CN117659210A - 一种用作植物双碱基编辑器的重组融合蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用作植物双碱基编辑器的重组融合蛋白及其应用，所述重组融合蛋白包含从N端到C端依次连接的1个胞嘧啶脱氨酶、1个腺嘌呤脱氨酶、1个单链DNA结合结构域、1个SpCas9变体和2个尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白。本发明克服了目前单碱基编辑器的碱基替换类型单一以及双碱基编辑器的编辑成功率低的技术缺陷，提供了一种高效的植物双碱基编辑器，同时编辑双碱基的效率高，具有无靶序列偏好性、编辑窗口窄且脱靶率低的优势，能够广靶向识别NG‑PAM并进行多靶点编辑，在植物的基因功能的研究和遗传改良方面具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种用作植物双碱基编辑器的重组融合蛋白及其应用。
背景技术
作物的重要农艺性状通常由关键基因的点突变或单核苷酸多态性(SNP)决定，碱基编辑技术是植物基因功能研究和作物遗传改良的有效策略。工程化的CRISPR/Cas9系统通过在基因组中产生双链断裂(DSB)和以非同源末端连接(NHEJ)修复为主的方式，来引入随机插入或缺失突变(Indels)，其编辑是随机不可控的。基于CRISPR/Cas系统开发的碱基编辑工具，包括胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)和腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)(Komor et al.,2016,Nature,533:420-424；Rees and Liu.,2018,Nature Reviews Genetics,19:770-788)，它们能够在不需要供体模板及不造成双链DNA断裂的条件下分别实现C-T(G-A)或A-G(T-C)的碱基替换。
现有技术已开发了多种DNA碱基编辑器，如能实现C-to-T转换的胞嘧啶单碱基编辑器(CBEs)，能实现A-to-G转换的腺嘌呤单碱基编辑器(ABEs)，能实现A-to-Y(Y＝C/T)的腺嘌呤碱基颠换编辑器(AYBE)，以及能同时实现同一位点的C-to-T和A-to-G转换的双碱基编辑器(DBEs或ACBEs)等。
单碱基编辑器虽然使用较多，但其突变形式较单一，应用范围有限。相比较而言，双碱基编辑器能通过一次转化同时引入两种碱基转换，丰富了靶点中的碱基突变类型，扩大了氨基酸定向突变的范围，在调控元件筛选、内源基因的从头驯化、饱和突变等方面显示出更广泛的应用前景。但当前植物双碱基编辑器的编辑效率(尤其是双碱基替换同时产生的效率)普遍较低，且靶点选择受限于NGG-PAM，缺乏全面的靶点序列偏好性和编辑活性窗口宽度的系统分析。此外，双碱基编辑器需要同时具有胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶两个功能元件，但具体这两种脱氨酶在编辑器上的位置以及所需要的数量对编辑效率是否有影响，有何种影响，这都是不清楚的。
发明内容
为了解决现有技术中存在的植物双碱基编辑器的编辑效率低，难以有效地在靶点中同时产生双碱基替换，且靶点选择受限于NGG-PAM，在植物生物技术领域中应用受限的问题，本发明提供了一种用作植物双碱基编辑器的重组融合蛋白及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种用作植物双碱基编辑器的重组融合蛋白。
本发明的第二个目的是提供所述重组融合蛋白在植物基因编辑中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种植物双碱基编辑系统。
本发明的第四个目的是提供一种编码植物双碱基编辑器的核苷酸分子。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
单链DNA结合结构域(DBD)通过增强与单链DNA结合的能力来提升单碱基编辑器的效率，已被用于CBEs和ABEs的改进与优化，但目前现有技术未公开其是否在植物的双碱基编辑器也具有类似的功能。本发明利用高活性的胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶和DBD的有效组合，提供一种有利于开发植物高效、无序列偏好性以及广靶向的新型植物双碱基编辑器，这对于功能基因组学研究和作物遗传改良具有重要的研究意义。
一种用作植物双碱基编辑器的重组融合蛋白，即CBE-ABE-DBD-SpGn融合蛋白，包含从N端到C端依次连接的1个胞嘧啶脱氨酶(即evoFERNY)、1个腺嘌呤脱氨酶(即TadA8e)、1个单链DNA结合结构域(即DBD)、1个SpCas9变体(即SpGn，已通过突变D10A失活SpCas9其中一个核酸酶活性)和2个尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白(即UGI)；
所述胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述腺嘌呤脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单链DNA结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述SpCas9变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述胞嘧啶脱氨酶的N端和所述尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白的C端分别设有核定位信号(即bpNLS)。
更优选地，所述核定位信号的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述嘧啶脱氨酶和所述腺嘌呤脱氨酶由第一连接肽(即Linker1)连接，所述腺嘌呤脱氨酶和所述单链DNA结合结构域由第二连接肽(即Linker2)连接；所述DNA结合结构域和所述SpCas9变体由第三连接肽(即Linker3)连接；所述SpCas9变体和邻近N端的所述尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白由第四连接肽(即Linker4)连接；所述2个尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白之间由第五连接肽(即Linker5)连接；第一连接肽、第二连接肽、第三连接肽、第四连接肽和第五连接肽为柔性连接肽。
