JP2003514529A - 輸送化合物、それらの製造および使用 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、Ki-67タンパク質のカルボキシル末端断片またはそれらの活性部分、それらの断片または相同体の、細胞内輸送のためならびに細胞への導入および細胞による放出に使用することができる化合物としての使用に関する。本発明はさらに、前述のKi-67タンパク質を含む輸送化合物、およびこれをコードしているベクターに関する。本発明はさらに、薬学的組成物および疾患治療における輸送タンパク質の賦形剤または活性物質としての使用に関する。
Description
【０００１】
技術分野
本発明は、結合された化合物を細胞へ導入することが可能であるような化合物
に関する。特に、本発明は、Ki-67タンパク質のカルボキシル末端断片を含む輸
送化合物に関する。さらに本明細書は、この輸送化合物をコードしている配列を
含むベクター、輸送化合物、ならびに該輸送化合物および／またはベクターを含
有する薬学的組成物を包含している。さらに該輸送化合物の使用に加え、それら
を製造する方法が主張されている。該輸送化合物が助けとなるような遺伝子治療
による疾患の治療または予防に関する対応する方法は、本発明の範囲内である。
に関する。特に、本発明は、Ki-67タンパク質のカルボキシル末端断片を含む輸
送化合物に関する。さらに本明細書は、この輸送化合物をコードしている配列を
含むベクター、輸送化合物、ならびに該輸送化合物および／またはベクターを含
有する薬学的組成物を包含している。さらに該輸送化合物の使用に加え、それら
を製造する方法が主張されている。該輸送化合物が助けとなるような遺伝子治療
による疾患の治療または予防に関する対応する方法は、本発明の範囲内である。
【０００２】
先行技術
タンパク質の標的化は、高度に協調された機構により制御される基本的に重要
な生物学的過程である。
な生物学的過程である。
【０００３】
従ってタンパク質の搬出または分泌は、例えば小胞体、ゴルジ体および小胞に
関連した亜細胞区画へのタンパク質の方向付けのために特徴づけられたシグナル
配列が使用されるような特異的反応経路を介して生じる。シグナル配列はさらに
、細胞内輸送のためにも使用される。例えば、核局在化配列(NLS)は、タンパク
質の細胞核への輸送について説明されたものであり；これらの核局在化配列は、
拡散により核へと通過することができないような巨大タンパク質に、核膜孔を通
って細胞核へと向かうことを指示する。
関連した亜細胞区画へのタンパク質の方向付けのために特徴づけられたシグナル
配列が使用されるような特異的反応経路を介して生じる。シグナル配列はさらに
、細胞内輸送のためにも使用される。例えば、核局在化配列(NLS)は、タンパク
質の細胞核への輸送について説明されたものであり；これらの核局在化配列は、
拡散により核へと通過することができないような巨大タンパク質に、核膜孔を通
って細胞核へと向かうことを指示する。
【０００４】
細胞におけるタンパク質の取り込みも、複雑な方法で調節されている。本明細
書に示す一例は、細胞膜上の受容体への結合による特異的タンパク質の移入、そ
れに続く小胞への封入を用いるような受容体媒介型エンドサイトーシスである。
この過程は、一方では代謝に必要な代謝物を伴う細胞を供給する役割を、他方で
はタンパク質を分解する役割を果たす。さらに、受容体媒介型エンドサイトーシ
スは、ペプチドホルモンまたは増殖因子のような多くの媒介物質に対する細胞応
答を媒介する。最後に該過程は、細胞へと移行するためにウイルスおよび毒素に
より使用される。
書に示す一例は、細胞膜上の受容体への結合による特異的タンパク質の移入、そ
れに続く小胞への封入を用いるような受容体媒介型エンドサイトーシスである。
この過程は、一方では代謝に必要な代謝物を伴う細胞を供給する役割を、他方で
はタンパク質を分解する役割を果たす。さらに、受容体媒介型エンドサイトーシ
スは、ペプチドホルモンまたは増殖因子のような多くの媒介物質に対する細胞応
答を媒介する。最後に該過程は、細胞へと移行するためにウイルスおよび毒素に
より使用される。
【０００５】
生物医学的研究、診断および治療における多くの用途について、物質、好まし
くはタンパク質、核酸、非ペプチド分子、例えばオリゴ糖、脂質又は薬物又はマ
ーカー分子などを細胞へ導入することが望ましい。前述の多くの物質は細胞膜を
通過することができないので、各々、該物質の導入およびそれらの細胞内生成の
ために様々な方法が使用される。
くはタンパク質、核酸、非ペプチド分子、例えばオリゴ糖、脂質又は薬物又はマ
ーカー分子などを細胞へ導入することが望ましい。前述の多くの物質は細胞膜を
通過することができないので、各々、該物質の導入およびそれらの細胞内生成の
ために様々な方法が使用される。
【０００６】
当業者は、例えばマイクロインジェクション法のような機械的方法以外に、例
えばこの目的のために分子生物学において使用される発現技術を周知である。し
かし最後に言及した方法は、あまり効果的ではなく；通常は、発現はわずかに細
胞の2〜20％において成功し、このことは例えばインビボにおける適用を非常に
困難なものにしている。この欠点は、最近単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)の構
造タンパク質(VP22)を使用することにより克服された。発現ベクターによる古典
的トランスフェクションの後、(発現した場合に)細胞のわずかに2〜5％において
検出されうるその他のHSV-1タンパク質とは対照的に、VP22は細胞の100％におい
て検出されうることがわかった(国際公開公報第97/05265号)。さらに、融合タン
パク質としての該ウイルスタンパク質は、様々なポリペプチドを標的細胞集団へ
導入することができることがわかった(国際公開公報第97/05265号)。しかし、当
業者には、ウイルスタンパク質は、各々、好ましくは哺乳類細胞、細胞集成体お
