CN116063549A - 一种碱基编辑系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种碱基编辑系统及其应用。该技术基于筛选出来的高效宽窗口腺嘌呤脱氨酶和胞嘧啶脱氨酶，通过在esgRNA的3′添加RNA配体来招募脱氨酶实现高效的碱基编辑；通过串联多个带有不同配体的sgRNA，可以同时在多个位点实现高效的多重碱基编辑。本发明能够实现效率更高、突变类型更丰富的碱基编辑，是一种用途更广的新型植物碱基编辑技术。

Description

一种碱基编辑系统及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因组碱基编辑，具体涉及一种碱基编辑系统及其应用。

背景技术

单核苷酸多态性(SNP)在生物体中起着至关重要的作用。人类遗传疾病中有50％是由碱基之间的替换或颠换造成的；而在植物中由碱基的变化引起的氨基酸变化也经常会导致重要性状的改变，通过饱和突变技术定向进化基因可以获得功能获得性突变体。然而对于突变体库的创制，传统方法(物理、化学诱变等)费时费力，不易鉴定。

2012年CRISPR/Cas9系统出现，通过设计一个简单的向导RNA(sgRNA)，精准靶向基因位点，可以精准创制大量突变体，然而由于CRISPR/Cas9系统产生双链断裂(DSB)，细胞内源 NHEJ修复后往往产生插入和缺失(Indel)，导致基因功能的丧失；从2016年开始，在CRISPR/Cas 的基础上先后开发了一系列精准编辑系统，包括胞嘧啶碱基编辑(CBE)、胞嘧啶鸟嘌呤碱基编辑(CGBE)、腺嘌呤碱基编辑(ABE)、引导编辑等(PE)。CBE是利用切口酶活性的Cas9(nCas9) 融合胞嘧啶脱氨酶以及尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)，实现C>T的碱基替换；而CGBE是在 CBE的基础上删除UGI同时融合UDG来促进AP位点的形成，在修复机制作用下实现C>G 的碱基替换；ABE在nCas9的基础上融合腺嘌呤脱氨酶，实现A>G的替换；PE是在nCas9 上融合了逆转录酶(RT)，同时pegRNA的作用下，可以实现任意碱基之间的转换以及小片段的插入和缺失。精准编辑产生碱基的替换引起氨基酸改变从而影响蛋白功能，这对于定向进化筛选优良性状是非常有利的。但引导编辑在植物中的效率过低，还需要进一步的优化和改造。

之前有研究融合胞嘧啶脱氨酶A3A和腺嘌呤脱氨酶TadA-TadA7.10二聚体在水稻中开发了双碱基编辑器STEME，能够同时实现A>G和C>T的碱基替换，但由于TadA-TadA7.10二聚体的活性较低，胞嘧啶碱基编辑的效率明显高于腺嘌呤碱基编辑的效率，导致产生的突变主要是C>T的编辑。也有研究利用配体招募形式分别胞嘧啶脱氨酶APOBEC1和腺嘌呤脱氨酶 TadA-TadA7.10二聚体，同时利用多个sgRNA策略可以同时在多个位点分别实现A>G和C>T 以及Indel多种编辑，但由于APOBEC1和TadA-TadA7.10活性较低，其碱基编辑效率并不理想。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明开发一款高效的多碱基编辑工具，来实现高效的多重碱基编辑。

本发明的第一个目的是提供一种碱基编辑系统，所述碱基编辑系统包括：

1)碱基编辑融合蛋白和/或含有编码所述碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，所述碱基编辑融合蛋白包括融合了胞嘧啶脱氨酶的RNA配体招募蛋白，或融合了腺嘌呤脱氨酶的RNA配体招募蛋白，优选的，所述RNA配体为MCP和N22p；和/或

2)至少一种向导RNA和/或至少一种含有编码所述至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

其中所述至少一种向导RNA针对所述靶核酸区域内的至少一个靶序列。

如本文所用，“碱基编辑系统”是指用于对细胞或生物体内基因组进行碱基编辑所需的成分的组合。其中所述系统的各个成分，例如碱基编辑融合蛋白、一种或多种向导RNA可以各自独立地存在，或者可以以任意的组合作为组合物的形式存在。

在某一个特殊的实施例中，所说碱基编辑融合蛋白和sgRNA同时构建至同一个基础载体上；具体的，由于技术开发过程是在水稻原生质体中进行，为了方便，采用将碱基编辑融合蛋白载体和sgRNA载体分开表达的模式，将这两部分同时构建至一个基础载体上。

在某一个特殊的实施例中，所述基础载体为pHUE411基础载体。

进一步的，所述碱基编辑融合蛋白选自包括以下元件的单元1～4中的一种或多种的组合：

单元1：腺苷脱氨酶-nCas9或其变体；

单元2：nCas9或其变体-T2A自剪切肽-腺苷脱氨酶-N22p配体招募蛋白；

单元3：胞嘧啶脱氨酶-nCas9或其变体-尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)；

单元4：nCas9或其变体-T2A自剪切肽-MCP配体招募蛋白-胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)。

所述碱基编辑融合蛋白N端设置启动子并在C端设置终止子；

当述碱基编辑融合蛋白选自单元1～4中多种的组合时，所述碱基编辑融合蛋白中nCas9或其变体的数量是一个或多个；

优选的，所述nCas9变体为nCas9(D10A)。

进一步的，所述碱基编辑融合蛋白中的腺苷脱氨酶选自TadA-TadA7.10二聚体、TadA8e、 TadA9；

优选的，所述腺苷脱氨酶选自TadA8e、TadA9；

进一步优选的，所述腺苷脱氨酶选自TadA9。

进一步的，所述碱基编辑融合蛋白中的胞嘧啶脱氨酶选自APOBEC1、APOBEC3B、CDA1、 AID、evoFERNY；

优选的，所述胞嘧啶脱氨酶选自APOBEC1、CDA1、AID；

进一步优选的，所述胞嘧啶脱氨酶选自CDA1、AID；

更优选的，所述胞嘧啶脱氨酶选自CDA1。

进一步的，所述碱基编辑融合蛋白为单元4中nCas9或其变体-T2A自剪切肽-MCP配体招募蛋白-胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)与单元2中T2A自剪切肽-腺苷脱氨酶 -N22p配体招募蛋白串联，并在N端设置启动子，C端设置终止子。

进一步的，所述碱基编辑融合蛋白序列中还包括Nucleoplasmin NLS、SV40NLS、bpNLS、 SGGSLinker、XTEN Linker、32aa Linke中的一个或多个。

所述Nucleoplasmin NLS、SV40 NLS、SGGS Linker、XTEN Linker、32aa Linker、bpNLS 等元件是构建碱基编辑融合蛋白的元件，Nucleoplasmin NLS、SV40 NLS、bpNLS是不同核定位信号，负责把蛋白定位至细胞核；SGGS Linker、XTEN Linker、32aa Linker是不同的连接子，负责连接两个蛋白；其中核定位信号(NLS)和连接子(Linker)的种类和位置都是限定的。

进一步的，所述碱基编辑融合蛋白为Nucleoplasmin NLS-nCas9(D10A)-SGGSLinker-SV40 NLS-T2A-MCP-XTEN Linker-SV40 NLS-CDA1-32aa Linker-SGGS Linker-UGI-SGGS Linker-Nucleoplasmin NLS-T2A-TadA9-32aa Linker-N22p-bpNLS。

进一步的，所述碱基编辑融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，编码所述碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，向导RNA的个数为一个或多个；在某个特殊的实施例中，向导RNA的个数为3 个。

进一步的，所述向导RNA选自sgRNA、esgRNA、经配体修饰的esgRNA中的一种或多种的组合。

进一步的，所述向导RNA选自：

1)esgRNA的3’端串联一个或多个MS2配体，或，

2)esgRNA的3’端串联一个或多个boxB配体，或，

3)esgRNA的3’端以任意顺序串联一个或多个MS2配体和一个或多个boxB配体。

在某个特殊的实施例中，串联的配体数量为2个。

进一步的，所述向导RNA为esgRNA的3’端顺序串联boxB配体-MS2配体。

进一步的，所述碱基编辑系统还包括用于驱动向导RNA的启动子。

在一些实施方案中，启动子包括但不限于聚合酶pol I、pol II或pol III启动子。在植物细胞中，向导RNA的表达可通过植物特异的RNA pol III启动子来驱动，如TaU6、OsU6或OsU3。

进一步的，向导RNA所针对的靶核酸区域内在靶序列的3’端包含PAM序列，使靶序列 2-12位存在碱基A或靶序列-2-11存在碱基C；所述PAM序列为NGG或CCN；

优选的，所述PAM序列为NGG时，位于靶序列下游，所述PAM序列为CCN时，位于靶序列上游；

进一步优选的，所述PAM序列为NGG时，位于靶序列下游20bp处，所述PAM序列为CCN时，位于靶序列上游20bp处。

本发明核苷酸序列中所述“N”代表4兼并碱基(ATGC)中的任意一个。

本发明的第二个目的是提供前述的碱基编辑系统的应用，所述应用为将前述碱基编辑系统导入待编辑基因组，对所述待编辑基因组靶核酸区域内一个位点或多个位点的核苷酸进行取代。

