JP2024028863A - エピジェネティックに調節される部位特異的ヌクレアーゼ - Google Patents
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Abstract
【課題】研究用試薬として、遺伝子ドライブ中に、または治療剤として使用するための、ゲノム編集ヌクレアーゼおよびカスタマイズ可能なDNA結合ドメイン融合タンパク質の特異性を改善するための方法および組成物を提供する。【解決手段】特異的TFまたは翻訳後ヒストン修飾に対して高い親和性を有する操作親和性タンパク質と遺伝的に連結された標的ヌクレアーゼを含む融合タンパク質を細胞において発現させること、または細胞をそれと接触させることを含む、細胞のゲノムを修飾するための方法であって、特異的TFまたは翻訳後ヒストン修飾が標的部位の近位に存在する場合にかぎり、融合タンパク質がその標的部位で活性である、方法が、提供される。【選択図】図1
Description
優先権の主張
本出願は、2016年10月14日に提出された米国仮特許出願第62/408,64
5号明細書の利益を主張する。前記出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれて
いる。
本出願は、2016年10月14日に提出された米国仮特許出願第62/408,64
5号明細書の利益を主張する。前記出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれて
いる。
連邦政府により支援された研究または開発
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)により与えられた助成
番号DP1 GM105378およびR35 GM118158の下で政府支援を受けて
なされた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)により与えられた助成
番号DP1 GM105378およびR35 GM118158の下で政府支援を受けて
なされた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
研究用試薬として、遺伝子ドライブ中に、または治療剤として使用するための、ゲノム
編集ヌクレアーゼ(例えば、RNAガイドCRISPR-Casヌクレアーゼまたは操作
ジンクフィンガーヌクレアーゼ)およびカスタマイズ可能なDNA結合ドメイン融合タン
パク質(例えば、RNAガイドdead-Cas9、RNAガイドdead-Cpf1、
または転写調節ドメインと融合した操作ジンクフィンガーアレイ)の特異性を改善するた
めの方法および組成物が、本明細書において記載される。
編集ヌクレアーゼ(例えば、RNAガイドCRISPR-Casヌクレアーゼまたは操作
ジンクフィンガーヌクレアーゼ)およびカスタマイズ可能なDNA結合ドメイン融合タン
パク質(例えば、RNAガイドdead-Cas9、RNAガイドdead-Cpf1、
または転写調節ドメインと融合した操作ジンクフィンガーアレイ)の特異性を改善するた
めの方法および組成物が、本明細書において記載される。
操作標的ヌクレアーゼは、ヒト細胞における病原変異を遺伝的に修正するために使用す
ることができる。このような治療戦略は、ヌクレアーゼがゲノム中の特定部位に配列特異
的DNA二本鎖切断(DSB)を導入することに依存している。例えば、CRISPR-
CasなどのRNAガイドヌクレアーゼ(RGN)プラットフォームの特異性は、標的D
NA部位に対する相補性を担持するガイドRNA分子(gRNA)によって主として指示
される。ジンクフィンガー(ZF)ヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼのような他
のゲノム編集プラットフォームは、それらの特異性を配列特異的なタンパク質-DNA接
触から導き出すが、ユーザー定義の配列と特異的に結合するタンパク質ドメインを産生す
るには、より複雑な操作戦略が必要となる。ゲノム編集は、非相同末端結合(NHEJ)
と呼ばれる誤りがちな経路を介して、または相同な外因性「ドナー鋳型」もしくはゲノム
自体の内部に見出される相同配列を使用するより正確な相同組換え修復(HDR)によっ
てのいずれかでこれらの標的DSBを修復する内因性細胞機構を利用することによって達
成される。ゲノム編集ヌクレアーゼは、それらの特定の標的部位でDSBを強く誘導する
ことができるものの、全てのヌクレアーゼプラットフォームが、目的の標的に類似する配
列に望まれないDSBを誘導することも知られている。これらのオフターゲットDSBは
、NHEJによって効率的に修復されるが、その結果、これらの部位で意図されない変異
が生じ、これらの変異がゲノム全体に分布するおそれがある。
ることができる。このような治療戦略は、ヌクレアーゼがゲノム中の特定部位に配列特異
的DNA二本鎖切断(DSB)を導入することに依存している。例えば、CRISPR-
CasなどのRNAガイドヌクレアーゼ(RGN)プラットフォームの特異性は、標的D
NA部位に対する相補性を担持するガイドRNA分子(gRNA)によって主として指示
される。ジンクフィンガー(ZF)ヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼのような他
のゲノム編集プラットフォームは、それらの特異性を配列特異的なタンパク質-DNA接
触から導き出すが、ユーザー定義の配列と特異的に結合するタンパク質ドメインを産生す
るには、より複雑な操作戦略が必要となる。ゲノム編集は、非相同末端結合(NHEJ)
と呼ばれる誤りがちな経路を介して、または相同な外因性「ドナー鋳型」もしくはゲノム
自体の内部に見出される相同配列を使用するより正確な相同組換え修復(HDR)によっ
てのいずれかでこれらの標的DSBを修復する内因性細胞機構を利用することによって達
成される。ゲノム編集ヌクレアーゼは、それらの特定の標的部位でDSBを強く誘導する
ことができるものの、全てのヌクレアーゼプラットフォームが、目的の標的に類似する配
列に望まれないDSBを誘導することも知られている。これらのオフターゲットDSBは
、NHEJによって効率的に修復されるが、その結果、これらの部位で意図されない変異
が生じ、これらの変異がゲノム全体に分布するおそれがある。
本発明は、少なくとも部分的に、研究用試薬として、遺伝子ドライブ中に(例えば、Ha
mmond et al., Nature Biotechnology 34:78-83 (2016)に記載)、または治療剤として使
用するための、ゲノム編集ヌクレアーゼ(例えば、RNAガイドCRISPR-Casヌ
クレアーゼまたは操作ジンクフィンガーヌクレアーゼ)およびカスタマイズ可能なDNA
結合ドメイン融合タンパク質(例えば、RNAガイドdead-Cas9、RNAガイド
dead-Cpf1、または転写調節ドメインと融合した操作ジンクフィンガーアレイ)
の特異性を改善するための方法および組成物の開発に基づく。
mmond et al., Nature Biotechnology 34:78-83 (2016)に記載)、または治療剤として使
用するための、ゲノム編集ヌクレアーゼ(例えば、RNAガイドCRISPR-Casヌ
クレアーゼまたは操作ジンクフィンガーヌクレアーゼ)およびカスタマイズ可能なDNA
結合ドメイン融合タンパク質(例えば、RNAガイドdead-Cas9、RNAガイド
dead-Cpf1、または転写調節ドメインと融合した操作ジンクフィンガーアレイ)
の特異性を改善するための方法および組成物の開発に基づく。
したがって、特異的TFまたは翻訳後ヒストン修飾に対して高い親和性を有する操作親
和性タンパク質(AP)と遺伝的に連結された標的ヌクレアーゼを含む融合タンパク質を
細胞において発現させること、または細胞をそれと接触させることを含む、細胞のゲノム
を修飾するための方法であって、特異的TFまたは翻訳後ヒストン修飾が標的部位の近位
に存在する場合にかぎり、融合タンパク質がその標的部位で活性である、方法が、本明細
書に提供される。
和性タンパク質(AP)と遺伝的に連結された標的ヌクレアーゼを含む融合タンパク質を
細胞において発現させること、または細胞をそれと接触させることを含む、細胞のゲノム
を修飾するための方法であって、特異的TFまたは翻訳後ヒストン修飾が標的部位の近位
に存在する場合にかぎり、融合タンパク質がその標的部位で活性である、方法が、本明細
書に提供される。
一部の実施形態では、APは、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブ
ドウ球菌(Staphylococcus aureus)免疫グロブリン結合プロテインA、操作ナノボディ
ー、および設計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される。
ドウ球菌(Staphylococcus aureus)免疫グロブリン結合プロテインA、操作ナノボディ
ー、および設計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、1)メガヌクレアーゼ、2)ジンクフィンガー
ヌクレアーゼ、3)転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ(TALEN)、および
4)クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)-CRIS
PR関連(Cas)ヌクレアーゼまたはCRISPR-Cpf1 RNAガイドヌクレア
ーゼ(RGN)からなる群より選択される。
ヌクレアーゼ、3)転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ(TALEN)、および
4)クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)-CRIS
PR関連(Cas)ヌクレアーゼまたはCRISPR-Cpf1 RNAガイドヌクレア
ーゼ(RGN)からなる群より選択される。
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、CRISPR-CasまたはCRISPR-C
pf1 RGNであり、方法は、ガイドRNAの存在下で行われる。
pf1 RGNであり、方法は、ガイドRNAの存在下で行われる。
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、表1に示される残基のうちの1つまたは複数の
変異を有する化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9ヌクレアーゼである。
変異を有する化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9ヌクレアーゼである。
R1015に変異、例えば、R1015A、R1015Q、またはR1015Hを担持
する黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9と融合したジンクフィンガーD
NA結合ドメイン(ZF DBD)またはTAL DNA結合アレイを含む融合タンパク
質を細胞において発現させること、または細胞をそれと接触させることを含む、細胞のゲ
ノムを修飾するための方法も、本明細書に提供される。
する黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9と融合したジンクフィンガーD
NA結合ドメイン(ZF DBD)またはTAL DNA結合アレイを含む融合タンパク
質を細胞において発現させること、または細胞をそれと接触させることを含む、細胞のゲ
ノムを修飾するための方法も、本明細書に提供される。
(i)標的DNA結合ドメインまたはガイドRNAと一緒の触媒不活性「dead」R
GN(dRGN)、(ii)異種機能性ドメイン、および(iii)操作親和性タンパク
質(AP)によって認識される転写因子またはヒストン修飾がDNA結合ドメインまたは
dRGNの標的部位の近位に存在する場合にかぎり活性であるAP、を含む融合タンパク
質を細胞において発現させること、または細胞をそれと接触させることを含む、細胞のゲ
ノムを修飾するための方法が、本明細書にさらに提供される。
GN(dRGN)、(ii)異種機能性ドメイン、および(iii)操作親和性タンパク
質(AP)によって認識される転写因子またはヒストン修飾がDNA結合ドメインまたは
dRGNの標的部位の近位に存在する場合にかぎり活性であるAP、を含む融合タンパク
質を細胞において発現させること、または細胞をそれと接触させることを含む、細胞のゲ
ノムを修飾するための方法が、本明細書にさらに提供される。
一部の実施形態では、APは、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブ
ドウ球菌(Staphylococcus aureus)免疫グロブリン結合プロテインA、操作ナノボディ
ー、および設計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される。
ドウ球菌(Staphylococcus aureus)免疫グロブリン結合プロテインA、操作ナノボディ
ー、および設計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される。
一部の実施形態では、機能性ドメインは、転写調節ドメイン、ヒストン修飾酵素、また
はDNA修飾酵素である。
はDNA修飾酵素である。
一部の実施形態では、ガイドRNAは、(i)19、18、および17bpのスペーサ
ー長を有するgRNA;(ii)目的の標的部位と比べて1、2、または3つの意図的な
ミスマッチを有するgRNA;(iii)オンターゲット部位と相補的な20ntを有し
、追加的なG塩基(標的DNA配列とミスマッチである)が5’に付加されたgRNA;
ならびに(iv)(i)~(iii)の任意の組合せからなる群から選択される。
ー長を有するgRNA;(ii)目的の標的部位と比べて1、2、または3つの意図的な
ミスマッチを有するgRNA;(iii)オンターゲット部位と相補的な20ntを有し
、追加的なG塩基(標的DNA配列とミスマッチである)が5’に付加されたgRNA;
ならびに(iv)(i)~(iii)の任意の組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ガイドRNAは、標的DNAに対する、9、10、11、12、
または13個のヌクレオチド塩基の非常に短い相補性配列を担持する切断型gRNAであ
る。
または13個のヌクレオチド塩基の非常に短い相補性配列を担持する切断型gRNAであ
る。
特に定義しないかぎり、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は
、本発明が属する技術分野の専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本
発明における使用のための方法および材料が、本明細書において記載されているが、当技
術分野において公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、
および例は、単なる例証であり、限定することを意図しない。全ての刊行物、特許出願、
特許、配列、データベース登録事項、および本明細書において言及される他の参考文献は
、その全体で参照により組み込まれている。矛盾する場合、定義を含めて本出願が優先さ
れる。
、本発明が属する技術分野の専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本
発明における使用のための方法および材料が、本明細書において記載されているが、当技
術分野において公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、
および例は、単なる例証であり、限定することを意図しない。全ての刊行物、特許出願、
特許、配列、データベース登録事項、および本明細書において言及される他の参考文献は
、その全体で参照により組み込まれている。矛盾する場合、定義を含めて本出願が優先さ
れる。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求
の範囲から明らかになるであろう。
の範囲から明らかになるであろう。
本特許または出願のファイルは、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カ
ラーの図面を有する本特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払え
ば、特許商標庁から提供されるであろう。
ラーの図面を有する本特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払え
ば、特許商標庁から提供されるであろう。
治療応用のためには、ヌクレアーゼ活性を特定のDNA配列だけでなく、特別なエピジ
ェネティック状況だけに、(特別なエピジェネティック状況は、次には特定の細胞型を表
す可能性があるので)例えば、疾患表現型を生成する細胞または遺伝的変化の導入が治療
上の利益を有すると予想される細胞だけに限定することが、望ましい能力であろう。この
ような能力を有することで、ヌクレアーゼが活性である細胞の数および種類を制限するこ
とができ、したがって、オンターゲットまたはオフターゲットDSBのいずれかが生じ得
る細胞数が最小になるであろう。細胞型特異的にゲノム編集を行うための既存の戦略は、
関連する細胞型を分離するためのex vivo選別アプローチ、特定の細胞もしくは組
織型に親和性を有するウイルス中にゲノム編集試薬をコードする核酸を送達すること、ま
たは細胞型特異的調節エレメント(例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサー)
を使用して、ヌクレアーゼの細胞型発現を推進することを含む。細胞表面標識および細胞
選別による特定の細胞型の富化は、費用がかかり、骨が折れ、場合により、近縁の細胞型
同士を識別することが不可能な場合がある。一部のウイルスは、細胞型に対して顕著な選
好性を有するものの、標的化可能な細胞型がかぎられており、多くの場合に中和宿主免疫
応答を回避することが困難であり得る。加えて、プロモーターなどの多くの細胞型特異的
調節エレメントは、関係する細胞型において漏出性の発現を示すので、ヌクレアーゼ活性
の厳重な制御を必要とするゲノム編集応用のためのそれらの有用性を限定する。この戦略
は、ゲノム編集試薬をコードするDNAによる送達よりも明らかに低いオフターゲットヌ
クレアーゼ効果を示した戦略である、細胞の混合集団へのRNA、精製ヌクレアーゼタン
パク質、またはリボ核タンパク質(RNP)複合体の送達とも不適合である。
ェネティック状況だけに、(特別なエピジェネティック状況は、次には特定の細胞型を表
す可能性があるので)例えば、疾患表現型を生成する細胞または遺伝的変化の導入が治療
上の利益を有すると予想される細胞だけに限定することが、望ましい能力であろう。この
ような能力を有することで、ヌクレアーゼが活性である細胞の数および種類を制限するこ
とができ、したがって、オンターゲットまたはオフターゲットDSBのいずれかが生じ得
る細胞数が最小になるであろう。細胞型特異的にゲノム編集を行うための既存の戦略は、
関連する細胞型を分離するためのex vivo選別アプローチ、特定の細胞もしくは組
織型に親和性を有するウイルス中にゲノム編集試薬をコードする核酸を送達すること、ま
たは細胞型特異的調節エレメント(例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサー)
を使用して、ヌクレアーゼの細胞型発現を推進することを含む。細胞表面標識および細胞
選別による特定の細胞型の富化は、費用がかかり、骨が折れ、場合により、近縁の細胞型
同士を識別することが不可能な場合がある。一部のウイルスは、細胞型に対して顕著な選
好性を有するものの、標的化可能な細胞型がかぎられており、多くの場合に中和宿主免疫
応答を回避することが困難であり得る。加えて、プロモーターなどの多くの細胞型特異的
調節エレメントは、関係する細胞型において漏出性の発現を示すので、ヌクレアーゼ活性
の厳重な制御を必要とするゲノム編集応用のためのそれらの有用性を限定する。この戦略
は、ゲノム編集試薬をコードするDNAによる送達よりも明らかに低いオフターゲットヌ
クレアーゼ効果を示した戦略である、細胞の混合集団へのRNA、精製ヌクレアーゼタン
パク質、またはリボ核タンパク質(RNP)複合体の送達とも不適合である。
戦略1 エピジェネティックに調節される配列特異的ヌクレアーゼ
一態様では、本方法は、標的部位に隣接する特異的転写因子(TF)またはヒストン修
飾の存在に依存するように配列特異的ヌクレアーゼの切断活性を操作することによって、
その活性を特定の細胞型に限定する。そのために、それ自体、最小限のDSBを誘導する
またはDSBを誘導しないヌクレアーゼが、特異的TFまたは翻訳後ヒストン修飾に対し
て高い親和性を有する操作親和性タンパク質(AP)と遺伝的に連結される((図1)。
APの例には、非限定的に、単鎖抗体(例えば、Chothia, Cyrus, et al. "Domain assoc
iation in immunoglobulin molecules: the packing of variable domains."Journal of
molecular biology 186.3 (1985): 651-663)、操作フィブロネクチンドメイン(例えば
、Koide, Akiko, et al. "The fibronectin type III domain as a scaffold for novel
binding proteins." Journal of molecular biology 284.4 (1998): 1141-1151に記載)
、操作黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)免疫グロブリン結合プロテインA(例
えば、Nord, Karin, et al. "Binding proteins selected from combinatorial librarie
s of an α-helical bacterial receptor domain." Nature biotechnology 15.8 (1997):
772-777に記載)、操作ナノボディー(例えば、Hamers-Casterman, C. T. S. G., et al
. "Naturally occurring antibodies devoid of light chains." Nature 363.6428 (1993
): 446-448に記載)、および設計アンキリンリピートタンパク質(例えば、Binz, H. Kas
par, et al. "Designing repeat proteins: well-expressed、soluble and stable prote