よび生物全体において、多面的効果を起こし得ることは周知である。
えばこの目的のために分子生物学において使用される発現技術を周知である。し
かし最後に言及した方法は、あまり効果的ではなく；通常は、発現はわずかに細
胞の2〜20％において成功し、このことは例えばインビボにおける適用を非常に
困難なものにしている。この欠点は、最近単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)の構
造タンパク質(VP22)を使用することにより克服された。発現ベクターによる古典
的トランスフェクションの後、(発現した場合に)細胞のわずかに2〜5％において
検出されうるその他のHSV-1タンパク質とは対照的に、VP22は細胞の100％におい
て検出されうることがわかった(国際公開公報第97/05265号)。さらに、融合タン
パク質としての該ウイルスタンパク質は、様々なポリペプチドを標的細胞集団へ
導入することができることがわかった(国際公開公報第97/05265号)。しかし、当
業者には、ウイルスタンパク質は、各々、好ましくは哺乳類細胞、細胞集成体お
よび生物全体において、多面的効果を起こし得ることは周知である。
【０００７】
例えば、アデノウイルスのE1Aタンパク質に加えサルウイルス40(SV4O)のT抗原
は、細胞における多くの過程を開始する。これらは、例えば、DNA合成の開始に
加え、ジヒドロ葉酸還元酵素、チミジンキナーゼおよびDNAポリメラーゼのよう
な様々な酵素の活性化を含んでいる(Nevins、J.R.、「アデノウイルスE1A：転写
調節および細胞増殖制御の変更(Adenovirus E1A: Transcription regulation an
d alteration of cell growth control)」、Doerfler、W.およびBohm、P.、「ア
デノウイルスIIIの分子レパートリー：生物学および病因論(The molecular repe
rtoire of Adenovirus III: Biology and pathogenesis)」、Springer Verlag B
erlin、ハイデルベルグ、ニューヨーク、1995年)。さらなる例は、レオウイルス
構造タンパク質の多面性である(Yue、Z.およびShatkin、A.J.、「レオウイルス
構造タンパク質の酵素機能および制御機能(Enzymatic and control functions o
f Reovirus structural proteins)」、Tyler、K.L.およびOldstone、M.B.A.、「
レオウイルスI：構造、タンパク質、および遺伝子(Reoviruses I: Structure, P
roteins, and Genetics)」、Springer Verlag Berlin、ハイデルベルグ、ニュー
ヨーク、1998年)。
は、細胞における多くの過程を開始する。これらは、例えば、DNA合成の開始に
加え、ジヒドロ葉酸還元酵素、チミジンキナーゼおよびDNAポリメラーゼのよう
な様々な酵素の活性化を含んでいる(Nevins、J.R.、「アデノウイルスE1A：転写
調節および細胞増殖制御の変更(Adenovirus E1A: Transcription regulation an
d alteration of cell growth control)」、Doerfler、W.およびBohm、P.、「ア
デノウイルスIIIの分子レパートリー：生物学および病因論(The molecular repe
rtoire of Adenovirus III: Biology and pathogenesis)」、Springer Verlag B
erlin、ハイデルベルグ、ニューヨーク、1995年)。さらなる例は、レオウイルス
構造タンパク質の多面性である(Yue、Z.およびShatkin、A.J.、「レオウイルス
構造タンパク質の酵素機能および制御機能(Enzymatic and control functions o
f Reovirus structural proteins)」、Tyler、K.L.およびOldstone、M.B.A.、「
レオウイルスI：構造、タンパク質、および遺伝子(Reoviruses I: Structure, P
roteins, and Genetics)」、Springer Verlag Berlin、ハイデルベルグ、ニュー
ヨーク、1998年)。
【０００８】
さらに本発明の目的は、このような欠点を克服するための化合物の輸送媒体を
提供することである。この輸送化合物は、遺伝子治療に使用することができる。
提供することである。この輸送化合物は、遺伝子治療に使用することができる。
【０００９】
本発明に係る輸送媒体は、哺乳類、好ましくはヒトが起源である。
【００１０】
発明の概要
本目的は、ヒトKi-67タンパク質のカルボキシル末端断片により、本発明によ
り実現される。
り実現される。
【００１１】
本発明のさらなる局面は、該断片をコードしているベクターに関する。
【００１２】
さらに、Ki-67タンパク質のカルボキシル末端断片を含む輸送タンパク質が説
明されている。
明されている。
【００１３】
本発明に係る輸送タンパク質は、本明細書ではヒト、マウス、ラットまたは他
の種のKi-67タンパク質のカルボキシル末端断片であることができる。
の種のKi-67タンパク質のカルボキシル末端断片であることができる。
【００１４】
さらに本発明は、輸送化合物の製造法および該輸送化合物をコードしているベ
クターの製造法に関する。
クターの製造法に関する。
【００１５】
さらなる局面は、前述の本発明に係る輸送タンパク質または本発明に係る輸送
タンパク質をコードしている配列を含むベクターの助けを借りて、細胞株、イン
ビトロの細胞、腫瘍細胞、組織などから選択された標的群へと、化合物を輸送す
る方法である。
タンパク質をコードしている配列を含むベクターの助けを借りて、細胞株、イン
ビトロの細胞、腫瘍細胞、組織などから選択された標的群へと、化合物を輸送す