进一步的，所述取代为A>G和/或C>T的编辑；

所述碱基编辑系统能够在待编辑基因组的多个位点分别实现A>G和/或C>T的多重碱基编辑。

进一步的，所述待编辑基因组来源于植物；

优选的，所述植物为单子叶植物和双子叶植物；

进一步优选的，所述植物为水稻。

本发明的碱基编辑系统在导入待编辑基因组后，所述碱基编辑融合蛋白和所述向导RNA能够形成复合物，并且该复合物在向导RNA介导下特异性靶向靶序列，并导致靶序列中一或多个A被G取代和/或一或多个C被T取代。

在一些实施方案中，本发明的碱基编辑融合蛋白的A至G碱基编辑窗口位于靶序列的位置 2-12。也就是说，本发明的碱基编辑融合蛋白可以使靶序列从5’末端起的第2-12位的一或多个 A被G取代。

在一些实施方案中，本发明的碱基编辑融合蛋白的C至T碱基编辑窗口位于靶序列的位置 -2-11。也就是说，本发明的碱基编辑融合蛋白可以使靶序列从5’末端起的第-2-11位范围内的一或多个C被T取代。

可以通过本发明的碱基编辑系统进行基因组修饰的生物体包括适于碱基编辑的任何生物体，优选真核生物。生物体的实例包括但不限于，哺乳动物如人、小鼠、大鼠、猴、犬、猪、羊、牛、猫；家禽如鸡、鸭、鹅；植物，包括单子叶植物和双子叶植物，例如，所述植物是作物植物，包括但不限于小麦、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、番茄、烟草、木薯和马铃薯。优选地，所述生物体是植物。更优选地，所述生物体是水稻。

在本发明的方法中，所述碱基编辑组合物可以本领域技术人员熟知的各种方法导入植物。可用于将本发明的碱基编辑系统导入植物的方法包括但不限于：基因枪法、PEG介导的原生质体转化、土壤农杆菌介导的转化、植物病毒介导的转化、花粉管通道法和子房注射法。优选地，通过土壤农杆菌介导的转化将所述碱基编辑组合物导入植物。

在本发明的方法中，只需在植物细胞中导入或产生所述碱基编辑融合蛋白和向导RNA即可实现对靶序列的修饰，并且所述修饰可以稳定遗传，无需将编码所述碱基编辑系统的组分的外源多核苷酸稳定转化植物。这样避免了稳定存在的(持续产生的)碱基编辑组合物的潜在脱靶作用，也避免外源核苷酸序列在植物基因组中的整合，从而具有更高生物安全性，获得含有碱基突变的转基因植物或植物部分。

在一些实施方式中，所述导入包括将本发明的碱基编辑系统转化至分离的植物细胞或组织，然后使所述经转化的植物细胞或组织再生为完整植物。优选地，在不存在选择压力下进行所述再生，也即是，在组织培养过程中不使用任何针对表达载体上携带的选择基因的选择剂。不使用选择剂可以提高植物的再生效率，获得不含外源核苷酸序列的经修饰的植物或植物部分。

与现有技术相比，本申请技术方案具有以下有益效果：

(1)碱基编辑融合蛋白可以同时在多个内源靶基因位点产生高效的多重编辑，并且每个靶位点的编辑效率与单靶点编辑相比没有明显变化。

(2)本发明利用筛选出的高效脱氨酶，通过改变sgRNA上的RNA配体来招募不同的配体蛋白进而将特定的脱氨酶定位到目标序列处，通过串联多个带有不同RNA配体的sgRNA，可以同时在多个位点实现高效的多重碱基编辑，从而建立了比传统碱基编辑器效率更高、突变类型更丰富、用途更广的新型植物碱基编辑技术。

附图说明

图1为碱基编辑融合蛋白单元1～4的蛋白融合及配体招募形式碱基编辑系统载体图

图2为水稻内源靶基因位点腺嘌呤碱基编辑系统效率测试图，图2A为实施例3所述编辑系统结构，图2B为实施例3所述辑系统对靶序列OsCDC48-T1的编辑效率测试，图2C为OsDEP1-T1，图2D为OsDEP1-T2，图2E为OsNRT1.1B-T1，图2F为OsEV，图2G为OsOD。

图3为不同腺嘌呤脱氨酶效率比较分析图

图4为水稻内源靶基因位点胞嘧啶碱基编辑系统效率测试图，图4A为实施例4所述编辑系统结构，图4B为实施例4所述辑系统对靶序列OsCDC48-T2的编辑效率测试，图4C为OsCDC48-T3，图4D为OsDEP1-T2，图4E为OsPDS-T1，图4F为OsEV，图4G为OsOD。

图5为不同胞嘧啶脱氨酶效率比较分析图

图6为水稻内源靶基因位点MoBE不同串联方式效率测试图，图6A为实施例5所述编辑系统载体图。图6B为实施例5所述编辑系统结构图，图6C为实施例5所述辑系统对靶序列OsCDC48-T1的编辑效率测试，图6D为OsCDC48-T2，图6E为OsEV，图6F为OsAAT-T1。

图7为对MoBE不同串联方式和STEME-1效率比较分析图

图8为对STEME-1和MoBE+boxB-MS2的编辑类型比较分析图

图9为水稻内源靶基因位点MoBE多碱基编辑效率测试图，图9A为对 OsCDC48-T1+OsDEP1-T2+OsAAT-T1三靶点同时编辑的效率测试，图9B为对 OsNRT1.1B-T1+OsPDS-T1+OsEV三靶点同时编辑的效率测试。

图10为pH-MoBE在转基因植株上发生的编辑，图10A在OsACC-T1上发生的C>T编辑，图10B在OsACC-T2上发生的A>G编辑。

具体实施方式

以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1构建由不同常用腺嘌呤脱氨酶和胞嘧啶脱氨酶组成的腺嘌呤碱基编辑ABE和胞嘧啶碱基编辑CBE。

为了开发一款高效的多碱基编辑器，我们采用配体招募(2A-AD)的形式构建ABE和CBE 碱基编辑系统(图1)。

1.ABE载体构建

(1)对核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的2A-TadA-TadA7.10载体进MluI单酶切(37℃，2h)，将6256bp～7447bp处的TadA-TadA7.10切掉，回收剩下的载体片段，用于后续实验步骤。

2A-TadA-TadA7.10载体包括依次设置的：核定位信号Nucleoplasmin NLS-Cas9蛋白 nCas9(D10A)-连接子SGGS Linker-核定位信号SV40NLS-自剪切肽T2A-腺嘌呤脱氨酶TadA- 连接子32aa Linker-腺嘌呤脱氨酶TadA7.10-连接子32aa Linker-配体蛋白N22p-核定位信号 bpNLS。

(2)获得核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的腺嘌呤脱氨酶TadA8e片段，该核苷酸编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

SEQ ID NO.15所示腺嘌呤脱氨酶TadA8e的核苷酸片段的获得方式可以是直接合成，或者使用一对引物以TadA8e-fusion载体为模板扩增得到，所述引物序列为：

TadA8e-fusion-F：cgtggaggagaatcccggccctacgcgtTCGGAGGTGGAGTTCTCTCATG(SEQ ID NO.70)

TadA8e-fusion-R：tcctggtcctggcgttgccacgcgtGCTCCCTCCAGAGCTGCC(SEQ IDNO.71)

TadA8e-fusion载体构建方法为：

对TadA-TadA7.10-fusion载体进行HindIII和AflII双酶切(37℃，2h)，回收大片段用于后续实验步骤；

TadA-TadA7.10-fusion载体来源于中科院遗传与发育所高彩霞老师赠送，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.57所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.58所示；

将人工合成的TadA8e与经HindIII和AflII双酶切后的大片段进行重组反应；

将连接产物转化大肠杆菌，菌落PCR鉴定后挑取2个正确单克隆送至生工测序，获得 TadA8e-fusion载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.59所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.60所示。

(3)获得SEQ ID NO.17所示腺嘌呤脱氨酶TadA9的核苷酸片段，该核苷酸编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示.。

SEQ ID NO.17所示腺嘌呤脱氨酶TadA9的核苷酸片段获得方式可以是直接合成，或者通过三对引物在TadA8e上引入V81S/Q153R获得TadA9片段。所述引物序列为：

TadA9-1F：caaagaagaagcggaaggtgGGATCCGAGGGCAGA(SEQ ID NO.72)

TadA9-1R：GCTCGAAGGTGGAATACAGGGTGGCATC(SEQ ID NO.73)

TadA9-2F：CCTGTATTCCACCTTCGAGCCGTGCGTCATGTG(SEQ ID NO.74)

TadA9-2R：CGTTGAACACCCGTCTTGGCATCCTG(SEQ ID NO.75)