更优选地，所述第一连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
更优选地，所述第二连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
更优选地，所述第三连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
更优选地，所述第四连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
更优选地，所述第五连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步优选地，所述重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
任一所述重组融合蛋白在植物基因编辑中的应用也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述植物包括水稻。
一种编码植物双碱基编辑器的核苷酸分子，所述核苷酸分子编码重组融合蛋白；所述重组蛋白包含从N端到C端依次连接的1个胞嘧啶脱氨酶、1个腺嘌呤脱氨酶、1个单链DNA结合结构域、1个SpCas9变体和2个尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白；
所述胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述腺嘌呤脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单链DNA结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述SpCas9变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，编码所述胞嘧啶脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
优选地，编码所述腺嘌呤脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
优选地，编码所述单链DNA结合结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
优选地，编码所述SpCas9变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
优选地，编码所述2个尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～18所示。
优选地，所述胞嘧啶脱氨酶的N端和所述尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白的C端分别设有核定位信号。
更优选地，所述核定位信号的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步优选地，编码所述胞嘧啶脱氨酶的N端的核定位信号的核苷酸序列如SEQID NO.19所示。
进一步优选地，编码所述尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白的C端的核定位信号的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
优选地，所述嘧啶脱氨酶和所述腺嘌呤脱氨酶由第一连接肽连接，所述腺嘌呤脱氨酶和所述单链DNA结合结构域由第二连接肽连接；所述DNA结合结构域和所述SpCas9变体由第三连接肽连接；所述SpCas9变体和邻近N端的所述尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白由第四连接肽连接；所述2个尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白之间由第五连接肽连接；第一连接肽、第二连接肽、第三连接肽、第四连接肽和第五连接肽为柔性连接肽。
更优选地，所述第一连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步优选地，编码所述第一连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
更优选地，所述第二连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步优选地，编码所述第二连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示。
更优选地，所述第三连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步优选地，编码所述第三连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。
更优选地，所述第四连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
进一步优选地，编码所述第四连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。
更优选地，所述第五连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步优选地，编码所述第五连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
进一步优选地，所述重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
更进一步优选地，所述核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
表达任一所述重组融合蛋白的重组表达载体也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述重组表达载体连接有任一所述核苷酸分子。