る方法である。
【００１６】
さらに本発明は、結合された化合物の輸送のための前述の化合物の使用、なら
びに疾患の治療および予防の方法、特に遺伝子治療における使用を含む。
びに疾患の治療および予防の方法、特に遺伝子治療における使用を含む。
【００１７】
さらに、本発明の輸送タンパク質を単独で、もしくは、さらなる化合物と結合
して含有する薬学的組成物、ならびにそれらの製造法も提供される。
して含有する薬学的組成物、ならびにそれらの製造法も提供される。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明に係る断片、すなわちKi-67タンパク質のカルボキシル末端領域は、ス
イスプロットへ受託番号P46013で受託されたKi-67タンパク質のアミノ酸3037位
から3256位の領域、またはそのゲノムの天然の異型により存在するような、その
領域の断片を含む。さらにこの断片は、輸送タンパク質としての機能が維持され
る限りは、前述の断片またはそれらの相同体の一部のみを含んでもよい。
イスプロットへ受託番号P46013で受託されたKi-67タンパク質のアミノ酸3037位
から3256位の領域、またはそのゲノムの天然の異型により存在するような、その
領域の断片を含む。さらにこの断片は、輸送タンパク質としての機能が維持され
る限りは、前述の断片またはそれらの相同体の一部のみを含んでもよい。
【００１９】
この場合相同体は、輸送化合物としてのカルボキシル末端領域の機能に必須で
あるようなアミノ酸残基の少なくとも80％が相同であることを意味している。
あるようなアミノ酸残基の少なくとも80％が相同であることを意味している。
【００２０】
ヒトKi-67タンパク質は、細胞周期の全ての活動期、すなわちG1期、S期、G2期
および有糸分裂期においては増殖している細胞の全ての核において発現するが、
静止期G0細胞においては発現しない(Gerdesら、「モノクローナル抗体K-67によ
り定義された細胞増殖に関連したヒト核抗原の細胞周期解析(Cell cycle analys
is of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by t
he monoclonal antibody K-67)」 J. Immunol.、133:1710-15、1984)。ヒトK-67
のcDNAおよびマウス等価物は既知であり、かつ他のタンパク質とは有意な相同性
を示すことはない(Schluterら、「Ki-67の細胞増殖関連抗原：細胞周期を維持す
るタンパク質の新規種類を示している、多くの反復エレメントを伴う、非常に巨
大な偏在性核タンパク質(The cell proliferation-associated antigen of anti
body Ki-67: a very large, ubiquitous nuclear protein with numerous repea
ted elements, representing a new kind of cell cycle-maintaining proteins
)」、 J. Cell Biol.、123:513-522、1993、Starborgら、「マウスK-67細胞増殖
抗原は細胞周期の進行に必須の間期細胞の核小体およびヘテロクロマチン領域な
らびに分裂期染色体の周辺に蓄積する(The murine K-67 cell proliferation an
tigen accumulates in the nucleolar and heterochromatic regions of interp
hase cells and at the periphery of the mitotic chromosomes in a process
essential for cell cycle progression)」、J. Cell Sc.、109:143-153、1996)
。ヒトKi-67タンパク質は、いくつかのNLSを有し、かつ有糸分裂期を除くと、生
理的に細胞核においてのみ検出することができる。抗体のマイクロインジェクシ
ョン後、Ki-67タンパク質が細胞質において形成され、かつおそらく超分子複合
体(supramolecular complexes)において、細胞核へと非常に迅速に輸送されるこ
とのみが示されている(Heydenら、「Ki-67タンパク質の細胞質に関する知見およ
びその核への輸送の免疫蛍光染色(Cytoplasmic observation of the Ki-67 prot
ein and immunofluorescence staining of its transport to the nucleus)」、
Eur. J. Cell Biol.、Vol 42:33、1996)。これまで核からの輸送または細胞から
の輸送さえも、観察も説明もされていない。従って本発明者らの知見は、Ki-67
タンパク質の部分構造の機能を試験する場合、一層驚くことばかりであった。
および有糸分裂期においては増殖している細胞の全ての核において発現するが、
静止期G0細胞においては発現しない(Gerdesら、「モノクローナル抗体K-67によ
り定義された細胞増殖に関連したヒト核抗原の細胞周期解析(Cell cycle analys
is of a cell proliferation-associated human nuclear antigen defined by t
he monoclonal antibody K-67)」 J. Immunol.、133:1710-15、1984)。ヒトK-67
のcDNAおよびマウス等価物は既知であり、かつ他のタンパク質とは有意な相同性
を示すことはない(Schluterら、「Ki-67の細胞増殖関連抗原：細胞周期を維持す
るタンパク質の新規種類を示している、多くの反復エレメントを伴う、非常に巨
大な偏在性核タンパク質(The cell proliferation-associated antigen of anti
