmacrd tggcggcaag caagcgctcg aaacggtgca gcggctgttg 180
ccggtgctgt gccaggacca tggcctcacc cccgatcagg tcgttgcaat cgcatccmac 240
rdtggcggaa aacaagccct ggagacagtg caacgattgc tgccggtcct gtgtcaagca 300
cacggc 306
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctgactccgg accaagtggt ggctatcgcc agcaacattg gcggcaagca agcgctcgaa 60
acggtgcagc gg 72
<210> 4
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctgactccgg accaagtggt ggctatcgcc agcaacggtg gcggcaagca agcgctcgaa 60
acggtgcagc gg 72
<210> 5
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctgactccgg accaagtggt ggctatcgcc agccacgatg gcggcaagca agcgctcgaa 60
acggtgcagc gg 72
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgactccgg accaagtggt ggctatcgcc agcaacaatg gcggcaagca agcgctcgaa 60
acggtgcagc gg 72
<210> 7
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggtgggaagc aggcattgga aaccgtccag agactccttc ccgtgctttg ccaagctcat 60
ggactgactc cggaccaagt 80
<210> 8
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggatgcgatt gcaacgacct gatcgggggt gaggccatgg tcctggcaca gcaccggcaa 60
cagccgctgc accgtttcga g 81
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cttacaccgg atcaagttgt cgctattgct tctaacattg gtgggaagca ggcattgg 58
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cttacaccgg atcaagttgt cgctattgct tctaacggtg gtgggaagca ggcattgg 58
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cttacaccgg atcaagttgt cgctattgct tctcacgatg gtgggaagca ggcattgg 58
<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cttacaccgg atcaagttgt cgctattgct tctaacaatg gtgggaagca ggcattgg 58
<210> 13
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gccgtgtgct tgacacagga ccggcagcaa tcgttgcact gtctccaggg cttgttttcc 60
gccaatgttg gatgcgattg caacgac 87
<210> 14
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gccgtgtgct tgacacagga ccggcagcaa tcgttgcact gtctccaggg cttgttttcc 60
gccaccgttg gatgcgattg caacgac 87
<210> 15
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gccgtgtgct tgacacagga ccggcagcaa tcgttgcact gtctccaggg cttgttttcc 60
gccatcgtgg gatgcgattg caacgac 87
<210> 16
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gccgtgtgct tgacacagga ccggcagcaa tcgttgcact gtctccaggg cttgttttcc 60
gccattgttg gatgcgattg caacgac 87
<210> 17
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cactgacggg tgcccccctg aacctcacac cggatcaagt tgtcgct 47
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tgaggccgtg tgcttgacac aggac 25
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gtgtcaagca cacggcctca caccggatca agttgtcgct 40
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gacaacttga tccggtgtaa gtccgtgtgc ttgacacagg ac 42
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
acttacaccg gatcaagttg tcgct 25
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ggcgggagtc aaaccatgat cttgacacag gaccggcagc 40
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
atcatggttt gactcccgcc caagttgtcg ctattgcttc t 41
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
atggtcctgg cacaacactg gcagcaatcg ttgcactgtc 40
<210> 25
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cagtgttgtg ccaggaccat gggcttacac cggatcaagt tgtcgct 47
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acagaggacg gggagcagcc tttgcactgt ctccagggct tg 42
<210> 27
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
aggctgctcc ccgtcctctg tcaggaccat gggcttacac cggatcaagt tgtcgct 57
