CN108779471A - 用于延长体细胞在离体培养过程中的复制能力的方法 - Google Patents

用于延长体细胞在离体培养过程中的复制能力的方法 Download PDF

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Abstract

一种用于使用靶向的基因修改来延长多细胞动物体细胞的复制能力的产品和方法，该基因修改用于消除在复制性衰老期间对细胞周期进程的抑制并且衍生用于多细胞动物细胞生物质的尺度放大应用和工业生产的克隆细胞系。使用靶向编码每种蛋白质的转录物的第一外显子的向导RNA进行的插入或缺失突变是使用CRISPR/Cas9产生的。靶向修改导致p15和p16蛋白的去活化，这增加了经修饰的细胞群相对于其未变异的亲代群体而言的增殖能力。将这些修改与来自指导TERT基因表达端粒酶蛋白同源物的基因构建体的辅助端粒酶活性组合时，该经修饰的细胞群的复制能力无限地增加。制造用于膳食消费的骨骼肌的一个应用是使用来自家禽物种原鸡(Gallus gallus)的细胞；另一个应用是来自家畜物种普通牛(Bos taurus)。

Description

用于延长体细胞在离体培养过程中的复制能力的方法
技术领域
本发明涉及：延长多细胞动物细胞的复制能力的产品和方法，其用于在工业生物工艺应用中可尺度放大的生物质制造过程。
背景技术
将近50年前首次述及，肌源性(即“肌肉形成的”)细胞系被用作理解骨骼肌生物学的基本模型。除基础研究外，肌肉(即成肌细胞)细胞系在生物机器人；生物人工肌肉构建物筛选药理化合物；治疗性纠正遗传性肌肉疾病；和离体生产用于膳食消费的可食用生物质中具有前瞻性的工业应用。从供体组织获得原代肌肉细胞作为动物生物质的商业尺度生产应用的细胞源需要技术的和材料的资源，这目前妨碍了面向应用的批量培养。此外，原代细胞复制的天然能力限制了：它们可以传代用于基因修改，或用于细胞建库和工业制造的规模尺度。为了解决这些挑战，本发明包括了基因修改，其延长了被定型为骨骼肌谱系的细胞的重生能力，以产生下文声称的“肌源性细胞系”。
通过本体上经谱系定型的表型，具有更广泛核型的基因组的稳定性，永久重生的能力，以及在体内表现出的、在其组织学对应物中存在的终末分化细胞的、功能性特征的潜力，鉴别出：全功能的细胞系、肌源性的或者其他类型。对于骨骼肌细胞系，这些特征中的一些包括：细胞融合、横纹肌原纤维发育和对化学刺激(诸如乙酰胆碱)的生理应答。
通过连续传代来自正常组织和突变组织，或分离自肿瘤的分离物，已经成功地衍生出一些骨骼肌细胞系。迄今为止，现有的肌源性的细胞系仍然表征不佳，常常具有不希望的性状，诸如基因组不稳定性、非整数倍性、分化能力受损以及其分子信号传导和转录网络的多向(pleotropic)变异。
永生化细胞系的可用选项仍然限于一组选定的祖先物种。大多数(如果不是全部的话)这些细胞系具有不利的特征，这些特征可能会降低：其对于需要代表所选择的祖先物种的种属特异性或高保真度的应用的功能适应性。例如，尚未实现：衍生出农业上重要的动物物种诸如牛、猪、鸡和鲑鱼的永生化的肌源性细胞系。现有的肌源性细胞系的选择主要限于生物医学研究中常用的模型物种，即鼠科动物和灵长类动物物种；但是这些细胞系作为产生用于食品的可食用生物质的祖源通常是不可接受的。
对于通过直接打靶导致复制性衰老的个体通路而建立肌源性细胞系的其他方法也是如此，前者诸如视网膜母细胞瘤家族蛋白(即p107、pRB、p130)介导的、对细胞周期进入的抑制、以及通过在连续细胞分裂周期期间缩短染色体末端的端粒DNA序列重复序列(TTAGGG)n引起的DNA损伤应答。例如，pRB功能的消除损害了肌源性细胞达到并维持终末分化状态的能力，并且前者单独地不足以维持它们的增殖能力。同样，通过过表达功能性端粒逆转录酶(“TERT”)对端粒酶活性的长期维持，通过抵消端粒侵蚀延长了原代成肌细胞的再生能力；它单独地不足以防止这些细胞的衰老。
在正常骨骼肌中，p107是在未分化的增殖成肌细胞中表达、并与E2F转录因子复合的显性视网膜母细胞瘤家族蛋白。在终末分化期间，成肌细胞退出细胞分裂周期并融合成多核肌管，其成熟为收缩性肌肉纤维。视网膜母细胞瘤家族蛋白pRB和p130在阻遏E2F指导的基因表达转录激活以在成肌细胞分化期间启动细胞周期退出并在肌管中维持有丝分裂后状态中的作用是由周期蛋白依赖性激酶抑制剂(“CKI”)指导的。但是在迄今为止建模和表征化的哺乳动物骨骼肌中，独立的CKI的功能不足以在终末分化期间阻止细胞周期。相反，由CKI(包括p21、p18、p27和p57)共同分担的作用在成肌细胞分化期间指导并稳定从细胞周期的退出。尚未就CKI的哪种组合足以有效执行这一作用并且为有效执行这一作用所必需达成共识。尽管有这一结论，但CKI蛋白p15和p16并未涉及这一作用。
CKI蛋白p16(也称为INK4A)是在哺乳动物中发现的CDKN2A基因的表达产物，该基因构成顺序CDKN2B和CDKN2A基因共有的INK4B-ARF-INK4A基因座的一部分。CDKN2A基因编码两种蛋白质ARF和p16的转录物，这两种蛋白质是从选择性剪接变体翻译而来。每种CDKN2A转录物的表达受不同启动子的调控。尽管ARF和p16蛋白由CDKN2A基因内的共有外显子编码，但是ARF转录物相对于p16转录物在选择性阅读框中转录，因此构成ARF和p16的氨基酸序列是完全不同的。CDKN2B基因编码p15蛋白(也称为INK4B)，其是在结构和功能上均类似于p16的CKI。
p15和p16是哺乳动物中存在的旁系同源物，其中CDKN2A基因被认为是由CDKN2B基因倍增产生的，这与多细胞动物系统发生之中的哺乳动物的趋异相一致。与p15不同，p16在复制性衰老期间充当哺乳动物中的显性CKI。
值得注意的是，已知裸鼹鼠(一种长寿的抗肿瘤啮齿动物)从将p15的第一外显子与p16的第二外显子和第三外显子桥接的转录剪接变体表达p15/p16杂合蛋白。在鱼类和鸟类中，INK4B-ARF-INK4A基因座的元件仅是部分保守的。在鸡基因组中，CDK2NA基因不编码p16蛋白；只编码p15和ARF蛋白。然而经测序和注释的鱼类基因组的特征为CDKN2B基因，CDKN2A基因不存在于这些基因组内。鸡p15蛋白在功能上与人p16蛋白相对应；当在人成纤维细胞中过表达时，两者均结合CDK4/6并限制细胞周期进程。此外，p15可促进鸡成纤维细胞中的复制性衰老。
此外，永生肌源性鼠科C2C12细胞系内的缺失突变，特别是INK4B-ARF-INK4A基因座中的缺失突变消除了p16和ARF的表达。然而迄今为止报道的肌源性细胞系尚未通过对INK4B-ARF-INK4A基因座的靶向的、非随机的基因修改而生成。相反，p16蛋白在人肌源性细胞中的阻遏性CKI功能已被CDK4(即周期蛋白依赖性激酶4)蛋白的异位过表达部分地战胜，以克服衰老并衍生出细胞系。
其他方法诸如对p16和p15功能的短发夹RNA(shRNA)沉默尚未被证实支持能够衍生出延长传代的肌源性细胞系。尚未报道用于从鱼类、家禽和家畜物种产生骨骼肌细胞系的非随机方法。迄今为止，动物的生物质尚未在商业上通过离体培养来制造用于膳食消费。已经记载了由动物的生物质制造的各种食品原型。然而，用于制造这些原型的细胞原种限于由细胞原种遗传程序所允许的扩增的规模尺度，上述遗传程序在所使用的正常体细胞中引起复制性衰老。
避免复制性衰老的一种方法采用了：指导先前建立的多能性或非肌源性细胞系的在本体上的谱系定型(ontological lineage commitment)，该细胞系具有对肌源性谱系的无限的重生能力。参见美国专利申请第15/134,252号，将其以引用的方式并入本文。相比之下，本文描述的替代方法是一个相反的做法，其无限地延长经谱系定型的肌肉细胞的复制能力，以便生成肌源细胞用于膳食消费和工业生物工艺应用的可尺度放大的生物质制造过程。
发明内容
本发明是将基因修改用于通过以下方式延长多细胞动物体细胞的复制能力的产品和方法：在增殖期间而不是在分化期间去除视网膜母细胞瘤蛋白对细胞周期的抑制；同时维持端粒酶活性，以减少或消除正常的、未经修饰的体细胞的复制性衰老表征，并且衍生出克隆细胞系用于多细胞动物细胞生物质在工业生产中的尺度放大的应用。
在本发明的一个实例中，当该应用是被制造用于膳食消费的生物质时，细胞的物种身份是原鸡(Gallus gallus)，细胞的谱系是骨骼肌。在一个实施方案中，本发明的基因修改构成了代表CDK4“INK4”CKI同源物p15和p16的抑制剂(它们是周期蛋白依赖性激酶4“CDK4”的抑制剂(因此它们的名称为CDK4的抑制剂))的蛋白质的直接去活化。通过使编码由INK4B-ARF-INK4A基因座编码的INK4蛋白的保守核苷酸序列突变来实现p15和p16的去活化，以延长靶细胞群的增殖能力。
具体而言，CDKN2B基因的第一外显子被打靶以破坏从原鸡(Gallus gallus)骨骼肌分离的原代细胞群内的p15蛋白。使用成簇规律间隔短回文重复序列-Cas9(CRISPR/Cas9)产生使用打靶第一外显子的向导RNA的插入或缺失突变(INDEL)。这证明了：单独破坏CDKN2B基因座足以增加经修饰的细胞群相对于其未变异的亲代群体而言的增殖能力。
尽管如此，当这些修改与来自指导端粒酶蛋白同源物(例如，由异位TERT基因)的表达的基因构建体的辅助端粒酶活性组合时，经修饰的细胞群的复制能力无限地增加。相对于未经变异的原代细胞群对增殖和衰老的指标进行评分，以验证该方法。
出于若干个原因而选择雌性原鸡(Gallus gallus)物种核型的细胞来对该方法建模。首先，原鸡(Gallus gallus)的雌性核型构成了异配性别。由于CDKN2B等位基因位于原鸡(Gallus gallus)的性染色体上，因此打靶仅一个等位基因使得该基因组在雌性动物中是无合子(nullizygotic)的。其次，原鸡(Gallus gallus)基因组缺乏编码p16蛋白的哺乳动物CDKN2A基因的直向同源物。因此，仅使一个INK4编码基因去活化是消除该模型中所有p15/p16活性所必需的。
附图说明
图1示出含有基因(示出的实例：血清白蛋白)的转基因DNA序列的插入，该基因之前是活性调控区(示出的实例：结蛋白启动子)并在该活性调控区的调控下。
图2示出含有活性调控区(示出的实例：结蛋白启动子)的转基因DNA序列的插入，该活性调控区用于调控基因组的内源性靶基因(示出的实例：血清白蛋白)的表达。
图3示出了通过INDEL或点突变对内源性调控区(示出的实例：血清白蛋白启动子)DNA序列的基因修改，该基因修改用于激活调控区(示出的实例：血清白蛋白基因)。
图4示出了代表靶基因(示出的实例：血清白蛋白基因)的转基因DNA序列的插入，以在具有组织特异性活性的内源性5'调控区(示出的实例：肌生成抑制素启动子)的调控下表达，并且平行破坏调控区对插入的DNA序列(示出的实例：肌生成抑制素基因)3'的内源性基因的激活。
图5示出了表观遗传或转录程序诱导性修改，其用于对来自靶基因的启动子区(示出的实例：血清白蛋白启动子和基因)的基因表达的靶向激活，该靶向激活是单独的或与通过基因序列靶向激活系链对来自调控区之外的增强子的基因表达的激活组合。出于示例性目的，示出了代表CRISPRa(即CRISPR激活)的模式。