body Ki-67: a very large, ubiquitous nuclear protein with numerous repea
ted elements, representing a new kind of cell cycle-maintaining proteins
)」、 J. Cell Biol.、123:513-522、1993、Starborgら、「マウスK-67細胞増殖
抗原は細胞周期の進行に必須の間期細胞の核小体およびヘテロクロマチン領域な
らびに分裂期染色体の周辺に蓄積する(The murine K-67 cell proliferation an
tigen accumulates in the nucleolar and heterochromatic regions of interp
hase cells and at the periphery of the mitotic chromosomes in a process
essential for cell cycle progression)」、J. Cell Sc.、109:143-153、1996)
。ヒトKi-67タンパク質は、いくつかのNLSを有し、かつ有糸分裂期を除くと、生
理的に細胞核においてのみ検出することができる。抗体のマイクロインジェクシ
ョン後、Ki-67タンパク質が細胞質において形成され、かつおそらく超分子複合
体(supramolecular complexes)において、細胞核へと非常に迅速に輸送されるこ
とのみが示されている(Heydenら、「Ki-67タンパク質の細胞質に関する知見およ
びその核への輸送の免疫蛍光染色(Cytoplasmic observation of the Ki-67 prot
ein and immunofluorescence staining of its transport to the nucleus)」、
Eur. J. Cell Biol.、Vol 42:33、1996)。これまで核からの輸送または細胞から
の輸送さえも、観察も説明もされていない。従って本発明者らの知見は、Ki-67
タンパク質の部分構造の機能を試験する場合、一層驚くことばかりであった。
【００２１】
ヒトKi-67タンパク質のカルボキシル末端断片は、CHO-K1(チャイニーズハムス
ター卵巣-K1、ATTC受託番号CRL9618)細胞株細胞において一過的に発現し、これ
はKON-21と称され(図１)、これは生成されたポリペプチドの完全に予想外の免疫
細胞分布パターンを示した。予想されたように、KON-21は、細胞の5〜20％にお
いて、対照タンパク質の場合と同様に細胞質に強く発現していた。さらにKON-21
は、細胞核の100％においても検出された。これは、Kon-21ペプチドは最初に細
胞の5〜20％において細胞質に生成され、かつこれはNLSを含むので、これは迅速
にこのような産生細胞の細胞核へ輸送されることを明らかにしている(実施例１
および図３)。さらに、KON-21は隣接するトランスフェクションされていない細
胞へと移行し、かつ該レシピエント細胞において細胞核に局在する。KON-21はこ
のような過程のための古典的シグナル配列が欠失しているので、このKON-21の細
胞内輸送は、おそらく前述の通常のタンパク質の搬出または移入の経路を辿るこ
とはない。細胞核への細胞内輸送はおそらく、KON-21のNLSの助けにより、Ran-G
TP-搬入(importin)-αシステムを介して実現される(Goerlich D.、「細胞核へま
たは細胞核からの輸送(Transport into and out of the cell nucleus)」、EMBO
J.、Vol. 17:2721-27、1998)。
ター卵巣-K1、ATTC受託番号CRL9618)細胞株細胞において一過的に発現し、これ
はKON-21と称され(図１)、これは生成されたポリペプチドの完全に予想外の免疫
細胞分布パターンを示した。予想されたように、KON-21は、細胞の5〜20％にお
いて、対照タンパク質の場合と同様に細胞質に強く発現していた。さらにKON-21
は、細胞核の100％においても検出された。これは、Kon-21ペプチドは最初に細
胞の5〜20％において細胞質に生成され、かつこれはNLSを含むので、これは迅速
にこのような産生細胞の細胞核へ輸送されることを明らかにしている(実施例１
および図３)。さらに、KON-21は隣接するトランスフェクションされていない細
胞へと移行し、かつ該レシピエント細胞において細胞核に局在する。KON-21はこ
のような過程のための古典的シグナル配列が欠失しているので、このKON-21の細
胞内輸送は、おそらく前述の通常のタンパク質の搬出または移入の経路を辿るこ
とはない。細胞核への細胞内輸送はおそらく、KON-21のNLSの助けにより、Ran-G
TP-搬入(importin)-αシステムを介して実現される(Goerlich D.、「細胞核へま
たは細胞核からの輸送(Transport into and out of the cell nucleus)」、EMBO
J.、Vol. 17:2721-27、1998)。
【００２２】
KON-21タンパク質との融合タンパク質をコードしている構築物を用いた実験は
、該融合タンパク質が効率的に発現しかつ細胞内輸送されることを示した。
、該融合タンパク質が効率的に発現しかつ細胞内輸送されることを示した。
【００２３】
細胞抽出物中のKON-21が標的細胞の培地に添加されるような実験において、KO
N-21の単独または融合タンパク質との組合せは、高度に効率的かつ非常に迅速な
ように標的細胞へと輸送される(実施例２および図４)。この局面はさらに、細胞
内では発現され得ないような非ペプチド性物質の輸送を可能にする。
N-21の単独または融合タンパク質との組合せは、高度に効率的かつ非常に迅速な
ように標的細胞へと輸送される(実施例２および図４)。この局面はさらに、細胞
内では発現され得ないような非ペプチド性物質の輸送を可能にする。
