CN108004246A - 利用金属亲和法快速进行液相靶标selex筛选的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法。现有SELEX筛选技术存在分离时间长、步骤繁琐的缺陷。本发明人工合成单链DNA文库和相应引物；建立融合表达组氨酸标签的重组蛋白基因工程菌株；在表达融合蛋白时利用镍离子或钴离子两种金属螯合物对组氨酸标签蛋白的亲和作用使与特异性靶蛋白结合的ssDNA进行筛选；经过多轮的筛选使与靶蛋白结合的适配子得到富集，对富集的寡核苷酸进行鉴定、测序后，选择高亲和力的核酸适配子成为待选适配子。本发明简单高效快速，明显改善了蛋白质需要包被过夜的过程，设备简单，能够从复杂液相标本中筛选针对差异成分的寡核苷酸适配子，也可利用富集的文库对差异成分进行钓取鉴定。

Description

利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法

技术领域

本发明涉及一种核酸适配体富集筛选技术，具体涉及一种利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法。

背景技术

生命科学的研究和对疾病的特异性诊断与靶向治疗，都离不开分子之间特异性的识别与结合以及相应的试剂或药物。1990年，一种制备特异性寡核苷酸分子的技术问世，这种被称为SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)的技术，经过富集的核酸分子可以形成多种稳定的次级结构，如茎环发夹、假结和口袋等，与靶分子形成空间互补，通过静电作用、范德华力以及氢键等分子间作用力，而与靶分子紧密地、特异性地结合呈一定的三维结构，它们可以识别不同靶分子之间极微小的差异，比如有无羟基等小的基团和手征差异适配体的靶分子可以是蛋白质，也可以是核酸、小分子有机物或金属离子，适配体亦可与病毒或细胞结合能与靶分子通过立体构象之间的适应性互补（并非碱基配对）。

指数富集的配体系统进化（SELEX）技术的基本原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20～100个碱基左右。将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的寡核苷酸配基（aptamer），经反复扩增、筛选数个循环，即可使与该靶分子特异结合的寡核苷酸序列得到富集。利用上述原理建立的SELEX技术已经成功获得多种靶分子的特异核酸适配子。SELEX技术打破了传统的核苷酸碱基配对的思路，称得上核酸研究与应用上的里程碑。利用SELEX技术筛选获得的aptamer识别分子的模式与抗体类似，但与蛋白质类抗体相比，核酸类配基具有更多的优越性，如不受免疫条件和免疫原性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰并易于长期保存和室温运输等。这些特性使得 aptamer在生物医药研究领域得到广泛应用，成为不可缺少的有力工具。

从1990年Gold等建立SELEX技术至今，SELEX技术和aptamer的研究不断受到新的挑战与更新。经过15年的发展，SELEX技术不断得到改进与完善，实现了筛选流程的自动化、筛选形式的多样化、筛选结果的快速化，aptamer也有了多种应用形式。

消减SELEX是一种改良SELEX技术（Wang C, et al. J Biotechnol; 2003, 102:15-22），其原理是在筛选过程中扣除能与已知或未知的共有靶分子的寡核苷酸配基，消减后的次级随机文库投入特异靶标的筛选。利用消减SELEX 技术可以从两组高度同源的靶分子混合物中筛选获得差异靶分子的特异aptamer。但是消减SELEX实验中需要提前建立与目的靶高度同源的筛选靶，验证限制了消减SELEX的应用范围。

加尾 SELEX（tailor ed SELEX）是通过构建随机文库（Vater A, et al. NucleicAcids Res; 2003, 31(21): e130），两端各含有4 nt和6 nt的固定序列，用于与接头序列连接搭桥。合成文库两端的单链连接序列含有T7启动子序列、可用碱裂解的碱基以及便于文库扩增的序列。合成的单链接头序列，能够与上述连接序列和文库的固定序列退火，形成搭桥，用于PCR扩增。如此，筛选过程中仅投入随机文库，在筛选后通过连接、搭桥的方式加入两端连接序列与接头序列，PCR扩增后再经碱裂解处理去除两端序列，投入下一轮筛选。但是由于操作较为复杂，因此未能得到很好的推广和应用。

基因组SELEX是根据SELEX技术原理将感兴趣的生物体基因组制成寡核苷酸文库，从中筛选生物活性分子如蛋白质、辅因子、多糖、抗生素等的天然识别序列。他们建立的genomic SELEX为解析细胞内基因调控、代谢调控等问题提供了大量实验数据。由于基因组SELEX中用于PCR扩增的引物序列可能会与中间的基因组序列配对，从而干扰靶标与基因组序列的结合，Wen等（Wen JD, et al. Nucleic Acids Res; 2004, 32(22): e182）结合加尾SELEX原理，发展出了无引物基因组SELEX (primer-free SELEX)方法。该方法是在筛选之前先将引物从基因组文库中除去，文库与靶分子孵育后，筛选获得的基因片段通过杂交-延伸热循环反应加入引物序列进行PCR扩增。无引物基因组SELEX为研究基因组调控提供了新的平台技术。

