KR20180134847A - 생체외 배양 과정 동안 체세포의 복제 능력을 증가시키는 방법 - Google Patents
생체외 배양 과정 동안 체세포의 복제 능력을 증가시키는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
복제성 노화 동안 세포 주기의 진행의 억제를 폐지하고 후생동물 세포 바이오매스의 확장 가능한 응용분야 및 산업 생산을 위한 클론 세포주를 유도하도록 표적화된 유전자 수정을 사용하여 후생동물 체세포의 복제 능력을 증가시키는 제품 및 방법. 각 단백질을 암호화하는 전사체의 첫 번째 액손을 표적으로 하는 가이드 RNA를 사용하는 삽입 또는 결실 돌연변이는 CRISPR/Cas9를 사용하여 생성된다. 표적화된 수정은 변형되지 않은 부모 집단에 비해 변형된 세포 집단의 증식 능력을 증가시키는 p15 및 p16 단백질의 불활성화를 초래한다. TERT 유전자로부터 텔로머라제 단백질 상동체의 발현을 지시하는 유전자 구조체로부터 보조 텔로머라제 활성과 이들 수정을 결합하면 변형된 세포 집단의 복제 능력을 무기한 증가시킨다. 한 응용분야는 가금류 종 적색야계로부터의 세포를 사용하여 식이 섭취를 위한 골격근을 제조하는 것이고 다른 하나는 가축 종 소로부터의 세포를 사용하여 식이 섭취를 위한 골격근을 제조하는 것이다.
Description
본 발명은 산업적 바이오 처리 응용분야에서 바이오매스의 확장 가능한 제조를 위해 후생동물 세포의 복제 능력을 증가시키는 제품 및 방법에 관한 것이다.
근원성(즉, "근육 형성") 세포주는 거의 50년 전에 그들의 유도가 최초로 기술되었기 때문에 골격근 생물학을 이해하기 위한 기본 모델로 사용되어 왔다. 기본적인 연구 외에도, 근육(즉, 근원세포) 세포주는 생물학적 로봇 공학; 약리학적 화합물을 스크리닝하는 바이오인공 근육 구조물; 유전성 근육 질환의 치료적 교정; 및 식이 섭취를 위한 식용 바이오매스의 생체 외 생산에서 산업적 응용을 기대하고 있다. 동물 바이오매스의 상업적 규모의 생산에서의 응용을 위한 세포 공급원으로서의 기증자 조직으로부터의 1차 근육 세포 조달은 현재 응용-특이적 배치 배양을 배제하는 기술적 및 물질적 자원을 필요로 한다. 또한, 1차 세포가 복제할 수있는 원래의 능력은 유전자 변형을 위해 계대배양되거나 세포 은행 및 산업적 제조에 사용되는 규모를 제한한다. 이러한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 이후 "근원성 세포주(myogenic cell line)"라고 부르는 것을 만드는 골격근 계통으로 분화될 세포의 재생 능력을 증가시키는 유전자 수정을 포함한다.
근원성으로 또는 다른 방식으로 완전 기능성 세포주는 분화될 계통이 정해진 존재론적 표현형, 보다 넓은 핵형을 갖는 게놈의 안정성, 영구적인 재생을 위한 능력 및 생체 내에서 조직학적 대응물에 존재하는 말단 분화 세포의 기능적 특징을 나타내는 잠재력에 의해 확인된다. 골격근 세포주의 경우, 이러한 특징의 일부는 세포 융합, 줄무늬 근섬유 발달 및 아세틸콜린과 같은 화학적 자극물질에 대한 생리적 반응을 포함한다.
특정 골격근 세포주의 유도의 성공은 정상 조직 및 돌연변이 조직으로부터 분리되거나 종양으로부터 분리된 연속적인 통과를 통해 달성되었다. 현재까지, 존재하는 근원성 세포주는 특징 묘사가 잘 되지 않았고, 주로 유전적 불안정성, 이수배체체, 손상된 분화 능력 및 분자 신호 전달와 전사 네트워크의 변이성 변화와 같은 바람직하지 않은 특성을 갖는다.
불멸화 세포주에 대한 이용가능한 옵션은 일부 전구 종의 선택된 그룹에 한정되어 있다. 이러한 세포주의 전부는 아니지만 대부분은 선택된 전구 종의 종-특이적 또는 고-충실도 표현을 필요로 하는 응용을 위한 기능적 적합성을 잠재적으로 감소시키는 바람직하지 못한 특징을 가진다. 예를 들어, 소, 돼지, 닭 및 연어와 같은 농업적으로 중요한 동물 종으로부터의 불멸화 근원성 세포주의 유도는 성취되지 못했다. 현존하는 근원성 세포주의 선택은 생의학 연구에서 일반적으로 사용되는 모델 종, 즉 쥐 및 영장류 종으로 주로 제한된다; 그러나 이러한 세포주는 일반적으로 식품에 사용하기 위한 식용 바이오매스를 생산하는 전구 공급원으로서 허용되지 않는다.
이것은 세포 주기 진입의 망막모세포종 패밀리 단백질(즉, p107, pRB, p130)-매개 억제 및 연속적인 세포 분할 주기 동안 염색체의 말단에서 텔로미어 DNA 서열의 반복체(TTAGGG)n의 짧아짐에 의해 유도된 DNA-손상 반응과 같이 반복적 인 노화에 기여하는 개별 경로를 직접 표적으로 하여 근원성 세포주를 확립하는데 사용되는 다른 접근법에도 해당된다. 예를 들어, pRB 기능의 절제는 말단적으로 분화된 상태에 도달하여 유지하는 근원 세포의 능력을 손상시키고, 그 자체만으로는 증식 능력을 유지하기에 불충분하다. 마찬가지로, 기능성 텔로미어 역전사 효소( "TERT")의 과발현에 의한 텔로머라제 활성의 장기간 유지는 텔로미어 침식을 중화시킴으로써 1차 근원세포의 재생 능력을 증가시킨다; 혼자서는 이러한 세포들에 의한 노화를 방지하기에는 불충분하다.
정상 골격근에서, p107은 미분화되고, 증식하는 근원세포에서 발현되어 E2F 전사 인자와 복합체화된 지배적인 망막모세포종 패밀리 단백질이다. 말단 분화 동안, 근원세포는 세포 분열 주기를 탈출하여 수축 근육 섬유로 성숙하는 다핵 근육으로 융합된다. 근원세포 분화 동안 세포-주기 탈출을 개시하고 근관에서 유사분열 후 상태를 유지하는 E2F에 의한 유전자 발현의 전사 활성화를 억제하는데 망막모세포종 패밀리 단백질 pRB와 p130의 역할은 사이클린-의존성 키나아제 억제제("CKIs")에 의해 지시된다. 그러나 현재까지 모델링되고 특성화된 포유류 골격 근육에서, 분리에서 CKI의 기능은 말단 분화 동안 세포 주기를 막기에는 충분하지 않다. 오히려, p21, p18, p27 및 p57을 포함하는 조합에서 CKI에 의해 공유되는 역할은 근원세포 분화 동안 세포 주기로부터의 탈출을 지시하고 안정화시킨다. CKI의 어떤 조합이 이 역할을 효과적으로 수행하기에 충분하고 필요한지에 대한 합의는 이루어지지 않았다. 이 결론에도 불구하고, CKI 단백질 p15와 p16은 이 역할에 관련되지 않았다.
CKI 단백질 p16(INK4A라고도 함)은 순차적 CDKN2B 및 CDKN2A 유전자에 의해 공유되는 INK4B-ARF-INK4A 유전자좌의 일부를 구성하는 포유 동물에서 발견된 CDKN2A의 발현 산물이다. CDKN2A 유전자는 선택적 스플라이싱 변이체로부터 번역되는 ARF와 p16, 두 개의 단백질에 대한 전사체를 암호화한다. 각 CDKN2A 전사체의 발현은 별개의 프로모터의 조절하에 있다. ARF 및 p16 단백질은 CDKN2A 유전자 내에서 공유된 엑손에 의해 암호화되지만, ARF 전사체는 p16 전사체에 비해 선택적 판독 프레임에서 전사되어, ARF와 p16을 포함하는 아미노산 서열은 완전히 구별된다. CDKN2B 유전자는 구조 및 기능 모두에서 p16과 유사한 CKI인 p15 단백질 (INK4B라고도 함)을 암호화한다.
P15 및 p16은 포유 동물에 존재하는 패럴로그(paralogs)이며, CDKN2A 유전자는 후생동물 계통 발생 내에서 포유 동물의 발산과 동시에 CDKN2B 유전자의 중복으로부터 발생하는 것으로 생각된다. p15와 달리, p16은 복제성 노화 동안 포유 동물에서 주요 CKI로 작용한다.
특히, 오래 살았던 종양 저항성 설치류인 벌거숭이 두더지 쥐는 p15의 첫 번째 엑손과 p16의 두 번째 및 세 번째 엑손을 연결하는 전사 스플라이스 변이체로부터 p15/p16 하이브리드 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있다. 어류 및 조류에서, INK4B-ARF-INK4A 유전자좌는 부분적으로만 보존된다. 닭 게놈에서, CDK2NA 유전자는 p16 단백질을 암호화하지 않는다; p15 및 ARF 단백질만 암호화된다. 서열화되고 주석이 달린 어류 게놈은 CDKN2B 유전자를 특징으로 하지만, CDKN2A 유전자는 이 게놈 내에 존재하지 않는다. 닭 p15 단백질은 인간 p16 단백질에 기능적으로 상응한다; 인간 섬유아세포에서 과발현될 때 CDK4/6에 결합하고 세포 주기 진행을 제한한다. 더욱이, p15는 닭 섬유아세포에서 복제성 노화를 촉진할 수 있다.
또한, 특히 INK4B-ARF-INK4A 유전자좌에서 불멸 근원성 쥐 C2C12 세포주 내에서 결실 돌연변이가 p16 및 ARF의 발현을 중지시킨다. 그러나 현재까지 보고된 근원성 세포주는 INK4B-ARF-INK4A 유전자좌의 표적화된 비-확률 유전자 수정에 의해 생성되지 않았다. 오히려, 인간 근원성 세포에서의 p16 단백질의 억제성 CKI 기능은 CDK4(즉, 사이클린-의존성 키나아제 4) 단백질의 이소성 과발현에 의해 부분적으로 극복되어 노화를 극복하고 세포주를 유도하였다.
p16 및 p15 기능의 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 사일런싱과 같은 다른 방법은 연장된 계대배양이 가능한 근원성 세포주의 유도를 입증하지 못했다. 어류, 가금류 및 가축 종으로부터 골격근 세포주를 생산하는 비-확률적 방법은 보고되지 않았다. 현재까지, 동물성 바이오매스는 식이 섭취를 위한 생체외 배양에 의해 상업적으로 제조되지 못했다. 동물 바이오매스로 제조된 다양한 식품 제품 시제품이 문서화되어있다. 그러나, 이러한 시제품을 제조하는데 사용된 세포 원료는, 정상적인 체세포에서, 복제성 노화를 수반하는 세포 원료의 유전 프로그램에 의해 허용되는 확장 규모로 제한된다.
복제성 노화를 회피하기 위한 하나의 접근법은 근원성 계통에 대한 무한 갱신 능력을 갖는 이전에 확립된 다능성 또는 비-근원성 세포주의 존재론적 계통 실행(ontological lineage commitmen)을 지시하는 것을 사용한다. 본 발명에 참조로 포함된 U.S. Pat. App. No. 15/134,252 참조. 대조적으로, 본 발명에서 기술된 대안적인 접근법은 식이 섭취 및 산업용 바이오프로세스 응용을 위한 바이오매스의 확장 가능한 제조를 위한 근원성 세포주를 생성하기 위해 계통-실행 근육 세포의 복제 능력을 무한히 확장시키는 상호 프로세스이다.
본 발명의 상기 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 정상적이고 변형되지 않은 체세포의 복제성 노화 특성을 줄이거 나 없애고, 후생동물 세포 바이오매스의 산업 생산에서 확장 가능한 응용을 위한 클론 세포주를 유도하기 위해 분화 동안은 아니지만, 증식 동안 세포 주기의 망막모세포종 단백질 억제를 중지시킴으로써 후생동물 체세포의 복제 능력을 증가시키면서 텔로머라제 활성을 유지함으로써 후생동물 체세포의 복제 능력을 증가시키는 유전자 수정을 사용하는 생산물 및 공정이다.
