CN111031790A - 产生基因修改的动物的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了产生多重基因修改的动物的方法,例如,猪内源性逆转录病毒(PERV)失活的猪。本公开还提供了提高多重转基因动物出生率的方法。在一些实施方式中,本公开涉及猪细胞的产生和使用,其中猪内源性逆转录病毒(PERV)部分已灭活。在一些实施方式中,克隆无PERV或PERV减少的猪细胞以产生猪胚胎。在一些实施方式中,无PERV或PERV减少的胚胎可生长为成年猪,从中可提取器官和/或组织并用于异种移植到例如人类的非猪动物中。
Description
优先权声明
本申请要求于2017年4月20日提交的美国临时申请号62/487,898的优先权,于2017年6月30日提交的美国临时申请号62/527,702的优先权,以及于2017年8月10日提交的美国临时申请号62/543,610的优先权,其公开内容在此通过引用整体并入本文。
公开背景
用于移植的人体器官和组织的短缺代表了严重未满足的医疗需求。仅在美国和欧洲,就有约200,000名患者等待器官移植,但是这些患者中只有一小部分曾经接受过供体器官(美国卫生及公共服务部,器官获取与移植网络-2017;欧盟委员会,器官捐献和移植记者研讨会,最新事实与数据,2016)。已设想了几种缓解供体器官严重短缺的策略,包括从人类诱导性多能干细胞(hiPSCs)体外发育器官,重新填充(repopulating)脱细胞器官支架,构建3D打印器官,生产具有人体器官的嵌合动物,以及进行跨物种移植(即异种移植)。特别地,异种移植是针对器官捐献和移植短缺的有吸引力的潜在解决方式。猪器官被认为是异种移植的有利资源,因为它们的大小和功能与人体器官相似。此外,可以在指定的无病原体条件下大量繁殖猪,并将其用于商业生产(异种移植(Xenotransplantation)2.0,2016,Nat.Biotechnol.34:1)。
异种移植具有为慢性器官衰竭患者提供几乎无限制的移植器官供应的潜力。然而,免疫不相容性以及猪内源性逆转录病毒(PERV)部分(element)传递的潜在风险已阻碍了猪器官的临床应用。PERV是猪基因组中的前病毒,最初在外源性逆转录病毒感染期间整合至生殖系染色体中(Gifford,R.&Tristem,M.,2003,《病毒基因》(Virus Genes)26,291–315)。PERV有三种主要亚型:PERV A,PERV B,和PERV C。亚型A和B普遍存在并且可以传递给猪和人,而C仅存在于一些猪品系中并且可以在猪之间传递(Patience等,2001,J.Virol,75:2771–2775)。根据定义,PERV不为其他物种所共有并且通常是近期逆转录病毒感染的结果(Gifford和Tristem)。
随着时间推移,大多数PERV由于累积的突变而变得失活,但是已经证明某些完整的PERV可在体外感染人细胞(Patience等,1997,Nat.Med.,3:282–286;Yang等,2015,《科学》(Science),350:1101–1104)。这些完整的PERV在猪到人的异种移植中存在人畜共患病的潜在风险(Denner等,2016,《异种移植》(Xenotransplantation),23:53–59;Denner J和Tonjes R,2012,Clin Microbiol Rev,25:318–343)。正如对其他逆转录病毒所报道的那样,由于PERV整合引起的诱变可能导致肿瘤发生和免疫缺陷(Bendinelli等,1985,《癌症研究进展》(Advances in Cancer Research),45:125–181),因此PERV被认为是临床异种移植中主要的安全问题。以前,有几支团队尝试使用TAL效应物核酸酶(Dunn等,2015,FASEB J,29:LB761)或锌指核酸酶(Semaan等,2015,PLoS One,10)来灭活PERV,但是这些尝试均未成功。
经设计以在其基因组中进行有意修改的基因修改的动物,几十年来一直被用于科学目的,改良牲畜,以及用于重组蛋白的生产等用途。已经发展了许多用于产生基因修改的动物的技术,包括转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN),锌指核酸酶(ZFN),脱氨酶,以及基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)的系统,例如CRISPR-Cas9。近来,这些技术已被用于标靶多个核酸序列以用于体外多重基因组编辑。然而,基因修改的动物的活产成功率和/或出生后的存活取决于多种因素,包括使用的技术,靶向基因组区域和被修改的动物的种类,但该比率要低于非基因修改的动物。
如此,需要发展无PERV的猪作为移植到人的细胞,组织,和/或器官的来源,以及需要提高基因修改的动物,特别是那些被设计为具有多种基因修改的基因修改的动物的出生率和/或存活率的技术。
公开概述
在一些方面,本公开提供了自胚胎发育的猪,其中所述胚胎包含具有至少75%的失活的猪内源性逆转录病毒(PERV)部分的猪细胞。
在一些方面,本公开提供了产生猪内源性逆转录病毒(PERV)失活的猪的方法,包括:获取具有细胞核的核供体细胞,其中所述核供体细胞中至少75%的所述PERV部分是失活的;将所述核供体细胞的所述细胞核转移至受体去核卵母细胞中以产生核转移的卵母细胞;使所述核转移的卵母细胞活化;培养所述核转移的卵母细胞以产生胚泡或胚胎;将所述胚泡或胚胎转移至代孕体中;以及从所述胚泡或胚胎中产生活体PERV失活的猪。
在一些方面,本公开提供了产生猪内源性逆转录病毒(PERV)失活的猪的方法,包括:使用来自核供体细胞的细胞核以产生胚泡或胚胎,其中所述核供体细胞中至少75%的所述PERV部分是失活的;以及将所述胚泡或胚胎转移至代孕体中以产生PERV失活的猪。
在一些方面,本公开提供了提高PERV失活的猪的出生率的方法,包括:使用来自核供体细胞的细胞核以产生胚泡或胚胎,其中所述核供体细胞中至少75%的PERV部分是失活的;以及将所述胚泡或胚胎转移至至少一个代孕体中以产生至少一只PERV失活的猪,其中,与从细胞中超过25%的PERV部分具有活性的细胞产生的胎儿的流产率相比,其流产率降低。
在一些方面,本公开提供了产生基因修改的动物的方法,包括:使用来自核供体细胞的细胞核以产生胚泡或胚胎,其中所述核供体细胞中的多个核酸序列被修改;以及将所述胚泡或胚胎转移至代孕体中以产生所述基因修改的动物。
在一些方面,本公开提供了预防或降低基因修改的胚泡或胚胎的体细胞核转移(SCNT)后妊娠丢失或流产的风险的方法,包括:使用基因修改的核供体细胞的细胞核产生胚泡或胚胎;以及将所述胚泡或胚胎转移至代孕体中以产生至少一个可育后代,其中,与对照的妊娠丢失率或流产率相比,其妊娠丢失率或流产率降低。
还提供了自在此公开和描述的任何实施方式的猪获取的器官或组织。还提供了通过在此公开和描述的任何方法产生的分离的猪细胞。
在一些实施方式中,细胞中约100%的PERV部分均为失活的。在一些实施方式中,细胞中100%的PERV部分均为失活的。
在一些实施方式中,PERV部分包含一种或多种导致PERV部分活性降低或丧失的突变或表观遗传变化。
在一些实施方式中,所述猪细胞的所述PERV部分已经通过以下方法失活,所述方法包括:向所述细胞施用针对参与PERV复制和/或装配的基因的基因组修改试剂,其中所述试剂破坏所述基因的转录和/或翻译。在一些实施方式中,所述试剂是核酸酶或切口酶或编码所述核酸酶或切口酶的核酸,例如所述核酸酶或切口酶是CRISPR相关的核酸酶或切口酶。在一些实施方式中,所述试剂还包含:a)CRISPR向导RNA或tracrRNA或;b)编码所述CRISPR向导RNA的核酸。
在一些实施方式中,所述CRISPR向导RNA包含SEQ ID NO:1–3或26–181中任一核苷酸序列,其任何品系特异性遗传变体,或其任何组合。在一些实施方式中,所述CRISPR向导RNA包含SEQ ID NO:1–3或26–116中任一核苷酸序列,其任何品系特异性遗传变体,或其任何组合。在一些实施方式中,所述CRISPR向导RNA包含SEQ ID NO:35,36,48,99,101,102,106,108,111,113中任一核苷酸序列,或其任何组合。在一些实施方式中,所述试剂是编码CRISPR-Cas9核酸酶或切口酶的核酸,其中所述细胞经设计以稳定地表达所述试剂,其中所述试剂还包含至少一种向导RNA,并且其中至少一个向导RNA序列包含SEQ ID NO:1–3或26–116中任一核苷酸序列。
在一些实施方式中,所述猪在妊娠后至少1个月,至少6个月,至少1年,至少5年,至少10年保持相同或基本相同的PERV失活水平。
在一些实施方式中,所述核供体细胞是体细胞,胎儿细胞,生殖细胞,干细胞,或诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方式中,所述核供体细胞是胎儿细胞。在一些实施方式中,所述核供体细胞分离自嵌合PERV失活的胎儿。在一些实施方式中,所述嵌合PERV失活的胎儿为约10天,约20天,约30天,或约3个月妊娠。
在一些实施方式中,使用基因组修改试剂产生所述嵌合PERV失活的胎儿,例如,锌指核酸酶或切口酶,TAL效应物核酸酶或切口酶,脱氨酶,和CRISPR相关的核酸酶或切口酶。
在一些实施方式中,所述核供体细胞在体外经历少于30次,少于20次,少于10次,少于5次,或少于2次的群体(population)倍增。在一些实施方式中,所述核供体细胞分离自猪。在一些实施方式中,所述核供体细胞分离自年龄小于10周,小于8周,小于6周,小于5周,小于4周,小于3周,小于2周,或小于1周的猪。在一些实施方式中,所述核供体细胞中至少约80%,至少约90%,至少约95%,至少约99%的PERV部分是失活的。
在一些实施方式中,所述PERV失活的猪在妊娠后至少1个月,至少6个月,至少1年,至少5年,至少10年保持相同或相似的PERV失活水平。
在一些实施方式中,所述方法还包括将至少一个野生型胚泡或胚胎转移至所述代孕体中。
在一些实施方式中,所述核供体细胞中至少约80%,至少约90%,至少约95%,至少约99%的PERV部分是失活的。在一些实施方式中,所述核供体细胞中100%的PERV部分是失活的。
在一些实施方式中,所述PERV失活的猪在妊娠后至少1个月,至少6个月,至少1年,至少5年,至少10年保持相同或相似的PERV失活水平。在一些实施方式中,所述PERV失活的猪是无PERV的猪。在一些实施方式中,所述PERV失活的猪具有至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,或至少99%的失活的PERV部分。
附图简要说明
图1A显示了被感染的人细胞中的PERV拷贝数随时间增加。将人HEK293T-GFP细胞与等量的猪PK15细胞共培养一周。基于GFP信号,通过流式细胞术分离HEK293T-GFP单个细胞(single cells),然后使其发育为克隆(clones)。分离HEK293T-GFP克隆并培养70,87和132天。使用PERV pol引物通过ddPCR分析PERV拷贝数。以与PK15细胞无任何接触的HEK293T-GFP作为对照。
图1B显示了被高度感染的i-HEK293T-GFP克隆中的PERV插入位点。通过反向PCR检测到的22个PERV插入位点中,有15个的位置被确定(mapped)在基因内区域(intragenicregion)。测试了部分基因内命中(intragenic hits)。12个中有7个已通过连接(junction)PCR验证并显示。30bp的人类基因组序列以实线下划线显示,而PERV LTR以双下划线显示。将基因组序列与UCSC基因组浏览器进行比对(align),并列出相应的基因。
图1C显示了用于检查人到人(human-to-human)PERV传递的实验设计的简化示意图。将被PERV感染的用GFP标记的人HEK293T细胞(i-HEK293T-GFP)与未标记的WT HEK293T(HEK293T)共培养14天。从共培养物中分离出HEK293T克隆,提取基因组DNA,以确定HEK293T克隆是否被来自i-HEK293T-GFP细胞的PERV感染。
图1D显示了人到人PERV传递的检测。HEK293T的单个克隆发育自通过流式细胞术从i-HEK293T-GFP与HEK293T的共培养物中分离的单个细胞。PCR凝胶成像显示在4个随机测试的HEK293T克隆中,有3个包含PERV序列(PERV pol,env,和gag),但没有GFP或猪基因组DNA序列(通过猪特异性GGTA测试)。样品顺序为:1)HEK293T克隆1;2)HEK293T克隆2;3)HEK293T克隆3;4)HEK293T克隆4;5)HEK293T-GFP对照;6)i-HEK293T-GFP;7)PK15 WT;和8)阴性对照。
图1E示出了不同的i-HEK293T-GFP克隆具有不同的传染性潜力(infectiouspotential)。i-HEK293T-GFP和WT HEK293T的共培养物中被感染的HEK293T克隆的百分比从20%到97%不等。该百分比对应于培养物中i-HEK293T-GFP克隆的PERV拷贝数。4个亲本i-HEK293T-GFP克隆的PERV拷贝数分别为:15,28,27和28。
图2A显示了PERV插入位点的染色体位置确定。使用杂交捕获和长读(long reads)Pacbio测序在WT FFF3细胞系中检测染色体上的PERV整合位点。灰色条代表染色体支架。箭头(朝上)代表正(forward)染色体链或正(plus)染色体链中的PERV。箭头(朝下)代表反(reverse)链或负(negative)链中的PERV。
图2B描绘了高度修改的FFF3克隆的存活。在标靶FFF3中的PERV之后,对单个细胞进行分选并立即进行基因分型。观察到PERV靶向频率在单个细胞中的双峰分布(上图)。进行直接基因分型的单个细胞中存在100%的无PERV的FFF3细胞。但是,这种模式在单个细胞扩增后发生了变化(下图)。在单个细胞克隆中,仅获得了效率较低(≤39%,群体中的平均靶向效率为37%)的克隆,并且观察到一些未100%根除PERV的FFF3克隆的持久性(下图)。
图2C显示了用PFTα和bFGF处理可维持高度修改的FFF3克隆的生长。p53抑制剂和生长因子的联合使用可拯救高度编辑的细胞。在基因编辑实验中,用PFTα和bFGF处理FFF3群体;然后将单个细胞分选以进行直接基因分型以及集落(colony)生长后再进行基因分型。单个细胞和扩增的克隆在PERV靶向效率上均显示出相似的双峰分布,并且高度修改的克隆在此条件下存活。
图2D显示了CRISPR-Cas9处理后位于PERV pol基因座(loci)的100%无PERV克隆之一的单体型(haplotype)。从PFTα和bFGF处理的FFF3群体获得了几个100%无PERV的克隆。y轴表示经编辑的PERV基因座。x轴表示插入缺失(indel)在PERV基因座内的相对位置。红色表示PERV pol序列中比对的插入缺失事件。紫色阴影表示不同的PERV单体型。
图2E显示了在100%PERV修改的克隆中,PERV的产生被消除。通过逆转录测定法检测细胞培养上清液中存在的PERV颗粒的逆转录酶(RT)活性。结果表明,在100%无PERV的克隆上清液中未产生PERV,而WT FFF3细胞的上清液显示出显著的RT活性。样品顺序从左至右为:2-log DNA梯带(ladder)(纽英伦生物技术(New England Biolabs));RT+(使用市售逆转录酶(RT));RT-(无RT酶);RT+/FF WT(市售RT酶加WT 3FFF裂解(3FFF培养基中病毒颗粒的裂解);100%FFF3(100%PERV失活的FFF3克隆裂解);WT FF(WT 3FFF裂解);阴性(无裂解或RT酶,无RNA模板)。
图3A显示了从100%无PERV的PFFF3克隆的猪胚泡。用SOX2(内部细胞团),DAPI(细胞核)和鬼笔环肽(phalloidin)(细胞边界)对第7天的无PERV的猪胚泡进行染色。使用激光扫描共聚焦显微镜对染色的胚泡成像。
图3B显示了从100%无PERV的PFFF3克隆的胎儿的PERV靶向效率。y轴表示经编辑的PERV基因座。x轴表示插入缺失在PERV基因座内的相对位置。红色表示PERV pol序列中比对的插入缺失事件。紫色阴影表示不同的PERV单体型。
图4A显示了iHEK293T-GFP的所选克隆中的PERV拷贝数。将WT HEK293T(无GFP)细胞与等量的被PERV感染的HEK293T-GFP(i-HEK293T-GFP)克隆10的细胞共培养两周。基于GFP信号,通过流式细胞术分离GFP阴性的单个人细胞。在单个细胞集落生长后,使用i-HEK293T-GFP克隆10PERV拷贝数作为标准标记物(在共培养实验之前已通过ddPCR检测到克隆10的PERV拷贝数),通过qPCR扩增基因组DNA,以检测和定量GFP阴性克隆中的PERV部分。通过PERV pol基因的qPCR检测到从i-HEK293T-GFP克隆10到WT HEK293T人细胞的PERV传递,并且不同的WT HEK293T克隆显示出不同的PERV拷贝数。
图4B显示了PERV优先插入开放染色质和转录活跃区域。测量并比较PERV插入位点周围区域与其余连接(junctions)的基因表达水平,DNase信号和H3K27Ac信号。观察到PERV插入位点中转录,DNase信号和H3K27Ac水平的增加。
图5A是示出了DNA损伤效应的调节剂效果图。用bFGF,PFTa,和bFGF+PFTa处理FFF3细胞。单独使用bFGF和PFTa进行处理均未提高PERV编辑效率,而使用bFGF和PFTa的混合物(cocktail)进行处理显著提高了靶向频率(p值=0.0016),表明bFGF和PFTa之间具有协同效应。
图5B是示出了随时间(D=天)推移的用PFT-a和bFGF的混合物对FFF3-#5群体进行处理的效果图。结果显示了持续的高PERV靶向效率,而未经混合物处理的FFF3-#4群体表现出PERV编辑效率降低的模式。(ANOVA,天(p值=0.23),PFTa/bFGF处理(p值=0.00002))。
图5C是示出了用bcl-2对FFF3细胞处理7天的效果图。检测到在使用不同剂量的Bcl-2进行处理时没有显著差异(p值=0.565)。在实验中还观察到Bcl-2的剂量依赖性的细胞毒性。
图6A是示出了大T抗原对FFF3群体中PERV靶向效率的效果图(p值=0.05,Wilcoxon检验(单侧))。
图6B是示出了大T抗原对自用于分析PERV编辑效率的分选的单个细胞生长的克隆的效果表。与未处理组相比,大T抗原处理可将>80%和>90%的PERV-ko克隆的比例分别提高3.75倍和5.06倍。
图7显示了100%无PERV的PFFF3的转录谱。RNAseq用于分析pol基因的PERV失活。y轴表示位点。X轴表示插入缺失在PERV基因座内的相对位置。红色表示PERV pol序列中比对的插入缺失事件。
图8显示了用于检测FF3CF中PERV连接的引物。
图9显示了出生时(born)无PERV的FFF3仔猪的PERV靶向效率。y轴表示经编辑的PERV基因座。x轴表示插入缺失在PERV基因座内的相对位置。红色表示PERV pol序列中比对的插入缺失事件。紫色阴影表示不同的PERV单体型。猪的基因型显示PERV的所有25个拷贝均发生了功能性突变。
图10显示了9头出生时无PERV的FFF3仔猪的PERV靶向效率。“#1”仔猪(左六栏)和“#2”仔猪(右三栏)表示两个不同的无PERV的FFF3克隆。
图11显示了猪PK15和与PK15共培养的人HEK293T(iHEK293T-GFP)中的PERV拷贝数。A)PK15细胞系中PERV env A,B,C的拷贝数。在PK15细胞中检测到PERV-A和PERV-B,但未检测到PERV-C。PERV-A的拷贝数大约是PERV-B的两倍。在每个2D扩增图谱中,黑点(左下象限)代表未扩增的液滴,绿色(右下象限)代表包含GAPDH(参考基因)的液滴,蓝色(左上象限)代表包含亚型A,B,或C的PERV env的液滴,橙色(右上象限)代表包含GAPDH和PERV env的液滴。在每个图谱下显示了相对于GAPDH测量的PERV亚型A,B,和C的拷贝数。B)PK15将PERV传递给HEK293T-GFP人细胞,并且HEK293T-GFP中的PERV拷贝数随时间增加。将HEK293T-GFP细胞与等量的PK15细胞共培养。基于GFP表达,通过连续几轮分选来分离人细胞群体。在三个时间点收集纯化的人细胞,收集基因组DNA,并通过ddPCR进行扩增,以检测和定量人细胞中的PERV部分。通过PERV env基因的ddPCR检测到从猪PK15到人HEK293T细胞的PERV传递。在与PK15有接触史的HEK293T细胞中检测到PERV-A和PERV-B,但未检测到PERV-C,并且HEK293T细胞中PERV拷贝数随时间而增加。
图12描绘了FFF3中PERV亚型拷贝数的验证。通过pol和env基因的ddPCR检测到WT猪原代胎儿成纤维细胞系(FFF3)的PERV拷贝数。通过pol基因确定的PERV拷贝数(25)与通过env基因检测的PERV拷贝数(24)相似。
图13描绘了描述在猪基因组中检测PERV位置的过程的示意图。为了确定PERV的位置,在PERV特异性杂交捕获后进行PacBio长读基因组测序(N50=2,439bp,如下所述),并确定了基因组的非重复区域中PERV的21个拷贝的位置。
图14描绘了描述pol标靶gRNA的设计过程的示意图。
图15A显示了用于猪克隆的无PERV克隆的代表性核型(karyotype)。使用核型分析解析了不同的克隆,5个显示出异常核型,3个显示出正常。3个异常核型的示例。值得注意的是,除了一种情形外(易位对t(10,12)中的染色体10,上图),所有易位的染色体(由颜色对表示)或具有插入或缺失的染色体均包含PERV。
图15B显示了代表性的正常核型。无PERV的克隆显示出完全正常的核型。
图16A显示了PERV-KO胎儿的代表性图像。从3头代孕母猪中共获得了6个活胎(2个WT和4个无PERV的胎儿)。这张照片显示了从妊娠第50天的代孕母猪获得的三个无PERV的活胎。
图16B表明了胎儿的基因组DNA中PERV的失活效率。胎儿基因组DNA用于测量PERV失活效率。与原始的无PERV细胞系相似,PERV-KO胎儿也显示出约100%的PERV失活效率,这表明在妊娠期间没有发生代孕母猪的再感染。
图17A显示了无PERV的猪的代表性图像。这张照片显示了分娩后第二天的最先出生的猪(Laika)。
图17B表明了猪的基因组DNA中的PERV失活。通过对PERV pol基因座进行深度测序,对不同年龄的PERV-KO猪进行基因分型。所有被检查的猪均表现出约100%的PERV失活效率,这表明没有发生可检测的从代孕母猪到克隆猪的PERV再感染。
