KR20160135729A - 뉴클레아제 없는 게놈 편집 - Google Patents

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아디 바젤
마크 에이. 케이
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

외인성으로 제공되는 뉴클레아제들의 사용 없이 세포의 게놈을 편집하기 위한 방법들 및 조성물들이 제공된다. 방법들의 양상들은 세포를 표적 자리 내로 통합되는 핵산 서열을 포함하는 표적화 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하며, 세포는 또한 뉴클레아제와 접촉되지 않는다. 게다가, 대상 방법들의 실행에 사용하는 시약들, 장치들 및 그것들의 키트들의 제공된다.

Description

뉴클레아제 없는 게놈 편집{GENOME EDITING WITHOUT NUCLEASES}
교차 참조
본 출원서는 2014년 9월 3일에 출원된 미국가특허출원 제62/045,451호, 2014년 8월 29일에 출원된 제62/044,145호, 2014년 3월 24일에 출원된 제61/969,709호, 및 2014년 3월 21일에 출원된 제61/969,013호의 이익을 주장하며, 각각은 전체가 참조로써 여기에 통합된다.
정부 권리
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 지원된 HL064274 계약 하에서의 정부 지원으로 만들어졌다.
본 발명은 외인성 뉴클레아제(exogenous nuclease)들의 부재 하에서의 게놈 편집에 관한 것이다.
게놈의 위치 특이적(site-specific) 조작은 의학, 생물공학, 및 생물학적 연구에서의 많은 적용을 위한 바람직한 목표이다. 최근에 체외 또는 체내 유사분열 또는 후-유사분열 세포에서의 유전자 표적화(gene targeting)를 위한 위치 특이적 뉴클레아제들을 개발하기 위하여 많은 노력이 만들어졌다. 그러나 이러한 표적화된 뉴클레아제들은 때때로 세포들에 독성이며 그것들의 오프 타겟 활성(off target activity)은 면역성이고 유전자 독성이다. 종래에 필요한 것은 외인성으로 제공되는 뉴클레아제들의 사용 없이 세포의 게놈을 편집하기 위한 방법들이다. 본 발명은 이러한 문제들을 다룬다.
외인성으로 제공되는 뉴클레아제의 세포의 게놈을 편집하기 위한 방법들 및 조성물들이 제공된다. 방법들의 양상은 세포를 표적 자리(target locus) 내로 통합되도록 핵산 서열을 포함하는 표적화 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하며, 세포는 또한 뉴클레아제와 접촉되지 않는다. 게다가, 대상 방법들의 실행에 사용하는 시약들, 장치들 및 키트들이 제공된다.
본 발명은 첨부된 도면들과 함께 구독될 때 아래의 상세한 설명으로부터 가장 잘 이해될 것이다. 일반적 관행에 따라, 도면들의 다양한 특징들은 축척으로 도시되지 않는다는 것이 강조된다. 이와 반대로, 다양한 특징들의 치수는 명확성을 위하여 임의로 확대되거나 또는 감소된다. 다음의 도면들이 본 발명의 도면 내에 포함된다.
도 1. 벡터 디자인 및 표적화 전략. 코돈 최적화된 인간 F-Ⅸ cDNA(연녹색)가 2A 펩티드(P2A, 진녹색)를 코딩하는 서열에 의해 진행된다. 이는 5'(청색) 및 3'(UTR, 황색)으로부터 알부민 종결 코돈을 스패닝하는(spanning) 것들에 상동인 서열에 의해 플랭킹된다(flanked). 상동 분지(homology arm)들은 각각, 1.3 및 1.4kb 길이이다. 알부민(Alb) 자리 내로의 통합은 키메라 유전자(chimeric gene)을 야기한다. 그러나 2A 펩티드에 의해 유도되는 리보솜 스키핑(ribosomal skipping)은 두 개의 개별 단백질의 생산을 허용한다. 알부민 단백질은 21 아미노산 길이(2A 태그tag))로 남겨지며 반면에 응고 인자(clotting factor)는 이후에 신호 펩티드의 일부분으로서 소포체(ER) 내에서 처리되는 N 말단 프롤린(N terminal Proline)과 관련된다.
도 2. 2일령 C57BL/6J (B6) 마우스들이 점 블롯(dot blot)에 의해 적정되는 것과 같이, 50 ul 함유 1e12 벡터 입자들에 의해 복강 내로(IP) 주사되었다. 플라스마 hF-Ⅸ은 안와후(retro-orbital) 채혈 후에 생명의 4주에서 시작하여, ELISA에 의해 매주 평가되었다. N=6, 에러 바(error bar)들은 표준 편차를 나타낸다.
도 3. 성체 C57BL/6J(B6) 마우스들이 점 블롯에 의해 적정되는 것과 같이, 1e12 벡터 입자들을 포함하는 100 ul에 의해 정맥 내로(IV) 주사되었다. 플라스마 hF-Ⅸ은 안와후 채혈 후에 생명의 4주에서 시작하여, ELISA에 의해 매주 평가되었다. N=3, 에러 바들은 표준 편차를 나타낸다.
도 4. RT 비-바이어싱된(unbiased) PCR. 프라이머 RT(위)로 역 전사가 실행되었고 임의 프라이머들로의 제 2 가닥 DNA 합성, Msel 제한 효소로의 절단, 링커 결찰(linker ligation) 및 프라이머 쌍 1&2로의 PCR이 뒤따랐다. 청색: Alb 엑손들, 오렌지색: Alb: 인트론들, 검은 실선: 벡터 및 게놈 사이의 상동의 말단. 온-타겟(on-target) 통합으로부터 예상되는 것과 같이, PCR 산물(아래)이 시퀀싱되었고 융합된 알부민_F-Ⅸ 전사체와 상응하는 것으로 발견되었다. 비-바이어싱 접근법은 에피솜 발현 또는 오프-타겟 통합과 상응하는 어떠한 PCR 산물들도 발생시키지 않는다.
도 5. 온-타겟 발현만을 나타내는, 크기의 알부민의 단일 항-2A 대역을 나타내는 플라스마의 웨스턴 블롯(western blot) 분석.
도 6. 간의 웨스턴 블롯 분석. hF-Ⅸ 대역의 크기는 2A 펩티드에 의한 효율적인 리보솜 스키핑을 나타낸다.
도 7. F-Ⅸ 녹아웃(knock-out) 마우스들의 표현형 보정(B6 및 CD-1의 교차). 성인 마우스들은 AAV8_hF-Ⅸ의 1×1012 벡터 게놈(Vg)으로 주사되었다. 응고 시간은 주사 2주 후에 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 분석에 의해 측정되었다. AAV8_hF-Ⅸ 표적화 벡터로 주사된 마우스들은 훨씬 향상된 응고 시간들을 나타낸다.
도 8. 벡터 디자인 및 실험 전략. a. rAAV 벡터는 코돈 최적화된 hF9 cDNA 및 Alb 종결 코돈의 통합 5'을 향하는 상동 분지(homology arm)들에 의해 플랭킹되는 2A-펩티드 코딩 서열을 인코딩한다. 5' 및 3'의 길이는 각각 1.3 및 1.4kb이다. 상동성 재조합에 의한 통합 이후에, Alb 및 hF9은 DNA 및 RNA 레벨들에서 융합되나, 두 개의 개별 단백질은 리보솜 스키핑의 결과로서 생산된다. b. Alb 상동 분지들과 관련하여, AAV 역 대조군은 2A-펩티드 코딩 서열, 인접한 Alb 엑손(exon) 및 선행 스플라이스 졍션(splice junction)과 함께 가역된 hF9을 갖는다. 얇은 흰색 직사각형들: Alb 인트론들; 두꺼운 옅은 회색 직사각형들: Alb 엑손들; 두꺼운 흰색 직사각형들: P2A; 두꺼운 흰색 화살표들: hF9; 두꺼운 옅은 회색 직사각형들: 우전자외(extragenic) DNA; 쇄선들: 종결 코돈; 타원들: 가역된 종결 반복들; P=프롤린.
도 9. 주사된 마우스들에서의 인간 인자 Ⅸ 발현 및 활성. a. hF9 실험 구성(n=6) 또는 역 대조군(n=3)의 2.5e11 vg로의 2일령 B6 마우스들의 IP 주사들 이후에 ELISA에 의해 측정된 플라스마 hF9. 검출 한계 아래의 측정들은 20ng/mL의 임계 값에 할당되었다. PH=부분 간 절제술. 에러 바들은 표준 편차를 나타낸다. 쇄선들은 정상 hF9 레벨들의 5% 및 20%를 나타낸다. b. AAV hF9 실험 구성(n=7) 또는 역 대조군(n=3)의 1e12 vg로의 9주령 B6 마우스들의 꼬리 정맥 주사, 혹은 "정확한" 지향 내의 hF9 구성을 위한 30㎍ 플라스미드(3.5e12 복사 수) 코딩의 유체역학적 주사 이후에 ELISA에 의해 측정된 플라스마 hF9. 검출의 한계는 20ng/mL이었다. 에러 바들 및 쇄선들은 (a)에서와 같다. c. AAV hF9 실험 구성(각각의 그룹에 대하여 n=4)의 지정된 MOI를 갖는 1e12 vg로의 9주령 B6 마우스들의 꼬리 정맥 주사 이후에 ELISA에 의해 측정된 플라스마 hF9. 에러 바들은 표준 편차를 나타낸다. d. 마우스 당 1e12 AAV8-hF9 vg의 꼬리 정맥 주사 2주 후에 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)에 의한 응고 효율의 측정(n=5). 에러 바들은 표준 편차를 나타낸다. e. AAV8-hF9 구성 또는 역 대조군으로 주사된 마우스들로부터의 간 샘플들 내의 hF9을 위한 웨스턴 블롯 분석. hF9의 예상 크기는 55-Kd이다.
도 10. DNA 및 RNA 레벨들에서의 Alb 표적화의 비율. a. 온-타겟 통합 비율의 평가는 게놈 자리에 어닐링하나 벡터에는 어닐링하지 않는, 바이오틴레이트 프라이머 1(검정)을 갖는 선형 증폭(LAM)을 사용하여 시작한다. 선형 앰플리콘(amplicin)들은 그리고 나서 스트렙타비디닐레이트 비드(streptavidinylated bead)들에 결합되고 에피솜 벡터들을 제거하도록 세척된다. 임의 프라이머들로의 뒤따르는 제 2 가닥 DNA 합성이 CviQl 제한 소화를 뒤따랐다. 호환 가능한 링커는 그리고 나서 결찰되고, 네스트 PCR(nested PCR) 증폭들(청색의 프라이머들 2-3, 및 그리고 나서 적색의 프라이머들 4-5)의 2회가 뒤따랐다. CviQl은 표적화 및 야생형 대립형질들 모두 내의 상동 경계로부터 동일한 거리에서 절단하며, 따라서 비-바이어싱된 증폭을 허용한다. 제 2 네스트 PCR의 앰플리콘들은 그리고 나서 프라이머들 6-7(녹색) 또는 8-9(오렌지색)를 갖는 qPCR 분석을 위한 템플릿의 역할을 한다. b. mRNA 정량화를 위하여, qPCR에 대하여 cDNA를 발생시키도록 프라이머들 10-11 또는 11-12가 사용되었다. 도 1에서와 같은 형태 및 필 코드(fill code). c. 검정 바들은 간세포 빈도를 설명하기 위하여 0.7의 인자에 의해 보정된, 프라이머들 8-9에 의해 증폭된 cDNA 템플릿의 풍부도(abundance)에 대한 프라이머들 6-7에 의해 증폭된 cDNA 템플릿의 풍부도 사이의 비율로서 Alb 대립형질들의 표적화 비율을 나타낸다. 회색 바들은 프라이머들 11-12에 의해 증폭된 cDNA 템플릿의 풍부도에 대한 프라이머들 10-12에 의해 증폭된 cDNA 템플릿의 풍부도 사이의 비율로서 Alb 대립형질들의 발현 비율을 나타낸다. N=3이고, 에러 바들은 표준 편차를 나타낸다.
도 11. hF9 발현의 특이성. a. 프라이머들 13-14 또는 14-15를 갖는 qPCR 분석을 위한 템플릿으로 역할을 한, 폴리(poly)-dT 프라이머를 갖는 RT로부터 생산되는, cDNA. b. 프라이머들 14-15에 의해 증폭되는 cDNA 템플릿의 풍부도에 대한 프라이머들 13-14에 의해 증폭되는 cDNA 템플릿의 풍부도 사이의 비율로서 총 hF9 함유 mRNA들에 대한 바들은 Alb_hF9 mRNA들의 비율을 나타낸다. 각각의 그룹에 대하여 N=3이고, 에러바들은 표준 편차를 나타낸다. c. P2A에 대항하는 프로브를 갖는 간 샘플들의 노던ㅍ블롯 분석. 낮은 비-특이적 신호는 18S rRNA의 크기와 상응한다. d. AAV-P2A-hF9 구성 또는 역 대조군으로 주사된 마우스들의 간 샘플들로부터의 P2A의 웨스턴 블롯 분석. P2A는 알부민(66.5-Kd)에 융합되는 것으로 기대된다.
도 12. hF9 간 면역조직화학. 상단부터 하단까지, 패널들은 양성 대조군 인간 간, 음성 대조군 미처리된 마우스 간 및 AAV-8-P2A-hF9을 갖는 신생아들로서 또는 성체들로서 처리된 마우스들로부터 두 개의 대표적인 가닥 내의 DAPI 핵 대비염색체(청색)로의 인간 인자 9 염색(적색)을 나타낸다.
도 13. 표적화 비율 평가의 전략. 온-타겟 통합 비율의 평가는 게놈 자리에 어닐링하나(anealing) 벡터에는 어닐링하지 않는, 바이오틴레이트 프라이머 1(검정)을 갖는 선형 증폭(LAM)을 사용하여 시작한다. 선형 앰플리콘들은 그리고 나서 그트렙타비디닐레이트 비드들에 결합되고 에피솜 벡터들을 제거하도록 세척된다(단계 2). 임의 프라이머들로의 뒤따르는 제 2 가닥 DNA 합성(단계 3)이 CviQl 제한 소화가 뒤따랐다(단계4). 호환 가능한 링커는 그리고 나서 결찰되고(단계 5) 네스트 PCR 증폭들(청색의 프라이머들 2-3- 단계 6, 및 그리고 나서 적색의 프라이머들 4-5- 단계 7)의 2회가 뒤따랐다. CviQl은 표적화 및 야생형 대립형질들 모두 내의 상동 경계로부터 동일한 거리에서 절단한다. 따라서 비-바이어싱된 증폭을 허용한다. 제 2 네스트 PCR의 앰플리콘들은 그리고 나서 프라이머들 6-7(녹색) 또는 8-9(오렌지색)를 갖는 qPCR을 위한 템플릿으로서 역할을 한다(단계 8).
도 14. qPCR에 의한 표적화 비율 평가를 위한 표준 곡선들. 표적화된 대립형질들을 위한 qPCR 표준 곡선들(프라이머들 8과 9, 도 3) 및 비-표적화된 대립형질(프라이머들 6과 7, 도 3). 사용된 질량 단위는 기능적으로 몰 농도와 동등한데 그 이유는 사용된 모든 앰플리콘이 동일한 길이였기 때문이다.
도 15. ALT 측정에 의한 독성 평가. 알라닌 트랜스아미나아제 레벨들(ALT)이 본 실험 벡터(1e12)를 위한 AAV8 코딩, 또는 알려진 비-독성 카셋트(H1 프로모터 구동된 shRNA의 5e12)를 위한 음성 대조군 코딩, 또는 알려진 독성 카셋트(U6 프로모터 구동된 shRNA의 5e12)를 위한 양성 대조군 코딩으로 주사된 마우스들에서의 주사 후 7일에 평가되었다. 데이터는 각각의 그룹들에 대한 4개의 독립적인 마우스의 두 개의 측정의 평균을 나타낸다. 통계적 유의성은 여기서 상이한 분산의 샘플들 사이의 단측 검정에서 p＜0.05를 갖는 것으로 정의된다.
도 16. 벡터 복사 수. 8 및 9 프라이머들을 사용하여 qPCR에 의해 평가되는 벡터 복사 수(도 3). 성인들로서 주사사된 마우스들에 대하여 N=7이고 신생아들로서 주사된 마우스들에 대하여 N=6이며 부분 간 절제술 이전 이후에 분석되었다. 에러 바들은 표준 편자를 나타낸다.
도 17. 1000 게놈프로젝트(http://www.1000genomes.org)로부터 추출된 것과 같이 관련 Alb 자리에서 인간 개체군 내의 하플로타입(Haplotype)들.
도 18. AAV8-F9 또는 AAVDJ-F9 실험 구성(각각 n=4)의 마우스 당 1×1012 벡터 게놈을 갖는 9주령 암컷 B6 마우스들의 꼬리 정맥 주사들 이후에 ELISA에 의해 측정되는 플라스마 F9.
도 19. 마우스 당 1×1012 벡터 게놈에서(상단) AAV8-F9 또는 마우스 당 3×1011 벡터 게놈에서 AAV8-F9 트리플(하단)의 꼬리 정맥 주사들 2주 후에 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)의 부분적 응고 효율의 측정(각각 n=5). KO, 녹아웃. 에러 바들은 표준 편차를 나타낸다.
도 20. AAV8-F9 실험 구성(n=4)의 마우스 당 2.5×1011 벡터 게놈을 갖는 2일령 B6 마우스들의 표재성 측두 정맥 주사(superficial temporal vein injection)들 이후에 ELISA에 의해 측정되는 플라스마 F9.
도 21. AAV8-VRC01 실험 구성(각각 n=4)의 마우스 당 1×1012 벡터 게놈을 갖는 9주령 암컷 B5 마우스들의 꼬리 정맥 주사들 이후에 ELISA에 의해 측정되는 플라스마 VRC01(HIV에 대항하여 광범위하게 중화하는 항체). 에러 바들은 표준 편차를 나타낸다. 샌드위치 ELISA는 인간 IgG의 일정한 영역에 대항하여 항체들로 덮인 플레이트들을 사용하며 기능적 ELISA는 VRC01 항체에 의해 인식되는 항원인 HIV 당단백질 gp120으로 덮인 플레이트들을 사용한다.
외인성으로 제공되는 뉴클레아제의 세포의 게놈을 편집하기 위한 방법들 및 조성물들이 제공된다. 방법들의 양상은 세포를 표적 위치 내로 통합되도록 핵산 서열을 포함하는 표적화 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하며, 세포는 또한 뉴클레아제와 접촉되지 않는다. 게다가, 대상 방법들의 실행에 사용하는 시약들, 장치들 및 키트들이 제공된다. 본 발명의 이러한 대상들 또는 다른 대상들, 장점들, 및 특징들은 아래에 더 완전히 설명되는 것과 같이 조성물들에 상세내용의 구독 상에서 통상의 지식을 가진 자들에 자명해질 것이다.
본 발명의 방법들 및 조성물들이 설명되기 전에, 본 발명은 물론 그와 같이 다양할 수 있는, 설명되는 특정 방법 또는 조성물에 한정되지 않는다는 것에 유의하여야 한다. 또한, 여기서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 예들의 설명의 목적을 위한 것이며, 이를 한정하도록 의도되지 않는다는 것에 유의하여야 하는데, 그 이유는 본 발명의 범위는 첨부된 청구항들에 의해 한정될 것이기 때문이다.
값들의 범위가 제공될 때, 문맥이 명확하게 달리 설명하지 않으면 그러한 범위의 상한 및 하한 사이의, 하한의 단위의 1/10까지의, 각각의 중간 값이 또한 구체적으로 개시된다는 것에 유의하여야 한다. 설명된 범위 내의 어떠한 설명된 값 또는 중간 갑쇼 및 그러한 설명된 범위 내의 어떠한 다른 설명된 값 또는 중간 값 사이의 각각의 더 작은 범위가 본 발명 내에 포함된다. 이러한 더 작은 범위들의 상한 및 하한은 범위 내에 독립적으로 포함되거나 또는 배제될 수 있으며, 한계들 중 하나, 무, 또는 둘 모두가 더 작은 범위 범위들 내에 포함되는 각각의 범위가 또한 특히 설명되는 범위 내의 어떤 구체적으로 배제되는 한계의 대상이 되는, 본 발명 내에 포함된다. 설명되는 범위는 한계들 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 때, 그러한 포함된 제한들 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않으면, 여기서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 통상의 지식을 가진 자들에 의해 공통으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기서 설명되는 것과 유사하거나 또는 동등한 어떠한 방법들 및 재료들이 본 발명의 실행 또는 검사에 사용될 수 있으나, 일부 잠재적 및 바람직한 방법들과 재료들이 이제 설명된다. 여기서 언급되는 모든 문헌은 문헌들에서 인용된 것과 함께 방법들 및/또는 재료들을 개시하고 설명하도록 참조로써 여기에 통합된다. 본 발명은 모순이 존재하는 정도까지 통합된 문헌의 어떠한 내용도 선행한다는 것을 이해하여야 한다.