TadA9-3F：GCCAAGACGGGTGTTCAACGCGCAGAAGAAG(SEQ ID NO.76)

TadA9-3R：gatttcagcgtaccgaattcccCACC(SEQ ID NO.77)

上述步骤(2)(3)中的PCR扩增反应体系为：

模板载体：1uL(20-50ng)

Primer-F：1.5uL(10uM)

Primer-R：1.5uL(10uM)

2×PCR Buffer for KOD FX：25uL

2mM dNTPs：10uL

KOD FX(TOYOBO KFX-101)：1uL

ddH₂O：10uL

反应程序为：94℃，2min(预变性)；98℃，10s(变性)；引物Tm-5℃，30s(退火)；68℃延伸(1kb/min)；变性-退火-延伸重复35个循环；68℃，10min(充分延伸)；4℃(保存)。

(4)将获得的TadA8e和TadA9片段分别与经MluI酶切过后的2A-TadA-TadA7.10进行重组反应，反应体系为：

骨架载体片段：长度(bp)×0.02/回收产物浓度(ng/uL)

插入片段：长度(bp)×0.04/回收产物浓度(ng/uL)

2×MultiF Seamless Assembly Mix(ABclonal RK21020)：5uL

ddH₂O：至10uL

反应程序为：50℃，30min(插入片段个数为1-2)/50℃，60min(插图片段个数为2-4)。

将连接产物进行转化：将10uL的连接产物加入50uL的DH5α大肠杆菌感受态细胞，冰上30min，42℃热激45s，冰上3min，加入700uL的无抗LB，37℃，220rpm摇床孵育30min，6000rpm离心1min收集菌体，吹打混匀后均匀凃至氨苄抗性LB板上，37℃恒温培养箱培养12-16h。

菌落PCR鉴定：用一对引物对大小一致的单菌落进行PCR，每个载体挑取12个单菌落进行检测，反应体系为：

2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme P222-01)：5uL

Primer-F：0.5uL

Primer-R：0.5uL

ddH₂O：4uL

反应程序为：95℃，3min(预变性)；95℃，15s(变性)；引物Tm值，30s(退火)；72℃延伸(1kb/15s)；变性-退火-延伸重复35个循环；72℃，5min(充分延伸)；4℃(保存)。

引物序列为：

Primer-F：CCAGAATTGGTCGGGTAGTGTTTG(SEQ ID NO.121)

Primer-R:cccttatcgggaaactactcacac(SEQ ID NO.19)

每个载体选择2个菌落PCR条带大小正确的单克隆送至生工测序，获得2A-TadA8e载体和2A-TadA9载体。

2A-TadA8e载体包括：核定位信号Nucleoplasmin NLS-Cas9蛋白nCas9(D10A)-连接子 SGGS Linker-核定位信号SV40 NLS-自剪切肽T2A-腺嘌呤脱氨酶TadA8e-连接子32aaLinker- 配体蛋白N22p-核定位信号bpNLS。

2A-TadA9载体包括：核定位信号Nucleoplasmin NLS-Cas9蛋白nCas9(D10A)-连接子SGGS Linker-核定位信号SV40 NLS-自剪切肽T2A-腺嘌呤脱氨酶TadA9-连接子32aaLinker-配体蛋白N22p-核定位信号bpNLS。

2.CBE载体构建

(1)对核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的2A-APOBEC1载体进行改造，在6668bp和7351bp处的APOBEC1的两端分别添加StuI(AGGCCT)和MluI(ACGCGT)酶切位点。

2A-APOBEC1载体包括依次连接的：核定位信号Nucleoplasmin NLS-Cas9蛋白nCas9(D10A)-连接子SGGS Linker-核定位信号SV40NLS-自剪切肽T2A-配体蛋白MCP-连接子 XTEN Linker-核定位信号SV40NLS-胞嘧啶脱氨酶APOBEC1-连接子SGGS Linker-尿嘧啶DNA糖基化酶抑制UGI-SGGS Linker-核定位信号Nucleoplasmin NLS。

(2)对改造后的2A-APOBEC1载体进行StuI和MluI双酶切(37℃，2h)，将APOBEC1 切掉后回收剩余片段，用于后续实验步骤。

将核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的胞嘧啶脱氨酶CDA1、核苷酸序列如SEQ IDNO.7 所示的胞嘧啶脱氨酶APOBEC3Bctd、核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的胞嘧啶脱氨酶AID 和核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的胞嘧啶脱氨酶evoFERNY在金斯瑞公司进行基因合成后， PCR分别获得相应片段，APOBEC3Bctd氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；CDA1氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；AID氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；evoFERNY氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

(3)将CDA1、AID、evoFERNY和APOBEC3Bctd分别和经步骤(2)StuI和MluI双酶切后的2A-APOBEC1载体进行重组反应，重组反应体系为：

骨架载体片段：长度(bp)×0.02/回收产物浓度(ng/uL)

插入片段：长度(bp)×0.04/回收产物浓度(ng/uL)

2×MultiF Seamless Assembly Mix(ABclonal RK21020)：5uL

ddH₂O：至10uL

反应程序为：50℃，30min(插入片段个数为1-2)/50℃，60min(插图片段个数为2-4)。

将连接产物进行转化：连接产物转化大肠杆菌，设计引物菌落PCR验证后挑取单克隆测序，获得2A-CDA1、2A-AID、2A-evoFERNY和2A-APOBEC3Bctd载体。

2A-CDA1载体包括：核定位信号Nucleoplasmin NLS-Cas9蛋白nCas9(D10A)-连接子SGGS Linker-核定位信号SV40 NLS-自剪切肽T2A-配体蛋白MCP-连接子XTEN Linker-核定位信号 SV40 NLS-胞嘧啶脱氨酶CDA1-连接子32aaLinker-连接子SGGS Linker-尿嘧啶DNA糖基化酶抑制UGI-SGGS Linker-核定位信号Nucleoplasmin NLS。

2A-AID载体包括：核定位信号Nucleoplasmin NLS-Cas9蛋白nCas9(D10A)-连接子SGGS Linker-核定位信号SV40NLS-自剪切肽T2A-配体蛋白MCP-连接子XTEN Linker-核定位信号 SV40NLS-胞嘧啶脱氨酶AID-连接子SGGS Linker-尿嘧啶DNA糖基化酶抑制UGI-SGGS Linker-核定位信号Nucleoplasmin NLS。

2A-evoFERNY载体包括：核定位信号Nucleoplasmin NLS-Cas9蛋白nCas9(D10A)-连接子 SGGS Linker-核定位信号SV40 NLS-自剪切肽T2A-配体蛋白MCP-连接子XTENLinker-核定位信号SV40 NLS-胞嘧啶脱氨酶CDA1-连接子SGGS Linker-尿嘧啶DNA糖基化酶抑制 UGI-SGGS Linker-核定位信号Nucleoplasmin NLS。

2A-APOBEC3Bctd载体包括：核定位信号Nucleoplasmin NLS-Cas9蛋白nCas9(D10A)-连接子SGGS Linker-核定位信号SV40 NLS-自剪切肽T2A-配体蛋白MCP-连接子XTEN Linker- 核定位信号SV40 NLS-胞嘧啶脱氨酶CDA1-连接子XTEN Linker-连接子SGGSLinker-尿嘧啶 DNA糖基化酶抑制UGI-SGGS Linker-核定位信号Nucleoplasmin NLS。

实施例2确定向导RNA序列

针对胞嘧啶碱基编辑(CBE)、腺嘌呤碱基编辑(ABE)和本发明的碱基编辑融合蛋白(MoBE) 分别确定靶序列，用于后续实验。

在靶序列选择时，为在水稻内源基因中选定20bp-NGG或者CCN-20bp的目标序列作为靶序列，若针对胞嘧啶脱氨酶，则目标序列的1-10位应包含尽可能多的碱基C，若针对腺嘌呤脱氨酶，则目标序列的2-9位应包含尽可能多的碱基A，若针对MoBE，则目标序列的1-10位应包含尽可能多的碱基C和A。

本实验筛选十个水稻内源靶因位点(sgRNA序列)：OsAAT-T1、OsCDC48-T1、OsCDC48-T2、 OsCDC48-T3、OsDEP1-T1、OsDEP1-T2、OsNRT1.1B-T1、OsPDS-T1、OsEV和OsOD。

以下靶序列中，加粗处为PAM序列，下划线斜体处为待编辑的目的碱基。

同时，制备与目标序列互补对应的sgRNA引物对(SgF/SgR)，即构建向导RNA所需引物，用于连接到对应的配体修饰的esgRNA载体和原始sgRNA载体上。以下sgRNA引物对中大写部分为与目标序列互补对应的20bp，小写部分为增加的酶切位点。

1、ABE

(1-1)OsCDC48-T1

靶序列:

(SEQ ID NO.26)

SgF：ggcgTAGCACCCATGACAATGACA(SEQ ID NO.27)

SgR：aaacTGTCATTGTCATGGGTGCTA(SEQ ID NO.28)

(1-2)OsDEP1-T1

靶序列：

(SEQ ID NO.29)