图6示出了表观遗传或转录程序遏制性修饰，其用于通过DNA序列靶向的阻遏系链对来自靶基因的调控区或直接来自靶基因的编码序列的基因表达的靶向阻遏(示出的实例：血清白蛋白启动子和基因)。出于示例性目的，示出了代表CRISPRi(即CRISPR干扰)的模式。
图7示出了通过INDEL或点突变对内源性调控区(示出的实例：肌生成抑制素启动子)或靶基因编码序列(诸如起始密码子)的基因修改，以沉默或破坏内源性靶基因(示出的实例：肌生成抑制素基因)的表达。
图8示出含有shRNA编码区(示出的实例：肌生成抑制素shRNA)的转基因DNA序列的插入，该编码区之前是活性调控区(示出的实例：结蛋白启动子)并在该活性调控区的调控下。
图9示出了p16和p15氨基酸比对：a.在代表性的哺乳动物：鼠(小家鼠(Musmusculus)；SEQ ID NO 17)、牛(普通牛(Bos taurus)；SEQ ID NO 18)和猪(野猪(Susscrofa)；SEQ ID NO 19)p16直向同源物内的预测氨基酸序列同源性之间的保守性(图A)；b.在代表性多细胞动物：鹑鸡(原鸡(Gallus gallus)；SEQ ID NO 20)、鼠(小家鼠(Musmusculus)；SEQ ID NO 21)、牛(普通牛(Bos taurus)；SEQ ID NO 23)、猪(野猪(Susscrofa)；SEQ ID NO 22)、鲑(虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)；SEQ ID NO 24)和慈鲷(罗非鱼(Oreochromis niloticus)；SEQ ID NO 25)p15直向同源物内的预测氨基酸序列同源性之间的保守性(图B)。
具体实施方式
本发明的基因修改解除了在复制性衰老期间视网膜母细胞瘤蛋白对细胞分裂周期推进的抑制。这通过去除CKI介导的对视网膜母细胞瘤蛋白的稳定化来实现，如示例性的实施方案中所示。我们公开了三个示例性的实施方案：(I)通过经由编码序列的靶向突变而破坏CDKN2B基因使p15蛋白去活化；(II)通过经由编码序列的靶向突变而破坏CDKN2A基因使p16蛋白去活化；以及(III)通过过表达周期蛋白依赖性激酶同源物去除内源性CKI介导的对视网膜母细胞瘤蛋白对细胞分裂周期进程的抑制的稳定化。这些修改，单独地或与由异位基因构建体指导的端粒酶的辅助过表达相组合，延长了经修改的多细胞动物细胞的复制能力。
图1-5中示出的是用于基因的靶向转录激活的诱导性修改的五个示例性模型和用于基因产物的靶向遏制的遏制性修改的四个示例性模型(图4、6-8)。在图1-8中，G是指天然基因组DNA序列，并且T指外源转基因DNA序列。应注意，图4可以表示对引入的转基因的诱导性修改和对从其天然启动子分离的内源性基因的遏制性修改。出于该实例的目的，野生型宿主细胞组织的谱系是肌生成抑制素+/结蛋白+骨骼肌。出于说明性目的，箭头指示通过INDEL或点突变在启动子和/或基因的DNA序列内的基因修改的示例性区域。ROSA26指示了示例性的、转录上有活性的修改基因座。前述修改可以包括，例如，对内源性的或未经修饰基因的、表观遗传的或转录程序的变异。
在通常被认为归类为家畜的物种之中，蛋白质p16的预测氨基酸序列在很大程度上是保守的，其中普通牛(Bos taurus)(SEQ ID NO 18)与野猪(Sus scrofa)(SEQ ID NO19)之间具有82％的成对同一性。同样，在归类为家畜和海产品的物种之中，蛋白质p15的氨基酸序列的保守性如下：普通牛(Bos taurus)(SEQ ID NO23)与野猪(Sus scrofa)(SEQ IDNO 22)之间的成对同一性为92％，虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)(SEQ ID NO 24)与罗非鱼(Oreochromis niloticus)(SEQ ID NO 25)之间为60％。此外，在p15基因座处比较所有家畜、家禽和海产品(如图9所示，图B)，基因组比对揭示存在58％成对同一性(原鸡(Gallusgallus)，SEQ ID NO 20；小家鼠(Mus musculus)，SEQ ID NO 21；普通牛(Bos taurus)，SEQID NO 23；野猪(Sus scrofa)，SEQ ID NO 22；虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)，SEQ ID NO24；和罗非鱼(Oreochromis niloticus)，SEQ ID NO 25)。
图9展示了p16和p15氨基酸比对：a.在代表性哺乳动物：鼠(小家鼠(Musmusculus)；SEQ ID NO 17)、牛(普通牛(Bos taurus)；SEQ ID NO 18)和猪(野猪(Susscrofa)；SEQ ID NO 19)p16直向同源物内的氨基酸序列同源性之间的保守性(图A)；b.在代表性多细胞动物：鹑鸡(原鸡(Gallus gallus)；SEQ ID NO 20)、鼠(小家鼠(Musmusculus)；SEQ ID NO 21)、牛(普通牛(Bos taurus)；SEQ ID NO 23)、猪(野猪(Susscrofa)；SEQ ID NO 22)、鲑(虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)；SEQ ID NO 24)和慈鲷(罗非鱼(Oreochromis niloticus)；SEQ ID NO 25)p15直向同源物内的氨基酸序列同源性之间的保守性(图B)。变暗的区域指示了保守性的程度(即同一性和相似性)：黑色阴影指示100％相似性，灰色指示60％-80％相似性并且白色表示小于60％的相似性，它们基于Blosum 62评分矩阵(Geneious R10中产生的图像和评分)(http://www.geneious.com，Kearse等人,2012)。
总而言之，这些直向同源物展示了在分类为家畜、家禽和海产品的物种之中，本发明的实施方案所靶向的p15和p16直向同源物的保守氨基酸序列同源性。应注意的是，带注释的鱼类和禽类基因组缺乏p16直向同源物。因此预测：作为本发明中靶向应用的平台，在禽类、哺乳动物和鱼类物质中的p15介导的功能完整性是保守的，并且在哺乳动物物种中p16介导的功能完整性是保守的。
<第一个示例性的实施方案：通过CDKN2B基因座的基因修改和TERT的异位表达延迟复制性衰老>
(A)通过CDKN2B基因座的基因修改延迟复制性衰老
总之，该第一个示例性的实施方案使用CRISPR/Cas9破坏了从原鸡(Gallusgallus)骨骼肌分离的原代成肌细胞群内编码p15蛋白的CDKN2B基因座，以生成利用向导RNA(gRNA)(SEQ ID NO 1-5)而打靶CDKN2B(NCBI登录号：NM_204433.1)的外显子#1的INDEL。虽然单独破坏CDKN2B基因座提供了益处，但是当与来自指导TERT基因(NCBI登录号：NM_001031007.1；NCBI基因ID：420972)表达端粒酶蛋白同源物的基因构建体(SEQ ID NO6)的辅助端粒酶活性相组合时，经修饰的细胞群的复制能力无限地增加。对CDKN2B的靶向去活化是一种新方法。
一般地说，第一实施方案以五步法延长了离体培养的多细胞动物体细胞的天然复制能力：(1)通过使p15蛋白去活化在增殖期间而不是在分化期间去除视网膜母细胞瘤蛋白对细胞周期的抑制，来解除在复制性衰老中视网膜母细胞瘤蛋白对细胞分裂周期推进的抑制；(2)通过用指导由功能性TERT基因对端粒酶蛋白同源物的表达(“TERT的异位表达”)的基因构建体转导多细胞动物体细胞来维持端粒酶活性，以减少正常的、未经修饰的多细胞动物体细胞的复制性衰老表征；(3)维持具有CDKN2B基因突变和TERT异位表达的细胞库(即“主细胞库”)；(4)在离体环境中培养来自主细胞库的细胞；并且(5)收获被培养的细胞生物质用于膳食消费。
更具体地并且在一个实施方案中，编码p15蛋白的CDKN2B基因(NCBI登录号：NM_204433.1)的第一外显子被打靶用于基因修改，其使用gRNA靶向的CRISPR/Cas9(gRNA SEQID NO 1-5)来在原鸡(Gallus gallus)细胞群的基因组内的CDKN2B基因的第一外显子内插入突变。有关这些实例所用方法的更详细讨论，请见于下面的材料和方法部分A、B、D、E和F。
示例性的实施方案I采用图7中所示的用于破坏内源性p15蛋白的功能的模型。具体而言，图7中所示的模型可以适用于本发明，其中内源性基因表达通过起始密码子或能够转录激活的调控区序列的突变而被破坏。可替代地，可以通过在起始密码子后引入移码突变来破坏内源性基因功能。例如，应用于本发明时，图7中所示的模型可以表示：通过使用CRISPR/Cas9靶向的核酸酶活性引入到CDKN2B基因的5'(5-prime)编码序列中的INDEL突变对p15功能的阻遏。
(B)异位TERT基因的表达
如实施方案I-A中所述那样修饰的细胞也可以用指导TERT基因(NCBI登录号：NM_001031007.1；NCBI基因ID：420972)表达端粒酶蛋白同源物的基因构建体修饰。此举之后，针对特征为通过指导端粒酶蛋白同源物表达的基因构建体进行的基因修改的细胞，从用指导TERT基因表达端粒酶蛋白同源物的基因构建体(SEQ ID NO 6)转导的这个群体中选择细胞。
示例性的实施方案I利用图1中所示的用于异位TERT基因的表达的模型。具体而言，图1中所示的模型可以适用于本发明，其中异位基因在外源启动子的调控下表达。例如，应用于本发明时，图1中所示的模型可以表示：从引入的CAG启动子表达异位的TERT基因。
图2中所示的模型可以适用于本发明，其中内源性基因在外源启动子的调控下表达。例如，应用于本创新时，图2中所示的模型还可以表示：从引入的CAG启动子表达内源性的TERT基因。
图3中所示的模型可以适用于本发明，其中基因表达通过其调控序列的靶向突变来进行变异。例如，应用于本发明时，图3中所示的模型可以表示：从内源性TERT启动子表达内源性的TERT基因，其中TERT启动子内的阻遏物结合位点已经被突变破坏。
图4中所示的模型可以适用于本发明，其中外源基因的表达在插入在基因的3'(3-prime)末端处的内源性启动子的调控下表达。例如，应用于本发明时，图4中所示的模型可以表示：从内源性β-肌动蛋白启动子表达外源性的TERT基因。
图5中所示的模型可以适用于本发明，其中内源性基因的表达通过打靶基因序列的激活系连(tethering)从启动子处激活转录。例如，应用于本发明时，图5中所示的模型可以表示：通过打靶TERT启动子的CRISPRa对内源性TERT基因的诱导。示例性的CRISPRa模式包括但不限于：由通过单一gRNA打靶靶基因调控区的、核酸酶缺陷型Cas9蛋白介导的激活。在CRISPRa范围之外，该诱导性修改机制的模式涵盖了打靶基因序列的激活系连，包括但不限于：核酸酶缺陷型锌指核酸酶(ZFN)和核酸酶缺陷型转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)。