ins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins." Journal
of molecular biology 332.2 (2003): 489-503に記載)が挙げられる。これらのヌクレア
ーゼ-AP融合物の切断活性は、ヌクレアーゼによって特定される標的部位の認識および
標的部位の近位のAP結合パートナーの存在の両方に依存する。
一態様では、本方法は、標的部位に隣接する特異的転写因子(TF)またはヒストン修
飾の存在に依存するように配列特異的ヌクレアーゼの切断活性を操作することによって、
その活性を特定の細胞型に限定する。そのために、それ自体、最小限のDSBを誘導する
またはDSBを誘導しないヌクレアーゼが、特異的TFまたは翻訳後ヒストン修飾に対し
て高い親和性を有する操作親和性タンパク質(AP)と遺伝的に連結される((図1)。
APの例には、非限定的に、単鎖抗体(例えば、Chothia, Cyrus, et al. "Domain assoc
iation in immunoglobulin molecules: the packing of variable domains."Journal of
molecular biology 186.3 (1985): 651-663)、操作フィブロネクチンドメイン(例えば
、Koide, Akiko, et al. "The fibronectin type III domain as a scaffold for novel
binding proteins." Journal of molecular biology 284.4 (1998): 1141-1151に記載)
、操作黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)免疫グロブリン結合プロテインA(例
えば、Nord, Karin, et al. "Binding proteins selected from combinatorial librarie
s of an α-helical bacterial receptor domain." Nature biotechnology 15.8 (1997):
772-777に記載)、操作ナノボディー(例えば、Hamers-Casterman, C. T. S. G., et al
. "Naturally occurring antibodies devoid of light chains." Nature 363.6428 (1993
): 446-448に記載)、および設計アンキリンリピートタンパク質(例えば、Binz, H. Kas
par, et al. "Designing repeat proteins: well-expressed、soluble and stable prote
ins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins." Journal
of molecular biology 332.2 (2003): 489-503に記載)が挙げられる。これらのヌクレア
ーゼ-AP融合物の切断活性は、ヌクレアーゼによって特定される標的部位の認識および
標的部位の近位のAP結合パートナーの存在の両方に依存する。
特異的転写因子は、本明細書に記載されたもの、ならびに例えば:造血TF:例えば、
GATA1、TAL1、ELF1、およびKLF1;基本転写因子、例えば、転写前開始
複合体のメンバーである因子、そのC末端ドメインの差次的リン酸化状態を有するRNA
Pol II(活発に転写中、休止済みなどに関連)、P300およびメディエーター
;下記の「親和性タンパク質」の節に挙げられるTF;ならびにDNA結合モチーフが特
定疾患に重要な調節エレメントに隣接するTFを含み得る。ヒストン修飾には、本明細書
に記載された修飾および異なる転写活性化状態と関連する修飾、例えば:H3K4me1
/2/3、H3K9me1/2/3、H3K27me1/2/3、H3K9ac、H3K
27ac、H3K56ac、H3K36me1/2/3、H3K79me1/2/3、ま
たはH4K16acが含まれる。
GATA1、TAL1、ELF1、およびKLF1;基本転写因子、例えば、転写前開始
複合体のメンバーである因子、そのC末端ドメインの差次的リン酸化状態を有するRNA
Pol II(活発に転写中、休止済みなどに関連)、P300およびメディエーター
;下記の「親和性タンパク質」の節に挙げられるTF;ならびにDNA結合モチーフが特
定疾患に重要な調節エレメントに隣接するTFを含み得る。ヒストン修飾には、本明細書
に記載された修飾および異なる転写活性化状態と関連する修飾、例えば:H3K4me1
/2/3、H3K9me1/2/3、H3K27me1/2/3、H3K9ac、H3K
27ac、H3K56ac、H3K36me1/2/3、H3K79me1/2/3、ま
たはH4K16acが含まれる。
切断活性を保っている(が、その標的部位を効率的に切断することができない)部位特
異的ヌクレアーゼを操作するために、これらのヌクレアーゼとその標的部位との結合を、
(i)標的DNA鎖と接触する残基への標的変異により、DNAに対するヌクレアーゼの
非特異的親和性を低下させること、および/または(ii)CRISPR-Casヌクレ
アーゼなどのRNAガイドヌクレアーゼについて標的部位に対する親和性または相互作用
能がかぎられているまたは低下しているガイドRNA(gRNA)を操作することによっ
て、不安定化することができる。このような戦略の一具体例は、DNAに対するタンパク
質の親和性を低下させることが意図される化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)C
as9(SpCas9)ヌクレアーゼに作成された変異の組合せを使用し、このような変
異の例には、非限定的に、表1に示される変異およびそれらの変異の任意の可能な組合せ
が挙げられる。
異的ヌクレアーゼを操作するために、これらのヌクレアーゼとその標的部位との結合を、
(i)標的DNA鎖と接触する残基への標的変異により、DNAに対するヌクレアーゼの
非特異的親和性を低下させること、および/または(ii)CRISPR-Casヌクレ
アーゼなどのRNAガイドヌクレアーゼについて標的部位に対する親和性または相互作用
能がかぎられているまたは低下しているガイドRNA(gRNA)を操作することによっ
て、不安定化することができる。このような戦略の一具体例は、DNAに対するタンパク
質の親和性を低下させることが意図される化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)C
as9(SpCas9)ヌクレアーゼに作成された変異の組合せを使用し、このような変
異の例には、非限定的に、表1に示される変異およびそれらの変異の任意の可能な組合せ
が挙げられる。
類似の効果を有するジンクフィンガーおよびZFNにおける変異が記載されており、そ
れらを本明細書において使用することもできる。例えば、Guilinger et al., Nat Method
s. 2014 Apr; 11(4): 429-435; Khalil et al., Cell. 2012 Aug 3;150(3):647-58を参照
されたい。
れらを本明細書において使用することもできる。例えば、Guilinger et al., Nat Method
s. 2014 Apr; 11(4): 429-435; Khalil et al., Cell. 2012 Aug 3;150(3):647-58を参照
されたい。
結果として生じたSpCas9バリアントは、(i)スペーサー長19、18、および
17bpを有するgRNA、(ii)意図される標的部位と比べて1、2、または3つの
意図的なミスマッチを有するgRNA、(iii)オンターゲット部位と20、19、1
8、または17ntの相補性を有する追加的なG塩基(標的DNA配列とミスマッチであ
る)をgRNAの5’に付加すること、ならびに(iv)これらの前記gRNAバリエー
ションのいずれかの組合せなどの、ゲノム標的部位に対して低下した親和性を有するgR
NAと共に使用することもできる。
17bpを有するgRNA、(ii)意図される標的部位と比べて1、2、または3つの
意図的なミスマッチを有するgRNA、(iii)オンターゲット部位と20、19、1
8、または17ntの相補性を有する追加的なG塩基(標的DNA配列とミスマッチであ
る)をgRNAの5’に付加すること、ならびに(iv)これらの前記gRNAバリエー
ションのいずれかの組合せなどの、ゲノム標的部位に対して低下した親和性を有するgR
NAと共に使用することもできる。
戦略2 三次元クロマチンコンフォメーションに依存する配列特異的ヌクレアーゼ
多数の遺伝子の転写調節は、特定の状況および細胞型において遺伝子発現を上方調節す
るように作用するエンハンサーエレメントの状況により制御される。これらのエンハンサ
ーは、しばしば一次配列における遺伝子プロモーターから数十~数百キロ塩基離れたどこ
かまで非常に離れている場合がある。しかし、長距離クロマチンループ形成によりこれら
のエンハンサーをプロモーターに近づけて、それらの標的遺伝子を活性化することができ
る。この態様では、RGNを調節エレメント(すなわち、エンハンサーまたはエンハンサ
ー周囲の配列)と標的遺伝子または遺伝子プロモーターとの間の長距離クロマチンループ
形成の出現に依存するように操作することによって、ヌクレアーゼの切断活性は、特定の
細胞型に限定される。
多数の遺伝子の転写調節は、特定の状況および細胞型において遺伝子発現を上方調節す
るように作用するエンハンサーエレメントの状況により制御される。これらのエンハンサ
ーは、しばしば一次配列における遺伝子プロモーターから数十~数百キロ塩基離れたどこ
かまで非常に離れている場合がある。しかし、長距離クロマチンループ形成によりこれら
のエンハンサーをプロモーターに近づけて、それらの標的遺伝子を活性化することができ
る。この態様では、RGNを調節エレメント(すなわち、エンハンサーまたはエンハンサ
ー周囲の配列)と標的遺伝子または遺伝子プロモーターとの間の長距離クロマチンループ
形成の出現に依存するように操作することによって、ヌクレアーゼの切断活性は、特定の
細胞型に限定される。
以前の研究は、SpCas9が操作ジンクフィンガーアレイ(ZF)またはTALEリ
ピートアレイなどの第2のDNA結合ドメイン(DBD)によりその標的部位近くに繋が
れたときにかぎり、DSBを誘導するように操作することができることを示した(Bolukb
asi, Mehmet Fatih, et al. "DNA-binding-domain fusions enhance the targeting rang
e and precision of Cas9." Nature methods 12.12 (2015): 1150-1156)。これは、タン
パク質がそのPAMモチーフを認識する能力に影響するSpCas9の位置R1333ま
たはR1335に変異を導入することによって成し遂げられる(このような変異は、Ca
s9 PAM相互作用ドメインノックダウンまたはCas9 PID KDと呼ばれる)
。SaCas9を用いた類似のシステムは、標的部位でSaCas9とPAM配列との間
の相互作用に影響する変異R1015A、R1015Q、またはR1015Hを担持する
SaCas9 PID KDに第2のZF DBDを融合することによって操作すること
ができる(Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2015 Dec;33(12):1293-1298)。
ピートアレイなどの第2のDNA結合ドメイン(DBD)によりその標的部位近くに繋が
れたときにかぎり、DSBを誘導するように操作することができることを示した(Bolukb
asi, Mehmet Fatih, et al. "DNA-binding-domain fusions enhance the targeting rang
e and precision of Cas9." Nature methods 12.12 (2015): 1150-1156)。これは、タン
パク質がそのPAMモチーフを認識する能力に影響するSpCas9の位置R1333ま
たはR1335に変異を導入することによって成し遂げられる(このような変異は、Ca
s9 PAM相互作用ドメインノックダウンまたはCas9 PID KDと呼ばれる)
。SaCas9を用いた類似のシステムは、標的部位でSaCas9とPAM配列との間
の相互作用に影響する変異R1015A、R1015Q、またはR1015Hを担持する
SaCas9 PID KDに第2のZF DBDを融合することによって操作すること
ができる(Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2015 Dec;33(12):1293-1298)。
戦略3 エピジェネティックに調節されるエピゲノム編集タンパク質
多く疾患が、遺伝子サブセットの発現変化によって特徴づけられ、これらの遺伝子サブ
セットは、疾患の表現型自体の原因となることが多い。疾患表現型を有する細胞中の遺伝
子を調節しているプロモーターおよび/またはエンハンサーの近位に特定の転写因子が結
合する、または結合しない結果として、遺伝子発現が変化する。ZFアレイ、TALEリ
ピートアレイなどのプログラム可能な配列特異的DBD、および触媒不活性RGN(de
ad RGNまたはdRGN)とエフェクタータンパク質を遺伝的に融合することによっ
て遺伝子発現をモジュレートする現行方法が存在するものの、これらのツールは試薬が送
達される全ての細胞型において機能すると予想され、特定の疾患または非疾患表現型を有
する細胞に対して内因性特異性を有しない。結果として、所望の細胞サブセットにこれら
の試薬を送達することは、複雑なex vivoアプローチまたは細胞型特異的転写調節
エレメントからこれらの試薬を発現させること(タンパク質送達と不適合な戦略)を要す
る。本態様では、遺伝子発現は、関心対象の遺伝子の近位に位置する特異的TFまたはヒ
ストン修飾の存在次第で修飾され、その結果、特異的TFの結合またはヒストン修飾プロ
ファイルを有する細胞にかぎり、遺伝子発現のプログラムされたモジュレーションが生じ
る。
多く疾患が、遺伝子サブセットの発現変化によって特徴づけられ、これらの遺伝子サブ
セットは、疾患の表現型自体の原因となることが多い。疾患表現型を有する細胞中の遺伝
子を調節しているプロモーターおよび/またはエンハンサーの近位に特定の転写因子が結
合する、または結合しない結果として、遺伝子発現が変化する。ZFアレイ、TALEリ
ピートアレイなどのプログラム可能な配列特異的DBD、および触媒不活性RGN(de
ad RGNまたはdRGN)とエフェクタータンパク質を遺伝的に融合することによっ
て遺伝子発現をモジュレートする現行方法が存在するものの、これらのツールは試薬が送
達される全ての細胞型において機能すると予想され、特定の疾患または非疾患表現型を有
する細胞に対して内因性特異性を有しない。結果として、所望の細胞サブセットにこれら
の試薬を送達することは、複雑なex vivoアプローチまたは細胞型特異的転写調節
エレメントからこれらの試薬を発現させること(タンパク質送達と不適合な戦略)を要す
る。本態様では、遺伝子発現は、関心対象の遺伝子の近位に位置する特異的TFまたはヒ
ストン修飾の存在次第で修飾され、その結果、特異的TFの結合またはヒストン修飾プロ
ファイルを有する細胞にかぎり、遺伝子発現のプログラムされたモジュレーションが生じ
る。
例えば、本方法は、DNAに対する非特異的親和性を低下させることを意図する戦略1
および2に記載の修飾を有するまたは有しないdRGNを、APと、および遺伝子の転写
アウトプットを変化させることができるエフェクタータンパク質(異種機能性ドメイン)
と、遺伝的に融合したものを使用することを含み得る(表2)。これらのdRGNは、d
RGNと複合するとgRNA配列によって特定される標的部位と安定的に結合することが
できない様々な修飾gRNA(例えば、戦略1および2で概要を示したもの)と一緒に使
用される。しかし、APとの結合パートナー(例えば、特定のTFまたはヒストン修飾)
が、また、gRNA結合部位に近接して存在するとき、AP-結合パートナー相互作用か
ら標的部位に対する親和性が増加することにより、複合体が特定の標的部位と安定的に会
合できるようになる(図6Aおよび6B)。次に、dRGN-APと融合したエフェクタ
ーは、標的遺伝子の発現を変化させることができる。戦略1および2に記載した修飾gR
NAに加えて、本発明者らは、9、10、11、12、または13個のヌクレオチド塩基
という非常に短いスペーサー配列を担持するgRNAと一緒に、触媒不活性化変異のみを
担持する(すなわち、DNAに対する非特異的親和性を低下させることを意図する追加的
な変異を有しない)dRGNタンパク質を使用することも提案する。この戦略は、標的部
位へのdRGN複合体の安定結合だけを必要とし、ヌクレアーゼ活性を必要としないので
、AP-結合パートナー相互作用に関連して複合体が結合できるために、9~13個の塩
基のスペーサー配列を担持するgRNAで十分な可能性がある。
および2に記載の修飾を有するまたは有しないdRGNを、APと、および遺伝子の転写
アウトプットを変化させることができるエフェクタータンパク質(異種機能性ドメイン)
と、遺伝的に融合したものを使用することを含み得る(表2)。これらのdRGNは、d
RGNと複合するとgRNA配列によって特定される標的部位と安定的に結合することが
できない様々な修飾gRNA(例えば、戦略1および2で概要を示したもの)と一緒に使
用される。しかし、APとの結合パートナー(例えば、特定のTFまたはヒストン修飾)
が、また、gRNA結合部位に近接して存在するとき、AP-結合パートナー相互作用か
ら標的部位に対する親和性が増加することにより、複合体が特定の標的部位と安定的に会
合できるようになる(図6Aおよび6B)。次に、dRGN-APと融合したエフェクタ
ーは、標的遺伝子の発現を変化させることができる。戦略1および2に記載した修飾gR
NAに加えて、本発明者らは、9、10、11、12、または13個のヌクレオチド塩基
という非常に短いスペーサー配列を担持するgRNAと一緒に、触媒不活性化変異のみを
担持する(すなわち、DNAに対する非特異的親和性を低下させることを意図する追加的
な変異を有しない)dRGNタンパク質を使用することも提案する。この戦略は、標的部
位へのdRGN複合体の安定結合だけを必要とし、ヌクレアーゼ活性を必要としないので
、AP-結合パートナー相互作用に関連して複合体が結合できるために、9~13個の塩
基のスペーサー配列を担持するgRNAで十分な可能性がある。
操作親和性タンパク質(AP)
本発明の融合タンパク質に有用なAPは、特異的転写因子(TF)または翻訳後ヒスト
ン修飾(例えば、図1に示すもの)に対して高い親和性を有するAPである。APの例に
は、非限定的に、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌(Stap
hylococcus aureus)免疫グロブリン結合プロテインA、操作ナノボディー、および設計
アンキリンリピートタンパク質が挙げられる。TFの例には、基本転写因子(例えば、T
FIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、およびTFIIH);発
生学的に調節されているTF(例えば、GATA、HNF、PIT-1、MyoD、My
f5、Hox、ウィングドヘリックス(Winged Helix));およびシグナル依存性TF(
例えば、SP1、AP-1、C/EBP、熱ショック因子、ATF/CREB、c-My
c、MEF2、STAT、R-SMAD、NF-κB、Notch、TUBBY、NFA
T、およびSREBP)が挙げられる。特異的翻訳後ヒストン修飾の例には、メチル化、
リン酸化、アセチル化、ユビキチン化、およびSUMO化が挙げられる。これらは、操作
タンパク質に行われたこれらの修飾に特異的親和性を有して、これらのタンパク質を介し
て標的化することができる。
本発明の融合タンパク質に有用なAPは、特異的転写因子(TF)または翻訳後ヒスト
ン修飾(例えば、図1に示すもの)に対して高い親和性を有するAPである。APの例に
は、非限定的に、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌(Stap
hylococcus aureus)免疫グロブリン結合プロテインA、操作ナノボディー、および設計
アンキリンリピートタンパク質が挙げられる。TFの例には、基本転写因子(例えば、T
FIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、およびTFIIH);発
生学的に調節されているTF(例えば、GATA、HNF、PIT-1、MyoD、My
f5、Hox、ウィングドヘリックス(Winged Helix));およびシグナル依存性TF(
例えば、SP1、AP-1、C/EBP、熱ショック因子、ATF/CREB、c-My
c、MEF2、STAT、R-SMAD、NF-κB、Notch、TUBBY、NFA
T、およびSREBP)が挙げられる。特異的翻訳後ヒストン修飾の例には、メチル化、
リン酸化、アセチル化、ユビキチン化、およびSUMO化が挙げられる。これらは、操作
タンパク質に行われたこれらの修飾に特異的親和性を有して、これらのタンパク質を介し
て標的化することができる。
特異的転写因子は、上に記載されたもの、ならびに例えば:造血TF:例えば、GAT
A1、TAL1、ELF1、およびKLF1;基本転写因子、例えば、転写前開始複合体
のメンバーである因子、そのC末端ドメインの差次的リン酸化状態を有するRNA Po
l II(活発に転写中、休止済みなどに関連)、P300およびメディエーター;下記
の「親和性タンパク質」の節に挙げられるTF;ならびにDNA結合モチーフが特定疾患
に重要な調節エレメントに隣接するTFを含み得る。ヒストン修飾には、本明細書におい
て記載された修飾および異なる転写活性化状態と関連する修飾、例えば:H3K4me1
/2/3、H3K9me1/2/3、H3K27me1/2/3、H3K9ac、H3K
27ac、H3K56ac、H3K36me1/2/3、H3K79me1/2/3、ま
たはH4K16acが含まれる。
A1、TAL1、ELF1、およびKLF1;基本転写因子、例えば、転写前開始複合体
のメンバーである因子、そのC末端ドメインの差次的リン酸化状態を有するRNA Po
l II(活発に転写中、休止済みなどに関連)、P300およびメディエーター;下記
の「親和性タンパク質」の節に挙げられるTF;ならびにDNA結合モチーフが特定疾患
に重要な調節エレメントに隣接するTFを含み得る。ヒストン修飾には、本明細書におい
て記載された修飾および異なる転写活性化状態と関連する修飾、例えば:H3K4me1
/2/3、H3K9me1/2/3、H3K27me1/2/3、H3K9ac、H3K