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gcagcaatcg ttgcactgtc 20
<210> 29
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gacagtgcaa cgattgctgc ctgtgctgtg ccaagatcat ggacttacac cggatcaagt 60
tgtcgct 67
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
acagaggacg gggagcagcc tttg 24
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
gacagtgcaa cgattgctgc ctgtgctgtg ccaag 35
<210> 32
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gcgagataac tgggcaacaa tgctttccaa tgccggcctc ccacca 46
<210> 33
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gcgagataac tgggcaacaa tgctttcgag cgctggcctg ccgcca 46
<210> 34
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gcgagataac tgggcaacaa tgctctccag ggctggtctt ccgcca 46
<210> 35
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
gctaccgtct ccctcacacc ggatcaagtt gtcgc 35
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gctaccgtct ccgccgtgtg cttgacacag gaccggcag 39
<210> 37
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gctaccgtct cccggcctta caccggatca agttgtcgc 39
<210> 38
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gctaccgtct ccccatgtgc ttgacacagg accggcag 38
<210> 39
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gctaccgtct ccatggactc acaccggatc aagttgtcgc 40
<210> 40
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
gctaccgtct ccaagccgtg tgcttgacac aggaccggca g 41
<210> 41
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gctaccgtct ccgcttgaca ccggatcaag ttgtcgc 37
<210> 42
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
gctaccgtct cccgtgtgct tgacacagga ccggcag 37
<210> 43
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gctaccgtct cccacggact tacaccggat caagttgtcg c 41
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gctaccgtct ccgtgagctt gacacaggac cggcag 36
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gctaccgtct cctcacggac tcacaccgga tcaagttgtc gc 42
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gctaccgtct cccagtccgt gtgcttgaca caggaccggc ag 42
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gctaccgtct ccactgacac cggatcaagt tgtcgc 36
<210> 48
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gctaccgtct cccagtccgt gtgcttgaca caggaccggc ag 42
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
gctaccgtct ccactgacac cggatcaagt tgtcgc 36
<210> 50
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gctaccgtct cctgctttcc aatgccggcc tcccacca 38
<210> 51
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
gctaccgtct cctgctttcg agcgctggcc tgccgcca 38
<210> 52
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
gctaccgtct cctgctctcc agggctggtc ttccgcca 38
<210> 53
<211> 1064
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
cctaagaaaa agaggaaggt gggtaccgtg gatctacgca cgctcggcta cagccagcag 60
caacaggaga agatcaaacc gaaggttcgt tcgacagtgg cgcagcacca cgaggcactg 120
gtcggccatg ggtttacaca cgcgcacatc gttgcgctca gccaacaccc ggcagcgtta 180
gggaccgtcg ctgtcaagta tcaggacatg atcgcagcgt tgccagaggc gacacacgaa 240
gcgatcgttg gcgtcggcaa acagtggtcc ggcgcacgcg ctctggaggc cttgctcacg 300
gtggcgggag agttgagagg tccaccgtta cagttggaca caggccaact tctcaagatt 360
gcaaaacgtg gcggcgtgac cgcagtggag gcagtgcatg catggcgcaa tgcactgacg 420
ggtgcccccc tgaacctcat gagacggcgc cgctacaggg cgcgtcccat tcgccattca 480
ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 540
cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 600
gacgttgtaa aacgacggcc agtgagcgcg cgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg 660
gtaccgggcc ccccctcgag gtcctccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattgcg 720
cgcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 780
ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 840
taactcacat taattgcgtt gcgctcaccg tctcaagcat tgttgcccag ttatctcgcc 900
ctgatccggc gttggccgcg ttgaccaacg accacctcgt cgccttggcc tgcctcggcg 960
gacgtcctgc gctggatgca gtgaaaaagg gattgccgca cgcgccggcc ttgatcaaaa 1020
gaaccaatcg ccgtattccc gaacgcacat cccatcgcgt tgcc 1064
<210> 54
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 54
Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His
1 5 10 15
Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala
20 25 30
Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe
35 40 45
Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg
50 55 60
Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly
65 70 75 80
Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile
85 90 95
Gly Gln Ala Asp Glu Met Glu Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg
100 105 110
Asp Lys His Leu Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser
115 120 125
Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn
130 135 140
Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly
145 150 155 160
Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys
165 170 175
Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly
180 185 190
Glu Ile Asn Phe
195
<210> 55
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 55
Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His
1 5 10 15
Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala
20 25 30
Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe
35 40 45
Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg
50 55 60
Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly
65 70 75 80
Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile
85 90 95
Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Lys Glu Asn Gln Thr Arg
100 105 110
Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser
115 120 125
Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn
130 135 140
Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn Arg Lys Thr Asn Cys Asn Gly
145 150 155 160
Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys
165 170 175
Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly
180 185 190
Glu Ile Asn Phe
195
<210> 56
<211> 52
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 56
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu
1 5 10 15
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe
20 25 30
Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp
35 40 45
Met Leu Gly Ser
50
<210> 57
<211> 522
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 57
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu
1 5 10 15
Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe
20 25 30
Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp
35 40 45
Met Leu Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ser Gln Tyr Leu
50 55 60
Pro Asp Thr Asp Asp Arg His Arg Ile Glu Glu Lys Arg Lys Arg Thr
65 70 75 80
Tyr Glu Thr Phe Lys Ser Ile Met Lys Lys Ser Pro Phe Ser Gly Pro
85 90 95