응용분야가 식이 섭취를 위해 제조된 바이오매스인 본 발명의 한 예에서, 세포의 종 정체는 적색야계(Gallus gallus)이고 세포 계통은 골격근이다. 한 실시태양에서, 본 발명의 유전자 수정은 CDK4 "INK4" CKI 상동체 p15 및 p16(사이클린-의존성 키나아제 4 "CDK4"의 억제제(따라서 이들의 이름은 CDK4의 억제제임))의 억제제를 나타내는 단백질의 직접적인 불활성화를 구성한다. p15 및 p16의 불활성화는 INK4B-ARF-INK4A 유전자좌에 의해 암호화되는 INK4 단백질을 암호화하는 보존 된 뉴클레오타이드 서열을 돌연변이시켜 표적화된 세포 집단의 증식 능력을 증가시킴으로써 달성된다.
특히, CDKN2B 유전자의 첫 번째 엑손은 적색야계 골격근으로부터 분리된 일차 세포 집단 내에서 p15 단백질을 파괴하도록 표적화된다. 첫 번째 엑손을 표적으로하는 가이드 RNA를 사용하는 삽입 또는 결실 돌연변이(INDEL)는 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복체(clustered regularly-interspaced short palindromic repeats)-Cas9(CRISPR/Cas9)를 사용하여 생성된다. 이것은 CDKN2B 유전자좌만의 파괴가 그들의 변형되지 않은 모집단에 비해 변형된 세포 집단에서 증식 능력을 증가시키기에 충분하다는 것을 입증한다.
그럼에도 불구하고, 이러한 수정이 (예를 들어, 이소성 TERT 유전자로부터의) 텔로머라제 단백질 상동체의 발현을 지시하는 유전자 구조체로부터의 부수적 인 텔로머라제 활성과 조합될 때, 변형된 세포 집단의 복제 능력은 무기한 증가한다. 접근법을 검증하기 위해 증식 및 노화에 대한 지표를 변경되지 않은 일차 세포 집단에 대해 점수화한다.
암컷 적색야계 종 핵형의 세포는 여러 가지 이유로 이 과정을 모델링하기 위해 선택되었다. 첫째, 적색야계의 암컷 핵형이 이형 염색체 배우자 성(heterogametic sex)을 구성한다. CDKN2B 대립 유전자가 적색야계의 성 염색체에 위치하고 있기 때문에, 오직 하나의 대립 유전자만을 표적으로 삼는다면 이 게놈을 암컷 동물에서 무효 접합체로 만든다. 둘째, 적색야계 게놈은 p16 단백질을 암호화하는 포유류 CDKN2A 유전자의 오솔로그가 결여된다. 따라서, 단지 하나의 INK4 암호화 유전자의 불활성화가 이 모델에서 모든 p15/p16 활성을 제거하기 위해 필요하다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 활성 조절 영역(도시된 예: 데스민 프로모터)이 선행되거나 그 규제하에 있는 유전자(도시된 예: 혈청 알부민)를 함유하는 형질전환 DNA 서열의 삽입을 도시한다.
도 2는 게놈에 내인성인 표적 유전자(도시된 예: 혈청 알부민)로부터의 발현 조절을 위한 활성 조절 영역(도시된 예: 데스민 프로모터)을 함유하는 형질전환 DNA 서열의 삽입을 도시한다.
도 3은 조절 영역(도시된 예: 혈청 알부민 유전자)의 활성화를 위한 INDEL 또는 점 돌연변이에 의한 내인성 조절 영역(도시된 예: 혈청 알부민 프로모터) DNA 서열의 유전자 수정을 도시한다.
도 4는 조직 특이적 활성을 갖는 내인성, 5 '조절 영역(도시된 예: 미오스타틴 프로모터)의 조절하에서 발현을 위한 표적 유전자(도시된 예: 혈청 알부민 유전자)를 나타내는 형질전환 DNA 서열의 삽입 및 삽입된 DNA 서열(도시된 예: 미오스타틴 유전자)에 내인성 유전자 3'의 조절 영역 활성화의 평형 파괴를 도시한다.
도 5는 표적 유전자(도시된 예: 혈청 알부민 프로모터 및 유전자)의 프로모터 영역으로부터의 유전자 발현의 표적화된 활성화 단독 또는 유전자 서열-표적 활성화 테더(tether)에 의한 조절 영역 바깥의 인핸서로부터의 유전자 발현의 활성화와 조합에 대한 대한 후성 또는 전사 프로그램 유도성 수정을 도시한다. 예시를 위해, CRISPRα(즉, CRISPR 활성화)를 나타내는 양식이 도시된다.
도 6은 표적 유전자의 조절 영역으로부터 또는 표적 유전자의 암호화 서열로부터의 DNA 발현 표적 억압 테더(도시된 예: 혈청 알부민 프로모터 및 유전자)에 의한 유전자 발현의 표적 억제에 대한 후성- 또는 전사 프로그램-억제 수정을 나타낸다. 예시적인 목적을 위해, CRISPRi를 나타내는 양상(즉, CRISPR 간섭)이 도시되어 있다.
도 7은 내인성 조절 영역(도시된 예: 미오스타틴 프로모터) 또는 내인성 표적 유전자(도시된 예: 미오스타틴 유전자)의 발현을 침묵시키거나 파괴시키기 위해 INDEL 또는 점 돌연변이에 의한 개시 코돈과 같은 표적 유전자 암호화 서열의 유전자 수정을 도시한다.
도 8은 활성 조절 영역(도시된 예: 데스민 프로모터)에 의해 선행되거나 조절하에 있는 shRNA 암호화 영역(도시된 예: 미오스타틴 shRNA)을 함유하는 형질 전환 DNA 서열의 삽입을 도시한다.
도 9는 p16 및 p15 아미노산 정렬을 도시한다: a. 대표적인 포유류 쥐(Mus musculus; SEQ ID NO 17), 소(Bos taurus; SEQ ID NO 18) 및 멧돼지(Sus scrofa; SEQ ID NO 19) p16 오솔로그 내 예측된 아미노산 서열 상동성 사이의 보존(패널 A); b. 대표적인 후생동물 적색야계(Gallus gallus; SEQ ID NO 20), 쥐(Mus musculus; SEQ ID NO 21), 소(Bos taurus, SEQ ID NO 23), 멧돼지(Sus scrofa; SEQ ID NO 22), 연어(Oncorhynchus mykiss; SEQ ID NO 24) 및 틸라피아(Oreochromis niloticus; SEQ ID NO 25) p15 오솔로그 내 예측된 아미노산 서열 상동성 사이의 보존(패널 B).
도 2는 게놈에 내인성인 표적 유전자(도시된 예: 혈청 알부민)로부터의 발현 조절을 위한 활성 조절 영역(도시된 예: 데스민 프로모터)을 함유하는 형질전환 DNA 서열의 삽입을 도시한다.
도 3은 조절 영역(도시된 예: 혈청 알부민 유전자)의 활성화를 위한 INDEL 또는 점 돌연변이에 의한 내인성 조절 영역(도시된 예: 혈청 알부민 프로모터) DNA 서열의 유전자 수정을 도시한다.
도 4는 조직 특이적 활성을 갖는 내인성, 5 '조절 영역(도시된 예: 미오스타틴 프로모터)의 조절하에서 발현을 위한 표적 유전자(도시된 예: 혈청 알부민 유전자)를 나타내는 형질전환 DNA 서열의 삽입 및 삽입된 DNA 서열(도시된 예: 미오스타틴 유전자)에 내인성 유전자 3'의 조절 영역 활성화의 평형 파괴를 도시한다.
도 5는 표적 유전자(도시된 예: 혈청 알부민 프로모터 및 유전자)의 프로모터 영역으로부터의 유전자 발현의 표적화된 활성화 단독 또는 유전자 서열-표적 활성화 테더(tether)에 의한 조절 영역 바깥의 인핸서로부터의 유전자 발현의 활성화와 조합에 대한 대한 후성 또는 전사 프로그램 유도성 수정을 도시한다. 예시를 위해, CRISPRα(즉, CRISPR 활성화)를 나타내는 양식이 도시된다.
도 6은 표적 유전자의 조절 영역으로부터 또는 표적 유전자의 암호화 서열로부터의 DNA 발현 표적 억압 테더(도시된 예: 혈청 알부민 프로모터 및 유전자)에 의한 유전자 발현의 표적 억제에 대한 후성- 또는 전사 프로그램-억제 수정을 나타낸다. 예시적인 목적을 위해, CRISPRi를 나타내는 양상(즉, CRISPR 간섭)이 도시되어 있다.
도 7은 내인성 조절 영역(도시된 예: 미오스타틴 프로모터) 또는 내인성 표적 유전자(도시된 예: 미오스타틴 유전자)의 발현을 침묵시키거나 파괴시키기 위해 INDEL 또는 점 돌연변이에 의한 개시 코돈과 같은 표적 유전자 암호화 서열의 유전자 수정을 도시한다.
도 8은 활성 조절 영역(도시된 예: 데스민 프로모터)에 의해 선행되거나 조절하에 있는 shRNA 암호화 영역(도시된 예: 미오스타틴 shRNA)을 함유하는 형질 전환 DNA 서열의 삽입을 도시한다.
도 9는 p16 및 p15 아미노산 정렬을 도시한다: a. 대표적인 포유류 쥐(Mus musculus; SEQ ID NO 17), 소(Bos taurus; SEQ ID NO 18) 및 멧돼지(Sus scrofa; SEQ ID NO 19) p16 오솔로그 내 예측된 아미노산 서열 상동성 사이의 보존(패널 A); b. 대표적인 후생동물 적색야계(Gallus gallus; SEQ ID NO 20), 쥐(Mus musculus; SEQ ID NO 21), 소(Bos taurus, SEQ ID NO 23), 멧돼지(Sus scrofa; SEQ ID NO 22), 연어(Oncorhynchus mykiss; SEQ ID NO 24) 및 틸라피아(Oreochromis niloticus; SEQ ID NO 25) p15 오솔로그 내 예측된 아미노산 서열 상동성 사이의 보존(패널 B).
본 발명의 유전적 수정은 복제성 노화 동안 세포 분열 주기 전진의 망막모세포종 단백질 억제를 완화시킨다. 이는 예시적인 실시태양에 도시된 바와 같이, 망막모세포종 단백질의 CKI-매개 안정화를 폐기함으로써 달성된다. 본 발명자들은 3 가지 실시태양을 개시한다: (I) 암호화 서열의 표적 돌연변이를 통한 CDKN2B 유전자의 파괴에 의한 p15 단백질의 불활성화; (II) 암호화 서열의 표적 돌연변이를 통한 CDKN2A 유전자의 파괴에 의한 p16 단백질의 불활성화; 및 (III) 사이클린-의존성 키나아제 상동체의 과발현에 의한 세포 분열 주기 진행의 망막모세포 단백질 억제의 내인성 CKI-매개 안정화의 폐지. 이런 수정은 단독으로 또는 이소성 유전자 구조에 의해 지시된 텔로머라제의 부수적인 과발현과 조합으로 수정된 후생동물 세포의 복제 능력을 증가시킨다.
유전자의 표적화된 전사 활성화에 대한 유도 수정의 5 가지 예시 모델 및 유전자 산물의 표적화된 억제에 대한 억제 수정의 4 가지 예시 모델(도 4, 6-8)이 도 1-5에 도시되어 있다. 도 1-8에서, G는 천연 게놈 DNA 서열을 나타내고 T는 외래 형질전환 DNA 서열을 나타낸다. 또한, 도 4는 도입된 형질전환 유전자에 대한 귀납적인 수정 및 이의 천연 프로모터로부터 분리된 내인성 유전자에 대한 억압적인 수정을 나타낼 수 있다는 것에 유의한다. 본 실시예를 위해서, 야생형 숙주 세포 조직 계통은 미오스타틴+/데스민+ 골격근이다. 예시를 위해서, 화살표는 INDEL 또는 점 돌연변이에 의해 프로모터 및/또는 유전자의 DNA 서열 내의 유전자 수정의 예시적인 영역을 나타낸다. ROSA26은 전형적으로 전사적으로 활동적인 수정 유전자좌를 나타낸다. 수정은, 예를 들어, 내인성 또는 변형되지 않은 유전성, 후성적 또는 전사 프로그램에 대한 변경을 포함할 수 있다.