图6中所示的模型可以适用于本发明，其中内源性基因的表达通过基因序列靶向的阻遏系连被从启动子阻遏转录。例如，应用于本发明时，图6中所示的模型可以表示通过打靶CDKN2B启动子的CRISPRi对内源性CDKN2B的阻遏。示例性的CRISPRi阻遏模式包括但不限于：由通过单一gRNA打靶调控区或基因的核酸酶缺陷型Cas9蛋白介导的阻遏。在CRISPRi范围之外，该遏制性修饰机制的模式涵盖了打靶DNA序列的阻遏系连，包括但不限于：核酸酶缺陷型ZFN和核酸酶缺陷型TALEN。
有关这些实例所用方法的更详细讨论，请见于下面的段落C、G、H和I中的材料和方法；应注意，在该示例性的实施方案中，该制造方法可以使用上文在I-B部分中描述的相同制造方法来完成。
(C)制造用于膳食消费的生物质
在一个实施方案中，制造用于膳食消费的生物质包括四个步骤：(1)对具有针对CDKN2B基因座的基因修改和/或TERT的异位表达的所选择的细胞群进行扩增；(2)将扩增的细胞群低温保存并储存在主细胞库库存(stock inventory)中；(3)在离体环境中接种和培养来自主细胞库库存的细胞；并且(4)收获培养的细胞生物质用于膳食消费。
步骤1是对具有针对CDKN2B基因座的基因修改的所选择的细胞群进行扩增。将具有基因修改的所选择的细胞群以7.5×103个细胞/cm2的密度接种到在含有10％动物血清的标准生长培养基(诸如但不限于牛血清加上基础培养基)中的由明胶包被的组织培养物处理的塑料构成的基质上，并且在37℃下、在5％二氧化碳、5％氧气的气氛下培养。当培养物接近80％汇合时，细胞被酶法分离，并且将扩增数量的细胞以7.5×103个细胞/cm2接种。重复该过程直到解离后收获的细胞总数超过1.0×108个细胞。
步骤2是将扩增的细胞群低温保存并储存在主细胞库库存中。收获的细胞数量等于或超过1.0×108。扩增后，通过以300×g离心5分钟来沉淀所选择的细胞。将细胞沉淀以2.5×106个细胞/mL悬浮于标准低温保存培养基中，并按每个冷冻小瓶1.0mL进行等分。使用受控制的冷却容器以1℃/分钟将冷冻小瓶冷却至-80℃并转移至含有液氮的杜瓦瓶中以进行长期储存。当从该库中耗尽细胞原液时，将剩余小瓶的细胞如实施方案I-B-1中所述那样进行扩增，并且如实施方案I-B-2中所述那样进行低温保存，以补充和扩增主细胞库存。
步骤3是在离体环境中接种和培养来自主细胞库的细胞：根据所需的培养规模尺度，将来自主细胞库的一个或多个小瓶快速解冻至室温。通过5分钟、300×g的离心步骤从细胞中除去低温保存培养基。如实施方案I-B-1中所概述，将细胞悬浮于标准生长培养基中，并且接种到标准生长培养基中的明胶包被的培养基质上并进行培养，不同之处在于，在收获前的最后一次传代中，允许细胞在细胞培养基质上增殖至等于或大于100％汇合。根据表1，概述了用于收获生物质的培养规模尺度，其中估计的平均细胞质量为2.0×10-9克，并且估计的平均细胞倍增时间为24小时(h)。
表1.
#小时 1个小瓶 2个小瓶 3个小瓶 4个小瓶 5个小瓶 6个小瓶 7个小瓶 8个小瓶 9个小瓶 10个小瓶
0h 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0.05
24h 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1
48h 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2
72h 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 0.24 0.28 0.32 0.36 0.4
96h 0.08 0.16 0.24 0.32 0.4 0.48 0.56 0.64 0.72 0.8
120h 0.16 0.32 0.48 0.64 0.8 0.96 1.12 1.28 1.44 1.6
144h 0.32 0.64 0.96 1.28 1.6 1.92 2.24 2.56 2.88 3.2
168h 0.64 1.28 1.92 2.56 3.2 3.84 4.48 5.12 5.76 6.4
192h 1.28 2.56 3.84 5.12 6.4 7.68 8.96 10.24 11.52 12.8
216h 2.56 5.12 7.68 10.24 12.8 15.36 17.92 20.48 23.04 25.6
240h 5.12 10.24 15.36 20.48 25.6 30.72 35.84 40.96 46.08 51.2
264h 10.24 20.48 30.72 40.96 51.2 61.44 71.68 81.92 92.16 102.4
288h 20.48 40.96 61.44 81.92 102.4 122.88 143.36 163.84 184.32 204.8
312h 40.96 81.92 122.88 163.84 204.8 245.76 286.72 327.68 368.64 409.6
336h 81.92 163.84 245.76 327.68 409.6 491.52 573.44 655.36 737.28 819.2
表1示出了以生产规模尺度培养生物质的产量估计值。质量以克为单位示出。1个小瓶相当于～2.5×106个细胞。
步骤4是收获培养的细胞生物质用于膳食消费。在细胞增殖至汇合后，除去培养基并用磷酸盐缓冲盐水冲洗粘附细胞培养物。接下来，通过刮擦装置将粘附细胞的汇合生物质从基质上以机械方式分离。将分离的生物质收集到离心管中，以400×g沉淀5分钟，除去过量的液体并加工用于食品产品制剂。
<第二个示例性的实施方案：通过CDKN2A基因座的基因修改和TERT的异位表达延迟复制性衰老>
总之，第二个示例性的实施方案使用CRISPR/Cas9破坏了多细胞动物体细胞群(其是从普通牛(Bos taurus)骨骼肌分离的原代成肌细胞群)内的编码p16蛋白的CDKN2A基因座，以产生使用gRNA(SEQ ID NO 8-10)打靶编码p16的CDKN2A序列第一外显子的INDEL突变。普通牛(Bos taurus)的基因CDKN2A具有两个预测的剪接变体(NCBI登录号：XM_010807759.2、XM_010807758.1)，其中编码p16的第一外显子是CDKN2A的外显子#2。虽然单独破坏CDKN2A基因座提供了复制上的益处，但是当与来自指导相同细胞群中TERT基因(NCBI登录号：NM_001046242.1；NCBI基因ID 518884)表达端粒酶蛋白同源物的合成基因构建体(SEQ ID NO 11)的辅助端粒酶活性相组合时，两种修改的协同作用可以相比于任一种单独修改进一步地增加经修饰的细胞群的复制能力。普通牛(Bos taurus)的物种基因组特征为CDKN2A基因，其预测的转录物编码p16(NCBI登录号：XM_010807759.2)。换句话说，基因修改是使用打靶CDKN2A基因外显子2(即，编码p16的基因序列的外显子1)的向导RNA对CDKN2A基因外显子2(即编码p16的基因序列的外显子1)中的保守核苷酸序列的突变，并使用CRISPR/Cas9产生。破坏预测的p16编码序列内的CDKN2A基因座是本申请中的新方法。有关这些实例所用方法的更详细讨论，请参见材料和方法部分A、B、C、D、E、F、G、H和I。
在所有其他方面，第二个示例性的实施方案遵循第一个示例性的实施方案中概述的方法以在离体培养过程中制造用于膳食消费的生物质，该方法包括：(1)在增殖期间而不是在分化期间通过使p15蛋白去活化以去除视网膜母细胞瘤蛋白对细胞周期的抑制，来解除在复制性衰老中视网膜母细胞瘤蛋白对细胞分裂周期推进的抑制；(2)通过用指导功能性TERT基因表达端粒酶蛋白同源物(“TERT的异位表达”)的基因构建体转导多细胞动物体细胞来维持端粒酶活性，以减少正常的、未经修饰的多细胞动物体细胞的复制性衰老表征；(3)维持具有CDKN2A基因座突变和TERT异位表达的细胞库(“主细胞库”)；(4)在离体环境中培养来自主细胞库的细胞；并且(5)收获培养的细胞生物质用于膳食消费。
示例性的实施方案II采用了图7中所示的用于破坏内源性p16蛋白的功能的模型；并且示例性的实施方案II采用了图1中所示的用于异位TERT基因表达的模型。
<第三个示例性的实施方案：通过异位周期蛋白依赖性激酶和异位TERT的表达延迟复制性衰老>
一般地说，第三个示例性的实施方案通过异位过表达周期蛋白依赖性激酶同源物；具体而言，使用指导CDK4基因(NCBI基因ID：510618)异位表达CDK4蛋白同源物的基因构建体修饰细胞消除在复制性衰老期间周期蛋白依赖性激酶抑制剂介导的对视网膜母细胞瘤蛋白对细胞分裂周期的抑制的稳定化。通过添加来自指导TERT基因(NCBI基因ID：518884)过表达端粒酶蛋白同源物的基因构建体的辅助端粒酶活性可以实现附加益处。端粒酶蛋白同源物的过表达增加了经修饰的细胞群相对于其未经修饰的亲代群体的复制能力。
更具体地并且在一个实施方案中，选择原鸡(Gallus gallus)来使用指导周期蛋白依赖性激酶基因异位表达周期蛋白依赖性激酶蛋白同源物的基因构建体对家禽骨骼肌细胞进行修饰建模；维持了具有指导周期蛋白依赖性激酶基因异位表达周期蛋白依赖性激酶蛋白同源物的基因构建体的细胞的主细胞库库存。所述多细胞动物细胞群的转导是用指导由普通牛(Bos taurus)CDK4基因(NCBI登录号：NM_001037594.2；NCBI基因ID：510618)表达CDK4蛋白同源物的基因构建体(SEQ ID NO 12)。有关这些实例所用方法的更详细讨论，请参见材料和方法部分C、G、H和I。
制造用于膳食消费的生物质和用指导TERT基因表达端粒酶蛋白同源物的基因构建体(SEQ ID NO 11)修饰多细胞动物细胞群的细胞遵循上文在第一个示例性的实施方案中描述的方法。
示例性的实施方案III采用图1中所示的用于异位CDK4基因的表达的模型。示例性的实施方案III采用图1中所示的用于异位TERT基因的表达的模型。
<材料和方法>
(A)靶基因座的测序
针对每种物种，用E.Z.N.A组织DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek)从原代细胞分离物中提取基因组DNA。使用被设计用于扩增来自原鸡(Gallus gallus)的内源性CDKN2B和来自普通牛(Bos taurus)的内源性CDKN2A的引物来PCR扩增基因组DNA。
在原鸡(Gallus gallus)中，推定启动子区域和CDKN2B使用引物SEQ ID NO 26-31进行PCR扩增；参见提供有关引物靶细节的下表2。在普通牛(Bos taurus)中，推定启动子区域和CDKN2A使用引物SEQ ID NO 32-43进行PCR扩增；关于有关引物靶的细节参见下表2。
表2.