图17C表明了mRNA水平的PERV失活。总mRNA产生的cDNA用于检测PERV-KO猪转录物(transcript)的PERV失活效率。在mRNA水平,所有猪均表现出约100%的PERV根除效率。
图18表明了源于30d无PERV猪的单个细胞的PERV失活效率。将源于30d H9p01无PERV猪的细胞分选为单个细胞,并使用单个细胞的基因组DNA为模板,通过深度测序对PERVpol基因片段进行基因分型。所有单个细胞均显示出100%PERV失活。
图19显示了无PERV的猪和WT FFF3成纤维细胞的PERV拷贝数。无PERV的猪和WTFFF3成纤维细胞的基因组DNA用于通过ddPCR来测量PERV拷贝数。所有无PERV的猪都显示出与WT FFF3成纤维细胞相似的PERV拷贝数。
图20显示了所有无PERV猪的核型代表。所有无PERV的猪均表现出正常的核型。
图21显示了根据本文所述的一个实施方式的细胞系构建策略的示意图。
图22显示了根据本文所述的一个实施方式的细胞质量控制策略的示意图。
图23显示了根据本文所述的一个实施方式的SCNT克隆程序的示意图。
图24显示了根据本文所述的一个实施方式的用于改善细胞存活力条件的方法的示意图。简言之,跳过单个细胞克隆过程以缩短体外培养时间窗。使用所选细胞群体,而不是SCNT的单个细胞克隆,以减少细胞生长时间,而母猪本身则选择具有最佳基因修改的胚胎来发育胎儿。
图25显示了根据本文所述的一个实施方式的用于改善细胞存活力条件的方法的示意图。简言之,通过显微注射受精卵,而不是细胞,来进行修改以减少对细胞的压力。
图26显示了根据本文所述的一个实施方式的用于改善细胞存活力条件的方法的示意图。简而言之,从30天的胎儿中分离出成纤维细胞并用于通过SCNT进行的重新克隆。
图27表明了PERV敲除(KO)效率随转染中使用的gRNA数量的增加而增加。获自Yucatan的胎儿成纤维细胞具有50–60个PERV拷贝。所示色谱数据来自片段分析。
图28描绘的PCR数据显示失活的PERV pol不能被人ERV pol的活性互补。
图29表明了代孕体选择对分娩率,产仔数,存活率,和每头母猪预产仔猪的影响。
图30表明了在猪产生的过程中包括重新克隆步骤对分娩率,产仔数,存活率,和每头母猪预产仔猪的影响。
图31A显示了WT猪中PERV片段分析的色谱数据。
图31B显示了PERV KO Yorkshire中PERV片段分析的色谱数据。数据显示100%的PERV KO仅具有大片段缺失(large deletions),大多数多于100个碱基对(bp)。
本公开的具体实施方式
本公开提供了具有减少的完整PERV的一种或多种基因修改的猪细胞,或产生这些细胞的方法。在一些实施方式中,一种或多种猪细胞不具有任何完整PERV,或产生这些细胞的方法。在一些实施方式中,可以克隆PERV减少的或无PERV的猪细胞以产生猪胚胎,其可以继而生长为成年猪,从中可提取器官和/或组织并用于例如异种移植到人体中的目的。
Ⅰ.定义
在整个说明书和权利要求书中,与数值结合使用的术语“大约”和“近似”表示本领域技术人员熟悉并可接受的精度范围。
在此公开的数值范围包括限定范围的数字。
术语“一个(a)”和“一个(an)”包括复数指代,除非使用该术语的上下文另外明确指出。术语“一个(a)”(或“一个(an)”)以及术语“一个或多个”和“至少一个”在此可以互换使用。此外,在此使用的“和/或”应被视为两个或多个指定特征或部件中的每一个具有或不具有另一个的特定公开。因此,例如在此的“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”,“A或B”,“A”(单独),和“B(单独)”。同样地,在例如“A,B,和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下各个方面:A,B,和C;A,B,或C;A或C;A或B;B或C;A和C;A和B;B和C;A(单独);B(单独);和C(单独)。
在整个说明书中,词语“包含(comprise)”或例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变体将被理解为暗示包括所述整数或整数组,但不排除任何其他整数或整数组。如在此使用的,术语“包括”还涵盖较窄术语“由……组成”和“基本上由……组成”的使用。
在此互换使用的术语“猪(pig)”,“猪(swine)”和“猪(porcine)”是指与几种家猪品种有关的任何事物,为野猪(Sus scrofa)种。
当用于指代蛋白质或多肽的片段或衍生物时,术语“生物学活性(biologicallyactive)”是指该片段或衍生物保留了参考全长蛋白质或多肽的至少一种可测量和/或可检测的生物活性。例如,CRISPR/Cas9蛋白的生物学活性片段或衍生物可能能够结合向导RNA,当与向导RNA复合时结合靶DNA序列,和/或切割一条或多条DNA链。
当在疾病,损伤或失调的上下文中使用时,术语“治疗(treatment)”,“治疗(treating)”,“缓解”等在此使用以笼统地表示获得期望的药理和/或生理效果,并且也可以用于指代改善,缓解,和/或降低所治疗的病症(condition)的一种或多种症状的严重程度。就完全或部分延迟疾病,病症,或其症状的发作或复发而言,该效果可以是预防性的,和/或对于疾病或病症和/或归因于疾病或病症的不良作用的部分或完全治愈而言,该效果可以是治疗性的。在此使用的“治疗”覆盖对哺乳动物,特别是人类的疾病或病症的任何治疗,并且包括:(a)防止该疾病或病症在可能易患该疾病或病症但尚未被诊断为患有该疾病或病症的受试者中发生;(b)抑制疾病或病症(例如,阻止其发展);或(c)减轻疾病或病症(例如,导致疾病或病症消退,从而改善一种或多种症状)。
Ⅱ.猪细胞,组织和器官
在一些实施方式中,细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中,哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方式中,哺乳动物细胞是非人哺乳动物细胞,例如马科,猪科,牛科,绵羊科,山羊科,犬科,或猫科动物。在一些实施方式中,细胞是猪细胞。
在一些实施方式中,本公开提供了具有减少的完整PERV的一种或多种猪细胞。在一些实施方式中,已经对猪细胞进行了基因修改,使得存在于猪细胞中的完整PERV已经被灭活。在一些实施方式中,猪细胞具有小于60,小于50,小于40,小于30,小于25,小于20,小于15,小于10,小于5,小于3,小于2,1或0个完整PERV的拷贝。在一些实施方式中,猪细胞具有小于10,小于5,小于3,小于2,1或0个完整PERV的拷贝。在一些实施方式中,猪细胞具有0个完整PERV的拷贝。在一些实施方式中,猪细胞具有约60个拷贝至约1个拷贝,约50个拷贝至约1个拷贝,约40个拷贝至约1个拷贝,约30个拷贝至约1个拷贝,约20个拷贝至约5个拷贝,约15个拷贝至约10个拷贝,或约5个拷贝至约1个拷贝的完整PERV。在一些实施方式中,细胞中至少约30%,约35%,约40%,约45%,约50%,约55%,约60%,约65%,约70%,约75%,约80%,约85%,约90%,约95%,约96%,约97%,约98%,约99%或100%的PERV是失活的。在一些实施方式中,细胞中约30%至100%,约35%至100%,约40%至100%,约45%至100%,约50%至100%,约55%至100%,约60%至100%,约65%至100%,约70%至100%,约75%至100%,约80%至100%,约85%至100%,约90%至100%,约95%至100%,约96%至100%,约97%至100%,约98%至100%,或约99%至100%的PERV是失活的。在一些实施方式中,细胞中100%的PERV是失活的。
在一些实施方式中,细胞是原代细胞,例如猪原代细胞。在一些实施方式中,细胞是体细胞。在一些实施方式中,细胞是产后细胞(post-natal cell)。在一些实施方式中,细胞是成体细胞(例如,成体耳成纤维细胞)。在一些实施方式中,细胞是胎儿/胚胎细胞(例如,胚胎卵裂球)。在一些实施方式中,细胞是生殖细胞。在一些实施方式中,细胞是卵母细胞。在一些实施方式中,细胞是干细胞。在一些实施方式中,细胞是来自原代细胞系的细胞。在一些实施方式中,细胞是上皮细胞,肌细胞,成纤维细胞,内皮细胞,肝细胞,颗粒细胞,脂肪细胞。在特定的实施方式中,细胞是成纤维细胞。在一些实施方式中,成纤维细胞是胎儿成纤维细胞,例如雌性胎儿成纤维细胞。在一些实施方式中,细胞是癌细胞。在一些实施方式中,细胞不是癌细胞。在一些实施方式中,细胞是体外的。在一些实施方式中,细胞是体内的。在一些实施方式中,细胞是单细胞。在一些实施方式中,细胞是细胞集落的一员。
在一些实施方式中,细胞是猪细胞。猪细胞的非限制性实施例是起源于或来源于以下任何猪品种的细胞:美国长白猪,美国约克郡猪,阿克塞黑斑猪,昂格尔恩白肩猪,阿巴拉契亚英国猪,阿拉帕瓦岛猪,奥克兰群岛猪,澳大利亚约克郡猪,巴比甘榜猪,巴旭银猪,班图猪,巴斯克猪,巴兹纳猪,北京黑猪,白俄罗斯黑斑猪,比利时长白猪,孟加拉棕猪,本特海姆黑斑猪,巴克夏猪,比萨罗猪,班格尔猪,黑斯拉夫尼亚猪,黑色加那利猪,布列伊托夫猪,英国长白猪,英国罗布泊猪,英国白肩猪,保加利亚白猪,金保罗猪,广东猪,凯尔特猪,查托穆尔西亚猪,切斯特白猪,清迈黑猪,乔克托猪,克里奥尔猪,捷克改良白猪,丹麦长白猪,丹麦抗议猪,Dermantsi猪,Li Yan猪,杜洛克猪,荷兰长白猪,东长白猪,东巴尔干猪,埃塞克斯猪,爱沙尼亚培根猪,枫泾猪,芬兰长白猪,林山猪,法国长白猪,加斯科涅猪,德国长白猪,格洛斯特郡花猪,哥廷根小型猪,格莱斯猪,几内亚猪,汉普夏猪,汉特猪,海福特猪,蕨麻猪,霍根猪,亨廷顿黑猪,伊比利亚猪,意大利长白猪,日本长白猪,济州黑猪,金华猪,卡赫季猪,可乐猪,克麦罗沃猪,韩国本土猪,Krskopolje猪,酷你酷你猪,南江猪,大黑猪,大黑白猪,大白猪,拉脱维亚白猪,Leicoma猪,立陶宛本土猪,立陶宛白猪,林肯郡卷毛猪,利夫内猪,Malhado de Alcobaca猪,曼加利察猪,梅山猪,中白猪,民猪,Minokawa Buta猪,蒙开猪,Mora Romagnola猪,莫拉猪,Mukota猪,缪尔福特猪,穆罗姆猪,米尔霍罗德猪,Nerodei Nebrodi猪,内江猪,新西兰猪,宁乡猪,北高加索猪,北西伯利亚猪,挪威长白猪,挪威约克郡猪,Ossabaw岛猪,牛津桑迪黑猪,北冲5猪,菲律宾本土猪,皮特兰猪,波中猪,红垂猪,白肩猪,哥萨克猪,西伯利亚黑斑猪、小黑猪,小白猪,斑点猪,泗水猪,施韦比施哈尔猪,瑞典长白猪,Swallow Belied Mangalitza猪,太湖猪,太姆华斯猪,Thuoc Nhieu猪,藏猪,东京-X猪,齐维利斯克猪,Turopolje猪,乌斑草原猪,乌白草原猪,乌尔茹姆猪,越南大肚猪,威尔士猪,威赛克斯白肩猪,西法白猪,Windsnyer猪,五指山猪,雅南猪,约克郡猪和约克郡蓝白猪。
在一些实施方式中,细胞(例如,供体核细胞)分离自嵌合(chimeric)/嵌合体(mosaic)胎儿。如在此使用的,术语“嵌合”和“嵌合体”可以互换使用,并且是指自单个受精卵发育的一个胎儿中有两个或两个以上具有不同基因型的细胞群体的胎儿。在一些实施方式中,嵌合胎儿为约5天,约10天,约15天,约20天,约25天,约30天,约2个月,约3个月,约4个月,约5个月,约6个月,约7个月,约8个月,约9个月或更长时间妊娠。在一些实施方式中,嵌合胎儿小于约5天,小于约10天,小于约15天,小于约20天,小于约25天,小于约30天,小于约2个月,小于约3个月,小于约4个月,小于约5个月,小于约6个月,小于约7个月,小于约8个月,或小于约9个月妊娠。
在一些实施方式中,使用基因组修改试剂产生嵌合胎儿,例如锌指核酸酶或切口酶,TAL效应物核酸酶或切口酶,脱氨酶,和CRISPR相关的核酸酶或切口酶。在一些实施方式中,嵌合胎儿通过直接受精卵注射产生。
在一些实施方式中,核供体细胞分离自年龄小于约10周,小于约9周,小于约8周,小于约7周,小于约6周,小于约5周,小于约4周,小于约3周,小于约2周,或小于1周的动物。
在一些实施方式中,核供体细胞,例如分离自嵌合胎儿的核供体细胞在体外扩增一段时间。在一些实施方式中,细胞在体外进行少于约30次,少于约25次,少于约20次,少于约15次,少于约10次,少于约5次,或少于约2次群体倍增的扩增。在一些实施方式中,细胞在体外进行不超过约2次,约3次,约4次,约5次,约6次,约7次,约8次,约9次,约10次,约11次,约12次,约13次,约14次,约15次,约16次,约17次,约18次,约19次,约20次,约21次,约22次,约23次,约24次,约25次,约26次,约27次,约28次,约29次,或约30次群体倍增的扩增。
在一些实施方式中,在基因修改之前或之后,在一种或多种改善细胞健康和/或存活的因子的存在下培养细胞。在一些实施方式中,该因子是BEPP单盐酸盐,pifithrin-α,R18三氟乙酸盐,成纤维细胞生长因子(fgf),大T抗原,BCL,或其任何组合。在一些实施方式中,该因子诱导RNA依赖的蛋白激酶凋亡,抑制p53介导的凋亡,抑制14-3-3蛋白,促进增殖,促进永生化,抗凋亡,或其任何组合。
在一些实施方式中,该因子是细胞周期检查点抑制剂。在一些实施方式中,该因子是抗凋亡因子。在一些实施方式中,该因子是bcl-2。在一些实施方式中,该因子是以下任一项的抑制剂:c-Myc,Bax,p53,tBid,和BCL。技术人员知道多种小分子以及这些小分子的可能的衍生物可用作抗凋亡检查点抑制剂或抗凋亡因子。在一些实施方式中,该因子是SV40抗原。
在一些实施方式中,该因子是p53抑制剂。在一些实施方式中,该因子是pifithrin分子或其衍生物。在一些实施方式中,该因子是pifithrin-alpha和/或pifithrin-beta。已证明Pifithrin(PFT)-α可逆地抑制p53依赖的转录激活和凋亡,并且已证明PFT-μ通过降低p53对Bcl-xL和Bcl-2的结合亲和力来抑制p53与线粒体的结合。在一些实施方式中,p53抑制剂是环化的PFT-αp53灭活剂,例如环状Pifithrin-α氢溴酸盐。在一些实施方式中,p53抑制剂是减少或消除细胞中p53表达的核酸。在一些实施方式中,核酸是反义和/或RNAi分子。在一些实施方式中,p53抑制剂是显性阴性p53蛋白,或编码显性阴性p53抑制剂的核酸。在一些实施方式中,p53抑制剂选自pifithrin-α,pifithrin-beta,pifithrin-α氢溴酸盐,pifithrin-mu,玫瑰树碱,9-羟基玫瑰树碱,nutlin-3,roscovitine,和SJ 172550。
在一些实施方式中,该因子是生长因子。在一些实施方式中,生长因子是源于猪的。在一些实施方式中,生长因子是对已被基因修改的细胞类型有用的生长因子。例如,如果基因修改的细胞是成纤维细胞或成纤维细胞谱系的细胞,则在一些实施方式中,生长因子是成纤维细胞生长因子。在一些实施方式中,成纤维细胞生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)。在一些实施方式中,成纤维细胞生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。在一些实施方式中,生长因子选自表皮生长因子(EGF),胰岛素样生长因子(IGF),血小板衍生生长因子(PDGF),血管内皮生长因子(VEGF),和角质形成细胞生长因子(KGF)。
在一些实施方式中,对细胞同时施用p53抑制剂和生长因子。在一些实施方式中,对细胞同时施用bFGF和pifithrin-alpha。
在一些实施方式中,本公开的细胞在约1–20%的氧气(O2),约1–20%的二氧化碳(CO2),约50–90%的N2,或其任何组合的条件下培养。在一些实施方式中,本公开的细胞在低氧条件下(例如,在少于10%的O2存在下)培养。在一些实施方式中,本公开的细胞在约37℃培养。在一些实施方式中,本公开的细胞可以在约5%的O2,5%的CO2和90%的N2下培养。在一些实施方式中,将细胞在三气培养箱中培养至少一段时间。
在一些实施方式中,当细胞低于约80%,约70%,约60%,约50%,约40%,约30%,约20%,约10%,或更少的融汇度(confluency)时,在体外培养的本公开的细胞被分裂和/或冻存。在一些实施方式中,当细胞低于约50%的融汇度时,细胞被分裂和/或冻存。
Ⅲ.基因修改
本公开提供了产生基因修改的细胞和由其衍生的动物的方法。
在一些实施方式中,通过灭活,外源核酸的插入,内源核酸的消减(subtraction),或其任何组合对多个内源核酸序列进行修改以产生基因修改的细胞和由其衍生的动物。
在一些实施方式中,对细胞(例如,核供体细胞)中的多个核酸序列进行了修改。在一些实施方式中,至少约2个,至少约5个,至少约10个,至少约20个,至少约30个,至少约40个,至少约50个,至少约60个,至少约70个,至少约80个,至少约90个,至少约100个,或更多个核酸序列被修改。在一些实施方式中,多个基因修改针对单一重复基因序列。在其他实施方式中,基因修改的至少一部分针对不同基因。
在一些实施方式中,本公开提供了具有减少的完整病毒部分(例如PERV)的一个或多个细胞。在一些实施方式中,已对核供体细胞进行了基因修改,使得存在于细胞中的完整病毒部分已被灭活。在一些实施方式中,细胞具有小于60,小于50,小于40,小于30,小于25,小于20,小于15,小于10,小于5,小于3,小于2,1或0个完整病毒部分的拷贝。在一些实施方式中,猪细胞具有小于10,小于5,小于3,小于2,1或0个完整病毒部分的拷贝。在一些实施方式中,猪细胞具有0个完整病毒部分的拷贝。在一些实施方式中,细胞具有约60个拷贝至约1个拷贝,约50个拷贝至约1个拷贝,约40个拷贝至约1个拷贝,约30个拷贝至约1个拷贝,约20个拷贝至约5个拷贝,约15个拷贝至约10个拷贝,或约5个拷贝至约1个拷贝的完整病毒部分。在一些实施方式中,细胞中至少约30%,约35%,约40%,约45%,约50%,约55%,约60%,约65%,约70%,约75%,约80%,约85%,约90%,约95%,约96%,约97%,约98%,约99%或100%的病毒部分是失活的。在一些实施方式中,细胞中约30%至100%,约35%至100%,约40%至100%,约45%至100%,约50%至100%,约55%至100%,约60%至100%,约65%至100%,约70%至100%,约75%至100%,约80%至100%,约85%至100%,约90%至100%,约95%至100%,约96%至100%,约97%至100%,约98%至100%,或约99%至100%的病毒部分是失活的。
在一些实施方式中,本公开的细胞,组织,器官或动物(例如,猪)缺乏传染性病毒(或经设计以缺乏传染性病毒的活化菌株)。在一些实施方式中,细胞缺乏内源性逆转录病毒。在一些实施方式中,本公开的细胞缺乏疱疹病毒,猪嗜淋巴疱疹病毒(PLHV),猪巨细胞病毒(PCMV),脑心肌炎病毒(EMCV),猪圆环病毒(PCV),戊型肝炎病毒(HEV),狂犬病病毒,伪狂犬病病毒,细小病毒,猪水泡病病毒,猪脊髓灰质炎病毒,血凝性脑心肌炎病毒,甲型猪流感病毒,腺病毒,传染性胃肠炎病毒,水疱性口炎病毒,猫白血病病毒,鼠乳腺瘤病毒,小鼠白血病病毒,猿猴免疫缺陷病毒(SIV),马传染性贫血,牛免疫缺陷病毒(BIV)等中的任何一种或多种(或经设计以缺乏其活化菌株)。在一些实施方式中,本公开的细胞,组织,器官或猪缺乏PERV(或经设计以缺乏PERV的活化菌株)。
在一些实施方式中,本公开的细胞,组织,器官或动物(例如,猪)包含一种或多种失活突变。在一些实施方式中,细胞,组织,器官或动物包含一种或多种导致核酸序列(例如,基因或逆转录病毒部分,例如PERV部分)活性降低或丧失的突变或表观遗传变化。在一些实施方式中,通过对存在于细胞,组织,器官或动物中的核酸进行基因修改以使一种或多种核酸序列(例如,PERV部分)失活。在一些实施方式中,一种或多种核酸序列(例如,PERV部分)的失活通过实验的方式确认。在一些实施方式中,该实验是感染性实验,逆转录酶PCR实验,转录组测序技术(RNA-seq),实时PCR,或连接PCR位置确定分析。
可以根据本领域技术人员已知的任何方法对细胞,组织,器官或动物进行基因修改。在一些实施方式中,对细胞中的核酸进行基因修改,使得细胞中的一个或多个核酸序列(例如,基因或逆转录病毒部分)失活。在一些实施方式中,使用本领域已知和/或在此公开的任何基因修改系统对核酸序列进行基因修改。在一些实施方式中,基因修改系统是TALEN,锌指核酸酶,和/或基于CRISPR的系统。在一些实施方式中,基因修改系统是CRISPR-Cas9系统。在一些实施方式中,对细胞进行基因修改,使得细胞中的一个或多个核酸序列失活,并且对细胞进行进一步的基因修改,使得细胞具有降低的一种或多种基因的表达,如果细胞(或从细胞克隆/衍生的组织或器官)被移植到人体,该基因表达会诱导免疫应答。在一些实施方式中,对细胞进行基因修改,使得细胞中的一个或多个核酸序列失活,并且对细胞进行进一步基因修改,使得细胞具有增加的一种或多种基因的表达,如果细胞(或从细胞克隆/衍生的组织或器官)被移植到人体,该基因表达会抑制免疫应答。在一些实施方式中,对细胞进行基因修改,使得细胞中的一个或多个核酸序列失活,并且对细胞进行进一步的基因修改,使得细胞具有降低的一种或多种基因的表达,如果细胞(或从细胞克隆/衍生的组织或器官)被移植到人体,该基因表达会诱导免疫应答,并且对细胞进行进一步的基因修改,使得细胞具有增加的一种或多种基因的表达,如果细胞(或从细胞克隆/衍生的组织或器官)被移植到人体,该基因表达会抑制免疫应答。
在一些实施方式中,本公开提供了自基因修改的细胞克隆的胚泡或胚胎。在一些实施方式中,从基因修改的细胞中提取基因修改的核酸并将其克隆到不同的细胞中。例如,在体细胞核转移中,来自基因修改细胞的基因修改核酸被引入去核卵母细胞。在一些实施方式中,卵母细胞可通过在极体附近进行部分带切开(partial zona dissection)然后在切开区域压出细胞质而去核。在一些实施方式中,获得具有全部或基本上全部完整的细胞质的卵母细胞。在一些实施方式中,对卵母细胞进行多层卵丘细胞筛选。在一些实施方式中,使用具有锋利有斜面的尖端的注射移液管来将基因修改的细胞注射到阻滞于减数分裂2的去核卵母细胞中。阻滞于减数分裂2的卵母细胞通常被称为“卵(eggs)”。在一些实施方式中,通过融合并活化卵母细胞以产生胚胎。这样的胚胎在此可被称为“基因修改的胚胎”。在一些实施方式中,基因修改的胚胎被转移至受体雌性猪的输卵管。