본 명세서를 구독하는 통상의 지식을 가진 자들에 자명해질 것과 같이, 여기서 설명되고 도시되는 각각의 개별 실시 예들은 개별 부품들 및 본 발명의 범위 또는 정신을 벗어나지 않고 다른 일부 실시 예들 중 어느 하나의 특징들로부터 쉽게 분리되거나 또는 쉽게 결합될 수 있는 특징들을 갖는다. 인용되는 어떠한 방법도 인용되는 이벤트들의 순서로 또는 논리적으로 가능한 어떠한 다른 순서로 수행될 수 있다.
여기서 사용되고 첨부된 청구항들에서 사용되는 것과 같이, 단수 형태들 "하나" "한", 및 "그"는 문맥이 명확하게 달리 설명하지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 사실에 유의하여야 한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 세포"는 복수의 그러한 세포를 포함하며 "펩티드(the peptide)"의 언급은 하나 이상의 펩티드 및 그것의 등가물들, 예를 들면 종래에 통상의 지식을 가진 자들에 알려진, 폴리펩티드들 등등을 언급한다.
여기서 설명되는 문헌들은 단지 출원 날짜 이전에 그것의 설명을 위한 것이다. 여기서 어떠한 것도 본 발명이 종래 발명에 의해 그러한 공보를 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 제공되는 문헌의 날짜들은 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 공개 날짜와 다를 수 있다.
세포의 게놈을 편집하기 위한 방법들 및 조성물들이 제공된다. 게놈 편집은 관심 있는 핵산 서열이 삽입되거나, 대체되거나, 또는 게놈으로부터 제거되는 유전자 공학을 의미한다. 본 발명의 경우에서, 대상 방법들 및 조성물들은 특히 여기서는 "이식유전자(transgene)"로서 언급되는, 세포 내에 발현되는 핵산 서열의 삽입에 사용한다. 일부 경우들에서, 이식유전자들은 펩티드 또는 폴리펩티드를 위하여 코딩하는 RNA를 인코딩한다. 다른 경우들에서, 이식유전자는 비-코딩 RNA, 즉 펩티드 또는 단백질, 예를 들면 리보자임(ribozyme), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), akdlzmfhRNA(miRNA), 또는 그것들의 전구체(precursor), 긴 비-코딩 RNA(long-noncoding RNA) 등을 인코딩하는 핵산 서열을 인코딩하지 않는 RNA를 위하여 인코딩한다. 일부 경우들에서, 하나의 이식유전자는 표적 위치 내에 삽입된다. 다른 경우들에서, 하나 이상의 이식 유전자가 삽입되며, 예를 들면 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 이식 유전자가 표적 위치 내로 삽입된다. 일부 경우들에서, 대상 이식유전자는 바이러스 벡터 상의 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 표적 통합 부위 내로의 통합 상에서 그러한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
대상 방법들의 실행에 있어서, 세포의 게놈은 외인성 뉴클레아제의 사용 없이 편집된다. "뉴클레아제"는 이중 가닥 절단(double strand break)을 생성하기 위하여 DNA의 뉴클레오티드 서브유닛들, 예를 들면 게놈 DNA 또는 미토콘드리아 DNA 사이의 포스포디에스테르 결합(phosphodiester bond)을 절단할(cleaving) 수 있는 뉴클레오티드 효소를 의미한다. 뉴클레아제들의 많은 예가 인공적으로 설계된 아연 핑거 뉴클레어제들(Zinc finger nucleases, ZFNs), 전사활성화인자 유사 이팩터 뉴클레아제들(탈렌들, Transcription Activator-Like Effector Nucleases, TALENs), CRISPR/Cas 시스템, 및 설계된 메가뉴클레아제 재-설계된 호밍 엔도뉴클레아제들(engineered meganuclease re-engineered homing endonucleases), 및 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)들, RecBCD 엔도뉴클레아제, T7 엔도뉴클레아제, T4 엔도뉴클레아제 Ⅳ, Bal 31 엔도뉴클레아제, 엔도뉴클레아제 Ⅰ(endo I), 엔도뉴클레아제 Ⅱ(endo VI, exo III), 마이크로코쿠스 뉴클레아제(Microcccal nuclease), 뉴로스포라 엔도뉴클레아제(Neurospora endonuclease), S1-뉴클레아제, P1-뉴클레아제, 녹두 뉴클레아제(Mung bean nuclease) Ⅰ, 우스틸라고 뉴클레아제(Ustilago nuclease), Dnase Ⅰ, AP 엔도뉴클레아제, 및 EndoR과 같은, 자연적으로 발생하는 뉴클레아제들을 포함하여, 종래에 알려져 있다. 외인성 뉴클레아제는 세포의 외부로부터 오는 뉴클레아제들, 예를 들면 살아있는 세포 내에 존재하고 활성이나 그러한 세포 외부에서 기원하는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제의 핵산 인코딩을 의미한다. 여기서의 작업 실시 예들에서 설명되는 것과 같이, 세포 내의 표적이 되는 게놈 편집은 세포로의 뉴클레아제들의 제공 없이, 즉 세포의 뉴클레아제 또는 뉴클레아제의 핵산 인코딩과의 접촉 없이 달성될 수 있다.
외인성 뉴클레아제의 사용이 없는 게놈 편집은 외인성 뉴클레아제의 사용에 요구하는 방법들에 대하여 다수의 이익을 제공한다. 예를 들면, 뉴클레아제들은 뉴클레아제 코딩 유전자를 전달하는 벡터들에서와 같이, 면역성일 수 있다. 게다가, 뉴클레아제 활성은 두 표적 특이 및 오프-타겟 절단 모두에 기인하여 유전독성일 수 있다. 게다가, 세포 내로의 유전자 코딩 서열의 도입은 이와 함께 뉴클레아제 코딩 서열의 게놈 내로의 가능한 통합 및 뉴클레아제의 뒤따르는 적절한 발현의 위험을 수반하며, 이는 면역성 및 유전독성의 훨씬 큰 위험뿐만 아니라 뉴클레아제의 발현을 구동하는 프로모터에 의하거나 또는 뉴클레아제들을 위하여 코딩하는 벡터 상에 존재하는 다른 프로모터들에 의해 근처의 유전자들의 활성에 이르게 한다. 뉴클레아제가 없는 방버브이 사용은 이러한 위험성을 제거한다.
대상 방법들의 실행에 있어서, 세포의 게놈 내로 통합되는 이식유전자가 여기서는 "표적화 벡터(targeting vector)"로서 언급되는, 벡터 상에서 세포들에 제공된다. 바꾸어 말하면, 세포들은 표적화 통합에 의해 세포 게놈 내로 통합되는 핵산 서열을 포함하는 표적화 벡터와 접촉된다. 아래의 상세한 설명에서, 표적화 벡터들을 포함하는 조성물들이 설명될 것이며, 그것들의 사용을 위한 바람직한 방법들이 뒤따를 것이다.
조성물들
본 발명의 양상에서, 예를 들면 본 발명의 방법들에 의해, 게놈 편집에 사용하는 조성물들이 제공된다. 일부 실시 예들에서, 조성물은 표적화 벡터이다. 위에 설명된 것과 같이, 표적화 벡터는 세포의 게놈 내로 통합되는 이식유전자를 포함하는 벡터를 언급한다. 본 발명에 의해 포함되는 표적화 벡터의 예들은 바이러스 벡터들 및 비-바이러스 벡터들, 예를 들면 플라스미드들, 미니서클(minicircle)들 등을 포함한다.
일부 실시 예들에서 표적화 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 바이러스 또는 세포 내로의 삽입을 위하여 외부 DNA의 절편이 삽입될 수 있는 바이러스 염색체 물질을 언급한다. DNA는 세포 내로의 전달을 위하여 삽입될 수 있다. 그것의 생명 주기에서 DNA 단계를 포함하는 어떠한 바이러스도 대상 방법들 및 조성물들에서의 바이러스 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 바이러스는 단일 가닥 DNA(ssDNA) 바이러스 또는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 바이러스일 수 있다. 또한 그것들의 생명 주기에서 DNA 단계를 갖는 RNA 바이러스들, 예를 들면 레트로바이러스(retrovirus)들, 예를 들면 MMLV, DNA 내로 역전사되는 렌티바이러스(lentivirus)가 적합하다. 바이러스는 통합 바이러스 또는 비-통합 바이러스일 수 있다.
한 가지 비-제한적 예로서, 관심 있는 하나의 바이러스는 아데노 연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV)이다. 아데노 연관 바이러스, 또는 "AAV"는 바이러스 자체 또는 그것의 유도체들을 의미한다. 용어는 달리 요구되는 것을 제외하고는, 모든 서브타입(subtype) 그리고 자연적 발생 및 재조합 형태 모두, 예를 들면 AAV 1형(AAV-1), AAV 2형(AAV-2), AAV 3형(AAV-3), AAV 4형(AAV-4), AAV 5형(AAV-5), AAV 6형(AAV-6), AAV 7형(AAV-7), AAV 8형(AAV-8), AAV 9형(AAV-9), AAV 10형(AAV-10), AAV 11형(AAV-11), 조류(avian) AAV, 소(bovine) AAV, 개(canine) AAV, 말(equine) AAV, 영장류(primate) AAV, 비-영장류 AAV, 양(ovine) AAV, 하이브리드 AAV (즉, 하나의 AAV 서브타입 및 캡시드 단백질(capsid protein) 및 또 다른 서브타입의 게놈 물질을 포함하는 AAV), 돌연변이 AAV 캡시드 단백질 또는 키메라(chimeric) AAV 캡시드(즉, AAV의 두 개 이상의 상이한 혈청형(serotype)으로부터 유도되는 영역들 또는 도메인들 또는 개별 아미노산들을 갖는 캡시드 단백질, 예를 들면 AAV-DJ, AAV-LK3, AAV-LK19)를 포함한다.
"재조합 AAV 벡터", 또는 "rAAV 벡터"는 AAV 기원이 아닌(즉, AAV에 폴리뉴클레오티드 이형인(heterologous)) 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 바이러스 또는 AAV 바이러스 염색체 물질을 의미하며, 일반적으로 세포 내로 통합되는 관심 있는 핵산 서열은 대상 방법들을 따른다. 일반적으로, 이형 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나, 그리고 일반적으로 두 개의 AAV 말단 반복 서열(inverted terminal repeat sequence, ITR)이 배열된다. 일부 경우들에서, 재조합 바이러스 벡터는 또한 재조합 바이러스 벡터 물질의 패키징(packaging)을 위하여 중요한 바이러스 유전자들을 포함한다. "패키징"은 바이러스, 입자, 예를 들면 AAV 바이러스 입자의 조립 및 인캡시데이션(encapsidation)을 야기하는 일련의 세포내 이벤트들을 의미한다. AAV 패키징을 위하여 중요한 핵산 서열들(즉, "패키징 유전자들")의 예들은 각각 아데노 연관 바이러스의 복제 및 인캡시데이션 단백질들을 위하여 인코딩하는, AAV "rep" 및 "cap" 유전자들을 포함한다. 용어 rAAV 벡터는 rAAV 입자들 및 rAAV 벡터 플라스미드들 모두를 포함한다.
"바이러스 입자"는 바이러스 기반 폴리뉴클레오티드를 싸는 캡시드를 포함하는 바이러스의 단일 단위, 예를 들면 바이러스 게놈(야생형 바이러스에서와 같은), 또는 예를 들면 대상 표적화 벡터(재조합 바이러스에서와 같은)를 언급한다. "AAV 바이러스 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질(일반적으로 야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질에 의한) 및 캡시드에 싸인 폴리뉴클레오티드 AAV 벡터로 구성되는 바이러스 입자를 언급한다. 만일 입자가 이형 폴리뉴클레오티드(즉, 포유동물 세포 내에 전달되는 이식유전자와 같은, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드)를 포함하면, 이는 일반적으로 "rAAV 벡터 입자" 또는 간단하게 "AAV 입자"로서 언급된다. 따라서, AAV 입자의 생산은 필연적으로 rAAV 벡터의 생산을 포함하는데, 그 이유는 그러한 벡터가 rAAV 입자 내에 포함되기 때문이다.
대상 표적화 벡터들은 세포 게놈 내의 관심 있는 특정 위치, 즉 "표적 자리"로의 이식유전자의 통합을 안내하도록 구성된다. 바꾸어 말하면, 통합은 표적화 통합이다. 표적화에 특히 관심 있는 포유동물 내의 자리들의 예들은 알부민 유전자; 콜라겐 유전자, 예를 들면 콜라겐 1형, 콜라겐 2형, 콜라겐 3형, 콜라겐 4형 콜라겐 5형, 콜라겐 6형, 콜라겐 7형, 콜라겐 8형, 콜라겐 9형, 콜라겐 10형, 콜라겐 11형, 콜라겐 12형, 콜라겐 13형, 콜라겐 14형 콜라겐 15형, 콜라겐 16형, 콜라겐 17형, 콜라겐 18형, 콜라겐 19형, 콜라겐 20형, 콜라겐 21형, 콜라겐 22형, 콜라겐 23형, 콜라겐 24형 콜라겐 25형, 콜라겐 26형, 콜라겐 27형, 콜라겐 28형; 액틴 유전자, 예를 들면 알파 액틴 및 베타 액틴; 등을 포함한다.
표적화된 통합을 촉진하기 위하여, 표적화 벡터는 통합의 부위에서 상동성 재조합에 관대한 핵산 서열들, 예를 들면 알부민 유전자, 콜라겐 유전자, 액틴 유전자 등과의 상동성 재조합에 관대한 서열들을 포함한다. 이러한 과정은 "표적" 분자, 즉 핵산 서열이 통합되는 핵산, 예를 들면 세포 게놈 내의 표적 위치의 템플릿 수선(template repair)에 대하여 "도너(donor)" 분자, 예를 들면 표적화 벡터를 사용하는, 핵산 서열 상동을 필요로 하며 도너로부터 표적으로 유전 정보의 전달에 이르게 한다. 이와 같이, 대상 조성물들의 표적화 벡터들에 있어서, 세포 게놈 내로 통합되는 이식유전자는 그것 및 상동성을 지탱하는 게놈 서열 사이의 상동 재조합을 지원하기 위하여, 절단 부위에서 게놈 서열에 대한 충분한 상동성, 예를 들면 절단 위치의 약 50 염기 이하 내, 예를 들면 약 30 염기 내, 약 15 염기, 내, 약 10 염기 내, 약 5 염기 내의, 절단 위치를 플랭킹하거나 또는 표적 통합 위치를 바로 플랭킹하는 뉴클레오티드 서열들과의 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100 상동성을 포함할 수 있다. 도너 및 게놈 서열 사이의 서열 상동성의 약 25, 50, 100, 250, 또는 500 뉴클레오티드 또는 그 이상이 그것들 사이의 상동 재조합을 지원할 것이다.
일부 실시 예들에서, 상동 재조합에 관대한 플랭킹 서열들의 존재는 플랭킹 서열들이 없거나 또는 표적 자리에 대하여 상동성이 아닌 플랭킹 서열들(예를 들면, 상이한 게놈 자리에 대하여 상동성인 플랭킹 서열들, 표적 게놈 내의 어떠한 위치에 대하여 어떤 상동성도 없는 플랭킹 서열들 등)을 갖는 벡터와 비교하여, 증가된 비율의 표적 위치 통합을 제공한다. 일부 실시 예들에서, 조직 내의 세포들 중에서 또는 표적화 벡터를 수용하는 세포들 중에서 0.01% 이상(예를 들면, 0.05% 이상, 0.1% 이상, 0.2% 이상, 0.3% 이상, 0.4% 이상, 0.5% 이상, 0.6% 이상, 0.7% 이상, 0.8% 이상, 0.9% 이상, 1% 이상, 1.5% 이상, 2% 이상, 5% 이상, 10% 이상)의 표적 자리는 투여 이후에 통합된 이식유전자를 포함한다. 표적 자리 내로의 통합의 비율은 어떠한 적절한 분석(예를 들면, 여기서 설명되는 것과 같은 선형 증폭 분석(linear amplification assay))에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시 예들에서, 이식유전자 발현은 실질적으로 표적 자리에서의 통합으로부터 야기한다. 예를 들면, 일부 경우들에서 75% 이상(예를 들면, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상)의 총 이식유전자 발현이 표적 자리에서 통합된 이식유전자로부터 존재한다. 바꾸어 말하면, 일부 경우들에서, 표적 자리에서의 통합으로부터의 발현과 비교하여 표적 자리에서의 통합 이외의 소스들로(예를 들면, 에피솜 발현, 또는 비-표적 자리에서의 통합)부터의 이식유전자의 상대 분획은 25% 이하(예를 들면, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하 등)이다. 표적-자리 기반 통합의 발현 비율은 어떤 적절한 분석, 예를 들면 여기에 개시되는 분석에 의해 측정될 수 있다.
플랭킹 재조합 서열들은 어떠한 길이, 예를 들면 10 뉴클레오티드 이상, 50 뉴클레오티드 이상, 100 뉴클레오티드 이상, 250 뉴클레오티드 이상, 500 뉴클레오티드 이상, 1000 뉴클레오티드(1 kb) 이상, 5000 뉴클레오티드(5 kb) 이상, 10000 뉴클레오티드(10 kb) 이상 등일 수 있다. 일반적으로, 도너 서열의 상동 영역(들)은 재조합이 원하는 게놈 서열에 대하여 적어도 50% 서열 식별을 가질 것이다. 특정 실시 예들에서, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 99.9% 서열 식별이 존재한다. 표적화 벡터의 길이에 의존하여, 1% 및 100% 서열 식별 사이의 어떠한 값이 존재할 수 있다
일부 경우들에서, 플랭킹 서열들은 실질적으로 길이가 서로 동일할 수 있으며, 예를 들면 길이는 나머지 플랭킹 서열보다 30% 짧거나 또는 그 이하, 나머지 플랭킹 서열보다 20% 짧거나 또는 그 이하, 나머지 플랭킹 서열보다 10% 짧거나 또는 그 이하, 나머지 플랭킹 서열보다 5% 짧거나 또는 그 이하, 나머지 플랭킹 서열보다 2% 짧거나 또는 그 이하, 혹은 나머지보다 단지 수 뉴클레오티드 짧을 수 있다. 다른 경우들에서, 플랭킹 서열은 실질적으로 서로 길이가 다를 수 있으며, 예를 들면 길이는 나머지 플랭킹 서열보다 40% 짧거나 또는 그 이상, 50% 짧거나 또는 그 이상, 때때로 60% 짧거나 또는 그 이상, 70% 짧거나 또는 그 이상, 80% 짧거나 또는 그 이상, 90% 짧거나 또는 그 이상, 혹은 95% 짧거나 또는 그 이상일 수 있다.
