CN110997728A

CN110997728A - 二分型碱基编辑器(bbe)结构和ii-型-cas9锌指编辑

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Publication number: CN110997728A
Application number: CN201880048952.7A
Authority: CN
Inventors: J·格鲁内瓦尔德; J·K·乔昂格; J·盎格斯特曼; J·M·格尔克
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2020-04-10
Also published as: CA3063733A1; JP2023113672A; WO2018218166A1; AU2018273968A1; EP3630198A4; US20200172885A1; AU2018272067A1; CN110959040A; EP3630849A1; EP3630849A4; EP3630970A4; EP3630970A2; JP7324713B2; JP2020521454A; WO2018218188A3; JP2023126956A; EP3630198A1; WO2018218206A1; JP2020521446A; CN111093714A

Abstract

本文提供用于二分型胞嘧啶碱基编辑器系统的融合蛋白，其包括：(i)第一融合蛋白，其含有与脱氨酶或其活化部分融合的非R‑环形成性可编程DNA结合结构域、优选转录激活子样效应子(TALE)或锌指阵列(ZF)，任选地在其间具有接头，或者(ii)第二融合蛋白，其含有与尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)融合的R‑环形成性Cas9蛋白，任选地在其间具有接头，所述R‑环形成性Cas9蛋白缺少核酸酶活性或为切口酶，但可与指导RNA和靶DNA相互作用。另外，提供使核酸中一个或多个所选胞嘧啶靶向性脱氨的方法。

Description

二分型碱基编辑器(BBE)结构和II-型-CAS9锌指编辑

优先权声明

本申请要求2017年5月25日提交的美国专利申请系列号No.62/511,296；2017年8月4日提交的美国专利申请系列号No.62/541,544；和2018年1月26日提交的美国专利申请系列号No.62/622,676的权益。上述的全部内容通过引用结合在此。

联邦资助的研究或开发

本发明借助美国政府支持在国立卫生研究院授予的授予号GM118158下做出。美国政府在本发明中享有某些权利。

技术领域

本文中描述了用于改进靶向性碱基编辑技术的全基因组特异性的方法和组合物。

背景技术

碱基编辑(BE)技术基于例如无催化活性或产生切口的Cas9(dCas9或nCas9)等DNA结合结构域与胞苷或腺嘌呤脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)的融合。这些融合蛋白允许在引入靶向置换(C/G→T/A或A/T→G/C)的特定基因组基因座处的R-环形成和胞嘧啶或腺嘌呤脱氨^1–4。单一核苷酸变体的精确和有效修正可产生实质性治疗益处，特别是通过同源介导修复(HDR)的基于双链断裂(DSB)的供体模板整合的当前方法是低效的且在有丝分裂后的细胞中不可行⁵。由于用于胞嘧啶至胸腺嘧啶转换的脱氨酶需要ssDNA底物，使nCas9非靶链变为单链的nCas9介导的R-环形成是BE靶向成功的关键因素¹。

发明内容

CRISPR碱基编辑器平台(BE)拥有在无需供体DNA分子情况下产生精确的、用户限定的基因组编辑事件的独特能力。碱基编辑器(BE)按照位点特异性方式有效诱导胞嘧啶至胸腺嘧啶(C至T)碱基转换，如通过CRISPR指导RNA(gRNA)间隔子序列确定的，其中所述碱基编辑器包含与胞苷脱氨酶结构域和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)(例如，BE3)融合的产生单链切口的CRISPR-Cas9(nCas9)蛋白¹。与全部基因组编辑试剂一样，至关重要的是，在用于治疗药之前，首先确定然后降低BE产生脱靶突变的能力，从而限制其产生有害和不可逆基因编码副作用的潜力。这里，我们描述了依靠使用邻近靶向DNA结合结构域来正常运作的二分型BE(BBE)。与先前描述的在单体单元中含有脱氨和形成R-环两者的装置(machinery)的BE不同，我们描述这两种关键功能被分离至两种蛋白中并且这两种蛋白必须共同起作用来刺激稳健脱氨作用的系统。为此，我们将工程化的锌指(ZF)融合至脱氨酶(ZF-脱氨酶)并且将其靶向nCas9-UGI结合位点附近，从而在邻近靶向DNA序列周围重建BE的完整功能并且刺激稳健DNA修饰。由于该二分型酶的有效活性依赖于两个分离的DNA结合结构域的特异性邻近结合，它应通过降低其组成部分在基因组DNA中在其任何脱靶结合位点处稳健起作用的能力来增加碱基编辑的特异性，只要在该位点不发生两个组成成分的邻近结合即可。nCas9与脱氨酶结构域在空间上分离也应减少邻近或在靶向碱基编辑位点处的协同诱导的插入缺失(indel)形成，从而增强整体产物纯度和脱靶插入缺失形成。

虽然一些Cas9直向同源物和变体对于CRISPR介导的DNA结合和基因组或碱基编辑可为不足的(例如PAM相互作用缺陷型(PID)突变或II-C型Cas9^14-16)，我们注意到，通过将它们融合至邻近靶向的工程化的DNA结合结构域例如ZF或TALE来挽救其DNA靶向能力可允许其构成具有比文献中所描述的那些更好的特异性特征的BE的基础。通过要求两个DNA结合结构域(ZF或TALE和缺陷型Cas9变体或直向同源物的邻近结合，所得蛋白指定含有两个靶位点的总DNA靶序列，增加由复合体确定的总碱基数量，从而对技术赋予更大的整体特异性。因此使用这些蛋白作为碱基编辑器的基础构建更加特异性的碱基编辑平台。因此，本文提供用于二分型(bipartite)胞嘧啶碱基编辑器系统的融合蛋白，其包括：(i)第一融合蛋白，其含有与脱氨酶或其活化部分融合的非R-环形成性可编程DNA结合结构域(non-R-loop-forming programmable DNA binding domain)、优选转录激活子样效应子(TALE)或锌指阵列(ZF)，任选地在其间具有接头，或(ii)第二融合蛋白，其含有与尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)融合的R-环形成性Cas9蛋白，任选地在其间具有接头，所述R-环形成性Cas9蛋白缺少核酸酶活性或为切口酶，但可与指导RNA和靶DNA相互作用。

在一些实施方案中，所述第一融合蛋白包括选自由载脂蛋白B mRNA编辑酶催化性多肽样1(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme,catalytic polypeptide-like 1,APOBEC1)、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D/E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4；活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)、胞嘧啶脱氨酶1(CDA1)、和CDA2、以及作用于tRNA的胞嘧啶脱氨酶(CDAT)组成的组的胞苷脱氨酶。

在一些实施方案中，所述第二融合蛋白包括具有D10、E762、D839、H983、或D986和H840或N863处突变的SpCas9切口酶或无活性核酸酶、或者无活性Cpf1(dCpf1)蛋白。在一些实施方案中，所述突变为D10A或D10N、或者H840A/H840N/H840Y中的一者或两者。

在一些实施方案中，所述DNA结合结构域包括锌指DNA结合阵列。

本文还描述了单体融合蛋白，其包括(i)第一部分，其含有脱氨酶或其活化部分，(ii)第二部分，其含有Cas9蛋白，所述Cas9蛋白缺少核酸酶活性或为切口酶，并且可与指导RNA相互作用但不足以结合靶DNA或形成R-环来加强基因组编辑或碱基事件，(iii)第三部分，其含有选自锌指和TALE的DNA结合结构域，和任选地(iv)第四部分，其含有尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)，任选地在第一、第二、第三、或第四部分中的一些或全部之间具有肽接头，并且其中结构域(i)-(iv)可为任何顺序。

此外，本文还提供融合蛋白，其包括(i)第一部分，其含有脱氨酶或其活化部分，(ii)第二部分，其含有Cas9蛋白，所述Cas9蛋白缺少核酸酶活性或为切口酶，并且可与指导RNA相互作用但不足以结合靶DNA或形成R-环来加强基因组编辑或碱基事件，所述Cas9蛋白例如II-C型Cas9直向同源物或类似缺陷物，和(iii)第三部分，其含有选自锌指和TALE的DNA结合结构域，任选地在第一、第二、或第三部分中的一些或全部之间具有肽接头，并且其中结构域(i)-(iii)可为任何顺序。

在一些实施方案中，所述第一部分包括选自由载脂蛋白B mRNA编辑酶催化性多肽样1(APOBEC1)、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D/E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4；活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)、胞嘧啶脱氨酶1(CDA1)、和CDA2、以及作用于tRNA的胞嘧啶脱氨酶(CDAT)组成的组的胞苷脱氨酶。

在一些实施方案中，所述第二部分包括具有D10、E762、D839、H983、或D986和H840或N863处突变的SpCas9核酸酶，或II-C型Cas9直向同源物。在一些实施方案中，所述突变为D10A或D10N、或者H840A/H840N/H840Y中的一者或两者。

在一些实施方案中，所述第二部分包括PlCas9、ClCas9、或NcCas9；或者具有对PAM相互作用结构域(PID)的突变的SpCas9、SaCas9、或CjCas9，例如如表2所示。

本文还提供包含纯化的本文所述融合蛋白的组合物，任选地进一步包括与所述融合蛋白的Cas9部(portion)相互作用的指导RNA。在一些实施方案中，所述组合物包括一个或多个核糖核蛋白(RNP)复合体。

此外，本文提供编码本文所述融合蛋白的核酸、含有所述核酸的载体、以及包含和/或表达所述融合蛋白的分离的宿主细胞。

还提供了含有编码本文所述融合蛋白的核酸的组合物。

另外，提供用于使核酸中一个或多个所选胞嘧啶靶向性脱氨的方法。所述方法包括使核酸与本文所述融合蛋白、以及指导RNA(gRNA)相接触，所述指导RNA与所述融合蛋白的Cas9部相互作用并且结合至所述核酸的含有或邻近所选胞嘧啶(例如，在1、2、5、10、15、或20nt内)的部分。在一些实施方案中，所述核酸在细胞、优选真核细胞中。

本文还提供用于使细胞中的核酸靶向性脱氨的方法。所述方法包括在细胞中表达、或使细胞接触：本文所述融合蛋白、以及指导RNA(gRNA)，所述指导RNA与所述融合蛋白的Cas9部相互作用并且结合至所述核酸的含有或邻近所选胞嘧啶(例如，在1、2、5、10、15、或20nt内)的部分。

在一些实施方案中，所述融合蛋白以RNP的形式递送、或者以含有编码所述融合蛋白的序列的mRNA或质粒的形式递送。

本文还提供核糖核蛋白(RNP)复合体，其包括本文所述的变体SpCas9和靶向以下序列的指导RNA，所述序列具有由含有Cas9的二分型脱氨酶融合蛋白靶向的PAM序列。