SgF：ggcgAGACAAGCTTGGCCCTCTTT(SEQ ID NO.30)

SgR：aaacAAAGAGGGCCAAGCTTGTCT(SEQ ID NO.31)

(1-3)OsDEP1-T2

靶序列：

(SEQ ID NO.32)

SgF：ggcgAGCACATGAGAGAACAATAT(SEQ ID NO.33)

SgR：aaacATATTGTTCTCTCATGTGCT(SEQ ID NO.34)

(1-4)OsNRT1.1B-T1

靶序列：

(SEQ ID NO.35)

SgF：ggcgACTAGATATCTAAACCATTA(SEQ ID NO.36)

SgR：aaacTAATGGTTTAGATATCTAGT(SEQ ID NO.37)

(1-5)OsEV

靶序列：

(SEQ ID NO.38)

SgF：ggcgCACACACACACTAGTACCTC(SEQ ID NO.39)

SgR：aaacGAGGTACTAGTGTGTGTGTG(SEQ ID NO.40)

(1-6)OsOD

靶序列：

(SEQ ID NO.41)

SgF：ggcgACACACACACTAGTACCTCT(SEQ ID NO.42)

SgR：aaacAGAGGTACTAGTGTGTGTGT(SEQ ID NO.43)

2、CBE

(2-1)OsCDC48-T2

靶序列：

(SEQ ID NO.44)

SgF：ggcgGACCAGCCAGCGTCTGGCGC(SEQ ID NO.45)

SgR：aaacGCGCCAGACGCTGGCTGGTC(SEQ ID NO.46)

(2-2)OsCDC48-T3

靶序列：

(SEQ ID NO.47)

SgF：ggcgTTCGCTGACCAGCCAGCGTC(SEQ ID NO.48)

SgR：aaacGACGCTGGCTGGTCAGCGAA(SEQ ID NO.49)

(2-3)OsDEP1-T2

靶序列：

(SEQ ID NO.32)

SgF：ggcgAGCACATGAGAGAACAATAT(SEQ ID NO.33)

SgR：aaacATATTGTTCTCTCATGTGCT(SEQ ID NO.34)

(2-4)OsPDS-T1

靶序列：

(SEQ ID NO.50)

SgF：ggcgGCTCCTGCAGAGGAATGGGT(SEQ ID NO.51)

SgR：aaacACCCATTCCTCTGCAGGAGC(SEQ ID NO.52)

(2-5)OsEV

靶序列：

(SEQ ID NO.38)

SgF：ggcgCACACACACACTAGTACCTC(SEQ ID NO.39)

SgR：aaacGAGGTACTAGTGTGTGTGTG(SEQ ID NO.40)

(2-6)OsOD

靶序列：

(SEQ ID NO.41)

SgF：ggcgACACACACACTAGTACCTCT(SEQ ID NO.42)

SgR：aaacAGAGGTACTAGTGTGTGTGT(SEQ ID NO.43)

3、MoBE

(3-1)OsAAT-T1

靶序列：

(SEQ ID NO.53)

SgF：ggcgCAAGGATCCCAGCCCCGTGA(SEQ ID NO.54)

SgR：aaacTCACGGGGCTGGGATCCTTG(SEQ ID NO.55)

(3-2)OsCDC48-T1

靶序列:

(SEQ ID NO.26)

SgF：ggcgTAGCACCCATGACAATGACA(SEQ ID NO.27)

SgR：aaacTGTCATTGTCATGGGTGCTA(SEQ ID NO.28)

(3-3)OsCDC48-T2

靶序列：

(SEQ ID NO.44)

SgF：ggcgGACCAGCCAGCGTCTGGCGC(SEQ ID NO.45)

SgR：aaacGCGCCAGACGCTGGCTGGTC(SEQ ID NO.46)

(3-4)OsEV

靶序列：

(SEQ ID NO.38)

SgF：ggcgCACACACACACTAGTACCTC(SEQ ID NO.39)

SgR：aaacGAGGTACTAGTGTGTGTGTG(SEQ ID NO.40)

实施例3筛选腺嘌呤脱氨酶

(1)将实施例2中与OsCDC48-T1、OsDEP1-T1、OsDEP1-T2、OsNRT1.1B-T1、OsEV 和OsOD对应的sgRNA引物对分别进行退火：98℃，5min；95℃，1,min；90℃，1min；80℃， 1min；70℃，1min；60℃，1min；50℃，1min；40℃，1min；30℃，1min；20℃，1min；10℃，1min；4℃保存，将退火产物分别连接至经过BsaI酶切灭活后(37℃，2h；80℃，20min)的 pOsU3-esgRNA-2×boxB(pOsU3-esgRNA-2×boxB核苷酸序列如SEQ ID NO.117所示)和 pOsU3-sgRNA载体(pOsU3-sgRNA载体核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示)上。

带有靶位点的pOsU3-sgRNA载体pOsU3-2×boxB载体的构建方法为，将OsCDC48-T1、 OsDEP1-T1、OsDEP1-T2、OsNRT1.1B-T1、OsEV和OsOD对应的sgRNA引物对退火后得到的退火产物分别连接至经过BsaI酶切灭活后的pOsU3-esgRNA-2×boxB和pOsU3-sgRNA载体上，获得分别带有OsCDC48-T1、OsDEP1-T1、OsDEP1-T2、OsNRT1.1B-T1、OsEV和OsOD 的pOsU3-sgRNA载体和pOsU3-esgRNA-2×boxB载体。

pOsU3-sgRNA载体来源于中科院遗传与发育所高彩霞老师赠送。

pOsU3-esgRNA-2×boxB载体构建方法为：

首先对pOsU3-sgRNA载体进行BasI和HindIII双酶切，切掉SEQ ID NO.56所示sgRNA scaffold-SUP4 terminator，回收剩下的载体片段，用于后续试验；

合成esgRNA-2×boxB-SUP4terminator片段，将合成的esgRNA-2×boxB-SUP4terminator片段与经BasI和HindIII双酶切后的pOsU3-sgRNA载体片段进行重组反应，获得pOsU3-esgRNA-2×boxB载体；

退火产物与BsaI酶切灭活后的pOsU3-esgRNA-2×boxB或pOsU3-sgRNA载体连接的连接体系为：

Target annealed：5uL

酶切载体：10-20ng

T4 DNA Ligase(NEB M0202L)：0.5uL

10×T4 DNA Ligase Buffer：1uL

ddH₂O：至10uL

反应体系为16℃，30min。

连接产物转化，菌落PCR鉴定，测序，得到带有OsCDC48-T1、OsDEP1-T1、OsDEP1-T2、OsNRT1.1B-T1、OsEV和OsOD靶序列的pOsU3-esgRNA-2×boxB和pOsU3-sgRNA载体。

(2)原生质体提取：

选取光培养15-20天的水稻幼苗茎杆和叶鞘部分分离原生质体，用锋利的刀片切成大约 0.5mm宽的条块。

将条块转移到0.6M的Mannitol溶液中，避光放置10分钟；用神奇滤布Miracloth过滤掉 Mannitol溶液，将条块转移到含有酶解液的150mL三角瓶中，避光，抽真空30分钟；再置于侧摆摇床上，转速为10rpm，避光酶解5个小时；

酶解结束后，加入等体积的W5溶液，稍有力地水平摇动10-20秒，释放原生质体；用神奇滤布Miracloth把释放出来的原生质体过滤到50mL圆底离心管中；

为了获得更多的原生质体，将条块放回三角瓶中，缓慢沿壁加入50mL W5溶液，再次摇动冲洗条块，释放原生质体，并过滤；

250g水平离心3分钟(升速3，降速3)，用5mL移液器小心地吸弃上清；

加入10mL W5重悬，轻缓悬起所有原生质体细胞，重复离心，并弃上清；

加入适量的MMG溶液轻缓重悬，使原生质体浓度为2×10⁶/mL；

(3)将2A-TadA-TadA7.10、实施例1构建的2A-TadA8e和2A-TadA9分别与步骤(1)构建的和OsCDC48-T1、OsDEP1-T1、OsDEP1-T2、OsNRT1.1B-T1、OsEV、OsOD对应的 pOsU3-esgRNA-2×boxB载体按10ug+10ug的比例加入到2ml EP管底。

将TadA-TadA7.10-fusion、TadA8e-fusion和Cas9载体分别与步骤(1)构建的和OsCDC48-T1、 OsDEP1-T1、OsDEP1-T2、OsNRT1.1B-T1、OsEV、OsOD对应的pOsU3-sgRNA载体按10ug+10ug 的比例加入到2ml EP管底。因为本发明采用配体招募的形式来招募脱氨酶，而TadA-TadA7.10-fusion、TadA8e-fusio均为蛋白融合形式，因此采用TadA-TadA7.10-fusion、 TadA8e-fusion做为对照；因为原生质体试验不同批次试验可能会有差异，因此Cas9用来衡量每次的试验水平，通过检测Cas9的效率来衡量每次试验的整体效率水平。