27ac、H3K56ac、H3K36me1/2/3、H3K79me1/2/3、ま
たはH4K16acが含まれる。
配列特異的ヌクレアーゼ
現在4つの主なクラスの配列特異的ヌクレアーゼ:1)メガヌクレアーゼ、2)ジンク
フィンガーヌクレアーゼ、3)転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ(TALEN
)、および4)クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)
Cas RNAガイドヌクレアーゼ(RGN)がある。DNAに対するタンパク質の非特
異的親和性をノックダウンすることにより、タンパク質が親和性タンパク質結合パートナ
ーからの追加的な結合エネルギーなしには、その標的配列と安定的に結合できないように
するために、これらのタンパク質の修飾を行うことができる。ZFNについて、リン酸D
NA骨格と接触するZFドメイン中の残基をノックアウトすることができる(Khalil et
al., Cell 2012参照)。TALEについて、DNAリン酸接触を媒介する各リピート中に
、変異させることができる特定の残基がある。一部の実施形態では、非常に長い結合事象
だけがヌクレアーゼ活性をもたらすように、ヌクレアーゼドメインがノックダウンされた
3-フィンガーZFアレイまたは結合エネルギーがより小さくなるような短鎖TALEN
アレイ(例えば7.5または8.5)を使用することができる。また、これらのプラット
フォームの様々な成分を一緒に融合して、Mega-TALおよびFokI-dCas9
融合物のような追加的なヌクレアーゼを生み出すことができる。例えば、Gaj et al., Tr
ends Biotechnol. 2013 Jul;31(7):397-405を参照されたい。当技術分野において公知の
方法を使用して、ヌクレアーゼを細胞に一過性または安定的に発現させることもでき、概
して、発現を得るために、タンパク質をコードする配列が、転写を指示するためのプロモ
ーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングされる。適切な真核発現システムは
、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A La
boratory Manual (4th ed. 2013); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Labora
tory Manual (2006);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al.,
eds., 2010)に記載されている。真核および原核細胞の形質転換は、標準的な技法に従っ
て行われる(例えば、上記参考文献およびMorrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351;
Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 198
3)を参照されたい。
現在4つの主なクラスの配列特異的ヌクレアーゼ:1)メガヌクレアーゼ、2)ジンク
フィンガーヌクレアーゼ、3)転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ(TALEN
)、および4)クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)
Cas RNAガイドヌクレアーゼ(RGN)がある。DNAに対するタンパク質の非特
異的親和性をノックダウンすることにより、タンパク質が親和性タンパク質結合パートナ
ーからの追加的な結合エネルギーなしには、その標的配列と安定的に結合できないように
するために、これらのタンパク質の修飾を行うことができる。ZFNについて、リン酸D
NA骨格と接触するZFドメイン中の残基をノックアウトすることができる(Khalil et
al., Cell 2012参照)。TALEについて、DNAリン酸接触を媒介する各リピート中に
、変異させることができる特定の残基がある。一部の実施形態では、非常に長い結合事象
だけがヌクレアーゼ活性をもたらすように、ヌクレアーゼドメインがノックダウンされた
3-フィンガーZFアレイまたは結合エネルギーがより小さくなるような短鎖TALEN
アレイ(例えば7.5または8.5)を使用することができる。また、これらのプラット
フォームの様々な成分を一緒に融合して、Mega-TALおよびFokI-dCas9
融合物のような追加的なヌクレアーゼを生み出すことができる。例えば、Gaj et al., Tr
ends Biotechnol. 2013 Jul;31(7):397-405を参照されたい。当技術分野において公知の
方法を使用して、ヌクレアーゼを細胞に一過性または安定的に発現させることもでき、概
して、発現を得るために、タンパク質をコードする配列が、転写を指示するためのプロモ
ーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングされる。適切な真核発現システムは
、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A La
boratory Manual (4th ed. 2013); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Labora
tory Manual (2006);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al.,
eds., 2010)に記載されている。真核および原核細胞の形質転換は、標準的な技法に従っ
て行われる(例えば、上記参考文献およびMorrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351;
Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 198
3)を参照されたい。
ホーミングメガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼは、細菌、酵母、藻類、および植物オルガネラなどの多様な生物を起
源にもつ配列特異的エンドヌクレアーゼである。内因性メガヌクレアーゼは、12~30
塩基対の認識部位を有する。18bpおよび24bp長のメガヌクレアーゼ認識部位を有
する特注のDNA結合部位が記載されており、どちらも本発明の方法および構築物に使用
することができる。例えば、Silva, G., et al., Current Gene Therapy, 11:11-27, (20
11); Arnould et al., Journal of Molecular Biology, 355:443-58 (2006); Arnould et
al., Protein Engineering Design & Selection, 24:27-31 (2011);およびStoddard, Q.
Rev. Biophys. 38, 49 (2005); Grizot et al., Nucleic Acids Research, 38:2006-18
(2010)を参照されたい。
メガヌクレアーゼは、細菌、酵母、藻類、および植物オルガネラなどの多様な生物を起
源にもつ配列特異的エンドヌクレアーゼである。内因性メガヌクレアーゼは、12~30
塩基対の認識部位を有する。18bpおよび24bp長のメガヌクレアーゼ認識部位を有
する特注のDNA結合部位が記載されており、どちらも本発明の方法および構築物に使用
することができる。例えば、Silva, G., et al., Current Gene Therapy, 11:11-27, (20
11); Arnould et al., Journal of Molecular Biology, 355:443-58 (2006); Arnould et
al., Protein Engineering Design & Selection, 24:27-31 (2011);およびStoddard, Q.
Rev. Biophys. 38, 49 (2005); Grizot et al., Nucleic Acids Research, 38:2006-18
(2010)を参照されたい。
CRISPR-Casヌクレアーゼ
最近の研究により、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRIS
PR)/CRISPR関連(Cas)システム(Wiedenheft et al., Nature 482, 331-3
38 (2012); Horvath et al., Science 327, 167-170 (2010); Terns et al., Curr Opin
Microbiol 14, 321-327 (2011))が、細菌、酵母およびヒト細胞において、ならびにショ
ウジョウバエ、ゼブラフィッシュおよびマウスなどの生物全体においてin vivoで
、ゲノム編集を行うための簡単で高効率的な方法の基礎として役立つことができると実証
された(Wang et al., Cell 153, 910-918 (2013); Shen et al., Cell Res (2013); Dic
arlo et al., Nucleic Acids Res (2013); Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239
(2013); Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013); Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 2
27-229 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Mali et al., Science 33
9, 823-826 (2013c); Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013); Gratz et al.,
Genetics 194(4):1029-35 (2013))。化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)由来Cas9ヌク
レアーゼ(以後、単にCas9と呼ぶ)は、17~20個のヌクレオチドの操作ガイドR
NA(gRNA)、例えば、単一のガイドRNAまたはcrRNA/tracrRNA対
と、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、例えば配列NGGまたはNAGとマッチ
するPAMの隣にある関心対象の標的ゲノムDNA配列の相補鎖との間の単純な塩基対相
補性を介してガイドされ得る(Shen et al., Cell Res (2013); Dicarlo et al., Nuclei
c Acids Res (2013); Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Jinek et al
., Elife 2, e00471 (2013); Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013); Cong
et al., Science 339, 819-823 (2013); Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c);
Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013); Jinek et al., Science 337, 816-8
21 (2012))。例えば、Zetsche et al., Cell 163, 759-771 (2015); Schunder et al.,
Int J Med Microbiol 303, 51-60 (2013); Makarova et al., Nat Rev Microbiol 13, 72
2-736 (2015); Fagerlund et al., Genome Biol 16, 251 (2015)に記載されているように
操作されたプレボテラ属(Prevotella)およびフランシステラ属(Francisella)由来C
RISPR 1(Cpf1)ヌクレアーゼも使用することができる。SpCas9とは異
なり、Cpf1は、その3’末端に標的DNA配列のプロトスペーサーと相補的な23n
tを有する、42ntのcrRNAを1つだけ必要とする(Zetsche et al., 2015)。さ
らに、SpCas9がプロトスペーサーの3’にあるNGG PAM配列を認識するのに
対し、AsCpf1およびLbCp1は、プロトスペーサーの5’に見られるTTTN
PAMを認識する(同上)。
最近の研究により、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRIS
PR)/CRISPR関連(Cas)システム(Wiedenheft et al., Nature 482, 331-3
38 (2012); Horvath et al., Science 327, 167-170 (2010); Terns et al., Curr Opin
Microbiol 14, 321-327 (2011))が、細菌、酵母およびヒト細胞において、ならびにショ
ウジョウバエ、ゼブラフィッシュおよびマウスなどの生物全体においてin vivoで
、ゲノム編集を行うための簡単で高効率的な方法の基礎として役立つことができると実証
された(Wang et al., Cell 153, 910-918 (2013); Shen et al., Cell Res (2013); Dic
arlo et al., Nucleic Acids Res (2013); Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239
(2013); Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013); Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 2
27-229 (2013); Cong et al., Science 339, 819-823 (2013); Mali et al., Science 33
9, 823-826 (2013c); Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013); Gratz et al.,
Genetics 194(4):1029-35 (2013))。化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)由来Cas9ヌク
レアーゼ(以後、単にCas9と呼ぶ)は、17~20個のヌクレオチドの操作ガイドR
NA(gRNA)、例えば、単一のガイドRNAまたはcrRNA/tracrRNA対
と、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、例えば配列NGGまたはNAGとマッチ
するPAMの隣にある関心対象の標的ゲノムDNA配列の相補鎖との間の単純な塩基対相
補性を介してガイドされ得る(Shen et al., Cell Res (2013); Dicarlo et al., Nuclei
c Acids Res (2013); Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013); Jinek et al
., Elife 2, e00471 (2013); Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013); Cong
et al., Science 339, 819-823 (2013); Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c);
Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013); Jinek et al., Science 337, 816-8
21 (2012))。例えば、Zetsche et al., Cell 163, 759-771 (2015); Schunder et al.,
Int J Med Microbiol 303, 51-60 (2013); Makarova et al., Nat Rev Microbiol 13, 72
2-736 (2015); Fagerlund et al., Genome Biol 16, 251 (2015)に記載されているように
操作されたプレボテラ属(Prevotella)およびフランシステラ属(Francisella)由来C
RISPR 1(Cpf1)ヌクレアーゼも使用することができる。SpCas9とは異
なり、Cpf1は、その3’末端に標的DNA配列のプロトスペーサーと相補的な23n
tを有する、42ntのcrRNAを1つだけ必要とする(Zetsche et al., 2015)。さ
らに、SpCas9がプロトスペーサーの3’にあるNGG PAM配列を認識するのに
対し、AsCpf1およびLbCp1は、プロトスペーサーの5’に見られるTTTN
PAMを認識する(同上)。
一部の実施形態では、本システムは、化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)もしくは黄色ブ
ドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来の野生型もしくはバリアントCas9タンパク
質、あるいは細菌にコードされているか、もしくは哺乳動物細胞における発現のためにコ
ドン最適化されているかのいずれかであり、かつ/またはそのPAM認識特異性および/
もしくはそのゲノムワイド特異性が修飾されている、アシダミノコッカス属(Acidaminoc
occus)の菌種BV3L6またはラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌ND2006由
来の野生型Cpf1タンパク質を利用する。いくつかのバリアントが記載されているが、
例えば、とりわけ国際公開第2016/141224号パンフレット、PCT/US第2
016/049147号明細書、Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2016 Aug;34(8)
:869-74; Tsai and Joung, Nat Rev Genet. 2016 May;17(5):300-12; Kleinstiver et al
., Nature. 2016 Jan 28;529(7587):490-5; Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov 5;60(
3):385-97; Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2015 Dec;33(12):1293-1298; Dahlma
n et al., Nat Biotechnol. 2015 Nov;33(11):1159-61; Kleinstiver et al., Nature. 2
015 Jul 23;523(7561):481-5; Wyvekens et al., Hum Gene Ther. 2015 Jul;26(7):425-3
1; Hwang et al., Methods Mol Biol. 2015;1311:317-34; Osborn et al., Hum Gene The
r. 2015 Feb;26(2):114-26; Konermann et al., Nature. 2015 Jan 29;517(7536):583-8;
Fu et al., Methods Enzymol. 2014;546:21-45;およびTsai et al., Nat Biotechnol. 2
014 Jun;32(6):569-76を参照されたい。ガイドRNAは、Cas9またはCpf1と一緒
に細胞において発現されるまたは存在する。ガイドRNAまたはヌクレアーゼの一方また
は両方を、細胞において一過性もしくは安定的に発現させる、または精製されたタンパク
質もしくは核酸として導入することができる。
ドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来の野生型もしくはバリアントCas9タンパク
質、あるいは細菌にコードされているか、もしくは哺乳動物細胞における発現のためにコ
ドン最適化されているかのいずれかであり、かつ/またはそのPAM認識特異性および/
もしくはそのゲノムワイド特異性が修飾されている、アシダミノコッカス属(Acidaminoc
occus)の菌種BV3L6またはラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌ND2006由
来の野生型Cpf1タンパク質を利用する。いくつかのバリアントが記載されているが、
例えば、とりわけ国際公開第2016/141224号パンフレット、PCT/US第2
016/049147号明細書、Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2016 Aug;34(8)
:869-74; Tsai and Joung, Nat Rev Genet. 2016 May;17(5):300-12; Kleinstiver et al
., Nature. 2016 Jan 28;529(7587):490-5; Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov 5;60(
3):385-97; Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2015 Dec;33(12):1293-1298; Dahlma
n et al., Nat Biotechnol. 2015 Nov;33(11):1159-61; Kleinstiver et al., Nature. 2
015 Jul 23;523(7561):481-5; Wyvekens et al., Hum Gene Ther. 2015 Jul;26(7):425-3
1; Hwang et al., Methods Mol Biol. 2015;1311:317-34; Osborn et al., Hum Gene The
r. 2015 Feb;26(2):114-26; Konermann et al., Nature. 2015 Jan 29;517(7536):583-8;
Fu et al., Methods Enzymol. 2014;546:21-45;およびTsai et al., Nat Biotechnol. 2