【００２４】
これらの前述の局面は、癌、アレルギー、自己免疫疾患などの疾患の遺伝子治
療における該輸送化合物の使用を可能にする。これは、本発明がさらに、疾患の
治療法に加え予防法も含むことを意味する。
療における該輸送化合物の使用を可能にする。これは、本発明がさらに、疾患の
治療法に加え予防法も含むことを意味する。
【００２５】
Kon21のDNA構築物は、分子生物学において使用される標準の方法を用いて調製
された。この目的のために、細胞株HeLa S3のcDNAがPCR法により増幅された。そ
の後のプラスミドベクターへのクローニングのための制限酵素部位に加え、mRNA
の効率的な翻訳に必要な配列モチーフが、それらの5'末端に追加の塩基配列を保
持するデオキシオリゴヌクレオチドプライマーを用いて導入された(図１参照)。
Kon21のDNA構築物は、最初にストラタジーン（Stratagene）社(ラホヤ、Ca、USA
)のクローニングベクターpBluescript SKにクローニングされた。DNA挿入断片を
配列決定したところ、既に公開されたKi-67 cDNAのDNA配列(Schluterら、前記)
との2個の逸脱を得た。いくつかの独立したクローンの配列解析は、得られた配
列が正確であることを確証した。発現に関して、このDNA挿入断片は、クローニ
ングベクターから制限酵素HindIIIおよびNotIにより切断され、かつインビトロ
ゲン（Invitrogen）社(カールスバッド、CA、USA)の真核細胞発現ベクターpCEP4
へとクローニングされた。図１は、DNA挿入断片の完全な塩基配列およびそれら
によりコードされた発現産物のアミノ酸配列を示している。図２は、Kon21発現
構築物の構造を概略的に示している。
された。この目的のために、細胞株HeLa S3のcDNAがPCR法により増幅された。そ
の後のプラスミドベクターへのクローニングのための制限酵素部位に加え、mRNA
の効率的な翻訳に必要な配列モチーフが、それらの5'末端に追加の塩基配列を保
持するデオキシオリゴヌクレオチドプライマーを用いて導入された(図１参照)。
Kon21のDNA構築物は、最初にストラタジーン（Stratagene）社(ラホヤ、Ca、USA
)のクローニングベクターpBluescript SKにクローニングされた。DNA挿入断片を
配列決定したところ、既に公開されたKi-67 cDNAのDNA配列(Schluterら、前記)
との2個の逸脱を得た。いくつかの独立したクローンの配列解析は、得られた配
列が正確であることを確証した。発現に関して、このDNA挿入断片は、クローニ
ングベクターから制限酵素HindIIIおよびNotIにより切断され、かつインビトロ
ゲン（Invitrogen）社(カールスバッド、CA、USA)の真核細胞発現ベクターpCEP4
へとクローニングされた。図１は、DNA挿入断片の完全な塩基配列およびそれら
によりコードされた発現産物のアミノ酸配列を示している。図２は、Kon21発現
構築物の構造を概略的に示している。
【００２６】
実施例実施例１
トランスフェクション後Kon21タンパク質は培養物の全ての細胞に輸送される
CHO細胞を、構築物pCEP4-Kon21で一過的にトランスフェクションし、異なる時
点で解析した。この目的のために、スライド上で増殖された細胞を伴うスライド
を、PBS/10％FCSで洗浄し、約6時間風乾し、その後クロロホルム/アセトンで固
定した。この過程に続けて、KON-21タンパク質を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体MIB-21による免疫蛍光染色を行った。その後抗体MIB-21の結合を、アレキ
サ（Alexa）488結合ヤギ抗マウス抗体(Molecular Probes社、ユージーン、オレ
ゴン州、USA)を用いて検出した。より良い位置確認のために、これらの細胞のDN
Aをさらにヨウ化プロピジウムにより対比染色した。染色の対照についても同じ
く、CHO細胞を発現ベクターpCEP4でトランスフェクションした。トランスフェク
ション後6時間(a-d)、10時間(e-h)および24時間(i-l)の細胞の顕微鏡写真。染色
は、MIB-21で(a、e、i、c、g、k)および対比染色はヨウ化プロピジウムで(b、f
、j、d、h、l)行った。写真の左半分の細胞は、pCEP4-Kon21でトランスフェクシ
ョンし(a、b、e、f、i、j)、かつ右半分の細胞はpCEP4でトランスフェクション
した(c、d、g、h、k、l)。6時間後にpCEP4-Kon21でトランスフェクションした細
胞の2、3個の核のみが、MIB-21による若干の染色を示したのに対し、10時間、お
よび24時間後のMIB-21染色は、全ての細胞核において増大した染色を示した。対
照的に、対照のためにpCEP4でトランスフェクションした細胞は、全ての期間に
ついて、非常に弱い非特異的バックグラウンド染色のみを示した。
CHO細胞を、構築物pCEP4-Kon21で一過的にトランスフェクションし、異なる時
点で解析した。この目的のために、スライド上で増殖された細胞を伴うスライド
を、PBS/10％FCSで洗浄し、約6時間風乾し、その後クロロホルム/アセトンで固
定した。この過程に続けて、KON-21タンパク質を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体MIB-21による免疫蛍光染色を行った。その後抗体MIB-21の結合を、アレキ
サ（Alexa）488結合ヤギ抗マウス抗体(Molecular Probes社、ユージーン、オレ
ゴン州、USA)を用いて検出した。より良い位置確認のために、これらの細胞のDN
Aをさらにヨウ化プロピジウムにより対比染色した。染色の対照についても同じ
く、CHO細胞を発現ベクターpCEP4でトランスフェクションした。トランスフェク
ション後6時間(a-d)、10時間(e-h)および24時間(i-l)の細胞の顕微鏡写真。染色
は、MIB-21で(a、e、i、c、g、k)および対比染色はヨウ化プロピジウムで(b、f