Thr Asp Pro Arg Pro Pro Pro Arg Arg Ile Ala Val Pro Ser Arg Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Val Pro Lys Pro Ala Pro Gln Pro Tyr Pro Phe Thr Ser
115 120 125
Ser Leu Ser Thr Ile Asn Tyr Asp Glu Phe Pro Thr Met Val Phe Pro
130 135 140
Ser Gly Gln Ile Ser Gln Ala Ser Ala Leu Ala Pro Ala Pro Pro Gln
145 150 155 160
Val Leu Pro Gln Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Met Val Ser
165 170 175
Ala Leu Ala Gln Ala Pro Ala Pro Val Pro Val Leu Ala Pro Gly Pro
180 185 190
Pro Gln Ala Val Ala Pro Pro Ala Pro Lys Pro Thr Gln Ala Gly Glu
195 200 205
Gly Thr Leu Ser Glu Ala Leu Leu Gln Leu Gln Phe Asp Asp Glu Asp
210 215 220
Leu Gly Ala Leu Leu Gly Asn Ser Thr Asp Pro Ala Val Phe Thr Asp
225 230 235 240
Leu Ala Ser Val Asp Asn Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu Asn Gln Gly
245 250 255
Ile Pro Val Ala Pro His Thr Thr Glu Pro Met Leu Met Glu Tyr Pro
260 265 270
Glu Ala Ile Thr Arg Leu Val Thr Gly Ala Gln Arg Pro Pro Asp Pro
275 280 285
Ala Pro Ala Pro Leu Gly Ala Pro Gly Leu Pro Asn Gly Leu Leu Ser
290 295 300
Gly Asp Glu Asp Phe Ser Ser Ile Ala Asp Met Asp Phe Ser Ala Leu
305 310 315 320
Leu Ser Gln Ile Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Arg Asp Ser Arg
325 330 335
Glu Gly Met Phe Leu Pro Lys Pro Glu Ala Gly Ser Ala Ile Ser Asp
340 345 350
Val Phe Glu Gly Arg Glu Val Cys Gln Pro Lys Arg Ile Arg Pro Phe
355 360 365
His Pro Pro Gly Ser Pro Trp Ala Asn Arg Pro Leu Pro Ala Ser Leu
370 375 380
Ala Pro Thr Pro Thr Gly Pro Val His Glu Pro Val Gly Ser Leu Thr
385 390 395 400
Pro Ala Pro Val Pro Gln Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala Val Thr Pro
405 410 415
Glu Ala Ser His Leu Leu Glu Asp Pro Asp Glu Glu Thr Ser Gln Ala
420 425 430
Val Lys Ala Leu Arg Glu Met Ala Asp Thr Val Ile Pro Gln Lys Glu
435 440 445
Glu Ala Ala Ile Cys Gly Gln Met Asp Leu Ser His Pro Pro Pro Arg
450 455 460
Gly His Leu Asp Glu Leu Thr Thr Thr Leu Glu Ser Met Thr Glu Asp
465 470 475 480
Leu Asn Leu Asp Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu Asn Glu Ile Leu Asp
485 490 495
Thr Phe Leu Asn Asp Glu Cys Leu Leu His Ala Met His Ile Ser Thr
500 505 510
Gly Leu Ser Ile Phe Asp Thr Ser Leu Phe
515 520
<210> 58
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 58
Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
50 55 60
Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln
65 70 75 80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
130 135 140
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
145 150 155 160
Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
210 215 220
Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 59
<211> 718
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 59
Leu Pro Thr Cys Ser Cys Leu Asp Arg Val Ile Gln Lys Asp Lys Gly
1 5 10 15
Pro Tyr Tyr Thr His Leu Gly Ala Gly Pro Ser Val Ala Ala Val Arg
20 25 30
Glu Ile Met Glu Asn Arg Tyr Gly Gln Lys Gly Asn Ala Ile Arg Ile
35 40 45
Glu Ile Val Val Tyr Thr Gly Lys Glu Gly Lys Ser Ser His Gly Cys
50 55 60
Pro Ile Ala Lys Trp Val Leu Arg Arg Ser Ser Asp Glu Glu Lys Val
65 70 75 80
Leu Cys Leu Val Arg Gln Arg Thr Gly His His Cys Pro Thr Ala Val
85 90 95
Met Val Val Leu Ile Met Val Trp Asp Gly Ile Pro Leu Pro Met Ala
100 105 110
Asp Arg Leu Tyr Thr Glu Leu Thr Glu Asn Leu Lys Ser Tyr Asn Gly
115 120 125
His Pro Thr Asp Arg Arg Cys Thr Leu Asn Glu Asn Arg Thr Cys Thr
130 135 140
Cys Gln Gly Ile Asp Pro Glu Thr Cys Gly Ala Ser Phe Ser Phe Gly