014 Jun;32(6):569-76を参照されたい。ガイドRNAは、Cas9またはCpf1と一緒
に細胞において発現されるまたは存在する。ガイドRNAまたはヌクレアーゼの一方また
は両方を、細胞において一過性もしくは安定的に発現させる、または精製されたタンパク
質もしくは核酸として導入することができる。
一部の実施形態では、SpCas9は、タンパク質のヌクレアーゼ部分を触媒不活性に
するために、Cas9のヌクレアーゼ活性を低下または破壊する以下の変異:D10、E
762、D839、H983、またはD986のうちの1つ、およびH840またはN8
63、例えば、D10A/D10NおよびH840A/H840N/H840Yも含み、
これらの位置での置換は、アラニン(Nishimasu al., Cell 156, 935-949 (2014)におけ
るように)、または他の残基、例えば、グルタミン、アスパラギン、チロシン、セリン、
もしくはアスパラギン酸、例えば、E762Q、H983N、H983Y、D986N、
N863D、N863S、またはN863H(国際公開第2014/152432号パン
フレット参照)であり得る。一部の実施形態では、バリアントは、D10AもしくはH8
40Aでの変異(一本鎖ニッカーゼを生み出す)、またはD10AおよびH840Aでの
変異(ヌクレアーゼ活性を消失させる;この変異はdead Cas9またはdCas9
として公知)を含む。
するために、Cas9のヌクレアーゼ活性を低下または破壊する以下の変異:D10、E
762、D839、H983、またはD986のうちの1つ、およびH840またはN8
63、例えば、D10A/D10NおよびH840A/H840N/H840Yも含み、
これらの位置での置換は、アラニン(Nishimasu al., Cell 156, 935-949 (2014)におけ
るように)、または他の残基、例えば、グルタミン、アスパラギン、チロシン、セリン、
もしくはアスパラギン酸、例えば、E762Q、H983N、H983Y、D986N、
N863D、N863S、またはN863H(国際公開第2014/152432号パン
フレット参照)であり得る。一部の実施形態では、バリアントは、D10AもしくはH8
40Aでの変異(一本鎖ニッカーゼを生み出す)、またはD10AおよびH840Aでの
変異(ヌクレアーゼ活性を消失させる;この変異はdead Cas9またはdCas9
として公知)を含む。
一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、FokI-dCas9融合体、すなわち、Ca
s9ヌクレアーゼが変異により触媒不活性(例えば、dCas9)にされ、FokIヌク
レアーゼが任意選択で介在リンカーを用いてdCas9とフレーム内融合したRNAガイ
ドFokIヌクレアーゼである。例えば、国際公開第2014/144288号パンフレ
ットおよび国際公開第2014/204578号パンフレットを参照されたい。
s9ヌクレアーゼが変異により触媒不活性(例えば、dCas9)にされ、FokIヌク
レアーゼが任意選択で介在リンカーを用いてdCas9とフレーム内融合したRNAガイ
ドFokIヌクレアーゼである。例えば、国際公開第2014/144288号パンフレ
ットおよび国際公開第2014/204578号パンフレットを参照されたい。
この方法は、低下した親和性を有するガイドRNA、例えば、(1)標的部位と相同な
20ntを有するgRNAであって、標的部位配列とミスマッチである、追加的に5’に
付加されたGを有するgRNA;(2)標的部位と相同な19ntを有するgRNAであ
って、5’の20番目のntに標的部位とミスマッチであるGを有するgRNA;または
(3)標的部位と相同な18ntを有するgRNAであって、標的部位とミスマッチであ
る2つのGを5’に有するgRNAと共に、DNAに対して通常の親和性を有する野生型
Casタンパク質を使用することを含み得る。例えば、上記参考文献のいずれかに記載さ
れているような適切なガイドRNAを設計および製造するために、公知の方法を改変する
ことができる。
20ntを有するgRNAであって、標的部位配列とミスマッチである、追加的に5’に
付加されたGを有するgRNA;(2)標的部位と相同な19ntを有するgRNAであ
って、5’の20番目のntに標的部位とミスマッチであるGを有するgRNA;または
(3)標的部位と相同な18ntを有するgRNAであって、標的部位とミスマッチであ
る2つのGを5’に有するgRNAと共に、DNAに対して通常の親和性を有する野生型
Casタンパク質を使用することを含み得る。例えば、上記参考文献のいずれかに記載さ
れているような適切なガイドRNAを設計および製造するために、公知の方法を改変する
ことができる。
したがって、本明細書においてSpCas9バリアントを含むCas9バリアントが提
供される。SpCas9の野生型配列は、以下の通りである:
供される。SpCas9の野生型配列は、以下の通りである:
本明細書に記載のSpCas9バリアントは、本明細書に記載または当技術分野におい
て公知の変異(すなわち、異なるアミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、またはセリン
による天然アミノ酸の置換)を有する、配列番号1のアミノ酸配列を含み得る。一部の実
施形態では、SpCas9バリアントは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%
、例えば少なくとも85%、90%、または95%同一であり、例えば、本明細書に記載
の変異に加えて、配列番号1の残基の最大5%、10%、15%、または20%に、例え
ば保存的変異により置換された差異を有する。
て公知の変異(すなわち、異なるアミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、またはセリン
による天然アミノ酸の置換)を有する、配列番号1のアミノ酸配列を含み得る。一部の実
施形態では、SpCas9バリアントは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%
、例えば少なくとも85%、90%、または95%同一であり、例えば、本明細書に記載
の変異に加えて、配列番号1の残基の最大5%、10%、15%、または20%に、例え
ば保存的変異により置換された差異を有する。
本明細書においてSaCas9バリアントも提供される。SaCas9の野生型配列は
、以下の通りである:
、以下の通りである:
本明細書に記載のSaCas9バリアントは、本明細書に記載または当技術分野におい
て公知の変異を有する配列番号2のアミノ酸配列を含み、例えば、本明細書に記載または
当技術分野において公知の変異を有する配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%、
例えば少なくとも85%、90%、または95%同一である配列を含む。
て公知の変異を有する配列番号2のアミノ酸配列を含み、例えば、本明細書に記載または
当技術分野において公知の変異を有する配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも80%、
例えば少なくとも85%、90%、または95%同一である配列を含む。
2つの核酸配列の同一率を決定するために、最適な比較を行う目的で配列がアライメン
トされる(例えば、最適なアライメントのために第1および第2のアミノ酸または核酸配
列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的で非相同配列を無視する
ことができる)。比較目的でアライメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少
なくとも80%であり、一部の実施形態では、少なくとも90%または100%である。
次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でヌクレオチドが比較される。第1
の配列中の位置が、第2の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有されて
いる場合、当該分子はその位置で同一である(本明細書において使用される核酸の「同一
性」は、核酸の「相同性」と等価である)。2つの配列の間の同一率は、2つの配列の最
適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考
慮して、両配列によって共有される同一な位置の数の関数である。2つのポリペプチドま
たは核酸配列の間の同一率は、当業者の技術の範囲内である様々な方法で、例えば、公的
に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えばSmith Waterman Al
ignment(Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7);
GeneMatcher Plus(商標)に組み込まれている「BestFit」(Sm
ith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981))、Schwarz and
Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed, pp 353-
358;BLASTプログラム(Basic Local Alignment Search Tool;(Altschul, S. F.,
W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10)、BLAST-2、BLAST-P
、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-
2、CLUSTAL、またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアを使用し
て決定される。加えて、当業者は、比較される配列の長さにわたり最大のアライメントを
達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、アライメントを測定するために適切
なパラメーターを決定することができる。一般に、タンパク質または核酸について、比較
の長さは、最大で完全長である任意の長さ(例えば、5%、10%、20%、30%、4
0%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%)であり得る
。本発明の組成物および方法のために、配列の完全長の少なくとも80%がアライメント
される。
トされる(例えば、最適なアライメントのために第1および第2のアミノ酸または核酸配
列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的で非相同配列を無視する
ことができる)。比較目的でアライメントされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少
なくとも80%であり、一部の実施形態では、少なくとも90%または100%である。
次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でヌクレオチドが比較される。第1
の配列中の位置が、第2の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有されて
いる場合、当該分子はその位置で同一である(本明細書において使用される核酸の「同一
性」は、核酸の「相同性」と等価である)。2つの配列の間の同一率は、2つの配列の最
適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考
慮して、両配列によって共有される同一な位置の数の関数である。2つのポリペプチドま
たは核酸配列の間の同一率は、当業者の技術の範囲内である様々な方法で、例えば、公的
に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えばSmith Waterman Al
ignment(Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7);
GeneMatcher Plus(商標)に組み込まれている「BestFit」(Sm
ith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981))、Schwarz and
Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed, pp 353-
358;BLASTプログラム(Basic Local Alignment Search Tool;(Altschul, S. F.,
W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10)、BLAST-2、BLAST-P
、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-
2、CLUSTAL、またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアを使用し
て決定される。加えて、当業者は、比較される配列の長さにわたり最大のアライメントを
達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めて、アライメントを測定するために適切
なパラメーターを決定することができる。一般に、タンパク質または核酸について、比較
の長さは、最大で完全長である任意の長さ(例えば、5%、10%、20%、30%、4
0%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%)であり得る
。本発明の組成物および方法のために、配列の完全長の少なくとも80%がアライメント
される。
本発明のために、配列の比較および2つの配列の間の同一率の決定は、Blossum
62スコアリングマトリックスをギャップペナルティー12、ギャップ伸長ペナルティ
ー4、およびフレームシフトギャップペナルティー5で使用して達成することができる。
62スコアリングマトリックスをギャップペナルティー12、ギャップ伸長ペナルティ
ー4、およびフレームシフトギャップペナルティー5で使用して達成することができる。
保存的置換は、概して、以下の群:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイ
シン;アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン
;リシン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシンの中の置換を含む。
シン;アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン
;リシン、アルギニン;およびフェニルアラニン、チロシンの中の置換を含む。
TALエフェクターリピートアレイ
キサントモナス(Xanthomonas)属における植物病原細菌のTALエフェクターは、宿
主DNAと結合し、エフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、疾患に重
要な役割を果たす、または防御を誘起する。特異性は、エフェクターの様々な数の不完全
な、概して約33~35個のアミノ酸リピートに依存する。多型は、主としてリピート位
置12および13に存在し、それらの位置は、本明細書においてリピート可変二残基(R
VD)と称される。TALエフェクターのRVDは、標的部位におけるヌクレオチドと直
接線形的に1つのRVDが1つのヌクレオチドへと対応し、幾分の縮重を有し、明らかな
状況依存性を有しない。一部の実施形態では、ヌクレオチド特異性を与える多型領域は、
三残基またはトリプレットとして表示される場合がある。
キサントモナス(Xanthomonas)属における植物病原細菌のTALエフェクターは、宿
主DNAと結合し、エフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、疾患に重
要な役割を果たす、または防御を誘起する。特異性は、エフェクターの様々な数の不完全
な、概して約33~35個のアミノ酸リピートに依存する。多型は、主としてリピート位
置12および13に存在し、それらの位置は、本明細書においてリピート可変二残基(R
VD)と称される。TALエフェクターのRVDは、標的部位におけるヌクレオチドと直
接線形的に1つのRVDが1つのヌクレオチドへと対応し、幾分の縮重を有し、明らかな
状況依存性を有しない。一部の実施形態では、ヌクレオチド特異性を与える多型領域は、
三残基またはトリプレットとして表示される場合がある。
各DNA結合リピートは、標的DNA配列中の塩基対の認識を決定するRVDを含む場
合があり、その際、各DNA結合リピートは、標的DNA配列中の一塩基対を認識するこ
とを担う。一部の実施形態では、RVDは、Cを認識するためのHA;Cを認識するため
のND;Cを認識するためのHI;Gを認識するためのHN;Gを認識するためのNA;
GまたはAを認識するためのSN;Tを認識するためのYG;およびGを認識するための
NKのうちの1つまたは複数、ならびにCを認識するためのHD;Tを認識するためのN
G;Aを認識するためのNI;GまたはAを認識するためのNN;AまたはCまたはGま
たはTを認識するためのNS;CまたはTを認識するためのN*(*は、RVDの第2の
位置におけるギャップを表す);Tを認識するためのHG;Tを認識するためのH*(*
は、RVDの2番目の位置におけるギャップを表す);およびTを認識するためのIGの
うちの1つまたは複数を含む場合がある。
合があり、その際、各DNA結合リピートは、標的DNA配列中の一塩基対を認識するこ
とを担う。一部の実施形態では、RVDは、Cを認識するためのHA;Cを認識するため
のND;Cを認識するためのHI;Gを認識するためのHN;Gを認識するためのNA;
GまたはAを認識するためのSN;Tを認識するためのYG;およびGを認識するための
NKのうちの1つまたは複数、ならびにCを認識するためのHD;Tを認識するためのN
G;Aを認識するためのNI;GまたはAを認識するためのNN;AまたはCまたはGま
たはTを認識するためのNS;CまたはTを認識するためのN*(*は、RVDの第2の
位置におけるギャップを表す);Tを認識するためのHG;Tを認識するためのH*(*
は、RVDの2番目の位置におけるギャップを表す);およびTを認識するためのIGの
うちの1つまたは複数を含む場合がある。
TALEタンパク質は、ゲノム工学において相同組換えを促すことができる標的キメラ
ヌクレアーゼとして研究およびバイオテクノロジーに有用であり得る(例えば、バイオ燃
料またはバイオ再生可能物(biorenewable)に有用な形質を植物に付加または強化するた
め)。これらのタンパク質は、また、例えば転写因子として、特に非限定的な例として病
原体(例えばウイルス)に対する治療薬などの、非常に高いレベルの特異性を要する治療
応用のために有用であり得る。
ヌクレアーゼとして研究およびバイオテクノロジーに有用であり得る(例えば、バイオ燃
料またはバイオ再生可能物(biorenewable)に有用な形質を植物に付加または強化するた
め)。これらのタンパク質は、また、例えば転写因子として、特に非限定的な例として病
原体(例えばウイルス)に対する治療薬などの、非常に高いレベルの特異性を要する治療
応用のために有用であり得る。
操作TALEアレイを作製するための方法は、当技術分野において公知であり、例えば
、米国特許出願第61/610,212号明細書、およびReyon et al., Nature Biotech
nology 30,460-465 (2012) に記載された迅速なライゲーションベースの自動化可能固相
高スループット(fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput)(
FLASH)システム、ならびにBogdanove & Voytas, Science 333, 1843-1846 (2011);
Bogdanove et al., Curr Opin Plant Biol 13, 394-401 (2010); Scholze & Boch, J. C
urr Opin Microbiol (2011); Boch et al., Science 326, 1509-1512 (2009); Moscou &
Bogdanove, Science 326, 1501 (2009); Miller et al., Nat Biotechnol 29, 143-148 (
2011); Morbitzer et al., T. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 21617-21622 (2010); Mo
rbitzer et al., Nucleic Acids Res 39, 5790-5799 (2011); Zhang et al., Nat Biotec
hnol 29, 149-153 (2011); Geissler et al., PLoS ONE 6, e19509 (2011); Weber et al
., PLoS ONE 6, e19722 (2011); Christian et al., Genetics 186, 757-761 (2010); Li
et al., Nucleic Acids Res 39, 359-372 (2011); Mahfouz et al., Proc Natl Acad Sc
i U S A 108, 2623-2628 (2011); Mussolino et al., Nucleic Acids Res (2011); Li et
al., Nucleic Acids Res 39, 6315-6325 (2011); Cermak et al., Nucleic Acids Res 3
9, e82 (2011); Wood et al., Science 333, 307 (2011); Hockemeye et al. Nat Biotec
hnol 29, 731-734 (2011); Tesson et al., Nat Biotechnol 29, 695-696 (2011); Sande
r et al., Nat Biotechnol 29, 697-698 (2011); Huang et al., Nat Biotechnol 29, 69
9-700 (2011);およびZhang et al., Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011)に記載された
方法を参照されたく、これらの全ては、その全体で参照により本明細書に組み込まれてい
る。