2001年Cox等（Cox JC, et al. Bioorg Med Chem; 2001, 9(10): 2525-2531）成功地应用 Beckman-CoulterBiomek 2000自动化工作站筛选到了溶菌酶的aptamer，该工作站包括机械操控台，热循环仪，磁珠自动分离器，多屏真空过滤仪，酶冷却仪，自动移液工具等。筛选的流程包括：通过链酶亲和素与生物素的相互作用将生物素化的靶蛋白固定在磁珠上。随后特异结合序列的分离，RT-PCR扩增和转录都通过设定的程序自动化完成，最后筛选得到的序列克隆到载体中进行测序鉴定。通过这种自动化筛选工作台，作者只用了不到两天的时间就完成了12轮的筛选。但由于这种自动化筛选过程需要昂贵的自动化分选设备，因此限制了它在蛋白质组学中的应用。

2004年Mendonsa等（Mendonsa SD, et al. J Am Chem Soc; 2004, 126(1): 20-21）根据核酸配基与靶分子结合能够使其构象和质量改变并导致其电泳行为显著变化的特性，利用毛细管电泳（CE）成功地将结合配基与游离配基有效分离。利用CE-SELEX方法仅需2～4轮筛选就可获得靶分子的特异配基。极大地提高了SELEX筛选效率。但是由于其对设备和操作的要求较高，其使用范围并不广泛。

专利201010266267.7公布了一种针对液相非纯化复合靶标的电泳凝胶阻滞-selex技术，其原理在于利用电泳凝胶阻滞的原理，通过消减筛选获得针对筛选样品和消减样品中差异成分的特异寡核苷酸适配子，可以明显减少筛选次数，提高分离效率。但是凝胶的制备和ssDNA的洗脱所耗费的时间过大导致其适配子的富集时间并没有发生明显的改变。

专利201310082033.0公布了一种可实时检测的固相指数富集的配体系统计划技术，其特点在于利用荧光素标记的链霉素对结合到固相包被的靶标上的ssDNA进行实时监控。可以有效改善实验操作的可行性，但是对于筛选的效率并没有明显提高。

专利201310656889.4公布了一种基于磁分离的HbsAg核酸适配子筛选方法，通过羧基化磁性纳米颗粒与HbsAg相偶联，可以快速分离与HbsAg结合的适配子，但是在该专利中并没有明确阐述筛选过程中核酸文库的处理过程和筛选轮数，因此不能确定其是否能够有效提高核酸文库的筛选效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法，基于镍离子或钴离子两种金属螯合物对组氨酸标签蛋白的亲和作用进行核酸筛选，以改善现有技术中分离操作时间长、操作过程步骤繁琐的缺陷，提高筛选的效率。

本发明所采用的技术方案为：

利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法，其特征在于：

包括以下操作：

人工合成单链DNA寡核苷酸文库和相应的引物；

建立融合表达组氨酸标签的重组蛋白基因工程菌株；

在表达融合蛋白的过程中利用镍离子或钴离子两种金属螯合物对组氨酸标签蛋白的亲和作用使与特异性靶蛋白结合的ssDNA进行筛选；

经过多轮的筛选使与靶蛋白结合的适配子得到富集，对富集的寡核苷酸进行鉴定、测序后，选择高亲和力的核酸适配子成为待选适配子。

所述的利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：合成随机单链 DNA 寡核苷酸文库和相应的引物

包括：

ssDNA：

5-TGCGGAAGCCACCAGGAGTTACGAGCCAAAGAGCCGCCAA-3；

正义引物：

5-TGCGGAAGCCACCAGGAGTT-3；

反义引物：

5- TTGGCGGCTCTTTGGCTCGT-3；

标记5端的生物素标记引物：

生物素标记上游引物：

5-TGCGGAAGCCACCAGGAGTT-3；

生物素标记下游引物：

5- TTGGCGGCTCTTTGGCTCGT-3；

步骤二：利用大肠杆菌表达靶分子蛋白

（1）利用基因重组的方法构建含His标签的靶基因的原核表达质粒，即重组质粒；

（2）重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），常规IPTG诱导表达，离心收集表达菌体，超声破碎，离心后分别获得含有目的蛋白可溶性表达的超声上清；