가축으로 분류되는 것으로 일반적으로 받아 들여지는 종 중에서, 단백질 p16의 예측된 아미노산 서열은 소(Bos taurus)(SEQ ID NO 18)와 멧돼지(Sus scrofa)(SEQ ID NO 19) 사이의 82% 쌍의 동일성으로 크게 보전된다. 마찬가지로, 가축 및 해산물로 분류되는 종 중에서, 단백질 p15의 아미노산 서열은 다음과 같이 보존된다: 소(Bos taurus)(SEQ ID NO 23) 및 멧돼지(Sus scrofa)(SEQ ID NO 22) 사이의 92% 쌍의 동일성, 연어(Oncorhynchus mykiss)(SEQ ID NO 24) 및 틸라피아(Oreochromis niloticus)(SEQ ID NO 25) 사이의 60% 쌍의 동일성. 또한, p15 유전자좌에서 모든 가축, 가금류 및 해산물을 비교하면(도 9 패널 B에 도시됨), 게놈 정렬은 58% 쌍의 동일성(Gallus gallus, SEQ ID NO 20; Mus musculus, SEQ ID NO 21; Bos taurus, SEQ ID NO 23; Sus scrofa, SEQ ID NO 22; Oncorhynchus mykiss) SEQ ID NO 24; 및 Oreochromis niloticus, SEQ ID NO 25)이 존재한다는 것을 나타낸다.
도 9는 p16 및 p15 아미노산 정렬을 입증한다: a. 대표적인 포유류 쥐(Mus musculus; SEQ ID NO 17), 소(Bos taurus; SEQ ID NO 18) 및 돼지(Sus scrofa; SEQ ID NO 19) p16 오솔로그 내 예측된 아미노산 서열 상동성 사이의 보존; b. 대표적인 후생동물 갈리나세안(Gallus gallus; SEQ ID NO 20), 쥐(Mus musculus; SEQ ID NO 21), 소(Bos taurus, SEQ ID NO 23), 돼지(Sus scrofa; SEQ ID NO 22), 연어(Oncorhynchus mykiss; SEQ ID NO 24) 및 틸라피아(Oreochromis niloticus; SEQ ID NO 25) p15 오솔로그 내 예측된 아미노산 서열 상동성 사이의 보존(패널 B). 검은색 음영은 보존의 등급(즉, 동일성 및 유사성)을 나타낸다: 블로섬(Blosum) 62 점수 행렬을 기반으로 검은색 음영은 100% 유사성을 나타내며, 회색은 60-80% 유사성을 나타내며 흰색은 60% 유사성을 나타낸다(Geneious R10에서 생성된 이미지 및 점수(http://www.geneious.com, Kearse et al., 2012).
함께, 이런 오솔로그는 가축, 가금류 및 해산물로 분류된 종 중에서 본 발명의 실시태양에 의해 표적화된 p15 및 p16 오솔로그의 보존된 아미노산 서열 상동성을 입증한다. 주석이 달린 물고기 및 조류 게놈은 p16 오솔로그가 없다는 것에 유의한다. 따라서, 조류, 포유류 및 어류 종 전반에 대한 p15-매개 기능의 무결성이 보존되고, 포유 동물 종 전반에에 대한 p16-매개 기능의 무결성이 본 발명의 표적화된 응용분야를 위한 플랫폼으로서 보존되는 것으로 예상된다.
<제 1 예시적 실시태양: CDKN2B 유전자좌의 유전자 수정 및 TERT의 이소성 발현을 통한 지연된 복제성 노화>
(A) CDKN2B 유전자좌의 유전자 수정을 통한 지연된 복제성 노화
요약하면, 이 제 1 예시적 실시태양은 가이드 RNAs(gRNAs)(SEQ ID NO 1-5)를 사용하는 CDKN2B의 엑손 #1(NCBI 등록 번호: NM_204433.1)을 표적으로 하는 INDEL을 생성하기 위해 CRISPR/Cas9를 사용하여 적색야계 골격근으로부터 분리된 1차 근육모세포 세포 집단 내의 p15 단백질을 암호화하는 CDKN2B 유전자좌를 파괴한다. TERT 유전자(NCBI 등록 번호: NM_001031007.1; NCBI Gene ID: 420972)로부터 텔로 머라아제 단백질 상동체의 발현을 지시하는 유전자 구조체(SEQ ID NO 6)으로부터의 보조 텔로머라제 활성과 조합하여 수행될 때, CDKN2B 유전자좌만 파괴시키는 것이 이점을 제공하지만, 변형된 세포 집단의 복제 능력은 무한히 증가한다. CDKN2B의 표적화된 비활성화는 새로운 접근법이다.
일반적으로, 제 1 실시태양은 5 단계 과정으로 생체외 배양에 의해 후생동물 체세포의 천연 복제 능력을 증가시킨다: (1) 분화 동안은 아니지만, 증식 동안 세포 주기의 망막모세포종 단백질 억제를 폐지하기 위해 p15 단백질을 불활성화시킴으로써 복제성 노화에서 세포 분열 주기 진행의 망막모세포종 단백질 억제를 디커플링(decoupling)하는 단계; (2) 기능적인 TERT 유전자로부터 텔로머라제 단백질 상동체의 발현("TERT의 이소성 발현")을 유도하는 유전자 구조체로 후생동물 체세포를 형질전환시켜 텔로머라제 활성을 유지시켜 복제성 노화를 줄이는 단계; (3) CDKN2B 유전자 돌연변이 및 TERT의 이소성 발현(즉, "마스터 세포 은행")을 갖는 세포의 은행을 유지하는 단계; (4) 생체외 환경에서 마스터 세포 은행으로부터 세포를 배양하는 단계; (5) 식이 섭취를 위해 배양된 세포 바이오매스를 수확하는 단계.
좀 더 구체적으로 그리고 한 실시태양에서, p15 단백질을 암호화하는 CDKN2B 유전자(NCBI 등록 번호: NM_204433.1)의 제 1 엑손은 적색야계 세포 집단의 게놈 내의 CDKN2B 유전자의 첫 번째 엑손 내에 돌연변이을 삽입하기 위해 gRNA-표적화 CRISPR/Cas9 (gRNA SEQ ID NO 1-5)를 사용하여 유전자 수정을 표적으로 한다. 이런 예를 위해 사용된 방법의 더욱 자세한 설명은 아래의 재료 및 방법 섹션 A, B, D, E 및 F를 참조.
예시적인 실시태양 I는 내인성 p15 단백질의 기능을 파괴하기 위한 도 7에 예시된 모델을 사용한다. 구체적으로는, 도 7에 도시된 모델은 내인성 유전자 발현이 개시 코돈의 돌연변이 또는 전사 활성화를 가능하게 하는 조절 영역 서열에 의해 파괴되는 본 발명에서의 사용에 적용될 수 있다. 대안으로, 내인성 유전자 기능은 시작 코돈 이후에 프레임변이 돌연변이를 도입함으로써 파괴될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적용된 바와 같이, 도 7에 도시된 모델은 CRISPR/Cas9-표적화 핵산 분해효소 활성을 사용하여 CDKN2B 유전자의 5-프라이머(5') 암호화 서열에 도입된 INDEL 돌연변이에 의한 p15 기능의 억제를 나타낼 수 있다.
(B) 이소성 TERT 유전자의 발현
실시태양 I-A에 기재된 바와 같이 변형된 세포는 또한 TERT 유전자(NCBI 등록 번호: NM_001031007.1; NCBI 유전자 ID: 420972)로부터 텔로머라제 단백질 상 동체의 발현을 지시하는 유전자 구조체로 변형될 수 있다. 이어서 텔로머라제 단백질 상동체의 발현을 지시하는 유전자 구조체에 의한 유전자 수정을 특징으로 하는 세포에 대한 TERT 유전자로부터 텔로머라제 단백질 상동체의 발현을 지시하는 유전자 구조체(SEQ ID NO 6)으로 형질 도입된 이 집단으로부터 세포를 선별한다.
예시적인 실시태양 I는 이소성 TERT 유전자의 발현을 위해 도 1에 도시된 모델을 사용한다. 구체적으로는, 도 1에 도시된 모델은 외부 유전자가 외래 프로모터의 조절하에 발현되는 본 발명에서의 사용에 적합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적용된 바와 같이, 도 1에 도시된 모델은 도입된 CAG 프로모터로부터의 이소성 TERT 유전자의 발현을 나타낼 수 있다.
도 2에 도시된 모델은 내인성 유전자가 외래 프로모터의 조절하에 발현되는 본 발명에서의 사용에 적합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적용된 바와 같이, 도 2는 또한 도입된 CAG 프로모터로부터의 내인성 TERT 유전자의 발현을 나타낼 수있다.
도 3에 도시된 모델은 유전자 발현이 그의 조절 서열의 표적화된 돌연변이에 의해 변경되는 본 발명에서의 사용에 적합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적용된 바와 같이, 도 3은 내인성 TERT 프로모터로부터의 내인성 TERT 유전자의 발현을 나타낼 수 있으며 여기서 TERT 프로모터 내의 리프레서 결합 부위가 돌연변이에 의해 파괴되었다.
도 4에 도시된 모델은 외래 유전자의 발현이 유전자의 3-프라이머(3') 말단에 삽입된 내인성 프로모터의 조절하에 발현되는 본 발명에서의 사용에 적합할 수있다. 예를 들어, 본 발명에 적용된 바와 같이, 도 4는 내인성 β-액틴 프로모터로부터의 외래 TERT 유전자의 발현을 나타낼 수 있다.
도 5에 도시된 모델은 내인성 유전자의 발현이 유전자 서열-표적화된 활성화 테더링에 의해 프로모터로부터 전사적으로 활성화되는 본 발명에서의 사용에 적합 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적용된 바와 같이, 도 5는 TERT 프로모터를 표적으로하는 CRISPRα에 의한 내인성 TERT 유전자의 유도를 나타낼 수있다. 예시적인 CRISPRα 양상은 단일 gRNA에 의해 표적 유전자의 조절 영역을 표적으로 하는 핵산 분해효소-결핍 Cas9 단백질에 의해 매개되는 활성화를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. CRISPRa의 범위 외부에, 이 유도 수정 메커니즘의 양상은 핵산 분해효소-결핍 아연 핑거 핵산 효소(ZFNs) 및 핵산 분해효소-결핍 전사 인자 유사 효과기 핵산 분해효소(TALENs)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 유전자 서열-표적화 활성화 테더링을 포함한다.
도 6에 도시된 모델은 내인성 유전자의 발현이 유전자 서열-표적 억압 테더링에 의해 프로모터로부터 전사적으로 억제되는 본 발명에서의 사용에 적합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 적용된 바와 같이, 도 6에 도시된 모델은 CDKN2B 프로모터를 표적으로 하는 CRISPRi에 의한 내인성 CDKN2B 유전자의 억제를 나타낼 수 있다. 예시적인 CRISPR1 억제 양상은 단일 gRNA에 의한 조절 영역 또는 유전자를 표적으로 하는 핵산 분해효소-결핍 Cas9 단백질에 의해 매개되는 억제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. CRISPRi의 범위 밖에서, 이 억압 수정 메커니즘의 양상은 핵산 분해효소-결핍 ZFN 및 핵산 분해효소-결핍 TALEN을 포함한 이에 제한되지 않는 DNA 서열-표적화 서열 테더링을 포함한다.
이런 예에서 사용된 방법의 더 자세한 설명을 위해, 아래의 C, G, H 및 I 항의 재료 및 방법을 참조; 이 제조 방법에 주목하는 것은 섹션 I-B에서 전술한 동일한 제조 방법을 사용하여 이 예시적인 실시태양에서 달성될 수 있다.
(C)식이 섭취를 위한 바이오매스 제조
한 실시태양에서, 식이 섭취를 위한 바이오매스 제조는 4 단계를 포함한다: (1) CDKN2B 유전자좌 및/또는 TERT의 이소성 발현에 대한 유전자 수정을 포함하는 선택된 세포 집단을 확장하는 단계; (2) 마스터 세포 은행 재고 목록에서 확장된 세포 집단을 냉동 보존 및 저장하는 단계; (3) 생체외 환경에서 마스터 세포 은행 재고 목록에서 세포를 씨딩하고 배양하는 단계; 및 (4) 식이 섭취를 위해 배양된 세포 바이오매스를 수확하는 단계.
단계 1은 CDKN2B 유전자좌에 대한 유전자 수정을 포함하는 선택된 세포 집단을 확장하는 것이다. 유전자 수정을 포함하는 선택된 세포 집단을 7.5 x 103 세포/ cm2의 밀도이고 5% 이산화탄소, 5% 산소 대기 조건하에 37℃에서 배양된 소 혈청 + 기초 배지를 포함하나 이에 제한되지 않는 10% 동물성 혈청을 함유하는 표준 성장 배지에서 젤라틴-코팅 조직-배양 처리 플라스틱으로 이루어진 기질 상에 씨드한다. 배양액이 80%의 밀집도에 이르면, 세포는 효소적으로 해리되고 세포의 확장된 양은 7.5 x 103 세포/cm2로 분주한다. 이 과정은 해리 후 수확된 총 세포 수가 1.0 x 108 세포를 초과할 때까지 반복한다.