同时增加20ug GFP载体的荧光观察组，以及任何载体都不加的对照组(untreated)。

Cas9载体和GFP载体构建方法为：

分别人工合成Cas9(核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.67所示)和GFP(核苷酸SEQ ID NO.68所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.69所示)，将合成的Cas9 和GFP分别连接至pJIT163载体骨架上，得到Cas9载体和GFP载体。

PJIT163载体骨架和pOsU3-sgRNA来源于中科院遗传与发育所高彩霞老师赠送，PJIT163 载体骨架在之前文献中有记载(Targeted genome modification of cropplants using a CRISPR-Cas system；Nature Biotechnology；2013)

上述各组样品离心机瞬离；加入200μL原生质体轻弹混匀再加入220μL现配现用的PEG 溶液，轻缓颠倒混匀，室温避光放置20分钟，诱导转化；

缓慢加入880μL W5溶液，轻缓颠倒混匀250g水平离心3分钟(升速3降速3)，用1mL移液器小心地吸弃上清；

加入1mL WI溶液重悬所有细胞，将2mL离心管平放，置于30℃暗培养过夜，观察GFP对照组荧光，评估此次转化效率；用于评估基因组编辑效率的实验组，在培养48～60小时后，提取原生质体基因组DNA。

试剂盒提取水稻原生质体DNA，设计引物扩增目标序列，为保证回收浓度，采用两轮PCR，一轮PCR产物长度为500-700bp，二轮PCR长度为150-200bp，目标序列应位于PCR产物的中间位置，同一目标序列的不同载体通过在二轮PCR产物两端添加不同的Barcode序列来区分。

每个组合的二轮PCR产物各取10uL混匀，胶回收后送至华大基因进行二代测序。

约3周后拿到原始数据，拆分整理数据得到在同一位点上不同ABEs的编辑效率(图2)以及不同ABEs的整体编辑效率(图3)。结果显示：在六个靶位点上进行效率测试，效率分析显示TadA8e和TadA9效率明显高于TadA-TadA7.10，编辑窗口也明显拓宽(图2)。比较分析发现，TadA-TadA7.10的平均编辑效率为0.6％，编辑窗口为A4～A8，而TadA8e编辑效率提升约23倍(13.4％)，TadA9提升32倍(19.1％)；编辑窗口也有所拓宽，TadA8e为A2～A10，TadA9为A2～A12(图2、图3)。

实施例4筛选胞嘧啶脱氨酶

(1)将实施例2中与OsCDC48-T2、OsCDC48-T3、OsDEP1-T2、OsPDS-T1、OsEV、OsOD 对应的sgRNA引物对进行退火，退火程序为：98℃，5min；95℃，1,min；90℃，1min；80℃， 1min；70℃，1min；60℃，1min；50℃，1min；40℃，1min；30℃，1min；20℃，1min；10℃， 1min；4℃保存；将退火产物分别连接至经过BsaI酶切灭活后的pOsU3-esgRNA-2×MS2 (pOsU3-esgRNA-2×MS2核苷酸序列如SEQ ID NO.118所示)和pOsU3-sgRNA载体 (pOsU3-sgRNA载体核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示)上，

带有靶位点的pOsU3-sgRNA载体和pOsU3-esgRNA-2×MS2载体的构建方法为，将OsCDC48-T2、OsCDC48-T3、OsDEP1-T2、OsPDS-T1、OsEV、OsOD对应的sgRNA引物对退火后得到的退火产物连接至经过BsaI酶切灭活后的pOsU3-sgRNA载体和 pOsU3-esgRNA-2×MS2载体，获得OsCDC48-T2、OsCDC48-T3、OsDEP1-T2、OsPDS-T1、 OsEV、OsOD相应的pOsU3-sgRNA载体和pOsU3-esgRNA-2×MS2载体。

pOsU3-esgRNA-2×MS载体构建方法为：

首先对pOsU3-sgRNA载体进行BasI和HindIII双酶切，切掉SEQ ID NO.56所示sgRNA scaffold-SUP4 terminator，回收剩下的载体片段，用于后续试验；

合成esgRNA-2×MS2-SUP4terminator片段，将合成的esgRNA-2×MS2-SUP4terminator片段与经BasI和HindIII双酶切后的片段进行重组反应，获得pOsU3-esgRNA-2×MS载体；

退火产物与BsaI酶切灭活后的pOsU3-esgRNA-2×MS2和pOsU3-sgRNA载体连接的连接体系为：

Target annealed：5uL

酶切载体：10-20ng

T4 DNA Ligase(NEB M0202L)：0.5uL

10×T4 DNA Ligase Buffer：1uL

ddH₂O：至10uL

反应体系为16℃，30min。

连接产物转化，菌落PCR鉴定，测序，获得带有OsCDC48-T2、OsCDC48-T3、OsDEP1-T2、 OsPDS-T1、OsEV、OsOD靶序列的pOsU3-esgRNA-2×MS2和pOsU3-sgRNA载体。

(2)将2A-APOBEC1、实施例1中构建的2A-APOBEC3Bctd、2A-CDA1、2A-AID和 2A-evoFERNY分别与步骤(1)构建的和OsCDC48-T2、OsCDC48-T3、OsDEP1-T2、OsPDS-T1、 OsEV、OsOD对应的pOsU3-esgRNA-2×MS2载体按10ug+10ug的比例加入到2ml EP管底，

将APOBEC1-fusion和Cas9载体分别与步骤(1)构建的和OsCDC48-T2、OsCDC48-T3、OsDEP1-T2、OsPDS-T1、OsEV、OsOD对应的pOsU3-sgRNA载体按10ug+10ug的比例加入到2mlEP管底。因为本发明采用配体招募的形式来招募脱氨酶，而后续pH-PBE为蛋白融合形式，为了凸显发明的优势，且更充分展示发明特性，所以用pH-PBE做了对照；因为原生质体试验不太稳定，不同批次试验可能会有差异，而Cas9用来衡量每次的试验水平，通过检测 Cas9的效率来衡量每次试验的整体效率水平。

APOBEC1-fusion载体来源于中科院遗传与发育所高彩霞老师赠送，核苷酸序列如SEQ ID NO.115所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.116所示。

同时增加20ugGFP载体的荧光观察组，和不加任何载体的对照组(untreated)。

Cas9和GFP载体构建方法为：

分别人工合成Cas9(核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.67所示)和GFP(核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.69所示)，将合成的Cas9和GFP分别连接至pJIT163载体骨架上，得到Cas9载体和GFP载体。

pJIT163载体骨架和pOsU3-sgRNA来源于中科院遗传与发育所高彩霞老师赠送。

提取原生质体，同时转化所有组合；过夜，观察GFP对照组荧光，评估此次转化效率；用于评估基因组编辑效率的实验组，在培养48～60小时后，提取原生质体基因组DNA。

试剂盒提取原生质体DNA，设计引物扩增目标序列，为保证回收浓度，采用两轮PCR。

每个组合的二轮PCR产物各取10uL混匀，胶回收后送至华大基因进行二代测序。

约3周后拿到原始数据，拆分整理数据得到在同一位点上不同CBEs的编辑效率(图4)以及不同CBEs的整体编辑效率(图5)。结果显示：esgRNA3′端添加2×MS2配体，同时将对应的 MCP配体招募蛋白分别融合APOBEC1、APOBEC3Bctd、CDA1、AID、evoFERNY五种胞嘧啶脱氨酶，同时增加融合蛋白形式的APOBEC1载体为对照，靶位点效率测试发现招募形式下CDA1和AID两种脱氨酶效率明显高于APOBEC1，而APOBEC3Bctd和evoFERNY效率较低；同时，相比于融合蛋白，配体招募形势下APOBEC1的效率更高(图4)。比较分析发现，招募形式下APOBEC1的平均编辑效率约为6.4％，编辑窗口为C3～C14；而相比于APOBEC1，AID 效率提升约1.7倍(10.7％)，编辑窗口为C-1～C10，；CDA1效率提升约2.5倍(16.3％)，编辑窗口为C-2～C11；值得注意的是，之前在文章中报道的效率最高的胞嘧啶脱氨酶 evoFERNY，我们采用招募形式构建的CBE载体效率极低，在所测试的几个靶位点上也几乎没有效率(图4、图5)。

实施例5筛选配体连接方式

(1)对实施例1构建的2A-CDA1载体进行HindIII、SmaI和PstI三酶切(37℃，2h)，回收大片段产物，用于试验后续步骤；

设计引物对实施例1构建的2A-TadA9进行PCR扩增，获得 T2A-TadA9-Linker-N22p-bpNLS片段；

所述引物对为：

2A-TadA9-F：gcaggcgaagaagaagaagGAGGGCAGAGGAAGTCTTCT(SEQ ID NO.78)

2A-TadA9-R：gatttcagcgtaccgaattcccCACC(SEQ ID NO.79)

设计引物对实施例1构建的2A-CDA1进行PCR扩增，获得T2A-MCP-XTEN Linker-SV40 NLS-CDA1-32aaLinker-SGGS Linker-UGI-SGGS Linker-nucleoplasmin NLS片段；