根据在此公开的任何实施方式可以产生基因修改的胚泡或胚胎。在一个实施方式中,可获取猪胎儿成纤维细胞并使用氖转染试剂进行转染,生物素缀合珠可用于通过FACS反选择(counter select)敲除基因和/或针对敲入基因的抗体结合选择,在体外对具有所需修改的单个细胞进行分选和扩增,对细胞进行基因分型和/或PCR验证阳性克隆,然后进行细胞转运和SCNT克隆,或其任何组合。在一些实施方式中,使用例如显微注射受精卵,而不是体外细胞来对受精卵进行基因修改。预期直接注射入受精卵可能对细胞的压力较小。当进行受精卵修改时,然后转移胚胎以获得嵌合体动物,并从嵌合体胎儿分离细胞以用于SCNT克隆。
在一些实施方式中,测试根据在此公开的任何实施方式产生的细胞,胚泡,胚胎等以进行质量控制。质量控制的非限制性实施例包括Miseq和Sanger测序以检测基因靶向效率,外显子组测序和/或全基因组测序以检测脱靶,核型分析以检测染色体异常,RT-qPCR以检测靶基因表达,RNA seq以检测整个基因表达模式的规度(nomality),敲除基因的抗体结合反选择(例如,通过珠富集(bead enrichment)),敲入基因的特异性基因抗体结合选择(例如,通过流式细胞术分选);特异性基因抗体结合,人血清抗体结合,补体细胞毒性,或自然杀伤(NK)细胞检测以检测靶基因的生理功能,胚泡发育率以检查基因编辑是否影响胚胎发育,及其任何组合。
Ⅳ.代孕体和/或体细胞核转移
在一些实施方式中,将基因修改的胚泡或胚胎转移至代孕体,例如代孕体的输卵管。在一些实施方式中,将基因修改的胚泡或胚在活化后约20至24小时转移至代孕体的输卵管。在一些实施方式中,将多于一个的胚泡或胚胎转移至代孕体中。在一些实施方式中,约1至约600,约50至约500,约100至约400,或约200至约300的胚泡或胚胎被转移。在一些实施方式中,在转移之前检查胚胎以进行质量控制,例如检查分裂(cleavage)率和胚泡率。在一些实施方式中,将源于样品细胞的胚胎或胚泡转移至多个代孕体中,例如,约5–20个代孕体/细胞系。在一些实施方式中,至少一个野生型胚泡或胚胎在与基因修改的胚泡或胚胎相同或基本相同的时间被转移至代孕体。在一些实施方式中,在将基因修改的胚泡或胚胎转移至代孕体之前或之后,将至少一个野生型胚泡或胚胎转移至代孕体中。在一些实施方式中,在基因修改的胚泡或胚胎转移后约20–21天检查代孕体是否妊娠。
在一些实施方式中,在胚泡或胚胎转移之前针对代孕体筛选某些特征。代孕体特征的非限制性实施例包括生理阶段,年龄,生育能力,母性行为,哺乳和养育能力,流产频率,疾病,或其任何组合。在一些实施方式中,针对先前的产仔数,合适的年龄,具有多于一个的生育史,和/或合适的生理阶段而选择代孕体。在一些实施方式中,在春季或秋季进行胚泡或胚胎转移。在一些实施方式中,在夏季和/或冬季不进行胚泡或胚胎转移。
在一些实施方式中,选择大的代孕体。能够预期,与较小的代孕体相比,较大的代孕体可以提高任何一种或多种结果指标所衡量的猪生产,包括分娩率,产仔数,存活率,和每头母猪预产仔猪。
在一些实施方式中,进行第一轮SCNT以产生被转移至代孕母的胚胎,从而产生胎儿,然后从胎儿中分离细胞。继而将分离的细胞用于第二轮SCNT,并转移至代孕体中以产生基因修改的动物。在一些实施方式中,第二轮SCNT中使用的胎儿在约10天,约20天,约30天,约40天,约50天,约60天,约70天,约80天,约90天,约100天,或约100天妊娠时被处死(sacrificed)。在一些实施方式中,第二轮SCNT中使用的胎儿为少于约50天,少于约40天,少于约30天,少于约20天,或少于约10天妊娠。
在一些实施方式中,基因修改的胚泡或胚胎生长为产后(post-natal)基因修改的动物(例如,猪)。在一些实施方式中,产后基因修改的动物是新生儿(neo-natal)基因修改的动物。在一些实施方式中,基因修改的动物是少年基因修改的动物。在一些实施方式中,基因修改的动物是成年基因修改的动物(例如,大于5–6个月)。在一些实施方式中,基因修改的动物是雌性基因修改的动物。在一些实施方式中,该动物是雄性基因修改的动物。在一些实施方式中,将基因修改的动物与非基因修改的动物一起繁殖。在一些实施方式中,将基因修改的动物与另一基因修改的动物一起繁殖。在一些实施方式中,将基因修改的动物与具有降低或没有活性的逆转录病毒(例如,PERV)的另一基因修改的动物一起繁殖。在一些实施方式中,将基因修改的动物与已被基因修改过的二次基因修改的动物一起繁殖,使得如果将二次基因修改的动物的细胞,组织,或器官移植到人体,则其更不太可能诱导免疫应答。
Ⅴ.基因修改的动物
本公开还提供了预防或降低基因修改的胚泡或胚胎的体细胞核转移(SCNT)后妊娠丢失或流产的风险的方法,包括:使用基因修改的核供体细胞的细胞核产生胚泡或胚胎;以及将所述胚泡或胚胎转移至代孕体中以产生至少一个可育后代,其中,与对照的妊娠丢失率或流产率相比,其妊娠丢失率或流产率降低。
在一些实施方式中,与对照的基因修改的胚泡或胚胎的妊娠丢失率或流产率相比,妊娠丢失率或流产率降低了至少约5%,至少约10%,至少约20%,至少约30%,至少约40%,至少约50%,至少约60%,至少约70%,至少约80%,至少约90%,或更多。
在一些实施方式中,基因修改的动物在妊娠后至少1个月,至少6个月,至少1年,至少5年,至少10年保持相同或相似的基因修改水平。
在一些实施方式中,基因修改的动物存活至少1个月,至少2个月,至少3个月,至少4个月,至少5个月,至少6个月,至少7个月,至少8个月,至少9个月,至少10个月,至少11个月,至少1年,至少2年,至少3年,至少4年,至少5年,至少6年,至少7年,至少8年,至少9年,至少10年,或更长。
在一些实施方式中,基因修改的猪是PERV失活的基因修改的猪,并且在妊娠后至少1个月,至少6个月,至少1年,至少5年,至少10年保持相同或相似的PERV失活水平。在一些实施方式中,即使在从非PERV失活的代孕体分娩之后或在与其他非PERV失活的猪处于设施/空间中之后,基因修改的猪仍保持为PERV失活的基因修改的猪。
在一些实施方式中,本公开提供了从在此所述的任何产后基因修改的动物(例如,猪)获取的细胞,组织或器官。在一些实施方式中,细胞,组织或器官选自:肝,肺,心脏,脑,胰腺,肌肉,血液,骨骼,睾丸和卵巢。在一些实施方式中,器官是肝,肺或心脏。在一些实施方式中,来自产后基因修改的动物的细胞选自:胰岛,肺上皮细胞,心肌细胞,骨骼肌细胞,平滑肌细胞,肝细胞,非实质性肝细胞,胆囊上皮细胞,胆囊内皮细胞,胆管上皮细胞,胆管内皮细胞,肝血管上皮细胞,肝血管内皮细胞,窦状细胞,脉络丛细胞,成纤维细胞,睾丸支持细胞,神经元细胞,干细胞,和肾上腺嗜铬细胞。在一些实施方式中,基因修改的器官,组织或细胞已经与它们的自然环境分离(即,与它们在其中生长的动物分离)。在一些实施方式中,与自然环境的分离是指与自然环境的完全物理分离,例如,从基因修改的供体动物中移除,以及基因修改的器官,组织或细胞与它们直接接触的相邻细胞的关系发生改变(例如,通过解离)。
Ⅲ.产生PERV减少或无PERV的猪细胞的方法
本公开提供了产生在此公开的任何PERV减少或无PERV的猪细胞的方法。在一些实施方式中,本公开提供了使在此公开的任何猪细胞的PERV部分失活的方法,包括向所述细胞施用针对参与PERV复制和/或装配的基因的基因组修改试剂,其中所述试剂破坏基因的转录和/或翻译。在一些实施方式中,所述试剂靶向基因的起始密码子并且抑制基因的转录。在一些实施方式中,所述试剂标靶基因中的外显子,并且所述试剂诱导基因中的移码(frameshift)突变。在一些实施方式中,所述试剂将失活突变引入基因。在一些实施方式中,所述试剂抑制基因的转录。
技术人员知道用于确定细胞是否无PERV的多种实验。一种方法是将人细胞暴露于被认为是PERV减少或无PERV的基因修改的细胞,并监测人细胞的PERV感染,即感染性实验。参见,例如实施例1和2。监测基因修改的细胞中PERV活性的其他方法包括,例如RNAseq,逆转录酶-PCR,微阵列,和/或接头PCR反应,以监测与PERV相关的基因(例如gag,pol和/或env)的表达和/或染色体完整性。
在一些实施方式中,在此公开的任何试剂是多核苷酸。在一些实施方式中,多核苷酸编码在此描述的一种或多种核酸酶和/或切口酶和/或RNA或DNA分子。在一些实施方式中,将多核苷酸试剂引入一个或多个PERV猪细胞。在一些实施方式中,将多核苷酸以被一个或多个细胞瞬时表达的方式引入一个或多个PERV猪细胞。在一些实施方式中,将多核苷酸以被一个或多个细胞稳定表达的方式引入一个或多个PERV猪细胞。在一些实施方式中,将多核苷酸以被稳定地整合至猪细胞基因组的方式引入。在一些实施方式中,将多核苷酸与一种或多种转座子(transposonal elements)一起引入。在一些实施方式中,转座子是编码转座酶的多核苷酸序列。在一些实施方式中,转座子是编码PiggyBac转座酶的多核苷酸序列。在一些实施方式中,转座因子(transposable element)是可诱导的。在一些实施方式中,转座因子是强力霉素可诱导的。在一些实施方式中,多核苷酸还包含可选择标记。在一些实施方式中,可选择标记是嘌呤霉素抗性标记。在一些实施方式中,可选择标记是荧光蛋白(例如,GFP)。
在一些实施方式中,所述试剂是用于标靶细胞中PERV DNA的核酸酶或切口酶。在一些实施方式中,所述试剂特定标靶并抑制PERV的表达。在一些实施方式中,所述试剂包含转录阻遏物结构域。在一些实施方式中,转录阻遏物结构域是Krüppel相关盒(KRAB)。
在一些实施方式中,所述试剂是任何可编程核酸酶。在一些实施方式中,所述试剂是天然的归巢大范围核酸酶。在一些实施方式中,所述试剂是基于TALEN的试剂,基于ZFN的试剂,或基于CRISPR的试剂,或其任何生物学活性片段,融合,衍生物或其组合。在一些实施方式中,所述试剂是脱氨酶或编码脱氨酶的核酸。在一些实施方式中,细胞经设计以稳定和/或瞬时表达基于TALEN的试剂,基于ZFN的试剂,和/或基于CRISPR的试剂。
A.基于TALEN的试剂
在一些实施方式中,所述试剂是基于TALEN的试剂。在一些实施方式中,基于TALEN的试剂是一种或多种TALEN多肽/蛋白或其生物学活性片段或衍生物,或一种或多种编码一种或多种TALEN多肽或其片段或衍生物的核酸。转录激活因子样(TAL)效应物序列可通过装配重复可变双残基(RVD)序列进行装配以特异性结合DNA靶标。TAL效应物核酸酶(TALEN)的融合蛋白可以在细胞DNA中产生靶向的双链断裂,可用于对细胞进行特定的基因修改。在一些实施方式中,所述试剂是标靶PERV细胞中一个或多个PERV DNA序列的TALEN多肽/蛋白或其片段或衍生物。在一些实施方式中,TALEN的重复可变双残基(RVD)部分已经被设计以标靶PERV细胞中的一个或多个PERV DNA序列。在一些实施方式中,基于TALEN的试剂是编码一种或多种TALEN蛋白的核酸。在一些实施方式中,核酸在质粒中。在一些实施方式中,核酸是mRNA。
在一些实施方式中,TALEN蛋白在细胞中表达并诱导一个或多个PERV基因中的位点特异性双链DNA断裂。在一些实施方式中,TALEN蛋白引入供体序列,其中所述供体序列部分或完全替代PERV基因,从而使PERV基因沉默或失活。在一些实施方式中,TALEN是左TALEN,并且还包括与左TALEN合作以使PERV基因中的双链断裂的右TALEN。在另一个实施方式中,编码TALEN和/或核酸供体序列的核酸是载体或质粒的一部分。在一些实施方式中,TALEN包含间隔子(例如,间隔子序列的长度为12至30个核苷酸)。
在一些实施方式中,TALEN蛋白包含TAL效应物DNA结合结构域和/或修改的FokI核酸酶催化结构域。在一些实施方式中,TAL效应物DNA结合结构域结合至PERV基因中的区域。在一些实施方式中,TALEN从N端至C端包含:(i)长度为约50至约200个氨基酸的第一片段;(ii)提供与PERV核苷酸序列序列特异性结合的TAL效应物DNA结合结构域;(iii)长度为约20至100个氨基酸的第二片段;以及(iv)修改的FokI核酸酶催化结构域。
设计TALEN以结合特定核酸的方法描述于Cermak等,Nucl.Acids Res.1–11(2011)。美国公开申请号2011/0145940公开了TAL效应物以及使用它们以修改DNA的方法。Miller等,《自然生物技术》(Nature Biotechnol)29:143(2011)描述了通过将TAL截短变体与Fok I核酸酶的催化结构域连接来产生用于位点特异性核酸酶结构的TALEN。TALEN结合结构域的一般设计原理可以在例如WO 2011/072246中找到。这些文件中的每一个在此全部并入本文。
在一些实施方式中,基于TALEN的试剂标靶PERV的核苷酸序列。在一些实施方式中,基于TALEN的试剂标靶在多于一株的PERV中保留的核苷酸序列。在一些实施方式中,基于TALEN的试剂标靶PERV pol,env,和/或gag基因。在一些实施方式中,基于TALEN的试剂标靶PERV pol基因。在一些实施方式中,基于TALEN的试剂标靶编码PERV pol基因的催化核心的序列。
B.基于ZFN的试剂
在一些实施方式中,所述试剂是基于锌指核酸酶(ZFN)的试剂。在一些实施方式中,基于ZFN的试剂是一种或多种ZFN多肽或其生物学活性片段或衍生物,或一种或多种编码一种或多种ZFN多肽或其片段或衍生物的核酸。ZFN是通过将锌指DNA结合结构域融合到核酸酶而产生的人工限制性酶。锌指结构域可以经设计以标靶特定的所需DNA序列,这使锌指核酸酶能够标靶复杂基因组中的特定序列。单个ZFN的DNA结合结构域通常包含3到6个单独的锌指重复单位(repeats)并且各自可以识别9到18个碱基对(bp)。如果锌指结构域完美识别3个碱基对DNA序列以产生3指阵列,则该阵列可以识别9个碱基对的靶位点。在一些实施方式中,利用1-指或2-指模块来产生具有六个或更多个单个锌指的锌指阵列。由于单个锌指的特异性可能重叠并且取决于周围锌指和DNA的环境,因此ZFN可能不适用于标靶特定PERV。
已经开发出许多选择方法来产生能够标靶所需序列的锌指阵列。在一些实施方式中,初始选择尝试利用噬菌体展示以从一大群的部分随机锌指阵列中选择结合给定DNA靶标的蛋白。在一些实施方式中,酵母单杂交系统,细菌单杂交系统和双杂交系统(例如,“OPEN”系统),以及哺乳动物细胞可用于选择结合给定DNA的蛋白。特别地,OPEN系统将预先选择的一群单个锌指组合起来,每个锌指被选择以结合给定的三联体,然后利用第二轮选择以获取能够结合所需的9-bp序列的3指阵列。
在一些实施方式中,用于编辑PERV基因序列的方法包括将至少一种编码锌指核酸酶的核酸引入细胞中,该锌指核酸酶识别基因组中的PERV序列并能够切割PERV基因序列中的位点。在一些实施方式中,方法进一步包括引入至少一个供体多核苷酸,该供体多核苷酸包含侧翼为与分裂位点的任一侧具有基本序列相同性的上游序列和下游序列的用于整合的序列。在一些实施方式中,方法进一步包括引入至少一种交换多核苷酸,该交换多核苷酸包含与分裂位点处的基因组PERV序列的一部分基本相同的序列,并且还包含至少一个核苷酸改变。在一些实施方式中,培养细胞以允许锌指核酸酶表达,使得锌指核酸酶将双链断裂引入基因组PERV序列。在一些实施方式中,通过非同源末端连接修复过程来修复双链断裂,使得沉默或失活突变被引入染色体序列。在一些实施方式中,通过同源性指导的修复过程来修复双链断裂,使得供体多核苷酸中的序列整合到基因组PERV序列,或者交换多核苷酸中的序列与染色体序列的部分进行交换。
在一些实施方式中,锌指核酸酶标靶PERV的核苷酸序列。在一些实施方式中,锌指核酸酶标靶在多于一株的PERV中保留的核苷酸序列。在一些实施方式中,锌指核酸酶标靶PERV pol,env,和/或gag基因。在一些实施方式中,锌指核酸酶标靶PERV pol基因。在一些实施方式中,锌指核酸酶标靶编码PERV pol基因的催化核心的序列。
C.基于CRISPR的试剂
在一些实施方式中,所述试剂是基于CRISPR的试剂。在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂是一种或多种参与CRISPR相关的(“Cas”)基因的表达或指导CRISPR相关的(“Cas”)基因的活性的多核苷酸,包括但不限于,编码Cas基因的序列,tracr(反式激活的CRISPR)序列(例如tracrRNA或活化的部分tracrRNA),tracr-mate序列(在内源性CRISPR系统的背景下包含“直接重复(direct repeat)”和tracrRNA处理的部分直接重复),向导序列(在内源性CRISPR系统的背景下也称为“间隔子”),和/或CRISPR基因座的其他序列和转录物。在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂是编码至少一种CRISPR蛋白和一种或多种向导RNA(gRNA)的多核苷酸。在一些实施方式中,一个或多个gRNA包含与PERV多核苷酸序列同源并且能够结合原间隔子(protospacer)相邻基序(“PAM”)的序列。在一些实施方式中,PAM包括序列NGG或NNGRRT。
在一些实施方式中,该试剂是标靶PERV细胞中的一个或多个PERV DNA序列的基于CRISPR的多肽或其片段或衍生物。在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂的特征在于促进在PERV DNA或RNA序列的位点处形成CRISPR复合物的部分。在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂是一种或多种CRISPR/Cas核酸内切酶或其生物活性片段或衍生物,或一种或多种编码一种或多种CRISPR/Cas多肽或其片段或衍生物的核酸。在一些实施方式中,CRISPR/Cas核酸内切酶或其衍生物来自CRISPR I型系统。在一些实施方式中,CRISPR/Cas核酸内切酶或其衍生物来自CRISPR II型系统。在一些实施方式中,CRISPR/Cas核酸内切酶或其衍生物来自CRISPR III型系统。在一些实施方式中,CRISPR/Cas核酸内切酶或其衍生物来自CRISPR IV型系统。在一些实施方式中,CRISPR/Cas核酸内切酶或其衍生物来自CRISPR V型系统。在一些实施方式中,CRISPR/Cas核酸内切酶或其衍生物来自CRISPR VI型系统。在一些实施方式中,CRISPR/Cas核酸内切酶或其衍生物来自CRISPR IIA型,IIB型或IIC型系统。在一些实施方式中,CRISPR/Cas核酸内切酶或其衍生物来自CRISPR IIC型系统。在一些实施方式中,II型CRISPR/Cas核酸内切酶是Cas9,或其衍生物。在一些实施方式中,CRISPR/Cas核酸内切酶或其衍生物是V型CRISPR/Cas核酸内切酶,例如Cpf1,或其衍生物。在一些实施方式中,定点修改多肽(site-directed modifying polypeptide)是III-B型Cmr复合物,例如衍生自极端嗜热菌(Pyrococcus furiosus),硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus),或嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的III-B型Cmr复合物。参见,例如,Hale,C.R.等《基因与发育》(Genes&Development),2014,28:2432–2443,和Makarova K.S.等《Nature Reviews Microbiology》(自然评论微生物学),2015,13,1–15。
在特定的实施方式中,基于CRISPR的试剂利用II型cas9核酸内切酶。在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂包含II型cas9核酸内切酶和另外的多核苷酸。在一些实施方式中,另外的多核苷酸是tracrRNA,crRNA(也称为“tracr-mate RNA”)和/或合成的单个向导RNA(sgRNA)。参见,例如,Jinek,M.等(2012)《科学》(Science),337,816–821。
在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂是缺乏切割双链DNA的能力的Cas蛋白。在一些实施方式中,Cas蛋白仅能够切割DNA的单链,即,Cas蛋白是“切口酶”。在一些实施方式中,Cas蛋白不能切割DNA的任何一条链。在一些实施方式中,Cas蛋白是已被突变的Cas9蛋白,使得它是切口酶或使得它缺乏切割DNA的任何一条链的能力。在一些实施方式中,Cas9蛋白具有D10A和/或H840A突变。在一些实施方式中,所述试剂是编码具有D10A和/或H840A突变的Cas9蛋白的多核苷酸。参见,例如,Cong L.等(2013)《科学》(Science),339,819–823;Jinek,M.等(2012)《科学》(Science),337,816–821;Gasiunas,G.等(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A,109,E2579–2586;和Mali,P.等(2013)《科学》(Science),339,823–826;每一个均在此通过引用全部并入本文。
在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂包含gRNA。在一些实施方式中,gRNA标靶PERV的核苷酸序列。在一些实施方式中,gRNA标靶在一种以上的PERV毒株中保留的(conserved)核苷酸序列。在一些实施方式中,gRNA标靶PERV pol,env,和/或gag基因。在一些实施方式中,gRNA标靶PERV pol基因。在一些实施方式中,gRNA标靶编码PERV pol基因的催化核心的序列。在一些实施方式中,gRNA标靶PERV pol基因的非催化核心区域。在一些实施方式中,PERV pol基因的非催化核心区域在PERV pol基因的催化核心区域的上游。
在一些实施方式中,gRNA包含SEQ ID NO:1–3或26–116中任一项核苷酸序列,片段或其任何品系特异性遗传变体(variant)。在特定的实施方式中,gRNA包含SEQ ID NO:1–3中任一项核苷酸序列,片段或其任何品系特异性遗传变体。在一些实施方式中,gRNA包含SEQ ID NO:1–3或26–181片段中任一项核苷酸序列(例如,原间隔子),组合或其任何品系特异性遗传变体。本领域技术人员能够很好地理解,基因组上的向导RNA切割位点由20bp的原间隔子组成,通常随后是3pb PAM序列(NGG,其中N可以是任何核苷酸),并且20bp的原间隔子用作与Cas9配对以进行基因组切割的向导RNA。众所周知,原间隔子的前1–3bp被截短(例如,截短的gRNA(“tru-gRNA”))可以实现类似的切割效果。参见,例如,Fu Y.等(2014)《自然》(Nature),32(3),279–284。对于tru-gRNA,如果gRNA最后的17–19bp相同且最开始的1–3bp被截短,则认为基因组靶标序列相同。在一些实施方式中,所述试剂包含至少三个向导RNA,其中所述三个向导RNA序列包含SEQ ID NO:1–3的核苷酸序列。在其他实施方式中,至少一个向导RNA包含SEQ ID NO:35,36,48,99,101,102,106,108,111,113中任一核苷酸序列,片段(例如,原间隔子),任何品系特异性遗传变体或其任何组合。