本文还提供用于使核酸中所选胞嘧啶靶向性脱氨、或改进靶向性脱氨的特异性的方法，其包括将核酸与一个或多个本文所述的融合蛋白或碱基编辑系统相接触。在一些实施方案中，所述融合蛋白以RNP的形式递送、或者以含有编码本文所述融合蛋白的序列的mRNA或质粒的形式递送。

本文还提供使核酸中所选胞嘧啶脱氨的方法，所述方法包括使核酸与本文所述的融合蛋白或碱基编辑系统接触。

另外，本文提供组合物，其包含如本文所述的纯化的融合蛋白或碱基编辑系统。

此外，本文还提供编码本文所述的融合蛋白或碱基编辑系统的核酸，以及包含这些核酸的载体，和包含这些核酸的宿主细胞，例如，干细胞，例如，造血干细胞。

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文中描述了用于本发明中的方法和材料；也可以使用本领域公知的其他合适方法和材料。材料、方法和实施例仅为示例性的，而非旨在限制。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利、序列和数据库条目和其他参考文献通过引用的方式完整并入。在矛盾的情况下，本说明书(包括定义)将居主导。

本发明的其他特征和优点将从以下具体实施方式及附图并且从权利要求中显而易见。

附图说明

图1.与ZF作为嵌合型BE技术的Cas9 PID突变体或II-C型Cas9。将6-指锌指阵列和UGI融合至nCas9的C-末端并且将任何野生型或工程化的脱氨酶结构域融合至nCas9的N-末端。ZF结合序列直接邻近gRNA靶位点。在该模型中，ZF的结合是通过nCas9形成R-环的先决条件，大大减少邻近ZF结合位点的、可能形成R-环的可能的脱靶位点的数量。本文还描述使用TALE代替ZF的类似策略。

图2.II-C型Cas9说明当融合至3-指ZF时，在人细胞中在其靶位点处的增加的结合和核酸酶活性。在该试验中，将染色体整合型EGFP基因用作结合(通过转录的空间位阻)或核酸酶活性(通过编码序列中NHEJ介导的小插入和缺失)的报告基因。表达各种Cas9直向同源物和具有与EGFP报告基因20-或23-核苷酸同源的gRNA的质粒的瞬时转染导致EGFP的破坏或抑制，当通过流式细胞仪试验时得到EGFP-阴性细胞。在所有情况中，ZF融合伴侣的添加增加所试验的Cas9直向同源物的EGFP破坏率。尤其，向PlCas9添加ZF融合伴侣将该直向同源物的EGFP破坏活性从背景水平提高至85％。

图3.二分型碱基编辑结构的示意图。产生切口的Cas9(nCas9)通过指导RNA(gRNA)靶向脱氨位点。其后R-环形成在不被nCas9结合的DNA链(脱氨链)上产生ssDNA编辑窗口。锌指-脱氨酶复合体靶向形成的R-环附近的dsDNA。编辑窗口内的靶胞嘧啶被脱氨。产生切口的Cas9在基因组DNA(非脱氨链)中诱导单链断裂(SSB)，从而吸引例如涉及错配修复(MMR)途径的DNA修复蛋白。随着编辑的靶胞嘧啶转换为尿嘧啶并且脱氨链作为产生切口的(未脱氨的)链的模板，修复偏向于预期的胞嘧啶至胸腺嘧啶转变。

图4.使用hA3A融合物在不同实验条件下在gRNA 5和gRNA 2靶位点处的重叠的胞嘧啶至胸腺嘧啶(C-至-T)转变。常规的hA3A-BE(hA3A-nCas9-UGI)作为阳性对照。具有与Cas9靶位点的5’结合的锌指-脱氨酶复合体的二分型碱基编辑器(BBE)显示出在相应靶位点的有效碱基编辑。对靶向的BBE相比，仅hA3A-ZF-UGI或靶位点附近的BBE未显示或大大减少的置换率。示出SEQ ID NOs.:1-2。

图5.比较rAPOBEC1-融合物下，在gRNA 2靶位点处的重叠的C-至-T转变。常规rAPOBEC1-BE(BE3)作为阳性对照。具有与Cas9靶位点的5’结合的锌指-脱氨酶复合体的二分型碱基编辑器(BBE)显示出在靶位点处的有效碱基编辑。与靶向的BBE相比，仅rAPOBEC1-ZF-UGI未显示碱基编辑活性。示出SEQ ID NO:3。

图6.比较hA3A-融合物下，gRNA 4靶位点处发生的重叠的胞嘧啶至胸腺嘧啶转变。与前述实验相反，锌指-脱氨酶复合体的方向为与nCas9反向平行，与gRNA 4靶位点的3’结合。因此，N-末端脱氨酶(hA3A)面向非靶链(ssDNA脱氨链)的3’端，其导致C-至-T编辑移位至3’端并且在典型BE1-4编辑窗口外。示出通过ZF-脱氨酶组分的差别取向/定位来空间控制碱基编辑窗口。示出SEQ ID NO:6。

图7A-7D.二分型碱基编辑器可以通过在编辑窗口侧翼添加UGI以及空间分隔切口结构域和脱氨酶来赋予增强的产物纯度。(7A)示出常规胞嘧啶至胸腺嘧啶碱基编辑的“产物杂质”，其由胞嘧啶至嘌呤(R)副产物以及插入缺失组成。(7B)与常规脱氨酶-nCas9-UGI融合物(例如，BE3或hA3A-nCas9-UGI)相比，含有双重的、二分型UGI的BBE显示出大大减少的EGFP gRNA2靶位点的全部胞苷中的胞嘧啶至嘌呤(R)副产物。(7C)跨gRNA2位点的单碱基的重叠显示出相关缺失频率。hA3A和rAPOBEC1二分型碱基编辑器均将缺失频率显著降低至对照水平。(7D)将C中的数据描述为跨靶位点和+/-25bp侧翼位点的缺失频率的分布图。

具体实施方式

在迄今描述的最有效的BE配置中，胞苷脱氨酶(DA)结构域和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI；抑制宿主细胞尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)(该酶负责从基因组切除尿嘧啶)的噬菌体小蛋白^1,4)均融合至nCas9(衍生自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9))。nCas9在依据其指导RNA(gRNA)和邻近前间区序列邻近基序(PAM)识别作用所规定的靶位点形成R-环，任由大约4-8个核苷酸非靶链作为单链DNA(ssDNA)暴露在R-环的PAM远端附近。该ssDNA区域是能够由ssDNA特异性的DA结构域脱氨以产生鸟苷:尿嘧啶(G:U)错配的模板并且限定了编辑窗口。nCas9切刻DNA的非脱氨链，通过指导细胞利用脱氨链作为模板修复切口损伤，使G:U错配的转换偏向于腺嘌呤:胸腺嘧啶(A:T)碱基对。迄今，这些融合蛋白中所述的DA结构域是大鼠APOBEC1(rAPO1)、衍生自七鳃鳗的活化诱导胞苷脱氨酶(AID)(称作CDA(PmCDA))、人AID(hAID)、或缺少核输出信号的hAID超活性形式^1-2,5-7。主要使用SpCas9蛋白针对其nCas9结构域(nSpCas9)建立BE技术，然而尽管本文中我们提到nCas9，但除非特别指示，否则基于Cas9蛋白的任何直向同源物(包括相关的Cpf1酶类)，通常可以使用任何Cas9样切口酶或无催化活性的Cas9。

在治疗环境中使用BE的一个重要考虑将要评估其全基因组脱靶诱变能力及将要修改该技术以最小化或理想地消除刺激有害脱靶突变的风险。这里，我们描述了对BE的技术性改进，这些改进可以用来减少或消除不需要的潜在BE诱变。

锌指/Cas9融合蛋白限制脱靶结合和脱氨

尽管RNA指导的核酸酶(例如，nCas9，参见表1的示例性可能的融合直向同源物的非详细列表)与胞苷或腺嘌呤脱氨酶(BE)的融合已证明是有效工具，但与该技术相关的主要安全问题集中在DNA的意外脱氨的可能性上。尽管缺少对单链DNA(ssDNA)的Cas9独立性脱氨酶活性的无偏见的全基因组检测，最近发表的数据提示脱靶碱基编辑在Cas9的已知脱靶结合位点发生^6,7。由于该类型的脱靶涉及核酸酶的靶向和结合，与切割相关的脱靶相反，高保真度Cas9变体的使用可在该情况下受到限制。

重要的是，取决于特定gRNA序列，Cas9:gRNA靶向通常可在不同程度上承受脱靶结合事件，这可作为脱靶BE诱变形成的重要来源⁸。尽管工程化酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9(SpCas9)以增加其作为核酸酶的特异性的努力已获得成功，但如高保真度SpCas9(HF-Cas9)⁹或eSpCas9¹⁰等工程化试剂的特异性优点可能无法转化为其中Cas9主要用作与BE一样的靶向平台的环境。普遍认为Cas9结合和Cas9切割的热力学参数显著不同，如观察到的由非常短的gRNA(～12-14nts)足以靶向无催化活性的基于SpCas9的转录因子融合物来改变基因表达所证明¹¹，而通过SpCas9切割DNA需要gRNA 17个核苷酸或更长¹²。因此，工程化BE的nSpCas9结构域来简单地包括工程化的HF-SpCas9突变可能不是消除BE的nSpCas9结构域激发脱靶脱氨事件的能力的最优策略。

一种减少脱靶脱氨事件的策略是将nCas9结合和R-环形成限制在gRNA位点，所述位点直接邻近转录激活子样效应子(TALE)或锌指阵列(ZE)结合位点(图3)，其同源TALE或ZF已并入BE结构。几个组已描述了“传统的”双链断裂诱导基因组编辑试剂，除了通常认为增加融合蛋白的整体特异性所必需的以外，其还使用额外的工程化的DNA结合结构域^13,14。应注意的是，当ZF和gRNA靶向邻近基因组序列时，敲低版本的SpCas9和6指ZF结构域之间的融合物显示出增加SpCas9介导的基因组编辑的特异性¹⁴。本文描述使用例如TALE或ZF等非R-环形成性DNA结合结构域的改进的BE技术以限制瞬时R-环的数量和范围，从而将ssDNA在整个基因组中暴露于BE的脱氨。该策略增加指定的碱基的数量，从而除了由TALE或ZF结构域指定的碱基外还包括gRNA所指定的那些(例如，3指ZF结构域的添加比单独的nCas9指定～9-10个更多的碱基)。