所述引物对为：

2A-CDA1-F：gaagaagcggaaggtgCTTAAGGAGGGCAGAGGAAGTCTTC(SEQ ID NO.80)

2A-CDA1-R：AGAAGACTTCCTCTGCCCTCcttcttcttcttcgcctgc(SEQ ID NO.81)

设计引物对pH-PBE进行PCR扩增，获得Nucleoplasmin NLS-nCas9-SGGS Linker-SV40 NLS片段；

所述引物对为：

pH-PBE-F1：agcggcgacgaagaaggcggggcaggcgaagaagaagaaggacaagaagtactcgatc(SEQ ID NO.82)

pH-PBE-F2：gttgtttggtgttacttctgcaaagcttATGaagcggccagcggcgacgaagaaggcg(SEQ ID NO.83)

pH-PBE-R：TTAAGcaccttccgcttcttctttggGCTCCCCCCCGAgtcgcccccgagctgagacag(SEQ ID NO.84)

pH-PBE载体来源于中科院遗传与发育所高彩霞老师赠送，核苷酸序列如SEQ IDNO.61 所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.62所示。

(2)将T2A-TadA9-Linker-N22p-bpNLS、T2A-MCP-XTEN Linker-SV40 NLS-CDA1-32aaLinker-SGGS Linker-UGI-SGGS Linker-nucleoplasmin和Nucleoplasmin NLS-nCas9-SGGS Linker-SV40 NLS片段与经HindIII、SmaI和PstI三酶切酶切后的2A-CDA1 载体片段进行重组反应，连接产物转化大肠杆菌，设计引物菌落PCR验证后挑取单克隆测序，获得正确的多重正交碱基编辑载体，即碱基编辑融合蛋白(Multiplexed orthogonal baseeditor, MoBE)。

所述碱基编辑融合蛋白MoBE的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述碱基编辑融合蛋白MoBE依次设置核定位信号Nucleoplasmin NLS-Cas9蛋白nCas9(D10A)-连接子SGGSLinker-核定位信号SV40NLS-自剪切肽T2A-配体蛋白MCP-连接子XTEN Linker-核定位信号SV40 NLS-胞嘧啶脱氨酶CDA1-连接子32aa Linker-连接子SGGS Linker-尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂UGI-连接子SGGS Linker- 核定位信号Nucleoplasmin NLS-自剪切肽T2A-腺嘌呤脱氨酶TadA9-连接子32aaLinker-N22p- 核定位信号bpNLS

(3)将实施例2中与OsAAT-T1、OsCDC48-T1、OsCDC48-T2和OsEV对应的sgRNA引物对进行退火，将退火产物分别连接至经过BsaI酶切灭活后的pOsU3-esgRNA-boxB-MS2(pOsU3-esgRNA-boxB-MS2核苷酸序列如SEQ ID NO.119所示)、pOsU3-esgRNA-MS2-boxB(pOsU3-esgRNA-MS2-boxB核苷酸序列如SEQ ID NO.120所示)和pOsU3-sgRNA载体 (pOsU3-sgRNA载体核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示)上获得带有OsAAT-T1、OsCDC48-T1、 OsCDC48-T2和OsEV的pOsU3-esgRNA-boxB-MS2、pOsU3-esgRNA-MS2-boxB和 pOsU3-sgRNA载体。

带有靶位点的pOsU3-sgRNA载体、pOsU3-esgRNA-boxB-MS2载体和 pOsU3-esgRNA-MS2-boxB载体的构建方法为，将OsAAT-T1、OsCDC48-T1、OsCDC48-T2和 OsEV对应的sgRNA引物对退火后得到的退火产物连接至经过BsaI酶切灭活后的 pOsU3-sgRNA载体、pOsU3-esgRNA-boxB-MS2载体和pOsU3-esgRNA-MS2-boxB载体，获得分别带有OsAAT-T1、OsCDC48-T1、OsCDC48-T2和OsEV的pOsU3-sgRNA载体、 pOsU3-esgRNA-boxB-MS2载体和pOsU3-esgRNA-MS2-boxB载体。

pOsU3-esgRNA-boxB-MS2：首先对pOsU3-sgRNA载体进行BasI和HindIII双酶切，切掉 sgRNA scaffold-SUP4 terminator，回收剩下的载体片段，用于后续试验；将合成的esgRNA-boxB-MS2-SUP4terminator片段与经BasI和HindIII双酶切后的片段进行重组反应，获得pOsU3-esgRNA-boxB-MS2载体；

pOsU3-esgRNA-MS2-boxB：首先对pOsU3-sgRNA载体进行BasI和HindIII双酶切，切掉 sgRNA scaffold-SUP4 terminator，回收剩下的载体片段，用于后续试验；将合成的esgRNA-MS2-boxB-SUP4terminator片段与经BasI和HindIII双酶切后的片段进行重组反应，获得pOsU3-esgRNA-MS2-boxB载体；

(4)将MoBE分别与OsAAT-T1、OsCDC48-T1、OsCDC48-T2和OsEV对应的 pOsU3-esgRNA-boxB-MS2和pOsU3-esgRNA-MS2-boxB载体按10ug+10ug的比例加入到2ml EP管底，

作为对比，将STEME-1和Cas9载体分别与OsAAT-T1、OsCDC48-T1、OsCDC48-T2和OsEV对应的pOsU3-sgRNA载体按10ug+10ug的比例加入到2ml EP管底，

同时增加20ug GFP载体的荧光观察组，和任何载体都不加的对照组(untreated)。

STEME-1载体已在之前文章中记载(Targeted,random mutagenesis of plantgenes

with dual cytosine and adenine base editors；Nature Biotechnology；2020),

STEME-1载体包括：胞嘧啶脱氨酶APOBEC3A-连接子48aaLinker-腺嘌呤脱氨酶TadA- 连接子32aaLinker-腺嘌呤脱氨酶TadA7.10-连接子32aaLinker-Cas9蛋白nCas9(D10A)-核定位信号nucleoplasminNLS-尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI-核定位信号SV40NLS

Cas9载体和GFP载体构建方法为：

分别人工合成Cas9(核苷酸序列如SEQ ID NO.66所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.67所示)和GFP(核苷酸SEQ ID NO.68所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.69所示)，将合成的Cas9 和GFP分别连接至pJIT163载体骨架上，得到Cas9载体和GFP载体。

pJIT163载体骨架和pOsU3-sgRNA来源于中科院遗传与发育所高彩霞老师赠送。

(5)提取原生质体，同时转化所有组合；过夜，观察GFP对照组荧光，评估此次转化效率；用于评估基因组编辑效率的实验组，在培养48～60小时后，提取原生质体基因组DNA。

试剂盒提取原生质体DNA，设计引物扩增目标序列，为保证回收浓度，采用两轮PCR。

每个组合的二轮PCR产物各取10uL混匀，胶回收后送至华大基因进行二代测序。

约3周后拿到原始数据，拆分整理数据得到在同一位点上两种MoBE载体组合和STEME-1 的编辑效率(图6)以及他们的整体编辑效率比较(图7)；同时利用网站 (https://crispresso.pinellolab.partners.org/submission)具体分析MoBE+boxB-MS2和 STEME-1+sgRNA的编辑类型(图8)。结果显示：筛选出高效脱氨酶后，在esgRNA3′末端同时添加MS2和boxB两种RNA配体同时招募高效的CDA1和TadA9来实现高效的双碱基编辑。同时采用boxB-MS2和MS2-boxB两种不同的配体串联方式并且以之前开发的STEME-1作为对照在4个靶位点测试编辑效率；结果显示TadA9和CDA1的活性相当，并且相比于单独招募CDA1和TadA9，同时招募两者对他们的编辑效率和编辑窗口没有影响；对于C>T编辑， STEME-1的编辑效率虽然低于双配体招募形式，但其编辑窗口更宽(C3～C15)；而STEME-1 对于A>G的编辑展现出了效率低(<1％)且窗口窄(A5～A6)的明显缺点(图6)。综合比较分析显示STEME-1的平均编辑效率(A>G and C>T)约为6.1％，而MoBE+boxB-MS2串联形式平均编辑效率为14.9％，MoBE+MS2-boxB串联形式为9.2％；boxB-MS2串联方式效率更高(图7)。对其突变类型分析比较显示，STEME-1主要产生C>T的编辑，同时产生A>G和C>T的编辑比率很低，平均约6.7％；而MoBE+boxB-MS2则主要产生A>G和C>T的同时编辑，平均约 94.7％(图8)。

实施例6多靶点编辑效率验证

利用不同启动子将三个不同的sgRNA串联，三个sgRNA将MoBE定位到三个目标序列以分别编辑2-12位的目标碱基A、-2-11位的目标碱基C、2-12位的目标碱基A和-2-11位的目标碱基C。