在一些实施方式中,所述试剂包含至少2个向导RNA,至少3个向导RNA,至少4个向导RNA,至少5个向导RNA,至少6个向导RNA,至少7个向导RNA,至少8个向导RNA,至少9个向导RNA,至少10个向导RNA,至少11个向导RNA,至少12个向导RNA,至少13个向导RNA,至少14个向导RNA,至少15个向导RNA,至少60个向导RNA,至少17个向导RNA,至少18个向导RNA,至少19个向导RNA,至少约20个向导RNA,至少约30个向导RNA,至少约40个向导RNA,至少约50个向导RNA,至少约60个向导RNA,至少约70个向导RNA,至少约80个向导RNA,至少约90个向导RNA,至少约100个向导RNA,或更多。
在一些实施方式中,所述试剂包含至少2个向导RNA。在一些实施方式中,使用至少2个向导RNA导致细胞中至少约30%,约35%,约40%,约45%,约50%,约55%,约60%,约65%,约70%,约75%,约80%,约85%,约90%,约95%,约96%,约97%,约98%,约99%或100%的PERV变得失活。在一些实施方式中,使用至少2个向导RNA导致细胞群体中至少约30%,约35%,约40%,约45%,约50%,约55%,约60%,约65%,约70%,约75%,约80%,约85%,约90%,约95%,约96%,约97%,约98%,约99%或100%的细胞中至少约95%,约96%,约97%,约98%,约99%或100%的PERV被灭活。向导RNA的非限制性组合包括,例如,下表中列出的组合。
在一些实施方式中,所述试剂包含至少3个向导RNA。在一些实施方式中,使用至少3个向导RNA导致细胞中约30%,约35%,约40%,约45%,约50%,约55%,约60%,约65%,约70%,约75%,约80%,约85%,约90%,约95%,约96%,约97%,约98%,约99%或100%的PERV变得失活。在一些实施方式中,使用至少3个向导RNA导致细胞群体中至少约30%,约35%,约40%,约45%,约50%,约55%,约60%,约65%,约70%,约75%,约80%,约85%,约90%,约95%,约96%,约97%,约98%,约99%或100%的细胞中至少95%,96%,97%,98%,99%或100%的PERV被灭活。向导RNA的非限制性组合包括,例如,下表中列出的组合。
在一些实施方式中,所述试剂包含至少4个向导RNA。在一些实施方式中,使用至少4个向导RNA导致细胞中约30%,约35%,约40%,约45%,约50%,约55%,约60%,约65%,约70%,约75%,约80%,约85%,约90%,约95%,约96%,约97%,约98%,约99%或100%的PERV变得失活。在一些实施方式中,使用至少4个向导RNA导致细胞群体中至少约30%,约35%,约40%,约45%,约50%,约55%,约60%,约65%,约70%,约75%,约80%,约85%,约90%,约95%,约96%,约97%,约98%,约99%或100%的细胞中至少95%,96%,97%,98%,99%或100%的PERV被灭活。向导RNA的非限制性组合包括,例如,下表中列出的组合。
在一些实施方式中,所述试剂包含至少5个向导RNA。在一些实施方式中,使用至少5个向导RNA导致细胞中约30%,约35%,约40%,约45%,约50%,约55%,约60%,约65%,约70%,约75%,约80%,约85%,约90%,约95%,约96%,约97%,约98%,约99%或100%的PERV变得失活。在一些实施方式中,使用至少5个向导RNA导致细胞群体中至少约30%,约35%,约40%,约45%,约50%,约55%,约60%,约65%,约70%,约75%,约80%,约85%,约90%,约95%,约96%,约97%,约98%,约99%或100%的细胞中至少95%,96%,97%,98%,99%或100%的PERV被灭活。向导RNA的非限制性组合包括,例如,下表中列出的组合。
在一些实施方式中,在PERV KO中使用至少2个向导RNA(例如,2至10个向导RNA)在PERV pol序列上产生缺失。在一些实施方式中,缺失大于1bp,大于2bp,大于3bp,大于4bp,大于5bp,大于6bp,大于7bp,大于8bp,大于9bp,大于约10bp,大于约15bp,大于约20bp,大于约25bp,大于约30bp,大于约35bp,大于约40bp,大于约45bp,大于约50bp,大于约55bp,大于约60bp,大于约65bp,大于约70bp,大于约75bp,大于约80bp,大于约85bp,大于约90bp,大于约95bp,大于约100bp,大于约125bp,大于约130bp,大于约135bp,大于约140bp,大于约145bp,大于约150bp,大于约200bp。
在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂的一个或多个部分衍生自包含内源性CRISPR系统的特定生物,例如化脓性链球菌,金黄色葡萄球菌,脑膜炎奈瑟球菌,嗜热链球菌或密螺旋体。
在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂是在此公开的任何基于CRISPR的多肽/蛋白和基于CRISPR的多核苷酸的组合。例如,在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂包含Cas核酸内切酶和向导RNA。在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂包含Cas核酸内切酶,tracrRNA和tracr-mate序列。在一些实施方式中,对tracrRNA和tracr-mate序列进行设计使得它们在同一分子中。在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂是编码任何前述物质的一个或多个多核苷酸。
在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂是嵌合RNA,例如CRISPR-Cas系统RNA。在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂具有至少一个第二向导序列,其能够与CRISPR-Cas系统的RNA序列或核酸分子杂交用于表达CRISPR-Cas复合物的组分以减少或消除系统或复合物的功能表达,从而系统或复合物可以自我失活;并且第二向导序列能够与用于表达CRISPR酶的核酸分子杂交。
在一些实施方式中,本公开提供了使用在此公开的任何基于CRISPR的试剂的方法。在一些实施方式中,本公开提供了通过利用在此公开的任何基于CRISPR的试剂来修改PERV多核苷酸序列的有效手段。本发明的CRISPR复合物具有广泛的用途,包括修改(例如,删除,失活)来自几种组织和器官的不同类型细胞中的PERV多核苷酸序列。如此,本发明的CRISPR复合物在例如基因或基因组编辑中具有广泛的应用。
在一些实施方式中,本公开提供了基因组编辑的体内方法,其包括提供大量的一种或多种载体,每一种均编码至少一种CRISPR蛋白和一种或多种向导RNA(gRNA),以及向哺乳动物施用一种或多种载体,其中一种或多种载体的体内表达包括CRISPR蛋白与和gRNA同源的PERV基因座的结合以及在哺乳动物细胞群体中体内产生双链断裂(DSB),其中DSB的体内同源重组(HR)导致了哺乳动物细胞群体的基因组的编辑。在一些实施方式中,CRISPR蛋白是cas9,并且一个或多个gRNA包含能够结合原间隔子相邻基序(“PAM”)的序列。在一些实施方式中,HR包括引入在PERV基因座表达的蛋白的错义或无义的非同源末端连接(NHEJ)。
在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂还包含调节PERV表达的部分。在一些实施方式中,基于CRISPR的试剂是包含转录阻遏物结构域的融合蛋白。在一些实施方式中,转录阻遏物结构域是Krüppel相关盒(KRAB)。
D.改善基因修改的细胞的健康/存活
在一些实施方式中,在此所述的任何基因修改的猪细胞的健康和/或存活由于基因修改过程(例如,多重DNA损伤作用)而受到损害。在这些情况下,用一种或多种改善基因修改的细胞的健康和/或存活的因子处理基因修改的细胞是有利的。
在一些实施方式中,对基因修改的一个或多个细胞施用p53抑制剂和生长因子这两者。在一些实施方式中,对基因修改的一个或多个细胞施用bFGF和pifithrin-alpha这两者。
Ⅳ.处理方法
在一些实施方式中,在此公开的任何基因修改的猪细胞,组织或器官均可用于处理非猪受试者。在一些实施方式中,本公开提供了将在此所述的任何基因修改的细胞,组织或器官移植到有此需要的非猪受试者中的方法。在一些实施方式中,非猪受试者是人。在一些实施方式中,受试者是非人灵长类动物。
在一些实施方式中,用于在此公开的任何方法中的基因修改的器官可以选自基因修改的猪的心脏,肺,脑,肝,基底神经节,脑干髓质,中脑,脑桥,小脑,大脑皮层,下丘脑,眼睛,垂体,甲状腺,甲状旁腺,食道,胸腺,肾上腺,阑尾,膀胱,胆囊,小肠,大肠,小肠,肾脏,胰腺,脾脏,胃,皮肤,前列腺,睾丸,卵巢和/或子宫。在一些实施方式中,用于在此公开的任何方法中的基因修改的组织可以选自软骨(例如,食道软骨,膝关节软骨,耳软骨,鼻软骨),肌肉,例如,但不限于基因修改的猪的平滑肌和心脏(例如心脏瓣膜),肌腱,韧带,骨骼(例如骨髓),角膜,中耳和静脉。在一些实施方式中,用于在此公开的任何方法中的基因修改的细胞包括血细胞,皮肤毛囊,头发毛囊,和/或干细胞。本发明的组合物也可以施用于器官或组织的任何部分(例如,眼睛的一部分,例如角膜)。
在一些实施方式中,本公开提供了用于治疗患有导致器官,组织或细胞功能受损,缺陷或缺失的疾病,失调或损伤的受试者的方法。在一些实施方式中,受试者遭受了损伤或创伤(例如,汽车事故),导致受试者的一个或多个细胞,组织或器官受损。在一些实施方式中,受试者遭受火或酸烧伤。在一些实施方式中,受试者患有导致器官,组织或细胞功能受损,缺陷或缺失的疾病或失调。在一些实施方式中,受试者患有自身免疫性疾病。在一些实施方式中,该疾病选自:心脏病(例如动脉粥样硬化),扩张型心肌病,严重冠状动脉疾病,瘢痕心脏组织,心脏先天缺陷,I型或II型糖尿病,肝炎,囊性纤维化,肝硬化,肾衰竭,狼疮,硬皮病,IgA肾病,多囊肾,心肌梗塞,肺气肿,慢性支气管炎,闭塞性毛细支气管炎,肺动脉高压,先天性横膈疝气,先天性表面活性蛋白B缺乏症,和先天性囊性肺气肿性肺病,原发性胆汁性胆管炎,硬化性胆管炎,胆道闭锁,酒精中毒,威尔森氏症,血色素沉着病,和/或α-1抗胰蛋白酶缺乏症。
在一些实施方式中,本公开的任何基因修改的细胞,组织和/或器官均与基因修改的供体猪分离,并施用于非猪受试者宿主中。在本文中使用的“施用(Administering)”或“施用(administration)”包括但不限于引入,施加,注射,植入,移植(grafting),缝合和移植(transplanting)。根据本公开,可以通过使本发明的器官,组织,细胞或组合物定位在所需位点的方法或途径来施用基因修改的细胞,组织和/或器官。可以通过任何能够将细胞递送至受试者中至少一部分细胞保持活力的期望位置的合适途径将本发明的器官,组织,细胞或组合物施用于受试者。在一些实施方式中,至少10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,或100%的细胞(无论是单独施用还是作为组织或器官的一部分施用)在施用于受试者后仍然保持活力。施用本发明的器官,组织,细胞或组合物的方法是本领域众所周知的。在一些实施方式中,将细胞,组织和/或器官移植到宿主中。在一些实施方式中,将细胞,组织和/或器官注射到宿主中。在一些实施方式中,将细胞,组织和/或器官移植到宿主表面(例如,骨骼或皮肤)。
在一些实施方式中,有必要保护基因修改的细胞,组织或器官免受基因修改的细胞,组织或器官所针对的宿主的免疫系统的影响。例如,在一些实施方式中,基因修改的细胞,组织或器官与基质或涂层(例如明胶)共同施用以保护基因修改的细胞,组织或器官免受来自宿主的免疫应答。在一些实施方式中,基质或涂层是可生物降解的基质或涂层。在一些实施方式中,基质或涂层是天然的。在其他实施方式中,基质或涂层是合成的。
在一些实施方式中,将基因修改的细胞,组织或器官与免疫抑制化合物一起施用。在一些实施方式中,免疫抑制化合物是小分子,肽,抗体,和/或核酸(例如,反义或siRNA分子)。在一些实施方式中,免疫抑制化合物是小分子。在一些实施方式中,小分子是类固醇,mTOR抑制剂,钙调神经磷酸酶抑制剂,抗增殖剂或IMDH抑制剂。在一些实施方式中,小分子选自皮质类固醇(例如,泼尼松,布地奈德,泼尼松龙),钙调神经磷酸酶抑制剂(例如,环孢素,他克莫司),mTOR抑制剂(例如,西罗莫司,依维莫司),IMDH抑制剂(硫唑嘌呤,来氟米特,霉酚酸酯),抗生素(例如,放线菌素,蒽环类,丝裂霉素C,博来霉素,光神霉素)和甲氨蝶呤,或其盐或衍生物。在一些实施方式中,免疫抑制化合物是选自以下的多肽:CTLA4,抗b7抗体,阿巴西普,阿达木单抗,阿那白滞素,赛妥珠单抗,依那西普,戈利木单抗,英夫利西单抗,伊西贝单抗(ixekizumab),那他珠单抗,利妥昔单抗,塞科银单抗(seckinumab),托珠单抗,尤特克单抗,维多珠单抗,巴利昔单抗,达利珠单抗,和莫罗单抗。
在一些实施方式中,对受试者施用的基因修改的细胞,组织或器官已被进一步基因修改,使得它们不太可能在受试者中诱导免疫应答。在一些实施方式中,基因修改的细胞,组织或器官已被进一步基因修改,使得它们不表达功能性免疫刺激分子。
实施例
现在总体上描述了本公开,通过参考以下实施例将更容易理解本公开,仅出于说明本公开的某些方面和实施方式的目的而包括这些示例,无意于限制本公开。例如,本文公开的特定构建体和实验设计代表用于验证适当功能的示例性工具和方法。这样,容易显而易见的是,任何公开的具体构建体和实验计划都可以在本公开的范围内被替代。
实施例1.人细胞中的PERV感染,复制和繁殖
临床医生曾经担心,猪供体器官或组织中存在的PERV可能感染人宿主的细胞。为了确定PERV是否在感染后仍在人细胞中保持活性并繁殖,对PERV感染的HEK293T-GFP细胞(i-HEK293T-GFP)的群体和克隆中的PERV拷贝数均进行了超过4个月的监控。通过液滴数字PCR(ddPCR)确定,PERV拷贝数随时间增加(图1A)。PERV有三种主要的亚型:PERV-A,PERV-B,和PERV-C。亚型A和B普遍存在,据报道可从猪传递给人,而亚型C仅存在于某些猪品系中,并且只能在猪之间传递(Patience等,2001;J.Virol.,75,2771–5)。与以前的报道一致,在被感染的人细胞中检测到PERV-A和PERV–B(数据未示出),证实它们是人趋向性的。但是,在PK15或i-HEK293T-GFP细胞中均未检测到PERV-C(数据未示出)。为了确定PERV是整合到人类基因组中还是在感染的人细胞中保持为游离型(episomal),对感染的克隆的i-HEK293T-GFP细胞进行了连接(junction)捕获测序。在人基因组中检测到新型PERV连接。这些PERV连接在基因内区域(22个检测到的连接中的15个)中过多(overrepresented)(图1B)。另外,与随机选择的基因组位置相比,PERV插入位点具有明显更高的转录水平,DNase敏感性,和H3K27乙酰化作用(图4B),表明PERV倾向于整合到转录活性区域中。
为了确定i-HEK293T-GFP克隆中PERV的拷贝数的增加是否由细胞内PERV复制或在人细胞之间的细胞间PERV传递所致,将克隆的i-HEK293T-GFP细胞与WT HEK293T细胞共培养两周。随后通过PCR在共培养的WT克隆中评估PERV部分(图1C和1D)。在没有与猪细胞的接触史的WT HEK293细胞中检测到PERV pol,env,和gag基因的存在。感染的WT HEK293T细胞的百分比从18%到97%不等,较低和较高的百分比分别对应于共培养中亲本(parent)i-HEK293T-GFP克隆中较低和较高的PERV拷贝数(图1E)。这些结果表明,感染的人细胞可将PERV传递给新鲜的人细胞群体。因此,在异种移植的情况下,存在将PERV传递给人宿主的风险,这证实了需要通过生产无PERV的猪来消除这种风险。
实施例2.无PERV的原代猪细胞
无PERV的猪的产生涉及缺乏PERV活性的原代猪细胞的生产,可通过体细胞核转移(SCNT)将其克隆以产生猪胚胎。选择猪胎儿成纤维细胞系(FFF3)进行修改以产生无PERV的原代猪细胞。首先,对存在于FFF3基因组中的PERV进行位置确定(map)和表征。通过对逆转录酶(pol)基因的ddPCR确定,功能性PERV的拷贝数估计为约25(数据未示出)。估计的PERV拷贝数接近于基因组中鉴定出的10份PERV-A env基因拷贝,14份PERV-B env基因拷贝,和0份PERV-C env基因拷贝的总和(数据未示出)。使用全基因组测序,检测到一份截短的PERV-B拷贝。先前无法通过ddPCR检测到该截短的PERV-B(数据未示出)。
PERV特异性杂交捕获后,进行PacBio长读基因组测序(N50=2,439bp)。结果确定了21个PERV拷贝的位置在基因组的非重复区域中(图2A)。还有两个拷贝的位置确定在重复区域中,而2个未能在当前的猪基因组装配中确定(11%缺口,Sus scrofa build 10.2)(Groenen等2012,《自然》(Nature),491:393–8)。为了标靶这些PERV以使其失活,设计了对PERV pol基因的催化核心具有特异性的三个CRISPR向导RNA(gRNA),其分别具有SEQ IDNO:1-3的序列。用CRISPR-Cas9和三个gRNA处理FFF3细胞群体12天后,37%的PERV pol基因座获得了失活突变。有趣的是,结果显示了单个细胞之间靶向效率的双峰分布。约34%(23个中的8个)单个细胞具有高编辑效率(>90%),而60%(23个中的14个)的单个细胞具有低编辑效率(<20%)。推测这是针对重复序列靶向(targeting)的基因转化的结果(Yang等2015,科学(Science),80:350)。出乎意料的是,尽管群体中存在高度修改的细胞,但上述程序并未高效地产生任何单个细胞FFF3克隆(图2B)。
为了确定Cas9在FFF3基因组的多个位点同时进行的DNA裂解(cleavage)是否可以触发DNA损伤诱导的衰老或凋亡,检查了对衰老和/或凋亡通路的抑制,以确定它们是否可以提高FFF3群体中的靶向效率并增强高度修改的克隆的活力。在基因修改过程中使用包含p53抑制剂,fithrthrin alpha(PFTα),和生长因子bFGF的混合物显著提高了所得FFF3群体的平均靶向效率(图5A(ANOVA,p=0.00002),图5B)。此外,瞬时过表达SV40大T抗原(p53和Rb途径这两者的抑制剂)也带来了平均靶向效率的提高(图6A,单方Wilcoxon测试,p=0.05)。相反,细胞凋亡抑制剂Bcl-2的过表达并没有增加平均靶向效率(图5C,ANOVA,p=0.565)。使用PFTα和bFGF混合物是因为其更高的效率,更低的细胞毒性,且易于控制。使用这种优化的混合物,从用CRISPR-Cas9处理的群体中分离出100%PERV失活的FFF3细胞(图2C,2D)。
在100%PERV失活的FFF3克隆上进行RNA-seq(图7)。结果证实所有pol转录物均已突变。此外,检查了PERV pol的全基因组破坏的影响及其在从FFF3进行PERV体外生产中的作用。在100%PERV失活的FFF3的细胞培养上清液中未检测到PERV的逆转录酶(RT)活性(图2E)。此外,在WT FFF3中观察到强的RT活性,表明修改的细胞产生很少的或不产生PERV颗粒。
为了检查CRISPR-Cas9在100%PERV灭活的细胞中的脱靶作用,进行了核型分析。核型分析结果显示正常的染色体结构(数据未示出)。为了以更高的分辨率检查染色体完整性,进行了连接PCR反应以检查一侧的所有PERV基因组连接的完整性,这些连接在PERV-PERV删除中会丢失。所有测试的连接均保持完整,这表明在这些区域中未检测到PERV-PERV删除。连接PCR反应中使用的引物如图8所示。因此,在100%PERV灭活的FFF3中,没有检测到由CRISPR-Cas9引起的脱靶作用或中靶基因组损伤。
实施例3.无PERV胚胎
获得了具有100%根除了PERV活性的FFF3细胞后,再使用SCNT产生无PERV的胚胎。使用手工猪克隆(Du等.2007,Theriogenology,68:1104–10),成功克隆了效率为50–78%的猪胚胎。这些胚胎在培养中生长7天,并达到了胚泡期。观察到正常的胚泡结构。此外,在第7天验证了内部细胞群(cell mass)(SOX2+)的多能性(图3A)。
使用无PERV的FFF3细胞系,通过体细胞核转移进行了额外一轮的猪克隆,并植入了代孕母体(surrogate mother)中(移植了250个胚胎)。胚胎移植后第49天,通过剖腹术(C-section)从一只代孕母猪(surrogate sow)收集胎儿。从母猪中分离出四个活胎儿。通过ddPCR检查PERV的失活水平和PERV拷贝数。结果表明,从无PERV的细胞系产生的胎儿中没有PERV的再感染(图3B)。胎儿表现出与其原始的无PERV细胞系相同的PERV失活效率(100%,图3B)和PERV拷贝数(数据未示出)。使用源自无PERV胎儿的细胞系进行第二轮猪克隆。
实施例4.无PERV的仔猪
将通过SCNT从100%根除了PERV活性的FFF3中产生的无PERV胚胎植入代孕母体(250个胚胎转移/母猪)。胎儿基因组DNA用于测量PERV失活效率。与原始的无PERV细胞系相似,PERV-KO胎儿也显示出约100%的PERV失活效率,这表明在妊娠期间未发生来自代孕母猪的再感染。(图16A和16B)。出人意料的是,即使有多个基因编辑,三个月,三周和三天后,出生的仔猪也完全没有PERV(图9和10)。已生产了16只无PERV的仔猪,其中3只通过剖腹术出生,13只通过自然分娩出生,而该13只中有2只死于自然分娩难产。从所有仔猪中分离出DNA,并从死亡仔猪的不同组织中提取mRNA,通过深度测序检查了剖腹术和自然分娩的仔猪的PERV再感染,结果表明所有仔猪在基因组DNA和mRNA水平上均显示了100%的PERV根除。此外,保持在设施中的带有WT的仔猪没有再感染(图17)。所有无PERV的猪均表现出与WTFFF3细胞相似的PERV拷贝数(图19)和正常的核型(图20)。
综上所述,该数据明确地确定了猪细胞在体外将PERV传递给原代人细胞。该研究的一个惊人的观察结果是,感染PERV的人细胞将使PERV稳健地传递给没有与猪细胞接触史的新鲜人细胞。因此,可以预见在进行人异种移植试验之前,有必要消除PERV传递的风险。这些研究证明了可克隆的原代猪成纤维细胞中PERV活性的完全根除。此外,还证明了使用修改的成纤维细胞生产PERV灭活的猪胚胎,胎儿和仔猪,并且不存在代孕母体的再感染。无PERV的猪是第一批缺乏活性内源性逆转录病毒的哺乳动物,可以深入了解这些部分与宿主的生物学功能。最重要的是,无PERV的猪可作为猪到人异种移植的器官和组织的安全来源。由于严重缺乏用于移植的器官对于器官衰竭的医学治疗是一个严峻的挑战,这将是非常重要且期待已久的生物医学进展。
方法
CRISPR-cas9 gRNAs设计
使用R库DECIPHER来设计具有SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列的特定gRNA。
细胞培养
猪PK15和人HEK293T细胞保持在含有补充了10%胎牛血清(英杰公司(Invitrogen)),和1%青霉素/链霉素(Pen/Strep,Invitrogen)的丙酮酸钠的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM,Invitrogen)高葡萄糖中。将所有细胞维持于37℃和5%CO2的加湿培养箱中。
将猪胎儿成纤维细胞FFF3保持在含有补充了15%胎牛血清(Invitrogen),1%青霉素/链霉素(Pen/Strep,Invitrogen)和1%HEPES(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific))的丙酮酸钠的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM,Invitrogen)高葡萄糖中。将所有细胞于38℃和5%CO2,90%N2,和5%O2保持在加湿三气培养箱中。
PiggyBac-Cas9/2gRNAs构件和细胞系建立
与Yang等人,2015,Science,80:350先前描述的程序相似,合成了编码U6-gRNA1-U6-gRNA2(Genewiz)的DNA片段,并将其导入到先前构建的PiggyBac-cas9质粒中。为了建立整合有PiggyBac-Cas9/2gRNAs的FFF3细胞系,使用Neon转染系统按照市售试剂盒(ThermoFisher Scientific)中的说明用16μg PiggyBac-Cas9/2gRNAs质粒和4μg Super PiggyBac转座酶质粒(System Biosciences)转染5×105FFF3细胞。为了选择携带整合的构建体的细胞,将2μg/mL的嘌呤霉素施用于转染的细胞。基于将嘌呤霉素应用于野生型FFF3细胞的阴性对照,确定了嘌呤霉素的选择在4天内完成。此后用2μg/mL嘌呤霉素维持FFF3-PiggyBac细胞系,并施用2μg/ml强力霉素以诱导强力霉素可诱导的FFF3-PiggyBac细胞系的Cas9表达。
为避免在FFF3细胞系中与Cas9一致的表达,通过使用Lipofectamine 2000试剂用3μg仅切除PiggyBac的Transposase载体转染5×105细胞,从FFF3基因组中切除了PiggyBac-Cas9/2gRNA。然后,将经过PiggyBac-Cas9/2gRNA切除的FFF3细胞以单个细胞分选到96孔板中,以进行克隆生长和基因分型。
单个细胞克隆的基因分型
首先,进行嘌呤霉素选择,然后在FFF3PiggyBac-Cas9/2gRNA细胞系上进行PiggyBac切除。接着将细胞以单个细胞分选到96孔PCR板中进行直接基因分型,以及分选到96孔细胞培养板中进行集落生长。
为了对没有克隆扩增的单个FF细胞进行基因分型,根据先前报道的单个细胞基因分型方案,直接对来自分选的单个细胞的PERV基因座进行扩增。简言之,将单个细胞分选到96孔PCR板中,每个孔载有5μl的裂解混合物,其包含0.5μl的10X KAPA表达提取缓冲液(KAPA Biosystems),0.1μl的1U/μl KAPA表达提取酶和4.6μl的水。将裂解反应物(reaction)于75℃孵育15分钟,然后将反应物于95℃灭活5分钟。接着将所有反应物添加到20μl PCR反应中,其中包含1×KAPA 2G fast(KAPA Biosystems),0.2μM PERV依诺米那(Illumina)引物(方法表2)。将反应物于95℃孵育3分钟,然后以95℃,20s;59℃,20s和72℃,10s进行25个循环。为了添加Illumina序列接头(adaptor),接着将3μl反应产物添加到20μl PCR混合物中,该混合物包含1×KAPA 2G fast(KAPA Biosystems)和0.3μM带有Illumina序列连接物的引物。将反应物于95℃孵育3分钟,然后以95℃,20s;59℃,20s和72℃,10s进行10个循环。在EX 2%凝胶(Invitrogen)上检查PCR产物,然后从凝胶回收300-400bp产物。接着将这些产物以大致相同的量混合,纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒),并用MiSeq个人测序仪(Personal Sequencer)(Illumina)进行测序。分析了深度测序数据,并确定了使用CRISPR-GA的PERV编辑效率(Denner等人,2016,Viruses,8:215)。
PERV pol基因分型中使用的引物
Illumina_PERV_pol正向(forward):
5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCGACTGCCCCAAGGGTTCAA-3’(SEQ IDNO:4)
Illumina_PERV_pol反向(reverse):
5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTCTCCTGCAAATCTGGGCC-3’(SEQ IDNO:5)
PK15 WT到GFP-HEK293T以及GFP-HEK293T到WT HEK293T的PERV感染性测试
1)PK15 WT到GFP-HEK293T的PERV感染性测试
该程序类似于Yang等人在2015年Science,80:350中描述的过程。简言之,将1×105细胞的Lenti-GFP-HEK293T细胞和1×105PK15 WT细胞在10cm培养皿中一起共培养并生长一周。通过流式细胞术进行有序的细胞分选以获得高纯度GFP阳性GFP-HEK293T细胞。将GFP-HEK293T细胞按体积分选并培养125天。在不同时间点(d76,d80,和d125)从细胞中分离基因组DNA,以通过ddPCR检测PERV拷贝数是否随时间增加。在不同的时间点对批细胞(bulkcell)进行单个细胞分选。在单个细胞长成克隆后,首先通过PCR检查某些克隆的PERV感染,然后通过ddPCR量化PERV感染的克隆的PERV拷贝数。
2)GFP-HEK293T到WT HEK293T的PERV感染性测试
为了测试PERV是否可以从人传递到人细胞,将PERV感染的HEK293T-GFP(i-HEK293T-GFP)克隆的1×105细胞与WT HEK293T的1×105细胞共培养2周,然后GFP阴性单个细胞通过流式细胞术分选。在单个细胞长成克隆后,通过PCR检查PERV感染以检测不同的i-HEK293T-GFP克隆的感染率。特别地,使用ddPCR检测到的i-HEK293T-GFP克隆10的拷贝数作为标准标记物,通过qPCR定量与i-HEK293T-GFP克隆10共培养的GFP阴性克隆的PERV拷贝数。
逆转录酶(RT)实验
RT实验与Yang等人在2015年Science,80:350中先前描述的方案相同。简言之,为了测试FFF3野生型细胞和100%修改的FFF3克隆的RT活性,将5×105细胞接种在10cmPetri培养皿中,并在细胞达到80%融汇度(confluency)后收集上清液。首先将培养基以400g离心4分钟以除去细胞和碎片,然后用0.45μM Millex-HV注射器过滤器(EMDMillipore Corporation)过滤。使用Amicon Ultra-15离心过滤单元(EMD MilliporeCorporation)将过滤的上清液以4000g浓缩10分钟。然后将浓缩的上清液以50,000rpm超离心60分钟。小心地除去上清液,并将病毒颗粒(virus pellet)完全重悬并于37°用20μl的10%NP40裂解60分钟。使用Omniscript RT试剂盒(Qiagen)进行RT反应。反应物的总体积为20μl,其包含1×RT缓冲液,0.5mM dNTP,0.5μM流感反向引物(5’CTGCATGACCAGGGTTTATG3’)(SEQ ID NO:6),100单位的RnaseOUT(Life Technology,Invitrogen),100单位的SuperRnase抑制剂(Life Technologies(生命技术公司)),5μl样品裂解物和40ng的IDT合成的流感RNA模板,其在5'和3'端均耐受Rnase。RNA模板序列为:5’rA*rA*rC*rA*rU*rGrGrArArCrCrUrUrUrGrGrCrCrCrUrGrUrUrCrArUrUrUrUrArGrArArArUrCrArArGrUrCrArArGrArUrArCrGrCrArGrArArGrArGrUrArGrArCrArUrArArArCrCrCrUrGrGrUrCrArUrGrCrArGrArCrCrU*rC*rA*rG*rU*rG 3’(*磷酸二酯键)(SEQ ID NO:7)。RT反应完成后,使用流感正向(5’ACCTTTGGCCCTGTTCATTT 3’)(SEQ ID NO:8)和流感反向引物(序列如上所示)通过PCR检查RT产物。扩增子的预期大小为72bp。
PERV拷贝数定量
如Yang等人在2015年Science,80:350中所述,根据制造商的说明(BioRad),使用液滴电子PCRTM(ddPCRTM)用于定量PERV的拷贝数。简言之,从培养的细胞中提取基因组DNA(DNeasy血液与组织试剂盒,Qiagen),并用MseI(10U)于37℃将50ng基因组DNA消化3小时,然后于65℃灭活10分钟。然后制备ddPCR反应物。反应混合物包含1×ddPCR预混液,1μl的18μM目标引物&5μM目标探针(VIC),1μl 18μM参考引物&5μM参考探针(FAM),5ng消化的DNA,和水,总体积为20μL。引物序列和探针信息可在扩展数据表1中找到。
用QX100 Droplet Generator产生液滴后,将液滴小心地转移到96孔PCR板中,并使用Biorad PCR机器进行如下的热循环:95℃ 10分钟的酶活化,然后40个循环的94℃ 30秒变性和60℃ 1分钟的接合(annealing)/延伸(升温速率2℃/秒),然后是98℃ 10分钟的酶失活。
热循环后,将96孔板置于Biorad Droplet Reader中,并使用QunataSoftSoftware设置实验设计并读取实验。程序完成后,根据制造商的说明(BioRad)通过门控分析了结果。
方法表1-ddPCR实验中使用的引物
名称序列
靶向效率计算
如先前Yang等人所述(6),建立了一个自定义管线来估计PERV灭活的效率。简言之,使用PE250或PE300通过Illumina次代测测序对pol基因进行扩增和测序。首先,将使用PEAR(15)的两个重叠读段合并并使用BLAT确定在参考区域中的位置。确定位置后,将读数分组为包含单倍型,和插入缺失型的特定组合的集合。代表量低于位置确定读取总数的0.5%的读取集合被丢弃。最后,如Güell等人(16)所述,解析位置确定输出以调用不同的插入和删除。
PERV-人连接捕获
通过标准反向PCR方案确定高度感染的i-HEK293-GFP克隆中的PERV插入位点。这些克隆的基因组DNA通过Sau3AI消化而片段化,并在低DNA浓度下使用T4 DNA连接酶(NEB)自连接。然后,使用下面显示的PERV LTR上的引物通过PCR扩增包含PERV-人连接的片段。PCR产物是使用PCR Blunt TOPO试剂盒(Thermo Fisher)的亚克隆,并进行了Sanger测序。使用USCS基因组浏览器(Genome Browser)将与PERV LTR紧邻的序列与人基因组进行比对。使用连接PCR和Sanger测序验证了人基因中的命中的一部分。
SEQ ID NO:24--PERV_LTR_F:ATGCCCCCGAATTCCAGA
SEQ ID NO:25--PERV_LTR_R:GGTTAGGTTGCATTTTCATCCTT
手工(Handmade)克隆以产生SCNT猪胚胎
除另有说明外,所有化学品均购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)。手工克隆(HMC)是基于Du等人在Theriogenology,68:1104-10中描述的方法。简言之,从屠宰场获得猪卵巢,并从大卵泡中收集卵丘卵母细胞复合物(COC)。然后在含有400uL碳酸氢盐缓冲的补充有10%猪卵泡液,10%胎牛血清(Gibco,Thermo Fisher Scientific),10IU/mL妊娠母马血清促性腺激素(PMSG)和5IU/mL人绒毛膜促性腺激素(hCG)的M199培养基(Gibco,Thermo Fisher Scientific)的四孔培养皿(Nunc,Thermo Fisher Scientific)中于矿物油下进行猪卵母细胞的体外成熟,并以38.5℃于加湿空气中的5%CO2,5%O2和90%N2中孵育42~43小时。成熟后,在含有1mg/ml透明质酸酶的HEPES缓冲的M199中重复移液,然后在T2(HEPES缓冲的M199,含2%FBS)液滴中进行卵母细胞洗涤,藉此去除COC的卵丘细胞。从这一点开始,所有操作均在调节至39℃的加热台上进行。溶液液滴(20ul/滴)在60-mm的Petri培养皿盖(Corning,Thermo Fisher Scientific)上制成,并用矿物油覆盖。卵母细胞的转移通过使用精细拉制并经火抛光的玻璃移液管进行。将卵母细胞放入链霉蛋白酶液滴(3.3mg/mL)并消化约1分钟,直到卵母细胞变形,然后在T2和T20(HEPES缓冲的M199,含20%FBS)液滴中连续洗涤,在洗涤过程中除去了卵母细胞的透明带。然后将无透明带卵母细胞排列在含有2.5ug/ml细胞松弛素B(CB)的T20液滴中。卵母细胞去核由极体位置引导,并在带有超锋利分割刀片(Ultra Sharp Splitting Blades)(Shearer Precision ProductsLLC,Pullman,WA)的立体显微镜下手动进行,以去除1/3卵母细胞的细胞质,然后将去核了的卵母细胞放入T2液滴以进行下一步融合。为了进行卵母细胞-体细胞融合,通过使用0.25%的胰蛋白酶分离100%PERV-KO FFF3成纤维细胞,并用T10(HEPES缓冲的M199,含10%FBS)中和并过滤以得到分离的单个细胞。同时,在35mm的Petri培养皿盖(Corning,Thermo Fisher Scientific)上制备用于融合的溶液液滴,将去核的称作细胞质的卵母细胞和1~5μl的体细胞置于不同的T10液滴中。将细胞质分别转移到0.4mg/mL的植物血凝素(PHA-P)中2-3s,然后迅速滴至沉降在T10液滴底部的单个细胞上。附着后,在含有0.3M甘露醇和5μm聚乙烯醇(PVA)的猪融合培养基(pFM)液滴中拾取并平衡细胞质-细胞对,然后转移至覆盖有500μL pFM溶液的融合室。融合室包含直径为0.5mm且间距为0.8mm的平行铂丝。
使用2V的交流电(AC)(细胞融合(CELLFUSION):BLS CF-150/BSP,BLS Ltd.,匈牙利),将线对(pair)连接到负极线,使体细胞离该线最远,然后用100V的单一直流电流(DC)脉冲熔合9μs。然后小心移除该线对,并在T10中孵育1小时以使体细胞完全融合到细胞质中。重复相同的步骤进行细胞质与体细胞的更多融合。
然后将上述融合了的线对与另一未融合的细胞质融合。同样地,将未融合的细胞质转移到覆盖有500μL牛融合培养基(bFM)的融合室中,其中含有0.3M甘露醇,5μm PVA,1mMMgSO4和0.5mM CaCl2。使用相同的2V AC将未融合的细胞质附着至负极线,然后将融合了的线对放置在细胞质的另一侧,该线对离负极线最远。施加一个80μs的43V DC的单脉冲,以融合胞质对三联体。然后将三联体(即构建的胚胎)置于T10液滴中约10分钟以使细胞质完全融合。在第二次融合之后进行化学活化。将构建的胚胎在补充有5μg/ml CB和10μg/ml环己酰亚胺(CX)的400μL PZM3溶液(Guell等人,2014,Bioinformatics,30:2968-2970)中孵育4小时,并用矿物油覆盖,然后在PZM3中洗涤胚胎,并转移至孔(WOW)系统的孔中,该系统包含由在4孔皿的底部上的聚集针DN-09/B(BLS Ltd.,匈牙利)制成的小U底孔。然后将WOW系统中的构建的胚胎于38.5℃在5%CO2,5%O2,和90%N2的加湿三气培养箱中孵育7天以形成胚泡形式,并评估每个重建的胚胎的胚泡率。
免疫染色
根据制造商的说明,将第7天的猪胚泡固定并使用多能干细胞4标记免疫细胞化学试剂盒(分子探针(Molecular Probes)A24881)进行染色。但是,该试剂盒提供的抗体被替换为与Alexa Fluor 647(Invitrogen A-21446)偶联的山羊抗猪抗SOX2主抗体(sc-17320)和兔抗山羊IgG二抗。在成像前五分钟应用Live试剂(分子探针R37605)和鬼笔环肽(A22282)。胚胎染色中使用的抗体的最终浓度对于抗SOX2是1:100,对于兔抗山羊IgG是1:200,对于鬼笔环肽是1:40,对于NucBlue是1:100。
共聚焦显微镜
将胚泡转移至μ-皿35mm中的微型插入4孔的孔(Ibidi 80406)中,并使用具有10倍水物镜的Leica TCS SP5共聚焦激光扫描显微镜成像。组合使用Imaris和Fiji软件对图像进行裁剪,分割,和对比增强。
实施例5.具有SCNT所需基因型的单个细胞克隆
在CRISPR/cas9基因编辑后,将细胞群体以单个细胞分选到96孔板中,并在补充有4.5g/L D-葡萄糖,110mg/丙酮酸钠,GlutaMax以及5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(13256029,Thermo Fisher Scientific)和10ng/ml环状pifithrin-α氢溴酸盐(cPFT-α)(一种P53抑制剂)(P4236,Sigma)的DMEM中生长约14天。然后从单个细胞克隆中分离基因组DNA并进行基因分型。接着,将所需克隆扩增并在上述培养条件下培养。该策略产生具有所需基因型的克隆,但由于细胞倍增次数太多,细胞活力可能欠佳。但是,在培养基中添加bFGF和cPFT-α将显著提高细胞活力。
实施例6.针对SCNT的批量细胞修改
基因编辑后,修改的细胞通过抗体结合或珠选择而富集,富集的细胞群体无需经过单个细胞分选程序即可直接用于SCNT。图24。该策略减少细胞培养时间,并避免细胞变得过老且通常缺乏活力。
实施例7:体内修改
对于体外基因编辑,在细胞培养和转染程序中,尤其是多重编辑时,通常难以避免细胞损伤。因此,开发了一种体内显微注射方法,用于将CRISPR/cas9递送至猪受精卵,以获得嵌合体胎儿。图25。收获30天大的胎儿并提取细胞。接着,将单个细胞分类并基因分型为单个细胞克隆。扩增所需的克隆并用于SCNT。该策略避免了体外转染程序,并且细胞保留充分的活力。如图30所示,重新克隆显著增加了产仔数(liter size),并且还显示了存活率的提高,尽管增加并不显著。
实施例8:卵母细胞收集和体内成熟(IVM)
来自性成熟小母猪或母猪的卵巢用于分离卵母细胞复合物(COC)。如R.Tomii等人,J.Reprod.Dev.55,121–7(2009)中所述进行卵母细胞收集和IVM培养。挑出被多层(至少三层)卵丘细胞包围的卵母细胞,在IVM培养基中于38.5℃的5%CO2,5%O2和90%N2大气氛下以饱和湿度进行约42-44h的体外成熟。
实施例9:体细胞核转移(SCNT)
如先前由H.Wei等人,PLoS One.8,e57728(2013)所述进行SCNT。通过用0.1%(w/v)透明质酸酶处理,从培养的COC除去卵丘细胞。用斜口移液管在TLH-PVA中轻轻吸取而除去卵母细胞和邻近细胞质中包含的第一极体。将来自GTKO/hCD55/hCD59阳性成纤维细胞系的供体细胞插入去核卵母细胞的卵周隙。使用电细胞融合产生器(Electro Cell FusionGenerator)(LF201,NEPA GENE Co.,Ltd.,日本)在融合培养基(0.25M D-山梨醇,0.05mMMg(C2H3O2)2,20mg/mL BSA和0.5mM HEPES[无酸])中用200V/mm的单直流脉冲将重建的胚胎融合20μs。然后,将胚胎在PZM-3中培养0.5-1h,并在包含0.25M D-山梨醇,0.01mM Ca(C2H3O2)2,0.05mM Mg(C2H3O2)2和0.1mg/mL BSA的激活介质中以150V/mm的单脉冲激活100ms。将胚胎在补充有5μg/mL细胞松弛素B的PZM-3中于38.5℃的5%CO2,5%O2和90%N2的加湿气氛(APM-30D,ASTEC,日本)中平衡2h,然后在与上述相同的培养条件下在PZM-3培养基中进行培养,直至胚胎转移。
实施例10:胚胎转移
为了进行胚胎转移,选择具有至少一个生育史和良好产仔数的母猪作为代孕母体。通过外科手术将SCNT胚胎转移到受体的输卵管中。手术转移后约23天,使用超声扫描仪(HS-101V,Honda Electronics Co.,Ltd.,Yamazuka,日本)确认了妊娠。已确定代孕体的选择对猪克隆结果可能很重要。例如,代孕母体(例如三元(Sanyuan))越大,则与更小的代孕母体(例如滇南(Diannan))相比,分娩率,产仔数,成活率,和每头母猪的预产猪数量越好。图29。
实施例11:胎儿和猪分析
为了测试从代孕母猪到胎儿以及从无PERV细胞克隆的猪是否有PERV的再感染,通过剖宫产(剖腹产)从代孕母猪收集WT和PERV敲除了的胎儿。在不同时间点从克隆猪的不同组织中分离基因组DNA和总RNA。然后通过深度测序来检查基因组DNA和RNA这两者的PERV基因型。PERV敲除了的胎儿和猪在基因组和组织转录物中均表现出约100%的PERV失活效率。证实PERV拷贝数与克隆它们的细胞系相似。用这些方法产生的胎儿或猪均未观察到PERV再感染。
实施例12:随所用向导RNA的数量的增加而增加的KO效率
为了研究不同数量的向导RNA对PERV敲除(KO)效率的影响,使用2,3和4种向导RNA组合进行了实验。简言之,PERV KO在Yucatan小型猪的胎儿成纤维细胞中进行,生成约50-60个PERV拷贝。使用片段分析对PERV KO效率进行批量(bulk)测量,并通过色谱法确定结果。观察到KO效率随着gRNA数量的增加而增加。图27。使用2个向导RNA导致群体中12.52%的细胞的PERV pol序列缺失,而使用3个向导RNA导致群体中22.19%的细胞的PERV pol序列缺失。当使用4个向导RNA时,KO效率增加到52.47%。重要的是,当使用至少4个向导RNA时,在大量细胞中观察到大于100bp的缺失。图27,右下图。预期与小插入不同,通过使用多于两个的向导RNA产生的大缺失将完全去除PERV pol的催化结构域,因此其不能被自发突变逆转。
除了避免自发突变之外,还证实PERV pol的失活不能通过人ERV pol的活性来补充。图28。简言之,表达重组的人ERV pol((“PK15-#15+重组ERV Pol)的PK15 WT细胞(“PK15-WT+樱桃红荧光蛋白(mCherry)”),PERV KO细胞(“PK15-#15),和PERV KO细胞与人293-GFP细胞共培养。两周后,将293-GFP细胞FACS分离为指定数量,并使用PCR确定通过pol和env水平测得的PERV感染。GGTA用作阴性对照,以显示pol/env表达是由PERV感染引起的,而不是由PK15污染的293-GFP细胞引起的。如图28所示,PK15-WT细胞同时表达pol和env,而PERV KO或表达重组人ERV pol的PERV KO均未表达pol或env。该数据表明,暴露于人ERV时,PERV失活的猪器官中的PERV不会被重新激活。
段(Para)A。一种自胚胎发育的猪,其中所述胚胎包含具有至少75%的失活的猪内源性逆转录病毒(PERV)部分的猪细胞。
段B。段A的猪,其中所述猪细胞均为猪雌性胎儿成纤维(PFFF3)细胞。
段C。段A或段B的猪,其中所述细胞内约100%的所述PERV部分均为失活的。
段D。段A-C中任一项的猪,其中所述PERV部分包含一种或多种导致PERV部分活性降低或丧失的突变或表观遗传变化。
段E。段A-D中任一项的猪,其中所述猪细胞的所述PERV部分已经通过以下方法失活,所述方法包括:向所述细胞施用针对参与PERV复制和/或装配的基因的基因组修改试剂,其中所述试剂破坏所述基因的转录和/或翻译。
段F。段E的猪,其中所述试剂是核酸酶或切口酶或编码所述核酸酶或切口酶的核酸。
段G。段F的猪,其中所述核酸或切口酶选自锌指核酸酶或切口酶,TAL效应物核酸酶或切口酶,和CRISPR相关的核酸酶或切口酶。
段H。段G的猪,其中所述核酸酶或切口酶是CRISPR相关的核酸酶或切口酶。
段I。段H的猪,其中所述CRISPR相关的核酸酶或切口酶是CRISPR-Cas9核酸酶或切口酶,CRISPR-Cpf1核酸酶或切口酶,或其生物活性片段或衍生物。
段J。段E-I中任一项的猪,其中所述试剂还包含:a)CRISPR向导RNA或tracrRNA或b)编码所述CRISPR向导RNA的核酸。
段K。段J的猪,其中所述CRISPR向导RNA包含SEQ ID NO:1–3或26–181中任一核苷酸序列,其任何品系特异性遗传变体,或其任何组合。
段L。段J的猪,其中所述CRISPR向导RNA包含SEQ ID NO:1–3或26–116中任一核苷酸序列,其任何品系特异性遗传变体,或其任何组合。
段M。段J的猪,其中所述CRISPR向导RNA包含SEQ ID NO:35,36,48,99,101,102,106,108,111,113中任一核苷酸序列,或其任何组合。
段N。段E-J中任一项的猪,其中所述试剂是编码CRISPR-Cas9核酸酶或切口酶的核酸,其中所述细胞经设计以稳定地表达所述试剂,其中所述试剂还包含至少一种向导RNA,并且其中至少一个向导RNA序列包含SEQ ID NO:1–3或26–116中任一核苷酸序列。
段O。段N的猪,其中所述试剂包含至少三种向导RNA,其中所述三种向导RNA序列包含SEQ ID NOs:1-3的核苷酸序列。
段P。段A-O中任一项的猪,其中所述猪在妊娠后至少1个月,至少6个月,至少1年,至少5年,至少10年保持相同或基本相同的PERV失活水平。
段Q。获自段A-P中任一项的猪的器官或组织。
段R。将段Q的器官或组织移植给受试者的方法,包括将所述器官移植入受试者的步骤。
段S。段R的方法,其中所述受试者是人。
段T。段R的方法,其中所述受试者是非人灵长目动物。
段U。一种产生猪内源性逆转录病毒(PERV)失活的猪的方法,包括:获取具有细胞核的核供体细胞,其中所述核供体细胞中至少75%的所述PERV部分是失活的;将所述核供体细胞的所述细胞核转移至受体去核卵母细胞中以产生核转移的卵母细胞;使所述核转移的卵母细胞活化;培养所述核转移的卵母细胞以产生胚泡或胚胎;将所述胚泡或胚胎转移至代孕体(surrogate)中;以及从所述胚泡或胚胎中产生活体PERV失活的猪。
段V。一种产生猪内源性逆转录病毒(PERV)失活的猪的方法,包括:使用来自核供体细胞的细胞核产生胚泡或胚胎,其中所述核供体细胞中至少75%的所述PERV部分是失活的;以及将所述胚泡或胚胎转移至代孕体中以产生PERV失活的猪。
段W。段U或段V的方法,其中所述核供体细胞是胎儿细胞。
段X。段U或段V的方法,其中所述核供体细胞分离自嵌合PERV失活的胎儿。
段Y。段X的方法,其中所述嵌合PERV失活的胎儿为约10天,约20天,约30天,或约3个月妊娠。
段Z。段X的方法,其中使用基因组修改试剂产生所述嵌合PERV失活的胎儿。
段AA。段Z的方法,其中通过受精卵注射来产生所述嵌合PERV失活的胎儿。
段AB。段Z的方法,其中所述基因组修改试剂选自锌指核酸酶或切口酶,TAL效应物核酸酶或切口酶,脱氨酶,和CRISPR相关的核酸酶或切口酶。
段AC。段U或段V的方法,其中所述核供体细胞在体外扩增。
段AD。段AC的方法,其中所述核供体细胞在体外经历少于30次,少于20次,少于10次,少于5次,或少于2次的群体倍增。
段AE。段U或段V的方法,其中所述核供体细胞是体细胞。
段AF。段U或段V的方法,其中所述核供体选自胎儿肌细胞,成纤维细胞,内皮细胞,肝细胞。
段AG。段U或段V的方法,其中所述核供体细胞分离自猪。
段AH。段AG的方法,其中所述猪年龄小于10周,小于8周,小于6周,小于5周,小于4周,小于3周,小于2周,或小于1周。
段AI。段U或段V的方法,其中所述核供体细胞中至少约80%,至少约90%,至少约95%,至少约99%的PERV部分是失活的。
段AJ。段U或段V的方法,其中所述核供体细胞中100%的PERV部分是失活的。
段AK。段U或段V的方法,其中所述PERV失活的猪在妊娠后至少1个月,至少6个月,至少1年,至少5年,至少10年保持相同或相似的PERV失活水平。
段AL。段U或段V的方法,其中所述PERV失活的猪是无PERV的猪。
段AM。段U或段V的方法,其中所述PERV失活的猪具有至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,或至少99%的失活PERV部分。
段AN。段U或段V的方法,还包括脱乙酰酶抑制剂。
段AO。段U或段V的方法,还包括将至少一个野生型胚泡或胚胎转移至所述代孕体中。
段AP。由段U至AO中任一项的方法产生的分离的猪细胞。
段AQ。由段U至AO中任一项的方法产生的细胞获得的器官或组织。
段AR。一种提高PERV失活的猪的出生率的方法,包括:使用来自核供体细胞的细胞核以产生胚泡或胚胎,其中所述核供体细胞中至少75%的PERV部分是失活的;以及将所述胚泡或胚胎转移至至少一个代孕体中以产生至少一只PERV失活的猪,其中,与从细胞中超过25%的PERV部分具有活性的细胞产生的胎儿的流产率相比,其流产率降低。
段AS。一种产生基因修改的动物的方法,包括:使用来自核供体细胞的细胞核产生胚泡或胚胎,其中所述核供体细胞中的多个核酸序列被修改;以及将所述胚泡或胚胎转移至代孕体中以产生所述基因修改的动物。
段AT。段AR或AS的方法,其中所述核供体细胞是胎儿细胞。
段AU。段AR或AS的方法,其中所述核供体细胞分离自嵌合胎儿。
段AV。段AR或AS的方法,其中所说嵌合胎儿为约10天,约20天,约30天,或约3个月妊娠。
段AW。段AV的方法,其中所述嵌合胎儿通过使用基因组修改试剂产生。
段AX。段AU的方法,其中所述嵌合胎儿通过受精卵注射产生。
段AY。段AW的方法,其中所述基因组修改试剂选自锌指核酸酶或切口酶,TAL效应物核酸酶或切口酶,脱氨酶,和CRISPR相关的核酸酶或切口酶。
段AZ。段AR或AS的方法,其中所述核供体细胞在体外扩增。
段BA。段AZ的方法,其中所述核供体细胞在体外经历少于30次,少于20次,少于10次,少于5次,或少于2次的群体倍增。
段BB。段AR或AS的方法,其中所述核供体细胞是体细胞。
段BC。段AR或AS的方法,其中所述核供体细胞选自胎儿肌细胞,成纤维细胞,内皮细胞,肝细胞。
段BD。段AR或AS的方法,其中所述核供体细胞分离自年龄小于10周,小于8周,小于6周,小于5周,小于4周,小于3周,小于2周,或小于1周的动物。
段BE。段AR或AS的方法,通过灭活,外源核酸的插入,内源核酸的消减,或其任何组合对多个核酸序列进行修改。
段BF。段AR或AS的方法,其中至少约2个,至少约5个,至少约10个,至少约20个,至少约30个,至少约40个,至少约50个,至少约60个,至少约70个,至少约80个,至少约90个,至少约100个,或更多个核酸序列被修改。
段BG。一种预防或降低基因修改的胚泡或胚胎的体细胞核转移(SCNT)后妊娠丢失或流产的风险的方法,包括:使用基因修改的核供体细胞的细胞核产生胚泡或胚胎;以及将所述胚泡或胚胎转移至代孕体中以产生至少一个可育后代,其中,与对照的妊娠丢失率或流产率相比,其妊娠丢失率或流产率降低。
段BH。段BG的方法,其中所述基因修改的核供体细胞具有多个基因修改。
段BI。段BH的方法,其中所述多个基因修改包括至少约2个,至少约3个,至少约4个,至少约5个,至少约10个,至少约15个,至少约20个,至少约30个,至少约40个,至少约50个,至少约60个,至少约70个,至少约80个,至少约90个,或至少约100个的基因修改。
段BJ。段BG的方法,其中所述多个基因修改针对单一重复基因序列。
段BK。段BG的方法,其中所述基因修改的至少一部分针对不同基因。
段BL。段BG的方法,其中所述基因修改的核供体细胞已使用选自锌指核酸酶或切口酶,TAL效应物核酸酶或切口酶,脱氨酶,和CRISPR相关的核酸酶或切口酶的基因组修改试剂进行了修改。
通过引用合并
本文提及的所有公开和专利均通过引用全文并入本文,如同每个单独的公开或专利均被明确地和单独地指出通过引用并入。
尽管已经讨论了本公开的特定实施方式,但是以上说明书是说明性的而非限制性的。在阅读本说明书和下面的权利要求书之后,本公开的许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本公开的全部范围应该通过参考权利要求书和其等同物的全部范围,以及说明书和这种变化来确定。
序列表
<110> E开创生物技术股份有限公司
<120> 产生基因修改的动物的方法
<130> 125710-8001.WO00
<150> 62/487,898
<151> 2017-04-20
<150> 62/527,702
<151> 2017-06-30
<150> 62/543,610
<151> 2017-08-10
<160> 231
<170> PatentIn 版本3.5
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<221> misc_signal
<222> (1)..(1)
<223> 56-FAM
<220>
<221> misc_signal
<222> (24)..(24)
<223> 3BHQ_1
<400> 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 18
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<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 19
ccgactgccc caagagttca a 21
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<220>
<221> misc_signal
<222> (1)..(1)
<223> 56-FAM
<400> 20
cacgtactgg aggagggtca cctg 24
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 21
ccgcgatcta atgttctctt tc 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 22
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<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<220>
<221> misc_signal
<222> (1)..(1)
<223> 5HEX
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cagccgcgtc cctgagacac 20
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 24
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
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ggttaggttg cattttcatc ctt 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 26
atactcccct gctaccggtt agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 27
caatgattat cgaccagtac agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 28
acttgagaga ggtcaataaa agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
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tgagcgccct cccgcctgaa cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 30
aaccactttt tgccttcgaa tgg 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 31
gatccaggta cgggaagaac cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 32
acctggaccc gactgcccca agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 33
cgaagcccta cacagagacc tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 34
cttcaggatc caacaccctc agg 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 35
gtacgtggat gacctgcttc tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 36
accaaacagg actgcttaga agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 37
ctgctggaat tgtctgacct agg 23
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
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ctacagagcc tctgctaaga agg 23
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 39
caggagagag gtaacatact tgg 23
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 40
ggcttcctaa ccggtagcag ggg 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 41
ctgtactggt cgataatcat tgg 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 42
tataagggtt cgggaccgtt ggg 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 43
caggcgggag ggcgctcaag agg 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 44
gtgtaatctc aggcagaaga agg 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 45
gcaaaaagtg gttggctagt ggg 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 46
tgcccggttc ttcccgtacc tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 47
cccttggggc agtcgggtcc agg 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 48
ggcttcgtca aagatggtcg ggg 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 49
gttggatcct gaagttggcc agg 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 50
actggaggag ggtcacctga ggg 23
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 51
tggtggctcc cgccagaagc agg 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 52
tagcagaggc tctgtagcct agg 23
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 53
tacctctctc ctgcaaatct ggg 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 54
ctgctaccgg ttaggaagcc tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 55
aggcttccta accggtagca ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 56
caggcttcct aaccggtagc agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 57
ttggtcccag gcttcctaac cgg 23
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 58
acctctctca agtcctgtac tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 59
tgctaccggt taggaagcct ggg 23
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 60
ggtcgataat cattggtccc agg 23
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 61
accagtacag gacttgagag agg 23
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 62
ggtgcaggac atacacccaa cgg 23
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 63
cttgagagag gtcaataaaa ggg 23
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 64
agaggtcaat aaaagggtgc agg 23
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 65
ttataagggt tcgggaccgt tgg 23
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 66