단계 2는 마스터 세포 은행 재고 목록에 확장된 세포 집단을 냉동 보존 및 저장한다. 세포를 1.0 x 108 이상의 양으로 수확한다. 확장 후, 선택된 세포를 300 x g에서 5분간 원심 분리하여 펠렛화한다. 세포 펠렛을 2.5 x 106 세포/mL의 표준 냉동 보존 배지에 현탁시키고, 냉동 바이알당 1.0 mL로 분취하였다. 냉동 바이알을 제어된 냉각 용기를 사용하여 1 ℃/분으로 -80℃까지 냉각시키고 장기 저장을 위해 액체 질소를 함유하는 듀어에 옮긴다. 세포 원료가 이 은행으로부터 고갈됨에 따라, 잔류 세포 바이알은 실시태양 I-B-1에서 기술된 바와 같이 확장되고 실시태양 I-B-2에서 기술된 바와 같이 냉동 보존되어 마스터 세포 은행 재고를 보충하고 확장시킨다.
단계 3은 생체외 환경에서 마스터 세포 은행의 세포를 씨딩하고 배양하는 것이다: 원하는 배양 규모에 따라, 마스터 세포 은행의 하나 이상의 바이알을 신속하게 실온으로 해동한다. 냉동 보존 배지를 5분, 300 X g 원심 분리 단계에 의해 세포에서 제거한다. 세포를 표준 성장 배지에 현탁시키고, 표준 성장 배지에서 젤라틴-코팅 배양 기질 상에 씨드하고, 실시태양 IB-1에서 약술한 바와 같이 배양하고, 다만 수확 전의 최종 계대배양 시에, 세포를 세포 배양 기질 상에서 100% 이상의 밀집도로 증식시킨다. 바이오매스 수확을 위한 배양 규모는 표 1에 요약되어 있으며, 예측된 평균 세포 질량은 2.0 x 10-9 그램이며 예측된 평균 세포 배증 시간은 24 시간(h)이다.
| # 시간 | 1 바이알 |
2 바이알 |
3 바이알 |
4 바이알 |
5 바이알 |
6 바이알 |
7 바이알 |
8 바이알 |
9 바이알 |
10 바이알 |
| 0 h | 0.005 | 0.01 | 0.015 | 0.02 | 0.025 | 0.03 | 0.035 | 0.04 | 0.045 | 0.05 |
| 24 h | 0.01 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 | 0.07 | 0.08 | 0.09 | 0.1 |
| 48 h | 0.02 | 0.04 | 0.06 | 0.08 | 0.1 | 0.12 | 0.14 | 0.16 | 0.18 | 0.2 |
| 72 h | 0.04 | 0.08 | 0.12 | 0.16 | 0.2 | 0.24 | 0.28 | 0.32 | 0.36 | 0.4 |
| 96 h | 0.08 | 0.16 | 0.24 | 0.32 | 0.4 | 0.48 | 0.56 | 0.64 | 0.72 | 0.8 |
| 120 h | 0.16 | 0.32 | 0.48 | 0.64 | 0.8 | 0.96 | 1.12 | 1.28 | 1.44 | 1.6 |
| 144 h | 0.32 | 0.64 | 0.96 | 1.28 | 1.6 | 1.92 | 2.24 | 2.56 | 2.88 | 3.2 |
| 168 h | 0.64 | 1.28 | 1.92 | 2.56 | 3.2 | 3.84 | 4.48 | 5.12 | 5.76 | 6.4 |
| 192 h | 1.28 | 2.56 | 3.84 | 5.12 | 6.4 | 7.68 | 8.96 | 10.24 | 11.52 | 12.8 |
| 216 h | 2.56 | 5.12 | 7.68 | 10.24 | 12.8 | 15.36 | 17.92 | 20.48 | 23.04 | 25.6 |
| 240 h | 5.12 | 10.24 | 15.36 | 20.48 | 25.6 | 30.72 | 35.84 | 40.96 | 46.08 | 51.2 |
| 264 h | 10.24 | 20.48 | 30.72 | 40.96 | 51.2 | 61.44 | 71.68 | 81.92 | 92.16 | 102.4 |
| 288 h | 20.48 | 40.96 | 61.44 | 81.92 | 102.4 | 122.88 | 143.36 | 163.84 | 184.32 | 204.8 |
| 312 h | 40.96 | 81.92 | 122.88 | 163.84 | 204.8 | 245.76 | 286.72 | 327.68 | 368.64 | 409.6 |
| 336 h | 81.92 | 163.84 | 245.76 | 327.68 | 409.6 | 491.52 | 573.44 | 655.36 | 737.28 | 819.2 |
표 1은 바이오매스 생산 규모 배양 수확량 추정치를 도시한다. 질량은 그램 단위로 표시된다. 1 바이알은 ~ 2.5 x 106 세포와 동일하다.
단계 4는 식이 섭취를 위해 배양된 세포 바이오매스를 수확하는 것이다. 세포가 밀집도로 증식한 후, 배양 배지를 제거하고 접착 세포 배양물을 인산 완충 식염수로 헹구었다. 다음으로, 접착 세포의 밀집 바이오매스는 스크래핑 장치에 의해 기질로부터 기계적으로 해리된다. 해리된 바이오매스를 원심 분리 튜브에 수집하여, 과량의 액체를 제거하기 위해 400 x g에서 5분 동안 펠렛화되고 식품 제품 제제를 위해 처리한다.
<제 2 예시적 실시태양: CDKN2A 유전자좌의 유전자 변형 및 TERT의 이소성 발현을 통한 지연된 복제성 노화>
요약하면, 제 2 예시적 실시태양은 gRNA(SEQ ID NO 8-10)를 사용하여, p16을 암호화하는 CDKN2A 서열의 제 1 엑손에 표적화된 INDEL 돌연변이를 생성하도록 CRISPR/Cas9를 사용하여 소(Bos taurus) 골격근으로부터 분리된 1차 근육모세포 세포 집단인 후생 동물 체세포 집단 내에서 p16 단백질을 암호화하는 CDKN2A 유전자좌를 파괴한다. 소 유전자 CDKN2A는 두 개의 예측된 스플라이스 변이체(NCBI 등록 번호: XM_010807759.2, XM_010807758.1)를 가지며, 여기서 p16을 암호화하는 첫 번째 엑손은 CDKN2A의 엑손 #2이다. 동일한 세포 집단(NCBI 등록 번호: NM_001046242.1, NCBI Gene ID 518884)에서 TERT 유전자로부터 텔로 머라제 단백질 상동체의 발현을 지시하는 합성 유전자 구조체(SEQ ID NO 11)의 보조 텔로머라제 활성과 조합하여 사용하는 경우, CDKN2A 유전자좌만을 파괴시키는 것은 복제 이점을 제공하지만, 두 수정의 상승 작용은 단독의 수정보다 변형된 세포 집단의 복제 능력을 더 증가시킬 수 있다. 소 종의 게놈은 p16(NCBI 등록 번호: XM_010807759.2)을 암호화하는 예측된 전사 인자를 갖는 CDKN2A 유전자를 특징으로 한다. 즉, 유전자 수정은 CDKN2A 유전자의 엑손 2(즉, p16을 암호화하는 유전자 서열의 엑손 1)에서 보존된 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이이고, CDKN2A 유전자의 엑손 2(즉, p16을 암호화하는 유전자 서열)를 표적으로 하는 가이드 RNA의 돌연변이이고 CRISPR/Cas9를 사용하여 생성된다. 예측된 p16 암호화 서열 내에서 CDKN2A 유전자좌를 파과시키는 것은 본 출원에서 새로운 방법이다. 이 예에 사용된 방법에 대한 자세한 설명은 재료 및 방법 섹션 A, B, C, D, E, F, G, H 및 I를 참조.
다른 모든 견지에서, 제 2 예시적 실시태양은 다음 단계를 포함하여 생체외 배양 과정에서 식이 섭취를 위한 바이오매스를 제조하는 제 1 예시적 실시태양에서 약술한 방법을 따른다: (1) 분화 동안은 아니지만, 증식 동안 세포 주기의 망막모세포종 단백질 억제를 폐지하기 위해 p15 단백질을 불활성화시킴으로써 복제성 노화에서 세포 분열 주기 진행의 망막모세포종 단백질 억제를 디커플링하는 단계; (2) 기능적인 TERT 유전자로부터 텔로머라제 단백질 상동체의 발현("TERT의 이소성 발현")을 유도하는 유전자 구조체로 후생동물 체세포를 형질전환시켜 텔로머라제 활성을 유지시켜 복제성 노화를 줄이는 단계; (3) CDKN2B 유전자 돌연변이 및 TERT의 이소성 발현(즉, "마스터 세포 은행")을 갖는 세포의 은행을 유지하는 단계; (4) 생체외 환경에서 마스터 세포 은행으로부터 세포를 배양하는 단계; (5) 식이 섭취를 위해 배양된 세포 바이오매스를 수확하는 단계
예시적인 실시태양 II는 내인성 p16 단백질의 기능을 파괴시키 위해 도 7에 예시된 모델을 사용한다; 예시적인 실시태양 II는 이소성 TERT 유전자의 발현을 위해 도 1에 예시된 모델을 사용한다.
<제 3 예시적 실시태양: 이소성 사이클린-의존성 키나아제 및 이소성 TERT 발현을 통한 지연된 복제성 노화>
일반적으로, 제 3 예시적 실시태양은 사이클린-의존성 키나아제 상동체의 이소성 과발현에 의한 복제성 노화 동안 세포 분열 주기의 망막모세포 단백질 억제의 사이클린-의존성 키나아제 억제제-매개 안정화; 특히, CDK4 유전자(NCBI Gene ID: 510618)로부터 CDK4 단백질 상동체의 이소성 발현을 지시하는 유전자 구조체에 의한 세포의 변형을 폐기시키는 것이다. 부수적인 텔로머라제 활성을 추가함으로써 TERT 유전자(NCBI Gene ID: 518884)로부터 텔로머라제 단백질 상동체의 과발현을 지시하는 유전자 구조체로부터 추가적인 이점을 얻을 수 있다. 텔로머라제 단백질 상동체의 과발현은 변형되지 않은 모집단에 비해 변형된 세포 집단의 복제 능력을 증가시킨다.
보다 구체적으로 한 실시태양에서, 적색야계(Gallus gallus)는 사이클린-의존성 키나아제 유전자로부터 사이클린-의존성 키나아제 단백질 상동체의 이소성 발현을 지시하는 유전자 구조체를 사용하여 가금류 골격근 세포의 변형을 모델링하도록 선택되었다; 사이클린-의존성 키나아제 유전자로부터 사이클린-의존성 키나아제 단백질 상동체의 이소성 발현을 지시하는 유전자 구성체를 보유하는 세포의 마스터 세포 은행 재고 목록을 유지한다. 상기 후생 동물 세포 집단의 형질 도입은 소 CDK4 유전자(NCBI 등록 번호: NM_001037594.2; NCBI 유전자 ID: 510618)로부터 CDK4 단백질 상동체의 발현을 지시하는 유전자 구조체(SEQ ID NO 12)를 사용한다. 이 예에 사용된 방법에 대한 자세한 설명은 재료 및 방법 섹션 C, G, H 및 I를 참조.
TERT 유전자로부터 텔로머라제 단백질 상동체의 발현을 지시하는 유전자 구조체(SEQ ID NO 11)을 갖는 후생 생물 세포 집단으로부터의 세포의 식이 섭취 및 변형을 위한 바이오매스 제조는 제 1 예시적 실시태양에서 상기 방법을 따른다.
예시적인 실시태양 III은 이소성 CDK4 유전자의 발현을 위해 도 1에 예시된 모델을 사용한다. 예시적인 실시태양 III은 이소성 TERT 유전자의 발현을 위해 도 1에 예시된 모델을 사용한다.
<재료 및 방법>
(A) 표적 유전자좌 시퀀싱
게놈 DNA는 E.Z.N.A에 의해 1차 세포 분리물로부터 추출된다. 각 종에 대한 조직 DNA 추출 키트(오메가 Bio-tek). 게놈 DNA는 적색야계의 내인성 CDKN2B와 소의 내인성 CDKN2A를 증폭하기 위해 고안된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭한다.