145 150 155 160
Cys Ser Trp Ser Met Tyr Phe Asn Gly Cys Lys Phe Gly Arg Ser Pro
165 170 175
Ser Pro Arg Arg Phe Arg Ile Asp Pro Ser Ser Pro Leu His Glu Lys
180 185 190
Asn Leu Glu Asp Asn Leu Gln Ser Leu Ala Thr Arg Leu Ala Pro Ile
195 200 205
Tyr Lys Gln Tyr Ala Pro Val Ala Tyr Gln Asn Gln Val Glu Tyr Glu
210 215 220
Asn Val Ala Arg Glu Cys Arg Leu Gly Ser Lys Glu Gly Arg Pro Phe
225 230 235 240
Ser Gly Val Thr Ala Cys Leu Asp Phe Cys Ala His Pro His Arg Asp
245 250 255
Ile His Asn Met Asn Asn Gly Ser Thr Val Val Cys Thr Leu Thr Arg
260 265 270
Glu Asp Asn Arg Ser Leu Gly Val Ile Pro Gln Asp Glu Gln Leu His
275 280 285
Val Leu Pro Leu Tyr Lys Leu Ser Asp Thr Asp Glu Phe Gly Ser Lys
290 295 300
Glu Gly Met Glu Ala Lys Ile Lys Ser Gly Ala Ile Glu Val Leu Ala
305 310 315 320
Pro Arg Arg Lys Lys Arg Thr Cys Phe Thr Gln Pro Val Pro Arg Ser
325 330 335
Gly Lys Lys Arg Ala Ala Met Met Thr Glu Val Leu Ala His Lys Ile
340 345 350
Arg Ala Val Glu Lys Lys Pro Ile Pro Arg Ile Lys Arg Lys Asn Asn
355 360 365
Ser Thr Thr Thr Asn Asn Ser Lys Pro Ser Ser Leu Pro Thr Leu Gly
370 375 380
Ser Asn Thr Glu Thr Val Gln Pro Glu Val Lys Ser Glu Thr Glu Pro
385 390 395 400
His Phe Ile Leu Lys Ser Ser Asp Asn Thr Lys Thr Tyr Ser Leu Met
405 410 415
Pro Ser Ala Pro His Pro Val Lys Glu Ala Ser Pro Gly Phe Ser Trp
420 425 430
Ser Pro Lys Thr Ala Ser Ala Thr Pro Ala Pro Leu Lys Asn Asp Ala
435 440 445
Thr Ala Ser Cys Gly Phe Ser Glu Arg Ser Ser Thr Pro His Cys Thr
450 455 460
Met Pro Ser Gly Arg Leu Ser Gly Ala Asn Ala Ala Ala Ala Asp Gly
465 470 475 480
Pro Gly Ile Ser Gln Leu Gly Glu Val Ala Pro Leu Pro Thr Leu Ser
485 490 495
Ala Pro Val Met Glu Pro Leu Ile Asn Ser Glu Pro Ser Thr Gly Val
500 505 510
Thr Glu Pro Leu Thr Pro His Gln Pro Asn His Gln Pro Ser Phe Leu
515 520 525
Thr Ser Pro Gln Asp Leu Ala Ser Ser Pro Met Glu Glu Asp Glu Gln
530 535 540
His Ser Glu Ala Asp Glu Pro Pro Ser Asp Glu Pro Leu Ser Asp Asp
545 550 555 560
Pro Leu Ser Pro Ala Glu Glu Lys Leu Pro His Ile Asp Glu Tyr Trp
565 570 575
Ser Asp Ser Glu His Ile Phe Leu Asp Ala Asn Ile Gly Gly Val Ala
580 585 590
Ile Ala Pro Ala His Gly Ser Val Leu Ile Glu Cys Ala Arg Arg Glu
595 600 605
Leu His Ala Thr Thr Pro Val Glu His Pro Asn Arg Asn His Pro Thr
610 615 620
Arg Leu Ser Leu Val Phe Tyr Gln His Lys Asn Leu Asn Lys Pro Gln
625 630 635 640
His Gly Phe Glu Leu Asn Lys Ile Lys Phe Glu Ala Lys Glu Ala Lys
645 650 655
Asn Lys Lys Met Lys Ala Ser Glu Gln Lys Asp Gln Ala Ala Asn Glu
660 665 670
Gly Pro Glu Gln Ser Ser Glu Val Asn Glu Leu Asn Gln Ile Pro Ser
675 680 685
His Lys Ala Leu Thr Leu Thr His Asp Asn Val Val Thr Val Ser Pro
690 695 700
Tyr Ala Leu Thr His Val Ala Gly Pro Tyr Asn His Trp Val
705 710 715
<210> 60
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 60
Pro Ser Arg Leu Gln Met Phe Phe Ala Asn Asn His Asp Gln Glu Phe
1 5 10 15
Asp Pro Pro Lys Val Tyr Pro Pro Val Pro Ala Glu Lys Arg Lys Pro
20 25 30
Ile Arg Val Leu Ser Leu Phe Asp Gly Ile Ala Thr Gly Leu Leu Val
35 40 45
Leu Lys Asp Leu Gly Ile Gln Val Asp Arg Tyr Ile Ala Ser Glu Val
50 55 60
Cys Glu Asp Ser Ile Thr Val Gly Met Val Arg His Gln Gly Lys Ile
65 70 75 80
Met Tyr Val Gly Asp Val Arg Ser Val Thr Gln Lys His Ile Gln Glu
85 90 95
Trp Gly Pro Phe Asp Leu Val Ile Gly Gly Ser Pro Cys Asn Asp Leu
100 105 110
Ser Ile Val Asn Pro Ala Arg Lys Gly Leu Tyr Glu Gly Thr Gly Arg