、米国特許出願第61/610,212号明細書、およびReyon et al., Nature Biotech
nology 30,460-465 (2012) に記載された迅速なライゲーションベースの自動化可能固相
高スループット(fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput)(
FLASH)システム、ならびにBogdanove & Voytas, Science 333, 1843-1846 (2011);
Bogdanove et al., Curr Opin Plant Biol 13, 394-401 (2010); Scholze & Boch, J. C
urr Opin Microbiol (2011); Boch et al., Science 326, 1509-1512 (2009); Moscou &
Bogdanove, Science 326, 1501 (2009); Miller et al., Nat Biotechnol 29, 143-148 (
2011); Morbitzer et al., T. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 21617-21622 (2010); Mo
rbitzer et al., Nucleic Acids Res 39, 5790-5799 (2011); Zhang et al., Nat Biotec
hnol 29, 149-153 (2011); Geissler et al., PLoS ONE 6, e19509 (2011); Weber et al
., PLoS ONE 6, e19722 (2011); Christian et al., Genetics 186, 757-761 (2010); Li
et al., Nucleic Acids Res 39, 359-372 (2011); Mahfouz et al., Proc Natl Acad Sc
i U S A 108, 2623-2628 (2011); Mussolino et al., Nucleic Acids Res (2011); Li et
al., Nucleic Acids Res 39, 6315-6325 (2011); Cermak et al., Nucleic Acids Res 3
9, e82 (2011); Wood et al., Science 333, 307 (2011); Hockemeye et al. Nat Biotec
hnol 29, 731-734 (2011); Tesson et al., Nat Biotechnol 29, 695-696 (2011); Sande
r et al., Nat Biotechnol 29, 697-698 (2011); Huang et al., Nat Biotechnol 29, 69
9-700 (2011);およびZhang et al., Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011)に記載された
方法を参照されたく、これらの全ては、その全体で参照により本明細書に組み込まれてい
る。
メガヌクレアーゼとTALエフェクターとの融合物であるMegaTALも、本方法に
使用するために適切である。例えば、Boissel et al., Nucl. Acids Res. 42(4):2591-26
01 (2014); Boissel and Scharenberg, Methods Mol Biol. 2015;1239:171-96を参照され
たい。
使用するために適切である。例えば、Boissel et al., Nucl. Acids Res. 42(4):2591-26
01 (2014); Boissel and Scharenberg, Methods Mol Biol. 2015;1239:171-96を参照され
たい。
TALを、転写活性化因子、転写抑制因子、メチル化ドメイン(例えば、DNA中のメ
チル化シトシンのヒドロキシル化を触媒する配列を含む触媒ドメイン、国際公開第201
3181228号パンフレット参照)、およびヌクレアーゼなどの機能性ドメインと融合
して、遺伝子発現を調節し、DNAメチル化を変化させ、モデル生物、植物、およびヒト
細胞のゲノムに標的変化を導入することができる。例えば、Tan et al., PNAS 100:11997
-12002 (2003); Wong et al., Cancer Res. 59:71-73 (1999); Zhang et al., Nat. Biot
ech. 29:149-154 (2011);および国際公開第2013181228号パンフレットを参照
されたい。
チル化シトシンのヒドロキシル化を触媒する配列を含む触媒ドメイン、国際公開第201
3181228号パンフレット参照)、およびヌクレアーゼなどの機能性ドメインと融合
して、遺伝子発現を調節し、DNAメチル化を変化させ、モデル生物、植物、およびヒト
細胞のゲノムに標的変化を導入することができる。例えば、Tan et al., PNAS 100:11997
-12002 (2003); Wong et al., Cancer Res. 59:71-73 (1999); Zhang et al., Nat. Biot
ech. 29:149-154 (2011);および国際公開第2013181228号パンフレットを参照
されたい。
ジンクフィンガー
ジンクフィンガータンパク質は、1つまたは複数のジンクフィンガー、すなわち独立し
てフォールディングした亜鉛含有ミニドメインを含有するDNA結合タンパク質であり、
その構造は、当技術分野において周知であり、例えば、Miller et al., 1985, EMBO J.,
4:1609; Berg, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:99; Lee et al., 1989, Science
. 245:635;およびKlug, 1993, Gene, 135:83に定義されている。DNAと結合したジンク
フィンガータンパク質Zif268およびそのバリアントの結晶構造は、半分保存された
相互作用パターンを示しており、そのパターンでは、概してジンクフィンガーのアルファ
-ヘリックスからの3つのアミノ酸が、DNA中の3つの隣接塩基対または「サブサイト
」と接触している(Pavletich et al., 1991, Science, 252:809; Elrod-Erickson et al
., 1998, Structure, 6:451)。したがって、Zif268の結晶構造は、ジンクフィン
ガーDNA結合ドメインが、ジンクフィンガーとDNA配列中の3塩基対の「サブサイト
」との間で1対1に相互作用してモジュール的に機能し得ることを示唆した。天然ジンク
フィンガー転写因子では、複数のジンクフィンガーが、概してタンデムアレイとして一緒
に連結して、連続DNA配列の配列特異的認識を達成する(Klug, 1993, Gene 135:83)
。
ジンクフィンガータンパク質は、1つまたは複数のジンクフィンガー、すなわち独立し
てフォールディングした亜鉛含有ミニドメインを含有するDNA結合タンパク質であり、
その構造は、当技術分野において周知であり、例えば、Miller et al., 1985, EMBO J.,
4:1609; Berg, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:99; Lee et al., 1989, Science
. 245:635;およびKlug, 1993, Gene, 135:83に定義されている。DNAと結合したジンク
フィンガータンパク質Zif268およびそのバリアントの結晶構造は、半分保存された
相互作用パターンを示しており、そのパターンでは、概してジンクフィンガーのアルファ
-ヘリックスからの3つのアミノ酸が、DNA中の3つの隣接塩基対または「サブサイト
」と接触している(Pavletich et al., 1991, Science, 252:809; Elrod-Erickson et al
., 1998, Structure, 6:451)。したがって、Zif268の結晶構造は、ジンクフィン
ガーDNA結合ドメインが、ジンクフィンガーとDNA配列中の3塩基対の「サブサイト
」との間で1対1に相互作用してモジュール的に機能し得ることを示唆した。天然ジンク
フィンガー転写因子では、複数のジンクフィンガーが、概してタンデムアレイとして一緒
に連結して、連続DNA配列の配列特異的認識を達成する(Klug, 1993, Gene 135:83)
。
関心対象のDNA標的部位と結合可能な所望のバリアントを同定するためにDNA結合
に関与するアルファ-ヘリックス位置でアミノ酸をランダム化することおよびファージデ
ィスプレイなどの選択方法論を使用することによって、個別のジンクフィンガーのDNA
結合特性を人工的に操作可能であることが、複数の研究によって示された(Rebar et al.
, 1994, Science, 263:671; Choo et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11163
; Jamieson et al., 1994, Biochemistry 33:5689; Wu et al., 1995 Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 92: 344)。そのような組換えジンクフィンガータンパク質は、転写活性化因
子、転写抑制因子、メチル化ドメイン、およびヌクレアーゼなどの機能性ドメインと融合
して、遺伝子発現を調節し、DNAメチル化を変化させ、モデル生物、植物、およびヒト
細胞のゲノムに標的変化を導入することができる(Carroll, 2008, Gene Ther., 15:1463
-68; Cathomen, 2008, Mol. Ther., 16:1200-07; Wu et al., 2007, Cell. Mol. Life Sc
i., 64:2933-44)。
に関与するアルファ-ヘリックス位置でアミノ酸をランダム化することおよびファージデ
ィスプレイなどの選択方法論を使用することによって、個別のジンクフィンガーのDNA
結合特性を人工的に操作可能であることが、複数の研究によって示された(Rebar et al.
, 1994, Science, 263:671; Choo et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11163
; Jamieson et al., 1994, Biochemistry 33:5689; Wu et al., 1995 Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 92: 344)。そのような組換えジンクフィンガータンパク質は、転写活性化因
子、転写抑制因子、メチル化ドメイン、およびヌクレアーゼなどの機能性ドメインと融合
して、遺伝子発現を調節し、DNAメチル化を変化させ、モデル生物、植物、およびヒト
細胞のゲノムに標的変化を導入することができる(Carroll, 2008, Gene Ther., 15:1463
-68; Cathomen, 2008, Mol. Ther., 16:1200-07; Wu et al., 2007, Cell. Mol. Life Sc
i., 64:2933-44)。
「モジュール集合」として公知の、ジンクフィンガーアレイを操作するための既存の一
方法は、予備選択されたジンクフィンガーモジュールを単純に一緒に繋げてアレイにする
ことを提唱している(Segal et al., 2003, Biochemistry, 42:2137-48; Beerli et al.,
2002, Nat. Biotechnol., 20:135-141; Mandell et al., 2006, Nucleic Acids Res., 3
4:W516-523; Carroll et al., 2006, Nat. Protoc. 1:1329-41; Liu et al., 2002, J. B
iol. Chem., 277:3850-56; Bae et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:275-280; Wright
et al., 2006, Nat. Protoc., 1:1637-52)。あらゆる研究者によって実施されるに足る
ほど直接的であるものの、最近の報告により、本方法に関して、特にジンクフィンガーヌ
クレアーゼに関連する高い失敗率が実証された(Ramirez et al., 2008, Nat. Methods,
5:374-375; Kim et al., 2009, Genome Res. 19:1279-88)。これは、概して任意の所与
の標的遺伝子について非常に多数のジンクフィンガータンパク質の構築および細胞ベース
の試験を必要とする制約である(Kim et al., 2009, Genome Res. 19:1279-88)。
方法は、予備選択されたジンクフィンガーモジュールを単純に一緒に繋げてアレイにする
ことを提唱している(Segal et al., 2003, Biochemistry, 42:2137-48; Beerli et al.,
2002, Nat. Biotechnol., 20:135-141; Mandell et al., 2006, Nucleic Acids Res., 3
4:W516-523; Carroll et al., 2006, Nat. Protoc. 1:1329-41; Liu et al., 2002, J. B
iol. Chem., 277:3850-56; Bae et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:275-280; Wright
et al., 2006, Nat. Protoc., 1:1637-52)。あらゆる研究者によって実施されるに足る
ほど直接的であるものの、最近の報告により、本方法に関して、特にジンクフィンガーヌ
クレアーゼに関連する高い失敗率が実証された(Ramirez et al., 2008, Nat. Methods,
5:374-375; Kim et al., 2009, Genome Res. 19:1279-88)。これは、概して任意の所与
の標的遺伝子について非常に多数のジンクフィンガータンパク質の構築および細胞ベース
の試験を必要とする制約である(Kim et al., 2009, Genome Res. 19:1279-88)。
ランダム化されたライブラリーからジンクフィンガーアレイを同定するコンビナトリア
ル選択ベース法は、モジュール集合よりも高い成功率を有することが示されている(Maed
er et al., 2008, Mol. Cell, 31:294-301; Joung et al., 2010, Nat. Methods, 7:91-9
2; Isalan et al., 2001, Nat. Biotechnol., 19:656-660)。好ましい実施形態では、ジ
ンクフィンガーアレイは、国際公開第2011/017293号パンフレットおよび同第
2004/099366号パンフレットに記載されている、またはそれらに記載されてい
るように作製される。追加的で適切なジンクフィンガーDBDは、米国特許第6,511
,808号明細書、同第6,013,453号明細書、同第6,007,988号明細書
、および同第6,503,717号明細書ならびに米国特許出願公開第2002/016
0940号明細書に記載されている。
ル選択ベース法は、モジュール集合よりも高い成功率を有することが示されている(Maed
er et al., 2008, Mol. Cell, 31:294-301; Joung et al., 2010, Nat. Methods, 7:91-9
2; Isalan et al., 2001, Nat. Biotechnol., 19:656-660)。好ましい実施形態では、ジ
ンクフィンガーアレイは、国際公開第2011/017293号パンフレットおよび同第
2004/099366号パンフレットに記載されている、またはそれらに記載されてい
るように作製される。追加的で適切なジンクフィンガーDBDは、米国特許第6,511
,808号明細書、同第6,013,453号明細書、同第6,007,988号明細書
、および同第6,503,717号明細書ならびに米国特許出願公開第2002/016
0940号明細書に記載されている。
異種機能性ドメイン
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、米国特許第8,993,2
33号明細書;米国特許出願公開第20140186958号明細書;米国特許第9,0
23,649号明細書;国際公開第2014/099744号パンフレット;国際公開第
2014/089290号パンフレット;国際公開第2014/144592号パンフレ
ット;国際公開第144288号パンフレット;国際公開第2014/204578号パ
ンフレット;国際公開第2014/152432号パンフレット;国際公開第2115/
099850号パンフレット;米国特許第8,697,359号明細書;米国特許出願公
開第2010/0076057号明細書;米国特許出願公開第2011/0189776
号明細書;米国特許出願公開第2011/0223638号明細書;米国特許出願公開第
2013/0130248号明細書;国際公開第2008/108989号パンフレット
;国際公開第2010/054108号パンフレット;国際公開第2012/16456
5号パンフレット;国際公開第2013/098244号パンフレット;国際公開第20
13/176772号パンフレット;米国特許出願公開第20150050699号明細
書;米国特許出願公開第20150071899号明細書および国際公開第2014/1
24284号パンフレットに記載されたような異種機能性ドメインを含む。好ましい実施
形態では、異種機能性ドメインはDNAを変化させる。例えば、好ましくは1つもしくは
複数のヌクレアーゼ活性の低下もしくは死滅変異、および/またはDNA結合親和性を低
下させる1つもしくは複数の変異を含むヌクレアーゼを、転写活性化ドメインまたは他の
異種機能性ドメイン(例えば、転写抑制因子(例えば、KRAB、ERD、SID、およ
びその他、例えば、ets2抑制因子(ERF)の抑制ドメイン(ERD)のアミノ酸4
73~530番、KOX1のKRABドメインのアミノ酸1~97番、もしくはMad
mSIN3相互作用ドメイン(SID)のアミノ酸1~36番;Beerli et al., PNAS US
A 95:14628-14633 (1998)参照)と融合させることができ、または当技術分野において公
知のヘテロクロマチンタンパク質1(HP1、swi6としても公知)、例えば、HP1
αもしくはHP1βなどのサイレンサー;MS2コートタンパク質、エンドリボヌクレア
ーゼCsy4、もしくはラムダNタンパク質によって結合されたもののような固定RNA
結合配列と融合した長鎖非コードRNA(lncRNA)を動員できるタンパク質もしく
はペプチド;DNAのメチル化状態を修飾する酵素(例えば、DNAメチルトランスフェ
ラーゼ(DNMT)もしくはTETタンパク質);またはヒストンサブユニットを修飾す
る酵素(例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)、ヒストンデアセチラ
ーゼ(HDAC)、ヒストンメチルトランスフェラーゼ(例えば、リシンもしくはアルギ
ニン残基のメチル化用)もしくはヒストンデメチラーゼ(例えば、リシンもしくはアルギ
ニン残基の脱メチル化用))を使用することもできる。そのようなドメイン、例えば、D
NA中のメチル化シトシンのヒドロキシル化を触媒するドメインについてのいくつかの配
列が、当技術分野において公知である。タンパク質の例には、DNA中の5-メチルシト
シン(5-mC)を5-ヒドロキシメチルシトシン(5-hmC)に変換する酵素である
Ten-Eleven-Translocation(TET)1~3ファミリーが挙げ
られる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、米国特許第8,993,2
33号明細書;米国特許出願公開第20140186958号明細書;米国特許第9,0
23,649号明細書;国際公開第2014/099744号パンフレット;国際公開第
2014/089290号パンフレット;国際公開第2014/144592号パンフレ
ット;国際公開第144288号パンフレット;国際公開第2014/204578号パ
ンフレット;国際公開第2014/152432号パンフレット;国際公開第2115/
099850号パンフレット;米国特許第8,697,359号明細書;米国特許出願公
開第2010/0076057号明細書;米国特許出願公開第2011/0189776
号明細書;米国特許出願公開第2011/0223638号明細書;米国特許出願公開第
2013/0130248号明細書;国際公開第2008/108989号パンフレット
;国際公開第2010/054108号パンフレット;国際公開第2012/16456
5号パンフレット;国際公開第2013/098244号パンフレット;国際公開第20
13/176772号パンフレット;米国特許出願公開第20150050699号明細
書;米国特許出願公開第20150071899号明細書および国際公開第2014/1
24284号パンフレットに記載されたような異種機能性ドメインを含む。好ましい実施
形態では、異種機能性ドメインはDNAを変化させる。例えば、好ましくは1つもしくは
複数のヌクレアーゼ活性の低下もしくは死滅変異、および/またはDNA結合親和性を低
下させる1つもしくは複数の変異を含むヌクレアーゼを、転写活性化ドメインまたは他の
異種機能性ドメイン(例えば、転写抑制因子(例えば、KRAB、ERD、SID、およ
びその他、例えば、ets2抑制因子(ERF)の抑制ドメイン(ERD)のアミノ酸4
73~530番、KOX1のKRABドメインのアミノ酸1~97番、もしくはMad
mSIN3相互作用ドメイン(SID)のアミノ酸1~36番;Beerli et al., PNAS US
A 95:14628-14633 (1998)参照)と融合させることができ、または当技術分野において公
知のヘテロクロマチンタンパク質1(HP1、swi6としても公知)、例えば、HP1
αもしくはHP1βなどのサイレンサー;MS2コートタンパク質、エンドリボヌクレア
ーゼCsy4、もしくはラムダNタンパク質によって結合されたもののような固定RNA
結合配列と融合した長鎖非コードRNA(lncRNA)を動員できるタンパク質もしく
はペプチド;DNAのメチル化状態を修飾する酵素(例えば、DNAメチルトランスフェ
ラーゼ(DNMT)もしくはTETタンパク質);またはヒストンサブユニットを修飾す