(1)构建OsCDC48-T1+OsDEP1-T2+OsAAT-T1的三靶点表达载体：

(1-1)首先对实施例3构建的含有OsCDC48-T1的pOsU3-esgRNA-2×boxB载体用HindIII 酶切后灭活(37℃，2h；85℃，10min)；设计引物对以核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示T-SO 载体为模板扩增获得SEQ ID NO.20所示OsU6片段，同时设计引物对分别以实施例4构建的含有OsDEP1-T2的pOsU3-esgRNA-2×MS2载体为模板扩增获得 OsDEP1-T2-esgRNA-2×MS-SUP4片段；

pOsU6-F1：CtttttttgttttttatgtctGGTACCGAGCTCGGATC(SEQ ID NO.85)

pOsU6-R1：ATATTGTTCTCTCATGTGCTCACACAAGCGACAGCGCGCG(SEQ ID NO.86)

pOsU3-esgRNA-2×MS2-F1：

CGCGCGCTGTCGCTTGTGTGAGCACATGAGAGAACAATAT(SEQ ID NO.87)

pOsU3-esgRNA-2×MS2-R1：gctatgaccatgattacgccaagcttagacataaaaaac(SEQ IDNO.88)

(1-2)将酶切后的pOsU3-esgRNA-2×boxB(OsCDC48-T1)与SEQ ID NO.20所示OsU6和 OsDEP1-T2-esgRNA-2×MS-SUP4片段进行重组反应，连接产物转化大肠菌，设计引物菌落PCR 验证后挑取单克隆测序，获得OsU3-OsCDC48-T1-esgRNA-2×boxB-SUP4-OsU6-OsDEP1-T2-esgRNA-2×MS-SUP4的中间载体；

(1-3)将中间载体用HindIII酶切后灭活，设计引物以核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示 pTaU6-sgRNA为模板扩增获得SEQ ID NO.21所示的TaU6片段，同时设计引物以含有OsAAT-T1的pOsU3-esgRNA-boxB-MS2载体(SEQ ID NO.119)为模板扩增获得 OsAAT-T1-esgRNA-boxB-MS2-SUP4片段；

pTaU6-sgRNA-F1：Ctttttttgttttttatgtctgaccaagcccgttattc(SEQ ID NO.89)

pTaU6-sgRNA-R1：TCACGGGGCTGGGATCCTTGcaagtctgatgcagcaagcg(SEQ ID NO.90)

pOsU3-esgRNA-boxB-MS2-F1：cgcttgctgcatcagacttgCAAGGATCCCAGCCCCGTGA(SEQID NO.91)

pOsU3-esgRNA-boxB-MS2-R1：ctatgaccatgattacgccaagcttagacataaaaaac(SEQID NO.92)

(1-4)将步骤(1-2)酶切后得到的中间载体与步骤(1-3)得到的TaU6片段和OsAAT-T1-esgRNA-boxB-MS2-SUP4片段进行重组反应，连接产物转化大肠菌，设计引物菌P引物验证后挑取单克隆测序，得到依次含有以下元件的OsCDC48-T1+OsDEP1-T2+OsAAT-T1三靶点载体：

OsU3-OsCDC48-T1-esgRNA-2×boxB-SUP4-OsU6-OsDEP1-T2-esgRNA-2×MS-SUP4-TaU6-OsA AT-T1-esgRNA-boxB-MS2-SUP4。

T-SO载体为南京农业大学水稻研究所万建民院士团队保存，pTaU6-sgRNA来源于中科院遗传与发育所高彩霞老师赠送，序列信息如上所示；

(2)构建OsNRT1.1B-T1+OsPDS-T1+OsEV的三靶点表达载体：

(2-1)首先对实施例3构建的含有OsNRT1.1B-T1的pOsU3-esgRNA-2×boxB载体用HindIII酶切后灭活(37℃，2h；85℃，10min)；

设计引物对以T-SO载体为模板扩增获得OsU6片段，同时设计引物对分别以实施例4构建的含有OsPDS-T1的pOsU3-esgRNA-2×MS2载体为模板扩增获得 OsPDS-T1-esgRNA-2×MS-SUP4片段；

pOsU6-F2：CtttttttgttttttatgtctGGTACCGAGCTCGGATC(SEQ ID NO.93)

pOsU6-R2：ACCCATTCCTCTGCAGGAGCCACACAAGCGACAGCGCGCG(SEQ ID NO.94)

pOsU3-esgRNA-2×MS2-F2：

CGCGCGCTGTCGCTTGTGTGGCTCCTGCAGAGGAATGGGT(SEQ ID NO.95)

pOsU3-esgRNA-2×MS2-R2：gctatgaccatgattacgccaagcttagacataaaaaac(SEQ IDNO.96)

(2-2)将酶切后的pOsU3-esgRNA-2×boxB(OsNRT1.1B-T1)与SEQ ID NO.20所示OsU6和OsPDS-T1-esgRNA-2×MS-SUP4片段进行重组反应，连接产物转化大肠菌，设计引物菌落PCR 验证后挑取单克隆测序，获得 OsU3-OsNRT1.1B-T1-esgRNA-2×boxB-SUP4-OsU6-OsPDS-T1-esgRNA-2×MS-SUP4的中间载体；

(2-3)将中间载体用HindIII酶切后灭活，设计引物以核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示 pTaU6-sgRNA为模板扩增获得SEQ ID NO.21所示TaU6片段，同时设计引物以含有OsEV的 pOsU3-esgRNA-boxB-MS2载体为模板扩增获得OsEV-esgRNA-boxB-MS2-SUP4片段；

pTaU6-sgRNA-F2：Ctttttttgttttttatgtctgaccaagcccgttattc(SEQ ID NO.97)

pTaU6-sgRNA-R2：GAGGTACTAGTGTGTGTGTGcaagtctgatgcagcaagcg(SEQ ID NO.98)

pOsU3-esgRNA-boxB-MS2-F2：cgcttgctgcatcagacttgCACACACACACTAGTACCTC(SEQID NO.99)

pOsU3-esgRNA-boxB-MS2-R2：ctatgaccatgattacgccaagcttagacataaaaaac(SEQID NO.100)

(2-4)将步骤(2-2)酶切后得到的中间载体与步骤(2-3)得到的TaU6片段和 OsEV-T1-esgRNA-boxB-MS2-SUP4片段进行重组反应，连接产物转化大肠菌，设计引物菌P 引物验证后挑取单克隆测序，得到依次含有以下元件的OsNRT1.1B-T1+OsPDS-T1+OsEV三靶点载体：

OsU3-OsCDC48-T1-esgRNA-2×boxB-SUP4-OsU6-OsDEP1-T2-esgRNA-2×MS-SUP4-TaU6-OsE V-esgRNA-boxB-MS2-SUP4。

T-SO载体为南京农业大学水稻研究所万建民院士团队保存，pTaU6-sgRNA来源于中科院遗传与发育所高彩霞老师赠送，序列信息如上所示；

(3)将实施例5构建的MoBE与OsCDC48-T1+OsDEP1-T2+OsAAT-T1和 OsNRT1.1B-T1+OsPDS-T1+OsEV三靶点载体按10ug+10ug的比例加入到2ml EP管底，同时增加20ug GFP载体的荧光观察组，和不加任何载体的对照组(untreated)。GFP载体构建方法为：人工合成GFP(核苷酸序列如SEQ ID NO.68所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.69所示)，将合成的GFP连接至pJIT163载体骨架上，得到GFP载体。

(4)提取原生质体，同时转化所有组合；过夜，观察GFP对照组荧光，评估此次转化效率；用于评估基因组编辑效率的实验组，在培养48～60小时后，提取原生质体基因组DNA。

试剂盒提取原生质体DNA，设计引物扩增目标序列，为保证回收浓度，采用两轮PCR。

每个组合的二轮PCR产物各取10uL混匀，胶回收后送至华大基因进行二代测序。

约3周后拿到原始数据，拆分整理数据得到MoBE在多个位点上的多重碱基编辑(图9)。

结果显示MoBE可以在三个靶位点同时实现高效的三种编辑，并且每个靶位点的编辑效率与单靶点编辑相比没有明显变化。

以上结果表明，本发明的碱基编辑系统可以产生高效的碱基编辑，结合多sgRNA策略，可以同时在多个位点产生多种类型的高效编辑。

上述实施例中蛋白表达载体均为pJIT163载体骨架，载体骨架来源于中科院遗传与发育所高彩霞老师赠送。

实施例7编辑水稻内源基因

为了验证MoBE能够在水稻中产生有效编辑，我们选择了抗除草剂相关基因OsACC，制备下面两个靶序列(sgRNA序列)和相应的sgRNA引物对(SgF/SgR)：

1.OsACC-T1：

靶序列：

(SEQ ID NO.101)

SgF：ggcgCAGCTCGATTGCTGGTTGGT(SEQ ID NO.102)

SgR：aaacACCAACCAGCAATCGAGCTG(SEQ ID NO.103)

2.OsACC-T2：

靶序列：

(SEQ ID NO.104)

SgF：ggcgCATAGCACTCAATGCGGTCT(SEQ ID NO.105)