115 120 125
Leu Phe Phe Glu Phe Tyr Arg Leu Leu His Asp Ala Arg Pro Lys Glu
130 135 140
Gly Asp Asp Arg Pro Phe Phe Trp Leu Phe Glu Asn Val Val Ala Met
145 150 155 160
Gly Val Ser Asp Lys Arg Asp Ile Ser Arg Phe Leu Glu Ser Asn Pro
165 170 175
Val Met Ile Asp Ala Lys Glu Val Ser Ala Ala His Arg Ala Arg Tyr
180 185 190
Phe Trp Gly Asn Leu Pro Gly Met Asn Arg Pro Leu Ala Ser Thr Val
195 200 205
Asn Asp Lys Leu Glu Leu Gln Glu Cys Leu Glu His Gly Arg Ile Ala
210 215 220
Lys Phe Ser Lys Val Arg Thr Ile Thr Thr Arg Ser Asn Ser Ile Lys
225 230 235 240
Gln Gly Lys Asp Gln His Phe Pro Val Phe Met Asn Glu Lys Glu Asp
245 250 255
Ile Leu Trp Cys Thr Glu Met Glu Arg Val Phe Gly Phe Pro Val His
260 265 270
Tyr Thr Asp Val Ser Asn Met Ser Arg Leu Ala Arg Gln Arg Leu Leu
275 280 285
Gly Arg Ser Trp Ser Val Pro Val Ile Arg His Leu Phe Ala Pro Leu
290 295 300
Lys Glu Tyr Phe Ala Cys Val
305 310
<210> 61
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 61
Gly Ser Tyr Ala Leu Gly Pro Tyr Gln Ile Ser Ala Pro Gln Leu Pro
1 5 10 15
Ala Tyr Asn Gly Gln Thr Val Gly Thr Phe Tyr Tyr Val Asn Asp Ala
20 25 30
Gly Gly Leu Glu Ser Lys Val Phe Ser Ser Gly Gly Pro Thr Pro Tyr
35 40 45
Pro Asn Tyr Ala Asn Ala Gly His Val Glu Gly Gln Ser Ala Leu Phe
50 55 60
Met Arg Asp Asn Gly Ile Ser Glu Gly Leu Val Phe His Asn Asn Pro
65 70 75 80
Glu Gly Thr Cys Gly Phe Cys Val Asn Met Thr Glu Thr Leu Leu Pro
85 90 95
Glu Asn Ala Lys Met Thr Val Val Pro Pro Glu Gly
100 105
<210> 62
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 62
Ala Ile Pro Val Lys Arg Gly Ala Thr Gly Glu Thr Lys Val Phe Thr
1 5 10 15
Gly Asn Ser Asn Ser Pro Lys Ser Pro Thr Lys Gly Gly Cys
20 25 30

Claims (4)

1.一种TALE表达载体构建方法，其特征在于，所述构建方法为通过密码子简并性构建获得TALE三联体模块，再通过TALE三联体模块按顺序拼接，连接到TALE骨架载体上形成TALE表达载体；所述TALE三联体模块为三个TALE模块的单体串联得到，包括三个重复的氨基酸序列，所述TALE三联体模块的氨基酸序列为：LTPDQVVAIASX1X2GGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASX3X4GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASX5X6GGKQALETVQRLLPVLCQAHG，如SEQ ID NO:1所示；其中X1X2、X3X4、X5X6为NI、NN、NG、HD的任意一种组合，共64种组合；
所述构建方法包括以下步骤：
S1.通过PCR技术获得64种TALE三联体模块组合库；
S2.以三联体模块为模板，利用接头引物进行PCR，再按顺序将多个三联体进行重组串联，并同时与TALE骨架载体进行重组连接获得重组TALE表达载体；
所述步骤S2中所述按顺序将多个三联体进行重组串联为利用Golden Gate酶切连接技术进行串联；其中，在三联体扩增引物末端添加IIS限制性内切酶酶切位点，每个三联体模块酶切产生的粘性末端不同，其中第一个片段的上游粘性末端与载体酶切后的TALE的N端互补配对，下游与第二个三联体酶切片段上游互补，第二个三联体的下游与第三个三联体上游末端互补，以此类推，最后一个三联体，分别设计结合三联体第一个、第二个和第三个模块的中部，扩增获得包含最后一个模块的单体，二联体或三联体，突出的粘性末端与TALE载体的C端互补配对；
所述步骤S1具体为：
分别以SEQ ID NO:3~6为模板，以SEQ ID NO:7~8为引物，扩增得到4个片段，再以所述4个片段为模板，以SEQ ID NO:9~13为上游引物和SEQ ID NO:14~16为下游引物进行扩增，共获得64种组合的三联体模块的核苷酸片段；
所述TALE三联体模块的核苷酸序列为：CTTACACCGGATCAAGTTGTCGCTATTGCTTCTMACRDTGGTGGGAAGCAGGCATTGGAAACCGTCCAGAGACTCCTTCCCGTGCTTTGCCAAGCTCATGGACTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCMACRDTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTCACCCCCGATCAGGTCGTTGCAATCGCATCCMACRDTGGCGGAAAACAAGCCCTGGAGACAGTGCAACGATTGCTGCCGGTCCTGTGTCAAGCACACGGC，如SEQ ID NO:2所示；
其中MACRDT分别代表AACAAT、AACATT、AACGGT、CACGAT的任意一种组合，共64种组合。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S2中所述按顺序将多个三联体进行重组串联为利用等温重组技术进行串联；
所述串联中接头引物以三联体模板库作为扩增模板，具有顺序性和方向性；接头引物扩增产物按顺序有15~25bp的重叠区域，最后一条产物下游与TALE骨架载体的C端重叠。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S2具体包括以下步骤：
S21.根据识别的目标序列调取TALE三联体模块和衔接引物对，扩增获得PCR产物；
S22.PCR产物纯化；
S23.将纯化PCR产物与TALE骨架载体1:1混合，加入相应的IIS限制性内切酶和DNA连接酶，进行Golden Gate法酶切连接反应，将三联体模块按顺序连入TALE骨架载体得到TALE表达载体。