为此，将TALE结构域阵列或ZF阵列融合至Cas9蛋白的N-或C-末端，所述Cas9蛋白无法与其gRNA在人细胞中指定的靶序列有效结合(关于可用于这些融合蛋白的蛋白质的列表，参见表2)。II-A型Cas9蛋白SpCas9或SaCas9的对PAM相互作用结构域(PID)的突变足以阻止这些蛋白在没有第二DNA结合结构域融合伴侣的情况下，在人细胞中有效发挥功能^14,15(关于PID突变的列表，参见表2)。II-C型Cas9直向同源物是一类在进化上不同的Cas9酶，其不具有解旋双链DNA的能力¹⁶。当与它们的同源gRNA共表达时，这些Cas9直向同源物中的一些不能在人细胞中切割基因组位点；然而，我们已发现，3指ZF融合伴侣所添加的亲和性允许这些Cas9直向同源物高活性地结合并切割基因组位点(图2)。在该设置中，UGI融合至ZF的与nCas9相反的末端，或使用例如2A元件等自切割肽与ZF-Cas9融合物共表达，或从内部核糖体进入位点独立地翻译。该策略也可与TALE DNA结合结构域一起使用来代替ZF。在任何配置中，这样的配置可用于通过延伸由靶向性复合体指定的功能性DNA结合位点来增强BE保真度。

二分型碱基编辑器(BBE)结构限制脱靶脱氨、增强产物纯度和可空间控制碱基编辑窗口

二分型BE(BBE)平台，其包括如图3中所示靶向邻近序列的、与脱氨酶结构域和R-环形成性Cas9组分(无催化活性的dCas9或产生切口的nCas9或类似无活性的Cas9直向同源物)融合的非R-环形成性DNA结合结构域(例如ZF或TALE)，并且可用来增强BE特异性。在该配置中，含脱氨酶的蛋白的结合需要R-环形成性蛋白的邻近结合来有效发挥作用，这是由于用于碱基编辑的脱氨酶(具体地，可以考虑表2中列出的任何脱氨酶结构域、或可以化学突变DNA碱基的任何其他酶促结构域)主要对在R-环形成期间暴露的ssDNA起效。该配置可用于通过有效扩展需要被复合体结合以使DNA突变的DNA碱基的总数量来增加特异性，这是由于ZF-或TALE-脱氨酶或R-环形成性组分的各个脱靶结合本身应具有降低的使DNA突变的能力。尽管其仍包括完全完整的脱氨酶，与标准BE相比，由于ZF-脱氨酶缺少产生稳定R-环来暴露ssDNA的能力，锌指-脱氨酶蛋白的脱靶结合具有显著降低的产生突变的能力。同时，由于dCas9或nCas9分子缺少脱氨酶结构域，其脱靶结合本身不具有刺激不需要的脱氨事件的能力，因此它可被认为是酶惰性的并且仅可通过其在DNA中产生单链切口的能力或通过将ssDNA暴露于其他核因子作为R-环形成的副产物来诱导低水平脱靶突变。

第二，尽管BBE的nCas9(具有或没有UGI)组分在该配置下可结合至假定脱靶位点并且形成切口，但由于其缺少脱氨酶结构域，其自身不可刺激脱靶碱基编辑。作为高度模块化系统(modular system)，可以通过各种产生切口或无催化活性的Cas9变体(可能的直向同源物参见表1)的共表达/应用，例如使用不同的PAM偏好，来严格控制中靶脱氨。总之，基因组共定位(“AND门”)来自两个独立表达的最小化脱靶风险的不同蛋白。该二分型碱基编辑(BBE)系统的每“一半”对于在目标靶位点指挥脱氨酶介导的诱变是必需的，通过将脱氨酶定位限制至邻近nCas9介导的R-环形成的位点，降低脱靶脱氨的可能性并且导致整个基因组中在nCas9脱靶位点处的突变。

总之，BBE平台在恒定或潜在增强的靶胞嘧啶至胸腺嘧啶编辑效率下提供高度优化的产物浓度，并且具有增强的编辑窗口控制的优点以及减少全基因组Cas9相关的脱靶脱氨的前景。

DNA结合结构域

本融合蛋白可包括1个、2个、或更多DNA结合结构域，例如锌指核酸酶、转录激活子效应子(TALE)、和成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)Cas RNA指导的核酸酶(RGN)。

CRISPR-Cas核酸酶

尽管本文中我们提到nCas9和dCas9，但除非特别指出，否则通常对于BBE系统可以使用任何无活性的或仅具有切口酶活性的R-环形成性Cas9样酶，例如Cas9蛋白(包括相关的Cpf1酶类)的任何直向同源物。

表1：示例性Cas9直向同源物列表

*基于UniProt数据库上的UniRule注释预测。

**可以基于与其他Cpf1直向同源物的序列比对来确定

本领域公知的这些直向同源物、及其突变体与变体可以用于本文所述的任何融合蛋白中。例如，参见WO 2017/040348(其描述特异性增加的SaCas9和SpCas9变体)和WO2016/141224(描述PAM特异性改变的SaCas9和SpCas9变体)。

来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶(此后简称为Cas9)可以受工程化指导RNA(gRNA)例如单一指导RNA或crRNA/tracrRNA对(pair)等的17-20个核苷酸和例如匹配序列NGG或NAG的PAM等的紧邻前间区序列邻近基序(PAM)的目标靶基因组DNA序列的互补链之间的简单碱基对互补性指导(Shen等人,Cell Res(2013)；Dicarlo等人,Nucleic Acids Res(2013)；Jiang等人,Nat Biotechnol 31,233-239(2013)；Jinek等人,Elife 2,e00471(2013)；Hwang等人,Nat Biotechnol 31,227-229(2013)；Cong等人,Science 339,819-823(2013)；Mali等人,Science 339,823-826(2013c)；Cho等人,Nat Biotechnol 31,230-232(2013)；Jinek等人,Science 337,816-821(2012))。也可以使用工程化的来自普氏菌属和弗朗西斯菌属的CRISPR 1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1,Cpf1)核酸酶，例如，如Zetsche等人,Cell 163,759-771(2015)；Schunder等人,Int J Med Microbiol 303,51-60(2013)；Makarova等人,Nat Rev Microbiol 13,722-736(2015)；Fagerlund等人,GenomeBiol 16,251(2015)中所述。不同于SpCas9，Cpf1仅需要单一42nt crRNA，其在3'末端具有23nt与靶DNA序列的前间区序列互补的核苷酸(Zetsche等人,2015)。另外，SpCas9识别存在于前间区3’的NGG PAM序列，而AsCpf1和LbCp1识别存在于前间区5’的TTTN PAM(同上)。

在一些实施方案中，本发明的系统利用来自酿脓链球菌或金黄色葡萄球菌的野生型或变体Cas9蛋白或来自氨基酸球菌属物种BV3L6或毛螺科细菌ND2006的野生型Cpf1蛋白，所述蛋白质如在细菌中编码或经密码子优化以在哺乳动物细胞中表达和/或在其PAM识别特异性和/或其全基因组特异性方面被修饰。已经描述多种变体；例如，特别参见WO2016/141224；PCT/US2016/049147；Kleinstiver等人,Nat Biotechnol.2016 Aug；34(8):869-74；Tsai和Joung,Nat Rev Genet.2016 May；17(5):300-12；Kleinstiver等人,Nature.2016 Jan 28；529(7587):490-5；Shmakov等人,Mol Cell.2015 Nov 5；60(3):385-97；Kleinstiver等人,Nat Biotechnol.2015 Dec；33(12):1293-1298；Dahlman等人,NatBiotechnol.2015 Nov；33(11):1159-61；Kleinstiver等人,Nature.2015 Jul 23；523(7561):481-5；Wyvekens等人,Hum Gene Ther.2015 Jul；26(7):425-31；Hwang等人,Methods Mol Biol.2015；1311:317-34；Osborn等人,Hum Gene Ther.2015Feb；26(2):114-26；Konermann等人,Nature.2015Jan 29；517(7536):583-8；Fu等人,MethodsEnzymol.2014；546:21-45；和Tsai等人,Nat Biotechnol.2014 Jun；32(6):569-76。指导RNA与Cas9或Cpf1一起表达或存在于细胞中。指导RNA或核酸酶之一或两者可以在细胞中瞬时或稳定表达、或作为纯化的蛋白或核酸引入。

表2示出可与ZF或TALE用作嵌合蛋白的潜在Cas9直向同源物。PlCas9、ClCas9、和NcCas9无法有效结合其在真核细胞中的靶位点，同时CjCas9在其靶位点具有大量活性，需要PAM相互作用结构域突变来敲低其有效结合其位点的能力。切口酶突变残基表示保守RuvC核酸酶结构域的催化活性所需的酶的位置、或基于与缺少结构信息的CjCas9序列比对来预测的该催化活性所需的酶的位置。

表2.Cas9直向同源物

*表示缺少充足结构信息的蛋白质。全部的位置信息指的是获得自uniprot.org的野生型蛋白质序列。

在一些实施方案中，Cas9还包含一个或多个突变，所述突变减少Cas9的核酸酶活性；例如，对于SpCas9，D10A或H840A处的突变(所述突变产生单链切口酶)。

在一些实施方案中，SpCas9变体还在以下氨基酸位置之一处包含破坏Cas9的核酸酶活性的突变：D10、E762、D839、H983、或D986和H840或N863，例如D10A/D10N和H840A/H840N/H840Y，以使该蛋白质的核酸酶部分无催化活性；在这些位置处的置换可以是丙氨酸(如它们在Nishimasu等人,Cell 156,935–949(2014)中那样)或其他残基，例如，谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸、丝氨酸或天冬氨酸，例如，E762Q、H983N、H983Y、D986N、N863D、N863S或N863H(参见WO 2014/152432)。

在一些实施方案中，融合蛋白包括一个或多个尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)蛋白序列；示例性UGI序列如下：

TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML(SEQ ID NO:7；Uniprot:P14739)。通常，UGI在C-末端，但也可以在N末端，或在本文所述融合蛋白的各组分之间。可使用本领域已知的接头。

TAL效应子重复阵列

通过结合宿主DNA并激活效应子特异性宿主基因，黄单胞菌属(Xanthomonas)中植物病原体细菌的TAL效应子在疾病或触发防御中发挥重要作用。特异性取决于不完全的、通常约33-35个氨基酸重复的效应子可变数量。多态性主要存在于重复位置12和13处，所述重复位置在本文中称作重复可变双残基(RVD)。TAL效应子的RVD以直接、线性方式对应于其靶位点中的核苷酸，一个RVD对应于一个核苷酸，具有某种简并性且无明显的邻近依赖性。在一些实施方案中，赋予核苷酸特异性的多态性区域可以表示为三残基或三联体。

每个DNA结合重复序列可以包含决定靶DNA序列中碱基对识别的RVD，其中每个DNA结合重复序列负责识别靶DNA序列中的一个碱基对。在一些实施方案中，RVD可以包括以下一种或多种：识别C的HA；识别C的ND；识别C的HI；识别G的HN；识别G的NA；识别G或A的SN；识别T的YG；和识别G的NK，和以下一种或多种：识别C的HD；识别T的NG；识别A的NI；识别G或A的NN；识别A或C或G或T的NS；识别C或T的N*，其中*代表RVD的第二位置中的缺口；识别T的HG；识别T的H*，其中*代表RVD的第二位置中的缺口；和识别T的IG。

TALE蛋白可以在研究和生物技术中用作靶向嵌合核酸酶，所述靶向嵌合核酸酶可以在基因组工程中促进同源重组(例如，植物中加入或增强可用于生物燃料或生物可再生物质的性状)。这些蛋白质还可以例如用作转录因子，并且特别用于要求极高水平特异性的治疗性应用，例如对病原体(例如，病毒)的治疗药等作为非限制性实例。

本领域公知用于产生工程化TALE阵列的方法，例如，参见在USSN 61/610,212和Reyon等人,Nature Biotechnology 30,460–465(2012)中描述的基于快速连接的可自动化固相高通量(FLASH)系统；以及以下文献中描述的方法：Bogdanove和Voytas,Science 333,1843-1846(2011)；Bogdanove等人,Curr Opin Plant Biol 13,394-401(2010)；Scholze和Boch,J.Curr Opin Microbiol(2011)；Boch等人,Science 326,1509-1512(2009)；Moscou和Bogdanove,Science 326,1501(2009)；Miller等人,Nat Biotechnol 29,143-148(2011)；Morbitzer等人,T.Proc Natl Acad Sci U S A 107,21617-21622(2010)；Morbitzer等人,Nucleic Acids Res 39,5790-5799(2011)；Zhang等人,Nat Biotechnol29,149-153(2011)；Geissler等人,PLoS ONE 6,e19509(2011)；Weber等人,PLoS ONE 6,e19722(2011)；Christian等人,Genetics 186,757-761(2010)；Li等人,Nucleic AcidsRes 39,359-372(2011)；Mahfouz等人,Proc Natl Acad Sci U S A 108,2623-2628(2011)；Mussolino等人,Nucleic Acids Res(2011)；Li等人,Nucleic Acids Res 39,6315-6325(2011)；Cermak等人,Nucleic Acids Res 39,e82(2011)；Wood等人,Science333,307(2011)；Hockemeye等人Nat Biotechnol 29,731-734(2011)；Tesson等人,NatBiotechnol 29,695-696(2011)；Sander等人,Nat Biotechnol 29,697-698(2011)；Huang等人,Nat Biotechnol 29,699-700(2011)；和Zhang等人,Nat Biotechnol 29,149-153(2011)；所述文献全部内容均通过引用的方式结合在此。

还适用于本发明方法的是MegaTAL，它们是大范围核酸酶(meganucleases)与TAL效应子的融合物；例如，参见Boissel等人,Nucl.Acids Res.42(4):2591-2601(2014)；Boissel和Scharenberg,Methods Mol Biol.2015；1239:171-96。

锌指

锌指蛋白是含有一个或多个锌指的DNA结合蛋白，所述锌指是独立折叠的含锌微型结构域，其结构为本领域熟知的并且在例如Miller等人,1985,EMBO J.,4:1609；Berg,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:99；Lee等人,1989,Science.245:635；和Klug,1993,Gene,135:83中定义。与DNA结合的锌指蛋白Zif268及其变体的晶体结构示出相互作用的半保守模式，其中来自锌指的α-螺旋的三个氨基酸通常与DNA中的三个邻近碱基对或“子位点”接触(Pavletich等人,1991,Science,252:809；Elrod-Erickson等人,1998,Structure,6:451)。因此，Zif268的晶体结构提示，锌指DNA结合结构域可以以模块方式以锌指和DNA序列中的三碱基配对“子位点”之间一对一的相互作用来发挥功能。在天然存在的锌指转录因子中，多个锌指通常以(例如3、4或6个锌指的)串联阵列连接在一起，以实现对连续DNA序列的序列特异性识别(Klug,1993,Gene 135:83)。

多项研究已经显示，通过使α-螺旋位置处涉及DNA结合作用的氨基酸随机化并且使用例如噬菌体展示等的选择方法来识别能够与目标DNA靶位点结合的所需变体，可以人工工程化各个锌指的DNA结合特征(Rebar等人,1994,Science,263:671；Choo等人,1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:11163；Jamieson等人,1994,Biochemistry 33:5689；Wu等人,1995Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:344)。这类重组锌指蛋白可以融合至例如转录激活物、转录阻遏蛋白、甲基化结构域和核酸酶等功能性结构域来调节基因表达、改变DNA甲基化并将靶向性改变引入模式生物、植物和人细胞的基因组(Carroll,2008,Gene Ther.,15:1463-68；Cathomen,2008,Mol.Ther.,16:1200-07；Wu等人,2007,Cell.Mol.Life Sci.,64:2933-44)。

一种工程化锌指阵列的既有方法，称作“模块式组装法”，提倡将预先选择的锌指模块简单连接在一起成阵列(Segal等人,2003,Biochemistry,42:2137-48；Beerli等人,2002,Nat.Biotechnol.,20:135-141；Mandell等人,2006,Nucleic Acids Res.,34:W516-523；Carroll等人,2006,Nat.Protoc.1:1329-41；Liu等人,2002,J.Biol.Chem.,277:3850-56；Bae等人,2003,Nat.Biotechnol.,21:275-280；Wright等人,2006,Nat.Protoc.,1:1637-52)。尽管足够简单可由任何研究者实施，但近期报告已经展示该方法的失败率高，特别是在锌指核酸酶背景下(Ramirez等人,2008,Nat.Methods,5:374-375；Kim等人,2009,Genome Res.19:1279-88)，限制为通常需要构建并基于细胞试验针对任何给定靶基因的极大量锌指蛋白(Kim等人,2009,Genome Res.19:1279-88)。

已经证实从随机化文库鉴定锌指阵列的基于组合选择的方法具有比模块式组装法更高的成功率(Maeder等人,2008,Mol.Cell,31:294-301；Joung等人,2010,Nat.Methods,7:91-92；Isalan等人,2001,Nat.Biotechnol.,19:656-660)。在优选的实施方案中，在WO 2011/017293和WO 2004/099366中的描述或如其中所述那样生成锌指阵列。美国专利号6,511,808、6,013,453、6,007,988、和6,503,717和美国专利申请2002/0160940中描述了其他合适的锌指DBD。

二分型碱基编辑器

在一些实施方案中，碱基编辑器是DNA结合结构域与脱氨酶或其活性部分的融合物，其修饰胞嘧啶DNA碱基，例如来自脱氨酶的载脂蛋白B mRNA编辑酶催化性多肽样(APOBEC)家族的胞苷脱氨酶，包括APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D/E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4(例如，参见Yang等人,J GenetGenomics.2017Sep 20；44(9):423-437)；例如活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)等活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)、胞嘧啶脱氨酶1(CDA1)和CDA2、和作用于tRNA的胞嘧啶脱氨酶(CDAT)。下表2提供示例性序列；也可以使用其他序列。

表2

*来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C

变体

在一些实施方案中，融合蛋白的组分与(例如，如本文提供的)示例性序列的氨基酸序列至少80％相同，例如，至少85％、90％、95％、97％或99％相同，例如，在示例性序列的多达5％、10％、15％或20％残基处具有差异，例如具有除本文所述突变之外的保守突变。在优选实施方案中，变体保留亲本的所需活性，例如，在Cas9变体或片段的情况下，切口酶活性或无核酸酶活性，和/或在脱氨酶变体或其活化部分的情况下，与指导RNA和/或靶DNA相互作用的能力，或脱氨酶活性。

为了确定两个核酸序列的同一性百分比，为了最佳比较目的将序列比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入空位用于最佳的比对，或者出于比较的目的可以忽略非同源序列)。出于比较目的而比对的参考序列的长度是参考序列长度的至少80％，并且在一些实施方案中是至少90％或100％。随后比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的核苷酸占据时，则该分子在该位置是同一的(如本文所用，核酸“同一性”等同于核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的同一的位置的数量的函数，考虑了为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数量和每个空位的长度。按照本领域技术范围内的各种方式确定两个多肽或核酸序列之间的同一性百分比，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如Smith Waterman Alignment(Smith,T.F.和M.S.Waterman(1981)J Mol Biol 147:195-7)；已合并到GeneMatcher Plus^TM,Schwarz和Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence andStructure,Dayhof,M.O.编著,第353-358页中的“BestFit”(Smith和Waterman,Advancesin Applied Mathematics,482-489(1981))；BLAST程序(基本局部比对检索工具；(Altschul,S.F.,W.Gish等人,(1990)J Mol Biol 215:403-10)、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL或Megalign(DNASTAR)软件。此外，本领域技术人员可以确定用于衡量比对的合适参数，包括在被比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。通常，对于蛋白质或核酸，比较的长度可以是任何长度，达到并包括全长(例如，5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)。出于本发明组合物和方法的目的，序列全长的至少80％进行比对。

为了本发明的目的，序列的比较和两个序列之间同一性百分比可以使用空位罚分12、空位延伸罚分4以及移框缺口罚分5的Blossum 62评分矩阵来确定。

保守性置换一般包括在以下组内的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。

本文还提供编码二分型脱氨酶融合蛋白的分离的核酸；包含分离的核酸的载体，所述核酸任选地与一个或多个调节结构域可操作地连接以表达变体蛋白；以及宿主细胞，例如，哺乳动物宿主细胞，所述细胞包含核酸并且任选地表达变体蛋白。在一些实施方案中，宿主细胞是干细胞，例如，造血干细胞。

本文所述的二分型脱氨酶融合蛋白可用于改变细胞的基因组。所述方法通常包括在细胞中表达或接触融合蛋白；在使用一种或两种Cas9的版本中，这些方法包括使用具有与细胞基因组的所选部分互补的区域的指导RNA。本领域已知选择性改变细胞基因组的方法，例如，参见US 8,993,233；US 20140186958；US 9,023,649；WO/2014/099744；WO 2014/089290；WO2014/144592；WO144288；WO2014/204578；WO2014/152432；WO2115/099850；US8,697,359；US20160024529；US20160024524；US20160024523；US20160024510；US20160017366；US20160017301；US20150376652；US20150356239；US20150315576；US20150291965；US20150252358；US20150247150；US20150232883；US20150232882；US20150203872；US20150191744；US20150184139；US20150176064；US20150167000；US20150166969；US20150159175；US20150159174；US20150093473；US20150079681；US20150067922；US20150056629；US20150044772；US20150024500；US20150024499；US20150020223；；US20140356867；US20140295557；US20140273235；US20140273226；US20140273037；US20140189896；US20140113376；US20140093941；US20130330778；US20130288251；US20120088676；US20110300538；US20110236530；US20110217739；US20110002889；US20100076057；US20110189776；US20110223638；US20130130248；US20150050699；US20150071899；US20150050699；；US20150045546；US20150031134；US20150024500；US20140377868；US20140357530；US20140349400；US20140335620；US20140335063；US20140315985；US20140310830；US20140310828；US20140309487；US20140304853；US20140298547；US20140295556；US20140294773；US20140287938；US20140273234；US20140273232；US20140273231；US20140273230；US20140271987；US20140256046；US20140248702；US20140242702；US20140242700；US20140242699；US20140242664；US20140234972；US20140227787；US20140212869；US20140201857；US20140199767；US20140189896；US20140186958；US20140186919；US20140186843；US20140179770；US20140179006；US20140170753；WO/2008/108989；WO/2010/054108；WO/2012/164565；WO/2013/098244；WO/2013/176772；US 20150071899；Makarova等人,"Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems"9(6)Nature ReviewsMicrobiology 467-477(1-23)(2011年6月)；Wiedenheft等人,"RNA-guided geneticsilencing systems in bacteria and archaea"482 Nature 331-338(2012年2月16日)；Gasiunas等人,"Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNAcleavage for adaptive immunity in bacteria"109(39)Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA E2579-E2586(2012年9月4日)；Jinek等人,"A ProgrammableDual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity"337 Science816-821(2012年8月17日)；Carroll,"A CRISPR Approach to Gene Targeting"20(9)Molecular Therapy 1658-1660(2012年9月)；2012年5月25日提交的美国申请号61/652,086；Al-Attar等人,Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPRs):The Hallmark of an Ingenious Antiviral Defense Mechanism inProkaryotes,Biol Chem.(2011)第392卷,第4期,pp.277-289；Hale等人,EssentialFeatures and Rational Design of CRISPR RNAs That Function With the Cas RAMPModule Complex to Cleave RNAs,Molecular Cell,(2012)第45卷,第3期,292-302。

在一些实施方案中，所述融合蛋白包含DNA结合结构域(例如，ZFN、TALE或nCas9)和BE结构域之间的接头。可以用于这些融合蛋白(或串联结构的融合蛋白之间)的接头可以包含不干扰所述融合蛋白的功能的任何序列。在优选的实施方案中，所述接头是短的，例如，2-20个氨基酸，并且一般是柔性的(即，包含高自由度的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。在一些实施方案中，所述接头包含由GGGS(SEQ ID NO:8)或GGGGS(SEQ ID NO:9)组成的一个或多个单元，例如，GGGS(SEQ ID NO:8)或GGGGS(SEQ ID NO:9)单元的两个、三个、四个或多个重复。也可以使用其他接头序列。

在一些实施方案中，所述融合蛋白包含促进向细胞内空间递送的细胞穿透肽序列，例如，HIV衍生的TAT肽、穿透素(penetratin)、转运蛋白(transportan)或hCT衍生的细胞穿透肽，例如参见，Caron等人,(2001)Mol Ther.3(3):310-8；Langel,Cell-PenetratingPeptides:Processes and Applications(CRC Press,Boca Raton FL 2002)；El-Andaloussi等人,(2005)Curr Pharm Des.11(28):3597-611；和Deshayes等人,(2005)CellMol Life Sci.62(16):1839-49。

细胞穿透肽(CPP)是短肽，其促进各种各样的生物分子跨细胞膜移动进入细胞质或其他细胞器，例如线粒体和细胞核。可以由CPP递送的分子的例子包括治疗药物、质粒DNA、寡核苷酸、siRNA、肽核酸(PNA)、蛋白质、肽、纳米颗粒和脂质体。CPP通常为30个氨基酸或更少，来源于天然或非天然存在的蛋白质或嵌合序列，含有高相对丰度的正电荷氨基酸，例如赖氨酸或精氨酸，或交替模式的极性和非极性氨基酸。本领域常使用的CPP包括Tat(Frankel等人,(1988)Cell.55:1189-1193；Vives等人,(1997)J.Biol.Chem.272:16010-16017)、穿透素(Derossi等人,(1994)J.Biol.Chem.269:10444-10450)、聚精氨酸肽序列(Wender等人,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:13003-13008；Futaki等人,(2001)J.Biol.Chem.276:5836-5840)和转运蛋白(Pooga等人,(1998)Nat.Biotechnol.16:857-861)。

CPP可以通过共价或非共价策略与它们的货物连接。本领域已知共价连接CPP和它的货物的方法，例如化学交联法(Stetsenko等人,(2000)J.Org.Chem.65:4900-4909；Gait等人,(2003)Cell.Mol.Life.Sci.60:844-853)或克隆融合蛋白(Nagahara等人,(1998)Nat.Med.4:1449-1453)。货物与包含极性和非极性结构域的短的两亲性CPP之间的非共价偶联通过静电和疏水性相互作用来建立。

本领域中已经利用CPP来向细胞递送潜在治疗性的生物分子。实例包括用于免疫抑制的连接到聚精氨酸的环孢菌素(Rothbard等人,(2000)Nature Medicine 6(11):1253-1257)、用于抑制肿瘤形成的、与CPP连接的针对细胞周期蛋白B1的siRNA，称为MPG(Crombez等人,(2007)Biochem Soc.Trans.35:44-46)，与CPP连接的肿瘤抑制物p53肽以减少癌细胞生长(Takenobu等人,(2002)Mol.Cancer Ther.1(12):1043-1049；Snyder等人,(2004)PLoSBiol.2:E36)，和与Tat融合的Ras的显性阴性形式或磷酸肌醇3激酶(PI3K)以治疗哮喘(Myou等人,(2003)J.Immunol.171:4399-4405)。

本领域已经利用CPP将造影剂转运到细胞内用于成像和生物传感应用。例如，附着到Tat的绿色荧光蛋白(GFP)已经用于标记癌细胞(Shokolenko等人,(2005)DNA Repair 4(4):511-518)。缀合至量子点的Tat已经用于成功地跨越血-脑屏障以可视化大鼠脑(Santra等人,(2005)Chem.Commun.3144-3146)。CPP还与磁共振成像技术组合用于细胞成像(Liu等人,(2006)Biochem.and Biophys.Res.Comm.347(1):133-140)。还参见Ramsey和Flynn,Pharmacol Ther.2015Jul 22.pii:S0163-7258(15)00141-2。

可选地或另外地，所述融合蛋白可以包含核定位序列，例如，SV40大T抗原NLS(PKKKRRV(SEQ ID NO:10))和核质蛋白NLS(KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:11))。本领域已知其他NLS；例如，参见Cokol等人,EMBO Rep.2000Nov 15；1(5):411–415；Freitas和Cunha,Curr Genomics.2009Dec；10(8):550–557。

在一些实施方案中，所述融合蛋白包括对配体例如GST序列、FLAG序列或六组氨酸序列具有高亲和性的部分。这样的亲和标签可以促进重组融合蛋白的纯化。

对于其中将融合蛋白递送给细胞的方法，所述融合蛋白可以使用本领域已知的任何方法产生，例如，通过体外翻译，或在合适的宿主细胞中从编码所述融合蛋白的核酸表达；本领域已知许多产生蛋白的方法。例如，所述蛋白可以在酵母、大肠杆菌、昆虫细胞系、植物、转基因动物或培养的哺乳动物细胞中产生并从中纯化；例如，参见Palomares等人,“Production of Recombinant Proteins:Challenges and Solutions,”Methods MolBiol.2004；267:15-52。此外，所述融合蛋白可以连接到便于转移入细胞的部分，例如，脂质纳米颗粒，任选地使用一旦蛋白质处于细胞内部就被切割的接头。例如，参见LaFountaine等人,Int J Pharm.2015 Aug 13；494(1):180-194。

表达系统

为了使用本文所述的融合蛋白，可期望从编码它们的核酸表达这些变体。这可以以多种方式进行。例如，可以将编码融合物的核酸克隆到中间载体中，以便转化入原核细胞或真核细胞用于进行复制和/或表达。中间载体一般是原核生物载体，例如，质粒、或穿梭载体、或昆虫载体，用于编码融合物的核酸的保存或操作，用于产生融合蛋白。也可以将编码融合蛋白的核酸克隆到表达载体中，用于向植物细胞、动物细胞、优选地哺乳动物细胞或人细胞、真菌细胞、细菌细胞或原生动物细胞施用。

为了获得表达，一般将编码融合蛋白的序列亚克隆到含有指导转录的启动子的表达载体中。合适的细菌启动子和真核启动子是本领域熟知的，例如，在Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3d ed.2001)；Kriegler,Gene Transfer andExpression:A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编著,2010)中描述。用于表达工程化蛋白质的细菌表达系统可获自例如大肠杆菌、芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)和沙门氏菌属(Salmonella)(Palva等人,1983,Gene22:229-235)中。用于这类表达系统的试剂盒是市售的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域熟知的并且也是市售的。

用来指导核酸表达的启动子取决于具体应用。例如，强组成型启动子一般用于融合蛋白的表达和纯化。相比之下，当融合蛋白将被体内施用而用于基因调节时，可以使用组成型或诱导型启动子，这取决于融合蛋白的具体运用。此外，用于融合蛋白的施用的优选启动子可以是弱启动子，如HSV TK或具有类似活性的启动子。启动子还可以包含响应于反式激活的元件，例如，低氧反应元件、Gal4反应元件、lac阻遏物反应元件和小分子控制系统，例如四环素调节的系统和RU-486系统(例如，参见Gossen和Bujard,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547；Oligino等人,1998,Gene Ther.,5:491-496；Wang等人,1997,Gene Ther.,4:432-441；Neering等人,1996,Blood,88:1147-55；和Rendahl等人,1998,Nat.Biotechnol.,16:757-761)。

除启动子之外，表达载体一般还含有转录单位或表达盒，其含有核酸在原核或真核宿主细胞中表达所需要的全部其他元件。因此，典型的表达盒含有启动子，其可操作地连接至，例如，编码所述融合蛋白的核酸序列，以及例如为了转录产物的有效多聚腺苷化、转录性终止、核糖体结合位点或翻译终止所需要的任何信号。表达盒的额外元件可以包括，例如，增强子和异源剪接的内含子信号。

针对所述融合蛋白的预期用途选择用于将遗传信息转运入细胞的具体表达载体，例如，在植物、动物、细菌、真菌、原虫等中表达。标准的细菌表达载体包括质粒，例如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D和市售的标签融合表达系统如GST和LacZ。

含有来自真核病毒的调节元件的表达载体经常用于真核表达载体中，例如，SV40载体、乳头瘤病毒载体和来自Epstein-Barr病毒的载体。其他示例性真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，和其他任何载体，所述载体允许蛋白质在SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他示出真核细胞中的表达有效性的启动子的指导下表达。

用于表达所述融合蛋白的载体可以包含RNA Pol III启动子以驱动指导RNA的表达，例如，H1、U6或7SK启动子。这些人类启动子允许融合蛋白在质粒转染后在哺乳动物细胞中表达。

一些表达系统具有用于选择稳定转染的细胞系的标志物，如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。高产率表达系统也是合适的，例如，在昆虫细胞中使用杆状病毒载体，以及在多角体蛋白启动子或其他强杆状病毒启动子的指导下的gRNA编码序列。

一般包括在表达载体中的元件还包括在大肠杆菌中起作用的复制子，编码抗生素抗性的基因以允许选择带有重组质粒的细菌，处在质粒的非关键区域中的独特的限制性位点以允许重组序列的插入。

使用标准转染方法来产生表达大量蛋白质的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，随后使用标准技术进行纯化(例如，参见Colley等人,1989,J.Biol.Chem.,264:17619-22；Guide to Protein Purification,引自Methods in Enzymology,第182卷(Deutscher编著,1990))。根据标准技术进行真核细胞和原核细胞的转化(例如，参见Morrison,1977,J.Bacteriol.132:349-351；Clark-Curtiss和Curtiss,Methods in Enzymology 101:347-362(Wud等人编著,1983)。

可以使用向宿主细胞中引入外源核苷酸序列的任何已知方法。这些方法包括使用磷酸钙转染法、聚凝胺法、原生质体融合法、电穿孔法、核转染法、脂质体法、微量注射法、裸DNA法、质粒载体法、病毒载体(游离的和整合的)和任何其他公知的方法将克隆的基因组DNA、cDNA、合成性DNA或其他外源遗传物质导入宿主细胞中(例如，参见Sambrook等人,上文)。仅仅必需的是，所用的具体基因工程方法能够向可表达所述融合蛋白的宿主细胞中成功地导入至少一种基因。

可选地，这些方法可以包括将融合蛋白和指导RNA一起递送，例如，作为复合体递送。例如，可以将融合蛋白和gRNA在宿主细胞中过量表达并纯化，随后与指导RNA复合(例如，在试管中)以形成核糖核蛋白(RNP)，并递送至细胞。在一些实施方案中，可以通过使用细菌表达质粒，在细菌中表达融合蛋白并从其中纯化。例如，可以将加His标签的融合蛋白在细菌细胞中表达并且随后使用镍亲和色谱纯化。RNP的使用规避了递送编码核酸酶或指导物的质粒DNA或者mRNA的形式的编码核酸酶的质粒DNA的必要性。RNP递送还可改进特异性，大概是因为RNP的半衰期较短并且不存在核酸酶和指导物的持续性表达(如从质粒将会得到那样)。例如，使用脂质介导的转染或电穿孔，可以将RNP在体内或在体外递送至细胞。例如，参见Liang等人"Rapid and highly efficient mammalian cell engineering viaCas9 protein transfection."Journal of biotechnology 208(2015):44-53；Zuris,John A.等人"Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficientprotein-based genome editing in vitro and in vivo."Nature biotechnology 33.1(2015):73-80；Kim等人"Highly efficient RNA-guided genome editing in humancells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins."Genome research 24.6(2014):1012-1019。

本发明还包括例如用于本文所述方法中的载体和包含载体的细胞，以及包含本文所述蛋白质和核酸的试剂盒。

实施例

以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例不限制权利要求中描述的本发明范围。

材料和方法

本文实施例中使用以下材料和方法。

分子克隆

通过以下方法构建表达质粒：使用PCR方法选择性扩增所需的DNA序列，使其具有明显重叠末端，并且使用等温组装法(或“Gibson组装法”，NEB)在pCAG表达载体中按所需顺序组装它们。使用Q5或Phusion聚合酶(NEB)进行PCR。使用基于pUC19的入门载体BPK1520(通过BsmBI盒)在U6启动子的控制下克隆Cas9 gRNA。

指导RNA和锌指靶位点

使用以下靶向锌指的EGFP：

ZF 11-1(223L)，靶位点gGTCGGGGTAg(SEQ ID NO:12)

ZF 13-6(292L)，靶位点aGAAGATGGTg(SEQ ID NO:13)

Cas9指导RNA 2前间区序列(PAM)：

AGCACTGCACGCCGTAGGTC(AGG)(SEQ ID NO:14)

Cas9指导RNA 4前间区序列(PAM)：

CATGCCCGAAGGCTACGTCC(AGG)(SEQ ID NO:15)

Cas9指导RNA 5前间区序列(PAM)：

CTGGACGTAGCCTTCGGGCA(TGG)(SEQ ID NO:16)

细胞培养和转染

对于BBE实验，使用由补充有10％FBS(Gibco)、1％10,000U/ml青霉素-链霉素溶液(Gibco)、和1％Glutamax(Gibco)的高级杜氏改良培养基(Gibco)组成的培养基，培养其中整合有整合型EGFP报告基因的HEK293细胞系。每3-4天传代细胞以维持群体活跃生长并避免缺氧状况。通过在24孔TC处理的平板上接种1x10⁵细胞并根据制造商的方案(Mirus Bio)使用TransIT-293试剂来进行含有800纳克的编码所需蛋白/gRNA的转染品质DNA(Qiagen大量或微量制备)的转染。使用DNAdvance试剂盒(Agencourt)在转染后3天收获gDNA。在补充有10％热灭活胎牛血清、2mM GlutaMax、青霉素和链霉素的DMEM中在37℃5％CO₂下培养含有EGFP-PEST报告基因的单一稳定整合拷贝的U2OS.EGFP细胞和HEK293T细胞。

U2OS.EGFP细胞的培养基补充有400μg ml^-1遗传霉素(Geneticin)。通过STR分析(ATCC)验证细胞系身份并且对细胞定期检验支原体污染。在Lonza 4-D Nucleofector上使用DN-100程序和SE细胞系试剂盒，根据生产商的推荐，用750ng表达BE的质粒和250ng表达gRNA的质粒转染U2OS.EGFP细胞。转染后48小时，使用流式细胞仪评价EGFP基因的破坏。

高通量扩增子测序

使用所需靶序列侧翼的基因特异性DNA引物扩增靶位点基因组DNA。通过PCR或NEBNext Ultra II试剂盒(NEB)将Illumina TruSeq衔接头添加至扩增子的末端，并且用NEBNext Dual Index Primers(NEB)进行分子索引。将样品并入文库并且使用MiSeqReagent Micro Kit v2(Illumina)在Illumina MiSeq机器上测序。使用软件CRISPResso(crispresso.rocks)的批量版本来分析测序结果。

相关蛋白质序列

N-nCas9(D10A)-SGGS接头-UGI-SV40NLS-C MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV(SEQ IDNO:17)

N-hAPOBEC3A-8AA接头-ZF-LRGS接头-UGI-SGGS接头-SV40NLS-CMEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGNSGGGLGSTSRPGERPFQCRICMRNFSXXXXLXXHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSXXXXLXXHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSXXXXLXXHLKTHLRGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV(SEQID NO:18)

N-rAPOBEC1-XTEN-8AA接头-ZF-LRGS接头-UGI-SGGS接头-SV40NLS-CMSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLKSGSETPGTSESATPESSGGGLGSTSRPGERPFQCRICMRNFSXXXXLXXHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSXXXXLXXHLRTHTGEKPFQCRICMFSXXXXLXXHLKTHLRGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKMLSGGSPKKKRKV(SEQ ID NO:19)

金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9

MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG(SEQID NO:20)

空肠弯曲杆菌(C.jejuni)Cas9

MARILAFDIGISSIGWAFSENDELKDCGVRIFTKVENPKTGESLALPRRLARSARKRLARRKARLNHLKHLIANEFKLNYEDYQSFDESLAKAYKGSLISPYELRFRALNELLSKQDFARVILHIAKRRGYDDIKNSDDKEKGAILKAIKQNEEKLANYQSVGEYLYKEYFQKFKENSKEFTNVRNKKESYERCIAQSFLKDELKLIFKKQREFGFSFSKKFEEEVLSVAFYKRALKDFSHLVGNCSFFTDEKRAPKNSPLAFMFVALTRIINLLNNLKNTEGILYTKDDLNALLNEVLKNGTLTYKQTKKLLGLSDDYEFKGEKGTYFIEFKKYKEFIKALGEHNLSQDDLNEIAKDITLIKDEIKLKKALAKYDLNQNQIDSLSKLEFKDHLNISFKALKLVTPLMLEGKKYDEACNELNLKVAINEDKKDFLPAFNETYYKDEVTNPVVLRAIKEYRKVLNALLKKYGKVHKINIELAREVGKNHSQRAKIEKEQNENYKAKKDAELECEKLGLKINSKNILKLRLFKEQKEFCAYSGEKIKISDLQDEKMLEIDHIYPYSRSFDDSYMNKVLVFTKQNQEKLNQTPFEAFGNDSAKWQKIEVLAKNLPTKKQKRILDKNYKDKEQKNFKDRNLNDTRYIARLVLNYTKDYLDFLPLSDDENTKLNDTQKGSKVHVEAKSGMLTSALRHTWGFSAKDRNNHLHHAIDAVIIAYANNSIVKAFSDFKKEQESNSAELYAKKISELDYKNKRKFFEPFSGFRQKVLDKIDEIFVSKPERKKPSGALHEETFRKEEEFYQSYGGKEGVLKALELGKIRKVNGKIVKNGDMFRVDIFKHKKTNKFYAVPIYTMDFALKVLPNKAVARSKKGEIKDWILMDENYEFCFSLYKDSLILIQTKDMQEPEFVYYNAFTSSTVSLIVSKHDNKFETLSKNQKILFKNANEKEVIAKSIGIQNLKVFEKYIVSALGEVTKAEFRQREDFKK(SEQ ID NO:21)

食清洁剂细小棒菌(P.lavamentivorans)Cas9

MERIFGFDIGTTSIGFSVIDYSSTQSAGNIQRLGVRIFPEARDPDGTPLNQQRRQKRMMRRQLRRRRIRRKALNETLHEAGFLPAYGSADWPVVMADEPYELRRRGLEEGLSAYEFGRAIYHLAQHRHFKGRELEESDTPDPDVDDEKEAANERAATLKALKNEQTTLGAWLARRPPSDRKRGIHAHRNVVAEEFERLWEVQSKFHPALKSEEMRARISDTIFAQRPVFWRKNTLGECRFMPGEPLCPKGSWLSQQRRMLEKLNNLAIAGGNARPLDAEERDAILSKLQQQASMSWPGVRSALKALYKQRGEPGAEKSLKFNLELGGESKLLGNALEAKLADMFGPDWPAHPRKQEIRHAVHERLWAADYGETPDKKRVIILSEKDRKAHREAAANSFVADFGITGEQAAQLQALKLPTGWEPYSIPALNLFLAELEKGERFGALVNGPDWEGWRRTNFPHRNQPTGEILDKLPSPASKEERERISQLRNPTVVRTQNELRKVVNNLIGLYGKPDRIRIEVGRDVGKSKREREEIQSGIRRNEKQRKKATEDLIKNGIANPSRDDVEKWILWKEGQERCPYTGDQIGFNALFREGRYEVEHIWPRSRSFDNSPRNKTLCRKDVNIEKGNRMPFEAFGHDEDRWSAIQIRLQGMVSAKGGTGMSPGKVKRFLAKTMPEDFAARQLNDTRYAAKQILAQLKRLWPDMGPEAPVKVEAVTGQVTAQLRKLWTLNNILADDGEKTRADHRHHAIDALTVACTHPGMTNKLSRYWQLRDDPRAEKPALTPPWDTIRADAEKAVSEIVVSHRVRKKVSGPLHKETTYGDTGTDIKTKSGTYRQFVTRKKIESLSKGELDEIRDPRIKEIVAAHVAGRGGDPKKAFPPYPCVSPGGPEIRKVRLTSKQQLNLMAQTGNGYADLGSNHHIAIYRLPDGKADFEIVSLFDASRRLAQRNPIVQRTRADGASFVMSLAAGEAIMIPEGSKKGIWIVQGVWASGQVVLERDTDADHSTTTRPMPNPILKDDAKKVSIDPIGRVRPSND(SEQ ID NO:22)

灰奈瑟氏菌(N.cinerea)Cas9

MAAFKPNPMNYILGLDIGIASVGWAIVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAAARRLARSVRRLTRRRAHRLLRARRLLKREGVLQAADFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVADNTHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRGDYSHTFNRKDLQAELNLLFEKQKEFGNPHVSDGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPTEPKAAKNTYTAERFVWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLDLDDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSPELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRVQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGNRYDEACTEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKSAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLGRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLALGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKERNLNDTRYINRFLCQFVADHMLLTGKGKRRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTIAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGEVLHQKAHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTPEKLRTLLAEKLSSRPEAVHKYVTPLFISRAPNRKMSGQGHMETVKSAKRLDEGISVLRVPLTQLKLKDLEKMVNREREPKLYEALKARLEAHKDDPAKAFAEPFYKYDKAGNRTQQVKAVRVEQVQKTGVWVHNHNGIADNATIVRVDVFEKGGKYYLVPIYSWQVAKGILPDRAVVQGKDEEDWTVMDDSFEFKFVLYANDLIKLTAKKNEFLGYFVSLNRATGAIDIRTHDTDSTKGKNGIFQSVGVKTALSFQKYQIDELGKEIRPCRLKKRPPVR(SEQ ID NO:23)

hAID

MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENHERTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRTLGL(SEQ ID NO:24)

缺少N-末端RNA-结合区域的hAIDv溶解性变体

MDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENHERTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRTLGL(SEQ ID NO:25)

缺少N-末端RNA-结合区域和C-末端结构不良区域的hAIDv溶解性变体

MDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENHERTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLPL(SEQ ID NO:26)

rAPOBEC1

MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLK(SEQ ID NO:27)

mAPOBEC3

MGPFCLGCSHRKCYSPIRNLISQETFKFHFKNLGYAKGRKDTFLCYEVTRKDCDSPVSLHHGVFKNKDNIHAEICFLYWFHDKVLKVLSPREEFKITWYMSWSPCFECAEQIVRFLATHHNLSLDIFSSRLYNVQDPETQQNLCRLVQEGAQVAAMDLYEFKKCWKKFVDNGGRRFRPWKRLLTNFRYQDSKLQEILRRMDPLSEEEFYSQFYNQRVKHLCYYHRMKPYLCYQLEQFNGQAPLKGCLLSEKGKQHAEILFLDKIRSMELSQVTITCYLTWSPCPNCAWQLAAFKRDRPDLILHIYTSRLYFHWKRPFQKGLCSLWQSGILVDVMDLPQFTDCWTNFVNPKRPFRPWKGLEIISRRTQRRLRRIKESWGLQDLVNDFGNLQLGPPMSN(SEQ ID NO:28)

mAPOBEC3催化结构域

MGPFCLGCSHRKCYSPIRNLISQETFKFHFKNLGYAKGRKDTFLCYEVTRKDCDSPVSLHHGVFKNKDNIHAEICFLYWFHDKVLKVLSPREEFKITWYMSWSPCFECAEQIVRFLATHHNLSLDIFSSRLYNVQDPETQQNLCRLVQEGAQVAAMDLYEFKKCWKKFVDNGGRRFRPWKRLLTNFRYQDSKLQEILRR(SEQ ID NO:29)

hAPOBEC3A

MEASPASGPRHLMDPHIFTSNFNNGIGRHKTYLCYEVERLDNGTSVKMDQHRGFLHNQAKNLLCGFYGRHAELRFLDLVPSLQLDPAQIYRVTWFISWSPCFSWGCAGEVRAFLQENTHVRLRIFAARIYDYDPLYKEALQMLRDAGAQVSIMTYDEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQALSGRLRAILQNQGN(SEQ ID NO:30)

hAPOBEC3G

MKPHFRNTVERMYRDTFSYNFYNRPILSRRNTVWLCYEVKTKGPSRPPLDAKIFRGQVYSELKYHPEMRFFHWFSKWRKLHRDQEYEVTWYISWSPCTKCTRDMATFLAEDPKVTLTIFVARLYYFWDPDYQEALRSLCQKRDGPRATMKIMNYDEFQHCWSKFVYSQRELFEPWNNLPKYYILLHIMLGEILRHSMDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYDDQGRCQEGLRTLAEAGAKISIMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQNQEN(SEQ ID NO:31)

hAPOBEC3G催化结构域

PPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYDDQGRCQEGLRTLAEAGAKISIMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQNQEN(SEQ ID NO:32)

hAPOBEC3H

MALLTAETFRLQFNNKRRLRRPYYPRKALLCYQLTPQNGSTPTRGYFENKKKCHAEICFINEIKSMGLDETQCYQVTCYLTWSPCSSCAWELVDFIKAHDHLNLGIFASRLYYHWCKPQQKGLRLLCGSQVPVEVMGFPKFADCWENFVDHEKPLSFNPYKMLEELDKNSRAIKRRLERIKIPGVRAQGRYMDILCDAEV(SEQ ID NO:33)

hAPOBEC3F

MKPHFRNTVERMYRDTFSYNFYNRPILSRRNTVWLCYEVKTKGPSRPRLDAKIFRGQVYSQPEHHAEMCFLSWFCGNQLPAYKCFQITWFVSWTPCPDCVAKLAEFLAEHPNVTLTISAARLYYYWERDYRRALCRLSQAGARVKIMDDEEFAYCWENFVYSEGQPFMPWYKFDDNYAFLHRTLKEILRNPMEAMYPHIFYFHFKNLRKAYGRNESWLCFTMEVVKHHSPVSWKRGVFRNQVDPETHCHAERCFLSWFCDDILSPNTNYEVTWYTSWSPCPECAGEVAEFLARHSNVNLTIFTARLYYFWDTDYQEGLRSLSQEGASVEIMGYKDFKYCWENFVYNDDEPFKPWKGLKYNFLFLDSKLQEILE(SEQ ID NO:34)

hAPOBEC3F催化结构域

KEILRNPMEAMYPHIFYFHFKNLRKAYGRNESWLCFTMEVVKHHSPVSWKRGVFRNQVDPETHCHAERCFLSWFCDDILSPNTNYEVTWYTSWSPCPECAGEVAEFLARHSNVNLTIFTARLYYFWDTDYQEGLRSLSQEGASVEIMGYKDFKYCWENFVYNDDEPFKPWKGLKYNFLFLDSKLQEILE(SEQ ID NO:35)

红嘴鸥弯曲杆菌(C.lari)Cas9

MRILGFDIGINSIGWAFVENDELKDCGVRIFTKAENPKNKESLALPRRNARSSRRRLKRRKARLIAIKRILAKELKLNYKDYVAADGELPKAYEGSLASVYELRYKALTQNLETKDLARVILHIAKHRGYMNKNEKKSNDAKKGKILSALKNNALKLENYQSVGEYFYKEFFQKYKKNTKNFIKIRNTKDNYNNCVLSSDLEKELKLILEKQKEFGYNYSEDFINEILKVAFFQRPLKDFSHLVGACTFFEEEKRACKNSYSAWEFVALTKIINEIKSLEKISGEIVPTQTINEVLNLILDKGSITYKKFRSCINLHESISFKSLKYDKENAENAKLIDFRKLVEFKKALGVHSLSRQELDQISTHITLIKDNVKLKTVLEKYNLSNEQINNLLEIEFNDYINLSFKALGMILPLMREGKRYDEACEIANLKPKTVDEKKDFLPAFCDSIFAHELSNPVVNRAISEYRKVLNALLKKYGKVHKIHLELARDVGLSKKAREKIEKEQKENQAVNAWALKECENIGLKASAKNILKLKLWKEQKEICIYSGNKISIEHLKDEKALEVDHIYPYSRSFDDSFINKVLVFTKENQEKLNKTPFEAFGKNIEKWSKIQTLAQNLPYKKKNKILDENFKDKQQEDFISRNLNDTRYIATLIAKYTKEYLNFLLLSENENANLKSGEKGSKIHVQTISGMLTSVLRHTWGFDKKDRNNHLHHALDAIIVAYSTNSIIKAFSDFRKNQELLKARFYAKELTSDNYKHQVKFFEPFKSFREKILSKIDEIFVSKPPRKRARRALHKDTFHSENKIIDKCSYNSKEGLQIALSCGRVRKIGTKYVENDTIVRVDIFKKQNKFYAIPIYAMDFALGILPNKIVITGKDKNNNPKQWQTIDESYEFCFSLYKNDLILLQKKNMQEPEFAYYNDFSISTSSICVEKHDNKFENLTSNQKLLFSNAKEGSVKVESLGIQNLKVFEKYIITPLGDKIKADFQPRENISLKTSKKYGLR(SEQ ID NO:36)

实施例1

我们产生由rAPOBEC1(WT)-ZF或hAPOBEC3A(WT)-ZF融合物和靶向邻近序列的nCas9-尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)组成的BBE。nCas9-UGI结构模拟已知是功能性BE蛋白的重要部分的标准BE3结构。由于有证据表明第二UGI的使用提高产物纯度，我们将UGI融合至ZF(通过LRGS接头)以及nCas9(与常规BE3相同的接头)C末端¹⁷。

另外，脱氨酶结构域与nCas9的物理分离以及UGI与二分型碱基编辑器的两个组分的融合似乎产生常规碱基编辑器的低协同中靶副作用，例如插入/缺失(indels)或不想要的置换(胞嘧啶至嘌呤，例如，C-至-G或C-至-A)，通常称为“产物杂质”。该属性可因UGI对UDG酶的更强抑制而出现，其已知有助于BE的产物纯度。

当靶向HEK293细胞中整合型EGFP报告基因中彼此相距6-8碱基对的相邻位点时，rAPOBEC1和hAPOBEC3A BBE两者可以以类似或大于(脱氨酶-nCas9-UGI形式的)单体BE对应物的速率刺激有效的碱基编辑(图4-6)。无论两个组分相对于彼此的方向如何，该效果是始终一致的并且使用多个不同的ZF或gRNA起作用。当ZF-脱氨酶融合物靶向nCas9位点的上游(朝向5’端)，BBE突变的胞嘧啶在与常规BE所述的那些类似的“编辑窗口”中并且具有类似分布(图4和5)。当ZF-脱氨酶位于nCas9位点的下游8个碱基对处，BBE具有更宽的、向gRNA靶位点的3’端移位的编辑窗口，表明可通过含脱氨酶的二分型的“一半”的程控接近度来控制编辑窗口。这种编辑窗口的柔性增加二分型碱基编辑环路(bipartite base editingcircuitry)的空间控制(图6)。可以想象或甚至可能的是，迄今为止未试验的BBE空间方向和间距将揭示BBE的更有趣且有用的特性。用于这些实验的ZF最初使用OPEN方法构建，其后被描述为高活性DNA结合蛋白。预期地，使用双重UGI方法降低靶位点胞嘧啶-至-鸟嘌呤和胞嘧啶-至-腺嘌呤的编辑量(图7A和7B)⁸。但是，最重要的是，并非仅归因于第二UGI，我们发现使用BBE显著降低插入缺失形成(图7C和7D)，因此说明BBE可表示具有显著更低产物杂质和改善的脱靶性能的碱基编辑方法。

参考文献

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其他实施方案

应理解的是，尽管已结合其详细描述来描述本发明，但前述描述意在说明而不在限制由所附权利要求的范围所定义的本发明的范围。其他方面、优点、和修改处于所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种用于二分型胞嘧啶碱基编辑器系统的融合蛋白，其包括：

(i)第一融合蛋白，其含有与脱氨酶或其活化部分融合的非R-环形成性可编程DNA结合结构域、优选转录激活子样效应子(TALE)或锌指阵列(ZF)，任选地在其间具有接头，或者

(ii)第二融合蛋白，其含有与尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)融合的R-环形成性Cas9蛋白，任选地在其间具有接头，所述R-环形成性Cas9蛋白缺少核酸酶活性或为切口酶，但可与指导RNA和靶DNA相互作用。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一融合蛋白包括选自由载脂蛋白BmRNA编辑酶催化性多肽样1(APOBEC1)、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D/E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4；活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)、胞嘧啶脱氨酶1(CDA1)、和CDA2、以及作用于tRNA的胞嘧啶脱氨酶(CDAT)组成的组的胞苷脱氨酶。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第二融合蛋白包括具有D10、E762、D839、H983、或D986和H840或N863处突变的SpCas9切口酶或无活性核酸酶，或者无活性Cpf1(dCpf1)蛋白。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述突变为D10A或D10N、或者H840A/H840N/H840Y中的一者或两者。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述DNA结合结构域包括锌指DNA结合阵列。

6.一种组合物，其包括纯化的根据权利要求1-5任一项所述的融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的组合物，其进一步包括与所述融合蛋白的Cas9部相互作用的指导RNA。

8.根据权利要求6所述的组合物，其包括一个或多个核糖核蛋白(RNP)复合体。

9.一种核酸，其编码根据权利要求1-5任一项所述的融合蛋白。

10.一种载体，其包括根据权利要求9所述的核酸。

11.一种分离的宿主细胞，其表达根据权利要求1-5任一项所述的融合蛋白。

12.一种组合物，其包括编码根据权利要求1-5任一项所述的融合蛋白的核酸。

13.一种使核酸中一个或多个所选胞嘧啶靶向性脱氨的方法，所述方法包括使所述核酸与根据权利要求1-5任一项所述的融合蛋白、以及指导RNA(gRNA)相接触，所述指导RNA与所述融合蛋白的Cas9部相互作用并结合至所述核酸的含有或邻近所选胞嘧啶的部分。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述核酸在细胞、优选真核细胞中。

15.一种使细胞中的核酸靶向性脱氨的方法，所述方法包括在所述细胞中表达、或使所述细胞接触：根据权利要求1-5任一项所述的融合蛋白、以及指导RNA(gRNA)，所述指导RNA与所述融合蛋白的Cas9部相互作用并且结合至所述核酸的含有或邻近所选胞嘧啶的部分。

16.根据权利要求15所述的方法，其中将所述融合蛋白以RNP、mRNA、或质粒的形式递送。

17.一种单体融合蛋白，其包括(i)第一部分，其含有脱氨酶或其活化部分，(ii)第二部分，其含有Cas9蛋白，所述Cas9蛋白缺少核酸酶活性或为切口酶，并且可与指导RNA相互作用但不足以结合靶DNA或形成R-环来加强基因组编辑或碱基事件，(iii)第三部分，其含有选自锌指和TALE的DNA结合结构域，和任选地(iv)第四部分，其含有尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)，任选地在第一、第二、第三、或第四部分中的一些或全部之间具有肽接头，并且其中结构域(i)-(iv)可为任何顺序。

18.一种融合蛋白，其包括(i)第一部分，其含有脱氨酶或其活化部分，(ii)第二部分，其含有Cas9蛋白，所述Cas9蛋白缺少核酸酶活性或为切口酶，并且可与指导RNA相互作用但不足以结合靶DNA或形成R-环来加强基因组编辑或碱基事件，所述Cas9蛋白例如II-C型Cas9直向同源物或类似缺陷物，和(iii)第三部分，其含有选自锌指和TALE的DNA结合结构域，任选地在第一、第二、或第三部分中的一些或全部之间具有肽接头，并且其中结构域(i)-(iii)可为任何顺序。

19.根据权利要求17或18所述的融合蛋白，其中所述第一部分包括选自由载脂蛋白BmRNA编辑酶催化性多肽样1(APOBEC1)、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D/E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4；活化诱导的胞苷脱氨酶(AICDA)、胞嘧啶脱氨酶1(CDA1)、和CDA2、和作用于tRNA的胞嘧啶脱氨酶(CDAT)组成的组的胞苷脱氨酶。

20.根据权利要求17或18所述的融合蛋白，其中所述第二部分包括具有D10、E762、D839、H983、或D986和H840或N863处突变的SpCas9核酸酶，或II-C型Cas9直向同源物。

21.根据权利要求20所述的融合蛋白，其中所述突变为D10A或D10N、或者H840A/H840N/H840Y中的一者或两者。

22.根据权利要求17或18所述的融合蛋白，其中所述第二部分包括PlCas9、ClCas9、或NcCas9；或者具有对PAM相互作用结构域(PID)的突变的SpCas9、SaCas9、或CjCas9。

23.根据权利要求22所述的融合蛋白，其中对PID的突变示于表2。

24.根据权利要求17或18所述的融合蛋白，其中所述DNA结合结构域包括锌指DNA结合阵列。

25.一种组合物，其包括纯化的根据权利要求17-24任一项所述的融合蛋白。

26.一种组合物，其包括纯化的根据权利要求18所述的融合蛋白，以及包括尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)的蛋白。

27.根据权利要求25或26所述的组合物，其进一步包括与所述融合蛋白的Cas9部相互作用的指导RNA。

28.根据权利要求27所述的组合物，其包括一个或多个核糖核蛋白(RNP)复合体。

29.一种核酸，其编码根据权利要求17-24任一项所述的融合蛋白。

30.一种载体，其包括根据权利要求29所述的核酸。

31.一种分离的宿主细胞，其表达根据权利要求17-24任一项所述的融合蛋白。

32.一种组合物，其包括编码根据权利要求17或19-24任一项所述的融合蛋白的核酸。

33.一种使核酸中所选胞嘧啶靶向性脱氨的方法，所述方法包括使所述核酸与根据权利要求17或19-24任一项所述的融合蛋白、以及指导RNA(gRNA)相接触，所述指导RNA与所述融合蛋白的Cas9部相互作用并且结合至所述核酸的含有或邻近所选胞嘧啶的部分。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述核酸在细胞中。

35.一种使细胞中的核酸靶向性脱氨的方法，所述方法包括在所述细胞中表达、或使所述细胞接触：根据权利要求17或19-24任一项所述的融合蛋白、以及指导RNA(gRNA)，所述指导RNA与所述融合蛋白的Cas9部相互作用并且结合至所述核酸的含有或邻近所选胞嘧啶的部分的。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述融合蛋白以RNP的形式递送、或者以编码所述融合蛋白的mRNA或质粒的形式递送。

37.一种核酸中所选胞嘧啶靶向性脱氨的方法，所述方法包括使所述核酸与根据权利要求18所述的融合蛋白、UGI蛋白、以及指导RNA(gRNA)相接触，所述指导RNA与所述融合蛋白的Cas9部相互作用并且结合至所述核酸的含有或邻近所选胞嘧啶的部分。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述核酸在细胞中。

39.一种使细胞中的核酸靶向性脱氨的方法，所述方法包括在所述细胞中表达、或使所述细胞接触：根据权利要求18所述的融合蛋白、UGI蛋白、以及指导RNA(gRNA)，所述指导RNA与所述融合蛋白的Cas9部相互作用并且结合至所述核酸的含有或邻近所选胞嘧啶的部分。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述融合蛋白以RNP的形式递送、或者以编码所述融合蛋白的mRNA或质粒的形式递送。