表2示出了gRNA和引物序列的细节。
使用凝胶电泳(1％琼脂糖以10W/cm运行)将PCR产物与经由计算机模拟预测的序列大小进行比较。为了确定CDKN2A和CDKN2B的基因组序列，将各自的PCR产物使用商业磁珠试剂盒纯化并且进行Sanger测序。测序引物与用于扩增初始PCR产物的引物相同。所有PCR引物均使用Primer3 2.3.7(Untergasser等人，2012)的修改版本设计，该修改版本可在Geneious R10(http://www.geneious.com，Kearse等人,2012)中获得，使用针对原鸡(Gallus gallus)CDK N2B(NCBI登录号NM_204433.1)和普通牛(Bos taurus)CDKN2A(NCBI登录号：XM_010807759.2)的参考序列。使用针对每种物种的参考染色体组装(对于普通牛(Bos taurus)NCBI登录号：AC_000165，对于原鸡(Gallus gallus)NCBI登录号：NC_006127)来设计扩增每个基因的推定启动子区的引物。
(B)gRNA的设计
使用CRISPR/Cas9来破坏普通牛(Gallus gallus)基因组中的CDKN2A的p16和原鸡(Gallus gallus)基因组中的CDKN2B的p15。使用Geneious R10(http://www.geneious.com，Kearse等人，2012)中的“寻找CRISPR位点(Find CRISPR Sites)”功能设计用于CRISPR/Cas9的合适gRNA。对于每种物种使用根据NCBI的最新参考基因组筛选脱靶效应：原鸡(Gallus gallus)-5.0(NCBI RefSeq组件登录号：GCF_000002315.4.)和普通牛(Bos taurus)v3.1.1(NCBI RefSeq组装登录号：GCF_000003055.6)。只有具有脱靶评分>90％的gRNA才被考虑用于合成。选择用于合成的向导RNA序列包括但不限于针对原鸡(Gallus gallus)的SEQ ID NO 1-5和针对普通牛(Bos taurus)的SEQ ID NO 8-10。由第三方供应商为每个选择的gRNA构建、扩增和纯化单独的pGS-gRNA载体。待与每种gRNA质粒共转染的pSpCas9PX165载体也来源于第三方供应商。
(C)合成构建体的设计
将巨细胞病毒、鸡β-肌动蛋白、兔β-球蛋白(CAG)调控元件(Alexopoulou,Couchman和Whiteford 2008)用于促进所有引入的合成构建体的稳健表达。从NCBI检索到原鸡(Gallus gallus)TERT参考序列(NCBI登录号：NM_001031007.1)。对于每种转录物变体(NM_001031007.1和XM_015282334.1)，提取编码DNA序列(CDS)区并将其连接成串联序列。然后在Geneious R10(http://www.geneious.com，Kearse等人，2012)中将CAG调控元件连接到每种转录物变体的CDS的5'端。由商业供应商将全长的合成构建体SEQ ID NO 6和SEQID NO 7组装并克隆到哺乳动物表达载体中。此处描述的策略也用于产生合成TERT构建体的牛版本。使用参考序列(NCBI登录号：NM_001046242.1)设计普通牛(Bos taurus)的TERT构建体(SEQ ID NO 11)。
为了驱动牛细胞中的CDK4的强表达，使用上述方法产生另一组合成构建体。从NCBI检索到普通牛(Bos taurus)CDK4参考序列(NCBI登录号：NM_001037594.2)。对于野生型和突变体序列，提取CDS区并将其连接成串联序列。由第三供应商将合成构建体SEQ IDNO 12组装并克隆到哺乳动物表达载体中。
(D)用于原鸡(Gallus gallus)CDKN2B或普通牛(Bos taurus)CDKN2A的INDEL诱变的CRISPR/Cas9细胞转染
为了进行靶向INDEL诱变，将由通过质粒编码的CRISPR/Cas9蛋白识别的gRNA序列进行合成、扩增和纯化用于转染。质粒DNA含有标准载体骨架，其含有用于在原核系统中扩增的必需调控元件。每个质粒还含有在每个靶细胞群内瞬时表达gRNA或Cas9蛋白所必需的调控区和编码区，以在5'调控区、编码区或两者内引起INDEL突变形成。
质粒DNA构建体的递送由非脂质体DNA复合物形成的转染试剂(Fugene HD，Promega)介导，该转染试剂直接递送至悬浮液中和粘附期间的原代细胞分离物。将打靶编码p15的原鸡(Gallus gallus)CDKN2B基因的5'区域的gRNA或编码p16的普通牛(Bostaurus)CDKN2A基因的5'区域的gRNA设计用于从转染的质粒表达。通过利用Grunwald和Speer(2007)的方案(Biochemica 3/2007，第26-27页)的修改版本来完成转染用于原代人骨骼肌成肌细胞的靶向修改。将制备的质粒DNA在无菌去离子水中稀释至1μg/μL的工作浓度。针对2μg的总DNA量将每种质粒DNA原液等分(按2:1比例的Cas9质粒DNA:gRNA质粒)，并且通过研磨充分混合。将总DNA在无菌去离子水中稀释至1μg/50μL的浓度。将Fugene HD以6:2的比例(Fugene HD试剂(以μL计):总DNA(以μg计))添加到DNA混合物中并充分混合。
将混合物在室温下温育15分钟以促进与DNA的复合。通过添加等体积的无菌去离子水稀释温育的DNA混合物。然后将该全部反应混合物滴加到悬浮液中的细胞。将细胞和DNA反应混合物在37℃下、在5％CO2、5％O2的气氛条件下温育16小时。
将靶细胞群维持在组织培养物处理的塑料(6孔板)上的增殖培养基中。以4×105个细胞/ml培养基的密度维持细胞。在转染之前，无菌去除细胞培养基，将细胞在1×PBS中洗涤，然后在37℃下暴露于1×解离试剂(TrypLE-Gibco)3分钟。通过添加等体积的增殖培养基终止反应，然后进行温和研磨。然后将细胞转移至0.1％明胶包被的孔中。此时，添加DNA转染反应复合物，并且在进一步处理和评价之前48小时，将细胞在37℃下、在5％CO2、5％O2下温育48小时。
(E)对打靶CDKN2B或CDKN2A的转染细胞的有限稀释
通过首先从经历一个转染循环的亲代细胞池中分离单个克隆细胞群来选择先前使用CRISPR/Cas9gRNA转染的细胞群。使用有限稀释法选择细胞。将转染的细胞酶促分离成单细胞悬浮液。产生2×104个细胞/mL增殖培养基的工作原液，总体积为500μL。将组织培养物处理的96孔板中的每个孔包被在0.1％明胶中。除A1孔外，每个孔预先填充有100μL的增殖培养基。将4×103个细胞(200uL)无菌转移至组织培养物处理的96孔板的0.1％明胶包被的A1孔中。将A1孔的一半体积(100μL)立即转移至B1孔并充分混合。从C1至H1孔重复该稀释系列(1:2)。在接收细胞后，从H1孔中移去100μL并丢弃。向从A1-H1的每个孔中添加100μL无细胞增殖培养基并充分混合。接下来，将孔A1中的一半体积转移至A2孔并充分混合。从A2到A12重复该过程。从B1孔开始再次重复稀释系列并继续至B12。对于C至H行重复这整个过程，直到整个板(所有96个孔)都接收到稀释体积的细胞。为了完成稀释系列，将第12列中的每个孔移去一半(100μL)并将其丢弃。第2至12列中的每个孔各自都添加100μL无细胞增殖培养基，以使板上每个孔的最终体积达到200μL。将整个板在37℃下在低氧下温育，直到出现单个细胞集落(大于或等于10倍细胞倍增或1,024个细胞)。将看来具有源自单个分离细胞的孔分解至单个细胞，并且1:1传代到0.1％明胶包被的24孔板的一个孔中并在37℃下、在5％CO2、5％O2气氛条件下温育。一旦90％汇合，将细胞扩增至12孔板，然后是6孔板。
然后将通过有限稀释分离出的、并在6孔板中扩增至90％汇合的细胞1:4传代到6孔板中。然后处理90％汇合的孔用于进一步的评价。将一个孔分解至单个细胞、进行洗涤并以300×g沉淀5分钟。将总的细胞基因组DNA分离并进行定量。然后对总的基因组DNA进行CDKN2B或CDKN2A基因座的PCR扩增，并在1％琼脂糖凝胶上以10W/cm运行直到解析出来。然后从琼脂糖凝胶中提取这些PCR产物并用于Sanger测序。将序列描图与先前验证的野生型的、未经处理的亲代细胞群CDKN2B或CDKN2A遗传序列进行比较。
(F)细胞增殖和衰老测定(EdU方法)
然后通过标准EdU测定来评价在打靶p15功能的原鸡(Gallus gallus)CDKN2B基因或打靶p16功能的普通牛(Bos taurus)CDKN2A基因的5'区域中展示出INDEL突变形成的细胞群的功能上的和表型的表征。将被确定具有正确INDEL破坏的基因并且为纯克隆性的细胞群与野生型细胞一起以相等的密度接种，该野生型细胞未接受过先前的CRISPR/Cas9打靶，并且具有与INDEL修改细胞相同的细胞群倍增数。使每种细胞类型在37℃下、在5％CO2、5％O2气氛条件下温育24小时。然后，将标准胸苷类似物试剂(EdU)添加到培养基(Click-ItAlexa 488EdU试剂盒，Thermo-Fisher)，并且将细胞在37℃下、在5％CO2、5％O2气氛条件下温育4小时。温育后，将细胞洗涤、固定、透化，并且使用抗EdU Alexa 488-缀合的叠氮化物探测。使用标准DAPI核染色实现核对比染色。然后，在标准488nm波长光下激发后可视化细胞。对野生型和CDKN2B/A基因修改的细胞群中的Alexa Flour 488/DAPI的比例进行定量和比较，以评估每个细胞群组内的增殖性群体比率。在每次群体处理的总细胞数方面和关于细胞传代数测量的阳性Alexa Fluor 488信号表明DNA复制已发生并且是细胞活跃增殖的直接量度。为了量化和追踪连续传代期间增殖能力的相对维持，在连续群体倍增期间重复该程序，直到至少一个细胞群停止增殖并且变衰老。
(G)异位质粒DNA转染的方法
为了异位表达，使用商业质粒生产服务以及独特的真核生物抗生素抗性基因(即对于其他常驻的药物选择性标记独特)生成含有对研究下的多细胞动物(即，“目的基因”)具有种属特异性的TERT或CDK4调控序列和编码序列的质粒DNA构建体。为了本文描述的预期用途，质粒DNA含有标准载体骨架，其含有用于在原核系统中扩增的必需调控元件。
每个质粒含有在每个靶细胞群内组成型表达TERT或CDK4蛋白所必需的调控区和编码区。质粒DNA构建体的递送由形成非脂质体DNA复合物的转染试剂(Fugene HD，Promega)介导，该转染试剂直接递送至悬浮液中和粘附期间的原代细胞分离物。质粒含有促进目的基因和编码真核生物抗生素抗性的基因表达所必需的调控序列。通过利用Grunwald和Speer(2007)方案(参考Biochemica 3/2007，第26-27页)的修改版本来完成转染用于原代人骨骼肌成肌细胞的靶向修改。使用独特的限制性位点，将制备的质粒DNA在5'调控组分的上游进行限制性酶消化。为了从未切割或错切的质粒中分离切割的质粒，以10W/cm运行0.8％琼脂糖凝胶直到解析出来。如果所有取样的质粒DNA都适当地线性化，则将切割的质粒在无菌去离子水中稀释至1μg/μL的工作浓度。将2μg总DNA在无菌去离子水中稀释至1μg/50μL的浓度。将Fugene HD以6:2的比例(Fugene HD试剂(以μL计):总DNA(以μg计))添加到DNA混合物中并充分混合。将混合物在室温下温育15分钟以促进与DNA的复合。通过添加等体积的无菌去离子水稀释温育的DNA混合物。然后将该全部反应混合物滴加到悬浮液中的细胞(参见下文)。将细胞和DNA反应混合物在37℃下、在5％CO2、5％O2气氛条件下温育48小时。
(H)对用异位DNA转染的细胞的克隆选择
通过抗生素药物选择并且存活法来选择细胞群：将在Fugene HD:线性化TERT或CDK4质粒DNA序列中温育的细胞除去其培养基、在1×PBS中洗涤，并施加新鲜的增殖培养基。然后将致死剂量的抗生素施加至培养基以启动细胞克隆选择。在致死性抗生素药物暴露下、37℃下、5％O2、5％CO2下温育细胞14天。监测细胞培养基并定期更换以除去由于药物诱导的死亡而引起的细胞碎屑和碎片。使用无菌p200移液管尖端挑取从具有转染质粒上携带抗生素抗性基因的单个细胞而来的非病态增殖细胞集落，并且将该细胞集落转移至96孔板的0.1％明胶包被的孔中。然后如前所述重新施加200μL含有致死性抗生素浓度的增殖培养基，以维持恒定的选择压力。将细胞在37℃下、在5％O2、5％CO2气氛条件下温育直到集落出现。然后将已建立且增殖的集落分离成单个细胞并扩增到更大表面积的明胶包被的孔中，直到在6孔板的6个孔内汇合。然后对由含目的基因的质粒靶向的每个存活的、扩增的细胞群的每个6孔板的一个汇合孔进行总的基因组DNA分离。将总的细胞基因组DNA分离并进行定量。然后对总的基因组DNA进行目的基因编码序列的PCR扩增，并在0.8％琼脂糖凝胶上以10W/cm运行直到解析出来。然后从琼脂糖凝胶中提取这些PCR产物并用于Sanger测序。将序列描图与野生型的、未经处理的亲代细胞群以及具有目的序列的种属特异性基因的计算机模拟设计进行比较。然后评价展示出具有与经由计算机模拟的预测相匹配的目的基因组序列的基因的细胞群的功能的和表型的表征。
(I)使用TRAP的端粒酶功能验证
使用标准TRAP测定实现对TERT表达产物的功能评价。TRAP，即端粒酶重复扩增方案以下列方式进行。将被确定具有TERT构建体的克隆分离的细胞群与不含TERT构建体的细胞(未经处理的细胞比较物)一起以相等的浓度铺板，并且在37℃下、在5％CO2、5％O2气氛条件下温育直到80％汇合。然后将细胞洗涤、收集、沉淀和裂解以收集细胞内蛋白质级分以及基因组DNA。使用含有必需试剂和缓冲液的市售TRAP测定试剂盒(TRAPeze端粒酶检测试剂盒，EMD Millipore)，对基因组DNA进行PCR扩增。将所得物在非变性丙烯酰胺凝胶上运行，以解析指示存在活性端粒酶的条带图样(即梯形条带的图样，其与活性端粒酶的增加或者其缺失存在正相关)。
<结论>
本发明并不限于：用于遏制解除在复制性衰老期间视网膜母细胞瘤蛋白对细胞分裂周期推进的特定技术。除了本文提到的这些特定技术之外，这种遏制可以通过其他技术实现。此类技术的实例包括但不限于以下：(1)通过短发夹RNA沉默RNA翻译(图8)；(2)通过向导RNA打靶的核酸酶缺陷型Cas9调节内源性基因表达(图5和6)；(3)慢病毒载体、逆转录病毒载体、转染DNA或同源重组介导的基因工程；(4)通过图4、6、7和8中建模的方法直接打靶对pRB功能或基因表达的抑制以破坏来自RB1基因座的基因表达；(5)异位过表达野生型周期蛋白依赖性激酶同源物诸如CDK6和CDK2，以及对CKI抑制无效的突变CDK同源物，诸如CDK4R24C(等人，1995；Science第269卷第1281-1284页)；(6)在其物种身份的特征为p15和p16两种转录物的细胞中同时破坏p15和p16功能两者；以及(7)使用打靶视网膜母细胞瘤家族蛋白的病毒蛋白破坏视网膜母细胞瘤家族蛋白功能，该病毒蛋白含有与含有亮氨酸–X–半胱氨酸–X–谷氨酸的五肽基序同源的基序。
尽管该方法的一个实施方案获得对用于膳食消费的动物生物质的培养，但是其他应用包括用于生产诸如皮革的纺织品的生物过程；和医疗用途，诸如治疗性组织和疫苗。此外，鉴于肉类的全球需求迅速增加、肉类消耗的资源要求和经济影响，克隆、完全肌源性和永生化的家畜细胞系可以为了解家畜骨骼肌发育的机制、改善家畜增重、兽医学和其他兽医学应用提供有价值的资源。还应当理解，在本发明范围内描述的用途涵盖了、不排除并且不受限于：(1)对于其遗传身份不是源自在农业中普遍的动物物种的细胞系的应用；以及(2)从骨骼肌以外的组织的本体细胞谱系生产动物生物质。
本发明和方法的分类范围涵盖：被认为是家禽的物种，包括但不限于：原鸡(Gallus gallus)、火鸡(Meleagris gallopavo)和绿头鸭(Anas platyrhynchos)、被认为是家畜的物种，包括但不限于普通牛(Bos taurus)、野猪(Sus scrofa)和家绵羊(Ovisaries)，以及被认为是海产品的物种，包括但不限于西洋鲑(Salmo salar)、金枪鱼(Thunnus thynnus)、大西洋鳕(Gadus morhua)、美洲螯龙虾(Homarus americanus)和白滨对虾(Litopenaeus setiferus)。
序列表
<110> 孟菲斯肉类公司（Memphis Meats, Inc.）
<120> 用于培养用于膳食消费的动物生物质的工程细胞系
<130> 45974.0002
<160> 43
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 原鸡
<400> 1
tcacccgcag cagatcgccg cgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 原鸡
<400> 2
cgggtgaagg agctactgga cgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 原鸡
<400> 3
gcaccacgcc tgctgctccg ggg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 原鸡
<400> 4
gctgggctcc cctcgcgggt cgg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 原鸡
<400> 5
cctcgtgtct gtgggcagcg ggg 23
<210> 6
<211> 5816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 增强子
<222> (1)..(293)
<223> 人 CMV IE1
<220>
<221> 启动子
<222> (294)..(573)
<223> 鸡β肌动蛋白启动子
<220>
<221> 内含子
<222> (576)..(1546)
<223> 内含子鸡β肌动蛋白
<400> 6
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 60
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 120
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 180
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 240
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga 300
ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt 360
gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggcgcg 420
cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg 480
cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc 540
ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg 600
tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc 660
cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat 720
gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt 780
tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt 840
gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc 900
tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct 960
gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg 1020
gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc 1080
cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg 1140
ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg 1200
gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc 1260
attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg 1320
cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt 1380
gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc 1440
cccttctccc tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac 1500
ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc 1560
atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt 1620
ctcatcattt tggcaaagaa ttcggcttga tcgaagccgt ctcaggggag agaccgcagg 1680
agcccgggct gggcataaaa gtcagggcag agccatctat tgcttacatt tgcttctgac 1740
acaactgtgt tcactagcaa cctcaaacag acaccatgga gcgcggggct cagccgggag 1800
tcggtgtgcg gcggctccgc aatgtagcgc gggaggagcc cttcgccgcg gtcctgggcg 1860
cgctgcgggg ctgctacgcc gaggccacgc cgctggaggc cttcgtccgg cggctgcagg 1920
agggtggcac cggggaggtc gaggtgctgc gaggcgacga cgctcagtgc taccggacct 1980
tcgtgtcgca gtgcgtggtg tgcgtccccc gcggtgctcg cgccatcccc cggcccatct 2040
gcttccagca gttatccagt cagagcgaag tcatcacaag aatcgttcag aggctgtgtg 2100
aaaagaaaaa gaagaacatc cttgcgtatg gatactcctt gctggatgag aacagttgtc 2160
acttcagagt tttgccatct tcgtgtatat acagctatct gtccaatact gtaacagaaa 2220
cgattcgcat cagtggcctc tgggagatac tgctgagtag gataggggac gacgtgatga 2280
tgtacctgct ggagcactgt gcactcttca tgctggttcc cccaagtaac tgttaccagg 2340
tctgcgggca accaatttat gaacttattt cgcgtaacgt agggccatcc ccagggtttg 2400
ttagacgacg gtactcaagg tttaaacata atagcttgct tgactatgtg cgaaaaaggc 2460
ttgtgtttca caggcactat ctttccaagt cgcagtggtg gaagtgcagg ccgagacgtc 2520
gaggtcgtgt ctccagcagg agaaaaagaa ggagccatag gatacaaagc ctaaggtctg 2580
gttatcagcc ttctgcaaaa gtgaactttc aagcaggtag gcagatcagc acagttactg 2640
cacgtctgga aaaacagagc tgctccagtt tatgtttgcc agctagagca ccatctttaa 2700
aaaggaagcg tgatggagaa caggttgaaa tcacagctaa gagagtgaaa ataatggaga 2760
aagagataga ggaacaggct tgtagtatcg ttcctgatgt aaaccaaagt agctcccaga 2820
ggcatggaac ctcctggcat gtagcaccac gtgctgtagg tcttattaaa gaacattaca 2880
tttctgaaag aagtaacagt gagatgtctg gtccttctgt agttcacaga tctcaccctg 2940
ggaagaggcc tgtggcagac aaaagctctt ttccacaagg agttcagggt aacaaacgca 3000
taaagaccgg tgcagaaaaa cgagcagaat ccaatagaag gggcatagag atgtatataa 3060
acccaatcca taaacccaat agaaggggca tagagaggcg tataaatcca acccacaaac 3120
ctgagttgaa ttctgtacaa actgaaccaa tggaaggtgc ttcttcaggg gacagaaagc 3180
aggaaaatcc cccagctcat ttggcaaagc agttaccaaa tacattgtcg cgctctacag 3240
tgtactttga gaagaaattt cttctgtatt cccgcagtta ccaagaatat tttcctaaat 3300
cgttcatact gagccgcctg cagggttgtc aggcaggtgg aaggcggctt atagaaacta 3360
tattcttaag ccaaaaccca ttaaaggaac agcagaacca aagcctacca cagcaaaagt 3420
ggcgaaagaa gaggttgccc aaacgctact ggcaaatgag agagatattt cagaagctgg 3480
taaagaacca tgagaagtgc ccttatttag ttttcttgag gaaaaattgc cctgttttgc 3540
tttctgaagc atgtttgaaa aagacggagc tgaccttgca ggcggctctg cctggggaag 3600
caaaggttca caagcacaca gaacatggga aagagtccac tgagggtact gcaccgaaca 3660
gcttcctcgc tcctccctca gtgctagcat gtgggcagcc agagagaggg gaacagcacc 3720
ctgcagaggg gagtgatccg ctcctcaggg agctgctcag gcagcacagc agccactggc 3780
aggtgtatgg ctttgtgagg gagtgcctgg agcgggtgat ccctgctgag ctgtggggtt 3840
caagccataa caaatgccgg ttctttaaaa acgtgaaagc attcatttcc atggggaagt 3900
atgctaagct ttcattgcag cagctgatgt ggaagatgag agtgaatgac tgcgtatggc 3960
ttcgtctggc caaaggtaat cactctgttc ctgcctatga acattgttac cgtgaagaaa 4020
ttctggcaaa attcctatac tggctgatgg attcctatgt tatcgagttg ctcaaatcat 4080
ttttctatat caccgagacc atgttccaga aaaacatgct tttctactac cgaaagttta 4140
tctggggcaa gttacagaac attggaatta gagaccattt tgccaaagta catctacgtg 4200
ccttgtcttc agaggagatg gaagtgatcc gtcaaaaaaa gtattttcct attgcatcaa 4260
ggctccggtt cattcctaaa atgaatggtt taagacccgt agtaagacta agccgtgttg 4320
ttgaaggaca gaaactcagc aaggaaagca gagaaaagaa gatacagcgc tataacactc 4380
agctaaaaaa tctatttagt gttttaaact atgaacgaac tgtaaacacc agtatcattg 4440
gctcttcagt attcgggaga gatgatatct acaggaagtg gaaggagttt gttacaaagg 4500
tttttgaatc aggtggtgaa atgcctcatt tctactttgt aaagggtgat gtatccagag 4560
cttttgatac cattcctcac aagaaacttg tggaagtgat atcacaggtc ttgaaacctg 4620
agagccaaac tgtctatgga ataaggtggt atgcagtgat tatgattacc ccaactggaa 4680
aagccaggaa actctataag agacatgttt ctactttcga ggattttatt ccagacatga 4740
agcagtttgt gtccaagctt caagagagaa cttcattacg aaatgcaata gtagttgaac 4800
agtgcttaac ttttaatgag aacagttcca ccctgtttac tttctttctt caaatgttac 4860
ataataacat cctggagatt gggcacaggt actatataca gtgctctgga atcccacagg 4920
gctccatttt gtcaacctta ctttgcagct tatgctacgg agacatggaa aacaaattac 4980
tctgtgggat ccagaaggat ggagtcctaa tacgtcttat tgatgacttt ttgctggtta 5040
cgccacattt aatgcaggca agaacttttc taaggactat agcagcaggt attcctgagt 5100
atggcttttt aataaatgcc aagaagactg tggtgaattt tcctgttgat gatatcccgg 5160
gatgttccaa gttcaaacat ctgccagatt gtcgtttgat ctcatggtgt ggtttattat 5220
tggatgtgca gacacttgag gtttattgtg attactccag ttatgccttt acttctatca 5280
gatcaagtct ttccttcaat tcaagtagaa tagctgggaa aaacatgaaa tgcaaattga 5340
ctgcagtcct caaactgaaa tgccatcctt tacttcttga cttaaagatc aacagccttc 5400
agacagttct aattaacatc tacaagatat ttttacttca ggcttacagg ttccatgcct 5460
gtgttcttca gcttccattc aaccagaaag ttaggaataa tcctgatttc ttcctaagga 5520
tcatctctga tactgcttca tgctgctatt ttatcctgaa agctaaaaat ccaggagttt 5580
ctttaggtag caaagatgca tctggcatgt tcccttttga ggcagcagaa tggctgtgct 5640
accatgcctt cattgtcaaa ctgtccaacc acaaagttat ttacaaatgc ttacttaagc 5700
cccttaaagt ctataagatg catctgtttg ggaagatccc aagggatact atggaactgc 5760
tgaagacggt gacggaacca tcgctttgtc aagatttcaa aactatactg gactaa 5816
<210> 7
<211> 5854
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 增强子
<222> (1)..(293)
<223> 人 CMV IE1
<220>
<221> 启动子
<222> (294)..(575)
<223> 鸡β肌动蛋白启动子
<220>
<221> 内含子
<222> (578)..(1548)
<223> 内含子鸡β肌动蛋白
<400> 7
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 60
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 120
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 180
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 240
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga 300
ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt 360
gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg 420
cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc 480
ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg 540
gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgcgct gccttcgccc 600
cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact 660
cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta 720
atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc 780
tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc 840
gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc 900
gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg 960
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ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg 1320
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gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg 1440
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<212> DNA
<213> 普通牛
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<211> 23
<212> DNA
<213> 普通牛
<400> 9
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<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 普通牛