tcaagaggtt ataagggttc ggg 23
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 67
ccagttccgt tcaggcggga ggg 23
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 68
ctcaagaggt tataagggtt cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 69
gggcgctcaa gaggttataa ggg 23
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 70
tgtaccagtt ccgttcaggc ggg 23
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 71
agggcgctca agaggttata agg 23
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 72
acggaactgg tacacagtat tgg 23
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 73
accagttccg ttcaggcggg agg 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 74
gtgtaccagt tccgttcagg cgg 23
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 75
actgtgtacc agttccgttc agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 76
ggctagtggg gtgtaatctc agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 77
ctccattcga aggcaaaaag tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 78
caaaaagtgg ttggctagtg ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 79
acctggatct ctccattcga agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 80
tcgggtccag gtgagctgcc cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 81
ggggagttct tgaacccttg ggg 23
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 82
gtgtagggct tcgtcaaaga tgg 23
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 83
ggcaaaaagt ggttggctag tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 84
attcgaaggc aaaaagtggt tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 85
gccttcgaat ggagagatcc agg 23
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 86
gaagaaccgg gcagctcacc tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
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cgaatggaga gatccaggta cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 88
gaatggagag atccaggtac ggg 23
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 89
atccaggtac gggaagaacc ggg 23
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 90
cttgaaccct tggggcagtc ggg 23
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 91
tcttgaaccc ttggggcagt cgg 23
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 92
cggggagttc ttgaaccctt ggg 23
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 93
tcggggagtt cttgaaccct tgg 23
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 94
gggcttcgtc aaagatggtc ggg 23
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 95
agggcttcgt caaagatggt cgg 23
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 96
gttggccagg tctctgtgta ggg 23
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 97
ggagggtcac ctgagggtgt tgg 23
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 98
gaagcaggtc atccacgtac tgg 23
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 99
ttctaagcag tcctgtttgg tgg 23
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 100
acagagacct ggccaacttc agg 23
<210> 101
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 101
ggtgaccctc ctccagtacg tgg 23
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 102
tctggcggga gccaccaaac agg 23
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 103
aggtacgaag gcactactgc tgg 23
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 104
agttggccag gtctctgtgt agg 23
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 105
agggtgttgg atcctgaagt tgg 23
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 106
gtcatccacg tactggagga ggg 23
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 107
tactggagga gggtcacctg agg 23
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 108
ggtcatccac gtactggagg agg 23
<210> 109
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 109
gcaggtcatc cacgtactgg agg 23
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 110
cgtggatgac ctgcttctgg cgg 23
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 111
gtggatgacc tgcttctggc ggg 23
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 112
accttctaag cagtcctgtt tgg 23
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 113
ggactgctta gaaggtacga agg 23
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 114
aatctgggcc ttcttagcag agg 23
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 115
ctaagaaggc ccagatttgc agg 23
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 116
catacttggg gtacagtttg cgg 23
<210> 117
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 117
ggcccagatt tgcaggagag agg 23
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 118
ttacctctct cctgcaaatc tgg 23
<210> 119
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 119
aggagagagg taacatactt ggg 23
<210> 120
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 120
ggagagaggt aacatacttg ggg 23
<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 121
atacttgggg tacagtttgc ggg 23
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 122
ctttgccaaa cccatccctg cgg 23
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 123
gccttcagtt gaataacctg tgg 23
<210> 124
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 124
ggtagcaggg gagtattcca agg 23
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 125
gttcaaagat taatccaaca ggg 23
<210> 126
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 126
caagcctggg cagaaaccgc agg 23
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 127
tagcagggga gtattccaag ggg 23
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 128
gatattcatc atctaattgg agg 23
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 129
aagcctgggc agaaaccgca ggg 23
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 130
ctttgacgaa gccctacaca ggg 23
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 131
tacttggggt acagtttgcg ggg 23
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 132
acagtacccc ttgagtagag agg 23
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 133
gtagcagggg agtattccaa ggg 23
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 134
ttggggtaca gtttgcgggg cgg 23
<210> 135
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 135
cttcagttga ataacctgtg ggg 23
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 136
ttgagtagag aggctcgaga agg 23
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 137
gcggtttctg cccaggcttg ggg 23
<210> 138
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 138
gttggccagg tccctgtgta ggg 23
<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 139
aaggggattg gacaggaact agg 23
<210> 140
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 140
tcaagatata cagtcctggt tgg 23
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 141
ttcagttgaa taacctgtgg ggg 23
<210> 142
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 142
ctgggcagaa accgcaggga tgg 23
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 143
ttggggaaac tgctccaacc agg 23
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 144
ttggagggtc aacacagtga tgg 23
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 145
gtattccaag gggattggac agg 23
<210> 146
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 146
ctcgagcctc tctactcaag ggg 23
<210> 147
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 147
tctcgagcct ctctactcaa ggg 23
<210> 148
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 148
gagaggctcg agaaggaatt tgg 23
<210> 149
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 149
tgttcaaaga ttaatccaac agg 23
<210> 150
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 150
tcttgatcag gctttacttg ggg 23
<210> 151
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 151
tggattaatc tttgaacatg cgg 23
<210> 152
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 152
ggagcagttt ccccaagcct ggg 23
<210> 153
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 153
ttctcgagcc tctctactca agg 23
<210> 154
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 154
tagttcctgt ccaatcccct tgg 23
<210> 155
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 155
cgaagcccta cacagggacc tgg 23
<210> 156
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 156
atattcatca tctaattgga ggg 23
<210> 157
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 157
caggaactag gatgccctgt tgg 23
<210> 158
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 158
ggcaaagcaa gttcccccac agg 23
<210> 159
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 159
tggagcagtt tccccaagcc tgg 23
<210> 160
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 160
agaaaccgca gggatgggtt tgg 23
<210> 161
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 161
cccacaggtt attcaactga agg 23
<210> 162
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 162
gctcaaattt cttttgaaca agg 23
<210> 163
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 163
tgggcagaaa ccgcagggat ggg 23
<210> 164
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 164
tctttgacga agccctacac agg 23
<210> 165
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 165
acagggacct ggccaacttc agg 23
<210> 166
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 166
ggggagtatt ccaaggggat tgg 23
<210> 167
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 167
tggagggtca acacagtgat ggg 23
<210> 168
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 168
gtcgatattc atcatctaat tgg 23
<210> 169
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 169
catccctgcg gtttctgccc agg 23
<210> 170
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 170
atcttgatca ggctttactt ggg 23
<210> 171
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 171
ctgatcaaga tatacagtcc tgg 23
<210> 172
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 172
tatcttgatc aggctttact tgg 23
<210> 173
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 173
ttgttattca cagacacttc tgg 23
<210> 174
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 174
gactgatact ggtgtagcac tgg 23
<210> 175