る酵素(例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)、ヒストンデアセチラ
ーゼ(HDAC)、ヒストンメチルトランスフェラーゼ(例えば、リシンもしくはアルギ
ニン残基のメチル化用)もしくはヒストンデメチラーゼ(例えば、リシンもしくはアルギ
ニン残基の脱メチル化用))を使用することもできる。そのようなドメイン、例えば、D
NA中のメチル化シトシンのヒドロキシル化を触媒するドメインについてのいくつかの配
列が、当技術分野において公知である。タンパク質の例には、DNA中の5-メチルシト
シン(5-mC)を5-ヒドロキシメチルシトシン(5-hmC)に変換する酵素である
Ten-Eleven-Translocation(TET)1~3ファミリーが挙げ
られる。
ヒトTET1~3についての配列は、当技術分野において公知であり、次表に示される
:
:
一部の実施形態では、触媒ドメインの完全長配列の全部または一部、例えば、システイ
ンリッチ伸長部を含む触媒モジュールおよび7つの高度に保存されたエクソンによってコ
ードされる2OGFeDOドメイン、例えば、アミノ酸1580~2052番を含むTe
t1触媒ドメイン、アミノ酸1290~1905番を含むTet2、およびアミノ酸96
6~1678番を含むTet3が含まれる場合がある。例えば、3つのTetタンパク質
全てにおける主要な触媒残基を示しているアライメントについては、Iyer et al., Cell
Cycle. 2009 Jun 1;8(11):1698-710. Epub 2009 Jun 27の図1を、完全長配列については
その補足資料(ftpのサイト、ftp.ncbi.nih.gov/pub/aravind/DONS/supplementary_ma
terial_DONS.htmlから入手可能)を参照されたい(例えば、seq 2c参照)。一部の
実施形態では、配列は、Tet1のアミノ酸1418~2136番またはTet2/3に
おける対応する領域を含む。
ンリッチ伸長部を含む触媒モジュールおよび7つの高度に保存されたエクソンによってコ
ードされる2OGFeDOドメイン、例えば、アミノ酸1580~2052番を含むTe
t1触媒ドメイン、アミノ酸1290~1905番を含むTet2、およびアミノ酸96
6~1678番を含むTet3が含まれる場合がある。例えば、3つのTetタンパク質
全てにおける主要な触媒残基を示しているアライメントについては、Iyer et al., Cell
Cycle. 2009 Jun 1;8(11):1698-710. Epub 2009 Jun 27の図1を、完全長配列については
その補足資料(ftpのサイト、ftp.ncbi.nih.gov/pub/aravind/DONS/supplementary_ma
terial_DONS.htmlから入手可能)を参照されたい(例えば、seq 2c参照)。一部の
実施形態では、配列は、Tet1のアミノ酸1418~2136番またはTet2/3に
おける対応する領域を含む。
他の触媒モジュールは、Iyer et al., 2009において同定されたタンパク質に由来し得
る。
る。
一部の実施形態では、異種機能性ドメインは、生物学的テザーであり、MS2コートタ
ンパク質、エンドリボヌクレアーゼCsy4、またはラムダNタンパク質(に由来するD
NA結合ドメイン、例えば)の全部または一部を含む。これらのタンパク質を使用して、
特異的ステムループ構造を含有するRNA分子を、dCas9 gRNA標的化配列によ
って特定される場所に動員することができる。例えば、MS2コートタンパク質、エンド
リボヌクレアーゼCsy4、またはラムダNと融合したdCas9バリアントを使用して
、例えば、Csy4、MS2またはラムダN結合配列に連結されたXISTまたはHOT
AIRなどの長鎖非コードRNA(lncRNA)を動員することができる。Keryer-Bib
ens et al., Biol. Cell 100:125-138 (2008)を参照されたい。あるいは、例えばKeryer-
Bibens et al.(上記)のようにCsy4、MS2またはラムダNタンパク質結合配列を
別のタンパク質と連結することができ、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、
このタンパク質をdCas9バリアント結合部位に標的化することができる。一部の実施
形態では、Csy4は触媒不活性である。一部の実施形態では、Cas9バリアント、好
ましくはdCas9バリアントは、米国特許第8,993,233号明細書;米国特許出
願公開第20140186958号明細書;米国特許第9,023,649号明細書;国
際公開第2014/099744号パンフレット;国際公開第2014/089290号
パンフレット;国際公開第2014/144592号パンフレット;国際公開第1442
88号パンフレット;国際公開第2014/204578号パンフレット;国際公開第2
014/152432号パンフレット;国際公開第2115/099850号パンフレッ
ト;米国特許第8,697,359号明細書;米国特許出願公開第2010/00760
57号明細書;米国特許出願公開第2011/0189776号明細書;米国特許出願公
開第2011/0223638号明細書;米国特許出願公開第2013/0130248
号明細書;国際公開第2008/108989号パンフレット;国際公開第2010/0
54108号パンフレット;国際公開第2012/164565号パンフレット;国際公
開第2013/098244号パンフレット;国際公開第2013/176772号パン
フレット;米国特許出願公開第20150050699号明細書;米国特許出願公開第2
0150071899号明細書および国際公開第2014/204578号パンフレット
に記載されているように、FokIと融合される。
ンパク質、エンドリボヌクレアーゼCsy4、またはラムダNタンパク質(に由来するD
NA結合ドメイン、例えば)の全部または一部を含む。これらのタンパク質を使用して、
特異的ステムループ構造を含有するRNA分子を、dCas9 gRNA標的化配列によ
って特定される場所に動員することができる。例えば、MS2コートタンパク質、エンド
リボヌクレアーゼCsy4、またはラムダNと融合したdCas9バリアントを使用して
、例えば、Csy4、MS2またはラムダN結合配列に連結されたXISTまたはHOT
AIRなどの長鎖非コードRNA(lncRNA)を動員することができる。Keryer-Bib
ens et al., Biol. Cell 100:125-138 (2008)を参照されたい。あるいは、例えばKeryer-
Bibens et al.(上記)のようにCsy4、MS2またはラムダNタンパク質結合配列を
別のタンパク質と連結することができ、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、
このタンパク質をdCas9バリアント結合部位に標的化することができる。一部の実施
形態では、Csy4は触媒不活性である。一部の実施形態では、Cas9バリアント、好
ましくはdCas9バリアントは、米国特許第8,993,233号明細書;米国特許出
願公開第20140186958号明細書;米国特許第9,023,649号明細書;国
際公開第2014/099744号パンフレット;国際公開第2014/089290号
パンフレット;国際公開第2014/144592号パンフレット;国際公開第1442
88号パンフレット;国際公開第2014/204578号パンフレット;国際公開第2
014/152432号パンフレット;国際公開第2115/099850号パンフレッ
ト;米国特許第8,697,359号明細書;米国特許出願公開第2010/00760
57号明細書;米国特許出願公開第2011/0189776号明細書;米国特許出願公
開第2011/0223638号明細書;米国特許出願公開第2013/0130248
号明細書;国際公開第2008/108989号パンフレット;国際公開第2010/0
54108号パンフレット;国際公開第2012/164565号パンフレット;国際公
開第2013/098244号パンフレット;国際公開第2013/176772号パン
フレット;米国特許出願公開第20150050699号明細書;米国特許出願公開第2
0150071899号明細書および国際公開第2014/204578号パンフレット
に記載されているように、FokIと融合される。
リンカーおよびタグ
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ヌクレアーゼとAPとの間にリンカーを含む
。これらの融合タンパク質(または連鎖状構造における融合タンパク質同士の間)に使用
することができるリンカーは、融合タンパク質の機能を妨害しない任意の配列を含み得る
。好ましい実施形態では、リンカーは、短鎖、例えばアミノ酸2~20個であり、概して
柔軟である(すなわち、グリシン、アラニン、およびセリンなどの高い自由度を有するア
ミノ酸を含む)。一部の実施形態では、リンカーは、GGGS(配列番号3)またはGG
GGS(配列番号4)からなる1つまたは複数のユニット、例えばGGGS(配列番号5
)またはGGGGS(配列番号6)ユニットの2、3、4つ、またはより多くのリピート
を含む。他のリンカー配列、例えばSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLR
GSHを使用することもできる。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ヌクレアーゼとAPとの間にリンカーを含む
。これらの融合タンパク質(または連鎖状構造における融合タンパク質同士の間)に使用
することができるリンカーは、融合タンパク質の機能を妨害しない任意の配列を含み得る
。好ましい実施形態では、リンカーは、短鎖、例えばアミノ酸2~20個であり、概して
柔軟である(すなわち、グリシン、アラニン、およびセリンなどの高い自由度を有するア
ミノ酸を含む)。一部の実施形態では、リンカーは、GGGS(配列番号3)またはGG
GGS(配列番号4)からなる1つまたは複数のユニット、例えばGGGS(配列番号5
)またはGGGGS(配列番号6)ユニットの2、3、4つ、またはより多くのリピート
を含む。他のリンカー配列、例えばSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLR
GSHを使用することもできる。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、細胞内腔への送達を促す細胞透過性ペプチド
配列、例えば、HIV由来TATペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはh
CT由来細胞透過性ペプチドを含む。例えば、Caron et al., (2001) Mol Ther. 3(3):31
0-8; Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, B
oca Raton FL 2002); El-Andaloussi et al., (2005) Curr Pharm Des. 11(28):3597-611
;およびDeshayes et al., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49を参照されたい。
配列、例えば、HIV由来TATペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはh
CT由来細胞透過性ペプチドを含む。例えば、Caron et al., (2001) Mol Ther. 3(3):31
0-8; Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, B
oca Raton FL 2002); El-Andaloussi et al., (2005) Curr Pharm Des. 11(28):3597-611
;およびDeshayes et al., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49を参照されたい。
細胞透過性ペプチド(CPP)は、細胞膜を通過して細胞質または他のオルガネラ、例
えばミトコンドリアおよび核への幅広い生体分子の移動を促す短鎖ペプチドである。CP
Pによって送達できる分子の例には、治療薬、プラスミドDNA、オリゴヌクレオチド、
siRNA、ペプチド-核酸(PNA)、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、およびリポ
ソームが挙げられる。CPPは、一般的にアミノ酸30個以下であり、天然または非天然
のタンパク質またはキメラ配列由来であり、高い相対存在量の正荷電アミノ酸、例えばリ
シンもしくはアルギニン、または交互パターンの極性アミノ酸および非極性アミノ酸のい
ずれかを含有する。当技術分野において通常使用されるCPPには、Tat(Frankel et
al., (1988) Cell. 55:1189-1193, Vives et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:16010-1
6017)、ペネトラチン(Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:10444-10450)、
ポリアルギニンペプチド配列(Wender et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:
13003-13008、Futaki et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:5836-5840)、およびトラン
スポータン(Pooga et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:857-861)が挙げられる。
えばミトコンドリアおよび核への幅広い生体分子の移動を促す短鎖ペプチドである。CP
Pによって送達できる分子の例には、治療薬、プラスミドDNA、オリゴヌクレオチド、
siRNA、ペプチド-核酸(PNA)、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、およびリポ
ソームが挙げられる。CPPは、一般的にアミノ酸30個以下であり、天然または非天然
のタンパク質またはキメラ配列由来であり、高い相対存在量の正荷電アミノ酸、例えばリ
シンもしくはアルギニン、または交互パターンの極性アミノ酸および非極性アミノ酸のい
ずれかを含有する。当技術分野において通常使用されるCPPには、Tat(Frankel et
al., (1988) Cell. 55:1189-1193, Vives et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:16010-1
6017)、ペネトラチン(Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:10444-10450)、
ポリアルギニンペプチド配列(Wender et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:
13003-13008、Futaki et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:5836-5840)、およびトラン
スポータン(Pooga et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:857-861)が挙げられる。
CPPは、それらのカーゴと共有または非共有戦略により連結することができる。CP
Pとそのカーゴとを共有結合的に繋ぐ方法は、当技術分野において公知であり、例えば化
学的架橋結合(Stetsenko et al., (2000) J. Org. Chem. 65:4900-4909、Gait et al. (
2003) Cell. Mol. Life. Sci. 60:844-853)または融合タンパク質をクローニングするこ
と(Nagahara et al., (1998) Nat. Med. 4:1449-1453)である。カーゴと、極性および
非極性ドメインを含む短鎖両親媒性CPPとの間の非共有結合的カップリングは、静電お
よび疎水性相互作用により確立される。
Pとそのカーゴとを共有結合的に繋ぐ方法は、当技術分野において公知であり、例えば化
学的架橋結合(Stetsenko et al., (2000) J. Org. Chem. 65:4900-4909、Gait et al. (
2003) Cell. Mol. Life. Sci. 60:844-853)または融合タンパク質をクローニングするこ
と(Nagahara et al., (1998) Nat. Med. 4:1449-1453)である。カーゴと、極性および
非極性ドメインを含む短鎖両親媒性CPPとの間の非共有結合的カップリングは、静電お
よび疎水性相互作用により確立される。
CPPは、当技術分野において潜在的治療用生体分子を細胞内に送達するために利用さ
れている。例には、免疫抑制用にポリアルギニンと連結されたシクロスポリン(Rothbard
et al., (2000) Nature Medicine 6(11):1253-1257)、腫瘍形成を阻害するためのMP
Gと呼ばれる、サイクリンB1に対するsiRNAをCPPと連結させたもの(Crombez
et al., (2007) Biochem Soc. Trans. 35:44-46)、がん細胞の成長を低下させるための
、CPPと連結した腫瘍抑制因子p53ペプチド(Takenobu et al., (2002) Mol. Cance
r Ther. 1(12):1043-1049、Snyder et al., (2004) PLoS Biol. 2:E36)、および喘息を
治療するための、Tatと融合した優性ネガティブ形態のRasまたはホスホイノシトー
ル3キナーゼ(PI3K)(Myou et al., (2003) J. Immunol. 171:4399-4405)が挙げ
られる。
れている。例には、免疫抑制用にポリアルギニンと連結されたシクロスポリン(Rothbard
et al., (2000) Nature Medicine 6(11):1253-1257)、腫瘍形成を阻害するためのMP
Gと呼ばれる、サイクリンB1に対するsiRNAをCPPと連結させたもの(Crombez
et al., (2007) Biochem Soc. Trans. 35:44-46)、がん細胞の成長を低下させるための
、CPPと連結した腫瘍抑制因子p53ペプチド(Takenobu et al., (2002) Mol. Cance
r Ther. 1(12):1043-1049、Snyder et al., (2004) PLoS Biol. 2:E36)、および喘息を
治療するための、Tatと融合した優性ネガティブ形態のRasまたはホスホイノシトー
ル3キナーゼ(PI3K)(Myou et al., (2003) J. Immunol. 171:4399-4405)が挙げ
られる。
CPPは、当技術分野においてイメージングおよびバイオセンシング応用のために細胞
内に造影剤を輸送するために利用されている。例えば、Tatと結合した緑色蛍光タンパ
ク質(GFP)が、がん細胞を標識するために使用されている(Shokolenko et al., (20
05) DNA Repair 4(4):511-518)。量子ドットとコンジュゲートしたTatは、ラット脳
の視覚化用に、血液脳関門をうまく通過させるために使用されている(Santra et al., (
2005) Chem. Commun. 3144-3146)。CPPは、細胞イメージングのために磁気共鳴イメ
ージング技術とも併用されている(Liu et al., (2006) Biochem. and Biophys. Res. Co
mm. 347(1):133-140)。Ramsey and Flynn, Pharmacol Ther. 2015 Jul 22. pii: S0163-
7258(15)00141-2も参照されたい。
内に造影剤を輸送するために利用されている。例えば、Tatと結合した緑色蛍光タンパ
ク質(GFP)が、がん細胞を標識するために使用されている(Shokolenko et al., (20
05) DNA Repair 4(4):511-518)。量子ドットとコンジュゲートしたTatは、ラット脳
の視覚化用に、血液脳関門をうまく通過させるために使用されている(Santra et al., (
2005) Chem. Commun. 3144-3146)。CPPは、細胞イメージングのために磁気共鳴イメ
ージング技術とも併用されている(Liu et al., (2006) Biochem. and Biophys. Res. Co
mm. 347(1):133-140)。Ramsey and Flynn, Pharmacol Ther. 2015 Jul 22. pii: S0163-
7258(15)00141-2も参照されたい。
代替的または追加的に、融合タンパク質は、核局在配列、例えば、SV40ラージT抗
原NLS(PKKKRRV(配列番号7))およびヌクレオプラスミンNLS(KRPA
ATKKAGQAKKKK(配列番号8))を含み得る。他のNLSは、当技術分野にお
いて公知である。例えば、Cokol et al., EMBO Rep. 2000 Nov 15; 1(5): 411-415; Frei
tas and Cunha, Curr Genomics. 2009 Dec; 10(8): 550-557を参照されたい。
原NLS(PKKKRRV(配列番号7))およびヌクレオプラスミンNLS(KRPA
ATKKAGQAKKKK(配列番号8))を含み得る。他のNLSは、当技術分野にお
いて公知である。例えば、Cokol et al., EMBO Rep. 2000 Nov 15; 1(5): 411-415; Frei
tas and Cunha, Curr Genomics. 2009 Dec; 10(8): 550-557を参照されたい。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、リガンドに対して高い親和性を有する部分、
例えばGST、FLAGまたはヘキサヒスチジン配列を含む。そのような親和性タグは、
組換えバリアントタンパク質の精製を容易にすることができる。
例えばGST、FLAGまたはヘキサヒスチジン配列を含む。そのような親和性タグは、
組換えバリアントタンパク質の精製を容易にすることができる。
融合タンパク質が細胞に送達される方法のために、当技術分野において公知の任意の方
法を用いて、例えばin vitro翻訳、または適切な宿主細胞中でバリアントタンパ
ク質をコードする核酸からの発現により、融合タンパク質を産生させることができ、タン