更优选地，所述重组表达载体以pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体(即“Ma et al.,2015，Molecular Plant,8:1274-1284”中的“pYLCRISPR/Cas9Pubi-H”)为骨架。
进一步优选地，所述任一所述核苷酸分子设于所述pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体的Pst I和BamH I位点之间。
任一所述核苷酸分子在植物基因编辑中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种植物双碱基编辑系统，包含任一所述重组融合蛋白和sgRNA。所述sgRNA可替换为sgRNA表达盒。表达所述重组融合蛋白的核苷酸分子与所述sgRNA或sgRNA表达盒可设置于同一个载体上。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明克服了目前单碱基编辑器的碱基替换类型单一以及双碱基编辑器的编辑成功率低的技术缺陷，提供了一种高效的植物双碱基编辑器，同时编辑双碱基的效率高，具有无靶序列偏好性、编辑窗口窄且脱靶率低的优势，能够广靶向识别NG-PAM并进行多靶点编辑，在植物的基因功能的研究和遗传改良方面具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例1的9种植物双碱基编辑器的结构示意图。
图2为连接sgRNA表达盒和植物双碱基编辑器的植物双碱基编辑系统的结构示意图；HPT为潮霉素抗性基因，用于筛选成功转入编辑载体的阳性植株；Pubi是SpGn的启动子，用于启动翻译合成有功能的蛋白；Tnos是终止子，用于终止翻译。
图3为1号植物双碱基编辑器～5号植物双碱基编辑器的编辑效率分析结果。
图4为6号植物双碱基编辑器～9号植物双碱基编辑器的编辑效率分析结果。
图5为1号植物双碱基编辑器～9号植物双碱基编辑器的碱基替换分析结果；A为双碱基编辑器的编辑效率(黑色实心圆点)以及平均编辑效率(柱形)；B为双碱基编辑器在12个靶点中所产生的编辑类型所占比例，包括单一的C-to-T替换(条纹)，单一的A-to-G替换(点状)，同时产生C-to-T和A-to-G替换(黑色)以及indels(灰色)。
图6为1号植物双碱基编辑器、2号植物双碱基编辑器和3号植物双碱基编辑器的编辑窗口分析结果；A为M1-M12(M＝A/C)编辑活性窗口中各位点的平均编辑效率；B为从测试的12个靶点中统计NGA、NGC、NGG-PAM靶点的平均编辑效率；C为突变类型分析，Ho:homozygousmutation(纯合突变)；He:heterozygous mutation(杂合突变)；Bi:bi-allelic mutation(双等位突变)；D为从主要的编辑活性窗口M3-M9区间发生所有突变中分析5’-AC、5’-CC、5’-GC、5’-TC中C被编辑的偏好性；E为从主要的编辑活性窗口M3-M9区间发生所有突变中分析CA-3’、CC-3’、CG-3’、CT-3’中C被编辑的偏好性；F为从主要的编辑活性窗口M3-M9区间发生所有突变中分析5’-AA、5’-CA、5’-GA、5’-TA中A被编辑的偏好性；G为从主要的编辑活性窗口M3-M9区间发生所有突变中分析AA-3’、AC-3’、AG-3’中A被编辑的偏好性。
图7为1号植物双碱基编辑器、2号植物双碱基编辑器和3号植物双碱基编辑器的脱靶效应分析结果(所预测的脱靶位点与On-target靶序列差异的碱基加粗凸显，靶点的PAM用下划线凸显)，V1TS3-Os03g0576900为1号植物双碱基编辑器和2号植物双碱基编辑器共同编辑的靶点，V2TS3-IPA1为1号植物双碱基编辑器、2号植物双碱基编辑器和3号植物双碱基编辑器共同编辑的靶点。
图8为2号植物双碱基编辑器与现有技术公开的植物碱基编辑器的性能比较情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1植物双碱基编辑器的构建
本实施例用于构建植物双碱基编辑器的功能元件主要包括：CBE包含胞嘧啶脱氨酶evoFERNY(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)和2个UGI(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示)；ABE包含腺嘌呤脱氨酶TadA8e(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)；单链DNA结合蛋白(即DBD)(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)；SpCas9缺刻酶变体(即SpGn)(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示)，已通过突变D10A(即将包含起始氨基酸M在内的第10位氨基酸由D突变为A)失活Cas蛋白的RuvC活性；N端的bpNLS(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.19所示)；C端的bpNLS(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示)；linker1(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示)；linker2(氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示)；linker3(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示)；linker4(氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示)；linker5(氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示)。
一、植物双碱基编辑器pYL-CBE-ABE-SpGn和pYL-CBE-ABE-DBD-SpGn的构建
1、bpNLS-evoFERNY-linker1片段的扩增
以PevoFERNY-NG载体(即“Zeng et al.,2020,Molecular Plant,13:1666-1669”中的“PevoFERNY-NG”)为模板，使用引物F-C-A-SPG-1(5’-CGATGCTCACCCTGTTGTTTG-3’)和引物R-C-A-SPG-1(5’-GTACTCGTGGGAGAACTCGACCTCGCTGCTGCCGCCGCTGCTGCCGCCA-3’)，进行PCR扩增，得到bpNLS-evoFERNY-linker1片段，记为片段A。