흔히, 적어도 하나의 플랭킹 재조합 서열은 표적 자리에서 유전자를 위한 코딩 서열을 포함할 것이다. 예를 들면, 만일 표적 통합 위치가 내인성 유전자의 3' 말단을 포함하면, 이식유전자의 5'인 표적화 벡터 상의 재조합 서열은 실질적으로 내인성 유전자의 종결 코돈의 상류의, 예를 들면 인접한 DNA 서열과 상동일 것이며, 이식유전자의 3'인 표적화 벡터 상의 재조합 서열은 실질적으로 내인성 유전자의 종결 코돈의 하류의, 예를 들면 인접한 DNA 서열에 상동일 것이다. 또 다른 예로서, 만일 표적 통합 위치가 내인성 유전자의 5' 말단을 포함하면, 이식유전자의 5'인 표적화 벡터 상의 재조합 서열은 실질적으로 내인성 유전자의 개시 코돈의 상류, 예를 들면 인접한 DNA 서열과 상동일 것이며, 이식유전자의 3'인 표적화 벡터 상의 재조합 서열은 실질적으로 내인성 유전자의 개시 코돈의 하류, 예를 들면 인접한 DNA 서열에 상동일 것이다. 표적 자리에서 유전자를 위한 코딩 서열의 표적 자리 내로의 통합은 많은 용도에 활용한다. 예를 들면, 삽입 위치의 하류, 예를 들면 3'인 표적 자리에서의 유전자를 위한 코딩 서열의 통합은 유전자의 발현이 실질적으로 관심 있는 유전자의 통합에 의해 방해되지 않는다는 것을 보장한다. 또 다른 예로서, 예를 들면 유전적 장애를 치료하도록 돌연변이 표적 자리를 야생형 유전자 서열과 보완하기 위하여, 예를 들면 만일 세포의 표적 자리에서의 유전자가 돌연변이라면, 세포의 표적 저리에서 그것과 변이체(variant)인 유전자 서열을 발현하도록 표적 위치에서의 유전자를 위한 코딩 서열을 통합하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시 예들에서, 실질적으로 편집된 자리에서 유전자의 발현을 방해하지 않고 세포의 게놈을 편집하는 것이 바람직하다. 이러한 말단을 향하여, 표적화 벡터는 또한 실질적으로 표적 자리에서 유전자의 발현을 방해하지 않고 이식유전자의 발현을 제공하는 하나 이상의 부가적인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 표적화 벡터는 표적 통합 위치 내로의 이식유전자의 통합 상에서 두 개의 독립적인 유전자 제품 - 표적 자리에서의 내인성 유전자, 및 통합된 이식유전자 - 의 생산을 촉진하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 그러한 핵산 서열들의 예들은 2A 펩티드; IRES; 인테인(intein); 위치 특이적 프로테아제를 위한 인식 서열(recognition sequence), 응고 연쇄반응(coagulation cascade)의 일부분으로서 절단되는 절단 가능한 링커(cleavable linker)를 인코딩하는 서열; 인자 XI 절단 위치를 인코딩하는 서열; 및 인트론 스플라이스 공여체(intronic splice donor)/접합 수용체 서열들;을 포함한다.
"2A 펩티드"는 단일 코딩 서열 내의 개별 단백질 산물들의 효율적인 조화 발현(concordant expression)을 허용하는 작은(18-22 아미노산) 펩티드 서열을 의미한다. 어떤 편리한 2A 펩티드, 예를 들면 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus, F2A), 말 비염(equine Rhinitis) A 바이러스, 돼지 테스코바이러스(porcine teschovirus)-1(P2A) 또는 토세어 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus, T2A), 또는 Szymczak-Workman, A.등. "Design and Construction of 2A Peptide-Linked Multicistronic Vectors"에서 설명된 2A 펩티드들 중 어느 하나와 같은, 바이러스로부터의 2A 펩티드가 표적화 벡터 내에서 사용될 수 있다. Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (ed. Friedmann and Rossi). CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007로부터 적용되며, 이는 참조로써 여기에 전체가 통합된다.
일반적으로, 이식유전자 및 2A 펩티드 코딩 서열은 이식유전자의 삽입 상에서 표적 자리에서 내인성 유전자의 중단되지 않는 발현, 즉 전사, 해것 및 활성을 제공하도록 표적화 벡터 상에 위치될 것이다. 예를 들면, 이식유전자를 표적 자리에서 내인성 유전자의 5' 단부 근처의 통합 위치, 즉 표적 위치에서 내인성 유전자의 개시 코돈의 바로 하류 내로 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 경우들에서, 2A 펩티드 코딩 서열은 그것이 이식유전자에 바로 3'이 되도록 표적화 벡터 내에 위치될 수 있으며 선택된 재조합 서열들의 플랭킹은 표적 자리에서 내인성 유전자의 개시 코돈의 바로 하류의 통합 위치로 이식유전자-2A 펩티드 코딩 서열 카셋트의 상동성 재조합 및 통합을 안내할 것이다. 또 다른 예로서, 이식유전자를 표적 자리에서 내인성 유전자의 3' 단부 내의 통합 위치, 즉 표적 위치에서 내인성 유전자의 종결 코돈의 바로 상류 내로 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 경우들에서, 2A 펩티드 코딩 서열은 그것이 이식유전자에 바로 5'이 되도록 표적화 벡터 내에 위치될 수 있으며 선택된 재조합 서열들의 플랭킹은 표적 자리에서 내인성 유전자의 종결 코돈의 바로 상류의 통합 위치로 2A-이식유전자 카셋트의 상동성 재조합 및 통합을 안내할 것이다.
"내부 리보솜 유입 위치(internal ribosome entry site" 또는 "IRES"는 메신저 RNA(mRNA) 서열의 중간에서 단백질 해석의 개시를 허용하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 예를 들면, IRES 단편이 비시스트로닉(bicistronic) 진핵세포 mRNA 분자 내의 두 개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 사이에 위치될 때, 이는 mRNA 분자의 5' 말단에 결합된 5' 캡 구조와 관계없이, 즉 상류 단백질 코딩 영역 상류의 앞에서 하류 단백질 코딩 영역의 해석을 유도할 수 있다. 그러한 단백질의 설립은 세포 내에서 생산된다. 제 1 시스트론 내에 위치되는 단백질은 캡 의존적 개시 접근법에 의해 합성되며, 제 2 단백질의 해석 개시는 두 개의 단백질 코딩 영역 사이의 인터시스트론 스페이서(intercistronic spacer) 영역 내에 위치되는 IRES 단편에 의해 향해진다. IRES들은 바이러스 게놈들 및 세포 게놈들로부터 분리되었다. 인공적으로 조작된 IRES들이 또한 종래에 알려져 있다. 어떠한 편리한 IRES도 도메인 폴리뉴클레오티드에서 사용될 수 있다.
일반적으로, 2A 펩티드에서와 같이, 이식유전자 및 IRES는 이식유전자의 삽입 상에서 표적 자리에서 유전자의 중단되지 않는 발현을 제공하도록 표적화 벡터 상에 위치될 것이다. 예를 들면, 이식유전자를 표적 자리에서 유전자의 5' 해석되지 않은 영역(UTR) 내의 통합 자리 내로 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 경우들에서, IRES는 그것이 이식유전자의 바로 3'이 되도록 표적화 벡터 내에 위치될 수 있으며 선택된 재조합 서열들의 플랭킹은 표적 자리에서 유전자의 5' UTR 내의 통합 위치로 IRES-이식유전자 카셋트의 상동성 재조합 및 통합을 안내할 것이다. 또 다른 예로서, 이식유전자를 표적 우치에서 유전자의 3' UTR 내의 통합 위치 내로, 즉 종결 코돈의 하류이나, 폴리에닐레이션 서열의 상류로 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 경우들에서, IRES는 그것이 이식유전자의 바로 5'이 되도록 표적화 벡터 내에 위치될 수 있으며 선택된 재조합 서열들의 플랭킹은 표적 자리에서 유전자의 3' UTR 내의 통합 위치로 IRES-이식유전자 카셋트의 상동성 재조합 및 통합을 안내할 것이다.
"인테인"은 스스로 절제할 수 있고 펩티드 결합으로 번역된 폴리펩티드 서열("엑스테인(extein)들")의 나머지 부분을 재결합할 수 있는 단편을 의미한다. 바꾸어 말하면, 표적화 벡터는 해석될 때, 변형된 표적 자리로부터 인코딩되는 단백질의 폴리펩티드로부터 이식유전자에 의한 절제를 촉진하는, 핵산 서열을 포함한다. 인테인들은 자연적으로 발생하는 인테인들, 즉 그것들 고유의 서열들을 절제하고 플랭킹 엑스테인 서열들을 결합하기 위하여 단백질 스플라이싱 반응을 자연적으로 촉매작용을 하는 인테인들일 수 있거나, 혹은 인공적 인테인들, 즉 제어 가능한 스플라이싱을 수행하기 위하여 유전자 조작된 인테인들일 수 있다. 인테인들은 일반적으로 가장 N-말단 위치 및 TXXH 서열 하류에서 Cys(C), Ser)S), Ala(A), Gln(Q) 및 Pro(P)를 포함하는 N-말단 스플라이싱 영역; 및 가장 C-말단 위치에서 Asn(N), Gln(Q) 또는 Asp(D)를 포함하고 끝에서 두 번째 C-말단 위치에서 His(H)를 포함하는 C-말단 스플라이싱 영역을 포함한다. 게다가, Cys(C), Ser(S) 또는 The(T)은 인테인이 스플라이싱되는 엑스테인의 +1 위치 내에 위치된다(엑스테인의 -1 및 +1은 인테인 삽입 위치에 대하여, 각각 바로 N-말단 및 C-말단 위치들로서 정의된다). 인테인들이 단백질 스플라이싱을 촉진하는 메커니즘 및 인테인 스플라이싱에 대한 요구조건이 Liu, X-Q, "Protein Splicing Intein: Genetic Mobility, Origin, and Evolution" Annual Review of Genetics 2000, 34: 61-76 및 예를 들면 at "tools.neb.com/inbase/mech.php"에서 월드 와이드 웹 상에서 발견되는, New England Biolabs 웹사이트 상의 InBase 데이터베이스와 같은, 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스들에서 발견될 수 있으며, 이들은 여기에 참조로써 통합된다. 어떠한 서열들, 예를 들면, 자연적 또는 제어식 절제든지간에, 도너 폴리뉴클레오티드 상에서 인테인 관련 절제를 부여하는 것으로 알려진, N-말단 스플라이싱 영역들 및 C-말단 스플라이싱 영역들이 대상 조성물들에서 사용한다. 인테인들로서 구성되는 관심 있는 유전자들은 표적 자리의 어떤 엑손 내의 통합 위치에서, 즉 표적 자리에서 개시 코돈 및 종결 코돈 사이에 삽입될 수 있다.
위치 특이 단백질분해효소를 위한 인식 서열은 일반적으로 단백질 가수분해를 실행하는 효소에 의해 인식되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 일부 경우들에서, 그러한 아미노산 서열은 "절단 가능한 링커(cleavable linker)"로서 언급된다. 일부 경우들에서 절단 가능한 링커는 응고 캐스케이드(coagulation cascade)의 일부분으로서 절단된다(예를 들면 일부 경우들에서, 위치 특히 단백질분해효소를 위한 인식 서열은 인자 XI 절단 위치이다). 고도로 특이적인 단백질분해효소 및 그것들이 절단하는 서열들의 비-제한 예들은 트롬빈(그것의 절단 위치(Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser)에서 아르기닌 잔류 뒤에 절단하는), TEV 단백질분해효소(그것의 절단 위치(Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Ser)에서 글루타민 잔류 뒤에 절단하는), 퓨린(Furin, 서열(Arg-X-(Lys/Arg)-Arg)의 마지막 알기닌 뒤에 절단하는), 엔테로키나아제(Enterokinase, 그것의 절단 위치(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)에서 리신 뒤에 절단하는); 인자 Xa (그것의 절단 위치(Ile-(Glu or Asp)-Gly-Arg)에서 아르기닌 잔류 뒤에 절단하는); 게네나아제(Genenase) Ⅰ (위치(Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr)에서 절단하는); HRV 3C 단백질분해효소(그것의 절단 위치(Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro)에서 글루타민 잔류 뒤에 절단하는)를 포함한다. 일부 실시 예들에서, 절단 가능한 링커는 세포내 단백질분해효소에 의해 절단된다. 일부 실시 예들에서, 절단 가능한 링커는 세포외 단백질분해효소에 의해 절단된다.
"인트론"은 유전자의 최종 성숙 RNA 산물을 발생시키도록 RNA 스플라이싱(RNA 스플라이싱)에 의해 제거되는 유전자 내의 어떠한 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 바꾸어 말하면, 표적화 벡터는 전사될 때, 이식유전자가 표적 자리의 mRNA로부터 개별적으로(그렇지 않으면, 만일 이식유전자가 siRNA, miRNA 등을 인코딩하면) 전사되도록 허용하는, 변형된 표작 자리로부터 전사되는 전-RNA로부터 관심 있는 유전자에 의해 인코딩되는 전-RNA의 절제(excision)를 촉진하는, 핵산 서열들을 포함한다. 인트론들은 일반적으로 5' 스플라이스 위치(스플라잇 도너), 3' 스플라이스 위치(스플라이스 수용체) 및 분기 위치를 포함한다. 스ㅍ플라이스 도너는 인트론의 5' 말단에서 거의 변하지 않는 서열(GU)을 포함한다. 스플라이스 수용체는 거의 변하지 않는 AG 서열을 갖는 인트론을 종결한다. 스플라이스 수용체로부터의 상류(5'-워드(ward))는 피리미딘들(C 및 U) 또는 폴리피리미딘 트랙트가 높은 영역이다. 폴리피리미딘 트랙트로부터의 상류는 아데닌 뉴클레오티드를 포함하는, 분기 지점이다. 이러한 요소들의 포함에 더하여, 표적화 벡터는 관심 있는 유전자로부터 전사되는 mRNA의 번역을 촉진하는 하나 이상의 부가적인 서열, 예를 들면 코작 공통 서열(Kozak consensus sequence), 리보솜 결합 위치, 내부 리보솜 유입 위치 등을 포함할 수 있다. 인트론들로서 구성되는 관심 있는 유전자들은 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 5' 어디에서나, 예를 들면 표적 자리에서 유전자의 3' 번역되지 않은 영역, 코딩 서열, 또는 5' 번역되지 않은 영역에서 표적 자리의 전사된 서열 내의 통합 자리에서 삽입될 수 있다.
위에 설명된 것과 같이, 일부 경우들에서, 관심 있는 두 개 이상의 유전자, 예를 들면 관심 있는 세 개 이상, 4개 이상, 또는 5개 이상의 유전자를 표적 자리 내로 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 경우들에서, 다수의 2A 펩티드 또는 IRES가 비시스트로닉 또는 멀티시스트로닉9multicistronic) 표적화 벡터를 생성하도록 사용될 수 있다. 예를 들면, 이식유전자 및 선택가능한 마커는 표적 자리에서 유전자의 3' 영역 내로 통합될 수 있으며, 2A 펩티드들은 표적 자리에 의해 인코딩된 폴리펩티드로부터 그리고 서로로부터 그것들의 절단을 촉진하도록 사용된다. 대안으로서, 관심 있는 코딩 서열들은 표적 자리에서 유전자의 그것과 구별되는 프로모터의 제어 하에서 표적화 벡터 상에 제공될 수 있다.
일반적으로, 관심 있는 유전자, 2A 펩티드, 및 재조합 서열들은 관심 있는 유전자의 삽입 상에서 표적 자리에서 유전자의 중단되지 않는 발현을 위하여 제공하도록 표적화 벡터 상에 위치될 것이다. 예를 들면, 위에 설명된 것과 같이, 관심 있는 유전자를 표적 자리에서 유전자의 개시 코돈의 3' 또는 "하류"인, 예를 들면 표적 자리에서 유전자를 위한 개시 코돈(즉, 시작 ATG)의 첫 번째 50 뉴클레오티드 3' 내의, 예를 들면 개시 코돈의 첫 번째 25 뉴클레오티드 3' 내의, 개시 코돈의 첫 번째 10 뉴클레오티드 3' 내의, 개시 코돈의 첫 번째 5 뉴클레오티드 3' 내의, 또는 일부 경우들에서, 개시 코돈의 바로 3', 즉 개시 코돈에 인접한, 통합 자리 내로 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 경우들에서, 2A 펩티드는 그것이 관심 있는 유전자의 바로 3'에 위치되도록 표적화 벡터 내에 위치될 수 있으며 선택된 재조합 서열들의 플랭킹은 표적 자리에서 관심 있는 유전자의 상동성 재조합 및 통합을 개시 코돈의 3'인 통합 자리로 안내할 것이다. 또 다른 예로서, 관심 있는 유전자를 표적 자리에서 유전자의 종결 코돈의 5' 또는 "상류"인, 예를 들면 말단 코돈(즉, 종결 코돈, 예를 들면 TAA, TAG 또는 TGA)의 첫 번째 50 뉴클레오티드 5' 내의, 예를 들면 말단 코돈의 첫 번째 25 뉴클레오티드 5' 내의, 예를 들면 말단 코돈의 첫 번째 10 뉴클레오티드 5' 내의, 예를 들면 말단 코돈의 첫 번째 5 뉴클레오티드 5' 내의, 또는 일부 경우들에서, 종결 코돈의 바로 5', 즉 말단 코돈에 인접한, 통합 자리 내로 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 경우들에서, 2A 펩티드는 그것이 관심 있는 유전자의 바로 5'에 존재하도록 표적화 벡터 내에 위치될 수 있이며 선택된 재조합 서열들의 플랭킹은 표적 자리에서 관심 있는 유전자의 상동성 재조합 및 통합을 종결 코돈의 5'인 통합 자리로 안내할 것이다.
표적화 벡터는 또한 서열들, 예를 들면 통합 자리에서 관심 있는 유전자의 성공적인 삽입을 위하여 액새스하도록 사용될 수 있는, 제한 자리들, 뉴클레오티드 동질이상(polymorphism), 선택 가능한 마커들 등을 포함할 수 있다. 일반적으로, 표적화 벡터는 또한 서열들, 예를 들면 바이러스 서열들, 예를 들면 관심 있는 표적 영역에 상동이 아니고 관심 있는 표적 영역 내로의 삽입을 위하여 의도도지 않는, 복제 기원들, 캡 유전자, rep 유전자, ITR들 등을 포함하는 벡터 백본을 포함할 것이다.
방법들
대상 방법들의 실행에 있어서, 세포, 예를 들면, 유사분열 세포, 후-유사분열 세포는 생체외 또는 생체내에서 표적화 벡터와 접촉된다. 바꾸어 말하면, 세포들은 표적화 벡터들이 세포들에 의해 잡히도록 표적화 벡터와 접촉된다. 대상 표적화 벡터는 예를 들면 노출된(naked) 핵산으로서, 리보솜 또는 폴록사머(poloxamer)와 같은 제제로 복잡해진 핵산으로서, 바이러스(예를 들면, 아데노바이러스, AAV, 레트로바이러스) 내으 유전적 물질으로서, 세포에 의해 잡히는 표적화 벡터를 야기하는 어떤 편리한 방법에 의해 세포에 도입될 수 있다. 전기 천공법(electroporation), 염화칼슘 트랜스펙션(calcium chloride transfection) 및 리포팩션(lipofection)과 같이, 플라스미드들인 핵산 벡터들에 세포들을 접촉하는 방법들이 잘 알려져 있으며, 이들 중 어떠한 것도 사용될 수 있다. 핵산 벡터들의 바이러스 캡시드들 내로의 패키징, 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자들의 수확, 및 세포들의 핵산 벡터를 포함하는 바이러스 입자들과의 접촉을 위한 방법들 및 시스템들이 또한 종래에 알려져 있으며, 이들 중 어떠한 것도 사용될 수 있다. 일단 세포 내부에서, 표적화 벡터는 에피솜으로, 예를 들면 플라스미드들, 미니서클 DNA들, 아데노 연관 바이러스, 아데노바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)와 같은 바이러스들로서 유지될 수 있거나, 또는 그것들은 상동 재조합 또는 임의 통합, 예를 들면 MMLV, HIV-1, ALV 등과 같은 레트로바이러스 유도된 벡터들을 통하여, 표적 세포 게놈 내로 통합될 수 있다.
일부 실시 예들에서, 표적화 벡터는 표적화 벡토를 포함하는 바이러스 입자들로서 세포들에 제공된다. 그러한 경우들에서, 표적화 벡터는 일반적으로 대상 핵산 서열(들), 예를 들면 이식유전자, 두 개의 독립적인 유전자 산물의 생산을 촉진하는 핵산 서열, 바이러스 게놈 서열과 관련된 이형 서열들, 예를 들면 역 말단 반복들(inverted terminal repeats, ITRs)로서, 표적 통합 위치에 상동의 서열들 등을 포함할 것이다. 그것의 생명주기에서 DNS 단계를 포함하는 어떠한 바이러스들이 대상 방법들 및 조성물들에서 바이러스 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 바이러스들은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 바이러스 또는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 바이러스일 수 있다. 또한 그것들의 생명주기에서 DNA 단계를 갖는 RNA 바이러스들, 예를 들면 레트로바이러스들, 예를 들면 DNA 내로 역전사되는, MMLV, 렌티바이러스가 적합하다. 바이러스는 통합 바이러스 또는 비-통합 바이러스일 수 있다.
예를 들면, 아데노 연관 바이러스들이 대상 방법들에 특히 접착하다. 아데노 연관 바이러스 또는 AAV는 바이러스 자체 또는 그것들의 유도체를 의미한다. 용어는 달리 요구되지 않으면, 모든 서브타입 및 자연적 발생과 재조합형 형태 모두, 예를 들면, AAV 1형(AAV-1), AAV 2형(AAV-2), AAV 3형(AAV-3), AAV 4형(AAV-4), AAV 5형(AAV-5), AAV 6형(AAV-6), AAV 7형(AAV-7), AAV 8형(AAV-8), AAV 9형(AAV-9), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 하이브리드 AAV (즉, 하나의 AAV 서브타입의 캡시드 단백질 및 또 다른 서브타입의 게놈 물질을 포함하는 AAV), 돌연변이 AAV 캡시드 단백질 또는 키메라 AAV 캡시드(즉, 두 개 이상의 상이한 AAV의 서브타입으로부터 유도되는 영역들 또는 도메인들 또는 개별 아미노산들을 갖는 캡시드 단백질, 예를 들면 AAV-DJ, AAV-LK3, AAV-LK19)를 포함하는 AAV 등을 포함한다.
관심 있는 이형 핵산 서열들, 예를 들면, 이식유전자, 두 개의 독립적인 유전자 산물의 생산을 촉진하는 핵산 서열, 표적 통합 자리에 상동의 서열들을 포함하고, AAV 비리오(virion)을 발생시키도록 사용되는 AAV 발현 벡터는 종래에 잘 알려져 있는 방법들을 사용하여 구성될 수 있다. 예를 들면, Koerber 등. (2009) Mol. Ther. 17:2088; Koerber 등. (2008) Mol Ther.16:1703-1709; 미국특허 제7,439,065호, 6,951,758호, 및 6,491,907호가 참조된다. 예를 들면, 이형 서열(들)은 그것으로부터 절단된 주요 AAV 오픈 리딩 프레임들(ORFs)을 가진 AAV 게놈 내로 직접적으로 삽입될 수 있다. ITRs의 충분한 부분이 복제 및 패키징 기능을 허용하도록 남아있는 한, AAV의 다른 게놈들이 또한 결실될 수 있다. 그러한 구성들은 종래에 알려진 기술들을 사용하여 디자인될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제5,173,414로 및 5,139,941호; 국제특허 제 WO 92/01070호(1992년 1월 23일에 공개된) 및 제 WO 93/03769호(1993년 3월 4일에 공개된); Lebkowski 등. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent 등. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97-129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling 및 Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; 및 Zhou 등. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875이 참조된다.
rAAV 비리온들을 생산하기 위하여, AAV 발현 벡터는 트랜스펙션에 의한 것과 같이, 알려진 기술들을 사용하여 적절한 숙주 세포 내로 도입된다. 예를 들면, Graham 등. (1973) Virology, 52:456, Sambrook 등. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis 등. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu 등. (1981) Gene 13:197이 참조된다. 특히 적절한 트랜스펙션 방법들은 인산칼슘 공동 침전(calcium phosphate co-precipitation) (Graham 등. (1973) Virol. 52:456-467), 배양된 세포들 내로의 직접적인 미세-주입(Capecchi, M. R. (1980) Cell 22:479-488), 전기천공법(Shigekawa 등. (1988) BioTechnigues 6:742-751), 리포솜 매개된 유전자 전달(Mannino 등. (1988) BioTechniques 6:682-690), 리포솜 매개된 형질도입(Felgner 등. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417), 및 고속도 미세사출물(microprojectile)들을 사용하는 핵산 전달(Klein 등. (1987) Nature 327:70-73)을 포함한다.
AAV 비리온들을 생산하기에 적절한 숙주 세포들은 이형 DNA 분자의 수용체들로서 사용될 수 있거나 또는 사용된, 미생물들, 효모 세포들, 곤충 세포들, 및 포유동물 세포들을 포함한다. 용어는 트랜스펙션된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 여기서 사용되는 것과 같이 "숙주 세포"는 외인성 DNA 서열로 트랜스펙션된 세포를 언급한다. 안정적인 인간 세포주(cell line), 293(예를 들면, American Type Culture Collection under Accession Number ATCC CRL1573을 통하여 쉽게 이용 가능한)로부터의 세포들이 사용될 수 있다. 예를 들면, 인간 세포주 293은 아데노바이로스 5형 DNA 단편들로 트랜스팩션된 인간 배아 신장 세포주이며(Graham 등. (1977) J. Gen. Virol. 36:59), 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자들을 발현한다(Aiello 등. (1979) Virology 94:460). 293 세포주는 쉽게 트랜스팩션되며, rAAV 비리온들을 생산하기에 편리한 플랫폼을 제공한다. 곤충 세포들에서 AAV 비리온의 생산 방법들은 종래에 알려져 있으며, 대상 rAAV 비리온을 생산하도록 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국특허공보 제 2009/0203071호; 미국특허 제7,271,002호; 및 Chen (2008) Mol. Ther. 16:924이 참조된다.
생산되는 AAV 바이러스는 복제 가능 또는 복제 불가능일 수 있다. "복제 가능" 바이러스(예를 들면, 복제 가능 AAV)는 감염성인 표현형으로 야생형 바이러스를 언급하고, 또한 감염된 세포 내에서(예를 들면, 헬퍼 바이러스(helper virus)의 존재 또는 헬퍼 바이러스 기능의 존재 하에서) 복제될 수 있다. AAV의 경우에, 복제 가능성은 일반적으로 기능적 AAV 패키징 유전자들의 존재를 요구한다. 일반적으로, 여기서 설명되는 것과 같은 rAAV 벡터들은 하나 이상의 AAV 패키징 유전자의 결여에 의해 포유동물 세포들(특히 인간 세포들)에서 복제 불가능하다. 일반적으로, 그러한 AAV 벡터들은 복제 가능 AAC가 AAV 패키징 유전자들 및 들어오는 rAAV 벡터 사이의 재조합에 의해 발생되는 가능성을 최소화하기 위하여 어떠한 AAV 패키징 유전자 서열들이 부족하다. 많은 실시 예들에서, 여기서 설명되는 것과 같은 rAAV 벡터 제조들은 만일 있다면 소수의 어떤 복제 가능 AAV(rcAAV, 또한 RCA로서 언급되는)를 포함하는 것들이다(102 rAAV 입자 당 약 1 rcAAV 이하, 104 rAAV 입자 당 약 1 rcAAV 이하, 108 rAAV 입자 당 약 1 rcAAV 이하, 1012 rAAV 입자 당 약 1 rcAAV 이하, 또는 무 rcAAV).
세포들은 생체외 또는 생체내에서 예를 들면 플라스미드로서, 바이러스 등으로서 대상 표적화 벡터들과 접촉될 수 있다. 만일 생체외 접촉되면, 세포들은 확립된 세포주들로부터 존재할 수 있거나 또는 일차 세포(primary cell)들일 수 있으며, "일차 세포들", "일차 세포주들", 및 "일차 배양들"은 대상으로부터 유도되고, 예를 들면 대상으로의 복원을 위하여 상당한 부가적인 배양 없이 변형된, 예를 들면 변형된 체외(ex vivo), 또는 배양의 제한된 수의 패시지(passage), 즉 분열 동안 생체외 성장하도록 허용된, 세포들 및 세포 배양들을 언급하도록 여기서 호환하여 사용된다. 예를 들면, 일차 배양들은 0회, 1회, 2회, 3회 4회, 5회, 10회, 또는 15회 통과되었을 수 있으나, 위기 단계를 통과하기에 충분하지 않은 배양들이다. 일반적으로, 일차 세포주들은 생체외에서 10 패시지 이하로 유지된다. 일반적으로, 접촉되는 세포들은 상동성 재조합에 관대하다.
만일 세포들이 일차 세포들이면, 그것들은 어떠한 편리한 방법에 의해 개별로부터 수확될 수 있다. 예를 들면, 백혈구들은 성분채집술(apheresis), 백혈구 성분채집술(leukocytapheresis), 밀도 구배 분리(density gradient separation) 등에 의해 편리하게 수확될 수 있으며, 피부, 근육, 골수, 비장, 간, 췌장, 허파, 내장, 위 등과 같은 조직들로부터의 세포들은 가장 편리하게 생검(biopsy)에 의해 수확된다. 수확된 세포들의 분산 또는 침전을 위하여 적절한 용액이 사용될 수 있다. 그러한 용액은 평향 염 용액(balanced salt solution), 예를 들면 낮은 농도에서 수용 가능한 완충액과 함께, 태아 송아지 혈청 또는 자연적으로 발생하는 인자들로 편리하게 보충되는, 생리 식염수, PBS, 행크 평형 염류액(Hank's balanced salt solution) 등일 것이다. 편리한 완충액들은 HEPES, 인산 완충액들, 젖산 완충액 등을 포함한다. 세포들은 바로 사용될 수 있거나, 혹은 장기간 동안 저장되거나, 동결되며, 해동되고 재사용될 수 있다. 그러한 경우들에서, 세포들은 일반적으로 10% DMSO, 50% 혈청, 40$ 완충 배지, 또는 그러한 동결 온도에서 세포들을 보존하도록 종래에 통상적으로 사용되는 것과 같은 용액과 같은 다른 일부에서 동결될 것이며, 동결된 배양 세포들의 해동을 위하여 종래에 통상적으로 알려진 방법으로 해동될 것이다.
생체 외 DNA 통합을 유도하기 위하여, 예를 들면, 바이러스로서, 표적화 벡터는 약 30분 내지 약 24시간, 예를 들면 1시간, 1.5시간, 2시간, 2.5시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 12시간, 16시간, 18시간, 20시간 동안, 혹은 매일 내지 매 4일, 예를 들면 매 1.5일, 매 2일, 매 3일의 빈도로 반복될 수 있는, 약 30분부터 약 24의 어떤 다른 기간, 혹은 약 매일부터 약 매 4일까지의 어떤 다른 빈도 동안 세포들에 제공될 수 있다. 표적화 벡터는 대상 세포들에 1회 이상, 예를 들면 1회, 2회, 3회, 또는 3회 이상 제공될 수 있으며, 세포들은 각각의 접촉 이벤트 이후에 일부 기간 동안, 예를 들면 16-24시간 동안 표적화 벡터와 함께 배양하도록 허용되었으며, 이후에 배지는 신선 배지로 대체되고 세포들은 더 배양된다.
세포들의 표적화 벡터와의 접촉은 어떠한 배양 배지 및 세포들의 생존을 촉진하는 어떤 배양 조건들 하에서 발생할 수 있다. 예를 들면, 세포들은 태아 송아지 혈청 또는 열 불활성화 염소 혈청(약 5-10%), L-글루타민, 티올(thiol), 특히 2-메르캅토에탄올(mercaptoethanol), 및 항생물질, 예를 들면, 페니실린과 스트렙토마이신(streptomycin)이 보강된, 이소코브 변형 DMEM(Iscove's modified DMEM) 또는 RPNI 1640과 같은, 편리한 어떤 적절한 영양 배지 내에 침전될 수 있다. 배양은 세포들이 반응하는 성장 인자들을 포함한다. 여기서 정의되는 것과 같은, 성장 인자들은 막관통 수용체(transmembrane receptor) 상의 특정 효과들을 통하여, 배양액 또는 온전한 조직 내의, 세포들의 생존, 성장 및/또는 분화를 촉진할 수 있는 분자들이다. 성장 인자들은 폴리펩티드들 및 비-폴리펩티드 인자들을 포함한다.
일반적으로, 재조합 및 통합을 촉진하기 위하여 표적화 벡터의 유효량이 세포들에 제공된다. 표적화 벡터의 유효량은 음성 대조군, 예를 들면 빈 벡터와 접촉되는 세포에 대하여 이식유전자의 통합이 관찰되는 세포들의 수의 2배 증가 또는 그 이상을 유도하기 위한 양이다. 통합의 양은 어떤 편리한 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 자리 내의 관심 있는 유전자의 존재는 예를 들면, 유동 세포분석법(flow cytometry)dp 의해 검출될 수 있다. 삽입의 존재를 검출하기 위하여 표적 자리를 증폭할 프라이머들을 사용하여 PCR 또는 서던 교잡(Southern hybridizatio)이 실행된다. 관심 있는 통합된 유전자의 활성의 발현은 예를 들면 도너 폴리뉴클레오티드와 접촉 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 이상 이후에, 웨스턴(Western), ELISA, 단백질 활성을 위한 검사 등에 의해 결정될 수 있다.
일반적으로, 대상 조성물들 및 방법들을 사용하는 세포의 유전자 변형은 변형된 자리, 즉 표적 자리에서 유전자의 발현의 붕괴를 수반하지 않을 것이다. 바꾸어 말하면, 표적 자리에서 유전자의 정상 발현은 공간적으로, 시간적으로, 그리고 실질적으로 정상 레벨들로부터 변하지 않는 레벨들에서, 예를 들면 관심 있는 유전자의 표적 자리 내로의 통합 이후에 정상 레벨들과 5배 이하 다른, 예를 들면 정상 레벨들과 4배 이하, 또는 3배 이하, 더 일반적으로 2배 이하 다른 레벨들에서 유지된다.
일부 경우들에서, 세포들의 개체군은 나머지 개체군으로부터 유전적으로 변형된 세포들을 분리함으로써 이식유전자를 포함하는 것들로 강화될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포들의 분리는 일반적으로 표적 자리 내로 공동 통합된 선택 가능한 마커의 발현에 의존한다. "선택 가능한 마커"는 세포들, 예를 들면 본 발명의 조성물들에 의해 표적화된 세포들을 선택하도록 사용될 수 있는 제제를 의미한다. 일부 경우들에서, 선택은 양의 선택일 수 있으며, 즉 세포들은 예를 들면 유전적 변형을 포함하는 세포들의 강화된 개체군을 생성하기 위하여, 개체군으로부터 분리된다. 다른 경우들에서, 선택은 음의 선택일 수 있으며, 즉 개체군은 예를 들면 유전적 변형을 포함하지 않는 세포들의 강화된 개체군을 생성하기 위하여, 세포들로부터 떨어져 분리된다. 분리는 사용되는 선택 가능한 마커에 적절한 어떤 편리한 분리 기술일 수 있다. 예를 들면, 만일 형광 마커가 삽입되었으면, 세포들은 형광 활성 세포 분류에 의해 분리될 수 있으며, 반면에 만일 세포 표면 마커가 삽입되었으면, 세포들은 친화성 분리 기술(affinity separation technique)들, 예를 들면 자기 분리, 친화성 크로마토그래피, 고체 매트릭스에 부착되는 친화성 시약으로의 "패닝", 또는 다른 편리한 기술에 의해 이형 개체군으로부터 분리될 수 있다. 정확한 분리를 제공하는 기술들은 다중 색 채널, 저각도 및 둔각 광 산란 검출 채널들, 임피던스 채널(impedance channel)들과 같은, 다양한 정도의 고도성을 가질 수 있는, 형광 활성 세포 분별장치(fluorescence activated cell sorters s)를 포함한다. 세포들은 사멸 세포들과 관련된 염료들(예를 들면, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide))의 사용에 의해 사멸 세포들에 대항하여 선택될 수 있다. 우전적으로 변형된 세포들의 생존력에 과도하게 유해하지 않은 어떠한 기술이 사용될 수 있다.
이식유전자를 포함하는 세포들을 위하여 고도로 강화된 세포 조성물들은 이러한 방법으로 달성된다. "고도로 강화된"은 유전적으로 변형된 세포들이 세포 조성물의 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 예를 들면 세포 조성물의 약 95% 이상, dir 98% 이상 존재할 것을 의미한다. 바꾸어 말하면, 조성물은 실질적으로 유전적으로 변형된 세포들의 순수 조성물일 수 있다.
여기서 설명된 방법들에 의해 생산되는 유전적으로 변형된 세포들은 바로 사용될 수 있다. 대안으로서, 세포들은 액화 질소 온도들에서 동결되고 장기간 동안 저장될 수 있으며, 해동되고 재사용될 수 있다. 그러한 경우들에서, 세포들은 일반적으로 10% DMSO, 50% 혈청, 40$ 완충 배지, 또는 그러한 동결 온도에서 세포들을 보존하도록 종래에 통상적으로 사용되는 것과 같은 그러한 일부 다른 용액 내에서 동결될 것이며, 동결된 배양 세포들의 해동을 위하여 종래에 통상적으로 알려진 방법으로 해동될 것이다.
유전적으로 변형된 세포들은 다양한 배양 조건들 하에서 생체외 배양될 수 있다. 세포들은 배양 내에서 소비, 즉 그것들의 증식을 촉진하는 조건들 하에서 성장될 수 있다. 세포 배지는 예를 들면 아가(agar), 메틸셀룰로오스 등을 포함하는, 액체 또는 반-고체일 수 있다. 세포 개체군은 태아 송아지 혈청 또는 열 불활성화 염소 혈청(약 5-10%), L-글루타민, 티올, 특히 2-메르캅토에탄올, 및 항생물질, 예를 들면, 페니실린과 스트렙토마이신이 보강된, 이소코브 변형 DMEM 또는 RPNI 1640과 같은, 편리한 어떤 적절한 영양 배지 내에 침전될 수 있다. 배양은 세포들이 반응하는 성장 인자들을 포함한다. 여기서 정의되는 것과 같은, 성장 인자들은 막관통 수용체 상의 특정 효과들을 통하여, 배양액 또는 온전한 조직 내의, 세포들의 생존, 성장 및/또는 분화를 촉진할 수 있는 분자들이다. 성장 인자들은 폴리펩티드들 및 비-폴리펩티드 인자들을 포함한다.
이러한 방법으로 유전적으로 변형된 세포들은 예를 들면 질환을 치료하기 위하여 또는 항바이러스, 항병원성 또는 항암 치료로서 유전자 치료와 같은 목적들을 위하여, 농업에서 유전적으로 변형된 생물체들의 생산을 위하여, 또는 생물학적 연구를 위하여, 대상에 이식될 수 있다. 대상은 신생아, 유아, 또는 성인일 수 있다. 특히, 포유동물 대상들이 흥미롭다. 본 발명의 방법들로 치료될 수 있는 포유동물 종들은 개와 고양이; 말; 소; 양; 등 및 영장류, 특히 인간들을 포함한다. 동물 모델들, 특히 작은 포유동물들, 예를 들면, 쥐과(murine), 토끼목(lagomorpha) 등이 실험 연구들을 위하여 사용될 수 있다.
세포들은 예를 들면 그것들이 이식되는 조직 내의 그것들의 성장 및/또는 조직화를 지원하기 위하여 대상에 단독으로 혹은 적절한 기질 또는 매트릭스와 함께 제공될 수 있다. 일반적으로, 적어도 1×103 세포, 예를 들면 5×103 세포, 1×104 세포, 5×104 세포, 1×105 세포, 1×106 세포가 투여될 것이다. 세포들은 다음의 경로: 비경구(parenteral), 피하(subcutaneous), 정맥내(intravenous), 두개내(intracranial), 척수내(intraspinal), 안구내(intraocular), 또는 척수액(spinal fluid)내, 중 어느 하나를 통하여 대상에 도입될 수 있다. 세포들은 주사, 카테터 등에 의해 도입될 수 있다. 국소 전달, 즉 상처 부위로의 전달을 위한 방법들의 예들은 예를 들면 옴마야 레저버(Ommaya reservoir)를 통하여, 예를 들면 척추 강내(intrathecal) 전달(예를 들면, 여기에 참조로써 통합되는, 미국특허 제5,222,982호 및 5385582호 참조); 예를 들면, 관절 내로 시린지에 의한, 볼루스(bolus) 주사; 예를 들면 대류와 함께, 배관삽입(cannulation)에 의한, 지속적 주입(예를 들면, 여기에 참조로써 통합되는, 미국특허출원 제20070254842호 참조); 세포들이 가역적으로 부착된 장치의 이식에 의해(예를 들면, 여기에 참조로써 통합되는, 미국특허출원 제20080081064호 및 20090196903호 참조) 도입될 수 있다.
대상으로의 치료제의 투여의 수는 다양할 수 있다. 대상 내로의 유전적으로 변형된 세포들의 도입은 1회성 이벤트일 수 있으나, 특정 상황들에서, 그러한 치료는 제한된 기간 동안 개선을 유발할 수 있고 일련의 반복되는 치료들의 진행을 요구할 수 있다. 다른 상황들에서, 효과가 관찰되기 이전에 유전적으로 변형된 세포들의 다중 투여가 요구될 수 있다. 정확한 프로토콜은 질병 또는 질환, 질병의 단계 및 치료되는 개별 대상의 파라미터들에 의존한다.
본 발명의 다른 양상들에서, 표적화 벡터는 생체 내 세포 DNA를 변형하도록 사용된다. 이러한 생체 내 실시 예들에서, 표적화 벡터들은 예를 들면 개인에 대한 바이러스로서, 바로 투여되었다. 표적화 벡터는 핵산의 대상으로의 투여를 위하여 종래에 잘 알려진 다수의 방법 중 어느 하나에 의해 투여될 수 있다. 표적화 벡터는 다양한 제형들 내로 통합될 수 있다. 더 구체적으로, 본 발명의 표적화 벡터들은 적절한 약학적으로 수용 가능한 캐리어들 또는 희석제(diluent)들과의 조합에 의해 약학 조성물들 내로 제형화될 수 있다.
약학 제제들은 예를 들면 약학적으로 수용 가능한 비히클(vehicle) 내에 존재하는, 바이러스로서, 표적화 벡터를 포함하는 조성물들이다. "약학적으로 수용 가능한 비히클들"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인된, 또는 인간들과 같은 포유 동물들에서의 사용을 위하여 미국 약전(pharmacopeia) 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 비히클들일 수 있다. 용어 "비히클"은 희석제, 보강제, 첨가제 또는 본 발명의 화합물이 포유동물로의 투여를 위하여 제형화되는 케리어일 수 있다. 그러한 약학적 비히클들은 액체들, 예를 들면 리포솜들, 예를 들면 리포솜 덴드리머(lposome dendrimer)들; 땅콩 오일, 대두 오일, 광물성 오일, 참기름 등과 같은, 석유(petroleum), 동물, 식물 또는 합성 기원의 액체를 포함하는 물 및 오일과 같은 액체들, 식염수; 아라비아 고무(gum acacia), 젤라틴, 녹말풀, 활석(talc), 케라틴, 콜로이드 규산, 요소 등;일 수 있다. 부가적으로, 보조제, 안정제(stabilizing agent), 농후화제(thickening agent), 윤활제, 및 착색제들이 사용될 수 있다. 약학 조성물들은 정제, 캡슐, 분말, 입자, 연고(ointments), 용액, 좌약, 주사, 흡입제(inhalants), 겔, 미소구체(microsphere), 및 에어로졸들과 같은, 고체, 반-고체, 액체, 또는 가스성 형태들의 제제들로 제형화될 수 있다. 이와 같이, 표적화 벡터의 투여는 구강(oral), 입(buccal), 직장(rectal), 비경구, 복강내, 안내, 피내*intradermal), 경피(transdermal), 기관내(intracheal) 투여 등을 포함하는 다양한 방법들로 달성될 수 있다. 활성 제제는 투여 이후에 전신(systemic)일 수 있거나 또는 영역 투여, 내부 투여(intramural administration)의 사용, 또는 이식의 부위에서 활성 약제를 유지하도록 작용하는 임플란트의 사용에 의해 국소적일 수 있다. 활성 제제는 즉각적인 활성을 위하여 제형화될 수 있거나 또는 지효성(sustained release)을 위하여 제형화될 수 있다.
일부 조건들, 특히 중추신경계 조건들을 위하여, 혈뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB)을 가로지르도록 제제들을 제형화하는 것이 필요할 수 있다. 혈뇌 장벽(BBB)을 통한 약물 전달을 위한 한 가지 전략은 만니톨(mannitol) 또는 류코트리엔(leukotrienes)들과 같은 삼투 수단들에 의한, 또는 생화학적으로 브래디키닌(bradykinin)과 같은 혈관 작용성 물질들의 사용에 의한, BBB의 분열을 포함한다. 뇌종양들에 대한 표적 특이 제제들에 대한 개방하는 BBB의 사용을 위한 가능성이 또한 선택적이다. BBB 분열 작용제(disrupting agent)는 조성물들이 혈관내 주사로 투여될 때 본 발명의 치료 조성물들과 공동 투여될 수 있다. BBB를 통하여 수행하기 위한 다른 전략들은 카베올린(Caveolin)-1 매개 통과세포외배출(transcytosis), 글루코오스 및 아미노산 캐리어들과 같은 캐리어 매개 운반체들, 인슐린 또는 트랜스페린(transferrin)을 위한 수용체 매개 통과세포외배출, 및 p-당단백질과 같은 활성 유출 운반체들을 포함하는, 내인성 운반 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 활성 전달 부분들은 또한 혈관의 내피 벽을 가로질러 운반을 용이하게 하도록 본 발명에서의 사용을 위한 치료 화합물들에 접합될 수 있다. 대안으로서, BBB 뒤에 치료제들의 역물 전달은 옴마야 레저버(예를 들면, 여기에 참조로써 통합되는, 미국특허 제5,222,982호 및 5385582호 참조)를 통한, 척추 강내(intrathecal) 전달에 의한; , 예를 들면, 관절 내로 또는 두개 내로 시린지에 의한, 볼루스(bolus) 주사; 예를 들면 대류와 함께, 배관삽입에 의한, 지속적 주입(예를 들면, 여기에 참조로써 통합되는, 미국특허출원 제20070254842호 참조)에 의한; 세포들이 가역적으로 부착된 장치의 이식에 의한(예를 들면, 여기에 참조로써 통합되는, 미국특허출원 제20080081064호 및 20090196903호 참조); 국소 전달에 의한 것일 수 있다.
일반적으로 표적화 벡터의 유효량이 제공된다. 체외 방법들과 관련하여 위에 설명된 것과 같이, 생체내 표적화 벡터의 유효 투여량의 유효량은 표적화 벡터 및 표적 자리 사이의 재조합이 음성 대조군, 예를 들면 빈 벡터 또는 비-상관 폴리펩티드와 접촉되는 세포에 대하여 관찰될 수 있는 세포들의 수의 2배 증가 또는 그 이상을 유도하기 위한 양이다. 재조합의 양은 예를 들면 위에 설명되고 종래에 알려진 것과 같은, 어떤 편리한 방법에 의해 측정될 수 있다. 투여되는 표적화 벡터의 유효량 또는 유료 투여량의 계산은 통상의 지식을 가진 자들의 기술의 범위 내에 존재하며 통상의 지식을 가진 자들에는 일상적일 것이다. 말할 필요도 없이, 투여되는 최종 양은 투여 경로 및 치료되는 장애 또는 질환의 본성에 의존될 것이다.
특정 환자에 주어지는 유효량은 다양한 인자들에 의존할 것이며, 이들 중 일부는 환자마다 다를 것이다. 능숙한 의사는 필요한 만큼 질병 조건의 진행을 정지시키거나 또는 역전시키도록 환자를 관리하기 위하여 치료제의 유효량을 결정할 수 있을 것이다. LD50 동물 데이터 및 제제를 위하여 이용 가능한 다른 정보를 사용하여, 의사는 투여 경로에 의존하여, 개인의 최대 안전 투여량을 결정할 수 있다. 예를 들면, 정맥 내로 투여되는 투여량은 치료 조성물이 투여되는 유체의 몸이 클 때, 척추강 내로 투여되는 투여량보다 많을 수 있다. 유사하게, 환자로부터 급속도로 제거되는 조성물들은 치료 농도를 유지하기 위하여 높은 투여량으로, 또는 반복되는 투여량으로 투여될 수 있다. 통상의 지식을 사용하여, 능숙한 의사는 정기적인 임상 시험들의 과정에서 특정 치료의 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
약제 내의 포함을 위하여, 표적화 벡터는 적절한 상업원으로부터 획득될 수 있다. 일반적인 제안으로서, 투여 당 비경구적으로 투여되는 표적화 벡터의 총 약학적 유효량은 투여 반응 곡선에 의해 측정될 수 있는 범위 내에 존재할 것이다.
표적화 벡터 기반 치료들은 멸균성이어야만 한다. 멸균은 멸균 여과 막(예를 들면, 0.2㎛ 막들)을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 치료 조성물들은 일반적으로 멸균 액세스 포트, 예를 들면 정맥내 용액 백(bag)을 갖거나 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스토퍼(stopper)를 갖는 컨테이너 내에 위치된다. 표적화 벡터 기반 치료들은 유닛 또는 다중-투여 컨테이너들, 예를 들면 수용액으로서 또는 재구성을 위하여 동결건조된 제형으로서, 밀봉된 앰플들 또는 바이알들 내에 저장될 수 있다. 냉동 건조된 제형의 예로서, 10-mL 바이알들이 화합물의 5㎖의 멸균 여과된 1%(w/w) 수용액으로 채워지고, 결과로서 생긴 혼합물은 냉동건조된다. 수액(infusion solution)은 정균 주사용 증류수(bacteriostatic Water-for-Injection)를 사용하여 냉동건조된 화합물의 재구성에 의해 제조된다.
약학 조성물들은 원하는 제형에 의존하여, 동물 또는 인간 투여를 위한 약학 조성물들을 제형화하는데 통상적으로 사용되는 비히클들로서 정의되는, 약학적으로 수용 가능한, 희석제들의 비-독성 캐리어들을 포함할 수 있다. 희석제는 조합의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 그러한 희석제들의 예들은 증류수, 완충수, 생리적 식염수, PBS, 링거액, 덱스트로오스 용액, 및 행크 용액(Hank's solution)이다. 게다가, 약학 조성물 또는 제형은 다른 캐리어들, 보조제들, 또는 비-독성, 비-치료상의, 비-면역성 안정화제들, 첨가제들 등을 포함할 수 있다. 조성물들은 또한 pH 조정 및 완충제들, 독성 조절제들, 습윤제들 및 세제들 등과 같은, 대략 생리학적 조건들에 대한 부가적인 물질들을 포함한다. 조성물들은 또한 예를 들면 산화방지제들과 같은, 다양한 안정화제들 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 그러한 변형 또는 복합제의 예들은 황산염(sulfate), 글루콘산염(gluconate), 구연산염 및 인산염을 포함한다. 조성물의 핵산들 또는 폴리뉴클레오티드들은 또한 그것들의 생체 내 습성들을 향상시키는 분자들과 복합될 수 있다. 그러한 분자들은 예를 들면, 탄수화물, 폴리아민류, 아미노산들, 다른 펩티드들, 이온들(예를 들면, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 망간) 등을 포함한다.
다양한 형태의 투여에 적합한 제형들에 관한 또 다른 안내는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)에서 발견될 수 있다. 약물 전달을 위한 방법들의 간단한 검토를 위하여, Langer, Science 249:1527-1533 (1990)이 참조된다.
약학 조성물들은 예방(prophylactic) 및/또는 치료를 위하여 투여될 수 있다. 활성 제제의 독성 및 치료 효과는 예를 들면 LD50(개체군의 50%에 치명적인 투여량) 및 ED50(개체군의 50%에서 치료상으로 유효한 투여량)의 결정을 포함하여, 세포 배양들 및/또는 실험 동물들에서의 표준 약학 과정들에 따라 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과들 사이의 투여량 비율은 치료 지수이며 이는 비율 LD50/ED50로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수들을 나타내는 치료들이 바람직하다.
일부 실시 예들에서, 유효량으로 대상에 투여되는 약학 조성물은 간 독성을 거의 나타내지 않거나 또는 어떤 간 독성도 나타내지 않는다(예를 들면, 실질적으로 어떤 간 독성도 나타내지 않거나, 실질적인 간 독성을 나타내지 않거나, 실질적으로 간에 비-독성이거나 등). 간 독성은 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(alanine aminotransferase, ALT) 및 아스파르트산 아미노기전달효소(aspartate aminotransferases, ASP) 중 하나, 둘 모두, 또는 비율의 레벨들의 측정과 같은, 다양한 방법들로 측정될 수 있다. 일부 실시 예들에서, 약학 조성물의 유효량의 투여는 그러한 투여 이전의 그러한 측정과 비교하여(또는 측정을 위한, 미처리된 대조군과 비교하여 또는 수용되는 정상 범위의 값들, 즉 기준 값들과 비교하여) 50% 이하(예를 들면 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하, 또는 0%) 간 독성의 측정을 감소시킨다(예를 들면, 투여에 의해 치료되는 질환이 간 독성을 야기하였을 때 야기할 수 있는 것과 같이)의 간 독성의 증가를 유도한다(예를 들면, 선택된 편리한 분석법에 의해 측정되는 것과 같이). 일부 실시 예들에서, 약학 조성물의 유효량의 투여는 그러한 투여 이전의 그러한 측정과 비교하여(또는 측정을 위한, 미처리된 대조군과 비교하여 또는 수용되는 정상 범위의 값들, 즉 기준 값들과 비교하여) 간 독성의 측정에서 어떠한 통계적으로 유의한 증가도 유도하지 않는다(예를 들면, 0.1, 0.05, 0.001 또는 그 이하의 p-값에서). 일부 실시 예들에서, 약학 조성물의 유효량의 투여는 그러한 투여 이전의 그러한 측정과 비교하여(또는 측정을 위한, 미처리된 대조군과 비교하여 또는 수용되는 정상 범위의 값들, 즉 기준 값들과 비교하여) 5% 이상(예를 들면 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상 등) 간 독성의 측정을 감소시킨다(예를 들면, 투여에 의해 치료되는 질환이 간 독성을 야기하였을 때 야기할 수 있는 것과 같이).
세포 배양 및/또는 동물 연구들로부터 획득된 데이터는 인간들을 위한 투여량의 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. 활성 제제의 투여량은 일반적으로 낮은 독성을 갖는 ED50을 포함하는 순환 농도들의 범위 내에 존재한다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 의존하여 이러한 범위 내에서 변경될 수 있다.
약학 조성물들을 제형화하는데 사용되는 성분들은 바람직하게는 고순도이고 실질적으로 잠재적으로 해로운 오염물질들이 없다(예를 들면, 적어도 국제 식품 등급, 일반적으로 적어도 분석 등급, 및 더 일반적으로 적어도 약학 등급). 게다가, 생체내 사용을 위하여 의도되는 조성물들은 일반적으로 멸균성이다. 주어진 화합물이 사용 이전에 합성되어야만 할 정도까지, 결과로서 생긴 제품은 일반적으로 실질적으로 합성 또는 정제 과정 동안에 존재할 수 있는, 어떠한 잠재적으로 독성인 제제들, 특히 어떠한 내독소들도 존재하지 않는다. 비경구적 투여를 위한 조성물은 또한 멸균성이고, 실질적으로 등장성(isotonic)이며, GMP 조건들 하에서 만들어진다.
특정 환자에 주어지는 치료 조성물의 유효량은 다양한 인자들에 의존할 것이며, 이들 중 일부는 환자마다 다를 것이다. 능숙한 의사는 필요한 만큼 질병 조건의 진행을 정지시키거나 또는 역전시키도록 환자를 관리하기 위하여 치료제의 유효량을 결정할 수 있을 것이다. LD50 동물 데이터 및 제제를 위하여 이용 가능한 다른 정보를 사용하여, 의사는 투여 경로에 의존하여, 개인의 최대 안전 투여량을 결정할 수 있다. 예를 들면, 정맥 내로 투여되는 투여량은 치료 조성물이 투여되는 유체의 몸이 클 때, 척추강 내로 투여되는 투여량보다 많을 수 있다. 유사하게, 환자로부터 급속도로 제거되는 조성물들은 치료 농도를 유지하기 위하여 높은 투여량으로, 또는 반복되는 투여량으로 투여될 수 있다. 통상의 지식을 사용하여, 능숙한 의사는 정기적인 임상 시험들의 과정에서 특정 치료의 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
실용성
여기서 설명되는 방법들 및 조성물들은 예를 들면 표적 위치에서 내인성 유전자와 동일한 공간적 및 시간적으로 제한된 패턴으로 하나 이상의 이식유전자를 발현하는 것이 바람직할 때 그리고 내인성 뉴클레아제의 사용의 위험을 방지하는 동안에, 세포 내의 특정 자리로부터 이식유전자를 발현하는 것이 바람직한 어떠한 생체외 또는 생체내 적용을 사용한다. 세포의 게놈을 편집하기 위한 대상 방법들 및 조성물들의 사용에 의해, 외인성 뉴클레아제의 사용을 요구하는 방법들에 대하여 다수의 이익이 달성될 수 있다. 예를 들면, 대상 방법들 및 조성물들의 사용은 그것이 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 코딩이든, 세로로의 외인성 뉴클레아제의 제공과 관련된 잠재적인 면역원성(immunogenicity) 및 유전독성을 방지할 것이다. 뉴클레아제 코딩 서열의 게놈 내로의 가능한 통합의 위험성 및 행상된 면역원성 및 유전독성을 야기할 수 있는, 뉴클레아제의 뒤따르는 안정적인 발현뿐만 아니라 뮤클레아제의 발현을 유도하는 프로모터에 의한 근처 유전자들의 활성이 또한 방지된다.
표적 자리에서 세포 DNA 내로 하나 이상의 이식유전자를 통합하기 위한 대상 방법들 및 조성물들은 예를 들면 유전자 치료, 농업, 생명공학, 및 연구를 포함하는, 많은 분야에서 사용한다. 예를 들면, 그러한 변형들은 예를 들면 유전자의 야생형 복사를 갖는 대상 내의 유전자 돌연변이를 보완함으로써 유전적 장애를 치료하기 위하여; 세포 활성들의 촉진/증대에 의해, 자연적으로 발생하는 과정들을 촉진하기 위하여(예를 들면 상처 치유와 관련된 세포 활성들의 증대에 의한, 만성 상처들의 치료를 위한 상처 치유의 촉진 또는 급성 상처 또는 플랩 손상(flap failure)의 방지을 위하여); 세포 반응을 조절하기 위하여(예를 들면, 인슐린의 제공에 의해, 진성 당뇨병(diabetes mellitus)을 치료하기 위하여); 대상들, 예를 들면 특정 세포 개체군들에서 또는 특정 질환들 하에서 항바이러스, 항병원성, 항암 치료제를 발현하기 위하여; 치료적으로 유용하다. 그러한 유전적 변형들을 위한 다른 사용들은 예를 들면 질병, 질환 또는 연구 목적을 위하여 개인으로부터 유도 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell, iPCS)들을 생산하기 위한 유도 다능성 줄기 세포들의 유도, 예를 들면 치료, 진단 또는 연구 목적을 위하여 세포들에 의한 단백질의 대량 생산을 위한 제조, 예를 들면 향상된 곡물의 생산을 위한 농업에서, 또는 예를 들면 질병의 동물 모델들의 연구를 위한 연구를 포함한다.
예를 들면, 대상 방법들 및 조성물들은 장애; 질병; 또는 대상 내의 의학적 질환을 치료하도록 사용될 수 있다. 용어들 "치료", "치료하는" 등은 여기서 원하는 약학적 및/또는 생리학적 효과의 획득을 의미하도록 사용된다. 효과는 질병 또는 그것의 증상의 놘전한 또는 부분적 방지와 관련한 면역예방일 수 있거나 및/또는 환자에 관한 치료 또는 질환 및/또는 질병에 기여할 수 있는 역효과에 대한 완전한 치유일 수 있다. 여기서 사용되는 것과 같이 "치료"는 포유동물에서의 질병의 어떠한 치료를 포함하며, (a) 질병에 대한 성형이 있을 수 있으나 아직 질병을 갖는 것으로진단되지 않은 대상 내의 발생으로부터 질병의 방지; (b) 질병의 억제, 즉 잘병 발생의 저지; 또는 (c) 질병의 완화, 즉 질병 감소의 야기;를 포함한다. 치료제는 질병 또는 손상의 발병 이전에, 동안에 또는 이후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 증상들을 안정화하거나 또는 감소시키는, 진행중인 질병의 치료가 특히 흥미롭다. 그러한 치료는 바람직하게는 영향을 받은 조직들의 완전한 손상 이전에 실행된다. 대상 치료는 바람직하게는 질병의 증상 단계 동안에, 그리고 일부 경우들에서 질병의 증상 단계 이후에 투여될 수 있다. 용어들 "개인", "대상", "숙주" 및 "환자"는 여기서 호환 가능하게 사용되며 진단, 치료 또는 치유가 바람직한 어떤 포유동물 대상, 특히 인간들을 언급한다.
이러한 목적을 향하여, 대상 조성물들의 하나 이상의 이식유전자는 치료제(tharapeutic agent)를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. "치료제"는 예를 들면 의학적 질환, 예를 질병 또는 장애를 치료하기 위한 생물학적 과정을 촉진하는, 세포 또는 개인에 대한 치료 효과를 갖는, 제제, 예를 들면 리보자임, siRNA,shRNA, miRNA, 펩티드, 폴리펩티드 등을 언급한다.