4.根据权利要求1~3任一所述的构建方法，其特征在于，所述TALE骨架载体是可转化细菌，经克隆生长、细菌培养和质粒提取后，获得用于转染细胞的载体。
CN202110746218.1A 2021-07-01 2021-07-01 一种基于密码子简并性的快速tale表达载体构建方法 Active CN113584064B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110746218.1A CN113584064B (zh) 2021-07-01 2021-07-01 一种基于密码子简并性的快速tale表达载体构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110746218.1A CN113584064B (zh) 2021-07-01 2021-07-01 一种基于密码子简并性的快速tale表达载体构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113584064A CN113584064A (zh) 2021-11-02
CN113584064B true CN113584064B (zh) 2023-07-21

Family

ID=78245477

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110746218.1A Active CN113584064B (zh) 2021-07-01 2021-07-01 一种基于密码子简并性的快速tale表达载体构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113584064B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117751133A (zh) * 2022-04-29 2024-03-22 北京大学 用于修饰线粒体dna的脱氨酶突变体、组合物和方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950623A (zh) * 2016-05-19 2016-09-21 电子科技大学 一种用于talen高效构建的双rvd单元模块库及talen构建方法
CN108949794A (zh) * 2018-07-04 2018-12-07 东南大学 一种tale表达载体及其快速构建方法和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102864158B (zh) * 2012-09-29 2014-04-23 北京大学 用于基因定点修饰的tale重复片段的高效合成方法
CN103146735A (zh) * 2012-12-28 2013-06-12 西北农林科技大学 Tale重复单元四聚体库的构建方法、talen表达载体的构建方法及其应用
CN107312788B (zh) * 2016-04-26 2020-07-28 中国科学院动物研究所 一种tale重复序列载体的构建方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950623A (zh) * 2016-05-19 2016-09-21 电子科技大学 一种用于talen高效构建的双rvd单元模块库及talen构建方法
CN108949794A (zh) * 2018-07-04 2018-12-07 东南大学 一种tale表达载体及其快速构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113584064A (zh) 2021-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240117330A1 (en) Enzymes with ruvc domains
US10913941B2 (en) Enzymes with RuvC domains
US5976846A (en) Method for multifragment in vivo cloning and mutation mapping
Hensgens et al. Nucleotide sequence of the mitochondrial structural gene for subunit 9 of yeast ATPase complex.
EP1291420B1 (en) Novel DNA cloning method relying on the E.coli RECE/RECT recombination system
Pierce et al. A mouse genomic library in the bacteriophage P1 cloning system: organization and characterization
US20030017552A1 (en) Modular vector systems
WO2013143438A1 (zh) 基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒
EP4146800A1 (en) Enzymes with ruvc domains
CN113584064B (zh) 一种基于密码子简并性的快速tale表达载体构建方法
CN113913405A (zh) 一种编辑核酸的系统及方法
US20090176281A1 (en) Modular vector systems
CA2636816A1 (en) Linear vectors, host cells and cloning methods
Szybalski From the double-helix to novel approaches to the sequencing of large genomes
CN108841866B (zh) 一种腺病毒载体及其构建方法
WO1999066035A2 (en) Vector construction by host cell-mediated recombination
CN111004813A (zh) 一种超大质粒构建试剂盒、超大质粒构建方法及其应用
US20220220460A1 (en) Enzymes with ruvc domains
WO2002044415A1 (en) Method for screening of dna libraries and generation of recombinant dna constructs
Zhao et al. A one-step system for convenient and flexible assembly of transcription activator-like effector nucleases (TALENs)
KR20190115717A (ko) 동물 세포에서 표적 ｄｎａ의 메틸화 감소와 표적 유전자의 발현 증가를 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법
WO2021226369A1 (en) Enzymes with ruvc domains
CN110982834A (zh) 一种质粒构建试剂盒、质粒构建方法及其应用
CN104404029A (zh) 一种基于甲基化环状dna分子的突变方法
CN111434771A (zh) 一种线性化载体自重组的质粒构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant