CN116004592A - 一种实现DNA上C/G到T/A编辑的RsCBE系统 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因编辑技术领域，公开了一种实现DNA上C/G到T/A编辑的RsCBE编辑系统。该编辑系统采用Ruminococcus sp.AF17‑6来源的双链DNA胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域的分割蛋白构建骨架载体，实现线粒体DNA和核DNA上靶标位置的C/G到T/A编辑，尤其对“gC”序列特征中的C可进行高效编辑，可用于制备基因编辑试剂盒，为基因编辑技术提供了新的工具。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，是一种实现DNA上C/G到T/A编辑的RsCBE编辑系统。
背景技术
线粒体疾病是一类严重危害人类健康可致残致死的母性遗传疾病，如线粒体脑肌病、共济失调等。线粒体疾病常由细胞核基因突变和线粒体DNA突变引起，特别地，针对线粒体DNA(mtDNA)突变造成的线粒体疾病更是束手无策，其中最重要的原因是缺少线粒体基因编辑工具构建线粒体疾病动物模型，以开展系统的分子机制研究和治疗方法探索。
由于RNA无法进入线粒体，因此现有的基于CRISPR的编辑工具无法用来编辑mtDNA。通过融合线粒体定位信号肽的限制性内切酶、mito-ZFN和mito-TALEN可以对突变的mtDNA引入DNA双链断裂(DSB)，以降低突变mtDNA的比例。然而，这些方法不能实现对mtDNA进行单个碱基的精准编辑，因此不能用来构建mtDNA突变动物疾病模型，也无法用于探索线粒体疾病的精准治疗。
来自Burkholderia cenocepacia的细菌毒素蛋白的DddA功能域即DddAtox具有双链DNA脱氨基酶活性，通过和TALE相连形成胞嘧啶碱基编辑器(DdCBE)，可以实现线粒体中定点C/G到T/A的突变。但是，原始版本的DdCBE只能对线粒体DNA上的“tC”序列特征中的C进行编辑，通过噬菌体进化得到的DdCBE突变体V6和V11的版本(BcDdCBE-V6、BcDdCBE-V11)，提高了编辑效率，拓宽了编辑序列偏向性的限制，但是针对“gC”的特征序列中的C进行编辑的效率依然很低。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种适用范围更广泛的DNA胞嘧啶编辑系统RsCBE(或称RsDdCBE)，可以实现DNA上没有特征序列限制的C/G到T/A编辑，尤其是针对“gC”特征序列中的C进行高效编辑。
本发明的另一目的是提供该系统的应用。
本发明的又一目的是提供利用该系统实现线粒体DNA上C/G到T/A编辑的方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种双链DNA胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域，该DddA结构域为Ruminococcussp.AF17-6来源的双链DNA胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域，其基因名为DWW94_10390，编码INTEIN_C_TER domain-containing protein的145-281位氨基酸(Uniprot ID：A0A373WC03)。
所述的胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域，该DddA结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述DddA结构域的分割蛋白，按该DddA的结构域的氨基酸结构特征选择在N188N位点进行分割得到一对half DddA的分割蛋白，为：N188N和N188C，以及，按该DddA的结构域的氨基酸结构特征选择在N256位点进行分割得到一对half DddA的分割蛋白，为N256N和N256C；分割蛋白成对使用。
所述的分割蛋白，该分割蛋白为核苷酸序列如下所示的分割蛋白：N188N氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；N188C氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；N256N氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示；N256C氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述DddA结构域或者所述分割蛋白在构建DNA的C/G到A/T编辑的胞嘧啶编辑系统RsCBE中的应用。
采用所述DddA结构域或者所述分割蛋白构建的胞嘧啶编辑系统RsCBE。
所述胞嘧啶编辑系统RsCBE，包括RVD文库、线粒体定位骨架载体和细胞核定位骨架载体，用于实现线粒体DNA的C/G到T/A编辑的胞嘧啶编辑系统RsCBE采用MTS-RsCBE骨架载体，用于实现细胞核DNA的C/G到T/A编辑的胞嘧啶编辑系统RsCBE采用NLS-RsCBE骨架载体；即：将Ruminococcus来源的双链DNA胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域的分割成half DddA的4个分割蛋白配对分别和糖基化酶抑制剂(UGI)融合之后分别插入到MTS-TALE骨架载体的NheⅠ和PmeⅠ这两个酶切位点之间分别得到4个MTS-RsCBE骨架载体；将Ruminococcus来源的双链DNA胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域的分割成half DddA的4个分割蛋白配对分别和糖基化酶抑制剂(UGI)融合之后分别插入到NLS-TALE骨架载体的NheⅠ和PmeⅠ这两个酶切位点之间分别得到4个NLS-RsCBE骨架载体。
所述胞嘧啶编辑系统RsCBE，其中4个MTS-RsCBE骨架载体分别为：MTS-ccdb-N188N-UGI、MTS-ccdb-N188C-UGI、MTS-ccdb-N256N-UGI、MTS-ccdb-N256C-UGI；4个NLS-RsCBE骨架载体分别为：NLS-ccdb-N188N-UGI、NLS-ccdb-N188C-UGI、NLS-ccdb-N256N-UGI和NLS-ccdb-N256C-UGI。
所述胞嘧啶编辑系统RsCBE，所述的MTS-TALE骨架载体包含的主要元件5’端到3’端依次为：线粒体定位信号(MTS)序列、TALE-N端(NTD)136个氨基酸的核苷酸序列、ccdb毒素基因、TALE-C末端(CTD)41个氨基酸的核苷酸序列、嘌呤霉素细胞药筛基因、氨卞青霉素抗性元件；
所述的NLS-TALE骨架载体包含的主要元件5’端到3’端依次为：细胞核定位信号(NLS)序列、TALE-N端(NTD)136个氨基酸的核苷酸序列、ccdb毒素基因、TALE-C端(CTD)63个氨基酸的核苷酸序列、嘌呤霉素细胞药筛基因、氨卞青霉素抗性元件。
所述胞嘧啶编辑系统RsCBE，其中，MTS-TALE骨架载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；NLS-TALE骨架载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；UGI编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
所述胞嘧啶编辑系统RsCBE，所有骨架载体匹配于一种TALE组装系统，骨架载体毒素基因ccdb两侧分别含有Bsa I酶切位点，酶切后产生不同的粘性末端用于特异性连接识别特定DNA序列的TALE序列。
所述的胞嘧啶编辑系统RsCBE在线粒体DNA或者细胞核DNA的C/G到T/A编辑中的应用。
所述DddA结构域、或者所述分割蛋白、或者所述胞嘧啶编辑系统RsCBE在制备线粒体DNA或细胞核DNA的C/G到T/A编辑的试剂盒中的应用。
一种用于线粒体DNA或细胞核DNA的C/G到T/A编辑的试剂盒，该试剂盒含有所述DddA结构域、或者所述分割蛋白、或者所述胞嘧啶编辑系统RsCBE。
所述的胞嘧啶编辑系统RsCBE的使用方法，包括以下步骤：
步骤1、根据所要编辑位点的DNA序列，设计编辑位点两侧的识别DNA的TALE序列，选择所述的DNA胞嘧啶编辑系统MTS-RsCBE或者NLS-RsCBE中的4个骨架载体，通过GoldenGate克隆法将TALE序列分别连到骨架载体上，组装胞嘧啶编辑器(RsCBE)载体；组装完成的RsCBE载体经过转化DH5α感受态、单克隆PCR验证、Sanger测序等步骤后，可获得正确组装的RsCBE载体，进一步通过提取质粒可获得RsCBE质粒；
步骤2、将正确组装RsCBE质粒按照Half DddA的配对方式(N188N和N188C配对，N256N和N256C配对)转染所要编辑的细胞，通过1μg/mL的嘌呤霉素筛选转染成功的细胞，编辑后的细胞通过Sanger测序或高通量测序验证RsCBE编辑效率，对编辑的细胞进一步培养获得稳定的线粒体DNA或细胞核DNA突变的细胞并进行后续的功能性分析。
所述的RsCBE编辑系统在治疗基因突变疾病中应用。
进一步说明：
本发明提供的用于实现DNA的C/G到T/A编辑的胞嘧啶编辑系统RsCBE，在于新发现的来源于Ruminococcus sp.AF17-6菌属中的双链DNA胞嘧啶脱氨基结构域DddAtox(Uniprot ID：A0A373WC03)，通过TALE融合Ruminococcus的DddAtox分割蛋白和糖基化酶抑制剂(Uracil glycosylase inhibitor,UGI)组成了RsCBE系统，可以实现对靶位点的胞嘧啶进行编辑，特别地，RsCBE能够对gC序列中的C进行高效编辑。
该结构域没有作为DddA结构域进行公开过，但是其整个蛋白的序列是在Uniprot和NCBI等蛋白数据库中是存在的，注释的名称是INTEIN_C_TER domain-containingprotein，其功能没有做过探究。
Ruminococcus双链DNA胞嘧啶脱氨基结构域DddAtox来源于Ruminococcussp.AF17-6菌属中编码INTEIN_C_TER domain-containing protein蛋白的145-281位氨基酸，与Burkholderia cenocepacia的DddAtox相比氨基酸序列相似性只有48％。
本发明将Ruminococcus sp.AF17来源的INTEIN_C_TER domain-containingprotein中的DddA结构域(145-281位氨基酸)在第N188位氨基酸，第N256位氨基酸，Q181位氨基酸，N216位氨基酸或G246位氨基酸位置进行分割产生10种Half DddA,分别将HalfDddA和糖基化酶抑制剂(UGI)通过linker氨基酸序列融合后分别插入到MTS-TALE骨架载体和NLS-TALE骨架载体中得到10个MTS骨架载体,其中在第N188位氨基酸或第N256位氨基酸获得的组合相较于其它位点分割的组合具有显著高编辑的效果，因此，我们选择N188和N256位点的分割蛋白来组建RsCBE编辑器。根据MTS骨架载体的结果，最终获得4个NLS骨架载体(见图1和图5所示)。
本发明提供的用于实现DNA的C/G到T/A编辑的胞嘧啶编辑系统RsCBE，包含以下4个MTS-RsCBE骨架载体(见图2)，分别为MTS-ccdb-N188N-UGI、MTS-ccdb-N188C-UGI、MTS-ccdb-N256N-UGI和MTS-ccdb-N256C-UGI；和/或，4个NLS-RsCBE骨架载体(见图3)NLS-ccdb-N188N-UGI、NLS-ccdb-N188C-UGI、NLS-ccdb-N256N-UGI和NLS-ccdb-N256C-UGI。
本发明的所有骨架载体匹配于一种TALE组装系统，骨架载体毒素基因ccdb两侧分别含有Bsa I酶切位点，酶切后产生不同的粘性末端用于特异性连接识别特定DNA序列的TALE序列，组装方法见授权专利：一种基于TALE组装的线粒体DNA编辑系统，专利号ZL202110688797.9。
本发明所述的RsCBE编辑系统用于双链DNA的C/G到T/A编辑的应用，尤其是对线粒体DNA的编辑应用，特别地可以实现对“gC”特征序列中的C进行高效编辑。
本发明按照N188N和N188C配对，N256N和N256C配对的原则选择本发明系统中所述的对应的2个RsCBE载体进行配对，将其转染到所要编辑的细胞，通过嘌呤霉素筛选转染成功的细胞，实现DNA由C/G到T/A的编辑
本发明所述的RsCBE编辑系统可以用来探索线粒体或细胞核DNA突变的功能。同时，利用本发明的工具可以在细胞上对突变的DNA进行修复。
本发明的工作原理：将RsCBE系统转染细胞后，可以对编辑位点实现C/G到T/A的编辑，主要通过双链DNA胞嘧啶脱氨基酶进行对要编辑的C进行脱氨基形成dU，进一步通过细胞的复制实现C/G到T/A的编辑。
为了实现线粒体DNA的C/G到T/AC编辑，Mok BY等报道的TALE-DddAtox可以实现线粒体DNA上“tC”序列中的C/G到T/A编辑(Nature.2020Jul；583(7817):631-637.)，本发明开发的DNA编辑系统RsCBE能实现线粒体DNA上“nC”序列中高效的C/G到T/A编辑，尤其是针对“gC”序列特征的C进行高效编辑。
本发明有益效果：
本发明，主要的创新价值在于找到了一个新的双链DNA脱氨基酶，可以实现双链DNA上任意位置的C/G到T/A编辑，尤其是针对DNA上“gC”特征序列中的C进行高效编辑。
附图说明
图1RsCBE编辑系统工作的示意图。
图1A，Ruminococcus sp.AF17菌种DWW94_10390基因编码蛋白的氨基酸结构域示意图；图1B，Ruminococcus sp.AF17的双链胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域的结构模式图；图1C，Ruminococcus sp.AF17来源的DddA结构域与Burkholderia cenocepacia菌属中的DddAtox氨基酸序列同源性比对；图1D，Ruminococcus sp及Burkholderiacenocepacia.DddA的不同分割蛋白的分割位点；图1E，RsCBE系统工作的模式图。
图2RsCBE编辑系统的MTS骨架载体。
图2带有线粒体定位信号(MTS)的不同分割类型的Ruminococcus-DddAtox，载体携带ccdb基因元件，ccdb位于两个Bsa I酶切位点之间，载体上带有氨卞青霉素抗性元件。
图3RsCBE编辑系统的NLS骨架载体。
图3带有细胞核定位信号(NLS)的不同分割类型的Ruminococcus-DddAtox，载体携带ccdb基因元件，ccdb位于两个Bsa I酶切位点之间，载体上带有氨卞青霉素抗性元件。
图4RsCBE编辑系统对T载体上tC、aC、gC和CC motif位点进行编辑情况。
图4A为T载体上的编辑窗口的tC motif的DNA序列；图4B为NLS-DdCBE对T载体上的aC motif中的C进行编辑的情况；图4C为NLS-RsCBE对T载体上的CC motif中的C进行编辑的情况；图4D为NLS-RsCBE对T载体上的gC motif中的C进行编辑的情况。
图5RsCBE及BcCBE编辑系统对线粒体m.13513位点进行编辑情况。
图5上为m.13513位点编辑窗口的序列信息，图5下图为不同组合的RsCBE对m.13513位点的编辑情况。
图6RsCBE及BcCBE编辑系统对线粒体m.3890位点进行编辑情况。
图6上为m.3890位点编辑窗口的序列信息，图6下图为不同组合的RsCBE及BcCBE对m.3890位点的编辑情况。
图7RsCBE及BcCBE编辑系统对线粒体m.4430位点进行编辑情况。
图7上为m.4430位点编辑窗口的序列信息，图7下图为不同组合的RsCBE及BcCBE对m.4430位点的编辑情况。
图8RsCBE及BcCBE编辑系统对线粒体m.3277位点进行编辑情况
图8上为m.3277位点编辑窗口的序列信息，图8下图为不同组合的RsCBE及BcCBE对m.3277位点的编辑情况。
图9RsCBE及BcCBE编辑系统对线粒体m.3684位点进行编辑情况
图9上为m.3684位点编辑窗口的序列信息，图9下图为不同组合的RsCBE及BcCBE对m.3684位点的编辑情况。
图10RsCBE及BcCBE编辑系统对线粒体m.4735位点进行编辑情况
图10上为m.4735位点编辑窗口的序列信息，图10下图为不同组合的RsCBE对m.4735位点的编辑情况。
图11RsCBE,BcCBE及其突变版本V6,V11编辑系统对线粒体m.8393位点进行编辑情况。
图11上为m.8393位点窗口的序列信息，图11下为RsCBE,BcCBE及其突变版本V6,V11对m.8393位点的编辑情况。
图12RsCBE,BcCBE及其突变版本V6,V11编辑系统对线粒体m.9380位点进行编辑情况。
图12上为m.9380位点窗口的序列信息，图12下为RsCBE,BcCBE及其突变版本V6,V11对m.9380位点的编辑情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细说明，借此对如何应用本发明实现DNA的C/G到T/A编辑充分理解并据以实施。
下面结合附图对本发明进一步说明。本发明提供了一种新型DNA编辑工具：RsCBE可以实现C/G到T/A编辑，该系统包括：线粒体定位的有4个载体，细胞核定位的有4个载体。可以选择线粒体定位的RsCBE实现对线粒体DNA的编辑，选择细胞核定位的RsCBE可以实现对细胞核基因组上的编辑。RVD文库可以选择与编辑系统相适应的任意文库，本发明在实施例中采用的文库见Cell Discov.2021Sep 3；7(1):78，组装方法见授权专利：一种基于TALE组装的线粒体DNA编辑系统，专利号ZL202110688797.9。实施例未详细描述的步骤、试剂、模块等为本领域技术人员熟知的内容，本申请不再赘述。
【实施例1】
利用细胞核定位的NLS版本的RsCBE，在人293FT细胞中对靶向的T载体进行编辑。
(一)设计TALE序列和RsCBE的组装
构建Spacer内包含不同motif的T载体(tC，aC，gC和CC)，Spacer两端还有相同的识别序列。将靶向T载体识别不同DNA碱基的RVD模块(Cell Discov.2021Sep 3；7(1):78)通过Golden Gate的方法分别组装到RsCBE骨架载体上，组装方法见授权专利：一种基于TALE组装的线粒体DNA编辑系统，专利号ZL202110688797.9。
将组装的产物转化DH5α并采用含有氨卞青霉素的固体LB培养板进行筛选，之后挑取单克隆并使用下述引物进行PCR鉴定，引物序列如Seq ID NO:9、10所示。根据RVD数量，判断阳性的克隆，如16个RVD大小应为1759bp，15个RVD大小应为1657bp。之后，使用上述引物进行正反测序，序列正确的阳性克隆提取质粒用于后续实验。
(二)转染细胞进行检测不同组合RsCBE的编辑效率
选择293FT细胞作为编辑对象，在细胞密度达到70-90％时，提前2小时换液，细胞计数后，取1.5x105个细胞用于细胞电转染(仪器：Lonza 4D-nucleofector)。将4个NLS版本的Half-DddA的载体按照N188N和N188C配对，N256N和N256C配对的原则进行组合与包含不同motif的T载体进行电转细胞293FT细胞。左右两端的载体各转染400ng，T载体50ng使用SF-Cell Line 4D-nucleofector X-kit电转染细胞。
电转染完成后，将细胞接入12孔板中并培养24小时，接着使用含有1μg/mL的嘌呤霉素进行细胞筛选，培养72小时后将细胞消化离心，并收取细胞用于检测DNA突变效率。
收取的细胞样品DNA提取方式如下：采用30μL的QuickExtractTM DNA ExtractionSolution(Lucigen)重选细胞，之后65℃加热45min，接着涡旋离心并使用98℃加热2min。
采用2×Green Taq Mix(Vazyme)扩增T载体或线粒体DNA上含有编辑位点的目的片段，之后用于Sanger测序；或采用Phanta Super-Fidelity DNA polymerase(Vazyme)及高通量测序建库引物进行高通量测序分析编辑效率。如图4所示，高通量测序的结果显示RsCBE在针对tC，aC，gC和CC motif的spacer内都能进行高效的编辑。
【实施例2】
利用线粒体定位的MTS版本的RsCBE，在人293FT细胞中线粒体DNA进行编辑。
选择人类线粒体DNA(参考序列版本：NC_012920.1)上m.13513，m.3890，m.4430，m.3277，m.3684，m.4735位点进行编辑(如图5-10的上部分所示)，根据这些位点的附近的DNA序列，设计识别的TALE序列，将识别的不同DNA碱基的RVD模块通过Golden Gate的方法分别组装到4个线粒体定位的RsCBE的骨架载体上。
将组装的产物转化DH5α并采用含有氨卞青霉素的固体LB培养板进行筛选，之后挑取单克隆并使用下述引物进行PCR鉴定，引物序列如Seq ID NO:9、10所示。根据RVD数量，判断阳性的克隆，如16个RVD大小应为1759bp，15个RVD大小应为1657bp。之后，使用上述引物进行正反测序，序列正确的阳性克隆提取质粒用于后续实验。
按实施例1中后面相同的操作流程，每个位点的的四个组合分别转染293FT细胞，并进行收集细胞，提取DNA进行构建扩增子文库，进行突变效率分析。如图5-10(AC为L-N188C+R-N188N；BD为L-N256C+R-N256N；CA为L-N188N+R-N188C；DB为L-N256N+R-N256C)(L为左端，R为右端)所示，RsCBE针对线粒体内源性的位点都能进行高效的编辑，显示出了编辑窗口内无motif限制的特征。
上述说明示出并描述了发明的实施例，总之，本发明提供了一种新型线粒体DNA编辑器：RsCBE。实验证实，本发明的一种新型线粒体DNA编辑器：RsCBE能够成功的在人线粒体上实现G/C到A/T的编辑。
Claims (16)
1.一种双链DNA胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域，其特征在于该DddA结构域为Ruminococcus sp.AF17-6来源的双链DNA胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域，其基因名为DWW94_10390，编码INTEIN_C_TER domain-containing protein的145-281位氨基酸(Uniprot ID：A0A373WC03)。
2.权利要求1所述的胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域，其特征在于该DddA结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.来自权利要求1所述DddA结构域的分割蛋白，其特征在于，按该DddA的结构域的氨基酸结构特征选择在N188N位点进行分割得到一对half DddA的分割蛋白，为：N188N和N188C，以及，按该DddA的结构域的氨基酸结构特征选择在N256位点进行分割得到一对half DddA的分割蛋白，为N256N和N256C；分割蛋白成对使用。
4.根据权利要求3所述的分割蛋白，其特征在于，该分割蛋白为核苷酸序列如下所示的分割蛋白：N188N氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；N188C氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；N256N氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；N256C氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
5.权利要求1、2所述DddA结构域或者权利要求3、4所述分割蛋白在构建DNA的C/G到A/T编辑的胞嘧啶编辑系统RsCBE中的应用。
6.采用权利要求1、2所述DddA结构域或者权利要求3、4所述分割蛋白构建的胞嘧啶编辑系统RsCBE。
7.根据权利要求6所述胞嘧啶编辑系统RsCBE，包括RVD文库、线粒体定位骨架载体和细胞核定位骨架载体，其特征在于，用于实现线粒体DNA的C/G到T/A编辑的胞嘧啶编辑系统RsCBE采用MTS-RsCBE骨架载体，用于实现细胞核DNA的C/G到T/A编辑的胞嘧啶编辑系统RsCBE采用NLS-RsCBE骨架载体；即：将Ruminococcus来源的双链DNA胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域的分割成half DddA的4个分割蛋白配对分别和糖基化酶抑制剂(UGI)融合之后分别插入到MTS-TALE骨架载体的NheⅠ和PmeⅠ这两个酶切位点之间分别得到4个MTS-RsCBE骨架载体；将Ruminococcus来源的双链DNA胞嘧啶脱氨基酶DddA结构域的分割成half DddA的4个分割蛋白配对分别和糖基化酶抑制剂(UGI)融合之后分别插入到NLS-TALE骨架载体的NheⅠ和PmeⅠ这两个酶切位点之间分别得到4个NLS-RsCBE骨架载体。
8.根据权利要求7所述胞嘧啶编辑系统RsCBE，其特征在于，4个MTS-RsCBE骨架载体分别为：MTS-ccdb-N188N-UGI、MTS-ccdb-N188C-UGI、MTS-ccdb-N256N-UGI、MTS-ccdb-N256C-UGI；4个NLS-RsCBE骨架载体分别为：NLS-ccdb-N188N-UGI、NLS-ccdb-N188C-UGI、NLS-ccdb-N256N-UGI和NLS-ccdb-N256C-UGI。
9.根据权利要求7所述胞嘧啶编辑系统RsCBE，其特征在于，所述的MTS-TALE骨架载体包含的主要元件5’端到3’端依次为：线粒体定位信号(MTS)序列、TALE-N端(NTD)136个氨基酸的核苷酸序列、ccdb毒素基因、TALE-C末端(CTD)41个氨基酸的核苷酸序列、嘌呤霉素细胞药筛基因、氨卞青霉素抗性元件；
所述的NLS-TALE骨架载体包含的主要元件5’端到3’端依次为：细胞核定位信号(NLS)序列、TALE-N端(NTD)136个氨基酸的核苷酸序列、ccdb毒素基因、TALE-C端(CTD)63个氨基酸的核苷酸序列、嘌呤霉素细胞药筛基因、氨卞青霉素抗性元件。
10.根据权利要求7所述胞嘧啶编辑系统RsCBE，其特征在于，MTS-TALE骨架载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；NLS-TALE骨架载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；UGI编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
11.根据权利要求7-10任一所述胞嘧啶编辑系统RsCBE，其特征在于，所有骨架载体匹配于一种TALE组装系统，骨架载体毒素基因ccdb两侧分别含有Bsa I酶切位点，酶切后产生不同的粘性末端用于特异性连接识别特定DNA序列的TALE序列。
12.权利要求6-10中任一所述的胞嘧啶编辑系统RsCBE在线粒体DNA或者细胞核DNA的C/G到T/A编辑中的应用。
13.权利要求1、2所述DddA结构域、或者权利要求3、4所述分割蛋白、或者权利要求6-10所述胞嘧啶编辑系统RsCBE在制备线粒体DNA或细胞核DNA的C/G到T/A编辑的试剂盒中的应用。
14.一种用于线粒体DNA或细胞核DNA的C/G到T/A编辑的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1、2所述DddA结构域、或者权利要求3、4所述分割蛋白、或者权利要求6-10所述胞嘧啶编辑系统RsCBE。
15.权利要求6-10所述的胞嘧啶编辑系统RsCBE的使用方法，包括以下步骤：
步骤1、根据所要编辑位点的DNA序列，设计编辑位点两侧的识别DNA的TALE序列，选择所述的DNA胞嘧啶编辑系统MTS-RsCBE或者NLS-RsCBE中的4个骨架载体，通过Golden Gate克隆法将TALE序列分别连到骨架载体上，组装胞嘧啶编辑器(RsCBE)载体；组装完成的RsCBE载体经过转化DH5α感受态、单克隆PCR验证、Sanger测序等步骤后，可获得正确组装的RsCBE载体，进一步通过提取质粒可获得RsCBE质粒；
步骤2、将正确组装RsCBE质粒按照Half DddA的配对方式(N188N和N188C配对，N256N和N256C配对)转染所要编辑的细胞，通过1μg/mL的嘌呤霉素筛选转染成功的细胞，编辑后的细胞通过Sanger测序或高通量测序验证RsCBE编辑效率，对编辑的细胞进一步培养获得稳定的线粒体DNA或细胞核DNA突变的细胞并进行后续的功能性分析。
16.权利要求6-10中任一项所述的RsCBE编辑系统在治疗基因突变疾病中应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117106758A (zh) * | 2023-08-25 | 2023-11-24 | 南京医科大学 | 一种特异在DNA的gC基序上实现C/G到T/A编辑的RiCBE系统 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111763686A (zh) * | 2019-08-20 | 2020-10-13 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 实现c到a以及c到g碱基突变的碱基编辑系统及其应用 |
| CN113151229A (zh) * | 2020-01-22 | 2021-07-23 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 胞嘧啶脱氨酶及包含该酶的胞嘧啶编辑器 |
| US20210355475A1 (en) * | 2018-08-10 | 2021-11-18 | Cornell University | Optimized base editors enable efficient editing in cells, organoids and mice |
| CN114736893A (zh) * | 2022-03-04 | 2022-07-12 | 南京医科大学 | 一种可以实现线粒体dna上a/t到g/c编辑的方法 |
-
2022
- 2022-11-18 CN CN202211443541.2A patent/CN116004592B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210355475A1 (en) * | 2018-08-10 | 2021-11-18 | Cornell University | Optimized base editors enable efficient editing in cells, organoids and mice |
| CN111763686A (zh) * | 2019-08-20 | 2020-10-13 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 实现c到a以及c到g碱基突变的碱基编辑系统及其应用 |
| CN113151229A (zh) * | 2020-01-22 | 2021-07-23 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 胞嘧啶脱氨酶及包含该酶的胞嘧啶编辑器 |
| CN114736893A (zh) * | 2022-03-04 | 2022-07-12 | 南京医科大学 | 一种可以实现线粒体dna上a/t到g/c编辑的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ANKIT SABHARWAL等: "The FusX TALE Base Editor (FusXTBE) for Rapid Mitochondrial DNA Programming of Human Cells In Vitro and Zebrafish Disease Models In Vivo", CRISPR J., pages 799 * |
| HYUNJI LEE等: "Mitochondrial DNA editing in mice with DddA-TALE fusion deaminases", NATURE COMMUNICATIONS, pages 1 - 6 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117106758A (zh) * | 2023-08-25 | 2023-11-24 | 南京医科大学 | 一种特异在DNA的gC基序上实现C/G到T/A编辑的RiCBE系统 |
| CN117106758B (zh) * | 2023-08-25 | 2024-05-17 | 南京医科大学 | 一种特异在DNA的gC基序上实现C/G到T/A编辑的RiCBE系统 |
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