パク質を産生させるためにいくつかの方法が当技術分野において公知である。例えば、融
合タンパク質は、酵母、大腸菌(E. coli)、昆虫細胞株、植物、トランスジェニック動
物、または培養哺乳動物細胞から産生および精製することができる。例えば、Palomares
et al., "Production of Recombinant Proteins: Challenges and Solutions," Methods
Mol Biol. 2004;267:15-52を参照されたい。加えて、融合タンパク質は、任意選択でタン
パク質が細胞内に入った後で切断されるリンカーと共に、細胞内への輸送を容易にする部
分、例えば脂質ナノ粒子と連結することができる。例えば、LaFountaine et al., Int J
Pharm. 2015 Aug 13;494(1):180-194を参照されたい。
法を用いて、例えばin vitro翻訳、または適切な宿主細胞中でバリアントタンパ
ク質をコードする核酸からの発現により、融合タンパク質を産生させることができ、タン
パク質を産生させるためにいくつかの方法が当技術分野において公知である。例えば、融
合タンパク質は、酵母、大腸菌(E. coli)、昆虫細胞株、植物、トランスジェニック動
物、または培養哺乳動物細胞から産生および精製することができる。例えば、Palomares
et al., "Production of Recombinant Proteins: Challenges and Solutions," Methods
Mol Biol. 2004;267:15-52を参照されたい。加えて、融合タンパク質は、任意選択でタン
パク質が細胞内に入った後で切断されるリンカーと共に、細胞内への輸送を容易にする部
分、例えば脂質ナノ粒子と連結することができる。例えば、LaFountaine et al., Int J
Pharm. 2015 Aug 13;494(1):180-194を参照されたい。
発現システム
本明細書に記載の融合タンパク質を使用するために、それらをコードする核酸からそれ
らを発現させることが望ましい場合がある。これは、様々な方法で行うことができる。例
えば、複製および/または発現用に原核または真核細胞中で形質転換するために、融合タ
ンパク質をコードする核酸を中間ベクターにクローニングすることができる。中間ベクタ
ーは、概して融合タンパク質の産生のために融合タンパク質をコードする核酸の貯蔵また
は操作のための原核生物ベクター、例えばプラスミド、またはシャトルベクター、または
昆虫ベクターである。融合タンパク質をコードする核酸は、植物細胞、動物細胞、好まし
くは哺乳動物細胞またはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞への投与用
に発現ベクター中にクローニングすることもできる。
本明細書に記載の融合タンパク質を使用するために、それらをコードする核酸からそれ
らを発現させることが望ましい場合がある。これは、様々な方法で行うことができる。例
えば、複製および/または発現用に原核または真核細胞中で形質転換するために、融合タ
ンパク質をコードする核酸を中間ベクターにクローニングすることができる。中間ベクタ
ーは、概して融合タンパク質の産生のために融合タンパク質をコードする核酸の貯蔵また
は操作のための原核生物ベクター、例えばプラスミド、またはシャトルベクター、または
昆虫ベクターである。融合タンパク質をコードする核酸は、植物細胞、動物細胞、好まし
くは哺乳動物細胞またはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞への投与用
に発現ベクター中にクローニングすることもできる。
発現を得るために、融合タンパク質をコードする核酸配列は、概して、転写を指示する
ためにプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニングされる。適切な細菌およ
び真核生物プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer a
nd Expression: A Laboratory Manual (1990);およびCurrent Protocols in Molecular B
iology (Ausubel et al., eds., 2010)に記載されている。操作タンパク質を発現させる
ための細菌発現システムは、例えば、大腸菌(E. coli)、バチルス属菌種(Bacillus sp
.)、およびサルモネラ属(Salmonella)(Palva et al., 1983, Gene 22:229-235)にお
いて利用可能である。そのような発現システム用のキットが市販されている。哺乳動物細
胞、酵母、および昆虫細胞用の真核発現システムは、当技術分野において周知であり、こ
れも市販されている。
ためにプロモーターを含有する発現ベクターにサブクローニングされる。適切な細菌およ
び真核生物プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer a
nd Expression: A Laboratory Manual (1990);およびCurrent Protocols in Molecular B
iology (Ausubel et al., eds., 2010)に記載されている。操作タンパク質を発現させる
ための細菌発現システムは、例えば、大腸菌(E. coli)、バチルス属菌種(Bacillus sp
.)、およびサルモネラ属(Salmonella)(Palva et al., 1983, Gene 22:229-235)にお
いて利用可能である。そのような発現システム用のキットが市販されている。哺乳動物細
胞、酵母、および昆虫細胞用の真核発現システムは、当技術分野において周知であり、こ
れも市販されている。
核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例え
ば、強い構成性プロモーターが、概して、融合タンパク質の発現および精製のために使用
される。対照的に、遺伝子調節のために融合タンパク質をin vivoで投与しようと
する場合、融合タンパク質の特定の使用に応じて構成性または誘導性プロモーターのいず
れかを使用することができる。加えて、融合タンパク質の投与に好ましいプロモーターは
、HSV TKまたは類似の活性を有するプロモーターのような弱いプロモーターであり
得る。プロモーターは、トランス活性化に応答性のエレメント、例えば、低酸素応答エレ
メント、Gal4応答エレメント、lac抑制因子応答エレメント、ならびにテトラサイ
クリン調節システムおよびRU-486システムのような小分子調節システムも含み得る
(例えば、Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547; Oligino et
al., 1998, Gene Ther., 5:491-496; Wang et al., 1997, Gene Ther., 4:432-441; Nee
ring et al., 1996, Blood, 88:1147-55;およびRendahl et al., 1998, Nat. Biotechnol
., 16:757-761を参照されたい)。
ば、強い構成性プロモーターが、概して、融合タンパク質の発現および精製のために使用
される。対照的に、遺伝子調節のために融合タンパク質をin vivoで投与しようと
する場合、融合タンパク質の特定の使用に応じて構成性または誘導性プロモーターのいず
れかを使用することができる。加えて、融合タンパク質の投与に好ましいプロモーターは
、HSV TKまたは類似の活性を有するプロモーターのような弱いプロモーターであり
得る。プロモーターは、トランス活性化に応答性のエレメント、例えば、低酸素応答エレ
メント、Gal4応答エレメント、lac抑制因子応答エレメント、ならびにテトラサイ
クリン調節システムおよびRU-486システムのような小分子調節システムも含み得る
(例えば、Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547; Oligino et
al., 1998, Gene Ther., 5:491-496; Wang et al., 1997, Gene Ther., 4:432-441; Nee
ring et al., 1996, Blood, 88:1147-55;およびRendahl et al., 1998, Nat. Biotechnol
., 16:757-761を参照されたい)。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、概して、原核または真核のいずれかの宿主細
胞における核酸の発現に必要な全ての追加的なエレメントを含有する転写ユニットまたは
発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、融合タンパク
質をコードする核酸配列と作動的に連結したプロモーター、および例えば、転写物の効率
的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結に必要な任意のシ
グナルを含有する。カセットの追加的なエレメントは、例えば、エンハンサーおよびスプ
ライシングされた異種内部シグナルを含み得る。
胞における核酸の発現に必要な全ての追加的なエレメントを含有する転写ユニットまたは
発現カセットを含有する。したがって、典型的な発現カセットは、例えば、融合タンパク
質をコードする核酸配列と作動的に連結したプロモーター、および例えば、転写物の効率
的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結に必要な任意のシ
グナルを含有する。カセットの追加的なエレメントは、例えば、エンハンサーおよびスプ
ライシングされた異種内部シグナルを含み得る。
遺伝情報を細胞内に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、融合タンパク質
の意図される使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現に関し
て選択される。標準的な細菌発現ベクターには、pBR322ベースのプラスミド、pS
KF、pET23Dなどのプラスミド、ならびにGSTおよびLacZなどの市販のタグ
融合発現システムが挙げられる。
の意図される使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現に関し
て選択される。標準的な細菌発現ベクターには、pBR322ベースのプラスミド、pS
KF、pET23Dなどのプラスミド、ならびにGSTおよびLacZなどの市販のタグ
融合発現システムが挙げられる。
真核ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターが、多くの場合に、真核発
現ベクター、例えばSV40ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイ
ン・バーウイルス由来のベクターに使用される。他の例示的な真核ベクターには、pMS
G、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルス
pDSVE、ならびにSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチ
オネインプロモーター、マウス乳がんウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモ
ーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効であることが示
された他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが
挙げられる。
現ベクター、例えばSV40ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイ
ン・バーウイルス由来のベクターに使用される。他の例示的な真核ベクターには、pMS
G、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルス
pDSVE、ならびにSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチ
オネインプロモーター、マウス乳がんウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモ
ーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に有効であることが示
された他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが
挙げられる。
融合タンパク質を発現させるためのベクターは、ガイドRNAの発現を推進するための
RNA Pol IIIプロモーター、例えばH1、U6または7SKプロモーターを含
み得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミドのトランスフェクション後に哺乳動物
細胞における融合タンパク質の発現を可能にする。
RNA Pol IIIプロモーター、例えばH1、U6または7SKプロモーターを含
み得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミドのトランスフェクション後に哺乳動物
細胞における融合タンパク質の発現を可能にする。
いくつかの発現システムは、安定的にトランスフェクトされた細胞の選択用のマーカー
、例えばチミジンキナーゼ、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、およびジヒド
ロ葉酸レダクターゼを有する。ポリヘドリンプロモーターまたは他の強いバキュロウイル
スプロモーターの指示下でgRNAコード配列を有するバキュロウイルスベクターを昆虫
細胞において使用することなどの高収率の発現システムも、適切である。
、例えばチミジンキナーゼ、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、およびジヒド
ロ葉酸レダクターゼを有する。ポリヘドリンプロモーターまたは他の強いバキュロウイル
スプロモーターの指示下でgRNAコード配列を有するバキュロウイルスベクターを昆虫
細胞において使用することなどの高収率の発現システムも、適切である。
概して発現ベクター中に含まれるエレメントには、大腸菌(E. coli)において機能す
るレプリコン、組換えプラスミドを収容する細菌を選択できるようにする抗生物質耐性コ
ード遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするためのプラスミドの可欠領域中の独特
な制限部位も挙げられる。
るレプリコン、組換えプラスミドを収容する細菌を選択できるようにする抗生物質耐性コ
ード遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするためのプラスミドの可欠領域中の独特
な制限部位も挙げられる。
標準的なトランスフェクション方法は、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、
酵母または昆虫細胞株を産生するために使用され、それらのタンパク質は、次に、標準的
な技法を用いて精製される(例えば、Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619
-22; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutsche
r, ed., 1990)を参照されたい)。真核および原核細胞の形質転換は、標準的な技法に従
って行われる(例えば、Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351; Clark-Curtiss &
Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照されたい
。
酵母または昆虫細胞株を産生するために使用され、それらのタンパク質は、次に、標準的
な技法を用いて精製される(例えば、Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619
-22; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutsche
r, ed., 1990)を参照されたい)。真核および原核細胞の形質転換は、標準的な技法に従
って行われる(例えば、Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351; Clark-Curtiss &
Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照されたい
。
宿主細胞に外来ヌクレオチド配列を導入するための公知の手順のいずれかが使用され得
る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト
融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェ
クション、ネイキッドDNA、プラスミドベクター、エピソームおよび組込みの両方のウ
イルスベクターの使用、ならびにクローニング後のゲノムDNA、cDNA、合成DNA
または他の外来遺伝材料を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかが挙げら
れる(例えば、Sambrook et al.、上記を参照されたい)。必要なことは、使用される特
定の遺伝子操作手順が、融合タンパク質を発現可能な宿主細胞中に少なくとも1つの遺伝
子をうまく導入できることだけである。
る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト
融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェ
クション、ネイキッドDNA、プラスミドベクター、エピソームおよび組込みの両方のウ
イルスベクターの使用、ならびにクローニング後のゲノムDNA、cDNA、合成DNA
または他の外来遺伝材料を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかが挙げら
れる(例えば、Sambrook et al.、上記を参照されたい)。必要なことは、使用される特
定の遺伝子操作手順が、融合タンパク質を発現可能な宿主細胞中に少なくとも1つの遺伝
子をうまく導入できることだけである。
本発明は、本明細書に記載のベクターを含む核酸、ベクターおよび細胞も含む。
キット
本明細書に記載の方法に使用するためのキットも、本明細書に提供される。キットは、
以下:フレーム内に連結したAPを有する、またはAPの包含のための1つもしくは複数
のクローニング部位を有する、部位特異的ヌクレアーゼをコードするベクター;精製組換
えヌクレアーゼタンパク質;例えば必要ならば対照としての、ガイドRNA(例えば、i
n vitro産生されたもの);任意選択で対照鋳型DNAおよび/もしくはガイドR
NAを含む、ヌクレアーゼと共に使用するための試薬;ならびに/または本明細書に記載
の方法に使用するための説明書の1つまたは複数を含み得る。
本明細書に記載の方法に使用するためのキットも、本明細書に提供される。キットは、
以下:フレーム内に連結したAPを有する、またはAPの包含のための1つもしくは複数
のクローニング部位を有する、部位特異的ヌクレアーゼをコードするベクター;精製組換
えヌクレアーゼタンパク質;例えば必要ならば対照としての、ガイドRNA(例えば、i
n vitro産生されたもの);任意選択で対照鋳型DNAおよび/もしくはガイドR
NAを含む、ヌクレアーゼと共に使用するための試薬;ならびに/または本明細書に記載
の方法に使用するための説明書の1つまたは複数を含み得る。
以下の実施例の中で本発明をさらに説明するが、この実施例は、特許請求の範囲に記載
される本発明の範囲を限定するものではない。
される本発明の範囲を限定するものではない。
[実施例1]
エピジェネティックに調節される配列特異的ヌクレアーゼ
R661AおよびQ695A変異を担持する、またはR661AおよびQ926A変異
を担持するSpCas9バリアントを、ゲノムに組み込まれた単一コピーEGFPレポー
ター遺伝子に標的化された操作ジンクフィンガーアレイ(ZF292R)と遺伝的に融合
させたシステムを開発した。EGFPコード領域にヌクレアーゼ誘導DSBを導入し、そ
れを次にNHEJにより修復することで、フレームシフト変異の導入をもたらすことがで
き、細胞を、フローサイトメトリーを用いて定量的にアッセイできる表現型であるEGF
P陰性にすることができる。本発明者らは、EGFP中の同じ部位を標的化する4つの異
なるgRNAバリアント:(1)標的部位と相同な20ntを有するgRNAであって、
標的部位配列とミスマッチである、追加的に5’に付加されたGを有するgRNA(gR
NA1)、(2)標的部位と相同な19ntを有するgRNAであって、5’の20番目
のntに標的部位とミスマッチであるGを有するgRNA(gRNA2)、(3)標的部
位と相同な18ntを有するgRNAであって、標的部位とミスマッチである2つのGを
5’に有するgRNA(gRNA3)、および(4)標的部位と相同な17ntを有する
gRNAであって、追加的なミスマッチのGのntを有しない、完全にマッチしたgRN
A(gRNA4)と一緒にZF292Rジンクフィンガーアレイを有するおよび有しない
これらのバリアントヌクレアーゼの活性を試験した。4つのgRNAの全てを用いて試験
したとき、EGFP破壊アッセイで判定して、SpCas9(R661A、Q695A)
およびSpCas9(R661A、Q926A)は、ZF292Rと融合したときに両方
ともヌクレアーゼ活性の増加を示した(図2A)。本発明者らは、配列ベースの挿入欠失
定量アッセイであるTIDEも行って、これらのヌクレアーゼ複合体のそれぞれのヌクレ
アーゼ活性を直接評価した。フローサイトメトリーアッセイと一致して、TIDEによる
細胞集団の分析により、試験した4つのgRNAの全てで両方のSpCas9バリアント
がZF292Rと融合したときに、挿入欠失の形成率が増加することが実証された(図2
B)。
エピジェネティックに調節される配列特異的ヌクレアーゼ
R661AおよびQ695A変異を担持する、またはR661AおよびQ926A変異
を担持するSpCas9バリアントを、ゲノムに組み込まれた単一コピーEGFPレポー
ター遺伝子に標的化された操作ジンクフィンガーアレイ(ZF292R)と遺伝的に融合
させたシステムを開発した。EGFPコード領域にヌクレアーゼ誘導DSBを導入し、そ
れを次にNHEJにより修復することで、フレームシフト変異の導入をもたらすことがで