PCR体系(30μL)为：2×Phanta Max Buffer 15μL，10mM dNTPs Mix 0.5μL，PhantaMax Polymerase 0.5μL，PevoFERNY-NG载体30ng，10μM F-C-A-SPG-1 0.5μL，10μM R-C-A-SPG-1 0.5μL，ddH2O补足到30μL。
PCR程序为：预变性95℃2min，30个PCR循环(95℃10s,56℃15s,72℃30s)，延伸72℃2min。
2、TadA8e-linker2-DBD-linker3-SpGn片段的扩增
分别以ABE8e-SpG载体和hyABE8e-SpG载体(即“Tan et al.,2022,PlantBiotechnology Journal,20:934-943”中的“ABE8e-SpG”和“hyABE8e-SpG”)为模板，使用引物F-C-A-SPG-2(5’-AGCGAGGTCGAGTTCTCCCAC-3’)和R-C-A-SPG-2(5’-GATGAGAGTAGCGTCGAGAACCTCCTTGGTG-3’)，进行PCR扩增，分别得到TadA8e-linker2-SpGn和TadA8e-linker2-DBD-linker3-SpGn片段，依次记为片段B和片段B’。
PCR体系(15μL)为：2×Phanta Max Buffer 7.5μL，10mM dNTPs Mix 0.35μL，Phanta Max Polymerase 0.35μL，hyABE8e-SpG载体10ng，10μM F-C-A-SPG-2 0.35μL，10μMR-C-A-SPG-20.35μL，ddH2O补足到15μL。
PCR程序为：预变性95℃2min，30个PCR循环(95℃10s,56℃15s,72℃5min)，延伸72℃2min。
3、linker4-UGI-linker5-UGI-bpNLS片段的扩增
以PevoFERNY-NG载体(即“Zeng et al.,2020,Molecular Plant,13:1666-1669”中的“PevoFERNY-NG”)为模板，使用引物F-C-A-SPG-3(5’-CACCAAGGAGGTTCTCGAC-3’)和R-C-A-SPG-3(5’-GCCAAATGTTTGAACGATCGGGAGGATCCTAG-3’)，进行overlapping PCR扩增，得到linker4-UGI-linker5-UGI-bpNLS片段，记为片段C。
PCR体系(15μL)为：2×Phanta Max Buffer 7.5μL，10mM dNTPs Mix 0.35μL，Phanta Max Polymerase 0.35μL，PevoFERNY-NG载体10ng，10μM F-C-A-SPG-3 0.35μL，10μM R-C-A-SPG-30.35μL，ddH2O补足到15μL。
PCR程序为：预变性95℃2min，30个PCR循环(95℃10s,56℃15s,72℃30min)，延伸72℃2min。
4、融合片段的扩增
以片段B和片段C为模板，使用引物F-C-A-SPG-2和R-C-A-SPG-3进行overlappingPCR扩增，得到融合片段TadA8e-linker2-SpGn-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNLS，记为融合片段D。
PCR体系(30μL)为：2×Phanta Max Buffer 15μL，10mM dNTPs Mix 0.5μL，PhantaMax Polymerase 0.5μL，片段B和片段C(浓度各为100ng/μL～150ng/μL)各0.1μL，10μM F-C-A-SPG-20.5μL，10μM R-C-A-SPG-3 0.5μL，ddH2O补足到30μL。
PCR程序为：预变性95℃2min，30个PCR循环(95℃10s,56℃15s,72℃5min)，延伸72℃2min。
以片段B’和片段C为模板，按照上述方法进行PCR扩增，得到融合片段TadA8e-linker2-DBD-linker3-SpGn-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNLS，记为融合片段D’。
5、连接
用Genstar纯化试剂盒纯化片段A的PCR产物、融合片段D和融合片段D’的PCR产物。
用Pst I和BamH I酶切pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体(即“Ma et al.,2015，Molecular Plant,8:1274-1284”中的“pYLCRISPR/Cas9Pubi-H”)。酶切反应体系为：10×Faster digest buffer，Pst I 0.5μL，BamH I 0.5μL，pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体300ng，ddH2O补足到10μL。酶切反应程序为：37℃反应1h。所得酶切产物经过胶回收，即得到载体骨架。
利用Gibson组装反应试剂盒(货号NEB#E5510S)将纯化后的片段A和融合片段D连接至载体骨架的Pst I和BamH I之间。连接反应体系为：2×Mix 5μL，片段A30ng，融合片段60ng，载体骨架90ng，ddH2O补足到10μL。连接反应程序为：50℃反应50min。
取1.5μL连接产物，通过电激法转化至大肠杆菌DH10B，在卡那霉素抗性(Kana)LB平板上，筛选转化单克隆，保留所得经测序鉴定为序列正确的阳性克隆，提取质粒，即得到pYL-CBE-ABE-SpGn(即C-A-SpGn)，记为1号植物双碱基编辑器。
按照上述方法将片段A和融合片段D’连接至载体骨架即得到pYL-CBE-ABE-DBD-SpGn载体(即C-A-D-SpGn)，记为2号植物双碱基编辑器，其表达的CBE-ABE-DBD-SpGn融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
二、植物双碱基编辑器pYL-ABE-CBE-DBD-SpGn的构建
与1号植物双碱基编辑器的构建方法基本相同，区别仅在于：以ABE8e-SpG载体为模板扩增得到bpNLS-TadA8e-linker1片段；以PevoFERNY-NG载体为模板扩增得到evoFERNY-linker2片段；以2号植物双碱基编辑器为模板扩增得到DBD-linker3-SpGn-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNL；将bpNLS-TadA8e-linker1片段与evoFERNY-linker2片段进行overlapping PCR融合，得到bpNLS-TadA8e-linker1-evoFERNY-linker2片段，再与DBD-linker3-SpGn-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNLS一同组装到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上，即得到pYL-ABE-CBE-DBD-SpGn载体(即A-C-D-SpGn)，记为3号植物双碱基编辑器。
三、植物双碱基编辑器pYL-CBE-DBD-SpGn-ABE的构建
与1号植物双碱基编辑器的构建方法基本相同，区别仅在于：以PevoFERNY-NG载体为模板扩增得到bpNLS-evoFERNY-linker2片段；以hyABE8e-SpG载体为模板扩增得到DBD-linker3-SpGn-linker1片段；将bpNLS-evoFERNY-linker2片段与DBD-linker3-SpGn-linker1片段进行overlapping PCR融合得到DBD-linker3-SpGn-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNL片段；将TadA8e(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)与片段C进行overlapping PCR融合得到TadA8e-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNLS片段；再将DBD-linker3-SpGn-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNL片段和TadA8e-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNLS片段一同组装到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上，即得到pYL-CBE-DBD-SpGn-ABE载体(即C-D-SpGn-A)，记为4号植物双碱基编辑器。
四、植物双碱基编辑器pYL-ABE-DBD-SpGn-CBE的构建
与1号植物双碱基编辑器的构建方法基本相同，区别仅在于：以PevoFERNY-NG载体为模板扩增得到linker1-evoFERNY片段，再与片段C进行overlapping PCR融合得到linker1-evoFERNY-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNLS片段；将片段B’与linker1-evoFERNY-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNLS片段一同组装到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上，即得到pYL-ABE-DBD-SpGn-CBE载体(即A-D-SpGn-C)，记为5号植物双碱基编辑器。
五、植物双碱基编辑器pYL-CBE-SpGn-DBD-ABE的构建
与1号植物双碱基编辑器的构建方法基本相同，区别仅在于：以ABE8e-SpG载体为模板扩增得到SpGn-linker2片段，再与片段A进行overlapping PCR融合得到bpNLS-evoFERNY-linker1-SpGn-linker2片段；以hyABE8e-SpG载体为模板扩增得到DBD-linker3片段，再与TadA8e(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)和片段C进行overlapping PCR融合得到DBD-linker3-TadA8e-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNLS片段；将bpNLS-evoFERNY-linker1-SpGn-linker2片段与DBD-linker3-TadA8e-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNLS片一同组装到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上，即得到pYL-CBE-SpGn-DBD-ABE载体(即C-SpGn-D-A)，记为6号植物双碱基编辑器。
六、植物双碱基编辑器pYL-ABE-SpGn-DBD-CBE的构建
与1号植物双碱基编辑器的构建方法基本相同，区别仅在于：以ABE8e-SpG载体为模板扩增得到bpNLS-TadA8e-linker1-SpGn片段；以hyABE8e-SpG载体为模板扩增得到linker2-DBD片段；将bpNLS-TadA8e-linker1-SpGn片段与linker2-DBD片段进行overlapping PCR融合得到TadA8e-linker1-SpGn-linker2-DBD片段；以PevoFERNY-NG载体为模板扩增得到linker3-evoFERNY片段，再与片段C进行overlapping PCR融合得到linker3-evoFERNY-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNLS片段；将TadA8e-linker1-SpGn-linker2-DBD片段与linker3-evoFERNY-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNLS片段一同组装到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上，即得到pYL-ABE-SpGn-DBD-CBE载体(即A-SpGn-D-C)，记为7号植物双碱基编辑器。
七、植物双碱基编辑器pYL-CBE-DBD-SpGn-DBD-ABE的构建
与1号植物双碱基编辑器的构建方法基本相同，区别仅在于：分别以3号植物双碱基编辑器和5号植物双碱基编辑器作为模板扩增得到bpNLS-evoFERNY-linker2-DBD-linker3-SpGn片段和linker2-DBD-linker3-TadA8e-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNL片段，再将二者一同组装到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上，即得到pYL-CBE-DBD-SpGn-DBD-ABE载体(即C-D-SpGn-D-A)，记为8号植物双碱基编辑器。
八、植物双碱基编辑器pYL-ABE-DBD-SpGn-DBD-CBE的构建
与1号植物双碱基编辑器的构建方法基本相同，区别仅在于：分别以4号植物双碱基编辑器和6号植物双碱基编辑器作为模板扩增得到bpNLS-TadA8e-linker2-DBD-linker3-SpGn片段和linker2-DBD-linker3-evoFERNY-linker4-UGI-linker5-UGI-bpNL片段，再将二者一同组装到pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上，即得到pYL-ABE-DBD-SpGn-DBD-CBE载体(即A-D-SpGn-D-C)，记为9号植物双碱基编辑器。
综上，本实施例共构建得到9种植物双碱基编辑器，其结构如图1所示。
实施例2 sgRNA表达盒的构建
为检测检测实施例1所得9种植物双碱基编辑器的编辑效率，采用相同的靶点和方法构建sgRNA表达盒。下文以2号植物双碱基编辑器为例，提供一种具体的sgRNA表达盒构建方法。
一、靶点引物的设计
在水稻基因组中寻找均有NGN-PAM的靶位点，利用网上程序CRISPR-GE网页(http://skl.scau.edu.cn/)(Xie et al.,2018,Molecular plant,11:720-735)，进入引物设计(PrimerDesign)子程序，进入primerDesign-V分支程序，选择对应启动子，勾上复选框，并选择method2，点击design，自动生成设计得到如表1所示用于构建2号植物双碱基编辑器的sgRNA表达盒的第一轮PCR扩增的引物，其中引物U-F和gR-T#的组合用于扩增获得含靶点的启动子序列，启动子包括OsU6a、OsU6b和OsU3，用于驱动不同靶点的sgRNA表达盒；引物gR-R与U#-T#的组合用于扩增获得含靶点的sgRNA序列。
表1第一轮PCR扩增的引物信息
(以2号植物双碱基编辑器的sgRNA表达盒的构建为例)
注：引物序列中的大写字母表示靶序列，小写字母表示与sgRNA或启动子同源的部分序列；T#表示V1TS1～V1TS6以及V2TS1～V2TS6；U#表示OsU6a、OsU6b和OsU3。
二、第一轮PCR
利用高保真DNA聚合酶(Phanta酶)和表1所示的引物，以pYLgRNA-OsU3、pYLgRNA-OsU6a和pYLgRNA-OsU6b载体(即“Ma et al.,2015，Molecular Plant,8:1274-1284”中的“pYLgRNA-OsU3、pYLgRNA-OsU6a和pYLgRNA-OsU6b”)为模板，在扩增OsU6/OsU3启动子序列和sgRNA序列的同时，还在启动子的下游和sgRNA的上游延伸出相应的靶点序列。
PCR体系(20μl)为：2×Phanta Max Buffer 10.0μl，10mmol/L dNTPs Mix 0.4μl，Phanta Max Polymerase 0.3μl，pYLgRNA-OsU6/3载体3ng，10μmol/L U-F 0.4μl，10μmol/LgR-T#(gR-V1TS1、gR-V1TS2、gR-V1TS3、gR-V1TS4、gR-V1TS5、gR-V1TS6、gR-V2TS1、gR-V2TS2、gR-V2TS3、gR-V2TS4、gR-V2TS5或gR-V2TS6)0.2μl，10μmol/L gR-R0.4μl，10μmol/LU#-T#(OsU6a-V1TS1、OsU6a-V1TS2、OsU6b-V1TS3、OsU6b-V1TS4、OsU3-V1TS5、OsU3-V1TS6、OsU6a-V2TS1、OsU6a-V2TS2、OsU6b-V2TS3、OsU6b-V2TS4、OsU3-V2TS5或OsU3-V2TS6)0.2μl，ddH2O补足到20μl。
PCR程序为：预变性95℃1min，28个PCR循环(95℃10s,58℃15s,72℃20s)，延伸72℃1min。
第一轮PCR所得产物为下游携带靶点序列的OsU3/OsU6启动子和上游携带靶点序列的sgRNA。
三、第二轮PCR扩增
如图2所示，实施例1所得的9种植物双碱基编辑器，各有12个测试的靶点，将12个靶点平均分为两组，即每组会有6个靶点，使用一个植物双碱基编辑器能同时靶向6个位点，需要串联6个sgRNA表达盒，最终每个双碱基编辑器需要构建两个串联6个sgRNA表达盒的测试载体。因此，以靶点中的V1TS1～V1TS6作为一组，V2TS1～V2TS6作为一组，每个双碱基编辑器需分别构建2个串联6个sgRNA表达盒的测试载体。
使用如表2所示的第二轮PCR引物Pps和Pgs，根据sgRNA表达盒的数量按照表3所示的信息调整引物组合，以此拼接以OsU3/OsU6启动子驱动的sgRNA表达盒，并在PCR产物两侧加上Bsa I酶切位点。
PCR体系(50μl)：2×Phanta Max Buffer 25.0μl，10mmol/L dNTPs Mix 1.0μl，Phanta Max Polymerase 1.0μl，10×稀释的第一轮PCR产物1.0μl，6靶点分别使用的引物为10μmol/L的Pps-R/Pgs-2(T1)，Pps-2/Pgs-3(T2)，Pps-3/Pgs-4(T3)，Pps-4/Pgs-5(T4)，Pps-5/Pgs-6(T5)，Pps-6/Pgs-L(T6)各1.0μl，ddH2O补足到50μl。
PCR程序为：预变性95℃1min，30个PCR循环(95℃10s,58℃15s,72℃30s)，延伸72℃1min。
使用Genstar纯化试剂盒纯化第二轮PCR产物。
表2第二轮PCR扩增的引物信息
注1：Bsa I酶切末端设计成非回文序列，可产生高效的连接(Golden Gateligation)。
注2：如果同一载体上连接的sgRNA表达盒的数量多于8个，需要自行设计更多组Pgs和Pps引物，每组含有互补的非回文Bsa I酶切末端。