、j、d、h、l)行った。写真の左半分の細胞は、pCEP4-Kon21でトランスフェクシ
ョンし(a、b、e、f、i、j)、かつ右半分の細胞はpCEP4でトランスフェクション
した(c、d、g、h、k、l)。6時間後にpCEP4-Kon21でトランスフェクションした細
胞の2、3個の核のみが、MIB-21による若干の染色を示したのに対し、10時間、お
よび24時間後のMIB-21染色は、全ての細胞核において増大した染色を示した。対
照的に、対照のためにpCEP4でトランスフェクションした細胞は、全ての期間に
ついて、非常に弱い非特異的バックグラウンド染色のみを示した。
【００２７】実施例２
培地への添加後、KON-21タンパク質は培養物の全ての細胞により取り込まれる
約500,000個のCHO細胞を、構築物pCEP4-Kon21により一過的にトランスフェク
ションした。対照のために同じく、500,000個のCHO細胞を、発現ベクターpCEP4
でトランスフェクションした。インキュベーター内で24時間インキュベーション
した後、これらの細胞を収集しかつ沈降し、かつこの細胞沈降物を-70℃で凍結
した。細胞沈降物を解凍後、500μlの氷冷した高塩緩衝液(10mM HEPES、pH7.9、
400mM NaCl、0.1mM EDTA、0.5mM DTT、5％グリセロール)中に再懸濁し、かつ0℃
で5分間インキュベーションした後、再度沈降させた。上清を、15ml培地中のCHO
細胞に添加し、かつこれらの細胞を異なる時点で解析した。この目的のために、
スライド上で増殖した細胞を伴うスライドを、PBS/10％FCSですすぎ、約6時間風
乾し、その後クロロホルム/アセトンで固定した。この工程に続けて、KON-21タ
ンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体MIB-21による免疫蛍光染色を行
った。その後抗体MIB-21の結合を、アレキサ488結合ヤギ抗マウス抗体(Molecula
r Probes社、ユージーン、オレゴン州、USA)を用いて検出した。より良い位置確
認のために、これらの細胞のDNAをさらにヨウ化プロピジウムにより対比染色し
た。高塩溶解液の添加後5分(a-d)および1時間(e-h)の細胞の顕微鏡写真。写真の
左半分の細胞は、MIB-21で染色した(a、c、e、g)。写真の右半分は、ヨウ化プロ
ピジウムで対比染色した同じ細胞を示す(b、d、f、h)。写真の上側半分は、高塩
溶解液の添加後5分後の細胞(a-d)を示し、および下側半分は高塩溶解液と1時間
インキュベーションした後の細胞(e-h)を示した。各々、pCEP4-Kon21トランスフ
ェクションした細胞由来の高塩溶解液の添加後の細胞(a、b、e、f)およびpCEP4
トランスフェクションした細胞由来の高塩溶解液(c、d、g、h)。pCEP4-Kon21で
トランスフェクションした細胞由来の高塩溶解液の添加後、MIB-21による細胞核
の弱い染色が5分後には既に検出された。1時間後、全ての細胞核は、MIB-21によ
る強力な染色を示す。対照的に、pCEP4でトランスフェクションした細胞由来の
高塩溶解液と共にインキュベーションした細胞は、非常に弱い非特異的バックグ
ラウンド染色のみを示す。
ションした。対照のために同じく、500,000個のCHO細胞を、発現ベクターpCEP4
でトランスフェクションした。インキュベーター内で24時間インキュベーション
した後、これらの細胞を収集しかつ沈降し、かつこの細胞沈降物を-70℃で凍結
した。細胞沈降物を解凍後、500μlの氷冷した高塩緩衝液(10mM HEPES、pH7.9、
400mM NaCl、0.1mM EDTA、0.5mM DTT、5％グリセロール)中に再懸濁し、かつ0℃
で5分間インキュベーションした後、再度沈降させた。上清を、15ml培地中のCHO
細胞に添加し、かつこれらの細胞を異なる時点で解析した。この目的のために、
スライド上で増殖した細胞を伴うスライドを、PBS/10％FCSですすぎ、約6時間風
乾し、その後クロロホルム/アセトンで固定した。この工程に続けて、KON-21タ
ンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体MIB-21による免疫蛍光染色を行
った。その後抗体MIB-21の結合を、アレキサ488結合ヤギ抗マウス抗体(Molecula
r Probes社、ユージーン、オレゴン州、USA)を用いて検出した。より良い位置確
認のために、これらの細胞のDNAをさらにヨウ化プロピジウムにより対比染色し
た。高塩溶解液の添加後5分(a-d)および1時間(e-h)の細胞の顕微鏡写真。写真の
左半分の細胞は、MIB-21で染色した(a、c、e、g)。写真の右半分は、ヨウ化プロ
ピジウムで対比染色した同じ細胞を示す(b、d、f、h)。写真の上側半分は、高塩
溶解液の添加後5分後の細胞(a-d)を示し、および下側半分は高塩溶解液と1時間
インキュベーションした後の細胞(e-h)を示した。各々、pCEP4-Kon21トランスフ
ェクションした細胞由来の高塩溶解液の添加後の細胞(a、b、e、f)およびpCEP4
トランスフェクションした細胞由来の高塩溶解液(c、d、g、h)。pCEP4-Kon21で
トランスフェクションした細胞由来の高塩溶解液の添加後、MIB-21による細胞核
の弱い染色が5分後には既に検出された。1時間後、全ての細胞核は、MIB-21によ
る強力な染色を示す。対照的に、pCEP4でトランスフェクションした細胞由来の
高塩溶解液と共にインキュベーションした細胞は、非常に弱い非特異的バックグ
ラウンド染色のみを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Kon21のDNA挿入断片の塩基配列を示す。塩基対の番号に加えクロ
ーニングに使用した制限酵素部位を、塩基配列の上側に記している。これに由来
したKon21タンパク質のアミノ酸配列は、塩基配列の下側に示している。太字で