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<210> 11
<211> 4993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 增强子
<222> (1)..(293)
<223> 人 CMV IE1
<220>
<221> 启动子
<222> (294)..(575)
<223> 鸡β肌动蛋白启动子
<220>
<221> 内含子
<222> (578)..(1548)
<223> 内含子鸡β肌动蛋白
<300>
<308> NCBI RefSeq / NM_001046242.1
<309> 2016-04-02
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<400> 11
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<212> DNA
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<223> 合成构建体
<220>
<221> 增强子
<222> (1)..(293)
<223> 人 CMV IE1
<220>
<221> 启动子
<222> (294)..(575)
<223> 鸡β肌动蛋白启动子
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<211> 2557
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 增强子
<222> (1)..(293)
<223> 人 CMV IE1
<220>
<221> 启动子
<222> (294)..(575)
<223> 鸡β肌动蛋白启动子
<220>
<221> 内含子
<222> (578)..(1548)
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ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt 360
gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg 420
cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc 480
ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg 540
gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgcgct gccttcgccc 600
cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact 660
cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta 720
atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc 780
tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc 840
gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc 900
gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg 960
ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt 1020
gggcgcgtcg gtcgggctgc aaccccccct gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg 1080
cccggcttcg ggtgcggggc tccgtacggg gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg 1140
ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc 1200
gggggagggg cgcggcggcc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag 1260
ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg 1320
tgcggagccg aaatctggga ggcgccgccg caccccctct agcgggcgcg gggcgaagcg 1380
gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg 1440
tccccttctc cctctccagc ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc ttcggggggg 1500
acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa 1560
ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct 1620
gtctcatcat tttggcaaag aattcatggc tacctcccga tatgagccag tggctgagat 1680
tggtgtcggt gcctatggga cagtgtacaa ggcctgtgat ccccacagtg gccactttgt 1740
ggccctcaag agtgtaagag tccccaatgg aggaggtgct ggagggggcc tgcccatcag 1800
caccgttcgg gaggtggcct tactgcggcg tctggaggct tttgagcatc ccaatgttgt 1860
caggcttatg gacgtctgtg caacagcccg aactgaccgg gagaccaaag tgaccctggt 1920
gtttgagcat gtggaccaag atctcaggac atatctggac aaggcacccc caccaggctt 1980
gccagtggag accataaaag atctgatgcg ccaatttcta agaggcctgg atttccttca 2040
tgccaactgc atcgttcacc gagacctgaa gccagagaac attctggtga caagtggtgg 2100
gacagtcaag ctggctgact ttggcctggc cagaatctac agctaccaga tggcacttac 2160
acctgtggtt gttacactct ggtatcgtgc tccagaagtt cttttgcagt ctacgtatgc 2220
aacacccgtg gacatgtgga gcgttggctg tatctttgca gagatgtttc gtcgaaagcc 2280
tctcttctgt ggaaactctg aagctgacca gttaggcaaa atctttgacc tgattggact 2340
gcccccagag gatgactggc cccgagatgt ctctctaccc cgaggagcct tttccccccg 2400
agggccccgc ccagtgcagt cggtggtccc tgagctggag gaatctggag cacagctgct 2460
gctggagatg ctgactttta acccacacaa gcgaatctct gccttccgag ccctgcagca 2520
ctcttatcta cacaaggcag aaggtgacgc agagtga 2557
<210> 14
<211> 2559
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 增强子
<222> (1)..(293)
<223> 人 CMV IE1
<220>
<221> 启动子
<222> (294)..(575)
<223> 鸡β肌动蛋白启动子
<220>
<221> 内含子
<222> (578)..(1548)
<223> 内含子鸡β肌动蛋白
<400> 14
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 60
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 120
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 180
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 240
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga 300
ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt 360
gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg 420
cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc 480
ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg 540
gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgcgct gccttcgccc 600
cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact 660
cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta 720
atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc 780
tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc 840
gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc 900
gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg 960
ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt 1020
gggcgcgtcg gtcgggctgc aaccccccct gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg 1080
cccggcttcg ggtgcggggc tccgtacggg gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg 1140
ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc 1200
gggggagggg cgcggcggcc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag 1260
ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg 1320
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gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg 1440
tccccttctc cctctccagc ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc ttcggggggg 1500
acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa 1560
ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct 1620
gtctcatcat tttggcaaag aattcatggc tacctctcga tatgagccag tggctgaaat 1680
tggtgtcggt gcctatggga cagtgtacaa ggcctgtgat ccccacagtg gccactttgt 1740
ggccctcaag agtgtgagag tccccaatgg aggaggaggt ggaggaggcc ttcccatcag 1800
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ccggctgatg gacgtctgtg ccacatcccg aactgaccgg gagatcaagg taaccctggt 1920
gtttgagcat gtagaccagg acctaaggac atatctggac aaggcacccc caccaggctt 1980
gccagccgaa acgatcaagg atctgatgcg ccagtttcta agaggcctag atttccttca 2040
tgccaattgc atcgttcacc gagatctgaa gccagagaac attctggtga caagtggtgg 2100
aacagtcaag ctggctgact ttggcctggc cagaatctac agctaccaga tggcacttac 2160
acccgtggtt gttacactct ggtaccgagc tcccgaagtt cttctgcagt ccacatatgc 2220
aacacctgtg gacatgtgga gtgttggctg tatctttgca gagatgtttc gtcgaaagcc 2280
tctcttctgt ggaaactctg aagccgacca gttgggcaaa atctttgacc tgattgggct 2340
gcctccagag gatgactggc ctcgagatgt atccctgccc cgtggagcct ttccccccag 2400
agggccccgc ccagtgcagt cggtggtacc tgagatggag gagtcgggag cacagctgct 2460
gctggaaatg ctgactttta acccacacaa gcgaatctct gcctttcgag ctctgcagca 2520
ctcttatcta cataaggatg aaggtaatcc ggagtgaaa 2559
<210> 15
<211> 2542
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 增强子
<222> (1)..(293)
<223> 人 CMV IE1
<220>
<221> 启动子
<222> (294)..(575)
<223> 鸡β肌动蛋白启动子
<220>
<221> 内含子
<222> (578)..(1548)
<223> 内含子鸡β肌动蛋白
<400> 15
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 60
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 120
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 180
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 240
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga 300
ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt 360
gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg 420
cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc 480
ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg 540
gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgcgct gccttcgccc 600
cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact 660
cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta 720
atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc 780
tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc 840
gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc 900
gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg 960
ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt 1020
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acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa 1560
ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttattgtgct 1620
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ggagaacaag ctctacctgg tctttgagtt cctgcaccag gacctgaaga agttcatgga 1920
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gatcctgctg ggctgcaagt actattcgac tgctgtggac atctggagcc tgggctgcat 2220
ttttgctgag atggtgacgc ggcgcgcgct cttccccggg gattcggaga tcgatcagct 2280
cttccgtatc ttccgcacgt tggggacacc ggatgaggcc gcctggcccg gcgtcaccgc 2340
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caagcgcatc tcggccaagg cagcgctgag ccaccccttc ttccgcgacg tcaccagggc 2520
tgtcccccac ctgcgcctgt ga 2542
<210> 16
<211> 2626
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 增强子
<222> (1)..(293)
<223> 人 CMV IE1
<220>
<221> 启动子
<222> (294)..(575)
<223> 鸡β肌动蛋白启动子
<220>
<221> 内含子
<222> (578)..(1548)
<400> 16
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 60
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 120
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 180
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 240
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga 300
ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt 360
gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg 420
cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc 480
ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg 540
gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgcgct gccttcgccc 600
cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact 660
cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta 720
atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc 780
tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc 840
gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc 900
gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg 960
ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt 1020
gggcgcgtcg gtcgggctgc aaccccccct gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg 1080
cccggcttcg ggtgcggggc tccgtacggg gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg 1140
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gtctcatcat tttggcaaag aattcatgga caaggacggc accaacctgg ccgaccagca 1680
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cctgaagaat ggcggccgct tcgtggcgct gaagcgggtg cgggtgcaga ccagcgagga 1800
gggcatgccg ctgtccacca tccgggaggt ggccgtcctg aggcacctgg agaccttcga 1860
gcaccccaac gtggtcagat tgtttgatgt gtgcaccgtg tcacgaacag acagagaaac 1920
caagttaacg ttggtgtttg aacatgtgga tcaagacttg actacttact tggataaagt 1980
tccagagcct ggagtgccta ctgaaactat aaaggatatg atgcttcagc tgtttcgggg 2040
actggatttt ctgcattcac atcgtgtggt gcatcgggac ctgaaacccc agaatatcct 2100
tgtaaccagc agtgggcaga taaagttagc tgactttgga cttgcacgaa tctacagttt 2160
tcagatggct cttacatcag tggttgttac tttgtggtat agagctcctg aagttttgct 2220
tcagtccagc tatgcaacac cagttgatct ttggagtgtt ggttgcatat ttgcagaaat 2280
gttccgtcga aaaccactct tccgtggaaa ttcagatgtt gatcagctag gaaaaatctt 2340
tgatgtaatt ggactcccag aagaagagga ctggcctaat gatgtggccc ttccaagaaa 2400
tgcttttgct tccagacccg cacaacctat tgaaaaattt gtaccagata ttgatgacat 2460
gggcaaagac ttgcttctta aatgcttagc gttcaatcca gccaagagaa tatctgccta 2520
tgctgccctg tctcacccct atttccatga tctggagaaa tgcaaggaga atctggactc 2580
tcacatgtca tccagccaaa actccagtga ggtgaacgca tcataa 2626
<210> 17
<211> 168
<212> PRT
<213> 小家鼠
<300>
<308> NCBI RefSeq / NP_001035744.1
<309> 2015-05-12
<313> (1)..(168)
<400> 17
Met Glu Ser Ala Ala Asp Arg Leu Ala Arg Ala Ala Ala Gln Gly Arg
1 5 10 15
Val His Asp Val Arg Ala Leu Leu Glu Ala Gly Val Ser Pro Asn Ala
20 25 30
Pro Asn Ser Phe Gly Arg Thr Pro Ile Gln Val Met Met Met Gly Asn
35 40 45
Val His Val Ala Ala Leu Leu Leu Asn Tyr Gly Ala Asp Ser Asn Cys
50 55 60
Glu Asp Pro Thr Thr Phe Ser Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu
65 70 75 80
Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Gly Ser Gly Ala Arg Leu
85 90 95
Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Leu Asp Leu Ala Gln Glu
100 105 110
Arg Gly His Gln Asp Ile Val Arg Tyr Leu Arg Ser Ala Gly Cys Ser
115 120 125
Leu Cys Ser Ala Gly Trp Ser Leu Cys Thr Ala Gly Asn Val Ala Gln
130 135 140
Thr Asp Gly His Ser Phe Ser Ser Ser Thr Pro Arg Ala Leu Glu Leu
145 150 155 160
Arg Gly Gln Ser Gln Glu Gln Ser
165
<210> 18
<211> 152
<212> PRT
<213> 普通牛
<300>
<308> NCBI RefSeq / XP_010806061.1
<309> 2016-01-26
<313> (1)..(152)
<400> 18
Met Glu Thr Ser Ala Asp Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Trp
1 5 10 15
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20 25 30
Pro Asn Arg Tyr Gly Arg Ser Ala Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser
35 40 45
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50 55 60
Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu
65 70 75 80
Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Ala Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu
85 90 95
Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu
100 105 110
Arg Gly His Arg Asp Val Ala Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Glu Asp
115 120 125
Thr Glu Gly Gly Ser His Ala Ser Ala Asp Ser Ala Glu Gly Pro Ala
130 135 140
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<210> 19
<211> 152
<212> PRT
<213> 野猪
<300>
<308> GenBank / CAC87046.1
<309> 2005-04-15
<313> (1)..(152)
<400> 19
Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu Ala Ser Ala Ala Ala Arg Gly Arg
1 5 10 15
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20 25 30
Pro Asn Arg Tyr Gly Arg Thr Pro Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser
35 40 45
Thr Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Asp Pro Asn Cys
50 55 60
Glu Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu
65 70 75 80
Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu
85 90 95
Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu
100 105 110
Arg Gly His Arg Asp Val Ala Gly Tyr Leu Arg Ala Asn Ala Gly Arg
115 120 125
Thr Glu Gly Gly Ser His Ala Arg Ser Asn Ser Gly Glu Asp Pro Ala
130 135 140
Asp Ile Ser Asn Leu Gln Asn His
145 150
<210> 20
<211> 139
<212> PRT
<213> 原鸡
<300>
<308> NCBI RefSeq / NP_989764.1
<309> 2016-11-06
<313> (1)..(139)
<400> 20
Met Ala Gln Arg Ala Ala Ser Thr Ala Ala Asp Glu Leu Ala Asn Ala
1 5 10 15
Ala Ala Arg Gly Asp Leu Leu Arg Val Lys Glu Leu Leu Asp Gly Ala
20 25 30
Ala Asp Pro Asn Ala Val Asn Ser Phe Gly Arg Thr Pro Ile Gln Val
35 40 45
Met Met Leu Gly Ser Pro Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Gln Arg Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Ala Ala Arg Ala Gly Phe Leu Asp Thr Leu Ala Ala Leu His Arg
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Ala Gly Ala Arg Leu Asp Leu Pro Asp Gly Arg Gly Arg Leu Pro Ile
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115 120 125
Arg Leu Pro Ala Leu Pro Arg Ala Pro Leu Pro
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<210> 21
<211> 130
<212> PRT
<213> 小家鼠
<300>
<308> NCBI RefSeq / NP_031696.1
<309> 2015-02-15
<313> (1)..(130)
<400> 21
Met Leu Gly Gly Ser Ser Asp Ala Gly Leu Ala Thr Ala Ala Ala Arg
1 5 10 15
Gly Gln Val Glu Thr Val Arg Gln Leu Leu Glu Ala Gly Ala Asp Pro
20 25 30
Asn Ala Leu Asn Arg Phe Gly Arg Arg Pro Ile Gln Val Met Met Met
35 40 45
Gly Ser Ala Gln Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro
50 55 60
Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala
65 70 75 80
Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala
85 90 95
Arg Leu Asp Val Cys Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala
100 105 110
Glu Glu Gln Gly His Arg Asp Ile Ala Arg Tyr Leu His Ala Ala Thr
115 120 125
Gly Asp
130
<210> 22
<211> 131
<212> PRT
<213> 野猪
<300>
<308> NCBI RefSeq / NP_999289.1
<309> 2016-07-29
<313> (1)..(131)
<400> 22
Met Leu Ser Gly Gly Gly Gly Asp Ala Gly Leu Ala Asn Ala Ala Ala
1 5 10 15
Arg Gly Gln Val Glu Thr Val Arg Gln Leu Leu Glu Ala Gly Ala Asp
20 25 30
Pro Asn Gly Leu Asn His Phe Gly Arg Arg Pro Ile Gln Val Met Met
35 40 45
Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Asp
50 55 60
Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala
65 70 75 80
Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Ala Leu Arg Arg Ala Gly
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Val Gln Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu
100 105 110
Ala Glu Glu Arg Gly His Arg Asp Val Ala Arg Phe Leu Arg Ala Ala