대상 방법들 및 조성물들을 사용하여 세포 게놈 내로 통합될 수 있는 치료제들의 예들은 리보자임들, siRNA들, shRNA들, miRNA들, 펩티드(예를 들면, 펩티드를 인코딩하는 핵산). 또는 세포 활성을 변경하는 폴리펩티드들(예를 들면, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산)과 같은 제제들을 포함한다(즉 통합된 이식유전자는 상기 제제들을 인코딩한다). 일부 경우들에서, 이식유전자는 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩한다. 그것들이 발현되는(예를 들면, 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 통하여) 다세포 생물체를 위한 치료 활성을 갖는 것으로 예상되는 펩티드 또는 폴리펩티드들의 예들은: 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 베타-글로빈, 저밀도 리포단백질 수용체, 아데노신 데아미나아제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포힐라아제(purine nucleoside phosphorylase), 스핑고미엘리나아제(sphingomyelinase), 글루코세레브로시다아제(glucocerebrosidase), 낭포성 섬유증 유발 세포막 단백질(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), 1-항트립신, CD-18, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(ornithine transcarbamylase), 아르기닌숙시네이트 신세타아제(argininosuccinate synthetase), 페닐알라닌 히드록실라아제(phenylalanine hydroxylase), 분기형 사슬 알파-케토산 탈수소효소, 푸마릴아세토아세테이트 하이드로라아제(fumarylacetoacetate hydrolase), 클루코오스 6-포스파타아제, 알파-L-푸코시다아제, 베타-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase), 알파-L-이두로니다아제(iduronidase), 갈락토오스 1-포스페이트 유리딜전환효소(uridyltransferase); 신경보호적 인자, 예를 들면 뉴로트로핀(neurotrophin, 예를 들면 NGF, BDNF, NT-3, NT-4, CNTF), Kifap3, Bcl-xl, 콜랩신 반응 매개 단백질(collapsin response mediator protein) 1, Chkβ, 칼모둘린(calmodulin) 2, 칼시온(calcyon), NPT1, Eef1a1, Dhps, Cd151, Morf412, CTGF, LDH-A, Atl1, NPT2, Ehd3, Cox5b, Tuba1a, 감마-액틴, Rpsa, NPG3, NPG4, NPG5, NPG6, NPG7, NPG8, NPG9, NPG10, 도파민(dopamine), 인터루킨(interleukin)들, 사이토카인(cytokine)들, 작은 펩티드들, 유전자들/단백질들(아래 참조: BCKDH 복합 (E1a, E1b 및 E2 서브유닛들); 메틸말로닐-보조효소A 뮤타아제(Methylmalonyl-CoA Mutase); 프로프오닐(Propionyl)-CoA 카르복실라아제(Carboxylase, 알파 및 베타 서브유닛들); 이소발레릴 (Isovaleryl) CoA 탈수소효소; HADHA; HADHB; LCHAD; ACADM; ACADVL; G6PC (GSD1a); G6PT1(GSD1b); SLC17A3; SLC37A4 (GSD1c); 산 알파-글루코시다아제(Acid alpha-glucosidase); OCTN2; CPT1; CACT; CPT2; CPS1; ARG1; ASL; OTC; UGT1A1; FAH; COL7A1; COL17A1; MMP1; KRT5; LAMA3; LAMB3; LAMC2; ITGB4; and/or ATP7B) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 위의 단백질들의 리스트는 포유동물 단백질들, 및 많은 실시 예들에서 인간 단백질들을 언급하며, 위의 단백질들의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들은 일반적으로 통상의 지식을 가진 자들에 알려져 있다.
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다른 경우들에서, 이식유전자는 단백질을 인코딩하지 않는 RNA를 위하여 인코딩하며, 예를 들면 핵산은 리보자임(ribozyme), 작은 헤어핀 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 또는 그것들의 전구체를 인코딩한다. 여기서 사용되는 것과 같이, 용어 "마이크로RNA"는 내인성 마이크로RNA들 및 인공 마이크로RNA들(예를 들면 합성 miRNA들)을 포함하나 이에 한정되지 않는, 어떠한 형태의 간섭 RNA들을 언급한다. 내인성 마이크로RNA들은 mRNA의 생산적 사용을 조절할 수 있는 게놈 내에 자연적으로 인코딩되는 작은 RNA들이다. 인공 마이크로RNA는 mRNA의 활성을 조절할 수 있는 내인성 마이크로RNA 이외의, 어떠한 형태의 RNA 서열일 수 있다. 마이크로RNA 서열은 어떠한 하나 이상의 이러한 서열들로 구성되는 RNA 분자일 수 있다. 마이크로RNA(또는 "miRNA") 서열들은 Lim, 등, 2003, Genes & Development, 17, 991-1008, Lim 등, 2003, Science, 299, 1540, Lee 및 Ambrose, 2001, Science, 294, 862, Lau 등, 2001, Science 294, 858-861, Lagos-Quintana 등, 2002, Current Biology, 12, 735-739, Lagos-Quintana 등, 2001, Science, 294, 853-857, 및 Lagos-Quintana 등, 2003, RNA, 9, 175-179와 같은 문헌들에서 설명되었다. 마이크로RNA들의 예들은 큰 RNA의 단편이거나 혹은 miRNA, siRNA, stRNA, sncRNA, tncRNA, snoRNA, smRNA, shRNA, snRNA, 또는 다른 작은 비-코딩 RNA인 어떠한 RNA를 포함한다. 예를 들면, 미국특허출원 제20050272923호, 제20050266552호, 제20050142581호, 및 제20050075492호가 참조된다. "마이크로RNA 전구체(또는 pre-miRNA)"는 그 안에 통합된 마이크로RNA 서열을 갖는 스템-루프(stem-loop) 구조를 갖는 핵산을 언급한다. "성숙 마이크로RNA(또는 성숙 miRNA)"는 마이크로 RNA 전구체(또는 성숙 miRNA)로부터 절단되었거나, 또는 합성된(예를 들면, 무세포 합성에 의해 실험실에서 합성된) 마이크로RNA를 포함하고 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt, 26 nt 또는 27 nt의 길이를 갖는다. 성숙 마이크로RNA는 표적 mRNA에 결합할 수 있고 표적 mRNA의 번역을 억제할 수 있다.
표적 자리 내로 통합될 수 있는 치료제들의 다른 예들은 면역예방(또한 벡터화된 면역예방(vectored immunoprophylaxis, 또는 VIP)러서 언급되는)을 촉진하는 제제들을 포함한다(즉, 통합된 이식유전자는 상기 제제들을 인코딩한다). 면역예방을 촉진하는 제제들의 예들은 항체들 혹은 면역글로불린 및 면역 작동체(immune effector)를 포함하는 키메라 폴리펩티드들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 면역예방을 촉진하는 제제들의 비-제한적 예들은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), C형 간염 바이러스(HCV), 플라스모듐(예를 들면, 플라스모듐 팔시파룸(plasmodium falciparum), 플라스모듐 말라리아에(plasmodium malariae) 등), 균류(fungus), 및 박테리아 등으로부터 선택되는 병원체에 특이적인, 중화 항체들 또는 키메라 폴리펩티드들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 면역예방을 촉진하는 제제들은 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), C형 간염 바이러스(HCV), 플라스모듐(예를 들면, 플라스모듐 팔시파룸(plasmodium falciparum), 플라스모듐 말라리아에(plasmodium malariae) 등), 균류(fungus), 및 박테리아 등의 균주들 중에서 보존된 에피토프들을 표적화하는, 중화 항체들 또는 키메라 폴리펩티드들을 포함할 수 있다.
일부 경우들에서, 체료제는 제제가 발현되는 세포의 활성을 변경한다. 바꾸어 말하면, 제제는 세포 고유의 효과를 갖는다. 예를 들면, 제제는 세포 내에 발현될 때 세포 내의 돌연변이 단백질을 치환하거나 또는 보완할(complement), 세포 내 단백질, 막간 단백질(transmembrane protein) 또는 분비 단백질일 수 있다. 다른 경우들에서, 치료제는 제제가 발현되는 세포들 이외의 세포들의 활성을 변경한다. 바꾸어 말하면, 제제는 세포 외적 효과를 갖는다. 예를 들면, 관심 있는 통합된 유전자는 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 성장 인자, 호르몬, 항체, 또는 다른 세포들의 활성을 조절하는 세포 표면 수용체를 인코딩할 수 있다.
대상 방법들 및 조성물들은 어떠한 질환, 장애, 또는 관심 있는 이식유전자의 통합에 의한 세포 활성의 조절로부터 혜택을 얻을 수 있는 자연적 세포 과정에 적용될 수 있다. 예를 들면, 대상 방법들 및 조성물들은 유전적 장애의 치료에 사용된다. 정의된 유전자 결함으로부터 야기하는 유전적 장애(예를 들면, 단일 유전자 결함을 갖는 장애, 두 개의 결함 유전자, 세 개의 결함 유전자, 4개의 결함 유전자, 5개의 결함 유전자, 두 개 이상의 결함 유전자, 세 개 이상의 결함 유전자, 4개 이상의 결함 유전자, 5개 이상의 결합 유전자를 갖는 장애 등)는 대상 조성물들 및 방법에 의해 치료될 수 있다. 결함은 단일 유전자 내의 하나 이상의 돌연변이체(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 돌연변이체)로부터 야기할 수 있거나 또는 두 개 이상의 유전자(에를 들면, 세 개 이상의 유전자, 4개 이상의 유전자, 5개 이상의 유전자, 두 개의 유전자, 세 개의 유전자, 4개의 유전자, 5개의 유전자 등) 내의 하나 이상의 돌연변이체로부터 야기할 수 있다. 유전적 결함들로부터 야기하는 질병들의 예들은 혈우병(hemophilia, 예를 들면, 혈우병 A, 혈우변 B), 분기 사슬 유기산 뇨증(branched-chain organic acidurias, 예를 들면, 단풍나무 시럽 병(Maple syrup urine disease, MSUD), 이소발레릭 산혈증(isovaleric acidaemia, IVA), 프로피온 산혈증(propionic aciduria, PA)과 메틸말로닌 산뇨증(methylmalonic aciduria, MMA), 3-메틸크로토닐 글리신뇨증(3-methylcrotonyl glycinuria), 3-메틸글루타코닉 산뇨증(3-methylglutaconic Aciduria) Ⅰ형, 단/분기-사슬 수산화 acyl-CoA 탈수소효소 결핍증(Short/branched-chain Acyl-CoA Dehydrogenase Deficiency), 2-메틸(methyl)-3-(히드록시부티릴(hydroxybutyryl)-CoA 탈수소효소 결핍증, 이소부티릴(Isobutyryl)-CoA 탈수소효소 결핍증, 3-하이드록시아이소뷰티릭(Hydroxyisobutyric) 산뇨증, 말론 산뇨증(Malonic Aciduria) 등), 장쇄 지방산 산화 장애들(long chained fatty acid oxidation disorders), 당원 저장증(glycogen storage diseases, 예를 들면, 당원 저장증 Ⅰ형(GSD1), 당원 저장증 Ⅱ형, 당원 저장증 Ⅲ형, 당원 저장증 Ⅳ형, 당원 저장증 Ⅴ형, 당원 저장증 Ⅵ형, 당원 저장증 Ⅶ형, 당원 저장증 Ⅷ형, 당원 저장증 Ⅸ형, 당원 저장증 Ⅹ형, 당원 저장증 XI형, 당원 저장증 XII형, 당원 저장증 0형 등), 카르니틴 회로 장애들(carnitine cycle disorders), 요소 회로 장애들, 크리글러-나자르 증후군(Crigler-Najjar syndrome), 유전성 티로신혈증(Heraditary Tyrosinemia), 수포성 표피박리증(Epidermolysis Bullosa), 윌슨병(Wilson Disease), 아데노신 데아미나아제 결핍증(adenosine deaminase deficiency), 겸상 적혈구병(sickle cell disease), X-염색체 연관성 중증복합 면역결핍증(X-Linked Severe Combined Immunodeficiency, SCID-X1), 지중해 빈혈(thalassemia), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 알파-1 항트립신 결핍증(anti-trypsin deficiency), 다이아몬드-블랙팬 빈혈(diamond-blackfan anemia), 고오시에씨 병(Gaucher's disease), 성장 호르묜 결핍증 등을 포함한다.
또 다른 예로서, 대상 방법들 및 조성물들은 신경계 질병들의 치료를 위하여 그리고 신경계 질병, 예를 들면 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 스필마이어-보그트-쇼그렌-배튼병(Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease, Batten Disease), 파킨슨병을 갖는 전측두엽 치매(Frontotemporal Dementia), 진행성 핵성마비(Progressive Supranuclear Palsy), 피크병(Pick Disease), 프리온(prion) 질병들(예를 들면, 크로이츠펠트 야곱병(Creutzfeldt-Jakob disease), 아밀로이드증(Amyloidosis), 녹내장(glaucoma), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 노화 관련 시력 감퇴(AMD) 등); 신경정신 장애들(neuropsychiatric disorders, 예를 들면 불안 장애들(예를 들면, 강박 장애), 기분 장애들(예를 들면, 우울증), 서아 장애들(예를 들면, 주의 결핍 장애, 자폐 장애들), 인지력 장애들(예를 들면, 망상(delirium), 치매), 조현병(schizophrenia), 물질 관련 장애들(예를 ㄷ들면, 중독), 식이 장애들 등); 이온통로병증들(channelopathies, 예를 들면 간질(epilepsy), 편두통(migraine) 등); 리보솜 저장 질병들(예를 들면, 테이-새크스병(Tay-Sachs disease), 고셰병(Gaucher disease), 파브리병(Fabry disease), 폼페병(Pompe disease), 니만-피크 질환(Niemann-Pick disease), 뮤코다당침착증(Mucopolysaccharidosis, MPS) 및 관련 질병들 등); 중추신경계의 자가면역 질병들(예를 들면, 다발성 경화증(Multiple Sclerosis), 뇌척수염(encephalomyelitis), 부종양 증후군(paraneoplastic syndromes, 예를 들면, 소뇌 변성증(cerebellar degeneration)), 자가면역 내이 질환(autoimmune inner ear disease), 안구간대경련-근간대경련 증후군(opsoclonus myoclonus syndrome) 등); 뇌경색(cerebral infarction), 뇌졸증(stroke), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 및 척수 손상(spinal cord injury);을 포함하는, 퇴행성 질병들에 대하여 중추신경계를 보호하기 위하여 사용한다.
또 다른 예로서, 대상 방법들 및 조성물들은 예를 들면 퇴행성 질병들, 예를 들면 신경ㄷ퇴행성 질병, 신장 질병들, 간 질병들 등에서, 조직 복구, 조직 재생을 촉진하거나 또는 또 다른 조직 손상에 대하여 보호하기 위하여, 예를 들면 상처 치유를 촉진하기 위하여, 세포 및/또는 이웃 세포들의 생존을 촉진하기 위하여; 감염 등을 예방하거나 또는 치료하기 위하여; 치료제를 이소성으로 발현하는 것이 바람직한 의학적 질환들 및 질병들에 사용될 수 있다.
의학적 질환을 치료하기 위하여 대상 방법들이 어떻게 사용될 수 있는지의 다른 예들이 여기서의 다른 곳에서 개시되거나, 또는 통상의 지식을 가진 자들에 쉽게 드러날 수 있다.
대상 방법들 및 조성물들은 관심 있는 세포들, 예를 들면 관심 있는 통합된 유전자를 포함하는 세포들의 영상화에 사용한다. 이와 같이, 통합되려는 이식유전자(또는 이식유전자들 중 하나)는 영상 마커(imaging marker)를 위하여 인코딩할 수 있다. "영상 마커"는 세포들, 예를 들면 본 발명의 조성물들에 m이해 표적화된 세포들을 위치시키고, 선택적으로 시각화할 수 있는 비-세포독성 제제를 의미한다. 영상 부분은 검출을위한 기질, 예를 들면 겨자무과 산화효소(horseradish peroxidase, HRP), 베타-갈락토시다아제(β-galactosidase), 루시페라아제(luciferase) 등의 첨가를 요구할 수 있다. 대안으로서, 영상 부분은 검출을 위한 기질의 첨가를 요구하지 않는 검출 가능한 신호, 예를 들면 형광단(fluorophore) 또는 발색단(chromophore) 염료, 예를 들면 Alexa Fluor 488® 또는 Alexa Fluor 647®, 혹은 형광단 또는 발색단을 포함하는 단백지ㅎ, 예를 들면 형광 단백질을 제공할 수 있다. 여기서 사용되는 것과 같이, 형광 단백질(FP)은 형광의 능력을 보유한(즉, 하나의 파장에서 에너지를 흡수하고 또 다른 파장에서 이를 방출하기 위하여) 단백질을 언급한다. 예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP)은 510 ㎚ 또는 약 510 ㎚의 방출 스펙트럼에서 피크를 갖는 폴리펩티드를 언급한다. 다양한 형광 단백질들이 종래에 알려져 있다. 관심 있는 형광 단백질들은 녹색 형광 단백질(GFP), 노랑 형광 단백질(YFP), 오렌지 형광 단백질(OFP), 시안 형광 단백질(CFP), 청색 형광 단백질(BFP), 적색 형광 단백질(RFP), 원적색 형광 단백질(far-red fluorescent protein) 또는 근적외선 형광 단백질 및 그것들의 변형체들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 예로서, 대상 방법들 및 조성물들은 관심 있는 세포들, 예를 들면 통합된 이식유전자를 포함하는 세포들의 분리에 사용한다. 이러한 목적을 향하여, 통합되는 이식유전자(또는 이식유전자들 중 하나)는 선택 가능한 마커를 위하여 인코딩할 수 있다. "선택 가능한 마커"는 세포들, 예를 들면 대상 적용들의 조성물들에 의해 표적화된 세포들을 선택하도록 사용될 수 있는 제제를 의미한다. 일부 경우들에서, 선택은 양의 선택일 수 있는데, 즉 세포들은 예를 들면 유전자 변형을 포함하는 세포들의 향상된 개체군을 생성하도록, 개체군으로부터 분리된다. 어떠한 편리한 선택 가능한 머커들, 예를 들면 약물 선택 가능한 마커, 예를 들면 약물의 부재에서 세포 사멸을 방지하는 마커. 약물의 부재에서 세포 사멸을 촉진하는 마커, 양상 마커 등; 영상 기술, 예를 들면 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sort)의 사용을 위하여 선택될 수 있는 영상 마커; 친화성 분리(affinity separation) 기술들, 예를 들면 형광 활성화 세포 분류, 자기 분리(magnetic separation), 친화성 크로마토그래피, 고체 매트릭스에 부착되는 친화성 시약과의 "패닝"의 사용을 위하여 선택될 수 있는 폴리펩티드 또는 펩티드; 등이 사용될 수 있다.
일부 경우들에서, 이식유전자는 예를 들면 제제, 예를 들면 공동인자(cofactor) 또는 약물의 부재/존재 하에서, 인코딩된 단백질의 안정성을 조절하는 코딩 도메인에 결합될 수 있다. 사용될 수 있는 불안정화 도메인들의 비-제한적 예들은 라파마이신(rapamycin) 유도체 C20-MaRap의 부재에서 불안정한 돌연변이 FRB 도메인(Stankunas K, 등. (2003) Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization. Mol Cell. 12(6):1615-24); 그것의 리간드 쉴드-1(Shield-1)의 부재에서 대사적으로 불안정한 FKBP12 돌연변이 폴리펩티드(Banaszynski LA 등. (2006) A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell.126(5):995-1004); 트리메소프림(trimethoprim, TMP)의 부재에서 대사적으로 불안정한 돌연변이 대장균 디하이드로폴레이트 환원 효소(DHFR) 폴리펩티드(Mari Iwamoto 등. (2010) A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chem Biol. 2010 September 24; 17(9): 981-988); 등을 포함한다.
위에 설명된 것과 같이, 통상의 지식을 가진 자들이 세포 내에 발현할 수 있는 어떠한 핵산 서열이 표적 자리내로 통할될 수 있으며, 예를 들면 리보자임, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 긴 비-코딩 RNA와 같은 비-코딩 RNA를 인코딩하는 어떠한 핵산 서열; 혹은 펩티드 또는 폴리펩티드를 위한 RNA 코딩을 인코딩하는 어떠한 핵산 서열;이 통합될 수 있다. 일부 경우들에서, 발현되려는 하나 이상의 서열이 통합될 수 있으며, 예를 들면 관심 있는 두 개 이상의 폴리뉴클레오티드가 통합될 수 있으며, 세 개 이상의 폴리뉴클레오티드가 통합될 수 있으며, 4개 이상의 폴리뉴클레오티드가 통합될 수 있으며, 예를 들면 5개 이상의 폴리뉴클레오티드가 통합될 수 있다. 따라서, 예를 들면 치료 유전자 및 영상 마커가 통합될 수 있고, 치료 유전자 및 비-코딩 RNA가 통합될 수 있으며, 치료 유전자 및 선택 가능한 마커가 통합될 수 있으며, 영상 마커 및 선택 가능한 마커가 통합될 수 있으며, 치료 유전자, 영상 마커 및 선택 가능한 마커가 통합될 수 있으며, 기타 등등이다.
시약들, 장치들 및 키트들
또한, 위에 설명된 하나 이상의 방법을 실행하기 위한 시약들, 장치들 및 그것들의 키트들이 제공된다. 시약들, 장치들 및 그것들의 키트들은 상당히 다양할 것이다.
위의 부품들에 더하여, 대상 키트들은 대상 방법들을 실행하기 위한 사양서를 더 포함할 것이다. 이러한 사양서는 하나 이상이 키트 내에 존재할 수 있는 다양한 형태로, 대상 키트들 내에 존재할 것이다. 이러한 사양서들이 존재할 수 있는 한 가지 형태는 적절한 매체 또는 기판 상에 인쇄된 정보, 예를 들면, 키트의 패키징, 패키지 인서트 등 내의, 정보가 인쇄된 한 장 또는 여러 장의 종이로서 존재할 수 있다. 또한 또 다른 수단은 컴퓨터 판독가능 매체, 예를 들면 전보가 기록된 디스켓, CD 등일 수 있다. 또한 존재할 수 있는 또 다른 수단은 제거된 위치에서 정보를 액세스하도록 인터넷을 통하여 사용될 수 있는 웹사이트 주소일 수 있다. 어떤 편리한 수단이 키트 내에 존재할 수 있다.
실시 예들
아래의 예들은 통상의 지식을 가진 자들에 본 발명을 만들고 사용하는지의 완전한 내용과 설명을 제공하기 위하여 만들어지며, 본 발명자들이 고유의 발명으로 간주하는 범위를 한정하거나 또는 아래의 실험들이 실행된 모든 실험 또는 유일한 실험들이라는 것을 나타내도록 의도되지 않는다. 사용된 숫자들(예를 들면, 양, 온도 등)에 관한 정확도를 보장하기 위한 노력들이 만들어졌으나, 일부 실험 오차들과 편차들이 고려되어야만 한다. 달리 표시되지 않으면, 부분은 중량부이고, 분자량은 질량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨(C)이며, 압력은 대기압 또는 근처 대기압이다.
분자 및 세포 생화학에서의 일반적인 방법들은 분자 클로닝: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook 등, HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel 등. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag 등, John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner 등. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 세포 및 조직 배영: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)에서와 같은 그러한 표준 교과서들에서 발견될 수 있으며, 이들 내용은 여기에 참조로써 통합된다. 본 발명에서 언급되는 유전적 조작을 위한 시약들, 클로닝 벡터들 및 키트들은 BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, 및 ClonTech와 같은 상업적 제조업체들로부터 이용 가능하다.
실시 예 1
뉴클레아제들 없는 생체 내 유전자 표적화는 신생아 또는 성체 마우스들의 AAV 벡터 주사 이후의 hF-Ⅸ의 치료 레벨을 용이하게 한다.
위치 특이 유전자 표적화의 치료 레벨들의 달성은 흔히 오프 타겟 효과들과 관련된 엔도뉴클레아제들(예를 들면, CRISPR, TALEN, ZFN)의 사용을 요구하도록 추정된다. 특히, 생체내 적용들을 위한 엔도뉴클레아제-코딩 벡터들의 전달은 부정적인 면역 결과들뿐만 아니라 지속된 발현으로부터의 유전독성 스테밍(genotoxity stemming)에 이르게 할 수 있다. 뉴클레아제들의 사용을 방지하여, 본 발명자들은 혈우병 B의 치료를 위한 알부민 자리로의 프로모터 없는 hF-Ⅳ 유전자의 생체내, AAV8 매개된 표적화를 실행하였다. 2A 펩티드를 코딩하는 서열에 의해 선행되는, 프로모터 없는 hF-Ⅸ 유전자는 알부민 ORF로의 DNA 융합으로서 그것의 통합을 표적화하는 상동 분지들에 의해 플랭킹된다. hF-Ⅳ 발현은 따라서 전사, RNA 처리, 현지화(localization) 및 안정성, 번역 개시 및 소포체 현지화의 레벨들에서 활발한 알부민 발현과 연관된다. 2A 펩티드는 리보솜 스키핑을 유도하고, 따라서 알부민은 태깅되나(tagged) 파괴되지 않는다. 오프 타겟 통합은 뉴클레아제들의 사용을 삼가함으로써 최소화되고, 벡터 매개 프로모터의 결여는 드문 오프 타겟 통합에 의한 이웃하는 종양 유전자 활성의 위험을 약화시킨다.
우선, 본 발명자들은 hF-Ⅸ 표적화 카셋트를 위한 AAV8 벡터 코딩의 마우스 당 2.5ㄷ11 Vg를 갖는 2일령 B6 마우스들의 복강내(IP) 주사를 실행하였다. 본 발명자들은 그리고 나서 생명의 4주에서 시작하여, 매주마다 플라스마 hF-Ⅸ 레벨들을 따랐다. 플라스마 hF-Ⅸ의 레벨들은 정상의 약 10%에서 안정적이었으며, 이는 만일 임상으로 이동되면 유의한 질병 개선과 상응한다. 중요하게도, hF-Ⅸ 플라스마 레벨들은 2/3 부분 간 절제술 이후에 곧 그것들의 원래 레벨로 다시 돌아왔다. 따라서 안정적인 이식유전자 통합을 달성하였다. 본 발명자들은 hF-Ⅸ 발현이 본질적으로 전적으로 RT 및 그 뒤에 링커 연결, 비-편향 PCR 및 시퀀싱의 실행에 의한 온-타겟 통합으로부터 기원한다는 것을 입증하였다. 특히, 이러한 방법은 에피솜으로부터 또는 어떤 오프 타겟 통합으로부터 어떠한 hF-Ⅸ 발현도 검출하지 않았다. 또한, 확증은 항-2A-펩티드 또는 항-알부민 항체를 사용할 때 웨스턴 블롯 신호들의 오버래핑으로부터 나온다. 항-hF-Ⅸ 프로브를 사용하는 노던 블롯은 예상된 크기의 알부민 hF-Ⅸ 융합된 mRNA에서 단일 대역을 나타내었다. 그 다음에, 본 발명자들은 신생아들과 관련된, 간세포 분열이 유전자 표적화의 치료 레벨들에 필수적인지를 검사하였다. 본 발명자들은 본 발명자들의 AAV8 벡터의 마우스 당 1e12 Vg를 갖는 성체 마우스들의 꼬리 정맥 주사를 실행하였다. hF-Ⅸ의 매주 모니터링은 정상의 15%에서 안정적인 발현을 나타내었다. 본 발명자들은 현재 혈우병 B에서의 이러한 연구들을 반복하고 있으며 온-타겟 통합 및 오프 타겟 통합의 분포의 비율을 정량화하기 위하여 qPCR, IHC 및 NGS를 사용하고 있다.
결론적으로, AAV 매개된 생체내 비-파괴되고 프로모터 없는 유전자 표적화 방법은 신생아들 및 성체들 모두에 적용 가능하다. 고도로 발현된 내인성 유전자로의 2A-융합으로서 이식유전자 통합의 표적화는 뉴클레아제들의 요구를 배제할 수 있으며, 따라서 오프 타겟 효과를 약화시키며, 이식유전자 발현의 치료 레벨들을 허용한다.
실시 예 2
방법들
벡터 구성을 위하여, 종결 코돈을 스패닝하는 Alb 게놈 DNA의 단편이 먼저 pTRUP 플라스미드 백본 상의 AAV2 ITR들 사이에 삽입되었다(Lisowski 등. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 20, 1912-1923, 2012). P2A 코딩 서열 및 hF9 cDNA가 그리고 나서 네스트 방식(nested fashion)으로 삽입되었다. 역 제어를 위하여, 중심 단편이 절단되고 다시 반대편 지향 내에 통합되었다. rAAV8은 HEK293 세포들 내에서 생산되었고 점 블롯에 의해 적정되었다(titered). 2일령 B6 마우스들이 rAAV8의 2.5e11 vg로 복강내로 주사하였고 ELISA를 위한 안와후 출혈(retro-orbital bleeding)에 의해 생명의 4주에서 시작하여 매주 채혈하였다. 성체 B6 마우스들은 rAAV8(hF9 또는 역)의 1e12 vg의 꼬리 정맥 주사들 또는 3.5e12 vg 플라스미드의 유체역학적 주사를 받았으며, ELISA를 위하여 매주 유사하게 채혈하였다. 확립된 프로토콜들에 따라 2/3 부분 가 절제술(PH)이 실행되었다. DNA, RNA 및 단백질 분석뿐만 아니라 IHC를 위한 간 조직들이 PH에서 마우스들의 희생으로 수집되었다. hF9 IHC를 위한 동결된 간 조직이 절개되었고 확립된 프로토콜들에 따라 염색되었다. TaqMan PCR 분석, 노던 및 웨스턴 블롯들이 확립된 프로토콜들을 사용하였다. aPTT 분석법이 이전에 설명된 것과 같이 혈우병 B 녹아웃 마우스들 상에서 실행되었다(Shi 등, Gene therapy 20, 987-996, 2013).
결과들
혈우병 B 마우스들 내의 출혈 체질을 개선시키기 위하여 재조합형 아데노 연관 바이러스(rAAV) 매개된 프로모터가 없는 유전자 표적화가 뉴클레아제들 없이 실행되었다. 특히, 프로모터가 없는 인간 응고 인자 Ⅸ(hF9) 유전자가 간 발현된 알부민(Alb) 자리에 표적화되었다. hF9은 이전 2A-펩티드 코딩 서열과 함께, Alb 종결 코돈의 바로 상류에 통합되도록 표적화되었다. hF9이 DNA 및 RNA 레벨들에서 Alb에 융합되는 동안에, 두 개의 개별 단백질이 리보솜 스키핑에 의해 합성되었다. 따라서, hF9 발현은 그것의 붕괴 없이 강력한 간 알부민 발현과 관련되었다. 간세포들 내의 알부민 대립형질들의 약 0.5% 내로의 온-타겟 통합을 달성하기 위하여 AAV8-hF9 벡터가 신생아 및 성인 마우스들에 주입되었다. hF9은 온-타겟 통합으로부터만 생산되었고 리보솜 스키핑은 매우 효율적이었다는 사실이 확립되었다. 정상의 7-20%의 안정적인 hF9 플라스마 레벨들이 획득되었고, 처리된 인자 Ⅸ 결핍 마우스들은 정상 응고 시간들을 가졌다. 고도로 발현된 내인성 유전자에 대한 2A-융합으로서의 이식유전자 통합은 뉴클레아제들 및/또는 벡터 유래 프로모터들에 대한 요구를 제거하였다. 이러한 예시 방법은 오프-타겟 효과들을 상당히 감소시킴으로써 유아들 및 성인들 모두에서 안전하고 효과적인 유전자 표적화를 허용하며 통합으로부터 발현의 치료 레벨을 제공한다.
1/30,000 수컷들에 영향을 미치는 X-염색체 관련 열성 질병 혈우병 B에서 결핍인, hF9 유전자가 표적화되었다. 영향을 받는 개인들은 간으로부터 생산되는 플라스마 응고 인자 Ⅳ의 결핍에 기인하는 심각한 자발성 출혈로부터 고통을 받는다. 1-2% 만큼의 응고 인자로의 재구성은 생명의 질을 상당히 향상시킬 수 있으며, 5-20%는 출혈 특이체질을 상당히 완화시킬 것이다. 간 굴성(tropic) rAAV 혈청형은 강력한 간 특이 Alb 프로모터로부터의 통합 상에서 발현을 위한 hF9을 표적화하도록 사용되었다. 본 발명자들은 (1) 비록 통합이 간세포들의 작은 부분에[서 발생하더라도, Alb 프로모터가 높은 레벨의 응고 인자 생산을 생산하여야만 하고, (2) Alb 자리에서의 높은 전사 활성이 상동성 재조합에 의해 이식유전자 통합에 더 민감하도록 만들 수 있다는 사실을 제안하였다.
뉴클레아제 없는 유전자 표적화는 간 내의 Alb 대립형질들의 작은 부분에만 영향을 미쳐야만 한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 Alb 리딩 프레임의 말단에서 2A-융합으로서 hF9의 표적화에 의한 Alb 유전자의 붕괴 및 조절장애를 최소화하기로 선택하였다(도 8a). +가닥 RNA 버이러스들로부터 유도되는 2A-펩티드들은 리보솜 스키핑에 의해 단일 리딩 프레임으로부터 다중 단백질의 생산을 허용한다(Kim, J. H. 등. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one 6, e18556, doi:10.1371/journal.pone.0018556 (2011)). 이러한 과정은 약 20C-말단 아미노산들로 태깅된(tagged) 제 1 번역된 단백질, 및 바로 하나의 부가적인 N-말단 프로파일을 갖는 제 2 단백질을 남긴다. 두 단백질의 기능은 일반적으로 유지되며, 2A-펩티드(P2A)를 사용하는 임상 실험들은 면역원성을 보고하지 않았다. Alb 종결 코돈의 바로 5'에 통합되도록, 돼지 테스코바이러스-1 2A-펩티드(P2A)를 위한 서열 코딩에 선행되는, 코돈 최적화된 hF9 cDNA를 표적화하기 위하여 단일 가닥 AAV가 사용되었다. 통합 이후에, Alb 및 hF9은 강력한 Alb 프로모터로부터 공동 전사되고 따라서 스플라이싱, 핵 출구, mRNA 안정성, 번역 개시 및 ER 국소화의 레벨들에서 공동 조절되어야만 한다. 두 개의 개별 단백질이 번역되었고, 둘 모두 신호 펩티드를 포함하였으며, 따라서 Alb의 ER-관련 번역은 분비를 위한 응고 인자의 번역 및 처리가 뒤따랐다. 최종적으로, 오프-타겟 hF9 발현의 기회를 더 감소시키기 위하여, 벡터는 hF9 신호 펩티드 앞에 ATG 개시 코돈을 갖지 않았고, 2A-펩티드 코딩 서열 또는 선형 Alb 엑손 내에 갸시 코돈도 갖지 않았다.
먼저, 2일령 C57BL/6(B6) 마우스들의 복강내(IP) 주사들이 hF9 표적화 카셋트 또는 역 대조군을 위한 rAAV 코딩의 마우스 당 2.5e11 벡터 게놈(vg)으로 실행되었다(도 8b). Alb 상동 분지와 관련하여 대조군 내에 가역된 단편은 hF9 유전자뿐만 아니라, P2A 코딩 서열, 인접한 Alb 엑손 및 선행 스플라이스 정션을 포함하였다. 역 대조군은 온-타겟 통합 상에서 상당한 hF9 발현을 허용해서는 안 되나, 실험 구성으로부터의 레벨들과 유사한 오프-타겟 발현의 레벨들을 허용할 수 있다(에피솜 발현은 아래의, 다른 수단들에 의해 제어된다). 플라스마 hF9 레벨들은 생명의 4주에서 시작하여, 효소결합면역흡착검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)에 의해 매주 측정되었다(도 9a). 실험 그룹을 위하여, 플라스마 hF9의 레벨들은 300-1000ng/mL에서 안정상태를 유지하였으며, 이는 정상의 7-20%와 상응한다. 역 대조군 그룹을 위하여, hF9 플라스마 레벨들은 검출 레벨(20 ng/mL) 또는 아래에 존재하였으며, 이는 hF9 플라스마 레벨들은 실험 그룹 내에서 hF9 발현은 실제로 온-타겟 통합으로부터 기원한 것을 나타낸다. hF9 레벨들은 2/3 부분 간 절제술, 에피솜 AAV 이식유전자 발현을 90% 이상 감소시키는 것으로 알려진 수술 과정 이후에 원래 플라스마 단백질 레벨들을 유지하였으며, 또한 안정적인 이식유전자 통합을 확립하였다.
신생아들로서 알 수 있는 것과 같이, 간 성장이 유전자 표적화의 치료 레벨들에 필수적인지를 결정하기 위하여, hF9이 성인 마우스들 내의 동일한 벡터를 사용하여 Alb 자리에 표적화되었다. 성인 B5 마우스들이 rAAV 벡터를 갖는 꼬리 정맥, 또는 역 대조군에 의해 마우스 당 1×1012 vg(마우스 당 약 5e13)로 주사되었다. 마우스들의 제 3 그룹은 "접촉" 지향으로 프로모터 없는 hF9 구성을 위한 플라스미드 코딩의 유체역학적 꼬리 정맥 주사들을 받았다. rAAV hF9 마우스들 그룹을 위하여, 플라스마 hF9 레벨들은 정상의 7-20%에서 안정적인 것으로 발견되었다(도 9b). 낮은 MOI에서의 벡터 주사들은 상부 임계 효과를 나타내기 위한 어떠한 플래토(plateau)도 없는 낮은 플라스마 hF9 레벨들에 이르게 하였다(도 9c). 성인들뿐만 아니라 신생아들을 위하여, 역 대조군 그룹의 hF9 플라스마 레벨들이 검출 한계 또는 한계 아래에 존재하였다. 감소된 hF9 플라스마 레벨들은 또한 플라스미드로 유체역학적으로 주사된 마우스들과 관련되었다. 따라서, 상당한 표적화는 rAAV 벡터화에 의존한다. 최종적으로, rAAV 주사들이 성인 F9 녹아웃(KO) 혈우병 B 마우스들에서 실행되었다. 미처리된 KO 마우스들 내의 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)에 의해 결정되는 것과 같이, 기능적 응고는 야생형 마우스들의 레벨과 유사한 레벨들로 회복되었다(도 9d). hF9 생물학적 활성은 야생형 마우스들과 레벨들과 유사한, 709±91ng/mL의 플라스마 단백질 레벨들과 상관되었다(도 9b-d).