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 175
agttggccag gtccctgtgt agg 23
<210> 176
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 176
tgcggtttct gcccaggctt ggg 23
<210> 177
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 177
ttggaatact cccctgctac cgg 23
<210> 178
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 178
caggactgta tatcttgatc agg 23
<210> 179
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 179
tggggtacag tttgcggggc ggg 23
<210> 180
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 180
gggtactgtc tgactgatac tgg 23
<210> 181
<211> 23
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 181
ctgcggtttc tgcccaggct tgg 23
<210> 182
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 182
gaccattacc aagcagggtc tgacaggtac tgaaaggatg aa 42
<210> 183
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 183
attaaacaac tcagccgggt gcggtgcctc tgaaaggatg aa 42
<210> 184
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 184
aactgtatag tcttggataa acagttcagg tgaaaggatg aa 42
<210> 185
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 185
cgtgggaaac aggggctccg cgactgcgct tgaaaggatg aa 42
<210> 186
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 186
gcaaatgtct ttattgtttg ttgctggttt tgaaaggatg aa 42
<210> 187
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 187
ggagtgcagt gatctgatct ccgctcatgg tgaaaggatg aa 42
<210> 188
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 188
ccgttcctcc caaggcgggc cttgaaagga tgaaaggatg aa 42
<210> 189
<211> 22
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 189
actctatcct ataaggttga ca 22
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 190
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 191
<211> 19
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 191
ggagcaaaag agcagtatg 19
<210> 192
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 192
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 193
tatatggacg cattcagttg 20
<210> 194
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 194
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 195
<211> 19
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 195
ttttcggagg attttcagg 19
<210> 196
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 196
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 197
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 197
tactgcattt gataccacat 20
<210> 198
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 198
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 199
<211> 22
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 199
gacttccgtc atttatgtaa ac 22
<210> 200
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 200
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 201
<211> 18
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 201
ctctggtcgt ttcagtgg 18
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 202
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 203
<211> 18
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 203
cagatgagtg gagcaagg 18
<210> 204
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 204
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 205
<211> 19
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 205
gttactgggt cagggataa 19
<210> 206
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 206
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 207
<211> 22
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 207
ccctccatat acattttctc ta 22
<210> 208
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 208
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 209
<211> 18
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 209
gagtcccatt caccaagt 18
<210> 210
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 210
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 211
<211> 18
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 211
acgcacaaga caaagaca 18
<210> 212
<211> 19
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 212
ctcccaccca gtttcatag 19
<210> 213
<211> 17
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 213
cccgcaaatc tcacgag 17
<210> 214
<211> 17
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 214
cccgcaaatc tcacgag 17
<210> 215
<211> 18
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 215
gtttgacagt ggtgttgt 18
<210> 216
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 216
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 217
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 217
tgttgagaca atagggtgat 20
<210> 218
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 218
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 219
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 219
tcatgaacaa gtgctgtatt 20
<210> 220
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 220
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 221
<211> 21
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 221
ggaatagatt gtcttgggaa t 21
<210> 222
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 222
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 223
<211> 17
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 223
ggctctctgg ggcatct 17
<210> 224
<211> 17
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 224
caggggcctg gggaatg 17
<210> 225
<211> 19
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 225
tgtttgagag gcagaagat 19
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 226
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 227
<211> 19
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 227
aggtacttgg tggtgaatg 19
<210> 228
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 228
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 229
<211> 22
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 229
tgagtatcag tatcatttgt ga 22
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 230
taggttgcat tttcatcctt 20
<210> 231
<211> 21
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 231
tctctcctgc aaatctgggc c 21
Claims (50)
1.一种自胚胎发育的猪,其中所述胚胎包含具有至少75%的失活的猪内源性逆转录病毒(PERV)部分的猪细胞。
2.根据权利要求1所述的猪,其中所述细胞中约100%的所述PERV部分均为失活的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的猪,其中所述PERV部分包含一种或多种导致PERV部分活性降低或丧失的突变或表观遗传变化。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的猪,其中所述猪细胞的所述PERV部分已经通过以下方法失活,所述方法包括:向所述细胞施用针对参与PERV复制和/或装配的基因的基因组修改试剂,其中所述试剂破坏所述基因的转录和/或翻译。
5.根据权利要求4所述的猪,其中所述试剂是核酸酶或切口酶或编码所述核酸酶或切口酶的核酸。
6.根据权利要求4所述的猪,其中所述核酸酶或切口酶是CRISPR相关的核酸酶或切口酶。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的猪,其中所述试剂还包含:
a)CRISPR向导RNA或tracrRNA或;
b)编码所述CRISPR向导RNA的核酸。
8.根据权利要求7所述的猪,其中所述CRISPR向导RNA包含SEQ ID NO:1-3或26-181中任一核苷酸序列,其任何品系特异性遗传变体,或其任何组合。
9.根据权利要求7所述的猪,其中所述CRISPR向导RNA包含SEQ ID NO:1-3或26-116中任一核苷酸序列,其任何品系特异性遗传变体,或其任何组合。
10.根据权利要求7所述的猪,其中所述CRISPR向导RNA包含SEQ ID NO:35,36,48,99,101,102,106,108,111,113中任一核苷酸序列,或其任何组合。
11.根据权利要求4-7中任一项所述的猪,其中所述试剂是编码CRISPR-Cas9核酸酶或切口酶的核酸,其中所述细胞经设计以稳定地表达所述试剂,其中所述试剂还包含至少一种向导RNA,并且其中至少一个向导RNA序列包含SEQ ID NO:1-3或26-116中任一核苷酸序列。
12.根据在前的任一权利要求所述的猪,其中所述猪在妊娠后至少1个月,至少6个月,至少1年,至少5年,至少10年保持相同或基本相同的PERV失活水平。
13.一种自在前的任一权利要求所述的猪获取的器官或组织。
14.一种产生猪内源性逆转录病毒(PERV)失活的猪的方法,包括:
i.获取具有细胞核的核供体细胞,其中所述核供体细胞中至少75%的所述PERV部分是失活的;
ii.将所述核供体细胞的所述细胞核转移至受体去核卵母细胞中以产生核转移的卵母细胞;
iii.使所述核转移的卵母细胞活化;
iv.培养所述核转移的卵母细胞以产生胚泡或胚胎;
v.将所述胚泡或胚胎转移至代孕体中;以及
vi.从所述胚泡或胚胎中产生活体PERV失活的猪。
15.一种产生猪内源性逆转录病毒(PERV)失活的猪的方法,包括:
i.使用来自核供体细胞的细胞核产生胚泡或胚胎,其中所述核供体细胞中至少75%的所述PERV部分是失活的;以及
ii.将所述胚泡或胚胎转移至代孕体中以产生PERV失活的猪。
16.根据权利要求14或15所述的方法,其中所述核供体细胞是胎儿细胞。
17.根据权利要求14或15所述的方法,其中所述核供体细胞分离自嵌合PERV失活的胎儿。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述嵌合PERV失活的胎儿为约10天,约20天,约30天或约3个月妊娠。
19.根据权利要求17所述的方法,其中使用基因组修改试剂产生所述嵌合PERV失活的胎儿。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述基因组修改试剂选自锌指核酸酶或切口酶,TAL效应物核酸酶或切口酶,脱氨酶,和CRISPR相关的核酸酶或切口酶。
21.根据权利要求14或15所述的方法,其中所述核供体细胞在体外经历少于30次,少于20次,少于10次,少于5次,或少于2次的群体倍增。
22.根据权利要求14或15所述的方法,其中所述核供体细胞分离自猪。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述猪年龄小于10周,小于8周,小于6周,小于5周,小于4周,小于3周,小于2周,或小于1周。
24.根据权利要求14或15所述的方法,其中所述核供体细胞中至少约80%,至少约90%,至少约95%,至少约99%的PERV部分是失活的。
25.根据权利要求14或15所述的方法,其中所述PERV失活的猪在妊娠后至少1个月,至少6个月,至少1年,至少5年,至少10年保持相同或相似的PERV失活水平。
26.根据权利要求14或15所述的方法,还包括将至少一个野生型胚泡或胚胎转移至所述代孕体中。
27.一种通过权利要求14-26中任一项所述的方法产生的分离的猪细胞。
28.一种自通过权利要求14-26中任一项所述的方法产生的细胞获取的器官或组织。
29.一种提高PERV失活的猪的出生率的方法,包括:
i.使用来自核供体细胞的细胞核以产生胚泡或胚胎,其中所述核供体细胞中至少75%的PERV部分是失活的;以及
ii.将所述胚泡或胚胎转移至至少一个代孕体中以产生至少一只PERV失活的猪,
其中,与从细胞中超过25%的PERV部分具有活性的细胞产生的胎儿的流产率相比,其流产率降低。
30.一种产生基因修改的动物的方法,包括:
i.使用来自核供体细胞的细胞核以产生胚泡或胚胎,其中所述核供体细胞中的多个核酸序列被修改;以及
ii.将所述胚泡或胚胎转移至代孕体中以产生所述基因修改的动物。
31.根据权利要求29或30所述的方法,其中所述核供体细胞是胎儿细胞。
32.根据权利要求29或30所述的方法,其中所述核供体细胞分离自嵌合PERV失活的胎儿。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述嵌合PERV失活的胎儿为约10天,约20天,约30天或约3个月妊娠。
34.根据权利要求32所述的方法,其中使用基因组修改试剂产生所述嵌合PERV失活的胎儿。
35.根据权利要求32所述的方法,其中所述嵌合PERV失活的胎儿通过受精卵注射产生。
36.根据权利要求34所述的方法,其中所述基因组修改试剂选自锌指核酸酶或切口酶,TAL效应物核酸酶或切口酶,脱氨酶,和CRISPR相关的核酸酶或切口酶。
37.根据权利要求29或30所述的方法,其中所述核供体细胞在体外经历少于30次,少于20次,少于10次,少于5次,或少于2次的群体倍增。
38.根据权利要求31所述的方法,其中所述猪年龄小于10周,小于8周,小于6周,小于5周,小于4周,小于3周,小于2周,或小于1周。
39.根据权利要求29或30所述的方法,其中所述核供体细胞中至少约80%,至少约90%,至少约95%,至少约99%的PERV部分是失活的。
40.根据权利要求29或30所述的方法,其中所述核供体细胞中100%的PERV部分是失活的。
41.根据权利要求29或30所述的方法,其中所述PERV失活的猪在妊娠后至少1个月,至少6个月,至少1年,至少5年,至少10年保持相同或相似的PERV失活水平。
42.根据权利要求29或30所述的方法,其中所述PERV失活的猪是无PERV的猪。
43.根据权利要求29或30所述的方法,其中所述PERV失活的猪具有至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,或至少99%的失活的PERV部分。
44.根据权利要求29或30所述的方法,还包括将至少一个野生型胚泡或胚胎转移至所述代孕体中。
45.一种预防或降低基因修改的胚泡或胚胎的体细胞核转移(SCNT)后妊娠丢失或流产的风险的方法,包括:
i.使用基因修改的核供体细胞的细胞核产生胚泡或胚胎;以及
ii.将所述胚泡或胚胎转移至代孕体中以产生至少一个可育后代其中,与对照的妊娠丢失率或流产率相比,其妊娠丢失率或流产率降低。
46.根据权利要求45所述的方法,其中所述基因修改的核供体细胞具有多个基因修改。
47.根据权利要求46所述的方法,其中所述多个基因修改包括至少约2个,至少约3个,至少约4个,至少约5个,至少约10个,至少约15个,至少约20个,至少约30个,至少约40个,至少约50个,至少约60个,至少约70个,至少约80个,至少约90个,或至少约100个的基因修改。
48.根据权利要求45所述的方法,其中所述多个基因修改针对单一重复基因序列。
49.根据权利要求45所述的方法,其中所述基因修改的至少一部分针对不同基因。
50.根据权利要求45所述的方法,其中所述基因修改的核供体细胞已使用选自锌指核酸酶或切口酶,TAL效应物核酸酶或切口酶,脱氨酶,和CRISPR相关的核酸酶或切口酶的基因组修改试剂进行了修改。
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