115 120 125
Ala Gly Asp
130
<210> 23
<211> 131
<212> PRT
<213> 普通牛
<300>
<308> NCBI RefSeq / NP_001069362.1
<309> 2016-07-29
<313> (1)..(131)
<400> 23
Met Leu Ser Gly Gly Gly Gly Asp Ala Asp Leu Ala Asn Ala Ala Ala
1 5 10 15
Arg Gly Gln Val Glu Ala Val Arg Gln Leu Leu Glu Ala Gly Val Asp
20 25 30
Pro Asn Arg Leu Asn Arg Phe Gly Arg Arg Pro Ile Gln Val Met Met
35 40 45
Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Asp
50 55 60
Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala
65 70 75 80
Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Ala Leu His Arg Ala Gly
85 90 95
Gly Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu
100 105 110
Ala Glu Glu Arg Gly His Arg Asp Val Ala Arg Tyr Leu Arg Ala Thr
115 120 125
Ala Gly Asp
130
<210> 24
<211> 126
<212> PRT
<213> 虹鳟
<300>
<308> GenBank / ACO08670.1
<309> 2009-03-27
<313> (1)..(126)
<400> 24
Met Thr Met Pro Leu Glu Asp Asp Leu Ala Ser Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Asn Thr Asn Arg Val Lys Ile Leu Leu Gln Ser Gly Val Asp Val Asn
20 25 30
Gly Val Asn Cys Phe Gly Arg Thr Pro Leu Gln Val Met Met Met Gly
35 40 45
Gly Ser Pro Val Ala Gln Leu Leu Leu Met Gln Gly Ala Asp Pro Asn
50 55 60
Ile Ala Asp Arg His Thr Gly Thr Thr Pro Leu His Asp Ala Ala Arg
65 70 75 80
Met Gly Phe Leu Asp Thr Val Glu Ile Leu Val Gln Phe Leu Ala Asp
85 90 95
Pro Asn Ser Arg Asp Asn Arg Asn Cys Arg Pro Ile Asp Leu Ala Ile
100 105 110
Glu Ser Gly His Asn Asn Val Val Ala Phe Leu Lys Ala Leu
115 120 125
<210> 25
<211> 127
<212> PRT
<213> 罗非鱼
<300>
<308> NCBI RefSeq / XP_003452283.1
<309> 2016-12-05
<313> (1)..(127)
<400> 25
Met Thr Leu Gln Asp Glu Leu Thr Thr Ala Ala Ala Lys Gly Asn Thr
1 5 10 15
Ala Ala Val Lys Ala Leu Leu Asp Arg Gly Ala Gln Val Asn Gly Thr
20 25 30
Asn Ser Phe Gly Arg Thr Ala Leu Gln Val Met Met Met Gly Ser Thr
35 40 45
Ser Val Ala Gln Leu Leu Leu Glu His Gly Ala Asn Pro Asn Val Gly
50 55 60
Asp Ser Ser Thr Gly Ala Ser Pro Leu His Asp Ala Ala Arg Thr Gly
65 70 75 80
Phe Val Asp Thr Val His Leu Leu Val Gln His His Ala Asp Pro Gln
85 90 95
Ala Arg Asp Lys Leu Asn Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Arg Gln His
100 105 110
Gly His Gly Asp Val Val Asp Phe Leu Glu Ser Leu Gln Asn Pro
115 120 125
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 原鸡
<400> 26
ctctccgtcc tccctacctg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 原鸡
<400> 27
gtaccaactg cggggagaaa 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 原鸡
<400> 28
ggacgccggt caatgaatca 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 原鸡
<400> 29
caggtgatga tgctgggcag 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 原鸡
<400> 30
tttctccccg cagttggtac 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 原鸡
<400> 31
ctgcaagacc caagacgtct 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 普通牛
<400> 32
gcctagtccc acaccctttc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 普通牛
<400> 33
catttaagcc tggcccctga 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 普通牛
<400> 34
tgtccgactc tttgccatcc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 普通牛
<400> 35
gaccctggat aaggcgtcag 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 普通牛
<400> 36
agtgaatgct ctgggaagcg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 普通牛
<400> 37
gattgtcagc gcatctgcag 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 普通牛
<400> 38
tagagatctg aaccccacgc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 普通牛
<400> 39
ctctgatggg agtggggaga 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 普通牛
<400> 40
aggcctttcc tacctggtct 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 普通牛
<400> 41
taattccgct ggtttcccaa 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 普通牛
<400> 42
aaactgctgc gacatctgga 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 普通牛
<400> 43
acggtccctc ttctctctcc 20

Claims (34)

1.一种用于延长多细胞动物体细胞群的复制能力的方法，所述方法包括：
通过使用基因修改去除周期蛋白依赖性激酶抑制剂(“CKI”)介导的视网膜母细胞瘤蛋白的稳定化，在复制性衰老期间解除视网膜母细胞瘤蛋白对细胞分裂周期推进的抑制；
通过用指导功能性端粒逆转录酶(“TERT”)蛋白的异位表达的基因构建体(SEQ ID NO11)转导所述多细胞动物体细胞群，来维持端粒酶活性；
维持具有所述基因修改和TERT蛋白的异位表达的细胞库，所述细胞库为主细胞库；
在离体环境中培养来自所述主细胞库的细胞作为被培养的细胞生物质；并且
收获所述被培养的细胞生物质用于膳食消费。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述基因修改包括：通过对所述多细胞动物体细胞群中的CDKN2B基因(NCBI基因ID：395076)的基因修改来使p15蛋白去活化，以消除在复制性衰老期间视网膜母细胞瘤蛋白对所述细胞周期的抑制。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述基因修改是所述CDKN2B基因的外显子1中的保守核苷酸序列的突变。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述基因修改是使用向导RNA制得的插入突变并且是使用成簇规律间隔短回文重复序列-Cas9(“CRISPR/Cas9”)产生的，所述向导RNA选自：由打靶所述CDKN2B基因的外显子1的向导RNA(SEQ ID No.1、2、3、4和5)组成的组。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述基因修改是使用向导RNA制得的缺失突变并且是使用CRISPR/Cas9产生，所述向导RNA选自：由打靶所述CDKN2B基因的外显子1的向导RNA(SEQ ID No.1、2、3、4和5)组成的组。
6.如权利要求2所述的方法，其中培养来自所述主细胞库的细胞还包括：
对来自所述主细胞库的被选择的细胞群进行扩增；
将扩增的细胞群低温保存并储存在主细胞库库存中；
在离体环境中接种和培养来自所述主细胞库库存的细胞；并且
收获所述被培养的细胞生物质用于膳食消费。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述多细胞动物体细胞群的物种身份是原鸡(Gallusgallus)，而所述多细胞动物体细胞群的谱系是骨骼肌。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述基因修改包括：通过对所述多细胞动物体细胞群中的CDKN2A基因(NCBI基因ID：616369)的基因修改来使p16蛋白去活化，以消除在复制性衰老期间视网膜母细胞瘤蛋白对所述细胞周期的抑制。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述基因修改是所述CDKN2A基因的外显子2中的保守核苷酸序列的突变。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述基因修改是使用打靶所述CDKN2A基因的外显子2的向导RNA制得的插入突变并且是使用CRISPR/Cas9产生的。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述基因修改是使用向导RNA制得的缺失突变并且是使用CRISPR/Cas9产生的，所述向导RNA选自：由打靶所述CDKN2A的外显子2的向导RNA(SEQ ID No.8、9和10)组成的组。
12.如权利要求8所述的方法，其中培养来自所述主细胞库的细胞还包括：
对来自所述主细胞库的被选择的细胞群进行扩增；
将扩增的细胞群低温保存并储存在主细胞库库存中；
在离体环境中接种和培养来自所述主细胞库库存的细胞；并且
收获所述被培养的细胞生物质用于膳食消费。
13.如权利要求8所述的方法，其中所述多细胞动物体细胞群的物种身份是普通牛(Bostaurus)，而所述多细胞动物体细胞群的谱系是骨骼肌。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述基因修改还包括：用指导CDK4基因(NCBI基因ID：510618)异位表达周期蛋白依赖性激酶4(“CDK4”)蛋白同源物的基因构建体(SEQ ID NO12)修饰所述细胞群。
15.如权利要求14所述的方法，其中培养来自所述主细胞库的细胞还包括：
对来自所述主细胞库的被选择的细胞群进行扩增；
将扩增的细胞群低温保存并储存在主细胞库库存中；
在离体环境中接种和培养来自所述主细胞库库存的细胞；并且
收获所述被培养的细胞生物质用于膳食消费。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述多细胞动物体细胞群的物种身份是原鸡(Gallus gallus)，并且所述多细胞动物体细胞群的谱系是骨骼肌。
17.如权利要求14所述的方法，其中修饰所述多细胞动物细胞群是用：指导来自普通牛(Bos taurus)CDK4基因的CDK4蛋白同源物的表达的基因构建体(SEQ ID NO 12)。
18.一种多细胞动物体细胞群的克隆细胞系，所述细胞系由包括以下项的方法衍生而来：
通过使用基因修改去除CKI介导的视网膜母细胞瘤蛋白的稳定化，在复制性衰老期间解除视网膜母细胞瘤蛋白对细胞分裂周期推进的抑制；
通过用指导功能性TERT蛋白的异位表达的基因构建体(SEQ ID NO 11)转导所述多细胞动物体细胞群，来维持端粒酶活性；
维持具有所述基因修改和TERT蛋白的异位表达的细胞库，所述细胞库为主细胞库；
在离体环境中培养来自所述主细胞库的细胞作为被培养的细胞生物质；
收获所述被培养的细胞生物质用于膳食消费；并且
其中所述克隆细胞系具有用于工业生产中的尺度放大应用的无限复制能力。
19.如权利要求18所述的克隆细胞系，其中所述基因修改包括：通过对所述多细胞动物体细胞群中的CDKN2B基因(NCBI基因ID：395076)的基因修改来使p15蛋白去活化，以消除在复制性衰老期间视网膜母细胞瘤蛋白对所述细胞周期的抑制。
20.如权利要求19所述的克隆细胞系，其中所述基因修改是所述CDKN2B基因的外显子1中的保守核苷酸序列的突变。
21.如权利要求20所述的克隆细胞系，其中所述基因修改是使用向导RNA制得的插入突变并且是使用CRISPR/Cas9产生的，所述向导RNA选自：由打靶所述CDKN2B基因的外显子1的(SEQ ID No.1、2、3、4和5)组成的组。
22.如权利要求20所述的克隆细胞系，其中所述基因修改是使用向导RNA制得的缺失突变并且是使用CRISPR/Cas9产生的，所述向导RNA选自：由打靶所述CDKN2B基因的外显子1的(SEQ ID No.1、2、3、4和5)组成的组。
23.如权利要求18所述的克隆细胞系，其中培养来自所述主细胞库的细胞还包括：
对来自所述主细胞库的所选择的细胞群进行扩增；
将扩增的细胞群低温保存并储存在主细胞库库存中；
在离体环境中接种和培养来自所述主细胞库库存的细胞；并且
收获被培养的细胞生物质用于膳食消费。
24.如权利要求19所述的克隆细胞系，其中所述多细胞动物体细胞群的物种身份是原鸡(Gallus gallus)，而所述多细胞动物体细胞群的谱系是骨骼肌。
25.如权利要求18所述的方法，其中所述基因修改包括：通过对所述多细胞动物体细胞群中的CDKN2A基因(NCBI基因ID：616369)的基因修改来使p16蛋白去活化，以消除在复制性衰老期间视网膜母细胞瘤蛋白对所述细胞周期的抑制。
26.如权利要求25所述的克隆细胞系，其中所述基因修改是所述CDKN2A基因的外显子2中的保守核苷酸序列的突变。
27.如权利要求26所述的克隆细胞系，其中所述基因修改是使用向导RNA制得的插入突变并且是使用CRISPR/Cas9产生的，所述向导RNA选自：由打靶所述CDKN2A的外显子2的(SEQID No.8-10)组成的组。
28.如权利要求26所述的克隆细胞系，其中所述基因修改是使用向导RNA制得的缺失突变并且是使用CRISPR/Cas9产生的，所述向导RNA选自：由打靶所述CDKN2A的外显子2的(SEQID No.8-10)组成的组。
29.如权利要求25所述的克隆细胞系，其中培养来自所述主细胞库的细胞还包括：
对来自所述主细胞库的所选择的细胞群进行扩增；
将扩增的细胞群低温保存并储存在主细胞库库存中；
在离体环境中接种和培养来自所述主细胞库库存的细胞；并且
收获所述被培养的细胞生物质用于膳食消费。
30.如权利要求25所述的克隆细胞系，其中所述多细胞动物体细胞群的物种身份是普通牛(Bos taurus)，而所述多细胞动物体细胞群的谱系是骨骼肌。
31.如权利要求18所述的克隆细胞系，其中所述基因修改还包括：用指导CDK4基因(NCBI基因ID：510618)异位表达CDK4蛋白同源物的基因构建体修饰所述细胞群。
32.如权利要求31所述的克隆细胞系，其中培养来自所述主细胞库的细胞还包括：
对来自所述主细胞库的所选择的细胞群进行扩增；
将扩增的细胞群低温保存并储存在主细胞库库存中；
在离体环境中接种和培养来自所述主细胞库库存的细胞；并且
收获所述被培养的细胞生物质用于膳食消费。
33.如权利要求31所述的克隆细胞系，其中所述多细胞动物体细胞群的物种身份是原鸡(Gallus gallus)，并且所述多细胞动物体细胞群的谱系是骨骼肌。
34.如权利要求31所述的克隆细胞系，其中修饰所述多细胞动物细胞群是用：指导来自普通牛(Bos taurus)CDK4基因的CDK4蛋白同源物的表达的基因构建体(SEQ ID NO 12)。
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