（3）利用重组蛋白C端的His标签对诱导表达后的超声上清进行纯化，获得纯化的目的蛋白用于筛选后适配子的鉴定；

步骤三：基于金属离子亲和作用的SELEX筛选

（1）将ssDNA文库溶解于去离子水中，于100℃变性5 min后立即置于冰上充分冷却10-20 min；

（2）将ssDNA文库与表达靶蛋白的大肠杆菌裂解液上清在37℃共孵育2h，使ssDNA文库与消减靶充分作用；

（3）将孵育后的ssDNA文库-MMP14蛋白混合液加入到已经准备好的镍或钴螯合磁珠中，室温孵育20 min，置于磁性分离器上，吸弃上清，并与沉淀中加入90℃预热的洗脱缓冲液（20 mmol /L Tris-Cl，4 mol /L异硫氰酸胍，1 mmol/L DTT，pH 8.3），酚氯仿抽提后乙醇沉淀回收；

步骤四：结合文库的扩增

（1）将乙醇沉淀回收到的ssDNA用水溶解后，使用正义引物和生物素标记下游引物进行PCR反应扩增；

（2）PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性 20秒，52℃退火20秒，72℃延伸20秒，扩增23个循环；最后72℃终延伸5 min；

（3）得到的dsDNA煮沸后立即放置冰上30 min，加入平衡后的Streptavidin-磁珠中混匀，室温放置30 min，使生物素化的dsDNA与磁珠相结合，随后加入0.15 N的NaOH溶液释放ssDNA，异丙醇沉淀后用–20℃保存备用；

步骤五：重复步骤三和四进行n轮筛选，最终完成筛选。

步骤五中所述的n轮筛选为8-15轮筛选。

第一轮筛选中，ssDNA文库的用量为1500 pmol，以后每轮筛选的投入量按照30%递减。

本发明具有以下优点：

1、简单快速：

本发明充分利用了镍离子或钴离子两种金属螯合物对组氨酸标签的亲和作用使液相中的蛋白质快速结合到了固相载体上，其作用简单高效，仅仅需要20-30 min，明显改善了原技术方案中蛋白质需要包被过夜的过程；

2、设备简单：

本发明中蛋白的分离和核酸的分离只需要简单的磁性分离器，大大减少了对自动化分选设备和毛细管电泳等设备的依赖，可以很好的推动SELEX方法的普及。

3、可用于液相靶标的筛选：

常规SELEX筛选过程中往往需要将靶蛋白固定到相应的固相介质上，但是这个往往会引起蛋白空间构象的变化，而本发明首先在液相中结合后在通过亲和分离的方法可以最大限度的保证筛选的适配子的有效性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及的利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法，可用于核酸、蛋白、小分子有机物或金属离子、病毒或细胞等多种靶标的鉴定和识别，以及靶向药物的传输，具体包括以下操作：

人工合成单链DNA寡核苷酸文库和相应的引物；建立融合表达组氨酸标签的重组蛋白基因工程菌株；在表达融合蛋白的过程中利用镍离子或钴离子两种金属螯合物对组氨酸标签蛋白的亲和作用使与特异性靶蛋白结合的ssDNA进行筛选；经过多轮的筛选使与靶蛋白结合的适配子得到富集，对富集的寡核苷酸进行鉴定、测序后，选择高亲和力的核酸适配子成为待选适配子。

本发明具体由以下步骤实现：

步骤一：合成随机单链DNA寡核苷酸文库和相应的引物

包括：

ssDNA：

5-TGCGGAAGCCACCAGGAGTT(N40)ACGAGCCAAAGAGCCGCCAA-3；

正义引物：

5-TGCGGAAGCCACCAGGAGTT-3；

反义引物：

5- TTGGCGGCTCTTTGGCTCGT-3；

标记5端的生物素标记引物：

生物素标记上游引物：

5-TGCGGAAGCCACCAGGAGTT-3；

生物素标记下游引物：

5- TTGGCGGCTCTTTGGCTCGT-3；

步骤二：利用大肠杆菌表达靶分子蛋白

（1）利用基因重组的方法构建含His标签的膜型Ⅰ型金属蛋白酶（MT1-MMP/MMP-14）基因的原核表达质粒，即重组质粒；

（2）重组质粒分别转化大肠杆菌BL21（DE3），常规IPTG诱导表达，离心收集表达菌体，超声破碎，离心后分别获得含有目的蛋白MMP-14可溶性表达超声上清；

（3）利用载体上含有的重组蛋白C端的His标签对诱导表达后的超声上清进行纯化，获得纯化的MMP-14蛋白用于筛选后适配子的鉴定；

步骤三：基于金属离子亲和作用的SELEX筛选

（1）将ssDNA文库溶解于去离子水中，于100℃变性5 min后立即置于冰上充分冷却10-20 min；

（2）将ssDNA文库与转化MMP14蛋白的未纯化上清在37℃共孵育2 h，使ssDNA文库与消减靶充分作用；

（3）将孵育后的ssDNA文库-MMP14蛋白混合液加入到已经准备好的镍或钴螯合磁珠中，室温孵育20 min，置于磁性分离器上，吸弃上清，并与沉淀中加入90℃预热的洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris-Cl，4 mol/L异硫氰酸胍，1 mmol/L DTT，pH 8.3），酚氯仿抽提后乙醇沉淀回收；