적색야계에서, 추정 프로모터 영역 및 CDKN2B는 프라이머 SEQ ID NO 26-31를 사용하여 PCR 증폭한다; 프라이머 표적에 대한 세부 사항을 제공하는 하기 표 2를 참조. 소에서, 추정 프로모터 영역 및 CDKN2A는 프라이머 SEQ ID NO 32-43을 사용하여 PCR 증폭한다; 프라이머 표적에 대한 자세한 내용은 아래의 표 2를 참조.
| SEQ ID NO | DNA 서열 | 세부 내용 |
| 1 | TCACCCGCAG CAGATCGCCG CGG | 적색야계 CDKN2B 엑손 1을 표적으로 하는 gRNA |
| 2 | CGGGTGAAGG AGCTACTGGA CGG | 적색야계 CDKN2B 엑손 1을 표적으로 하는 gRNA |
| 3 | GCACCACGCC TGCTGCTCCG GGG | 적색야계 CDKN2B 엑손 1을 표적으로 하는 gRNA |
| 4 | GCTGGGCTCC CCTCGCGGGT CGG | 적색야계 CDKN2B 엑손 1을 표적으로 하는 gRNA |
| 5 | CCTCGTGTCT GTGGGCAGCG GGG | 적색야계 CDKN2B 엑손 1을 표적으로 하는 gRNA |
| 8 | GGCGGCCAAC AAGTCGGCCG AGG | 소 CDKN2A 엑손 2를 표적으로 하는 gRNA |
| 9 | GCCAACGCGC CGAACCGTTA CGG | 소 CDKN2A 엑손 2를 표적으로 하는 gRNA |
| 10 | CCTCGGGTGC AAAGACTCCG CGG | 소 CDKN2A 엑손 2를 표적으로 하는 gRNA |
| 26 | CTCTCCGTCC TCCCTACCTG | 적색야계 CDKN2B 엑손 1를 위한 프라이머 |
| 27 | GTACCAACTG CGGGGAGAAA | 적색야계 CDKN2B 엑손 1를 위한 프라이머 |
| 28 | GGACGCCGGT CAATGAATCA | 적색야계 CDKN2B 엑손 2를 위한 프라이머 |
| 29 | CAGGTGATGA TGCTGGGCAG | 적색야계 CDKN2B 엑손 2를 위한 프라이머 |
| 30 | TTTCTCCCCG CAGTTGGTAC | 적색야계 CDKN2B 프로모터를 위한 프라이머 |
| 31 | CTGCAAGACC CAAGACGTCT | 적색야계 CDKN2B 프로모터를 위한 프라이머 |
| 32 | GCCTAGTCCC ACACCCTTTC | 소 CDKN2A 프로모터를 위한 프라이머 |
| 33 | CATTTAAGCC TGGCCCCTGA | 소 CDKN2A 프로모터를 위한 프라이머 |
| 34 | TGTCCGACTC TTTGCCATCC | 소 CDKN2A 엑손 4를 위한 프라이머 |
| 35 | GACCCTGGAT AAGGCGTCAG | 소 CDKN2A 엑손 4를 위한 프라이머 |
| 36 | AGTGAATGCT CTGGGAAGCG | 소 CDKN2A 엑손 3을 위한 프라이머 |
| 37 | GATTGTCAGC GCATCTGCAG | 소 CDKN2A 엑손 3을 위한 프라이머 |
| 38 | TAGAGATCTG AACCCCACGC | 소 CDKN2A 엑손 2를 위한 프라이머 |
| 39 | CTCTGATGGG AGTGGGGAGA | 소 CDKN2A 엑손 2를 위한 프라이머 |
| 40 | AGGCCTTTCC TACCTGGTCT | 소 CDKN2A 엑손 1을 위한 프라이머 |
| 41 | TAATTCCGCT GGTTTCCCAA | 소 CDKN2A 엑손 1을 위한 프라이머 |
| 42 | AAACTGCTGC GACATCTGGA | 소 CDKN2A 프로모터를 위한 프라이머 |
| 43 | ACGGTCCCTC TTCTCTCTCC | 소 CDKN2A 프로모터를 위한 프라이머 |
표 2는 gRNA 및 프라이머 서열의 세부 사항을 도시한다.
PCR 생성물을 겔 전기영동(10 W/cm에서 1% 아가로스 실행)을 사용하여 인 실리코 예측 서열 크기와 비교하였다. CDKN2A 및 CDKN2B의 게놈 서열을 결정하기 위해, 각각의 PCR 생산물을 상업용 자기 비드 키트를 사용하여 정제하고 생거(Sanger) 서열화한다. 시퀀싱 프라이머는 초기 PCR 생산물을 증폭시키는데 사용되는 것과 동일하다. 모든 PCR 프라이머는 적색야계 CDKN2B(NCBI 등록 번호 NM_204433.1) 및 소 CDKN2A(NCBI 등록 번호: XM_010807759.2)를 사용하여, Geneious R10(http://www.geneious.com, Kearse et al., 2012)에서 구입할 수 있는 Primer3 2.3.7(Untergasser et al., 2012)의 변형 버전을 사용하여 설계된다. 각 종에 대한 참조 염색체(소의 경우 NCBI Accession Number: AC_000165, 적색야계의 경우 NCBI Accession Number: NC_006127)에 대한 기준 염색체 어셈블리를 사용하여 각 유전자의 추정 프로모터 영역을 증폭하는 프라이머를 디자인한다
(B) gRNA 디자인
CRISPR/Cas9는 소 게놈에서 CDKN2A의 p16 및 적색야계 게놈에서 CDKN2B의 p15를 파괴시키는데 사용된다. CRISPR/Cas9에 적합한 gRNA는 Geneious R10(http://www.geneious.com, Kearse et al., 2012)에서 "Find CRISPR Sites" 기능을 사용하여 설계한다. 오프-표적 효과는 각 종: 적색야계-5.0(NCBI RefSeq Assembly Accession Number: GCF_000002315.4.) 및 소 v3.1.1(NCBI RefSeq Assembly Accession Number: GCF_000003055.6)에 대한 NCBI의 최신 참고 게놈을 사용하여 스크리닝된다. 오프-표적 점수 >90%를 갖는 gRNA만 합성을 위해 고려된다. 합성을 위해 선택된 가이드 RNA 서열은 적색야계의 경우 SEQ ID NO 1-5 및 소 경우 SEQ ID NO 8-10을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 별도의 pGS-gRNA 벡터가 제 3 자 공급업체에 의해 선택된 각 gRNA에 대해 제작, 증폭 및 정제된다. 각 gRNA 플라스미드와 함께 형질감염될 pSpCas9 PX165 벡터는 또한 제 3 자 공급업체로부터 공급받는다.
(C) 합성 제조 디자인
사이토메갈로바이러스, 닭 베타-액틴, 토끼 베타-글로불린(CAG) 조절 요소(Alexopoulou, Couchman 및 Whiteford 2008)는 모든 도입된 합성 구조체의 강력한 발현을 촉진하는데 사용된다. 적색야계 TERT 참조 서열(NCBI 등록 번호: NM_001031007.1)은 NCBI로부터 검색하였다. 각 전사 변이체(NM_001031007.1 및 XM_015282334.1)의 경우, 암호화 DNA 서열(CDS) 영역이 추출되어 연쇄상 서열로 결합된다. 그런 후에 CAG 조절 요소는 Geneious R10(http://www.geneious.com, Kearse et al., 2012)의 각 전사 변이체에 대해 CDS의 5' 말단에 결합된다. 전체 합성 구조체 SEQ ID NO 6 및 SEQ ID NO 7을 모으고 상업적 공급업자에 의해 포유류 발현 벡터에 복제하였다. 본 발명에 기술된 전략은 합성 TERT 구조체의 소 버전을 생산하는데 사용된다. 소 TERT 구조체(SEQ ID NO 11)은 기준 서열(NCBI 등록 번호: NM_001046242.1)을 사용하여 디자인된다.
소 세포에서 CDK4의 강한 발현을 유도하기 위해, 상기 기술된 방법을 사용하여 다른 세트의 합성 구조체를 제조하였다. 소 CDK4 참조 서열(NCBI 등록 번호: NM_001037594.2)은 NCBI로부터 검색하였다. 야생형 및 돌연변이 염기 서열 모두에 대해, CDS 영역을 추출하여 연쇄상 서열로 결합시켰다. 합성 구조체 SEQ ID NO 12를 결합하고 제 3 자 판매자에 의해 포유류 발현 벡터에 복제하였다.
(D) 적색야계 CDKN2B 또는 소 CDKN2A의 INDEL 돌연변이 유발을 위한 CRISPR/Cas9 세포 형질감염
표적화된 INDEL 돌연변이 유발을 수행하기 위해, 플라스미드에 의해 암호화된 CRISPR/Cas9 단백질에 의해 인식되는 gRNA 서열을 형질 감염을 위해 합성, 증폭 및 정제한다. 플라스미드 DNA는 원핵생물 시스템에서 증폭을 위해 필요한 조절 요소를 함유하는 표준 벡터 백본을 포함한다. 각각의 플라스미드는 또한 5' 조절 영역, 암호화 영역 또는 둘 모두 내에서 INDEL 돌연변이 형성을 유도하기 위해 각 표적 세포 집단 내에서 일시적으로 gRNA 또는 Cas9 단백질을 발현하는데 필요한 조절 및 암호화 영역을 함유한다.
플라스미드 DNA 구조체의 전달은 현탁액 상태로 접착 동안 일차 세포 분리물에 직접 전달되는 비-리포솜 DNA 복합체-형질감염 시약(Fugene HD, Promega)에 의해 매개된다. p15를 암호화하는 적색야계 CDKN2B 유전자의 5' 영역 또는 p16을 암호화하는 소 CDKN2A 유전자의 5' 영역을 표적으로 하는 gRNA는 형질감염된 플라스미드로부터의 발현을 위해 디자인된다. 형질감염은 일차 인간 골격 근육모세포의 표적화된 변형에 대한 Grunwald and Speer(2007) 프로토콜의 변형을 사용하여 수행된다(Biochemica 3/2007, 26-27 페이지). 준비된 플라스미드 DNA를 살균 탈이온수에 1μg/μL의 작업 농도로 희석한다. 각각의 플라스미드 DNA 원료를 2㎍의 총 DNA 양에 대해 2:1 비율의 Cas9 플라스미드 DNA:gRNA 플라스미드로 분취하고 분쇄를 통해 잘 혼합한다. 총 DNA는 살균 탈이온수에 1μg/50μL의 농도로 희석한다. Fugene HD를 DNA 혼합물에 6:2의 비율로 첨가하고(Fugene HD 시약(μL): 총 DNA(μg)) 잘 혼합한다.
혼합물은 DNA와의 착화를 촉진시키기 위해 실온에서 15분 동안 배양한다. 배양된 DNA 혼합물을 동일한 부피의 살균 탈이온수를 첨가하여 희석시켰다. 그런 후에 이 전체 반응 혼합물을 현탁액 속의 세포에 적가한다. 세포와 DNA 반응 혼합물을 5% CO2, 5% O2 대기 조건하에서 16시간 동안 37℃에서 배양한다.
표적 세포 집단을 조직 배양 처리 플라스틱(6-웰 플레이트)의 증식 배지에서 유지한다. 세포는 4 x 105 세포/ml의 배양 배지의 밀도로 유지된다. 형질감염 전에, 세포 배지를 무균적으로 제거하고 세포를 1x PBS로 세척한 다음 37 ℃에서 1x 해리 시약(TrypLE-Gibco)에 3분간 노출시켰다. 동량의 증식 배지를 첨가하고 부드럽게 연화하여 반응을 종결시킨다. 그런 후에 세포를 0.1% 젤라틴-코팅 웰로 옮긴다. 이 시점에서, DNA 형질감염 반응 복합체를 첨가하고, 추가 처리 및 평가에 앞서 48시간 동안 5% CO2, 5% O2에서 48시간 동안 37℃에서 세포를 배양한다.
(E) CDKN2B 또는 CDKN2A를 표적으로 하는 형질전환된 세포의 한계 희석
CRISPR/Cas9 gRNA를 사용하여 이전에 형질감염된 세포 집단을 하나의 형질감염 사이클을 거친 세포의 부모 풀로부터 세포의 개별 클론 집단을 먼저 분리함으로써 선택된다. 세포는 한계 희석법을 사용하여 선택한다. 형질감염된 세포는 효소 적으로 단일 세포 현탁액으로 해리된다. 2 x 104 세포/mL 증식 배지의 작업 원료가 총 500μL 부피로 생산된다. 조직-배양 96웰 플레이트의 각 웰을 0.1% 젤라틴에 코팅한다. 웰 A1을 제외하고, 각 웰을 100㎕의 증식 배지로 미리 채운다. 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트의 0.1% 젤라틴 코팅 A1 웰에 4 x 103 세포(200 uL)를 무균 적으로 옮긴다. 웰 A1의 부피(100μL)의 절반을 즉시 웰 B1로 옮기고 잘 섞는다. 이 희석 시리즈(1:2)를 웰 C1에서 H1까지 반복한다. 세포를 받으면, 100μL를 제거하고 웰 H1으로부터 버린다. 100μL의 세포-제거 증식 배지를 A1-H1의 각 웰에 첨가하고 잘 혼합한다. 다음으로, 웰 A1의 부피의 절반을 웰 A2에 옮기고 잘 혼합한다. 이 과정을 A2에서 A12까지 반복한다. 희석 시리즈를 웰 B1로부터 다시 시작하여 반복하고 B12까지 지속한다. 이 전체 과정을 전체 플레이트(96 웰 모두)가 희석된 부피의 세포를 수용할 때까지 C 내지 H행에 대해 반복한다. 희석 시리즈를 완료하기 위해, 12열의 각 웰의 절반(100μL)을 제거하고 버린다. 2열에서 12열의 각 웰은 각각에 첨가된 100μL의 세포-제거 증식 배지를 가져서 플레이트 상의 각 웰의 최종 부피를 200μL로 만든다. 전체 플레이트를 개별 세포 콜로니가 나타날 때까지 저산소 상태에서 37℃에서 배양한다(10 세포 더블링 또는 1,024 세포보다 크거나 같음). 하나의 분리된 세포로부터 유래하는 세포를 보유하는 것으로 보이는 웰은 단일 세포로 해리되고 0.1% 젤라틴 코팅된 24 웰 플레이트의 1개의 웰 속에 1:1로 계대배양하고 5% CO2, 5% O2 대기 조건하에서 37℃에서 배양한다. 90% 밀집 후, 세포를 12웰 및 6웰 플레이트로 팽창시킨다.