示したヌクレオチドは、使用された制限酵素部位である。下線をつけたヌクレオ
チドは、使用されたデオキシオリゴヌクレオチドプライマーにより構築物に導入
された。より良く調べるために、2本鎖DNAの5'-3'方向の一本鎖のみを示してい
る。
ーニングに使用した制限酵素部位を、塩基配列の上側に記している。これに由来
したKon21タンパク質のアミノ酸配列は、塩基配列の下側に示している。太字で
示したヌクレオチドは、使用された制限酵素部位である。下線をつけたヌクレオ
チドは、使用されたデオキシオリゴヌクレオチドプライマーにより構築物に導入
された。より良く調べるために、2本鎖DNAの5'-3'方向の一本鎖のみを示してい
る。
【図２】 使用したベクターpCEP4-Kon21の地図である。
【図３】 トランスフェクション後6時間(a-d)、10時間(e-h)、および24時
間(i-l)での細胞の顕微鏡写真であり；試験条件は実施例１を参照のこと。MIB-2
1による染色(a、e、i、c、g、k)、およびヨウ化プロピジウムによる対比染色(b
、f、j、d、h、l)。写真の左半分の細胞は、pCEP4-Kon21でトランスフェクショ
ンし(a、b、e、f、i、j)、かつ右半分の細胞はpCEP4によりトランスフェクショ
ンした(c、d、g、h、k、l)。
間(i-l)での細胞の顕微鏡写真であり；試験条件は実施例１を参照のこと。MIB-2
1による染色(a、e、i、c、g、k)、およびヨウ化プロピジウムによる対比染色(b
、f、j、d、h、l)。写真の左半分の細胞は、pCEP4-Kon21でトランスフェクショ
ンし(a、b、e、f、i、j)、かつ右半分の細胞はpCEP4によりトランスフェクショ
ンした(c、d、g、h、k、l)。
【図４】 高塩溶解液添加後5分(a-d)および1時間(e-h)での細胞の顕微鏡写
真であり、実施例２を参照のこと。写真の左半分の細胞は、MIB-21で染色した(a
、c、e、g)。写真の右半分の細胞は、ヨウ化プロピジウムで対比染色した同じ細
胞を示す(b、d、f、h)。写真の上側半分は、5分後の細胞を示し(a-d)、下側半分
は高塩溶解液と1時間インキュベーションした後の細胞を示す(e-h)。pCEP4-Kon2
1でトランスフェクションした細胞由来の高塩溶解液添加後の細胞(a、b、e、f)
、およびpCEP4でトランスフェクションした細胞由来の高塩溶解液添加後の細胞(
c、d、g、h)。
真であり、実施例２を参照のこと。写真の左半分の細胞は、MIB-21で染色した(a
、c、e、g)。写真の右半分の細胞は、ヨウ化プロピジウムで対比染色した同じ細
胞を示す(b、d、f、h)。写真の上側半分は、5分後の細胞を示し(a-d)、下側半分
は高塩溶解液と1時間インキュベーションした後の細胞を示す(e-h)。pCEP4-Kon2
1でトランスフェクションした細胞由来の高塩溶解液添加後の細胞(a、b、e、f)
、およびpCEP4でトランスフェクションした細胞由来の高塩溶解液添加後の細胞(
c、d、g、h)。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年５月２８日（２００２．５．２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 29/00 ４Ｈ０４５
Ａ６１Ｐ 29/00 １０１
１０１ 35/00
35/00 37/00
37/00 37/08
37/08 Ｃ０７Ｋ 14/47
Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 15/00 ＺＮＡＡ
5/06 5/00 Ｂ
5/10 Ｅ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ウォーレンバーグ クラウディア
ドイツ連邦共和国 ハンブルグ カッパー
テイチェウェグ 22
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 BA80 CA04
CA07 CA20 DA02 EA04 GA11
HA11 HA17
4B065 AA01X AA58X AA72X AA90X
AA93Y AB01 AC20 BA02
BA30 CA24 CA44 CA46
4C076 AA95 BB11 BB16 CC03 CC04
CC27 EE41
4C084 AA01 AA13 AA16 NA13 ZB07
ZB11 ZB13 ZB15 ZB26
4C087 AA01 BC83 NA13 ZB07 ZB11
ZB13 ZB15 ZB26
4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41
BA50 CA40 EA20 EA50 FA50
FA74
Claims (24)
- 【請求項１】 Ki-67タンパク質のまたは活性部分のカルボキシル末端断片
、それらの断片または相同体の、細胞への輸送ならびに細胞による取り込みおよ
び細胞からの放出に適した化合物としての、使用。 - 【請求項２】 カルボキシル末端断片が、スイスプロット（Swiss Prot）受
託番号P46013で示されたKi-67タンパク質の配列のアミノ酸3037から3256、また
はそれらの相同配列を含むことを特徴とする、請求項１記載の使用。 - 【請求項３】 カルボキシル末端断片、活性部分、それらの断片または相同
体が、標的細胞への輸送が望ましいような第二の成分または数種の成分に連結さ
れている、請求項１記載の使用。 - 【請求項４】 さらなる1つまたは複数の成分がペプチドまたは非ペプチド
である、請求項３記載の使用。 - 【請求項５】 1種または複数のさらなる化合物と結合された輸送化合物が
、細胞の標的集団に添加され、かつ標的集団により取り込まれる、請求項１〜４
のいずれか１項記載の使用。 - 【請求項６】 1種または複数のさらなる化合物と結合された輸送化合物が
、化合物を含みかつ選択的に生成するような細胞から、別の細胞へと輸送され、