き、細胞を、フローサイトメトリーを用いて定量的にアッセイできる表現型であるEGF
P陰性にすることができる。本発明者らは、EGFP中の同じ部位を標的化する4つの異
なるgRNAバリアント:(1)標的部位と相同な20ntを有するgRNAであって、
標的部位配列とミスマッチである、追加的に5’に付加されたGを有するgRNA(gR
NA1)、(2)標的部位と相同な19ntを有するgRNAであって、5’の20番目
のntに標的部位とミスマッチであるGを有するgRNA(gRNA2)、(3)標的部
位と相同な18ntを有するgRNAであって、標的部位とミスマッチである2つのGを
5’に有するgRNA(gRNA3)、および(4)標的部位と相同な17ntを有する
gRNAであって、追加的なミスマッチのGのntを有しない、完全にマッチしたgRN
A(gRNA4)と一緒にZF292Rジンクフィンガーアレイを有するおよび有しない
これらのバリアントヌクレアーゼの活性を試験した。4つのgRNAの全てを用いて試験
したとき、EGFP破壊アッセイで判定して、SpCas9(R661A、Q695A)
およびSpCas9(R661A、Q926A)は、ZF292Rと融合したときに両方
ともヌクレアーゼ活性の増加を示した(図2A)。本発明者らは、配列ベースの挿入欠失
定量アッセイであるTIDEも行って、これらのヌクレアーゼ複合体のそれぞれのヌクレ
アーゼ活性を直接評価した。フローサイトメトリーアッセイと一致して、TIDEによる
細胞集団の分析により、試験した4つのgRNAの全てで両方のSpCas9バリアント
がZF292Rと融合したときに、挿入欠失の形成率が増加することが実証された(図2
B)。
DNAと結合した人工転写因子への結合に活性が依存するヌクレアーゼを生み出すため
の原理証明をもたらすために、本発明者らは、次に、操作scFv(scFv GCN4
)が堅固および特異的に結合できるGCN4ペプチドに、ZF292Rが遺伝的に融合し
ている(GCN4-ZF292R)システムを開発した。本発明者らは、このscFv
GCN4をSpCas9(R661A、Q695A)およびSpCas9(R661A、
Q926A)と直接融合し、GCN4-ZF292R融合物の存在下または不在下でこれ
らのSpCas9-scFv GCN4融合物がEGFPを破壊することができるかどう
かを、gRNA1、gRNA2、またはgRNA3を使用して評価した(図2C)。Sp
Cas9(R661A、Q695A)-scFv GCN4およびSpCas9(R66
1A、Q926A)-scFv GCN4の両方は、GCN4-ZF292Rと同時発現
したときにフローサイトメトリーにより判定されたEGFPの破壊の強化を示した。この
活性がGCN4-ZF292RとscFv GCN4との間の相互作用に特異的であった
かどうか判定するために、本発明者らは、SpCas9(R661A、Q695A)-s
cFv GCN4をGCN4-ZF292RまたはH3(1-38)-ZF292R(同
じZF292RジンクフィンガーアレイをヒストンH3のN末端のアミノ酸38個に融合
したもの)と同時発現させた第2の実験を行った。gRNA1およびgRNA2を使用し
て、H3(1-38)-ZF292RではなくGCN4-ZF292Rと同時発現したと
きに、SpCas9(R661A、Q695A)-scFv GCN4は、実際にEGF
P破壊の増加を示した(図3A)。フローサイトメトリーアッセイと一致して、TIDE
によるこれらの細胞集団の分析により、H3(1-38)-ZF292Rではなく、GC
N4-ZF292Rと同時発現した場合にかぎり、SpCas9(R661A、Q695
A)-scFv GCN4による挿入欠失の形成率の増加が実証された(図3B)。追加
的に対照として、EGFP中の異なる標的部位と完全に相補的な20ntを担持し、5’
にミスマッチのGが付加されていないgRNA(gRNA5)を用いて各SpCas9融
合構築物を試験して、これらのタンパク質が上記のgRNA修飾の不在下で野生型SpC
as9に匹敵するヌクレアーゼ活性を保持していることを確認した。
の原理証明をもたらすために、本発明者らは、次に、操作scFv(scFv GCN4
)が堅固および特異的に結合できるGCN4ペプチドに、ZF292Rが遺伝的に融合し
ている(GCN4-ZF292R)システムを開発した。本発明者らは、このscFv
GCN4をSpCas9(R661A、Q695A)およびSpCas9(R661A、
Q926A)と直接融合し、GCN4-ZF292R融合物の存在下または不在下でこれ
らのSpCas9-scFv GCN4融合物がEGFPを破壊することができるかどう
かを、gRNA1、gRNA2、またはgRNA3を使用して評価した(図2C)。Sp
Cas9(R661A、Q695A)-scFv GCN4およびSpCas9(R66
1A、Q926A)-scFv GCN4の両方は、GCN4-ZF292Rと同時発現
したときにフローサイトメトリーにより判定されたEGFPの破壊の強化を示した。この
活性がGCN4-ZF292RとscFv GCN4との間の相互作用に特異的であった
かどうか判定するために、本発明者らは、SpCas9(R661A、Q695A)-s
cFv GCN4をGCN4-ZF292RまたはH3(1-38)-ZF292R(同
じZF292RジンクフィンガーアレイをヒストンH3のN末端のアミノ酸38個に融合
したもの)と同時発現させた第2の実験を行った。gRNA1およびgRNA2を使用し
て、H3(1-38)-ZF292RではなくGCN4-ZF292Rと同時発現したと
きに、SpCas9(R661A、Q695A)-scFv GCN4は、実際にEGF
P破壊の増加を示した(図3A)。フローサイトメトリーアッセイと一致して、TIDE
によるこれらの細胞集団の分析により、H3(1-38)-ZF292Rではなく、GC
N4-ZF292Rと同時発現した場合にかぎり、SpCas9(R661A、Q695
A)-scFv GCN4による挿入欠失の形成率の増加が実証された(図3B)。追加
的に対照として、EGFP中の異なる標的部位と完全に相補的な20ntを担持し、5’
にミスマッチのGが付加されていないgRNA(gRNA5)を用いて各SpCas9融
合構築物を試験して、これらのタンパク質が上記のgRNA修飾の不在下で野生型SpC
as9に匹敵するヌクレアーゼ活性を保持していることを確認した。
[実施例2]
クロマチンの三次元コンフォメーションに依存する配列特異的ヌクレアーゼ
以前の研究により、SpCas9は、操作ジンクフィンガーアレイ(ZF)またはTA
LEリピートアレイなどの第2のDNA結合ドメイン(DBD)によりその標的部位近く
に繋がれた場合にかぎり、DSBを誘導するように操作できることが示された。これは、
SpCas9の位置R1333またはR1335に、このタンパク質がそのPAMモチー
フを認識する能力に影響する変異を導入することによって達成される(このような変異体
は、Cas9 PAM相互作用ドメインノックダウンまたはCas9 PID KDと呼
ばれる)。戦略1に記載されたものと類似のEGFP破壊アッセイを使用して、本発明者
らは、標的部位でSaCas9とPAM配列との間の相互作用に影響する変異R1015
A、R1015Q、またはR1015Hを担持するSaCas9 PID KDに第2の
ZF DBDを融合することによって、SaCas9を用いた類似のシステムを操作でき
ることを示した(図4Aおよび4B)。これを試験するために、本発明者らは、ZF29
2Rドメインの結合部位に隣接するEGFPレポーター遺伝子中の部位に標的化された、
R1015A、R1015Q、またはR1015H変異を担持するSaCas9バリアン
トの融合物を、標的部位と21ntの相補性を有するgRNAを用いて試験した。ZF2
92R DBDにこれらのSaCas9バリアントを融合させることで、これらのヌクレ
アーゼに有意なEGFP破壊活性が回復した(図4C)。本発明のために、本発明者らは
、直鎖配列においてCas9標的部位から遠位であるが、特定の細胞型における三次元空
間ではほんの近位であるDNA配列に結合する操作ZFまたはTALEにSpCas9ま
たはSaCas9 PID KDを融合することを構想している。したがって、この立体
配置で、第2のDBDによって標的化される遠位配列と、Cas9 PID KDの標的
部位との間の細胞型特異的クロマチンループ形成は、ヌクレアーゼをgRNA標的部位に
近づけ、Cas9 PID KDに標的遺伝子のDSBを誘導させる(図5Aおよび5B
)。さらに本発明者らは、Cas9 PID KDの代わりに、表1に概略を示したSp
Cas9バリアントを、遠位調節配列を標的化する操作DBDと融合することを提案する
。戦略1および戦略2に概要を示したgRNA修飾を使用して、第2のDBDが、gRN
A標的部位の近位のその標的部位と結合可能な場合にかぎり(例えば、遠位の調節エレメ
ントと関心対象の遺伝子との間にループ形成がある細胞型にかぎり)、SpCas9バリ
アントからヌクレアーゼ活性を獲得することができるであろう。
クロマチンの三次元コンフォメーションに依存する配列特異的ヌクレアーゼ
以前の研究により、SpCas9は、操作ジンクフィンガーアレイ(ZF)またはTA
LEリピートアレイなどの第2のDNA結合ドメイン(DBD)によりその標的部位近く
に繋がれた場合にかぎり、DSBを誘導するように操作できることが示された。これは、
SpCas9の位置R1333またはR1335に、このタンパク質がそのPAMモチー
フを認識する能力に影響する変異を導入することによって達成される(このような変異体
は、Cas9 PAM相互作用ドメインノックダウンまたはCas9 PID KDと呼
ばれる)。戦略1に記載されたものと類似のEGFP破壊アッセイを使用して、本発明者
らは、標的部位でSaCas9とPAM配列との間の相互作用に影響する変異R1015
A、R1015Q、またはR1015Hを担持するSaCas9 PID KDに第2の
ZF DBDを融合することによって、SaCas9を用いた類似のシステムを操作でき
ることを示した(図4Aおよび4B)。これを試験するために、本発明者らは、ZF29
2Rドメインの結合部位に隣接するEGFPレポーター遺伝子中の部位に標的化された、
R1015A、R1015Q、またはR1015H変異を担持するSaCas9バリアン
トの融合物を、標的部位と21ntの相補性を有するgRNAを用いて試験した。ZF2
92R DBDにこれらのSaCas9バリアントを融合させることで、これらのヌクレ
アーゼに有意なEGFP破壊活性が回復した(図4C)。本発明のために、本発明者らは
、直鎖配列においてCas9標的部位から遠位であるが、特定の細胞型における三次元空
間ではほんの近位であるDNA配列に結合する操作ZFまたはTALEにSpCas9ま
たはSaCas9 PID KDを融合することを構想している。したがって、この立体
配置で、第2のDBDによって標的化される遠位配列と、Cas9 PID KDの標的
部位との間の細胞型特異的クロマチンループ形成は、ヌクレアーゼをgRNA標的部位に
近づけ、Cas9 PID KDに標的遺伝子のDSBを誘導させる(図5Aおよび5B
)。さらに本発明者らは、Cas9 PID KDの代わりに、表1に概略を示したSp
Cas9バリアントを、遠位調節配列を標的化する操作DBDと融合することを提案する
。戦略1および戦略2に概要を示したgRNA修飾を使用して、第2のDBDが、gRN
A標的部位の近位のその標的部位と結合可能な場合にかぎり(例えば、遠位の調節エレメ
ントと関心対象の遺伝子との間にループ形成がある細胞型にかぎり)、SpCas9バリ
アントからヌクレアーゼ活性を獲得することができるであろう。
本出願は例えば以下の発明も提供する。
[1] 特異的転写因子(TF)または翻訳後ヒストン修飾に対して高い親和性を有する操
作親和性タンパク質(AP)と連結された標的ヌクレアーゼを含む融合タンパク質を細胞
において発現させること、または前記細胞をそれと接触させることを含む、前記細胞のゲ
ノムを修飾する方法。
[2] 前記APが、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌(St
aphylococcus aureus)免疫グロブリン結合プロテインA、操作ナノボディー、および設
計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される、[1]に記載の方法。
[3] 前記ヌクレアーゼが、1)メガヌクレアーゼ、2)ジンクフィンガーヌクレアーゼ
、3)転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ(TALEN)、および4)クラスタ
ー化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)-CRISPR関連(C
as)ヌクレアーゼまたはCRISPR-Cpf1 RNAガイドヌクレアーゼ(RGN
)からなる群から選択される、[1]に記載の方法。
[4] 前記ヌクレアーゼが、CRISPR-CasまたはCRISPR-Cpf1 RG
Nであり、前記方法が、ガイドRNAの存在下で行われる、[3]に記載の方法。
[5] 前記ヌクレアーゼが、表1に示される残基のうちの1つまたは複数の変異を有する
化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9ヌクレアーゼである、[4]に記載の
方法。
[6] R1015に変異を含む黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9と融
合したジンクフィンガーDNA結合ドメイン(ZF DBD)またはTAL DNA結合
アレイを含む融合タンパク質を細胞において発現させること、または前記細胞をそれと接
触させることを含む、前記細胞のゲノムを修飾する方法。
[7] 前記黄色ブドウ球菌(S. aureus)Cas9が、R1015A、R1015Q、お
よびR1015Hからなる群から選択される変異を含む、[6]に記載の方法。
[8] (i)標的DNA結合ドメインまたはガイドRNAと一緒の触媒不活性「dead
」RGN(dRGN)、(ii)異種機能性ドメイン、および(iii)操作親和性タン
パク質(AP)によって認識される転写因子またはヒストン修飾がDNA結合ドメインま
たはdRGNの標的部位の近位に存在する場合にかぎり活性である前記AP、を含む融合
タンパク質を細胞において発現させること、または前記細胞をそれと接触させることを含
む、前記細胞のゲノムを修飾する方法。
[9] 前記APが、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌(St
aphylococcus aureus)免疫グロブリン結合プロテインA、操作ナノボディー、および設
計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される、[8]に記載の方法。
[10] 前記機能性ドメインが、転写調節ドメイン、ヒストン修飾酵素、またはDNA修
飾酵素である、[9]に記載の方法。
[11] 前記ガイドRNAが、(i)19、18、および17bpのスペーサー長を有す
るgRNA;(ii)目的の標的部位と比べて1、2、または3つの意図的なミスマッチ
を有するgRNA;(iii)オンターゲット部位と相補的な20ntを有し、追加的な
G塩基(標的DNA配列とミスマッチである)が5’に付加されたgRNA;ならびに(
iv)(i)~(iii)の任意の組合せからなる群から選択される、[4]または[8]に
記載の方法。
[12] 前記ガイドRNAが、前記標的DNAに対する、9、10、11、12、または
13個のヌクレオチド塩基の非常に短い相補性配列を担持する切断型gRNAである、[
8]に記載の方法。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に説明したが、前記の説明は、添付の特許請求の範囲によ
って定義される本発明の範囲を限定するのではなく、例証することを意図していることを
理解すべきである。他の態様、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
[1] 特異的転写因子(TF)または翻訳後ヒストン修飾に対して高い親和性を有する操
作親和性タンパク質(AP)と連結された標的ヌクレアーゼを含む融合タンパク質を細胞
において発現させること、または前記細胞をそれと接触させることを含む、前記細胞のゲ
ノムを修飾する方法。
[2] 前記APが、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌(St
aphylococcus aureus)免疫グロブリン結合プロテインA、操作ナノボディー、および設
計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される、[1]に記載の方法。
[3] 前記ヌクレアーゼが、1)メガヌクレアーゼ、2)ジンクフィンガーヌクレアーゼ
、3)転写活性化因子エフェクター様ヌクレアーゼ(TALEN)、および4)クラスタ
ー化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)-CRISPR関連(C
as)ヌクレアーゼまたはCRISPR-Cpf1 RNAガイドヌクレアーゼ(RGN
)からなる群から選択される、[1]に記載の方法。
[4] 前記ヌクレアーゼが、CRISPR-CasまたはCRISPR-Cpf1 RG
Nであり、前記方法が、ガイドRNAの存在下で行われる、[3]に記載の方法。
[5] 前記ヌクレアーゼが、表1に示される残基のうちの1つまたは複数の変異を有する
化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9ヌクレアーゼである、[4]に記載の
方法。
[6] R1015に変異を含む黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9と融
合したジンクフィンガーDNA結合ドメイン(ZF DBD)またはTAL DNA結合
アレイを含む融合タンパク質を細胞において発現させること、または前記細胞をそれと接
触させることを含む、前記細胞のゲノムを修飾する方法。
[7] 前記黄色ブドウ球菌(S. aureus)Cas9が、R1015A、R1015Q、お
よびR1015Hからなる群から選択される変異を含む、[6]に記載の方法。
[8] (i)標的DNA結合ドメインまたはガイドRNAと一緒の触媒不活性「dead
」RGN(dRGN)、(ii)異種機能性ドメイン、および(iii)操作親和性タン
パク質(AP)によって認識される転写因子またはヒストン修飾がDNA結合ドメインま
たはdRGNの標的部位の近位に存在する場合にかぎり活性である前記AP、を含む融合
タンパク質を細胞において発現させること、または前記細胞をそれと接触させることを含
む、前記細胞のゲノムを修飾する方法。
[9] 前記APが、単鎖抗体、操作フィブロネクチンドメイン、操作黄色ブドウ球菌(St
aphylococcus aureus)免疫グロブリン結合プロテインA、操作ナノボディー、および設
計アンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される、[8]に記載の方法。
[10] 前記機能性ドメインが、転写調節ドメイン、ヒストン修飾酵素、またはDNA修
飾酵素である、[9]に記載の方法。
[11] 前記ガイドRNAが、(i)19、18、および17bpのスペーサー長を有す
るgRNA;(ii)目的の標的部位と比べて1、2、または3つの意図的なミスマッチ
を有するgRNA;(iii)オンターゲット部位と相補的な20ntを有し、追加的な
G塩基(標的DNA配列とミスマッチである)が5’に付加されたgRNA;ならびに(
iv)(i)~(iii)の任意の組合せからなる群から選択される、[4]または[8]に
記載の方法。
[12] 前記ガイドRNAが、前記標的DNAに対する、9、10、11、12、または
13個のヌクレオチド塩基の非常に短い相補性配列を担持する切断型gRNAである、[
8]に記載の方法。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に説明したが、前記の説明は、添付の特許請求の範囲によ
って定義される本発明の範囲を限定するのではなく、例証することを意図していることを
理解すべきである。他の態様、利点、および修飾は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
Claims (1)
- 本願明細書に記載の発明。
Applications Claiming Priority (4)
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US62/408,645 | 2016-10-14 | ||
PCT/US2017/056738 WO2018071892A1 (en) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | Epigenetically regulated site-specific nucleases |
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JP2019520038A Division JP7399710B2 (ja) | 2016-10-14 | 2017-10-16 | エピジェネティックに調節される部位特異的ヌクレアーゼ |
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AU2017308889B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-11-09 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
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KR20240007715A (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-16 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
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EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
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IL269458B2 (en) | 2017-03-23 | 2024-02-01 | Harvard College | Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins |
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