SgR：aaacAGACCGCATTGAGTGCTATG(SEQ ID NO.106)

将OsACC-T1和OsACC-T2对应的sgRNA引物对分别进行退火：98℃，5min；95℃，1,min；90℃，1min；80℃，1min；70℃，1min；60℃，1min；50℃，1min；40℃，1min；30℃，1min； 20℃，1min；10℃，1min；4℃保存，将OsACC-T1对应的退火产物连接至经BsaI酶切灭活(37℃，2h；80℃，20min)后的pOsU3-esgRNA-2×MS2载体上，将OsACC-T2对应的退火产物连接至经BsaI酶切灭活(37℃，2h；80℃，20min)后的pOsU3-esgRNA-2×boxB载体上；

连接产物转化，菌落PCR挑取正确的单菌落送至生工测序，得到带有OsACC-T1的pOsU3-esgRNA-2×MS2和带有OsACC-T2的pOsU3-esgRNA-2×boxB；

对pHUE411载体进行StuI、MluI和SacI三酶切(37℃，2h)，回收载体大片段用于后续试验；

pHUE411载体来源于中国年农业大学陈其军老师，在文献中已有记载(A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants；BMC Plant Biol；2014)

设计引物对以MoBE载体为模板进行PCR，分别获得Nucleoplasmin

NLS-nCas9(D10A)-SGGS Linker-SV40 NLS和T2A-MCP-XTEN Linker-SV40 NLS-CDA1-32aa Linker-SGGS Linker-UGI-SGGS Linker-Nucleoplasmin NLS-T2A-TadA9-32aaLinker-N22p-bpNLS(即MoBE蛋白部分)片段；

引物为：

pH-MoBE-F1：gttacttctgcagccctaggcctATGaagcggccagcggcg(SEQ ID NO.107)

pH-MoBE-R1：CCTCTGCCCTCCTTAAGcaccttccgcttcttctttggGCT(SEQ ID NO.108)

pH-MoBE-F2：GGGAGCccaaagaagaagcggaaggtgCTTAAG(SEQ ID NO.109)

pH-MoBE-R2：acgaacgaaagctctgagctctcagcgtaccgaattcccCACC(SEQ ID NO.110)

将两个PCR片段与经StuI、MluI和SacI三酶切的pHUE411载体大片段进行重组反应；

连接产物转化大肠杆菌，菌落PCR鉴定挑取正确单菌落测序，得到pH-MoBE载体；

对pH-MoBE进行HindIII单酶切(37℃，2h)，回收载体大片段用于后续试验；

设计引物分别以带有OsACC-T1的pOsU3-esgRNA-2×MS2和带有OsACC-T2的pOsU3-esgRNA-2×boxB；为模板进行PCR扩增得到OsU3-OsACC-T1-esgRNA-2×MS2-SUP4 和OsU3-OsACC-T2-esgRNA-2×boxB-SUP4片段

引物为：

OsACC-T1-F：gtaaaacgacggccagtgccagtaattcatccaggtcacc(SEQ ID NO.111)

OsACC-T1-R：gtgacctggatgaattactagacataaaaaacaaaaaaaG(SEQ ID NO.112)

OsACC-T2-F：Ctttttttgttttttatgtctagtaattcatccaggtcac(SEQ ID NO.113)

OsACC-T2-R：ggtcacgctgcactgcaggcatgcagacataaaaaacaaaaaaaG(SEQ IDNO.114)

将两个片段与经HindIII单酶切的载体大片段进行重组反应，连接产物转化大肠杆菌，挑取正确单菌落测序，得到带有OsACC-T1和OsACC-T2的pH-MoBE载体。

将带有双靶点的pH-MoBE载体转化农杆菌感受态，利用农杆菌侵染水稻愈伤组织，在得到的82颗转基因苗中，有32颗植株发生了编辑，编辑效率达39％；在编辑植株中，我们发现了在OsACC-T1位点产生了C>T的碱基编辑，在OsACC-T2位点产生了A>G的编辑(图10)，在OsACC-T1位点C>T突变导致E2327和L2328两个位置的氨基酸发生了纯合的同义突变，而OsACC-T2位点A>G突变产生了C2186R的杂合突变，并且C2186R突变会使植株对甲禾灵除草剂产生抗性。

结果表明，MoBE可以在水稻中产生多重编辑。

Claims (16)

1.一种碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑系统包括：

1)碱基编辑融合蛋白和/或含有编码所述碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体，所述碱基编辑融合蛋白包括融合了胞嘧啶脱氨酶的RNA配体招募蛋白，或融合了腺嘌呤脱氨酶的RNA配体招募蛋白，优选的，所述RNA配体为MCP和N22p；和/或

2)至少一种向导RNA和/或至少一种含有编码所述至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；

其中所述至少一种向导RNA针对所述靶核酸区域内的至少一个靶序列。

2.根据权利要求1所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑融合蛋白选自包括以下元件的单元1～4中的一种或多种的组合：

单元1：腺苷脱氨酶-nCas9或其变体；

单元2：nCas9或其变体-T2A自剪切肽-腺苷脱氨酶-N22p配体招募蛋白；

单元3：胞嘧啶脱氨酶-nCas9或其变体-尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)；

单元4：nCas9或其变体-T2A自剪切肽-MCP配体招募蛋白-胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)；

所述碱基编辑融合蛋白N端设置启动子并在C端设置终止子；

当述碱基编辑融合蛋白选自单元1～4中多种的组合时，所述碱基编辑融合蛋白中nCas9或其变体的数量是一个或多个；

优选的，所述nCas9变体为nCas9(D10A)。

3.根据权利要求2所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑融合蛋白中的腺苷脱氨酶选自TadA-TadA7.10二聚体、TadA8e、TadA9；

优选的，所述腺苷脱氨酶选自TadA8e、TadA9；

进一步优选的，所述腺苷脱氨酶选自TadA9。

4.根据权利要求2所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑融合蛋白中的胞嘧啶脱氨酶选自APOBEC1、APOBEC3Bctd、CDA1、AID、evoFERNY；

优选的，所述胞嘧啶脱氨酶选自APOBEC1、CDA1、AID；

进一步优选的，所述胞嘧啶脱氨酶选自CDA1、AID；

更优选的，所述胞嘧啶脱氨酶选自CDA1。

5.根据权利要求2所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑融合蛋白为单元4中nCas9或其变体-T2A自剪切肽-MCP配体招募蛋白-胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(UGI)与单元2中T2A自剪切肽-腺苷脱氨酶-N22p配体招募蛋白串联，并在N端设置启动子，C端设置终止子。

6.根据权利要求2所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑融合蛋白序列中还包括Nucleoplasmin NLS、SV40 NLS、bpNLS、SGGS Linker、XTEN Linker、32aa Linker中的一个或多个；

优选的，所述碱基编辑融合蛋白为Nucleoplasmin NLS-nCas9(D10A)-SGGS Linker-SV40 NLS-T2A-MCP-XTEN Linker-SV40 NLS-CDA1-32aa Linker-SGGS Linker-UGI-SGGSLinker-Nucleoplasmin NLS-T2A-TadA9-32aa Linker-N22p-bpNLS。

7.根据权利要求1所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

8.根据权利要求1所述的碱基编辑系统，其特征在于，编码所述碱基编辑融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

9.根据权利要求1所述的碱基编辑系统，其特征在于，向导RNA的个数为一个或多个。

10.根据权利要求1所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述向导RNA选自经配体修饰的esgRNA中的一种或多种的组合。

11.根据权利要求1所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述向导RNA选自：

1)esgRNA的3’端串联一个或多个MS2配体，或，

2)esgRNA的3’端串联一个或多个boxB配体，或，

3)esgRNA的3’端以任意顺序串联一个或多个MS2配体和一个或多个boxB配体。

优选的，所述向导RNA为esgRNA的3’端顺序串联boxB配体-MS2配体。

12.根据权利要求1所述的碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑系统还包括用于驱动向导RNA的启动子。

13.根据权利要求1所述的碱基编辑系统，其特征在于，向导RNA所针对的靶核酸区域内在靶序列的3’端包含PAM序列，使靶序列2-12位存在碱基A或靶序列-2-11存在碱基C；所述PAM序列为NGG或CCN；

优选的，所述PAM序列为NGG时，位于靶序列下游，所述PAM序列为CCN时，位于靶序列上游；

进一步优选的，所述PAM序列为NGG时，位于靶序列下游20bp处，所述PAM序列为CCN时，位于靶序列上游20bp处。

14.权利要求1至13任一项权利要求所述的碱基编辑系统的应用，其特征在于，所述应用包括将权利要求1-13中任一项的碱基编辑系统导入待编辑基因组，对所述待编辑基因组靶核酸区域内一个位点或多个位点的核苷酸进行取代。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述取代为A>G和/或C>T的编辑。

16.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述待编辑基因组来源于植物；

优选的，所述植物为单子叶植物和双子叶植物；

进一步优选的，所述植物为水稻。

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