注3：引物序列中的小写字母表示Bas I内切酶的识别位点和切割位点；ACTAGT和ACGCGT分别为构建好的双元载体导入的SpeⅠ和MluⅠ切点，SpeⅠ为唯一切点,可用于以“Gibson Assembly”方法进行第二轮克隆更多的sgRNA表达盒，MluⅠ切点用于酶切分析构建好的双元载体。
表3组装不同数量sgRNA表达盒的第二轮PCR引物组合
第二轮PCR所得产物为包含OsU3/OsU6启动子、Spacer间隔序列(即靶点序列)和sgRNA序列在内的完整sgRNA表达盒，其两侧具有Bsa I酶切位点。
综上，本实施例最终得到分别靶向V1TS1～V1TS6组和V2TS1～V2TS6组的sgRNA表达盒。
实施例3含不同靶点的sgRNA表达盒的植物双碱基编辑系统的构建
一、sgRNA表达盒与植物双碱基编辑器连接
如图2所示，使用基于Bsa I酶切和连接的“金门”克隆方法，以“边切边连接”方式(Ma and Liu,2016，Current Protocols in Molecular Biology,115:31.6.1-31.6.21；曾栋昌等，2018，中国科学:生命科学,48:783-794)，将实施例2所得分别靶向V1TS1～V1TS6组和V2TS1～V2TS6组的sgRNA表达盒，分别克隆到实施例1所得1号植物双碱基编辑器～9号植物双碱基编辑器中。
“金门”克隆反应体系(15μl)：10×CutSmart Buffer 1.5μl，10mmol/L ATP 1.5μl，植物双碱基编辑器(80～100ng)，纯化后的sgRNA表达盒10～15ng，Bsa I-HF 10U，T4 DNAligase 35U，ddH2O补足到15μl。
“金门”克隆反应程序：首先，用PCR仪变温循环进行酶切连接反应：37℃10min；接着10个～12个循环(37℃5min,10℃3min,20℃5min)；最后37℃3min。
二、筛选鉴定
用透析膜(透析液为1/3TE)透析连接产物后，通过电激转化至大肠杆菌DH10B，在卡那霉素抗性(Kana)LB板上筛选。
挑选阳性克隆，使用引物SP-L1(5’-GCGGTGTCATCTATGTTACTAG-3’)和SP-R(5’-TGCAATAACTTCGTATAGGCT-3’)，进行菌落PCR鉴定，保留经引物SP-L1测序鉴定为序列正确的阳性克隆，提取质粒，即得到18个植物双碱基编辑系统，即组装了靶向V1TS1～V1TS6组的sgRNA表达盒的1号植物双碱基编辑器～9号植物双碱基编辑器，以及组装了V2TS1～V2TS6组的sgRNA表达盒的1号植物双碱基编辑器～9号植物双碱基编辑器。
实施例4双碱基编辑效率评价
一、实验方法
(1)农杆菌转化
利用农杆菌(EHA105)介导的水稻(粳稻中花11号)愈伤转化，把实施例3得到的18个植物双碱基编辑系统分别转化至水稻愈伤，经过潮霉素筛选，得到T0代转化植株。
(2)扩增测序
提取各T0代转化植株的叶片DNA作为模板，扩增碱基编辑靶位点的DNA片段，所用引物为Cas9-F：5’-CTGACGCTAACCTCGACAAG-3’和Cas9-R：5’-CCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3’。PCR反应体系(15μl)为：2×Taq Mix 7.5μl，引物各0.3μl，DNA模板1μl，ddH2O补足到15μl。PCR反应程序为：预变性95℃1min，30个PCR循环(95℃10s,56℃15s,72℃30s)，延伸72℃1min。回收PCR产物进行高通量测序。
(3)测序结果分析
通过将测序结果和参考序列比对，统计和比较实施例1所得1号植物双碱基编辑器～9号植物双碱基编辑器的编辑效率(碱基替换；绘制编辑活性窗口图；碱基偏好)。利用网上程序CRISPR-GE网页(http://skl.scau.edu.cn/)(Xie et al.,2018,Molecular plant,11:720-735)，进入引物设计(off-target)子程序，输入V1TS3和V2TS3的靶点序列，从这两个靶点中选择具有≤2个碱基不匹配的脱靶位点用于脱靶频率分析，以评价脱靶效应。
二、实验结果
1、编辑效率分析结果
如图3和图4所示，与不含DBD的1号植物双碱基编辑器(即C-A-SpGn)相比，融合了一个DBD的2号植物双碱基编辑器(即C-A-D-SpGn)、3号植物双碱基编辑器(即A-C-D-SpGn)、5号植物双碱基编辑器(即A-D-SpGn-C)和6号植物双碱基编辑器(即C-SpGn-D-A)的编辑效率普遍提高，4号植物双碱基编辑器(即C-D-SpGn-A)和7号植物双碱基编辑器(即A-SpGn-D-C)的编辑效率无明显变化；融合了两个DBD的8号植物双碱基编辑器(即C-D-SpGn-D-A)和9号植物双碱基编辑器(即A-D-SpGn-D-C)的编辑效率则明显下降。其中，2号植物双碱基编辑器的平均编辑效率最高(41.9％)，是1号植物双碱基编辑器的平均编辑效率(33.7％)的1.24倍，且在V2TS6靶点的编辑效率高达95.2％。
2、碱基替换分析结果
与当前广泛使用的单碱基编辑器CBE和ABE相比，双碱基编辑器能够产生丰富的碱基替换突变类型。如图5中的A和B所示，在2号植物双碱基编辑器(即C-A-D-SpGn)成功编辑的所有突变体中，以同时产生双碱基替换为主(占48.6％)，部分则产生单一的C-to-T替换(占16.8％)或A-to-G替换(占29.4％)，且产生的插入缺失(indels)较少(占5.3％)。而同样具有较高编辑效率的3号植物双碱基编辑器(即A-C-D-SpGn)、5号植物双碱基编辑器(即A-D-SpGn-C)和6号植物双碱基编辑器(即C-SpGn-D-A)只能产生小部分的双碱基替换，大部分是单碱基替换。
以上结果表明，本发明提供的2号植物双碱基编辑器(pYL-CBE-ABE-DBD-SpGn载体)在提高平均编辑效率显著的同时，还具有提高双碱基编辑频率的优势。
3、碱基编辑器的编辑窗口分析结果
综合上述9个双碱基编辑系统的平均编辑效率及其编辑产物的分析，选出其中能够有效产生双碱基替换的1号植物双碱基编辑器(即C-A-SpGn)、2号植物双碱基编辑器(即C-A-D-SpGn)和3号植物双碱基编辑器(即A-C-D-SpGn)进一步比较。根据T0代的测序结果，分别统计了1号植物双碱基编辑器(即C-A-SpGn)、2号植物双碱基编辑器(即C-A-D-SpGn)和3号植物双碱基编辑器(即A-C-D-SpGn)的12个靶点在M3～M12(M＝A/C)中每个位点C-to-T和A-to-G的平均编辑效率，绘制成编辑活性窗口图。如图6中的A所示，2号植物双碱基编辑器(即C-A-D-SpGn)和1号植物双碱基编辑器(即C-A-SpGn)产生C-to-T和A-to-G的活性窗口趋于一致，主要集中在M5～M9，比起单一的碱基编辑器及报道的双碱基编辑器，2号植物双碱基编辑器(即C-A-D-SpGn)的编辑窗口更窄，能够实现更精确的碱基替换，有利于实现目的氨基酸的定向突变。