步骤四：结合文库的扩增

（1）将乙醇沉淀回收到的ssDNA用水溶解后，使用正义引物和生物素标记下游引物进行PCR反应扩增；

（2）PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性20秒，52℃退火20秒，72℃延伸20秒，扩增23个循环；最后72℃终延伸5 min；

（3）得到的dsDNA煮沸后立即放置冰上30 min，加入平衡后的Streptavidin-磁珠中混匀，室温放置30 min，使生物素化的dsDNA与磁珠相结合，随后加入0.15 N的NaOH溶液释放ssDNA，异丙醇沉淀后用–20℃保存备用；

步骤五：重复步骤三和四进行n轮筛选，最终完成筛选。

步骤五中所述的n轮筛选为8-15轮筛选。第一轮筛选中，ssDNA文库的用量为1500pmol，以后每轮筛选的投入量按照30%梯度递减。

本发明通过建立的基于金属亲和作用的SELEX筛选，获得了特异识别融合蛋白中MMP14结构域的富集文库。因此，该方法能够从复杂液相标本中筛选针对差异成分的寡核苷酸适配子，也能利用富集的文库对差异成分进行钓取鉴定。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (4)

1.利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法，其特征在于：

包括以下操作：

人工合成单链DNA寡核苷酸文库和相应的引物；

建立融合表达组氨酸标签的重组蛋白基因工程菌株；

在表达融合蛋白的过程中利用镍离子或钴离子两种金属螯合物对组氨酸标签蛋白的亲和作用使与特异性靶蛋白结合的ssDNA进行筛选；

经过多轮的筛选使与靶蛋白结合的适配子得到富集，对富集的寡核苷酸进行鉴定、测序后，选择高亲和力的核酸适配子成为待选适配子。

2.根据权利要求1所述的利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：合成随机单链 DNA 寡核苷酸文库和相应的引物

包括：

ssDNA：

5-TGCGGAAGCCACCAGGAGTTACGAGCCAAAGAGCCGCCAA-3；

正义引物：

5-TGCGGAAGCCACCAGGAGTT-3；

反义引物：

5- TTGGCGGCTCTTTGGCTCGT-3；

标记5端的生物素标记引物：

生物素标记上游引物：

5-TGCGGAAGCCACCAGGAGTT-3；

生物素标记下游引物：

5- TTGGCGGCTCTTTGGCTCGT-3；

步骤二：利用大肠杆菌表达靶分子蛋白

（1）利用基因重组的方法构建含His标签的靶基因的原核表达质粒，即重组质粒；

（2）重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），常规IPTG诱导表达，离心收集表达菌体，超声破碎，离心后分别获得含有目的蛋白可溶性表达的超声上清；

（3）利用重组蛋白C端的His标签对诱导表达后的超声上清进行纯化，获得纯化的目的蛋白用于筛选后适配子的鉴定；

步骤三：基于金属离子亲和作用的SELEX筛选

（1）将ssDNA文库溶解于去离子水中，于100℃变性5 min后立即置于冰上充分冷却10-20 min；

（2）将ssDNA文库与表达靶蛋白的大肠杆菌裂解液上清在37℃共孵育2h，使ssDNA文库与消减靶充分作用；

（3）将孵育后的ssDNA文库-MMP14蛋白混合液加入到已经准备好的镍或钴螯合磁珠中，室温孵育20 min，置于磁性分离器上，吸弃上清，并与沉淀中加入90℃预热的洗脱缓冲液（20 mmol /L Tris-Cl，4 mol /L异硫氰酸胍，1 mmol/L DTT，pH 8.3），酚氯仿抽提后乙醇沉淀回收；

步骤四：结合文库的扩增

（1）将乙醇沉淀回收到的ssDNA用水溶解后，使用正义引物和生物素标记下游引物进行PCR反应扩增；

（2）PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性 20秒，52℃退火20秒，72℃延伸20秒，扩增23个循环；最后72℃终延伸5 min；

（3）得到的dsDNA煮沸后立即放置冰上30 min，加入平衡后的Streptavidin-磁珠中混匀，室温放置30 min，使生物素化的dsDNA与磁珠相结合，随后加入0.15 N的NaOH溶液释放ssDNA，异丙醇沉淀后用–20℃保存备用；

步骤五：重复步骤三和四进行n轮筛选，最终完成筛选。

3.根据权利要求2所述的利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法，其特征在于：

步骤五中所述的n轮筛选为8-15轮筛选。

4.根据权利要求3所述的利用金属亲和法快速进行液相靶标SELEX筛选的方法，其特征在于：

第一轮筛选中，ssDNA文库的用量为1500 pmol，以后每轮筛选的投入量按照30%递减。