한계 희석에 의해 분리되고 6웰 플레이트에서 90% 밀집도로 팽창된 세포를 6 웰 플레이트로 1:4로 계대배양한다. 그런 후에 90% 밀집도 웰을 다음 평가를 위해 처리한다. 하나의 웰을 단일 세포로 해리시키고, 세척하고, 5분 동안 300 x g에서 펠렛화하였다. 총 세포 게놈 DNA를 분리하고 정량화한다. 그런 후에 총 게놈 DNA를 CDKN2B 또는 CDKN2A 유전자좌의 PCR 증폭으로 처리하고 분석될 때까지 10W/cm의 1% 아가로 오스 겔에서 수행한다. 그런 후에 이 PCR 생산물을 아가로오스 겔에서 추출하여 생거(Sanger) 서열 분석을 위해 제출한다. 서열 추적을 이전에 검증된 야생형 비처리 부모 세포 집단 CDKN2B 또는 CDKN2A 유전자 서열과 비교한다.
(F) 세포 증식 및 노화 분석(EdU 방법)
p15 기능을 표적으로 하는 적색야계 CDKN2B 유전자 또는 p16 기능을 표적으로 하는 소 CDKN2A 유전자의 5' 영역에서 INDEL 돌연변이 형성을 나타내는 세포 집단을 표준 EdU 분석을 통해 기능적 및 표현형 특성에 대해 평가한다. 정확하게 INDEL 파괴 유전자를 보유하고 클론적으로 순수한 것으로 판명된 세포 집단은 이전의 CRISPR/Cas9 표적화를 받지 않은 야생형 세포와 동일한 밀도로 씨드되며 INDEL-수정 세포와 동일한 세포 더블링 수이다. 각 세포 유형은 5% CO2, 5% O2 대기 조건 하에서 24시간 동안 37℃에서 배양한다. 다음에, 표준 티미딘 유사 시약(EdU)을 배양 배지(Click-It Alexa 488 EdU 키트, Thermo-Fisher)에 첨가하고 세포를 4시간 동안 5% CO2, 5% O2 대기 조건하에 37℃에서 배양한다. 배양 후, 세포를 세척하고, 고정시키고, 투과성으로 만들고, 항-EdU Alexa 488-접합 아자이드를 사용하여 프로브한다. 핵 역-염색법은 표준 DAPI 핵 염색을 사용하여 성취된다. 그런 후에 세포를 다음 표준 488nm 파장 빛 아래에서 여기 후 시각화한다. 야생형 및 CDKN2B/A 유전자-수정된 세포 집단에서 Alexa Flour 488/DAPI의 비율을 정량하고 비교하여 각 세포 그룹 내에서의 증식 집단 비율을 평가한다. 집단 처리 당 총 세포 수와 세포 계대배양 수를 통해 측정한 양성 Alexa Fluor 488 신호는 DNA 복제가 발생했음을 나타내며 적극적으로 증식하는 세포의 직접적인 척도이다. 연속적으로 계대배양 동안 증식 능력의 상대적 유지를 정량화하고 추적하기 위해, 이 과정을 세포 집단 중 적어도 하나가 증식을 멈추고 노화가 될 때까지 연속적인 집단 더블링 동안 반복한다.
(G) 이소성 플라스미드 DNA 형질감염 방법
이소성으로 발현하기 위해, 연구중인 후생 동물(즉, "관심 유전자")에 종-특이적 TERT 또는 CDK4 조절 및 암호화 서열을 함유하는 플라스미드 DNA 구조체는 상업적인 플라스미드 생산 서비스뿐만 아니라 독특한 진핵 항생제 저항 유전자(즉, 다른 상주 약물 선택 마커에 독특한)를 사용하여 생성된다. 본 발명에 기술된 의도된 사용을 위해, 플라스미드 DNA는 원핵생물 시스템에서 증폭을 위해 필요한 조절 요소를 함유하는 표준 벡터 백본을 함유한다.
각 플라스미드는 각 표적 세포 집단 내에서 TERT 또는 CDK4 단백질을 구성 적으로 발현하는데 필요한 조절 및 암호화 영역을 함유한다. 플라스미드 DNA 구조체의 전달은 현탁액 상태로 접착 동안 일차 세포 분리물에 직접 전달되는 비-리포솜 DNA 복합체-형질감염 시약(Fugene HD, Promega)에 의해 매개된다. 플라스미드는 관심 유전자 및 진핵 항생제 내성을 암호화하는 유전자의 발현을 촉진시키는데 필요한 조절 서열을 함유한다. 형질감염은 일차 인간 골격 근육모세포의 표적화된 변형에 대한 Grunwald and Speer(2007) 프로토콜의 변형을 사용하여 수행된다(Reference Biochemica 3/2007, 26-27 페이지). 준비된 플라스미드 DNA는 독특한 제한 효소 부위를 사용하여 5' 조절 성분의 제한 효소 절단 상류이다. 절단되지 않은 또는 잘못 절단된 플라스미드로부터 절단된 플라스미드를 절단하기 위해, 0.8% 아가로오스 겔을 분해될 때까지 10W/cm에서 수행하였다. 샘플링된 모든 플라스미드 DNA가 적절하게 선형화되면, 절단된 플라스미드를 살균 탈이온수에 1μg/μL의 작업 농도로 희석한다. 2μg의 총 DNA를 살균 탈이온수에 1μg/50μL의 농도로 희석한다. Fugene HD를 DNA 혼합물에 6:2의 비율(Fugene HD 시약(μL): 총 DNA(μg))로 첨가하고 잘 혼합한다. 혼합물을 DNA와의 착화를 촉진시키기 위해 실온에서 15분 동안 배양한다. 배양된 DNA 혼합물을 동일한 부피의 살균 탈이온수를 첨가하여 희석한다. 그런 후에 이 전체 반응 혼합물을 현탁액 속의 세포에 적가한다(아래 참조). 세포와 DNA 반응 혼합물을 5% CO2, 5% O2 대기 조건에서 48시간 동안 37℃에서 배양한다.
(H) 이소성 DNA로 형질감염된 세포의 클론 선택
세포 집단은 항생제 약물 선택 및 생존을 통해 선택된다: Fugene HD : 선형화된 TERT 또는 CDK4 플라스미드 DNA 서열에서 배양된 세포는 배지를 제거하고 1x PBS로 세척하고 새로운 증식 배지를 도포한다. 치사량의 항생 물질을 세포 배양물에 도포하여 세포 클론 선택을 개시한다. 세포를 치사 항생제 약물에 노출시키면서 5% O2, 5% CO2 하에서 14일 동안 37℃에서 배양한다. 세포 배양 배지를 모니터하고 일정한 간격으로 대체하여 약물로 유발된 사망으로 인한 세포질 및 잔해를 제거한다. 형질감염된 플라스미드 상에 운반된 항생제 내성 유전자를 보유하는 단일 세포로부터 나오는 비 병리적, 증식하는 세포 콜로니를 살균 p200 피펫 팁을 사용하여 골라 내고 96웰 플레이트의 0.1% 젤라틴 코팅된 웰로 옮겼다. 치명적인 항생제 농도가 포함된 200μL의 증식 배지를 일정한 선택 압력을 유지하기 위해 이전과 같이 재도포한다. 콜로니가 나타날 때까지 세포를 5% O2, 5% CO2 대기 조건 하에서 37℃에서 배양한다. 그런 후에 확립되고 증식하는 콜로니는 단일 세포로 해리되고 6 웰 플레이트의 6 웰 내에서 밀집될 때까지 더 큰 표면적의 젤라틴-코팅 웰로 확장된다. 관심 유전자 함유 플라스미드에 의해 표적화된 각 살아남은, 확장된 세포 집단의 각각의 6 웰 플레이트 중 하나의 밀집 웰을 전체 게놈 DNA 분리 처리한다. 총 세포 게놈 DNA를 분리하고 정량화한다. 그런 후에 총 게놈 DNA를 관심 유전자의 암호화 서열을 PCR 증폭으로 처리하고 용해될 때까지 10W/cm의 0.8% 아가로오스 겔에서 수행한다. 그런 후에 이 PCR 생산물을 아가로오스 겔에서 추출하여 생거(Sanger) 서열 분석을 위해 제출한다. 서열 추적을 야생형, 처리되지 않은 부모 세포 집단 및 관심 서열의 종 특이적 유전자의 인 실리코 디자인과 비교한다. 인 실리코 예측과 일치하는 관심 유전자 게놈 서열을 나타내는 세포 집단을 기능적 및 표현형 특성에 대해 평가한다.
(I) TRAP를 사용하는 텔로머라제 기능 검증 분석
표준 TRAP 분석을 사용하여 TERT 발현 생산물의 기능적 평가를 수행한다. TRAP, Telomerase Repeated Amplification Protocol을 다음과 같은 방식으로 수행한다. TERT 구조체를 보유하기로 결정된 분리된 세포 집단을 TERT 구조체(처리되지 않은 세포 비교체)를 함유하지 않는 세포와 동일한 농도로 플레이트하고 5% CO2, 5% O2 대기 조건 하에서 37℃에서 80% 밀집도까지 배양하였다. 그런 후에, 세포를 세척하고, 수집하고, 펠렛화하고 용해시켜 게놈 DNA뿐만 아니라 세포내 단백질 분획을 수집한다. 필요한 시약과 완충액을 함유하는 구입가능한 TRAP 분석 키트(TRAPeze Telomerase Detection Kit, EMD Millipore)를 사용하여, 게놈 DNA에 대해 PCR 증폭을 수행한다. 결과는 활성 텔로머라제의 존재를 나타내는 밴딩 패턴(즉, 증가된 활성 텔로머라제 또는 이의 부재와 양의 상관 관계가 있는 사다리 밴딩의 패턴)을 핵석하기 위해 비 변성 아크릴아마이드 겔 상에서 수행된다.
<결론>
본 발명은 복제성 노화 동안 세포 분열 주기 진행의 망막모세포종 단백질 억제를 분리하는데 사용된 특정 기술에 의해 제한되지 않는다. 본 발명에 명명된 이러한 특정 기술 이외에, 이러한 억제는 다른 기술에 의해 성취될 수 있다. 이러한 기술의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: (1) 짧은 헤어핀 RNA에 의한 RNA 번역의 사일런싱(도 8); (2) 가이드 RNA 표적 뉴클레아제-결핍 Cas9에 의한 내인성 유전자 발현의 조절(도 5 및 도 6); (3) 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 형질감염된 DNA 또는 상동 재조합 유도 유전자 공학; (4) RB1 유전자좌에서 유전자 발현을 파괴하도록 도 4, 6, 7 및 8에 모델링된 방법에 의한 pRB 기능 또는 유전자 발현의 직접 표적화 억제; (5) CDK6 및 CDK2와 같은 야생형 사이클린 의존성 키나아제 상동체뿐만 아니라 CDK4R24C와 같은 CKI 억제에 내성인 돌연변이 CDK 상동체(Wolfel et al., 1995; Science Vol. 269 pp 1281 - 1284)의 이소성 과발현; (6) 종 정체성이 두 전사체를 특징으로 하는 세포에서 p15와 p16 기능의 동시 파괴; (7) 류신-X-시스테인-X-글루탐산을 함유하는 펜타펩타이드 모티프에 상동성인 모티프를 함유하는 망막모세포종 패밀리 단백질을 표적으로 하는 바이러스 단백질을 사용하여 망막모세포종 패밀리 단백질 기능의 파괴.