传统的SpCas9只能识别NGG-PAM，改造后的Cas9-NG变体虽然扩大了基因组的编辑范围，但是和传统的SpCas9相比，其切割编辑效率发生了一定幅度下降(Zeng et al.,2020,Plant Biotechnology Journal,18:1348-1350)，而新型的SpCas9缺刻酶变体SpGn既能够识别广泛的NG-PAM，且进行高效的编辑。为了探究3种植物双碱基编辑器能否在NGN-PAM靶点实现高效编辑，进一步从12个靶点中统计了其在NGA-、NGC-、NGG-PAM靶点的平均编辑效率(由于符合NGT-PAM的靶点较少，此部分结果未展示)，如图6中的B所示，2号植物双碱基编辑器(即C-A-D-SpGn)对NGA-、NGC-和NGG-PAM靶点均进行高效编辑，且编辑效率均高于1号植物双碱基编辑器(即C-A-SpGn)和3号植物双碱基编辑器(即A-C-D-SpGn)。此外，图6中的C所示，2号植物双碱基编辑器(即C-A-D-SpGn)的编辑产物主要以杂合突变为主。
与此同时，分别统计1号植物双碱基编辑器(即C-A-SpGn)、2号植物双碱基编辑器(即C-A-D-SpGn)和3号植物双碱基编辑器(即A-C-D-SpGn)在M3-M9(M＝A/C)活性窗口上5’-AC、5’-CC、5’-GC、5’-TC和CA-3’、CC-3’、CG-3’、CT-3’中C-to-T的平均效率以及5’-AA、5’-CA、5’-GA、5’-TA和AA-3’、AC-3’、AG-3’中A-to-G的平均效率，并分析了它们的碱基偏好。统计结果如图6中的D～G所示，1号植物双碱基编辑器(即C-A-SpGn)和2号植物双碱基编辑器(即C-A-D-SpGn)均消除了靶点序列环境的偏好性，且2号植物双碱基编辑器(即C-A-D-SpGn)具有更显著的编辑效率。如图6中的D和E所示，3号植物双碱基编辑器(即A-C-D-SpGn)对C和A的编辑均存在较为明显的偏好性，对5'-GC和5'-TC中的C以及5'-AA和5'-CA中的A几乎不产生编辑。
以上结果表明，本发明提供的2号植物双碱基编辑器(pYL-CBE-ABE-DBD-SpGn载体)的编辑窗口窄，能够实现精准编辑，且靶向范围广，主要产生杂合突变，无靶点序列偏好性。
4、脱靶效应分析结果
如图7所示，2号植物双碱基编辑器(pYL-CBE-ABE-DBD-SpGn载体)在潜在脱靶位点未发现脱靶效应，而1号植物双碱基编辑器(pYL-CBE-ABE-SpGn载体)在Off-target 1中检测到低(2.1％)的脱靶效应。表明本发明提供的2号植物双碱基编辑器(pYL-CBE-ABE-DBD-SpGn载体)未检测到脱靶效应。
综上所述，本发明开发的新型高效植物双碱基编辑器——2号植物双碱基编辑器(pYL-CBE-ABE-DBD-SpGn载体)，相比其他8个植物双碱基编辑器，以及目前已报道的植物碱基编辑器(如图8所示)而言，具有编辑效率更显著、靶向范围更广和编辑窗口更精确等优点，能够广泛的用于作物基因功能筛选、大规模饱和突变、编辑调控元件、引入提前终止密码子或进行可变剪接等操作。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用作植物双碱基编辑器的重组融合蛋白，其特征在于，包含从N端到C端依次连接的1个胞嘧啶脱氨酶、1个腺嘌呤脱氨酶、1个单链DNA结合结构域、1个SpCas9变体和2个尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白；
所述胞嘧啶脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述腺嘌呤脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单链DNA结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述SpCas9变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶的N端和所述尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白的C端分别设有核定位信号。
3.根据权利要求2所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述核定位信号的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述嘧啶脱氨酶和所述腺嘌呤脱氨酶由第一连接肽连接，所述腺嘌呤脱氨酶和所述单链DNA结合结构域由第二连接肽连接；所述DNA结合结构域和所述SpCas9变体由第三连接肽连接；所述SpCas9变体和邻近N端的所述尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白由第四连接肽连接；所述2个尿嘧啶糖基化酶抑制蛋白之间由第五连接肽连接；
第一连接肽、第二连接肽、第三连接肽、第四连接肽和第五连接肽为柔性连接肽。
5.权利要求1～4任一所述重组融合蛋白在植物基因编辑中的应用。
6.一种植物双碱基编辑系统，其特征在于，包含权利要求1～4任一所述重组融合蛋白和sgRNA。
7.一种编码植物双碱基编辑器的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码权利要求1所述重组融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的核苷酸分子，其特征在于，编码所述SpCas9变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
9.根据权利要求7所述的核苷酸分子，其特征在于，编码所述单链DNA结合结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
10.根据权利要求7所述的核苷酸分子，其特征在于，编码所述胞嘧啶脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
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