かつ細胞により取り込まれる、請求項１〜４記載の使用。 - 【請求項７】 Ki-67タンパク質のカルボキシル末端、活性部分、それらの
断片または相同体を、1種または複数のさらなる輸送されるべき成分と一緒に含
有する、輸送タンパク質。 - 【請求項８】 1種または複数のさらなる成分がペプチドおよび非ペプチド
を含む、請求項７記載の輸送タンパク質。 - 【請求項９】 第一の細胞により生成され、かつ輸送タンパク質それ自体を
生成しないような別の細胞により取り込まれる、請求項７または８記載の輸送タ
ンパク質。 - 【請求項１０】 組換えにより生成される、請求項７または８記載の輸送タ
ンパク質。 - 【請求項１１】 請求項７から９記載の輸送タンパク質をコードしている核
酸またはそれらの相同体。 - 【請求項１２】 請求項７から９のいずれか１項記載の輸送タンパク質を発
現を可能にする、請求項11記載の核酸を含むベクター。 - 【請求項１３】 第一の細胞がトランスフェクションまたは形質転換され、
次にそれらの産物が第二の／さらなる細胞へと輸送される、請求項12記載の発現
ベクター。 - 【請求項１４】 請求項12または13記載のベクター、請求項11記載の核酸を
含み、かつこれが請求項７から10記載の輸送タンパク質を生成する、真核または
原核宿主細胞。 - 【請求項１５】 請求項７から10記載のKi-67タンパク質のカルボキシル末
端または輸送タンパク質の、薬学的組成物における活性物質の担体としての使用
。 - 【請求項１６】 請求項７から10記載のKi-67タンパク質のカルボキシル末
端を担体として含み、かつ別の薬学的活性物質のためのパートナーを輸送する、
薬学的組成物。 - 【請求項１７】 遺伝子治療用の薬学的組成物を製造するための、請求項７
から10記載のKi-67タンパク質のカルボキシル末端の使用。 - 【請求項１８】 下記の工程を含む、標的集団として細胞集団へ化合物を輸
送する方法： a)請求項12または13記載の発現ベクターを宿主細胞へ導入する工程； b)宿主細胞に、請求項７から10のいずれか１項記載のベクターによりコードさ
れた輸送タンパク質を発現し、かつこれを排出する工程；および c)輸送タンパク質を別の細胞集団へ輸送する工程。 - 【請求項１９】 発現ベクターが、形質転換、トランスフェクションまたは
マイクロインジェクションにより宿主細胞へ導入される、請求項18記載の方法。 - 【請求項２０】 輸送タンパク質が標的細胞の環境へ導入されるような、イ
ンビトロにおいて細胞へ化合物を輸送する方法。 - 【請求項２１】 下記の工程を含む、細胞へ化合物を輸送する方法： a)請求項12または13記載の発現ベクターの助けにより、請求項７から10記載の
輸送タンパク質を組換えにより発現する工程；および b)標的細胞が輸送タンパク質を取り込むように、標的細胞および工程a)におい
て生成された輸送タンパク質をインビトロにおいて連結する工程。 - 【請求項２２】 結合された化合物が、請求項７から10記載の輸送タンパク
質を用いてまたは請求項12または13記載の発現ベクターの助けにより、細胞へ導
入される、疾患の処置、予防および治療の方法。 - 【請求項２３】 疾患が、癌、アレルギー、自己免疫疾患、炎症、リウマチ
疾患である、請求項22記載の方法。 - 【請求項２４】 遺伝子治療における、請求項７から10記載の輸送タンパク
質または請求項12または13記載の発現ベクターの使用。
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|---|---|---|---|
| DE19955576A DE19955576B4 (de) | 1999-11-18 | 1999-11-18 | Transferverbindungen, ihre Herstellung und ihre Verwendung |
| DE19955576.1 | 1999-11-18 | ||
| PCT/EP2000/011482 WO2001036629A1 (de) | 1999-11-18 | 2000-11-17 | Transferverbindungen, ihre herstellung und ihre verwendung |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=7929531
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1234034A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003514529A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| DE19822954A1 (de) * | 1998-05-22 | 1999-11-25 | Forschungszentrum Borstel Zent | Antisense-Oligonukleotide zur Behandlung von proliferierenden Zellen |
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2000
- 2000-11-17 JP JP2001538508A patent/JP2003514529A/ja active Pending
- 2000-11-17 WO PCT/EP2000/011482 patent/WO2001036629A1/de active IP Right Grant
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2002
- 2002-05-20 US US10/152,212 patent/US7189808B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
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