이 공정의 한 실시태양은 식이 섭취를 위한 동물 바이오매스의 배양을 초래하나, 다른 응용분야는 가죽과 같은 직물 생산을 위한 바이오공정; 치료 조직 및 백신과 같은 의학적 용도를 포함한다. 또한, 고기에 대한 세계적 요구가 급속히 증가함에 따라, 육류 소비, 클론, 완전 근원성 및 불멸화 가축 세포주의 자원 요구량 및 생태학적 영향이 가축의 골격근 발달 메커니즘을 이해하고, 가축의 체중 증가를 개선하고 수의학 및 기타 수의학 응용분야에 유용한 자원을 제공할 수 있다.또한, 본 발명의 범위 내에서 기술된 용도는 (1) 유전자 정체성이 농업에서 유행하는 동물 종으로부터 유래되지 않은 세포주에 대한 응용분야; 및 (2) 골격근 이외의 조직의 존재론적 세포 계통으로부터의 동물 바이오매스의 생산을 배제하지 않으며 이에 제한되지 않는다.
본 발명 및 방법의 분류학적 범위는 적색야계(Gallus gallus), 들칠면조(Meleagris gallopavo) 및 청둥오리(Anas platyrhynchos)를 포함하나 이에 제한되지 않는 가금류로 허용되는 종, 소(Bos taurus), 멧돼지(Sus scrofa) 및 양(Ovis aries)을 포함하나 이에 제한되지 않는 종 및 대서양연어(Salmo salar), 참다랑어(Thunnus thynnus), 대서양참대구(Gadus morhua), 아메리칸 랍스터(Homarus americanus) 및 보리새우(Litopenaeus setiferus)을 포함하나 이에 제한되지 않는 해산물로 허용되는 종을 포함한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Memphis Meats, Inc.
<120> Engineer cell lines for cultivation of animal biomass for dietary
consumption
<130> 45974.0002
<160> 43
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<220>
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<222> (576)..(1546)
<223> Intron Chicken beta actin
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aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 120
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 180
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 240
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga 300
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gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt 780
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acaactgtgt tcactagcaa cctcaaacag acaccatgga gcgcggggct cagccgggag 1800
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gcttccagca gttatccagt cagagcgaag tcatcacaag aatcgttcag aggctgtgtg 2100
aaaagaaaaa gaagaacatc cttgcgtatg gatactcctt gctggatgag aacagttgtc 2160
acttcagagt tttgccatct tcgtgtatat acagctatct gtccaatact gtaacagaaa 2220
cgattcgcat cagtggcctc tgggagatac tgctgagtag gataggggac gacgtgatga 2280
tgtacctgct ggagcactgt gcactcttca tgctggttcc cccaagtaac tgttaccagg 2340
tctgcgggca accaatttat gaacttattt cgcgtaacgt agggccatcc ccagggtttg 2400
ttagacgacg gtactcaagg tttaaacata atagcttgct tgactatgtg cgaaaaaggc 2460
ttgtgtttca caggcactat ctttccaagt cgcagtggtg gaagtgcagg ccgagacgtc 2520
gaggtcgtgt ctccagcagg agaaaaagaa ggagccatag gatacaaagc ctaaggtctg 2580
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tttctgaaag aagtaacagt gagatgtctg gtccttctgt agttcacaga tctcaccctg 2940
ggaagaggcc tgtggcagac aaaagctctt ttccacaagg agttcagggt aacaaacgca 3000
taaagaccgg tgcagaaaaa cgagcagaat ccaatagaag gggcatagag atgtatataa 3060
acccaatcca taaacccaat agaaggggca tagagaggcg tataaatcca acccacaaac 3120
ctgagttgaa ttctgtacaa actgaaccaa tggaaggtgc ttcttcaggg gacagaaagc 3180
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tattcttaag ccaaaaccca ttaaaggaac agcagaacca aagcctacca cagcaaaagt 3420
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taaagaacca tgagaagtgc ccttatttag ttttcttgag gaaaaattgc cctgttttgc 3540
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<308> NCBI RefSeq / NM_001046242.1
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ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct 1620
gtctcatcat tttggcaaag aattcatggc tacctctcga tatgagccag tggctgaaat 1680
tggtgtcggt gcctatggga cagtgtacaa ggcctgtgat ccccacagtg gccactttgt 1740
ggccctcaag agtgtgagag tccccaatgg aggaggaggt ggaggaggcc ttcccatcag 1800
cacagttcgt gaggtggctt tactgaggcg actggaggct tttgagcatc ccaatgttgt 1860
ccggctgatg gacgtctgtg ccacatcccg aactgaccgg gagatcaagg taaccctggt 1920
gtttgagcat gtagaccagg acctaaggac atatctggac aaggcacccc caccaggctt 1980
gccagccgaa acgatcaagg atctgatgcg ccagtttcta agaggcctag atttccttca 2040
tgccaattgc atcgttcacc gagatctgaa gccagagaac attctggtga caagtggtgg 2100
aacagtcaag ctggctgact ttggcctggc cagaatctac agctaccaga tggcacttac 2160
acccgtggtt gttacactct ggtaccgagc tcccgaagtt cttctgcagt ccacatatgc 2220
aacacctgtg gacatgtgga gtgttggctg tatctttgca gagatgtttc gtcgaaagcc 2280
tctcttctgt ggaaactctg aagccgacca gttgggcaaa atctttgacc tgattgggct 2340
gcctccagag gatgactggc ctcgagatgt atccctgccc cgtggagcct ttccccccag 2400
agggccccgc ccagtgcagt cggtggtacc tgagatggag gagtcgggag cacagctgct 2460
gctggaaatg ctgactttta acccacacaa gcgaatctct gcctttcgag ctctgcagca 2520
ctcttatcta cataaggatg aaggtaatcc ggagtgaaa 2559
<210> 15
<211> 2542
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> enhancer
<222> (1)..(293)
<223> human CMV IE1
<220>
<221> promoter
<222> (294)..(575)
<223> Chicken Beta Actin Promoter
<220>
<221> Intron
<222> (578)..(1548)
<223> Intron Chicken beta actin
<400> 15
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 60
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 120
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 180
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 240
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga 300
ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt 360
gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg 420
cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc 480
ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg 540
gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgcgct gccttcgccc 600
cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact 660
cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta 720
atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc 780
tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc 840
gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc 900
gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg 960
ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt 1020
gggcgcgtcg gtcgggctgc aaccccccct gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg 1080
cccggcttcg ggtgcggggc tccgtacggg gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg 1140
ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc 1200
gggggagggg cgcggcggcc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag 1260
ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg 1320
tgcggagccg aaatctggga ggcgccgccg caccccctct agcgggcgcg gggcgaagcg 1380
gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg 1440
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gtctcatcat tttggcaaag aattcatgga gaacttccag aaggtggaga agatcgggga 1680
gggcacctat ggtgtggtgt acaaggctcg caacaagcgc acgggcgagc tggtggcgct 1740
caagaagatc cggctggaca cggagaccga gggtgtcccc agcactgcca tccgagaaat 1800
ctcgctgctg aaggagctga agcatcccaa catagtcaaa ctgctggacg tgatccacac 1860
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tgcatcatcc ctgggcggca tcgcgctgcc cctcatcaag agctacctgt tccagctgct 1980
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ttttgctgag atggtgacgc ggcgcgcgct cttccccggg gattcggaga tcgatcagct 2280
cttccgtatc ttccgcacgt tggggacacc ggatgaggcc gcctggcccg gcgtcaccgc 2340
gctgcccgac tacaagccca gcttccccaa atgggcccgg caggatctgg gcaaggtggt 2400
gccgccgctg gatgaggagg gccgcaagct gctggctcaa atgctgcact acgatcccaa 2460
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tgtcccccac ctgcgcctgt ga 2542
<210> 16
<211> 2626
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> enhancer
<222> (1)..(293)
<223> human CMV IE1
<220>
<221> promoter
<222> (294)..(575)
<223> Chicken Beta Actin Promoter
<220>
<221> Intron
<222> (578)..(1548)
<400> 16
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 60
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 120
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 180
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 240
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga 300
ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt 360
gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg 420
cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc 480
ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg 540
gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgcgct gccttcgccc 600
cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact 660
cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta 720
atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc 780
tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc 840
gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc 900
gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg 960
ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt 1020
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acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa 1560
ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct 1620
gtctcatcat tttggcaaag aattcatgga caaggacggc accaacctgg ccgaccagca 1680
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tgtaaccagc agtgggcaga taaagttagc tgactttgga cttgcacgaa tctacagttt 2160
tcagatggct cttacatcag tggttgttac tttgtggtat agagctcctg aagttttgct 2220
tcagtccagc tatgcaacac cagttgatct ttggagtgtt ggttgcatat ttgcagaaat 2280
gttccgtcga aaaccactct tccgtggaaa ttcagatgtt gatcagctag gaaaaatctt 2340
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<300>
<308> NCBI RefSeq / NP_001035744.1
<309> 2015-05-12
<313> (1)..(168)
<400> 17
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Val His Asp Val Arg Ala Leu Leu Glu Ala Gly Val Ser Pro Asn Ala
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Pro Asn Ser Phe Gly Arg Thr Pro Ile Gln Val Met Met Met Gly Asn
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Val His Val Ala Ala Leu Leu Leu Asn Tyr Gly Ala Asp Ser Asn Cys
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<212> PRT
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<300>
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<309> 2016-01-26
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<300>