간으로부터의 hF9 발현은 면역조직화학(IHC)에 의해 확인되었다(도 12). 간 셈플들의 웨스턴 블롯 분석은 예상된 분자량에서 hF9을 검출하였으며, 이는 ELISA 및 IHC 신호들 모두가 정확하게 처리된 hF9과 상응한다는 것을 나타낸다(도 9E).
hF9은 분비 단백질이다. 따라서, IHC 신호는 드믈었고 표적화 비율들의 정량화를 위하여 사용될 수 없었다. 대신에, qPCR이 hF9에 의한 Alb 표적화의 비율을 정령적으로 평가하도록 사용되었다. 에피솜 rAAV로부터의 오신호(false signal)를 방지하기 위하여, 게놈 Alb 자리의 3' 단편이 먼저 통합된 hF9 서열의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받지 않는 방식으로 증폭되었다(도 10a, 도 13), 비-바이어싱된 증폭은 표적화되고 야생형 대립형질들 내의 종결의 대략 동일한 거리 3'에서 공통 제한 위치의 존재에 의해 가능해졌다. PCR 앰플리콘은 그리고 나서 두 개의 상이한 qPCR 분석법: 하나는 표적화된 Alb 대립형질들의 풍부도의 정량화 및 나머지는 비-표적화된 야생형 대립형질들의 풍부도의 정량화의 템플릿으로서 사용된다. 간 내에서, 간세포들만이 rAAV8에 의해 표적화된다(Nakai, H. 등. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J Virol 79, 214-224, doi:10.1128/JVI.79.1.214-224.2005 (2005)). 따라서, 본 발명자들은 70% 간세포 빈도에 대하여 보존적으로 보정하였고 hF9에 의해 표적화된 Alb 대립형질들의 비율이 신생아들 또는 성인들로서 주사된 마우스들에 대하여 평균 0.5%인 것을 발견하였다(도 10 및 도 14에서의 관련 표준 곡선). 야생형 Alb mRNA들에 대한 융합된 Alb-hF9 mRNA들의 비율은 그때 비-바이어싱된 cDNA 템플릿 상에 실행된 두 개의 각각의 qPCR 분석법의 비교에 의해 조사되었다(도 10b). 비율은 신생아들 또는 성인들로서 주사된 마우스들에 대한 평균에서 0.1%인 것으로 발견되었다(도 10c). 이러한 값은 비록, 차이가 통계적으로 유의하지 않았더라도, DNA 레벨에서의 통합의 비율보다 낮은 경향을 가졌다. 키메라 hF9-Alb mRNA 전사물들의 생산, 처리 및/또는 안정성이 야생형 Alb mRNA와 비교하여 감소된 것이 가능하다. 또한 일부 통합이 알부민을 발현하지 않는 비-실질(parenchymal) 세포들에서 발생한 것이 가능하다. 관찰된 표적화 비율은 이전에 보고된 것들(Miller, D. G. 등. Gene targeting in vivo by adeno-associated virus vectors. Nature biotechnology 24, 1022-1026, doi:10.1038/nbt1231 (2006); Paulk, N. K., Loza, L. M., Finegold, M. J. & Grompe, M. AAV-mediated gene targeting is significantly enhanced by transient inhibition of nonhomologous end joining or the proteasome in vivo. Human gene therapy 23, 658-665, doi:10.1089/hum.2012.038 (2012))보다 높으며, 이는 특히 비-증식 세포들이 낮은 비율의 상동성 재조합을 허용하도록 예상된, 성인 마우스들에서 주목할 만하다. 본 발명자들은 Alb 자리의 높은 발현 비율 및 관련 크로마틴 상태가 높은 비율의 표적화에 기여할 수 있다는 것을 가정한다. 손상 유도된 증폭은 엄격하게 제외될 수 없으나, 주사 이후에 ALT 레벨들의 어떠한 상승도 관찰되지 않았다(도 15).
AAV 벡터는 에피솜들로서 혹은 온-타겟 또는 오프-타겟 성분으로서 세포들 내에 존재할 수 있다. 총 벡터 복사 수는 qPCR에 의해 평가되었다(도 16). 신생아들로서 주사된 마우스들에서의 부분 간 절제술 이후에 벡터 복사 수의 상대적으로 작은 변화는 에피솜 벡터가 이미 상당히 희석된 것을 나타낼 수 있다. 그러한 경우에, 벡터 복사 수는 온 타겟 통합에 대한 오프 타겟의 비율에 대한 근사치의 낮은 경계로서 알 수 있다. 그러나 벡터 유래 프로모터의 부재에서, hF9은 온-타겟 통합으로부터만 발현되어야만 한다. 부분 간 절제술 이후에 재구성된 높은 hF9 레벨들은 이러한 가정을 지원하는데 그 이유는 트렌지언트 에피솜 발현과 달리, 안정적으로 통합된 이식유전자만이 그러한 과정 이후에 재결합하였기 때문이다. 가역 대조군 벡터로의 치료 이후에 상당한 hF9 플라스마 레벨들의 결여는 또한 감소된 오프-타겟 발현을 입증하였다. 본 발명자들은 총 hF9 mRNA 풀 중에서 융합된 Alb_hF9 mRNA들의 비율을 직접적으로 평가하기 위하여 RT-qPCR을 사용하였다(도 11a). 비율은 신생아들로서 주사된 마우스들뿐만 아니라 성인들로서 주사된 마우스들에 대해서도 1.1인 것으로 발견되었다(도 11b). 이는 hF9이 온-타겟 통합으로부터 거의 독점적으로 발현되는 것을 나타낸다. 실제로, P2A 프로브를 갖는 노던 블롯으로부터의 특정 신호만이 예상된 융합된 Alb-P2A-hF9 mRNA와 상응하였다(도 11c). 최종적으로, 발현이 온-터겟 통합에 한정되고 효율적인 리보솜 스키핑이 뒤따랐을 때에만 예상될 수 있는 것과 같이. 항-2A-펩티드 항체로의 웨스턴 블롯이 Alb의 예상되는 분자량에서 단일 종과 관련된다(도 11D).
rAAV는 임상 치료를 위한 일반적인 벡터가 되었다. 성인들 내의 이식유전자 발현의 주기는 적어도 수년 동안 지속될 수 있으며, 많은 유전적 장애들에 요구되는 것과 같이, 평생 동안의 발현이 정기적인 프로모터 함유 벡터들로 획득될 수 있는지는 아직 알려지지 않았다. AAV 벡터들로부터의 에피솜 발현은 세포 분열의 1회 이후에도 급속하게 손실된다. 이는 세포 재생을 유도하는 질병들이 유아기에서 치료되나 조직들은 계속 성장하며, 제한된 발현을 가질 것이다. AAV 벡터의 이차 주입은 일차 벡터 투여로부터 야기하는 강한 체액 면역성에 기인하여, 이차 형질도입을 야기하지 않을 것이다. 이와 대조적으로, 여기서 설명되는 접근법은 시간에 따른 발현의 손실을 제거할 수 있는 벡터 통합을 야기한다. 그러나 이는 사전-존재하는 면역성에 의한 중화를 방지하도록 적절한 AAV 혈청형들에 의존한다.
이식유전자 마우스 내의 키메라 자리로의 hF9의 표적화를 설명하는 이전 연구((Li, H. 등. In vivo genome editing restores haemostasis in a mouse model of haemophilia. Nature 475, 217-221, doi:10. 1038/nature10177 (2011))는 면역학적 및 유전독성 부작용과 관련될 수 있는 뉴클레아제들의 공동 발현에 의존하였다. 엔도뉴클레아제들에 대한 동일한 의존은 심지어 hF8이 마우스들 및 비-인간 영장류에서 Alb 자리에 표적화되었을 때 사실이었는데(Anguela, X. e. a. ZFN Mediated Targeting Of Albumin "Safe Harbor" Results In Therapeutic Levels Of Human Factor VIII In a Mouse Model Of Hemophilia A. Blood 122, 720 (2013), 아마도 그 이유는 어떠한 상동 분지도 제공되지 않았으며 통합은 대신에 비-상동 단부 결합에 의존하였기 때문이다. rAAA는 혈우병 B를 치료하기 위한 임상적 유전자 치료 시도들에서 이미 사용되었다(Nathwani, A. C. 등. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England journal of medicine 365, 2357-2365, doi:10.1056/NEJMoa1108046 (2011)).　그러나, 이러한 임상 실험에서의 이식유전자는 마우스들에서 보고된 것과 같이, 종양 유전자 활성을 유도할 수 있는 벡터 유래 프로모터로부터 발현되었다(Donsante, A. et al. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science 317, 477, doi:10.1126/science.1142658 (2007)). 알라닌 트랜스아미나아제들의 레벨들의 측정에 의해 평가되는 것과 같이, 여기서 설명된 hF9 표적화 벡터의 주사로 어떠한 간 독성도 관찰되지 않았다(도 15).
여기서 설명되는 연구는 뉴클레아제들 없이 그리고 벡터 유래 프로모터 없이 생체내 유전자 표적화를 위한 치료 효과를 입증한다. 인간 환자 개체군 내의 표적 자리에서의 유전적 다형성(genetic polymorphism)들은 잠재적으로 감소된 상동성에 기인하는 다양한 치료 효과에 이르게 할 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 인간 개체군의 1,000 샘플 중 약 95%가 관련 Alb 서열에서 단지 두 개의 하플로타입을 갖는 것을 발견하였으며, 다라서 이는 본 발명이 광범위한 적용성을 갖는 것을 입증한다(도 17).
rAAV를 위한 이러한 무-프로모터 및 무-뉴클레아제 유전자 표적화 전략의 바람직한 안정적인 프로파일은 혈우병 및 다른 유전자 결핍증들의 치료를 위한 주요 후보군이 되도록 만든다(Yew,N. S.& Cheng, S. H. Gene tjerapy for lysosomal storage disorders, Pediatric endocrinology riwiews : PER 11 Suppl 1, 99-109 (2013)). 더 일반적으로, 전략은 치료 효과가 분비된 단백질에 의해 전달될 때(예를 들면, 광범위하게 중화하는 항체들) 또는 표적화가 선택적 장점을 부여할 때 적용될 수 있다(Paulk, N. K., Loza, L. M., Finegold, M. J. & Grompe, M. AAV-mediated gene targeting is significantly enhanced by transient inhibition of nonhomologous end joining or the proteasome in vivo. Human gene therapy 23, 658-665, doi:10.1089/hum.2012.038 (2012)).
실시 예 3
도 18은 AAV8-F9 또는 AAVDJ-F9 실험 구성의 마우스 당 1×1012 벡터 게놈을 갖는 9주령 암컷 B6 마우스들의 꼬리 정맥 주사(tail vein injection) 이후에 플라스마 F9의 측정(ELISA에 의해 측정된)에 의해 획득된 데이터를 제공한다(각각 n=4).
도 19는 마우스 당 1×1012 벡터 게놈에서 AAV-F9(상부), 또는 마우스 당 3×1011 벡터 게놈에서 AAV8-F9 트리플(하부)의 꼬리 정맥 주사 2주 후에 응고 효율의 측정(활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)에 의한)에 의해 획득된 데이터를 제공한다(각각 n=4).
도 20은 AAV8-F9 실험 구성의 마우스 당 2.5×1011 벡터 게놈을 갖는 2일령 B6 마우스들의 표층 측두 정맥 주사(superficial temporal vein injection) 이후에 플라스마 F9의 측정(ELISA에 의해 측정된)에 의해 획득된 데이터를 제공한다(n=4).
도 21은 AAV-8-VRC01 실험 구성의 마우스 당 1×1012 벡터 게놈을 갖는 9주령 암컷 B6 마우스들의 꼬리 정맥 주사 후에 플라스마 VRC01의 측정(HIV에 대한 항체를 대략적으로 중화하는, ELISA에 의해 측정된)에 의해 획득된 데이터를 제공한다. 샌드위치 ELISA는 인간 IgG의 일정 영역에 대항하는 항체들로 덮인 플레이트들을 사용하였으며 반면에 기능적 ELISA는 VRC01 항체에 의해 인식되는 항원인 HIV 당단백질 gp120으로 덮인 플레이트들을 사용하였다.
이전 설명은 단지 본 발명의 원리들을 설명한다. 통상의 지식을 가진 자들은 비록 여기에 명확하게 설명되거나 또는 도시되지 않더라도, 본 발명의 원리들을 구현하고 본 발명의 정신 및 범위 내에 포함되는 다양한 배치들을 고안할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 게다가, 여기에 인용된 모든 실시 예 및 조건 언어는 원칙적으로 기술의 발전시키도록 독자에 본 발명의 원리들과 본 발명자들이 기여하는 개념들을 이해시키고 이해에 도움을 주도록 의도되며, 그러한 구체적으로 인용된 실시 예들 및 조건들에 대해 제한이 없는 것으로 구성된다. 게다가, 본 발명의 원리들, 양상들, 및 실시 예들뿐만 아니라 그것들의 구체적인 예들을 인용한 여기서의 모든 설명은 그것들의 구조적 및 기능적 등가물들 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 부가적으로, 그러한 등가물들은 현재 알려진 등가물들 및 미래에 개발되려는 등가물들, 즉, 구조와 관계없이 동일한 기능을 실행하는 어떠한 개발된 요소들 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 범위는 여기에 도시되고 설명된 바람직한 실시 예들에 한정되는 것으로 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 정신 및 범위는 첨부된 청구항들에 의해 구현된다.
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Claims (23)

  1. 외인성으로 제공되는 뉴클레아제의 부재 하에서 이식유전자의 세포의 게놈 내로의 표적화된 통합을 위한 방법에 있어서,
    세포를 재조합 바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하고,
    상기 재조합 바이러스 벡터는:
    ⅰ. 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, - 상기 제 1 핵산 서열은 상기 이식 유전자를 인코딩하고 상기 제 2 핵산 서열은 상기 제 1 핵산 서열에 대하여 5' 또는 3'에 위치되며 상기 세포의 게놈 내의 상기 표적 통합 위치 내로의 통합 상에서 두 개의 독립적인 유전자 산물의 생산을 촉진함, -;
    ⅱ. 상기 폴리뉴클레오티드에 대하여 5'에 위치되고 실질적으로 상기 세포의 게놈 내의 표적 통합 위치의 게놈 서열 5'에 상동인 서열을 포함하는 제 3 핵산 서열; 및
    ⅲ. 상기 폴리뉴클레오티드의 3'에 위치되고 실질적으로 상기 세포의 게놈 내의 표적 통합 위치의 게놈 서열 3'에 상동인 서열을 포함하는 제 4 핵산 서열;을 포함하며,
    상기 세포는 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산과 접촉되지 않는, 이식유전자의 세포의 게놈 내로의 표적화된 통합을 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포는 분열 종료 세포인, 이식유전자의 세포의 게놈 내로의 표적화된 통합을 위한 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 접촉하는 단계는 생체 내에서 발생하는, 이식유전자의 세포의 게놈 내로의 표적화된 통합을 위한 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 방법은 유전자 결핍과 관련된 의료 질환에 사용하는, 이식유전자의 세포의 게놈 내로의 표적화된 통합을 위한 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 의료 질환은 혈우병; 혈우병 A, 혈우병 B, 분기 사슬 유기산 뇨증(branched-chain organic acidurias), 단풍나무 시럽 병(Maple syrup urine disease, MSUD), 이소발레릭 산혈증(isovaleric acidaemia, IVA), 프로피온 산혈증(propionic aciduria, PA), 메틸말로닌 산뇨증(methylmalonic aciduria, MMA), 3-메틸크로토닐 글리신뇨증(3-methylcrotonyl glycinuria), 3-메틸글루타코닉 산뇨증(3-methylglutaconic Aciduria) Ⅰ형, 단/분기-사슬 수산화 acyl-CoA 탈수소효소 결핍증(Short/branched-chain Acyl-CoA Dehydrogenase Deficiency), 2-메틸(methyl)-3-(히드록시부티릴(hydroxybutyryl)-CoA 탈수소효소 결핍증, 이소부티릴(Isobutyryl)-CoA 탈수소효소 결핍증, 3-하이드록시아이소뷰티릭(Hydroxyisobutyric) 산뇨증, 말론 산뇨증(Malonic Aciduria) 등), 장쇄 지방산 산화 장애(long chained fatty acid oxidation disorder), 당원 저장증(glycogen storage diseases), 카르니틴 회로 장애(carnitine cycle disorder), 요소 회로 장애, 크리글러-나자르 증후군(Crigler-Najjar syndrome), 유전성 티로신혈증(Heraditary Tyrosinemia), 수포성 표피박리증(Epidermolysis Bullosa), 윌슨병(Wilson Disease), 아데노신 데아미나아제 결핍증(adenosine deaminase deficiency), 겸상 적혈구병(sickle cell disease), X-염색체 연관성 중증복합 면역결핍증(X-Linked Severe Combined Immunodeficiency, SCID-X1), 지중해 빈혈(thalassemia), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 알파-1 항트립신 결핍증(anti-trypsin deficiency), 다이아몬드-블랙팬 빈혈(diamond-blackfan anemia), 고오시에씨 병(Gaucher's disease), 성장 호르묜 결핍증, 및 파킨슨병으로부터 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 이식유전자의 세포의 게놈 내로의 표적화된 통합을 위한 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 방법은 면역예방을 촉진하는데 사용하는, 이식유전자의 세포의 게놈 내로의 표적화된 통합을 위한 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 이식 유전자는 면역예방을 촉진하는 제제를 인코딩하는, 이식유전자의 세포의 게놈 내로의 표적화된 통합을 위한 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역예방을 촉진하는 제제는 항체 또는 키메라 폴리펩티드이고, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), C형 간염 바이러스(HCV), 플라스모듐, 플라스모듐 팔시파룸(plasmodium falciparum), 플라스모듐 말라리아에(plasmodium malariae), 균류(fungus), 및 박테리아로부터 선택되는 병원체에 특이적인, 이식유전자의 세포의 게놈 내로의 표적화된 통합을 위한 방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 방법은 상처 치유에 사용하는, 이식유전자의 세포의 게놈 내로의 표적화된 통합을 위한 방법.
  10. 이익유전자를 세포의 게놈 내의 표적 통합 위치 내로 통합하기 위한 재조합 바이러스 벡터에 있어서,
    제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 카셋트, - 상기 제 1 핵산 서열은 상기 이식 유전자를 포함하고, 상기 제 2 핵산 서열은 상기 제 1 핵산 서열에 대하여 5' 또는 3'에 위치되며 상기 세포의 게놈 내의 상기 표적 통합 위치 내로의 통합 상에서 두 개의 독립적인 유전자 산물의 생산을 촉진함, -;
    ⅱ. 상기 폴리뉴클레오티드 카셋트에 대하여 5'에 위치되고 실질적으로 상기 세포의 게놈 내의 표적 통합 위치의 게놈 서열 5'에 상동인 서열을 포함하는 제 3 핵산 서열; 및
    ⅲ. 상기 폴리뉴클레오티드 카셋트의 3'에 위치되고 실질적으로 상기 세포의 게놈 내의 표적 통합 위치의 게놈 서열 3'에 상동인 서열을 포함하는 제 4 핵산 서열;을 포함하는, 재조합 바이러스 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 재조합 아데노 연관 바이러스(rAAV) 벡터인, 재조합 바이러스 벡터.
  12. 제10항에 있어서, 상기 표적 통합 위치에서 두 개의 독립적인 유전자 산물의 생산을 촉진하는 상기 핵산 서열은 2A 펩티드; IRES; 인테인(intein); 위치 특이적 프로테아제를 위한 인식 서열, 응고 연쇄반응의 일부분으로서 절단되는 절단 가능한 링커를 인코딩하는 서열; 인자 XI 절단 위치를 인코딩하는 서열; 및 인트론 접착 공여체/접합 수용체 서열들;을 인코딩하는 서열로부터 선택되는, 재조합 바이러스 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 표적 통합 위치를 포함하는 내인성 유전자의 상기 발현 및 활성은 상기 이식유전자의 통합에 의해 방해되지 않는, 재조합 바이러스 벡터.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 내인성 유전자의 3' 말단은 상기 표적 통합 위치를 포함하고,
    상기 제 3 핵산 서열의 서열은 실질적으로 상기 내인성 유전자의 종결 코돈의 상류의 DNA 서열에 상동이며,
    상기 제 4 핵산 서열의 서열은 실질적으로 상기 내인성 유전자의 종결 코돈의 하류의 DNA 서열에 상동인, 재조합 바이러스 벡터.
  15. 제13항에 있어서,
    내인성 유전자의 5' 말단은 상기 표적 통합 위치를 포함하고,
    상기 제 3 핵산 서열의 서열은 실질적으로 상기 내인성 유전자의 개시 코돈의 상류의 DNA 서열에 상동이며,
    상기 제 4 핵산 서열의 서열은 실질적으로 상기 내인성 유전자의 종결 코돈의 하류의 DNA 서열에 상동인, 재조합 바이러스 벡터.
  16. 제13항에 있어서, 상기 내인성 유전자는 알부민 유전자, 콜라겐 유전자, 및 액틴 유전자로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 재조합 바이러스 벡터.
  17. 제10항에 있어서, 상기 이식유전자는 유전자 결핍을 보완하는, 재조합 바이러스 벡터.
  18. 제10항에 있어서, 상기 이식 유전자는 면역예방을 촉진하는 제제를 인코딩하는, 재조합 바이러스 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 상기 면역예방을 촉진하는 제제는 면역글로불린 도메인 및 이팩터 도메인을 포함하는 폴리펩티드인, 재조합 바이러스 벡터.
  20. 제18항에 있어서, 상기 면역예방을 촉진하는 제제는 항체인, 재조합 바이러스 벡터.
  21. 제18항에 있어서, 상기 면역예방을 촉진하는 제제는 항체 또는 키메라 폴리펩티드이고, 인간 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, C형 간염 바이러스, 플라스모듐, 플라스모듐 팔시파룸, 플라스모듐 말라리아에, 균류, 및 박테리아로부터 선택되는 병원체에 특이적인, 재조합 바이러스 벡터.
  22. 제10항에 있어서, 상기 이식유전자는 맥관형성 및/또는 혈관형성을 촉진하는, 재조합 바이러스 벡터.
  23. 제22항에 있어서, 상기 이식유전자는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)인, 재조합 바이러스 벡터.
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