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<212> PRT
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<300>
<308> NCBI RefSeq / NP_989764.1
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20 25 30
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35 40 45
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115 120 125
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<210> 21
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<300>
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<309> 2015-02-15
<313> (1)..(130)
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1 5 10 15
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20 25 30
Asn Ala Leu Asn Arg Phe Gly Arg Arg Pro Ile Gln Val Met Met Met
35 40 45
Gly Ser Ala Gln Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro
50 55 60
Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Glu Glu Gln Gly His Arg Asp Ile Ala Arg Tyr Leu His Ala Ala Thr
115 120 125
Gly Asp
130
<210> 22
<211> 131
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<300>
<308> NCBI RefSeq / NP_999289.1
<309> 2016-07-29
<313> (1)..(131)
<400> 22
Met Leu Ser Gly Gly Gly Gly Asp Ala Gly Leu Ala Asn Ala Ala Ala
1 5 10 15
Arg Gly Gln Val Glu Thr Val Arg Gln Leu Leu Glu Ala Gly Ala Asp
20 25 30
Pro Asn Gly Leu Asn His Phe Gly Arg Arg Pro Ile Gln Val Met Met
35 40 45
Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Asp
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ala Glu Glu Arg Gly His Arg Asp Val Ala Arg Phe Leu Arg Ala Ala
115 120 125
Ala Gly Asp
130
<210> 23
<211> 131
<212> PRT
<213> Bos taurus
<300>
<308> NCBI RefSeq / NP_001069362.1
<309> 2016-07-29
<313> (1)..(131)
<400> 23
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1 5 10 15
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Pro Asn Arg Leu Asn Arg Phe Gly Arg Arg Pro Ile Gln Val Met Met
35 40 45
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115 120 125
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<211> 126
<212> PRT
<213> Oncorhynchus mykiss
<300>
<308> GenBank / ACO08670.1
<309> 2009-03-27
<313> (1)..(126)
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100 105 110
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115 120 125
<210> 25
<211> 127
<212> PRT
<213> Oreochromis niloticus
<300>
<308> NCBI RefSeq / XP_003452283.1
<309> 2016-12-05
<313> (1)..(127)
<400> 25
Met Thr Leu Gln Asp Glu Leu Thr Thr Ala Ala Ala Lys Gly Asn Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Ala Leu Leu Asp Arg Gly Ala Gln Val Asn Gly Thr
20 25 30
Asn Ser Phe Gly Arg Thr Ala Leu Gln Val Met Met Met Gly Ser Thr
35 40 45
Ser Val Ala Gln Leu Leu Leu Glu His Gly Ala Asn Pro Asn Val Gly
50 55 60
Asp Ser Ser Thr Gly Ala Ser Pro Leu His Asp Ala Ala Arg Thr Gly
65 70 75 80
Phe Val Asp Thr Val His Leu Leu Val Gln His His Ala Asp Pro Gln
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Leu Asn Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Arg Gln His
100 105 110
Gly His Gly Asp Val Val Asp Phe Leu Glu Ser Leu Gln Asn Pro
115 120 125
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 26
ctctccgtcc tccctacctg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 27
gtaccaactg cggggagaaa 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 28
ggacgccggt caatgaatca 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 29
caggtgatga tgctgggcag 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 30
tttctccccg cagttggtac 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 31
ctgcaagacc caagacgtct 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 32
gcctagtccc acaccctttc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 33
catttaagcc tggcccctga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 34
tgtccgactc tttgccatcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Bos taurus
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<211> 20
<212> DNA
<213> Bos taurus
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Claims (34)
- 다음 단계를 포함하여 후생동물 체세포 집단의 복제 능력을 증가시키는 방법:
유전자 수정을 사용하여 망막모세포종 단백질의 사이클린-의존성 키나아제 억제제("CKI")-매개 안정화를 폐지함으로써 복제성 노화 동안 세포 분열 주기 진행의 망막모세포종 단백질 억제를 완화시키는 단계;
기능성 텔로미어 역전사효소("TERT") 단백질의 이소성 발현을 지시하는 유전자 구조체(SEQ ID NO 11)로 후생동물 체세포 집단을 형질전환시켜 텔로머라제 활성을 유지시키는 단계;
유전자 돌연변이 및 TERT 단백질의 이소성 발현을 갖는 마스터 세포 은행인 세포의 은행을 유지하는 단계;
배양된 세포 바이오매스인 생체외 환경에서 마스터 세포 은행으로부터 세포를 배양하는 단계; 및
식이 섭취를 위해 배양된 세포 바이오매스를 수확하는 단계. - 제 1 항에 있어서,
유전자 수정은 복제성 노화 동안 세포 주기의 망막모세포종 단백질 억제를 폐지하기 위해 후생동물 체세포 집단에서 CDKN2B 유전자(NCBI Gene ID: 395076)의 유전자 수정에 의해 p15 단백질을 불활성화시키는 단계를 포함하는 방법. - 제 2 항에 있어서,
유전자 수정은 CDKN2B 유전자의 엑손 1에서 보존된 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이인 방법. - 제 3 항에 있어서,
유전자 수정은 가이드 RNA를 사용하여 만들어진 삽입 돌연변이이고, 상기 가이드 RNA는 CDKN2B 유전자의 엑손 1을 표적으로 하는 가이드 RNA로 이루어진 그룹(SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 및 5)으로부터 선택되며 뭉쳐진 규칙적으로 이격된 짧은 회분구조 반복체-Cas9("CRISPR/Cas9")를 사용하여 생성되는 방법. - 제 3 항에 있어서,
유전자 수정은 가이드 RNA를 사용하여 만들어진 결실 돌연변이이고, 상기 가이드 RNA는 CDKN2B 유전자의 엑손 1을 표적으로 하는 가이드 RNA로 이루어진 그룹(SEQ ID NO 1, 2, 3, 4 및 5)으로부터 선택되며 CRISPR/Cas9를 사용하여 생성되는 방법. - 제 2 항에 있어서,
마스터 세포 은행으로부터의 세포를 배양하는 것은 다음 단계를 추가로 포함하는 방법:
마스터 세포 은행으로부터 선택된 세포 집단을 확장하는 단계;
마스터 세포 은행 재고 목록에서 확장된 세포 집단을 냉동 보존 및 저장하고 생체외 환경에서 마스터 세포 은행 재고 목록에서 세포를 씨딩하고 배양하는 단계; 및
식이 섭취를 위해 배양된 세포 바이오매스를 수확하는 단계. - 제 2 항에 있어서,
후생동물 체세포 집단 종 정체는 적색야계이고 후생동물 체세포 집단 계통은 골격근인 방법. - 제 1 항에 있어서,
유전자 수정은 복제성 노화 동안 세포 주기의 망막모세포종 단백질 억제를 폐지하기 위해 후생동물 체세포 집단에서 CDKN2A 유전자(NCBI Gene ID: 616369)의 유전자 수정에 의해 p16 단백질을 불활성화시키는 단계를 포함하는 방법. - 제 8 항에 있어서,
유전자 수정은 CDKN2A 유전자의 엑손 2에서 보존된 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이인 방법. - 제 9 항에 있어서,
유전자 수정은 CDKN2A 유전자의 엑손 2를 표적으로 하는 가이드 RNA를 사용하여 만들어진 삽입 돌연변이이고 CRISPR/Cas9를 사용하여 생성되는 방법. - 제 9 항에 있어서,
유전자 수정은 가이드 RNA를 사용하여 만들어진 결실 돌연변이이고, 상기 가이드 RNA는 CDKN2A의 엑손 2를 표적으로 하는 가이드 RNA로 이루어진 그룹(SEQ ID NO. 8, 9 및 10)으로부터 선택되며 CRISPR/Cas9를 사용하여 생성되는 방법. - 제 8 항에 있어서,
마스터 세포 은행으로부터의 세포를 배양하는 것은 다음 단계를 추가로 포함하는 방법:
마스터 세포 은행으로부터 선택된 세포 집단을 확장하는 단계;
마스터 세포 은행 재고 목록에서 확장된 세포 집단을 냉동 보존 및 저장하고 생체외 환경에서 마스터 세포 은행 재고 목록에서 세포를 씨딩하고 배양하는 단계; 및
식이 섭취를 위해 배양된 세포 바이오매스를 수확하는 단계. - 제 8 항에 있어서,
후생동물 체세포 집단 종 정체는 소이고 후생동물 체세포 집단 계통은 골격근인 방법. - 제 1 항에 있어서,
유전자 수정은 CDK4 유전자(NCBI Gene ID: 510618)로부터 사이클린-의존성 키나아제 4("CDK4") 단백질 상동체의 이소성 발현을 지시하는 유전자 구조체(SEQ ID NO 12)로 세포 집단을 변형시키는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제 14 항에 있어서,
마스터 세포 은행으로부터의 세포를 배양하는 것은 다음 단계를 추가로 포함하는 방법:
마스터 세포 은행으로부터 선택된 세포 집단을 확장하는 단계;
마스터 세포 은행 재고 목록에서 확장된 세포 집단을 냉동 보존 및 저장하고 생체외 환경에서 마스터 세포 은행 재고 목록에서 세포를 씨딩하고 배양하는 단계; 및
식이 섭취를 위해 배양된 세포 바이오매스를 수확하는 단계. - 제 14 항에 있어서,
후생동물 체세포 집단 종 정체는 소이고 후생동물 체세포 집단 계통은 골격근인 방법. - 제 14 항에 있어서,
후생동물 세포 집단을 변형시키는 단계는 소 CDK4 유전자로부터 CDK4 단백질 상동체의 발현을 지시하는 유전자 구조체(SEQ ID NO 12)를 이용하는 방법. - 유전자 수정을 사용하여 망막모세포종 단백질의 CKI-매개 안정화를 폐지함으로써 복제성 노화 동안 세포 분열 주기 진행의 망막모세포종 단백질 억제를 디커플링하는 단계;
기능성 TERT 단백질의 이소성 발현을 지시하는 유전자 구조체(SEQ ID NO 11)로 후생동물 체세포 집단을 형질전환시켜 텔로머라제 활성을 유지시키는 단계;
유전자 돌연변이 및 TERT 단백질의 이소성 발현을 갖는 마스터 세포 은행인 세포의 은행을 유지하는 단계;
배양된 세포 바이오매스인 생체외 환경에서 마스터 세포 은행으로부터 세포를 배양하는 단계;
식이 섭취를 위해 배양된 세포 바이오매스를 수확하는 단계를 포함하여 유도된 후생동물 체세포 집단의 클론 세포주로서,
클론 세포주는 산업 생산에서 확장 가능한 응용분야를 위한 무기한 복제 능을 갖는 클론 세포주. - 제 18 항에 있어서,
유전자 수정은 복제성 노화 동안 세포 주기의 망막모세포종 단백질 억제를 폐지하기 위해 후생동물 체세포 집단에서 CDKN2B 유전자(NCBI Gene ID: 395076)의 유전자 수정에 의해 p15 단백질을 불활성화시키는 단계를 포함하는 클론 세포주. - 제 19 항에 있어서,
유전자 수정은 CDKN2B 유전자의 엑손 1에서 보존된 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이인 클론 세포주. - 제 20 항에 있어서,
유전자 수정은 가이드 RNA를 사용하여 만들어진 삽입 돌연변이이고, 상기 가이드 RNA는 CDKN2B의 엑손 1을 표적으로 하는 가이드 RNA로 이루어진 그룹(SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4 및 5)으로부터 선택되며 CRISPR/Cas9를 사용하여 생성되는 클론 세포주. - 제 20 항에 있어서,
유전자 수정은 가이드 RNA를 사용하여 만들어진 결실 돌연변이이고, 상기 가이드 RNA는 CDKN2B의 엑손 1을 표적으로 하는 가이드 RNA로 이루어진 그룹(SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4 및 5)으로부터 선택되며 CRISPR/Cas9를 사용하여 생성되는 클론 세포주. - 제 18 항에 있어서,
마스터 세포 은행으로부터의 세포를 배양하는 것은 다음 단계를 추가로 포함하는 클론 세포주:
마스터 세포 은행으로부터 선택된 세포 집단을 확장하는 단계;
마스터 세포 은행 재고 목록에서 확장된 세포 집단을 냉동 보존 및 저장하고 생체외 환경에서 마스터 세포 은행 재고 목록에서 세포를 씨딩하고 배양하는 단계; 및
식이 섭취를 위해 배양된 세포 바이오매스를 수확하는 단계. - 제 19 항에 있어서,
후생동물 체세포 집단 종 정체는 적색야계이고 후생동물 체세포 집단 계통은 골격근인 클론 세포주. - 제 18 항에 있어서,
유전자 수정은 복제성 노화 동안 세포 주기의 망막모세포종 단백질 억제를 폐지하기 위해 후생동물 체세포 집단에서 CDKN2A 유전자(NCBI Gene ID: 616369)의 유전자 수정에 의해 p16 단백질을 불활성화시키는 단계를 포함하는 클론 세포주. - 제 25 항에 있어서,
유전자 수정은 CDKN2A 유전자의 엑손 2에서 보존된 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이인 클론 세포주. - 제 26 항에 있어서,
유전자 수정은 가이드 RNA를 사용하여 만들어진 삽입 돌연변이이고, 상기 가이드 RNA는 CDKN2A의 엑손 2를 표적으로 하는 가이드 RNA로 이루어진 그룹(SEQ ID NO. 8-10)으로부터 선택되며 CRISPR/Cas9를 사용하여 생성되는 클론 세포주. - 제 26 항에 있어서,
유전자 수정은 가이드 RNA를 사용하여 만들어진 결실 돌연변이이고, 상기 가이드 RNA는 CDKN2A의 엑손 2를 표적으로 하는 가이드 RNA로 이루어진 그룹(SEQ ID NO. 8-10)으로부터 선택되며 CRISPR/Cas9를 사용하여 생성되는 클론 세포주. - 제 25 항에 있어서,
마스터 세포 은행으로부터의 세포를 배양하는 것은 다음 단계를 추가로 포함하는 클론 세포주:
마스터 세포 은행으로부터 선택된 세포 집단을 확장하는 단계;
마스터 세포 은행 재고 목록에서 확장된 세포 집단을 냉동 보존 및 저장하고 생체외 환경에서 마스터 세포 은행 재고 목록에서 세포를 씨딩하고 배양하는 단계; 및
식이 섭취를 위해 배양된 세포 바이오매스를 수확하는 단계. - 제 25 항에 있어서,
후생동물 체세포 집단 종 정체는 소이고 후생동물 체세포 집단 계통은 골격근인 클론 세포주. - 제 18 항에 있어서,
유전자 수정은 CDK4 유전자(NCBI Gene ID: 510618)로부터, CDK4 단백질 상동체의 이소성 발현을 지시하는 유전자 구조체로 세포 집단을 변형시키는 단계를 추가로 포함하는 클론 세포주. - 제 31 항에 있어서,
마스터 세포 은행으로부터의 세포를 배양하는 것은 다음 단계를 추가로 포함하는 클론 세포주:
마스터 세포 은행으로부터 선택된 세포 집단을 확장하는 단계;
마스터 세포 은행 재고 목록에서 확장된 세포 집단을 냉동 보존 및 저장하고 생체외 환경에서 마스터 세포 은행 재고 목록에서 세포를 씨딩하고 배양하는 단계; 및
식이 섭취를 위해 배양된 세포 바이오매스를 수확하는 단계. - 제 31 항에 있어서,
후생동물 체세포 집단 종 정체는 적색야계이고 후생동물 체세포 집단 계통은 골격근인 클론 세포주. - 제 31 항에 있어서,
후생동물 세포 집단을 변형시키는 단계는 소 CDK4 유전자로부터 CDK4 단백질 상동체의 발현을 지시하는 유전자 구조체(SEQ ID NO 12)을 이용하는 클론 세포주.
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- 2021-12-08 US US17/545,632 patent/US20220251550A1/en active Pending
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